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KR20210124265A - Enpp1 억제제 및 면역 반응을 조정하는 방법 - Google Patents

Enpp1 억제제 및 면역 반응을 조정하는 방법 Download PDF

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KR20210124265A
KR20210124265A KR1020217025752A KR20217025752A KR20210124265A KR 20210124265 A KR20210124265 A KR 20210124265A KR 1020217025752 A KR1020217025752 A KR 1020217025752A KR 20217025752 A KR20217025752 A KR 20217025752A KR 20210124265 A KR20210124265 A KR 20210124265A
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KR
South Korea
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substituted
compound
alkyl
cancer
alkoxy
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217025752A
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English (en)
Inventor
링인 리
마크 스미쓰
재컬린 앤 카로자
볼커 뵈너트
Original Assignee
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티, 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 filed Critical 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

ENPP1의 억제를 위한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 본 방법의 측면은 샘플을 ENPP1 억제제 화합물과 접촉시켜 ENPP1의 cGAMP가수분해 활성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 세포 불투과성이다. ENPP1 억제제 화합물은 세포외로 작용하여 cGAMP의 분해를 차단할 수 있다. 또한 암을 치료하기 위한 제약 조성물 및 방법이 제공된다. 방법의 측면은 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 억제제를 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 특정 경우에, 암은 고형 종양 암이다. 또한 대상체에게 ENPP1 억제제를 투여하는 것과 함께 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 방법이 제공된다. 방사선 요법은 본 방법에서 대상체에 대한 방사선 손상을 감소시키지만, 면역 반응은 여전히 유발하는데 효과적인 선량 및/또는 빈도로 투여될 수 있다.

Description

ENPP1 억제제 및 면역 반응을 조정하는 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 2월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/800,283 및 2019년 3월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/814,745에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
미국 정부의 권리
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 계약 CA190896 및 CA228044 및 미국 국방부에 의해 수여된 계약 W81XWH-18-1-0041 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
서론
시클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트 (cGAMP)는 중요한 항암 선천성 면역 경로인 인터페론 유전자의 자극인자 (STING) 경로를 활성화시킨다. cGAS-cGAMP-STING 경로는 미생물 감염 또는 암 및 자가면역 장애를 포함한 병리-생리학적 상태로 인해 세포질 DNA의 존재 하에 활성화된다. 시클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS)는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제 패밀리에 속하고, 시토졸 dsDNA에 결합 시 활성화되어 신호전달 분자 (2'-5', 3'-5') 시클릭 GMP-AMP (또는 2', 3'-cGAMP 또는 시클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트, cGAMP)를 생산하는 보편적인 DNA 센서이다. 미생물 감염 동안 제2 메신저로서 작용하여, 2', 3'-cGAMP는 STING에 결합하고 이를 활성화시켜, 제I형 인터페론 (IFN) 및 면역 반응을 촉발하는 다른 공동-자극 분자의 생산을 유도한다. 감염성 질환에서의 그의 역할 이외에도, STING 경로는 암 면역요법 및 자가면역 질환에 대한 표적으로서 부상하였다.
엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 1 (ENPP1)은 cGAMP를 분해할 수 있는 cGAMP의 우세한 히드롤라제이다. ENPP1은 엑토-뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 (ENPP) 패밀리의 구성원이고, 2개의 동일한 디술피드-결합된 서브유닛을 포함하는 유형 II 막횡단 당단백질이다. ENPP1은 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 피로포스페이트 결합을 비롯한 다양한 기질을 절단하는 광범위한 특이성을 갖는다. ENPP1은 뉴클레오시드 5' 트리포스페이트를 그의 상응하는 모노포스페이트로 가수분해하는 기능을 할 수 있고, 또한 디아데노신 폴리포스페이트를 가수분해할 수 있다.
ENPP1의 억제를 위한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 본 방법의 측면은 샘플을 ENPP1 억제제 화합물과 접촉시켜 ENPP1의 cGAMP 가수분해 활성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 세포 불투과성이다. ENPP1 억제제 화합물은 세포외로 작용하여 cGAMP의 분해를 차단할 수 있다. 또한 암을 치료하기 위한 제약 조성물 및 방법이 제공된다. 방법의 측면은 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 억제제를 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 특정 경우에, 암은 고형 종양 암이다. 또한 대상체에게 ENPP1 억제제를 투여하는 것과 함께 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 방법이 제공된다. 방사선 요법은 본 방법에서 대상체에 대한 방사선 손상을 감소시키지만, 면역 반응은 여전히 유발하는데 효과적인 선량 및/또는 빈도로 투여될 수 있다.
개시내용의 이들 및 다른 이점 및 특색은 하기에서 보다 충분히 기재된 조성물 및 사용 방법의 세부사항을 읽으면 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해된다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 1개의 도면을 포함한다. 관례에 따라, 도면의 다양한 특색부는 척도에 맞지 않음이 강조된다. 오히려, 다양한 특색부의 치수는 명확성을 위해 임의로 확대 또는 축소된다. 하기 도면이 도면부에 포함된다. 하기 기재된 도면은 단지 예시 목적을 위한 것으로 이해된다. 도면은 어떠한 방식으로도 본 교시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1, 패널 a 내지 j는 cGAMP가 293T cGAS ENPP1-/- 세포로부터 가용성 인자로서 유출된다는 것을 입증하는 실험 결과를 보여준다.
도 2, 패널 a 내지 c는 ENPP1이 세포외 cGAMP를 조절할 수 있다는 것을 입증하는 실험 결과를 보여준다.
도 3, 패널 a 내지 f는 예시적인 ENPP1 억제제 (화합물 1)의 구조 및 다양한 세포 검정에서의 활성을 예시한다.
도 4, 패널 a 내지 e는 암 세포가 cGAS를 발현하고 배양물에서 cGAMP를 연속적으로 유출한다는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 5, 패널 a 내지 i는 세포외 cGAMP의 격리가 종양-연관 수지상 세포를 종양 cGAS 및 숙주 STING 의존성 방식으로 감소시킨다는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 6, 패널 a 내지 d는 ENPP1-/- 종양이 선천성 면역 침윤을 동원하고, 덜 공격적이고, IR 및 항-CTLA-4 (세포독성 T-림프구-연관 항원 4) 요법에 보다 감수성이라는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 7, 패널 a 내지 c는 ENPP1 억제가 IR 처리 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 항종양 효과를 발휘한다는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 8, 패널 a 내지 d는 ENPP1 가수분해 활성 및 cGAMP 수준을 평가하기 위한 LC-MS/MS 방법 및 293T cGAS ENPP1저 및 293T cGAS ENPP1-/- 세포주의 사용을 예시한다.
도 9, 패널 a 내지 b는 세포외 cGAMP에 대한 CD14+ 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 반응을 예시하는 실험 개략도 및 결과를 보여준다.
도 10, 패널 a 내지 b는 화합물 1 및 화합물 QS1의 ENPP1 억제 활성을 비교하고, 세포 검정에서의 QS1 활성을 보여주는 실험 결과를 보여준다.
도 11, 패널 a 내지 f는 예시적인 ENPP1 억제제 화합물 1 (STF-1084)이 세포 불투과성이고, ENPP1에 특이적이고, 비독성임을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 12, 패널 a 내지 e는 암 세포가 배양물에서 cGAMP를 연속적으로 유출한다는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 13, 패널 a 내지 d는 세포외 cGAMP의 격리가 종양-연관 수지상 세포를 종양 cGAS 및 숙주 STING 의존성 방식으로 감소시킨다는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 14, 패널 a 내지 f는 확립된 ENPP1-/- 종양이 종양-연관 수지상 세포 증가를 유도하고, 덜 공격적이고, IR 및 항-CTLA-4 요법에 보다 감수성이라는 것을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 15는 ENPP1 억제 (예를 들어, 화합물 1; STF-1084를 사용함)가 IR 처리와 상승작용하여 종양-연관 수지상 세포를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터의 그래프를 보여준다.
도 16은 합성 세포로부터 표적 세포로의 상이한 모드의 cGAMP 전달을 예시하는 개략도를 보여준다.
도 17은 cGAMP가 생체내에서 암 세포에 의해 분비되는 암 위험 신호임을 예시하는 개략도를 보여준다.
도 18a 내지 도 18c는 예시적인 ENPP1 억제제 (화합물 1)가 세포계에 존재하는 세포외 cGAMP의 양을 증가시킬 수 있음을 예시하는 데이터를 보여준다.
도 19a 내지 도 19b는 예시적인 ENPP1 억제제 (화합물 1)가 cGAMP-자극된 인터페론 전사를 증가시킬 수 있음을 예시하는 실험 개략도 및 결과를 보여준다.
도 20a 내지 도 20b는 예시적인 ENPP1 억제제 (화합물 1)가 마우스 종양 모델에서 종양-연관 수지상 세포의 수를 증가시킬 수 있음을 예시하는 데이터를 보여준다.
도 21a 내지 도 21c는 ENPP1 억제가 IR 처리 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 항종양 효과를 발휘한다는 것을 예시하는 실험 결과를 보여준다.
도 22는 ENPP1이 면역전달물질 cGAMP를 조절하는 선천성 면역 체크포인트임을 예시하는 개략도를 보여준다.
본 개시내용의 실시양태가 추가로 기재되기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정한 실시양태로 제한되지 않으며, 따라서 물론 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시양태를 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어 "화합물"에 대한 언급은 단일 화합물 뿐만 아니라 2종 이상의 화합물의 조합을 포함하고, "치환기"에 대한 언급은 단일 치환기 뿐만 아니라 2개 이상의 치환기를 포함하는 등이다.
본 발명을 기재하고 청구하는데 있어서, 특정 용어가 하기 제시된 정의에 따라 사용될 것이다. 본원에 제공된 정의는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않음이 인지될 것이다. 따라서, 일부 화학적 모이어티는 1종을 초과하는 용어의 정의 내에 속할 수 있다.
어구 "예를 들어", "예를 들면", "예컨대", 또는 "포함한"은 보다 일반적인 대상을 추가로 명확하게 하는 예를 도입하기 위한 것으로 의도된다. 이들 예는 단지 개시내용의 이해를 돕기 위한 것으로서 제공되고, 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 논의된 공개는 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 공개를 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 공개 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
용어 "활성제", "길항제", "억제제", "약물" 및 "약리학적 활성제"는 유기체 (인간 또는 동물)에게 투여되는 경우에 국부 및/또는 전신 작용에 의해 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화학적 물질 또는 화합물을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과, 예컨대 종양 부담의 감소를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포괄하는 것으로 의도되고, (a) 질환에 대한 소인이 있지만 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 질환 또는 질환의 증상이 발생하는 것을 예방하는 것 (예를 들어, 원발성 질환과 연관되거나 또는 그에 의해 유발될 수 있는 질환 (만성 HCV 감염과 관련하여 발생할 수 있는 간 섬유증에서와 같음) 포함); (b) 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발생을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것 (예를 들어, 종양 부담의 감소)을 포함한다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 환자, 예컨대 포유동물에게 투여하는 것이 허용되는 염 (주어진 투여 요법에 대해 허용되는 포유동물 안전성을 갖는 반대이온과의 염)을 의미한다. 이러한 염은 제약상 허용되는 무기 또는 유기 염기 및 제약상 허용되는 무기 또는 유기 산으로부터 유도될 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 화합물의 제약상 허용되는 염을 지칭하며, 염은 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유도되고, 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등을 포함하고; 분자가 염기성 관능기를 함유하는 경우에, 유기 또는 무기 산의 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포르메이트, 타르트레이트, 베실레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트 등을 포함한다.
용어 "개체", "숙주", "대상체", 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 원숭이 및 인간을 포함한 인간 및 비-인간 영장류; 래트 및 마우스를 포함한 설치류; 소; 말; 양; 고양이; 개 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동물을 지칭한다. "포유동물"은 임의의 포유동물 종의 구성원 또는 구성원들을 의미하고, 예로서 개; 고양이; 말; 소; 양; 설치류 등 및 영장류, 예를 들어 비-인간 영장류, 및 인간을 포함한다. 비-인간 동물 모델, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 뮤린, 토끼목 등이 실험 조사에 사용될 수 있다.
용어 "결정하는", "측정하는", "평가하는", 및 "검정하는"은 상호교환가능하게 사용되고, 정량적 및 정성적 결정 둘 다를 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 코딩 및 비-코딩 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 용어는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 이종 및 천연 리더 서열을 갖는 융합체; 면역학적으로 태그부착된 단백질; 검출가능한 융합 파트너를 갖는 융합 단백질, 예를 들어 융합 파트너로서 형광 단백질, β-갈락토시다제, 루시페라제 등을 포함하는 융합 단백질 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 제어 영역, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다.
"치료 유효량" 또는 "효과적인 양"은 질환, 상태, 또는 장애를 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여되는 경우에 질환, 상태, 또는 장애에 대한 이러한 치료를 실시하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "치료 유효량"은 화합물, 질환 및 그의 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노피리미딘 화합물)의 미리 결정된 양을 함유한다. 단위 투여 형태에 대한 상세사항은 사용되는 특정한 화합물 및 달성하고자 하는 효과, 및 숙주에서 각각의 화합물과 연관된 약역학에 따라 달라진다.
용어 "제약상 허용되는 부형제", "제약상 허용되는 희석제", "제약상 허용되는 담체", 및 "제약상 허용되는 보조제"는 일반적으로 안전하고, 비-독성이고, 생물학적으로나 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 제약 조성물을 제조하는데 유용한 부형제, 희석제, 담체, 또는 아주반트를 지칭하고, 수의학적 용도 뿐만 아니라 인간 제약 용도를 위해 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 및 보조제를 포함한다. 명세서 및 청구범위에 사용된 "제약상 허용되는 부형제, 희석제, 담체 및 보조제"는 1종 및 1종 초과의 이러한 부형제, 희석제, 담체, 및 보조제 둘 다를 포함한다.
용어 "제약 조성물"은 대상체, 예컨대 포유동물, 특히 인간에게 투여하기에 적합한 조성물을 포괄하는 것으로 의도된다. 일반적으로, "제약 조성물"은 멸균이고, 바람직하게는 대상체 내에서 바람직하지 않은 반응을 도출할 수 있는 오염물이 없다 (예를 들어, 제약 조성물 내의 화합물(들)은 제약 등급임). 제약 조성물은 경구, 협측, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 기관내, 근육내, 피하 등을 포함한 다수의 상이한 투여 경로를 통해 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하기 위해 설계될 수 있다.
어구 "화학식을 갖는" 또는 "구조를 갖는"은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 용어 "포함하는"이 통상적으로 사용되는 것과 동일한 방식으로 사용된다. 용어 "로부터 독립적으로 선택된"은 언급된 요소, 예를 들어 R 기 등이 동일하거나 상이할 수 있음을 나타내기 위해 본원에 사용된다.
용어 "할 수 있다", "임의적인", "임의로", 또는 "임의로 할 수 있다"는 후속적으로 기재되는 상황이 발생할 수 있거나 또는 발생하지 않을 수 있음을 의미하며, 따라서 기재는 상황이 발생하는 경우 및 상황이 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 어구 "임의로 치환된"은 비-수소 치환기가 주어진 원자 상에 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있음을 의미하며, 따라서, 기재는 비-수소 치환기가 존재하는 구조 및 비-수소 치환기가 존재하지 않는 구조를 포함한다.
"아실"은 기 H-C(O)-, 알킬-C(O)-, 치환된 알킬-C(O)-, 알케닐-C(O)-, 치환된 알케닐-C(O)-, 알키닐-C(O)-, 치환된 알키닐-C(O)-, 시클로알킬-C(O)-, 치환된 시클로알킬-C(O)-, 시클로알케닐-C(O)-, 치환된 시클로알케닐-C(O)-, 아릴-C(O)-, 치환된 아릴-C(O)-, 헤테로아릴-C(O)-, 치환된 헤테로아릴-C(O)-, 헤테로시클릴-C(O)-, 및 치환된 헤테로시클릴-C(O)-를 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다. 예를 들어, 아실은 "아세틸" 기 CH3C(O)-를 포함한다.
용어 "알킬"은 반드시는 아니지만 전형적으로 1 내지 약 24개의 탄소 원자를 함유하는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소 기 (즉, 모노-라디칼), 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실 등, 뿐만 아니라 시클로알킬 기, 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 지칭한다. 반드시는 아니지만, 일반적으로 본원에서 알킬 기는 1 내지 약 18개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 이러한 기는 1 내지 약 12개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 기를 의도한다. "치환된 알킬"은 1개 이상의 치환기로 치환된 알킬을 지칭하고, 이는 카르보닐 기에서와 같이 알킬 치환기의 동일한 탄소 원자로부터의 2개의 수소 원자가 대체된 경우를 포함한다 (즉, 치환된 알킬 기는 -C(=O)- 모이어티를 포함할 수 있음). 용어 "헤테로원자-함유 알킬" 및 "헤테로알킬"은 하기에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 적어도 1개의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 알킬 치환기를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "알킬" 및 "저급 알킬"은 각각 선형, 분지형, 시클릭, 비치환된, 치환된, 및/또는 헤테로원자-함유 알킬 또는 저급 알킬을 포함한다.
용어 "치환된 알킬"은 알킬 쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예컨대 -O-, -N-, -S-, -S(O)n- (여기서 n은 0 내지 2임), -NR- (여기서 R은 수소 또는 알킬임)로 임의로 대체되고, 알콕시, 치환된 알콕시, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 히드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로시클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로시클릴, 헤테로시클로옥시, 히드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 -NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기를 갖는 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 R' 및 R"는 동일하거나 상이할 수 있고, 수소, 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릭으로부터 선택된다.
용어 "알케닐"은 적어도 1개의 이중 결합을 함유하는 2 내지 약 24개의 탄소 원자의 선형, 분지형 또는 시클릭 탄화수소 기, 예컨대 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐, 헥사데세닐, 에이코세닐, 테트라코세닐 등을 지칭한다. 또한 반드시는 아니지만, 일반적으로 본원의 알케닐 기는 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 예를 들어 2 내지 12개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 용어 "저급 알케닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자의 알케닐 기를 의도한다. 용어 "치환된 알케닐"은 1개 이상의 치환기로 치환된 알케닐을 지칭하고, 용어 "헤테로원자-함유 알케닐" 및 "헤테로알케닐"은 적어도 1개의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 알케닐을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "알케닐" 및 "저급 알케닐"은 각각 선형, 분지형, 시클릭, 비치환된, 치환된, 및/또는 헤테로원자-함유 알케닐 및 저급 알케닐을 포함한다.
용어 "알키닐"은 적어도 1개의 삼중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 탄화수소 기, 예컨대 에티닐, n-프로피닐 등을 지칭한다. 또한 반드시는 아니지만, 일반적으로 본원의 알키닐 기는 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 이러한 기는 2 내지 12개의 탄소 원자를 추가로 함유할 수 있다. 용어 "저급 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자의 알키닐 기를 의도한다. 용어 "치환된 알키닐"은 1개 이상의 치환기로 치환된 알키닐을 지칭하고, 용어 "헤테로원자-함유 알키닐" 및 "헤테로알키닐"은 적어도 1개의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 알키닐을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "알키닐" 및 "저급 알키닐"은 각각 선형, 분지형, 비치환된, 치환된, 및/또는 헤테로원자-함유 알키닐 및 저급 알키닐을 포함한다.
용어 "알콕시"는 단일의 말단 에테르 연결을 통해 결합된 알킬 기를 지칭하며; 즉, "알콕시" 기는 -O-알킬로서 나타내어질 수 있고, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같다. "저급 알콕시" 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시 기를 지칭하고, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, t-부틸옥시 등을 포함한다. 본원에서 "C1-C6 알콕시" 또는 "저급 알콕시"로서 확인되는 치환기는, 예를 들어, 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 추가의 예로서, 이러한 치환기는 1 또는 2개의 탄소 원자를 함유할 수 있다 (즉, 메톡시 및 에톡시). 명칭 "-OMe" 및 "MeO-"는 메톡시 기를 지칭한다.
용어 "치환된 알콕시"는 치환된 알킬-O-, 치환된 알케닐-O-, 치환된 시클로알킬-O-, 치환된 시클로알케닐-O-, 및 치환된 알키닐-O-기를 지칭하며, 여기서 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 시클로알킬, 치환된 시클로알케닐 및 치환된 알키닐은 본원에 정의된 바와 같다.
용어 "아릴"은, 달리 명시되지 않는 한, 반드시는 아니지만, 일반적으로 5 내지 30개의 탄소 원자를 함유하고, 단일 방향족 고리, 또는 함께 융합되거나, 직접 연결되거나, 또는 간접 연결된 (상이한 방향족 고리가 공통 기, 예컨대 메틸렌 또는 에틸렌 모이어티에 결합되도록 함) 다중 방향족 고리를 함유하는 방향족 치환기를 지칭한다. 아릴 기는, 예를 들어, 5 내지 20개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 추가 예로서, 아릴 기는 5 내지 12개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 아릴 기는 1개의 방향족 고리 또는 2개 이상의 융합된 또는 연결된 방향족 고리 (즉, 비아릴, 아릴-치환된 아릴 등)를 함유할 수 있다. 예는 페닐, 나프틸, 비페닐, 디페닐에테르, 디페닐아민, 벤조페논 등을 포함한다. "치환된 아릴"은 1개 이상의 치환기로 치환된 아릴 모이어티를 지칭하고, 용어 "헤테로원자-함유 아릴" 및 "헤테로아릴"은 하기에 추가로 상세히 기재될 바와 같이, 적어도 1개의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 아릴 치환기를 지칭한다. 아릴은 페닐, 비페닐, 나프틸, 피리딜, 푸릴, 티오페닐, 이미다조일, 피리미디닐, 및 옥사조일로 예시되나 이에 제한되지는 않는, 안정한 시클릭, 헤테로시클릭, 폴리시클릭, 및 폴리헤테로시클릭 불포화 C3-C14 모이어티를 포함하는 것으로 의도되며; 이는 추가로, 히드록시, C1-C8 알콕시, C1-C8 분지쇄 또는 직쇄 알킬, 아실옥시, 카르바모일, 아미노, N-아실아미노, 니트로, 할로겐, 트리플루오로메틸, 시아노, 및 카르복실로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 구성원으로 치환될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Katritzky, Handbook of Heterocyclic Chemistry] 참조). 달리 나타내지 않는 한, 용어 "아릴"은 비치환, 치환, 및/또는 헤테로원자-함유 방향족 치환기를 포함한다.
용어 "아르알킬"은 아릴 치환기를 갖는 알킬 기를 지칭하고, 용어 "알크아릴"은 알킬 치환기를 갖는 아릴 기를 지칭하며, 여기서 "알킬" 및 "아릴"은 상기 정의된 바와 같다. 일반적으로, 본원에서 아르알킬 및 알크아릴 기는 6 내지 30개의 탄소 원자를 함유한다. 아르알킬 및 알크아릴 기는, 예를 들어 6 내지 20개의 탄소 원자를 함유할 수 있고, 추가의 예로서, 이러한 기는 6 내지 12개의 탄소 원자를 함유할 수 있다.
용어 "알킬렌"은 디-라디칼 알킬 기를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 이러한 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 포화 탄화수소 쇄를 포함하며, 이는 치환 또는 비치환될 수 있고, 1개 이상의 지환족 기를 함유할 수 있고, 헤테로원자-함유일 수 있다. "저급 알킬렌"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌 연결을 지칭한다. 예는 메틸렌 (--CH2--), 에틸렌 (--CH2CH2--), 프로필렌 (--CH2CH2CH2--), 2-메틸프로필렌 (--CH2--CH(CH3)--CH2--), 헥실렌 (--(CH2)6--) 등을 포함한다.
유사하게, 용어 "알케닐렌", "알키닐렌", "아릴렌", "아르알킬렌" 및 "알크아릴렌"은 각각 디-라디칼 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 및 알크아릴 기를 지칭한다.
용어 "아미노"는 기 -NRR'를 지칭하며, 여기서 R 및 R'는 독립적으로 수소 또는 비수소 치환기이며, 비수소 치환기는 예를 들어 알킬, 아릴, 알케닐, 아르알킬, 및 그의 치환된 및/또는 헤테로원자-함유 변이체를 포함한다.
용어 "할로" 및 "할로겐"은 클로로, 브로모, 플루오로 또는 아이오도 치환기를 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다.
"카르복실", "카르복시" 또는 "카르복실레이트"는 -CO2H 또는 그의 염을 지칭한다.
"시클로알킬"은 융합, 가교, 및 스피로 고리계를 포함한 단일 또는 다중 시클릭 고리를 갖는 3 내지 10개의 탄소 원자의 시클릭 알킬 기를 지칭한다. 적합한 시클로알킬 기의 예는, 예를 들어 아다만틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로옥틸 등을 포함한다. 이러한 시클로알킬 기는, 예로서, 단일 고리 구조, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로옥틸 등, 또는 다중 고리 구조, 예컨대 아다만타닐 등을 포함한다.
용어 "치환된 시클로알킬"은 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 히드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로시클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로시클릴, 헤테로시클로옥시, 히드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기 또는 1 내지 3개의 치환기를 갖는 시클로알킬 기를 지칭한다.
"헤테로원자-함유 알킬 기" (또한 "헤테로알킬" 기로도 지칭됨) 또는 "헤테로원자-함유 아릴 기" (또한 "헤테로아릴" 기로도 지칭됨)에서와 같은 용어 "헤테로원자-함유"는 1개 이상의 탄소 원자가 탄소 이외의 원자, 예를 들어 질소, 산소, 황, 인 또는 규소, 전형적으로 질소, 산소 또는 황으로 대체된 분자, 연결 또는 치환기를 지칭한다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬"은 헤테로원자-함유 알킬 치환기를 지칭하고, 용어 "헤테로시클로알킬"은 헤테로원자-함유 시클로알킬 치환기를 지칭하고, 용어 "헤테로시클릭" 또는 "헤테로사이클"은 헤테로원자-함유 시클릭 치환기를 지칭하고, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로방향족"은 각각 헤테로원자-함유 "아릴" 및 "방향족" 치환기 등을 지칭한다. 헤테로알킬 기의 예는 알콕시아릴, 알킬술파닐-치환된 알킬, N-알킬화 아미노 알킬 등을 포함한다. 헤테로아릴 치환기의 예는 피롤릴, 피롤리디닐, 피리디닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 푸릴, 피리미디닐, 이미다졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴 등을 포함하고, 헤테로원자-함유 지환족 기의 예는 피롤리디노, 모르폴리노, 피페라지노, 피페리디노, 테트라히드로푸라닐 등이다.
