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KR20230040328A - 인플루엔자 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 hvt 벡터 및 면역원성 조성물, 및 이의 제조 및 용도 - Google Patents

인플루엔자 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 hvt 벡터 및 면역원성 조성물, 및 이의 제조 및 용도 Download PDF

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KR20230040328A
KR20230040328A KR1020237000280A KR20237000280A KR20230040328A KR 20230040328 A KR20230040328 A KR 20230040328A KR 1020237000280 A KR1020237000280 A KR 1020237000280A KR 20237000280 A KR20237000280 A KR 20237000280A KR 20230040328 A KR20230040328 A KR 20230040328A
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KR
South Korea
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virus
viral vector
sequence
recombinant viral
recombinant
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020237000280A
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English (en)
Inventor
엠로 카사
테숌 메뱃션
Original Assignee
베링거잉겔하임베트메디카게엠베하
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Abstract

면역학적 반응을 유도하기 위해 비히클로서 사용을 위한 재조합 바이러스 벡터 및 그들을 포함하는 조성물을 제공한다. 다가 바이러스 벡터는 다양한 병원체에 대해 보호를 위한 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 조성물 또는 백신으로서 사용될 수 있다. 이들 바이러스 벡터의 형성은 다양한 병원체에 대해 보호하기 위해 외래 유전자의 삽입 및 발현을 포함할 수 있다. 또한, 재조합 바이러스 벡터를 제조하고 사용하는 방법을 비롯하여, 벡터 및/또는 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 특히, 면역원성 조성물은 재조합 바이러스 벡터 예컨대 vHVT509, vHVT522, 및/또는 vHVT523을 포함할 수 있다.

Description

인플루엔자 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 HVT 벡터 및 면역원성 조성물, 및 이의 제조 및 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 6월 17일 출원된 미국 가출원 제63/040,411호에 대해 우선권을 청구한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 서열 목록을 함유한다. 상기 ASCII 사본은 2021년 6월 15일 생성되었고, 명칭은 BI20-AH022-WO-1_SL.txt이고, 크기는 69,660 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 다양한 병원체에 대항하여 보호하기 위해서 안전한 면역화 비히클로서 사용을 위한 외래 유전자의 삽입 및 발현을 위한 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 또한 다양한 병원체에 대항하여 보호를 위한 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다가 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 제조하고 사용하는 방법을 비롯하여, 벡터 및/또는 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
가금류 백신접종은 뉴캐슬병 (ND), 전염성 활액낭병 (IBD), 마렉병 (MD), 전염성 기관지염 (IB), 전염성 후두기관염 (ILT) 및 조류 인플루엔자　(AI), 예를 들어, 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI)를 포함한 치명적인 질환으로부터 가금류 무리를 보호하기 위해 널리 사용되고 있다. ND는 파라믹소비리다에 과에 속하는 ND 바이러스 (NDV)로서도 지정된 조류 파라믹소바이러스 1 (APMV-1)에 의해 유발된다. 일부 예에서, MD는 MD 바이러스 혈청형 1 (MDV1)로서도 지정된 갈리드 (Gallid)　헤르페스바이러스　2 (헤르페스비리다에 과)에 의해 유발된다. IB는 코로나비리다에 과에 속하는 IB 바이러스 (IBV)에 의해 유발되고, ILT는 ILT 바이러스 (ILTV)로도 지정된 갈리드　헤르페스바이러스 1 (헤르페스피리다에 과)에 의해 야기되며, AI는 오르쏘믹소비리다에 과에 속하는 AI 바이러스 (AIV)에 의해 유발된다.
재조합 백신은 하나 이상의 상이한 질환에 대해 조류에서 보호적 면역 반응을 제공하는데 사용될 수 있다. 특히, 백신은 조류 동물에서 폐사율, 임상 징후, 및 효과를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 개발된 백신은 조류, 예컨대 닭에서 전염성 활액낭병 (감보로병으로서도 알려짐), 뉴캐슬병(ND), 전염성 기관지염 (IB), 전염성 후두기관염 (ILT), 조류 인플루엔자 (AI) 및/또는 마렉병에 대한 보호성을 제공하는데 사용될 수 있다.
다수의 재조합 조류 바이러스 벡터가 이들 조류 병원체에 대항하여 새를 백신접종하기 위해 제안되었었다. 사용되는 바이러스 벡터는 조류폭스 바이러스, 특히 계두 (EP-A-0,517,292),　마렉 바이러스, 예컨대 혈청형 1, 2 및 3 (HVT) (WO87/04463; WO2013/082317), 또는 대안적으로 ITLV,　NDV　및 조류 아데노바이러스를 포함한다. 이들 재조합 조류 바이러스 벡터의 일부가 백신접종에 사용되었을 때, 그들은 가변적인 보호 수준을 나타낸다.
마렉병 바이러스 (MDV)는 알파헤르페스비리다에 과 및 마르디바이러스 속에 속한다. MDV 비리온은 감싸져 있고 약 160 nm 크기이다. 캡시드는 100 내지 200 kbp 크기의, 선형 이중 가닥 DNA의 거대 게놈을 포함한다.
MDV의 혈청형 중에서 MDV 혈청형 1 (MDV1) 및 MDV 혈청형 2 (MDV2)는 둘 모두 가금류에게 병원성이지만, MDV 혈청형 3 (MDV3)은 그렇지 않다. 일부 예에서, MDV3은 멜레아그리드 헤르페스바이러스 1, 칠면조 헤르페스바이러스, 및/또는 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)라고 한다.
MDV3의 다른 균주 (즉, HVT), 예컨대 PB1 또는 FC-126이 MDV1 및/또는 MDV2로 인해 유발된 MD에 대항하여 조류 (예를 들어, 닭)를 백신접종하는데 사용되어 왔다. 보다 병독성인 MDV1의 변이체에 대항한 보호가 요구될 때, HVT는 MDV2 백신-균주, 예를 들어 SB1, 또는 약독화된 MDV1 백신 균주와 조합하여 사용되었다.
IBDV, NDV, ILTV 및 AIV를 포함한 다양한 병원체 (미국 특허 제5,980,906호, 제5,853,733호, 제6,183,753호, 제5,187,087호)로부터의 항원을 발현하는 칠면조의 몇몇 재조합 헤르페스바이러스 (멜레아그리드 헤르페스바이러스　1 또는 MDV 혈청형 3이라고도 함) 벡터가 개발되었고 허가받았다.
IBDV,　NDV, ILTV 및 AIV를 포함한 다양한 병원체 (미국 특허 제5,980,906호, 제5,853,733호, 제6,183,753호, 제5,187,087호)로부터의 항원을 발현하는 칠면조의 몇몇 재조합 헤르페스바이러스 (HVT, 멜레아그리드 헤르페스바이러스 1 또는　MDV　혈청형 3로도 표시됨) 벡터가 개발되었고 허가받았다. 예를 들어, IBDV VP 2 보호 유전자를 발현하는 HVT　벡터는 고전적인 IBD 백신에 비해 분명한 장점을 보였다 (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol. 137, S81-S84; 미국 특허 제5,980,906호). 다른 관심 HVT 벡터는　NDV　(Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70; 미국 특허 제6,866,852호; 제5,650,153호), ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259; 미국 특허 제6,299,882호; 제5,853,733호, EP 1801204), 또는　NDV　및 IBDV　(미국 특허 제9,114,108호; WO2016102647, WO2013/057235, WO2015032910, WO2013144355) 보호 유전자(들)를 발현하는 것들이다. US2016/0158347은 HVT　벡터에 의해 발현된 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 올리고데옥시뉴클레오티드 TLR21 효현제의 사용을 보고하였다.
또한, 중국, 광둥에서 1996년에 이의 출현 이래로, A/거위/광둥/1/1996 (Gs/GD) 계통의 H5N1 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI) 바이러스가 전세계로 확산되어 가축 및 야생 새들을 감염시키고 때때로 인간을 포함한 포유동물에게 유출된다. 시간이 경과하면서, H5N1 HPAI 바이러스는 H5 헤마글루티닌 (HA)을 기반으로 다수의 계통발생학적으로, 그리고 항원적으로 구별되는 분기군 및 하위 분기군으로 분기되었고, 많은 백신 종자 균주에 내성인 항원성 변이체가 출현하였다. 이러한 유전적 및 항원적 다양성은 가금류 백신을 위한 관련 H5 종자 균주를 유지시키는데 도전을 야기했다. 그러므로, 항원적으로 구별되는 공동-순환 바이러스를 비롯하여 향후 드리프트 변이체의 적용 범위를 제공할 수 있는 광범위하게 보호적인 H5 인플루엔자 A 백신의 개발이 매우 바람직하다.
이러한 도전을 극복하고, HA의 보존된 도메인을 표적화하는 다가 H5N1 백신, 및 합성 공통 DNA 항원-기반 백신을 포함한, 중화 항체의 레파토리를 확장하기 위해 몇개의 전략을 조사하였다. 후자의 전략에 따라서, "계산적으로 최적화된 광범위 반응성 항원 (Computationally Optimized Broadly Reactive Antigen)" (COBRA)이라고 하는 이전에 기술된 방법론이 신규한 H5 HA 상동성 서열을 갖는 항원을 생성시키는데 이용되었다. 마우스, 페럿, 및 사이노몰거스 마카크를 사용한 이전 연구들에서, COBRA HA 항원 백신은 상동성 및 이종성 H5N1 HPAI 바이러스에 의한 치명적인 챌린지에 대항하여 보호하여, 1가 또는 다가 백신에 비해서 상이한 분기군 및 하위 분기군에 대해 더 넓은 항체 반응을 유발시키고 보다 효율적인 바이러스 제거를 보인다. 최근 연구에서, COBRA HA 바이러스-유사 입자 (VLP) 백신은 상동성 H5N1 HPAI 바이러스의 치사량으로 챌린지된 닭에서 임상적 보호를 제공하였다. 그러나, 드리프트 변이체 H5N1 HPAI 바이러스로 챌린지 시, COBRA HA VLP 백신은 닭에서 부분 임상적 보호를 제공하거나 또는 전혀 제공하지 않고, 바이러스 발산의 감소는 양쪽 챌린지 균주에 의해서 최적이 아니었다. 게다가, 드리프트 균주에 대한 COBRA 백신에 의해 유발된 강건한 HA 항체 반응은 이러한 바이러스의 챌린지 시 보호 효능으로 해석되지 않아서, HA 항체 역가의 양성 예측값이 절대적이지 않다는 것을 입증한다. 종합적으로, 이들 결과는 항원적으로 다양한 HPAI 균주의 챌린지 시 임상적 보호 및 바이러스 발산의 감소 둘 모두를 증강시키기 위해서 항원 상동성 서열 및 백신 제제를 더욱 개선시키고자 하는 필요성을 강조하였다.
HVT는 새의 말초 혈액 림프구 (PBL)에서 복제되고, 따라서 대체로 세포 면역계를 겨냥한 장기간 면역 반응을 유도하는 전신 바이러스이다. HVT 백신은 냉동된 HVT-감염된 세포로서 상업적으로 입수가능하고, HVT 예컨대 MDA에 대한 항체에 상대적으로 둔감하므로 어린 나이의 닭에게 적용할 수 있다. 새로 태어난 병아리는 이의 생애 첫날부터 MDV의 감염 압력에 직면하기 때문에, 따라서 HVT 백신은 가능한 빨리, 예를 들어 계란에서 그들이 부화한 날 (1일)에, 병아리에게 또는 여전히 계란 내에 존재하면서, 부화 전에 접종된다. 소위 '계란내 백신접종'이라고 하는, 이러한 마지막 접근법은 배아 백신접종의 형태로서, 배아 발생 (ED) 18일차, 부화 전 약 3일에 통상적으로 적용된다.
그 자체로 백신으로서 사용되는 것 다음에, HVT는 또한 가금류에게 다양한 면역원성 단백질의 발현 및 전달을 위한 바이러스 벡터 백신으로서 사용되며, 예를 들어, WO 87/04463을 참조한다. 전형적으로, 발현된 유전자는 백신접종이 요구되는, 가금류에 대해 병원성인 미생물의 보호적 항원 (의 일부)을 코딩한다. 수년에 걸쳐서, 많은 이종성 유전자, 예컨대 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349-358), 전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV) (Darteil et al., 1995, Virology, vol. 211, p. 481-490), 및 기생충 항원 (Cronenberg et al., 1999, Acta Viral., vol. 43, p. 192-197) 유래의 것이 HVT 벡터에서 발현되었다.
가금류에게 HVT 벡터 백신의 투여는 발현된 이종성 유전자를 비롯하여, MD에 대항하여 보호하는 HVT에 대한 면역 반응을 생성시키는 것으로 설명되었다. 이것은 다양한 시판 HVT 벡터 백신 제품, 예를 들어, NDV F 단백질 유전자: lnnovax™-ND (MSD Animal Health), 및 Vectormune™ HVT-NDV (Ceva); 또는 IBDV VP2 유전자: Vaxxitek™ HVT+IBD (Merial; 이전 명칭: Gallivac™ HVT-IBD; Aly, R. et al., Report and Opinion 2012;4(4):1-11)), 및 Vectormune™ HVT-IBD (Ceva)로서 적용된다.
대안적으로, HVT 벡터는 닭의 면역 반응을 조작하기 위해서, 치료적 단백질, 예를 들어, 사이토카인의 발현 및 전달에 사용되었다 (WO 2009/156.367; Tarpey et al., 2007, Vaccine, vol. 25, p. 8529-8535).
예컨대 상동성 재조합 (Sondermeijer et al., supra), 코스미드 재생 (US 5,961,982), 또는 백미드 (bacterial artificial chromosomes) (Baigent et al., 2006, J. of Gen. Viral., vol. 87, p. 769-776)를 사용하여, HVT로 이종성 유전자의 삽입을 위한 몇몇 방법이 기술되었다.
HVT 게놈으로 이종성 유전자-구성체의 삽입을 위한 많은 유전자 위치가 조사되었고, 몇몇 적합한, 불필수 유전자좌가 예를 들어, HVT 게놈의 고유의 짧은 (Us) 영역 (EP 431.668); 또는 HVT 고유의 긴 (UL) 영역 (EP 794.257)에서 기술되었다.
상이한 프로모터, 예컨대 PRV gpX 프로모터 (WO 87/04.463), 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, SV40 초기 유전자 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자 프로모터 (EP 1.298.139), 또는 인간 (hCMV IE1) 또는 쥣과동물 (mCMV IE1) 사이토메갈로바이러스로부터의 급초기 1 유전자 프로모터가 HVT에 대한 발현 카세트에서 이종성 유전자의 발현을 구동하는데 사용되었으며, EP 728.842를 참조한다. 최근에 단일 구성체로부터 NOV 및 IBDV 둘 모두로부터 항원을 발현한 HVT 벡터 백신이 기술되었다: WO 2013/057.235.
IBDV VP2 보호적 유전자를 발현하는 HVT 벡터가 사용되었다 (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84). 다른 관심 HVT　벡터는 NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70) 또는 ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259) 보호적 유전자(들)를 발현하는 것들이다. 몇몇 HVT-기반 재조합체 백신을 함께 사용하는 실질적인 문제 중 하나는 그들 간섭이다. 상이한 항원을 발현하는 2종의 HVT 재조합체를 혼합했을 때 적어도 질환 중 하나에 대해서 더 낮은 보호성을 유도한다 (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; paper presented at the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancun, Mexico, August 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23rd-25th, p84).
HVT 및 SB-1, 갈리드 헤르페스바이러스　3 (MDV 혈청형 2 또는 MDV-2) 백신 균주의 조합은 MD 보호에 대해 상승적 효과를 보였다 (Witter and Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). 간섭 문제를 해결하기 위해서, HVT　벡터와 상용성일 수 있고 MD 보호성을 개선시킬 수 있는 보호적 항원(들)을 발현시키기 위한 백신 벡터로서 SB-1 바이러스를 평가하는 것이 흥미롭다.
SB-1 게놈은 박테리아 인공 염색체 (BAC)에 클로닝되어 특징규명되었다 (Petherbridge, et al., J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al, Research　in　Veterinary Science 89, 140-145, 2010). MDV2 SB-1 서열은 최근에 수득되어 분석되었다 (Spatz and Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). SB-1 바이러스의 당단백질 E 결실은 Petherbridge 등 (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009)이 기술하였다. 그러나, 외래 보호 유전자를 발현하는 바이러스 벡터로서 SB-1을 사용한 연구는 보고된 적이 없다.
개별적으로 UL13 단백질 키나제 및 당단백질 C (UL44) 유전자 둘 모두는 닭에서 MDV의 수평 전파에 필수적인 것으로 확인되었다 (Jarosinski, et al, J. of Virology 81, 10575-10587, 2007; Jarosinski, et al, J. of Virology 84, 7911- 7916, 2010).
몇몇　HVT-기반 재조합 백신을 함께 사용하는 실질적인 문제 중 하나는 그들 간섭이다. 상이한 항원을 발현하는 2종 HVT 재조합체를 혼합했을 때 적어도 질환 중 하나에 대해 더 낮은 보호성을 유도한다 (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; paper presented at the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancun, Mexico, Aug. 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, Calif., USA, March 23rd-25th, p84).
수의학적 공중 보건 및 경제에 대한 동물 병원체, 예컨대 MDV, AIV, NDV 및/또는 IBDV의 잠재적 효과를 고려하여, 감염을 예방하고 동물을 보호하는 효율적인 방법이 필요하다. 조합된 효과적인 벡터 백신의 해법 및 2　HVT-기반 벡터 백신들 간에 관찰된 간섭 문제를 완화시킬 수 있는 백신을 제조하기 위한 적합한 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 출원에서 임의 문헌의 인용 또는 식별은 이러한 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 인정이 아니다.
본 명세서는 칠면조의 헤르페스바이러스, 마렉병 바이러스 (MDV), 및/또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스를 포괄하는 재조합 벡터를 개시한다. 예를 들어, 재조합 벡터는 마렉병 바이러스 (MDV) 예컨대 vHVT509, vHVT522, 및/또는 vHVT523을 코딩하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한 재조합 벡터 vHVT509, vHVT522, 및/또는 vHVT523을 포함하는 조성물, 예를 들어 면역원성 조성물, 및/또는 백신을 개시한다.
재조합 바이러스 벡터는 칠면조의 헤르페스바이러스 (rHVT), 마렉병 바이러스, 또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스로부터 유래되는 적어도 하나의 핵산 서열, 재조합 바이러스 벡터가 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원을 생체내에서 발현하게 하는 조류 인플루엔자 바이러스 유래 제1 외생성 핵산 서열, 및 조류 질환의 적어도 하나의 항원을 코딩하고 생체내에서 발현하는 조류 질환 유래의 제2 외생성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 마렉병 바이러스 혈청형 3을 포함할 수 있다. 또한, 일부 예에서 재조합 바이러스 벡터는 마렉병 바이러스, 혈청형 3, 균주 FC-126 (MDV-3 FC-126)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 면역원성 조성물 및 재조합 바이러스 벡터는 조류 예컨대 닭, 거세닭, 오리, 거위, 칠면조, 꿩, 뇌조, 메추라기, 백조, 새끼 비둘기, 또는 비둘기를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물로 치료되는 조류는 닭일 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 조류 인플루엔자, 아형 H5의 외생성 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 HA 항원은 COBRA-C H5 헤마글루티닌 단백질을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 사전결정된 서열, 예컨대 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 또는 도 49에 도시된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 조류 인플루엔자 바이러스 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스 HA H5 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자는 기준 서열 예컨대 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 또는 도 49에 도시된 임의 서열과 약 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성 초과의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있다. 또한, 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클, 또는 보강제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현되는 조류 인플루엔자 바이러스 항원은 기준 서열 예컨대 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 또는 도 49에 도시된 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 전염성 활액낭병 바이러스 항원, 뉴캐슬병 항원, 및/또는 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 항원을 코딩하는 하나 이상의 외생성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원 및/또는 뉴캐슬병 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 백신은 다수의 성분으로 형성될 수 있다. 조류를 접종하기 위한 백신의 성분은 사용 전에 별개 용기에 저장될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터, 바이러스 벡터, 항원, 및/또는 단백질을 포함한, 세포와 같은, 면역원성 작용제는 용기 예컨대 앰풀에 저장될 수 있고 사용 전에 별개 용기 중에 희석제와 조합될 수 있다. 특히, 앰풀은 특정 질환에 대한 항원 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 액체 질소에 냉동된 감염된 세포를 포함할 수 있고 표적 동물에게 주사 전에 희석제와 조합될 수 있다.
동물에서 사용을 위한 백신은 표적 질환에 따라서 희석제와 함께 상이한 질환에 대한 다수 앰플의 내용물을 조합할 수 있다.
면역원성 조성물은 수의학적으로 허용가능한 담체 예컨대 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 바와 같은 AIV H5 COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 바와 같은 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 바와 같은 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 바와 같은 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 갖는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질에 대한 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 제1 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 제2 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 통해서 구축될 수 있다.　
재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법은 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 제1 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 제2 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 HVT 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 IG1 유래 측접 서열을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터의 생산 이후에, 이것은 회수 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물에서 사용하기 전에, 생산된 재조합 바이러스 벡터는 면역원성 조성물에 사용을 위해서 회수된 다음에 정제될 수 있다.
면역원성 조성물에서, 사전결정된 바이러스, 예컨대 마렉병 바이러스, 칠면조의 헤르페스바이러스 (rHVT), 또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스는 조성물이 조류에게 투여될 때, 표적 질환에 대한 반응, 예컨대 마렉병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 전염성 활액낭병 바이러스, 및/또는 조류 인플루엔자를 포함한 임의의 표적 질환에 대한 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 존재한다.
면역원성 조성물, 예컨대 백신은 면역원성 작용제를 하나 이상의 수의학적으로 허용가능한 담체와 혼합시킨 이후에 형성될 수 있다. 예를 들어, 백신은 면역원성 작용제를 포함하는 앰풀 및 수의학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 희석제를 조합하여 형성될 수 있다. 특히, 백신 혼합을 위한 앰풀은 면역원성 작용제, 예를 들어, 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 포함할 수 있다. 앰풀의 내용물은 희석제의 용기와 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 면역원성 작용제, 예컨대 액체 질소에 냉동된 바이러스 벡터를 함유하는 세포를 포함하는 앰풀을 희석제의 사전결정된 양과 조합하여 형성될 수 있다.
앰풀은 약 103 내지 약 107 PFU/mL 범위의 역가를 갖는 면역학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 앰풀 중 면역학적 조성물은 약 105 내지 107 PFU/mL 범위의 역가를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 앰풀 중 면역학적 조성물은 바람직한 투여 용량에 비해서 더 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 앰풀 중 면역학적 조성물은 바람직한 투여 용량에 비해서 3배 더 농축될 수 있다. 예를 들어, 투여하려는 백신의 용량이 용량 당 약 2500 PFU인 일 구현예에서, 방출 용량 (즉, 앰풀 중 양)은 약 3배, 즉, 용량 당 약 7500일 수 있다.
백신에 포함되는 하나 이상의 항원 및/또는 단백질을 발현하는 특정 바이러스 벡터의 최소 유효/보호 용량 (MPD)은 실험적으로 결정할 수 있다. 일반적으로, MPD는 면역학적 조성물 중 바람직한 역가를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, US에서 방출 역가는 MPD 값의 배수일 수 있다. 특히, 면역학적 조성물, 예컨대 백신 중 바람직한 역가는 MPD의 약 3배일 수 있다.
일부 경우에, 면역학적 조성물, 예컨대 백신은 약 1000 PFU/용량 내지 약 8000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 구현예는 약 2000 PFU/용량 내지 약 6000 PFU/용량 범위의 역가를 갖는 백신을 포함할 수 있다.
조류용 백신의 구현예는 약 2200 PFU/용량 내지 약 4000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 일부 조류 백신은 약 2250 PFU/용량 초과의 역가를 포함할 수 있다. 특히, 백신은 약 2250 PFU/용량 내지 약 3000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 예를 들어, 백신은 약 2500 PFU/용량의 역가를 가질 수 있다.
면역원성 조성물, 예컨대 백신의 일부 구현예는 MDV (즉, HVT) 특히 상대적으로 긴 수명을 갖는 조류, 예컨대 종계 및 산란계의 경우 약 5000 PFU/용량 초과의 역가를 포함할 수 있다.
마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자, 및 전염성 활액낭병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 재조합 바이러스 벡터의 유효량 또는 본 명세서에 기술된 면역원성 조성물의 유효량을 조류에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 HA 항원, 및 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자를 포함할 수 있고 생체내에서 발현할 수 있다. 일부 예에서, 외생성 조류 인플루엔자 서열은 아형 H5일 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 NDV 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생체내 발현되는 단백질, 예컨대 NDV-F 단백질은 기준 서열 예컨대 도 50에 도시된 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있다. 재조합 바이러스 벡터에서 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자는 코돈 최적화될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 유전자간 I (IG1)부위를 위한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시켜서 구축될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법은 마렉병 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있고, 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터의 임의 생산은 생산 후에 회수될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물은 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.　
면역원성 조성물은 면역원성 조성물의 투여 이후에 마렉병 바이러스 및/또는 조류 인플루엔자 바이러스 및/또는 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 하나 이상의 면역원성 작용제, 예컨대 재조합 바이러스 벡터로 감염된 세포의 유효량을 조류에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물 예컨대 백신의 유효량이 결정된다.
사전결정된 바이러스의 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 플라스미드는 뉴캐슬병 바이러스 F 항원 및/또는 단백질을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함한다.
예를 들어, MDV-3의 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 플라스미드는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 플라스미드에서 사용되는 AIV는 아형 H5의 것일 수 있다. 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자 또는 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
조성물 또는 백신은 마렉병 혈청형　3 (MDV-3) 또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스 1 (MeHV-1)로부터 선택되는 바이러스를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 외생성 뉴클레오티드, 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스 뉴클레오티드는 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 코딩하고 발현한다. 또한, 추가의 이종성 뉴클레오티드는 조류 병원체의 적어도 하나의 항원 예컨대 전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV) 캡시드 단백질 (VP2), 또는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클, 또는 보강제를 코딩하고 발현한다.
조성물 또는 백신은 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및 도 49에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 조류 인플루엔자 바이러스 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클, 또는 보강제를 포함할 수 있다.
조성물 또는 백신은 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 사전결정된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV) 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 갖는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 조성물 또는 백신은 도 12, 도 18, 도 28, 도 40 또는 도 49에 도시된 바와 같은 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 코딩하는 사전결정된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV VP2 단백질을 코딩하는 사전결정된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
조성물 또는 백신은 도 50 또는 도 39에 도시된 바와 같은 NDV 단백질, 예컨대 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클, 또는 보강제를 포함할 수 있다.
조성물 또는 백신은 도 12, 도 18, 도 28, 도 40 또는 도 49에 도시된 바와 같은 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 코딩하는 사전결정된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 도 50 또는 도 39에 도시된 바와 같은 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F)을 코딩하는 사전결정된 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 다른 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명 내에 임의의 이전에 공지된 제품, 제품의 제조 방법, 또는 제품의 사용 방법을 포괄하지 않으므로 출원인은 권리를 보유하고 여기서 임의의 이전에 공지된 제품, 공정, 또는 방법의 면책 조항을 개시한다. 본 발명은 본 발명의 범주 내에 USPTO (35 U.S.C. §112, 제1 단락) 또는 EPO (EPC의 83조)의 명세서 기재 요건 및 실시가능 요건을 충족하지 않는 임의의 제품, 제품의 제조 방법 또는 제품의 사용 방법을 포괄하고자 의도하지 않으므로, 출원인은 권리를 보유하고 여기서 임의의 이전에 기술된 제품, 제품의 제조 방법, 또는 제품의 사용 방법의 면책 조항을 개시한다는 것을 더욱 유의한다. 조항 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 본 발명의 실시에서 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 제3자의 임의의 다른 계보 또는 임의의 이전 출원에서 출원인의 임의의 등록 특허(들)의 주제인 임의의 구현예를 명시적으로 부인할 수 있는 모든 권리를 명시적으로 보유한다. 본 명세서의 어떠한 것도 약속으로 해석되어서는 안된다.
본 개시 및 특히 청구항 및/또는 단락에서, 용어 예컨대 "포함하다", "포함된", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며, 예를 들어 그들은 "포괄하다", "포괄된", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고, 용어 예컨대 "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 그들에게 부여하는 의미를 가지며, 예를 들어, 그들은 명시적으로 인용되지 않은 구성요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치는 구성요소는 배제한다는 것을 유의한다.
이들 및 다른 구현예가 개시되거나 또는 하기 구체적인 내용으로부터 자명하고 그를 포괄한다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)과 본 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 사무국이 제공하게 될 것이다.
예로서 제공되지만, 오로지 기술된 특별한 구현예에만 본 발명을 제한하려는 의도는 아닌, 하기 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 명세서에 기술된 면역원성 조성물에서 사용될 수 있는 바이러스 구성체 및 이의 구성요소의 일부를 보여주는 다이아그램이다.
도 2는 3가 바이러스 벡터 vHVT-522 및 vHVT-523의 위치 지도를 도시한다.
도 3은 vHVT509의 프라이머 위치 지도이다.
도 2, 도 4는 vHVT509 프리-MSV 스톡의 PCR 증폭을 도시한다.
도 3, 도 5는 vHVT509 X+12 스톡의 PCR 증폭을 도시한다.
도 6은 닭 항-AIV H5N2 혈청 (Charles Rivers Laboratories, Lot#J0210) 및 토끼 항-닭 IgG-FITC 접합 (Sigma cat# F8888, lot#075M4812V)을 사용한 vHVT509의 간접 면역형광 어세이의 결과를 도시한다.
도 7은 vHVT509의 이중 간접 면역형광 어세이의 결과를 도시한다.
