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KR20230162024A - 헌팅틴(HTT) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

헌팅틴(HTT) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230162024A
KR20230162024A KR1020237036367A KR20237036367A KR20230162024A KR 20230162024 A KR20230162024 A KR 20230162024A KR 1020237036367 A KR1020237036367 A KR 1020237036367A KR 20237036367 A KR20237036367 A KR 20237036367A KR 20230162024 A KR20230162024 A KR 20230162024A
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KR
South Korea
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nucleotides
dsrna
seq
antisense strand
nucleotide
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020237036367A
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English (en)
Inventor
망갈라 미나크쉬 사운다라판디안
제임스 디. 맥키닌치
마크 케이. 슐레겔
애덤 카스토레노
Original Assignee
알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은, 헌팅틴(HTT) 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 리보핵산(dsRNAi) 제제 및 조성물, 및 이러한 dsRNAi 제제 및 조성물을 사용하여 HTT 유전자의 발현을 억제하는 방법, 및 HTT 관련 질환 또는 장애, 예를 들어, 헌팅턴병을 가진 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

헌팅틴(HTT) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2021년 3월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 63/167,140호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 본원에 그 전체가 참조로서 통합된다. 2022년 3월 22일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 121301-_14420_SL.txt이며, 크기는 198,616 바이트이다.
헌팅턴병은 운동 장애, 인지 상실 및 정신과적 징후를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 장애이다(문헌참조: Martin과 Gusella (1986) N. Engl. J. Med. 315:1267-1276) 이는 상염색체 우성 방식으로 유전되며, 대부분의 유럽 출신 인구에서 약 10,000명의 개체 중 1명에게 영향을 미친다(문헌참조: Harper, P. S. 외, in Huntington's Disease, W. B. Saunders, Philadelphia, 1991). 헌팅턴병의 특징은 특유의 무도 운동 장애(choreic movement disorder)로, 통상적으로 생후 4~50세에 미묘하고 잠행성으로 발병하여 사망할 때까지 10~20년에 걸쳐 점진적으로 악화된다. 때때로 헌팅턴병은 청소년에게서 발병하며 통상적으로 경직 및 보다 급격한 경과를 포함하는 더 심각한 증상으로 나타낸다. 헌팅턴병의 청소년 발병은 질환 대립유전자의 부계 전염의 우세와 관련이 있다. 헌팅턴병의 신경병리학은 또한 뇌의 미상 및 피각 영역에서 가장 심각한 뉴런의 선택적 손실과 함께 독특한 패턴을 나타낸다.
헌팅턴병은 IT15 또는 헌팅틴(HTT)이라는 유전자의 엑손 1에서 글루타민 반복이 확장되어 발생하는 것으로 나타났다. 이 유전자는 광범위하게 발현되고 정상적인 발달에 필요하지만 헌팅턴병의 병리는 아직 잘 알려지지 않은 이유로 뇌에 국한된다. HD(상염색체 우성 질환)를 가진 환자에게, 폴리글루타민 반복의 확장은 야생형 전사체, 확장된 폴리글루타민 반복을 갖는 전장 돌연변이 전사체 뿐만 아니라 확장된 폴리글루타민 반복을 갖는 절단된 돌연변이 전사체를 초래한다. 헌팅틴 유전자 생성물이 환자와 대조군에서 유사한 수준으로 발현되지만, 폴리글루타민 반복의 확장 및 전장 돌연변이 전사체 및 절단된 돌연변이 전사체의 존재가 독성을 유도하는 것으로 나타났다.
헌팅턴병에 대한 효과적인 치료법은 현재 이용가능하지 않다. 무도병 운동과 불안한 행동은 혼수상태, 저혈압, 또는 파킨슨병의 부작용이 나타날 때까지 항정신병제(예를 들어, 클로르프로마진) 또는 레세르핀에 의해 대개 부분적으로만 억제될 수 있다. 또한, RNAi 및 헌팅턴병 치료 분야의 상당한 진전에도 불구하고 높은 생물학적 활성과 생체 내 안정성을 모두 갖고, 표적 헌팅틴 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는, 세포 자체의 RNAi 기구를 사용하여 HD 유전자를 선택적이고 효율적으로 침묵시킬 수 있는 제제가 여전히 요구된다.
본 발명은 헌팅틴(HTT) 유전자의 RNA 전사체의 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)-매개된 절단에 영향을 미치는 RNAi 제제 조성물을 제공한다. HTT 유전자는 세포, 예를 들어 사람과 같은 대상체 내 세포 내에 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 HTT 유전자의 발현을 억제하기 위해 또는 HTT 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키는 것으로부터 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 HTT 관련 질환을 앓거나 이를 앓기 쉬운 대상체를 치료하기 위해 본 발명의 RNAi 제제 조성물을 사용하는 방법을 제공한다
일 양태에서, 본 발명은 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 HTT를 암호화하는 mRNA에 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 표 2~5 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4391~4669; 6500~6540; 또는 6009~6037의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하, 예를 들어 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420; 4403~4425; 또는 6512~6534의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420과 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 AD-1271085, AD-1271083, 또는 AD-1271084으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 AD-1271085의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열로부터 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열 번호 15)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열 번호 15)로 이루어진다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열 번호 16)을 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열번호 15)로 이루어진다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열번호 15)를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열번호 16)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열번호 15)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열번호 16)로 이루어진다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 26~77; 또는 142~202과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 27~49; 55~77; 147~169; 또는 173~195의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 147~169와 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 AD-1019448, AD-1498524, AD-1498526, 또는 AD-1498528으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 AD-1498524의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되고, 예를 들어, 하나 이상의 친유성 모이어티는 안티센스 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서,하나 이상의 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일부 구현예에서, logKow에 의해 측정된 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획에 의해 측정된 dsRNA 제제의 소수성은 0.2를 초과한다. 일부 구현예에서, 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정이다.
일부 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 2개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다. 다른 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 3개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일부 구현예에서, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는데, 예를 들어 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 9~12를 제외한 모든 위치를 포함하거나, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 위치 11~13을 제외한 모든 위치를 포함한다.
일부 구현예에서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다. 다른 구현예에서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 11~13, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥 상의 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 4~8 및 13~18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6~10 및 15~18로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15, 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 영역에서 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합된다.
다른 구현예에서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물이다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 군, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 히드록실, 아민, 카르복시산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유한다. 일부 구현예에서,포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄는 가닥의 5'- 말단으로부터 계수하여 위치 6에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 내부 위치(들) 또는 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)을 대체하는 캐리어를 통해 접합된다. 일부 구현예에서, 캐리어는 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 환형 작용기이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티이다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 dsRNA 제제에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 뉴클레오염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오시드간 결합에 접합된다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드는 미변형 뉴클레오타이드이다. 다른 구현예에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠김 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 비염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-하이드록실-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-히드록시메틸-테트라히드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시티미딘-3'포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드기에 결합된 말단 뉴클레오티드; 및 이들의 조합의 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT), 잠긴 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 및 비닐-포스포네이트 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 상의 변형의 적어도 하나는 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형이다. 일부 구현예에서, 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형은 무염기 변형; 듀플렉스에서 반대 뉴클레오타이드와 미스매치; 및 불안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 핵산(UNA), 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸, GNA 및 2' 플루오로 변형이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, dsRNA 제제는 6~8개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 하나의 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다. 관련 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 모두에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 구현예에서, 가닥은 센스 가닥이다.
일부 구현예에서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행 또는 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
이중 가닥 영역은 길이가 15~30개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 17~25개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍; 또는 길이가 19~21개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
각각의 가닥은 19~30개 뉴클레오타이드; 19~23개 뉴클레오타이드; 또는 21~23개 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 GalNAc 접합체이다. 다른 구현예에서, dsRNA 제제는 GalNAc 접합체와 같은 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 추가로 CNS 조직으로의 전달을 매개하는 수용체를 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들어 친수성 리간드를 포함한다.
특정 구현예에서, 표적화 리간드는 C16 리간드이다. 일 구현예에서, 리간드는
,
여기서, B는 뉴클레오타이드 염기 또는 뉴클레오타이드 염기 유사체이고, 선택적으로 여기서 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 CNS 조직으로의 전달을 매개하는 수용체를 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들어 친수성 리간드, 예컨대 C16 리간드, 예를 들어 다음을 포함하고,
,
여기서, B는 뉴클레오타이드 염기 또는 뉴클레오타이드 염기 유사체이고, 선택적으로 여기서 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이고 GalNAc 접합체와 같은 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스 및 이의 조합의 관능화된 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오 절단 가능한 링커를 통해 접합된다.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 아민을 갖는 환형 기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 군으로으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 배위 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에서 제3 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 Sp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배위로 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배위 중 어느 하나로 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드 간 결합에 존재하는 말단 키랄 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 추가로 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 총 21개 뉴클레오타이드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23개 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열5'- UAUCAGCUUUUCCAGGGUCGCCG -3'(서열 번호 53)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCGACCCUGGAAAAGCUGAUA -3'(서열번호 40)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCGACCCUGGAAAAGCUGAUA -3'(서열번호 40)를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UAUCAGCUUUUCCAGGGUCGCCG -3'(서열번호 53)을 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UAGGACTUGAGGGACUCGAAGGC -3'(서열 번호 57)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUA -3'(서열번호 44)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUA -3'(서열번호 44)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UAGGACTUGAGGGACUCGAAGGC -3'(서열번호 57)을 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UUAAAAGCAGAACCUGACCGGCC -3'(서열번호 59)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- CCGGUCAGGUUCUGCUUUUAA -3'(서열번호 46)을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- CCGGUCAGGUUCUGCUUUUAA -3'(서열번호 46)를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UUAAAAGCAGAACCUGACCGGCC -3'(서열번호 59)을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3'(서열번호 65)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Chd)는 2'-O-헥사데실-시토신-3'-포스페이트이고; C2p는 시티딘-2`-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3'(서열번호 65)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3'(서열번호 65)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3'(서열번호 65)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3' (서열번호 65)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3'(서열번호 65)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3'(서열번호 79)로 이루어진다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; Tgn는 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3'(서열번호 70)으로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3'(서열번호 83)으로 이루어진다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Chd)는 2'-O-헥사데실-시토신-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)를 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3'(서열번호 72)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3'(서열번호 85)로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열번호 15)과 3개 이하(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이)의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열번호 16)과 3개 이하(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이)의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든, 예를 들어 18, 19, 20, 또는 21개 이상의 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든, 예를 들어 20, 21, 22, 또는 23개 이상의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 2'-O-헥사데실 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, dsRNA 제제는 6개 내지 8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하고, 센스 가닥은 하나 이상의 비닐 포스포네이트(VP) 변형, 예를 들어 안티센스 가닥의 5'-말단에서 단일 VP 변형을 포함하고, dsRNA 제제는 간 조직을 표적화하는 리간드, 예를 들어 GalNAc 리간드를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 8개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA-3'(서열번호 15)과 3개 이하(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이)의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU-3'(서열번호 16)과 3개 이하(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드가 상이)의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든, 예를 들어 18, 19, 20, 또는 21개 이상의 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든, 예를 들어 20, 21, 22, 또는 23개 이상의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형 및 2'-O-헥사데실 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합, 예를 들어 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 안티센스 가닥은 4개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합, 예를 들어 5'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 및 3'-말단에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 센스 가닥은 하나 이상의 비닐 포스포네이트(VP) 변형, 예를 들어 안티센스 가닥의 5'-말단에서 단일 VP 변형을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa-3'(서열번호 17)를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu-3'(서열번호 18)를 포함하고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) 변형 A, G, C, 및 U이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 변형 A, C, G, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; VP는 비닐-포스포네이트이다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 리간드, 예컨대 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-히드록시프로리놀을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa-3'(서열번호 17)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu-3'(서열번호 18)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) 변형 A, G, C, 및 U이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 변형 A, C, G, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; VP는 비닐-포스포네이트이다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 리간드, 예컨대 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도데카노일)]-4-히드록시프로리놀을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa-3'(서열번호 17)를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu-3'(서열번호 18)를 포함하고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) 변형 A, G, C, 및 U이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 변형 A, C, G, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; VP는 비닐-포스포네이트이고, 리간드는 다음의 개략도에 도시된 것과 같이 센스 가닥의 3' 말단에 접합되고;
여기서 X는 O이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa-3'(서열번호 17)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5'-VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu-3'(서열번호 18)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) 변형 A, G, C, 및 U이고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2′-플루오로 변형 A, C, G, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; VP는 비닐-포스포네이트이고, 리간드는 다음의 개략도에 도시된 것과 같이 센스 가닥의 3' 말단에 접합되고;
여기서 X는 O이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3'(서열번호 19)를 포함하고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3'(서열번호 20)를 포함하고, a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3'(서열번호 21)를 포함하고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3'(서열번호 22)를 포함하고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-유리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3'(서열번호 17)를 포함하고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3'(서열번호 18)를 포함하고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, 및 U이고; dG 및 dT는 각각 2′-데옥시 G 및 T이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-유리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- usgsgaa(Ahd)AfgCfUfGfaugaaggcscsa -3'(서열번호 23)를 포함하고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusGfsgccu(Tgn)caucagCfuUfuuccasgsg -3(서열번호 24)를 포함하고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; (Tgn)은 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3'(서열번호 19)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3'(서열번호 20)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3'(서열번호 21)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3'(서열번호 22)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-유리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3'(서열번호 17)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3'(서열번호 18)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Uf는 각각 2′-플루오로 A, C, 및 U이고; dG 및 dT는 각각 2′-데옥시 G 및 T이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-유리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- usgsgaa(Ahd)AfgCfUfGfaugaaggcscsa -3'(서열번호 23)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 변형 뉴클레오타이드 서열 5'- VPusGfsgccu(Tgn)caucagCfuUfuuccasgsg -3(서열번호 24)로 이루어지고, a, g, c 및 u는 각각 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; (Tgn)은 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체이고; VP는 5'-비닐-포스포네이트이다.
본 발명은 또한 발명의 임의의 dsRNA 제제를 함유하는 세포 및 발명의 임의의 dsRNA 제제를 포함하는, HTT를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 이중가닥 RNAi 제제는 비완충 용액 중에 있다. 선택적으로, 비완충 용액은 식염수 또는 물이다. 또 다른 구현예에서, 이중가닥 RNAi 제제는 완충 용액 중에 있다. 선택적으로, 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 이중가닥 RNAi 제제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 지질 제형은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 둘 이상의 dsRNA 제제, 예컨대 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하는 제1 dsRNA 제제 및 전장 사람 HTT를 표적으로 하는 제2 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 2개 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 dsRNA 제제 각각은 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 독립적으로 포함하고, 각각의 안티센스 가닥은 HTT를 암호화하는 mRNA에 상보성 영역을 독립적으로 포함하고, 각각의 상보성 영역은 표 2~5 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 2개 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 dsRNA 제제 각각은 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 독립적으로 포함하고, 각각의 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4391~4669; 6500~6540; 또는 6009~6037의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 독립적으로 포함하고, 각각의 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420; 4403~4425; 또는 6512~6534의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥 중 하나는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 안티센스 가닥은 AD-1271085, AD-1271083, 또는 AD-1271084으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥 중 하나는 AD-1271085의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 세포 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 2개 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 dsRNA 제제 각각은 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 독립적으로 포함하고, 각각의 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 26~77; 또는 142~202의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 독립적으로 포함하고, 각각의 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 27~49; 55~77; 147~169; 또는 173~195의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥 중 하나는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 147~169와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 안티센스 가닥은 AD-1019448; AD-1498524, AD-1498526, 또는 AD-1498528.으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥 중 하나는 AD-1498524의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 센스 가닥 중 적어도 하나 또는 상기 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 하나 이상의 친유성 모이어티에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 dsRNA 제제의 센스 가닥 전부 또는 안티센스 가닥 전부는 하나 이상의 친유성 모이어티에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 위치에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티 각각은 링커 또는 캐리어를 통해 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, logKow에 의해 측정된 친유성 모이어티 각각의 친유성은 독립적으로 0을 초과한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합 분율에 의해 측정된, 이중-가닥 RNAi 제제 각각의 소수성은 독립적으로 0.2를 초과한다.
일 구현예에서, 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정이다.
일 구현예에서, 각각의 dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 dsRNA 제제의 각각의 센스 가닥 및 각각의 안티센스 가닥은 독립적으로 5개 이하의 미변형 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 각각의 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형을 독립적으로 포함한다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 잠금 뉴클레오타이드, 잠금 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-히드록시메틸-테트라히드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시티미딘-3'포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-O 헥사데실 뉴클레오타이드, 2'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 시티딘-2'-포스페이트 뉴클레오타이드, 구아노신-2'-포스페이트 뉴클레오타이드, 2'-O-헥사데실-시티딘-3'-포스페이트 뉴클레오타이드, 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트 뉴클레오타이드, 2'-O-헥사데실-구아노신-3'-포스페이트 뉴클레오타이드, 2'-O-헥사데실-우리딘-3'-포스페이트 뉴클레오타이드, 5'-비닐 포스포네이트(VP), 2`-데옥시아데노신-3`-포스페이트 뉴클레오타이드, 2`-데옥시시티딘-3`-포스페이트 뉴클레오타이드, 2`-데옥시구아노신-3`-포스페이트 뉴클레오타이드, 2`-데옥시티미딘-3`-포스페이트 뉴클레오타이드, 2`-데옥시우리딘 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데카노산 비스데실아미드기에 결합된 말단 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT), 잠김 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-데옥시-변형, 또는 2'플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 적어도 하나는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 적어도 하나는 6~8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 dsRNA 제제의 각각의 가닥은 독립적으로 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 dsRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 독립적으로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 dsRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 독립적으로 포함한다.
각각의 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역은 길이가 15~30개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 17~23개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 17~25개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍; 또는 길이가 19~21개의 뉴클레오타이드 쌍; 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
각각의 dsRNA 제제의 각각의 가닥은 독립적으로 19~30개의 뉴클레오타이드; 길이가 19~23개의 뉴클레오타이드; 또는 길이가 21~23개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 각각의 dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 독립적으로 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
일 구현예에서,하나 이상의 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 각각 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 2개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 적어도 하나의 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 3개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 9~12를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 위치 11~13을 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 위치 12~14을 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 내부 위치는 독립적으로 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥 상의 위치 11~13, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥 상의 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 하나 이상의 친유성 모이어티는 독립적으로 각각의 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 4~8 및 13~18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6~10 및 15~18로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각 독립적으로 각각의 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15, 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다.
일 구현예에서, 이중 가닥 영역에서 각각의 위치는 독립적으로 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제한다.
일 구현예에서, 각각의 센스 가닥은 독립적으로 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 각각의 안티센스 가닥은 독립적으로 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 각각의 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 또는 위치 7에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 또는 위치 15에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 20, 또는 위치 15에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 안티센스 가닥의 위치 16에 독립적으로 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물이다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 군, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 포화 또는 불포화 C4~C30 탄화수소 쇄, 및 히드록실, 아민, 카르복시산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유한다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 포화 또는 불포화 C6~C18 탄화수소 쇄를 함유한다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유한다.
일 구현예에서, 각각의 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄는 독립적으로 가닥의 5'- 말단으로부터 계수하여 위치 6에 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 내부 위치(들) 또는 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)을 대체하는 캐리어를 통해 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 캐리어는 독립적으로 피롤리디닐, 파라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 환형 작용기이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티이다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 독립적으로 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 iRNA 제제에 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티는 뉴클레오염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오시드간 결합에 접합된다.
일 구현예에서, 각각의 친유성 모이어티 또는 하나 이상의 표적화 리간드는 독립적으로 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스 및 이의 조합의 관능화된 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오 절단 가능한 링커를 통해 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 센스 가닥의 3' 말단은 독립적으로 아민을 갖는 환형 기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 군으로으로부터 선택된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 적어도 하나는 추가로 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 포스페이트 모방체는 독립적으로 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
일 구현예에서, 각각의 센스 가닥은 독립적으로 총 21개의 뉴클레오타이드를 갖고, 각각의 안티센스 가닥은 독립적으로 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 본원의 RNAi 제제 각각의 “약제학적으로 허용가능한 염”은 나트륨 염, 칼슘 염, 리튬 염, 칼륨 염, 암모늄 염, 마그네슘 염, 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자는, RNAi 제제가, 선택적으로 변형 포스포디에이터 골격의 유리산 기당 1 양이온 및/또는 임의의 다른 산성 변형(예를 들어, 5'-말단 포스폰산염 기)을 갖는 다중양이온 염으로서 제공될 때, 이를 이해할 것이다. 예를 들어, 길이가 “n”개 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드는 n-1의 선택적로 변형 포스포디에스테르를 함유하므로, 길이가 21 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드가 최대 20개의 양이온(예를 들어, 20개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다. 유사하게, 길이가 21 nt인 센스 가닥 및 길이가 23 nt인 안티센스 가닥을 갖는 RNAi 제제는 최대 42개의 양이온(예를 들어, 42개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다. RNAi 제제가 또한 5'-말단 포스페이트 또는 5'-말단 비닐포스포네이트 기를 포함하는 선행 예에서, RNAi 제제는 최대 44개의 양이온(예를 들어, 44개의 나트륨 양이온)을 갖는 염으로서 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 발명의 조성물을 포함하는, 예를 들어, 지질 제형을 포함하는, 세포 및 약제학적 화합물을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 세포 내 HTT 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 세포를 본 발명의이중 가닥 RNAi 제제, 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지하여 세포 내 HTT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 세포는 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 또는 4개의 발명의 dsRNA 제제(또는 본 발명의 조성물), 예컨대 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하는 제1 dsRNA 제제 및 전장 사람 HTT를 표적으로 하는 제2 dsRNA 제제와 접촉된다.
일 구현예에서, 세포는 대상체 내에 있다. 선택적으로, 대상체는 사람이다.
특정 구현예에서, 대상체는 레서스 원숭이(rhesus monkey), 시노몰구스 원숭이, 마우스 또는 랫츠이다. 특정 구현예에서, HTT 발현은 RNAi 제제에 의해 적어도 약 50%만큼 억제된다.
특정 구현예에서, 사람 대상체는 HTT 관련 질환, 예를 들어, 헌팅턴병을 진단 받았다.
본 발명의 또 다른 양태는 HTT 관련 질환, 예를 들어 헌팅턴병을 진단받은 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제, 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 대상체는 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 또는 4개의 발명의 dsRNA 제제(또는 본 발명의 조성물), 예컨대 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하는 제1 dsRNA 제제 및 전장 사람 HTT를 표적으로 하는 제2 dsRNA 제제를 투여받는다.
제1 및 제2 dsRNA 제제는 동일하거나 분리된 조성물에 존재할 수 있다.
제1 및 제2 dsRNA 제제는 동일한 시간 또는 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 치료는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 완화를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 치료는 질환의 진행을 예방하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, dsRNA 제제는 대상체에게 척추강내로 투여된다. 일 구현예에서, 방법은 뇌(예를 들어, 선조체) 또는 척추 조직에서 HTT 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, 뇌 또는 척추 조직은 선조체, 피질, 소뇌, 경추, 요추 또는 흉추이다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 수득된 샘플 내 HTT의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체 내 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 방법은: 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여함으로써, 대상체 내 HTT의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 HTT 관련 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가의 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1 은 표시된 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 24시간차에 CSF에서 1000 ng/mL siRNA를 초과하는 비사람 영장류의 뇌 및 척추의 표시된 영역에서 HTT 녹다운을 도시한 그래프이다.
도 2 는 표시된 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 24시간차에 비사람 영장류(군 당 n=5)의 뇌 및 척추의 표시된 영역에서 HTT mRNA 발현의 억제를 도시하는 표이다.
도 3a 는 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 24시간차에 표시된 비사람 영장류(도 2 참조)의 CSF에서 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 3b 는 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 45일차에 표시된 비사람 영장류(도 2 참조)의 전전두엽 피질에서 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 3c 는 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 45일차에 표시된 비사람 영장류(도 2 참조)의 선조체(미상)에서 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 3d 는 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 45일차에 표시된 비사람 영장류(도 2 참조)의 선조체(피각)에서 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 3e 는 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 경막내 투여한 후 45일차에 표시된 비사람 영장류(도 2 참조)의 흉추에서 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 4a 는 시험된 모든 듀플렉스의 60 mg의 단일 투여량을 복강내 투여한 비사람 영장류에서 HTT의 녹다운 수준과 뇌 및 척추 조직에서의 siRNA 농도의 상관관계를 도시하는 그래프이다.
도 4b 는 듀플렉스 AD-1019465의 60 mg의 단일 투여량을 복강내 투여한 비사람 영장류에서 HTT의 녹다운 수준과 뇌 및 척추 조직에서의 siRNA 농도의 상관관계를 도시하는 그래프이다.
도 4c 는 듀플렉스 AD-1271082의 60 mg의 단일 투여량을 복강내 투여한 비사람 영장류에서 HTT의 녹다운 수준과 뇌 및 척추 조직에서의 siRNA 농도의 상관관계를 도시하는 그래프이다.
도 4d 는 듀플렉스 AD-1271085의 60 mg의 단일 투여량을 복강내 투여한 비사람 영장류에서 HTT의 녹다운 수준과 뇌 및 척추 조직에서의 siRNA 농도의 상관관계를 도시하는 그래프이다.
도 5a 는 단일 척추강 내 듀플렉스의 60 mg 투여량에 이어 시간 경과에 따른 혈장 샘플에서의 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 5b 는 60 mg의 모든 시험된 듀플렉스의 단일 경막내 투여 후 표시된 시점에서 CSF 및 혈장 내 siRNA의 농도를 도시하는 그래프이다(도 2 참조).
도 6a 는 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg/kg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이체 사람 HTT mRNA의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 비교를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 토미네르센(로슈, IONIS-HTTRx 및 RG6042로도 알려짐)의 효과가 또한 도시되어 있다.
도 6b 는 웨스턴 블롯 및 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg/kg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 사람 단백질 수준을 아래 그래프에서 정량화한다. 비교를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 토미네르센(로슈, IONIS-HTTRx 및 RG6042로도 알려짐)의 효과가 또한 그래프에 도시되어 있다.
도 7 은 QuantiGene 패널의 각 검정에 의해 평가된 Htt 전사부의 부분을 개략적으로 도시한다. 문헌[Papadopoulou, 외. (2019) Scientific Reports 9권, 16137조] 참조한다.
도 8a 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 폴리A-부위 1(680 bp 변이체) 발현을 갖는 HTT(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI) 및 야생형 마우스의 척수 및 선조체 내 폴리A-부위 1(680 bp 변이체) 발현을 갖는 HTT(마우스 내인성), 인트론 1의 수준을 도시하는 그래프이다. 평균+/-SD, ***p<0.001(Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 ANOVA) 및 ###p<0.001(WT에 대한 Si 대조군과의 비쌍 t-검정). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 8b 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 폴리A-부위 2(1145 bp 변이체) 발현을 갖는 HTT(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI) 및 야생형 마우스의 척수 및 선조체 내 폴리A-부위 1(680 bp 변이체) 발현을 갖는 HTT(마우스 내인성), 인트론 1의 수준을 도시하는 그래프이다. 평균+/-SD, *p<0.05(Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 ANOVA) 및 ##p<0.01; ###p<0.001(WT에 대한 Si 대조군과의 비쌍 t-검정). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 8c 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 평균 형광 강도(MFI) 및 야생형 마우스의 척수 및 선조체 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 수준을 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~6으로 제시된다. 표시한 것과 같이 쌍별 비교: *p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001(Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 ANOVA) 및 ###p<0.001; ####p<0.0001(WT에 대한 Si 대조군과의 비쌍 t-검정). 군 1과 군 6 간의 비교는 모델(유전자형) 효과에 대한 대조군으로서 작용한다. 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 8d 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 3' 말단 발현의 (유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서) 평균 형광 강도(MFI) 및 야생형 마우스의 척수 및 선조체 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 수준을 도시하는 그래프이다. 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 8e 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 3 발현의 (유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서) 평균 형광 강도(MFI) 및 야생형 마우스의 척수 및 선조체 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 수준을 도시하는 그래프이다. 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 8f 는 표시된 제제, 비-표적화 대조군 제제, 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 이형접합 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 농도를 도시하는 그래프이다. 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 농도는 총 단백질의 밀리그램 당 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 펨토몰로서 도시되어 있다.
도 8g 는 표시된 제제, 비-표적화 대조군 제제, 또는 aCSF 대조군의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 후 이형접합 Q175 KI 마우스의 척수 및 선조체 내 야생형 헌팅틴 단백질의 농도를 도시하는 그래프이다. 야생형 헌팅틴 단백질의 농도는 총 단백질의 밀리그램 당 야생형 헌팅틴 단백질의 펨토몰로서 도시되어 있다.
도 9 는 투여 후 45일차에 AD-1019465(n=5), AD-1271082(n=5), 또는 AD-1271085(n=5)의 단일 60 mg 투여량을 척수강내 투여받은 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조 미상, 요추 및 흉추 조직에 남아있는 HTT 단백질 백분율을 도시한다. 남은 HTT 단백질의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질의 수준에 상대적이다.
도 10a 는 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이체 사람 HTT mRNA의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 비교를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 A-1800326(토미네르센; 로슈, IONIS-HTTRx 및 RG6042로도 알려짐)의 효과가 또한 도시되어 있다.
도 10b 는 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 야생형 마우스 HTT mRNA의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 비교를 위해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 A-1800326(토미네르센; 로슈, IONIS-HTTRx 및 RG6042로도 알려짐)의 효과가 또한 도시되어 있다.
도 10c는 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이체 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질 녹다운의 수준을 도시하는 웨스턴 블롯이다. “a-CSF”는 인공 CSF를 지칭하며; “476-600”은 AD-1019476의 600 μg/kg 투여량을 지칭하며; “476-300”은 AD-1019476의 300 μg/kg 투여량을 지칭한다. MAB2166(EMD 밀리포어)을 단백질 검출에 사용하였다.
도 10d 는 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이체 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질 녹다운의 수준을 도시하는 웨스턴 블롯이다. “a-CSF”는 인공 CSF를 지칭하며; “079-600”은 AD-1443079의 600 μg/kg 투여량을 지칭하며; “079-300”은 AD-1443079의 300 μg/kg 투여량을 지칭하고; “080-600”은 AD-1443080의 600 μg/kg 투여량을 지칭하며; “080-300”은 AD-1443080의 300 μg/kg 투여량을 지칭한다. MAB2166(EMD 밀리포어)을 단백질 검출에 사용하였다.
도 10e 는 웨스턴 블롯 및 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 도 10c의 용해물을 D7F7 항체로 재분석하여 관찰된 HTT 단백질 녹다운을 확인하였다. 돌연변이 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질 수준을 아래 그래프에서 정량화하였다. “a-CSF”는 인공 CSF를 지칭하고; “476-600”은 AD-1019476의 600 μg/kg 투여량을 지칭하며; “476-300”은 AD-1019476의 300 μg/kg 투여량을 지칭한다.
도 10f 는 웨스턴 블롯 및 표시된 듀플렉스 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 또는 600 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질의 녹다운 수준을 도시하는 그래프이다. 도 10d의 용해물을 D7F7 항체로 재분석하여 관찰된 HTT 단백질 녹다운을 확인하였다. 돌연변이체 사람 HTT 단백질 및 마우스 야생형 단백질 수준은 아래 그래프에서 정량화된다. 비교를 위해 두 블롯(도 10e 및 도 10f 블롯)으로부터의 정량화가 나란히 도시되어 있다. “a-CSF”는 인공 CSF를 지칭하고; “079-600”은 AD-1443079의 600 μg/kg 투여량을 지칭하며; “079-300”은 AD-1443079의 300 μg/kg의 투여량을 지칭하며; “080-600”은 AD-1443080의 600 μg/kg 투여량을 지칭하고; “080-300”은 AD-1443080의 300 μg/kg 투여량을 지칭한다.
도 11a 는 AD-1019476, 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 37.5 μg, 75 μg, 150 μg 또는 300 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 돌연변이체 사람 HTT 단백질의 수준을 도시하는 그래프이다. 2개의 상이한 항체인 MAB2166(EMD 밀리포어) 및 D7F7(세포 신호)을 사용하였고, 두 항체로부터의 결과는 HTT 단백질의 유사한 녹다운을 입증하였다.
도 11b 는 AD-1019476, 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 37.5 μg, 75 μg, 150 μg 또는 300 μg 투여량을 투여한 YAC128의 전두엽 피질에서 뇌실내 주사(ICV)에 의한 마우스 야생형 단백질의 수준을 도시하는 그래프이다. 2개의 상이한 항체인 MAB2166(EMD 밀리포어) 및 D7F7(세포 신호)을 사용하였고, 두 항체로부터의 결과는 HTT 단백질의 유사한 녹다운을 입증하였다.
도 12a 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 척수 내 폴리A-부위 1(680 bp 변이체) 발현을 갖는 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, Q175 HET Si-대조군 10개월 대 Q175 WT Si-대조군 10개월; * p < 0.05, *** p < 0.001, Q175 WT Si-대조군 12개월 및 Q175 HET AD-1498524 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월(Welch 보정/Welch의 ANOVA 테스트, Dunnett의 T3 다중 비교 테스트를 사용한 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12b 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 척수 내 폴리A-부위 2(1145 bp 변이체) 발현을 갖는 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: ** p < 0.01, Q175 HET Si-대조군 10개월 대 Q175 WT Si-대조군 10개월; * p < 0.05, ** p < 0.001, Q175 WT Si-대조군 12개월, Q175 HET AD-1498524 12개월 및 Q175 HET AD-1271085 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월 (Welch 보정/일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하는 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12c 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 척수 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 3' 말단 발현(유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n= 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, Q175 HET AD-1019448 10개월 대 Q175 HET Si-대조군 10개월(일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12d 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 척수 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 3 발현(유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n= 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성 없음: p > 0.05, (Welch 보정/일반 일방향 ANOVA를 이용한 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12e 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 척수 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, Q175 WT Si-대조군 10개월, Q175 HET AD-1271085 10개월, Q175 HET AD-1498524 10개월, Q175 HET AD-1019448 10개월 대 Q175 HET Si-대조군 10개월; *** p < 0.001, **** p < 0.0001, Q175 WT Si-대조군 12개월, Q175 HET AD-1271085 12개월 및 Q175 HET AD-1498524 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월(Welch 보정/일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하는 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12f 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 선조체 내 폴리A-부위 1(680 bp 변이체) 발현을 갖는 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, Q175 HET Si-대조군 10개월 대 Q175 WT Si-대조군 10개월; **** p < 0.0001, Q175 WT Si-대조군 12개월 및 Q175 HET AD-1498524 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월(Welch 보정/Welch의 ANOVA 테스트, Dunnett의 T3 다중 비교 테스트를 사용한 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12g 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 선조체 내 폴리A-부위 2(1145 bp 변이체) 발현을 갖는 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: *** p < 0.001, Q175 HET Si-대조군 10개월 대 Q175 WT Si-대조군 10개월; * p < 0.05, *** p < 0.001, Q175 WT Si-대조군 12개월 및 Q175 HET AD-1498524 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월(Welch 보정/일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하는 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12h 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 선조체 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 1의 3' 말단 발현(유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, Q175 HET AD-1271085 10개월 및 Q175 HET AD-1019448 10개월 대 Q175 HET Si-대조군 10개월(일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12i 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 선조체 내 Htt(마우스 내인성), 인트론 3 발현(유지된 인트론 영역 발현의 검출을 위한 음성 대조군으로서)의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성 없음: p > 0.05, (Welch 보정/일반 일방향 ANOVA를 이용한 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12j 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사 10개월 및 12개월 후 Q175 WT 및 HET 마우스의 선조체 내 헌팅틴, 전장(총) 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 SD, n = 군 당 3~10으로 제시된다. 통계적 유의성: ** p < 0.01, *** p < 0.001, Q175 WT Si-대조군 10개월, Q175 HET AD-1271085 10개월, Q175 HET AD-1498524 10개월, Q175 HET AD-1019448 10개월 대 Q175 HET Si-대조군 10개월; **** p < 0.0001, Q175 WT Si-대조군 12개월, Q175 HET AD-1271085 12개월 및 Q175 HET AD-1498524 12개월 대 Q175 HET Si-대조군 12개월(Welch 보정/일반 일방향 ANOVA, Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하는 비쌍 t 테스트). 3개의 참조 유전자의 기하평균으로 정규화됨.