"헤테로아릴"은 고리 내에 1 내지 15개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 10개의 탄소 원자 및 산소, 질소, 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 10개의 헤테로원자의 방향족 기를 지칭한다. 이러한 헤테로아릴 기는 고리계 내에 단일 고리 (예컨대, 피리디닐, 이미다졸릴 또는 푸릴) 또는 다중 축합 고리 (예를 들어 인돌리지닐, 퀴놀리닐, 벤조푸란, 벤즈이미다졸릴 또는 벤조티에닐과 같은 기에서와 같음)를 가질 수 있으며, 여기서 고리계 내의 적어도 1개의 고리는 방향족이며, 단 부착 지점은 방향족 고리의 원자를 통한다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기의 질소 및/또는 황 고리 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥시드 (N→O), 술피닐 또는 술포닐 모이어티를 제공한다. 이 용어는 예로서 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐, 및 푸라닐을 포함한다. 헤테로아릴 치환기에 대한 정의에 의해 달리 제약되지 않는 한, 이러한 헤테로아릴 기는 아실옥시, 히드록시, 티올, 아실, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 시클로알킬, 치환된 시클로알케닐, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아실아미노, 알크아릴, 아릴, 아릴옥시, 아지도, 카르복실, 카르복실알킬, 시아노, 할로겐, 니트로, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로시클릴, 헤테로시클로옥시, 아미노아실옥시, 옥시아실아미노, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴 및 -SO2-헤테로아릴, 및 트리할로메틸로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기 또는 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릭" 및 "헤테로시클릴"은 단일 고리, 또는 융합 가교 및 스피로 고리계를 포함한 다중 축합 고리를 갖고, 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한 3 내지 15개의 고리 원자를 갖는 포화 또는 불포화 기를 지칭한다. 이들 고리 헤테로원자는 질소, 황 및 산소로부터 선택되며, 여기서 융합 고리계에서 고리 중 1개 이상은 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴일 수 있으며, 단 부착 지점은 비-방향족 고리를 통한다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클릭 기의 질소 및/또는 황 원자(들)는 임의로 산화되어 N-옥시드, -S(O)-, 또는 -SO2- 모이어티를 제공한다.
헤테로사이클 및 헤테로아릴의 예는 아제티딘, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 디히드로인돌, 인다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프틸피리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 페난트롤린, 이소티아졸, 페나진, 이속사졸, 페녹사진, 페노티아진, 이미다졸리딘, 이미다졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌린, 프탈이미드, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린, 4,5,6,7-테트라히드로벤조[b]티오펜, 티아졸, 티아졸리딘, 티오펜, 벤조[b]티오펜, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐 (또한 티아모르폴리닐로도 지칭됨), 1,1-디옥소티오모르폴리닐, 피페리디닐, 피롤리딘, 테트라히드로푸라닐 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
헤테로시클릭 치환기에 대한 정의에 의해 달리 제약되지 않는 한, 이러한 헤테로시클릭 기는 알콕시, 치환된 알콕시, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아실옥시, 옥시아미노아실, 아지도, 시아노, 할로겐, 히드록실, 옥소, 티오케토, 카르복실, 카르복실알킬, 티오아릴옥시, 티오헤테로아릴옥시, 티오헤테로시클로옥시, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로시클릴, 헤테로시클로옥시, 히드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2-아릴, -SO2-헤테로아릴, 및 융합 헤테로사이클로부터 선택된 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
"히드로카르빌"은 1 내지 약 30개의 탄소 원자를 함유하고, 1 내지 약 24개의 탄소 원자를 포함하고, 추가로 1 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함하고, 추가로 약 1 내지 12개의 탄소 원자를 포함하고, 선형, 분지형, 시클릭, 포화 및 불포화 종, 예컨대 알킬 기, 알케닐 기, 아릴 기 등을 포함하는 1가 히드로카르빌 라디칼을 지칭한다. 히드로카르빌은 1개 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 용어 "헤테로원자-함유 히드로카르빌"은 적어도 1개의 탄소 원자가 헤테로원자로 대체된 히드로카르빌을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "히드로카르빌"은 치환된 및/또는 헤테로원자-함유 히드로카르빌 모이어티를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
"치환된 히드로카르빌", "치환된 알킬", "치환된 아릴" 등에서와 같은 "치환된"은, 상기 언급된 정의 중 일부에서 암시된 바와 같이, 히드로카르빌, 알킬, 아릴, 또는 다른 모이어티에서, 탄소 (또는 다른) 원자에 결합된 적어도 1개의 수소 원자가 1개 이상의 비-수소 치환기로 대체된 것을 의미한다. 이러한 치환기의 예는, 비제한적으로, 관능기, 및 히드로카르빌 모이어티 C1-C24 알킬 (C1-C18 알킬 포함, 추가로 C1-C12 알킬 포함, 및 추가로 C1-C6 알킬 포함), C2-C24 알케닐 (C2-C18 알케닐 포함, 추가로 C2-C12 알케닐 포함, 및 추가로 C2-C6 알케닐 포함), C2-C24 알키닐 (C2-C18 알키닐 포함, 추가로 C2-C12 알키닐 포함, 및 추가로 C2-C6 알키닐 포함), C5-C30 아릴 (C5-C20 아릴 포함, 및 추가로 C5-C12 아릴 포함), 및 C6-C30 아르알킬 (C6-C20 아르알킬 포함, 및 추가로 C6-C12 아르알킬 포함)을 포함한다. 상기 언급된 히드로카르빌 모이어티는 1개 이상의 관능기 또는 추가의 히드로카르빌 모이어티, 예컨대 구체적으로 열거된 것으로 추가로 치환될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 기 중 임의의 것은 비치환된 기에 더하여 치환된 및/또는 헤테로원자-함유 모이어티를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
"술포닐"은 기 SO2-알킬, SO2-치환된 알킬, SO2-알케닐, SO2-치환된 알케닐, SO2-시클로알킬, SO2-치환된 시클로알킬, SO2-시클로알케닐, SO2-치환된 시클로알케닐, SO2-아릴, SO2-치환된 아릴, SO2-헤테로아릴, SO2-치환된 헤테로아릴, SO2-헤테로시클릭, 및 SO2-치환된 헤테로시클릭을 지칭하며, 여기서 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환된 시클로알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 및 치환된 헤테로시클릭은 본원에 정의된 바와 같다. 술포닐은, 예로서, 메틸-SO2-, 페닐-SO2-, 및 4-메틸페닐-SO2-를 포함한다.
용어 "관능기"는 화학적 기, 예컨대 할로, 히드록실, 술프히드릴, C1-C24 알콕시, C2-C24 알케닐옥시, C2-C24 알키닐옥시, C5-C20 아릴옥시, 아실 (C2-C24 알킬카르보닐 (-CO-알킬) 및 C6-C20 아릴카르보닐 (-CO-아릴) 포함), 아실옥시 (-O-아실), C2-C24 알콕시카르보닐 (-(CO)-O-알킬), C6-C20 아릴옥시카르보닐 (-(CO)-O-아릴), 할로카르보닐 (-CO)-X (여기서 X는 할로임), C2-C24 알킬카르보네이토 (-O-(CO)-O-알킬), C6-C20 아릴카르보네이토 (-O-(CO)-O-아릴), 카르복시 (-COOH), 카르복실레이토 (-COO-), 카르바모일 (-(CO)-NH2), 일치환된 C1-C24 알킬카르바모일 (-(CO)-NH(C1-C24 알킬)), 이치환된 알킬카르바모일 (-(CO)-N(C1-C24 알킬)2), 일치환된 아릴카르바모일 (-(CO)-NH-아릴), 티오카르바모일 (-(CS)-NH2), 카르바미도 (-NH-(CO)-NH2), 시아노 (-C≡N), 이소시아노 (-N+≡C-), 시아네이토 (-O-C≡N), 이소시아네이토 (-O-N+≡C-), 이소티오시아네이토 (-S-C≡N), 아지도 (-N=N+=N-), 포르밀 (-(CO)-H), 티오포르밀 (-(CS)-H), 아미노 (-NH2), 모노- 및 디-(C1-C24 알킬)-치환된 아미노, 모노- 및 디-(C5-C20 아릴)-치환된 아미노, C2-C24 알킬아미도 (-NH-(CO)-알킬), C5-C20 아릴아미도 (-NH-(CO)-아릴), 이미노 (-CR=NH, 여기서 R = 수소, C1-C24 알킬, C5-C20 아릴, C6-C20 알크아릴, C6-C20 아르알킬 등), 알킬이미노 (-CR=N(알킬), 여기서 R = 수소, 알킬, 아릴, 알크아릴 등), 아릴이미노 (-CR=N(아릴), 여기서 R = 수소, 알킬, 아릴, 알크아릴 등), 니트로 (-NO2), 니트로소 (-NO), 술포 (-SO2-OH), 술포네이토 (-SO2-O-), C1-C24 알킬술파닐 (-S-알킬; 또한 "알킬티오"로도 명명됨), 아릴술파닐 (-S-아릴; 또한 "아릴티오"로도 명명됨), C1-C24 알킬술피닐 (-(SO)-알킬), C5-C20 아릴술피닐 (-(SO)-아릴), C1-C24 알킬술포닐 (-SO2-알킬), C5-C20 아릴술포닐 (-SO2-아릴), 포스포노 (-P(O)(OH)2), 포스포네이토 (-P(O)(O-)2), 포스피네이토 (-P(O)(O-)), 포스포 (-PO2), 및 포스피노 (-PH2), 모노- 및 디-(C1-C24 알킬)-치환된 포스피노, 모노- 및 디-(C5-C20 아릴)-치환된 포스핀을 의미한다. 또한, 상기 언급된 관능기는, 특정한 기가 허용되는 경우에, 1개 이상의 추가의 관능기로 또는 1개 이상의 히드로카르빌 모이어티, 예컨대 상기 구체적으로 열거된 것으로 추가로 치환될 수 있다.
"연결기", "링커 모이어티" 등에서와 같이 "연결" 또는 "링커"는 공유 결합을 통해 2개의 기를 결속시키는 연결 모이어티를 의미한다. 링커는 선형, 분지형, 시클릭 또는 단일 원자일 수 있다. 이러한 연결기의 예는 알킬, 알케닐렌, 알키닐렌, 아릴렌, 알크아릴렌, 아르알킬렌, 및 비제한적으로 아미도 (-NH-CO-), 우레일렌 (-NH-CO-NH-), 이미드 (-CO-NH-CO-), 에폭시 (-O-), 에피티오 (-S-), 에피디옥시 (-O-O-), 카르보닐디옥시 (-O-CO-O-), 알킬디옥시 (-O-(CH2)n-O-), 에폭시이미노 (-O-NH-), 에피미노 (-NH-), 카르보닐 (-CO-) 등을 포함한 관능기를 함유하는 연결 모이어티를 포함한다. 특정 경우에, 링커 백본의 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 초과의 탄소 원자는 황, 질소 또는 산소 헤테로원자로 임의로 치환될 수 있다. 백본 원자 사이의 결합은 포화 또는 불포화일 수 있고, 통상적으로 1, 2, 또는 3개 이하의 불포화 결합이 링커 백본에 존재할 것이다. 링커는, 예를 들어 알킬, 아릴 또는 알케닐 기를 갖는 1개 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 링커는, 비제한적으로, 폴리(에틸렌 글리콜) 단위(들) (예를 들어, -(CH2-CH2-O)-); 에테르, 티오에테르, 아민, 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 알킬 (예를 들어, (C1-C12)알킬), 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸 (이소-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸 (t-부틸) 등을 포함할 수 있다. 링커 백본은 시클릭 기, 예를 들어 아릴, 헤테로사이클 또는 시클로알킬 기를 포함할 수 있으며, 여기서 시클릭 기의 2개 이상의 원자, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 원자는 백본에 포함된다. 링커는 절단성 또는 비-절단성일 수 있다. 연결된 기에 대해 링커의 임의의 편리한 배향 및/또는 연결이 사용될 수 있다.
용어 "치환된"이 가능한 치환된 기의 목록 앞에 나타나는 경우에, 상기 용어는 그러한 기의 모든 구성원에 대해 적용되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "치환된 알킬 및 아릴"은 "치환된 알킬 및 치환된 아릴"로 해석되어야 한다.
본원의 개시내용에 더하여, 용어 "치환된"은, 명시된 기 또는 라디칼을 수식하는데 사용되는 경우에, 명시된 기 또는 라디칼의 1개 이상의 수소 원자가 각각 서로 독립적으로 하기 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 치환기로 대체된 것을 또한 의미할 수 있다.
본원의 개별 용어와 관련하여 개시된 기에 더하여, 명시된 기 또는 라디칼에서 포화 탄소 원자 상의 1개 이상의 수소를 치환하기 위한 치환기는 (단일 탄소 상의 임의의 2개의 수소는 =O, =NR70, =N-OR70, =N2 또는 =S로 대체될 수 있음), 달리 명시되지 않는 한, -R60, 할로, =O, -OR70, -SR70, -NR80R80, 트리할로메틸, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -SO2R70, -SO2O-M+, -SO2OR70, -OSO2R70, -OSO2O-M+, -OSO2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70) 2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)O-M+, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)O-M+, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60은 임의로 치환된 알킬, 시클로알킬, 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 R70은 독립적으로 수소 또는 R60이고; 각각의 R80은 독립적으로 R70이거나 또는 대안적으로 2개의 R80'은 이들이 결합되어 있는 질소 원자와 함께 5-, 6-, 또는 7-원 헤테로시클로알킬을 형성하고, 이는 임의로 O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 동일하거나 상이한 추가의 헤테로원자 중 1 내지 4개를 포함할 수 있고, 이 중 N은 -H 또는 C1-C3 알킬 치환기를 가질 수 있고; 각각의 M+는 알짜 단일 양전하를 갖는 반대 이온이다. 각각의 M+는 독립적으로, 예를 들어, 알칼리 이온, 예컨대 K+, Na+, Li+; 암모늄 이온, 예컨대 +N(R60)4; 또는 알칼리 토류 이온, 예컨대 [Ca2+]0.5, [Mg2+]0.5, 또는 [Ba2+]0.5일 수 있다 ("아래첨자 0.5는 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온 중 1개가 본 발명의 화합물의 이온화된 형태일 수 있고, 다른 것은 전형적인 반대 이온, 예컨대 클로라이드일 수 있거나, 또는 본원에 개시된 2개의 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온으로서 작용할 수 있거나, 또는 본 발명의 이중으로 이온화된 화합물이 이러한 2가 알칼리 토류 이온에 대한 반대 이온으로서 작용할 수 있음을 의미함). 구체적 예로서, -NR80R80은 -NH2, -NH-알킬, N-피롤리디닐, N-피페라지닐, 4N-메틸-피페라진-1-일 및 N-모르폴리닐을 포함하는 것으로 의도된다.
본원의 개시내용에 더하여, "치환된" 알켄, 알킨, 아릴 및 헤테로아릴 기에서 불포화 탄소 원자 상의 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않는 한, -R60, 할로, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트리할로메틸, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -SO2R70, -SO3 -M+, -SO3R70, -OSO2R70, -OSO3 -M+, -OSO3R70, -PO3 -2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)2, -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -CO2 -M+, -CO2R70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OCO2 -M+, -OCO2R70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70CO2 -M+, -NR70CO2R70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 이전에 정의된 바와 같고, 단 치환된 알켄 또는 알킨의 경우에, 치환기는 -O-M+, -OR70, -SR70, 또는 -S-M+가 아니다.
본원의 개별 용어와 관련하여 개시된 기에 더하여, "치환된" 헤테로알킬 및 시클로헤테로알킬 기에서 질소 원자 상의 수소에 대한 치환기는, 달리 명시되지 않는 한, -R60, -O-M+, -OR70, -SR70, -S-M+, -NR80R80, 트리할로메틸, -CF3, -CN, -NO, -NO2, -S(O)2R70, -S(O)2O-M+, -S(O)2OR70, -OS(O)2R70, -OS(O)2O-M+, -OS(O)2OR70, -P(O)(O-)2(M+)2, -P(O)(OR70)O-M+, -P(O)(OR70)(OR70), -C(O)R70, -C(S)R70, -C(NR70)R70, -C(O)OR70, -C(S)OR70, -C(O)NR80R80, -C(NR70)NR80R80, -OC(O)R70, -OC(S)R70, -OC(O)OR70, -OC(S)OR70, -NR70C(O)R70, -NR70C(S)R70, -NR70C(O)OR70, -NR70C(S)OR70, -NR70C(O)NR80R80, -NR70C(NR70)R70 및 -NR70C(NR70)NR80R80이며, 여기서 R60, R70, R80 및 M+는 이전에 정의된 바와 같다.
본원의 개시내용에 더하여, 특정 실시양태에서, 치환된 기는 1, 2, 3, 또는 4개의 치환기, 1, 2, 또는 3개의 치환기, 1 또는 2개의 치환기, 또는 1개의 치환기를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 명백하게 정의되지 않은 치환기의 명명법은 관능기의 말단 부분에 이어 부착 지점을 향해 인접한 관능기를 명명함으로써 도달된다. 예를 들어, 치환기 "아릴알킬옥시카르보닐"은 기 (아릴)-(알킬)-O-C(O)-를 지칭한다.
1개 이상의 치환기를 함유하는 본원에 개시된 임의의 기에 대해, 물론, 이러한 기는 입체적으로 비실용적이고/거나 합성적으로 실현불가능한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 함유하지 않는 것으로 이해된다. 또한, 대상 화합물은 이들 화합물의 치환으로부터 발생하는 모든 입체화학적 이성질체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 치환기는 화합물의 광학 이성질현상 및/또는 입체 이성질현상에 기여할 수 있다. 화합물의 염, 용매화물, 수화물, 및 전구약물 형태가 또한 관심 대상이다. 모든 이러한 형태는 본 개시내용에 의해 포괄된다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 전구약물 및 이성질체를 비롯한 그의 염, 용매화물, 수화물, 전구약물 및 이성질체 형태를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화합물은 제약 활성 유도체로 대사될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 원자에 대한 언급은 그러한 원자의 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, H에 대한 언급은 1H, 2H (즉, D) 및 3H (즉, T)를 포함하는 것으로 의도되고, C에 대한 언급은 12C 및 탄소의 모든 동위원소 (예컨대 13C)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 각각의 개별 실시양태는 본 발명의 범주 또는 취지로부터 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 실시양태의 특색으로부터 용이하게 분리되거나 또는 그와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특색을 갖는다. 임의의 열거된 방법은 열거된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
장치 및 방법은 문법적 유동성을 위해 기능적인 설명과 함께 기재되었거나 기재될 것이지만, 청구범위는, 35 U.S.C. §112 하에 분명하게 편성되지 않은 한, "수단" 또는 "단계" 제한의 구성에 의해 임의의 방식으로 반드시 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 사법 균등론 하에 청구범위에 의해 제공되는 정의의 의미 및 등가물의 완전한 범주가 부여되어야 하고, 청구범위가 35 U.S.C. §112 하에 분명하게 편성된 경우에는 35 U.S.C. §112 하에 완전한 법령 등가물이 부여되어야 함이 분명하게 이해되어야 한다.
다른 용어 및 개념의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 나타난다.
상세한 설명
상기 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 측면은 ENPP1의 억제를 위한 화합물, 조성물 및 방법을 포함한다. 방법의 측면은 샘플을 ENPP1 억제제 화합물과 접촉시켜 ENPP1의 cGAMP가수분해 활성을 억제하는 것을 포함한다. 이들 화합물, 조성물 및 방법은 ENPP1의 억제가 바람직한 다양한 적용분야에서의 용도가 발견된다.
또한 대상 ENPP1 억제제 화합물을 사용하여 암을 치료하기 위한 제약 조성물 및 방법이 제공된다. 방법의 측면은 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 억제제 화합물을 투여하여 cGAMP의 가수분해를 억제하고 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다.
ENPP1-억제제 화합물
대상 ENPP1 억제제 화합물은 친수성 머리기에 연결된 아릴 또는 헤테로아릴 고리계, 예를 들어, 퀴나졸린 또는 퀴놀린 기를 기초로 하는 코어 구조를 포함할 수 있다. 아릴 또는 헤테로아릴 고리계와 친수성 머리기 사이의 링커는 모노시클릭 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클 또는 헤테로사이클 및 1개 이상의 비-시클릭 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 퀴나졸린 또는 퀴놀린 코어 구조는 4-위치에서 링커로 치환될 수 있다. 아릴 또는 헤테로아릴 고리계는 임의로 추가로 치환된다. 본 개시내용은 4-위치에서 링커로 치환되고 3-위치에서 시아노 기로 치환된 퀴놀린 코어 구조를 갖는 화합물을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 1,4-이치환된 6-원 아릴 또는 헤테로아릴 시클릭 기, 예컨대 페닐, 또는 치환된 페닐을 포함한다. 특정 경우에, 링커는 1,4-이치환된 6-원 포화 헤테로사이클 또는 카르보사이클, 예컨대 N1,4-이치환된 피페리딘 고리 또는 N1,N4-이치환된 피페라진 고리를 포함한다. 대상 ENPP1 억제제 화합물의 추가 측면은 하기, 및 2018년 9월 7일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/050018 (Li et al.)에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
용어 "친수성 머리기"는 친수성이고, 수성 환경, 예를 들어 생리학적 조건에서 잘 용매화되고, 세포 막에 대해 낮은 투과성을 갖는, 코어 아릴 또는 헤테로아릴 고리계에 연결된 기를 지칭한다. 일부 경우에, 세포 막에 대한 낮은 투과성은 막 (예를 들어, 세포 단층, 예컨대 결장직장 Caco-2 또는 신장 MDCK 세포주)을 통한 단리된 친수성 머리기에 대한 임의의 편리한 수동 확산 방법을 통해 측정 시, 10-4 cm/s 이하, 예컨대 10-5 cm/s 이하, 10-6 cm/s 이하, 10-7 cm/s 이하, 10-8 cm/s 이하, 10-9 cm/s 이하, 또는 심지어 그 미만의 투과 계수를 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Yang and Hinner, Methods Mol Biol. 2015; 1266: 29-53]을 참조한다. 친수성 머리기는 그것이 부착되어 있는 분자에 대해 개선된 수용해도 및 감소된 세포 투과성을 부여할 수 있다. 친수성 머리기는 수성 환경에서 잘 용매화되고 막에 대해 낮은 투과성을 갖는 임의의 편리한 친수성 기일 수 있다. 특정 경우에, 친수성 기는 별개의 관능기 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 그의 치환된 버전이다. 일반적으로, 하전된 기, 또는 보다 큰 비하전된 극성 기는 낮은 투과성을 갖는다. 일부 경우에, 친수성 머리기는 예를 들어 양으로 하전되거나 또는 음으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 그 자체가 세포 투과성이 아니고, 대상 화합물에 세포 불투과성을 부여한다. 친수성 머리기 또는 그의 전구약물 형태는 대상 화합물의 목적하는 세포 투과성을 제공하도록 선택될 수 있는 것으로 이해된다. 특정 경우에, 친수성 머리기는 중성 친수성 기이다. 일부 경우에, 친수성 머리기는 전구약물 형태에 포함되며, 따라서 생체내에서 제거될 수 있는 프로모이어티를 포함한다. 특정 경우에, 대상 화합물은 세포 투과성이다.
친수성 머리기는 아연 이온에 결합 또는 킬레이팅할 수 있는 임의의 편리한 기, 또는 그의 전구약물 형태일 수 있다. 특정 경우에, 친수성 머리기는 인 함유 기이다. 대상 ENPP1 억제제에서 이용될 수 있는 관심 인-함유 기는 포스폰산 또는 포스포네이트, 포스포네이트 에스테르, 포스페이트, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트, 티오포스페이트 에스테르, 포스포르아미데이트 및 티오포스포르아미데이트, 또는 그의 염, 또는 그의 전구약물 형태 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
퀴나졸린 및 이소퀴놀린 고리계를 포함하는 예시적인 관심 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (I)-(XVb) 및 표 1-2의 화합물 구조에 제시된다.
일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 전구약물, 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이며:
Figure pct00001
여기서,
X1은 친수성 머리기 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)이고;
A는 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 고리계이고;
L1 및 L2는 독립적으로 공유 결합 또는 링커이고;
Z3은 부재하거나 또는 NR22, O 및 S로부터 선택되고;
Z2는 CR12 또는 N이고;
Z1은 CR11 또는 N이고;
R1은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 치환된 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 (예를 들어, 에테닐아릴), 치환된 알케닐아릴, 알케닐헤테로아릴 (예를 들어, 에테닐헤테로아릴), 치환된 알케닐헤테로아릴, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
R11 및 R12는 독립적으로 H, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되고;
R22는 H, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되고;
R2 내지 R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나; 또는 여기서 R2 및 R3, R3 및 R4, 또는 R4 및 R5는 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택된 융합된 고리 (예를 들어, 5- 또는 6-원 모노시클릭 고리)를 제공한다.
화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z3은 부재한다. 화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z3은 NR22이며, 여기서 R22는 H, C(1-6)알킬 및 치환된 C(1-6)알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, Z3은 NH이다. 특정 경우에, Z3은 NR22이고, R22는 C(1-6)알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 또는 헥실이다. 특정 경우에, Z3은 NR22이고, R22는 치환된 C(1-6)알킬이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z3은 O이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z3은 S이다.
화학식 (I)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (I)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소이다. 일부 경우에, R11은 시아노이다. 일부 경우에, R11은 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R11은 할로겐, 예를 들어 Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R11은 알킬, 예를 들어 C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R11은 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (I)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (I)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소이다. 일부 경우에, R12는 시아노이다. 일부 경우에, R12는 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R12는 할로겐, 예를 들어, Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R12는 알킬, 예를 들어, C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R12는 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z1 및 Z2 중 적어도 1개는 N이다. 화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z1은 CR11이고, Z2는 N이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 CR11이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 N이다.