도 8은 vHVT509의 뉴클레오티드 서열 분석을 위한 PCR 앰플리콘을 도시한다.
도 9는 vHVT509 프리-MSV의 각 서열 반응으로 생성된 contig의 그래픽 도면이다.
도 10은 vHVT509 X+12의 각 서열 반응으로 생성된 contig의 그래픽 도면이다.
도 11은 vHVT509 프리-MSV 및 X+12 계대 스톡 contig의 뉴클레오티드 서열 및 시퀀싱 프라이머 위치 (SEQ ID NO: 47)를 도시한다. 검은색 = 재조합 팔부 영역, 파란색 = mCMV 프로모터, 붉은색 = AIV HA COBRA-C, 회색 = 합성 폴리A, 밑줄 = 시퀀싱 프라이머. 시퀀싱 프라이머는 프라이머의 방향으로 밑줄표시된다. 재조합 팔부의 일부분은 검은색으로 표시되고, AIV HA COBRA-C 유전자는 붉은색으로 표시된다.
도 12는 vHVT509의 AIV HA COBRA-C 유전자의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 48)을 도시한다.
도 13은 vHVT509의 시퀀싱된 영역의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 47)을 도시한다.
도 14는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 플라스미드의 구성도이다.
도 15는 HindIII-BIpl 단편의 결찰을 보여주는 플라스미드 다이아그램이다.
도 16은 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 49)이고, 여기서 녹색 = 유전자간 1 팔부, 오렌지색 = SV40 폴리A, 진한 붉은색 = H5 HA COBRA-C, 파란색 = IRES, 붉은색 = VP2, 검은색 = 벡터이다.
도 17은 VP2의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 50)이다.
도 18은 H5 HA COBRA-C의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 48)이다.
도 19는 vHVT522의 PCR 프라이머 위치를 보여주는 다이아그램이다.
도 20은 하기 주형: vHVT522 프리-MSV (레인 1), vHVT522 프리-MSV+12 (레인 2), vHVT013 (레인 3), 도너 플라스미드 (pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C (레인 4) 및 음성 대조군 (레인 5) 및 표 5에 표시된 상이한 프라이머 쌍을 사용한 PCR 생성물이 로딩된 아가로스 겔의 사진이다.
도 21은 프리-MSV (P3) 계대 (A) 및 프리-MSV+12 계대 (B)의 대표적인 사진을 보여주는, 이중 면역형광 어세이 결과를 도시한다.
도 22는 vHVT522의 시퀀싱 프라이머의 위치를 보여주는 다이아그램이다.
도 23은 시퀀싱을 위한 vHVT522 프리-MSV (P3) 및 X+12 (프리-MSV+12) PCR을 도시한다.
도 24는 vHVT522 (P3) 프리-MSV 시퀀싱 contig이다.
도 25는 vHVT522 프리-MSV+12 시퀀싱 contig이다.
도 26은 프라이머 위치와 vHVT522의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 51)이고, 여기서 녹색 = IG1 팔부 (pFIRESVP2 도너 플라스미드), 연파란색 = SV40 폴리A, 연녹색 = IG1 팔부 (vHVT013 도너 플라스미드), 오렌지색 = NDV-F, 보라색 = IRES, 진한 붉은색 = VP2, 파란색 = mCMV, 밑줄 = 시퀀싱 프라이머이다.
도 27은 vHVT522의 시퀀싱된 영역의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 51)을 도시한다.
도 28은 vHVT522의 AIV HA COBRA-C 유전자의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 48)을 도시한다.
도 29는 vHVT522의 IBDV VP2 유전자의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 50)을 도시한다.
도 30은 2개 서던 블롯 프로브를 제조하는데 사용된 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 플라스미드 (도너 플라스미드)의 제한효소 지도이다. 검은색 막대의 H5 및 VP2 프로브는 붉은색 원형으로 제한효소 부위에 걸쳐서 도시된다.
도 31은 vHVT522 항원 삽입 부위, 서던 블롯에 사용된 엔도뉴클레아제의 제한효소 지도, 및 단편의 예상 길이의 개략도이다.
도 32는 vHVT013 (Vaxxitek) 항원 삽입 부위, 서던 블롯에 사용된 엔도뉴클레아제의 제한효소 지도, 및 단편의 예상 길이의 개략도이다.
도 33은 도너 플라스미드 (pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C), 서던 블롯에 사용된 엔도뉴클레아제의 제한효소 지도, 및 단편의 예상 길이의 개략도이다.
도 34는 BamHI, EcoRV 또는 Not-I 제한 효소로 분해된 vHVT522, vHVT013 및 도너 플라스미드 (pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C) DNA에 대한 VP2 프로브를 사용한 예상 서던 블롯 밴드를 도시한다.
도 35는 BamHI, EcoRV 또는 Not-I 제한 효소로 분해된 vHVT522, vHVT-013 및 도너 플라스미드 (pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C) DNA에 대한 H5 프로브를 사용한 예상 서던 블롯 밴드를 도시한다.
도 36은 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C의 도너 플라스미드 구축의 다이아그램을 도시한다.
도 37은 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출된 COBRA-C 유전자로 이전에 생성된 플라스미드 (pFwt-IRES-SaH9opt)의 사우디-아라비아 H9 유전자의 치환을 통한 pFwt-IRES-COBRA-C 플라스미드의 구축을 보여주는 플라스미드 다이아그램을 도시한다.
도 38은 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C 플라스미드의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 52)을 도시하고, 여기서 녹색 = 유전자간 1 팔부, 오렌지색 = SV40 폴리A, 진한 붉은색 = H5 HA COBRA-C, 파란색 = IRES, 붉은색 = NDV-F, 갈색 = mCMV 프로모터, 검은색 = 벡터이다.
도 39는 NDV-F의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 53)을 도시한다.
도 40은 H5 HA COBRA-C의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 48)을 도시한다.
도 41은 vHVT523의 PCR 프라이머 위치를 보여주는 다이아그램이다.
도 42는 하기 주형: vHVT523 프리-MSV (레인 1), vHVT523 프리-MSV+12 (레인 2), vHVT013 (레인 3), 도너 플라스미드 (pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C (레인 4) 및 음성 대조군 (레인 5) 및 표 8에 표시된 상이한 프라이머 쌍을 사용한 PCR 생성물이 로딩된 아가로스 겔의 사진이다.
도 43은 프리-MSV (P3) 계대 (A) 및 프리-MSV+12 계대 (B)로부터의 대표적인 사진을 보여주는, 이중 면역형광 어세이의 결과를 도시한다.
도 44는 vHVT523의 시퀀싱 프라이머 위치를 보여주는 다이아그램이다.
도 45는 시퀀싱을 위한 vHVT523 프리-MSV (P3) 및 X+12 (프리-MSV+12) PCR을 도시한다.
도 46은 vHVT523 (P3) 프리-MSV 시퀀싱 contig를 도시한다.
도 47은 프라이머 위치와 vHVT523의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 54)을 도시하고, 여기서 연녹색 = IG1 팔부, 파란색 = mCMV, 오렌지색 = NDV-F, 보라색 = IRES, 진한 붉은색 = H5 HA, 연파란색 = SV40 폴리A, 녹색 = IG1 팔부, 밑줄 = 시퀀싱 프라이머이다
도 48은 vHVT523의 시퀀싱된 영역의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 54)을 도시한다.
도 49는 vHVT523의 AIV HA COBRA-C 유전자의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 48)을 도시한다.
도 50은 vHVT523의 NDV-F 유전자의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 53)을 도시한다.
도 51은 연구 30일 동안 계산된 발산 역가의 상자 그래프를 도시한다.
도 52는 연구 32일 동안 계산된 발산 역가의 상자 그래프를 도시한다.
도 53은 연구 그룹에 따른 계산된 활액낭 대 체중 비의 상자 그래프를 도시한다.
도 54는 성별 및 연구 그룹에 따른 계산된 활액낭 대 체중 비의 상자 그래프를 도시한다.
도 55는 미네소타/12582-1로 챌린지 전에 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신이 투여된 닭에 대한 바이러스 발산 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 결과는 챌린지 후 2일 및 챌린지 후 4일 동안 측정된 발산량을 도시한다.
도 56은 이집트/N04915로 챌린지 전에 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신이 투여된 닭에 대한 바이러스 발산 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 결과는 챌린지 후 2일 및 챌린지 후 4일 동안 측정된 발산량을 도시한다.
도 57은 헝가리/53433으로 챌린지 전에 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신이 투여된 닭에 대한 바이러스 발산 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 결과는 챌린지 후 2일 및 챌린지 후 4일 동안 측정된 발산량을 도시한다.
도 58은 챌린지 전 (24일, 파란색으로 표시) 및 챌린지 후 (42일, 오렌지색으로 표시)에 구성체 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신 중 하나가 백신접종된 닭에 대해 수행된 혈구응집 억제 어세이의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 이 연구에서 닭은 미네소타/12582로 챌린지되었다.
도 59는 챌린지 전 (24일, 파란색으로 표시) 및 챌린지 후 (42일, 오렌지색으로 표시)에 구성체 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신 중 하나가 백신접종된 닭에 대해 수행된 혈구응집 억제 어세이의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 이 연구에서 닭은 이집트/N04915로 챌린지되었다.
도 60은 챌린지 전 (24일, 파란색으로 표시) 및 챌린지 후 (42일, 오렌지색으로 표시)에 구성체 vHVT509, vHVT522, 및 vHVT523 또는 모의 백신 중 하나가 백신접종된 닭에 대해 수행된 혈구응집 억제 어세이의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 이 연구에서 닭은 헝가리/53433으로 챌린지되었다.
본 개시 및 특히 청구항 및/또는 단락에서, 용어 예컨대 "포함하다", "포함된", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 부여하는 의미를 가질 수 있고, 예를 들어 그들은 "포괄하다", "포괄된", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고, 용어 예컨대 "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지다"는 미국 특허법에서 그들에 부여하는 의미를 가지며, 예를 들어, 그들은 명시적으로 인용되지 않은 구성요소를 허용하지 않지만, 선행 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치는 구성요소는 배제한다는 것을 유의한다.
달리 표시하지 않으면, 기술 용어는 통상의 용법에 따라서 사용된다. 분자 생물학의 공통 용어의 정의는 하기 문헌들에서 확인할 수 있다: Benjamin Lewin, Genes V. (Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) 출판); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) 출판); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). 단수 용어 "일", "한" 및 "그"는 명확하게 문맥에서 달리 표시하지 않으면 다수 참조를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥에서 달리 명확하게 표시하지 않으면 "및"을 포함하고자 한다. 단어 "또는"은 특정 목록의 임의의 한 구성원을 의미하고 그 목록의 구성원들의 임의 조합을 또한 포함한다.
용어 "동물"은 모든 포유동물, 새류 및 어류를 포함하고자 본 명세서에서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 동물은 말과 (예를 들어, 말), 갯과 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양잇과 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 야생 고양이, 다른 대형 고양이, 및 치타 및 스라소니를 포함한 다른 고양잇과), 솟과 (예를 들어, 소), 돼지과 (예를 들어, 돼지), 양과 (예를 들어, 양, 염소, 라마, 들소), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치새, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 인간, 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 용어 "동물"은 또한 배아 및 태아 단계를 포함한, 모든 발생 단계의 개별 동물을 포함한다.
용어 "조류"는 닭, 거세닭, 오리, 거위, 칠면조, 꿩, 뇌조, 메추라기, 백조, 새끼 비둘기, 비둘기, 앵무새, 핀치새, 매, 까마귀, 타조, 에뮤, 및 화식조를 의미할 수 있다. 많은 구현예에서, 조류는 닭을 의미하는데 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 연속적인 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해서 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고 RNA, DNA, cDNA, 또는 cRNA 및 이의 유도체, 예컨대 변형된 골격을 함유하는 것들을 의미한다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 것과 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다는 것을 이해해야 한다. 본 발명에서 고려되는 "폴리뉴클레오티드"는 전방향 가닥 (5'에서 3') 및 역방향 상보성 가닥 (3'에서 5') 둘 모두를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 상이한 방식 (예를 들어, 화학 합성, 유전자 클로닝 등)으로 제조될 수 있고, 다양한 형태 (예를 들어, 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드, 중합체, 프로브 등)를 취할 수 있다.
용어 "게놈 DNA", 또는 "게놈"은 상호교환적으로 사용되고 숙주 유기체의 유전가능한 유전 정보를 의미한다. 게놈 DNA는 핵의 DNA (염색체 DNA라고도 함)를 비롯하여 색소체 (예를 들어, 엽록체) 및 다른 세포 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아)의 DNA를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 게놈 DNA 또는 게놈은 또한 바이러스의 RNA를 의미한다. RNA는 포지티브 가닥 또는 네거티브 가닥 RNA일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 용어 "게놈 DNA"는 본 명세서에 기술된 것과 상보적인 서열을 함유하는 게놈 DNA를 포함한다. 용어 "게놈 DNA"는 또한 메신저 RNA (mRNA), 상보적 DNA (cDNA), 및 상보적 RNA (cRNA)를 의미한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 폴리뉴클레오티드의 임의 절편을 의미하는데 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열에서의 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA에서의 코딩 서열, 예컨대 출발 코돈 (메티오닌 코돈)에서 시작하여 종결 신호 (중지 코돈)에서 종료되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 또한 그들 발현, 예컨대 전사 개시, 번역, 및 전사 종결을 조절하는 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 또한, 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (일반적으로, 이들 조절 구성요소는 코딩 서열 또는 유전자의 출발 코돈의 상류에 대략 60 내지 250 뉴클레오티드에 위치됨; Doree S M et al; Pandher K et al; Chung J Y et al), 전사 종결자 (일반적으로, 종결자는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 하류에 대략 50 뉴클레오티드에 위치됨; Ward C K et al)를 포함한다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나, 또는 특별한 단백질을 코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성 DNA"는 상이한 유기체, 예컨대 수령체와 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래되는 DNA를 의미한다. 이 용어는 또한 숙주 DNA의 동일 게놈 상의 DNA 또는 이의 단편을 의미하고, 이종성 DNA는 이의 본래 위치와 상이한 게놈 영역에 삽입된다.
"투약 용법"은 소정의 사전결정된 개체군 및/또는 개별 동물에서 바람직한 효과를 유도하기 위해서, 예컨대 소정 개체군, 예를 들어, 백신접종된 조류에서 질환의 발생률의 감소, 표적 질환의 중증도 감소 또는 그 증상의 억제, 및/또는 동물 및/또는 그들 자손에서 면역 반응의 유도를 위해서 개발된 면역원성 조성물로 조류를 처치할 때 면역원성 조성물의 양, 투여 횟수, 및/또는 투여 경로를 약술하는 일정을 의미할 수 있다.
"면역 반응"은 바이러스에 대한 노출 또는 백신에 의해 유도된 반응을 의미한다. 면역 반응은 체액성　면역 반응, 예를 들어, 바이러스 중화 항체, 세포 면역 반응, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응의 증강, 혈청학적 반응, 예컨대 ELISA 및/또는 혈구응집 억제 검사, 및/또는 투여된 면역원성 조성물에 의해 표적화된 질환의 임상 징후 및/또는 측정가능한 마커의 경감 및/또는 감소로서 측정될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "면역원"은 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체, 사멸, 약독화 또는 생; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원성 성질을 갖는 삽입부를 함유하는 재조합체 벡터; 숙주 동물에게 제시 시 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA의 조각 또는 단편; 폴리펩티드, 에피토프, 햅텐, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드"는 숙주에게 투여되면, 단백질에 대항하여 유도된 체액형 및/또는 세포형의 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 의미에서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 단백질 단편은 전체 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 적어도 하나의 에피토프 또는 항원성 결정부를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질의 전체 길이 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"이란 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역학적 반응을 유발하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당분야에 충분히 공지된, 임의의 다수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols　in　Methods　in　Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 단백질 분자의 일부분에 상응하는 펩티드인, 고형 지지체 상에서 많은 수의 펩티드를 동시에 합성하고, 여전히 펩티드를 지지체 상에 부착시킨 상태로 펩티드를 항체와 반응시켜서 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제4,708,871호에 기술되어 있다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는 예컨대 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 통해서, 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하여 쉽게 확인된다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols, 상동]을 참조한다.
용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드"는 폴리펩티드가 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역학적 반응을 생산하는 한, 서열에 대해 결실, 부가, 및 치환을 더 고려한다. 용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩되는 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기이게 되는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 치환을 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 성질이 본질적으로 보존적일 것이고, 다시 말해서, 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 하기 4개 패밀리로 분류된다: (1) 산성 - 아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성 - 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 - 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 - 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 대한 주요한 효과를 갖지 않는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 보존성 치환을 포함한다. 그러므로, 기준 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 미미한 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 기준 폴리펩티드의 정의 내에 있다. 이들 변형으로 생산된 모든 폴리펩티드는 본 명세서에 포함된다. 용어 "보존성 변이"는 또한 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 또한 미치환된 폴리펩티드와 면역반응한다면 미치환된 부모 아미노산 대신에 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.
용어 "에피토프"는 특이적인 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 햅텐 상의 부위를 의미한다. 이 용어는 또한 "항원성 결정부" 또는 "항원성 결정 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 한 항체의 능력을 보여주는 단순 면역어세이에서 확인할 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발생이다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 하기 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 생산. 바람직하게, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증강되게 하고/하거나 질환의 임상 중증도를 감소시키도록 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해서 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결여, 보다 신속한 회복 시간, 및/또는 감염된 숙주에서 하락된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "면역학적 조성물"은 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 임의 조성물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 자극제"는 면역 반응, 바람직하게 특별한 면역 반응, 예를 들어 특별한 병원체에 대한 면역 반응의 개시 또는 증가없이, 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 임의의 작용제 또는 조성물을 의미한다. 적합한 용량으로 면역 자극제를 투여하도록 더욱 지시된다.
용어 "재조합체" 및 "유전자 변형된"은 상호교환적으로 사용되고, 이의 천연 형태 또는 구조의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의 변형, 변경 또는 조작, 또는 이의 천연 환경 또는 주변에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의 변형, 변경 또는 조작을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 변형, 변경 또는 조작은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실, 전체 유전자의 결실, 유전자의 코돈-최적화, 아미노산의 보존성 치환, 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "다가 백신 또는 조성물", "조합 또는 콤보 백신 또는 조성물" 및 "다원자가 백신 또는 조성물"은 하나 초과의 조성물 또는 백신을 함유하는 조성물 또는 백신을 의미하고자 상호교환적으로 사용된다. 다가 백신 또는 조성물은 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 조성물 또는 백신을 함유할 수 있다. 다가 백신 또는 조성물은 재조합 바이러스 벡터, 활성 또는 약독화 또는 사멸 야생형 바이러스, 또는 활성 또는 약독화 또는 사멸 형태의 야생형 바이러스 및 재조합 바이러스 벡터의 혼합물을 포함할 수 있다.
당분야에 공지된 "서열 동일성"은 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 기준 서열 및 기준 서열과 비교하려는 소정 서열 간 관계를 의미한다. 서열 동일성은 이러한 서열의 스트링 간 일치에 의해 결정되는, 최고 정도의 서열 유사성을 생성하도록 서열을 최적으로 정렬시킨 후 기준 서열과 소정 서열을 비교하여 결정된다. 이러한 정렬 시에, 서열 동일성은 위치 대 위치 기반으로 확인되는데, 예를 들어, 서열은 그 위치에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일하면 특정 위치에서 "동일"하다. 이러한 위치 동일성의 총 수를 기준 서열 중 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 개수로 나누어서 % 서열 동일성을 제공한다. 서열 동일성은 제한없이 그 교시가 본 명세서에 참조로 편입되는 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함한, 기지 방법을 통해서 쉽게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and 게놈 Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). 서열 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 서열 간에 최대 일치를 제공하도록 디자인된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 소정 서열 간 서열 동일성을 결정하는 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화된다. 이러한 프로그램의 예는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처 (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시는 참조로 본 명세서에 편입됨)에서 공공으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 소정 서열 및 기준 서열 간 최고 수준의 서열 동일성을 생성하기 위해서 디폴트 갭 가중치를 사용해 서열을 최적으로 정렬시킨다. 예시로서, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도, 예를 들어, 80%, 바람직하게 85%, 보다 더 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 소정 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드 당 20 이하, 바람직하게 15 이하, 바람직하게 10 이하, 보다 더 바람직하게 5 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 소정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 달리 말해서, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해서 적어도 80%, 바람직하게 85%, 보다 더 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 기준 서열의 뉴클레오티드의 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5%가 결실될 수 있거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5%의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 이들 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접한 그룹에 산재될 수 있다. 유사하게, 기준 아미노산 서열에 대해서 적어도, 예를 들어, 80%, 바람직하게 85%, 보다 더 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95% 서열 동일성을 갖는 소정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 소정 폴리펩티드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100 아미노산 당 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5% 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고 폴리펩티드의 소정 아미노산 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 보다 더 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95% 서열 동일성을 갖는 소정 폴리펩티드 서열을 수득하기 위해서, 기준 서열 중 아미노산 잔기의 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5%는 결실될 수 있거나 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 중 아미노산 잔기의 총 수의 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5%의 다수 아미노산이 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내 잔기 중에 개별적으로 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접한 그룹으로 산재될 수 있다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하다. 그러나, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때 일치로서 포함되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "서열 상동성"은 2개 서열의 관련성을 결정하는 방법을 의미한다. 서열 상동성을 결정하기 위해서, 둘 이상의 서열은 최적으로 정렬되고, 필요하면 갭이 도입된다. 그러나, "서열 동일성"과 대조적으로, 보존성 아미노산 치환은 서열 상동성을 결정할 때 일치로 간주된다. 달리 말해서, 기준 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 기준 서열 중 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 80%, 바람직하게 85%, 보다 더 바람직하게 90%, 가장 바람직하게 95%는 일치해야 하거나 또는 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의한 보존성 치환을 포함해야만 하거나, 또는 기준 서열 중, 보존성 치환을 포함하지 않는, 전체 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 20% 이하, 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10%, 가장 바람직하게 5%의 다수 아미노산 또는 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 바람직하게 상동체 서열은 적어도 50, 보다 더 바람직하게 적어도 100, 보다 더 바람직하게 적어도 250, 및 보다 더 바람직하게 적어도 500 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동체"는 오솔로그, 유사체 및 파라로그를 포함한다. 용어 "유사체"는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖지만, 비관련 유기체에서 별개로 진화되어 온 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "오솔로그"는 상이한 종 유래이지만, 종분화를 통해서 공통 조상 유전자로부터 진화해 온 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 오솔로그는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "파라로그"는 게놈 내에서 중복에 의해 관련된 2종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 파라로그는 일반적으로 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능은 관련될 수 있다. 야생형 폴리펩티드의 유사체, 오솔로그, 및 파라로그는 번역후 변형에 의해서, 아미노산 서열 차이에 의해서, 또는 둘 모두에 의해서, 야생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 상동체는 일반적으로 상기 기술된 항원의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 전부 또는 일부와 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다.
"보존성 치환"은 전체 기능성이 유의하게 변화하지 않도록, 크기, 소수성 등을 포함한 유사한 특징 또는 성질을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 치환을 의미한다.
"단리된"은 이의 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해서" 변경된 것을 의미하는데, 다시 말해서, 자연에서 발생한 경우에, 이의 본래 환경으로부터 제거되었거나 또는 변경되었거나, 또는 둘 모두이다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 이의 자연 상태의 공존하는 재료로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이 용어가 본 명세서에서 적용되는 것처럼, "단리된" 것이다.
변이체는 대립유전자 변이체를 포함한다. 용어 "대립유전자 변이체"는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 일으키고 천연 개체군 (예를 들어, 바이러스 종 또는 변종) 내 존재하는 다형성을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에서 1 내지 5% 변이를 일으킬 수 있다. 대립유전자 변이체는 종들에서 동일 유전자의 유전자좌를 확인하기 위해서 혼성화 프로브를 사용하여 쉽게 수행될 수 있는, 다수의 상이한 종에서의 관심 핵산 서열의 시퀀싱을 통해서 확인할 수 있다. 천연 대립유전자 변이의 결과이고, 관심 유전자의 기능적 활성을 변경시키지 않는 임의의 모든 이러한 핵산 변이 및 최종 아미노산 다형성은 본 발명의 범주 내인 것으로 의도된다.
서열에 대한 용어 "동일성"은 예를 들어, 2개 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 개수로 나눈 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 위치의 개수를 의미할 수 있고, 여기서 2개 서열의 정렬은 Wilbur 및 Lipman 알고리즘 (Wilbur and Lipman)에 따라서 결정될 수 있다. 2개 아미노산 서열의 서열 동일성 또는 서열 유사성, 또는 2개 뉴클레오티드 서열 간 서열 동일성은 벡터 NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)를 사용해 결정될 수 있다. RNA 서열이 유사하다고 하거나, 또는 DNA 서열과 서열 동일성 또는 상동성의 정도를 갖는다고 할때, DNA 서열 중 티미딘 (T)은 RNA 서열 중 우라실 (U)과 동일한 것으로 간주된다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주 내에 있고, DNA 서열로부터 유래될 수 있으며, DNA 서열의 티미딘 (T)은 RNA 서열의 우라실 (U)과 동일한 것으로 간주된다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드의 결과로서 축퇴성인 서열, 예를 들어, 특정 숙주에 최적화된 코돈 요법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "최적화된"은 소정 종에서 이의 발현을 증가시키도록 유전자 조작된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해서, 단백질 유전자의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고도로 발현되는 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 상기 종에서 실질적으로 발견되는 뉴클레오티드 염기 조성 중 A+T 또는 G+C 함량을 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 분해 및 종결을 야기하거나, 또는 2차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이싱 부위를 형성하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. 상기 종에서 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물, 또는 특정 종에서 코돈 용법의 분포 빈도를 이용하여 획득될 수 있다.
용어 "선호된 코돈 용법의 빈도"는 소정 아미노산을 특정하기 위해서 뉴클레오티드 코돈의 용법에서 특정한 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 의미한다. 20개 천연 아미노산이 존재하고, 이들 대부분은 1개 초과의 코돈에 의해 특정된다. 그러므로, 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 본 개시에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "수의학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다.
당업자는 본 명세서에서 사용되는 조성물이 기지의 주사가능한, 생리적으로 허용가능한 멸균 용액을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위해 사용-준비된 용액을 제조하기 위해서, 수성 등장성 용액, 예컨대 예를 들어, 염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액은 쉽게 입수가능하다. 또한, 본 개시의 면역원성 및 백신 조성물은 희석제, 등장화제, 안정화제, 또는 보강제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 특히, 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "보강제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, Ala.), 유중수 에멀션, 수중유 에멀션, 수중유중수 에멀션을 포함할 수 있다. 에멀션은 특히 경질 액상 파라핀 오일 (유럽 약전 유형); 이소프레노이드 오일 예컨대 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화에 의한 스쿠알란 또는 스쿠알렌 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 알콜 또는 산의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 에멀션을 형성하도록 유화제와 조합하여 사용된다. 유화제는 바람직하게 비이온성 계면활성제, 특히 솔비탄, 만니드 (예를 들어, 무수만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산의 에스테르, 임의로 에톡실화되는 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 Pluronic 제품, 특히 L121이다 (참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) 및 Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)).
면역원성 조성물이 본 명세서에서 기술된다. 특히, 본 발명은 수의학 백신 분야, 즉 재조합 바이러스 벡터 기반 백신에 관한 것이다. 특히, 조류 인플루엔자, 마렉병, 뉴캐슬병, 및 전염성 활액낭병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 질환에 대항하여 조류에서 사용을 위한 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물이 본 명세서에서 기술된다.
본 명세서에 개시된 면역원성 조성물에 의해 표적이 되는 질환은 고도의 전염성 조류 질환인 마렉병 (MD)을 포함한다. MD의 임상 증상은 체중 감소, 예를 들어 다리 또는 날개의 마비, 종양, 예컨대 심장, 난소, 고환, 근육, 폐, 깃털 여포 등에서의 종양, 눈 병변, 불규칙적 동공, 및 폐사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. MD는 몇몇 장기 및 신경에서 T-세포 림프종의 존재와 연관된다. 일부 예에서, 면역 모체로부터의 모체 유래 항체 (MDA)는 새롭게 태어난 조류에게 보호성을 제공할 수 있다.
기술된 바와 같이 본 발명은 조류 병원체의 항원을 포함하고 발현하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 재조합 벡터는 면역원성 조성물, 예를 들어, 재조합 벡터를 포함하는 백신에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신은 조류 병원체의 적어도 하나의 항원을 코딩하고 발현하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합체 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 조류를 치료하는 방법, 예를 들어, 다양한 조류 병원체에 대해 백신접종하는 방법, 및 재조합 벡터를 제조하는 방법이 기술된다.
벡터는 바이러스, 예를 들어, 생 바이러스, 불활성화 바이러스, 예컨대 사멸 백신, 재조합 바이러스 및/또는 박테리아를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 기술된 바와 같은, 면역원성 조성물은 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
백신 벡터는 바이러스로부터 구축될 수 있다. 일부 예에서, 면역원성 조성물에서 사용을 위한 재조합 벡터에서 사용을 위한 바이러스는 바이러스의 성질을 기반으로 사전결정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터에서 사용을 위한 사전결정된 바이러스는 칠면조 유래 헤르페스바이러스 (HVT), 마렉병 바이러스 예컨대 마렉병 바이러스 혈청형 3 (MDV-3), MDV-1, MDV-2, 및/또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스 예컨대 멜레아그리드 헤르페스바이러스 혈청형 1 (MeHV-1)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스를 포함할 수 있다.
예를 들어, 가금류에게 MDV-3 (HVT) 벡터 백신의 투여는 발현된 이종성 유전자에 대항하여 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 일부 예에서, MDV-3 벡터 백신은 동물 (예를 들어, 조류)의 면역 반응을 조작하기 위해서, 치료적 단백질, 예를 들어 사이토카인을 발현 및/또는 전달하는데 사용될 수 있다.