도 12k 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사후 WT 및 Q175 HET 마우스의 선조체 내 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 농도(상단) 및 총 HTT 단백질의 농도(하단)를 도시하는 그래프이다. 돌연변이체 및 총 헌팅틴 단백질의 농도는 총 단백질의 밀리그램 당 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 펨토몰로서 도시되어 있다. 통계적 유의성: Q175 Het Si-대조군 대 치료: 일방향 ANOVA에 이어 각각의 시점에서 Dunnett의 다중 비교 검정을 비교하였다. *p ≤0.05, ***p <0.001, **p <0.01, ****p<0.0001.
도 12l 는 표시된 제제 또는 aCSF 대조군(Si-대조군)의 300 μg의 단일 뇌실내 주사후 WT 및 Q175 HET 마우스의 척수 내 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 농도(상단) 및 총 HTT 단백질의 농도(하단)를 도시하는 그래프이다. 돌연변이체 및 총 헌팅틴 단백질의 농도는 총 단백질의 밀리그램 당 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 펨토몰로서 도시되어 있다. 통계적 유의성: Q175 Het Si-대조군 대 치료: 일방향 ANOVA에 이어 각각의 시점에서 Dunnett의 다중 비교 검정을 비교하였다. ***p <0.001, **p <0.01, ****p<0.0001.
도 13a 는 투여 후 33일차에 AD-1271085(n=8)의 단일 3 mg 또는 10 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피질, 선조 미상, 요추(척추 L1~L3) 조직에 남아 있는 HTT 전사체의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 전사체의 수준에 상대적이다.
도 13b 는 투여 후 33일차에 AD-1271085(n=8)의 단일 3 mg 또는 10 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피질, 및 선조 미상 조직에 남아 있는 HTT 전사체의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 전사체의 수준에 상대적이다.
도 13c 는 투여 후 33일차에 AD-1271085(n=8)의 단일 3 mg 또는 10 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피질, 선조 미상, 요추(척추 L1~L3) 조직에 남아 있는 HTT 단백질의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 단백질의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질의 수준에 상대적이다.
도 13d 는 투여 후 33일차에 AD-1271085(n=8)의 단일 3 mg 또는 10 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피질, 및 선조 미상 조직에 남아 있는 HTT 단백질의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 단백질의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질의 수준에 상대적이다.
도 13e 는, 투여 후 33일차에 AD-1271085(n=8)의 단일 3 mg 또는 10 mg 투여량의 경막내 투여의 효과와 비-사람 영장류의 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피질, 선조 미상, 및 요추(척추 L1~L3) 조직에 남아 있는 HTT 전사체 및 단백질의 백분율의 상관관계를 도시한 그래프이다. 남은 HTT 단백질 및 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질 및 전사체의 수준에 상대적이다.
도 14a 는 투여 후 59일차에 AD-1498524, AD-1498526 또는 AD-1498528(n=5)의 단일 60 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 선조 미상, 선조체 피질, 해마, 전전두엽 피질 및 요추 조직에 남아있는 HTT 단백질의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 단백질의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질의 수준에 상대적이다.
도 14b 는 투여 후 59일차에 AD-1498524, AD-1498526 또는 AD-1498528(n=5)의 단일 60 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 선조 미상, 선조체 피질, 해마, 전전두엽 피질 및 요추 조직에 남아있는 HTT 전사체의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 전사체의 수준에 상대적이다.
도 14c 는 투여 후 59일차에 AD-1498524, AD-1498526 또는 AD-1498528(n=5)의 단일 60 mg 투여량을 경막내 투여받은 비-사람 영장류의 선조 미상, 선조체 피질, 해마, 전전두엽 피질 및 요추 조직에 남아있는 HTT 전사체의 백분율을 도시한 그래프이다. 남은 HTT 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 전사체의 수준에 상대적이다.
도 14d 는 투여 후 59일차에 AD-1498524, AD-1498526 또는 AD-1498528(n=5)의 단일 60 mg 투여량의 경막내 투여의 효과와 비사람 영장류의 조직에 남아있는 HTT 전사체 및 단백질의 백분율의 상관관계를 도시하는 그래프이다. 남은 HTT 단백질 및 전사체의 백분율은 인공 CSF(aCSF)가 투여된 비사람 영장류의 상응하는 조직에서 HTT 단백질 및 전사체의 수준에 상대적이다.
도 15 는 표시된 듀플렉스의 구조의 개략도이다.
본 발명은 헌팅틴(HTT) 유전자의 RNA 전사체의 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)-매개된 절단에 영향을 미치는 RNAi 제제 조성물을 제공한다. HTT 유전자는 세포, 예를 들어 사람과 같은 대상체 내 세포 내에 존재할 수 있다. 이들 iRNA의 사용은 포유류에서 상응하는 유전자(HTT 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명의 iRNA는 다른 포유동물 종의 HTT 오솔로그(orthologs)에 보존된 유전자의 일부를 포함하는 전장 HTT 유전자를 표적화하도록 설계되어, 예를 들어, 전장 야생형 전사체 및 전장 돌연변이 전사체를 표적화한다. 이론에 의해 제한하고자 하는 의도 없이, 이들 iRNA에서 이전의 성질 및 특이적 표적 부위 또는 특이적 변형의 조합 또는 서브-조합은 발명의 iRNA에 개선된 효능, 안정성, 효능, 내구성 및 안전성을 부여하는 것으로 사료된다.
따라서, 본 발명은 또한 HTT 유전자의 발현을 억제하거나 HTT 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것으로부터 혜택을 받을 장애, 예를 들어 HTT 관련 질환, 예를 들어, 헌팅턴병(HD)을 가진 대상체를 치료하기 위해, 본 발명의 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 또는 4개의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 포함하여 본 발명의 RNAi 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 RNAi 제제는 길이가 약 30개 이하, 예를 들어 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 뉴클레오타이드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 이 영역은 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 길이가 21~23개 뉴클레오타이드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 이 영역은 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 더 긴 길이, 예를 들어 길이가 최대 66개 뉴클레오타이드, 예를 들어 36~66, 26~36, 25~36, 31~60, 22~43, 27~53개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 적어도 19개 연속 뉴클레오타이드의 영역은 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 더 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이러한 RNAi 제제는 바람직하게는 길이가 20~60개 뉴클레오타이드의 제2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함할 수 있고, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 18~30개 연속 뉴클레오타이드의 듀플렉스를 형성한다.
이들 RNAi 제제의 사용은 포유류에서 HTT 유전자의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 따라서, 이들 RNAi 제제를 포함하는 방법 및 조성물은 HTT 단백질의 수준 또는 활성 감소에 의해 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 헌팅턴병(HD)과 같은 HTT 관련 질환을 가진 대상체를 치료하는 데 유용하다.
다음의 상세한 설명은 HTT 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라 유전자의 발현의 억제 또는 감소로부터 혜택을 받을 질환 및 장애를 가진 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본원 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값의 중간 값 및 범위가 또한 본 발명의 일부로 의도된다는 점에 유의해야 한다.
단수형 관사(“a” 및 “an”)는 본원에서 관사의 문법적인 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭한다. 예로서, “일 요소”는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어, 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는(including)"은 문구 “~을 포함하지만 이에 제한되지 않는”을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다. 용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 의미하지 않는 이상, 용어 “및/또는”을 의미하기 위해 본원에 사용되고 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 “약”은 당업계의 통상적인 허용 오차 범위 내에 있음을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, “약”은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에서, 약은 ±10%를 의미한다. 특정 구현예에서, 약은 ± 5%를 의미한다. 약이 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, “약”은 일련의 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해한다.
수 또는 일련의 수들 앞의 용어 “적어도”, “초과”, 또는 “이상”은 용어 “적어도”에 근접한 수, 및 문맥으로부터 분명해지듯이 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 수 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, “21개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오타이드”는 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오타이드가 지정된 성질을 가짐을 의미한다. 적어도가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, “적어도”는 일련의 또는 범위 내의 각각의 수를 수식할 수 있는 것으로 이해한다.
본원에 사용된 것과 같이, “이하” 또는 “미만”은 문구에 인접한 값으로 이해되고, 논리적으로 낮은 값 또는 정수는 문맥상 논리적으로 0으로 이해한다. 예를 들어, “2개 이하의 뉴클레오타이드”의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. “이하”가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재하는 경우, “이하”는 일련의 또는 범위 내의 수 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 것과 같이, 검출 방법은 존재하는 분석물의 양이 방법의 검출 수준 미만인 결정을 포함할 수 있다.
지정된 표적 부위와 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 뉴클레오타이드 서열에 모순이 있는 경우, 지정된 서열이 우선된다.
화학 구조와 화학명이 모순되는 경우 화학 구조가 우선된다.
"헌팅틴(Huntingtin)", "헌팅턴병 단백질", "IT15", "HD," HD 단백질 또는 "LOMARS"라고도 공지된 "HTT" 또는 "헌팅틴(huntingtin)"이라는 용어는 정상적인 발달을 위해 요구되는, 광범위하게 발현되는 단백질인, HTT를 암호화하는 널리 공지된 유전자 및 단백질 생성물에서 폴리글루타민 반복체로서 해독되는 헌팅틴 유전자에서 확장되고 불안정한 트리뉴클레오타이드(CAG) 반복에 의해 유발되는 선조체 뉴런의 상실을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애인 헌팅턴병과 연관되는 질환 유전자를 지칭한다.
HTT의 예시저인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 예를 들어 GenBank 승인 번호 NM_002111.8 (호모 사피엔스(Homo sapiens) HTT, 서열번호 1, 역 상보체, 서열번호 6); GenBank 승인 번호 NM_010414.3(무스 무스쿨루스(Mus musculus) HTT, 서열번호 2; 역 상보체, 서열번호 7); GenBank 승인 번호 NM_024357.3(래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) HTT, 서열번호 3, 역 상보체, 서열번호 8); GenBank 승인 번호 XM_015449989.1(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) HTT, 서열번호 4, 역 상보체, 서열번호 9); 및 GenBank 승인 번호 XM_028848247.1(마카카 물라타(Macaca mulatta) HTT, 서열번호 5, 역 상보체, 서열번호 10)에서 찾을 수 있다.
HTT 서열의 추가의 예는 대중에게 가용한 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, OMIM, 및 UniProt에서 찾을 수 있다.
HTT에 대한 추가의 정보는 예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3064에서 찾을 수 있다.
전술한 GenBank 수탁 번호 및 유전자 데이터베이스 번호 각각의 전문은 본 출원을 제출한 날짜를 기준으로 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 HTT는 또한 SNP 데이터베이스에서 제공된 변 이체를 포함하는 NTT 유전자의 변이를 언급한다. HTT 유전자 내 수많은 서열 변이가 확인되었고, 예를 들어, NCBI dbSNP 및 UniProt에서 찾을 수 있다(예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?LinkName=gene_snp&from_uid=3064를 참조하며 이의 전문이 본 출원을 제출한 날짜를 기준으로 본원에 참조로서 인용된다).
본원에 사용된 "표적 서열"은 1차 전사 생성물의 RNA 처리 생성물인 mRNA를 포함하는 HTT 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열의 표적 부분은 HTT 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 부분에서 또는 그 부분 근처에서 RNAi-지시된 절단을 위한 기질로 작용하기에 적어도 충분히 길 것이다.
표적 서열은 길이가 약 15-30개 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 표적 서열은 길이가 약 15~30개 뉴클레오타이드, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열은 길이가 19~23개 뉴클레오타이드, 선택적으로 길이가 21~23개 뉴클레오타이드이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 발명의 일부인 것으로 고려된다.
본원에 사용된 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 지칭된 서열에 의해 기술된 뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
“G,” “C,” “A,” “T,” 및 “U”는 각각 변형 또는 미변형 뉴클레오타이드의 문맥에서, 일반적으로 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드를 각각 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 또한 하기에 추가로 상세히 설명되는 것과 같이 변형 뉴클레오타이드, 또는 대용 대체 모이어티(예를 들어, 표 1 참조)를 지칭할 수 있음이 이해된다. 통상의 기술자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘, 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 이노신을 그 염기로 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드는 본 발명에서 특징화된 dsRNA의 뉴클레오타이드 서열에서, 예를 들어 이노신을 함유하는 뉴클레오타이드에 의해 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드의 어느 곳에서나 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 발명에서 특징화된 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "iRNA", "RNAi 제제", "iRNA 제제", "RNA 간섭 제제"라는 용어는 본원에 정의된 것과 같은 RNA를 함유하고, RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. RNA 간섭(RNAi)은 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시하는 공정이다. RNAi는 세포, 예를 들어, 포유동물 대상체와 같은 대상체 내 세포에서 HTT 유전자의 발현을 조절, 예를 들어, 억제한다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, HTT 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNAi를 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것 없이 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의해 센스 가닥 및 안티 센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 분해되는 것으로 사료된다(문헌참조: Sharp 외(2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제 III형 효소인 다이서는 이들 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19~23개 염기쌍의 짧은 간섭 dsRNA로 가공한다(문헌참조: Bernstein, 외, (2001) Nature 409:363). 이어서 이들 siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 푸는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로 혼입되고, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 유도할 수 있도록 한다(문헌참조: Nykanen, 외, (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵을 유도한다(문헌참조: Elbashir, 외, (2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 생성되고 RISC 복합체의 형성을 촉진하여 표적 유전자, 즉, HTT 유전자의 침묵에 영향을 미치는 단일 가닥 RNA(ssRNA)(siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥)에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA"는 또한 전술한 것과 같은 RNAi를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체 내로 도입되는 단일 가닥 RNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제인 아르고너트(Argonaute) 2에 결합하여 표적 mRNA를 절단한다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15~30개 뉴클레오타이드이고 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 RNA의 설계 및 시험은 미국 특허번호 제8,101,348호 및 문헌[Lima 외, (2012) Cell 150:883~894]에 기술되어 있고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 본원에 기술된 임의의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기술된 것과 같거나 문헌[Lima 외, (2012) Cell 150:883~894]에 기술된 방법에 의해 화학적으로 변형 것과 같은 단일 가닥 siRNA으로서 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 및 방법에 사용하기 위한 “RNAi 제제”는 이중 가닥 RNA이고, 본원에서 “이중 가닥 RNAi 제제”, “이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자”, “dsRNA 제제” 또는 “dsRNA”로 지칭된다. 용어 “dsRNA”는 2개의 역평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭하고, 표적 RNA, 즉, HTT 유전자에 대해 “센스” 및 “안티센스” 배향을 가는 것으로 지칭된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사후 유전자-침묵 매커니즘을 통해 표적 RNA, 예를 들어 mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 본원에서 상세히 기술된 것과 같이, 각각 또는 양쪽 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 것과 같은 "RNAi 제제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있고; RNAi 제제는 다중 뉴클레오타이드에서 실질 적인 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형 뉴클레오타이드"는 독립적으로 변형 당 모이어티, 변형 뉴클레오타이드 간 결합, 또는 변형 뉴클레오염기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 용어 변형 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 간 결합, 당 모이어티 또는 뉴클레오염기에 대한, 예를 들어 작용기 또는 원자의 치환, 추가 또는 제거를 포괄한다. 본 발명의 제제에 사용하기에 적합한 변형은 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형의 분자에 사용된 것과 같은 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 “RNAi 제제”에 의해 포괄된다.
본 발명의 특정 구현예에서, RNAi 제제 내에 존재하는 경우, 데옥시-뉴클레오타이드의 포함은 변형 뉴클레오타이드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 원하는 표적 RNA의 특정 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있고, 길이가 약 15~36개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개 염기쌍, 예컨대 길이가 약 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 염기쌍의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19-21개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 21개 염기쌍이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 발명의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나 이들은 별도의 RNA 분자일 수 있다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄로 결합되어 있는 경우, 연결 RNA 쇄는 "헤어핀 루프"로서 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 이상의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드 또는 dsRNA의 표적 부위로 지향되지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 10개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 8개 이하의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4~10개의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4~8개 뉴클레오타이드일 수 있다.
dsRNA의 실질적으로 상보적인 2개의 가닥이 별도의 RNA 분자로 이루어지는 경우, 이들 분자는 그럴 필요는 없지만 공유 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄 이외의 수단에 의해 공유적으로 결합되어 있는 경우, (본원의 다른 곳에 정의된 특정 다른 구조가 또한 “링커”로서 지칭될 수 있다는 것이 주지되더라도) 결합 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 수는 dsRNA의 최단 가닥에서 듀플렉스 내에 존재하는 임의의 오버행을 제외한 뉴클레오타이드의 수이다. 듀플렉스 구조 이외에, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. RNAi 제제의 일 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 구현예에서, RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제의 하나의 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 모두는 적어도 1개 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 dsRNA로, 이의 각각의 가닥은 독립적으로 표적 RNA 서열, 예를 들어, HTT 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지향하는 19~23개 뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 오버행"은 RNAi 제제, 예를 들어 dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘 어 확장되거나 그 반대의 경우, 뉴클레오타이드 오버행이 있다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안적으로, 오버행은 적어도 2개 뉴클레오타이드, 적어도 3개 뉴클레오타이드, 적어도 4개 뉴클레오타이드, 적어도 5개 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 0~3, 1~3, 2~4, 2~5, 4~10, 5~10 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에서 오버행된, 1~10개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 오버행은 10개 뉴클레오티드보다 더 긴, 예를 들어, 길이가 1~30개 뉴클레오타이드, 2~30개 뉴클레오타이드, 10~30개 뉴클레오타이드, 또는 10~15개 뉴클레오타이드보다 연장된 길이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다. 특정 구현예에서, 오버행은 오버행이 생리학적 조건 하에서 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자체 상보적인 부분을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 가닥의 저어도 하나의 말단은 듀플렉스 표적화 영역을 넘어 연장되어, 가닥 중 하나가 열역학적으로 안정한 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허번호 제8,513,207호 및 제8,927,705호, 및 국제특허번호 제2010033225호로, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로 인용됨). 이러한 구조는 (분자의 하나 또는 양 측면 상에) 단일 가닥 연장 및 이중 가닥 연장을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 모두를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 결합되고, 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 서열은 테트라루프 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 센스 가닥은 길이가 25~35개 뉴클레오타이드이다.
테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 이의 조합을 함유할 수 있다. 통상적으로, 테트라루프는 4 내지 5개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 루프는 GAAA로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 루프(GAAA)의 뉴클레오타이드의 적어도 하나는 뉴클레오타이드 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오타이드는 2'-변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 2 '-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-아미노디에톡시메탄올, 2'-아뎀, 및 2'-데옥시-2'-피오로--d-아라비노핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형이다. 일부 구현예에서, 루프의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 일부 구현예에서, GAAA 서열 중 G는 2'-OH를 포함한다. 일부 구현예에서, GAAA 서열 중 뉴클레오타이드 각각은 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, GAAA 서열 중 A 각각은 2'-OH를 포함하고, GAAA 서열 중 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 일부 구현예에서, GAAA 서열 중 A 각각은 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형을 포함하고, GAAA 서열 중 G는 2'-O-메틸 변형을 포함하거나; GAAA 서열 중 A 각각은 2'-아뎀 변형을 포함하고, GAAA 서열 중 G는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개공보 국제번호 제2020/206350호를 참조하고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
예시적인 2' 아뎀 변형 뉴클레오타이드는 아래에 도시된다:
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dsRNA와 관련하여 본원에 사용된 것과 같은 용어 “둔화” 또는 “둔화 말단”은 dsRNA의 소정의 말단에서 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 없는, 즉 뉴클레오타이드 오버행이 없음을 의미한다. dsRNA의 말단 중 하나 또는 모두는 둔화 말단일 수 있다. dsRNA의 말단 모두가 둔화인 경우, dsRNA는 둔화 말단인 것으로 일컬어진다. 명백하게, “둔화 말단화된” dsRNA는 양말단이 둔화인 dsRNA이고, 즉 분자의 어느 말단에도 뉴클레오타이드 오버행이 없다. 가장 흔하게, 그러한 분자는 그 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 것이다.
용어 “안티센스 가닥” 또는 “가이드 가닥”은 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA의 가닥을 지칭하며, 이는 표적 서열, 예를 들어, HTT mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함한다.
본원에 사용된 용어 “상보성 영역”은 서열, 예를 들어 본원에 정의된 표적 서열, 예컨대, HTT 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로 가장 허용되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어, RNAi 제제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3, 또는 2개 뉴클레오타이드 내에 있다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제는 안티센스 가닥 내에 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와 4개 이하의 미스매치를 포함하고, 예를 들어, 안티센스 가닥은 표적 mRNA와 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와 4개 이하의 미스매치를 포함하고, 예를 들어, 안티센스 가닥은 센스 가닥과 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제는 안티센스 가닥 내에 뉴클레오타이드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 센스 가닥은 안티센스 가닥과 4개 이하의 미스매치를 포함하고, 예를 들어, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 4, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 미스매치는, 예를 들어, iRNA의 3'-말단으로부터 5, 4, 3개 뉴클레오타이드 내에 있다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 미스매치는, 예를 들어, iRNA 제제의 3'-말단 뉴클레오타이드 내에 있다. 일부 구현예에서, 미스매치(들)는 씨드 영역 내에 있지 않다.
따라서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 표적 서열에 대해 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 3개 이하의 미스매치(즉, 3, 2, 1, 또는 0개 미스매치)를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제는 0개의 미스매치를 함유한다. 특정 구현예에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대해 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치는 선택적으로 상보성 영역의 5'-말단 또는 3'-말단으로부터 마지막 5개 뉴클레오타이드 내에 있는 것으로 제한될 수 있다. 예를 들어, 그러한 구현예에서, 23개 뉴클레오타이드 RNAi 제재의 경우, HTT 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로 중앙 13개 뉴클레오타이드 내에 임의의 미스매치를 함유하지 않는다. 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 표적 서열에 대해 미스매치를 함유하는 RNAi 제제가 HTT 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지를 결정할 수 있다. HTT 유전자의 발현을 억제하는데 있어서 미스매치를 갖는 RNAi 제제의 효능의 고려는 중요하며, 특히 HTT 유전자 내 상보성의 특정 영역이 집단 내 다형성 서열 변화를 갖는 것으로 공지된 경우 그러하다.
본원에 사용된 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥"은 용어가 본원에 정의된 것과 같이 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 제제의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용되는 것과 같이, 용어 "절단 영역"은 절단 부위에 바로 인접하여 위치하는 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 일어나는 표적 상의 부위이다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 있고 이에 바로 인접한 3개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단 상에 있고 이에 바로 인접한 2개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 10 및 11에 의해 결합되는 부위에서 발생하며, 절단 영역은 뉴클레오타이드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에 사용되는 것과 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 “상보적”은 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 설명하는 데 사용될 때, 당업자에 의해 이해될 수 있는 것과 같이, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 특정한 조건 하에서 듀플렉스 구조를 혼성화하고 형성하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다.
RNAi 제제 내의, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 dsRNA 내의 상보적인 서열은 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기쌍 형성을 포함한다. 그러한 서열은 본원에서 서로에 대해 “완전한 상보적”인 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원의 제2 서열과 관련하여 “실질적으로 상보적”으로서 언급되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 이들은 30개 이하의 염기쌍의 듀플렉스에 대한 혼성화 시, 하나 이상, 그러나 일반적으로 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 미스매칭된 염기쌍을 형성할 수 있는 한편, 이들의 궁극적인 적용, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제와 가장 관련된 조건하에서 혼성화하는 능력을 보유한다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 혼성화 시, 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계된 경우, 그러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 완전히 상보적인 21개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는, 길이가 21개 뉴클레오타이드인 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 길이가 23개 뉴클레오타이드인 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNA는 본원에 기술된 목적을 위해 “완전히 상보적”으로서 여전히 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 "상보적" 서열은 또한 혼성화하는 이들의 능력과 관련하여 위의 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-클릭(non-Watson-Crick) 염기쌍 또는 비-천연 및 변형 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다. 그러한 비-왓슨-클릭 염기쌍은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그슈타인(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이들의 사용과 관련된 문맥으로부터 이해되는 것과 같이, 본원의 용어 “상보적인”, “완전한 상보적인”, 및 “실질적으로 상보적인”은 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 “적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오타이드는 관심 대상의 mRNA(예를 들어, HTT를 암호화하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 서열이 HTT를 암호화하는 mRNA의 비-중단 부분에 실질적으로 상보적인 경우 HTT mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 HTT 서열에 완전히 상보적이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 안티센스 폴리고뉴클레오타이드는 표적 보체 성분 HTT 서열에 실질적으로 상보적이고, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1~5 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열의 등가 영역, 또는 서열번호 1~5 중 임의의 하나의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 HTT 서열에 실질적으로 상보적이고, 전체 길이에 걸쳐 표 2~5 중 임의의 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나, 또는 표 2~5 중 임의의 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나의 단편에 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 발명의 RNAi 제제는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인, 결국 표적 HTT 서열과 동일한 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6~10의 뉴클레오타이드 서열의 등가 영역, 또는 서열번호 6~10 중 임의의 하나의 단편에 적어도 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 발명의 iRNA는 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인, 결국 표적 HTT 서열에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이에 걸쳐 표 2~5 중 임의의 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나, 또는 표 2~5 중 임의의 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나의 단편에 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, HTT 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제는, 실질적으로 제1 세포 또는 세포 군과 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 군(대조군 세포)과 비교하여, HTT 유전자가 전사되고 HTT 유전자의 발현이 억제되도록 처리되거나 처리되지 않은 제1 세포 또는 세포 군으로부터 단리되거나 이에서 검출될 수 있는 HTT mRNA의 양의 감소로 평가된다. 억제 정도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
본원에 사용된 dsRNA와 같은 "RNAi 제제와 세포의 접촉"이라는 문구는 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. RNAi 제제와 세포의 접촉은 RNAi 제제와 시험관내 세포를 접촉시키는 것 또는 RNAi 제제와 생체내 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, RNAi 제제는 방법을 수행하는 개체에 의해 세포와 물리적 접촉에 놓일 수 있거나, 대안적으로, RNAi 제제는 후속적으로 세포와 접촉하도록 허용하거나 이를 야기하는 상황에 놓일 수 있다.
시험관내 세포와의 접촉은, 예를 들어, 세포를 RNAi 제제로 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 생체내 세포와의 접촉은, 예를 들어, RNAi 제제를 세포가 위치한 조직에 또는 이의 부근에 주사하여, 또는 RNAi 제제를 또 다른 영역, 예를 들어, 선택적으로 척추강내, 유리체내 또는 다른 주사를 통해, 중추신경계(CNS), 또는 혈류 또는 피하 공간으로 주사하여 제제가 후속적으로 접촉될 세포가 위치한 조직에 도달하도록함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNAi 제제는 관심 대상의 부위, 예를 들어, CNS에서 RNAi 제제를 지시하거나 다르게는 안정화시키는 리간드, 예를 들어, 아래에 기술되고, 예를 들어 본원에 참조로 인용된 PCT/US2019/031170에 상세히 추가로 기재된 친유성 모이어티 또는 모이어티들을 함유할 수 있거나 이에 결합될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 RNAi 제제와 시험관내 접촉될 수 있고, 후속적으로 대상체에 이식될 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제와 세포의 접촉은 세포 내로의 취득(uptake) 또는 흡수(absorption)를 촉진하거나 초래함으로써 "RNAi 제제를 세포 내로 도입" 또는 "전달하는 것"을 포함한다. RNAi 제제의 흡수 또는 취득은 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. RNAi 제제의 세포 내로의 도입은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입을 위해, RNAi 제제는 조직 부위에 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기천공 및 지질감염과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가의 접근법은 하기 본원에 기술되어 있거나 당업계에 공지되어 있다.
용어 “친유성” 또는 “친유성 모이어티”는 광범위하게 지질에 대해 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 친유성 모이어티의 친유성을 특징 분석하기 위한 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수인 logKow이며, 여기서 Kow는 평형 상태에서 2상 시스템의 수성 상에서 이의 농도에 대한 옥탄올 상에서의 화학물질 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 연구 측정된 성질이다. 그러나 제1원리 또는 경험적 방법을 사용하여 계산된 화학물질의 구조적 성분에 기인하는 계수를 사용하여 예측할 수도 있다(문헌참조: 예를 들어, Tetko 외, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407~21(2001), 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨). 이것은 물 보다 비수성 또는 유성 환경을 선호하는 물질의 경향(즉, 이의 친수성/친유성 균형)의 열역학 척도를 제공한다. 원칙적으로 화학 물질은 logKow가 0을 초과할 때 특징이 친유성이다. 통상적으로, 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과 또는 10 초과의 logKow를 보유한다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logKow는 대략 0.7인 것으로 예상된다. 동일한 방법을 사용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카바메이트의 logKow는 10.7인 것으로 예상된다.
분자의 친유성은 이것이 갖는 작용기와 관련하여 변화할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 하이드록실 군 또는 아민 군의 첨가는 친유성 모이어티의 분배 계수(예를 들어, logKow) 값을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 이의 단백질 결합 특성에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획은 이중 가닥 RNAi 제제의 상대적 소수성과 양의 상관관계가 있는 것으로 결정될 수 있고, 이는 이어서 이중 가닥 RNAi 제제의 침묵 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있다.
일 구현예에서, 결정된 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)이다. 이러한 결합 검정의 예시적인 프로토콜은 예를 들어, PCT/US2019/031170에 상세히 기재되어 있다. 결합 검정에서 미결합 siRNA의 분획으로 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 siRNA의 증진된 생체내 전달에 대해 0.15 초과이거나, 0.2 초과이거나, 0.25 초과이거나, 0.3 초과이거나, 0.35 초과이거나, 0.4 초과이거나, 0.45 초과이거나 0.5 초과이다.
따라서, 이중 가닥 RNAi 제제의 내부 위치(들)로 친유성 모이어티의 접합은 siRNA의 증진된 생체내 전달에 대해 최적의 소수성을 제공한다.
용어 “지질 나노입자” 또는 “LNP”는 핵산 분자, 예를 들어, RNAi가 전사되는 RNAi 또는 플라스미드와 같은 약제학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 소포이다. LNP는, 예를 들어, 미국 특허번호 제6,858,225호, 제6,815,432호, 제8,158,601호, 및 제8,058,069호에 기술되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, “대상체”는 영장류(예컨대, 사람, 비-사람 영장류, 예를 들어, 원숭이, 및 침팬지), 또는 비-영장류(예컨대, 랫트, 또는 마우스)를 포함하는 포유류와 같은 동물이다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 사람, 예컨대 HTT 발현의 감소로부터 혜택을 받을 질환, 장애 또는 병태를 치료받거나 평가받은 사람, HTT 발현의 감소로부터 혜택을 받을 질환, 장애 또는 병태의 위험에 처한 사람; HTT 발현의 감소로부터 혜택을 받을 질환, 장애 또는 병태를 가진 사람; 또는 본원에 기술된 HTT 발현의 감소로부터 혜택을 받을 질환, 장애 또는 병태를 치료받는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 여성 사람이다. 다른 구현예에서, 대상체는 남성 사람이다. 일 구현예에서, 대상체는 성인 대상체이다. 일 구현예에서, 대상체는 소아 대상체이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 청소년 대상체, 즉, 20세 연령 미만의 대상체이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 HTT 유전자 발현 또는 HTT 단백질 생성과 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상, 예를 들어, HTT 관련 질환, 예를 들어, 헌팅턴병의 완화 또는 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유익한 또는 목적하는 결과를 지칭한다. “치료”는 또한 치료의 부재하에 예상되는 생존률과 비교하여 생존률을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
대상체에서 HTT의 수준 또는 질환 마커 또는 증상과 관련하여 용어 “보다 낮은”은 그러한 수준에서 통계적으로 유의적인 감소를 지칭한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 감소는 적어도 20%이다. 특정 구현예에서, 감소는 질환 마커, 예를 들어, 단백질 또는 유전자 발현 수준에서 적어도 50%이다. 대상체에서 HTT 수준과 관련하여 “보다 낮은”은 바람직하게 그러한 장애가 없는 개체에 대한 정상 범위 내에 있는 것으로서 허용되는 수준으로의 감소이다. 특정 구현예에서, “보다 낮은”는 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 마커 또는 증상의 수준과 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준 사이의 차이의 감소, 예를 들어 비만인 개체와 정상 범위 내에서 허용되는 체중을 갖는 개체간의 체중에서의 감소 수준의 감소이다.
본원에서 사용되는 것과 같이, HTT 유전자의 발현 또는 HTT 단백질의 생산의 감소로부터 혜택을 받을, 질환, 장애 또는 이의 병태와 관련하여 사용될 때, “예방” 또는 “예방하는”은 대상체가 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상, 예를 들어 HTT 관련 질환의 증상을 발병할 가능성에서의 감소를 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태 발병의 실패 또는 그러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상의 발병 감소(예를 들어, 이러한 질환 또는 장애에 대한 임상적으로 허용되는 스케일에서 적어도 약 10% 감소, 또는 지연된 증상의 지연된 발현(예를 들어, 며칠, 몇 주, 몇 달 또는 몇 년)은 효과적인 예방으로 간주된다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "HTT 관련 질환" 또는 "HTT 관련 장애"는 HTT의 발현 및/또는 활성의 감소로부터는 혜택을 받을 임의의 질환 또는 장애로서 이해된다. 예시적인 HTT 관련 질환은 헌팅턴병을 포함한다.
HD, 헌팅턴 무도병, 마이어 무도병(Chorea Maior), 만성 진행성 무도병 및 유전성 무도병으로도 알려진 "헌팅턴병"은 무도증 운동과 진행성 지적 퇴화를 특징으로 하는 상염색체 우성 유전 장애로 보통 중년(35~50세)에 시작된다. 이 질환은 남녀 모두에게 균등하게 영향을 미친다. 미상핵이 위축되고 소세포 집단이 퇴화하며 신경전달물질인 감마-아미노부티르산(GABA) 및 물질 P의 수치가 감소한다. 이 위축은 CT 스캔에서 볼 수 있는 특징적인 “박스카 심실(boxcar ventricles)”을 초래한다.
HD의 증상 및 징후는 은밀하게 나타난다. HD의 가장 명백한 증상은 무도병이라고 하는 비정상적인 신체 운동과 협응력 부재이지만 여러 정신 능력과 성격의 일부 측면에도 영향을 미친다. 이들 신체적 증상은 일반적으로 40대에 눈에 띄게 나타나지만 모든 연령에서 발생할 수 있다. 발병 연령이 20세 미만인 경우 이는 청소년 HD로 알려져 있다.
무관심 및 과민성에서 본격적인 양극성 장애 또는 정신 분열증 장애에 이르는 치매 또는 정신 장애가 운동 장애에 선행하거나 진행 중에 발생할 수 있다. 무쾌감 또는 반사회적 행동이 첫 번째 행동 징후일 수 있다. 운동 징후에는 사지의 움직임, 쪼그려 앉는 걸음걸이, 운동 비지속성(혀 돌출과 같은 운동 행위를 지속할 수 없음), 안면 찡그림, 운동 실조 및 근긴장이상을 포함한다.