화학식 (I)의 특정 실시양태에서, L1 및 L2는 각각 공유 결합이다. 특정 경우에, L1 및 L2는 각각 링커이다. 특정 경우에, L1은 공유 결합이고, L2는 링커이다. 특정 경우에, L1은 링커이고, L2는 공유 결합이다. 임의의 편리한 링커는 A를 X에 및/또는 A를 Z3에 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음). 일부 경우에, A는 공유 결합을 통해 X에 연결된다. 특정 경우에, A는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커를 통해 X에 연결된다. 링커 L2는 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다. 일부 경우에, A는 공유 결합을 통해 Z3에 연결된다. 특정 경우에, A는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커를 통해 Z3에 연결된다. 링커 L1은 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 케토 (CO), 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다. Z3이 NR22인 경우에, 링커 L1은 Z3과 함께 아미도 기 (NR22CO) 연결을 제공하는 말단 케토 (C=O) 기를 포함할 수 있다. Z31이 O 또는 S인 경우에, 링커 L1은 Z31과 함께 에스테르 또는 티오에스테르 기 연결을 제공하는 말단 케토 (C=O) 기를 포함할 수 있다.
화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z3은 아연 이온에 결합할 수 있는 인-함유 기, 또는 그의 전구약물 형태이다.
화학식 (I)의 특정 경우에, Z3은 NR22, O 및 S로부터 선택된다. 따라서, 화학식 (I)의 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (II)에 의해 기재될 수 있으며:
Figure pct00002
여기서 Z31은 NR22, O 및 S로부터 선택된다.
화학식 (II)의 특정 실시양태에서, Z31은 NR22이고, 여기서 R22는 H, C(1-6)알킬 및 치환된 C(1-6)알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, Z31은 NH이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 C(1-6)알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 또는 헥실이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 치환된 C(1-6)알킬이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z31은 O이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z31은 S이다.
화학식 (II)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (II)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소이다. 일부 경우에, R11은 시아노이다. 일부 경우에, R11은 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R11은 할로겐, 예를 들어 Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R11은 알킬, 예를 들어 C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R11은 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (II)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (II)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소이다. 일부 경우에, R12는 시아노이다. 일부 경우에, R12는 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R12는 할로겐, 예를 들어, Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R12는 알킬, 예를 들어, C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R12는 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (II)의 특정 실시양태에서, Z1 및 Z2 중 적어도 1개는 N이다. 화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z1은 CR11이고, Z2는 N이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 CR11이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (I)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 N이다.
화학식 (II)의 특정 실시양태에서, L1 및 L2는 각각 공유 결합이다. 특정 경우에, L1 및 L2는 각각 링커이다. 특정 경우에, L1은 공유 결합이고, L2는 링커이다. 특정 경우에, L1은 링커이고, L2는 공유 결합이다. 임의의 편리한 링커는 A를 X에 및/또는 A를 Z3에 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음). 일부 경우에, A는 공유 결합을 통해 X에 연결된다. 특정 경우에, A는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커를 통해 X에 연결된다. 링커 L2는 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 케토 (CO), 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다. 일부 경우에, A는 공유 결합을 통해 Z3에 연결된다. 특정 경우에, A는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커를 통해 Z3에 연결된다. 링커 L1은 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 케토 (C=O), 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다. Z31이 NR22인 경우에, 링커 L1은 Z31과 함께 아미도 기 (NR22CO) 연결을 제공하는 말단 케토 (C=O) 기를 포함할 수 있다. Z31이 O 또는 S인 경우에, 링커 L1은 Z31과 함께 에스테르 또는 티오에스테르 기 연결을 제공하는 말단 케토 (C=O) 기를 포함할 수 있다.
화학식 (II)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (III)을 갖고:
Figure pct00003
여기서
각각의 R31 내지 R34는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R31 및 R32 또는 R33 및 R34는 시클릭 연결되고, 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 치환된 헤테로시클릴 고리를 제공하고;
n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6 (예를 들어, 0-3)의 정수이다.
화학식 (III)의 특정 실시양태에서, Z31은 NR22이고, 여기서 R22는 H, C(1-6)알킬 및 치환된 C(1-6)알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, Z31은 NH이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 C(1-6)알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 또는 헥실이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 치환된 C(1-6)알킬이다. 화학식 (III)의 특정 경우에, Z31은 O이다. 화학식 (III)의 특정 경우에, Z31은 S이다.
화학식 (II)에서, Z31이 NR22인 경우에, 링커 L1은 Z31과 함께 아미도 기 (NR22CO) 연결을 제공하는 말단 케토 (C=O) 기를 포함할 수 있다. 따라서, 화학식 (II)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (IIIa)을 갖고:
Figure pct00004
여기서
Z41은 -NR22C(=O)-이고;
각각의 R31 내지 R34는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R31 및 R32 또는 R33 및 R34는 시클릭 연결되고, 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 치환된 헤테로시클릴 고리를 제공하고;
n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6 (예를 들어, 0-3)의 정수이다.
화학식 (III)-(IIIa)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 일부 경우에, Z1은 CR11이고, R11은 수소이다. 일부 경우에, R11은 시아노이다. 일부 경우에, R11은 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R11은 할로겐, 예를 들어 Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R11은 알킬, 예를 들어 C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R11은 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (III)-(IIIa)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬 수소로부터 선택된다. 일부 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C1-5 알킬이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 일부 경우에, Z2는 CR12이고, R12는 수소이다. 일부 경우에, R12는 시아노이다. 일부 경우에, R12는 트리플루오로메틸이다. 일부 경우에, R12는 할로겐, 예를 들어, Br, I, Cl 또는 F이다. 일부 경우에, R12는 알킬, 예를 들어, C1-5 알킬이다. 일부 경우에, R12는 치환된 알킬, 예를 들어, 치환된 C1-5 알킬이다.
화학식 (III)-(IIIa)의 특정 실시양태에서, Z1 및 Z2 중 적어도 1개는 N이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 특정 실시양태에서, Z1은 CR11이고, Z2는 N이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 특정 경우에, Z1은 CR11이고, Z2는 CR12이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 특정 경우에, Z1은 N이고, Z2는 N이다.
화학식 (III)-(IIIa)의 특정 실시양태에서, R31 내지 R34는 각각 수소이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 알킬이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 할로겐이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 알킬이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 치환된 알킬이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 할로겐이고, 나머지는 수소이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 알킬이고, 나머지는 수소이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 치환된 알킬이고, 나머지는 수소이다.
화학식 (III)-(IIIa)의 특정 실시양태에서, n은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n은 0이다. 특정 경우에, n은 1이다. 특정 경우에, n은 2이다. 특정 경우에, n은 3이다. 화학식 (III)-(IIIa)의 특정 실시양태에서, m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, m은 0이다. 특정 경우에, m은 1이다. 특정 경우에, m은 2이다. 특정 경우에, m은 3이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 3이다. 특정 경우에, n+m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n+m은 0이다. 특정 경우에, n+m은 1이다. 특정 경우에, n+m은 2이다. 특정 경우에, n+m은 3이다.
화학식 (I) 내지 (IIIa) 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 고리계 A는 페닐, 치환된 페닐, 피리딜, 치환된 피리딜, 피리미딘, 치환된 피리미딘, 피페리딘, 치환된 피페리딘, 피페라진, 치환된 피페라진, 피리다진, 치환된 피리다진, 시클로헥실 및 치환된 시클로헥실로부터 선택된다. 특정 경우에, 고리계 A는 페닐 또는 치환된 페닐이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피리딜 또는 치환된 피리딜이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피페리딘 또는 치환된 피페리딘이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피페라진 또는 치환된 피페라진이다. 일부 경우에, 고리계 A는 시클로헥실 또는 치환된 시클로헥실이다.
일부 실시양태에서, 고리계 A는 화학식 (A1)에 의해 기재되며:
Figure pct00005
여기서
각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
p는 0 내지 4의 정수이다.
특정 경우에, A1은 페닐렌이다. 특정 경우에, A1은 일치환된 페닐렌이다. 특정 경우에, A1은 이치환된 페닐렌이다. 특정 경우에, A1은 삼치환된 페닐렌이다. 특정 경우에, A1은 사치환된 페닐렌이다. 특정 경우에, 페닐렌의 치환기는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실) 및 할로겐 (예를 들어, F, Cl, I 또는 Br)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, A1 고리는 화학식 (A1a)에 의해 기재된다:
Figure pct00006
.
일부 실시양태에서, 고리계 A는 화학식 (A2)에 의해 기재되며:
Figure pct00007
여기서
Z5는 N 및 CR6으로부터 선택되고;
각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
q는 0 내지 2의 정수이다.
특정 경우에, A2는 피리딜이다. 특정 경우에, A2는 치환된 피리딜이다. 일부 경우에, 피리딜은 일치환된 피리딜이다. 다른 경우에, 피리딜은 이치환된 피리딜이다. 다른 경우에, 피리딜은 삼치환된 피리딜이다. 특정 경우에, Z5는 N이며, 따라서 A2는 피리미딜이다. 일부 경우에, A2는 치환된 피리미딜이다. 일부 경우에, 피리미딜은 일치환된다. 일부 경우에, 피리미딜은 이치환된다. A2의 특정 실시양태에서, 치환기는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실), 트리플루오로메틸 및 할로겐 (예를 들어, F, Cl, I 또는 Br)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 고리계 A는 화학식 (A3)에 의해 기재되며:
Figure pct00008
여기서
Z5는 N 및 CR6으로부터 선택되고;
각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
q는 0 내지 2의 정수이다.
특정 경우에, A3은 피리딜이다. 특정 경우에, A3은 치환된 피리딜이다. 일부 경우에, 피리딜은 일치환된 피리딜이다. 다른 경우에, 피리딜은 이치환된 피리딜이다. 다른 경우에, 피리딜은 삼치환된 피리딜이다. 특정 경우에, Z5는 N이며, 따라서 A3은 피리미딜이다. 일부 경우에, A3은 치환된 피리미딜이다. 일부 경우에, 피리미딜은 일치환된다. 일부 경우에, 피리미딜은 이치환된다. A3의 특정 실시양태에서, 치환기는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실), 트리플루오로메틸 및 할로겐 (예를 들어, F, Cl, I 또는 Br)으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 고리계 A는 화학식 (A4)에 의해 기재되며:
Figure pct00009
여기서
Z5는 N이고;
각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
q는 0 내지 2의 정수이다.
일부 경우에, A4는 치환된 피리미딜이다. 일부 경우에, 피리미딜은 일치환된다. 일부 경우에, 피리미딜은 이치환된다. A4의 특정 실시양태에서, 치환기는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실), 트리플루오로메틸 및 할로겐 (예를 들어, F, Cl, I 또는 Br)으로부터 선택된다.
화학식 (III)-(IIIa)의 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (IV)-(IVa)을 갖고:
Figure pct00010
여기서
Z31은 NR22, O 및 S로부터 선택되고;
Z41은 -NR22C(=O)-이고;
Z11 및 Z21은 독립적으로 N 및 C(CN)로부터 선택되고;
각각의 R31 내지 R34는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R31 및 R32 또는 R33 및 R34는 시클릭 연결되고, 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 치환된 헤테로시클릴 고리를 제공하고;
각각의 R6은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸 및 할로겐으로부터 선택되고;
p는 0 내지 4의 정수이고;
n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6 (예를 들어, 0-3)의 정수이다.
화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, Z31은 NR22이고, 여기서 R22는 H, C(1-6)알킬 및 치환된 C(1-6)알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, Z31은 NH이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 C(1-6)알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 펜틸 또는 헥실이다. 특정 경우에, Z31은 NR22이고, R22는 치환된 C(1-6)알킬이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 경우에, Z31은 O이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 경우에, Z31은 S이다.
화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, Z11 및 Z21 중 적어도 1개는 N이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, Z11은 C(CN)이고, Z21은 N이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 경우에, Z11은 N이고, Z21은 C(CN)이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 경우에, Z11은 C(CN)이고, Z21은 C(CN)이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 경우에, Z11은 N이고, Z21은 N이다.
화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, R31 내지 R34는 각각 수소이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 알킬이다. 특정 실시양태에서, R31 내지 R34 중 적어도 1개는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 할로겐이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 알킬이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 치환된 알킬이고, 나머지는 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 할로겐이고, 나머지는 수소이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 알킬이고, 나머지는 수소이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 치환된 알킬이고, 나머지는 수소이다.
화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, n은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n은 0이다. 특정 경우에, n은 1이다. 특정 경우에, n은 2이다. 특정 경우에, n은 3이다. 화학식 (IV)-(IVa)의 특정 실시양태에서, m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, m은 0이다. 특정 경우에, m은 1이다. 특정 경우에, m은 2이다. 특정 경우에, m은 3이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 3이다. 특정 경우에, n+m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n+m은 0이다. 특정 경우에, n+m은 1이다. 특정 경우에, n+m은 2이다. 특정 경우에, n+m은 3이다.
화학식 (IVa)의 일부 경우에, n은 0이고 m은 0-2이며, 예컨대 m은 1 또는 2이다.
화학식 (IV)-(IVa)의 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (V)-(Va)을 갖고:
Figure pct00011
여기서
R41 내지 R44는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된다.
화학식 (V)-(Va)의 특정 실시양태에서, Z11 및 Z21 중 적어도 1개는 N이다. 화학식 (V)-(Va)의 특정 실시양태에서, Z11은 C(CN)이고, Z21은 N이다. 화학식 (V)-(Va)의 특정 경우에, Z11은 N이고, Z21은 C(CN)이다. 화학식 (V)-(Va)의 특정 경우에, Z11은 C(CN)이고, Z21은 C(CN)이다. 화학식 (V)-(Va)의 특정 경우에, Z11은 N이고, Z21은 N이다.
화학식 (V)-(Va)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (VIa)-(VId) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00012
.
화학식 (VIa)-(VId)의 특정 실시양태에서, R41 내지 R44는 각각 수소이다. 특정 실시양태에서, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 특정 실시양태에서, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 히드록시이다. 특정 실시양태에서, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 트리플루오로메틸이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 아실 또는 치환된 아실이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 카르복시이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 카르복시아미드 또는 치환된 카르복시아미드이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 술포닐 또는 치환된 술포닐이다. 특정 경우에, R41 내지 R44 중 적어도 1개는 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드이다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 1개는 수소이고, 나머지는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 2개는 수소이고, 나머지는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된다. 특정 경우에, R31 내지 R34 중 3개는 수소이고, 나머지는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된다.
화학식 (VIa)-(VId)의 특정 실시양태에서, n은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n은 0이다. 특정 경우에, n은 1이다. 특정 경우에, n은 2이다. 특정 경우에, n은 3이다. 화학식 (VIa)-(VId) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, m은 0이다. 특정 경우에, m은 1이다. 특정 경우에, m은 2이다. 특정 경우에, m은 3이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 3이다. 특정 경우에, n+m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n+m은 0이다. 특정 경우에, n+m은 1이다. 특정 경우에, n+m은 2이다. 특정 경우에, n+m은 3이다.
화학식 (VIa)-(VId) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R22는 수소이다. 특정 경우에, R22는 알킬이다. 특정 경우에, R22는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, 알킬 또는 치환된 알킬은 C(1-6)알킬이다.
화학식 (I)-(VId) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R1은 수소, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 치환된 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 (예를 들어, 에테닐아릴), 치환된 알케닐아릴, 알케닐헤테로아릴 (예를 들어, 에테닐헤테로아릴), 치환된 알케닐헤테로아릴, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택된다.
화학식 (I)-(VId)의 특정 경우에, R1은 수소이다. 특정 경우에, R1은 아릴 또는 치환된 아릴이다. 특정 경우에, R1은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 특정 경우에, R1은 알킬아릴 또는 치환된 알킬아릴이다. 특정 경우에, R1은 알킬헤테로아릴 또는 치환된 알킬헤테로아릴이다. 특정 경우에, R1은 알케닐아릴, 또는 치환된 알케닐아릴이다. 특정 경우에, R1은 에테닐아릴이다. 특정 경우에, R1은 치환된 에테닐아릴이다. 일부 경우에, R1은 에테닐헤테로아릴이다. 특정 경우에, R1은 알케닐헤테로아릴 또는 치환된 알케닐헤테로아릴이다. 일부 경우에, R1은 치환된 에테닐헤테로아릴이다.
화학식 (VIa)-(VId)의 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (VIIa)-(VIIb) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00013
.
화학식 (I)-(VIIb) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된다.
화학식 (I)-(VIIb) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 수소, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된다.
특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 2개는 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 각각은 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 히드록시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시 또는 치환된 알콕시는 C(1-6)알콕시, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜톡시, 헥속시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 메톡시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 -OCF3이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 경우에, 할로겐은 플루오라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 클로라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 브로마이드이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 시아노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 아민 또는 치환된 아민이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 C(1-6)알킬아미노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 디-C(1-6)알킬아미노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 아미드이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다.
화학식 (I)-(VIIb)의 일부 경우에, R3 및 R4는 독립적으로 알콕시이고; R2 및 R5는 둘 다 수소이다. 특정 경우에, 알콕시는 메톡시이다. 일부 경우에, R3은 알콕시이고; R2, R4 및 R5는 수소이다. 일부 경우에, R4는 알콕시이고; R2, R3 및 R5는 각각 수소이다. 특정 경우에, R2, R3 및 R4는 수소이고, R5는 알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 C(1-6)알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 메톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 에톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 프로폭시이다. 특정 경우에, 알콕시는 부톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 펜톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 헥실옥시이다.
화학식 (VIc)-(VId)의 일부 경우에, R41-R44는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C(1-6)알킬 또는 C(1-6)알콕시이다. 화학식 (VIc)-(VId)의 일부 경우에, m은 1 또는 2이다. 화학식 (VIc)-(VId)의 일부 경우에, R2는 H이고, R3 내지 R5는 독립적으로 수소, C(1-6)알콕시, F, Cl 및 C(1-6)알킬로부터 선택된다.
화학식 (VIIa)-(VIIb)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (VIIc)-(VIIl) 중 하나를 갖는다:
Figure pct00014
.
화학식 (VIa)의 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (VIIm)을 갖는다:
Figure pct00015
.
화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된다. 화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 수소, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된다. 화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, n+m=1이다. 화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, n+m=2이다. 화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, n은 1이고, m은 0이다.
화학식 (VIIm)의 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 수소이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 2개는 수소이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 각각은 수소이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 히드록시이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 화학식 (VIIm)의 특정 경우에, 알콕시 또는 치환된 알콕시는 C(1-6)알콕시, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜톡시, 헥속시이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 메톡시이다. 화학식 (VIIm)의 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 -OCF3이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 경우에, 할로겐은 플루오라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 클로라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 브로마이드이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 시아노이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 아민 또는 치환된 아민이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 C(1-6)알킬아미노이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 디-C(1-6)알킬아미노이다. 화학식 (VIIm)의 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 아미드이다. 특정 경우에, R3 내지 R5 중 적어도 1개는 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다.
화학식 (VIIm)의 일부 경우에, R3 및 R4는 독립적으로 알콕시이고; R2 및 R5는 둘 다 수소이다. 특정 경우에, 알콕시는 메톡시이다. 일부 경우에, R3은 알콕시이고; R2, R4 및 R5는 수소이다. 일부 경우에, R4는 알콕시이고; R2, R3 및 R5는 각각 수소이다. 화학식 (VIIm)의 특정 경우에, R2, R3 및 R4는 수소이고, R5는 알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 C(1-6)알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 메톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 에톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 프로폭시이다. 특정 경우에, 알콕시는 부톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 펜톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 헥실옥시이다.
화학식 (VIIm)의 특정 실시양태에서, n은 0-3이고, m은 0-3이다. 화학식 (VIIm)의 일부 경우에, m은 0이다. 특정 경우에, m은 1이다. 특정 경우에, m은 2이다. 특정 경우에, m은 3이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 0이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 1이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 2이고, m은 3이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 0이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 1이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 2이다. 특정 경우에, n은 3이고, m은 3이다. 특정 경우에, n+m은 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, n+m은 0이다. 특정 경우에, n+m은 1이다. 특정 경우에, n+m은 2이다. 특정 경우에, n+m은 3이다.
화학식 (I)의 ENPP1 억제제 화합물의 특정 경우에, Z3은 부재한다. 화학식 (I)의 특정 실시양태에서, Z3은 부재하고, Z2는 CR12이고, R12는 시아노이고, 화합물은 화학식 (X)에 의해 기재되며:
Figure pct00016
여기서 L11 및 L12는 독립적으로 공유 결합 또는 링커이다. 화학식 (X)의 일부 경우에, L11은 공유 결합이다.
화학식 (X)의 일부 실시양태에서, 고리계 A는 페닐, 치환된 페닐, 피리딜, 치환된 피리딜, 피리미딘, 치환된 피리미딘, 피페리딘, 치환된 피페리딘, 피페라진, 치환된 피페라진, 피리다진, 치환된 피리다진, 시클로헥실 및 치환된 시클로헥실로부터 선택된다. 특정 경우에, 고리계 A는 페닐 또는 치환된 페닐이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피리딜 또는 치환된 피리딜이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피리미딘 또는 치환된 피리미딘이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피페리딘 또는 치환된 피페리딘이다. 일부 경우에, 고리계 A는 피페라진 또는 치환된 피페라진이다. 일부 경우에, 고리계 A는 시클로헥실 또는 치환된 시클로헥실이다.
일부 실시양태에서, 고리계 A는 화학식 (A1)-(A4) 중 어느 하나에 의해 기재되며 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음):
Figure pct00017
여기서
Z5는 N 및 CR6으로부터 선택되고;
각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
p는 0 내지 4의 정수이고;
q는 0 내지 2의 정수이다.
일부 실시양태에서, A 고리는 화학식 (A5)에 의해 기재되며:
Figure pct00018
여기서
각각의 Z5는 독립적으로 N 및 CR16으로부터 선택되고;
각각의 R16은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
r은 0 내지 8의 정수이다.
특정 경우에, A5는 피페리딘 또는 치환된 피페리딘이다. 특정 경우에, A5는 피페라진 또는 치환된 피페라진이다. 특정 경우에, A5는 시클로헥실 또는 치환된 시클로헥실이다. A5의 특정 실시양태에서, r은 0 초과, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 경우에, A5는 1개의 R16 기를 포함한다. 일부 경우에, A5는 2개의 R16 기를 포함한다. 일부 경우에, A5는 3개의 R16 기를 포함한다. 일부 경우에, A5는 4개의 R16 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치환기는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실), 트리플루오로메틸 및 할로겐 (예를 들어, F, Cl, I 또는 Br)으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, A 고리는 화학식 (A5a)-(A5c) 중 어느 하나를 갖는다:
Figure pct00019
.
특정 실시양태에서, A 고리는 화학식 (A5d) 또는 (A5e)의 상대 배위를 갖는 시클로헥실이다:
Figure pct00020
.
화학식 (X)의 특정 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XI)을 갖고:
Figure pct00021
여기서
각각의 Z5는 독립적으로 N 및 CR16으로부터 선택되고;
각각의 R16은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
r은 0 내지 8의 정수이다.
화학식 (XI)의 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 Z5는 N이다. 화학식 (XI)의 특정 실시양태에서, 1개의 Z5는 N이고, 다른 Z5는 CR16이다. 화학식 (XI)의 특정 경우에, 둘 다의 Z5 기는 CR16이다. 화학식 (XI)의 특정 경우에, 둘 다의 Z5 기는 N이다.
화학식 (X)-(XI) 중 어느 하나의 화합물의 특정 실시양태에서, L11 및 L12는 각각 공유 결합이다. 특정 경우에, L11 및 L12는 각각 링커이다. 특정 경우에, L11은 공유 결합이고, L12는 링커이다. 특정 경우에, L11은 링커이고, L12는 공유 결합이다. 임의의 편리한 링커는 L11 및 L12로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, L11은 공유 결합이다. 특정 경우에, L11은 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커이다. 링커 L11은 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다. 일부 경우에, L12는 공유 결합이다. 특정 경우에, L12는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 링커이다. 링커 L12는 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다.
화학식 (XI)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XII)을 갖는다:
Figure pct00022
.
화학식 (XII)의 화합물의 특정 실시양태에서, Z5는 CR16이고, 여기서 R16은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된다. 화학식 (XII)의 화합물의 특정 경우에, Z5는 N이다.
화학식 (XII)의 화합물의 특정 실시양태에서, L12는 공유 결합이다. 특정 경우에, L12는 링커이다. 임의의 편리한 링커는 L12로서 이용될 수 있다. 특정 경우에, L12는 1-12개 원자 길이, 예컨대 1-10, 1-8 또는 1-6개 원자 길이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 원자 길이의 선형 링커이다. 링커 L12는 (C1-6)알킬 링커, 또는 헤테로원자 또는 연결 관능기, 예컨대 에스테르 (-CO2-), 아미도 (CONH), 카르바메이트 (OCONH), 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-) 및/또는 아미노 기 (-NR-, 여기서 R은 H 또는 알킬임)로 임의로 치환된, 치환된 (C1-6)알킬 링커일 수 있다.
화학식 (XII)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XIII)을 갖고:
Figure pct00023
여기서
R35 및 R36은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R35 및 R36은 시클릭 연결되고, 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 치환된 헤테로시클릴 고리를 제공하고;
s는 0 내지 6 (예를 들어, 0 내지 3)의 정수이다.
화학식 (XIII)의 특정 실시양태에서, R35 및 R36은 각각 수소이다. 특정 실시양태에서, R35 또는 R36 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 실시양태에서, R35 또는 R36 중 적어도 1개는 알킬이다. 특정 실시양태에서, R35 내지 R36 중 적어도 1개는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R35는 할로겐이고, R36은 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R35는 알킬이고, R36은 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R35는 치환된 알킬이고, R36은 수소, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택된다. 특정 경우에, R35는 할로겐이고, R36은 수소이다. 특정 경우에, R35는 알킬이고, R36은 수소이다. 특정 경우에, R35는 치환된 알킬이고, R36은 수소이다.
화학식 (XIII)의 특정 실시양태에서, s는 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, s는 0이다. 특정 경우에, s는 1이다. 특정 경우에, s는 2이다. 특정 경우에, s는 3이다.
화학식 (XIII)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XIV)을 갖고:
Figure pct00024
여기서 s는 0 내지 6 (예를 들어, 0 내지 3)의 정수이다.
화학식 (XIII)의 특정 실시양태에서, s는 0 내지 3의 정수이다. 특정 경우에, s는 0이다. 특정 경우에, s는 1이다. 특정 경우에, s는 2이다. 특정 경우에, s는 3이다.
화학식 (X)-(XIV) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된다.
화학식 (X)-(XIV) 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, R2 내지 R5는 독립적으로 수소, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된다.