MDV-3 균주 예컨대 FC-126은 바이러스 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. HVT (MDV-3)의 게놈 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AF291866 (균주 FC-126)으로서 GenBank™ 에서 입수가능하다.
MDV-3 (즉, HVT)으로 이종성 유전자-구성체의 삽입을 위한 유전자 위치는 불필수 유전자좌를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 삽입은 MDV-3 게놈의 HVT 고유의 긴 (UL) 영역에서, MDV-3 게놈의 고유의 짧은 (Us) 영역에서의 위치에서 일어날 수 있다.
PRV gpX 프로모터, 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, SV40 초기 유전자 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자 프로모터, 및/또는 인간 유래 급초기 1 유전자 프로모터 (hCMV IE1), mCMV 프로모터, 또는 쥣과동물 (mCMV IE1) 사이토메갈로바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 상이한 프로모터가 이종성 유전자의 발현을 구동하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 소정 바이러스 벡터에서, 하나 이상의 프로모터는 포함된 유전자 서열의 발현을 구동하는데 사용될 수 있다.
재조합 벡터의 구성을 위해서, 벡터의 게놈으로 삽입시키려는 이종성 핵산은 일반적으로 항원 (의 적어도 면역원성 부분)을 코딩하는, 적어도 하나의 이종성 유전자 또는 코딩 영역을 포함한다. 일부 예에서, 구성체는 이종성 유전자의 발현을 구동시키기 위한 프로모터 서열, 및 조절 신호 예컨대 인핸서, 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다. 이러한 조합된 삽입부는 종종 '발현 카세트'라고 한다.
벡터의 게놈으로 발현 카세트의 삽입의 효과는 이것이 삽입되는 방식 및 위치에 따라서, 상이하고, 벡터 게놈은 게놈 상에서 최종 결과가 각각 유전 물질의 부가, 치환 또는 결실인지 여부에 의존하여, 크기가 더 커지게 되거나, 동일하거나, 또는 더 작아지게 될 것이다. 또한, 삽입의 위치는 게놈의 코딩, 비-코딩, 또는 조절 영역 내에 위치하여, 효과를 가질 수 있다. 특히, 이들 선택은 복제 및 발현에 대한 이의 능력, 및 이의 유전적 안정성 관점에서, 최종 벡터 백신의 특징에 영향을 미친다.
일부 예에서, 바이러스 벡터는 도너 플라스미드를 사용하여 MDV-1, MDV-2, 및/또는 MDV-3에 하나 이상의 외생성 서열 삽입부를 포함시켜서 구성될 수 있다. 또한, 일부 면역원성 조성물은 외생성 서열을 포함하는 둘 이상의 바이러스 구성체를 포함할 수 있다. 예를 들어, MDV-1, MDV-2, 및/또는 MDV-3로부터 형성된 바이러스 벡터의 다양한 조합은 각각이 질환에 대한 하나 이상의 외생성 서열을 포함하여 면역원성 조성물을 형성할 수 있다. 또한, 다수의 바이러스 벡터는 3 이상의 질환에 대항하여 보호성을 제공하도록 면역원성 조성물 중에서 조합될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 백신 벡터의 일부 구현예는 MDV-3 균주 FC-126을 부모 바이러스로서 사용한다 (예, Ross, LJ et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).
부모 바이러스에 따라서 도너 플라스미드의 구성이 다양할 수 있다. 도너 플라스미드는 프로모터 예컨대 mCMV 프로모터, 표적 질환에 대한 관심 유전자, 및/또는 전사 중지 예컨대 폴리A를 포함하는 것이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, AIV를 표적으로 하는, 일 구현예에서, 선택된 도너 플라스미드는 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, 및/또는 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다. 이러한 도너 플라스미드는 pCD046-COBRA-C로 명명될 수 있고, MDV-3 균주 FC-126을 변형시켜서 도 1에 도시된 바와 같은 vHVT509를 형성한다.
AIV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 바와 같은 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 특히, AIV 및 IBDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 90% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, AIV 및 IBDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 95% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, MDV-3 균주 FC-126은 vHVT013 또는 Vaxxitek으로서 공지된 바이러스를 형성하기 위해 전염성 활액낭병 (IBDV)으로부터의 VP2 단백질을 코딩하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있다 (EPAR-Scientific Discussion at www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-discussion/vaxxitek-hvtibd-epar-scientific-discussion_en.pdf; www.biodic.go.jp/bch/download/lmo/H28.9.23_doubutsuiyaku_sp.pdf). 예를 들어, (바이러스 백신 균주인) 본 명세서에 기술된 변형된 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 출발 바이러스 벡터는 HVT013 또는 vHVT013일 수 있거나 또는 VAXXITEK(R)의 성분 (종종 vHVT013-069라고도 함)일 수 있다.
특히, vHVT13 (또는 HVT013-69)은 Merial (Boehringer Ingelheim Animal Health)의 VAXXITEK(R) (HVT+IBD) 백신의 활성 성분이다. 미국 특허 제5,980,906호에서, vHVT013 또는 vHVT013-69 또는 HVT013으로서 일반적으로 알려진 HVT+IBD 구성체 또는 VAXXITEK(R)의 활성 성분은 vHVT17이라고 한다. vHVT13 (또는 vHVT013-69 또는 HVT013) 벡터는 mCMV IE 프로모터 (SEQ ID NO:6), IBDV　VP2 유전자 (SEQ ID NO:2를 코딩하는 SEQ ID NO:1), 및 IG1 삽입 부위에 삽입된 SV40 폴리A 꼬리부 (SEQ ID NO:8)를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
이러한 재조합체 백신 균주, vHVT013 (IBDV　VP2 유전자를 발현하는 HVT 벡터)은 HVT의 부모 FC-126 균주의 DNA 및 상동성 팔부에 의해 둘러싸인 관심 유전자를 포함하는 플라스미드 간 상동성 재조합을 통해서 삽입 영역을 표적화하는 단계를 포함하는 프로토콜에 따라 구축되었다. 최종 재조합체는 더욱 변형되어서 바이러스 벡터, vHVT522 및/또는 vHVT523을 창출할 수 있다.
일부 구현예에서, vHVT013은 단백질을 코딩하는 서열을 첨가하여 변형될 수 있다. 특히, vHVT013은 질환의 항원 및/또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, vHVT013은 조류 인플루엔자의 항원 및/또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 도1 에 도시된 바와 같이, vHVT013은 바이러스 벡터 vHVT522를 형성하기 위해 COBRA-C H5 HA에서 형성된 바와 같은 조류 인플루엔자 항원을 코딩하는 서열을 포함하도록 도너 플라스미드를 사용해 변형될 수 있다.
예를 들어, vHVT013은 조류 인플루엔자 항원을 코딩하는 서열을 포함하도록 도너 플라스미드를 사용해 변형될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, vHVT013은 바이러스 벡터 예컨대 vHVT522 및/또는 vHVT523을 형성하도록 AIV 항원, 예컨대 COBRA-C H5를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 사용해 변형될 수 있다. 특히, pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C, pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C를 비롯하여, 외생성 서열의 상이한 조합을 도입한 다른 플라스미드를 사용할 수도 있다.
일부 구현예에서, vHVT522는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 합성 전염성 활액낭병 바이러스 구조적 캡시드 단백질 VP2.
재조합 바이러스 벡터는 SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질 (IBDV VP2)을 포함할 수 있는 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드를 사용해 형성될 수 있다. 이러한 플라스미드는 Vaxxitek 바이러스 우측 IG1 팔부 및 IBDV VP2로 상동성 재조합을 사용해 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 도너 플라스미드는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C일 수 있고, 이것은 Vaxxitek 바이러스의 우측 유전자간 1 팔부, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), IRES, 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 합성적으로 주문된 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 부모 바이러스 유래 mCMV 프로모터를 포함할 수 있다. 특히, vHVT522의 구현예는 도 1에 도시된 바와 같은 mHVT013 바이러스의 출발점으로부터의 mCMV 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합은 시험관내 2차 닭 배아 섬유아세포 (2° CEF)에서 일어날 수 있다. 재조합 선택은 닭 항-조류 인플루엔자 혈청을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA) 및 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 수행할 수 있다. 플라스미드 다이아그램은 도 14 및 도 15에 도시된다.
일부 구현예에서, 플라스미드 pVP2-IRES-COBRA-C는 합성 COBR-C 단편 (Genscript Lot U5872BA260-3)을 pVP2-IRES-Cobra-A에 클로닝하여 생성될 수 있다. 또한, pVP2-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 VP2+COBC로 교체하여 변형시켜서 pVP2-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 시작부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거할 수 있다. 최종 도너 플라스미드는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C이다. 도너 플라스미드, pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C를 생성하여 재조합 바이러스를 생성시킬 수 있다.
AIV 및 IBDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 특히, AIV 및 IBDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용된 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 90% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, AIV 및 IBDV에 대한 항원을 포함한 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 95% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다.
시험관내 재조합 (IVR)은 vHVT013으로부터 단리된 바이러스 DNA 및 도너 플라스미드로서 선형화된 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C를 사용해 2° CEF 세포의 동시-전기천공을 통해서 수행될 수 있다. 동시-전기천공은 300 μl Opti-MEM 중 1x107 2° CEF를 사용해 수행될 수 있고, 2 mm 전기천공 큐벳 중에서 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가할 수 있다. 이어서 형질감염된 세포를 96-웰 플레이트에 파종하였고 4일 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트에서 성장된 세포를 2개 96-웰 플레이트에서 복제시킬 수 있다. 96-웰 플레이트의 1개 세트는 재조합체를 함유하는 양성 웰을 확인하기 위해서 AIV H5 HA에 대한 닭 다클론 혈청을 사용해 IFA에 사용될 수 있고, 96-웰 플레이트의 다른 세트는 상응하는 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하는데 사용될 수 있다.
재조합체 바이러스 정제 방법은 먼저 96-웰 플레이트 복제 및 최소량의 IFA 음성 플라크와 최대량의 IFA 양성 플라크를 함유하는 웰에 대한 IFA 선택을 통해 수행될 수 있다. 그들 기준에 부합하는 웰을 이어서 수확하고 1 mL까지 DMEM+2% FBS로 조정할 수 있다. 1 mL 스톡으로부터, 10-20 μl을 제거할 수 있고 10 mL DMEM+2% FBS 중 1x107 2° CEF와 혼합할 수 있으며, 그 다음에 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트에 분취할 수 있다. 단일 플라크를 함유하는 웰의 상청액은 PCR을 통해 부모 바이러스의 부재에 대해 시험될 수 있다. 이러한 과정은 모든 시험된 웰이 순수한 재조합체 밴드 패턴을 보이고 부모 바이러스를 보이지 않을 때까지 몇 라운드 동안 반복될 수 있다.
일 구현예에서, vHVT013은 둘 이상의 외생성 서열을 코딩하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 구현예는 뉴캐슬병 (NDV) 단백질, 예컨대 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열 및 조류 인플루엔자 단백질 예컨대 도 1에 도시된 바와 같은 COBRA-C H5 HA를 코딩하는 추가 서열을 갖도록 변형된 vHVT013을 포함할 수 있다.
특히, vHVT523은 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해서 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV) A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 단백질은 또한 본 명세서에서 Computationally Optimized Broadly Reactive Antigen-version C 에 대해 COBRA-C라고도 한다. 또한, vHVT523은 합성 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 융합 단백질 (F)을 포함할 수 있다.
재조합체 HVT 바이러스로부터 형성된 vHVT523 구성체는 mCMV 프로모터, NDV 융합 단백질 F, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 바이러스 (아형 H5, COBRA-C)의 HA 단백질 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있는 BamHI I 단편에 유전자간 I 부위를 포함할 수 있다.
도너 플라스미드는 vHVT013 바이러스의 유전자간 1 팔부 유래 합성 DNA 단편, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), IRES, NDV-F 단백질 및 mCMV 프로모터를 포함하는 플라스미드를 포함하는 것인 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C일 수 있다. 재조합은 2차 닭 배아 섬유아세포 (2° CEF) 세포에서 시험관내에서 일어날 수 있다. 재조합 선택은 닭 항-조류 인플루엔자 혈청을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA) 및 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 플라스미드 pFwt-IRES-COBRA-C는 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출된 COBRA-C 유전자로 이전에 생성된 플라스미드 (pFwt-IRES-SaH9opt)의 사우디-아라비아 H9 유전자를 치환시켜서 구축될 수 있다. COBRA-C 유전자는 SalI 및 HindIII을 사용한 제한 효소를 사용하여 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출될 수 있고 역시 동일한 효소로 분해된 pFwt-IRES-SaH9opt에 클로닝될 수 있다. pFwt-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 F+COBC로 치환시켜 더욱 변형하여서 pFwt-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 시작부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거하였다. 새로운 올바른 도너 플라스미드는 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C라고 한다. 이러한 플라스미드는 재조합 바이러스를 생성시키는데 사용될 수 있다. 플라스미드의 구성의 구현예의 다이아그램은 도 36 및 도 37에 도시된다.
AIV 및 NDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 38에 도시된 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 특히, AIV 및 NDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 38에 도시된 플라스미드의 서열과 90% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, AIV 및 NDV에 대한 항원을 포함하는 바이러스 벡터를 구축하는데 사용되는 도너 플라스미드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 38에 도시된 플라스미드의 서열과 95% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 시험관내 재조합 (IVR)은 vHVT013로부터 단리된 바이러스 DNA 및 도너 플라스미드로서 선형화된 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C를 사용하여 2° CEF 세포의 동시-전기천공을 통해서 수행될 수 있다. 동시-전기천공은 300 μl Opti-MEM 중 1x107 2° CEF를 사용해 수행될 수 있고, 2 mm 전기천공 큐벳 중에서 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가할 수 있다. 형질감염된 세포를 96-웰 플레이트에 파종할 수 있고 4일 동안 인큐베이션할 수 있다. 이어서, 96-웰 플레이트에서 성장된 세포는 2개 96-웰 플레이트에서 복제될 수 있다. 96-웰 플레이트의 1개 세트는 재조합체를 함유하는 양성 웰을 확인하기 위해서 AIV H5 HA에 대한 닭 다클론 혈청을 사용한 IFA에 사용될 수 있고, 96-웰 플레이트의 다른 세트는 상응하는 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하기 위해 사용될 수 있다.
재조합체 바이러스 정제 방법은 재조합 바이러스 벡터를 회수하는데 사용될 수 있다. 이들 정제 방법은 먼저 96-웰 플레이트 복제 및 최소량의 IFA 음성 플라크와 최대량의 IFA 양성 플라크를 함유하는 웰에 대한 IFA 선택을 통해서 수행될 수 있다. 그들 기준에 부합하는 웰을 수확할 수 있고 1 mL 까지 DMEM+2% FBS로 조정할 수 있다. 1 mL 스톡으로부터, 10-20 μl를 제거하고 10 mL DMEM+2% FBS 중 1x107 2° CEF와 혼합하여, 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트에 분취할 수 있다. 단일 플라크를 함유한 웰의 상청액은 PCR을 통해서 부모 바이러스의 부재에 대해 시험될 수 있다. 이러한 과정은 순수한 재조합체 밴드 패턴을 보이고 부모 바이러스가 없을 때까지 몇 라운드 동안 반복될 수 있다.
플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C의 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 도시된 바와 같이, 바이러스 구성체, vHVT509는 COBRA-C H5 HA를 코딩하는 서열이 첨가된 MDV-3 균주 FC-126으로부터 형성된다.
바이러스 벡터의 선택은 숙주에서 바이러스의 복제, 면역 반응, 예컨대 체액성 및/또는 세포-매개 면역력을 유도하는 바이러스의 능력, 폐사율의 감소, 관심 증상의 감소, 바이러스 생산 용이성, 면역원성 조성물에 바이러스를 도입하는 능력, 조류에 투여 용이성 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바이러스의 몇몇 성질의 고려를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물 제조에서 사용을 위해 선택되는 바이러스는 바이러스 예컨대 칠면조의 헤르페스바이러스 (rHVT) 예컨대 갈리드 헤르페스바이러스, 마렉병 바이러스, 멜레아그리드 헤르페스바이러스 및/또는 당분야에 공지된 다른 바이러스의 하나 이상의 균주를 포함할 수 있다. 특히, HVT, MDV, 또는 MeHV의 다양한 균주가 많은 중요한 질환, 특히 가금류에 영향을 미치는 바이러스 질환에 대항하여 보호하기 위해 생 바이러스 벡터 백신으로서 사용을 위해 선택될 수 있다.
칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)로도 알려진, 마렉병 바이러스 (MDV) 혈청형 3 (MDV-3)을 사용한 면역화가 MDV에 대항하여 닭 개체군을 보호하기 위해 전세계적으로 사용되어 왔다. 또한, HVT는 다른 장점 중에서도 특히, 숙주에서 이의 지속적인 복제, 체액성 및 세포-매개 면역력 둘 모두를 유도하는 이의 능력, 및 이의 상대적으로 용이한 제조 및 투여 덕분에 많은 중요한 바이러스 가금류 질환에 대항하여 보호하도록 생 바이러스 벡터 백신으로서 개발하는데 사용되어 왔다.
MDV (즉, HVT), MDV-1, MDV-2, 및/또는 MDV-3의 특정 균주는 바람직한 제품 또는 적용 (즉, 특정 부류의 동물에게 투여)을 위해 흥미로운 사전결정된 성질에 대해 선택될 수 있다. 이들 성질은 관심 질환에 대한 효능, 특히 일부 예에서 관심 질환에 대한 바이러스 벡터의 효능을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그 자체를 코딩하는 질환 및/또는 외생성 서열(들)에서 유래되는 질환에 대한 바이러스 벡터의 효능이다. 예를 들어, 외생성 서열은 IBD, ND, AIV, 예컨대 AIV H5, 및/또는 임의의 다른 관심 바이러스로부터 유래되는 항원 및/또는 단백질을 코딩한다. MDV 균주, 특히, MDV-3은 재조합 바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV-3 FC-126 균주는 다른 특징 중에서도, 숙주에서 이의 지속적 복제, 체액성 및 세포-매개 면역력 둘 모두를 유도하는 이의 능력, 및 이의 상대적으로 용이한 제조 및 투여 덕분에 면역원성 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV-3 FC-126 클론 2는 관심 재조합체 구성체를 형성하는데 사용될 수 있다.
재조합체 백신 벡터는 플라스미드를 사용하여 사전결정된 바이러스로부터 구축될 수 있다. 플라스미드는 사전결정된 바이러스에 하나 이상의 바람직한 서열을 삽입시켜서 재조합 바이러스 벡터를 형성시키는데 사용될 수 있다. 또한, 사전선택된 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자는 일부 재조합체 백신 벡터에 포함될 수 있다. 특히, 관심 단백질을 코딩하는 서열, 예를 들어, 하나 이상의 조류 질환의 항원을 코딩하는 서열은 플라스미드를 사용해 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 플라스미드는 바이러스 벡터로 발현 카세트를 삽입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 하나 이상의 유전자 및 그들 발현을 제어하는 서열 (예를 들어, 조절 서열)을 포함할 수 있는 사전선택된 DNA를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 세포의 기구가 RNA 및/또는 단백질(들)을 만들도록 지시할 수 있다. 발현 카세트는 단백질-코딩 서열의 모듈식 클로닝을 허용할 수 있다.
일부 예에서, 발현 카세트는 다수의 성분들, 예를 들어, 프로모터　서열, 오픈 리딩 프레임, 및/또는 비번역 영역을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 상이한 벡터로 형질감염될 수 있다. 특히, 바람직한 유전자로부터의 프로모터 DNA가 벡터에 삽입될 수 있다.
하나 이상의 질환 예컨대 조류 인플루엔자 (AI), 예를 들어, 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAIV), 전염성 활액낭병 (IBDV), 뉴캐슬병 (NDV), 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV), HVT, MDV, 예를 들어 MDV-1, MDV-2, 또는 MDV-3, MeHV, 및/또는 관심 조류 바이러스로부터 유래되는 서열은 면역원성 조성물에서 사용을 위한 면역원성 작용제를 형성하도록 조합될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 백신, 예컨대 다가 백신일 수 있다.
외생성 서열을 포함한, 서열은 바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 바이러스 벡터는 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 조류 아스트로바이러스, 조류 파보바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 전염성 활액낭병 바이러스, 콕시디아증 (에이메리아 (Eimeria) sp.), 캄필로박터 (Campylobacter) sp., 살모넬라 (Salmonella) sp., 파스퇴렐라 (Pasteurella) sp., 아비박테리움 (Avibacterium) sp., 마이코플라스마 갈리셉티쿰 (Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라스마 시노비아에 (Mycoplasma synoviae), 클로스트리듐 (Clostridium) sp., 및 이. 콜라이 (E. coli)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 조류 병원체로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물, 예컨대 백신에서 사용을 위한 바이러스 벡터는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌 뉴라미니다제 (NDV-HN), 마렉병 바이러스 당단백질 C (gC), 마렉병 바이러스 당단백질 B (gB), 마렉병 바이러스 당단백질 E (gE), 마렉병 바이러스 당단백질 I (gl), 마렉병 바이러스 당단백질 H (gH) 또는 마렉병 바이러스 당단백질 L (gL), IBDV VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, IBDV VP4, ILTV 당단백질 B, ILTV 당단백질 I, ILTV UL32, ILTV 당단백질 D, ILTV 당단백질 E, ILTV 당단백질 C, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 인플루엔자 뉴라미니다제 (NA), 마이코플라스마 갈리셉티쿰 (MG), 또는 마이코플라스마 시노비아에 (MS)로부터 유래되는 보호 유전자, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관심 항원 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 서열, 또는 뉴크렐오티드를 포함할 수 있다. 3가 바이러스 벡터의 예는 도 2에 도시되어 있다.
재조합 바이러스 벡터는 바이러스 및 바이러스 상의 특정 부위로 삽입을 위한 삽입 플라스미드 또는 도너 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법으로 구축될 수 있다.
도너 플라스미드에 의해 바이러스로 전달된 뉴클레오티드 삽입부는 바람직한 단백질 예컨대 항원을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열의 발현이 생체내에서 가지게 되는 효과를 기반으로 선택될 수 있다. 도너 플라스미드는 플라스미드의 특별한 성질 예컨대 특별한 부위에 서열을 도입시키는 능력에 대해서 선택될 수 있고, 예를 들어, 플라스미드는 바이러스와 재조합, 재조합 항원의 발현 강도, 및/또는 바이러스 생활주기의 발현 단계를 지정하는 측접된 상동성 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 도너 플라스미드는 바이러스의 재조합 유전자좌에서 바람직한 서열을 도입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열은 MDV-3의 재조합 유전자좌, 예컨대 BamHI-I 단편에 위치하는 유전자간 1 유전자좌에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 선택된 도너 플라스미드는 mCMV 프로모터, SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 전염성 활액낭병 바이러스 항원을 코딩하는 외생성 서열 및/또는 뉴캐슬병 바이러스 항원을 코딩하는 외생성 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특히, 재조합 바이러스 벡터는 MDV-3 (예를 들어, 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)), 및 SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오티드 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 전염성 활액낭병 바이러스 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오티드 서열, 및/또는 뉴캐슬병 바이러스 항원을 코딩하는 외생성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 MDV-3 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 삽입 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 통해서 구축될 수 있다.
도너 플라스미드 및 후속하여 형성되는 바이러스 벡터에 포함을 위한 삽입부는 바람직한 단백질 예컨대 항원을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열의 발현이 생체내에서 가지게 되는 효과를 기반으로 선택될 수 있다.
바이러스 벡터를 형성하도록 바이러스에 삽입되는 외생성 서열은 일부 예에서 코돈 최적화될 수 있다.
상이한 H5 삽입부 및/또는 다른 질환의 항원에 대한 삽입부를 포함하는, vMDV-H5 (즉, vHVT-H5) 구성체를 포함한 면역원성 조성물, 예컨대 백신이 개발될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 사용해 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 포함하도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 재조합체 MDV (즉, HVT)는 COBRA를 사용해 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 포함하도록 구축될 수 있다.
특히, 재조합체 MDV HA H5 백신은 상이한 H5 삽입부, 다른 질환의 항원에 대한 삽입부, 및/또는 다른 기능성 삽입부를 포함하는 것이 개발될 수 있다. H5 삽입부를 갖는 생체내 재조합 벡터 HVT (vMDV-H5 및/또는 vHVT-H5)는 가금류에서 HPAI에 대해 유망한 결과를 입증하였다. 일부 구현예에서, 단일 H5 삽입부가 하나의 바이러스 벡터에 제공될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터의 구현예는 H5의 다수 유전자 삽입부를 포함할 수 있다.
COBRA 및 vMDV (즉, vHVT) 기술의 결합은 현장에서 H5 HPAI 바이러스 제어를 개선시킬 수 있다. 벡터 플랫폼으로서 생 바이러스의 사용은 COBRA HA 효능을 개선시킬 수 있다.
조류에게 제공하려는 면역원성 조성물용 면역원성 작용제를 생성시키기 위해서 COBRA와 함께 재조합체 기술의 이용은 현장에서 바이러스 제어를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 면역학적 조성물을 구축하기 위해 COBRA 및 재조합 바이러스 벡터의 사용은 개선된 H5 HPAI 바이러스 제어를 일으킬 수 있다.
예를 들어, 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예컨대 MDV-3에서 사용할 때 코돈 최적화될 수 있다.
바이러스 벡터는 하나 이상의 관심 서열을 포함하는 것을 형성시킬 수 있다. 특히, 바이러스 벡터는 MDV의 재조합 영역에서 프로모터, 조류 바이러스 항원, 및/또는 SV40 폴리A 꼬리부를 비롯하여, 관심 유전자 및/또는 기능성을 코딩하는 다른 서열을 포함하는 재조합 MDV일 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합체 MDV는 항원, 예컨대 조류 인플루엔자 바이러스의 단백질 유전자를 포함하도록 구축될 수 있다. 이러한 재조합체 MDV 구성체는 또한 프로모터, AIV 단백질 유전자, MDV의 사전결정된 부위에 삽입시키려는 사전선택된 서열을 포함할 수 있다.
재조합체 MDV 구성체는 MDV-3 균주의 재조합 영역 유전자간 부위 1에 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 vHVT509는 MDV-3 FC-126 균주의 재조합 영역 유전자간 부위 1에 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 재조합 MDV-3일 수 있다.
바이러스 벡터 vHVT509의 뉴클레오티드 서열은 도 13의 vHVT509의 시퀀싱된 영역의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 도 13에 도시된 바와 같은 vHVT509에 대한 서열과 약 90% 초과의 동일성 및/또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, vHVT509에서 사용되는 AIV HA COBRA-C에 대한 아미노산 서열은 도 12에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 도 13에 도시된 바와 같은 vHVT509에 대한 서열과 약 90% 초과의 동일성 및/또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분을 갖는 바이러스 벡터를 이용하는 것이 표적 질환, 표적 동물, 및/또는 동물의 성질에 따라서 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터를 형성하는데 사용되는 도너 플라스미드는 조류 인플루엔자 항원을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 AIV 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 사용해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, vHVT522는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
도너 플라스미드의 일부 예에서, 재조합체 바이러스 구성체는 부모 바이러스, 예컨대 MDV-3으로부터 형성될 수 있다. 특히, 균주 예컨대 MDV-3 FC-126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 일부 구현예에서, 부모 바이러스는 MDV-3 FC-126 클론 2일 수 있다. 도너 플라스미드는 MDV-3의 재조합 유전자좌에서 바람직한 서열을 도입시키는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 도너 플라스미드는 플라스미드의 적어도 일부분이 표적 바이러스와 상동성이도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 도너 플라스미드는 삽입의 적어도 일부분은 MDV3의 재조합 유전자좌, 예컨대 BamHI-I 단편에 위치된 유전자간 1 유전자좌에서 일어나도록 구축될 수 있다.
도너 플라스미드는 관심 성질을 기반으로 선택 및/또는 구축될 수 있다. 도너 플라스미드는 프로모터, 관심 유전자, 및 폴리A (전사 중지)를 포함할 수 있다. 프로모터는 개발자에게 유용한 것으로 결정되는 다양한 성질에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 강도 (예를 들어, 강, 중, 약) 및/또는 동역학적 부류 (즉, 활성화 시간, 예를 들어, 급초기, 초기, 후기 프로모터)가 다양할 수 있고 특정 강도, 특정 활성화 시간, 또는 변수의 조헙에 대해 선택될 수 있다. 관심 유전자는 야생형 서열 또는 코돈 최적화된 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 도너 플라스미드는 폴리A 서열을 포함할 수 있다. 플라스미드에서 사용을 위한 특별한 폴리A 서열의 선택은 사전결정된 유전자와 조합되는 폴리A 서열의 능력, 유사한 폴리A를 사용한 다른 유전자와의 재조합을 억제하고/하거나 피하는 이의 능력, 재조합 유전자의 발현 수준에 대한 이의 효과, 재조합 유전자를 코딩하는 서열과 이의 상용성, 및/또는 당분야에 공지된 다른 바람직한 성질 또는 효과에 기인할 수 있다.
도너 플라스미드는 면역원성 조성물이 보호성을 제공하는 질환으로부터 유래되는 하나 이상의 항원 및/또는 단백질을 갖도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 도너 플라스미드는 IBD, ILT, ND, AI, MD 및/또는 이의 임의 조합으로부터 유래되는 항원을 포함할 수 있다.
도너 플라스미드는 프로모터 예컨대 mCMV 프로모터, 표적 질환에 대한 관심 유전자 및 폴리A (전사 중지)를 포함할 수 있다. 예를 들어, AIV를 표적으로 하는 일 구현예에서, 선택된 도너 플라스미드는 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, 및/또는 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다. 이러한 도너 플라스미드는 pCD046-COBRA-C로서 지정될 수 있다.