HD는 헌팅틴(HTT) 유전자의 트리뉴클레오타이드 반복 확장에 의해 유발되고 여러 폴리글루타민 확장(또는 PolyQ 확장) 질환 중 하나이다. 이것은 돌연변이 헌팅틴 단백질(mHtt)의 확장된 형태를 생성하여 뇌의 선택 영역에서 세포 사멸을 초래한다.
본원에서 사용된 것과 같이, “치료학적 유효량”은 HTT-관련 질환을 갖는 대상체에 투여되었을 때, (기존 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소, 완화, 또는 유지함으로써) 질환의 치료를 수행하기에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. “치료학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 및 그 중증도 및 치료 받을 대상체의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형, 및 기타 개별 특성에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용된 것과 같이, “예방학적 유효량”은 HTT-관련 장애를 갖는 대상체에 투여되었을 때, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화시키기에 충분한 RNAi 제제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 질환의 완화는 질환 과정을 서행시키거나 후기 발병 질환의 중증도를 감소시킴을 포함한다. “예방학적 유효량"은 RNAi 제제, 제제가 투여되는 방식, 질환 위험 정도, 및 치료 받을 대상체의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 경우에 따라 선행 또는 병용 치료의 유형, 및 기타 개별 특성에 따라 달라질 수 있다.
“치료학적-유효량” 또는 “예방학적 유효량”은 또한 합리적인 이득/위험 비율로 임의의 치료에 적용가능한 일부 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 제제의 양을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 RNAi 제제는 그러한 치료에 적용가능한 합리적인 이득/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
문구 “약제학적으로 허용가능한”은 본원에서 건전한 의학학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 사람 대상체 및 동물 대상체의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하며, 합리적인 이득/위험 비율에 상응하는 화합물, 물질(염을 포함), 조성물, 또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 문구 “약제학적으로 허용가능한 캐리어”는 대상 화합물을 한 기관, 또는 신체의 한 부분에서 또 다른 기관, 또는 신체의 다른 부분으로 운반하거나 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 캐리어는 제형의 다른 성분과 호환성일 수 있고 치료 받는 대상체에게 해를 끼치지 않는다는 점에서 "허용가능"해야만 한다. 약제학적으로 허용되는 캐리어로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예를 들어, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰 로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 겔라틴; (7) 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크; (8) 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어, 땅콩유, 면화씨유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 ; (12) 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 부재 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; (22) 벌크제, 예를 들어, 폴리펩타이드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예를 들어, 혈청 알부민, HDL 및 LDL; 및 (22) 약제학적 제형에 사용되는 다른 비독성 호환성 물질.
본원에서 사용되는 용어 “샘플”은 대상체로부터 분리된 유사한 체액, 세포 또는 조직뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 체액, 세포 또는 조직의 집합체를 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 뇌척수액, 안액, 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 샘플은 조직, 기관, 또는 국소 영역으로부터의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특정 기관, 기관의 일부 또는 해당 기관 내의 체액 또는 세포로부터 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 뇌 로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 전체 뇌 또는 뇌의 특정 분절, 예를 들어, 선조체 또는 뇌 내의 특정 유형의 세포, 예를 들어, 뉴런 및 신경아교 세포(성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포). 일부 구현예에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 수득된 혈액 또는 이로부터 유래된 혈장 또는 혈청을 지칭한 다. 추가의 구현예에서, “대상체로부터 유래된 샘플”은 대상체로부터 유래된 뇌 조직(또는 이의 서브성분) 또는 망막 조직(또는 이의 서브성분)을 지칭한다.
II. 본 발명의 RNAi 제제
HTT 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 제제가 본원에 개시된다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 대상체, 예를 들어 포유류, 예를 들어, HTT 관련 질환, 예를 들어, 헌팅턴병을 가진 사람 내의 세포와 같은 세포에서 HTT 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA는 HTT 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 길이가 약 15~30개 뉴클레오타이드 이하이다. HTT 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, RNAi 제제는 HTT 유전자(예를 들어, 사람 유전자, 영장류 유전자, 비-영장류 유전자)의 발현을 PCR 또는 분지형 DNA(bDNA) 기반 방법에 의해, 또는 단백질 기반 방법에 의해, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 유동 세포측정 기술을 사용한 면역형광 분석에 의한 검정 시 적어도 50%만큼 억제한다. 하나에서, 녹다운 수준은 이중-루시퍼라제 검정 방법을 사용하여 Cos7에서 검정된다.
dsRNA는 상보적이고, dsRNA가 사용될 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 혼성화하는 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 하나의 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열과 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 HTT 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래할 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 2개의 가닥은 적합한 조건 하에서 조합되는 경우 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성한다. 본원의 다른 곳에 기술되고 당업계에 공지된 것과 같이, dsRNA의 상보적 서열은 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 것과는 달리, 단일 핵산 분자의 자체-상보적 영역으로서 또한 함유될 수 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개 염기쌍, 예를 들어, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 길이가 21~22개 염기쌍이다. 특정 바람직한 구현예에서, 듀플렉스 구조는 길이가 18 내지 25개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-25, 21-24, 21-23, 21-22, 22-25, 22-24, 22-23, 23-25, 23-24 또는 24~25개 염기쌍, 예를 들어, 길이가 19~21개 염기쌍이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 발명의 일부인 것으로 고려된다.
유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이가 19~23개 뉴클레오타이드 또는 길이가 21-23개 뉴클레오타이드이다. 위에서 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이는 또한 발명의 일부인 것으로 고려된다.
일부 구현예에서, 듀플렉스 구조는 길이가 19 내지 30개 염기쌍이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 19 내지 30개 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, dsRNA는 길이가 15 내지 23개 뉴클레오타이드, 길이가 19 내지 23개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 25 내지 30개 뉴클레오타이드이다. 일반적으로, dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질로서 작용하기에 충분히 길다. 예를 들어, 약 21~23개 뉴클레오타이드보다 긴 dsRNA가 다이서에 대한 기질로 작용할 수 있다는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자가 또한 인지하는 것과 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 흔히 보다 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련되는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 그것이 RNAi-지시된 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되도록 하기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 일차 기능성 부분, 예를 들어, 약 15 내지 36개 염기쌍, 예를 들어, 15-36, 15-35, 15-34, 15-33, 15-32, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 또는 21~22개 염기쌍, 예를 들어 19~21개 염기쌍의 듀플렉스 영역이라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일 구현예에서, 절단을 위해 원하는 RNA를 표적화하는, 예를 들어, 15-30개 염기쌍의 기능성 듀플렉스로 가공되는 정도로, RNA 분자 또는 30개 초과의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 일 구현예에서, miRNA가 dsRNA임을 인지할 것이다. 또 다른 구현예에서, dsRNA는 자연적으로 발생하는 miRNA가 아니다. 또 다른 구현예에서, HTT 발현을 표적화하는데 유용한 RNAi 제제는 더 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본원에 기술된 dsRNA는 추가로 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오타이드 오버행, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
dsRNA는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 발명의 이중 가닥 RNAi 화합물은 2단계 과정을 사용하여 제조될 수 있다. 첫번째로, 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥은 별도로 제조된다. 이어서, 성분 가닥은 어닐링된다. siRNA 화합물의 개별 가닥은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리 고뉴클레오타이드 가닥을 용이하게 제조할 수 있다는 이점을 제공한다. 유사하게, 발명의 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열, 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. HTT에 대한 센스 가닥 서열은 표 2~5 중 어느 하나에 제공된 서열 군으로부터 선택될 수 있고, 센스 가닥의 안티센스 가닥의 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 표 2~5 중 어느 하나의 서열 군으로부터 선택될 수 있다. 본 양태에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 다른 하나에 상보적이고, 서열 중 하나는 실질적으로 HTT 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 상보적이다. 이와 같이, 본 양태에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드는 표 2~5 중 어느 하나에서 센스 가닥(패신저 가닥)으로서 기술되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 표 2~5 중 어느 하나에서 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥(가이드 가닥)으로서 기술된다.
일 구현예에서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 별도의 올리고뉴클레오타이드 상에 함유된다. 또 다른 구현예에서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 단일 올리고뉴클레오타이드 상에 함유된다.
표 2~5의 서열의 일부가 변형되거나 접합된 서열로서 기술되지 않았지만, 본 발명의 RNAi 제제, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA의 RNA는 표 2~5 중 어느 하나에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 이는 본원에 기술된 것과 상이하게 변형되지 않거나, 접합되지 않거나, 또는 접합된 것이다. 예를 들어, 표 3에 도시된 본 발명의 제제의 센스 가닥이 C16 리간드에 접합되었지만, 본원에 기술된 것과 같이 이들 제제는 간으로의 전달을 지시하는 모이어티, 예를 들어 GalNAc 리간드에 접합될 수 있다. 친유성 리간드는 본 출원에 제공된 임의의 위치에 포함될 수 있다.
당업자는 약 20 내지 23개 염기쌍, 예를 들어, 21개 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 환영받고 있음을 잘 알고 있다(문헌참조: Elbashir 외, (2001) EMBO J., 20:6877~6888). 그러나, 다른 당업자들은 더 짧거나 더 긴 RNA 듀플렉스 구조가 또한 효과적일 수 있음을 밝혀냈다(문헌참조: Chu 및 Rana (2007) RNA 14:1714~1719; Kim 외 (2005) Nat Biotech 23:222~226). 전술된 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성에 의해, 본원에 기술된 dsRNA는 최소로 21개 뉴클레오타이드의 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 하나 또는 양 말단 상의 수개의 뉴클레오타이드만을 뺀 것을 갖는 더 짧은 듀플렉스가 전술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있는 것으로 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖고, Cos7 및 10nM 농도의 RNA 제제를 사용한 시험관내 검정 및 본원의 실시예에 제공된 것과 같은 PCR 검정을 사용하여 전체 서열을 포함하는 dsRNA로부터 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하의 억제에 의해 HTT 유전자의 발현을 억제하는 이들의 능력이 상이한 dsRNA가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
또한, 본원에 기재된 RNA는 RISC 매개된 절단에 민감한 HTT 전사체에서의 부위(들)를 식별한다. 이와 같이, 본 발명은 이러한 부위(들) 내에서 표적화하는 RNAi 제제를 추가로 특징으로 한다. 본원에 사용된 것과 같이, RNAi 제제는 RNAi 제제가 그 특정 부위 내 어느 곳에서의 전사체의 절단을 촉진시키는 경우, RNA 전사체의 특정 부위 내를 표적화하는 것으로 일컬어진다. 이러한 RNAi 제제는 일반적으로 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 19개 뉴클레오타이드를, HTT 유전자에서 선택된 서열에 연속하는 영역으로부터 취해진 추가의 뉴클레오타이드 서열에 커플링된 본원에 제공된 서열의 하나로부터 포함한다.
III. 본 발명의 변형 RNAi 제제
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 변형되지 않고, 예를 들어, 당업계에 공지되고 본원에 기술된 화학적 변형 또는 접합을 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 이로운 특징을 증진시킨다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. “실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형되”는 본 발명의 RNAi 제제는 대부분 변형되지만 완전히 변형되지는 않으며 5, 4, 3, 2개 이하의 미변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특징화된 핵산은 당업계에서 잘 확립된 방법, 예컨대 본원에 참조로 인용된, 문헌[“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. 외 (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것과 같은 방법들에 의해 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 말단 변형, 예컨대 5'-말단 변형(인산화, 접합, 역위 결합) 또는 3'-말단 변형(접합, DNA 뉴클레오타이드, 역위 결합, 등); 염기 변형, 예컨대 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기로의 대체, 염기(무염기 뉴클레오타이드), 또는 접합된 염기의 제거; 당 변형(예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기술된 구현예에 유용한 RNAi 제제의 특정 예는 변형 골격을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오타이드 간 결합을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형 골격을 갖는 RNA는 무엇보다 골격 내 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 그리고 당업계에서 때로 언급되는 것과 같이, 이들의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 갖지 않는 변형 RNA는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형 RNAi 제제는 이의 뉴클레오사이드 간 골격 내 인 원자를 가질 것이다,
변형 RNA 골격은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들 중 2'-5'-결합 유사체, 및 인접한 뉴클레오사이드 단위의 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 결합되는 역극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 발명의 일부 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 유리산 형태로 있다. 발명의 다른 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 염 형태로 있다. 일 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제는 나트륨 염 형태로 있다. 특정 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제가 나트륨 염 형태로 있는 경우, 나트륨 이온은 제제에 존재하는 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 군에 대한 역이온으로서 제제에 존재한다. 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합이 나트륨 역이온을 갖는 제제는 나트륨 역이온 없이 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 발명의 dsRNA 제제가 나트륨 염 형태로 있는 경우, 나트륨 이온은 제제에 존재하는 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 군에 대한 역이온으로서 제제에 존재한다.
전술한 인-함유 결합의 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허번호 RE39464호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형 RNA 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 결합; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격을 갖는 것들; 및 혼합 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타를 포함한다.
앞서 말한 올리고뉴클레오사이드의 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
다른 구현예에서, 적합한 RNA 모사체가 RNAi 제제에서 사용하기 위해 고려되며, 뉴클레오타이드 단위의 당 및 뉴클레오사이드 간 결합, 즉, 골격 둘 모두가 신규 군으로 대체된다. 염기 단위는 적당한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 성질을 갖는 것으로 나타난 RNA 모사체인 하나의 그러한 올리고머 화합물은 펩타이드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글라이신 골격으로 대체된다. 뉴클레오염기는 보유되고 직접적으로 또는 간접적으로 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다. 본 발명의 RNAi 제제에 사용하기에 적합한 추가 PNA 화합물은, 예를 들어, 문헌[Nielsen 외, Science, 1991, 254, 1497~1500]에 기술되어 있다.
본 발명에서 특징화된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오사이드, 그리고 특히 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서 천연 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨] 및 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,602,240호의 아미드 골격을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 특징화된 RNA는 위에서 참조된 미국 특허번호 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는다.
변형 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. RNAi 제제, 예를 들어, 본원에서 특징화된 dsRNA는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 구현예에서, dsRNA는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 군, 리포터 군, 삽입제, RNAi 제제의 약동학 성질을 개선시키기 위한 군, 또는 RNAi 제제의 약력학 성질을 개선시키기 위한 군, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨)(문헌참조: Martin 외, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486~504) 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 본원의 하기 실시예에 기술된 것과 같이 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 추가의 예시적인 변형은 다음을 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오타이드(이 세 패밀리의 R 및 S 이성체 모두); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA(N-메틸아세트아미드).
기타 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-헥사데실 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 RNAi 제제의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 결합된 dsRNA 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모사체를 가질 수 있다. 이러한 변형 당 구조물의 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이중 일부는 본 출원과 함께 일반적으로 소유된다. 이전 문헌의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 RNAi 제제는 또한 뉴클레오염기(종종 당업계에서 단순히 “염기”로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, “미변형” 또는 “천연” 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형 뉴클레오염기는 합성 및 천연 뉴클레오염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 아날 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 뉴클레오염기는 미국 특허번호 제3,687,808호에 개시된 것들, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858~859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌[Englisch 외, (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613]에 의해 개시된 것들, 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, 페이지 289~302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 의해 개시된 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오염기 중 일부는 특히 본 발명에서 특징화된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6~1.2°C 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌참조: Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때, 예시적인 염기 치환이다.
전술한 변형 뉴클레오염기뿐만 아니라 다른 변형 뉴클레오염기의 특정 제조를 교지하는 대표적인 미국 특허는 전술된 미국 특허번호 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 또한 하나 이상의 이환식 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. “이환식 당”은 인접하든 인접하지 않든, 2개의 탄소의 가교에 의해 형성된 고리에 의해 변형 후라노실 고리이다. “이환식 뉴클레오사이드”(“BNA”)는 인접하든 인접하지 않든, 당 고리의 2개의 탄소 원자의 가교에 의해 형성된 고리를 포함하는 당 모이어티를 가져 이환식 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오사이드이다. 특정 구현예에서, 가교는 당 고리의 4'-탄소 및 2'-탄소를, 선택적으로는 2'-비환식 산소 원자를 통해 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 발명의 제제는 하나 이상의 잠김 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 잠김 핵산은 변형 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드이고, 여기서 리보스 모이어티는 2' 및 4' 탄소를 결합하는 여분의 가교를 포함한다. 다시 말해, LNA는 4'-CH2-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드이다. 본 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 “잠근다”. siRNA로의 잠김 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프-표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Elmen, J. 외, (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439~447; Mook, OR. 외, (2007) Mol Canc Ther 6(3):833~843; Grunweller, A. 외, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185~3193). 발명의 폴리뉴클레오타이드에 사용하기 위한 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4'와 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오사이드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 제제는 4′에서 2′로의 가교를 포함하는 하나 이상의 이환식 뉴클레오사이드를 포함한다.
잠긴 뉴클레오사이드는 구조식(분리 입체화학)으로 나타낼 수 있고,
여기서 B는 뉴클레오염기 또는 변형 뉴클레오염기이고, L은 2'-탄소를 리보오스 고리의 4'-탄소에 결합하는 연결기이다. 이러한 4′에서 2′로의 가교 이환식 뉴클레오사이드의 예는 4′-(CH2)―O-2′ (LNA); 4′-(CH2)―S-2′; 4′-(CH2)2―O-2′ (ENA); 4′-CH(CH3)―O-2′(또한 “제한된 에틸” 또는 “cEt”로도 지칭됨) 및 4′-CH(CH2OCH3)―O-2′(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제7,399,845호를 참조함); 4′-C(CH3)(CH3)―O-2′(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,283호를 참조함); 4′-CH2―N(OCH3)-2′(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,425호를 참조함); 4′-CH2―O―N(CH3)-2′(예를 들어, 미국 공개번호 제2004/0171570호를 참조함); 4′-CH2―N(R)―O-2′, 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 질소 보호기(예를 들어, 미국 특허번호 제7,427,672호를 참조함); 4′-CH2―C(H)(CH3)-2′(문헌참조: 예를 들어, Chattopadhyaya 외, J. Org. Chem., 2009, 74, 118~134); 및 4′-CH2―C(CH2)-2′(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허번호 제8,278,426호를 참조함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이전 문헌의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
잠김 핵산 뉴클레오타이드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 공보는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 미국 특허번호 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,034,133; 제7,084,125호; 제7,399,845호; 제7,427,672호; 제7,569,686호; 제7,741,457호; 제8,022,193호; 제8,030,467호; 제8,278,425호; 제8,278,426호; 제8,278,283호; 미국 특허 공개번호 제2008/0039618호; 및 미국 특허 공개번호 제2009/0012281호로, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
예를 들어 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 구성을 갖는 임의의 전술한 이환식 뉴클레오시드를 제조할 수 있다(국제특허번호 제99/14226호를 참조함).
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 제한된 에틸 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "구속된 에틸 뉴클레오타이드" 또는 "cEt"는4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 이환식 당 모이어티를 포함하는 잠김 핵산이다(즉, L은 전술한 구조식에 있음). 일 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오타이드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태로 있다.
발명의 iRNA는 또한 하나 이상의 “형태적으로 제한된 뉴클레오타이드”(“CRN”)를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 결합하는 링커를 갖는 뉴클레오타이드 유사체이다. CRN은 리보스 환을 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 혼성화 친화성을 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보스 고리 퍼커링을 감소시키기에 충분한 길이이다.
전술된 CRN의 특정 제조를 교시하는 대표적인 공개 공보는 미국 공개번호 제2013/0190383호; 및 PCT 공개 공보 국제번호 제2013/036868호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 발명의 iRNA는 UNA(잠김 해제된 핵산) 뉴클레오타이드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 잠김 해제된 “당” 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(문헌참조: Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133~134 (2008) 및 Fluiter 외, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 참조로서 본원에 인용됨).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공개 공보는 미국 특허번호 제8,314,227호; 및 미국 특허 공개번호 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3'-포스페이트, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드, 예컨대 역 dT(idT), 역 dA(idA), 및 역 무염기성 2'-데옥시리보뉴클레오타이드(iAb) 및 기타를 포함할 수 있다. 이 변형의 개시내용은 국제특허번호 제2011/005861호에서 찾을 수 있다.
일 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단 말단은 역 dT(idT), 역 dA(idA), 또는 역 무염기성 2'-데옥시리보뉴클레오타이드(iAb)와 같은 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드에 결합된다. 일 특정예에서, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드는 본원에 기술된 센스 가닥의 3' 말단과 같은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결합되고, 여기서 결합은 3'-3' 포스포디에스테르 결합 또는 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 역 무염기성 리보뉴클레오타이드(iAb)에 결합된다. 또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 역 dA(idA)에 결합된다.
일 특정예에서, 역 2'-데옥시-변형 리보뉴클레오타이드는 본원에 기술된 센스 가닥의 3' 말단과 같은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결합되고, 여기서 결합은 3'-3' 포스포디에스테르 결합 또는 3'-3'-포스포로티오에이트 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시예에서, 센스 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 역 dA(idA)이고, 3'-3'-결합(예를 들어, 3'-3'-포스포로티오에이트 결합)을 통해 선행 뉴클레오타이드에 결합된다.
본 발명의 iRNA의 뉴클레오타이드의 기타 변형은 iRNA의 안티센스 가닥 상의 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 예를 들어, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는, 예를 들어, 미국 공개번호 제2012/0157511호에 개시되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 변형 RNAi 제제
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는, 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제공개번호 제2013/075035호에 개시된 것과 같은 화학적 변형을 갖는 제제를 포함한다. 본원 및 국제공개번호 제2013/075035에 나타낸 것과 같이, 보다 우수한 결과는 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥으로, 특히 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 도입함에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은 경우에 따라 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. RNAi 제제는 선택적으로 친유성 리간드, 예를 들어, 센스 가닥 상의, 예를 들어 C16 리간드와 접합될 수 있다. RNAi 제제는 선택적으로, 예를 들어, 안티센스 가닥의 하나 이상의 잔기 상에서 (S)-글리콜 핵산(GNA) 변형으로 변형될 수 있다. 생성된 RNAi 제제는 보다 우수한 유전자 침묵 활성을 제공한다.
따라서, 본 발명은 표적 유전자(즉, HTT 유전자)의 발현을 생체내 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다. RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 제제의 각각의 가닥은 길이가 15~30개 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 16~30개 뉴클레오타이드, 길이가 17~30개 뉴클레오타이드, 길이가 25~30개 뉴클레오타이드, 길이가 27~30개 뉴클레오타이드, 길이가 17~23개 뉴클레오타이드, 길이가 17~21개 뉴클레오타이드, 길이가 17~19개 뉴클레오타이드, 길이가 19~25개 뉴클레오타이드, 길이가 19~23개 뉴클레오타이드, 길이가 19~21개 뉴클레오타이드, 길이가 21~25개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 21~23개 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 가닥은 길이가 19~23개 뉴클레오타이드이다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 통상적으로 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성하며, 이는 본원에서 "RNAi 제제"로도 지칭된다. RNAi 제제의 듀플렉스 영역은 길이가 15~30개 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 길이가 16~30개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17~30개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 27~30개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17~23개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17~21개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17~19개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~25개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~23개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19~21개 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 21~25개 뉴클레오타이드 쌍, 또는 길이가 21~23개 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 및 27 뉴클레오타이드로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 19~21개 뉴클레오타이드 쌍이다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 하나 또는 둘 모두의 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 말단 모두에서 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑 군을 함유할 수 있다. 오버행은 길이가 1~6개 뉴클레오타이드, 예를 들어 길이가 2~6개 뉴클레오타이드, 길이가 1~5개 뉴클레오타이드, 길이가 2~5개 뉴클레오타이드, 길이가 1~4개 뉴클레오타이드, 길이가 2~4개 뉴클레오타이드, 길이가 1~3개 뉴클레오타이드, 길이가 2~3개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 1~2개 뉴클레오타이드일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레오타이드 오버행 영역은 길이가 2개의 뉴클레오타이드이다. 오버행은 한 가닥이 다른 가닥보다 길거나 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 추가 염기에 의해 결합되어 헤어핀을 형성하거나, 다른 비염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 오버행 영역에서의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로, 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 2'-당 변형 또는 미변형 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, TT는 어느 한 가닥의 어느 한 말단에 대해 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 모두에서 5'- 또는 3'- 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 가닥 모두의 3'-말단에 존재한다. 일 구현예에서, 이 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 구현예에서, 이 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 제제는 그 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 말단 또는 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단 말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단) 또는 그 반대로 위치한 둔화 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오타이드 오버행을 갖고, 5'-말단은 둔화 말단이다. 이론에 의해 국한되고자 하는 것 없이, 안티센스 가닥의 5'-말단에서 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서 비대칭 둔화 말단은 RISC 공정으로 로딩되는 가이드 가닥을 선호한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 길이가 19개 뉴클레오티드인 이중 말단 둔화말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8, 9에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 20개 뉴클레오타이드 길이인 이중 말단 둔화말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 10에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 적어도 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, RNAi 제제는 길이가 21개 뉴클레오타이드인 이중 말단 둔화말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 21개 뉴클레오타이드 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, RNAi 제제의 하나의 말단은 둔화인 한편, 다른 말단은 2개 뉴클레오타이드 오버행을 포함한다. 바람직하게, 2개 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 있다. 2개 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 경우, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 3번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 형성한 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, RNAi 제제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 갖는다. 일 구현예에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, 각각의 잔기는 독립적으로, 예를 들어, 교호(alternating) 모티프에서 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 변형된다. 선택적으로, RNAi 제제는 추가로 리간드(예를 들어, 친유성 리간드, 선택적으로는 C16 리간드)를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25~30개 뉴클레오타이드 잔기이고, 5' 말단 뉴클레오타이드(위치 1)에서 시작하여 제1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36~66개 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1~23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센 스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1~6개 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10~30개 연속 뉴클레오타이드를 포함하여, 10~30개 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬되는 경우 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하여, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스인 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개 리보뉴클레오타이드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이고; 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하며, 여기서 모티프의 적어도 하나는 절단 부위에서 또는 그 부근에서 일어난다. 안티센스 가닥은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 dsRNAi 제제는 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프와 적어도 25 내지 최대 29개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제1 가닥 및 최대 30개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단은 둔화 말단을 형성하고 제2 가닥은 제1 가닥보다 이의 3' 말단에서 1-4개 뉴클레오타이드 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25개 뉴클레오타이드이고, 제2 가닥은 RNAi 제제가 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 제2 가닥 길이의 적어도 19개 뉴클레오타이드를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이고, RNAi 제제의 다이서 절단이 우선 제2 가닥의 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, RNAi 제제는 추가로 리간드를 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥 내 절단 부위에서 일어난다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 또한 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥 내 절단 부위에서 또는 그 부근에서 일어난다.
길이가 17~23개 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 RNAi 제제의 경우, 안티센스 가닥의 절단 부위는 통상적으로 5'-말단으로부터 10, 11 및 12 위치 주변에 있다. 따라서 3개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10, 11 위치; 10, 11, 12 위치; 11, 12, 13 위치; 12, 13, 14 위치; 또는 13, 14, 15 위치에 일어날 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 안티센스 가닥 내 절단 부위는 또한 5'-말단으로부터 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 부근에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성할 때, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 센스 가닥 상에 3개의 뉴클레오타이드의 하나의 모티프와 안티센스 가닥 상에 3개의 뉴클레오타이드의 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오타이드 중복을 갖도록 정렬될 수 있고, 즉, 센스 가닥 내 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안티센스 가닥 내 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나와 염기쌍을 형성한다. 대안적으로, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있거나, 모든 3개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재할 수 있고, 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서 용어 "윙 변형"은 동일한 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 모티프로부터 분리된 가닥의 또 다른 부분에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 첫 번째 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학적 작용은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 경우, 화학적 작용은 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 첫 번째 모티프에 대해 하나의 말단에 존재하거나 리드(lead) 모티프의 어느 한 측면 상에 존재한다.
센스 가닥과 마찬가지로, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 변형을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 첫 번째 하나 또는 두 개의 말단 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 통상적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에서 듀플렉스 영역 내에 첫 번째 하나 또는 두 개의 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단 상에 있을 수 있고, 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 가질 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 정렬되어 하나의 가닥에서 각각 두 개의 변형이 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는 듀플렉스 영역의 하나의 말단 상에 있고; 하나의 가닥에서 각각 두 개의 변형이 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는 듀플렉스 영역의 다른 말단 상에 있고; 하나의 가닥에서 두 개의 변형이 리드 모티프의 양측 상에 있으며, 듀플렉스 영역에 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드의 중첩을 갖는다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 듀플렉스 내에서 표적과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만, 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 바람직하고; G:U는 G:C 보다 바람직하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기술된 것과 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성보다 바람직하다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 하기를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 처음 1, 2, 3, 4, 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다: A:U, G:U, I:C, 및 미스매치쌍, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼쌍 이외의 것 또는 범용 염기를 포함하는 쌍은 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진한다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2, 또는 3개 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
또 다른 구현예에서, 센스 가닥의 3'-말단에 뉴클레오타이드는 데옥시-티민(dT)이다. 또 다른 구현예에서, 안티센스 가닥의 3'-말단에 뉴클레오타이드는 데옥시-티민(dT)이다. 일 구현예에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 데옥시-티민 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2개의 dT 뉴클레오타이드의 짧은 서열이 있다.
일 구현예에서, 센스 가닥 서열은 화학식 I로 나타낼 수 있다:
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3' (I)
여기서:
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0~25개 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY, 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게 YYY는 모든 2'-F 변형 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일 구현예에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에서 존재한다. 예를 들어, dsRNAi 제제가 길이가 17~23개 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에서 존재할 수 있고(예를 들어, 위치 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 또는 11, 12, 13), 계수는 제1 뉴클레오타이드로부터, 5'-말단으로부터 시작하거나; 선택적으로, 계수는 듀플렉스 영역 내 제1 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 시작한다.
일 구현예에서, i는 1이고 j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i 및 j 둘 모두는 1이다. 센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); 또는
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
센스 가닥을 화학식 Ib로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Ic로 나타내는 경우, Nb는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥을 화학식 Id로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 구현예에서, i는 0이고, j는 0이고, 센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np- Na -YYY- Na-nq 3' (Ia).
센스 가닥을 화학식 Ia로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 II로 나타낼 수 있다:
5' nq'-Na′-(Z'Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′ 3' (II)
여기서:
k 및 l는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0~25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서 Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
및
X′X′X′, Y′Y′Y′, 및 Z′Z′Z′는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 구현예에서, Na' 또는 Nb'는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
Y′Y′Y′ 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다. 예를 들어, RNAi 제제가 길이가 17~23개 뉴클레오타이드인 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y′Y′Y′ 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 ; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있고, 계수는 제1 뉴클레오타이드로부터, 5'-말단으로부터 시작하거나; 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 바람직하게는, Y′Y′Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에서 발생한다.
일 구현예에서, Y′Y′Y′ 모티프는 모든 2'-OMe 변형 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, k는 1이고 l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k 및 l 둘 모두는 1이다.
안티센스 가닥은 따라서 하기의 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' nq'-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np' 3' (IIb);
5' nq'-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np' 3' (IIc); 또는
5' nq'-Na′- Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′- X′X′X′-Na′-np' 3' (IId).
안티센스 가닥을 화학식 IIb로 나타내는 경우, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥을 화학식 IIc로 나타내는 경우, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥을 화학식 IId로 나타내는 경우, 각각의 Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
또 다른 구현예에서, k는 0이고 l은 0이고, 안티센스 가닥은 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (Ia).
안티센스 가닥을 화학식 IIa로 나타내는 경우, 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-하이드록실, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 각각의 X, Y, Z, X′, Y′ 및 Z′는 특히 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21 nt인 경우에 가닥의 9, 10, 및 11 위치에서 존재하는 YYY 모티프를 포함할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 포함할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe-변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12, 13에서 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 포함할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 제1 쌍형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 포함할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe-변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
위의 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id 중 어느 하나에 의해 나타낸 센스 가닥은 듀플렉스를 형성하고, 여기서 안티센스 가닥은 각각 화학식 IIa, IIb, IIc, 및 IId 중 어느 하나에 의해 나타낸다.
따라서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖고, RNAi 듀플렉스는 하기 화학식 III에 의해 나타낸다:
센스: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np '-Na '-(X'X′X′)k-Nb '-Y′Y′Y′-Nb '-(Z′Z′Z′)l-Na '-nq ' 5'
(III)
여기서:
i, j, k, 및 l는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p′, q, 및 q′는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0~25개 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서:
여기서, 각각의 np', np, nq', 및 nq는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 구현예에서, i는 0이고 j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0 이고 j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 또 다른 구현예에서, k는 0이고 l는 0이거나; k는 1이고 l는 0이고; k는 0이고 l는 1이거나; k 및 I 둘 모두는 0이거나; k 및 I 둘 모두는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 화학식을 포함한다:
5' np - Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y′Y′Y′ -Na 'nq ' 5'
(IIIa)
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y′Y′Y′-Nb '-Z′Z′Z′-Na 'nq ' 5'
(IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np '-Na '-X′X′X′-Nb '-Y′Y′Y′-Na 'nq ' 5'
(IIIc)
5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '-X′X′X′-Nb '-Y′Y′Y′-Nb '-Z′Z′Z′-Na-nq ' 5'
(IIId)
RNAi 제제를 화학식 IIIa로 나타내는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 IIIb로 나타내는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1~10, 1~7, 1~5, 또는 1~4개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 IIIc로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2~20, 2~15 또는 2~10개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb 및 Nb '는 독립적으로 교호 패턴의 변형을 포함한다.
일 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np′ >0이고 적어도 하나의 np′는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합된다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np′ >0이고 적어도 하나의 np′는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커(후술됨)를 통해 부착된 하나 이상의 C16(또는 관련된) 모이어티에 접합된다. 또 다른 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIId로 나타내는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np′ >0이고 적어도 하나의 np′는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커(후술됨)를 통해 선택적으로 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어 C16(또는 관련된) 모이어티에 접합된다.
일 구현예에서, RNAi 제제를 화학식 IIIa로 나타내는 경우, Na 변형은 2′-O-메틸 또는 2′-플루오로 변형이고, np′ >0이고 적어도 하나의 np′는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 결합을 통해 결합되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커(후술됨)를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어 C16(또는 관련된) 모이어티에 접합된다.
일 구현예에서, RNAi 제제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 결합된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 결합된다. 링커는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 선택적으로, 다량체는 추가로 리간드를 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId로 나타낸 2개의 RNAi 제제는 5' 말단, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 모두에서 서로 결합되고, 선택적으로 리간드에 접합된다. 제제의 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 제제의 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
다양한 공보는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 제제를 기술한다. 이러한 공개 공보는 국제특허번호 제2007/091269호, 제2010/141511호, 제2007/117686호, 제2009/014887호, 및 제2011/031520호; 및 미국 특허번호 제7858769호를 포함하고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본원에 기술된 것과 같은 RNAi 제제의 비닐 포스포네이트(VP) 변형을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 발명의 5'-비닐 포스포네이트 변형 뉴클레오타이드는 하기의 구조를 갖는다:
여기서 X는 O 또는 S이고;
R은 수소, 하이드록시, 플루오로, 또는 C1-20알콕시(예를 들어, 메톡시 또는 n-헥사데실옥시)이고;
R5'은 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)으로 있고;
B는 뉴클레오염기 또는 변형 뉴클레오염기이고, 선택적으로 여기서 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
일 구현예에서, R5'은 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 배향이다. 또 다른 구현예에서, R은 메톡시이고, R5'는 =C(H)-P(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 배향이다. 또 다른 구현예에서, X는 S이고, R은 메톡시이고, R5'는 =C(H)-P(O)(OH)2이며, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 배향이다.