화학식 (X)-(XIV) 중 임의의 것의 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 2개는 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5중 적어도 3개는 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 각각은 수소이다. 특정 경우에, R2 내지 R5중 적어도 1개는 히드록시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시 또는 치환된 알콕시는 C(1-6)알콕시, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜톡시, 헥속시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 메톡시이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 -OCF3이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 할로겐이다. 특정 경우에, 할로겐은 플루오라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 클로라이드이다. 특정 경우에, 할로겐은 브로마이드이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 시아노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 아민 또는 치환된 아민이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 C(1-6)알킬아미노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 디-C(1-6)알킬아미노이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 아미드이다. 특정 경우에, R2 내지 R5 중 적어도 1개는 헤테로사이클 또는 치환된 헤테로사이클이다.
화학식 (X)-(XIV) 중 임의의 것의 일부 경우에, R3 및 R4는 독립적으로 알콕시이고; R2 및 R5는 둘 다 수소이다. 일부 경우에, R3은 알콕시이고; R2, R4 및 R5는 수소이다. 일부 경우에, R4는 알콕시이고; R2, R3 및 R5는 각각 수소이다. 특정 경우에, R2, R3 및 R4는 수소이고, R5는 알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 C(1-6)알콕시이다. 특정 경우에, 알콕시는 메톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 에톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 프로폭시이다. 특정 경우에, 알콕시는 부톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 펜톡시이다. 특정 경우에, 알콕시는 헥실옥시이다.
화학식 (XIV)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XIVa)-(XIVe) 중 하나를 갖고:
Figure pct00025
여기서 s는 0 내지 6 (예를 들어, 0 내지 3)의 정수이다.
화학식 (I)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 화학식 (XVa) 또는 (XVb)을 갖고:
Figure pct00026
여기서
s는 0 내지 3이고;
R21은 C(1-6)알킬 또는 치환된 C(1-6)알킬이고;
R3 및 R4는 Cl 및 F로부터 선택된다.
화학식 (XVa)-(XVb)의 일부 경우에, R21은 메틸, 에틸, n-프로필 및 이소프로필로부터 선택된다. 특정 경우에, R21은 메틸이다. 화학식 (XVa)-(XVb)의 일부 경우에, R3 및 R4는 Cl이다. 특정 경우에, R3 및 R4는 F이다. 화학식 (XVa)-(XVb)의 일부 경우에, s는 2이다. 특정 경우에, s는 1이다. 화학식 (XVa)-(XVb)의 일부 실시양태에서, s는 2이고; R21은 메틸 또는 이소프로필이고; R3 및 R4는 Cl 및 F로부터 선택된다.
화학식 (XVa)-(XVb)의 일부 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 하기 구조 중 하나의 화합물, 또는 그의 전구약물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)이다:
Figure pct00027
상기 기재된 바와 같이, X1은 친수성 머리기 또는 그의 전구약물 버전이다. 본원에 기재된 친수성 머리기의 임의의 실시양태는 본원에 기재된 화학식 (I)-(XVb)의 실시양태 중 어느 하나에 혼입될 수 있다. 화학식 (I)-(XVb)의 일부 실시양태에서, X1은 아연 이온에 결합할 수 있는 하전된 기를 포함하는 친수성 머리기, 또는 그의 전구약물 형태이다. 특정 경우에, 아연 이온에 결합할 수 있는 친수성 머리기는 인 함유 관능기 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)이다.
화학식 (I)-(XVb)의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기 (X1)는 포스폰산 또는 포스포네이트, 포스포네이트 에스테르, 포스페이트, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트, 티오포스페이트 에스테르, 포스포르아미데이트, 티오포스포르아미데이트, 술포네이트, 술폰산, 술페이트, 히드록삼산, 케토산, 아미드 및 카르복실산으로부터 선택된다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 포스폰산, 포스포네이트, 또는 그의 염이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 포스페이트 또는 그의 염이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 포스포네이트 에스테르 또는 포스페이트 에스테르이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 티오포스페이트이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 티오포스페이트 에스테르이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 포스포르아미데이트이다. 화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 티오포스포르아미데이트이다.
본원에 기재된 화학식 (I)-(XVb)의 실시양태 중 어느 하나에 혼입될 수 있는 관심 친수성 머리기의 특정한 예는 포스페이트 (RPO4H-), 포스포네이트 (RPO3H-), 붕산 (RBO2H2), 카르복실레이트 (RCO2 -), 술페이트 (RSO4 -), 술포네이트 (RSO3 -), 아민 (RNH3 +), 글리세롤, 당, 예컨대 락토스로부터 선택되거나, 또는 히알루론산, 극성 아미노산, 폴리에틸렌 옥시드 및 올리고에틸렌글리콜로부터 유도되고, 임의로 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 핵산, 당, 이노시톨, 아미노산 또는 아미노산 에스테르 (예를 들어, 세린) 및 지질 (예를 들어, 지방 산 또는 탄화수소 쇄, 예컨대 C8-C30 포화 또는 불포화 탄화수소)로부터 선택된 제2 모이어티의 잔기에 접합된 제1 모이어티를 포함하는 머리기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 머리기는 다양한 다른 변형을 함유할 수 있고, 예를 들어 올리고에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌 옥시드 (PEG) 함유 머리기의 경우에, 이러한 PEG 쇄는 메틸 기로 종결될 수 있거나 또는 추가의 변형을 위한 원위 관능기를 가질 수 있다. 친수성 머리기의 예는 또한 티오포스페이트, 포스포콜린, 포스포글리세롤, 포스포에탄올아민, 포스포세린, 포스포이노시톨, 에틸포스포스포릴콜린, 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세롤, 멜라민, 글루코사민, 트리메틸아민, 스페르민, 스페르미딘, 및 접합된 카르복실레이트, 술페이트, 붕산, 술포네이트, 술페이트 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XVI)을 갖고:
Figure pct00028
여기서
Z6은 부재하거나, 또는 O 및 CH2로부터 선택되고;
Z7 및 Z9는 각각 독립적으로 O 및 NR10으로부터 선택되고, 여기서 R10은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Z8은 O 및 S로부터 선택되고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아실, 치환된 아실, 비-방향족 헤테로사이클, 치환된 비-방향족 헤테로사이클, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 및 프로모이어티로부터 선택된다.
화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, Z6은 부재한다. 다른 경우에, Z6은 CH2이다. 다른 경우에, Z6은 산소이다. 화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, Z7은 산소이고, Z9는 NR10이다. 일부 경우에, Z7은 NR10이고, Z9는 산소이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 산소이다. 다른 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 NR10이다. 일부 경우에, Z8은 산소이다. 다른 경우에, Z8은 황이다.
화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, Z7, Z8 및 Z9는 모두 산소 원자이고, Z6은 부재하거나 또는 CH2이다. 다른 경우에, Z8은 황 원자이고, Z7 및 Z9는 둘 다 산소 원자이고, Z6은 부재하거나 또는 CH2이다. 다른 경우에, Z8은 황 원자이고, Z6, Z7 및 Z9는 모두 산소 원자이다. 일부 경우에, Z8은 산소 원자이고, Z7은 NR10이고, Z9는 산소 원자이고, Z6은 부재하거나 또는 CH2이다. 다른 경우에, Z8은 산소 원자이고, Z7은 NR10이고, Z6 및 Z9는 둘 다 산소 원자이다. 다른 경우에, Z8은 산소 원자이고, Z7 및 Z9는 각각 독립적으로 NR10이고, Z6은 산소 원자이다. 또 다른 경우에, Z8은 산소 원자이고, Z7 및 Z9는 각각 독립적으로 NR10이고, Z6은 부재하거나 또는 CH2이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9는 각각 동일하다. 다른 경우에, Z7 및 Z9는 상이하다. 화학식 (XVI)의 기는 도시된 구조의 1종 이상의 호변이성질체 형태를 포함할 수 있고, 모든 이러한 형태 및 그의 염은 포함되는 것으로 의도되는 것으로 이해된다.
화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, Z7 및 Z9 중 적어도 1개는 NR10이다. 일부 경우에, R10은 수소이다. 일부 경우에, R10은 알킬이다. 일부 다른 경우에, R10은 치환된 알킬이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 NR10이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 NR10이고, 각각의 R10, R8 및 R9는 독립적으로 수소이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 NR10이고, 각각의 R10은 알킬 기이고, R8 및 R9는 각각 수소이다. 일부 경우에, Z7 및 Z9 둘 다는 NR10이고, 각각의 R10은 치환된 알킬 기 (예를 들어, 에스테르 또는 카르복실 기로 치환된 알킬 기)이고, R8 및 R9는 각각 수소이다.
화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, R8 및 R9는 둘 다 수소 원자이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 수소 이외의 치환기이다. 다른 경우에, R8 및 R9 둘 다는 수소 이외의 치환기이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 알케닐 또는 치환된 알케닐이다. 일부 다른 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 아실 또는 치환된 아실이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이다. 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다. 일부 경우에, R8 및 R9는 둘 다 알킬 기 (예를 들어, 저급 알킬)이다. 일부 경우에, R8 및 R9는 둘 다 치환된 알킬 기이다 (예를 들어, 알콕시, 치환된 알콕시, 에스테르 또는 카르복실 기로 치환된 C(1-6)알킬). 일부 경우에, R8 및 R9 중 적어도 1개는 프로모이어티를 포함한다. 특정 경우에, R8 및 R9 둘 다는 페닐 기이다. 일부 경우에, R8 및 R9는 동일하다. 다른 경우에, R8 및 R9는 상이하다.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XVIa) 내지 (XVIf) 중 어느 하나로부터 선택되며:
Figure pct00029
여기서
R10 및 R11은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아실, 치환된 아실, 카르복실, 치환된 카르복실 및 프로모이어티 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터 선택된다.
화학식 (XVIa) 내지 (XVIf)의 일부 실시양태에서, R10 및 R11은 둘 다 수소 원자이다. 일부 경우에, R10 및 R11 중 적어도 1개는 수소 이외의 치환기이다. 다른 경우에, R10 및 R11 둘 다는 수소 이외의 치환기이다. 일부 경우에, R10 및 R11은 동일하다. 다른 경우에, R10 및 R11은 상이하다. 일부 경우에, R10 및 R11 중 적어도 1개는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 일부 경우에, R10 및 R11 중 적어도 1개는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 일부 경우에, R10 및 R11 둘 다는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 일부 경우에, R10 및 R11 둘 다는 아릴 또는 치환된 아릴이다. 일부 경우에, R10 및 R11 둘 다는 아실 또는 치환된 아실이다. 일부 경우에, R10 및 R11은 둘 다 저급 알킬 기이다. 일부 경우에, R10 및 R11은 둘 다 치환된 알킬 기이다 (예를 들어, 알콕시, 치환된 알콕시, 에스테르 또는 카르복실 기로 치환된 C(1-6)알킬). 일부 경우에, R10 및 R11 중 적어도 1개는 프로모이어티를 포함한다. 특정 경우에, R10 및 R11 둘 다는 페닐 기이다.
화학식 (XVIa) 내지 (XVId)의 특정 경우에, R10 및 R11 중 적어도 1개는 절단가능한 기 또는 자기 희생적 프로모이어티를 포함한다. 자기 희생적 기는 디술피드 연결된 프로모이어티 또는 자기 희생적 에스테르 함유 프로모이어티일 수 있다. 일부 경우에, R10 및/또는 R11은 화학식: -CH2CH2-SS-R12의 디술피드 연결된 프로모이어티를 포함하며, 여기서 R12는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 특정 경우에, R12는 C8-C30 포화 또는 불포화 탄화수소 쇄이다. 일부 경우에, R10 및/또는 R11은 화학식 -CH2OCOR13의 프로모이어티를 포함하고, 여기서 R13은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 일부 경우에, R10 및/또는 R11은 화학식 -CH2C(R14)2CO2R14의 프로모이어티를 포함하고, 여기서 각각의 R14는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1 또는 그의 전구약물 형태는:
Figure pct00030
또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된다.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XVI)을 갖고:
Figure pct00031
여기서
R81 및 R91은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 아실 기, 에스테르, 아미드, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로부터 선택되거나, 또는 R81 및 R91은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 기를 형성한다.
화학식 (XVI)의 일부 실시양태에서, R81 및 R91은 둘 다 수소 원자이다. 다른 경우에, R81 및 R91 둘 다는 수소 이외의 치환기이다.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XVII)을 갖는다:
Figure pct00032
.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XVIII)을 갖고:
Figure pct00033
여기서
Z61은 부재하거나, 또는 O 및 CH2로부터 선택된다.
화학식 (XVIII)의 일부 실시양태에서, 친수성 머리기는 하기 기 중 하나로부터 선택된다:
Figure pct00034
.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XIX)을 갖는다:
Figure pct00035
.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XX)을 갖고:
Figure pct00036
여기서
R92는 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 아실 기, 에스테르, 아미드, 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬로부터 선택된다.
화학식 (XX)의 일부 실시양태에서, R92는 수소이다. 다른 경우에, R92는 수소 이외의 치환기이다. 특정 실시양태에서, R92는 알킬 또는 치환된 알킬이다. 화학식 (XX)의 특정 실시양태에서, 친수성 머리기는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00037
.
화학식 (I)-(XVb) 중 어느 하나의 일부 경우에, 친수성 머리기 X1은 화학식 (XXI)을 갖는다:
Figure pct00038
.
화학식 (I)-(XVb) 중 임의의 것의 기 X1에서 히드록실 및 아민 기 중 임의의 것은 임의의 편리한 기, 예를 들어 알킬 기, 치환된 알킬 기, 페닐 기, 치환된 페닐 기, 에스테르 기 등으로 임의로 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 임의의 편리한 대안적 친수성 기가 화학식 (I)-(XVb) 중 임의의 화합물에서 기 X1로서 이용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, ENPP1 억제제 화합물은 표 1의 구조 중 하나, 또는 그의 전구약물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 또는 그의 제약상 허용되는 염에 의해 기재된다.
표 1: ENPP1 억제제 화합물
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
특정 실시양태에서, ENPP1 억제제 화합물은 표 2의 구조 중 하나, 또는 그의 전구약물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 또는 그의 제약상 허용되는 염에 의해 기재된다.
표 2: ENPP1 억제제 화합물
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
특정 실시양태에서, ENPP1 억제제 화합물은 표 3의 구조 중 하나, 또는 그의 전구약물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 또는 그의 제약상 허용되는 염에 의해 기재된다.
표 3: ENPP1 억제제 화합물
Figure pct00050
Figure pct00051
특정 실시양태에서, 화합물은 표 1-3의 화합물 중 하나의 구조에 의해 기재된다 (본원에서, 표 1-3에 대한 언급은 표 3a를 포함함). 표 1-3에 제시된 화합물 중 임의의 것은 염 형태로 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 경우에, 화합물의 염 형태는 제약상 허용되는 염이다. 표 1-3에 제시된 화합물 중 임의의 것은 전구약물 형태로 존재할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 화합물은 표 3a의 화합물 중 하나의 구조에 의해 기재된다.
표 3a
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
본 개시내용의 측면은 ENPP1 억제제 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 그의 염 (예를 들어, 제약상 허용되는 염), 및/또는 그의 용매화물, 수화물 및/또는 전구약물 형태를 포함한다. 또한, 1개 이상의 키랄 중심을 갖는 본원에 기재된 임의의 화합물에서, 절대 입체화학이 명백하게 표시되지 않은 경우에, 각각의 중심은 독립적으로 R-배위 또는 S-배위 또는 그의 혼합일 수 있는 것으로 이해된다. 염, 용매화물, 수화물, 전구약물 및 입체이성질체의 모든 순열이 본 개시내용에 의해 포괄되는 것으로 의도된다는 것이 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 대상 ENPP1 억제제 화합물 또는 그의 전구약물 형태는 제약상 허용되는 염의 형태로 제공된다. 아민 또는 질소 함유 헤테로아릴 기를 함유하는 화합물은 성질상 염기성일 수 있고, 따라서 임의의 수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 염을 형성하는데 통상적으로 사용되는 산은 무기 산 예컨대 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 황산 및 인산, 뿐만 아니라 유기 산 예컨대 파라-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐술폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산, 및 관련 무기 및 유기 산을 포함한다. 따라서, 이러한 제약상 허용되는 염은 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트, 히푸레이트, 글루코네이트, 락토비오네이트 등의 염을 포함한다. 특정의 구체적 실시양태에서, 제약상 허용되는 산 부가염은 무기 산 예컨대 염산 및 브로민화수소산으로 형성된 것, 및 유기 산 예컨대 푸마르산 및 말레산으로 형성된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 전구약물 형태로 제공된다. "전구약물"은 활성제를 방출하기 위해 신체 내에서의 변환을 필요로 하는 활성제의 유도체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변환은 효소적 변환이다. 전구약물은 반드시는 아니지만 빈번하게, 활성제로 전환될 때까지 약리학적으로 불활성이다. "프로모이어티"는 활성제 내의 관능기를 차폐하는데 사용된 경우에 활성제를 전구약물로 전환시키는 보호기의 형태를 지칭한다. 일부 경우에, 프로모이어티는 생체내 효소적 또는 비-효소적 수단에 의해 절단되는 결합(들)을 통해 약물에 부착될 것이다. 대상 화합물의 임의의 편리한 전구약물 형태는, 예를 들어 문헌 [Rautio et al., ("Prodrugs: design and clinical applications", Nature Reviews Drug Discovery 7, 255-270 (February 2008))]에 기재된 전략 및 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 경우에, 프로모이어티는 대상 화합물의 친수성 머리기에 부착된다. 일부 경우에, 프로모이어티는 대상 화합물의 히드록시 또는 카르복실산 기에 부착된다. 특정 경우에, 프로모이어티는 아실 또는 치환된 아실 기이다. 특정 경우에, 프로모이어티는, 예를 들어 대상 화합물의 친수성 머리기에 부착된 경우에 에스테르 관능기를 형성하는 알킬 또는 치환된 알킬 기, 예를 들어 포스포네이트 에스테르, 포스페이트 에스테르 등이다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 포스폰산 또는 포스포네이트, 또는 포스페이트 머리기를 포함하는 화합물로 변환될 수 있는 포스포네이트 에스테르 또는 포스페이트 에스테르 전구약물이다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물, 그의 전구약물, 입체이성질체 또는 염은 용매화물 (예를 들어, 수화물)의 형태로 제공된다. 본원에 사용된 용어 "용매화물"은 용질, 예를 들어 전구약물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 1개 이상의 분자, 및 용매의 1개 이상의 분자에 의해 형성된 복합체 또는 응집체를 지칭한다. 이러한 용매화물은 전형적으로 실질적으로 고정된 몰비의 용질 및 용매를 갖는 결정질 고체이다. 대표적인 용매는 예로서 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세트산 등을 포함한다. 용매가 물인 경우, 형성된 용매화물은 수화물이다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 경구 투여에 의해 제공되고, 혈류 내로 흡수된다. 일부 실시양태에서, 대상 화합물의 경구 생체이용률은 30% 이상이다. 변형은 장 내강을 가로지르는 흡수 또는 그의 생체이용률을 증가시키는 임의의 편리한 방법을 사용하여 대상 화합물 또는 그의 제제에 대해 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 대사적으로 안정하다 (예를 들어, 화합물의 반감기 동안 생체내에서 실질적으로 무손상으로 유지됨). 특정 실시양태에서, 화합물은 5분 이상, 예컨대 10분 이상, 12분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 60분 이상, 2시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 또는 심지어 그 초과의 반감기 (예를 들어, 생체내 반감기)를 갖는다.
ENPP1을 억제하는 방법
상기 요약된 바와 같이, 본 개시내용의 측면은 ENPP1 억제제, 및 이를 사용한 억제 방법을 포함한다. ENPP1은 엑토-뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 (ENPP) 패밀리의 구성원이다. 따라서, 본 방법의 측면은 cGAMP에 대한 ENPP1의 히드롤라제 활성의 억제를 포함한다. 본 발명자들은 cGAMP가, cGAMP의 세포외 분해, 예를 들어 그의 분해 효소 ENPP1에 의한 가수분해를 차단하는 것에 의해 증진될 수 있는 유의한 세포외 생물학적 기능을 가질 수 있다는 것을 발견하였다. 특정 경우에, ENPP1 억제 표적은 세포외이고, 대상 ENPP1 억제 화합물은 세포-불투과성이고, 따라서 세포 내로 확산할 수 없다. 따라서, 본 방법은 ENPP1의 히드롤라제 활성의 선택적 세포외 억제 및 cGAMP의 증가된 세포외 수준을 제공할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, ENPP1 억제 화합물은 ENPP1의 활성을 세포외 억제하는 화합물이다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험은 ENPP1의 활성을 억제하는 것이 세포외 cGAMP를 증가시키고, 결과적으로 STING 경로를 부스팅할 수 있다는 것을 나타낸다.
ENPP1을 억제하는 것은 효소의 활성이 (예를 들어, 임의의 편리한 시험관내 억제 검정에서 대조군에 비해) 10% 이상, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 감소됨을 의미한다. 일부 경우에, ENPP1을 억제하는 것은 효소의 활성을 그의 정상 활성에 비해 (예를 들어, 임의의 편리한 검정에 의해 측정된 바와 같이 대조군에 비해) 2배 이상, 예컨대 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 100배 이상, 또는 1000배 이상 감소시키는 것을 의미한다.
일부 경우에, 방법은 샘플에서 ENPP1을 억제하는 방법이다. 본원에 사용된 용어 "샘플"은 반드시는 아니지만 전형적으로, 1종 이상의 관심 성분을 함유하는 유체 형태의 물질 또는 물질의 혼합물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 샘플을 세포 불투과성 ENPP1 억제제와 접촉시켜 ENPP1의 cGAMP 가수분해 활성을 억제하는 것을 포함하는, ENPP1을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 샘플은 세포 샘플이다. 일부 경우에, 샘플은 cGAMP를 포함한다. 특정 경우에, cGAMP 수준은 세포 샘플에서 (예를 들어, 억제제와 접촉되지 않은 대조군 샘플에 비해) 상승된다. 본 방법은 증가된 수준의 cGAMP를 제공할 수 있다. "cGAMP의 증가된 수준"은 대상 화합물과 접촉된 세포 샘플에서의 cGAMP의 수준을 의미하며, 여기서 샘플에서의 cGAMP 수준은 작용제와 접촉되지 않은 대조군 샘플에 비해 10% 이상, 예컨대 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 또는 심지어 그 초과만큼 증가된다.
특정 실시양태에서 ENPP1 억제제는 본원에 정의된 바와 같은 억제제이다. 일부 실시양태에서, ENPP1 억제제는 화학식 (I)-(XVb) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 중 어느 하나에 따른 억제제이다. 일부 경우에, ENPP1 억제제는 표 1-3의 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 중 어느 하나이다. 일부 경우에, ENPP1 억제제는 세포 불투과성이다.
일부 실시양태에서 ENPP1 억제제는 세포 투과성이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 샘플을 세포 투과성 ENPP1 억제제와 접촉시켜 ENPP1을 억제하는 것을 포함하는, ENPP1을 억제하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 추가의 효소에 대한 활성을 반영하는 ENPP1 억제 프로파일을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상 화합물은 1종 이상의 다른 효소를 바람직하지 않게 억제하지 않으면서 ENPP1을 특이적으로 억제한다.
일부 실시양태에서, 개시내용의 화합물은 cGAMP 및 ENPP1의 상호작용을 방해한다. 예를 들어, 대상 화합물은 cGAMP에 대한 ENPP1의 히드롤라제 활성을 억제함으로써 세포외 cGAMP를 증가시키는 작용을 할 수 있다. 임의의 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, 세포외 cGAMP를 증가시키는 것은 STING 경로를 활성화시키는 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 억제 검정에 의해, 예를 들어, 대조군 대비 대상 화합물로의 처리 후에 무세포계에서 또는 세포에서 효소의 활성 수준을 결정하는 검정에 의해 각각 IC50 또는 EC50 값을 측정함으로써 결정된 바와 같이 ENPP1을 억제한다. 특정 실시양태에서, 대상 화합물은 10 μM 이하, 예컨대 3 μM 이하, 1 μM 이하, 500 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 3 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 심지어 더 낮은 IC50 값 (또는 EC50 값)을 갖는다.
상기 요약된 바와 같이, 개시내용의 측면은 ENPP1을 억제하는 방법을 포함한다. 대상 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)은 ENPP1의 활성을 10% 내지 100%의 범위로, 예를 들어 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 억제할 수 있다. 특정 검정에서, 대상 화합물은 그의 표적을 1 x 10-6 M 이하 (예를 들어, 1 x 10-6 M 이하, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 또는 1 x 10-11 M 이하)의 IC50으로 억제할 수 있다.
ENPP1 활성을 결정하는데 사용될 수 있는 프로토콜은 많고, 무세포 검정, 예를 들어 결합 검정; 정제된 효소를 사용하는 검정, 세포 표현형을 측정하는 세포 검정, 예를 들어 유전자 발현 검정; 및 특정한 동물 (특정 실시양태에서, 표적 병원체와 관련된 상태에 대한 동물 모델일 수 있음)을 수반하는 생체내 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 샘플을 ENPP1을 특이적으로 억제하는 대상 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 시험관내 방법이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 ENPP1을 함유하는 것으로 의심되고, 본 방법은 화합물이 ENPP1을 억제하는지 여부를 평가하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 대상 화합물은 표지, 예를 들어 형광 표지를 포함하는 변형된 화합물이고, 본 방법은 샘플 내에 표지가 존재하는 경우에 이를, 예를 들어 광학 검출을 사용하여 검출하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 지지체에 의해 변형되거나 또는 지지체에 결합하는 친화성 기 (예를 들어 비오틴)에 의해 변형되어, 화합물에 결합하지 않은 임의의 샘플은 (예를 들어, 세척에 의해) 제거될 수 있다. 이어서, 특이적으로 결합된 ENPP1은 존재하는 경우에 임의의 편리한 수단을 사용하여, 예컨대 표지된 표적 특이적 프로브의 결합을 사용하여, 또는 형광 단백질 반응성 시약을 사용하여 검출될 수 있다.