도너 플라스미드예는 pCD046-COBRA-C, pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C, pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C를 비롯하여, 외생성 서열의 상이한 조합을 도입시키는 다른 플라스미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
플라스미드 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C에 대한 뉴클레오티드 서열은 도 38에 도시된 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C에 대한 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 플라스미드의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
벡터로서 사용을 위한 재조합 바이러스는 본 명세서에 개시된 방식으로 생성될 수 있다. 특히, 시험관내 재조합 (IVR)은 도너 플라스미드, 예컨대 pCD046-COBRA-C, 및 바람직한 바이러스로부터 단리된 바이러스 DNA, 예컨대 MDV-3 균주 FC-126을 사용한 2차 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 세포의 동시-전기천공을 통해 수행될 수 있다. 동시-전기천공은 200 μL의 감소된 혈청 배지 중 1x107 2차 CEF를 사용해 수행될 수 있고, 2 mm 전기천공 큐벳 중에서 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가할 수 있다. 형질감염된 CEF 세포는 세포 성장 배지, 예컨대 2% 태아 소 혈청 (FBS) 함유 기초 배지 (예컨대, Dulbecco's Modified Eagle Medium "DMEM")와 함께 96-웰 플레이트에 파종될 수 있고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4-5일 동안 인큐베이션될 수 있다. 다음으로 96-웰 플레이트에서 성장된 세포를 2개 96-웰 플레이트로 복제할 수 있고, 2일 또는 3일 더 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션될 수 있다. 복제된 96-웰 플레이트의 1개 세트는 닭 항-AIV H5N2 혈청 및 토끼 항-닭 IgY (IgG) (전체 분자)-FITC 접합을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA)를 통해 재조합 바이러스에 대해 스크리닝될 수 있다. 재조합 바이러스의 순수한 개체군을 수득하기 위해서, 상응하는 96-웰 플레이트 중 IFA 양성 웰로부터의 CEF를 회수할 수 있고 정제 단계에서 처리할 수 있다.
재조합 바이러스의 정제는 96-웰 플레이트 중 개체군 혼합물 (재조합체 및 부모 바이러스)의 희석에 이어서 IFA 및 PCR 스크린을 통해 수행될 수 있다. 재조합 바이러스를 확인한 후에, 추가 희석은 오직 순수한 재조합 바이러스가 플레이트의 웰에 존재할 때까지 중복 플레이트의 상응하는 웰 중 CEF로부터 수행될 수 있다. 간략하게, IFA 양성인 상응하는 96-웰 플레이트의 웰은 TrypLE express로 트립신처리하여 수집될 수 있고 1 mL로 10% FBS-DMEM을 사용해 조정될 수 있다. 1 mL 스톡으로부터, 웰 중 플라크의 수에 따라서, 5-20 μl의 스톡을 제거할 수 있고, 20 mL 2% FBS-DMEM 중 3-5x106 CEF와 혼합하고, 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖고자 새로운 96-웰 플레이트에 분취할 수 있다. 96-웰 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4일 인큐베이션 후 복제될 수 있고, 각 웰은 IFA 및 PCR에 의해 재조합 바이러스의 존재에 대해 시험될 수 있다. PCR 증폭 패턴을 비교하여, 더 많은 재조합 바이러스를 갖는 것으로 보이는 웰을 수확할 수 있고, 순수한 재조합체 개체군을 가질때까지 상기 기술된 바와 같이 정제 단계를 반복할 수 있다.
재조합 바이러스의 PCR 분석을 완료하기 위해서, 바이러스 DNA는 바이러스 벡터, 예를 들어, vHVT509로부터 추출될 수 있다. PCR 프라이머는 AIV HA COBRA-C, mCMV 프로모터, SV40 폴리A 꼬리부, 및/또는 HVT 바이러스 (MDV-3)의 측접된 재조합 팔부의 존재를 확인하기 하기 위해 디자인될 수 있다. PCR 증폭은 프라이머 쌍 예컨대 MB080 (CGAACAAACTTCATCGCTATGC (SEQ ID NO: 1)) 및 MB081 (TAACTCAAATGCGAAGCGTTGC (SEQ ID NO: 2)), mCMV-F (AACTCCGCCCGTTTTATG (SEQ ID NO: 3)) 및 SV40 tail-R (TCGACTCTAGAGGATCCG (SEQ ID NO: 4)), 및 SV40 pro-F (AGCTTGGCTGTGGAATGT (SEQ ID NO: 5)) 및 syntail-R (ATGTTCTGGCACCTGCAC (SEQ ID NO: 6)) (여기서, 서열은 전방향 가닥 (5'에서 3')에 따라 열거됨)과 함께 DNA 주형을 사용해 수행될 수 있다. PCR은 당분야에 공지된 표준 조건 및/또는 본 명세서에 기술된 실시예에 약술된 조건을 사용해 실행될 수 있다.
vHVT522 및 vHVT523을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 삽입부를 도입한 다른 바이러스 벡터는 상이한 외생성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 바이러스 vHVT522는 하기 외생성 서열을 포함할 수 있다: MB080 (CGAACAAACTTCATCGCTATGC (SEQ ID NO: 7)) 및 MB081 (TAACTCAAATGCGAAGCGTTGC (SEQ ID NO: 8)), COBc-FF (TGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGC (SEQ ID NO: 9)), Vp2-FF-ak (GTCACACTAGTAGCCTACGAAAGAGTGGC (SEQ ID NO: 10)), 및 폴리A 꼬리부-RR (CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCA (SEQ ID NO: 11)), 여기서 서열은 전방향 가닥 (5'에서 3')에 따라 열거된다.
재조합 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 바이러스 vHVT523의 다른 구현예는 하기 외생성 서열을 포함할 수 있다: MB080 (CGAACAAACTTCATCGCTATGC (SEQ ID NO: 7)) 및 MB081 (TAACTCAAATGCGAAGCGT (SEQ ID NO: 12)), COBc-FF (TGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGC (SEQ ID NO: 9)), NDV-F1 (ATGGGCTCCAAACCTTCTAC (SEQ ID NO: 13)), 및 폴리A 꼬리부-RR (CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCA (SEQ ID NO: 11)), 여기서 서열은 전방향 가닥 (5'에서 3')에 따라 열거된다.
발현은 본 명세서에 기술된 분석을 사용해 결정될 수 있다. 간접 면역형광 어세이 (IFA)는 생성된 바이러스 벡터, 예를 들어, vHVT509에 대해 수행될 수 있다. 바이러스 벡터, 예를 들어, vHVT509가 접종된 CEF는 실온에서 5분 동안 빙냉 95% 아세톤으로 고정시킬 수 있고 10분 동안 공기-건조시킬 수 있다. PBS로 플레이트를 재수화시킨 후에, 2종의 1차 항체 1) 1:500 희석의 닭 항-AIV H5N2 혈청 및 2) 1:3000 희석의 MDV-3에 대한 L78 단일클론 항체를 첨가할 수 있고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. PBS로 3회 세척 후, 2종의 2차 항체, 1) 1:500 희석의 토끼 항-닭 IgG-FITC 및 2) 1:300 희석의 당나귀 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 568을 첨가할 수 있다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있고 이어서 PBS로 3회 세척될 수 있다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-필터를 사용한 형광 현미경 및 역상 현미경의 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)-필터로 IFA 양성 플라크를 확인하기 위해 관찰될 수 있다.
바이러스 벡터, 예컨대 vHVT509의 게놈 DNA의 분석은 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 삽입된 유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 결정을 통해서 수행될 수 있다. 프라이머 세트, MB080 및 MB081은 재조합 팔부의 일부를 포함한 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭시키는데 사용되었다. PCR 증폭은 하기와 같이 수행될 수 있다: 2분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 3분 동안 68℃의 30 사이클, 및 68℃에서 5분의 최종 연장. 3.6 kb PCR 생성물을 정제할 수 있다. 반응 당 25 μl의 총 8회 PCR 반응물을 풀링할 수 있고 키트를 사용해 정제할 수 있다. 최종 용리는 아가로스 겔 전기영동으로 확인할 수 있다. 상세한 시퀀싱 프라이머는 표 4에 열거된다.
유전적 안정성 분석은 연속 계대를 사용해 수행될 수 있다. 프리MSV 스톡은 블라인드 계대를 통해 2차 CEF로 전달될 수 있다. 간략하게, 100 μl의 이전 계대를 T25 플라스크 중 CEF 단층에 접종할 수 있다. 세포는 양호한 크기의 플라크가 만들어질 때까지 (전형적으로, 3-4일) 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션될 수 있다. 바이러스 감염된 CEF는 TrypLE express (Gibco # 12604)로 트립신처리하여 수집될 수 있고 LN2 저장을 위해서 총 1 mL 까지 10% FBS-DMEM 및 10% DMSO로 조정될 수 있다. 대략 50-100 μl의 스톡을 T25 플라스크 중 신선한 CEF 배양물에 전달할 수 있다. 프리MSV (X-1)로부터 총 13 계대 (X+12)를 수행할 수 있다. X+12 스톡의 시험관내 특징규명은 PCR 스크리닝, 이식유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 분석, 및 앞서 기술된 바와 같이 이중 IFA에 의한 AIV HA COBRA-C의 발현에 대해 수행될 수 있다.
다수 라운드의 플라크 정제 이후에, 순수한 재조합 바이러스 (예를 들어, vHVT509)를 단리할 수 있다. vHVT509는 IFA 및 PCR을 통해 시험하여 적절한 이식유전자 삽입을 검증할 수 있을 뿐만 아니라 잔존 부모 바이러스가 없다는 것을 확인할 수 있다. 다음으로, 재조합 바이러스 (예를 들어, vHVT509)는 96-웰 플레이트의 한 웰로부터 T-25 플라스크, T-150 플라스크, 및 최종적으로 롤러 병 (850 cm 표면적)에 전달하여 프리-MSV 스톡을 생성시킬 수 있다.
PCR 분석, 특히, 다양한 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 사용하여 바이러스 벡터, 예를 들어, vHVT509가 프리MSV 스톡 및 X+12 계대 수준에서 예상 증폭 패턴 및 앰플리콘을 가질 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
이러한 방식으로 분석은 예를 들어, 형성된 재조합체 MDV-3 바이러스 벡터 (예를 들어, 칠면조의 헤르페스바이러스 (rHVT))가 원하는 조류 질환 항원, 예를 들어, 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자를 포함하고 생체내에서 발현할 수 있다는 것을 보장하도록 보조할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터, vHVT509는 vHVT509의 뉴클레오티드 서열을 도시한 도 13에 도시된다.
일부 예에서, AIV 항원, 예컨대 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 사용해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자 (즉, COBRA-C (H5 HA 단백질))는 적어도 하나의 조류 바이러스 항원과 조합될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 12, 도 18, 도 28, 도 40, 및/또는 도 49에 도시된 바와 같은 AIV H5 HA COBRA-C 유전자를 코딩하는 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 갖는 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, COBRA-C H5 HA 단백질 유전자 또는 이의 일부는 합성 전염성 활액낭병 바이러스 단백질, 예컨대 IBDV 캡시드 단백질 VP2, 뉴캐슬병 바이러스 단백질, 예컨대 뉴캐슬병 F 단백질 (NDV-F) 유전자, 또는 관심의 임의의 조류 질환 항원 단백질과 조합될 수 있다.
예를 들어, 일부 예에서, 전염성 활액낭병 바이러스의 VP2 유전자 및 폴리-A 서열의 cDNA를 삽입할 수 있다. 예를 들어, cDNA는 닭의 활액낭에서 단리된 비리온 유래 게놈 RNA로부터 만들어질 수 있다. 삽입 유전자좌를 정의할 수 있고, 삽입은 바이러스에 상동성인 플라스미드 서열을 표적으로 할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 예를 들어, 부모 바이러스가 HVT FC-126일 때, 표적이 되는 플라스미드는 바이러스의 HVT FC-126 서열과 상동성인 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IBDV 항원로부터의 서열, 또는 부분 서열이 바이러스 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV-3의 IG1 영역으로부터 유래되는 서열이 측접된 IBDV 단백질 서열은 MDV-3 (예를 들어, Vaxxitek 바이러스)으로 상동성 재조합을 허용할 수 있다.
구현예의 일 측면에서, IBDV　항원　또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은 기준 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 보존성 변이체, 대립유전자 변이체, 상동체 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8개 또는 적어도 10개 연속 아미노산을 포함하는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합에 대해서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV의 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 도 17 또는 도 29에 도시된 바와 같은 IBDV 캡시드 단백질 (VP2) 단백질을 코딩하는 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 MDV, AIV 항원, 및/또는 NDV 항원의 적어도 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. NDV-F 항원을 코딩하는 발현하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 사용하여 도너 플라스미드를 형성시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F)을 코딩하는 서열이 VP2 단백질을 코딩하는 서열 대신에 사용될 수 있다. 특히, 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F)은 IG1 영역으로부터 유래되는 서열이 측접된다. 이것은 재조합 바이러스 벡터를 위한 바이러스로 상동성 재조합을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, IG1 영역으로부터 유래되는 서열이 측접된 NDV-F 단백질 서열의 사용은 MDV-3 (예를 들어, Vaxxitek 바이러스)으로 상동성 재조합을 허용할 수 있다.
구현예의 일 양태에서, NDV-F　항원을 코딩하고 발현하는 뉴클레오티드 서열은 도 39 또는 도 50에 기재된 서열, 또는 보존성 변이체, 대립유전자 변이체, 상동체 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8개 또는 적어도 10개 연속 아미노산을 포함하는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 NDV F (NDV-F) 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질에 대한 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있다.
프로모터는 부모 바이러스에 존재할 수 있거나 또는 프로모터는 플라스미드를 사용해 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 오직 부모 바이러스 유래 프로모터, 예컨대 mCMV 프로모터만을 포함할 수 있다.
기능성 삽입부는 SV40 폴리A 꼬리부를 포함할 수 있다. SV40 폴리A 꼬리부는 바이러스 벡터의 특별한 부위에 삽입될 수 있다. 예를 들어, SV40 폴리A 꼬리부는 MDV-3 FC-126 균주의 재조합 영역 유전자간 부위 1에서 삽입될 수 있다. 이러한 구성체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터 vHVT522 및 vHVT523에서 사용된다.
특히, 재조합 바이러스 구성체는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 사용해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 vHVT522는 조류 인플루엔자 바이러스 A의 합성 헤마글루티닌 단백질 유전자, 특히 COBRA를 사용해 디자인된 COBRA-C (H5 HA 단백질)를 비롯하여, 합성 전염성 활액낭병 바이러스 구조 캡시드 단백질 VP2를 포함할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터, vHVT522는 vHVT522의 뉴클레오티드 서열을 도시한, 도 26에 도시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 적어도 일부분은 도 27에 도시된 vHVT522의 시퀀싱된 영역의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, vHVT522에서 사용되는 AIV HA COBRA-C 유전자에 대한 아미노산 서열은 도 28에 도시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 바이러스 벡터 vHVT522의 IBDV VP2 유전자에 대한 아미노산 서열은 도 29에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
구현예는 SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질 (IBDV VP2)을 포함할 수 있는, 바이러스 벡터, 예컨대 MDV-3 균주의 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 삽입 플라스미드는 SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질 (IBDV VP2)을 MDV-3 바이러스 (예를 들어, Vaxxitek 백신에서 사용되는 바와 같은 MDV-3 FC126)의 우측 IG1 팔부에 삽입시키는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 사용되는 플라스미드는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본 발명은 MDV-3 (예를 들어, Vaxxitek 바이러스)의 우측 유전자간 1 팔부, SV40 폴리A 꼬리부,　 COBRA-C (H5 HA 단백질), IRES, 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 합성 주문 플라스미드를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터의 일부 구현예는 이전에 변형시킨 부모 바이러스로부터의 외부 프로모터만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외부 프로모터, 예컨대 mCMV는 이전에 변형시킨 부모 바이러스, 예컨대 vHVT013에 존재할 수 있다.
또한, 일부 플라스미드 구현예는 테트라사이클린, 카나마이신, 암피실린 등, 및/또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항생제에 대한 항생제 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 특히, 암피실린에 대한 항생제 내성을 부여하는 유전자가 바이러스 벡터에 도입될 수 있다.
외생성 DNA가 플라스미드에 도입될 수 있고, 이어서 외생성 DNA를 바이러스 벡터에 도입시키는데 사용되어서 재조합 바이러스를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 도너 플라스미드, 예를 들어, pVP2-IRES-COBRA-C는 합성 COBRA-C 단편 (Genscript Lot U5872BA260-3)을 pVP2-IRES-Cobra-A에 클로닝하여 생성될 수 있다. pVP2-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 VP2+COBC로 치환시켜서 더욱 변형되어 pVP2-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 출발부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거할 수 있다.
vHVT522를 구축하는데 사용된 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C에 대한 뉴클레오티드 서열은 도 16에 도시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, vHVT522를 구축하는데 사용된 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 중 H5 HA COBRA-C 단백질을 코딩하는 아미노산 서열은 도 18에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
재조합 바이러스를 생성시키는데 사용을 위한 도너 플라스미드는 pCD046-COBRA-C, pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C, pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 구성을 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 16에서 확인할 수 있듯이, vHVT522 바이러스 벡터의 형성에서 사용되는, 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C의 도시된 뉴클레오티드 서열은 유전자간 1 팔부 (녹색), SV40 폴리A (오렌지색), H5 HA COBRA-C (진한 붉은색), IRES (파란색), VP2 (붉은색), 및 벡터 (검은색)를 갖는 플라스미드 구성을 보인다.
면역원성 조성물에 대한 백신 벡터의 다른 예는 본 명세서에 기술된 바와 같은 vHVT523이다. vHVT523은 외생성 DNA의 다수 부분을 포함할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터, vHVT523의 구현예는 vHVT523의 부분 뉴클레오티드 서열을 도시한 도 48에 부분적으로 도시된다.
vHVT523 바이러스 벡터의 형성에서 사용되는, 플라스미드 pFwt-IRES-COBRA-C의 도시된 뉴클레오티드 서열은 IG1 팔부 (연녹색), mCMV (파란색), NDV-F (오렌지색), IRES (보라색), H5 HA (진한 붉은색), SV40 폴리A (S연파란색), 및 IG1 팔부 (녹색)를 갖는 플라스미드 구성을 보인다. 또한, 도 38은 vHVT523 바이러스 벡터에 대한 플라스미드 중 관심의 특별한 뉴클레오티드의 위치를 표시한다.
외생성 DNA의 이들 부분은 생체내에서 원하는 유전자를 코딩하고 발현하고/하거나 바람직한 성질에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, vHVT523은 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 사용해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질, 합성 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 융합 단백질 (F) 중 하나 이상을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 적어도 일부분은 도 48에 도시된 vHVT523의 시퀀싱된 영역의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터 vHVT523에서 사용하는 바와 같은 NDV-F 유전자에 대한 아미노산 서열은 도 39 또는 도 50에 도시된 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 vHVT523에서 사용되는 바와 같은 NDV-F 유전자에 대한 아미노산 서열은 도 39 또는 도 50에 도시된 NDV-F 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 가질 수 있다.
특히, 재조합 바이러스 벡터는 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 외생성 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 도 30 또는 도 50에 도시된 바와 같은 NDV-F 단백질에 대한 서열과 약 80% 내지 약 100% 범위의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
유전자는 플라스미드를 사용해 벡터에 삽입될 수 있다. 바이러스 벡터의 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드는 상동성 재조합을 촉진하도록 관심 바이러스의 IG1 영역으로부터 유래되는 서열이 측접된 SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 및 마우스 CMV 프로모터를 포함할 수 있다. 특히, MDV-3 바이러스 벡터의 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드는 예를 들어, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 및 상동성 재조합을 촉진하도록 MDV-3의 IG1 영역으로부터 유래하는 서열이 측접된 마우스 CMV 프로모터를 포함할 수 있다.
면역원성 조성물에서 사용을 위한 바이러스 벡터를 생성시키는데 사용을 위한 플라스미드는 사전결정된 바이러스의 삽입 부위에서 DNA 부분과 상동성인 하나 이상의 부분을 비롯하여, 관심 유전자 및/또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물에서 사용을 위한 바이러스 벡터를 생성하는데 사용되는 플라스미드는 MDV-3 바이러스의 우측 및 좌측 유전자간 1 팔부에 상응하는 상동성 부분, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C H5 HA 단백질, IRES, 및 NDV 융합 단백질 (F)을 포함할 수 있다.
vHVT523을 구축하는데 사용되는 플라스미드 pFwt-IRES[MOD]-Cobra에 대한 뉴클레오티드 서열은 도 38에 도시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일 구현예에서, vHVT523을 구축하는데 사용되는 플라스미드 pFwt-IRES[MOD]-Cobra 중 H5 HA COBRA-C에 대한 아미노산 서열은 도 40에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
바이러스 벡터 vHVT523을 구축하는데 사용되는 플라스미드 pFwt-IRES[MOD]-Cobra 중 NDV-F에 대한 아미노산 서열은 도 39 또는 도 50에 도시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
또한, 기능성 성질을 코딩하는 외생성 서열, 예컨대 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자 또는 프로모터가 플라스미드에 도입될 수 있다. 프로모터 예컨대 mCMV 프로모터는 바이러스 벡터 예컨대 MDV-3 벡터에 삽입을 위해 플라스미드에 도입될 수 있다. 또한, 암피실린 내성 유전자가 바이러스 벡터의 형성에서 사용을 위한 플라스미드에 도입될 수 있다.
예를 들어, 바이러스 벡터 구성에 사용을 위한 플라스미드 (즉, pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C)는 pFwt-IRES-COBRA-C로부터 변형될 수 있다. 플라스미드 pFwt-IRES-COBRA-C는 이전에 생성된 플라스미드 (pFwt-IRES-SaH9opt) 중 사우디-아라비아 H9 유전자를 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출된 COBRA-C 유전자로 치환시켜 구축될 수 있다. COBRA-C 유전자는 SalI 및 HindIII를 사용한 제한 효소를 사용하여 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출될 수 있고, 동일 효소로 분해될 수 있는 pFwt-IRES-SaH9opt에 클로닝될 수 있다. pFwt-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 F+COBC으로 치환시켜 더욱 변형되어서 pFwt-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 출발부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거할 수 있다. 도너 플라스미드, pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C는 재조합 바이러스를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 면역원성 조성물은 vHVT509, vHVT522, 및/또는 vHVT523을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하기 재조합 바이러스 구성체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법은 MDV (즉, 칠면조의 헤르페스바이러스 (HVT)), 예컨대 MDV-3, 및 SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 분자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자를 포함하는 MDV-3의 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 삽입 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입 플라스미드는 바이러스 벡터를 형성하도록 부모 바이러스로 플라스미드의 삽입을 촉진하기 위해 IG1로부터의 측접 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 도입될 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 면역원성 조성물에서 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 수의학적으로 허용가능한 담체를 비롯하여, 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터, 예컨대 MDV-3의 재조합 바이러스는 조성물이 조류에게 투여될 때, 조류에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 하나 이상의 조류 질환, 예컨대 마렉병 바이러스, 전염성 활액낭병 바이러스 및/또는 조류 인플루엔자에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다.
마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자, 전염성 활액낭병 바이러스 및/또는 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 재조합 바이러스 벡터의 유효량 또는 표적 바이러스(들)의 항원을 포함하는 조성물의 유효량을 조류에게 투여하는 단계에 의한다.
활성 성분 (예를 들어, 바이러스 벡터)의 유효량은 플라크 형성 단위로 측정될 수 있다. 특히, 바이러스 벡터는 0.2 mL 용량 당 약 1000 플라크 형성 단위 (PFU) 초과의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 0.2 mL 용량은 약 2500 PFU 초과의 용량으로 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서 백신의 용량 (예를 들어, 0.2 mL)은 피하 경로를 통해 투여되는 재조합 바이러스의 적어도 3.0 log10 PFU를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 난내 경로를 통해 투여되는 용량은 용량 당 약 3.6 log10 PFU 초과를 포함할 수 있다.
투여 경로에 따라서, 용량은 동물에게 전달될 수 있고, 동일할 수 있지만, 상이한 부피의 담체 중에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 조류에게 전달되는 용량은 난내 또는 피하 투여 둘 모두와 동일할 수 있지만, 부피는 각각 50 μl 및 200 μl일 수 있다.
백신에 포함되는 하나 이상의 항원 및/또는 단백질을 발현하는 특정 바이러스 벡터의 최소 유효/보호 용량 (MPD)은 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, MPD는 면역학적 조성물 중 바람직한 역가를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물 중 역가는 MPD 값의 배수일 수 있다. 특히, 면역학적 조성물, 예컨대 백신 중 바람직한 역가는 MDP의 약 3배일 수 있다.
일부 경우에, 면역학적 조성물, 예컨대 백신은 약 1000 PFU/용량 내지 약 8000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 구현예는 약 2000 PFU/용량 내지 약 6000 PFU/용량 범위의 역가를 갖는 백신을 포함할 수 있다.
조류용 백신의 구현예는 약 2200 PFU/용량 내지 약 4000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 일부 조류 백신은 약 2250 PFU/용량 초과의 역가를 포함할 수 있다. 특히, 백신은 약 2250 PFU/용량 내지 약 3000 PFU/용량 범위의 역가를 가질 수 있다. 예를 들어, 백신은 약 2500 PFU/용량의 역가를 가질 수 있다.
일부 예에서, 바이러스 벡터의 유효량은 동물의 유형 또는 기능에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 가금류 산업은 장기간 지속되는 새, 예컨대 종계 및 산란계의 경우에 높은 PFU 역가를 이용하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, MDV (즉, HVT)의 경우 약 5000 PFU/용량 초과의 역가를 갖는 용량이 상대적으로 긴 수명을 갖는 조류, 예컨대 종계 및 산란계에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 최종 백신 조성물은 면역학적 조성물의 앰풀을 희석제와 혼합하여 형성될 수 있다. 이러한 면역학적 조성물은 면역원성 조성물의 약 103 내지 약 107 PFU/mL 범위로 전체 항원 및/또는 바이러스 역가를 가질 수 있다. 앰풀로 사용을 위한 면역학적 조성물의 구현예는 면역원성 조성물의 약 105 내지 107 PFU/mL 범위로 전체 항원 및/또는 바이러스 역가를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물 중 바이러스 벡터의 분획은 관심 질환에 대항하여 반응을 유도하는 성분에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물의 분획은 각 분획이 약 1000 PFU 초과이도록 마렉병, 전염성 활액낭병, 뉴캐슬병, 조류 인플루엔자, 및/또는 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV)에 대한 항원 및/또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 면역원성 조성물의 분획은 각 분획이 약 2000 PFU 초과의 개별 면역원성 작용제를 포함하도록 MD, IBD, ND, AI, 및/또는 ILTV에 대한 항원 및/또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물 예컨대 백신은 총 약 6000 PFU/용량 초과의 역가를 가질 수 있다.
면역학적 조성물 및/또는 백신은 동물 (예를 들어, 유형, 연령, 상태), 용량, 및/또는 원하는 결과에 따라서 다양한 방법을 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 (S.C.) 주사가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 1회 주사가 충분할 수 있다. 대안적으로, 원하는 면역 반응을 보장하도록 2회 이상의 주사를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 일부 예에서 투여 경로는 계란내일 수 있다. 예를 들어, 배아 백신접종의 형태인, 계란내 백신접종은 배아 발생 (ED)의 사전결정된 날에 수행될 수 있다. 계란내 백신접종은 약 15일 내지 21일의 배아 발생의 다양한 시기에 발생될 수 있다. 특히 계란내 투여는 배아 발생의 18일 내지 19일에 발생될 수 있다. 예를 들어, 계란내 백신접종은 배아 발생 (ED)의 대략 18일, 부화 전 약 3일에 발생될 수 있다.
면역학적 조성물은 조류에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 백신은 조류 예컨대 닭, 거세닭, 오리, 거위, 칠면조, 꿩, 뇌조, 메추라기, 백조, 새끼 비둘기, 및/또는 비둘기에게 투여될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기술된 백신으로 처치되는 조류는 닭이다.
투약 용법은 조류 사육의 경제성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물, 예컨대 백신은 조류 새끼, 조류 성체, 또는 둘 모두를 보호하기 위한 노력으로 상이한 생활 단계에서 조류에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 투약 용법은 소정의 사전결정된 개체군 및/또는 개별 동물에서 원하는 효과를 유도하기 위해, 예컨대 소정 개체군, 예를 들어 백신접종된 조류에서 질환 발생률의 감소, 예를 들어, 표적 질환의 중증도 감소 및/또는 증상의 억제, 및/또는 개체군, 동물, 및/또는 그들 자손에서 면역 반응의 유도에 충분한 바이러스 벡터의 유효량을 전달하도록 개발될 수 있다.
투약 용법에 대한 결정은 원하는 결과, 면역원성 조성물에서 사용을 위해 선택된 성분, 투여 경로, 예컨대 비경구, 피하, 및/또는 계란내 투여, 전달 횟수 또는 용량, 예를 들어, 단일 투여 또는 다수 용량 (예를 들어, 1회 이상의 부스터), 및/또는 처치하려는 동물 또는 동물 개체군의 특정한 성질, 예를 들어, 동물의 연령, 크기, 건강 상태 및/또는 병태와 관련될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 치료 방법은 원하는 결과를 기반으로 상이할 수 있다. 예를 들어, 계란내 투여를 비롯하여 닭에게 피하 투여는 무리에서 집단 면역을 제공하거나 또는 확립하는데 도움을 주기 위해서, 표적 조류 바이러스와 관련된 병태 및/또는 임상 증상을 억제 및/또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다.