본 발명의 비닐 포스포네이트는 본 발명의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 비닐 포스포네이트는, 선택적으로, dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에서 dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다.
비닐 포스포네이트 변형은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 위해 고려된다. 예시적인 비닐 포스포네이트 구조는 선행하는 구조를 포함하며, 여기서 R5'는 =C(H)-OP(O)(OH)2이고, C5' 탄소와 R5' 사이의 이중 결합은 E 또는 Z 배향(예를 들어, E 배향)이다.
i. 열 불안정화 변형
특정 구현예에서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 시드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9에서) 열 불안정화 변형을 혼입시켜 오프-타겟 유전자 침묵을 감소시키거나 억제함으로써 RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA가 오프-표적 유전자 침묵 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내 듀플렉스의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상)의 열 불안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2~9, 또는 바람직하게는 위치 4~8에 위치한다. 일부 추가의 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형(들)은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 6, 7 또는 8에 위치한다. 또 일부 추가의 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 7에 위치한다. 용어 “열 불안정화 변형(들)”은 보다 낮은 전체 용융 온도(Tm)(바람직하게, 이러한 변형(들)을 갖지 않는 dsRNA의 Tm 보다 1, 2, 3 또는 4도 낮은 Tm)을 갖는 dsRNA를 생성시키는 변형(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 2, 3, 4, 5 또는 9에 위치한다.
열 불안정화 변형들은 무염기 변형; 반대 가닥에 반대 뉴클레오타이드를 갖는 미스매치; 및 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 예를 들어, 잠김 해제된 핵산(UNA), 또는 글리콜 핵산(GNA)과 같은 당 변형; 및 2'-5'-결합된 리보뉴클레오타이드(“3'-RNA”)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
예시된 무염기 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
여기서 R = H, Me, Et 또는 OMe이고; R' = H, Me, Et 또는 OMe이고; R” = H, Me, Et 또는 OMe이고
여기서 B는 변형되거나 미변형 뉴클레오염기이다.
예시된 당 변형은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
여기서 B는 변형되거나 미변형 뉴클레오염기이다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서 B는 변형되거나 미변형 뉴클레오염기이고 각각의 구조 상에 별표는 R, S 또는 라세미체를 나타낸다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서 B는 변형되거나 미변형 뉴클레오염기이고 별표는 R, S 또는 라세미체(예를 들어, S)를 나타낸다.
용어 “비환형 뉴클레오타이드”는 비환형 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하고, 예를 들어, 여기서, 리보스 탄소 간의 임의의 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')은 부재이거나 리보스 탄소 또는 산소 (예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합으로 뉴클레오타이드가 부재이다. 일부 구현혜에서, 비환형 뉴클레오타이드는 , , , 또는 이고, 여기서 B는 변형되거나 미변형 뉴클레오염기이고, R1 및 R2는 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 용어 “UNA”는 잠김 해제된 비환형 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 잠김 해제된 “당” 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2' 및 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거된다(문헌참조: Mikhailov 외, Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); 및 Fluiter 외, Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009), 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 비환형 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성에 영향을 주는 것 없이 보다 큰 골격 가요성을 제공한다. 비환형 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 결합을 통해 결합될 수 있다.
용어 'GNA'는 글리콜 핵산을 지칭하며 이는 DNA 또는 RNA과 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 결합된 반복 글리세롤 유닛으로 이루어진다는 점에서 이의 “골격”의 조성이 상이하다.
듀플렉스의 열 불안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 열 불안정화 뉴클레오타이드와 반대 가닥 내 반대 뉴클레오타이드 간의 미스매치(즉, 비상보성 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이의 조합을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 미스매치 염기쌍 형성은 또한 본 발명에 적합할 수 있다. 미스매치는 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 존재할 수 있고, 즉, 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당에 대한 변형과는 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 뉴클레오염기 사이에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, dsRNA 분자는 2'-데옥시 뉴클레오염기인, 미스매치 쌍형성에서 적어도 하나의 뉴클레오염기를 포함하고; 예를 들어, 2'-데옥시 뉴클레오염기는 센스 가닥 내 존재한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 상보적 염기로의 손상된 W-C H-결합을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다:
.
무염기 뉴클레오타이드, 비환형 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA 포함) 및 미스매치 변형의 보다 많은 예는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제특허번호 제2011/133876호에 상세히 기재되었다.
열 불안정화 변형은 또한 반대 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범용 용기, 및 포스페이트 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 반대 가닥에서 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전히 폐지된 뉴클레오염기 변형과 같은 비카노니칼 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 뉴 클레오염기 변형은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제특허번호 제2010/0011895호에 기재된 것과 같이 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 불안정화에 대해 평가되었다. 예시적인 뉴클레오염기 변형은 다음과 같다:
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열 불안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 염기에 상보적인 하나 이상의 α-뉴클레오타이드를 포함한다:
여기서 R은 H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 또는 O-알킬이다.
천연 포스포디에스테르 결합과 비교하여 dsRNA 듀플렉스의 열 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적인 포스페이트 변형은 다음과 같다:
R 군에 대한 알킬은 C1-C6알킬일 수 있다. R 군에 대한 특이적 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자가 인식하는 것과 같이, 뉴클레오염기의 기능적 역할의 관점에서 본 발명의 RNAi 제제의 특이성을 정의하는 반면 뉴클레오염기 변형은 예를 들어, 오프-표적 효과에 상대적으로 온-표적 효과를 증진시킬 목적을 위해 본원에 기재된 것과 같이 다양한 방식으로 수행되어, 예를 들어, 불안정화 변형을 본 발명의 RNAi 제제로 도입할 수 있고, 다양한 범위의 변형이 가용하고, 일반적으로 본 발명의 RNAi 제제 상에 존재시 비-뉴클레오염기 변형, 예를 들어 폴리리보뉴클레오티드의 당 군 또는 포스페이트 골격에 대한 변형에 대해 훨씬 더 큰 경향이 있다. 이러한 변형은 본 개시내용의 다른 섹션에서 보다 상세히 기재되고 명백하게 본 발명의 RNAi 제제에 대해 전술된 또는 본원의 다른 곳에 기재된 것과 같은 본래의 뉴클레오염기 또는 변형 뉴클레오염기를 소유하는 것으로 고려된다.
열 불안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥에 더해, dsRNA는 또한 하나 이상의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어,dsRNA는 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 제한 없이, 안정화 변형은 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다. 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 안정화 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 안정화 변형 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14 및 16에 안정화 변형을 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 14 및 16에 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 안정화 변형을 포함한다. 예를 들어, 안정화 변형은 불안정화 변형의 5'-말단 또 는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 안정화 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 10 및 11에 안정화 변형을 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10 및 11에 안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 안정화 변형의 블록을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 변형을 포함하지 않는다.
예시적인 열 안정화 변형은 2'-플루오로 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 열 안정화 변형은 LNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 4개(예를 들어, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 2'-플루오로 뉴클레오타이드 모두는 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드상에 존재할 수 있거나; 각각의 2'-플루오로 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 2'-플루오로 변형 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 6, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 또 다른 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 2, 14, 및 16에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형에 인접하게 적어도 하나의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 불안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각에서, 즉 불안정화 변형의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 불안정화 변형의 3'-말단에서, 즉, 불안정화 변형의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 2'-플루오로 변형은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스는 5'-말단으로부터 위치 7, 10, 및 11에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 위치 7, 9, 10, 및 11에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 2, 3, 또는 4개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드의 블록을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 변형과 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 21개 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드(nt) 안티센스를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9에) 존재하고, dsRNA의 하나의 단부는 둔화인 반면, 다른 단부는 2 뉴클레오타이드 오버행을 포함하고, dsRNA는 다음의 특징 중 선택적으로 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; 및 (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 포함. 바람직하게, 2개 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스의 3'-말단에 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기에서: 센스 가닥은 길이가 25~30개 뉴클레오타이드 잔기이고, 5'말단 뉴클레오타이드(위치 1)에서부터 시작하여, 상기 센스 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36~66개 뉴클레오타이드 잔기이고, 3'말단 뉴클레오타이드에서부터 시작하여, 센스 가닥의 위치 1~23와 쌍을 형성하는 위치에서 적어도 8개 리보뉴클레오타이드는 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연소 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않음으로써 1~6개 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10~30개의 연속 뉴클레오타이드로부터 포함함으로써, 10~30개 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때, 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성함으로써, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개 리보뉴클레오타이드를 따라 포적 RNA에 충분히 상보적이어서 상기 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키고; 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9에) 존재한다. 예를 들어, 열 불안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5' 말단의 위치 14~17과 반대 또는 상보적인 위치 사이에서 발생하고, dsRNA는 다음의 특징 중 선택적으로 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4, 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; 및 (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함, 및 (vii) dsRNA는 길이가 12~30 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 상기 dsRNA 분자는 길이가 적어도 25개 및 최대 29개 뉴클레오타이드인 센스 가닥 및 길이가 최대 30개 뉴클레오타이드인 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5'말단으로부터 위치 11에서의 효소 분해에 민감한 변형 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 센스 가닥의 3' 말단 및 상기 안티센스 가닥의 5' 말단은 둔화 말단을 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 센스 가닥보다 3' 말단에서 1~4개 뉴클레오타이드가 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25개 뉴클레오타이드이고, 상기 안티센스 가닥은 상기 dsRNA 분자가 포유류 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 적어도 19 뉴클레오타이드의 상기 안티센스 가닥 길이를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이며, 상기 dsRNA의 다이서 절단은 우선적으로 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 말단을 포함하는 siRNA를 초래하고, 이에 따라, 포유동물에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에(즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 2~9에) 존재하며, dsRNA는 다음의 특징 중 선택적으로 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드와 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4, 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 포함; 및 (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고, 및 (vii) dsRNA는 길이가 12~29 뉴클레오타이드 쌍인 듀플렉스 영역을 가짐.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있으며, 이는 비-결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 성분, 예를 들어, 리보스 당의 2'하이드록실의 변경; 포스페이트 모이어티를 "데포스포" 링커로 대량 대체; 천연 발생 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 포함할 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체이므로, 많은 변형, 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티의 변형, 또는 포스페이트 모이어티의 비-결합 O이 핵산 내에서 반복되는 위치에서 발생한다. 일부 경우에, 변형은 핵산 내의 모든 대상체 위치에서 발생하지만, 많은 경우에 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3'- 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-결합 O 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역 내, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'- 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 향상시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 변형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대리물을 단일 가닥 오버행에, 예를 들어, 5'- 또는 3'-오버행에, 또는 둘 모두에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서 3' 또는 5' 오버행의 염기 모두 또는 일부는, 예를 들어, 본원에 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 당업계에 공지된 변형을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 뉴클레오염기의 리보당 대신 변형 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 군에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
적어도 2개의 상이한 변형은 통상적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 그러한 2개의 변형은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 비환형 뉴클레오타이드 또는 기타일 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티 센스 가닥 각각은 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이하게 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 뉴클레오타이드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE) 뉴클레오타이드, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 뉴클레오타이드 또는 2'-ara-F 뉴클레오타이드로 독립적으로 변형된다. 다시, 이들 변형은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 특히 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에서 교호 패턴의 변형을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "교호 모티프” 또는 “교호 패턴”은 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 한 가닥의 교호 뉴클레오타이드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오타이드는 하나 걸러 뉴클레오타이드 당 하나 또는 3개 뉴클레오타이드 당 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C 각각이 뉴클레오타이드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 모티프는 “ABABABABABAB…,” “AABBAABBAABB…,” “AABAABAABAAB…,” “AAABAAABAAAB…,” “AAABBBAAABBB…,” 또는 “ABCABCABCABC…,” 등일 수 있다.
교호 모티프에 포함된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 각각이 뉴클레오타이드 상에 한 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 하나 걸러 뉴클레오타이드 상의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 “ABABAB…”, “ACACAC…” “BDBDBD…” 또는 “CDCDCD…,” 등과 같은 교호 모티프 내 변형의 몇 가지 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNAi 분자는 전환한 안티센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 전환(shift)은 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형 군이 안티 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형 군에 상응하도록 할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 "ABABAB"로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'에서 5'로 "BABABA"로 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 “AABBAABB”로 시작할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'에서 5'로 “BBAABBAA”로 시작할 수 있어 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 변형 패턴의 완전하거나 부분적인 전환이 있다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 “ABABAB”이며, 여기서 각각의 A는 미변형 리보뉴클레오타이드이고 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 “ABABAB”이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
또 다른 특정 예에서, 안티센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 “BABABA”이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 “ABABAB”이고, 안티센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 “BABABA”이며, 여기서 각각의 A는 미변형 리보뉴클레오타이드이고 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
하나의 특정 예에서, 센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 5'에서 3'로 “ABABAB”이고, 안티센스 가닥에서의 교호 모티프는 가닥의 3'에서 5'로 “BABABA”이며, 여기서 각각의 A는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 각각의 B는 2'-O메틸 변형 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 dsRNA 분자는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 가닥의 임의의 위치의 센스 가닥, 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 임의의 뉴클레오타이드 상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있고; 각각의 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있고; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오타이드 간 결합 변형 둘 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드 간 결합 변형의 교호 패턴에 상대적인 전환을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드 간 결합 변형은 또한 오버행 뉴클레오타이드를 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 결합하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있고, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드를 오버행 뉴클레오타이드 옆에 있는 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드와 결합하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다. 바람직하게, 이들 말단 3개 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 2 내지 10개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 1~10개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 2개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 3개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 4개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 5개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 6개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 7개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 8개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 또는 4개 포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합에 의해 분리되는 9개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 2개 블록을 포함하고, 여기에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합의 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 위치하고 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드 간 결합 중 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 결합을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들)의 1~10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 말단 또는 말단 모두에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 또는 안티센스 가닥의 각각의 듀플렉스의 내부 영역의 1~10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드는 센스 가닥의 5 '-말단으로부터 계수하여 듀플렉스 영역의 위치 8~16에서 포스포로티오에이트 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 통해 결합될 수 있고; dsRNA 분자 는 선택적으로 말단 위치(들)의 1~10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1 내지 5개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형(들) 및 위치 18~23 내 1 내지 5개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형(들), 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1 내지 5개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1 내지 5개를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1~5 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 18~23 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 18~23 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 20 및 21에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 20 및 21에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21 및 22에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 21 및 22에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 22 및 23에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형 및 위치 21에서 1개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형, 및 안티센스 가닥의 (5'-말단으로부터 계수하여) 위치 1 및 2 내 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들 및 위치 23 및 23에서 2개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합 변형들을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 골격 키랄 중심 패턴을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 5개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 6개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 7개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 8개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 9개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 16개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 17개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 18개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 19개의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 3개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 (비제한적인 예로서, 포스포디에스테르) 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 3개 이하의 뉴클레오타이 드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 2개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 1개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 골격 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오타이드 간 결합 및 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드 간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, Sp 배위에서 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 구현예에서, Rp 배위에서 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 구현예에서, 키랄이 아닌 뉴클레오타이드 간 결합은 선택적으로 연속성이거나 연속성이 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 블록을 포함하고 이는 입체화학 블록이다. 일부 구현예에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 결합이 Rp인 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Rp 블록이다. 일부 구현예에서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오타이드 간 결합이 Sp인 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 및 Sp 블록 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Sp 블록이 아닌 하나 이상의 Rp를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 블록이 아닌 하나 이상의 Sp를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 PO 블록을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오타이드 간 결합은 천연 포스페이트 결합이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 5'-블록을 포함하고 이는 Sp 블록이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 변형 뉴클레오타이드 간 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 포스포로티오에이트 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에 서, 5'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5 '-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 변형 뉴클레오타이드 간 결합이고, 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에 서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오타이드 간 결합 각각은 포스포로티오에이트 결합이고 각각의 당 모이어티는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 특정 영역에서 한 유형의 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 이어서 특정 유형의 뉴클레오타이드 간 결합, 예를 들어, 천연 포스페이트 결합, 변형 뉴클레오타이드 간 결합, Rp 키랄 뉴클레오타이드 간 결합, Sp 키랄 뉴클레오타이드 간 결합 등을 포함한다. 일부 구현예에서, A에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, A에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, A에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, U에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, C에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, G에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 Rp가 있다. 일부 구현예에서, C 및 U에 이어서 천연 포스페이트 결합(PO)이 있다. 일부 구현예에서, A 및 G에 이어서 Sp가 있다. 일부 구현예에서, A 및 G에 이어서 Rp가 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 21와 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9)에 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, dsRNA는 선택적으로 다음의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 3, 4, 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드에 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; (vii) dsRNA는 길이가 12~40개 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 가짐.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9)에 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, dsRNA는 선택적으로 다음의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 센스 가닥은 리간드에 접합; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개 2'-플루오로 변형을 포함; (iv) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; (vi) dsRNA는 길이가 12~40개 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함; (vii) dsRNA는 길이가 12~40개 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 가짐.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9)에 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, dsRNA는 선택적으로 다음의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (iii) 센스 가닥은 리간드에 접합; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개 2'-플루오로 변형을 포함; (v) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; (vii) dsRNA는 길이가 12~40개 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 가짐.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 위치 1과 2 사이, 뉴클레오타이드 위치 2와 3 사이, 뉴클레오타이드 위치 21과 22 사이, 및 뉴클레오타이드 위치 22와 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 위치 2~9)에 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 변형을 포함하고, dsRNA는 선택적으로 다음의 특징 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개 2'-플루오로 변형을 포함; (ii) 센스 가닥은 리간드에 접합; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개 2'-플루오로 변형을 포함; (iv) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함; (vi) dsRNA는 길이가 12~40개 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함; 및 (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-말단에 둔화 말단을 가짐.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 듀플렉스 내에서 표적과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만, 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 바람직하고; G:U는 G:C 보다 바람직하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기술된 것과 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성보다 바람직하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 하기를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에서 처음 1, 2, 3, 4, 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다: A:U, G:U, I:C, 및 미스매치쌍, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼쌍 이외의 것 또는 범용 염기를 포함하는 쌍은 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2, 또는 3개 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의의 위치에서 4'-변형 또는 5'-변형 뉴클레오타이드의 디뉴클레오타이드의 포스포티에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 또는 포스포로디티오에이트(PS2) 결합의 3'-말단으로의 도입이 뉴클레오타이드 간 결합에 대한 입체 효과를 나타낼 수 있어 뉴클레아제에 대해 이를 보호하거나 안정화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 5'-변형 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입된다. 예를 들어, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입될 수 있다. 리보스 당의 5' 위치에서 알킬 군은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-변형 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입된다. 예를 들어, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입될 수 있다. 리보스 당의 4' 위치에서 알킬 군은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 대안적으로, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에서 도입될 수 있다. 리보스 당의 4'-O-아킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오사이드는 5'-메틸 뉴클레오사이드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 4'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 변형은 dsRNA의 효능을 유지시키거나 개선시킨다. 5'-알킬은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화된 뉴클레오사이드는 4'-O-메틸 뉴클레오사이드이다. 4'-O-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 2'-5' 결합(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖고 P=O 또는 P=S)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 결합 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나, 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖는 L 리보스, L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 L 당 변형을 사용하여 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 센스 가닥의 안티센스 가닥으로의 결합을 억제할 수 있거나, 센스 가닥의 5' 말단에서 사용하여 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피할 수 있다.
다양한 공개 공보는 모두 본 발명의 dsRNA와 함께 사용될 수 있는 다량체 siRNA를 기재한다. 이러한 공개 공보는 국제특허번호 제2007/091269호, 미국 특허번호 제7858769호, 국제특허번호 제2010/141511호, 제2007/117686호, 제2009/014887호, 및 제2011/031520호를 포함하고 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
하기에서 더 상세히 기술된 것과 같이, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 RNAi 제제로의 접합을 함유하는 RNAi 제제는 RNAi 제제의 하나 이상의 성질을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 RNAi 제제의 변형 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들어, dsRNA 제제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물(바람직하게는, 환형) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 그렇게 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본원에서 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 환형(cyclic) 캐리어는 카보사이클릭 고리 시스템일 수 있고, 즉, 모든 고리(ring) 원자는 탄소 원자, 또는 헤테로사이클릭(heterocyclic) 고리 시스템이고, 즉, 하나 이상의 환 원자는 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소, 황일 수 있다. 환형 캐리어는 모노사이클릭(monocyclic) 고리 시스템일 수 있거나, 2개 이상의 고리, 예를 들어, 융합된 고리를 함유할 수 있다. 환형 캐리어는 완전히 포화된 고리 시스템일 수 있거나, 이것은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 캐리어는 (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착점"을 포함한다. 본원에 사용된 "골격 부착점"은 작용기, 예를 들어, 하이드록실 군, 또는 일반적으로 이를 위해 이용가능한 결합을 지칭하고, 이는 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어 황 함유 골격으로의 캐리어의 혼입에 적합하다. 일부 구현예에서 "테더링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는, 환형 캐리어의 구성 고리 원자, 예를 들어, 탄소 원자 또는 헤테로원자(골격 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고사카라이드, 및 폴리사카라이드일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 환형 캐리어로의 삽입 테더에 의해 연결된다. 따라서, 환형 캐리어는 종종 작용기, 예를 들어, 아미노 군을 포함하거나, 일반적으로 또 다른 화학적 실체, 예를 들어, 구성 환에 대한 리간드의 도입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공한다.
RNAi 제제는 캐리어를 통해 리간드에 접합될 수 있고, 여기서 캐리어는 환형 작용기 또는 비환형 작용기일 수 있고; 바람직하게는, 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페 라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린로부터 선택되고; 바람직하게는, 비환형 작용기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격으로부터 선택된다.
특정 구체적 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 표 2~5 중 어느 하나에 열거된 제제의 군으로부터 선택된 제제이다. 이들 제제는 추가로 리간드를 포함할 수 있다.
IV. 리간드에 접합된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은, 예를 들어, 세포로의 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 iRNA 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 결합하는 것을 포함한다. 이러한 리간드는 콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티(문헌참조: Letsinger 외., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553~6556), 콜산(문헌참조: Manoharan 외, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053~1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 외, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306~309; Manoharan 외, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765~2770), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 외, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533~538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 외, EMBO J, 1991, 10:1111~1118; Kabanov 외, FEBS Lett., 1990, 259:327~330; Svinarchuk 외, Biochimie, 1993, 75:49~54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 외, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654; Shea 외, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777~3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 외, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969~973), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 외, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651~3654), 또는 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 외, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229~237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 외, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923~937)이다.
특정 구현예에서, 리간드는 이것이 도입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 일부 구현예에서 리간드는, 예를 들어, 리간드가 부재인 종과 비교하여 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증진된 친화성을 제공한다. 통상적인 리간드는 듀플렉스 핵산에서 듀플렉스 쌍형성에 관여하지 않을 것이다.
리간드는 천연 발생 물질, 예컨대 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린, 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L- 락티드-코-글리콜화된) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는 다음을 포함한다: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염 또는 α 나선 펩타이드.
리간드는 또한 표적화 군, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화 제제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 콩팥 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화 군은 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토스아민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체일 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 다가 갈락토스, 예를 들어, N-아세틸-갈락토사민이다.
리간드의 다른 예는 염료, 중간증량제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 삭피린), 다환 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-Bis-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르놀, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산,O3-(올레오일)리소콜산, O3-(올레오일)콜레산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나피디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진자(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어, 공동-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩타이드 종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N- 아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 미세소관, 마이크로필라멘트 또는 중간 필라멘트를 붕괴시킴에 의해 세포의 세포골격을 파괴함으로써 iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트린쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신, 또는 미오세빈일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제(PK 조절제)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 따라서, 짧은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 골격 내 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드도 본 발명에 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 적용될 수 있다. 또한, 혈청 성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한 본원에 기술된 구현예에서 PK 조절 리간드로서 사용하기에 적합하다.
발명의 리간드-접합 iRNA는 (하기에서 기술하는 것과 같이) 올리고뉴클레오타이드 상으로의 결합 분자의 부착으로부터 유래된 것과 같은 펜던트 반응성 관능기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 이러한 반응성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 이용가능한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 갖는 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 기기는 여러 판매업자에 의해 시판되고 있고, 예를 들어, Applied Biosystems®(포스터 시티, 캘리포니아)을 포함한다. 당업계에 공지된 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단은 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위한 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다.
본 발명의 리간드-접합된 올리고뉴클레오타이드 및 리간드-분자 함유 서열-특이적 결합된 뉴클레오시드에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 결합 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 접합 전구체, 이미 리간드 분자를 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-접합체 전구체, 또는 비-뉴클레오사이드 리간드-보유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 제조될 수 있다.
이미 결합 모이어티를 보유하는 뉴클레오사이드 접합 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 결합된 뉴클레오사이드의 합성은 통상적으로 완료되고, 리간드 분자는 결합 모이어티와 반응하여 리간드-접합 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 결합된 뉴클레오사이드는 상업적으로 이용가능하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미디트 및 비표준 포스포르아미디트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 접합체로부터 유래된 포스포르아미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질 접합체
특정 구현예에서, 리간드 또는 접합체는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 그러한 지질 또는 지질 기반 분자는 통상적으로 혈청 단백질, 예를 들어 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-콩팥 표적 조직으로의 접합체의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자는 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA로의 결합을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
지질-기반 리간드를 사용하여 접합체의 표적 조직으로의 결합을 조절, 예를 들어, 제어(예를 들어, 억제)할 수 있다. 예를 들어, 보다 강하게 HSA에 결합하는 지질 또는 지질-기반 리간드는 콩팥으로 표적화될 가능성이 적고 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 접합체를 콩팥에 표적화시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 지질-기반 리간드는 HSA에 결합한다. 예를 들어, 리간드는 충분한 친화성으로 HSA에 결합하여 비-콩팥 조직으로의 접합체의 분포가 증진될 수 있다. 그러나, 친화성은 통상적으로 HSA-리간드 결합이 역행될 수 없을 정도로 강하지 않다.
특정 구현예에서, 지질-기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 콩팝으로의 접합체의 분포가 증진될 것이다. 콩팥 세포를 표적화하는 다른 모이어티는 또한 지질-기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 특히 예를 들어 악성 또는 비악성 유형의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 암세포를 치료하는 데 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양물을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지질단백질(LDL)이 포함된다.
B. 세포 투과 제제
또 다른 양태에서, 리간드는 세포 투과 제제, 예를 들어 나선 세포 투과 제제이다. 특정 구현예에서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜모사체, 인버토머, 비펩타이드 또는 슈도-펩타이드 결합 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선 제제는 통상적으로 α-나선 제제이고 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 가질 수 있다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도모사체일 수 있다. (본원에서 올리고펩티도모사체라고도 지칭되는) 펩티도모사체는 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩할 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩타이드 및 펩티도모사체의 부착은 예를 들어, 세포 인지 및 흡착을 증진시킴에 의해 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도모사체 모이어티는 약 5~50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
펩타이드 또는 펩티도모사체는 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 이루어진)일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 구속된 펩타이드 또는 가교결합된 펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 11)를 갖는 RFGF이다. 소수 성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(서열번호 12))은 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 세포막에 걸쳐 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 포함하는 대형 극성 분자를 운반할 수 있는 “전달” 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질로부터의 서열(GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 13)) 및 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 14))은 전달 펩타이드로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩타이드 또는 펩티도모사체는 예를 들어, 파아지-디스플레이 라이브러리 또는 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 라이브러리로 식별된 펩타이드와 같은 DNA의 무작위 서열에 의해 암호화될 수 있다(문헌참조: Lam 외, Nature, 354:82~84, 1991). 통상적으로, 혼입된 단량체 단위를 통해 dsRNA 제제에 테터링된 펩타이드 또는 펩티도모사체는 아르지닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드, 또는 RGD 모방체와 같은 세포 표적화 펩타이드이다. 펩타이드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 성질을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기 기술된 임의의 구조적 변형이 사용될 수 있다.
발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 변형되어, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)로의 표적화를 촉진시킬 수 있다. RGD-함유 펩타이드 및 펩티도모사체는 합성 RGD 모방체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가로, 당업자는 인테그린 리간드를 표적화하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 이러한 리간드의 바람직한 접합체는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적화한다.
RGD 펩타이드 모이어티를 사용하여 특정 세포 유형, 예를 들어, 종양 세포, 예컨대, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적화할 수 있다(문헌참조: Zitzmann 외, Cancer Res., 62:5139~43, 2002). RGD 펩타이드는 폐, 콩팥, 비장 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양으로 dsRNA 제제의 표적화를 용이하게 할 수 있다(문헌참조: Aoki 외, Cancer Gene Therapy 8:783~787, 2001). 통상적으로, RGD 펩타이드는 iRNA 제제의 콩팥으로의 표적화를 용이하게 한다. RGD 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 특이적 조직으로의 표적화를 용이하게 하기 위해 변형, 예를 들어, 글리코실화 또는 메틸화될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화된 RGD 펩타이드는 iRNA 제제를 αVß3를 발현하는 종양 세포로 전달할 수 있다(문헌참조: Haubner 외, Jour. Nucl. Med., 42:326~336, 2001).
“세포 투과 펩타이드”는 세포, 예를 들어, 미생물 세포, 예컨대, 세균 또는 진균류 세포, 또는 포유동물 세포, 예컨대, 사람 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩타이드는 예를 들어, α-나선 선형 펩타이드(예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩타이드(예를 들어, α -데펜신, β-데펜신 또는 박테네신), 또는 단지 하나 또는 2개의 주요 아미노산을 함유하는 펩타이드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩타이드는 또한 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인 및 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유래된 MPG와 같은 이분형 양친매성 펩타이드일 수 있다(문헌참조: Simeoni 외, Nucl. Acids Res. 31:2717~2724, 2003).
C. 탄수화물 접합체
발명의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, iRNA는 추가로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물 접합된 iRNA는 본원에 기술된 것과 같이 생체내 치료학적 사용을 위해 적합한 조성물 뿐만 아니라 핵산의 생체내 전달을 위해 유리하다. 본원에 사용된 것과 같은, “탄수화물”은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 자체인 화합물; 또는 이의 일부로서 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 각각 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 단당류 유닛(선형, 분지형 또는 환형일 수 있는)으로 이루어진 탄수화물 모이어티를 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물은 당(모노-, 디-, 트리-, 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 유닛을 함유하는 올리고사카라이드) 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 폴리사카라이드 검을 포함한다. 특이적 단당류는 C5 이상(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 유닛(예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8)을 갖는 당을 포함한다.
특정 구현예에서, 탄수화물 접합체는 단당류를 포함한다.
특정 구현예에서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 접합체는 예를 들어, 미국 특허번호 제8,106,022호에 기술되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 iRNA를 특정 세포로 표적화하는 리간드로서 작용한다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 예를 들어, 간 세포(예를 들어, 간 세포(hepatocyte))의 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 리간드로서 작용함에 의해 iRNA를 간 세포로 표적화한다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc 유도체는 링커, 예를 들어, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 링커를 통해 iRNA 제제에 (예를 들어, 센스 가닥의 3' 말단에) 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 링커, 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 링커를 통해 iRNA 제제에 (예를 들어, 센스 가닥의 5' 말단에) 접합된다.
발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 발명의 또 다른 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 발명의 다른 구현에에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 1가 링커를 통해 이중가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, GalNAc 접합체는 다음이다:
화학식 II.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 하기의 도식에 나타낸 것과 같이 링커를 통해 탄수화물 접합체에 부착되고, 여기서 X는 O 또는 S이다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 표 1에 정의된 것과 같이 L96에 접합되고 하기에 나타낸다:
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
화학식 II,
화학식 III,
화학식 IV,
화학식 V,
화학식 VI,
화학식 VII,
화학식 VIII,
화학식 IX,
화학식 X,
화학식 XI,
화학식 XII,
화학식 XIII,
화학식 XIV,
화학식 XV,
화학식 XVI,
화학식 XVII,
화학식 XVIII,
화학식 XIX,
화학식 XX,
화학식 XXI,
화학식 XXII,
화학식 XXIII;
, 여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이고(화학식 XXIV);
, 여기서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이고(화학식 XXV);
화학식 XXVI;
, 여기서 X는 O 또는 S이고(화학식 XXVII);
화학식 XXVII; 화학식 XXIX;
화학식 XXX
화학식 XXXII; 화학식 XXXIII.
화학식 XXXIV.
특정 구현예에서, 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 단당류이다. 특정 구현예에서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민으로, 다음과 같다:
화학식 II.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 하기의 도식에 나타낸 것과 같이 링커를 통해 탄수화물 접합체에 부착되고, 여기서 X는 O 또는 S이다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 표 1에 정의된 것과 같이 L96에 접합되고 하기에 나타낸다:
본원에 기술된 구현예에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 접합체는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않고
(화학식 XXXVI),
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
일부 구현예에서, 적합한 리간드는 국제특허번호 제2019/055633호에 기술된 리간드이고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일 구현예에서, 리간드는 하기의 구조를 포함한다:
특정 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는, 이러한 GalNAc 리간드가 현재 본 발명의 바람직한 경막내/CNS 전달 경로(들)에 대해 제한된 값으로 예측되는 경우에도, GalNAc 리간드를 포함할 수 있다.
발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다. 발명의 또 다른 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 발명의 iRNA 제제에 부착된다.
일 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나 이상의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에서 링커를 통해 임의의 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. GalNac는 센스 가닥의 5'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, GalNAc는 예를 들어, 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
다른 구현예에서, 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 다수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 다수의 링커, 예를 들어 1가 링커를 통해 이중가닥 RNAi 제제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 발명의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 탄수화물 접합체는 전술된 하나 이상의 추가 리간드, 예를 들어 PK 조절제 또는 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가 탄수화물 접합체 및 링커는 국제특허번호 제2014/179620호 및 국제특허번호 제2014/179627호에 기술된 것들을 포함하고, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
D. 링커
일부 구현예에서, 본원에 기술된 접합체 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오타이에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "연결기"는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들어 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 단위 또는 원자 사슬, 예를 들어, 하지만 비제한적으로, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 종결될 수 있고; 여기서 R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 특정 구현예에서, 링커는 약 1~24개 원자 사이, 2~24, 3~24, 4~24, 5~24, 6~24, 6~18, 7~18, 8~18개 원자, 7~17, 8~17, 6~16, 7~16, 또는 8~16개 원자이다.
절단가능한 연결기 세포 외부에서 충분히 안정할 수 있지만 표적 세포로 진입 시 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출시키는 군이다. 바람직한 구현예에서, 절단가능한 연결기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청 중에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내는 것으로 선택될 수 있는)하에서 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내는 것으로 선택될 수 있는)하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 약 100배 신속하게 절단된다.
절단가능한 연결기는 절단제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감할 수 있다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액에서 보다 세포 내부에서 보다 높은 수준 또는 활성인 상태로 보다 만연해 있거나 발견된다. 그러한 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 어떠한 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제로서, 이는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어, 환원에 의해 산화환원 절단가능한 연결기를 분해시킬 수 있는 세포에 존재하는 머캅탄을 포함하는 산화환원제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 제제, 예를 들어, 5 이하의 pH를 유도하는 것들; 일반산으로서 작용함에 의해 산 절단가능한 연결기를 가수분해시키거나 분해할 수 있는 효소, 펩티다제(이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타제.