본 방법의 또 다른 실시양태에서, 샘플은 ENPP1을 함유하는 것으로 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포를 유효량의 대상 ENPP1 억제제 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)과 접촉시켜 암 세포 증식을 감소시키는 것을 포함하는, 암 세포 증식을 감소시키는 방법이다. 특정 경우에, 대상 ENPP1 억제제 화합물은 세포내에서 작용할 수 있다. 방법은 화학요법제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)와 조합되어 수행될 수 있다. 암 세포는 시험관내 또는 생체내 암 세포일 수 있다. 특정 경우에, 방법은 세포를 ENPP1 억제제 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)과 접촉시키는 단계 및 세포를 화학요법제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 편리한 암 세포가 표적화될 수 있다.
치료 방법
본 개시내용의 측면은 cGAMP에 대한 ENPP1의 히드롤라제 활성을 억제하는 방법을 포함하며, 이는 cGAMP의 증가된 수준 및/또는 STING 경로의 하류 조정 (예를 들어, 활성화)을 제공한다. 본 발명자들은 cGAMP가 세포외 공간에 존재할 수 있고, ENPP1이 cGAMP의 세포외 수준을 제어할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 cGAMP가 생체내에서 유의한 세포외 생물학적 기능을 가질 수 있다는 것을 발견하였다. 본원에 기재되고 입증된 결과는 본 방법에 따른 ENPP1 억제가 생체내에서 STING 활성을 조정할 수 있고, 따라서 다양한 질환의 치료에서, 예를 들어 암 면역요법을 위한 표적으로서의 용도를 발견할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 방법은 ENPP1 활성 (예를 들어, cGAMP의 히드롤라제 활성)의 선택적 세포외 억제를 제공하여, cGAMP의 세포외 수준을 증가시키고, 인터페론 유전자의 자극인자 (STING) 경로를 활성화시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 방법은 대상체에서 STING 매개된 반응을 증가시키는 방법이다. 일부 경우에, 본 방법은 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법이다.
"STING 매개된 반응"은, 예를 들어 박테리아 병원체, 바이러스 병원체, 및 진핵 병원체에 대한 면역 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는, STING에 의해 매개되는 임의의 반응을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Ishikawa et al., Immunity 29: 538-550 (2008); Ishikawa et al., Nature 461: 788-792 (2009); 및 Sharma et al., Immunity 35: 194-207 (2011)]을 참조한다. STING는 또한 자기 DNA의 부적절한 인식에 의해 개시되는 특정 자가면역 질환 (예를 들어, 문헌 [Gall et al., Immunity 36: 120-131 (2012)] 참조), 뿐만 아니라 DNA 백신에 반응한 적응성 면역의 유도 (예를 들어, 문헌 [Ishikawa et al., Nature 461: 788-792 (2009)] 참조)에서 기능한다. 대상체에서 STING 매개된 반응을 증가시키는 것은 대조군 대상체 (예를 들어, 대상 화합물을 투여받지 않은 대상체)와 비교하여 대상체에서의 STING 매개된 반응의 증가를 의미한다. 일부 경우에, 대상체는 인간이고, 대상 화합물 및 방법은 인간 STING의 활성화를 제공한다. 일부 경우에, STING 매개된 반응은 면역 반응의 조정을 포함한다. 일부 경우에, 본 방법은 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법이다.
일부 경우에, STING 매개된 반응은 대상체에서 인터페론 (예를 들어, 유형 I 인터페론 (IFN), 유형 III 인터페론 (IFN))의 생산을 증가시키는 것을 포함한다. 인터페론 (IFN)은 다양한 생물학적 활성, 예를 들어 항바이러스, 면역조정 및 항증식성을 갖는 단백질이다. IFN은 다양한 유도제, 예컨대 바이러스, 폴리펩티드, 미토겐 등에 대한 노출에 반응하여 포유동물 세포에 의해 생산되는 비교적 소형의 종-특이적 단일 쇄 폴리펩티드이다. 인터페론은 바이러스 공격에 대해 동물 조직 및 세포를 보호하며, 중요한 숙주 방어 메카니즘이다. 인터페론은 유형-I, 유형-II 및 유형-III 인터페론으로 분류될 수 있다. 관심 포유동물 제I형 인터페론은 IFN-α (알파), IFN-β (베타), IFN-κ (카파), IFN-δ (델타), IFN-ε (엡실론), IFN-τ (타우), IFN-ω (오메가), 및 IFN-ζ (제타, 또한 리미틴으로도 공지됨)를 포함한다.
인터페론은 이들 분자가 다중 수준으로 작용하는 항암 활성을 갖기 때문에 다양한 암의 치료에서의 용도가 발견된다. 인터페론 단백질은 인간 종양 세포의 증식을 직접적으로 억제할 수 있다. 일부 경우에, 항증식 활성은 또한 다양한 승인된 화학요법제, 예컨대 시스플라틴, 5FU 및 파클리탁셀과 상승작용적이다. 인터페론 단백질의 면역조정 활성은 또한 항종양 면역 반응의 유도로 이어질 수 있다. 이러한 반응은 NK 세포의 활성화, 대식세포 활성의 자극 및 MHC 부류 I 표면 발현의 유도를 포함하며, 이는 항종양 세포독성 T 림프구 활성의 유도로 이어진다. 또한, 인터페론은 면역계에서 항원의 교차-제시에서 소정의 역할을 한다. 또한, 일부 연구는 IFN-β 단백질이 항혈관신생 활성을 가질 수 있음을 추가로 나타낸다. 혈관신생, 새로운 혈관 형성은 고형 종양의 성장에 중요하다. IFN-β는 혈관신생촉진 인자, 예컨대 bFGF 및 VEGF의 발현을 억제함으로써 혈관신생을 억제할 수 있다. 인터페론 단백질은 또한 조직 재형성에 중요한 효소, 예컨대 콜라게나제 및 엘라스타제의 발현을 조정함으로써 종양 침습성을 억제할 수 있다.
방법의 측면은 암을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 억제제를 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 암을 갖는 것으로 진단되었거나 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체이다. 임의의 편리한 ENPP1 억제제가 암을 치료하는 본 방법에 사용될 수 있다. 특정 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 화합물이다. 특정 경우에, ENPP1 억제제는 세포 불투과성 화합물이다. 특정 경우에, ENPP1 억제제는 세포 투과성 화합물이다. 특정 경우에, 암은 고형 종양 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암 (소세포암 및 비소세포암 둘 다), 갑상선암, 암종, 육종, 교모세포종, 흑색종 및 다양한 두경부 종양으로부터 선택된다. 일부 경우에, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 림프종이다.
방법의 측면은 대상체에게 치료 유효량의 세포 불투과성 ENPP1 억제제를 투여하여 cGAMP의 가수분해를 억제하고 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 특정 경우에 암은 고형 종양 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암 (소세포암 및 비소세포암 둘 다), 갑상선암, 암종, 육종, 교모세포종, 흑색종 및 다양한 두경부 종양으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 경우에, 암은 림프종이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 세포 불투과성 ENPP1 억제제는 화학식 (I)-(XVb) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 중 어느 하나의 억제제이다. 일부 경우에, ENPP1 억제제는 표 1-3의 화합물 또는 그의 전구약물 형태 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, ENPP1 억제제는 세포 투과성이다.
따라서, 방법의 측면은 샘플을 대상 화합물 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)과, 화합물이 ENPP1을 억제하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함한다. 화합물을 샘플과 접촉시키기 위한 임의의 편리한 프로토콜을 사용할 수 있다. 사용되는 특정한 프로토콜은, 예를 들어 샘플이 시험관내 샘플인지 또는 생체내 샘플인지에 따라 달라질 수 있다. 시험관내 프로토콜의 경우, 샘플과 화합물의 접촉은 임의의 편리한 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 적합한 배양 배지에서 유지되는 세포를 포함하고, 복합체는 배양 배지 내로 도입된다. 생체내 프로토콜의 경우, 임의의 편리한 투여 프로토콜이 사용될 수 있다. 화합물의 효력, 관심 세포, 투여 방식, 존재하는 세포의 수에 따라, 다양한 프로토콜이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체에서 암을 치료하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 유효량의 대상 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함한다. 대상 화합물은 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)의 일부로서 투여될 수 있다. 방법의 특정 경우에, 투여되는 화합물은 화학식 (I)-(XVb) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 중 하나의 화합물이다. 방법의 특정 경우에, 투여되는 화합물은 표 1-3의 화합물 중 하나에 의해 기재된다.
일부 실시양태에서, "유효량"은 1회 이상의 용량으로, 단독요법으로 또는 조합 요법으로 개체에게 투여되는 경우에, 화합물을 사용한 치료의 부재 하의 개체에서의 ENPP1 활성과 비교하여, 또는 대안적으로, 화합물을 사용한 치료 전 또는 후의 개체에서의 ENPP1 활성과 비교하여, ENPP1을 약 20% (20% 억제), 적어도 약 30% (30% 억제), 적어도 약 40% (40% 억제), 적어도 약 50% (50% 억제), 적어도 약 60% (60% 억제), 적어도 약 70% (70% 억제), 적어도 약 80% (80% 억제), 또는 적어도 약 90% (90% 억제)만큼 억제하는데 효과적인 대상 화합물의 양이다.
일부 실시양태에서, "치료 유효량"은, 1회 이상의 용량으로, 단독요법으로 또는 조합 요법으로 개체에게 투여되는 경우에, 화합물을 사용한 치료의 부재 하의 개체에서의 종양 부담과 비교하여, 또는 대안적으로, 화합물을 사용한 치료 전 또는 후의 대상체에서의 종양 부담과 비교하여, 대상체에서의 종양 부담을 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소시키는데 효과적인 대상 화합물의 양이다. 본원에 사용된 용어 "종양 부담"은 암을 갖는 대상체가 보유하는 종양 조직의 총 질량을 지칭한다.
일부 실시양태에서, "치료 유효량"은, 1회 이상의 용량으로, 단독요법으로 또는 조합 요법으로 개체에게 투여되는 경우에, 화합물을 사용한 치료의 부재 하에 개체에서 종양 수축을 관찰하는데 요구되는 방사선요법의 선량과 비교하여, 대상체에서 종양 수축을 관찰하는데 요구되는 방사선요법의 선량을 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 감소시키는데 효과적인 대상 화합물의 양이다.
일부 실시양태에서, 화합물의 "치료 유효량"은 암을 갖는 개체에게 1회 이상의 용량으로 투여하는 경우에 종양 크기의 1.5-log, 2-log, 2.5-log, 3-log, 3.5-log, 4-log, 4.5-log, 또는 5-log 감소를 달성하는데 효과적인 양이다.
일부 실시양태에서, 화합물의 유효량은 약 50 ng/ml 내지 약 50 μg/ml (예를 들어, 약 50 ng/ml 내지 약 40 μg/ml, 약 30 ng/ml 내지 약 20 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 10 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 800 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 700 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 600 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 약 60 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 약 70 ng/ml 내지 약 300 ng/ml, 약 60 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 약 65 ng/ml 내지 약 85 ng/ml, 약 70 ng/ml 내지 약 90 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 900 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 800 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 700 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 600 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 200 ng/ml 내지 약 400 ng/ml, 또는 약 200 ng/ml 내지 약 300 ng/ml) 범위의 양이다.
일부 실시양태에서, 화합물의 유효량은 약 10 pg 내지 약 100 mg, 예를 들어, 약 10 pg 내지 약 50 pg, 약 50 pg 내지 약 150 pg, 약 150 pg 내지 약 250 pg, 약 250 pg 내지 약 500 pg, 약 500 pg 내지 약 750 pg, 약 750 pg 내지 약 1 ng, 약 1 ng 내지 약 10 ng, 약 10 ng 내지 약 50 ng, 약 50 ng 내지 약 150 ng, 약 150 ng 내지 약 250 ng, 약 250 ng 내지 약 500 ng, 약 500 ng 내지 약 750 ng, 약 750 ng 내지 약 1 μg, 약 1 μg 내지 약 10 μg, 약 10 μg 내지 약 50 μg, 약 50 μg 내지 약 150 μg, 약 150 μg 내지 약 250 μg, 약 250 μg 내지 약 500 μg, 약 500 μg 내지 약 750 μg, 약 750 μg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 100 mg, 또는 약 50 mg 내지 약 100 mg 범위의 양이다. 양은 단일 용량일 수 있거나 또는 총 1일 양일 수 있다. 총 1일 양은 10 pg 내지 100 mg의 범위일 수 있거나, 또는 100 mg 내지 약 500 mg의 범위일 수 있거나, 또는 500 mg 내지 약 1000 mg의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물의 단일 용량이 투여된다. 다른 실시양태에서, 다중 용량이 투여된다. 다중 용량이 소정 기간에 걸쳐 투여되는 경우에, 화합물은 소정 기간에 걸쳐 1일 2회 (qid), 매일 (qd), 격일 (qod), 3일마다, 1주에 3회 (tiw), 또는 1주에 2회 (biw) 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 1일 내지 약 2년 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 qid, qd, qod, tiw, 또는 biw 투여된다. 예를 들어, 화합물은 다양한 인자에 따라 1주, 2주, 1개월, 2개월, 6개월, 1년, 또는 2년, 또는 그 초과 동안 상기 언급된 빈도 중 임의의 것으로 투여된다.
암을 갖는 개체에게 치료 유효량의 대상 화합물을 투여하는 것은 1) 종양 부담의 감소; 2) 종양 수축을 달성하는데 요구되는 방사선요법의 선량의 감소; 3) 개체에서 한 세포로부터 또 다른 세포로의 암의 확산의 감소; 4) 임상 결과에서 이환율 또는 사망률의 감소; 5) 다른 항암제와 조합되는 경우 총 치료 기간의 단축; 및 6) 질환 반응의 지표의 개선 (예를 들어, 암의 1종 이상의 증상의 감소) 중 1종 이상을 발생시킬 수 있다. 다양한 방법 중 임의의 것이 치료 방법이 효과적인지 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상 방법으로 치료받은 개체로부터 수득한 생물학적 샘플을 검정할 수 있다.
본원에 기재된 화합물 중 임의의 것이 대상 치료 방법에 이용될 수 있다. 특정 경우에, 화합물은 화학식 (I)-(XVb) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) 중 하나를 갖는다. 특정 경우에, 화합물은 표 1-3의 화합물 중 하나 또는 그의 전구약물 형태이다. 일부 경우에, 대상 방법에 이용되는 화합물은 세포 투과성이 아니다. 일부 경우에, 대상 방법에 이용되는 화합물은 불량한 세포 투과성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 화합물은 ENPP1을 특이적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 cGAMP의 활성을 조정한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 ENPP1과 cGAMP의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 STING 경로의 활성화를 유발한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 경우에, 대상체는 인간이다. 다른 대상체는 애완동물 (예를 들어, 개 및 고양이), 가축 (예를 들어, 소, 돼지, 염소, 말 등), 설치류 (예를 들어, 마우스, 기니 피그, 및 래트, 예를 들어 질환의 동물 모델에서와 같음), 뿐만 아니라 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 및 원숭이)를 포함할 수 있다. 대상체는 암의 치료를 필요로 할 수 있다. 일부 경우에, 본 방법은 본원에 기재된 암 중 어느 하나를 포함한 암을 진단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 제약 제제로서 투여된다.
특정 실시양태에서, ENPP1 억제제 화합물은 표지를 포함하는 변형된 화합물이고, 방법은 대상체에서 표지를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 표지의 선택은 검출 수단에 좌우된다. 임의의 편리한 표지화 및 검출 시스템이 본 방법에 사용될 수 있고, 예를 들어, 문헌 [Baker, "The whole picture," Nature, 463, 2010, p977-980]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 화합물은 광학 검출에 적합한 형광 표지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화합물은 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 사용한 검출을 위한 방사성표지를 포함한다. 일부 경우에, 화합물은 단층촬영 검출에 적합한 상자성 표지를 포함한다. 대상 화합물은 상기 기재된 바와 같이 표지될 수 있지만, 일부 방법에서 화합물은 비표지되고, 2차 표지제가 영상화에 사용된다.
조합 요법
대상 화합물은 단독으로 또는 추가의, 즉 제2 활성제와 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다. 조합 치료 방법에서 대상 ENPP1 억제제 화합물은 제2 활성제 또는 추가의 요법, 예를 들어 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 용어 "작용제", "화합물", 및 "약물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, ENPP1 억제제 화합물은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 약물, 예컨대 면역조정 질환 및 상태 및 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관심 질환의 치료에 사용되는 약물과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 제2 작용제, 예를 들어 소분자, 화학요법제, 항체, 항체 단편, 항체-약물 접합체, 압타머, 단백질, 또는 체크포인트 억제제를 병용으로 또는 순차적으로 공투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에 대해 방사선 요법을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
용어 "공투여" 및 "조합하여"는 구체적 시간 제한 없이 동시에, 공동으로 또는 순차적으로 2종 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 세포 또는 대상체의 신체에 동시에 존재하거나 또는 그의 생물학적 또는 치료 효과를 동시에 발휘한다. 한 실시양태에서, 치료제는 동일한 조성물 또는 단위 투여 형태이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 개별 조성물 또는 단위 투여 형태이다. 특정 실시양태에서, 제1 작용제는 제2 치료제의 투여 전에 (예를 들어, 분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 그와 병용하여, 또는 그 후에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 투여될 수 있다.
공지된 치료 약물 또는 추가의 요법과 본 개시내용의 제약 조성물의 "병용 투여"는 공지된 약물 및 본 발명의 조성물 둘 다가 치료 효과를 가질 시간에서의 화합물 및 제2 작용제 또는 추가의 요법의 투여를 의미한다. 이러한 병용 투여는 대상 화합물의 투여와 관련하여 약물의 공동 (즉, 동시), 이전 또는 후속 투여를 수반할 수 있다. 2종의 작용제의 투여 경로는 달라질 수 있으며, 여기서 대표적인 투여 경로는 하기에 보다 상세하게 기재된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 특정한 약물 또는 요법 및 화합물에 대한 투여의 적절한 시기, 순서 및 투여량을 결정하는데 어려움이 없을 것이다.
일부 실시양태에서, 화합물 (예를 들어, 대상 화합물 및 적어도 1종의 추가의 화합물 또는 요법)은 서로 24시간 내에, 예컨대 서로 12시간 내에, 서로 6시간 내에, 서로 3시간 내에, 또는 서로 1시간 내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 화합물은 서로 1시간 내에 투여된다. 특정 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 동시에 투여된다. 실질적으로 동시에 투여되는 것은 화합물이 서로 약 10분 이하, 예컨대 5분 이하, 또는 1분 이하 내에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다.
또한, 대상 화합물 및 제2 활성제의 제약 제제가 제공된다. 제약 투여 형태에서, 화합물은 그의 제약상 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 또한 단독으로 또는 적절한 회합으로, 뿐만 아니라 다른 제약 활성 화합물과 조합되어 사용될 수 있다.
본 방법 중 임의의 것과 함께, ENPP1 억제제 화합물 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음) (또는 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물)은 염증을 감소 또는 예방하거나, 만성 염증 또는 섬유증을 치료 또는 예방하거나, 또는 암을 치료하도록 설계된 또 다른 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 각 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 다른 약물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 특정 경우에, 암은 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암 (소세포암 및 비소세포암 둘 다), 갑상선암, 암종, 육종, 신경교종, 교모세포종, 흑색종 및 다양한 두경부 종양으로부터 선택된다.
암의 치료를 위해, ENPP1 억제제 화합물은 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사물, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 스테로이드 호르몬, 탁산, 뉴클레오시드 유사체, 스테로이드, 안트라시클린, 갑상선 호르몬 대체 약물, 티미딜레이트-표적화 약물, 키메라 항원 수용체/T 세포 요법, 키메라 항원 수용체/NK 세포 요법, 아폽토시스 조절자 억제제 (예를 들어, B 세포 CLL/림프종 2 (BCL-2) BCL-2-유사 1 (BCL-XL) 억제제), CARP-1/CCAR1 (세포 분열 주기 및 아폽토시스 조절자 1) 억제제, 콜로니-자극 인자-1 수용체 (CSF1R) 억제제, CD47 억제제, 암 백신 (예를 들어, Th17-유도 수지상 세포 백신, 또는 유전자 변형된 티로시나제, 예컨대 온셉트(Oncept)®) 및 다른 세포 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제와 조합되어 투여될 수 있다.
구체적인 관심 화학요법제는 겜시타빈, 도세탁셀, 블레오마이신, 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 보수티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 트라메티닙, 베바시주맙, 수니티닙, 소라페닙, 트라스투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 리툭시맙, 이필리무맙, 라파마이신, 템시롤리무스, 에베롤리무스, 메토트렉세이트, 독소루비신, 아브락산, 폴피리녹스, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 테이수모, 파클리탁셀, 프레드니손, 레보티록신, 페메트렉세드, 나비토클락스, 및 ABT-199를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 화합물이 또한 사용될 수 있다. 관심 암 화학요법제는 돌라스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체; 및 아우리스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, WO 96/33212, WO 96/14856, 및 U.S. 6,323,315를 참조한다. 적합한 암 화학요법제는 또한 메이탄시노이드 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, EP 1391213; 및 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623] 참조); 두오카르마이신 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1 포함); 및 벤조디아제핀 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 피롤로벤조디아제핀 (PBD))를 포함한다.
일부 실시양태에서, ENPP1 억제제 화합물은 암을 치료하기 위해 화학요법제와 조합되어 투여될 수 있다. 특정 경우에, 화학요법제는 겜시타빈이다. 일부 경우에, 화학요법제는 도세탁셀이다. 일부 경우에, 화학요법제는 아브락산이다.
암 (예를 들어, 고형 종양 암)의 치료를 위해, ENPP1 억제제 화합물은 면역요법제와 조합되어 투여될 수 있다. 면역요법제는 면역 반응을 유도, 증진, 또는 억제함으로써 질환 치료에서의 용도가 발견된 임의의 편리한 작용제이다. 일부 경우에, 면역요법제는 면역 체크포인트 억제제이다. 예를 들어, 도 21a-4c는 예시적인 ENPP1 억제제가 마우스 모델에서 면역 체크포인트 억제제와 상승작용적으로 작용할 수 있다는 것을 예시한다. 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4) 억제제, 프로그램화된 사멸 1 (PD-1) 억제제 및 PD-L1 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 편리한 체크포인트 억제제가 이용될 수 있다. 특정 경우에, 체크포인트 억제제는 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4) 억제제, 프로그램화된 사멸 1 (PD-1) 억제제 및 PD-L1 억제제로부터 선택된다. 예시적인 관심 체크포인트 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암 및/또는 염증성 질환의 치료를 위해, 면역조정 폴리펩티드(들)는 콜로니-자극 인자-1 수용체 (CSF1R) 억제제와 조합되어 투여될 수 있다. 관심 CSF1R 억제제는 에막투주맙을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
임의의 편리한 암 백신 요법 및 작용제가 대상 ENPP1 억제제 화합물, 조성물 및 방법과 조합되어 사용될 수 있다. 암, 예를 들어 난소암의 치료를 위해, ENPP1 억제제 화합물은 백신접종 요법, 예를 들어 Th1/Th17 면역을 촉진하는 수지상 세포 (DC) 백신접종 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. Th17 세포 침윤은 난소암 환자에서 현저하게 연장된 전체 생존과 상관관계가 있다. 일부 경우에, ENPP1 억제제 화합물은 Th17-유도 백신접종과 조합된 보조 치료로서의 용도가 발견된다.
또한 관심 대상은 문헌 [Rishi et al., Journal of Biomedical Nanotechnology, Volume 11, Number 9, September 2015, pp. 1608-1627(20)]에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CARP-1/CCAR1 (세포 분열 주기 및 아폽토시스 조절자 1) 억제제, 및 항-CD47 항체 작용제, 예컨대 Hu5F9-G4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 CD47 억제제인 작용제이다.
특정 경우에, 조합물은 어느 하나의 성분 단독에 비해 증진된 효과를 제공하고; 일부 경우에, 조합물은 성분의 조합 효과 또는 상가적 효과에 비해 초상가적 효과 또는 상승작용적 효과를 제공한다. 대상 화합물 및 화학요법제의 다양한 조합물이 이용될 수 있고, 이는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다. 다중 투여량의 경우, 2종의 작용제는 직접 교대될 수 있거나, 또는 1종의 작용제의 2회 이상의 용량이, 예를 들어 다른 작용제의 단일 용량과 교대될 수 있다. 둘 다의 작용제의 동시 투여는 또한 개별 작용제의 투여량과 교대되거나 또는 달리 사이에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 투여량 사이의 시간은 치료 개시 후 약 1-6시간 내지 약 6-12시간, 내지 약 12-24시간, 내지 약 1-2일, 내지 약 1-2주 또는 그 초과의 기간일 수 있다.
cGAMP-유도 화학요법제와의 조합
본 개시내용의 측면은 암을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 ENPP1 억제제 화합물 (또는 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물)은 생체내에서 cGAMP의 생산을 유도할 수 있는 화학요법제와 조합되어 투여될 수 있다. 대상체가 유효량의 특정한 화학요법제에 노출되는 경우에, 2'3'-cGAMP의 생산이 대상체에서 유도될 수 있다. cGAMP의 유도된 수준은 cGAMP의 분해를 방지하기 위해 대상 ENPP1 억제제 화합물이 공투여되는 경우에 유지 및/또는 증진될 수 있고, 예를 들어 어느 하나의 작용제 단독에 의해 달성되는 수준과 비교하여 증진될 수 있다. DNA 손상을 초래할 수 있고 압도적인 복구 또는 분해 메카니즘으로 인해 죽어가는 세포에 의한 cGAMP 생산을 유도할 수 있는 임의의 편리한 화학요법제, 예컨대 알킬화제, 핵산 유사체, 및 삽입제가 본 발명의 조합 치료 방법에 사용될 수 있다. 일부 경우에, cGAMP-유도 화학요법제는 항유사분열제이다. 항유사분열제는 DNA를 손상시키거나 미세관에 결합함으로써 작용하는 작용제이다. 일부 경우에, cGAMP-유도 화학요법제는 항신생물제이다.
본 조합 요법을 사용하여 치료될 수 있는 관심 암은 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암 (소세포암 및 비소세포암 둘 다), 갑상선암, 암종, 육종, 신경교종, 교모세포종, 흑색종 및 다양한 두경부 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 암은 유방암이다. 특정 경우에, 암은 신경교종 또는 교모세포종이다.