투약 용법은 조류, 예컨대 닭을 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물의 적어도 1회 용량으로 백신접종하는 단계를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물의 용량은 약 0.01 mL 내지 약 0.5 mL 범위일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물의 용량은 약 0.2 mL의 용량으로서 피하에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 계란내 투여를 사용할 때 용량은 약 0.05 mL 범위일 수 있다.
투약 용법은 또한 노출 경로에 따른 투여 경로 및/또는 횟수에 대한 지침을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 연령, 특히 약 부화 1주 이내에 피하 노출 경로를 통해 조류에게 면역원성 조성물의 용량을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 예에서, 조류는 약 1일령에 피하로 면역원성 조성물이 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 면역원성 조성물은 계란에 전달되어, 계란내 투여 경로를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물 및 원하는 결과에 따라서 특정 연령의 계란, 특히 배아 발생의 약 18일 내지 약 19일에 계란내 노출 경로를 통해서 조류에게 면역원성 조성물의 용량을 전달하는 것이 바람직할 수 있다.
면역원성 조성물의 다수 용량이 투약 용법으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신의 2회 이상의 용량이 조류에게 제공될 수 있다.
면역원성 조성물은 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 HA 항원, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자를 갖고 생체내에서 발현할 수 있는 MDV-3 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 조류 인플루엔자는 아형 H5이다.
재조합 바이러스 벡터는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 분자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자 및 마우스 CMV 프로모터를 포함하는 MDV 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드 및 MDV 로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 통해서 구축될 수 있다.
예를 들어, MDV-3 재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법은, IG1 영역 유래 서열이 측접된, SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 분자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자 및 마우스 CMV 프로모터를 포함하는 MDV 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드 및 MDV-3 로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. MDV-3 재조합 바이러스 벡터의 제조 후, 회수 및/또는 정제될 수 있다.
면역원성 조성물은 수의학적으로 허용가능한 담체 예컨대 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정화제, 희석제 예컨대 수크로스, 카세인 가수분해물, 인산이칼륨, 인산이수소칼륨, 페놀 레드 나트륨 염, 수산화나트륨, 및/또는 물, 부형제 예컨대 디메틸 술폭시드, 배지, 혈청 예컨대 태아 소 혈청 또는 송아지 혈청, 탄산수소나트륨, 페놀 레드, 염산, 및/또는 정제수, 보존제, 항박테리아제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 조류에게 투여될 때, 원하는 반응, 예컨대 표적 질환(들)의 임상 시스템의 감소 및/또는 억제, 마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 및/또는 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하는데 충분할 수 있다.
마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 또는 조성물의 유효량을 조류에게 투여하는 단계를 포함한다.
MDV-3 (즉, HVT) 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 플라스미드는 SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 분자, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자를 포함한다.
MDV-3 (즉, HVT) 유전자간 I (IG1) 부위에 삽입을 위한 플라스미드는, IG1 영역 유래 서열이 측접된, SV40 폴리A 꼬리부, 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자 및 마우스 CMV 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 아형 H5의 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 서열을 포함할 수 있다. 또한, 플라스미드는 코돈 최적화된 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 서열을 포함할 수 있다.
동물을 백신접종하거나 또는 동물에서 면역원성 또는 보호성 반응을 유도하는 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물 또는 바이러스 벡터의 적어도 1회 투여를 포함한다.
생 MDV (즉, vHVT) 백신 벡터를 위한 구성체는 H5 바이러스 유전자 삽입부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 구현예는 H5의 다수 유전자 삽입부를 포함할 수 있다. COBRA 구성체는 조류 인플루엔자 및 마렉병, 혈청형 3 둘 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 COBRA 구성체를 포함하는 백신은 새 당 0.2 mL 중 마렉병 백신의 2,500 플라크-형성 단위 (PFU)의 표적 용량으로 피하 경로를 통해서 1일령에 투여될 수 있다.
또한, 백신 벡터의 구현예는 다른 조류 인플루엔자 분기군 예컨대 H9 및/또는 H7로부터 유래된 항원을 포함할 수 있다.
백신접종된 새는 재조합체 MDV-3 H5 벡터 (예를 들어, rHVT-H5) 백신접종 및/또는 챌린지 후 임상 징후없이 임상적으로 건강한 채로 유지될 수 있다. 백신접종된 새는 임의의 챌린지, 예를 들어, 상동성 Tk/MN/15 바이러스 또는 이종성 이집트/14 챌린지 바이러스를 사용한 챌린지 이전에 혈청전환될 수 있다. 예를 들어, 챌린지 후 백신접종된 새는 챌린지 바이러스에 대한 항체를 가져서 그 결과 검출가능한 항체 역가를 생성할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 백신 구성체는 백신접종된 조류가 이후에 바이러스 조류 질환에 노출될 때 조류에서 발산을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 서열, 폴리뉴클레오티드, 및/또는 단백질은 본 명세서에서 예시하고 기술된 정확한 서열과 상이할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 서열이 본 발명의 방법에 따라서 기능하는 한, 도시된 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 고려한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 본질적으로 보존될 것이고, 다시 말해서, 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 다음의 4개 패밀리로 분류된다: (1) 산성 - 아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성 - 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 - 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 - 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 이소류신 또는 발린으로 류신의 단리되거나 또는 비천연 발생되는 치환, 또는 그 반대; 글루타메이트로 아스파테이트의 치환, 또는 그 반대; 세린으로 트레오닌의 치환 또는 그 반대; 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 보존성 치환이 생물학적 활성에 대해 주요한 효과를 갖지 않을 것임은 합리적으로 예측가능하다. 그러므로, 예시되고 기술된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 미미한 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원의 기능적 및/또는 항원적으로 동등한 변이체 및 유도체 및 이의 기능적으로 동등한 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 이들 기능적으로 동등한 변이체, 유도체, 및 단편은 항원성 활성을 보유하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 코딩되는 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열의 변화를 비롯하여, 아미노산 잔기의 보존성 치환, 하나 또는 소수의 아미노산 결실 또는 부가, 및 아미노산 유사체로 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 것들은 코딩되는 폴리펩티드의 성질에 유의하게 영향을 미치지 않는 것들이다. 보존성 아미노산 치환은 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌/메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판이다.
일부 구현예에서, 치환은 유사한 화학적 구조, 유사한 화학적 성질, 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 아미노산을 치환하는, 보존성 변화를 도입시킨다. 도입된 아미노산은 그들이 치환시킨 아미노산에 대해 유사한 극성, 친수성, 또는 소수성을 가질 수 있다. 보존성 아미노산 변화는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이것은 또한 아미노산 측쇄에 대한 수치요법 척도를 참조하여 결정될 수 있다.
본 발명 및 이의 장점을 상세히 기술하였지만, 다양한 변화, 대체, 및 변경이 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에서 만들어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 단지 예시 목적으로 제공되고 임의 방식으로 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예에서 더욱 예시될 것이다.
실시예
실시예 1 vHVT509의 구축
vHVT509는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한다. 이 프로토콜의 목적은 MDV-3 FC-126 (칠면조의 헤르페스 바이러스 (HVT) Fc126)의 재조합 영역 유전자간 부위 1에서 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, SV40 폴리A 꼬리부를 함유하는 재조합체 HVT를 구축하고 특징규명하는 것이었다.
재조합체의 부모 바이러스는 MDV-3 FC-126 클론 2 (즉, HVT Fc126 클론 2)였다. 재조합 유전자좌는 BamHI-I 단편에 위치하는 유전자간 1 유전자좌였다. 도너 플라스미드는 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C, 및 SV40 폴리A 꼬리부를 함유하는 pCD046-COBRA-C였다. 재조합은 2차 닭 배아 섬유아세포 (2° CEF) 세포에서 시험관내에서 발생되었다. 재조합 선택은 닭 항-조류 인플루엔자 혈청을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA) 및 특이적 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을 통해 수행되었다.
재조합 바이러스의 생성: 시험관내 재조합 (IVR)은 도너 플라스미드로서 pCD046-COBRA-C 및 MDV-3 FC-126 (즉, HVT Fc126)로부터 단리된 바이러스 DNA를 사용하여 2차 CEF 세포의 동시-전기천공을 통해 수행되었다. 동시-전기천공은 300 μl Opti-MEM (Gibco cat#31985) 중 1x107 2차 CEF를 사용해 수행되었고 2 mm 전기천공 큐벳에서 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가하였다. 형질감염된 CEF 세포는 2% FBS 함유 DMEM (Gibco cat #11960)과 함께 96-웰 플레이트에 파종하였고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4-5일 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트에서 성장시킨 세포를 이어서 2개 96-웰 플레이트에 복제하였고 2일 또는 3일 더 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 복제된 96-웰 플레이트의 1개 세트는 닭 항-AIV H5N2 혈청 (Charles River Laboratories, Lot#J0210) 및 토끼 항-닭 IgY (IgG) (전체 분자)-FITC 접합 (Sigma cat#F8888, Lot#075M4812V)을 사용한 IFA를 통해서 재조합 바이러스에 대해 스크리닝되었다. 재조합 바이러스의 순수한 개체군을 수득하기 위해서, 상응하는 96-웰 플레이트 중 IFA 양성 웰로부터의 CEF를 회수하였고 정제 단계를 처리하였다.
재조합 바이러스의 정제: 재조합 바이러스 정제는 96-웰 플레이트 중 개체군 혼합물 (재조합체 및 부모 바이러스)의 희석에 이어서 IFA 및 PCR 스크린을 통해서 수행되었다. 재조합 바이러스를 확인한 후에, 추가 희석은 오직 순수한 재조합 바이러스만이 플레이트의 웰에 존재할 때까지 복제된 플레이트의 상응하는 웰 중 CEF로부터 수행되었다. 간략하게, IFA 양성인 상응하는 96-웰 플레이트 중 웰은 TrypLE express (Gibco # 12604)로 트립신처리하여 수집하였고 1 mL 까지 10% FBS-DMEM으로 조정하였다. 1 mL 스톡으로부터, 웰 중 플라크의 개수에 의존하여, 5-20 μl의 스톡을 제거하여 20 mL 2% FBS-DMEM 중 3-5x106 CEF와 혼합하였고 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트에 분취하였다. 96-웰 플레이트는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4일 인큐베이션 이후에 복제되었고 각 웰은 IFA 및 PCR을 통해서 재조합 바이러스의 존재에 대해 시험되었다. PCR 증폭 패턴을 비교하여 더 많은 재조합 바이러스를 갖는 것으로 보이는 웰을 수확하였고, 순수한 재조합체 개체군을 가질 때까지 상기 기술된 바와 같이 정제 단계를 반복하였다.
재조합 바이러스의 PCR 분석: 바이러스 DNA는 QIA DNeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen cat#69506)를 통해서 vHVT509로부터 추출되었다. PCR 프라이머는 AIV HA COBRA-C, mCMV 프로모터, SV40 폴리A 꼬리부, HVT 바이러스의 측접된 재조합 팔부의 존재를 확인하도록 디자인되었다. PCR 증폭은 하기 표에 표시된 프라이머 쌍 및 PCR 조건과 함께 ∼200 ng의 DNA 주형을 사용해 수행되었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
발현 분석: 간접 면역형광 어세이 (IFA)를 vHVT509에 대해 수행하였다. vHVT509가 접종된 CEF는 실온에서 5분 동안 빙냉 95% 아세톤으로 고정되었고 10분 동안 공기-건조되었다. PBS로 플레이트를 재수화한 후에, 2종 1차 항체 1) 1:500 희석의 닭 항-AIV H5N2 혈청 (Charles Rivers Laboratories, Lot#J0210) 및 2) 1:3000 희석의 HVT에 대한 L78 단일클론 항체 (Merial Select, Gainesville, GA)를 첨가하였고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척 후, 2종의 2차 항체, 1) 1:500 희석의 토끼 항-닭 IgG-FITC (Sigma cat#F8888, lot#075M4812V) 및 2) 1:300 희석의 당나귀 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe #A10037, lot#1752099)을 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었고 이어서 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-필터를 사용한 형광 현미경 및 Nikon Eclipse Ti 역상 현미경의 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)-필터로 IFA 양성 플라크를 확인하기 위해 관찰하였다.
게놈 DNA 분석: vHVT509의 게놈 DNA는 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 삽입된 유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 결정을 통해 수행되었다. 프라이머 세트, MB080 및 MB081은 재조합 팔부의 일부를 포함한 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭시키는데 사용되었다. PCR 증폭은 하기처럼 수행되었다: 2분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 3분 동안 68℃의 30 사이클, 및 5분 동안 68℃에서 최종 연장. 3.6 kb PCR 생성물은 제조사 설명서에 따라서 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen #28706)를 사용해 정제되었다. 반응 당 25 μl의 총 8회 PCR 반응물을 풀링하였고 키트를 사용해 정제하였다. 최종 용리는 아가로스 겔 전기영동을 통해서 수행되었다.
유전적 안정성 분석을 위한 연속 계대: 프리-MSV 스톡 (p.3)은 블라인드 계대를 통해서 2차 CEF로 전달되었다. 간략하게, 100 μl의 이전 계대를 T25 플라스크 중 CEF 단층에 접종하였다. 세포는 양호한 크기의 바이러스 플라크를 만들때까지 (전형적으로 3-4일) 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션되었다. 바이러스 감염된 CEF는 TrypLE express (Gibco # 12604)로 트립신처리하여 수집되었고 총 1 mL 까지 LN2 저장을 위해 10% FBS-DMEM 및 10% DMSO로 조정하였다. 대략 50-100 μl의 스톡을 T25 플라스크 중 신선한 CEF 배양물로 전달하였다. 프리-MSV (X-1)로부터 총 13 계대 (X+12)기 수행되었다. X+12 스톡의 시험관내 특징규명은 PCR 스크리닝, 이식유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 분석, 및 앞서 기술된 바와 같은 이중 IFA에 의한 AIV HA COBRA-C의 발현을 위해 수행되었다.
결과
재조합 바이러스: 2 라운드의 플라크 정제 이후에, 순수한 재조합 바이러스 (vHVT509)를 단리하였다. vHVT509는 IFA 및 PCR을 통해 시험하여 적절한 이식유전자 삽입을 비롯하여 잔존 부모 바이러스가 없음을 검증하였다. vHVT509는 96-웰 플레이트의 한개 웰로부터 T-25 플라스크, T-150 플라스크, 및 최종적으로 롤러 병 (850 cm 표면적)에 전달하여 프리-MSV 스톡을 생성시켰다.
PCR 분석: 표 1에 열거된 다양한 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 프리-MSV 스톡 (도 4) 및 X+12 계대 수준 (도 5)에서 vHVT509가 예상 증폭 패턴 및 앰플리콘을 갖는다는 것을 입증하였다.
Figure pct00003
발현 분석: IFA 결과는 vHVT509가 바이러스-감염된 CEF에서 AIV HA COBRA-C 유전자를 발현한다는 것을 의미한다 (도 6). 300개 이상의 vHVT509 플라크가 현미경의 FITC-필터 및 TRITC-필터를 사용해 계측되었다. HA COBRA-C 유전자의 전체 발현은 프리-MSV 스톡 및 X+12 계대 수준에서의 HVT 플라크와 일치한다. 계측된 바이러스 플라크의 FITC 및 TRITC-필터된 이미지는 도 7을 참조한다.
Figure pct00004
게놈 분석: vHVT509 게놈 DNA의 분석은 PCR 증폭 및 이어서 뉴클레오티드 서열 결정을 통해 수행되었다. vHVT509 게놈의 일부를 증폭하고 서열 결정하기 위한 프라이머는 하기 표에 기술되었다. 프라이머 세트, MB080 및 MB081은 전체 mCMV 프로모터, HA COBRA-C 유전자, 측접 영역의 일부 (유전자간 1 팔부)를 포함한 SV40 폴리A 꼬리부 서열을 증폭하는데 사용되었다. 총 3648 bp PCR 앰플리콘을 정제하였고 (도 8), 뉴클레오티드 서열은 하기 표에 기술된 시퀀싱 프라이머를 사용해 결정되었다.
Figure pct00005
시퀀싱 반응은 Eurofins MWG Operon (www.operon.com)을 통해 수행되었고, contig (도 9 및 도 10)는 벡터 NTI Advance 11.5 패키지의 Contig 발현 모듈을 사용해 생성되었다.
vHV509 프리-MSV 및 X+12 계대 스톡 contig의 뉴클레오티드 서열 및 시퀀싱 프라이머 위치는 도 11에 도시된다. 시퀀싱 프라이머는 프라이머의 방향으로 밑줄표시된다. 검은색 = 재조합 팔부 영역, 파란색 = mCMV 프로모터, 붉은색 = AIV HA COBRA-C, 회색 = 합성 폴리A, 밑줄 = 시퀀싱 프라이머. 재조합 팔부는 검은색이고 AIV HA COBRA-C 유전자는 붉은색이다.
도 12는 vHVT509의 AIV HA COBRA-C 유전자의 아미노산 서열을 도시한다.
도 13은 vHVT509의 뉴클레오티드 서열의 텍스트 형태로 도시된다.
결론: vHVT509의 PCR 스크리닝, 및 뉴클레오티드 분석의 데이터는 mCMV 프로모터, AIV HA COBRA-C 서열, SV40 폴리A 꼬리부 카세트가 MDV-3 FC-126 (즉, HVT Fc126) 게놈의 유전자간 1 팔부 사이에 삽입되었다는 것을 의미한다. vHVT509는 바이러스 감염된 CEF에서 AIV HA COBRA-C 단백질을 발현한다. vHVT509 X+12 샘플의 PCR 스크리닝 및 서열 분석은 vHVT509가 연속 계대 이후에 이식유전자 카세트를 유지하였다는 것을 의미한다. 또한, vHVT509는 계대 (X+12 수준) 이후에 HA COBRA-C 단백질을 안정하게 발현하였다.
실시예 2 vHVT522의 구축
vHVT522는 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 합성 전염성 활액낭병 바이러스 구조 캡시드 단백질 VP2.
프로토콜의 목적은 Vaxxitek 바이러스 우측 IG1 팔부 및 IBDV VP2에 상동성 재조합을 위해 SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질 (IBDV VP2)을 함유하게 되는 유전자간 I (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드를 구축하는 것이었다.
도너 플라스미드는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C로서, 이의 골격은 Vaxxitek 바이러스의 우측 유전자간 1 팔부, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), IRES, 및 전염성 활액낭병 바이러스 캡시드 단백질을 함유하는 합성 주문된 플라스미드로 구성된다. 플라스미드는 부모 바이러스 유래 mCMV 프로모터를 함유한다. 재조합은 2차 닭 배아 섬유아세포 (2° CEF) 세포에서 시험관내에서 발생되었다. 재조합 선택은 닭 항-조류 인플루엔자 혈청을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA) 및 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 수행되었다. 플라스미드 다이아그램은 도 14 및 도 15에 도시된다.
플라스미드 pVP2-IRES-COBRA-C는 합성 COBR-C 단편 (Genscript Lot U5872BA260-3)을 pVP2-IRES-Cobra-A에 클로닝하여 사전에 생성시켰다. pVP2-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 VP2+COBC으로 치환하여 더욱 변형시켜서 pVP2-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 출발부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거하였다. 새로운 올바른 도너 플라스미드는 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C라고 한다. 이러한 플라스미드를 사용하여 재조합 바이러스를 생성시킨다.
재조합체 생성: 시험관내 재조합 (IVR)은 도너 플라스미드로서 선형화된 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 및 vHVT013으로부터 단리된 바이러스 DNA를 사용하여 2° CEF 세포의 동시-전기천공을 통해 수행되었다. 동시-전기천공은 300 μl Opti-MEM 중 1x107 2° CEF를 사용해 수행되었고 2 mm 전기천공 큐벳 중 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가하였다. 형질감염된 세포는 96-웰 플레이트에 파종하였고 4일 동안 인큐베이션하였다. 다음으로 96-웰 플레이트에서 성장된 세포는 2개 96-웰 플레이트로 복제하였다. 96-웰 플레이트 중 1개 세트는 재조합체를 함유하는 양성 웰을 확인하기 위해서 AIV H5 HA에 대한 닭 다클론 혈청을 사용한 IFA에 사용하였고 96-웰 플레이트의 다른 세트는 상응하는 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하는데 사용되었다.
재조합체의 정제: 재조합체 바이러스 정제 방법은 먼저 96-웰 플레이트 복제 및 최소량의 IFA 음성 플라크와 최대량의 IFA 양성 플라크를 함유하는 웰에 대한 IFA 선택을 통해 수행되었다. 그들 기준에 부합하는 웰을 수확하였고 1 mL 까지 DMEM+2% FBS로 조정하였다. 1 mL 스톡으로부터, 10-20 μl를 제거하였고 10 mL DMEM+2% FBS 중 1x107 2° CEF와 혼합하고 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트에 분취하였다. 단일 플라크를 함유한 웰의 상청액을 PCR을 통해서 부모 바이러스의 부재에 대해 시험하였다. 이러한 과정은 시험된 웰이 순수한 재조합체 밴드 패턴을 보이고 부모 바이러스가 보이지 않을 때까지 몇 라운드 동안 반복하였다. 4개의 PCR 순수 웰을 수확하였고 냉동하였다 (P0), vHVT-VP2-IRES[MOD]-COBRA C #2, #5, #6 및 #12. 4개 중에서, 자매 클론 중 2개 (#5 및 #6)를 T-25 플라스크 (P1) 및 궁극적으로 T-150 플라스크 (P2)에서 확장시켰다. P2 확장 단계의 2개 중 하나로서, vHVT-VP2-IRES[MOD]-COBRA-C, #6을 3X 850 ㎠ 롤러 병에서 확장시켰고, 수확하였으며, P3, 프리-MSV 스톡으로서 냉동하였다 (vHVT-522 IBD-AI (P3) #6 11-May-2018 AK). 12회 연속 계대를 프리-MSV 스톡 (X+12)을 넘어 T-25 플라스크에서 수행하였다.
PCR 분석: 바이러스 DNA는 vHVT522 (프리-MSV) 및 vHVT522 X+12로부터 QIA DNAeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen cat#69506)를 사용해 추출하였다. PCR 프라이머는 오직 재조합 바이러스에만 존재하지만 부모 vHVT013 바이러스에는 부재하는 H5 HA COBRA-C 코딩 서열의 존재를 특이적으로 확인하도록 디자인되었다. PCR 프라이머는 또한 바이러스의 무결성을 시퀀싱하여 확인하기 위해서 재조합 팔부의 일부, 프로모터, 및 재조합체 유전자를 포함하는 전체 카세트를 증폭하도록 디자인되었다 (표 5). PCR은 표 1에 표시된 특정 프라이머 쌍과 함께 500 ng의 DNA 주형을 사용해 수행되었다. PCR 사이클링 조건은 다음과 같다: 94℃ - 2분; 94℃ - 30초, 58℃ - 45초, 68℃ - 1 또는 6분의 40 사이클; 68℃ - 5분 (연장 시간은 예상 생성물 크기에 따라 조정됨).
발현 분석: 간접 면역형광 어세이 (IFA)를 vHVT522에 대해 수행하였다. vHVT522가 접종된 CEF는 빙냉 95% 아세톤을 사용해 20분 동안 -20℃에서 고정하였고 10분 동안 공기-건조하였다. 다음으로, 플레이트는 PBS로 재수화하였고 이중 염색의 2개 세트를 수행하여 각 바이러스 플라크에서 항원의 동시 발현을 검토하였다. 1개 세트에서, 2종의 1차 항체, 1:500 희석의 닭 전염성 활액낭병 (IBD) 혈청 (Charles Rivers Laboratories, Lot. G0117) 및 1:3,000 희석의 HVT에 대한 L78.2 단일클론 항체 (Boehringer Ingelheim Animal Health, BIAH, Gainesville, GA)를 첨가하여 VP2 및 MDV-3 (HVT) 항원의 발현을 검토하였다. 제2 세트에서, 2종 1차 항체, 1:300 희석의 H5N2 닭 혈청 불활성화 (Charles River Laboratories, Lot. J0210) 및 1:3,000 희석의 HVT에 대한 L78.2 단일클론 항체 (Boehringer Ingelheim Animal Health, BIAH, Gainesville, GA)를 첨가하였다. 1차 항체가 존재하는 모든 플레이트는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척 후, 2종의 2차 항체, 1:300 희석의 Alexa Fluor 568 염소 항-닭 IgG (Invitrogen, Cat.# A11041, lot#1868220) 및 1:300 희석의 항-마우스 IgG-FITC (Sigma, Cat.# F2012-1 mL, lot#5LBG3032)를 첨가하였다. 플레이트는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음에 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-필터를 사용한 형광 현미경 및 Nikon Eclipse Ti 역상 현미경의 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)-필터로 IFA 양성 플라크를 확인하기 위해 관찰되었다.
게놈 분석: vHVT522의 게놈 DNA는 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 삽입된 유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 결정이 수행되었다. 프라이머 세트, MB080 및 MB081은 재조합 팔부의 일부를 포함하는 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭하는데 사용되었다. PCR 증폭은 다음과 같이 수행되었다: 2분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 45초 동안 58℃, 5분 동안 68℃의 30 사이클, 및 5분 동안 68℃에서 최종 연장. 5.6 kb PCR 생성물을 Qiagen 겔 추출 키트 (Cat. No. 28706, Lot. #157036708)를 사용해 겔 정제하였고 전체 단편은 하기 표에 열거된 시퀀싱 프라이머를 사용해 시퀀싱되었다.
Figure pct00006
서던 블롯 분석: 전체 게놈 DNA는 vHVT013-69 TC5 (Vaxxitek의 프리-MSV), vHVT522 프리-MSV, 및 vHVT522 프리-MSV+13으로부터 먼저 재료를 50 mL 코니칼 튜브로 옮기고 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 추출되었다. 서던 블롯 경우, 프리-MSV 재료는 바이러스 게놈 DNA 추출을 위해 충분한 세포를 수확하기 위해서 12 계대 이상으로 1회 더 계대하였다 (따라서, 프리-MSV +13). 세포 펠렛은 1 mL의 PBS로 재현탁하였다. 14 mL의 세포 용해 완충액을 150 μL의 프로테이나제 K (20 mg/mL)와 함께 첨가하였고, 2시간 동안 55℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 600 μL의 5 M NaCl을 첨가하였다. 동일한 총 부피의 페놀을 첨가하였고 수분 동안 조심스럽게 흔들었다. 다음으로 재료를 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성층 (윗층)을 새로운 50 mL 튜브로 옮겼고 상기 기술된 바와 같이 클로로포름을 사용해 2회 더 반복하였다. 최종 수성층을 폴리카보네이트 원심분리 튜브로 옮겼고 30 mL의 100% 에탄올을 첨가하였다. 부드럽게 혼합한 후, 용액을 -20℃에서 밤새 정치시켰다. 다음 날에, 용액을 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 쏟아버렸고, DNA 펠렛을 70% 빙냉 에탄올로 세정하였다. DNA 펠렛을 10분 동안 공기 건조하였다. 500 μL의 20 mM HEPES를 건조된 펠렛에 첨가하였다. 전체 게놈 DNA를 4℃에 저장하였다.
각각의 제한효소 분해를 위해서, 10 μg의 게놈 DNA (도너 플라스미드 경우 3 μg)는 10 μL의 제한효소 분해 믹스 당 1 μg DNA의 농도로 사용되었다. vHVT013 (음성 대조군), pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 도너 플라스미드, vHVT522 프리-MSV, 및 vHVT522 프리-MSV+13의 게놈 DNA는 각각 밤새 37℃에서 BamHI, EcoRV, 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 분해되었다. 제한효소 분해 이후에, 게놈 DNA 및 도너 플라스미드의 양은 먼저 VP2 및 NDV-F에 대한 도트 블롯 및 프로빙을 수행하여 평형화되었다. 총 40 μL의 1X 로딩 완충액 중 총 3 μg의 vHVT522 프리-MSV, 2 μg의 vHVT522 프리-MSV+13, 1 μg의 vHVT013 및 1 ng의 도너 플라스미드를 1% 아가로스 겔에 로딩하였고 냉장실에서 밤새 25 V에서 러닝하였다. 각각의 분해 및 러닝은 사용된 각 프로브에 대해 이중으로 하였다.
아가로스 겔을 탈푸린화 용액, 변성화 용액, 및 중화 용액에 각각 7분 동안 두었다. 5 Hg로 설정된 진공 전달 스테이션을 사용하여 아가로스 겔에서 양으로 하전된 나일론 막으로 DNA를 약 2시간 동안 전달하였다. 전달 후에, 막은 0.4 M NaOH로 처리한 다음에 SSC-HCL 완충액으로 중화하였다. 막을 공기 건조하고 UV 가교하였다. 막은 1시간 동안 사전 혼성화하였고 그 다음에 North2South 화학발광 혼성화 및 검출 키트 (Thermo Scientific)에 대한 제조사 설명서에 따라서 밤새 55℃에서 프로브와 혼성화시켰다.
사용된 프로브는 도너 플라스미드 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C로부터 분해를 통해 단리되었다. VP2 프로브는 MScI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 도너 플라스미드의 분해를 통해 생성되었고 1.3 Kb 단편을 겔 정제하였다. H5 프로브는 NcoI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 도너 플라스미드를 분해하여 생성되었고 1.7 Kb 단편을 겔 정제하였다. 각각의 밴드를 Qiagen의 겔 추출 키트 (Qiagen, cat# 28706)를 사용해 겔 추출하고 정제하였다. North2South 바이오틴 무작위 프라임 표지화 키트 (Thermo Scientific)의 제조사 설명서에 따라서, 겔 추출된 생성물은 바이오틴화된 뉴클레오티드의 도입을 통해 표지화하였다. 1개 막은 VP2로 프로빙하였고 나머지는 H5 프로브로 프로빙하였다. 밤새 혼성화 이후에, 막을 차단 완충액에 위치시킬 때까지 몇회의 엄격 세척을 수행한 다음에 30분 후에 차단 완충엑에 스트렙타비딘-HRP를 첨가하였다. 임의의 비결합된 스트렙타비딘-HRP의 막을 세정한 후에, 루미날 및 퍼옥시드의 기질 용액을 첨가하였다. 다음으로, 막을 Biorad Chemidoc Imaging System™에 위치시켰고 이미지는 화학발광 검출 모드로 포착하였다.