절단가능한 연결기, 예를 들어, 디설파이드 결합은 pH에 민감할 수 있다. 사람 혈청의 pH는 7.4이고, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1~7.3 범위이다. 엔도좀은 5.5~6.0의 범위에서 보다 산성의 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0에서 심지어 보다 산성의 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되어 세포 내부의 리간드로부터 양이온성 지질을 방출하거나 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하는 절단가능한 연결기를 갖는다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커로 혼입된 절단가능한 연결기의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다. 예를 들어, 간-표적화 리간드는 에스테르 군을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 결합될 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부함으로, 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서 보다 간 세포에서 보다 효율적으로 절단된다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형은 폐, 신피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 활막세포와 같은 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 표적화하는 경우 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능한 연결기의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액 내에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단가능한 연결기를 테스트하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 따라서, 당업자는 제1 조건 과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적인 감수성을 결정할 수 있고, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내도록 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청 내 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가의 평가에 의해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 이상 신속하게 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 연결기
특정 구현예에서, 절단가능한 연결기는 환원 또는 산화 시 절단되는 산화환원 절단가능한 연결기이다. 환원 절단가능한 연결기의 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 연결기가 적합한 "환원 절단가능한 연결기"인지 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하여 디티오트레이톨(DTT) 또는 기타 환원제를 사용한 항온처리에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 하나에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%만큼 절단된다. 다른 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 보다 신속하게 분해 된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 및 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트-기반 절단가능한 연결기
특정 구현예에서, 절단가능한 링커는 포스페이트 기반 절단가능한 연결기를 포함한다. 표스페이트-기반 절단가능한 연결기는 포스페이트 군을 분해하거나 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트 군을 절단하는 제제의 예는 세포의 포스파타제와 같은 효소이다. 포스파타제 기반 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단가능한 연결기
특정 구현예에서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 연결기를 포함한다. 산 절단가능한 연결기는 산성 조건하에서 절단되는 연결기이다. 바람직한 구현예에서, 산 절단가능한 연결기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)인 산성 환경에서 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 기관은 산 절단 가능한 연결기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 연결기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단가능한 군은 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 바람직한 구현예는 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시 군)가 아릴 군, 치환된 알킬 군 또는 3급 알킬 군, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르-기반 절단가능한 연결기
특정 구현예에서, 절단가능한 링커는 에스테르-기반 절단가능한 연결기를 포함한다. 에스테르 기반 절단가능한 연결기는 세포내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르-기반 절단가능한 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 군의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단가능한 연결기는 화학식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩타이드-기반 절단가능한 연결기
또 다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 펩타이드-기반 절단가능한 연결기를 포함한다. 펩타이드-기반 절단가능한 연결기는 세포내 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩타이드-기반 절단가능한 연결기는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이고 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성한다. 펩타이드-기반 절단가능한 군은 아미드 군(-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 군은 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이고 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단 군은 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드-기반 절단가능한 연결기는 화학식 - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 군이다. 이들 후보물은 전술된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 접합된다. 발명의 조성물 및 방법의 링커와 iRNA 탄수화물 접합체의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
(화학식 XLIV), X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
발명의 조성물 및 방법의 특정 구현예에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.　
특정 구현예에서, 발명의 dsRNA는 화학식 (XLV) - (XLVI) 중 임의의 것에 나타낸 구조의 군으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 접합된다:
여기서:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각 경우에 독립적으로 0~20을 나타내고, 여기서 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 부재하는 각 경우에 각각 독립적으로 CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 부재하는 각 경우에 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), C≡C or C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 종결될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 부재하는 각 경우에 각각 독립적으로 NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, 또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드; 즉, 각각의 발생에 대해 각각 독립적으로 단당류(GalNAc와 같은), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 접합 GalNAc 유도체는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 예컨대 화학식 (XLIX)와 함께 사용하기에 특히 유용하다
여기서 L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 단당류를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 접합시키는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 군의 예는 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII로서 앞서 언급된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호; 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 및 제8,106,022호를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이의 각각의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며 실제로 앞서 언급한 변형 중 하나 이상이 단일 화합물 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오사이드에 도입될 수 있습니다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명과 관련하여 “키메라” iRNA 화합물 또는 “키메라”는 iRNA 화합물, 바람직하게는 dsRNAi 제제이고 이는 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 함유하고, 이들 각각은 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉 dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이들 iRNA는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고, 여기서 RNA는 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 표적 핵산에 대한 증가된 세포 취득 또는 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. iRNA의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는 따라서 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 증진시킨다. 결과적으로, 상응하는 결과는 흔히 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 동일한 표적 영역에 하이브리드화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용하여 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당업계에 공지된 연합된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 경우에, iRNA의 RNA는 비-리간드 군에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 iRNA에 접합되어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 취득을 증진시키고, 이러한 접합을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 이용가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤(문헌참조: Kubo, T. 외, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(문헌참조: Manoharan 외, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(문헌참조: Manoharan 외, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 외, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(문헌참조: Oberhauser 외, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌참조: Saison-Behmoaras 외, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 외, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 외, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌참조: Manoharan 외, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 외, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777) 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌참조: Manoharan 외, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(문헌참조: Manoharan 외, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 손바닥 모이어티(문헌참조: Mishra 외, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(문헌참조: Crooke 외, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함한다. 이러한 RNA 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 앞서 열거되었다. 통상적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 함유하는 RNA의 합성을 포함한다. 아미노 군은 이어서 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합된 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA를 사용하거나 용액 상에서 RNA의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 접합체의 정제는 통상적으로 순수한 접합체를 제공한다.
V. 본 발명의 RNAi 제제의 전달
세포, 예를 들어 사람 대상체와 같은 대상체(예를 들어, 헌팅턴병과 같은 HTT 관련 장애를 갖고 있는 대상체와 같이 이를 필요로 하는 대상체) 내의 세포로의 본 발명의 RNAi 제제의 전달은 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포를 본 발명의 RNAi 제제와 시험관내 또는 생체내 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은 RNAi 제제를 암호화하고 이를 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이들 대안은 하기에서 추가로 논의된다.
일반적으로, (시험관내 또는 생체내) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 발명의 RNAi 제제와 함께 사용하기 위해 채택될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Akhtar S. 및 Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139~144 및 국제특허번호 제94/02595호, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다). 생체내 전달을 위해, RNAi 제제를 전달하기 위해 고려할 인자들은 예를 들어, 전달된 제제의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 예방, 및 표적 조직에서 전달된 제제의 축적을 포함한다. RNAi 제제의 비특이적 효과는 국소 투여에 의해, 예를 들어, 조직으로의 직접적인 주사 또는 이식에 의해 또는 국소적으로 제제를 투여함에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 제제의 국소 농도를 최대화하고, 다르게는 제제에 의해 방해될 수 있거나 제제를 분해시킬 수 있는 전신 조직으로의 제제의 노출을 제한하고, 보다 낮은 총 용량의 RNAi 제제가 투여될 수 있게 한다. 여러 연구는 RNAi 제제가 국소로 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 녹다운을 보여주었다. 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서 유리체내 주사에 의해 VEGF dsRNA의 안내 전달(문헌참조: Tolentino, MJ. 외, (2004) Retina 24:132~138) 및 마우스에서 망막하 주사(문헌참조: Reich, SJ. 외 (2003) Mol. Vis. 9:210~216)는 모두 연령-관령 반점 변성 실험 모델에서 신혈관 형성을 예방하는 것으로 나타났다. 또한, 마우스에서의 dsRNA의 직접 종양내 주사가 종양 부피를 감소시키고(문헌참조: Pille, J. 외 (2005) Mol. Ther. 11:267~274) 종양 보유 마우스의 생존을 연장시킨다(문헌참조: Kim, WJ. 외, (2006) Mol. Ther. 14:343~350; Li, S. 외, (2007) Mol. Ther. 15:515~523). RNA 간섭은 또한 직접 주사에 의한 CNS로의 국소 전달에서 성공적이고(문헌참조: Dorn, G. 외, (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. 외. (2005) Gene Ther. 12:59~66; Makimura, H. 외(2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., 외 (2004) Neuroscience 129:521~528; Thakker, ER., 외 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270~17275; Akaneya,Y., 외 (2005) J. Neurophysiol. 93:594~602) 비강내 투여에 의한 폐로의 국소 전달에서 성공적인 것으로 나타났다(Howard, KA. 외, (2006) Mol. Ther. 14:476~484; Zhang, X. 외, (2004) J. Biol. Chem. 279:10677~10684; Bitko, V. 외, (2005) Nat. Med. 11:50~55). 질환의 치료를 위한 RNAi 제제의 전신 투여를 위해, RNA는 변형될 수 있거나 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있고; 방법 모두는 엔도- 및 엑소- 뉴클레아제에 의해 생체내 dsRNA의 신속한 분해를 방지하는 작용을 한다. RNA 또는 약제학적 캐리어의 변형은 또한 RNAi 제제의 표적 조직으로의 표적화를 가능하게 하 고 바람직하지 못한 오프-표적 효과를 회피한다(예를 들어, 이론에 의해 국한시키고자 하는 것 없이, 본원에 기재된 것과 같은 GNA의 사용은 dsRNA의 씨드 영역을 불안정화시켜, 오프-표적 효과가 이러한 씨드 영역 불안정화에 의해 유의미적으로 약해짐에 따라서 오프-표적에 비해 온-표적 효과를 위한 이러한 dsRNA 의 증진된 선호도를 유도하는 것으로 확인되었다). RNAi 제제는 콜레스테롤과 같은 친유성 군으로의 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 흡수를 증진시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 접합된 ApoB에 대한 RNAi 제제는 마우스에 전신 주사하고 간과 공장 둘 모두에서 apoB mRNA의 녹다운을 유도하였다(문헌참조: Soutschek, J., 외 (2004) Nature 432:173~178). RNAi 제제의 압타머로의 접합은 전립선암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴행을 매개하는 것으로 나타났다(문헌참조: McNamara, JO. 외, (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005~1015). 대안적인 구현예에서, RNAi 제제는 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 분자 RNAi 제제(음으로 하전된)의 결합을 촉진시키고 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호작용을 증진시켜 세포에 의한 RNAi 제제의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 RNAi 제제에 결합될 수 있거나 RNAi 제제가 내장된 소포 또는 마이셀을 형성하도록 유도될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Kim SH, 외 (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107~116). 소포 또는 마이셀의 형성은 전신 투여되는 경우 RNAi 제제의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-RNAi 제제 복합체를 제조하고 투여하기 위한 방법은 능히 당업자의 능력 범위내에 있다(문헌참조: 예를 들어, Sorensen, DR., 외 (2003) J. Mol. Biol 327:761~766; Verma, UN. 외, (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291~1300; Arnold, AS 외 (2007) J. Hypertens. 25:197~205, 이는 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다). RNAi 제제의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 비제한적인 예는 DOTAP(문헌참조: Sorensen, DR., 외 (2003), 전술됨; Verma, UN, 외 (2003), 전술됨), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(문헌참조: Zimmermann, TS, 외 (2006) Nature 441:111~114), 카디오리핀(문헌참조: Chien, PY, 외 (2005) Cancer Gene Ther. 12:321~328; Pal, A, 외 (2005) Int J. Oncol. 26:1087~1091), 폴리에틸렌이민(문헌참조: Bonnet ME, 외 (2008) Pharm. Res. Aug 16 인쇄 전 Epub; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩타이드(문헌참조: Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472~487), 및 폴리아미도아민(문헌참조: Tomalia, DA, 외 (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61~67; Yoo, H., 외 (1999) Pharm. Res. 16:1799~1804)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi 제제는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. RNAi 제제 및 사이클로덱스트린의 투여 및 약제학적 조성물 위한 방법은 미국 특허번호 제7,427,605호에서 찾을 수 있고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 특정 양태는 세포 내 HTT 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 간외 세포, 선택적으로 CNS 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체 내 HTT 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 대상체에 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 CNS 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 본 발명의 이중-가닥 HTT-표적화 RNAi 제제의 치료적 유효량을 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 헌팅턴병을 포함한다.
일 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척추강내로 투여된다. 이중-가닥 RNAi 제제의 척추강내 투여에 의해, 방법은 뇌(예를 들어, 선조체) 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 HTT 표적 유전자의 발현 을 감소시킬 수 있다.
설명의 용이함을 위해 본 섹션에서 제형, 조성물 및 방법은 변형 siRNA 화합물과 관련하여 주로 논의된다. 그러나, 이들 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물과 함께 실시될 수 있고, 이러한 실시는 본 발명 내에 있는 것으로 이해될 수 있다. RNAi 제제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 척추강내, 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비강, 폐 및 안구를 포함한다.
본 발명의 RNAi 제제는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 하나 이상의 종의 RNAi 제제 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함한다. 본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물에 적합하지 않은 경우를 제외하고는 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물은 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과, 질, 직장, 비강, 경피 포함), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 표적화하기 위해, 관심 대상의 근육으로 근육내 주사는 논리적 선택이다. 폐 세포는 에어로졸 형태로 RNAi 제제를 투여함에 의해 표적화될 수 있다. 혈관 내피 세포는 풍선 카테터에 RNAi 제제를 코팅하고 RNA를 기계적으로 도입함으로써 표적화될 수 있다.
국소 투여용의 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 적가제, 좌제, 분무, 액체, 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 캐리어, 수성 분말 또는 오일 기제, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물, 시럽, 엘릭시르 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 캐리어는 락토스, 나트륨 시트레이트 및 인산의 염을 포함한다. 정제에는 전분과 같은 다양한 붕해제와 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제가 일반적으로 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구 사용을 위해 요구되는 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁제와 배합될 수 있다. 경우에 따라, 특정 감미제 및/또는 향미제가 첨가될 수 있다.
척추강내 또는 뇌실내 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 심실내 주사는 예를 들어 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 정맥내 사용의 경우, 용질의 총 농도는 제조물을 등방성으로 만들기 위해 조절될 수 있다.
일 구현예에서, ssiRNA 화합물, 예를 들어 이중-가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물, 조성물의 투여는 비경구로, 예를 들어, 정맥내(예를 들어, 볼루스로서 또는 확산성 주입으로서), 피내, 복강내, 근육내, 척추강내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경, 직장, 구강, 질, 국소, 폐, 비강내, 요도 또는 안구이다. 투여는 대상체 또는 다른 사람, 예를 들어 의료 제공자에 의해 제공될 수 있다. 약물은 측정된 용량으로 제공되거나 계량된 용량을 전달하는 분배기로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 하기에 보다 상세하게 논의된다.
A. 척추강내 투여.
일 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척추강내 주사(즉, 뇌 및 척수 조직을 담고 있는 척수액으로의 주사)에 의해 전달된다. 척수액에 RNAi 제제의 척추강내 주사는 볼루스 주사 또는 피부 아래에 이식될 수 있는 미니펌프를 통해 수행되어, 척수액으로의 siRNA의 정기적이고 지속적인 전달을 제공할 수 있다. 척수액이 생성되는 맥락총으로부터의 척수액의 순환은 척수 및 후근 신경절 주위를 따라 아래로, 이어서 소뇌를 지나 피질을 거쳐 지주막 과립으로 흐르며, 여기서 유체가 CNS를 빠져나갈 수 있고 주사된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 따라 척추강내로 전달된 분자는 CNS 전체에 걸쳐 표적을 공략할 수 있다.
일부 구현예에서, 척추강내 투여는 펌프를 통해서이다. 펌프는 수술적으로 이식된 삼투압 펌프일 수 있다. 일 구현예에서, 삼투압 펌프는 척추강내 투여를 용이하게 하기 위해 척추관의 지주막하 공간에 이식된다.
일부 구현예에서, 척추강내 투여는 약제의 용량을 함유하는 저장소 및 저장소에 함유된 약제의 일부를 전달하도록 이루어진 펌프를 포함하는 약제용 척추강 내 전달 시스템을 통해서이다. 이러한 척추강내 전달 시스템에 대한 더 자세한 내용은 국제특허번호 제2015/116658호에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전문이 참조로 인용된다.
척추강내 주사된 RNAi 제제의 양은 하나의 표적 유전자로부터 또 다른 표적 유전자에 따라 다양할 수 있고 적용되어야 하는 적절한 양은 각각의 표적 유전자에 대해 개별적으로 결정되어야 할 수 있다. 통상적으로, 이러한 양은 10 μg 내지 2 mg, 바람직하게 50 μg 내지 1500 μg, 보다 바람직하게 100 μg 내지 1000 μg의 범위이다.
B. 본 발명의 벡터 암호화된 RNAi 제제
HTT 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Couture, A, 외, TIG. (1996), 12:5~10; 국제특허번호 제00/22113호, 국제특허번호 제00/22114호, 및 미국 특허번호 제6,054,299호). 발현은 사용된 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 바람직하게 (수개월 또는 그 이상) 지속된다. 이들 전이유전자는 선형 작제물, 환형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있고, 이는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 전이유전자는 또한 염색체 외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수 있다(문헌참조: Gassmann, 외, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292).
RNAi 제제의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상에서 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 별도의 가닥이 발현되어, 예를 들어, dsRNA를 생성하는 경우, 2개의 별도의 발현 벡터는 (예를 들어, 형질감염 또는 감염에 의해) 표적 세포 내로 공동 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드에 위치한 프로모터 둘 모두에 의해 전사될 수 있다. 일 구현예에서, dsRNA는 dsRNA가 스템 및 루프 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 연결된 역위 반복 폴리뉴클레오타이드로서 발현된다.
RNAi 제제 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와 상용성인 발현 벡터, 바람직하게 영양 세포와 상용성인 것들을 사용하여 본원에 기재된 것과 같은 RNAi 제제의 발현을 위한 재조합 작제물을 생성할 수 있다. RNAi 제제 발현 벡터의 전달은 예를 들어 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 추출된 표적 세포에 투여한 후 환자에게 재도입함에 의해, 또는 목적하는 표적 세포로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 전신적일 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물과 사용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 파필로마 바이러스 벡터; (h) 피코나바이러스 벡터; (i) 폭스 바이러스 벡터, 예컨대, 오르토폭스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예를 들어. 카나리 폭스 또는 파울 폭스; 및 (j) 헬퍼 의존성 또는 거트리스(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 복제 결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터는 세포의 게놈에 도입되거나 도입되지 않는다. 작제물은 경우에 따라 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피좀 복제할 수 있는 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터에 도입될 수 있다. RNAi 제제의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로 표적세포 에서 RNAi 제제의 발현을 확실히 하기 위해 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 한다. 벡터 및 작제물을 위해 고려할 다른 양태는 당업계에 공지되어 있다.
VI. 본 발명의 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 RNAi 제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 또는 4개의 dsRNA 제제, 예를 들어 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하는 제1 dsRNA 제제 및 전장 사람 HTT를 표적으로 하는 제2 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 예를 들어, dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 각각의 센스 가닥 또는 각각의 안티센스 가닥은 표 2~5 중 어느 하나의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이다.
또 다른 구현예에서, 본원에서는 본원에 기술된 것과 같은 RNAi 제제 또는 조성물을 함유하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어가 제공된다. RNAi 제제 또는 조성물을 함유하는 약제학적 조성물은 HTT의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애, 예를 들어 헌팅턴병을 치료하는 데 유용하다.
일부 구현예에서, 발명의 약제학적 조성물은 멸균성이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 발열원 부재 또는 비-발열원성이다.
이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제형화된다. 일례로는 비경구 전달을 통한, 예를 들어 정맥내(IV), 근육내(IM) 또는 피하(subQ) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화된 조성물이다. 또 다른 예는 예를 들어 척추강내 또는 유리체내 주사 경로에 의해, 선택적으로 뇌(예를 들어, 선조체)로의 주입, 예를 들어 연속 펌프 주입에 의해 CNS로의 직접 전달을 위해 제형화된 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 HTT 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 RNAi 제제의 적합한 용량은 하루 수용자의 체중 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위이고, 일반적으로 하루 체중 킬로그램 당 약 1 내지 50mg 범위이다.
반복 투여 용법은 정기적 주기로, 예를 들어, 매월 1회 내지 6개월 마다 1회로 치료학적 양의 RNAi 제제의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 분기별 약 1회(즉, 약 3개월 마다 1회) 내지 연간 약 2회 투여된다.
초기 치료 용법(예를 들어, 부하 용량) 후, 치료제는 덜 빈번한 기준으로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물의 단일 용량은 오래 지속되어, 후속 용량은 1, 2, 3 또는 4개월 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 단일 용량은 1개월 마다 1회 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 단일 용량은 분기별 1회 내지 연간 2회 투여된다.
당업자는 특정 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 용량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있음을 인지하며, 이는 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
마우스 유전학의 발전으로 HTT의 발현 감소가 이득이 되는 HD와 같은 다양한 사람 질환 연구를 위해 다수의 마우스 모델이 생성되었다. 이러한 모델은 RNAi 제제의 생체내 시험과 치료학적 유효량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 설치류 모델은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Cepeda, 외 (ASN Neuro (2010) 2(2):e00033) 및 문헌(Pouladi, 외 (Nat Reviews (2013) 14:708)에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들어, 경피 패치에 의함), 폐, 예를 들어 분무기를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 예를 들어 이식된 장치를 통한 피하; 또는 두개내, 예를 들어 실질내, 척추강내 또는 뇌실내 투여에 의한 것을 포함한다.
RNAi 제제는 CNS와 같은 특정 조직(예를 들어, 뇌의 뉴런, 신경교 또는 혈관 조직)을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여용의 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 적가제, 좌제, 분무, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 캐리어, 수성 분말 또는 오일 기제, 증점제 등이 필요하거나 요구될 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본 발명에 특성화된 RNAi 제제가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린), 음이온성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 발명에 특성화된 RNAi 제제는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나 이것과 특히 양이온성 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, RNAi 제제는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 인용된 미국 특허번호 제6,747,014호에 상세히 기재되어 있다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는 RNAi 제제 제형
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 막 분자 어셈블리, 예를 들어, 리포좀 또는 마이셀에서의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "리포좀"은 적어도 하나의 이중층, 예를 들어, 하나의 이중층 또는 다수의 이중층에 배열된 양친매성 지질로 이루어진 소포를 지칭한다. 리포좀은 친유성 물질과 수성 내부로 형성된 막을 갖는 단층 및 다중층 소포를 포함한다. 수성 부분은 RNAi 제제 조성물을 함유한다. 친유성 물질은 통상적으로 RNAi 제제 조성물을 포함하지 않지만, 일부 예에서는 그럴 수 있는 수성 외부로부터 수성 내부를 단리한다. 리포좀은 활성 성분을 작용 부위로 전이 및 전달하는데 유용하다. 리포좀 막은 구조적으로 생물학적 막과 유사하기 때문에 리포좀이 조직에 적용되는 경우, 리포좀 이중층은 세포막의 이중층과 융합된다. 리포좀과 세포의 병합이 진행됨에 따라, RNAi 제제를 포함하는 내부 수성 내용물은 RNAi 제제가 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있고 RNAi를 매개할 수 있는 세포로 전달된다. 일부 경우에, 리포좀은 또한 특이적으로 표적화되어, 예를 들어, RNAi 제제를 특정 세포 유형으로 지시한다.
RNAi 제제를 함유하는 리포좀은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 예에서, 리포좀의 지질 성분은 세제에 용해되어 마이셀은 지질 성분과 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 높은 임계 마이셀 농도를 가질 수 있고 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코사이드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 이어서 RNAi 제제는 지질 성분을 포함하는 마이셀에 첨가된다. 지질 상의 양이온성 군은 RNAi 제제와 상호작용하고 RNAi 제제 주변에서 응축하여 리포좀을 형성한다. 응축 후 세제는, 예를 들어 투석에 의해 제거되어 RNAi 제제의 리포솜 제조물을 수득한다.
필요한 경우 응축을 보조하는 캐리어 화합물이 응축 반응 동안, 예를 들어 제어된 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 캐리어 화합물은 핵산 이외의 중합체(예를 들어, 스퍼민 또는 스퍼미딘)일 수 있다. pH는 또한 응축에 유리하게 조정될 수 있다.
전달 비히클의 구조적 성분으로서 폴리뉴크레오타이드/양이온성 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오타이드 전달 비히클을 제조하는 방법은 예를 들어, 국제특허번호 제96/37194호에 추가로 기재되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 리포좀 형성은 또한 문헌(Felgner, P. L. 외, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413~7417); 미국 특허번호 제4,897,355호; 미국 특허번호 제5,171,678호; 문헌(Bangham 외, (1965) M. Mol. Biol. 23:238); 문헌(Olson 외, (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9); 문헌(Szoka 외, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194); 문헌(Mayhew 외 (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169); 문헌(Kim 외 (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339); 및 문헌(Fukunaga 외 (1984) Endocrinol. 115:757)에 기술된 예시적인 방법의 하나 이상의 양태를 포함할 수 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 적절한 크기의 지질 응집체를 제조하기 위해 일반적으로 사용되는 기술은 초음파 처리 및 냉동-해동 및 압출을 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Mayer 외(1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161). 미세유체화는 일관되게 작고(50 내지 200 nm) 비교적 균일한 응집체가 필요할 때 사용될 수 있다(문헌참조: Mayhew 외 (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169) 이들 방법은 RNAi 제제 제조물을 리포좀으로 팩키징하는데 용이하게 적용된다.
리포좀은 2개의 광범위한 부류로 분류된다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위해 음으로 하전된 핵산 분자와 상호작용하는 양으로 하전된 리포좀이다. 양으로 하전된 핵산/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고 엔도좀에 내재화된다. 엔도좀 내 산성 pH로 인해, 리포좀은 붕괴되어, 이들의 내용물을 세포질로 방출한다(문헌참조: Wang 외 (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980~985).
pH 민감성이거나 음으로 하전된 리포좀은 이들과의 복합체 보다는 핵산을 포집한다. 핵산과 지질 모두는 유사하게 하전되기 때문에 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이들 리포좀의 수성 내부에 포집된다. pH 민감성 리포좀은 티미딘 키나제 유전자를 암호화하는 핵산을 배양 중의 세포 단층으로 전달하기 위해 사용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 검출 되었다(문헌참조: Zhou 외. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269~274).
하나의 주요 유형의 리포좀 조성물은 천연적으로 유래된 포스파티딜콜린 이외에 포스포지질을 포함한다. 중성 리포좀 조성물은, 예를 들어 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 또는 포스파티딜콜린 또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
시험관내 및 생체내 세포로 리포좀을 도입하는 다른 예시적인 방법은 미국 특허번호 제5,283,185호; 미국 특허번호 제5,171,678호; 국제특허번호 제94/00569호; 국제특허번호 제93/24640호; 국제특허번호 제91/16024호; 문헌(Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550); 문헌(Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307); 문헌(Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649); 문헌(Gershon, (1993) Biochem. 32:7143); 및 문헌(Strauss, (1992) EMBO J. 11:417)를 포함한다.
비이온성 리포좀 시스템은 또한 피부, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NovasomeTM I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A를 전달하기 위해 사용되었다. 결과는 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 피부의 다른 층에 사이클로스포린 A의 침착을 촉진하는 데 효과적임을 나타냈다(문헌참조: Hu 외, (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
리포좀은 또한 "입체 안정화된" 리포좀을 포함하는데, 본원에 사용된 용어는 리포좀으로 도입될 때 이러한 특수화된 지질이 부족한 리포좀에 비해 순환 수명을 증진시키는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포 형성 지질 부분의 일부가 (A)모노시알로강글리오사이드 GM1과 같은 하나 이상의 당지질을 포함하거나 (B) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 것들이다. 임의의 특정 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 당업계에서 적어도 강글리오사이드, 스핑고마이엘린 또는 PEG 유도체화된 지질을 함유하는 적어도 입체적으로 안정화된 리포좀에 대해, 이들 입체적으로 안정화된 리포좀의 증진된 순환 반감기는 세망내피 시스템(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래한다고 여겨진다(문헌참조: Allen 외, (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu 외, (1993) Cancer Research, 53:3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀은 당업계에 공지되어 있다. Papahadjopoulos 외 (문헌참조: Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64)는 리포좀의 혈액 반감기를 개선하는 모노시알로간글리오시드 GM1, 갈락토세레브로사이드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨의 능력을 보고하였다. 이러한 소견은 Gabizon 외 (문헌참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949)에 의해 설명되었다. Allen 외의 미국 특허번호 제4,837,028호 및 국제특허번호 제88/04924호 둘 모두는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오사이드 GM1 또는 갈락토세레브로사이드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시한다. 미국 특허번호 제5,543,152호(Webb 외)는 스핑고마이엘린을 포함하는 리포좀을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀이 국제특허번호 제97/13499호(Lim 외)에 개시되어 있다.
일 구현예에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포 막에 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포좀은 세포질막과 효율적으로 융합할 수 없지만, 생체내 대식세포에 의해 흡수되고 RNAi 제제를 대식세포에 전달하는 데 사용될 수 있다.
리포좀의 추가 이점은 다음과 같다: 천연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생체적합적 및 생분해성이고; 리포좀에는 광범위한 수용성 및 지용성 약물이 혼입될 수 있고; 리포좀은 이들의 내부 격실에서 대사 및 분해로부터 캡슐화된 RNAi 제제를 보호할 수 있다(문헌참조: Rosoff, "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, 1권, 페이지. 245). 리포좀 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포좀의 수성 용적이다.
양으로 하전된 합성 양이온 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)는 핵산과 자발적으로 상호작용하여, 조직 배양 세포의 세포 막의 음으로 하전된 지질과 융합가능한 지질-핵산 복합체를 형성하는 작은 리포좀을 형성하는 데 사용되어, RNAi 제제의 전달을 초래할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Felgner, P. L. 외, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413~7417, 및 미국 특허번호 제4,897,355호로, DOTMA 및 이의 DNA와의 용도의 설명).
DOTMA 유사체, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)는 인지질과 조합되어 사용되어 DNA-복합 소포를 형성할 수 있다. Lipofectin™(Bethesda 연구소, 게이더스버그, 메릴랜드)는 음으로 하전된 폴리뉴클레오타이드와 자발적으로 상호작용하여 복합체를 형성하는 양으로 하전된 DOTMA 리포좀을 포함하는 생 조직 배양 세포로 고도의 음이온성 핵산의 전달을 위한 효과적인 제제이다. 충분히 양으로 하전된 리포좀이 사용되는 경우, 수득한 복합체 상의 총 전하는 또한 양성이다. 이러한 방식으로 제조된 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고 세포질막과 융합하여 효율적으로 기능성 핵산을, 예를 들어, 조직 배양 세포로 전달한다. 상업적으로 이용가능한 또 다른 양이온성 지질인, 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP") (Boehringer Mannheim, 인디애나주 인디애나폴리스)은 올레오일 모이어티가 에테르 결합보다는 차라리 에스테르에 의해 결합되어 있다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
보고된 다른 양이온성 지질 화합물은 2가지 유형의 지질 중 하나와 접합된, 예를 들어 카르복시스페민을 포함하는 다양한 모이어티에 접합된 것들을 포함하고, 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드("DOGS")(Transfectam™, Promega, 매디슨, 위스콘신) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드("DPPES")와 같은 화합물을 포함한다(문헌참조: 예를 들어 미국 특허번호 제5,171,678호).
또 다른 양이온성 지질 접합체는 DOPE와 조합하여 리포좀으로 제형화된 콜레스테롤(“DC-Chol”)로 지질을 유도체화하는 것을 포함한다(문헌참조: Gao, X. 및 Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280). 폴리라이신을 DOPE에 접합시킴으로써 제조되는 리포폴리리신은 혈청이 있는 상태에서 형질감염에 효과적임이 보고되었따(문헌참조: Zhou, X. 외, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). 특정 세포주에 대해, 접합된 양이온성 지질을 함유하는 이들 리포좀은 DOTMA-함유 조성물보다 낮은 독성을 나타내고 보다 효율적인 형질감염을 제공하는 것으로 알려져 있다. 기타 상업적으로 이용가능한 양이온성 지질 제품은 DMRIE 및 DMRIE- HP(Vical, 라호야, 캘리포니아) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., 게이더스버그, 메릴랜드)을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 전달을 위해 적합한 다른 양이온성 지질은 국제특허번호 제98/39359호 및 국제특허번호 제96/37194호에 기술되어 있다.
리포좀 제형은 특히 국소 투여를 위해 적합하고 리포좀은 다른 제형보다 여러 이점들을 제공한다. 이러한 이점들은 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 목적하는 표적에서 투여된 약물의 증가된 축적, 및 RNAi 제제를 피부에 투여하는 능력을 포함한다. 일부 구현에서, 리포좀은 RNAi 제제를 상피 세포에 전달하고 또한 RNAi 제제의 진피 조직, 예를 들어 피부로의 투과를 증진시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 리포좀은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포좀으로서 제형화된 약물의 피부로의 국소 전달은 보고되었다(문헌참조: 예를 들어, Weiner 외, (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405~410 및 du Plessis 외, (1992) Antiviral Research, 18:259~265; Mannino, R. J. 및 Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682~690; Itani, T. 외, (1987) Gene 56:267~276; Nicolau, C. 외 (1987) Meth. Enzymol. 149:157~176; Straubinger, R. M. 및 Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512~527; Wang, C. Y. 및 Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851~7855).
비이온성 리포좀 시스템은 또한 피부, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템으로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 진피로 약물을 전달하기 위해 사용되었다. RNAi 제제를 사용한 이러한 제형은 피부 장애를 치료하는 데 유용하다.
RNAi 제제를 포함하는 리포좀은 고도로 변형 가능하게 제조될 수 있다. 이러한 변형성은 리포좀의 평균 반경보다 작은 기공을 통해 리포좀을 투과시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스페로좀은 일종의 변형될 수 있는 리포좀이다. 트랜스페로좀은 표면 엣지 활성화인자, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가함에 의해 제조될 수 있다. RNAi 제제를 포함하는 트랜스페로좀은 예를 들어 피부의 각질형성세포에 RNAi 제제를 전달하기 위해 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 온전한 포유동물 피부를 통과하기 위해 지질 소포는 적합한 경피 농도구배의 영향 하에 각각 직경이 50nm 미만인 일련의 미세 공극을 통과해야 한다. 또한, 지질 성질로 인해 이러한 트랜스페로좀은 자가 최적화(예를 들어, 피부에서 공극 형태에 적응), 자가 복구가 가능하고 흔히 단편화 없이 이들의 표적에 도달하고, 종종 자가 부하 할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 제형은 2008년 1월 2일에 제출된 미국 가출원번호 제61/018,616호; 2008년 1월 2일에 제출된 제61/018,611호; 2008년 3월 26일에 제출된 제61/039,748호; 2008년 4월 22일에 제출된 제61/047,087호 및 2008년 5월 8일에 제출된 제61/051,528호에 기술되어 있다. 2007년 10월 3일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/080331은 또한 본 발명에 따를 수 있는 제형을 기술한다.
또 다른 유형의 리포좀인 트랜스페로좀은 약물 전달 비히클에 대해 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체이다. 트랜스페로좀은 변형이 매우 커서 액적보다 작은 공극을 통해 쉽게 투과할 수 있는 지질 액적으로서 기재될 수 있다. 트랜스페로좀은 이들이 사용되는 환경에 적응할 수 있고, 예를 들어, 이들은 자가 최적화(피부의 공극 형태에 적응)하고, 자가 복구하고, 흔히 단편화 없이 이들의 표적에 도달하고, 종종 자가 부하한다. 트랜스페로좀을 제조하기 위해, 표면 엣지 활성화제, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가할 수 있다. 트랜스페로좀은 혈청 알부민을 피부에 전달하기 위해 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스페로좀-매개 전달은 혈청 알부민을 함유한 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
계면활성제는 본원에 기재된 것과 같은 제형, 특히 에멀젼(마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀에 광범위하게 적용된다. 천연 및 합성 계면활성제의 많은 다양한 유형의 성질을 분류하고 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 군("헤드"로서도 공지된)의 특성은 제형에 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하는 데 가장 유용한 수단을 제공한다(문헌참조: Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 페이지. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약제 및 화장품에 광범위하게 적용되며 광범위한 pH 값에서 사용할 수 있다. 일반적으로 이들의 HLB 값은 이들의 구조에 의존하여 2 내지 약 18 범위이다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 슈크로스 에스테르, 및 에톡실화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭실화된 알콜 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이러한 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류의 가장 대중적인 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠면 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카복실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠면 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다. 4차 암모늄 염은 이러한 부류의 가장 널리 사용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖는 경우, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 인지질을 포함한다.