관심 화학요법제는 우라실 유사체, 플루오로우라실 전구약물, 티미딜레이트 신타제 억제제, 데옥시시티딘 유사체, DNA 합성 억제제 (예를 들어, S-기 아폽토시스를 유도함), 폴레이트 유사체, 데히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 안트라시클린, 삽입제 (예를 들어, 이중 가닥 파괴를 유도함), 토포이소머라제 IIa 억제제, 탁산, 미세관 해체 억제제 (예를 들어, G2/M 기 정지/아폽토시스를 유도함), 미세관 조립 억제제, 미세관 기능 안정화제 (예를 들어, G2/M-기 아폽토시스를 유도함), 튜불린 중합 프로모터, 튜불린 결합제 (예를 들어, M-기 정지에 의한 아폽토시스를 유도함), 에포틸론 B 유사체, 빈카 알칼로이드, 질소 머스타드, 니트로소우레아, DNA 알킬화제 (예를 들어, 가닥간 가교, p53을 통한 아폽토시스를 유도함), VEGF 억제제, 항혈관신생 항체, HER2 억제제, 퀴나졸린 HER2 억제제, EGFR 억제제, 티로신 키나제 억제제, 시롤리무스 유사체, mTORC1 억제제 (예를 들어, 유방암에서 엑세메스탄 = 에스트로겐 생산을 억제하는 아로마스타제 억제제와 조합), 트리아젠, 다카르바진 전구약물, 메틸히드라진을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 관심 유방암 화학요법제는 카페시타빈, 카르모푸르, 플루오로우라실, 테가푸르, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 독소루비신, 에피루비신, 도세탁셀, 익사베필론, 빈데신, 비노렐빈, 시클로포스파미드, 베바시주맙, 페르투주맙, 트라스투주맙, 라파티닙 및 에베롤리무스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 신경교종 / 교모세포종 관련 항신생물 약물은: 카르무스틴, 로무스틴, 테모졸로미드, 프로카르바진, 빈크리스틴 및 베바시주맙을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 관심 DNA 손상 화학요법제는 멜팔란, 시스플라틴, 및 에토포시드, 플루오로우라실, 겜시타빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조합 방사선 요법
대안적으로, 암을 치료하는 방법을 위해, ENPP1 억제제 화합물 (또는 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물)은 방사선 요법과 조합되어 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 것을 포함한다. 다시, ENPP1 억제제 화합물은 방사선 요법의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 따라서, 본 방법은 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방사선 요법 및 대상 화합물의 투여의 조합은 상승작용적 치료 효과를 제공할 수 있다. 대상체가 방사선 요법 (RT) 동안 적합한 선량 및/또는 빈도의 방사선에 노출되는 경우에, 2'3'-cGAMP의 생산이 대상체에서 유도될 수 있다. cGAMP의 이러한 유도된 수준은 cGAMP의 분해를 방지하기 위해 대상 ENPP1 억제제 화합물이 공투여되는 경우에 유지 및/또는 증진될 수 있고, 예를 들어 RT 단독에 의해 달성되는 수준과 비교하여 증진될 수 있다. 예를 들어, 도 21a는 예시적인 ENPP1 억제제가 마우스 모델에서 방사선 요법 (RT)과 상승작용적으로 작용하여 종양 부담을 감소시킬 수 있음을 예시한다. 따라서, 본 방법의 측면은 방사선 치료 단독의 치료 유효 선량 및/또는 빈도/요법과 비교하여 방사선 치료의 감소된 선량 및/또는 빈도/요법의 투여를 포함한다. 일부 경우에, 방사선 요법은 대상체에 대한 방사선 손상, 예를 들어 방사선 치료 단독의 치료 유효 선량 및/또는 빈도/요법 하에 발생할 것으로 예상되는 방사선 손상의 위험을 감소시키는데 유효한 선량 및/또는 빈도로 대상 화합물과 조합되어 투여된다.
일부 경우에, 방법은 방사선 요법 전에 대상체에게 ENPP1 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 대상체를 방사선 요법에 노출시킨 후에 대상체에게 ENPP1 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 특정 경우에, 방법은 방사선 요법, 이어서 ENPP1 억제제, 이어서 체크포인트 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 순차적으로 투여하는 것을 포함한다.
유용성
예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물 및 방법은 다양한 적용분야에서의 용도가 발견된다. 관심 적용분야는 연구 적용분야 및 치료 적용분야를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법은 ENPP1의 억제가 바람직한 임의의 편리한 적용분야를 포함한 다양한 상이한 적용분야에서의 용도가 발견된다.
대상 화합물 및 방법은 다양한 연구 적용분야에서의 용도가 발견된다. 대상 화합물 및 방법은 화합물의 생체이용률 및 대사 안정성의 최적화에 사용될 수 있다.
대상 화합물 및 방법은 다양한 치료 적용분야에서의 용도가 발견된다. 관심 치료 적용분야는 암 치료에서의 적용분야를 포함한다. 따라서, 대상 화합물은 숙주에서의 암의 억제 및/또는 치료가 바람직한 다양한 상이한 상태의 치료에서의 용도가 발견된다. 예를 들어, 대상 화합물 및 방법은 고형 종양 암 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)을 치료하는데 있어서 용도가 발견될 수 있다.
제약 조성물
본원에 논의된 화합물은 임의의 편리한 부형제, 시약 및 방법을 사용하여 제제화될 수 있다. 조성물은 제약상 허용되는 부형제(들)와 함께 제제로 제공된다. 매우 다양한 제약상 허용되는 부형제가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 본원에서 상세하게 논의될 필요 없다. 제약상 허용되는 부형제는, 예를 들어 문헌 [A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.]을 포함한 다양한 간행물에 상세하게 기재되어 있다.
제약상 허용되는 부형제, 예컨대 비히클, 아주반트, 담체 또는 희석제는 공중에게 용이하게 입수가능하다. 또한, 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 안정화제, 습윤제 등이 공중에게 용이하게 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물은 수성 완충제 중에 제제화된다. 적합한 수성 완충제는 농도가 5mM 내지 100mM로 다양한 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 및 포스페이트 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 수성 완충제는 등장성 용액을 제공하는 시약을 포함한다. 이러한 시약은 염화나트륨; 및 당, 예를 들어 만니톨, 덱스트로스, 수크로스 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 수성 완충제는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80을 추가로 포함한다. 임의로, 제제는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 벤질 알콜, 페놀, 클로로부탄올, 벤즈알코늄 클로라이드 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 많은 경우에, 제제는 약 4℃에서 저장된다. 제제는 또한 동결건조될 수 있으며, 이 경우에 이는 일반적으로 동결보호제, 예컨대 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스, 만니톨 등을 포함한다. 동결건조 제제는 심지어 주위 온도에서도 장기간에 걸쳐 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상 화합물은 지속 방출을 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물 및 제2 활성제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음), 예를 들어 소분자, 화학요법제, 항체, 항체 단편, 항체-약물 접합체, 압타머, 또는 단백질 등은 제약상 허용되는 부형제(들)와 함께 제제로 (예를 들어, 동일한 제제 또는 개별 제제로) 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 활성제는 체크포인트 억제제, 예를 들어 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4) 억제제, 프로그램화된 사멸 1 (PD-1) 억제제, 또는 PD-L1 억제제이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 이성질체, 호변이성질체 또는 전구약물을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지고, 추가로 1종 이상의 추가의 관심 활성제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 임의의 편리한 활성제가 대상 화합물과 함께 대상 방법에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 체크포인트 억제제이다. 대상 화합물 및 체크포인트 억제제, 뿐만 아니라 조합 요법을 위한 본원에 기재된 바와 같은 추가의 치료제는 경구로, 피하로, 근육내로, 비강내로, 비경구로, 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 대상 화합물 및 제2 활성제 (존재하는 경우)는 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 치료제는, 예를 들어 경구, 직장, 비강, 국소 (경피, 에어로졸, 협측 및 설하 포함), 질, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함), 방광내 또는 이환 기관 내로의 주사를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 경우에, 치료제는 비강내로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료제는 종양내로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상 화합물 및 화학요법제는 제약상 허용되는 부형제(들)와 함께 제제로 (예를 들어, 동일한 또는 개별 제제로) 개체에게 투여된다. 화학요법제는 알킬화제, 니트로소우레아, 항대사물, 항종양 항생제, 식물 (빈카) 알칼로이드, 및 스테로이드 호르몬을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 화합물이 또한 사용될 수 있다. 적합한 암 화학요법제는 돌라스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체; 및 아우리스타틴 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 등)를 포함한다. 예를 들어, WO 96/33212, WO 96/14856, 및 U.S. 6,323,315를 참조한다. 적합한 암 화학요법제는 또한 메이탄시노이드 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, EP 1391213; 및 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623] 참조); 두오카르마이신 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1 포함); 및 벤조디아제핀 및 그의 활성 유사체 및 유도체 (예를 들어, 피롤로벤조디아제핀 (PBD))를 포함한다.
대상 화합물 및 제2 화학요법제, 뿐만 아니라 조합 요법을 위한 본원에 기재된 바와 같은 추가의 치료제는 경구로, 피하로, 근육내로, 비경구로, 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 대상 화합물 및 제2 화학요법제는 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 치료제는, 예를 들어 경구, 직장, 비강, 국소 (경피, 에어로졸, 협측 및 설하 포함), 질, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함), 방광내 또는 이환 기관 내로의 주사를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다.
대상 화합물은 단위 투여 형태로 투여될 수 있고, 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 대상 화합물을 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하는 것을 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 선택된 투여 경로 및 표준 제약 실시에 기초하여 선택된다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 "제약상 허용되는" 것이어야 한다. 이러한 담체는 고체 또는 액체일 수 있고, 유형은 일반적으로 사용되는 투여의 유형에 기초하여 선택된다.
적합한 고체 담체의 예는 락토스, 수크로스, 젤라틴, 한천 및 벌크 분말을 포함한다. 적합한 액체 담체의 예는 물, 제약상 허용되는 지방 및 오일, 알콜 또는 다른 유기 용매, 예컨대 에스테르, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르, 현탁액, 용액 및/또는 현탁액, 및 비-발포성 과립으로부터 재구성된 용액 및/또는 현탁액 및 발포성 과립으로부터 재구성된 발포성 제제를 포함한다. 이러한 액체 담체는, 예를 들어 적합한 용매, 보존제, 유화제, 현탁화제, 희석제, 감미제, 증점제, 및 용융제를 함유할 수 있다. 바람직한 담체는 식용 오일, 예를 들어 옥수수 또는 카놀라 오일이다. 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 PEG도 또한 우수한 담체이다.
본 개시내용의 투여 요법을 제공하는 임의의 약물 전달 장치 또는 시스템이 사용될 수 있다. 매우 다양한 전달 장치 및 시스템이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
실시예
하기 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용의 실시양태를 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 또한 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
본 발명이 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 진정한 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 치환될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 특정한 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 개시내용의 목적, 취지 및 범주에 적합화하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
실시예 1: 화합물의 합성
화합물은 임의의 편리한 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 본 개시내용의 화합물을 제조하는데 사용하기 위해 적합화될 수 있는 방법은 실시예 1a-1c에 기재된 예시적인 합성 방법, 및 그의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 2018년 9월 7일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/050018 (Li et al.)에 기재된 방법을 포함한다. 개시된 화합물을 합성하는데 유용한 통상적으로 공지된 화학적 합성 반응식 및 조건을 제공하는 많은 일반적 참고문헌이 또한 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978] 참조). 반응은 박층 크로마토그래피 (TLC), LC/MS, 및 LC/MS 및 1H NMR에 의해 특징화되는 반응 생성물에 의해 모니터링될 수 있다. 중간체 및 최종 생성물은 실리카 겔 크로마토그래피 또는 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
실시예 1a: 예시적인 합성 반응식 화합물 1
본 개시내용의 화합물을 제조하는데 사용하기 위해 적합화될 수 있는 화합물 1의 합성이 하기에 제시된다:
Figure pct00061
디메틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트의 제조
Figure pct00062
수소화나트륨 (2.16 g, 54.11 mmol)을 톨루엔 (100 mL) 중 비스(디메톡시포스포릴)메탄 (11.42 g, 49.19 mmol)의 교반 용액에 실온에서 조심스럽게 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 두고, 온도를 40℃ 미만으로 유지시키면서 톨루엔 (50 mL) 중 1-벤질피페리딘-4-카르브알데히드 (10 g, 49.19 mmol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반되도록 한 다음, 수성 포화 염화암모늄 용액을 첨가하여 켄칭하였다. 유기 상을 분리하고, 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (120 g SiO2; 헥산 중 EtOAc의 5에서 100% 구배)하여 디메틸 (E)-(2-(1-벤질피페리딘-4-일)비닐)포스포네이트 (6.2 g, 16%)를 무색 오일로서 수득하였다.
에탄올 (40 mL) 중 디메틸 (E)-(2-(1-벤질피페리딘-4-일)비닐)포스포네이트 (3.7 g, 12.0 mmol)의 혼합물에 Pd/C (1.1 g, 10.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 12시간 동안 교반하고, 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켜 디메틸 (2-(피페리딘-4 일)에틸)포스포네이트 (2.7 g, 100%)를 무색 오일로서 수득하였다.
디메틸 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트의 제조
Figure pct00063
디이소프로필에틸아민 (0.6 g, 8.9 mmol)을 이소프로필 알콜 (20 mL) 중 디메틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 (1.1 g, 4.9 mmol) 및 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 (1.0 g, 4.5 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 90℃에서 3시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 실리카 겔 (디클로로메탄 중 5% MeOH) 정제하여 디메틸 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 (755 mg, 37%)를 오일로서 수득하였다.
LC-MS: m/z = 410.25 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.65 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 4.19 (dq, J = 14.0, 2.9, 2.4 Hz, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.05 (td, J = 12.8, 2.3 Hz, 2H), 1.93 - 1.77 (m, 4H), 1.67 (ddd, J = 14.1, 9.5, 5.9 Hz, 3H), 1.46 (qd, J = 12.2, 3.7 Hz, 2H).
디메틸 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4일)에틸)포스폰산 (화합물 1)의 제조
Figure pct00064
브로모트리메틸실란 (3.67 g, 24 mmol)을 빙조로 냉각시킨 클로로포름 (60 mL) 중 디메틸 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 (3.25 g, 7.94 mmol)의 냉각된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 90분 후에 메탄올 (20 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에 증발 건조시킨 다음, 메탄올 (100 mL) 중에 용매화시켰다. 반응 혼합물을 절반 부피로 농축시키고, 여과하여 침전물을 제거한 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로 결정화하고, 여과하고, 진공 하에 건조시켜 디메틸 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 (2.1 g, 69%)을 수득하였다.
LC-MS: m/z = 381.8 [M+H]+
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.71 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.48 (t, J = 12.7 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 4H), 1.40-1.27 (m, 2H).
실시예 1b: 화합물 5의 합성 (표 1)
하기 제시된 합성 반응식을 사용하여 화합물 5를 제조하였다:
Figure pct00065
실시예 1c: 화합물 6의 합성 (표 1)
하기 제시된 합성 반응식을 사용하여 화합물 6을 제조하였다:
Figure pct00066
화학적 합성: 달리 나타내지 않는 한, 반응은 주위 분위기 하에 수행하였다. 정성적 TLC 분석을 250 mm 두께, 60 Å, 유리 배킹된, F254 실리카 (실리사이클(Silicycle), 캐나다 퀘벡 시티) 상에서 수행하였다. UV 광 및 p-아니스알데히드 또는 KMnO4 염색 용액에의 노출에 이은 가열을 사용하여 가시화를 달성하였다. 사용된 모든 용매는 ACS 등급 슈어-실(Sure-Seal)이었고, 모든 다른 시약은 달리 나타내지 않는 한 제공받은 대로 사용하였다. 상업적으로 입수가능하지 않은 4-클로로퀴나졸린 및 4-클로로3-퀴놀린 니트릴의 합성은 아민 빌딩 블록과 함께 보충 정보에 기재되어 있다. 플래쉬 크로마토그래피는 텔레다인 이스코(Teledyne Isco) 정제 시스템 상에서 실리카 겔 플래쉬 카트리지 (실리사이클®, 실리아셉(SiliaSep)™ 40-63 μm, 60Å)를 사용하여 수행하였다. HPLC는 애질런트 1260 인피니티(Agilent 1260 Infinity) 정제용 규모 정제 시스템 상에서 애질런트 PrepHT 조르박스 이클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C18 역상 칼럼 (21.2 x 250 mm)을 사용하여 수행하였다. 구조 결정은 브루커(Bruker) AV-500 분광계 상에 기록된 1H 스펙트럼, 및 시마즈(Shimadzu) 20-20 ESI LCMS 기기 상에 수집된 저해상도 질량 스펙트럼 (ESI-MS)을 사용하여 수행하였다. 구조 결정은 브루커 AV-500 또는 AV-400 분광계 상에 기록된 1H 스펙트럼, 및 시마즈 20-20 ESI LCMS 기기 상에 수집된 저해상도 질량 스펙트럼 (ESI-MS)을 사용하여 수행하였다. 최종 화합물 순도는 HPLC-MS에 의해 결정된 바와 같이 >95%였다. 모든 최종 화합물 1H 스펙트럼은 예상된 구조와 일치하였다.
우레아 4 및 5의 합성.
Figure pct00067
1-(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)우레아 4 (표 3a)의 제조
이소프로판올 (5 mL) 중 1-(2-(피페리딘-4-일)에틸)우레아 64 (173 mg, 1.01 mmol)의 용액에 질소 분위기 하에 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (181 mg, 0.81 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (391 mg, 3.03 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제 (정제용 HPLC)하여 표제 화합물 4 (172 mg, 47%)를 담황색 결정으로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 360.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 5.92-5.90 (m, 1H), 5.36 (br s, 2H), 4.13-4.09 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.04-2.94 (m, 4H), 1.81-1.78 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 1H) 및 1.38-1.33 (m, 4H).
1-((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)우레아 5 (표 3a)의 제조
이소프로판올 (10 mL) 중 1-(피페리딘-4-일메틸)우레아 65 (155 mg, 0.97 mmol)의 용액에 질소 분위기 하에 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (174 mg, 0.78 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (394 mg, 2.9 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2: 디클로로메탄 중 0에서 6% MeOH)하여 목적 생성물 5 (150 mg, 44%)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 346.0
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.44 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 4.28-4.24 (m, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.13-3.07 (m, 4H), 1.94-1.87 (m, 3H) 및 1.50-1.41 (m, 2H).
3-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)프로판산 6 (표 3a)의 제조
Figure pct00068
4-클로로-6,7-디메톡시-퀴나졸린 63 (3.14g, 13.98 mmol) 및 3-(4-피페리딜)프로판산 (2.0 g, 12.72 mmol)을 이소프로판올 (100 mL) 중에 현탁시키고, 90℃에서 3시간 동안 교반하였다. 냉각되면, 혼합물을 감압 하에 증발 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 CH2Cl2 (20 mL)로 연화처리하여 표제 화합물 6 (1.87 g, 42%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ
(2-(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)보론산 7 (표 3a)의 제조
Figure pct00069
용매 중 tert-부틸 4-에티닐피페리딘-1-카르복실레이트 66 (2.92 g, 13.95 mmol), 비스(시클로펜타디에닐)지르코늄 클로라이드 히드라이드 (150 mg, 0.518 mmol) 및 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 67 (1.49 g, 11.63 mmol)의 용액을 60℃에서 16시간 동안 교반한 다음, 에테르로 희석하고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2; 석유 에테르 중 2-5% 에틸 아세테이트)하여 68 (4.2 g, 89%)을 수득하였다. MeOH (500 mL) 중 tert-부틸 (E)-4-(2-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)비닐)피페리딘-1-카르복실레이트 68 (4.2 g, 12.46 mmol) 및 탄소 상 팔라듐 (840 mg, 20% w/w)의 혼합물을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 셀라이트(Celite)® 패드를 통해 여과한 다음, 감압 하에 증발 건조시켜, 69 (4.2 g, 92%)를 수득하였다. 1M 수성 HCl 용액 (4 mL) 용액을 MeOH/헥산 (5 mL/5 mL) 중 73 (460 mg, 1.36 mmol)의 냉각된 (0℃) 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켜 (2-(피페리딘-4-일)에틸)보론산 70 (180 mg, 68%)을 히드로클로라이드 염으로서 수득하였다. THF (5 mL) 중 70 (140 mg, 1.04 mmol)의 용액에 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (180 mg, 0.935 mmol)에 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (360 mg, 1.87 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제 (정제용 HPLC)하여 표제 화합물을 담황색 고체 (105 mg; 37%)로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 346.3.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.67 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 4.62-4.59 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.42-3.36 (m, 4H), 2.46 (s, 1H), 1.88-1.86 (m, 2h), 1.29-1.14 (m, 3H) 및 0.60-0.56 (m, 2H).
히드록삼산 8 및 9의 제조.
Figure pct00070
2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)-N-히드록시아세트아미드 8 (표 3a)의 제조
i-PrOH (6 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (600 mg, 2.68 mmol) 및 에틸 2-(피페리딘-4-일)아세테이트 71 (504 mg, 2.95 mmol)의 혼합물을 밀봉된 튜브에서 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 에틸 2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)아세테이트 (750 mg, 77%)를 수득하였다. H2O 중 2M NaOH 용액 (1 mL)을 THF (10 mL) 중 에틸 2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)아세테이트 (250 mg, 0.696 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 1M HCl 용액을 첨가하여 켄칭하였다. 유기 상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켜 산 72 (200 mg, 86%)를 백색 고체로서 수득하였다.
THF (10 mL) 중 산 72 (300 mg, 0.906 mmol)의 혼합물에 NH2OH·HCl (76 mg, 1.09 mmol), DIEA (468 mg, 3.63 mmol) 및 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP) (481 mg, 1.09 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수 용액으로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2, 용매)하여 표제 생성물 8 (180 mg, 77%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 347.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.42 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 4.68-4.62 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.51-3.45 (m, 2H), 2.21-2.15 (m, 3H), 1.93-1.0 (m, 2H) 및 1.45-1.36 (m, 2H).
1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)-N-히드록시피페리딘-4-카르복스아미드 9 (표 3a)의 제조.
8에 대한 절차에 따르되 에틸 피페리딘-4-카르복실레이트 73을 사용하여 합성하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 333.25.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.39 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 4.62-4.58 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.47-3.41 (m, 2H), 2.65-2.60 (m, 1H), 1.97-1.94 (m, 2H) 및 1.82-1.77 (m, 2H).
화합물 10, 11, 12, 13 및 16 (표 3a)에 대한 일반적 절차.
Figure pct00071
2-(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에탄-1-올 77의 제조.
이소프로판올 (10 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (1.0 g, 4.46 mmol) 및 피페리딘-4-일에탄올 79 (633 mg, 4.91 mmol)의 혼합물을 밀봉된 튜브에서 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (SiO2; 석유 에테르 중 EtOAc)에 의해 정제하여 2-(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에탄-1-올 75 (1.3 g, 91%)를 수득하였다.
(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 78의 제조.
i-PrOH (10 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (900 mg, 4.02 mmol) 및 피페리딘-4-일메탄올 76 (508 mg, 4.42 mmol)의 혼합물을 밀봉된 튜브에서 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2; 석유 에테르 중 10에서 80% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 (1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 78 (1g, 82%)을 수득하였다.
2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸 디히드로겐 포스페이트 10 (표 3a)의 제조
2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에탄-1-올 77 (340 mg, 1.07 mmol)을 건조 피리딘 10 mL 중에 용해시킨 다음, 이를 -15℃로 냉각시키고, 10분 동안 교반하였다. POCl3 (821 mg, 5.4 mmol)을 N2 분위기 하에 적가하였다. 반응 온도를 0℃로 천천히 상승시킨 다음, 추가로 30분 동안 다시 교반하였다. 혼합물을 0℃에서 탄산수소나트륨 용액 (250 mL 물 중 800 mg)에 부었다. 목적 화합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상을 농축시키고, 정제용 HPLC로 정제하여 2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸 디히드로겐 포스페이트 10 (52 mg, 12%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 398.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 4.28-4.16 (m, 2H), 3.93 (s, 8H), 3.13-3.04 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.75 (s, 1H), 1.59 (d, J = 6.4 Hz, 2H) 및 1.44-1.32 (m, 2H).
(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메틸 디히드로겐 포스페이트 11 (표 3a)의 제조
(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 78 (100 mg, 0.33 mmol)을 무수 피리딘 (3 mL) 중에 용해시킨 다음, -15℃로 냉각시키고, 10분 동안 교반하였다. POCl3 (253 mg, 1.65 mmol)을 질소 분위기 하에 적가하였다. 반응 온도를 0℃로 천천히 상승시킨 다음, 추가로 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃에서 수성 NaHCO3 용액 (물 50 mL 중 160 mg)에 부었다. 목적 화합물을 디클로로메탄으로 추출한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 (1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메틸 디히드로겐 포스페이트 11 (70 mg, 55%)을 동결건조 후에 백색 분말로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 384.20.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.74 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 4.66 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.97 (m, J = 12.6, 1.6 Hz, 8H), 3.76 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.19-2.00 (m, 1H), 1.92 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 1.45 (dd, J = 14.2, 10.7 Hz, 1H).
O-(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸) O,O-디히드로겐 포스포로티오에이트 12 (표 3a)의 제조
건조 피리딘 (5 mL) 중 2-(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에탄-1-올 77 (150 mg, 0.473 mmol)의 용액에 -15℃에서 P(S)Cl3 (477 mg, 2.84 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 H2O (50 mL) 중 NaHCO3 (238 mg, 2.84 mmol)의 용액에 부었다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 진행을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 이어서, 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 화합물 12 (16 mg, 8%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 414.05.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.62 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 4.45 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 3.91 (d, J = 11.3 Hz, 10H), 1.86 (d, J = 12.2 Hz, 3H), 1.56 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 1.34 (d, J = 10.7 Hz, 2H).
O-((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)O,O-디히드로겐 포스포로티오에이트 13 (표 3a)의 제조.
건조 피리딘 (5 mL) 중 (1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 78 (100 mg, 0.330 mmol)의 용액에 -15℃에서 P(S)Cl3 (280 mg, 1.98 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 H2O (50 mL) 중 NaHCO3 (116 mg, 1.98 mmol)의 용액에 부었다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 증발 건조시키고, 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 화합물 13 (10 mg, 7.6%)을 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 400.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.25 (d, J = 13.4 Hz, 2H), 3.89 (d, J = 9.1 Hz, 6H), 3.76 (s, 2H), 3.10 (d, J = 11.8 Hz, 3H), 1.94 (s, 1H), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.39 (d, J = 11.4 Hz, 1H).