결과
PCR 분석: vHVT522 프리-MSV (X) 및 프리-MSV+12 (X+12)의 PCR 분석은 도 19에서 vHVT522 지도에 도시되고, 표 5에 열거된 PCR 프라이머를 사용해 수행되었다. 도 20에 도시된 바와 같이, 겔 전기영동 이후 PCR 생성물의 크기는 예상 크기 및 밴드 패턴과 충분히 상응하였다. 도 20의 vHVT522에서 부모 vHVT013 바이러스의 증거는 존재하지 않았다.
발현 분석: 재조합체 vHVT522 바이러스 플라크는 이중 염색을 위해 TRITC 필터 및 FITC 필터 둘 모두를 사용해 가시화하였다. FITC 필터 (녹색)는 모든 바이러스 플라크에서 예상되는, HVT 발현을 보인데 반해서, TRITC 필터 (붉은색)는 염색에 사용된 1차 항체의 유형에 따라서, VP2 또는 H5 HA의 재조합체 항원의 발현을 보였다. vHVT522 (P3) 프리-MSV 스톡을 비롯하여, P3 (프리-MSV) 단계 이상으로 12 라운드 동안 시험관내에서 전달된, vHVT522 X+12 둘 모두에서 FITC-HVT 및 TRITC-VP2 또는 FITC-HVT 및 TRITC-H5 HA를 비교하여 300개가 넘는 플라크가 계측되었다. 플라크 계측의 요약은 표 6에 도시되고 대표적인 도면은 도 21에 도시되어 있다. 관찰된 모든 플라크는 이중 염색에 대해 양성이었다.
Figure pct00007
게놈 분석: vHVT522 프리-MSV 스톡 (P3) 및 X+12의 게놈 DNA는 프라이머 세트 MB080 및 MB081을 사용해 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭시키기 위한 주형으로서 사용되었다. 5.6 kb PCR 생성물을 겔 정제하였고 전체 단편은 표 7에 열거되고 도 22에 개략적으로 도시된 시퀀싱 프라이머를 사용해 시퀀싱되었다.
Figure pct00008
하기 주형을 사용한 PCR: vHVT522 프리-MSV (레인 1), vHVT522 프리-MSV+12 (레인 2)는 재조합 팔부의 일부를 포함한 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭시키기 위해서 프라이머-쌍 MB080 및 MB081을 사용해 설정되었다. 5.6kb PCR 생성물을 겔 추출하였고 표 7에 열거된 프라이머를 사용해 서열 분석에 사용되었다. 서열 분석은 Eurofins MWG Operon LLC로 수행하였다.
시퀀싱 contig는 표 7에 표시된 프라이머로부터의 시퀀싱 반응물로부터 조립되었다. vHVT522 프리-MSV 경우 도 24 및 vHVT522 프리-MSV+12 시퀀싱 contig 경우 도 25를 참조한다.
vHVT522 프리-MSV+12로부터 수득된 시퀀싱 결과는 정렬을 형성하도록 벡터 NTI 소프트웨어를 사용해 정렬되었다. 정렬은 vHVT522 프리-MSV와 같이 정확한 서열와 일치한다.
서던 블롯 분석: 서던 블롯 분석은 VP2 및 H5 유전자 단편에 대해 프로빙을 수행하였다. 도 30은 서던 블롯에서 사용된 2개 프로브를 제조하는데 사용된 pVP2-IRES[MOD]-COBRA-C 플라스미드의 지도를 나타낸다. 이러한 플라스미드는 vHVT522에 존재하는 H5 및 VP2 유전자 둘 모두를 함유한다. VP2 프로브, 1.3 Kb는 MscI 및 NotI이 측접하고, H5 프로브, 1.7 Kb는 NcoI 및 NotI 제한효소 부위가 측접한다. 제한 엔도뉴클레아제의 각 쌍에 의한 플라스미드의 분해 이후에, 각각의 단편은 겔 추출되었고 바이오틴화된 DNA 프로브를 제조하기 위한 주형으로서 사용되었다.
각 구성체의 제한효소 분해를 통해 수득된 DNA 단편의 예상 크기는 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 도 34 및 도 35에 도시된 바와 같이, 수득된 예상 크기는 서던 블롯을 현상한 이후에 수득된 실제 밴드에 상응한다. vHVT522의 프리-MSV 및 프리-MSV+13 게놈 DNA 둘 모두에서 검출된 특이적 DNA 단편의 패턴은 동일하다. 그러나, 1 내지 1.6 kb 마커 사이에 눈에 띄는 번짐 (붉은색 화살표로 표시)으로 보이는 것이 존재하는데, 사용된 제한 엔도뉴클레아제에 의해 패턴이 변화되지 않아서, 아마도 부분적으로 분해된 게놈에서 발생한 것인 듯하다.
결론: vHVT522의 PCR, 면역형광, 및 서열 분석을 기반으로, 부모 vHVT013이 잔존한다는 증거는 존재하지 않는다. 데이터는 mCMV 프로모터 (VP2) 및 IRES 서열 (HA)의 제어 하에서 IBDV 유래 VP2 유전자 및 AIV 유래 H5 유전자 (아래 경로)를 발현하는 재조합체 HVT인 것을 입증한다. 데이터는 또한 vHVT522가 프리-MSV를 넘어 12계대에서 유전적으로 표현형적으로 안정하다는 것을 입증한다.
실시예 3
vHVT523의 구축
vHVT523은 COBRA (computationally optimized broadly reactive approach)를 통해 디자인된 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV) A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 이러한 특정 단백질은 또한 본 명세서에서 C omputationally O ptimized B roadly R eactive A ntigen-version C 대신에 COBRA-C라고 한다. vHVT523은 또한 합성 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 융합 단백질 (F)을 포함한다.
이 프로토콜의 목적은 BamHI I 단편의 유전자간 I 부위가 mCMV 프로모터, NDV 융합 단백질 F, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 바이러스 (아형 H5, COBRA-C)의 HA, 단백질 및 SV40 폴리A 꼬리부를 함유하게 되는 재조합체 HVT 바이러스를 구축하는 것이었다.
도너 플라스미드는 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C로서, 이의 골격은 vHVT013 바이러스의 유전자간 1 팔부로부터의 합성 DNA 단편, SV40 폴리A 꼬리부, COBRA-C (H5 HA 단백질), IRES, NDV-F 단백질 및 mCMV 프로모터를 함유하는 플라스미드로 구성된다. 재조합은 2차 닭 배아 섬유아세포 (2° CEF) 세포에서 시험관내에서 발생되었다. 재조합 선택은 닭 항-조류 인플루엔자 혈청을 사용한 간접 면역형광 어세이 (IFA) 및 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 수행하였다.
플라스미드 pFwt-IRES-COBRA-C는 먼저 이전에 생성된 플라스미드 (pFwt-IRES-SaH9opt)의 사우디-아라비아 H9 유전자를 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출된 COBRA-C 유전자로 치환하여 구축되었다. COBRA-C 유전자는 SalI 및 HindIII를 사용한 제한 효소를 사용하여 pVP2-IRES-COBRA-C로부터 추출하였고 동일 효소로 역시 분해된 pFwt-IRES-SaH9opt에 클로닝하였다. pFwt-IRES-COBRA-C 플라스미드는 HindIII-BlpI 단편을 새로운 합성 단편 F+COBC로 치환하여 더욱 변형시켜서 pFwt-IRES-COBRA-C에 존재하는 COBRA-C 서열의 출발부 및 IRES 서열의 종결부 사이에 개재된 서열 스트레치를 제거하였다. 새로운 올바른 도너 플라스미드는 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C라고 한다. 이러한 플라스미드를 사용하여 재조합 바이러스를 생성시킨다. 플라스미드 구축의 다이아그램은 도 36 및 도 37에 도시된다.
재조합 바이러스 생성: 시험관내 재조합 (IVR)은 도너 플라스미드로서 선형화된 pFwt-IRES[MOD]-COBRA-C 및 vHVT013으로부터 단리된 바이러스 DNA를 사용하여 2° CEF 세포의 동시-전기천공을 통해 수행되었다. 동시-전기천공은 300 μl Opti-MEM 중 1x107 2° CEF를 사용해 수행되었고, 2 mm 전기천공 큐벳 중에서 950 정전용량과 150 볼트에서 충격을 가하였다. 형질감염된 세포는 96-웰 플레이트에 파종되었고 4일 동안 인큐베이션되었다. 96-웰 플레이트에서 성장된 세포를 2개 96-웰 플레이트에 복제하였다. 96-웰 플레이트의 1개 세트는 재조합체를 함유하는 양성 웰을 확인하기 위해서 AIV H5 HA에 대한 닭 다클론 혈청을 사용한 IFA에 사용되었고, 96-웰 플레이트의 다른 세트는 상응하는 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하는데 사용되었다.
재조합체의 정제: 재조합체 바이러스 정제 방법은 먼저 96-웰 플레이트 복제 및 최소량의 IFA 음성 플라크와 최대량의 IFA 양성 플라크를 함유하는 웰에 대한 IFA 선택을 통해 수행되었다. 그들 기준에 부합하는 웰을 수확하였고 1 mL 까지 DMEM+2% FBS로 조정하였다. 1 mL 스톡으로부터, 10-20 μl를 제거하였고 10 mL DMEM+2% FBS 중 1x107 2° CEF와 혼합하였고, 웰 당 단일 HVT 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트에 분취하였다. 단일 플라크를 함유한 상청액은 PCR을 통해서 부모 바이러스의 부재에 대해 시험되었다. 이러한 과정은 모든 시험된 웰이 순수한 재조합체 밴드 패턴을 보이고 부모 바이러스를 보이지 않을 때까지 몇 라운드 동안 반복되었다. 5개의 PCR 순수 웰을 수확하였고 (P0), vHVT-Fwt-IRES[MOD]-COBRA-C, R3(P0) #1, #2, #3, #4 및 #5를 냉동하였다. 5개 중에서, 자매 클론 중 2개 (#1 및 #4)는 T-25 플라스크 (P1) 및 궁극적으로 T-150 플라스크 (P2)에서 확장시켰다. P2 확장 단계에서 2개 중 하나인, vHVT-Fwt-IRES[MOD]-COBRA-C, #1은 3X 850 ㎠ 롤러 병에서 확장되었고, 수확되었으며, P3, 프리-MSV 스톡, (vHVT-523 NDV-AI (P3) #1 11-May-2018 AK)으로서 냉동되었다. 12 연속 계대는 프리-MSV 스톡 이상으로 T-25 플라스크에서 수행되었다 (X+12).
PCR 분석: 바이러스 DNA는 QIA DNAeasy 혈액 및 조직 키트 (Qiagen cat#69506)를 통해서 vHVT523 (프리-MSV) 및 vHVT523 X+12로부터 추출되었다. PCR 프라이머는 재조합 바이러스만이 존재하고 부모 vHVT013 바이러스는 부재해야 하는 H5 HA COBRA-C 코딩 서열의 존재를 특이적으로 확인하기 위해 디자인되었다. PCR 프라이머는 또한 바이러스의 무결성을 시퀀싱하여 확인하기 위해서 재조합 팔부의 일부, 프로모터, 및 재조합체 유전자를 포함한, 전체 카세트를 증폭하도록 디자인되었다. PCR은 표 1에 표시된 명시된 프라이머 쌍과 함께 500 ng의 DNA 주형을 사용해 수행하였다. PCR 사이클린 조건은 다음과 같다: 94℃ - 2분; 94℃ - 30초, 58℃ - 45초, 68℃ - 1 또는 6분의 40 사이클; 68℃ - 5분 (연장 시간은 예상 생성물 크기에 따라 조정됨).
발현 분석: 간접 면역형광 어세이 (IFA)는 vHVT523에 대해 수행되었다. vHVT523이 접종된 CEF는 빙냉 95% 아세톤으로 20분 동안 -20℃에서 고정되었고 10분 동안 공기-건조되었다. 다음으로 플레이트는 PBS로 재수화하였고 이중 염색의 2개 세트는 각 바이러스 플라크에서 항원의 동시 발현을 검토하기 위해 수행되었다. 1개 세트에서, 2종 1차 항체, 1:300 희석의 닭 뉴캐슬병 바이러스 (ND) 혈청 (Charles Rivers Laboratories, Lot. C0117A) 및 1:3,000 희석의 HVT에 대한 L78.2 단일클론 항체 (Boehringer Ingelheim Animal Health, BIAH, Gainesville, GA)를 첨가하여 각각 NDV-F 및 HVT 항원의 발현을 검토하였다. 제2 세트에서, 2종 1차 항체, 1:300 희석의 H5N2 닭 혈청 불활성화 (Charles River Laboratories, Lot. J0210) 및 1:3,000 희석의 HVT에 대한 L78.2 단일클론 항체 (Boehringer Ingelheim Animal Health, BIAH, Gainesville, GA)를 첨가하였다. 1차 항체 존재의 모든 플레이트는 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. PBS로 3회 세척 후, 2종의 2차 항체, 1:300 희석의 Alexa Fluor 568 염소 항-닭 IgG (Invitrogen, Cat.# A11041, lot#1868220) 및 1:300 희석의 항-마우스 IgG-FITC (Sigma, Cat.# F2012-1 mL, lot#5LBG3032)를 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었고 이어서 PBS로 3회 세척하였다. 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-필터를 사용하는 형광 현미경 및 Nikon Eclipse Ti 역상 현미경의 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC)-필터를 사용해 IFA 양성 플라크를 확인하기 위해 관찰되었다.
게놈 분석: vHVT523의 게놈 DNA는 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 삽입된 유전자 카세트의 뉴클레오티드 서열 결정을 통해 수행되었다. 프라이머 세트, MB080 및 MB081은 재조합 팔부의 일부를 포함한 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭하는데 사용되었다. PCR 증폭은 다음과 같이 수행되었다: 2분 동안 94℃, 30초 동안 94℃, 45초 동안 58℃, 6분 동안 68℃의 30 사이클, 및 5분 동안 68℃의 최종 연장. 5.9 kb PCR 생성물은 Qiagen 겔 추출 키트 (Cat. No. 28706, Lot. #157036708)를 사용해 겔 정제하였고 전체 단편은 하기 표에 열거된 시퀀싱 프라이머를 사용해 시퀀싱하였다.
Figure pct00009
결과
PCR 분석: vHVT523 프리-MSV (X) 및 프리-MSV+12 (X+12)의 PCR 분석은 표 8에 열거되고 도 41의 vHVT523 지도에서 도시된 PCR 프라이머를 사용해 수행되었다. 도 42에 도시된 바와 같이, 겔 전기영동 이후 PCR 생성물의 크기는 예상 크기 및 밴드 패턴과 충분히 상응한다. 또한, vHVT523에 부모 vHVT013 바이러스의 증거는 존재하지 않는다.
발현 분석: 재조합체 vHVT523 바이러스 플라크는 이중 염색을 위해 TRITC 및 FITC 필터 둘 모두를 사용해 가시화하였다. FITC 필터 (녹색)는 모든 바이러스 플라크에서 예상되는, HVT 발현을 보이는 한편, TRITC 필터 (붉은색)는 염색에 사용되는 1차 항체의 유형에 따라서, NDV-F 또는 H5 HA의, 재조합체 항체의 발현을 보인다. vHVT523 (P3) 프리-MSV 스톡을 비롯하여, P3 (프리-MSV) 단계를 넘어 12 라운드 동안 시험관내에서 전달된, vHVT523 X+12 둘 모두에서 FITC-HVT 및 TRITC-NDV-F 또는 FITC-HVT 및 TRITC-H5 HA를 비교하여 300개 이상의 플라크를 계측하였다. 플라크 계측의 요약은 하기 표에 도시되고 대표 도면은 도 43에 도시된다. 관찰된 모든 플라크는 이중 염색에 대해 양성이었다.
Figure pct00010
게놈 분석: vHVT523 프리-MSV 스톡 (P3) 및 X+12의 게놈 DNA는 프라이머 세트 MB080 및 MB081을 사용하여 재조합 팔부 영역의 일부를 비롯하여 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭하기 위한 주형으로서 사용되었다. 5.9 kb PCR 생성물은 겔 정제되었고 전체 단편은 하기 표에 열거되고 도 41에 개략적으로 도시된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다.
Figure pct00011
PCR은 하기 주형을 사용한다: vHVT523 프리-MSV (레인 1), vHVT523 프리-MSV+12 (레인 2)는 재조합 팔부의 일부를 포함한 전체 삽입된 유전자 카세트를 증폭하기 위해서 프라이머-쌍 MB080 및 MB081을 사용해 설정되었다. 5.6kb PCR 생성물은 겔 추출되었고 표 10에 열거된 프라이머를 사용한 서열 분석에 사용되었다. 서열 분석은 Eurofins MWG Operon LLC로 수행되었다.
시퀀싱 contig는 표 10에 표시된 프라이머로부터의 시퀀싱 반응물로부터 조립되었다. vHVT523 프리-MSV 시퀀싱 contig에 대해 도 46을 참조한다.
vHVT523 프리-MSV로부터 수득된 시퀀싱 결과는 상기 정렬을 형성하도록 벡터 NTI 소프트웨어를 사용해 정렬되었다. 생성된 정렬은 예상되는 vHVT523 서열에 정확하게 일치하였다.
결론: vHVT523의 PCR, 면역형광, 및 서열 분석을 기반으로, 부모 vHVT013이 남은 증거는 존재하지 않는다. 데이터는 vHVT523이 mCMV 프로모터 (F) 및 IRES 서열 (HA)의 제어 하에서 NDV 유래 융합 (F) 유전자 및 AIV 유래 H5 유전자 (아래 경로)를 발현하는 재조합체 HVT인 것으로 입증되었다. 데이터는 또한 프리-MSV 이상으로 12계대에서 유전적으로 표현형적으로 안정하다는 것을 입증한다.
실시예 4 고-병원성조류 인플루엔자 바이러스 챌린지에 대항하여, 1일령 SPF 닭에게 투여된 조류 인플루엔자-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 후보 (vHVT522-AI-IBDV, vHVT523-AI-NDV 및 vHVT509-AI)의 효능의 평가.
이 연구의 목적은 3종의 고-병원성조류 인플루엔자 바이러스 (HPAIV) 균주의 챌린지에 대항하여, 1일령 SPF 닭에게 투여된, 조류 인플루엔자-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 후보의 효능을 결정하는 것이었다.
조사된 주요 변수는 다음과 같다: 1. 고-병원성 조류 인플루엔자와 연관된 폐사율 및 전형적인 임상 징후, 및 2. 구강인두 면봉에서 바이러스 존재량 및 바이러스 발산 새의 %.
144마리의, 1일령 SPF 병아리, SPAFAS 무리 T36을 하기 표에 따라서 12개 그룹에 배정하였다. 모든 새는 2,560 PFU'0.2 mL 용량의 vHVT522-AI-IBDV (P5 082918); 2,360 PFU/0.2 mL 용량의 vHVT523-AI-NDV (P5 082918); 및 2,160 PFU/0.2 mL 용량의 vHVT509-AI (vHVT509 X+5 071318)로, 하기 표에 따라서, 피하 (SQ) 경로를 통해서, 백신접종 또는 모의-백신접종되었다. 새들은 처치 그룹별로 수용하였고, 유닛 당 18마리 새였다.
Figure pct00012
연구에서 사용된 시험 백신은 하기 표에 표시된다.
Figure pct00013
연구에서 사용되는 챌린지 재료는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00014
연구에서 사용되는 동물은 하기 표에 표시된다.
Figure pct00015
연구 일정표는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00016
연구 24일에, 모든 그룹은 그룹 당 10마리 새로 줄였고, 번호표시된 밴드로 개체 식별을 위해 목 밴드를 하였다. 혈액 샘플은 날개 또는 경정맥으로부터 정맥천자를 통해 수집하였다.
연구 25일에, 모든 그룹은 남동부 가금류 연구 실험실 (Southeastern Poultry Research Laboratory) (SEPRL)로 수송하였고 격리 유닛에, 유닛 당 10마리 새를 배치하였다.
연구 28일에, 모든 새는 HPAIV A/칠면조/미네소타/12582/2015; 분기군 2.3.4.4; [미네소타/12582], 용량 당 105.9 EID50 (그룹 1-4); A/이집트/N04915/2014, H5N1, 분기군 2.2.1; [이집트/N04915], 용량 당 106.5 EID50 (그룹 5-8); 또는 A/가축 칠면조/헝가리/53433/2016, 분기군 2.3.4.4B - H5N8 [헝가리/53433], 용량 당 105.9 EID50 이 후비공내 경로를 통해서 챌린지되었다.
연구 28일 내지 42일에, 새들은 폐사를 포함하여, HPAIV 임상 징후 및 챌린지에 대한 불리한 반응에 대해 매일 관찰되었다. 임상 징후는 중증 우울증, 신경계 또는 호흡계 징후 및/또는 폐사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 관찰 기간의 종료 시 (연구 42일)에, 생존한 새들은 혈청학을 위해 채혈하였고 종결시켰다.
연구 30일 및 32일에, 구강인두 면봉을 모든 새 (이들 샘플일에 폐사된 채로 발견된 새 포함)에서 수집하였고, 바이러스 발산을 결정하기 위한 분자 검사가 수행될 때까지 뇌 및 심장 주입 매질 (BHI)에 -70℃에서 저장하였다.
연구 42일에, 혈액을 남은 모든 새들에서 수집하였고 새들을 종결시켰다.
모든 동물은 동일한 방식으로 사육하였다. 새들은 음압 격리 유닛에서 사용되었다. 물 및 사료는 자유식으로 제공되었다.
모든 새는 수송까지 Merial 시설에서 사육하였다. 연구 25일 내지 28일에, 모든 새들을 SEPRL로 옮겼고 여기서 그들은 나머지 연구를 위해서 BSL-3 승인 유닛에 배치되었다.
분석 검사
백신: 각 실험 백신 조제물은 1회 내지 3회 적정하여 제공되는 실제 용량 (ADG)을 결정하였다. 역가는 마렉병 바이러스 및 조류 인플루엔자 유전자 삽입부를 포함한 모든 백신 분획에 대해 결정되었다.
챌린지: 챌린지 바이러스는 계란에서 1회 적정하여 제공되는 실제 챌린지 용량을 결정하였다.
혈청학: 챌린지 전 및 챌린지 후 수집된 혈청은 선택된 AIV 균주에 대한 항체 수준을 결정하기 위해 혈구응집 억제 (HI) 어세이에서 사용되었다.
바이러스 발산 - RT-PCR: HPAIV 바이러스 존재량은 SEPRL에서 수집된 면봉에서 실시간 RT-PCR로 시험되었다. 구강인두 면봉은 연구 30일 및 32일에 수집되었고 처리까지 BHI 매질 중에 -70℃에서 저장되었다. 바이러스 RNA는 제조사의 설명서에 따라서 MagMAX™-96 AI/ND 바이러스 RNA 단리 키트® (Ambion, Inc.)를 사용해 추출하였다. 최종 바이러스 RNA 추출물은 7500 FAST 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용해 인플루엔자 매트릭스 유전자를 표적으로 하는 1단계 qRRT-PCR을 통해 정량되었다. 바이러스 RNA 정량에 대한 표준 곡선은 챌린지 바이러스의 동일한 적정 스톡의 희석물로부터 추출된 RNA를 사용해 확립되었다. 발산 역가 (Log10/mL)는 RT-PCR로 측정하였다. 각 새에 대한 양성 면봉 결과는 각 새에서 챌린지 후 양성 RT-PCR 결과의 하나 이상의 존재로서 정의되었다. 분석을 위해서, 모든 음성 샘플은 각 바이러스에 대해 확립된 검출 한계 미만으로 간주되었다.
동물 성향: 연구 동안 폐사한 모든 새 및 Merial에서 종결된 새들은 실험 농장에서 소각 처리되었다. SEPRL에서 연구 종료 시에 폐사 또는 종결된 새들은 SEPRL BSL-3 시설에서 권고 및 승인된 절차에 따라서 처리되었다.
결과
하기 표는 연구 그룹에 따른 HPAIV에 양성인 새의 마릿수 및 %보호율/감염율을 표시한다.
Figure pct00017
발산 결과의 요약은 하기 표 및 도 55-57에 표시된다. 연구 30일 및 32일 동안 발산 역가의 상자 그래프는 각각 도 51 및 도 52에 도시된다.
Figure pct00018
하기 표는 일별 및 그룹에 따른 양성 구강인두 발산의 빈도를 표시한다.
Figure pct00019
하기 표는 일별 및 그룹에 따른 HI 결과의 요약을 보여준다.
Figure pct00020
하기 표는 그룹에 따른 HPAIV에 양성인 새의 마릿수 및 감염율을 보여준다. 연구에서 배제된 새들은 없었다.
Figure pct00021
임상 징후 예컨대 중증 우울증, 신경계 또는 호흡계 징후 및/또는 폐사의 빈도가 하기 표에 표시된다.
Figure pct00022
Figure pct00023
하기 표는 연구 그룹에 따른 폐사율 빈도를 보여준다.
Figure pct00024
일별 및 연구 그룹에 따른 PCR/발산 결과, 및 각 연구 그룹 내 동물 ID가 하기 표에 표시된다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
하기 표는 연구 그룹에 따라 관찰된 PCR 결과의 통계를 요약한다.
Figure pct00029
하기 표는 일별 및 그룹에 따른 양성/음성 PCR 결과의 빈도를 표시한다.
Figure pct00030
미네소타/12582의 챌린지에 대한 RT-PCR 검출 한계는 1.1이었다.
헝가리/53433의 챌린지에 대한 RT-PCR 검출 한계는 1.4였다.
이집트/N04915의 챌린지에 대한 RT-PCR 검출 한계는 1.7이었다.
검출 한계 미만의 역가를 갖는 모든 샘플은 음성으로 간주하였다. 통계적 계산 목적을 위해서, 모든 음성 샘플은 검출 한계 미만의 "0.1"의 값이 지정되었다.
하기 표는 그룹, 동물 ID, 및 일별로 미네소타/12582가 챌린지된 연구 그룹에서의 혈구응집 억제 결과를 보여준다.
Figure pct00031
Figure pct00032
혈구응집 억제 검사에 대한 검출 한계는 8이었다. "<8"로서 열거된 모든 샘플은 음성이고, 기하 평균 역가 계산 목적을 위해서 "4"의 값을 지정하였다.
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 미네소타/12582 혈구응집 억제 결과의 기하 평균 역가 계산을 요악한다.
Figure pct00033
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 양성 미네소타/12582 혈구응집 억제 결과의 빈도를 보여준다.
Figure pct00034
도 58은 미네소타/12582로 챌린지된 닭에 대해서 24일 및 42일에 혈구응집 억제 결과의 그래프를 도시한다.
하기 표는 그룹, 동물 ID 및 일별에 따른 이집트/N04915로 챌린지된 연구 그룹에서의 혈구응집 억제 결과를 표시한다.
Figure pct00035
Figure pct00036
혈구응집 억제 검사의 검출 한계는 8이었다. "<8"로서 열거된 모든 샘플음 음성이고 기하 평균 역가 계산 목적을 위해 "4"의 값을 지정하였다.
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 이집트/N04915 혈구응집 억제 결과의 기하 평균 역가 계산을 요약한다.
Figure pct00037
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 양성 이집트/N04915 혈구응집 억제 결과의 빈도를 표시한다.
Figure pct00038
도 59는 이집트/N04915로 챌린지된 닭에 대한 24일 및 42일에 혈구응집 억제 결과의 막대 그래프를 도시한다.
하기 표는 그룹, 동물 ID, 및 일별에 따른 헝가리/53433으로 챌린지된 연구 그룹에서 혈구응집 억제 결과를 표시한다.
Figure pct00039
Figure pct00040
혈구응집 억제 검사의 검출 한계는 8이었다. "<8"로서 열거된 모든 샘플은 음성이고 기하 평균 역가 계산 목적을 위해서 "4"의 값을 지정하였다.
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 헝가리/53433 혈구응집 억제 결과의 기하 평균 역가 계산을 요약한다.
Figure pct00041
하기 표는 일별 및 연구 그룹에 따른 양성 헝가리/53433 혈구응집 억제 결과의 빈도를 표시한다.
Figure pct00042
도 60은 헝가리/53433로 챌린지된 닭에 대한 24일 및 42일에 혈구응집 억제 결과의 막대 그래프를 도시한다.
하기 표는 챌린지 재료, 백신 용량, 및 연구일에 따른 바이러스 발산 실험의 결과를 표시한다. 구강인두 면봉 샘플은 연구 30일 및 32일에 수집되었다. 발산 역가 (Log10/mL)는 RT-PCR로 측정하였다. 각 새에 대한 양성 면봉 결과는 각 새에서 챌린지 후 양성 RT-PCR 결과의 1회 이상의 존재로서 정의되었다. 음성 샘플은 각 바이러스에 대해 확립된 검출 한계 미만으로 간주되었다. 연구 30일 및 32일 동안 발산 결과의 상자 그래프는 각각 도 51 및 도 52에 도시된다.
Figure pct00043
하기 표는 미네소타/12582로 챌린지된, 처치 그룹 (1, 2, 및 3) 및 대조군 4 간 연구 30일에 추정된 log10 편차를 표시한다.
Figure pct00044
처치 그룹 (1, 2, 및 3) 및 그룹 4 간 평균 log10 역가 편차에 대한 95% 신뢰 구간이 0을 함유하지 않으므로, 처치 그룹 (1, 2, 및 3)에 대한 평균 역가는 그룹 4의 경우 모두 유의하게 평균 역가 미만이다.