약물 제품, 제형 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용이 검토되었다(문헌참조: Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 페이지. 285).
본 발명의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 또한 마이셀 제형으로서 제공될 수 있다. “마이셀"은 분자의 모든 소수성 부분이 안쪽으로 향하고 친수성 부분이 주변 수성상과 접촉한 상태로 남아있도록 양친매성 분자가 구형 구조로 배열된 특정 유형의 분자 어셈블리로 본원에서 정의된다. 환경이 소수성인 경우 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적합한 혼합 마이셀 제형을 siRNA 조성물의 수성 용액, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트, 및 마이셀 형성 화합물을 혼합하여 제조할 수 있다. 예시적인 마이셀 형성 화합물은 렉시틴, 하이알루론산, 하이알루론산의 약제학적으로 허용가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트리하이드록시 옥소 콜라닐 글라이신 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 라이신, 폴리라이신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이의 유사체, 폴리도칸올 알킬 에테르 및 이의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 이의 혼합물을 포함한다. 마이셀 형성 화합물은 동시에 또는 알칼리 금속 알킬 설페이트의 첨가 후 첨가될 수 있다. 혼합 마이셀은 성분들의 실질적으로 임의의 종류의 혼합으로 형성되지만 왕성한 혼합으로 보다 작은 크기의 마이셀을 제공한다.
하나의 방법에서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 함유하는 제1 마이셀 조성물이 제조된다. 이어서, 제1 마이셀 조성물을 3종 이상의 마이셀 형성 화합물과 혼합하여 혼합 마이셀 조성물을 형성한다. 또 다른 방법에 서, 마이셀 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 마이셀 형성 화합물 중 하나 이상을 혼합한 후, 왕성한 혼합과 함께 나머지 마이셀 형성 화합물을 첨가함으로써 제조된다.
페놀 또는 m-크레졸을 혼합 마이셀 조성물에 첨가하여 제형을 안정화하고 세균 성장으로부터 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 또는 m-크레졸이 마이셀 형성 성분과 함께 첨가될 수 있다. 혼합 마이셀 조성물의 형성 후에 글리세린과 같은 등장제를 첨가할 수도 있다.
마이셀 제형을 분무로 전달하기 위해 제형을 에어로졸 분배기에 넣고 분배기에 추진제를 충전할 수 있다. 압력하에 있는 추진제는 분배기에 액체 형태로 있다. 성분의 비율은 수성 및 추진제 상이 하나가 되도록 조정되어, 즉, 하나의 상이 있다. 2개의 상이 있는 경우, 내용물의 일부를 예를 들어, 계량 밸브를 통해 분배하기 전에 분배기를 흔들 필요가 있다. 분배된 용량의 약제는 미세 분말로 계량된 밸브로부터 추진된다.
추진제는 수소 함유 클로로플루오로카본, 수소 함유 플루오로카본, 디메틸에테르 및 디에틸에테르를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, HFA 134a(1,1,1,2 테트라플루오로에탄)가 사용될 수 있다.
필수 성분들의 특이적 농도는 상대적으로 직접적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 구강을 통한 흡수의 경우, 주사를 통한 또는 위장관을 통한 투여의 용량을, 예를 들어 적어도 2배 또는 3배로 증가시키는 것이 종종 바람직할 수 있다.
B. 지질 입자
RNAi 제제, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA는 지질 제형, 예를 들어, LNP 또는 기타 핵산-지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "LNP"는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 통상적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 접합체)을 포함한다. LNP는 이들이 정맥내(i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 말단 부위(예를 들어, 투여 부위에서 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 적용에 매우 유용하다. LNP는 국제특허번호 제00/03683호에 제시된 캡슐화된 응축 제제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 통상적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 통상적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 통상적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 본 발명의 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허번호 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 미국 특허 공개번호 제2010/0324120호 및 국제특허번호 제96/40964호에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 지질 대 약물 비율(질량/질량 비율)(예를 들어, 지질 대 dsRNA 비율)은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 것이다. 위에서서 언급된 범위의 중간 범위는 또한 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.
RNAi 제제의 전달을 위한 특정 특이적 LNP 제형은 당업계에 보고되었고, 본원에 참조로 인용된 국제특허번호 제2008/042973호에 기재된 것과 같이, 예를 들어, “LNP01” 제형을 포함한다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기의 표에서 확인된다.
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14)(평균 분자량이 2000인 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18)(평균 분자량 이 2000인 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(평균 분자량이 2000인 PEG)
SNALP(l,2-딜리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA))을 포함하는 제형은 국제특허번호 제2009/127060호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
XTC를 포함하는 제형은 국제특허번호 제2010/088537호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
MC3을 포함하는 제형은 예를 들어, 미국 특허 공개번호 제2010/0324120호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
ALNY-100을 포함하는 제형은 국제특허번호 제2010/054406호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
C12-200을 포함하는 제형은 국제특허번호 제2010/129709호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세입자, 나노입자, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 소형정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 제형은 본 발명에서 특성화된 dsRNA가 하나 이상의 투과 증진제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 제형이다. 적합한 계면활성제는 지방산 또는 에스테르 또는 이의 염, 담즙산 또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 적합한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염(예를 들어, 나트륨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 투과 증진제들의 조합이 사용되고, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염이 사용된다. 하나의 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 투과 증진제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특성화된 DsRNA는 분무된 건조 입자 또는 마이크로 또는 나노입자를 형성하도록 복합체화된 입자를 포함하는 과립 형태로 경구적으로 전달될 수 있다. dsRNA 복합 제제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥시에탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE 유도체화된 폴리이민, 꽃가루, 셀룰로스 및 전분을 포함한다. 적합한 복합 제제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락트산-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA에 대한 제형 및 이들의 제조는 미국 특허번호 제6,887,906호, 미국 공개번호 제2003/0027780호, 및 미국 특허번호 제6,747,014호에 자세히 기술되어 있고, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다.
비경구, (뇌로의) 조직내, 척수강내, 심실내 또는 간내 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 이에 제한되지 않지만 투과 증진제, 캐리어 화합물과 같은 기타 적합한 첨가제 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 용제, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. HTT 관련 질환 또는 장애를 치료하는 경우 뇌를 표적화하는 제형이 특히 바람직하다.
유닛 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있는 본 발명의 약제학적 제형은 제약 산업에 잘 공지된 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술들은 활성 성분을 약제학적 캐리어(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 캐리어 또는 미분된 고체 캐리어 또는 모두와 활성 성분을 균일하고 친밀하게 연합시키고 이어서 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같은 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 중에 현탁액로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
C. 추가 제형
i. 에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로서 제조되고 제형화될 수 있다. 에멀젼은 통상적으로 일반적으로 직경이 0.1μm를 초과하는 액적의 형태로 또 다른 액체에 분산된 하나의 액체의 이종성 시스템이다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 외, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301) 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 비혼화성 액체 상을 포함하는 이상성 시스템이다. 일반적으로, 에멀졀은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 다양성 중 어느 하나일 수 있다. 수성상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 오일상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불리운다. 대안적으로 오일상이 미세하게 나누어져 미세한 액적으로서 벌크 수성상으로 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불리운다. 에멀젼은 분산상 외에 추가 성분을 함유할 수 있으며, 수성상, 오일상 또는 별도의 상으로 자체적으로 용액으로 존재할 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약제학적 부형제는 또한 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀젼은 또한 예를 들어 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼의 경우에 2개 이상의 상으로 이루어진 다중 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합 제형은 종종 단순 이원 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물 액적을 내포하는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 또한, 오일 연속 상으로 안정화된 물의 구체에 내포된 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 거의 열역학 안정성이 없음을 특징으로 한다. 흔히, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되고 유화제 또는 제형의 점도를 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼 유형의 연고 기제 및 크림의 경우에서와 같이 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 하나의 상에 도입될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 광범위하게 4가지 범주로 분류될 수 있다: 합성 계면활성제, 천연 유화제, 흡수 기제, 및 미세 분산 고체(문헌참조: Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 및 Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199).
표면 활성제로도 공지된 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위하게 적용할 수 있음을 발견했고, 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 및 Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 1권, 페이지. 199). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이고 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 특성의 비율을 친수성/친유성 균형(HLB)이라고 하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 유용한 도구이다. 계면활성제는 친수성 군의 특성에 따라 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성의 상이한 부류로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 및 Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 285).
에멀젼 제형에 사용되는 천연적으로 존재하는 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파타이드, 렉시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 기제는 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하면서도 무수 라놀린 및 친수성 바셀린(petrolatum)과 같은 반고체 농도를 유지할 수 있는 친수성을 가지고 있다. 미분된 고체는 특히 계면활성제 및 점성 제제와 조합하여 우수한 유화제로서 사용되었다. 이들은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀기트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
다양한 비-유화 재료는 또한 에멀젼 제형에 포함되고, 에멀젼의 성질에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제를 포함한다(문헌참조: Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199).
친수성 콜로이드 또는 하이드로콜로이드는 천연적으로 존재하는 검 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리사카라이드(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 및 카복시프로필셀룰로스) 및 합성 중합체(예를 들어, 카보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)를 포함한다. 이들은 물에 분산되거나 팽창하여 분산 상 액적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부 상의 점도를 증가시켜 에멀젼을 안정화시키는 콜로로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼이 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파타이드와 같은 많은 성분을 포함하기 때문에 이러한 제형은 종종 보존제가 혼입된다. 에멀젼 제형에 포함된 일반적으로 사용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤잘코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제는 또한 제형의 악화를 방지하기 위해 일반적으로 에멀젼 제형에 첨가된다. 사용되는 항산화제는 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔과 같은 자유 라디칼 소거 제 또는 아스코르브산 및 나트륨 메타바이설피트와 같은 환원제 및 시트르산, 타르타르산, 및 리시틴과 같은 항상화 상승제일 수 있다.
피부과, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제제의 적용 및 이들의 제조를 위한 방법이 문헌에서 검토되었다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199). 경구 전달용 에멀젼 제형은 제형이 용이할 뿐만 아니라 흡수 및 생체이용률 측면에서 효능 때문에 매우 널리 사용되어 왔다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 199). 미네랄-오일 기반 완하제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 일반적으로 o/w 에멀젼으로 경구 투여되는 물질 중에 있다.
ii. 마이크로에멀젼
본 발명의 일 구현예에서, RNAi 제제 및 핵산의 조성물은 마이크에멀젼으로 제형화되었다. 마이크로에멀젼은, 단일 광학적으로 등방성 및 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 양친매체의 시스템으로서 정의될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245). 통상적으로 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면활성제 용액에 오일을 분산시킨 다음 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로 중간 쇄 길이의 알코올을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 두 개의 불혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 투명한 분산액으로 기술되었다(문헌참조: Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, 페이지 185~215). 마이크로에멀젼은 일반적으로 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지 여부는 사용된 오일 및 계면활성제의 성질, 및 계면활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적 팩킹에 따라 상이하다(문헌참조: Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, 페이지. 271).
상 도표를 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되었으며, 기술분야의 숙련자에게 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법에 대한 종합적인 지식을 산출해 냈다(문헌참조: 예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1권, 페이지. 335). 통상적인 에멀젼과 비교하여 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정적인 액적의 제형에서 수불용성 약물을 가용화하는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용되는 계면활성제는 단독으로 또는 보조계면활성제와 조합되어, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 에탄올, 1-프로판올, 및 1-부탄올과 같은 단쇄 알콜인 보조계면활성제는 계면활성제 필름에 침투하여 결과적으로 계면활성제 분자 사이에 생성된 보이드(void) 공간으로 인해 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나 마이크로에멀젼은 보조계면활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있으며 무알콜 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 수성 상은 통상적으로 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmula MCM, 지방산 에스테르, 중쇄(C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일과 같은 물질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
마이크로에멀젼은 특히 약물 가용화 및 약물의 증진된 흡수의 관점에서 관심 대상이다. 지질 기반 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o 모두)은 펩타이드를 포함한 약물 의 경구 생체이용률을 증진시키기 위해 제안되었다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허번호 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides 외, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385~1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 가용화, 효소 가수분해로부터 약물의 보호, 계면활성제에 의한 막 유동성 및 투과성 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 증진, 제조 용이성, 고체 투여 형태에 대한 경구 투여의 용이성, 개선된 임상 효능 및 감소된 독성의 이점을 제공한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허번호 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; Constantinides 외, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 외, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138~143). 흔히 마이크로에멀젼은 이들의 성분이 주위 온도에서 함께 합쳐지는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이것은 특히 열 불안정성 약물, 펩타이드 또는 RNAi 제제를 제형화할 때 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 또한 화장품 및 약제학적 적용 모두에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 위장관으로부터 RNAi 제제 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 뿐만 아니라 RNAi 제제 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선할 것으로 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 또한 ?イ렝? 특성을 개선하고 본 발명의 RNAi 제제 및 핵산의 흡수를 증진시키기 위해 소르비탄 모노스테아레이트(그릴 3), 라브라솔 및 투과 증진제와 같은 추가 성분 및 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에 사용되는 투과 증진제는 5개의 광범위한 카테고리--계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이팅제, 및 비-킬레이팅 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로서 분류될 수 있다(문헌참조: Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지. 92). 이들 부류의 각각은 위에서 논의되었다.
iii. 마이크로입자
본 발명의 RNAi 제제는 입자, 예를 들어, 마이크로입자에 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무 건조에 의해 생성될 수 있지만 또한 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이러한 기술의 조합을 비롯한 다른 방법에 의해 생성될 수도 있다.
iv. 투과 증진제
일 구현예에서, 본 발명은 핵산, 특히 RNAi 제제를 동물의 피부에 효율적으로 전달하기 위해 다양한 투과 증진제를 사용한다. 대부분의 약물은 이온화된 및 비이온화된 형태 둘 모두로 용액 중에 존재한다. 그러나, 일반적으로 지용성 또는 친유성 약물만이 용이하게 세포막을 통과한다. 심지어 비친유성 약물이 통과될 막이 투과 증진제로 처리되는 경우 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통한 비친유성 약물의 확산을 돕는 것 외에도 투과 증진제는 또한 친유성 약물의 투과성을 증진시킨다.
침투 증강제는 크게 다섯 가지 범주, 즉 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지. 92) 앞에서 언급된 부류의 침투 증진제 각각은 하기에 보다 상세하게 기재한다.
계면활성제(또는 "표면 활성제")는 수용액에 용해되는 경우 용액의 표면 장력 또는 수용액과 또 다른 액체 간의 계면 장력을 감소시켜 그 결과 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 화학적 실체이다. 담즙염 및 지방산에 더하여, 이들 침투 증강제는, 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지.92); 및 FC-43과 같은 과불화화학 에멀젼을 포함한다 (문헌참조: Takahashi 외, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
침투 증강제로서 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는, 예를 들어, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-rac-글리세롤), 딜라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실라자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이의 모노- 및 디-글리세리드(즉, 올레산염, 라우레이트, 캡레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트, 등)(문헌참조: 예를 들어, Touitou, E., 외 Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; El Hariri 외, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651~654).
담즙의 생리학적 역할에는 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진이 포함된다(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 외 Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, 페이지. 934~935). 다양한 천연 담즙염 및 이들의 합성 유도체는 침투 증강제로서 작용한다. 따라서, 용어 “담즙 염”은 담즙의 임의의 천연 발생 성분뿐만 아니라 이들의 임의의 합성 유도체를 포함한다. 적절한 담즙염은, 예를 들어, 콜산(또는 약학적으로 허용가능한 나트륨 염, 콜산나트륨), 디하이드로콜산(나트륨 디하이드로콜레이트), 데옥시콜산(데옥시콜산나트륨), 글루콜산(글루콜산나트륨), 글리콜산(글루코산 나트륨), 글리코데옥시콜산(글루코데옥시콜산나트륨), 타우로콜산(타우로콜산 나트륨), 타우로데옥시콜산(타우로데옥시콜산 나트륨), 케노데옥시콜산(케노데옥시콜산 나트륨), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)(문헌참조: 예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, 페이지 782~783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; Yamamoto 외, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 외, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579~583).
본 발명과 관련하여 사용되는 킬레이트화제는, 그것과 복합체를 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하는 화합물로서 정의될 수 있으며, 그 결과 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수가 향상될 수 있다. 본 발명에서 투과 증강제로서 이들의 사용과 관련하여, 대부분의 특성화된 DNA 뉴클레아제는 촉매작용을 위해 2가 금속 이온을 필요로 하며 따라서 킬레이트제에 의해 억제되기 때문에, 킬레이트제는 또한 DNase 억제제로서 작용하는 추가적인 이점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315~339). 적합한 킬레이트제는 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨(EDTA), 시트르산, 살리실산염(예를 들어, 살리실산나트륨, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 베타-다이케톤(에나민)의 라우레스-9 및 N-아미노 아실 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.(문헌참조: 예를 들어, Katdare, A. 외, Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33; Buur 외, J. Control Rel., 1990, 14, 43~51).
본원에서 사용되는 것과 같이, 비-킬레이트성 비-계면활성제 투과 증강 화합물은 킬레이트화제 또는 계면활성제로서 중요하지 않은 활성을 나타내지만 그럼에도 불구하고 소화관 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 향상시키는 화합물로서 정의될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1~33). 이러한 부류의 투과 증진제는 예를 들어, 불포화 환형 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체(문헌참조: Lee 외, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 페이지 92); 및 비-스테로이드성 항-염증성 제제, 예를 들어, 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐 부타존(문헌참조: Yamashita 외, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621~626)을 포함한다.
세포 수준에서 RNAi 제제의 흡수를 증진시키는 제제는 또한 본 발명의 약제 및 기타 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙틴(문헌참조: Junichi 외, 미국 특허번호 제5,705,188호), 양이온성 글리세롤 유도체, 및 폴리라이신 같은 다가양이온 분자(국제특허번호 제97/30731호) 또한 dsRNA의 세포 흡수를 증진시키는 것으로 알려져 있다.
에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤과 같은 피롤, 아존, 및 리모넨 및 멘톤과 같은 테르펜을 포함하는 다른 제제는 투여된 핵산의 투과를 증진시키는 데 활용될 수 있다.
vi. 부형제
캐리어 화합물과 대조적으로, "약제학적 캐리어" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제, 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합될 때 목적하는 벌크, 일관성 등을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 통상적인 약제학적 캐리어는 결합제(예를 들어, 사전 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전제(예를 들어, 락토스 및 기타 당, 미세결정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소 칼슘 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여가 아닌 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 유기 및 무기 부형제는 또한 본 발명의 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형은 멸균 및 비멸균 수성 용액, 알콜과 같은 일반적인 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 기제 중의 핵산 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 해롭게 반응하지 않는 비경구 투여가 아닌 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
vii. 다른 성분
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을 당업계에 확립된 사용 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약제학적 활성 물질을 함유할 수 있거나 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 착향제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 멸균화될 수 있고, 경우에 따라, 보조제, 예를 들어 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있고, 이들은 제형의 핵산(들)과 해롭게 상호 작용하지 않는다.
수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 특징화된 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 RNAi 제제 및 (b) 비-RNAi 기전에 의해 기능하고 HTT-관련 장애를 치료하는 데 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다. 이러한 제제의 예는 모노아민 억제제, 레세르핀, 항경련제, 항정신병제 및 항우울제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
그러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물 중에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에 사용하기 위한 용량의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 본원에 특징화된 조성물의 투여량은 일반적으로 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있으며, 독성은 거의 없거나 전혀 없다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징화된 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 용량은 동물 모델에서 제형화하여 화합물의 순환 혈장 농도 범위를 성취하거나 적절한 경우 세포 배양물 중에서 결정된 것과 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 표적 서열의 폴리펩타이드 생성물의 순환 혈장 농도 범위(예를 들어, 폴리펩타이드의 감소된 농도를 성취하는)를 성취할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
이들의 투여에 더해, 전술된 것과 같이, 본 발명에서 특성화된 RNAi 제제는 뉴클레오타이드 반복 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에서 효과적인 다른 공지된 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여 의사는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 효능의 표준 측정을 사용하여 관찰된 결과에 기초하여 RNAi 제제 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
VII. 키트
특정 양상에서, 본 발명은 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어 전구체, 예를 들어 ssiRNA 화합물로 가공될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어 이중 가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물을 암호화하는 DNA 또는 이의 전구체)의 약제학적 제형을 함유하는 적합한 컨테이너를 포함하는 키트를 제공한다.
이러한 키트는 하나 이상의 dsRNA 제제(들) 및 사용 지침서, 예를 들어 예방학적 또는 치료학적 유효량의 dsRNA 제제(들)를 투여하기 위한 지침서를 포함한다. dsRNA 제제는 바이알 또는 미리-충전된 주사기에 있을 수 있다. 키트는 선택적으로 dsRNA 제제를 투여하기 위한 수단(예를 들어, 사전 충전된 주사기와 같은 주사 장치), 또는 C3의 억제를 측정하기 위한 수단(예를 들어, HTT mRNA, HTT 단백질 및/또는 HTT 활성의 억제를 측정하기 위한 수단)을 추가로 포함할 수 있다. HTT의 억제를 측정하기 위한 이러한 수단은 예를 들어 CSF 및/또는 혈장 샘플과 같은 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 발명의 키트는 선택적으로 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량을 결정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 제형의 개별 성분은 하나의 컨테이너, 예를 들어 바이알 또는 미리 충전된 주사기에 제공될 수 있다. 대안적으로, 약제학적 제형의 성분을 2개 이상의 컨테이너, 예를 들어 siRNA 화합물 제조를 위한 하나의 컨테이너 및 캐리어 화합물을 위한 적어도 또 다른 컨테이너에 별도로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 단일 박스에 하나 이상의 컨테이너와 같은 다양한 구성으로 패키징될 수 있다. 예를 들어 키트와 함께 제공된 지침에 따라 다양한 성분들이 조합될 수 있다. 성분들은 예를 들어 약제학적 조성물을 제조 및 투여하기 위해 본원에 기술된 방법에 따라 조합될 수 있다. 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
VII. HTT 발현을 억제하기 위한 방법
본 발명은 또한 세포에서 HTT 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 RNAi 제제, 예를 들어, 세포에서 HTT의 발현을 억제하는 유효한 양의 이중 가닥 RNAi 제제, 본 발명의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물, 또는 본 발명의 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시켜, 세포 내 HTT의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 것과 같이 세포를 2개 이상의 이중 가닥 RNAi 제제를 접촉시키는 단계로서, 예를 들어, 제1 dsRNA 제제는 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하고 제2 dsRNA 제제는 전장 사람 HTT를 표적으로 하고, 예를 들어, 임의의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제는 표 2~5의 dsRNA 제제의 군으로부터 선택되는, 단계를 포함한다. 2개 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 방법의 특정 구현예에서, 2개 이상의 dsRNA 제제는 동일한 조성물, 별도의 조성물, 또는 이들의 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포를 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계로서, 예를 들어, 제1 dsRNA 제제는 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하고 제2 dsRNA 제제는 전장 사람 HTT를 표적으로 하고, 예를 들어, 임의의 2개 이상의 dsRNA 제제는 표 2~5의 dsRNA 제제의 군으로부터 선택되는, 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, HTT는 우선적으로 CNS(예를 들어, 뇌) 세포에서 억제된다.
본원에 기술된 것과 같이, 세포를 2개 이상의 dsRNA 제제와 접촉시키는 단계로서, 예를 들어, 임의의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 또는 4개의 dsRNA 제제는 표 2~5의 dsRNA 제제의 군으로부터 선택되는, 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 세포는 제1 제제(또는 제1 제제를 포함하는 조성물)와 제1 시점에, 제2 제제(또는 제2 제제를 포함하는 조성물)와 제2 시점에, 제3 제제(또는 제3 제제를 포함하는 조성물)과 제3 시점에, 그리고 제4 제제(또는 제4 제제를 포함하는 조성물)와 제4 시점에 접촉하거나; 세포는 동시에 모든 제제(또는 모든 제제를 포함하는 조성물)와 접촉할 수 있다. 대안적으로, 세포는 제1 제제(또는 제1 제제를 포함하는 조성물)와 제1 시점에 접촉하고 제2, 제3, 및/또는 제4 제제(또는 제2, 제3, 및/또는 제4 제제를 포함하는 조성물)과 제2 시점에 접촉할 수 있다. 세포를 본 발명의 둘 이상의 제제(또는 둘 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물)와 접촉시키는 다른 조합도 또한 고려된다.
세포와 RNAi 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 제제의 접촉은 시험관내 또는 생체내 수행될 수 있다. 세포와 RNAi 제제의 생체내 접촉은 대상체, 예를 들어, 사람 대상체 내 세포 또는 세포 군과 RNAi 제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포와 접촉시키는 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다.
세포와의 접촉은 앞서 논의된 것과 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 또한, 세포와의 접촉은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 성취될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어 GalNAc 리간드, 또는 RNAi 제제를 관심 대상의 부위로 유도하는 임의의 다른 리간드이다.
본원에서 사용되는 용어 “억제하는(inhibiting)”은 “감소시키는(reducing)”, “침묵시키는(silencing)” “하향조절하는(downregulating)”, “억제하는(suppressing)”, 및 기타 유사 용어와 상호교환적으로 사용되고, 임의의 억제 수준을 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 RNAi 제제에 대한 억제 수준은 세포 배양 조건에서 평가될 수 있고, 예를 들어, 여기서 세포 배양 내 세포는 10nM 이하, 1nM 이하 등의 세포 부근 농도에서 LipofectamineTM 매개 형질감염을 통해 형질감염된다. 주어진 RNAi 제제의 녹다운은 세포 배양물에서 전처리된 수준 대 세포 배양물에서 후처리된 수준의 비교를 통해 결정될 수 있고, 선택적으로 스크램블된 또는 다른 형태의 대조군 RNAi 제제와 병행하여 처리된 세포와 비교하기도 한다. 이로써, 예를 들어, 바람직하게는 50% 이상의 세포 배양에서의 녹다운은 "억제하는" 또는 "감소시키는", "하향조절하는" 또는 "억제하는(suppressing)" 등이 발생했음을 나타내는 것으로 식별될 수 있다. 표적화된 mRNA 또는 암호화된 단백질 수준의 평가(및 따라서 본 발명의 RNAi 제제에 의해 유발된 "억제하는" 정도 등)는 또한 당업계에 기술된 것과 같이 적절하게 제어된 조건 하에서 본 발명의 RNAi 제제에 대한 생체내 시스템에서 평가될 수 있는 것으로 명백하게 고려된다.
본원에 사용된 “HTT 유전자의 발현을 억제하는" 또는 “HTT의 발현을 억제하는”이라는 문구는 임의의 HTT 유전자(예를 들어, 마우스 HTT 유전자, 랫츠 HTT 유전자, 원숭이 HTT 유전자 또는 사람 HTT 유전자) 및 HTT 단백질을 암호화하는 HTT 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현 억제를 포함한다. 따라서, HTT 유전자는 유전적으로 조작된 세포, 세포 군 또는 유기체의 맥락에서 야생형 HTT 유전자, 돌연변이 HTT 유전자, 또는 유전자이식 HTT 유전자일 수 있다.
“HTT 유전자의 발현 억제”는 HTT 유전자의 임의의 수준의 억제, 예를 들어, HTT 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제, 예컨대 적어도 20%의 억제를 포함한다. 특정 구현예에서, 억제는 적어도 30%, 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 적어도 약 60%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96% 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 검정 방법의 검출 수준 미만이다.
HTT 유전자의 발현은 HTT 유전자 발현과 관련된 임의의 변수의 수준, 예를 들어, HTT mRNA 수준 또는 HTT 단백질 수준, 또는 예를 들어, HTT 돌연변이 단백질의 수준에 기초하여 평가될 수 있다.
억제는 대조군 수준과 비교하여 이러한 변수 중 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소로 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 베이스라인 수준, 또는 처리되지 않거나 대조군(예를 들어, 완충제만의 대조군 또는 불활성 제제 대조군)으로 처리된 유사 대상체, 세포, 또는 세포로부터 결정된 수준일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, HTT 유전자의 발현은 적어도 20%, 30%, 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 검정의 검출 수준 미만으로 억제된다. 특정 구현예에서, 본 방법은 예를 들어, HTT의 발현을 감소시키는 제제로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 것과 같이 HTT 발현의 임상적으로 관련된 억제를 포함한다.
HTT 유전자의 발현 억제는 제1 세포 또는 세포 군(이러한 세포은 예를 들어 대상체로부터 유래된 샘플에 존재)에 의해 발현되는 mRNA 양의 감소에 의해 나타날 수 있고, 여기서 HTT 유전자는 전사되고 (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 발명의 RNAi 제제와 접촉시킴으로써, 또는 본 발명의 RNAi 제제를 세포가 존재하거나 존재했던 대상체에게 투여함으로써) 처리되어, 제1 세포 또는 세포 군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 군과 비교하여 HTT 유전자의 발현이 억제된다(대조군 세포(들)은 RNAi 제제로 처리되지 않거나 관심 유전자에 표적화된 RNAi 제제로 처리되지 않음). 억제 정도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
다른 구현예에서, HTT 유전자의 발현 억제는 HTT 유전자 발현과 기능적으로 연관되는 파라미터, 예를 들어 HTT 단백질 발현의 감소의 측면에서 측정될 수 있다. HTT 유전자 침묵은 발현 작제물로부터 내인성 또는 이종성인 HTT를 발현하는 임의의 세포에서, 및 당업계에 공지된 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
HTT 단백질의 발현 억제는 세포 또는 세포 군에 의해 발현되는 HTT 단백질의 수준(예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플 내 발현된 단백질 수준)의 감소로 나타날 수 있다. 상기 설명한 것과 같이 mRNA 억제의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포 군에서 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포 군에서 단백질 수준의 퍼센트로서 유사하게 표현될 수 있다.
HTT 유전자의 발현 억제를 평가하기 위해 사용할 수 있는 대조군 세포 또는 세포 군은 아직 본 발명의 RNAi 제제와 접촉되지 않은 세포, 또는 세포 군을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포 군은 RNAi 제제를 사용한 대 상체의 치료 전에 개별 대상체(예를 들어, 사람 또는 동물 대상체)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포 군에 의해 발현되는 HTT mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 샘플에서 HTT의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부, 예를 들어 HTT 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 예를 들어 산 페놀/ 구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasyTM RNA 제조 키트(Qiagen®) 또는 PAXgene(PreAnalytix, 스위스)을 사용함을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 사용하는 통상적인 검정 포맷은 핵 전개-온 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정, 노던 블롯팅, 동일계 하이브리드화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환 HTT mRNA는 국제특허번호 제2012/177906호에 기재된 방법을 사용하여 검출할 수 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, HTT의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본원에 사용된 용어 "프로브"는 특정 HTT 핵산 또는 단백질, 또는 이의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성될 수 있거나 적당한 생물학적 제제로부터 유래할 수 있다. 프로브는 특이적으로 표지되도록 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 검정에 사용할 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 한 가지 방법은 단리된 mRNA를 HTT mRNA에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)로 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, mRNA는 예를 들어 아가로스 겔 상에서 단리된 mRNA를 전개시키고 겔로부터 니트로셀룰로스와 같은 막 상으로 mRNA를 전달함으로써 고체 표면에 고정화되고 프로브와 접촉시킨다. 대안적 구현예에서, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정화되고, mRNA는 예를 들어, Affymetrix® 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉된다. 당업자는 HTT mRNA의 수준을 결정하는 데 사용하기 위한 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 적용할 수 있다.
샘플에서 HTT의 발현 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은, 예를 들어 RT-PCR(실험적 실시예는 Mullis, 1987, 미국 특허번호 제4,683,202호에 제시됨), 리가제 연쇄 반응(문헌참조: Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189~193), 자체 지속 시퀀스 복제(문헌참조: Guatelli 외(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874~1878), 전사 증폭 시스템(문헌참조: Kwoh 외(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173~1177), Q-베타 레플리카제(문헌참조: Lizardi 외(1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(문헌참조: Lizardi 외, 미국 특허번호 제5,854,033호) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출에 의해 샘플 중에 예를 들어, mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사 효소(cDNA를 제조하기 위해)의 공정을 포함한다. 이들 검출 기획은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 특정 양상에서, HTT의 발현 수준은 정량적 형광원성 RT-PCR(즉, TaqManTM 시스템)에 의해, Dual-Glo® 루시퍼라제 검정에 의해, 또는 HTT 발현 또는 mRNA 수준의 측정을 위한 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 결정된다.
HTT mRNA의 발현 수준은 막 블롯(노던, 서던, 도트 등과 같은 하이브리드화 분석에 사용된 것과 같은), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본원에 참조로 인용된 미국 특허번호 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조한다. HTT 발현 수준의 결정은 또한 용액 중에 핵산 프로브를 사용함을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 발현의 수준은 분지형 DNA(bDNA) 검정 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 평가된다. 이들 PCR 방법의 사용은 본원에 제공된 실시예에 기재되고 예시된다. 이러한 방법은 또한 HTT 핵산의 검출을 위해 사용될 수 있다.
HTT 단백질 발현의 수준은 단백질 수준의 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광광도측정 검정, 유동 세포측정, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정(RIA), 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등을 포함한다. 이러한 검정은 또한 HTT 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, HTT 관련 질환의 치료에 있어서 본 발명의 방법의 효능은 HTT mRNA 수준의 감소에 의해 평가된다(예를 들어, HTT 수준에 대한 CSF 샘플 및/또는 혈장 샘플, 뇌 생검 등의 평가).
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, RNAi 제제는 대상체 내의 특정 부위에 RNAi 제제가 전달되도록 대상체에게 투여된다. HTT의 발현 억제는 대상체 내 특정 부위로부터 유래된 샘플, 예를 들어, CNS 세포에서 HTT mRNA 또는 HTT 단백질의 수준 또는 수준에서의 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 방법은 예를 들어, HTT의 발현을 감소시키는 제제로 대상체를 치료한 후의 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증되듯이 HTT의 발현의 임상적으로 관련된 억제로서, 예를 들어, 미상 위축의 안정화 또는 억제(예를 들어, 용적측정 MRI(vMRI)에 의해 평가된 것과 같이), 대상체로부터 CSF 샘플에서 신경 필라멘트 경쇄(Nf1) 수준에서의 안정화 또는 감소, 돌연변이 HTT mRNA 또는 절단된 돌연변이 HTT 단백질, 예를 들어, 전장 돌연변이 HTT mRNA 또는 단백질 및 절단된 돌연변이 HTT mRNA 또는 단백질의 하나 또는 둘에서 감소, 및 통합된 헌팅턴병 평가 척도(UHDRS) 점수에서의 안정화 또는 개선을 포함한다.
본원에 사용된 용어 분석물 수준의 검출 또는 결정은 물질, 예를 들어 단백질, RNA가 존재하는지 여부를 결정하기 위한 단계를 수행하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 것과 같이, 검출 또는 결정 방법은 사용된 방법에 대한 검출 수준 미만인 분석물 수준의 검출 또는 측정을 포함한다.