((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)포스폰산 16의 제조.
무수 CH2Cl2 (40 mL) 중 PPh3 (3.39 g, 15 mmol) 및 이미다졸 (1.02 g, 15 mmol)을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, I2 (3.8g, 15 mmol)를 첨가하였다. 조 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 두고, 추가로 10분 동안 교반한 다음, (1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 78 (3.03 g, 10 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 반응물을 수성 Na2S2O3의 첨가에 의해 켄칭하였다. 조 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고, 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 메탄올로부터 재결정화하여 4-(4-(아이오도메틸)피페리딘-1-일)-6,7-디메톡시퀴나졸린 (2.28 g, 56%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 414.3.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.23 (s, 2H), 4.00 (s, 6H), 3.19 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 3.08 (s, 2H), 2.11-2.00 (m, 2H), 1.82 (s, 1H), 1.49 (s, 2H), 1.29-1.20 (m, 1H).
1,8-디아자비시클로(5.4.0)운데스-7-엔 (DBU) (9.2 g, 60.5 mmol)을 무수 MeCN (40 mL) 중 비스(벤질옥시)(옥소)-λ4-포스판 (9.5 g, 36.3 mmol)의 차가운 (0℃) 용액에 첨가하였다. 10분 후, 4-(4-(아이오도메틸)피페리딘-1-일)-6,7-디메톡시퀴나졸린 (5.0 g, 12.1 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 물, 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. FCC [CH2Cl2:MeOH (50:1)]에 의해 정제하여 디벤질 ((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)포스포네이트 (1.1g, 18%)를 무색의 점성 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 548.20.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.39-7.33 (m, 10H), 6.99 (s, 1H), 5.08 (m, 3H), 4.96 (m, 2H), 4.64 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 4.09 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.27 (d, J = 12.9 Hz, 2H), 2.05 (d, J = 13.9 Hz, 5H), 1.76 (m, 4H), 1.42 (d, J = 12.5 Hz, 2H).
MeOH (20 mL) 중 디벤질 ((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)포스포네이트 (660 mg, 1.2 mmol) 및 Pd/C (132 mg, 20% w/w)를 함유하는 혼합물을 H2 분위기 하에 두고, 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 조 혼합물을 셀라이트®의 패드를 통해 여과하고, 여과물을 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 ((1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)포스폰산 16 (125 mg, 28%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 368.10.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.72 (s, 1H), 7.29 (s, 2H), 4.60 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 11.2 Hz, 6H), 3.46 (s, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.61 (s, 2H), 1.42 (s, 2H).
(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)프로필)포스폰산 14 (표 3a)의 제조
Figure pct00072
아이오딘 (1.35 g, 5.34 mmol)을 CH2Cl2 (20 mL) 중 PPh3 (1.4 g, 5.34 mmol) 및 이미다졸 (0.36 g, 5.34 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반한 다음, CH2Cl2 (5 mL) 중 79 (1.0 g, 4.11 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 포화 Na2SO3 용액으로 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기 상을 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2; 석유 에테르 중 5% EtOAc)하여 tert-부틸 4-(3-아이오도프로필)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.0 g, 68% 수율)를 담황색 오일로서 수득하였다.
DMF (50 mL) 중 tert-부틸 4-(3-아이오도프로필)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.0 g, 2.83 mmol)의 혼합물에 디에틸 포스포네이트 (0.58 g, 4.24 mmol) 및 Cs2CO3 (1.84 g, 5.66 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 밤새 교반한 다음, 물을 첨가하여 켄칭하였다. 유기 상을 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2; 석유 에테르 중 20% EtOAc)하여 80 (0.78 g, 76%)을 담황색 오일로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 364.30.
CH2Cl2 (8 mL) 중 80 (0.78 g, 2.14 mmol)의 용액에 TFA (1.5 mL, 21.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 조 81을 오일로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 264.25.
DIPEA (1.37 g, 10.63 mmol)를 CH2Cl2 (10 mL) 중 디에틸포스포네이트 (597 mg, 2.65 mmol) 및 조 81의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 포화 수성 NH4Cl 용액으로 켄칭하고, CH2Cl2로 추출하였다. 유기 상을 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2, CH2Cl2 중 5% MeOH)하여 디에틸포스포네이트 (0.5 g, 39%) 중간체를 황색 오일로서 수득하였다. 이를 MeCN (10 mL) 중에 용매화시키고, TMSBr (1.46 mL, 11.07 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (정제용 HPLC)하여 14 (220 mg, 50%)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 396.20.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.51 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.49 (t, J = 12 Hz, 2H), 2.00-1.97 (m, 3H), 1.75-1.66 (m, 5H) 및 1.45-1.37 (m, 5H).
(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포노티오 O,O-산 17의 제조.
Figure pct00073
DMSO (10 mL) 중 O,O-디에틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포노티오에이트 (400 mg, 1.51 mmol) 및 DIPEA (927 mg, 7.19 mmol)의 교반 용액에 4-클로로-6,7-디메톡시-퀴나졸린 66 (403 mg, 1.80 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 둔 다음, 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제 (SiO2, 헥산 중 0-100% EtOAc)하여 O,O-디에틸(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포노티오에이트 (380 mg, 46%)를 수득하였다. TMSI (7 mL) 중 O,O-디에틸(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포노티오에이트 (45 mg, 0.099 mmol)의 교반 용액을 60℃에서 16시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 건조 (Na2SO4)시킨 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제용 HPLC에 의해 정제하여 (2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스포노티오 O,O-산 17 (13 mg, 32%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 396.25.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.58 (d, J = 10.4 Hz, 3H), 3.48 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.81 (s, 1H), 1.64 (d, J = 17.9 Hz, 2H), 1.61-1.51 (m, 2H), 1.45-1.32 (m, 2H).
(2-(4-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-1-일)에틸)포스폰산 18 (표 3a)
Figure pct00074
LCMS: [M + H]+ m/z 382.25
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.65 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.30-3.22 (m, 1H), 3.18-3.15 (m, 2H), 2.73-2.66 (m, 2H), 2.37-2.32 (m, 2H) 및 1.79-1.63 (m, 6H).
(2-(4-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페라진-1-일)에틸)포스폰산 브로민화수소 염 19 (표 3a).
Figure pct00075
프로판-2-올 중 피라진 82 및 화합물 63을 함유하는 혼합물을 환류 하에 30분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기 상을 분리하고, 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 디에틸 에테르로부터의 결정화로 83을 백색 고체 (1.65 g, 84%)로서 수득하였다. 피페라진 83 (0.31 g, 1.1 mmol)을 물 (20 mL) 중에 용해시키고, 비닐 포스포네이트 84 (0.19 g, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 클로로포름으로 추출하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2 12 g; CH2Cl2 중 15% MeOH)에 이어서 디에틸 에테르로부터 결정화하여 에틸 에스테르 85 (0.23 g; 49%)를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 410.10
1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 8.67 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 4.01 (d,　J　= 18.8 Hz, 6H), 3.77 (d,　J　= 10.9 Hz, 6H), 3.68 (t,　J　= 4.9 Hz, 4H), 3.49 (s, 2H), 2.81-2.66 (m, 6H), 2.11-2.00 (m, 2H).
트리메틸실릴 브로마이드 (198 mg, 1.3 mmol)를 클로로포름 (20 mL) 및 DMF (5 mL) 중 4-[4-(2-디에톡시포스포릴에틸)피페라진-1-일]-6,7-디메톡시-퀴나졸린 85 (600 mg, 3.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 3시간 동안 교반되도록 한 다음, 메탄올을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에 증발 건조시키고, 메탄올-디에틸 에테르로부터 결정화하여 목적 생성물 19 (0.23 g, 89%)를 HBr 염으로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 382.8.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 4.02 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.34 (t,　J = 8.6 Hz, 2H), 3.17 (s, 2H), 2.90 (s, 2H), 2.74 (s, 2H), 2.20-2.08 (m, 2H).
(4-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)페네틸)포스폰산 20 (표 3a)의 제조
Figure pct00076
2.5M n-부틸리튬 (24 mL)을 질소 분위기 하에 -78℃에서 무수 THF (100 mL) 중 2-(4-브로모페닐)에탄-1-올 86 (5.0 g, 24.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 트리이소프로필 보레이트 (8.6 mL)를 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 2M HCl 용액 (100 mL)을 첨가하여 켄칭하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (3 x 100 mL)으로 추출하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2; 디클로로메탄: 메탄올, 1:0에서 20:0)하여 보론산 87 (1.34 g, 33%)을 담황색 고체로서 수득하였다. 이어서, 이 물질을 THF (30 mL) 및 물 (10 mL)의 용액 중에 용해시켰다. 4-클로로-6,7-디메톡시퀴나졸린 63 (2.24 g, 10.0 mmol) 및 탄산칼륨 (2.76 g, 20.0 mmol)을 용액에 첨가한 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0.5 g, 0.43 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 65℃에서 16시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2: (디클로로메탄 중 메탄올 0에서 10%)하여 88 (1.43 g, 60%)을 담황색 고체로서 수득하였다.
디클로로메탄 (24 mL) 중 트리페닐포스핀 (2.36 g, 9.0 mmol)의 용액에 0℃에서 이미다졸 (700 mg, 10.28 mmol)을 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, I2 (2.3 g, 9.0 mmol)를 첨가하였다. 추가로 10분 동안 교반한 후, 디클로로메탄 (12 mL) 중 화합물 89 (1.5 g, 4.8 mmol). 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄 (36 mL)으로 희석하고, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (SiO2: 석유 에테르:에틸 아세테이트 10:1)하여 89 (4.0 g)를 무색 오일로서 수득하였다.
탄산세슘 (1.426 g, 4.4 mmol)을 DMF (20 mL) 중 조 89 (930 mg, 2.2 mmol) 및 디벤질 포스포네이트 (884 mg, 3.37 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에 두고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 완결되면, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (C18 칼럼: 물:아세토니트릴, 1:0에서 80:1)에 이어서 동결건조하여 디벤질 중간체 (750 mg, 79%)를 회백색 고체로서 수득하였다. 디벤질 (4-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)페네틸)포스포네이트 (230 mg, 0.41 mmol)를 MeOH (20 mL) 중에 용해시켰다. Pd/C (46 mg, 20% w/w)를 첨가하고, 혼합물을 수소 분위기 하에 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 셀라이트®를 통해 여과하였다. 크로마토그래피 (산성 조건 하에 정제용 HPLC)하여 화합물 20 (55.4 mg, 36%)을 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 375.0.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)): δ 9.09 (s, 1H), 7.75-7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 4.08 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.91 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.89-2.87 (m, 3H) 및 1.89 (m, 2H).
(4-((6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)아미노)페닐)포스폰산 나트륨 염 21의 합성 (표 3a)
Figure pct00077
iPrOH (10 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시-퀴나졸린 67 (0.67 g, 3.0 mmol) 및 디에틸 (4-아미노페닐)포스포네이트 (0.69 g, 3.0 mmol)의 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 고체 침전물을 여과하고, EtOAc로 세척하고, 건조시켜 디에틸 (4-((6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)아미노)페닐)포스포네이트 (0.92 g, 73% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. 생성물을 MeCN (20 mL) 중에 용해시키고, 여기에 트리메틸실릴브로마이드 (2.8 mL, 22 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반하고, 냉각시킨 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 조 잔류물을 포화 수성 NaHCO3의 첨가에 의해 켄칭하였다 (pH 8로 조정됨). 생성된 혼합물을 정제용 HPLC에 의해 (중성 조건 하에) 정제한 다음, 동결건조시켜 목적 생성물 21 (300 mg, 35% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 362.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.73 (s, 1H), 7.53 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.39 (s, 1H), 6.16 (s, 1H) 및 3.39 (s, 6H).
(4-((6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)아미노)벤질)포스폰산 나트륨 염 22 (표 3a)의 합성
Figure pct00078
iPrOH (10 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시-퀴나졸린 67 (0.34 g, 1.5 mmol) 및 디에틸 (4-아미노벤질)포스포네이트 (0.36 g, 3.0 mmol)의 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 침전물을 여과하고, EtOAc로 세척하고, 감압 하에 증발 건조시킨 다음, 아세토니트릴 (20 mL) 중에 용해시켰다. 여기에 트리메틸실릴브로마이드 (0.58 mL, 4.6 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반하였다. 농축시킨 후, 용액이 pH 8에 도달할 때까지 잔류물을 포화 수성 NaHCO3으로 처리하였다. 혼합물을 정제용 HPLC (중성)에 의해 정제하여 22 (104 mg, 57%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 376.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.77 (s, 1H), 7.15 (s, 4H), 6.49 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 3.47 (s, 6H) 및 2.70 (d, J = 19.5 Hz, 2H).
(4-(((6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)아미노)메틸)페닐)포스폰산 나트륨 염 23 (또한 표 1에서 4로도 지칭됨).
Figure pct00079
iPrOH (10 mL) 중 4-클로로-6,7-디메톡시-퀴나졸린 63 (0.93 g, 4.14 mmol) 및 (4-브로모페닐)메탄아민 90 (0.77 g, 4.14 mmol)의 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 침전된 고체를 여과하고; 에틸 아세테이트로 세척하고, 감압 하에 증발 건조시켜 N-(4-브로모벤질)-6,7-디메톡시퀴나졸린-4-아민 히드로클로라이드 91 (1.5 g, 88%)을 백색 고체로서 수득하였다. 트리에틸아민 (0.37 mL, 2.68 mmol)을 THF (10 mL) 중 KOAc (11 mg, 0.112 mmol), Pd(OAc)2 (5.5 mg, 0.025 mmol), dppf (27 mg, 0.049 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 질소로 퍼징하였다. 트리에틸아민 (0.37 mL, 2.68 mmol)을 첨가하였다. 70℃에서 15분 동안 교반한 후, THF (10 mL) 중 N-(4-브로모벤질)-6,7-디메톡시퀴나졸린-4-아민 히드로클로라이드 (0.5 g, 1.22 mmol) 및 디에틸 포스포네이트 (0.16 g, 1.22 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 환류 하에 6시간 동안 교반한 다음, EtOAc (30 mL)와 물 (20 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 물, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 에틸 아세테이트 중 50% 석유 에테르)에 의해 정제하여 디에틸 (4-(((6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)아미노)메틸)페닐) 포스포네이트 (0.2 g, 38%)를 황색 고체로서 수득하였다.
MeCN (20 mL) 중 디에틸 (4-(((6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)아미노)메틸)페닐) 포스포네이트 (0.5 g, 1.16 mmol)의 용액에 TMSBr (1.45 mL, 11.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 포화 수성 NaHCO3 (pH 9)으로 켄칭하고, 생성된 혼합물을 정제용 HPLC (중성)에 의해 정제하여 표제 생성물 23을 회백색 고체 (102 mg, 22%)로서 수득하였다.
LCMS: [M- H]+ m/z: 374.00.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.00 (s, 1H), 7.61 (s, 2H), 7.29 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.70 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.75 (d, J = 18.2 Hz, 6H).
디메틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 92 및 디에틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 93의 일반적 절차 합성
Figure pct00080
수소화나트륨 (1.1 몰 당량)을 톨루엔 중 비스(디메톡시포스포릴)메탄 92 또는 비스(디에톡시포스포릴)메탄 93 (1 몰 당량)의 교반 용액에 실온에서 조심스럽게 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 두고, 온도를 40℃ 미만으로 유지시키면서 톨루엔 중 1-벤질피페리딘-4-카르브알데히드 94 (1 몰 당량)의 용액을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반되도록 한 다음, 수성 포화 NH4Cl 용액을 첨가하여 켄칭하였다. 유기 상을 분리하고, 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (120 g SiO2; 헥산 중 EtOAc 5에서 100% 구배)하여 디메틸 또는 디에틸 (E)-(2-(1-벤질피페리딘-4-일)비닐)포스포네이트를 무색 오일로서 수득하였다. 에탄올 중 디메틸 또는 디에틸 (E)-(2-(1-벤질피페리딘-4-일)비닐)포스포네이트 (1 몰 당량)의 혼합물에 촉매 Pd/C를 첨가하였다. 혼합물을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 12시간 동안 교반하고, 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켜 디메틸 또는 디에틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 95 및 96을 무색 오일로서 수득하였다.
디벤질 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 100의 합성에 대한 일반적 절차
Figure pct00081
아이오딘 (1.5 몰 당량)을 CH2Cl2 중 PPh3 (1.5 몰 당량) 및 이미다졸 (1.5 몰 당량)의 용액에 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, CH2Cl2 중 97 (1.0 몰 당량)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 셀라이트®의 패드를 통해 여과하고, 5% 티오황산나트륨 용액으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피하여 화합물 98을 오일로서 수득하였다.
DBU (5.0 몰 당량)를 MeCN 중 화합물 98 (3.0 몰 당량)의 용액에 40℃에서 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, MeCN 중 디벤질포스포네이트 (1.0 몰 당량)의 용액을 적가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에 증발 건조시키고, 크로마토그래피로 정제하여 화합물 99를 수득하였다.
TFA/DCM 중 화합물 99 (1.0 몰 당량)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켜 화합물 100을 오일로서 수득하였다.
(2-(1-(퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산, (2-(1-(퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 및 (2-(1-(이소퀴놀린-1-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산을 합성하는 일반적 방법.
방법 A:
디이소프로필에틸아민 (2 몰 당량)을 이소프로필 알콜 중 디메틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 95 또는 디에틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 96 (1.1 몰 당량) 및 4-클로로퀴나졸린, 4-클로로퀴놀린 또는 1-클로로이소퀴놀린 (1 몰 당량)의 혼합물 (0.1 M 반응 농도)에 첨가하였다. 90℃에서 3시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 실리카 겔 (디클로로메탄 중 5% MeOH) 정제하여 디메틸 또는 디에틸 포스포네이트를 수득하였다. 클로로포름 또는 디클로로메탄 중 포스포네이트 (1 몰 당량)의 냉각된 (0℃) 용액 (0.5 M 반응 농도)에 트리메틸실릴 브로마이드 (3 몰 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 90분 후, 메탄올을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에 증발 건조시킨 다음, 메탄올 중에 용매화시켰다. 반응 혼합물을 절반 부피로 농축시키고, 여과하여 침전물을 제거한 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로 결정화하고, 여과하고, 감압 하에 건조시켜 목적 포스폰산을 브로마이드 염으로서 수득하였다.
방법 B:
디이소프로필에틸아민 (3 몰 당량)을 디클로로메탄 중 디메틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 95 또는 디에틸 (2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 96 (1.1 몰 당량) 및 4-클로로퀴나졸린, 4-클로로퀴놀린 또는 1-클로로이소퀴놀린 (1 몰 당량)의 혼합물 (0.1 M 반응 농도)에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 상을 분리하고, 물 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 실리카 겔 (디클로로메탄 중 5% MeOH) 정제하여 디메틸 또는 디에틸 포스포네이트를 수득하였다. 아세토니트릴 중 디메틸 또는 디에틸 포스포네이트 (7 몰 당량)의 냉각된 (0℃) 용액 (0.1 M 반응 농도)에 트리메틸실릴 브로마이드 (3 몰 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반하고, 냉각시키고, 감압 하에 증발 건조시키고, 조 잔류물을 포화 수성 NaHCO3 용액의 첨가에 의해 (pH 8~9가 관찰될 때까지) 켄칭하였다. 조 잔류물을 정제용 HPLC (중성)에 의해 정제하여 포스폰산을 나트륨 염으로서 수득하였다.
방법 C:
디이소프로필에틸아민 (3 몰 당량)을 디클로로메탄 중 디벤질(2-(피페리딘-4-일)에틸)포스포네이트 100 (1.1 몰 당량) 및 4-클로로퀴나졸린, 4-클로로퀴놀린 또는 1-클로로이소퀴놀린 (1 몰 당량)의 혼합물 (0.1 M 반응 농도)에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 상을 분리하고, 물 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 실리카 겔 (디클로로메탄 중 5% MeOH) 정제하여 디벤질 포스포네이트를 수득하였다. MeOH 중 디벤질 포스포네이트 (1 몰 당량) 및 Pd/C의 혼합물을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 셀라이트®를 통해 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켜, 포스폰산을 수득하였다.
(2-(1-(6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 (또는 화합물 1)의 제조
Figure pct00082
방법 A에 따라 제조하여 15 (2.1 g, 69%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 381.8.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.71 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.48 (t, J = 12.7 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 4H), 1.40-1.27 (m, 2H).
(4-(((6,7-디메톡시퀴나졸린-4-일)아미노)메틸)벤질)포스폰산 24 (또한 본원의 표에서 5로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00083
방법 B에 따라 제조하였다. 생성물을 정제용 HPLC (9% 수율)에 의해 회백색 고체로서 단리하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 390.15.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.12 (s, 1H), 7.22 (s, 4H), 7.11 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.79 (s, 2H), 4.76 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 2.79 (s, 1H), 2.74 (s, 1H)
(2-(1-(6-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 25의 제조
Figure pct00084
방법 A에 따라 제조하여 25 (50% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 352.10.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.57 (s, 1H), 7.74-7.73 (m, 1H), 7.68-7.66 (m, 1H), 7.46 (d, 1H), 4.96 (br s, 2H), 3.98, (s, 3H), 3.57 (br s, 2H), 2.65 (s, 2H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.79-1.75 (m, 2H), 1.66-1.63 (m, 2H) 및 1.46-1.44 (m, 2H).
(2-(1-(6-히드록시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 26의 제조
Figure pct00085
방법 C에 따라 제조하여 26 (7% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 338.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (s, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 4.21-4.17 (m, 2H), 2.99-2.95 (m, 2H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.53-1.49 (m, 5H) 및 1.30-1.19 (m, 2H).
(2-(1-(7-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 27의 제조
Figure pct00086
방법 A에 따라 제조하여 27 (95% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 352.0
1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) δ 8.55 (s, 1H), 8.10 (d, J = 10 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 10 Hz 및 5 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.57-3.48 (m, 2H), 2.65 (s, 1H), 2.05-2.02 (m, 2H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.80-1.74 (m, 2H), 1.65-1.60 (m, 2H) 및 1.46-1.41 (m, 2H).
(2-(1-(7-에톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 28의 제조.
Figure pct00087
방법 B에 따라 제조하여 28을 회백색 고체로서 수득하였다.
(2-(1-(7-히드록시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 29의 제조
Figure pct00088
방법 B에 따라 제조하여 29 (4% 수율)를 연황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 338.25.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.49 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.96 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 9.2 및 2.2 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.62 (br s, 2H), 3.38 (br s, 2H), 1.87 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.72 (br s, 1H), 1.58-1.38 (m, 4H) 및 1.28-1.22 (m, 2H).
(2-(1-(7-아미노퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 30의 제조
Figure pct00089
방법 C에 따라 제조하여 30 (32% 수율)을 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 337.10.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.61 (br s, 1H), 6.30 (br s, 2H), 4.26-4.20 (m, 2H), 3.10-2.90 (m, 2H), 1.79-1.76 (m, 2H), 1.60-1.30 (m, 5H) 및 1.25-1.20 (m, 2H).
(2-(1-(7-이소프로폭시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 31의 제조
Figure pct00090
방법 B에 따라 제조하여 31을 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 337.10.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.30 (br s, 2H), 4.25-4.21 (m, 2H), 3.08-2.96 (m, 2H), 1.81-1.75 (m, 2H), 1.65-1.31 (m, 5H) 및 1.27-1.18 (m, 2H).
(2-(1-(8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 32의 제조
Figure pct00091
방법 B에 따라 제조하여 32 (32% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 352.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.92 (s, 1H), 6.92-6.88 (m, 1H), 6.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.76-3.70 (m, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.72 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.64 (d, J = 12 Hz, 2H), 1.51-1.28 (m, 5H) 및 1.02-0.94 (m, 2H).
(2-(1-(8-에톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 33 (또한 본원의 표에서 226으로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00092
방법 B에 따라 제조하여 33을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 366.20.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.17 (s, 1H), 7.21-7.09 (m, 2H), 4.13-3.98 (m, 4H), 2.97 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 1.82 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 1.56-1.35 (m, 8H), 1.26 (q, J = 11.4 Hz, 2H).
(2-(1-(8-이소프로폭시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 34 (표 3a)의 제조
Figure pct00093
방법 B에 따라 제조하여 34 (43% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.10 (s, 1H), 7.11 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.94 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 12.6 Hz, 2H), 1.67 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 1.40-1.07 (m, 13H).
(2-(1-(8-히드록시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 36 (표 3a)의 제조
Figure pct00094
방법 B에 따라 제조하여 35를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1H NMR (400 MHz, D2O)
(2-(1-(5,8-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 36의 제조
Figure pct00095
방법 B에 따라 제조하여 36을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 382.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.47 (s, 1H), 7.54 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 12.0 Hz, 8H), 1.82 (s, 2H), 1.67 (s, 1H), 1.59-1.30 (m, 6H), 1.21 (s, 2H).
(2-(1-(6,8-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 37의 제조
Figure pct00096
방법 C에 따라 제조하여 37 (15% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 382.15
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.54 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.86-6.82 (m, 1H), 4.50 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.27 (m, 1 H), 3.85 (m, 6 H), 3.74 (m, 2 H), 3.27 (m, 2 H), 1.88-1.85 (m, 2 H), 1.66 (m, 1 H), 1.54-1.48 (m, 4 H) 및 1.29 (m, 2 H).
(2-(1-(7,8-디메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 38의 제조
Figure pct00097
방법 C에 따라 제조하여 38 (16% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 382.15
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.60 (s, 1H), 7.90 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.69 (m, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.46 (m, 2H), 1.90 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.75 (m, 1H), 1.53-1.49 (m, 4 H) 및 1.31-1.28 (m, 2H).
(2-(1-(7,8-디히드로-[1,4]디옥시노[2,3-g]퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 39 (표 3a)의 제조
Figure pct00098
방법 C에 따라 제조하여 39 (7% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 380.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.64 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 4.56 (d, J = 11.8 Hz, 2H), 4.45 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 4.38 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 3.39 (s, 1H), 3.33 (s, 1H), 1.87 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 1.71 (s, 1H), 1.58-1.38 (m, 4H), 1.26 (d, J = 10.2 Hz, 2H).
(2-(1-(5-플루오로-8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 40 (표 3a)의 제조
Figure pct00099
방법 C에 따라 제조하여 40 (7% 수율)을 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 370.10.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.55 (s, 1H), 7.44-7.38 (m, 2H), 4.28-4.23 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.28-3.18 (m, 2H), 1.82-1.78 (m, 2H), 1.70-1.66 (m, 1H), 1.49-1.23 (m, 4H) 및 1.26-1.09 (m, 2H).