하기 표는 이집트/N04915로 챌린지된, 처치 그룹 (5, 6, 및 7) 및 대조군 8 간에 연구 30일에 추정된 log10 편차를 표시한다.
Figure pct00045
처치 그룹 (5, 6, 및 7) 및 그룹 8 간에 평균 log10 역가 편차에 대한 95% 신뢰 구간이 0을 함유하지 않으므로, 처치 그룹 (5, 6, 및 7)에 대한 평균 역가는 그룹 8의 경우에 모두 유의하게 평균 역가 미만이다.
하기 표는 헝가리/53433으로 챌린지된, 처치 그룹 (9, 10, 및 11) 및 대조군 12 간에 연구 30일에 추정된 log10 편차를 표시한다.
Figure pct00046
처치 그룹 (9, 10, 및 11) 및 그룹 12 간에 평균 log10 역가 편차에 대한 95% 신뢰 구간이 0을 함유하지 않으므로, 처치 그룹 (9, 10, 및 11)에 대한 평균 역가는 그룹 12의 경우에 모두 유의하게 평균 역가 미만이다.
결론: 이러한 시험의 조건 하에서, 모든 시험된 구성체는 임상 징후 및 폐사율에 대해 필요한 임상 보호를 제공할 수 있었고, 모든 시험된 후보는 또한 30일 및 32일에 평균 발산을 유의하게 감소시킬 수 있었는데, 구성체 vHVT509, 이어서 vHVT522로 백신접종된 새에서 모든 시험된 챌린지 균주에 대해 전체적으로 더 양호한 감소 (평균 역가 및 발산 새의 마릿수)가 있었다. 챌린지 전 HI에 의해 양성인 새의 마릿수 및 항체 수준은 vHVT522 및 vHVT509 간에 유사하였고, 약간 더 낮은 수준이 vHVT523에서 관찰되었다. 모든 시험된 구성체는 필요한 임상 보호, 발산 감소 및 백신접종전 적절한 HI 수준을 제공한다. 임상 보호, 발산 및 항체 수준을 기반으로, 더 양호한 전체 결과를 갖는 구성체는 vHVT509와 이어서 vHVT522 및 vHVT523이었다.
실시예 5
전염성 활액낭병 바이러스, STC 고전적 및 변이체-E 균주로 챌린지 시 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-AI-IBDV)의 효능
이 연구의 목적은 전염성 활액낭병 바이러스 (STC 및 VAR-E 균주)로 챌린지 시 vHVT522-AI-IBDV의 면역원성을 평가하는 것이다.
조사되는 주요 변수는 육안 병변 (STC) 또는 체중 (B/B wt.) 비 (VAR-E)의 관찰에 대한 전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV)의 효과이다. 이 연구의 목적을 위해서, 육안 병변은 낭주위 부종 및/또는 부종 및/또는 활액낭 조직 내 거시적 출혈을 포함한다. 이들 명시된 병변을 갖는 임의 새는 양성으로 기록되었다.
연구에서 사용된 시험 백신은 다음과 같았다.
Figure pct00047
이 연구에서 사용된 챌린지 재료는 다음과 같았다.
Figure pct00048
연구에서 사용된 동물은 다음과 같았다.
Figure pct00049
100일령 SPF 병아리, SPAFAS 무리는 C17은 그룹 1-5로 지정되었다. 20마리 새들이 격리 유닛 당 지정되었다. 모든 새들은 백신접종 또는 모의-백신접종되었다. 그룹 1-2는 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터, vHVT-522 IBD-AI (P3) #6, Lot 11-May-2018 AK가, 2,050 PFU HVT/0.2 mL 용량으로 백신접종되었다. 그룹 3-5은 마렉의 희석제 단독 (DJ612, Exp. Date JAN 20)이 접종되었다.
Figure pct00050
모든 동물은 동일한 방식으로 사육되었다. 새들은 시험 기간 동안 음압 격리 유닛에서 사육되었다. 물 및 사료는 자유식으로 제공되었다.
STC가 챌린지된 새는 챌린지 후 4일 동안 관찰되었다. 관찰 기간 (연구 32일)의 종료 시에, 새들은 부검되었고 IBDV STC의 육안 병변에 대해 조사되었다.
STC에 대한 이러한 시험의 목적을 위해서, 육안 병변은 낭주위 부종 및/또는 부종 및/또는 활액낭 조직 내 거시적 출혈을 포함해야 한다. 이들 명시된 병변을 갖는 임의 새는 양성으로 기록되었다.
VAR-E로 챌린지되고 모의 챌린지된 나머지 새들은 챌린지 후 11일 동안 관찰되었다. 관찰 기간 (연구 39일)의 종료 시에, 새들은 종결되었고 성별, 체중 및 활액낭 무게를 수집하였다.
VAR-E에 대한 이러한 시험의 목적을 위해서, B/B wt. 비를 기반으로 감소된 크기 (위축)가 관찰되었다.
0일에, 새들은 그들이 음압 격리 유닛에 배치되기 전에 SQ 경로를 통해서 백신접종되거나 또는 모의-백신접종되었다. 백신은 목표 용량을 투여하기 위해서 마렉병 백신 희석제로 희석하였다.
연구 13일에, 모든 나머지 새들은 개체 식별을 위해 목-밴드를 하였다.
연구 21일에, 그룹 1 및 3의 새들은 IBDV-STC, EP-1 Lot 080116이, 101.8 EID50/0.03 mL 용량으로 챌린지되었다.
연구 25일에, IBDV-STC (그룹 1 및 3)가 챌린지된 모든 나머지 새들은 안락사되었고 부검하여 육안 활액낭 병변에 대해 조사되었다..
연구 28일에, 모든 새들은 Var-E IBDV 1084-E CP2 3-14-95 Lot 031495가 102.9 EID50/0.03 mL 용량으로 챌린지되었거나, 또는 모의-챌린지되었다.
연구 39일에, 성별, 체중 및 활액낭 무게가 그룹 2, 4 및 5에서 남은 모든 새들로부터 수집되었다.
결과
IBDV-STC로 챌린지 후에 활액낭병에 대해 양성으로 시험된 새의 마릿수는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00051
IVDB VAR-E로 챌린지 또는 모의-백신접종 및 모의-챌린지 이후에 연구 그룹에 따른 평균 B/B wt. 비는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00052
체중
체중 및 활액낭 무게를 수집하였고 B/B wt. 비 (활액낭 무게/체중 비 X 100)는 각 새에 대해 계산되었다. B/B wt. 비에 대한 요약 통계는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00053
p-값은 Tukey-Kramer 방법을 사용한 다중 비교를 위해 조정되었고, 쌍별 그룹 비교를 관찰할 수 있다.
하기 표는 활액낭 대 체중 비의 쌍별 비교 및 그룹 중 성별에 따른 활액낭 대 체중 비의 쌍별 비교의 p-값 및 조정된 p-값을 도시한다.
Figure pct00054
하기 표는 동물 ID 및 연구 그룹에 따른 연구로부터 배제된 새들을 표시한다. 연구 0일은 2018년 8월 23일이었다.
Figure pct00055
하기 표는 동물 ID 및 연구 그룹에 따른 연구에서 동물의 폐사율 기록을 표시한다. 연구 0일은 2018년 8월 23일이었다.
Figure pct00056
하기 표는 연구 그룹에 따른 양성 활액낭병 점수 및 양성율을 갖는 새의 마릿수를 표시한다. 그룹 3의 1마리 동물은 IBDV-STC 챌린지 이후에 우울한 것으로 관찰되었다.
Figure pct00057
관찰된 육안 병변의 빈도는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00058
하기 표는 IBDV VAR-E 챌린지 및 모의 챌린지된 동물들에서 그룹 및 동물 ID에 따라 관찰된 활액낭 무게/체중 (B/BW) 비를 표시한다.
Figure pct00059
Figure pct00060
그룹 및 성별 및 그룹에 따른 활액낭 대 체중 비의 상자 그래프가 각각 도 53 및 도 54에 도시된다.
하기 표는 그룹에 따라 관찰된 평균 B/BW 비를 표시한다.
Figure pct00061
B/B wt. 비에 대한 요약 통계가 하기 표에 표시된다.
Figure pct00062
B/B wt. 비는 선형 모델을 사용해 모델링되었고, 여기서 그룹, 성별, 및 성별에 따른 그룹은 그룹 2, 4 및 5에 대한 고정 효과로서 사용되었다. 고정 효과의 p-값은 하기 표에 기록된다.
Figure pct00063
그룹에 따른 B/B wt. 비의 최소 제곱 평균 (LSMeans) 및 성별 및 그룹에 따른 LSMeans는 하기 표에 기록된다.
Figure pct00064
그룹 비교 및 성별에 따른 그룹 비교의 결과는 하기 표에 표시된다. p-값은 Tukey-Kramer 방법을 사용한 다중 비교에 대해 조정되었다.
Figure pct00065
결론: 이 시험 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-AI-IBDV)는 백신접종 후 21일에 IBDV-STC 챌린지에 대항하여 필요한 보호를 제공할 수 있었다. IBDV-VarE에 대한 보호는 또한 모의 백신접종된 챌린지된 새 (VAR-E 챌린지 대조군)의 평균 B/B wt. 비와 비교하여 평균 B/B wt. 비 간에 통계적으로 유의한 편차에 의해 관찰되었다. 또한 음성 대조군의 평균 B/B wt. 비와 비교하여 챌린지된 대조군의 평균 B/B wt. 비 간 통계적으로 유의한 편차가 존재하였다.
실시예 6 뉴캐슬병 바이러스, GB 텍사스로 챌린지 시 조류 인플루엔자-뉴캐슬병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT523-AI-NDV)의 효능
이 연구의 목적은 뉴캐슬병 바이러스로 챌린지 후 1일령 새에서 vHVT523-AI-NDV의 효능을 평가하는 것이었다.
조사된 주요 변수는 폐사율을 포함하여, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 임상 징후의 발생이었다.
시험 백신은 다음과 같았다.
Figure pct00066
이 연구를 위한 챌린지 재료는 하기와 같았다.
Figure pct00067
이 연구에서 사용된 동물은 다음과 같았다.
Figure pct00068
40일령 SPF 닭, SPAFAS 무리 W67는 하기 표에 따라서 그룹 1 또는 2로 지정되었다. 10마리 새가 격리 유닛 당 지정되었다 (그룹 당 2 유닛). 새들은 백신접종 또는 모의 백신접종되었다. 그룹 1은 조류 인플루엔자-뉴캐슬병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT523-AI-NDV), (P3 #1), 11-May-2018 AK가, 2,390 PFU HVT/0.2 mL 용량으로 백신접종되었고, 그룹 2는 마렉 희석제 단독 (Lot DJ612, Exp. Date JAN 20)으로 모의-백신접종되었다.
Figure pct00069
모든 동물은 동일한 방식으로 사육되었다. 새들은 시험 동안 음압 격리 유닛에서 사육되었다. 물 및 사료는 자유식으로 제공되었다.
모든 새들은 챌린지 후 14일까지 중추 신경계 또는 호흡기 징후, 및/또는 폐사를 포함한 뉴캐슬병 임상 징후에 대해 관찰되었다. 관찰 기간의 종료 시에, 생존한 새들은 종결시켰다.
연구 시간표는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00070
결과
하기 표는 연구 그룹에 따른 NDV에 양성인 새의 마릿수 및 양성률을 표시한다.
Figure pct00071
격리 단위에 따른 양성 NDV의 빈도는 하기 표에 표시된다.
Figure pct00072
결론: 이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-뉴캐슬병-마렉병, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT523-AI-NDV)는 병독성 텍사스 GB 뉴캐슬 바이러스로 챌린지에 대해 새의 ≥ 95%를 보호하는 허용 기준을 충족하였다. 챌린지 바이러스 병독성은 모의 백신접종된 챌린지된 대조군에서 100%의 폐사율 및 감염율로 관찰되었다.
실시예 7 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI)의 안전성
이 연구의 목적은 SPF 닭에서 5회 역-전달시 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI)의 안전성 및 비-백신접종 접촉자에게 전파되는지 여부를 평가하는 것이었다.
요약
연구 0일에, 20마리 SPF 새들은 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로, 무작위 표를 사용해 지정되었다. 15마리의, 1일령 병아리는 0.2 mL의 vHVT522-IBD-AI, X+5, Lot 072419가 8,280 VP2/AI로, 그리고 7,480 pfu/0.2 mL 용량의 HVT로 백신접종되었고, 접촉자는 미처치된 채로 남겨두었다. 그룹 1의 새들은 역-계대 1 (BP1)로 지정되었고 무작위 표에 따라 식별을 위해 목-밴드를 하였다. 연구 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일 및 49일에, 새들은 섹션 4 및 섹션 5에 따라서, 샘플 수집 및 역계대를 위해 무작위 표에 따라 선택되었다. 연구 28일, 35일, 42일, 49일 및 77일에, 새들을 종결시키고 부검하여서 마렉병과 연관된 육안 병변에 대해 조사하였다. 이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5는 안전하였고 생체내 역계대 이후에 병독성으로 되돌아가지 않았다. 백신은 또한 비-백신접종 접촉 새들에게 확산되지 않았다. 그러나, 연구는 MSV가 아닌 X+5 재료를 사용해 수행하였다.
사건의 일정
0일: 20마리의 1일령 SPF 병아리는 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해 지정하였다. 15마리의, 1일령 SPF 병아리를 백신접종하였고 접촉자는 미처리된 채로 남겨두었다. 그룹 1의 새들은 역-계대 1 (BP1)로 지정하였고 무작위 표에 따라서 식별을 위해 목-밴드를 하였다. 초기 백신접종자 및 접촉자는 동일한 유닛에 함께 사육하였다 (유닛 당 20마리 새).
7일: 그룹 1의 5마리 초기 백신접종을 무작위 표에 따라 선택하였고, 심장 천자를 통해 채혈하고 종결시켰다. 혈액 샘플을 풀링하였고, 분취액을 접종원으로서 사용하였고, 나머지는 바이러스 회수를 검증하기 위해서 버피 코트 추출 (BCE)을 위한 분석에 전달하였다. BCE의 분취액은 추가 분자 분석을 위해 저장하였다. 20마리의 1일령 SPF 병아리는 2개 처리, 백신접종 (15마리 병아리) 및 접촉 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해 그룹 2에 지정하였다. 15마리의 1일령 SPF 병아리는 BP2로 지정하였고 0.25 mL의 G1 유래 풀링 혈액 (BP1)을 접종하였다. 접촉자는 미처리된 채로 남겨두었다. 그룹 2의 모든 새들은 무작위 표에 따라서 식별을 위해 목-밴드를 하였다. BP2 접종된 접촉된 새를 동일한 유닛에 함께 사육하였다 (유닛 당 20마리 새).
14일: 그룹 2로부터 5마리 초기 접종된 새들 (BP2)은 무작위 표에 따라 선택하였고 심장 천자를 통해 채혈하였고 종결시켰다. 혈액 샘플을 풀링하였고, 분취액을 접종원으로서 사용하였고, 나머지는 바이러스 회수를 검증하기 위해 버피 코트 추출 (BCE)을 위한 분석에 전달하였다. BCE의 분취액은 향후 분자 분석을 위해 저장하였다. 20마리의 1일령 SPF 병아리는 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해 그룹 3으로 지정하였다. 15마리의 1일령 SPF 병아리는 BP3으로 지정하였고 0.25 mL의 G2로부터의 풀링된 혈액 (BP2)을 접종하였다. 접촉자는 미처치된 채로 남겨두었다. 그룹 3의 모든 새들은 무작위 표에 따라 식별을 위해 목-밴드를 하였다. BP3 접종되고 접촉된 새들은 동일한 유닛에 함께 사육되었다 (유닛 당 20마리 새).
21일: 그룹 3의 5마리 접종된 새들 (BP3)을 무작위 표에 따라 선택하였고 심장 천자를 통해 채혈하고 종결시켰다. 혈액 샘플을 풀링하였고, 분취액을 접종원으로서 사용하였고, 나머지는 바이러스 회수를 검증하기 위해서 버피 코트 추출 (BCE)을 위한 분석에 전달하였다. BCE의 분취액은 향후 분자 분석을 위해 저장하였다. 20마리의 1일령 SPF 병아리는 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해, 그룹 5에 배정하였다. 15마리의 1일령 SPF 병아리는 BP4로 지정하였고 G3으로부터의 0.25 mL의 풀링된 혈액 (BP3)을 접종하였다. 접촉자는 미처리된 채로 남겨두었다. 그룹 4의 모든 새들은 무작위 표에 따라 식별을 위해 목-밴드를 하였다. BP4 접종하고 접촉된 새들은 동일한 유닛에 함께 사육하였다 (유닛 당 20마리 새). 그룹 1의 모든 접촉자는 날개 채혈하였고, BCE는 바이러스 회수를 검증하기 위해서 이들 샘플에 대해 개별적으로 수행되었다. 이들 새들은 안락사하지 않았고 샘플채취 후에 본래 유닛으로 다시 배치하였다. BCE 샘플의 분취액은 분자 분석을 위해 저장하였다.
28일: 그룹 4의 5마리 접종된 새들 (BP4)은 무작위 표에 따라 선택되었고 심장 천자로 채혈하였고 종결하였다. 혈액 샘플을 풀링하였고, 분취액은 접종원으로 사용하였으며, 나머지는 바이러스 회수를 검증하기 위해 버피 코트 추출 (BCE)을 위한 분석에 전달하였다. BCE의 분취액은 향후 분자 분석을 위해 저장하였다. 20마리의 1일령 SPF 병아리는 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해, 그룹 5로 지정하였다. 15마리의 1일령 SPF 병아리는 BP5로 지정하였고 G4로부터의 0.25 mL의 풀링된 혈액 (BP4)을 접종하였다. 접촉자는 미처치된 채로 남겨두었다. 그룹 5의 모든 새들은 무작위 표에 따라 식별을 위해 목-밴드를 하였다. BP5 접종하고 접촉된 새들은 동일한 유닛에 함께 사육하였다 (유닛 당 20마리 새). 추가의 21일령 SPF 병아리는 2개 처치, 백신접종자 (15마리 병아리) 및 접촉자 (5마리 병아리)로 무작위 표를 사용해, 그룹 6으로 지정하였다. 15마리 병아리는 백신접종으로 지정하였고 vHVT522-IBD-AI를 백신접종하였다. 접촉자는 미처리된 채로 남겨두었다. 그룹 6의 모든 새들은 무작위 표에 따라 식별을 위해 목-밴드를 하였다. vHVT522-IBD-AI 백신접종되고 접촉된 새들은 동일한 유닛에 함께 사육하였다 (유닛 당 20마리 새). 그룹 2의 접촉자는 날개 채혈하였고, BCE는 바이러스 회수를 검증하기 위해 이들 샘플에 대해 개별적으로 수행되었다. 이들 새는 안락사하지 않았고 샘플채취 이후에 본래 유닛으로 다시 배치하였다. BCE 샘플의 분취액은 분자 분석을 위해 저장하였다. 그룹 1의 모든 나머지 새들은 종결시켰고 부검하여서 마렉병과 연관된 육안 병변에 대해 조사하였다.
35일: 그룹 3의 모든 접촉자는 날개 채혈하였고, BCE는 바이러스 회수를 검증하기 위해서, 이들 샘플에 대해 개별적으로 수행되었다. 이들 새들은 안락사되지 않았고 샘플 채취 후에 본래 유닛으로 다시 배치되었다. BCE의 분취액은 분자 분석을 위해 저장되었다. 그룹 2의 모든 나머지 새들은 종결되었고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변에 대해 조사되었다.
42일: 그룹 5의 5마리 접종된 새들 (BP5), 및 그룹 6의 5마리 백신접종자는 무작위 표에 따라 선택되었고 심장 천자를 통해 채혈하고 종결시켰다. 혈액 샘플을 풀링하였고 바이러스 회수를 검증하기 위해서 버피 코트 추출 (BCE)을 위한 분석에 전달하였다. BCE의 분취액은 향후 유전적 안정성 분석을 위해 저장하였다. 그룹 4의 모든 접촉자는 날개 채혈하였고 BCE는 바이러스 회수를 검증하기 위해 이들 샘플에 대해 개별적으로 수행하였다. 이들 새는 안락사되지 않았고 샘플채취 후 본래 유닛으로 다시 배치되었다. BCE 샘플의 분취액은 분자 분석을 위해 저장되었다. 그룹 3의 모든 나머지 새들을 종결하였고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변을 조사하였다.
49일: 그룹 5 및 6의 모든 접촉자는 날개 채혈하였고, BCE는 바이러스 회수를 검증하기 위해 이들 샘플에 대해 개별적으로 수행되었다. BCE 샘플의 분취액은 분자 분석을 위해 저장하였다. 그룹 4의 모든 나머지 새들은 종결되었고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변에 대해 조사하였다.
77일: 그룹 5 및 6의 모든 나머지 새들은 종결되었고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변에 대해 조사하였다.
연구 디자인
120마리의 1일령 SPF 병아리 (갈루스 도메스티쿠스 (Gallus domesticus) 종), 암컷 및 숫컷을 이 연구에 사용하였다. 연구 디자인은 하기 표 64에 표시된다.
Figure pct00073
시험 백신
백신은 그룹 1의 경우 마렉 희석제에 희석하여 VP2 및 AI 유전자로 결정하여 용량 당 8,280 플라크 형성 유닛 (pfu); HVT로 결정하여 7,480을 산출하였거나; 또는 그룹 6 경우에 VP2 및 AI 유전자로 결정하여 용량 당 9,640 플라크 형성 유닛 (pfu); 또는 HVT로 결정하여 8,680을 산출하였다. 백신은 액체 질소에 저장하였다.
처치
새들은 SQ 경로를 통해서, 1일령에, 역계대 재료가 접종되었거나 또는 1회 백신접종되었다. 모든 백신접종 및 접종은 접종/배치 기록 형태로 기록되었다. 새들은 상기 기재된 시간표에 따라 샘플채취되었다. 새들은 28일 (그룹 1-4) 또는 49일 (그룹 5 및 6) 동안 관찰된 다음에 부검되었다. 마렉의 임상 징후, 폐사율 및 육안 병변 (존재시)은 부검 기록 형태로 기록되었다.
임상 관찰
연구 전반에서, 모든 닭은 그들 전반적 건강 및 웰빙 및 백신에 대한 임의의 부작용에 대해 매일 관찰되었다. 모든 관찰은 연구 로그에 기록되었다. 새들은 부화후 28일 (그룹 1-4), 또는 부화후 49일 (그룹 5 및 6) 까지 마비, 기관차 징후, 및 중증 쇠약 또는 우울증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 마렉병으로 인한 임상 징후에 대해 관찰되었다. 존재한다면, 임상 징후는 부검 기록 형태로 기록되었다.
HVT 회수 - 혈액 샘플용 BCE
혈액 샘플은 개별적으로 취급하였거나 또는 BCE (Buffy Coat Extraction)를 위해 풀링되었다. 각각의 BCE 샘플은 제조된 닭 배아 섬유아세포 (CEF)에 대해 개별적으로 접종되었다. 플레이트는 37℃에서 5일 동안 인큐베이션된 다음에 HVT 세포변성 효과 (CPE)에 대해 검사되었다. CPE 이외에도, 마지막 역계대로부터 단리된 플라크는 특이적 항체로 염색되었다.
결과 및 평가
결과는 하기 표 65-67에 표시된다.
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
고찰/결론
이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5는 안전하였고 생체내 역계대 이후에 병독성으로 되돌아가지 않았다. 백신은 또한 비-백신접종된 접촉자 새에게 확산되지 않았다. 그러나, 연구는 MSV가 아닌 X+5 재료를 사용해 수행되었고 역계대 부분은 MSV로 반복하지 않을 것이다.
실시예 8 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신의 GA22 바이러스, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI)에 대항하여, 1일령 SPF 닭에게 피하로 또는 계란내 투여된, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5의 효능의 평가
이 연구의 목적은 1일령 SPF 병아리에게 피하로 또는 계란내 투여된, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5의 효능을 평가하는 것이었다.
요약
연구 0일에, 그룹 1 및 3에서, 18-19일령 배아, SPF, SPAFAS 무리 T41은 백신접종 또는 모의-백신접종되었다. 그룹 2 및 4의 배아 (그룹 당 ∼46 배아)는 임의의 처치를 받지 않고 인큐베이션되었다. 그룹 1의 배아는 0.05 mL의 vHVT522-IBD-AI, X+5가, 2,330AI/VP2로, 그리고 2,180 pfu/0.05 mL 용량의 HVT가 계란내 백신접종되었다. 접종된 배아는 다시 습도-제어된 인큐베이터에 배치되었다. 백신접종 및 모의 백신접종 이후에, 그룹 1의 배아를 인큐베이션하였고 그룹 2-4에서 개별적으로 부화되었다. 연구 3일에, 무작위 표를 사용하여, 그룹 1-3의 살아있는, 부화된 병아리로부터 무작위로 35마리 새, 및 그룹 4로부터 25마리를 선택하였다. 그룹 1-4로부터 130마리의 1일령 SPF 닭이 격리 유닛에 지정되었고 무작위 표에 따라 번호표시된 밴드를 하였다. 그룹 1, 3, 및 4의 모든 새들은 임의의 처치를 받지 않고 격리 유닛에 배치되었다. 그룹 2의 새들은 0.2 mL의 vHVT522-IBD-AI, X+5가, 2,280 AI/VP2로, 2,070 pfu/0.2 mL 용량의 HVT가 피하 (SQ)로 백신접종되었다. 모든 새들은 배치 전에 개체 식별을 위해 목 밴드를 하였다. 연구 7일에, 그룹 1-3의 모든 새들 (5일령)은 새 당 0.2 mL로, 복강내 경로를 통해서, vMDV GA22가 27,600 세포/0.2 mL 용량으로 챌린지되었다. 연구 7일 내지 52일 사이에, 모든 새들은 챌린지에 대한 임의의 불리한 반응에 대해 매일 관찰되었다. 연구 52일에, 모든 나머지 새들을 종결시켰고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변을 조사하였다. 이 시험 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5가 백신접종된, 그룹 1 및 2의 새들은 vMDV에 대항한 보호에 대한 허용 기준을 충족하였다. 바이러스 병독성은 그룹 3에서 관찰된 감염성으로 확인하였다. 최소 보호 용량은 SQ 경로로 투여했을 때 1일령 닭의 경우 2,070 pfu/0.2 mL 용량, 및 계란내 경로로 투여시 2,180 pfu/0.05 mL 용량으로 확립되었다.
사건 일정
0일: 그룹 1 및 4의 18일령 내지 19일령 배아는 백신접종 또는 모의-백신접종되었다. 그룹 2 및 3의 배아 (∼90 배아)는 임의 처치를 받지 않고 인큐베이션되었고, 그룹 4의 배아는 마렉병 백신 희석제 단독으로 모의 접종되었다. 접종된 배아는 습도-제어 인큐베이터에 다시 배치되었다. 백신접종 및 모의 백신접종 이후에, 그룹 2-4의 배아를 인큐베이션하였고 그룹 1로부터 개별적으로 부화시켰다.
3일: 무작위 표를 사용하여, 그룹 1-3의 살아있는, 부화된 병아리로부터 부작위로 35마리, 및 그룹 4로부터 25마리를 선택하였다. 그룹 1-4의 130마리의 1일령 SPF 닭을 격리 유닛에 지정하였고 무작위 표에 따라 번호표시 밴드를 하였다. 11마리 내지 13마리 새들을 격리 유닛 당 지정하였다 (그룹 1-3 경우 3 유닛; 및 그룹 4 경우 2 유닛). 그룹 1, 3, 및 4의 모든 새들은 임의의 처치를 받지 않고 격리 유닛에 배치하였다. 그룹 2의 새들은 SQ 백신접종되었다. 모든 새들은 배치 전에 개체 식별을 위해 목 밴드를 하였다.
7일: 그룹 1-3의 모든 새들 (5일령)은 하기 기술된 대로 챌린지하였다.
7일-52일: 새들은 챌린지에 대한 임의의 불리한 반응에 대해 매일 관찰되었다.
52일: 새들을 종결시켰고 부검하여 마렉병과 연관된 육안 병변을 조사하였다.
연구 디자인
210개 배아/130마리 1일령 SPF 병아리 (갈루스 도메스티쿠스 종) SPAFAS 무리 T41 암컷 및 숫컷이 이 연구에 사용되었다. 연구 디자인은 하기 표 68에 표시된다.
Figure pct00077
시험 백신
백신은 마렉 희석제에 희석하여서 VP2 및 AI 유전자로 결정하여 용량 당 2,330 플라크 형성 유닛 (pfu); 또는 계란내 백신접종을 위해 HVT로 결정하여 2,180을 산출하였다. SQ 백신접종을 위해서, 백신은 마렉 희석제에 희석하여서 VP2 및 AI 유전자로 결정하여 용량 당 2,280 pfu; 또는 HVT로 결정하여 2,070을 산출하였다. 백신은 액체 질소에 저장하였다. 대조 제품 (CP)은 마렉병 백신 희석제 (모의 백신)였다. 챌린지 재료는 병독성 마렉병 바이러스 (vMDV), 단리주 GA22였다.
처치
그룹 1-3의 새들은 vHVT522-IBD-AI, 또는 마렉 희석제로, 1일령에 SQ 경로를 통해서 또는 계란내 경로 (18-19일의 배아)를 통해서 1회 백신접종 또는 모의 백신접종되었다. 새들은 연구 3일에 목-밴드를 하였고, 그룹 1-3은 연구 7일에 챌린지되었다. 모든 새들은 연구 52일까지 관찰되었고, 모든 나머지 새들은 실험 기간의 종료 시에 부검되었다.