IX. HTT 관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법
본 발명은 또한 본 발명의 RNAi 제제, 본 개시의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 또는 4개 이중 가닥 RNAi 제제(예를 들어, 각각의 제제는 독립적으로 사람 HTT 유전자의 일부를 표적화하며, 예컨대, 제1 dsRNA 제제는 사람 HTT의 엑손 1을 표적으로 하고 제2 dsRNa 제제는 전장 사람 HTT를 표적으로 함), 본 발명의 dsRNA 제제를 각각 독립적으로 포함하며, 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 또는 4개 조성물(예컨대 약제학적 조성물)로서, 본 개시의 RNAi 제제를 함유하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물), 또는 본 개시의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 또는 4개 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 사용하여 세포에서 HTT 발현을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 본 발명의 dsRNA, 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계, 및 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하여 세포에서 HTT 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 시간 동안 포유류를 유지하는 단계를 포함한다. 유전자 발현에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, HTT의 발현 감소는 당업자에게 일상적인 방법, 예를 들어 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 HTT의 mRNA 발현 수준을 결정함에 의해 또는 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술과 같은 당업자에게 일상적인 방법을 사용하여 HTT의 단백질 수준을 결정함에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 세포는 시험관내 또는 생체내 접촉될 수 있으며, 즉, 세포는 대상체내에 있을 수 있다.
본 발명의 방법을 사용한 치료에 적합한 세포는 HTT 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 영장류 세포(예를 들어 사람 세포 또는 비-사람 영장류 세포, 예를 들어 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 비-영장류 세포(예를 들어 랫츠 세포 또는 마우스 세포)일 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 사람 세포, 예를 들어, 사람 CNS 세포이다.
HTT 발현은 세포에서 적어도 약 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 약 100%, 즉 검출 수준 미만으로 억제된다. 바람직한 구현예에서, HTT 발현은 적어도 50%만큼 억제된다.
본 개시의 생체내 방법은 대상체에게
RNAi 제제를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 RNAi 제제는 치료될 포유류의 HTT 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에게 본 발명의 RNAi 제제를 각각 독립적으로 포함하는 2개 이상의, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 조성물이 투여된다. 조성물은 동일하거나 상이할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체에게 각각 독립적으로 HTT 유전자의 일부를 표적으로 하는 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물이 투여된다.
치료될 유기체가 사람과 같은 포유류인 경우, 조성물은 경구, 복막내, 또는 두개내(예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 척추강내), 정맥내, 근육내, 유리체내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장 및 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 포함하는 비경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 척추강내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 투여는 데포 주사를 통해서이다. 데포 주사는 장기간 동안 일정한 방식으로 RNAi 제제를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 목적하는 효과, 예를 들어 목적하는 HTT 억제, 또는 치료학적 또는 예방학적 효과를 수득하기 위해 필요한 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 또한 보다 일관된 혈청 농도를 제공할 수 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 구현예에서, 투여는 펌프를 통해서이다. 펌프는 외용 펌프 또는 수술적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 구현예에서, 펌프는 피하 이식된 삼투압 펌프이다. 다른 구현예에서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 두개내, 정맥내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 다른 구현예에서, 펌프는 RNAi 제제를 CNS에 전달하는 수술적으로 이식된 펌프이다.
투여 방식은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 및 치료될 영역에 기초하여 선택될 수 있다. 투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키기 위해 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 포유류 내 HTT 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 포유류의 세포에서 HTT 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 단계 및 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하여 세포에서 HTT 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 시간 동안 포유류를 유지하는 단계를 포함한다. 유전자 발현에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어, qRT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNA는 약제학적 조성물과 같은 조성물에 존재한다. 일부 구현예에서, 포유동물에게 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 각각의 dsRNA 제제는 조성물에 독립적으로 존재한다. 다른 구현예에서, 포유동물에게 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물이 투여된다.
단백질 생성에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, CNS 생검 샘플 또는 뇌척수액(CSF) 샘플은 HTT 유전자 또는 단백질 발현(또는 이에 따른 프록시)의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 작용한다.
본 발명은 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 치료 방법은 HTT 유전자를 표적화하는 RNAi 제제 또는 HTT 유전자를 표적화하는 RNAi 제제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량으로, 본 발명의 RNAi 제제를 대상체, 예를 들어, HTT 발현의 억제로부터 혜택을 받는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 각각의 dsRNA 제제는 조성물에 독립적으로 존재한다. 다른 구현예에서, 대상체에게 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA를 포함하는 조성물이 투여된다.
또한, 본 발명은 대상체에서 HTT 관련 질환 또는 장애(예를 들어, 헌팅턴병)의 진행, 예를 들어, HTT 관련 질환 또는 장애의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 치료학적 유효량의 임의의 RNAi 제제, 예를 들어, dsRNA 제제, 또는 본원에 제공된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 HTT 관련 질환 또는 장애의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA 제제가 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 각각의 dsRNA 제제는 조성물에 독립적으로 존재한다. 다른 구현예에서, 대상체에게 본 발명의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 dsRNA를 포함하는 조성물이 투여된다.
본원에 기술된 것과 같이, 2개 이상의 dsRNA 제제를 투여하는 단계로서, 예를 들어, 임의의 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 또는 4개의 dsRNA 제제는 표 2~5의 dsRNA 제제의 군으로부터 선택되는, 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 대상체에게 제1 제제(또는 제1 제제를 포함하는 조성물)를 제1 시점에, 제2 제제(또는 제2 제제를 포함하는 조성물)를 제2 시점에, 제3 제제(또는 제3 제제를 포함하는 조성물)를 제3 시점에, 그리고 제4 제제(또는 제4 제제를 포함하는 조성물)를 제4 시점에 투여하거나; 대상체에게 동시에 모든 제제(또는 모든 제제를 포함하는 조성물)를 투여할 수 있다. 대안적으로, 대상체에게 제1 제제(또는 제1 제제를 포함하는 조성물)를 제1 시점에 투여하고 제2, 제3, 및/또는 제4 제제(또는 제2, 제3, 및/또는 제4 제제를 포함하는 조성물)를 제2 시점에 투여할 수 있다. 세포를 본 발명의 둘 이상의 제제와 접촉시키는 다른 조합이 또한 고려된다.
본 발명의 RNAi 제제는 “유리된 RNAi 제제”로서 투여될 수 있다. 유리된 RNAi 제제는 약제학적 조성물의 부재하에 투여된다. 나출된 RNAi 제제는 적합한 완충 용액 중에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수(PBS)이다. RNAi 제제를 함유하는 완충 용액의 pH 및 삼투압은 대상체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 RNAi 제제는 dsRNA 리포좀 제형과 같은 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
HTT 유전자 발현의 감소 또는 억제로부터 혜택을 받을 대상체는 HTT 관련 질환, 예를 들어, 헌팅턴병을 가진 이들이다.
본 발명은 추가로, 예를 들어 HTT 유전자 발현의 감소 또는 억제로부터 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 HTT 관련 장애를 갖는 대상체를 다른 약제 또는 다른 치료학적 방법, 예를 들어, 이들 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 것들과 같은 공지된 약제 또는 공지된 치료학적 방법과 조합하여 치료하기 위한 RNAi 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 방법 및 용도를 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, HTT를 표적화하는 RNAi 제제는, 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재되거나 당업계에 달리 공지된 것과 같은 HTT 관련 장애를 치료하는 데 유용한 제제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, HTT 발현의 감소로부터 혜택을 받을 대상체, 예를 들어 HTT 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하기에 적합한 추가 제제는 HTT의 증상을 치료하기 위해 현재 사용되는 제제를 포함할 수 있다. RNAi 제제 및 추가의 치료학적 제제는 동시에 또는 동일한 조합으로 투여, 예를 들어, 척추강내로 투여될 수 있거나, 추가의 치료학적 제제는 별도의 조성물의 일부로서 또는 별도의 시간에 또는 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
예시적인 추가 치료제는 예를 들어, 모노아민 억제제, 예를 들어 테트라베나진(제나진), 듀테트라베나진(아우스테도), 및 레세르핀, 항경련제, 예를 들어 발프 로산(데파코트, 데파켄, 데파콘) 및 항정신병제인 클로나제팜(클로노핀), 예를 들어 리스페리돈(리스페달) 및 할로페리돌(할돌) 및 항우울제, 예를 들어 파록세틴(팍실)을 포함한다.
일 구현예에서, 본 방법은 표적 HTT 유전자가 감소하도록 본원에서 특징화된 조성물을 적어도 1개월 동안 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 발현은 적어도 2개월, 3개월, 또는 6개월 동안 감소된다.
바람직하게는, 본원에 특성화된 방법 및 조성물에 유용한 RNAi 제제는 표적 HTT 유전자의 RNA(1차 또는 가공)를 특이적으로 표적화한다. RNAi를 사용한 이들 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원에 기재된 것과 같이 제조되고 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 dsRNA의 투여는 HTT 관련 장애를 갖는 환자에게서 이러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상 또는 마커의 감소를 유도할 수 있다. 이러한 맥락에서 "감소"는 이러한 수준에서 통계학적으로 유의미하거나 임상적으로 유의미한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 약 100%일 수 있다.
질환의 치료 또는 예방의 효능은, 예를 들어 질환 진행, 질환 경감, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 유지하는 데 필요한 약물의 용량, 질환 마커의 수준 또는 예방을 위해 치료되거나 표적화된 소정의 질환에 적절한 임의의 다른 측정 가능한 파라미터를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 파라미터 중 어느 하나 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, HTT 관련 장애의 치료 효능은 예를 들어 대상체의 주기적 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 이후 판독값과 초기 판독값의 비교는 의사에게 치료가 효과적인지의 징후를 제공한다. 이러한 파라미터 중 어느 하나 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. HTT를 표적화하는 RNAi 제제 또는 이의 약제학적 조성물의 투여와 관련하여, HTT 관련 장애"에 대해 효과적인"은 임상적으로 적절한 방식으로의 투여가 환자의 적어도 통계학적으로 유의미적인 부분에 대해 이로운 효과, 예를 들어, 증상의 개선, 치유, 질환의 감소, 수명의 연장, 삶의 질에서의 ㅐ선, 또는 HTT 관련 장애 및 관련 원인을 치료하는 것에 익숙한 의사에 의해 일반적으로 긍정적인 것으로 인식되는 다른 효과를 낳은 것을 의미한다.
치료 또는 예방 효과는 질환 상태의 하나 이상의 파라미터에서 통계학적으로 유의미적인 개선이 있거나 그렇지 않으면 예상되는 증상이 악화되거나 발병하지 않음으로써 명백하다. 하나의 예로서, 질환의 측정 가능한 파라미터에서 적어도 10%, 및 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상의 유리한 변화는 효과적인 치료임을 나타낼 수 있다. 소정의 RNAi 제제 약물 또는 이러한 약물의 제형에 대한 효능은 또한 당업계에 공지된 것과 같은 소정의 질환에 대한 실험 동물 모델을 사용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 치료 효능은 마커 또는 증상의 통계적으로 유의미한 감소가 관찰될 때 뒷받침된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 허용되는 질병 중증도 등급 척도에 기초하여 진단 분야의 당업자에 의해 결정되는 질병 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 스케일을 사용하여 측정된 질환의 중증도의 감소를 초래하는 임의의 양성 변화는 본원에 기재된 것과 같은 RNAi 제제 또는 RNAi 제제 제형을 사용한 적절한 치료를 나타낸다.
대상체는 치료학적 양의 dsRNA, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg을 투여받을 수 있다.
RNAi 제제는 규칙적으로 일정 기간 동안 척추강내로, 유리체내 주사를 통해 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 치료 용법 후, 치료는 덜 빈번한 주기로 투여될 수 있다. RNAi 제제의 투여는 예를 들어, 세포, 조직, 혈액, CSF샘플 또는 환자의 다른 구획에서 HTT 수준을, 예를 들어 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70,% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99% 이상까지 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, RNAi 제제의 투여는 예를 들어, 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 환자의 다른 구획에서 HTT 수준을 적어도 50%만큼 감소시킬 수 있다.
전체 용량의 RNAi 제제를 투여하기 전에 환자에게 5% 주입 반응과 같은 보다 적은 용량을 투여하고 알레르기 반응과 같은 부작용에 대해 모니터링될 수 있다. 또 다른 예에서, 환자는 증가된 사이토킨(예를 들어, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같은 원치 않는 면역자극 효과에 대해 모니터링될 수 있다.
대안적으로, RNAi 제제는 피하로, 즉 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 하나 이상의 주사를 사용하여 목적하는 용량, 예를 들어, 월 투여량의 RNAi 제제를 대상체에게 전달할 수 있다. 주사는 일정 기간 동안 반복될 수 있다. 투여는 정기적 주기로 반복될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 치료 용법 후, 치료는 덜 빈번한 주기로 투여될 수 있다. 반복-투여 용법은 예를 들어 매월 또는 분기에 1회, 1년에 2회, 1년에 1회로의 연장과 같이 정기적으로 치료학적 양의 RNAi 제제의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 약 1개월에 1회 내지 약 분기별 1 회(즉, 약 3개월 마다 1회) 투여된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명에서 특성화된 RNAi 제제 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 내용 전체가 참조로 인용된다. 상기 문헌들과 내용상 상충하는 경우가 발생하는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. RNAi 제제 설계계, 합성, 선택, 및 시험관내 평가
본 실시예는 HTT RNAi 제제의 설계, 합성, 선택 및 시험관내 평가를 위한 방법을 기재한다.
시약 공급원
시약 공급원이 본원에 구체적으로 주어지지 않는 경우, 그러한 시약은 분자 생물학에 적용하기 위한 품질/순도 표준에서 분자 생물학용 시약 공급업체로부터 수득될 수 있다.
생물정보학
사람 헌팅틴 전사체(HTT; 사람 NCBI 참조 서열 번호 NM_002111.8; NCBI 유전자 번호: 3064)를 표적으로 하는 siRNA는 맞춤형 R 및 파이톤 스크립트를 사용하여 설계되었다. 사람 NM_002111 REFSEQ mRNA 버전 8은 13,498개 염기 길이를 갖는다.
미변형 HTT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 2에 나타나 있다. 변형 HTT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 3에 나타나 있다.
출원 전반에 걸쳐, 소수가 없는 듀플렉스 명칭은 단지 듀플렉스의 배치 번호를 참조하는 소수를 갖는 듀플렉스 명칭과 동등하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, AD-564727은 AD-564727.1과 동등하다.
DYNABEADS mRNA 단리 키트를 사용한 총 RNA 단리
RNA는 DYNABEAD(Invitrogen, cat#61012)를 사용한 BioTek-EL406 플랫폼 상에서 자동화 프로토콜을 사용하여 단리하였다. 간략하게, 70 μL의 용해/결합 완충액 및 3 μL의 자기 비드를 함유하는 10 μL의 용해 완충액을 세포를 갖는 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리한 다음, 자기 비드를 포획하고 상등액을 제거하였다. 그런 다음 비드 결합된 RNA를 150μL 세척 완충액 A로 2회 세척하고 세척 완충액 B로 1회 세척하였다. 그런 다음 비드를 150 μL의 용출 버퍼로 세척하고, 재포획하고 상드을 제거하였다.
ABI 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, 포스터 시티, 캘리포니아, Cat #4368813)를 사용한 cDNA 합성
1μL의 10X 완충액, 0.4μL의 25X dNTP, 1μL의 10x 무작위 프라이머, 0.5μL의 역전사효소, 0.5μL의 RNase 억제제 및 반응당 6.6μL의 H2O를 포함하는 10μL의 마스터 혼합물을 전술한 단리된 RNA에 첨가했다. 플레이트는 밀봉시키고, 혼합하고, 실온에서 10분동안 전자기 진탕기 상에서 항온처리하고, 이어서 37℃에서 2시간 항온처리하였다.
실시간 PCR
2 μL의 cDNA가 0.5 μL의 사람 또는 마우스 GAPDH TaqMan 프로브(ThermoFisher cat 4352934E 또는 4351309) 및 0.5 μL의 적절한 HTT 프로브(예를 들어, Thermo Fisher로부터 상업적으로 이용가능함) 및 5 μL의 라이트사이클러 480 프로브 마스터 혼합물(Roche Cat # 04887301001)을 포함하는 마스터 혼합물에 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)의 웰당 첨가되었다. 실시간 PCR은 라이트사이클러480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 수행되었다. 각각의 듀플렉스는 N=4로 시험하였고 데이터를 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염된 세포에 대해 정규화하였다. 상대적 배수 변화를 계산하기 위해, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고 적절한 대조군으로 수행된 검정에 대해 정규화하였다.
[표 1] 핵산 서열 제공에서 사용되는 뉴클레오타이드 단량체의 약어. 이들 단량체는, 올리고뉴클레오타이드에 존재할 때, 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 결합되는 것을 이해할 것이고; 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형을 함유하는 경우, 플루오로가 부모 뉴클레오타이드의 해당 위치에서 하이드록시를 대체한다는 것을 이해할 것이다(즉, 이는 2'-데옥시-2'-플루오로뉴클레오타이드임).
실시예 2. HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제의 생체내 평가
전장(FL) 사람 HTT 또는 사람 HTT 엑손 1을 표적으로 하는 관심 듀플렉스를 비사람 영장류에서 생체내로 평가하였다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 듀플렉스를 합성하고 제조하였다.
관심 듀플렉스의 센스 및 안티센스 가닥의 미변형 뉴클레오타이드 서열이 위의 표 2에 제공된다. 관심 듀플렉스의 센스 및 안티센스 가닥의 변형 뉴클레오타이드 서열이 위의 표 3에 제공된다.
3~4 kg의 체중인, 수컷 비사람 영장류에게 2 ml의 용량인 AD-1019465(사람 HTT의 엑손 1을 표적화함; 문헌참조: PCT 출원번호 제PCT/US2020/057849호로, 이의 전문이 본원에 참조로 인용됨), AD-1271082(사람 HTT의 엑손 1을 표적화함), 또는 AD-1271085(전장 사람 HTT를 표적화함)(듀플렉스 당 n=5)의 60 mg의 단일 투여량을 수동 볼루스로 대략 3분에 걸쳐 복강내 투여하고, 이어서 1일차에 인공 CSF(aCSF), 또는 인공 aCSF의 0.3 mL 관류를 투여하였다. 혈장 샘플은 투여 전 -7일 및 투여 후 0.5시간, 2시간, 8시간, 24시간, 및 8, 15, 36, 및 43일차에 수집하였다. 뇌척수액(CSF) 샘플을 큰수조(cisterna magna)로부터 투여 전 -7일차 및 투여 후 2, 8, 15, 36, 43일차에, 그리고 투여 전 1일차에 요추 경막내 공간으로부터 수집하였다. 투여 후 43일차에, 동물을 희생시키고, 식염수로 관류시키고, 조직을 수집하였다. 조직을 siRNA 수준, 면역조직화학(IHC) 분석, 및 제자리 혼성화(ISH) 분석을 위해 포르말린 고정시키고, 급속 냉동시켰다. 수집된 조직에는 뇌(전전두엽 피질, 측두 피질, 해마, 뇌간, 소뇌, 선조체(미상 및 피각/창배핵), 척수(경추, 흉부, 요추), 간, 신장 및 심장이 포함되었다.
도 1에 도시된 것과 같이, 투여 후 24시간 시점에 CSF에서 > 1000 ng/mL siRNA를 갖는 동물에서, 뇌 및 척추 전체에 걸쳐 성공적인 경막내 투여를 나타내는 HTT mRNA의 강력한 녹다운이 있었다. 전장 HTT를 표적으로 하는 듀플렉스(AD-1271085)의 투여는 HTT mRNA를 피질 및 해마에서 약 80%, 그리고 선조체에서 약 60%, 및 HTT의 엑손 1을 표적으로 하는 듀플렉스의 투여(AD-1271082 및 AD-1019465)는 HTT mRNA를 피질 및 해마에서 약 60~70%, 그리고 선조체에서 약 30%로 녹다운하였다.
도 2는 도 1에 도시된 그래프의 표 값이다. 경막내 투여의 고유한 기술적 변동성으로 인해, 투여 후 24시간 시점에 CSF 내 siRNA 수준을 성공적인 투여의 지표로 사용하였다. <1000 ng/ml siRNA 수준을 갖는 동물을 분석에서 제거하였다.
도 3a~3e는, 큰수조로부터의 CSF에 더하여(도 3a), siRNA가 척수강내 투여 후 뇌 전체 영역에서 검출될 수 있음을 입증한다. 특히, siRNA의 최고 농도는 2154~25030 ng/g 범위의 듀플렉스의 경막내 투여 후 모든 동물의 흉추 샘플에서 검출되었다(도 3e). siRNA의 다음 최고 농도는 전전두엽 피질 샘플에서 104~26681 ng/g의 범위로 검출되었으며, 샘플 중 2개는 정량 하한(LLOQ) 미만의 siRNA 농도를 가졌다(도 3b). 선조체에서의 siRNA의 농도는 204~2953 ng/g의 범위였으며, 샘플 중 7개는 siRNA 수준이 LLOQ이었으며(도 3c), 마지막으로, 피각에서, siRNA의 농도의 범위는 134~2463 ng/g이였고, 샘플 중 8개는 siRNA 농도가 LLOQ이었다(도 3d).
또한, 도 4a~4d에 나타낸 것과 같이, 조직 siRNA 수준은 시험된 모든 듀플렉스에 대한 HTT 전사체 녹다운과 상관 관계가 있었다. 또한, 도 5a에 입증된 것과 같이, 뇌 및 척추 조직에 영향을 미치는 것 외에도, 듀플렉스의 경막내 투여는 단일 60 mg 용량의 듀플렉스가 투여된 비사람 영장류로부터의 혈장 샘플에서 siRNA의 수준을 증가시켰다. 또한, 도 5b에 입증된 것과 같이, 낮은 CSF 수준은 경막내 투여 후 30분차에 더 높은 혈장 수준과 상관 관계가 있었으며 그 반대의 경우도 마찬가지였다. 이러한 데이터는 24시간 CSF 검사에 대한 대안으로서 IT 투여의 품질을 결정하기 위해, 경막 내 투여 후 30분차에, 혈장 샘플을 수집할 수 있음을 입증한다.
실시예 3. 전장 HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제의 생체내 평가
전장 사람 HTT(AD-1271085, AD-1271084, 및 AD-1271083) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제제인 토미너센을 표적으로 하는 관심 듀플렉스가, 헌팅턴병(HD)의 당업계에서 인정된 마우스 모델인, YAC128 마우스 모델에서 평가되었다. YAC128 마우스는 효모 인공 염색체(YAC)를 보유하며 이는 이들의 게놈에 128 CAG 반복을 함유하는 전체 사람 HD 유전자를 함유한다. YAC128 마우스는 운동 이상 및 간질신경세포 상실과 관련된 피질 및 선조 위축을 포함하는 연령 의존적 뇌 위축을 발병시킨다. YAC128 마우스는 초기 과잉행동을 나타내는데 이어서 운동 결핍의 발병 및 최종적으로 운동감소증를 나타낸다(문헌참조: 예를 들어, Slow, 외 (2003) Human Molecular Genetics 12(13):1555; Van Raamsdonk, 외 (2005), Human Molecular Genetics 14(24):3823; 및 Carroll, 외 (2011) Neurobiology of Disease 43:257~265).
0일차에, YAC128 마우스(생후 7~13주, 27.7 ± 3.4 그램, n=36)에게 단일 300 μg/kg의 관심 제제 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군을 뇌실내 주사(ICV)로 투여하였다. 투여 후 14일차에, 동물을 희생시켜 전두엽 피질 샘플을 수집하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시키고, mRNA를 추출하고, RT-QPCR 방법으로 분석하였다.
전장 돌연변이체 사람 HTT mRNA에 대한 이들 제제의 효과는 도 6a에 도시되어 있다. 이들 데이터는 시험된 예시적인 듀플렉스가 생체 내에서 돌연변이체 사람 HTT 메신저 RNA의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 입증한다.
웨스턴 블롯 분석을 사용하여 인간 전장 돌연변이 HTT 단백질 수준을 결정하였다.
간략하게, 전두엽 피질 샘플을 프로테아제 억제제와 함께 RIPA 완충액에서 균질화시켰다. 제조사의 지침에 따라 Pierce BCA 키트를 사용하여 총 단백질을 정량화하였다. 총 세포 용해물의 80 μg을 4x LDS 완충액에서 끓여 변성시키고, 3~8% 트리스 아세테이트 구배 겔에서 SDS-PAGE를 수행하여 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 Odyssey 차단 완충액으로 차단하고, 4°C에서 밤새 특정 항체에 혼성화하였다. 다음의 항체를 사용하였다: HTT(밀리포어, 카탈로그 #MAB2166), 칼넥신(밀리포어-시그마, 카탈로그 # C4731, 형광 접합된 이차 항체(감초, 염소 항토끼(Goat anti-rabbit), 카탈로그 #926-32211 및 당나귀 항마우스(Donkey anti-mouse), 카탈로그 #926-680721:5000). Biorad Chemidoc MP 이미징 시스템을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 각 HTT 밴드의 밀도를 칼넥신 로딩 대조군으로 정규화하고, 정규화된 강도를 사용하여 siRNA로 처리된 샘플에서 비히클(1X PBS)로 처리된 대조군에 대한 HTT 녹다운을 정량화하였다.
돌연변이체 사람 HTT 단백질 수준에 대한 이들 제제의 효과는 도 6b에 도시되어 있다. 이들 데이터는 시험된 예시적인 듀플렉스 제제가 생체 내에서 전장 돌연변이체 사람 HTT 메신저 RNA의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 4. 전장 HTT 또는 엑손 1 HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제의 생체내 평가
전장 사람 HTT(AD-1271085) 또는 사람 HTT의 엑손 1(AD-1271082 또는 AD-1019465)을 표적으로 하는 관심 듀플렉스를, 헌팅턴병(HD)의 당업계에서 인정된 마우스 모델인, HD의 Q175DN 이형접합 마우스 모델에서 평가하였다(문헌참조: 예를 들어, Menalled, 외 (2012) PLoS One 7(12):e49838. doi: 10.1371/journal.pone.0049838). Q175DN 마우스에서, 마우스 HTT 엑손 1은 대략 180~220 CAG의 트랙터 반복을 갖는 사람 엑손 1 HTT 서열의 녹인으로 대체된다. HD의 이러한 마우스 모델은 HD 환자와 유사한 여러 선조 마커 및 HD 특징의 생체내 감소를 포함하여 운동, 인지, 분자 및 전기생리학적 이상을 나타낸다. 예를 들어, 동형접합 마우스는 운동 및 악력 이상의 조기 발병(각각 생후 8주 및 4주)을 나타내고, 이어서 생후 30주에 로타로드 및 등반 활동에서의 결핍 및 약 생후 1년에 인지 결핍이 이어졌다. 또한, 생후 약 4.5개월부터, 특히 주간주기의 암기(dark phase)에서 이형접합성 마우스의 명백한 행동 결핍이 존재한다. 체중 감소는 이형접합체 및 동형접합체 모두에서 관찰되고, 동형접합체에서 생존율은 유의미하게 감소한다. 또한, 생후 12주부터 선조 유전자 마커의 조기 및 유의미한 감소가 존재한다.
0일차에, 대략 생후 5주의 이형접합체 Q175DN 마우스(Q175 KI 마우스로도 지칭됨)(혼성)에게 단일 300 μg 투여량의 관심 제제, 인공 CSF(aCSF) 대조군, 또는 비-HTT 표적화 dsRNA 제제(대조군)를 뇌실내 주사(ICV)에 의해 투여하였다. 또한 야생형 마우스도 베이스라인 Htt 전사체 발현을 조절하기 위해 연구 군에 포함시켰다. 연구 설계는 아래 표에 요약되어 있다.
주사 후 4주차에, 마우스에게 뇌 및 척수의 샘플 수집을 수행하였다. 각 마우스로부터의 하나의 척수 샘플(요추 영역) 및 하나의 선조체 샘플을 Htt 변이체 RNA 수준의 QuantiGene 분석에 사용하였다. 3마리의 미치료 WT 마우스를 QuantiGene 분석을 위한 기준 대조군으로서 사용하였다. 척수 샘플(요추 영역)의 하나의 추가 샘플 및 각각의 마우스로부터의 하나의 선조체 샘플을 Htt 야생형 및 돌연변이체 단백질 수준을 결정하기 위한 메소 스케일 발견(MSD) 분석에 사용하였다.
Htt 전사체 평가를 위한 QuantiGene 패널이 아래 표에 제공되어 있다. Atp5b, Eif4a2, 및 Gapdh의 발현 수준은 기준 유전자 대조군으로서 역할하였다. QuantiGene 패널의 각 검정에 의해 평가된 Htt 전사체 부분의 개략도가 도 7에 도시되어 있다.
본 연구에서 수행된 통계적 비교는
(1) 치료군 2~5 대 Si-대조군으로 치료한 Q175 KI 마우스(Dunnett 다중 비교 검정을 이용한 ANOVA); 및
(2) 치료군 1(Si-대조군) 대 치료군 6(WT 미치료 마우스): 비대응 t-검정. 이러한 비교는 (주어진 연령에서) 예상대로 Q175 동물에서 Htt 인트론 전사체(Htt-I1-pA1 및 Htt-I1-pA2)가 증가하는 것을 확인하기 위한 모델(유전자형) 효과에 대한 대조군으로서 작용하였다.
도 8a~8e는 QuantiGene 분석의 결과를 도시한다.
도 8a 및 8b에 도시된 것과 같이, 모든 제제 AD-1271085, AD-1271082, 또는 AD-1019465의 투여는 선조체 및 척수에서, 폴리A 부위 1을 갖는 내인성 마우스 Htt 인트론 1(680 bp 변이체) 및 폴리A 부위 2를 갖는 내인성 마우스 Htt 인트론 1(1145 bp 변이체)의 발현을 억제한다. aCSF 대조군과 비교했을 때, AD-1271082의 뇌실내 주사(사람 HTT의 엑손 1을 표적화함)는 선조체에서 폴리 A-부위 1을 갖는 내인성 마우스 Htt 인트론 1(680 bp 변이체) 발현을 약 30%만큼 억제하고, 선조체에서 폴리 A-부위 2를 갖는 내인성 마우스 Htt 인트론 1(1145 bp 변이체) 발현을 약 18%만큼 억제한다. 도 8c는 유사하게 모든 제제의 투여가 척수 및 선조체에서 전장 Htt의 발현을 억제함을 보여준다. 대조군 aCSF와 비교하여, AD-1271085의 투여는 전장 Htt 발현을 선조체에서 약 52%만큼 억제하였고, AD-1271082의 투여는 전장 Htt 발현을 선조체에서 약 39%만큼 억제하였고, AD-1019465의 투여는 전장 Ht 발현을 선조체에서 약 18%만큼 억제하였다. 또한, 예상대로, 하류 인트론에 대한 검정을 사용하여 Htt 발현을 억제한 제제는 없었다(도 8d 및 8e 참조).
돌연변이 HTT 단백질을 검출하기 위한 MSD 분석 결과는 도 8f에 도시되어 있고, 야생형 HTT 엑손 1 단백질을 검출하기 위한 MSD 분석 결과는 도 8g에 도시되어 있다.
도 8f 및 8g에 도시된 것과 같이, 시험된 모든 듀플렉스는 전사체 및 표적화 특이성에 대한 이들의 다양한 효능 효과를 기반으로 예상대로 일정 수준의 Htt 단백질 녹다운을 나타냈다. 특히, 야생형 Htt 단백질의 녹다운은 AD-1271085에서만 관찰되며, 이는 이러한 듀플렉스가 마우스 야생형 유전자만을 표적화하기 때문이다(도 8g). AD-1019465 및 AD-102521은 모두 표적 사람 HTT 엑손 1만을 표적으로 하며, 이들은 전장 마우스 단백질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다(도 8g). 그러나, 특히 도 8g의 군 3 및 4에 대한 데이터의 철저한 검토는 평균을 왜곡하는 하나의 이상치가 존재하며, 따라서 단백질 KD(도 8c의 전사체 KD에 의해 반영됨)가 존재함을 보여준다. 또한, 도 8f에 도시된 것과 같이, AD-1019465 및 AD-102521 모두는 척수 및 선조체에서 돌연변이 Htt를 강력하게 녹다운한다.
이들 데이터는, 시험된 예시적인 듀플렉스 제제가 생체내에서 Htt 메신저 RNA 및 Htt 단백질의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 추가로 입증한다.
실시예 5. 전장 HTT 또는 엑손 1 HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제를 사용하는 생체내 HTT 단백질 녹다운.
비사람 영장류의 다양한 신경 조직에서 야생형 HTT 단백질을 녹다운하는, 전장 사람 HTT(AD-1271085) 또는 사람 HTT의 엑손 1(AD-1271082 또는 AD-1019465)을 표적으로 하는 관심 듀플렉스의 능력이 평가되었다. 구체적으로, 3~4 kg의 체중인, 수컷 비사람 영장류에게 2 ml의 용량인 AD-1019465(n=5), AD-1271082(n=5), 또는 AD-1271085(n=5)의 60 mg의 단일 투여량을 수동 볼루스로 대략 3분에 걸쳐 척수강내 투여하고, 이어서 1일차에 인공 CSF(aCSF), 또는 인공 aCSF(n=5)의 0.3 mL 관류를 투여하였다. 투여 후 45일차에, 동물을 희생시키고, 식염수로 관류시켜 조직을 수집하였다. 조직을 메조 스케일 발견(MSD) 분석을 위해 급속 냉동시켰다. 수집된 조직에는 전전두엽 피질, 해마, 선조체, 요추 및 흉추가 포함되었다.
도 9에 도시된 것과 같이, HTT 전사체의 억제 후, HTT 단백질은 또한 시험된 siRNA 듀플렉스의 다양한 효능을 반영할 가능성이 있는 다양한 수준으로 감소되었다. AD-1271085가 투여된 동물의 전전두엽 피질 및 해마 조직에서 최대 억제가 관찰되었다.
이들 데이터는 시험된 예시적인 듀플렉스 제제가 생체 내에서 HTT 단백질의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 추가로 입증한다.
단일 척수강 내 투여된 60 mg 용량의 AD-1271085가 168일의 기간 동안 비사람 영장류의 다양한 신경 조직에서 야생형 HTT 단백질을 녹다운하는 능력을 평가하기 위한 또 다른 연구에서, 투여 후 49일차에 시작하여, 듀플렉스가 투여된 15마리의 동물 중 3마리가 이전 연구에서 관찰되지 않은 후기 발병 '이상' 임상 징후(연장된 떨림, 발작, 협응 상실, 및 활동 감소)를 가졌다. 동물을 안락사시키고 연구를 중단시켰다. 후속하여, 투여량 감소는 이 연구에서 관찰된 명백한 부작용을 매개하였다는 점이 주목되었다. 예를 들어, 아래의 실시예 10을 참조한다.
실시예 6. 사람 HTT 엑손 1을 표적으로 하는 듀플렉스의 구조-활동 분석
사람 HTT 엑손 1을 표적으로 하는 듀플렉스의 구조-활성 분석을 수행하고, YAC128 마우스에서 이들 제제의 효능을 평가하였다.
이러한 분석에 기초하여 설계되고 합성된 미변형 HTT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 4에 나타나 있다. 이러한 분석에 기초하여 설계되고 합성된 변형 HTT 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록이 표 5에 나타나 있다.
0일차 및 14일차에, YAC128 마우스(생후 7~13주, 27.7 ± 3.4 그램, n=36)에게 AD-1019476의 300 μg/kg 투여량, AD-1019476의 600 μg/kg 투여량, AD-1443080의 300 μg/kg 투여량, AD-1443080의 600 μg/kg 투여량, AD-1443079의 600 μg/kg 투여량, AD-1800326의 300 μg/kg 투여량(안티센스, 올리고뉴클레오타이드, 토미네르센), 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군을 뇌실내 주사(ICV)로 투여하였다.