임상 관찰
연구 전반에서, 모든 닭은 그들 전반적 건강 및 웰빙 및 백신에 대한 임의의 부작용에 대해 매일 관찰되었다. 모든 관찰은 연구 로그에 기록되었다. 관찰 기간 (연구 52일)의 종료 시에, 모든 나머지 새들은 안락사시켰고 부검하였고 마렉병의 육안 병변을 조사하였다. 병변은 하기 장기들을 포함하지만, 이에 제한되지 않았다: 간, 심장, 비장, 생식선, 신장, 피부, 근육 병변 및 신경 비대. 연구의 모들 새들이 부검될 때까지 한번에 1-15마리 새를 부검하기 위해서 3개의 상이한 유닛으로부터 유닛 당 1마리 내지 5마리 새를 선택하였다. 새가 부검되는 유닛의 순서는 무작위 표에 따라서 무작위로 선택되었다. 육안 병변 및 폐사율은 부검 기록 형태로 기록되었다.
결과 및 평가
결과는 하기 표 69-70에 표시된다.
Figure pct00078
Figure pct00079
고찰/결론
이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5로 백신접종된 그룹 1 및 2의 새들은 vMDV에 대한 보호에 대해 허용 기준을 충족하였다. 바이러스 병독성은 그룹 3에서 관찰된 감염성으로 확인되었다. 최소 보호 용량은 SQ 경로로 투여시 1일령 닭의 경우 2,070 pfu/0.2 mL 용량, 및 계란내 경로로 투여시 2,180 pfu/0.05 mL 용량으로 확립되었다.
실시예 9 전염성 활액낭병 바이러스, STC 고전적 균주에 대한, 1일령 SPF 닭에게 피하로 또는 계란내 투여된, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5의 효능의 평가
이 연구의 목적은 1일령 SPF 병아리에게 피하로 또는 18-10일령 배아에 계란내로 투여된, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5의 효능을 평가하는 것이었다.
요약
연구 0일에, 그룹 1 및 3에서, 18-19일령 배아, SPF, SPAFAS 무리 T41은 백신접종 또는 무의 백신접종되었다. 그룹 2의 배아 (그룹 당 75 배아)는 임의의 처치를 받지 않고 인큐베이션되었다. 그룹 1의 배아는 0.05 mL의 vHVT522-IBD-AI, X+5가 2,620 pfu/0.05 용량의 AIV HA 및 IBDV VP2로, 그리고 2,490 pfu/0.05 mL 용량의 HVT가 계란내 백신접종되었다. 백신접종된 배아는 습도-제어 인큐베이터에 다시 배치되었다. 백신접종 및 모의 백신접종 후에, 그룹 1의 배아를 인큐베이션하였고 그룹 2 및 3으로부터 개별적으로 부화되었다. 연구 3일에, 무작위 표를 사용하여 그룹 1-3으로부터 살아있는, 부화된 병아리에서 무작위로 36마리 새를 선택하였다. 그룹 1 및 3의 모든 새들은 임의의 처치를 받지 않고 격리 유닛에 배치되었다. 그룹 2의 새들은 0.2 mL의 vHVT522-IBD-AI, X+5가, 2,170 pfu/0.2 용량의 AIV HA 및 IBDV VP2로, 그리고 1,950 pfu/0,2 mL 용량의 HVT가 피하로 (SQ) 백신접종되었다. 연구 25일에, 무작위 일정을 사용하여 그룹 1-3 경우에 그룹 당 30마리 새 (유닛 당 10마리 새)로 새의 마릿수를 줄였고, 모든 나머지 새들은 안락사하였다. 모든 나머지 새들은 개체 식별을 위해서 목-밴드를 하였다. 연구 31일에, 모든 나머지 새들은 새 당 0.03 mL로, 안구내 경로를 통해서, IBDV-STC, STC EP1, Lot 080116가, 102.7 EID50/0.03 mL 용량으로 챌린지되었다. 연구 32일 내지 35일에, 모든 새들은 챌린지에 대한 임의의 불리한 반응에 대해 매일 관찰되었다. 연구 35일에, 모든 나머지 새들을 안락사시키고 부검하여 육안 활액낭 병변의 존재를 검사하였다. 이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5가 백신접종된, 그룹 1 및 2의 새들은 IBDV-STC에 대한 보호에 대해 허용 기준을 충족하였다. 바이러스 병독성은 그룹 3에서 관찰된 감염성으로 확인되었다. 최소 보호 용량은 9 CFR 113.331(c)(3) 요건에 따라서, SQ 경로로 투여 시 1일령 닭 경우에 2,170 pfu/0.2 mL 용량, 및 계란내 경로로 투여시 2,620 pfu/0.05 mL 용량으로 확립되었다.
사건 일정
0일: 그룹 1 및 3에서 18 내지 19일령 배아는 백신접종 또는 모의 백신접종되었다. 그룹 2의 배아 (75 배아)는 임의의 처치없이 인큐베이션되었다. 모든 배아는 습도-제어 인큐베이터에 다시 배치되었다. 백신접종 및 모의 백신접종 이후에, 그룹 1의 배아를 인큐베이션하였고 그룹 2 및 3으로부터 개별적으로 부화되었다.
3일: 무작위 표를 사용하여 그룹 1-3으로부터 살아있는, 부화된 병아리로부터 부작위로 36마리 새를 선택하였다. 그룹 1-3의 108마리의 1일령 SPF 닭은 격리 유닛에 지정하였다. 12마리 새가 격리 유닛 당 지정되었다 (그룹 당 3 유닛). 그룹 1 및 3의 모든 새들은 연구 3일에 임의의 처치를 받지 않고 격리 유닛에 배치되었다. 그룹 2의 새들은 SQ 백신접종되었다.
25일: 무작위 일정을 사용해 그룹 1-3의 경우 그룹 당 30마리 새 (유닛 당 10마리 새)로 새의 마릿수를 줄였고 모든 나머지 새들은 안락사시켰다. 모든 나머지 새들은 개체 식별을 위해 목-밴드를 하였다.
31일: 모든 나머지 새들은 하기 기술된 대로 챌린지하였다 (28일령).
32일 내지 35일: 모든 새들은 챌린지 후 4일 동안 챌린지에 대한 임의의 불리한 반응에 대해 관찰되었다.
35일: 모든 남은 새들은 안락사하였고 부검하여서 육안 활액낭 병변을 조사하였다.
연구 디자인
225개 배아/108마리 1일령 SPF 병아리 (갈루스 도메스티쿠스 종) SPAFAS 무리 T41 암컷 및 숫컷이 이 연구에 사용되었다. 연구 디자인은 하기 표 71에 표시된다.
Figure pct00080
시험 백신
백신은 마렉 희석제에 희석하여 AIV HA 및 IBDV VP2 유전자로 결정하여 용량 당 2,620 플라크 형성 유닛 (pfu); 또는 계란내 백신접종 경우 HVT로 결정하여 2,490을 산출하였다. SQ 백신접종을 위해서, 백신은 마렉 희석제에 희석하여서 IBD2 및 AIV HA 유전자로 결정하여 용량 당 2,170 pfu; 또는 HVT로 결정하여 1,950 을 산출하였다. 백신은 액체 질소에 저장하였다. 대조 제품 (CP)은 마렉병 백신 희석제 (모의 백신)였다. 챌린지 재료는 전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV-STC) lot 번호 STC EP1, lot 080116으로서, -70℃에 저장되었고 102.7 EID50/0.03 mL 용량 (안내 경로)이었다.
처치
새들은 vHVT522-IBD-AI로 SQ 경로 (1일령)를 통해서 또는 계란내 경로 (18-10일의 배아)를 통해 1회 백신접종되었다. 모든 백신접종은 계란내 백신접종 또는 모의 백신접종을 받은 그룹으로부터 부화/백신접종 기록 형태로 기록되었다 (그룹 1 및 3).
새들은 28일령 (연구 31일)에 챌린지되었다. 챌린지는 비맹검 개인이 챌린지 기록 형태로 기록하였다. 모든 챌린지 새들은 챌린지 후 4일 동안 관찰된 다음에 안락사되어 부검하여서 파브리시우스낭에서 육안 병변의 존재를 조사하였다. 육안 병변 및 폐사율은 IBDV STC 점수 기록 형태로 기록되었다.
임상 관찰
연구 전반에서, 모든 닭은 그들 전반적인 건강 및 웰빙 및 백신 또는 챌린지에 대한 임의의 부작용에 대해 매일 관찰되었다 (32일 내지 35일). 모든 관찰은 연구 로그에 기록되었다.
관찰 기간 (연구 35일)의 종료 시에, 새들은 고전적-STC IBDV 챌린지로 인해 육안 병변을 조사하였다. 연구의 모든 새들이 부검될 때까지, 한번에 1-15마리 새를 부검하기 위해서, 3개의 상이한 유닛으로부터 1 내지 5 마리 새를 선택하였다. 새를 부검한 유닛의 순서는 무작위 표에 따라서 무작위로 선택되었다. 부검 결과는 IBDV-STC 점수 기록 형태로 기록되었다. 이 시험의 목적을 위해서, 육안 병변은 낭주위 부종 및/또는 부종 및/또는 활액낭 조직 내 거시적 출혈을 포함해야 한다. 이들 명시된 병변을 갖는 임의 새는 양성으로 기록되었다.
백신 조성물은 제공되는 실제 용량 (ADG)을 결정하기 위해 5회 적정되었다. 마렉병 바이러스, 전염성 활액낭병 바이러스(VP2) 및 조류 인플루엔자 유전자 (HA) 삽입부를 포함하는 모든 백신 분획에 대해 역가를 결정하였다.
결과 및 평가
결과는 하기 표 72-74에 표시된다.
Figure pct00081
Figure pct00082
고찰/결론
이 시험의 조건 하에서, 조류 인플루엔자-활액낭병-마렉병 백신, H5 혈청형, 혈청형 3, 생 마렉병 벡터 (vHVT522-IBD-AI), X+5가 백신접종된 그룹 1 및 2의 새들은 IBDV-STC에 대한 보호를 위한 허용 기준을 충족하였다. 바이러스 병독성은 그룹 3에서 관찰된 감염성으로 확인하였다. 최소 보호 용량은 SQ 경로로 투여 시 1일령 닭 경우 2,170 pfu/0.2 mL 용량, 및 계란내 경로로 투여 시 2,620 pfu/0.05 mL 용량으로 확립되었다.
상기 기술된 관련 출원, 그에 인용되거나 또는 그들 진행 동안 인용된 모든 문헌 ("출원 인용 문헌"), 출원-인용 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌, 및 본 명세서에서 인용되거나 또는 참조된 모든 문헌 ("본 명세서에서 인용된 문헌"), 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용되거나 또는 참조된 모든 문헌은, 본 명세서에서 언급되거나 또는 본 명세서에서 참조로 편입한 임의 문헌에서 언급되는 임의 제품에 대한 제조사 설명서, 지침, 제품 사양, 및 제품 시트와 함께 참조로 본 명세서에 편입되고, 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다. 보다 특히, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 특별히 개별적으로 참조로 편입된다고 표시된 바와 동일한 정도로 참조로 편입된다.
따라서 본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 설명하였지만, 상기 단락에서 정의되는 본 발명은 본 발명의 정신 또는 범주를 벗어나지 않고 이의 많은 분명한 변동이 가능하므로 상기 설명에 기술된 특정 상세사항에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH USA INC. <120> RECOMBINANT HVT VECTORS EXPRESSING INFLUENZA HEMAGGLUTININ AND IMMUNOGENIC COMPOSITIONS, AND PRODUCTION AND USES THEREOF <130> BI20-AH022-WO-1 <140> <141> <150> 63/040,411 <151> 2020-06-17 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 cgaacaaact tcatcgctat gc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 taactcaaat gcgaagcgtt gc 22 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 aactccgccc gttttatg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 tcgactctag aggatccg 18 <210> 5 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ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 9360 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 9420 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 9480 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 9540 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 9600 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 9660 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 9720 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 9780 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 9840 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 9900 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 9960 catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 10020 ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 10080 atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 10140 tatgcggcga 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80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala 130 135 140 Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser 165 170 175 Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn 180 185 190 Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val 195 200 205 Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln 210 215 220 Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly 245 250 255 Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr 260 265 270 Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn 275 280 285 Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu 290 295 300 Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro 305 310 315 320 Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr 340 345 350 Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser 355 360 365 Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met 370 375 380 Ala Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg 385 390 395 400 Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val 405 410 415 Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile 420 425 430 Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile 435 440 445 Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser 450 455 460 Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg 465 470 475 480 Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr 485 490 495 Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu 500 505 510 Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys 515 520 525 Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu 530 535 540 Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala 545 550 <210> 54 <211> 5913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 54 taactcaaat gcgaagcgtt gcacgtctgc gataactacg cctactatgc acattgttac 60 tcctgcatct taaaaatata tcctgtagta attttcacag caatgtcata acatcatctc 120 gctaaagaat gacctgggat tggagaagta atgaatattt gcaaccaatg cattgaataa 180 actaacatta aacgaattca ctagtggatc ccccaactcc gcccgtttta tgactagaac 240 caatagtttt taatgccaaa tgcactgaaa tcccctaatt tgcaaagcca aacgccccct 300 atgtgagtaa tacggggact ttttacccaa tttcccaagc ggaaagcccc ctaatacact 360 catatggcat atgaatcagc acggtcatgc actctaatgg cggcccatag ggactttcca 420 catagggggc gttcaccatt tcccagcata ggggtggtga ctcaatggcc tttacccaag 480 tacattgggt caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca agcacactga 540 gtcaaatggg actttccact gggttttgcc caagtacatt gggtcaatgg gaggtgagcc 600 aatgggaaaa acccattgct gccaagtaca ctgactcaat agggactttc caatgggttt 660 ttccattgtt ggcaagcata taaggtcaat gtgggtgagt caatagggac tttccattgt 720 attctgccca gtacataagg tcaatagggg gtgaatcaac aggaaagtcc cattggagcc 780 aagtacactg cgtcaatagg gactttccat tgggttttgc ccagtacata aggtcaatag 840 gggatgagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca ctgactcaat agggactttc 900 cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga gtcaacagga aagtcccatt 960 ggagccaagt acattgagtc aatagggact ttccaatggg ttttgcccag tacataaggt 1020 caatgggagg taagccaatg ggtttttccc attactggca cgtatactga gtcattaggg 1080 actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc 1140 ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa 1200 aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa 1260 taggggtgag tcattgggtt tttccagcca atttaattaa aacgccatgt actttcccac 1320 cattgacgtc aatgggctat tgaaactaat gcaacgtgac ctttaaacgg tactttccca 1380 tagctgatta atgggaaagt accgttctcg agccaataca cgtcaatggg aagtgaaagg 1440 gcagccaaaa cgtaacaccg ccccggtttt cccctggaaa ttccatattg gcacgcattc 1500 tattggctga gctgcgttct acgtgggtat aagaggcgcg accagcgtcg gtaccgtcgc 1560 agtcttcggt ctgaccaccg tagaacgcag agctcctcgc tgcaggcggc cgcatgggct 1620 ccaaaccttc taccaggatc ccagcacctc tgatgctgat cacccggatt atgctgatat 1680 tgggctgtat ccgtccgaca agctctcttg acggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg 1740 tagtaacagg agataaggca gtcaatgtat acacttcgtc tcagacaggg tcaatcatag 1800 tcaagttgct cccgaatatg cccagggata aggaggcgtg tgcaaaagcc ccattagagg 1860 catataacag aacactgact actttgctca ctcctcttgg cgactccatc cgcaagatcc 1920 aagggtctgt gtccacatct ggaggaggca agcaaggccg cctgataggt gctgttattg 1980 gcagtgtagc tcttggggtt gcaacagcgg cacagataac agcagctgcg gccctaatac 2040 aagccaacca gaatgccgcc aacatcctcc ggcttaagga gagcattgct gcaaccaatg 2100 aagctgtgca tgaagtcacc gacggattat cacaactatc agtggcagtt gggaagatgc 2160 agcagtttgt caatgaccag tttaataata cggcgcgaga attggactgt ataaaaatca 2220 cacaacaggt tggtgtagaa ctcaacctat acctaactga attgactaca gtattcgggc 2280 cacagatcac ctcccctgca ttaactcagc tgaccatcca ggcactttat aatttagctg 2340 gtggcaatat ggattactta ttaactaagt taggtatagg gaacaatcaa ctcagctcgt 2400 taattggtag cggcctgatc actggttacc ctatactgta tgactcacag actcaactct 2460 tgggcataca agtgaattta ccctcagtcg ggaacttaaa taatatgcgt gccacctatt 2520 tggagacctt atctgtaagt acaaccaaag gatatgcctc agcacttgtc ccgaaagtag 2580 tgacacaagt cggttccgtg atagaagagc ttgacacctc atactgtata gagtccgatc 2640 tggatttata ttgtactaga atagtgacat tccccatgtc cccaggtatt tattcctgtt 2700 tgagcggcaa cacatcagct tgcatgtatt caaagactga aggcgcactc actacgccgt 2760 atatggccct taaaggctca gttattgcca attgtaaaat aacaacatgt agatgtacag 2820 accctcctgg tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt atccctgata gatagacatt 2880 cgtgcaatgt cttatcatta gacgggataa ctctaaggct cagtggggaa tttgatgcaa 2940 cttatcaaaa gaacatctca atactagatt ctcaagtcat cgtgacaggc aatcttgata 3000 tatcaactga acttggaaac gtcaacaatt caatcagcaa tgccttggat aggttggcag 3060 aaagcaacag caagctagaa aaagtcaatg tcagactaac cagcacatct gctctcatta 3120 cctatattgt tctaactgtc atttctctag ttttcggtgc acttagtctg gtgttagcgt 3180 gttacctgat gtacaaacag aaggcacaac aaaagacctt gctatggctt gggaataata 3240 ccctcgatca gatgagagcc actacaagag catgagcggc cccccccccc ccctaacgtt 3300 actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 3360 atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 3420 attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 3480 gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 3540 cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 3600 acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 3660 gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 3720 cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 3780 ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat 3840 gataatacca tggagaaaat agtgcttctt cttgcaatag tcagtcttgt taaaagtgat 3900 cagatttgca ttggttacca tgcaaacaac tcgacagagc aggttgacac aataatggaa 3960 aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac atactggaaa agacacacaa cgggaagctc 4020 tgcgatctag atggagtgaa gcctctaatt ttgagagatt gtagtgtagc tggatggctc 4080 ctcggaaacc ctatgtgtga cgaattcatc aatgtgccgg aatggtctta catagtggag 4140 aaggccagtc cagccaatga cctctgttac ccaggggatt tcaacgacta tgaagaactg 4200 aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt gagaaaattc agatcatccc caaaagttct 4260 tggtccaatc atgaagcctc atcaggggtg agctcagcat gtccatacca ggggaagtcc 4320 tcctttttca gaaatgtggt atggcttatc aaaaagaaca gtgcataccc aacaataaag 4380 aggagctaca ataataccaa ccaagaagat cttttggtac tgtgggggat tcaccatcct 4440 aatgatgcgg cagagcagac aaagctctat caaaacccaa ccacctatat ttccgttggg 4500 acatcaacac taaaccagag attggtacca aaaatagcta ctagatccaa agtaaacggg 4560 caaagtggaa gaatggagtt cttctggaca attttaaagc cgaatgatgc tatcaacttc 4620 gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa tatgcataca aaattgtcaa gaaaggggac 4680 tcagcaatta tgaaaagtga attggaatat ggtaactgca acaccaaatg tcaaactcca 4740 atgggggcga taaactctag tatgccattc cacaacatac accctctcac catcggggaa 4800 tgccccaaat atgtgaaatc aaacagatta gtccttgcga cagggctcag aaatagccct 4860 caaagagaga caagaggact atttggagct atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag 4920 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg agcaggggag tggatacgct 4980 gcagacaaag aatccactca aaaggcaata gatggagtca ccaataaggt caactcgatc 5040 attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaaagg 5100 agaatagaga atttaaacaa gaagatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 5160 gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag agaactctag acttccatga ctcaaatgtc 5220 aagaaccttt acgacaaggt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaac 5280 ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaacgga 5340 acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa gcaagactaa agagagagga aataagtgga 5400 gtaaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 5460 tccctagcac tggcaatcat ggtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatggatcg 5520 ttacaatgca gaatttgcat ttaagcggcc gcatcggatc ccggggcggc cgcggggatc 5580 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 5640 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 5700 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 5760 gggaggtttt ttcggatcct ctagacctgc agggtcgaca attattttat ttaataacat 5820 atagcccaaa gacctctatg aacatttagt ttcccgtata ctcaacggcg cgtgtacaca 5880 cgcatctctt tgcatagcga tgaagtttgt tcg 5913

Claims (41)

  1. 칠면조의 헤르페스바이러스 (rHVT); 마렉병 바이러스; 또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스로부터 선택되는 사전결정된 바이러스로부터 유래된 적어도 하나의 핵산 서열;
    재조합 바이러스 벡터가 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원을 생체내에서 발현되게 하는 조류 인플 루엔자 바이러스 유래 제1 외생성 핵산 서열; 및
    조류 질환의 적어도 하나의 항원을 코딩하고 생체내에서 발현하는 조류 질환 유래의 제2 외생성 핵산 서열
    을 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 사전결정된 바이러스는 마렉병 바이러스 혈청형 3을 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 사전결정된 바이러스는 마렉병 바이러스 균주 FC-126을 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 조류 인플루엔자는 아형 H5인 재조합 바이러스 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 제1 외생성 핵산 서열은 코돈 최적화되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 제2 외생성 핵산 서열은 전염성 활액낭병 바이러스 항원, 뉴캐슬병항원, 또는 전염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 항원을 코딩하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 제2 외생성 핵산 서열은 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원 또는 뉴캐슬병 F 항원을 코딩하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 제1 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 제2 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 유전자간 I (IG1) 부위로 삽입을 위한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 통해 구축되는 것인 재조합 바이러스 벡터.　
  9. 제1항에 있어서, AIV H5 HA 단백질을 코딩하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 더 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터에서 사용되는 AIV HA COBRA-C 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터의 IBDV VP2 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터의 NDV-F 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  13. 제1항의 재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법으로서, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 제1 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 제2 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 HVT 유전자간 1 (IG1) 부위로 삽입을 위한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 포함하는 것인 제조 방법.
  14. 제1항의 재조합 바이러스 벡터 및 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.　
  15. 제14항에 있어서, 사전결정된 바이러스는 조성물을 조류에게 투여했을 때, 마렉병 바이러스 및/또는 전염성 활액낭병 바이러스 및/또는 조류 인플루엔자에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 조성물.
  16. 마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자, 및 전염성 활액낭병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 제1항의 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 또는 제14항의 조성물의 유효량을 조류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 유도 방법.
  17. 외생성 조류 인플루엔자 바이러스 HA 항원, 및
    뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자
    를 포함하고 생체내에서 발현하는 재조합 바이러스 벡터.
  18. 제1항 또는 제17항에 있어서, 조류 인플루엔자는 아형 H5인 재조합 바이러스 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자는 코돈 최적화되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  20. 제17항에 있어서, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 유전자간 1 (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 통해 구축되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  21. 제17항의 재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법으로서, IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 유전자간 1 (IG1) 부위에 대한 삽입 플라스미드 및 사전결정된 바이러스로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 방법을 포함하는 것인 제조 방법.
  22. 제13항 또는 제21항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  23. 제21항의 재조합 바이러스 벡터 및 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.　
  24. 제23항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 조성물을 조류에게 투여했을 때, 마렉병 바이러스 및/또는 조류 인플루엔자 바이러스 및/또는 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 조성물.
  25. 제14항 또는 제23항에 있어서, 조류는 닭, 거세닭, 오리, 거위, 칠면조, 꿩, 뇌조, 메추라기, 백조, 새끼 비둘기, 또는 비둘기인 조성물.
  26. 제14항 또는 제23항에 있어서, 조류는 닭인 조성물.
  27. 마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자 및 뉴캐슬병 바이러스에 대항하여 조류에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 제17항의 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 또는 제23항의 조성물의 유효량을 조류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 유도 방법.　
  28. 제16항 또는 제27항에 있어서, 조류는 닭, 거세닭, 오리, 거위, 칠면조, 꿩, 뇌조, 메추라기, 백조, 새끼 비둘기, 또는 비둘기인 유도 방법.　
  29. 제16항 또는 제27항에 있어서, 조류는 닭인 유도 방법.
  30. IG1 영역 유래 서열이 측접된, 전염성 활액낭병 바이러스 VP2 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 사전결정된 바이러스의 유전자간 1 (IG1) 부위로 삽입을 위한 플라스미드.
  31. IG1 영역 유래 서열이 측접된, 마우스 CMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 F 항원을 코딩하는 외생성 핵산 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 조류 인플루엔자 HA를 코딩하는 외생성 핵산 서열 및 SV40 폴리A 꼬리부를 포함하는 사전결정된 바이러스의 유전자간 1 (IG1) 부위로 삽입을 위한 플라스미드.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 조류 인플루엔자는 아형 H5인 플라스미드.
  33. 제30항 또는 제31항에 있어서, 조류 인플루엔자 HA 항원을 코딩하는 외생성 핵산 분자는 코돈 최적화되는 것인 플라스미드.
  34. 제21항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터에서 사용되는 AIV HA COBRA-C 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  35. 제21항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터의 IBDV VP2 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  36. 제21항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터의 NDV-F 유전자에 대한 아미노산 서열은 사전 결정된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  37. 마렉병 혈청형　3 (MDV-3) 또는 멜레아그리드 헤르페스바이러스 1 (MeHV-1)로부터 선택되는 사전결정된 바이러스;
    합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질 유전자를 코딩하고 발현하는 적어도 하나의 조류 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오티드; 및
    전염성 활액낭병 바이러스 (IBDV) 캡시드 단백질 (VP2), 또는
    뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F)
    중 적어도 하나를 포함하는 조류 병원체의 적어도 하나의 항원을 코딩하고 발현하는 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 재조합 바이러스 벡터; 및
    약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클, 또는 보강제
    를 포함하는 조성물 또는 백신.
  38. 제37항에 있어서, 적어도 하나의 조류 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오티드는 AIV H5 HA 기준 서열과 적어도 80%, 90%, 92%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물 또는 백신.
  39. 제37항에 있어서, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드는 사전결정된 기준 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 85%, 90%, 92%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 것인 조성물 또는 백신.
  40. 제37항에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질은 AIV 기준 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩되고, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F)을 포함하고 NDV-F 기준 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며, 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 보강제를 더 포함하는 것인 조성물 또는 백신.
  41. 제37항에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스 A (아형 H5)의 합성 헤마글루티닌 (HA) 단백질은 AIV 기준 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해 코딩되고, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드는 IBDV VP2 단백질을 포함하고 IBDV VP2 기준 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며, 조성물 또는 백신은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 보강제를 더 포함하는 것인 조성물 또는 백신.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11596687B2 (en) 2016-06-17 2023-03-07 Intervet Inc. Recombinant non-pathogenic Marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and infectious bursal disease virus antigens
WO2019072964A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Intervet International B.V. RECOMBINANT NON-PATHOGENIC MAREK DISEASE VIRUS CONSTRUCTS ENCODING MULTIPLE HETEROLOGOUS ANTIGENS
WO2025046413A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Ndv aiv vectors and uses thereof
CN118325855B (zh) * 2024-06-12 2024-09-20 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 表达h9n2亚型aiv ha和ibdv vp2基因的重组马立克氏病病毒株及其构建方法和应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US5965138A (en) 1985-09-06 1999-10-12 Syntro Corporation Recombinant chimeric virus and uses thereof
US5961982A (en) 1985-09-06 1999-10-05 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
EP0256092B1 (en) 1986-01-27 1998-04-08 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
EP0794257B1 (en) 1986-01-27 2006-10-18 Schering-Plough Ltd. Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino aced sequence and vaccine containing same
JP2779447B2 (ja) 1988-03-20 1998-07-23 財団法人阪大微生物病研究会 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
US5853733A (en) 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US6183753B1 (en) 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
FR2728794B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
US6299882B1 (en) 1999-04-09 2001-10-09 Schering Corporation UL54.5 of Marek's disease virus (MDV)
US6764684B2 (en) 2001-09-28 2004-07-20 Zeon Corporation Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine
US6866852B2 (en) 2002-01-31 2005-03-15 Zeon Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof
BRPI0913216A2 (pt) 2008-06-23 2016-01-19 Intervet Int Bv uso de um herpesvírus recombinante de perus, e, herpesvírus recombinante de perus.
CN103874508A (zh) 2011-10-21 2014-06-18 英特维特国际股份有限公司 提供多价免疫的重组非致病性mdv载体
EP2785373B1 (en) * 2011-11-30 2019-11-20 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9114108B2 (en) 2011-11-30 2015-08-25 Merial, Inc. Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP2644702A1 (en) 2012-03-30 2013-10-02 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant avian herpes virus and vaccine for immunizing avian species
AR097029A1 (es) 2013-07-26 2016-02-17 Intervet Int Bv Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune
EP2845904A1 (en) 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
CA2970163A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Oregon Health & Science University Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian h5n1 influenza
AR103245A1 (es) 2014-12-24 2017-04-26 Intervet Int Bv Vacuna vectorial basada en hvt (herpes virus de los pavos) frente a nd (enfermedad de newcastle) - ibd (enfermedad de gumboro) mejorada
CA2986701A1 (en) * 2015-06-09 2016-12-15 Sanofi Pasteur, Inc. Methods of optimizing nucleotide sequences encoding engineered influenza proteins
EP3854415A1 (en) * 2016-12-14 2021-07-28 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Recombinant hvt vectors expressing multiple antigens of avian pathogens, and vaccines comprising them
EP3391903B1 (en) * 2017-04-21 2022-02-23 The Pirbright Institute Recombinant gallid herpesvirus 3 vaccines encoding heterologous avian pathogen antigens

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