투여 후 28일차에, 동물을 희생시키고, 전체 반구 샘플을 수집하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. mRNA 및 단백질을 샘플로부터 추출하고, 전술한 것과 같은 RT-QPCR 방법 또는 웨스턴 블롯 방법에 의해 분석하였다.
돌연변이체 전장 사람 HTT mRNA에 대한 이들 제제의 효과는 도 10a에 도시되어 있고, 야생형 전장 마우스 HTT mRNA에 대한 이들 제제의 효과는 도 10b에 도시되어 있으며, 제제가 사람 돌연변이체 전사체를 녹다운하지 않음을 보여준다. 그러나, 도 10c 및 10d에 도시된 것과 같이, 시험된 모든 제제 및 투여량에 대해 항체 MAB2166(밀리포어, 카탈로그 #MAB2166; 사람 HTT 단백질의 아미노산 445 내지 459에 걸쳐 있는 15-aa 영역에 결합함)을 사용하면, 야생형 전장 마우스 및 돌연변이체 전장 사람 HTT 단백질 둘 모두는 거의 검출가능하지 않으며 단백질 수준을 낮추는 것에 대한 제제의 현저한 효능을 입증한다.
야생형 전장 마우스 HTT 단백질 및 돌연변이체 전장 사람 HTT 단백질의 수준에 대한 제제의 효과를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 제2 항체 D7F7(세포 신호 기술)을 사용하여 반복하였고, 도 10e 및 10f에 도시된 것과 같이, 시험된 제제 및 투여량은 야생형 전장 마우스 HTT 단백질 및 돌연변이체 전장 사람 HTT 단백질을 낮추는 데 있어서 현저한 효능을 다시 입증하였다.
실시예 7. 사람 HTT 엑손 1을 표적으로 하는 듀플렉스의 투여량 반응 분석
제제의 효능을 구별하기 위해 투여량 반응 분석을 수행하여 제제의 최고 용량을 확인하였다.
0일차에, YAC128 마우스(수컷 및 암컷, 생후 6주, n=3, n=2인 경우 300 μg 투여량 제외)에게 AD-1019476 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 투여량 37.5 μg, 75 μg, 150 μg 또는 300 μg을 뇌실내 주사(ICV)로 투여하였다. 투여 후 14일차에, 동물을 희생시키고, 뇌의 두 반구 모두를 수집하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. 단백질을 추출하고 항체 MAB2166 또는 D7F7을 사용해 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
이러한 분석의 결과가 도 11a 및 11b에 제공되어 있으며, AD-1019476의 단일 75 μg 투여량이 최대 녹다운 효능을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 8. 전장 HTT 또는 엑손 1 HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제의 생체내 평가
전장 사람 HTT(AD-1271085) 또는 사람 HTT의 엑손 1(AD-1498524 또는 AD-1019448)를 표적으로 하는 관심 듀플렉스가 HD의 Q175DN 이형접합 마우스 모델에서 평가되었다. Q175DN 마우스는 마우스 HTT 엑손 1을 대체하는 약 180~220 CAG의 트랙터 반복을 갖는 사람 엑손 1 HTT 서열의 녹인을 보유한다.
0일차에, 생후 대략 9개월 이형접합 Q175DN 마우스(Q175 HET 마우스로도 지칭됨)(혼성)에게, 단일 300 μg 투여량의 관심 제제, 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군을 뇌실내 주사(ICV)에 의해 투여하였다. 또한 야생형 마우스는 베이스라인 Htt 전사체 발현을 조절하기 위해 연구 군에 포함되었다. 연구 설계는 아래 표에 요약되어 있다.
투여 후 1개월 또는 3개월차에(각각 생후 10개월 또는 12개월 마우스) 마우스를 대상으로 척수 및 선조체 조직 샘플을 포함하는 조직 수집하였다. 각각의 마우스로부터의 하나의 척수 샘플 및 하나의 선조체 샘플이 Htt 변이체 RNA 수준의 QuantiGene 분석에 사용되었다. Si-대조군으로 치료한 WT 마우스를 QuantiGene 분석을 위한 기준 대조군으로서 사용하였다.
Htt 전사체 평가를 위한 QuantiGene 패널이 아래 표에 제공되어 있다. Atp5b, Eif4a2, 및 Gapdh의 발현 수준은 기준 유전자 대조군으로서 역할하였다. QuantiGene 패널의 각 검정에 의해 평가된 Htt 전사체 부분의 개략도가 도 7에 도시되어 있다.
도 12a~12j는 QuantiGene 분석의 결과를 도시한다.
도 12a, 12b, 12f 및 도 12g에 나타낸 것과 같이, Si-대조군으로 치료한 WT 마우스와 비교하여 (Htt-I1-pA1 및 Htt-I1-pA2를 사용한) HTT를 함유하는 인트론 서열의 발현이 Si-대조군으로 치료한 Q175 HET 마우스에서 상당히 높게 관찰되어, 이형접합 동물에서 확장된 CAG 반복 삽입체에 의해 생성된 돌연변이 HTT 단편의 존재를 확인하였다. 이러한 효과는 척수 및 선조체 조직 모두에서, 그리고 두 결과변수 모두에서 관찰되었다(생후 10개월 및 12개월). 반대로, (Htt-FL-(엑손 50~53)를 사용한) 전장 Htt의 발현은 Si-대조군으로 치료한 WT 마우스의 두 조직 모두 및 두 결과변수 모두에서 더 높았다(도 12e 및 12j).
시험된 제제는 인트론/스플라이스 변이체(Htt-I1-pA1 및 Htt-I1-pA2) 프로브에 의해 검출된 전사체의 발현뿐만 아니라 전장 HTT 전사체의 발현 모두를 감소시키는 가변적인 경향을 입증하였으며, 특히 AD-1498524의 투여가 생후 12개월(투여 후 3개월) 코호트에서 현저한 효과를 초래하였다.
모든 제제는 조직 및 연령 코호트 모두에서 Si-대조군으로 치료한 Q175 HET에 비해 전장 HTT 전사체(Htt-FL-(엑손_50~53)의 발현에 대한 감소 효과를 입증하였다. 이는 WT 동물과 비교하여 전장 형태의 저하를 보다 더 초래하였다.
Htt-I1-3'에 대한 일부 비교에서 관찰된 통계적으로 유의미한 효과(암호 폴리(A) 신호에서 종결되지 않은 불완전하게 스플라이싱된 인트론 1 서열을 나타냄)는 제제의 일부 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, (다른 표적과 비교하여) Htt-I1-3'의 순형광 및 정규화된 발현 수준은 전반적으로 낮으며, 이는 이러한 표적의 낮은 수준이 매우 생물학적으로 유의미하지 않을 수 있음을 시사한다.
전장 사람 HTT(AD-1271085) 또는 사람 HTT의 엑손 1(AD-1498524 또는 AD-1019448)을 표적으로 하는 관심 듀플렉스, 또는 인공 CSF(aCSF) 대조군의 단일 300 μg 투여량을 뇌실내 주사(ICV)에 의해 주사 후 1개월 차 및 3개월차에 투여받은 Q175DN 마우스로부터 수집된 추가 조직 샘플(54개의 우측 피질 조직 샘플 및 54개의 경추 척수 조직 샘플)에 메조 스케일 발견(MSD) 분석을 수행하여 돌연변이체, 야생형 및 총 HTT 단백질 수준을 결정하였다.
모든 피질 및 척수 조직 샘플을 표준 절차에 따라 균질화하였다. MP 바이오메디칼(Cat# 6913)으로부터의 2-mL 용해 매트릭스 D 튜브 중 300 μl MSD 용해 완충액 1에서 피질 샘플을 균질화하였다. MP 바이오메디칼(cat# 6961)으로부터의 2-mL 용해 매트릭스 Z 튜브 중 250 μl MSD 용해 완충액 1에서 척수 샘플을 균질화하였다. 조직을 MSD 용해 완충액 1을 함유하는 조직 균질화 튜브로 옮겼다. FastPrep-24 고속 벤치탑 균질화기를 사용하여, 30초의 3회 회전으로 6m/s(피질) 또는 6.5m/s(척수)로 조직을 균질화하였다. 튜브를 4°C에서 20,800 g으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 1.5-mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 옮기고, 4°C에서 20,800 g으로 20분 동안 다시 원심분리하였다. 후속 단백질 결정 및 MSD 분석을 위해 용해물을 분취하고 -80°C에서 보관하였다.
BCA 분석을 수행하여 모든 샘플의 총 단백질 농도를 결정하였다. 각각의 개별 샘플의 BCA 결과를 MSD 분석 후, 데이터 분석 중에, 로딩된 단백질의 실제 양을 보정하기 위해 사용하였다.
돌연변이 HTT 및 총 HTT 결정을 위한 MSD 검정은 아래 표에 제공된다. 모든 피질 및 척수 샘플을 코팅/차단된 MSD 플레이트 상에 로딩하고 플레이트 간 기술 복제물로 시험하였다. 검출 항체 및 스트렙타비딘-설포태그(MSD)로 순차적으로 항온처리한 후, MSD S600 이미저 상에서 플레이트를 판독하였다. MSD 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선으로부터 HTT 농도를 계산하였다. 로딩된 단백질 농도를 사용하여 fmol/mg 총 HTT 단백질로 역계산하였다.
피질 샘플에서 돌연변이 HTT 및 총 HTT 단백질을 검출하는 MSD 분석의 결과는 도 12k에 도시되어 있고, 척수 샘플에서 돌연변이 HTT 및 총 HTT 단백질을 검출하는 MSD 분석의 결과는 도 12l에 도시되어 있다.
도 12k에 도시된 것과 같이, 돌연변이 HTT 수준은 Q175 HET Si-대조군 군과 비교하여 제제(AD-1271085, AD-1498524, 또는 AD-1019448)로 치료한 Q175 HET 마우스에서 유의미하게 낮아졌다. 예상대로, 돌연변이 HTT는 임의의 WT 샘플에서 검출되지 않았다. 유사하게, 총 마우스 HTT 수준은 Q175 HET Si-대조군 군과 비교하여 제제(AD-1271085, AD-1498524, 또는 AD-1019448)로 치료한 Q175 HET 마우스에서 유의미하게 낮아졌다. 야생형 군의 총 마우스 HTT 수준은 예상대로 Q175 Het 군의 대략 2배였다. Q175 Het Si-대조군의 돌연변이 HTT(**) 및 총 마우스 HTT(*) 수준을 제외하고, 돌연변이 HTT 또는 총 마우스 HTT 수준에서 10개월 및 12개월 평가변수 사이에 통계적 차이는 관찰되지 않았다(양측 비쌍 t 검정).
유사한 결과가 척수 조직에서 나타났다. 도 12l에 도시된 것과 같이, 돌연변이 HTT 수준은 Q175 HET Si-대조군 군과 비교하여 제제(AD-1271085, AD-1498524, 또는 AD-1019448)로 치료한 Q175 HET 마우스에서 유의미하게 낮아졌다. 예상대로, 돌연변이 HTT는 임의의 WT 샘플에서 검출되지 않았다. 총 마우스 HTT 수준은 Q175 Het Si-대조군 군과 비교하여 제제((AD-1271085, AD-1498524, 또는 AD-1019448)로 치료된 Q175 HET 마우스에서 유의미하게 낮아졌다. WT 군의 총 마우스 HTT 수준은 대략 Q175 Het 군의 2배였다. Q175 Het AD-1498524 군의 mHTT (****) 수준을 제외하고, 돌연변이 HTT 또는 총 마우스 HTT 수준에서 10개월 및 12개월 평가변수 사이에 통계적 차이는 관찰되지 않았다(양측 비쌍 t 검정).
따라서, 시험된 모든 듀플렉스는 Si-대조군에 비해 돌연변이 HTT 및 총 마우스 HTT 단백질 수준에서의 유의미한 감소를 나타냈다. 특히, AD-1271085 또는 AD-1498524를 투여한 후 AD-1019448을 투여한 후에 돌연변이 HTT 및 총 HTT 단백질 수준 모두의 가장 강력한 억제가 관찰되었다.
결론적으로, 이들 데이터는 시험된 예시적인 듀플렉스 제제가 생체 내에서 돌연변이 HTT 메신저 RNA 및 돌연변이 HTT 단백질의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 추가로 입증한다.
실시예 9. 전장 HTT를 표적으로 하는 RNAi 제제를 사용하는 생체내 HTT 단백질 녹다운
비사람 영장류에게 낮은 투여량(예를 들어, 3 mg 및 10 mg)으로 투여된, 전장 사람 HTT를 표적으로 하는 관심 듀플렉스(AD-1271085)의 다양한 신경 조직에서 야생형 HTT 전사체 및 단백질을 녹다운하는 능력이 평가되었다.
구체적으로, 암컷 비사람 영장류에게 2 ml의 용량인 AD-1271085 (n=8)의 3 mg의 단일 투여량 또는 10 mg의 단일 투여량을 수동 볼루스로 대략 3분에 걸쳐 척수강내 투여하고, 이어서 1일차에 인공 CSF(aCSF), 또는 인공 aCSF(n=3)의 0.3 mL 관류를 투여하였다. 투여 후 33일차에, 동물을 희생시키고, 식염수로 관류시키고, 조직을 수집하였다. 조직을 메조 스케일 발견(MSD) 분석을 위해 급속 냉동시켰다. 수집된 조직에는 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피각, 선조체 미상, 및 척추 L1~L3(요추)이 포함되었다. 실험 설계는 아래 표에 제공되어 있다:
도 13a에 도시된 것과 같이, 3 mg 투여량의 AD-1271085를 투여한 결과 전전두엽 피질 및 해마에서 HTT 전사 수준이 약 55% 감소하였다. 10 mg 투여량의 AD-1271085의 투여한 결과 HTT 전사 수준이 전전두엽 피질 및 해마에서 약 70% 감소하고, 선조체 미상에서 약 20% 감소하였다. 각 투여량에서, 각 동물에 대한 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피각, 및 선조체 미상 샘플에서의 HTT 전사 수준이 도 13b에 도시되어 있다.
HTT 전사체의 억제 후, HTT 단백질 또한 감소되었다(도 13c). 3 mg의 AD-1271085를 투여받은 동물의 전전두엽 피질 및 해마에서 약 65%의 억제가 관찰되었고, 선조체 미상에서 약 40~50%의 억제가 관찰되었다. 10 mg 투여량의 AD-1271085의 투여한 결과 HTT 단백질 수준이 전전두엽 피질 및 해마에서 약 80% 감소하고, 선조체 미상에서 약 50~60% 감소하였다. 각 투여량에서, 각 동물에 대한 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피각, 및 선조체 미상 샘플에서의 HTT 단백질 수준이 도 13d에 도시되어 있다.
도 13e는 전전두엽 피질, 해마, 선조체 미상, 선조체 피각, 요추 조직 샘플에서 HTT 전사체 및 단백질 저하에 대한 AD-1271085의 효과의 상관관계를 도시한다.
또한, H&E의 조직병리학적 분석; 및 33일차의 말단 희생에서, 검사된 뇌 및 척수로부터의 IBA-1 염색된 피질 또는 해마 절편은 3mg/kg 또는 10mg/용량을 투여한 후 AD-1271085와 관련된 신경/교세포 괴사의 현미경적 증거가 없음을 입증하였다.
이들 데이터는, 예시적인 듀플렉스 제제인 AD-1271085가 3 mg 및 10 mg의 더 낮은 용량에서도 생체 내에서 HTT 전사체 및 단백질의 수준을 효과적으로 감소시켰음을 추가로 입증한다.
실시예 10. HTT의 엑손 1을 표적화하는 RNAi 제제의 생체 내 HTT 단백질 녹다운
비사람 영장류의 다양한 신경 조직에서 야생형 HTT 전사체 및 단백질을 녹다운하는 사람 HTT의 엑손 1(AD-1498524, AD-1498526 및 AD-1498528)을 표적으로 하는 선택된 관심 듀플렉스의 능력이 평가되었다. 구체적으로, 암컷 비사람 영장류에게 2 ml의 용량인 제제(n=5)의 60 mg의 단일 투여량을 수동 볼루스로 대략 3분에 걸쳐 척수강내 투여하고, 이어서 1일차에 인공 CSF(aCSF), 또는 인공 aCSF(n=3)의 0.3 mL 관류를 투여하였다. 투여 후 59일차에, 동물을 희생시키고, 식염수로 관류시키고, 조직을 수집하였다. 수집된 조직에는 전전두엽 피질, 해마, 선조체 피각, 선조체 미상, 및 요추가 포함되었다. 전사체 수준을 RT-PCR 분석에 의해 결정하고, 단백질 수준을 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC/MS)에 의해 정량화하였다.
실험 설계는 아래 표에 제공되어 있다:
도 14a에 도시된 것과 같이, HTT 단백질은 시험된 제제의 투여 후 감소되었다. AD-1498524가 투여된 동물에서, 특히 전전두엽 피질 및 선조체 미상에서 유의미한 억제가 관찰되었다. 시험된 모든 제제에 대한 전사체 수준에서 유사한 억제 효과가 관찰되었으며, AD-1498524를 투여받은 동물은 모든 조직 샘플에 걸쳐 HTT 전사체의 가장 유의미한 저하를 나타냈다(도 14b). 또한 각 조직 샘플에서의 HTT mRNA 수준은 도 14c에 도시되어 있다. 도 14d는 조직 샘플에서 HTT 전사체와 단백질 수준에 대한 억제 효과의 상관관계를 보여준다.
이들 데이터는 시험된 예시적인 듀플렉스 제제가 생체 내에서 HTT 메신저 RNA 및 HTT 단백질의 수준을 효과적으로 감소시킨다는 것을 추가로 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> HUNTINGTIN (HTT) IRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-14420 <140> <141> <150> 63/167,140 <151> 2021-03-29 <160> 101 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctgccggga cgggtccaag atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag 60 agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga 120 ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga 180 gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 240 gcagcagcag cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca 300 gcttcctcag ccgccgccgc aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc 360 gccgcccccg ccgccacccg gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccaaagaa 420 agaactttca gctaccaaga aagaccgtgt gaatcattgt ctgacaatat gtgaaaacat 480 agtggcacag tctgtcagaa attctccaga atttcagaaa cttctgggca tcgctatgga 540 actttttctg ctgtgcagtg atgacgcaga gtcagatgtc aggatggtgg ctgacgaatg 600 cctcaacaaa gttatcaaag ctttgatgga ttctaatctt ccaaggttac agctcgagct 660 ctataaggaa attaaaaaga atggtgcccc tcggagtttg cgtgctgccc tgtggaggtt 720 tgctgagctg gctcacctgg ttcggcctca gaaatgcagg ccttacctgg tgaaccttct 780 gccgtgcctg actcgaacaa gcaagagacc cgaagaatca gtccaggaga ccttggctgc 840 agctgttccc aaaattatgg cttcttttgg caattttgca aatgacaatg aaattaaggt 900 tttgttaaag gccttcatag cgaacctgaa gtcaagctcc cccaccattc ggcggacagc 960 ggctggatca gcagtgagca tctgccagca ctcaagaagg acacaatatt tctatagttg 1020 gctactaaat gtgctcttag gcttactcgt tcctgtcgag gatgaacact ccactctgct 1080 gattcttggc gtgctgctca ccctgaggta tttggtgccc ttgctgcagc agcaggtcaa 1140 ggacacaagc ctgaaaggca gcttcggagt gacaaggaaa gaaatggaag tctctccttc 1200 tgcagagcag cttgtccagg tttatgaact gacgttacat catacacagc accaagacca 1260 caatgttgtg accggagccc tggagctgtt gcagcagctc ttcagaacgc ctccacccga 1320 gcttctgcaa accctgaccg cagtcggggg cattgggcag ctcaccgctg ctaaggagga 1380 gtctggtggc cgaagccgta gtgggagtat tgtggaactt atagctggag ggggttcctc 1440 atgcagccct gtcctttcaa gaaaacaaaa 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gctgcttgtc aaccacaccg actaccgctg 5700 gtgggcagaa gtgcagcaga ccccgaaaag acacagtctg tccagcacaa agttacttag 5760 tccccagatg tctggagaag aggaggattc tgacttggca gccaaacttg gaatgtgcaa 5820 tagagaaata gtacgaagag gggctctcat tctcttctgt gattatgtct gtcagaacct 5880 ccatgactcc gagcacttaa cgtggctcat tgtaaatcac attcaagatc tgatcagcct 5940 ttcccacgag cctccagtac aggacttcat cagtgccgtt catcggaact ctgctgccag 6000 cggcctgttc atccaggcaa ttcagtctcg ttgtgaaaac ctttcaactc caaccatgct 6060 gaagaaaact cttcagtgct tggaggggat ccatctcagc cagtcgggag ctgtgctcac 6120 gctgtatgtg gacaggcttc tgtgcacccc tttccgtgtg ctggctcgca tggtcgacat 6180 ccttgcttgt cgccgggtag aaatgcttct ggctgcaaat ttacagagca gcatggccca 6240 gttgccaatg gaagaactca acagaatcca ggaatacctt cagagcagcg ggctcgctca 6300 gagacaccaa aggctctatt ccctgctgga caggtttcgt ctctccacca tgcaagactc 6360 acttagtccc tctcctccag tctcttccca cccgctggac ggggatgggc acgtgtcact 6420 ggaaacagtg agtccggaca aagactggta cgttcatctt gtcaaatccc agtgttggac 6480 caggtcagat tctgcactgc tggaaggtgc 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Claims (145)

  1. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 HTT를 암호화하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상보성 영역은 듀플렉스 AD-1019465 및 AD-1019476를 제외한, 표 2~5 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  2. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 26~77; 또는 142~202의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  3. 제2항에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 27~49; 147~169; 또는 173~195의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  4. 제3항에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 147~169와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-1498524, AD-1498526, 또는 AD-1498528으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-1498524의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  7. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4391~4669; 또는 6009~6037의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 6의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  8. 제2항에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420; 4403~4425; 또는 6512~6534의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  9. 제8항에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4398~4420과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-1271085, AD-1271083, 또는 AD-1271084으로 이루어진 군으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  11. 제10항에 있어서, 안티센스 가닥은 AD-1271085의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합되는, dsRNA 제제.
  13. 제12항에 있어서, 친유성 모이어티는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역 내의 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 안티센스 가닥 상에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 링커 또는 캐리어를 통해 적어도 하나의 가닥 상에서 하나 이상의 내부 위치에 접합되는, dsRNA 제제.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, logKow에 의해 측정된 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과하는, dsRNA 제제.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 미결합된 분획에 의해 측정된 dsRNA 제제의 소수성은 0.2를 초과하는, dsRNA 제제.
  18. 제17항에 있어서, 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용한 전기영동 이동성 변화 검정인, dsRNA 제제.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 2개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  20. 제19항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 각각의 말단으로부터 말단인 3개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  22. 제21항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 5’-말단으로부터 계수하여, 위치 9~12를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  23. 제21항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 3’-말단으로부터 계수하여, 위치 11~13을 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  24. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  25. 제24항에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5’-말단으로부터 계수하여, 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  26. 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 11~13, 및 5'-말단으로부터 계수하여, 안티센스 가닥 상의 위치 12~14를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 제제.
  27. 제12항 내지 제26항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5’-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 4~8 및 13~18 및 안티센스 가닥 상의 위치 6~10 및 15~18로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 각각의 가닥의 5’-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15, 및 17 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 내부 위치 중 하나 이상에 접합되는, dsRNA 제제.
  29. 제13항에 있어서, 이중 가닥 영역에서의 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 배제하는, dsRNA 제제.
  30. 제12항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드이고, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 접합되는, dsRNA 제제.
  32. 제12항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 지방족, 지환족, 또는 폴리지환족 화합물인, dsRNA 제제.
  33. 제32항에 있어서, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥산올, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 군, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  34. 제33항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 히드록실, 아민, 카르복시산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유하는, dsRNA 제제.
  35. 제34항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 제제.
  36. 제34항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 제제.
  37. 제36항에 있어서, 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄는 가닥의 5'- 말단으로부터 계수하여, 위치 6에 접합되는, dsRNA 제제.
  38. 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 내부 위치(들) 또는 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)을 대체하는 캐리어를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  39. 제38항에 있어서, 캐리어는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 환형 작용기이거나; 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격을 기반으로 하는 비환형 모이어티인, dsRNA 제제.
  40. 제12항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 결합, 클릭 반응의 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 dsRNA 제제에 접합되는, dsRNA 제제.
  41. 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 뉴클레오염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오시드 간 결합에 접합되는, dsRNA 제제.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  43. 제42항에 있어서, 5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오타이드 및 5개 이하의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드는 미변형 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  44. 제43항에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3’-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2’-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2’-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2’-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 2’-5’-결합된 리보뉴클레오타이드(3’-RNA), 잠긴 뉴클레오타이드, 잠김 해제된 뉴클레오타이드, 입체적으로 제한된 뉴클레오타이드, 구속된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2’-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2’-O-알릴-변형 뉴클레오타이드, 2’-C-알킬-변형 뉴클레오타이드, 2’-히드록실-변형 뉴클레오타이드, 2’-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드, 2’-O-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 뉴클레오타이드를 포함하는 비-천연 염기, 테트라하이드로피란 변형 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형 뉴클레오타이드, 시클로헥세닐 변형 뉴클레오타이드, 5’-포스포로티오에이트 군을 포함하는 뉴클레오타이드, 5’-메틸포스포네이트 군을 포함하는 뉴클레오타이드, 5’ 포스페이트 또는 5’ 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성질체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-히드록실-테트라히드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2’-데옥시티미딘-3’포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2’-데옥시구아노신-3’-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체에 결합된 말단 뉴클레오타이드, 도데카노산 비스데실아미드 군; 아시티딘-2`-포스페이트, 구아노신-2’-포스페이트, 우리딘-2`-포스페이트, 아데노신-2’-포스페이트, 2’-O-헥사데실-아데노신-3’-포스페이트, 2’-O-헥사데실-시티딘-3’-포스페이트, 2’-O-헥사데실-구아노신-3’-포스페이트, 및 2’-O-헥사데실-우리딘-3’-포스페이트의 군, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  46. 제45항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT), 잠긴 뉴클레오타이드, 무염기 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  47. 제45항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오타이드, 글리콜 변형 뉴클레오타이드(GNA), 및 비닐-포스포네이트 뉴클레오타이드의 군; 및 이들의 조합으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  48. 제45항에 있어서, 뉴클레오타이드 상의 변형 중 적어도 하나는 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형인, dsRNA 제제.
  49. 제48항에 있어서, 열 불안정화 뉴클레오타이드 변형은 무염기 변형; 듀플렉스 내 반대 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 불안정화 당 변형, 2'-데옥시 변형, 비환형 뉴클레오타이드, 2’-5’-결합된 리보뉴클레오타이(3’-RNA), 잠김 해제된 핵산(UNA), 및 글리세롤 핵산(GNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  50. 제45항에 있어서, 변형 뉴클레오타이드는 3’-말단 데옥시-티민 뉴클레오타이드(dT)의 짧은 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
  51. 제45항에 있어서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2’-O-메틸, GNA 및 2’플루오로 변형인, dsRNA 제제.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  53. 제52항에 있어서, dsRNA 제제는 6~8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간 결합을 포함하는, dsRNA 제제.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 3’ 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  56. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3’ 오버행을 포함하는, dsRNA 제제.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 15~30개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  58. 제57항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~23개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  59. 제57항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17~25개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  60. 제57항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 23~27개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  61. 제57항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19~21개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  62. 제57항에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 21~23개 뉴클레오타이드 쌍인, dsRNA 제제.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 19~30개 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  64. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 19~23개 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  65. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 21~23개 뉴클레오타이드인, dsRNA 제제.
  66. 제12항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스의 관능화된 모노사카라이드 또는 올리고사카라이드로 이루어진 군 및 이의 조합으로부터 선택된 바이오 절단가능한 링커를 통해 접합되는, dsRNA 제제.
  67. 제12항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 3’ 말단은 아민을 갖는 환형 작용기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 환형 작용기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 군으로으로부터 선택되는, dsRNA 제제.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
    센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위 또는 Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제
  69. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
    센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  70. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
    센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  71. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
    센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  72. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 3’ 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형,
    안티센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형, 및
    센스 가닥의 5’ 말단에서 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하고, Rp 또는 Sp 배위에서 결합 인 원자를 갖는 말단, 키랄 변형을 추가로 포함하는, dsRNA 제제
  73. 제1항 내지 제72항에 있어서, 안티센스 가닥의 5’-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함하는, dsRNA 제제.
  74. 제73항에 있어서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, dsRNA 제제.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5-말단의 1 위치에서 염기쌍은 AU 염기쌍인, dsRNA 제제.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 총 21개 뉴클레오타이드를 갖고 안티센스 가닥은 총 23개 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 제제.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UAUCAGCUUUUCCAGGGUCGCCG -3’ (서열번호 53)을 포함하는, dsRNA 제제.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- GCGACCCUGGAAAAGCUGAUA -3’ (서열번호 40)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UAUCAGCUUUUCCAGGGUCGCCG -3’ (서열번호 53)을 포함하는, dsRNA 제제.
  79. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Chd)는 2’-O-헥사데실-시토신-3’-포스페이트이고; C2p는 시티딘-2’-포스페이트이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  80. 제79항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  82. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’-VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)를 포함하는, dsRNA 제제.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열5’- gscsgac(Chd)CfuGfGfAfaaagcugasusa -3’(서열번호 65)으로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’-VPusAfsucdAg(C2p)uuuudCcAfgdGgucgcscsg -3’(서열번호 79)으로 이루어지는, dsRNA 제제.
  85. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UAGGACTUGAGGGACUCGAAGGC -3’(서열번호 57)을 포함하는, dsRNA 제제.
  86. 제1항 내지 제73항 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUA -3’(서열번호 44)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UAGGACTUGAGGGACUCGAAGGC -3’(서열번호 57)을 포함하는, dsRNA 제제.
  87. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Ahd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; Tgn는 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S -이성질체이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  88. 제87항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)를 포함하는, dsRNA.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- csusucg(Ahd)GfuCfCfCfucaaguccsusa -3’(서열번호 70)으로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfsggac(Tgn)ugagggAfcUfcgaagsgsc -3’(서열번호 83)으로 이루어지는, dsRNA.
  93. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UUAAAAGCAGAACCUGACCGGCC -3’(서열번호 59)을 포함하는, dsRNA 제제.
  94. 제1항 내지 제76항 및 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- CCGGUCAGGUUCUGCUUUUAA -3’(서열번호 46)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UUAAAAGCAGAACCUGACCGGCC -3’(서열번호 59)을 포함하는, dsRNA 제제.
  95. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Chd)는 2’-O-헥사데실-시토신-3’-포스페이트이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  96. 제95항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)를 포함하는, dsRNA.
  100. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- cscsggu(Chd)AfgGfUfUfcugcuuuusasa -3’(서열번호 72)으로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusUfsaadAadGcagaacCfudGaccggscsc -3’(서열번호 85)으로 이루어지는, dsRNA.
  101. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU -3’(서열번호 16)을 포함하는, dsRNA 제제.
  102. 제1항 내지 제76항 및 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- GCUAUUCAUAAUCACAUUCGA -3’ (서열번호 15)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UCGAAUGUGAUUAUGAAUAGCAU -3’(서열번호 16)을 포함하는, dsRNA 제제.
  103. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-우리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  104. 제103항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)를 포함하는, dsRNA 제제.
  108. 제103항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsuau(Uhd)CfaUfAfAfucacauucsgsa -3’(서열번호 17)으로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsgaaUfgUfGfauuaUfgAfauagcsasu -3’(서열번호 18)으로 이루어지는, dsRNA 제제.
  109. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UCAGGAAUCCGAUUCACCAGCUC -3’(서열번호 30)을 포함하는, dsRNA 제제.
  110. 제1항 내지 제76항 및 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- GCUGGUGAAUCGGAUUCCUGA -3’ (서열번호 26)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UCAGGAAUCCGAUUCACCAGCUC -3’(서열번호 30)을 포함하는, dsRNA 제제.
  111. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3’(서열번호 22)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-우리딘-3'-포스페이트이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  112. 제111항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3’(서열번호 22)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3’(서열번호 22)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3’(서열번호 22)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc -3’(서열번호 22)를 포함하는, dsRNA 제제.
  116. 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- gscsugg(Uhd)GfaAfUfCfggauuccusgsa -3’(서열번호 21)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusCfsaggAfaUfCfcgauUfcAfccagcsusc u -3’(서열번호 22)로 이루어지는, dsRNA 제제.
  117. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’ - UACAAACGAAUGUGAUUAUGAAU -3’(서열번호 29)을 포함하는, dsRNA 제제.
  118. 제1항 내지 제76항 및 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UCAUAAUCACAUUCGUUUGUA -3’ (서열번호 25)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- UACAAACGAAUGUGAUUAUGAAU -3’(서열번호 29)을 포함하는, dsRNA 제제.
  119. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
    dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)과 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)와 4개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고,
    a, g, c 및 u는 2′-O-메틸(2′-OMe) A, G, C, 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; Af, Cf, Gf, Uf는 2′-플루오로 A, C, G, 및 U이고; (Uhd)는 2'-O-헥사데실-아데노신-3'-포스페이트이고; VP는 5’-비닐 포스포네이트인, 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  120. 제119항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)과 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)와 2개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)과 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)와 1개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 제제.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)를 포함하는, dsRNA 제제.
  124. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- uscsaua(Ahd)UfcAfCfAfuucguuugsusa -3’(서열번호 19)로 이루어지고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 5’- VPusAfscaaAfcGfAfauguGfaUfuaugasasu -3’(서열번호 20)로 이루어지는, dsRNA 제제.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
  126. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는, HTT를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물.
  127. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물.
  128. 세포에서 헌팅틴(HTT)의 발현을 억제하기 위한 2개 이상의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물로서,
    각각의 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 독립적으로 포함하고,
    안티센스 가닥 각각은 HTT를 암호화하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 독립적으로 포함하고, 상보성 영역 각각은 표 2~5 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함하는, 조성물.
  129. 세포에서 헌팅틴(HTT) 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서:
    (a) 세포를 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제128항의 조성물, 또는 제126항 또는 제127항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를 HTT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서 HTT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 세포는 대상체 내에 있는, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 대상체는 사람인, 방법.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, HTT의 발현은 적어도 50%만큼 억제되는, 방법.
  133. 제129항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 HTT 관련 질환을 진단받은, 방법.
  134. 제133항에 있어서, 뉴클레오타이드 반복 확장 질환은 헌팅턴병인, 방법.
  135. HTT 관련 질환을 진단받은 대상체를 치료하는 방법으로서, 방법은 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제128항의 조성물, 또는 제126항 또는 제127항의 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 치료는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 완화를 포함하는, 방법.
  137. 제135항에 있어서, 치료는 질환 진행의 예방을 포함하는, 방법.
  138. 제135항에 있어서, HTT 관련 질환은 헌팅턴병인, 방법.
  139. 제135항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  140. 제135항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, dsRNA 제제는 대상체에게 경막내 투여되는, 방법.
  141. 제135항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수득된 샘플에서 HTT의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  142. 제135항 내지 제141항에 있어서, 대상체에게 HTT 관련 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가의 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  143. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제128항의 조성물, 또는 제126항 또는 제127항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  144. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제128항의 조성물, 또는 제126항 또는 제127항의 약제학적 조성물을 포함하는 바이알.
  145. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 또는 제128항의 조성물, 또는 제126항 또는 제127항의 약제학적 조성물을 포함하는 주사기.
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