(2-(1-(6-플루오로-8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 41 (표 3a)의 제조
Figure pct00100
방법 B에 따라 제조하여 41 (44% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 366.15.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.02 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 1.91-1.88 (m, 2 H), 1.74(m, 1 H), 1.53-1.49(m, 5 H), 및 1.29-1.27 (m, 3 H).
(2-(1-(6-클로로-8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 42 (표 3a)의 제조
Figure pct00101
방법 B에 따라 제조하여 42 (42% 수율)를 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 386.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.03 (s, 1H), 6.91-6.88 (m, 2H), 3.92-3.89 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.93-2.87 (m, 2H), 1.70-1.67 (m, 2H) 및 1.41-1.12 (m, 7H).
(2-(1-(7-클로로-8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 43 (표 3a)의 제조
Figure pct00102
방법 B에 따라 제조하여 43 (50% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 386.05.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.07 (s, 1H), 7.10-7.06 (m, 2H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.96-2.90 (m, 2H), 1.71-1.68 (m, 2H) 및 1.42-1.01 (m, 7H).
2-[1-[6,7-디메톡시-2-[(E)-2-(3-피리딜)비닐]퀴나졸린-4-일]-4-피페리딜]에틸-히드록시-포스피네이트 44의 제조
Figure pct00103
방법 B에 따라 제조하여 44 (49% 수율)를 담황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 485.25.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.09 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.74 (d, J = 16.8 Hz 1H), 6.58 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 3.94-3.91 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 2.96-2.90 (m, 2H), 1.96-1.93 (m, 2H) 및 1.56-1.32 (m, 7H).
(E)-(2-(1-(8-메톡시-2-(2-(피리딘-3-일)비닐)퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 45의 제조
Figure pct00104
방법 B에 따라 제조하여 45 (79% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 455.20.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ9.07 (br s, 1H), 8.70 (br s, 1H), 8.62-8.60 (m, 1H), 8.31 (d, 1H), 7.89-7.88 (m, 1H), 7.70-7.54 (m, 4H), 5.20-5.00 (m, 2H) 4.13 (s, 3H), 3.58-3.50 (m, 2H), 2.07-2.02 (m, 2H), 1.88-1.82 (m, 1H), 1.78-1.64 (m, 4H) 및 1.51-1.46 (m, 2H).
(2-(1-(6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 46의 제조
Figure pct00105
방법 C에 따라 제조하여 46 (22% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 381.30.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ8.35 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.29-7.27 (m, 2H), 7.11 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.27-4.23 (m, 2H), 4.03 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 3.40-3.32 (m, 2H), 2.06-2.03 (m, 4H) 1.82-1.79 (m, 3H) 및 1.62-1.48 (m, 2H).
(2-(1-(3-시아노-6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 47 (또한 표 2에서 42로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00106
방법 B에 따라 제조하여 47 (47% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 406.20.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.00 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.18 (d, J = 12.3 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 12.2 Hz, 2H), 1.72 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 1.43-1.30 (m, 6H), 1.17-1.04 (m, 2H).
(2-(1-(3-시아노-6-메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 48 (또한 표 2에서 44로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00107
방법 B에 따라 제조하여 48 (16% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 376.20.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.15 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.60-3.51 (m, 2H), 3.15-3.08 (m, 2H), 1.81-1.74 (m, 2H) 및 1.41-1.15 (m, 7H).
(2-(1-(3-시아노-7-메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 49 (또한 표 2에서 43으로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00108
방법 B에 따라 제조하여 49 (23% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 376.20.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ7.94 (s, 1H), 7.39 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 6.84-6.64 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.59 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 3.22 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.89 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.62-1.45 (m, 5H) 및 1.33-1.25 (m, 2H).
(2-(1-(3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 50 (또한 표 1에서 45로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00109
방법 B에 따라 제조하여 50을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 376.20.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.03 (s, 1H), 7.27-7.23 (m, 1H), 7.11-7.09 (m, 1H), 7.04-7.02 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.43 (br d, J = 12.4 Hz, 2H), 3.06 (br t, J = 12 Hz, 2H), 1.80 (br d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.50-1.47 (m, 5H) 및 1.31-1.24 (m, 2H).
(2-(1-(6,7-디메톡시이소퀴놀린-1-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 51의 제조
Figure pct00110
방법 B에 따라 제조하여 51 (30% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 381.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.79 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 3.96 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 3.23 (m, 4H), 1.88 (m, 2H), 1.55 (m, 2H), 1.48 (m, 1H) 및 1.45 (m, 4 H).
(2-(1-(4-시아노-6,7-디메톡시이소퀴놀린-1-일)피페리딘-4-일)에틸)포스폰산 52 (표 3a)의 제조
Figure pct00111
방법 B에 따라 제조하여 52 (50% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z
1H NMR (400 MHz, D2O) δ
O-((1-(8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메틸)O,O-디히드로겐 포스포로티오에이트 53 (표 3a)의 제조
Figure pct00112
피리딘 (5 mL) 중 (1-(8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)메탄올 (화합물 80과 동일한 방법을 사용하여 제조됨) (500 mg, 1.83 mmol)의 용액에 포스포로티오일 트리클로라이드 (1.6 g, 9.45 mmol)를 -15℃에서 적가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물 (20 mL) 중 중탄산나트륨 (923 mg, 10.98 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 정제 (정제용 HPLC)하여 53 (83 mg, 12%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 354.10
1H NMR (400 MHz, , DMSO-d6) δ8.59 (s, 1H), 7.59-7.50 (m, 2H), 7.45 (dd, J = 6.5, 2.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.80-3.74 (m, 4H), 2.03 (s, 1H), 1.86 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 1.41 (q, J = 11.8 Hz, 2H).
(((1-(8-메톡시퀴나졸린-4-일)피페리딘-4-일)옥시)메틸)포스폰산 54 (표 3a)의 제조
Figure pct00113
화합물 10 및 11과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. 혼합물을 정제 (정제용 HPLC 0.1% TFA)하여 54를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 353.3.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.40 (s, 1H), 7.54 (s, 2H), 7.40 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.37 (s, 3H), 4.01-3.88 (m, 9H), 3.71 (d, J = 9.3 Hz, 4H), 3.63 (s, 1H), 2.11 (s, 2H), 1.81 (s, 2H).
(4-(8-메톡시퀴나졸린-4-일)페네틸)포스폰산 55 (표 3a)의 제조
Figure pct00114
화합물 20과 동일한 방법을 사용하여 백색 고체로서 제조하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 345.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ
(4-(((8-메톡시퀴나졸린-4-일)아미노)메틸)페닐)포스폰산 56의 제조
Figure pct00115
화합물 23과 동일한 방법에 따라 제조하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 346.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.20 (s, 1H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.31-7.28 (m, 2H), 7.23-7.21 (m, 1H) 및 2.93 (s, 3H).
(4-(((3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)아미노)메틸)페닐)포스폰산 57 (또한 표 1에서 52로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00116
화합물 23과 동일한 방법에 따라 제조하여 57을 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 370.10.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.02 (s, 1H), 7.48-7.43 (m, 2H, 7.36-7.30 (m, 2H), 7.15-7.09 (m, 3H), 4.77 (s, 2H) 및 3.81 (s, 3H).
(4-(((3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)아미노)메틸)벤질)포스폰산 58 (또한 표 2에서 211로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00117
화합물 23과 동일한 방법에 따라 제조하여 58을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 384.15.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ8.32 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35-7.33 (m, 2H), 7.26 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.02 (s, 2H), 3.99 (s, 3H) 및 2.85 (d, J = 20 Hz, 2H).
(3-(1-(3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)프로필)포스폰산 59 (또한 표 2에서 210으로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00118
화합물 14와 동일한 방법에 따라 제조하여 59를 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 390.20.
1H NMR (400 MHz, D2O) δ8.30 (s, 1H), 7.39 (br s, 2H), 7.19 (br s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.73-3.70 (m, 2H), 3.30 (t, J = 12 Hz, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.70-1.45 (m, 3H) 및 1.40-1.27 (m, 6H).
(4-(((3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)아미노)메틸)페닐)보론산 60 (또한 표 2에서 214로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00119
2-메톡시에탄올 (10 mL) 중 화합물 101 (0.97 g, 5.0 mmol)의 용액에 (4-브로모페닐)메탄아민 90 (1.74 g, 10.0 mmol) 및 Et3N (1.51 g, 15 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 밤새 가열하고, 실온으로 냉각시킨 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (석유 에테르 중 35% EtoAc)하여 102 (1.5 g, 88%)를 백색 고체로서 수득하였다. DMSO (3 mL) 중 화합물 102 (69 mg, 0.2 mmol)의 용액에 비스(피나콜레이토)디보론 (61.0 mg, 0.24 mmol), 아세트산칼륨 (58.8 mg, 3.0 mmol), Pd(dppf)Cl2 (7.4 mg, 0.05 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소로 퍼징하여 탈기한 다음, 80℃에서 48시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 희석한 다음, 셀라이트® 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 감압 하에 증발 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc (10 mL) 중에 용해시키고, EtOAc 중 HCl (4M, 0.2 mL, 4.0 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 [정제용 HPLC (TFA))하여 60 (2 단계에 걸쳐 40.5 mg, 65%)을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 334.15.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ 8.69 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.41 (dd, J = 17.3, 7.8 Hz, 2H), 5.05 (s, 2H), 4.13 (s, 3H).
(2-(1-(3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)피페리딘-4-일)에틸)보론산 61 (또한 표 2에서 216으로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00120
화합물 7과 동일한 절차에 따라 제조하였다. 화합물 61을 황색 고체로서 단리하였다.
LCMS: [M + H]+ m/z 340.20.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-d4) δ8.81 (s, 1H), 7.83 (d, J = 12 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 12 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 12 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 2.66 (s, 1H). 2.05 (br d, J = 12 Hz, 2H), 1.72-1.30 (m, 4H) 및 0.91-0.85 (m, 2H).
4-(((3-시아노-8-메톡시퀴놀린-4-일)아미노)메틸)-N-히드록시벤즈아미드 62 (또한 표 2에서 220으로도 지칭됨)의 제조
Figure pct00121
2-메톡시에탄올 (40 mL) 중 101 (2.0 g, 8.9 mmol) 및 103 (1.5 g 8.9 mmol)의 용액을 환류 하에 밤새 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 증발 건조시킨 다음, EtOAc로 연화처리하고, 여과하고, 건조시켜 조 화합물 104 (1.7 g)를 담황색 고체로서 수득하였다.
THF (20 mL) 중 화합물 104 (0.5 g, 1.55 mmol)의 용액에 NaOH (0.17 g, 4.65 mmol, 물 2 mL 중에 용해됨)를 첨가하였다. 혼합물을 45℃로 밤새 가열하였다. 냉각된 용액을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 수성 HCl (2N)로 pH 5.5가 실현될 때까지 처리하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 건조시켜 조 산 중간체 (0.3 g, 62% 수율)를 담황색 고체로서 수득하였다. 조 산을 DMF (10 mL) 중에 용해시킨 다음, 0℃로 냉각시키고, 질소 하에 두었다. BOP (0.48 g, 1.06 mmol) 및 DIPEA (0.50 g, 3.88 mmol)를 첨가하고, 이어서 HONH2-HCl (0.09 g, 1.26 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 물 (50 mL)로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 물 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO3)시키고, 감압 하에 증발 건조시켰다. 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 5% MeOH)에 이어서 정제용 HPLC (H+, 0.1% TFA)하여 62 (34 mg, 10%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
LCMS: [M + H]+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.19 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.45 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 4.6, 2.9 Hz, 2H), 7.29 (dd, J = 12.3, 5.0 Hz, 2H), 5.11 (s, 2H), 3.93 (s, 3H).
실시예 2: 화합물 활성의 평가
표 1-3의 선택된 화합물 및 다른 유도체를 제조하고, ENPP1 활성 검정에서 기질로서 티미딘 모노포스페이트 파라니트로페놀 (TMP-pNP)을 사용하여 평가하였다. 효소 반응물을 실온에서 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 200 μM ZnCl2, pH 7.5 중 TMP-pNP (2 μM), ENPP1 억제제의 5-배 희석물, 및 정제된 재조합 마우스 ENPP1 (0.5 nM)로 제조하였다. 반응에 의해 생성된 파라니트로페놀레이트의 400 nm에서의 흡광도를 20분 동안 측정함으로써 반응 진행을 모니터링하였다. 생성물 형성의 기울기를 추출하고, 플롯팅하고, 피팅하여 그래프패드 프리즘 7.03에 의해 IC50 값을 수득할 수 있다.
화합물을 또한 ENPP1 효소 활성 검정에서 기질로서 cGAMP를 사용하여 평가하였다. 대상 화합물을 평가하는데 사용될 수 있는 방법은 2018년 9월 7일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2018/050018 (Li et al.)에 기재된 것을 포함한다. 예시적인 방법이 하기 제시된다.
물질:
마우스 ENPP1: 문헌 [Kato et al., PNAS (2012) 109(42):16876-8]에 따라 발현시키고 정제하였다. cGAMP: 문헌 [Li et al., Nat. Chem. Biol. (2014) 10:1043-8]에 따라 합성하고 정제하였다. 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제 (PAP): PAP 유전자 (진뱅크: AB092983.1)를 합성하고 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)), His-SUMO C-말단 태그를 갖는 pTB146 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드로 형질전환된 BL21(DE3) 세포를 성장시키고, 0.75 mM IPTG로 16℃에서 밤새 OD600 = 1로 유도하였다. 세포를 50 mM 트리스 pH 7.5, 400 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 2 mM DTT, 프로테아제 억제제 (로슈(Roche))를 함유하는 완충제 중에 재현탁시키고, 2회의 동결-해동 주기 및 초음파처리에 의해 용해시켰다. 모든 후속 단계는 4℃에서 수행하였다. 용해물을 40,000 rcf에서 1시간 동안 원심분리하여 청정화하고, 상청액을 HisPur 코발트 수지 (써모 피셔 사이언티픽)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 수지를 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 30 mL로 2회 세척하고, 단백질을 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 600 mM 이미다졸로 용리시켰다. 음이온 교환 크로마토그래피 (하이트랩 Q HP)를 수행하였다. 미오키나제 (밀리포어시그마(MilliporeSigma)). 셀타이터글로(CellTiterGlo) (프로메가(Promega))
ENPP1 효소 활성 검정에 대한 예시적인 절차:
3 nM 마우스 ENPP1을 5 uM cGAMP, 및 50 mM 트리스 pH 7.6, 250 nM NaCl, 500 uM CaCl2, 및 1 uM ZnCl2를 함유하는 완충제 중 화합물의 5-배 연속 희석물과 함께 (총 반응 부피 = 10 μL) 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 반응물을 95℃에서 10분 동안 열 불활성화시켰다. AMP 분해 생성물을 ATP로 전환시키고, 이를 루시페라제를 사용하여 검출하였다. 이를 달성하기 위해, 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제 (PAP) 및 미오키나제의 효소 혼합물을 EP2771480 (Goueli et al.)에 따라 제조하였다. 간략하게, PAP를 50 mM 트리스 pH 7.5, 0.1% NP-40을 함유하는 완충제 중에 2 mg/mL로 희석하였다. 미오키나제를 3.2 mM 황산암모늄 pH 6.0, 1 mM EDTA, 및 4 mM 폴리포스페이트를 함유하는 완충제 중에 2 KU/mL로 희석하였다. 열-불활성화된 ENPP1 반응물을 40 mM 트리스 pH 7.5, 0.05 mg/mL 프리오넥스, 5 mM MgCl2, 20 μM 폴리포스페이트, 및 0.15 g/L 페놀 레드 (피펫팅의 용이성을 위함)를 함유하는 완충제 중에서 3시간 동안 PAP (0.01 μg/μL) 및 미오키나제 (0.0075 U/μL)와 함께 인큐베이션하였다 (총 반응 부피 = 20 μL). 셀타이터글로 (20 uL)를 제조업체의 프로토콜에 따라 반응물에 첨가하고, 발광을 측정하였다. 데이터를 100% 효소 활성 (화합물 없음) 및 0% 효소 활성 (효소 없음)에 대해 정규화한 후, 함수 100 / (1 + ([화합물] / IC50))에 피팅하였다.
IC50 값은 문자 A-C에 의해 표시된 범위에 속하며, 여기서 A는 50 nM 미만의 IC50 값을 나타내고, B는 50 nM 내지 100 nM의 IC50 값을 나타내고, C는 100 nM 초과의 IC50 값을 나타낸다.
표 4: ENPP1 효소 활성. IC50 값: A (<50 nM); B (50 nM - 100 nM); C (> 100 nM).
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실시예 3: 세포외 ENPP1의 입증 및 세포외 ENPP1의 억제
도 18a 내지 18c를 참조하면, ENPP1은 cGAMP의 세포외 수준을 제어하고, cGAMP 수준은 세포를 ENPP1 억제제 (예를 들어, 화합물 1)로 처리하는 것에 의해 회복될 수 있다는 것이 관찰되었다.
293T cGAS ENPP1-/- 세포를 인간 ENPP1 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 전체 세포 용해물에서 cGAMP 히드롤라제 활성을 확인하였다 (도 18a). 293T 세포를 ATCC로부터 구입하고, 마우스 cGAS를 안정하게 발현하도록 바이러스 형질감염시켰다. 인간 ENPP1 (5' CACCGCTGGTTCTATGCACGTCTCC-3') (서열식별번호: 1)을 표적화하는 CRISPR sgRNA의 바이러스 형질감염에 의해 293T mcGAS ENPP1-/-를 생성하였다. 293T mcGAS ENPP1-/- 세포를 10% FBS (아틀란타 바이올로직스(Atlanta Biologics)) (v/v) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔)으로 보충된 DMEM (코닝 셀그로(Corning Cellgro)) 중 푸르콜(PurCol) (어드밴스드 바이오매트릭스(Advanced BioMatrix))로 코팅된 조직 배양 처리 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅 12-24시간 후에, 제조업체의 지침서에 따라 퓨진 6(Fugene 6) (프로메가) 플러스 표시된 농도의 (공 또는 인간 ENPP1 함유) pcDNA3 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 웨스턴 블롯팅 (항체 토끼 항-ENPP1 (L520, 1:1000) 및 마우스 항-튜불린 (DM1A, 1:2,000), 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies) 사용)에 의한 ENPP1 발현의 분석을 위해 세포를 용해시켰다. 10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1% NP-40, pH 9.0 중에서 1x106개의 세포를 용해시킴으로써 전세포 용해물을 생성하였다. 32P-cGAMP (5 μM)를 전세포 용해물과 함께 인큐베이션하고, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 분해를 모니터링하였다 (도 18a).
무손상 세포에서, ENPP1 발현은 세포외 cGAMP를 고갈시키지만, 세포내 cGAMP 농도에는 영향을 미치지 않는다 (도 18b). 293T mcGAS ENPP1-/-를 (공 또는 인간 ENPP1 함유) pcDNA3으로 형질감염시키고 24시간 후에, 배지를 제거하고, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄-피루브산나트륨 (써모피셔) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 무혈청 DMEM으로 교체하였다. 배지 교체 12-24시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 차가운 PBS로 플레이트에서 세척해내었다. 배지 및 세포 둘 다를 1000 rcf에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정법 (LC-MS/MS)에 의한 cGAMP 농도 측정을 준비하였다. 세포를 내부 표준물로서 500 nM 시클릭 GMP-13C10, 15N5-AMP로 보충된 30 내지 100 μL의 50:50 아세토니트릴:물 중에 용해시키고, 15,000 rcf에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 불용성 분획을 제거하였다. 배지를 제거하고, 내부 표준물로서 500 nM 시클릭 GMP-13C10, 15N5-AMP, 및 20% 포름산을 보충하였다. 4℃로 설정된 오토샘플러가 구비되고 에이비 사이엑스(AB Sciex) 4000 QTRAP (캘리포니아주 포스터 시티)에 연결된 시마즈 HPLC (캘리포니아주 샌프란시스코) 상에서 샘플을 cGAMP, ATP, 및 GTP 함량에 대해 분석하였다. 10 μL의 부피를 바이오베이직 AX LC 칼럼, 5 μm, 50 x 3 mm (써모 사이언티픽) 상에 주입하였다. 이동상은 100 mM 탄산암모늄 (A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (B)으로 이루어졌다. 초기 조건은 90% B였고, 0.5분 동안 유지시켰다. 이동상을 0.5분에서 2.0분까지 30% A로 경사지게 하고, 2.0분에서 3.5분까지 30% A로 유지시키고, 3.5분에서 3.6분까지 90% B로 경사지게 하고, 3.6분에서 5분까지 90% B로 유지시켰다. 유량은 0.6 mL/분으로 설정하였다. 질량 분광계를 전극 분무 양이온 방식으로 작동시켰고, 소스 온도는 500℃로 설정하였다. 질소 기체를 사용하여 디클러스터링 및 충돌-유도 해리를 달성하였다. 디클러스터링 전위 및 충돌 에너지는 표준물의 직접 주입에 의해 최적화하였다. 각각의 분자에 대해, MRM 전이(들) (m/z), DP (V), 및 CE (V)는 하기와 같았다: ATP (508 > 136, 341, 55), GTP (524 > 152, 236, 43), cGAMP (675 > 136, 121, 97; 675 > 312, 121, 59; 675 > 152, 121, 73), 내부 표준물 시클릭 GMP-13C10,15N5-AMP (690 > 146, 111, 101; 690 > 152, 111, 45; 690 > 327, 111, 47), 추출 표준물 시클릭 13C10,15N5-GMP-13C10,15N5-AMP (705 > 156, 66, 93; 705 > 162, 66, 73).
ENPP1을 억제하는 것은 세포외 cGAMP의 분해를 차단한다 (도 18c). 동일한 실험을 상기와 같이 수행하였으며, 이번에는 또한 배지 교체 시 50 μM의 ENPP1 억제제 (화합물 1)를 포함하였다. 억제제에 의해, 배지 중 세포외 cGAMP 농도는 이전 수준으로 복귀되었다.
도 18a는 공벡터 및 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염되고, 24시간 후에 웨스턴 블롯을 사용하여 ENPP1 단백질 발현에 대해 분석된 293T cGAS ENPP1-/- 세포 (상부), 박층 크로마토그래피를 사용한 ENPP1 32P-cGAMP 가수분해 활성 (TLC) (하부)을 보여준다. 도 18b는 LC-MS/MS를 사용한 세포내 및 세포외 cGAMP 농도를 보여준다. BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.005 (스튜던트 t 검정). 도 18c는 50 μM 화합물 1의 존재 또는 부재 하에서의 공벡터 또는 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염된 293T cGAS ENPP1-/- 세포에 대한 세포내 및 세포외 cGAMP 농도를 보여준다. BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.0013 (스튜던트 t 검정).
실시예 4: ENPP1 억제는 1차 CD14+ 단핵구의 cGAMP 활성화를 증가시킨다
ENPP1 억제제 (화합물 1)를 사용하여, 293T cGAS ENPP1저 세포주에 의해 유출된 cGAMP가 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 인간 CD14+ 단핵구에 의해 검출될 수 있는지 여부를 시험하였다 (도 19a). 293T cGAS ENPP1저 세포를 (공 또는 인간 ENPP1 함유) pcDNA로 형질감염시켰다. 전혈로부터의 풍부화된 백혈구 연층을 퍼콜 밀도 구배에 적용함으로써 1차 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 단리하였다. CD14+ 마이크로비즈 (밀테니(Miltenyi))를 사용하여 CD14+ 단핵구를 단리하였다. CD14+ 단핵구를 2% 인간 혈청 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RMPI에서 배양하였다. 293T cGAS ENPP1저 세포의 형질감염 8시간 후에, 예시적인 ENPP1 억제제 화합물 1의 존재 또는 부재 하의, 2% 인간 혈청 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RMPI로 배지를 교체하였다. 배지 교체 24시간 후, 293T cGAS ENPP1저 세포로부터의 상청액을 CD14+ 단핵구로 옮겼다 (도 19a). 상청액을 옮기고 24-26시간 후에, 트리졸 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 막시마 H 마이너스 리버스 트랜스크립타제 (써모 피셔 사이언티픽)로 역전사시켰다. 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 아큐파워 2X 그린스타(AccuPower 2X Greenstar) qPCR 마스터 믹스 (바이오니어(Bioneer))로 이중으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 CD14 발현에 대해 데이터를 정규화하였다. 배수 유도는 ΔΔCt를 사용하여 계산하였다. 인간 IFNB1에 대한 프라이머: fwd (5'-AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3') (서열식별번호: 2), rev (5'-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3') (서열식별번호: 3); 인간 CD14에 대한 프라이머: fwd (5'-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3') (서열식별번호: 4), rev (5'- TGAGGGGGCCCTCGACG-3') (서열식별번호: 5).
cGAS-발현 293T cGAS ENPP1저 세포로부터의 상청액은 CD14+ IFNB1 발현을 유도하였지만, cGAS-널 293T 세포는 그렇지 않았고, 이는 암 세포에 의해 유출된 세포외 cGAMP가 CD14+ 세포에 의해 신호전달 인자로서 검출될 수 있음을 시사한다 (도 19b). 293T cGAS ENPP1저 세포 상에서의 ENPP1의 일시적 과다발현은 세포외 cGAMP 분해 및 CD14+ IFNB1 발현의 감소를 유발하였지만, 화합물 1의 첨가는 세포외 cGAMP 수준을 구제하고 CD14+ IFNB1 발현을 유도하였다 (도 19b).
도 19a는 상청액 전달 실험의 개략도를 보여준다. 도 19b는 DNA로 형질감염되고 화합물 1의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션된 cGAS-널 293T 세포 또는 293T cGAS ENPP1저 세포를 보여준다. 이들 세포로부터의 상청액을 1차 CD14+ 인간 PBMC로 옮겼다. IFNB1 mRNA 수준을 CD14에 대해 정규화하고, 비처리된 CD14+ 세포 대비 유도 배수를 계산하였다. 평균 ± SEM (n = 2). *P < 0.05, ***P < 0.001 (일원 ANOVA).
실시예 5: ENPP1 억제는 이온화 방사선 (IR) 처리와 상승작용하여 종양-연관 수지상 세포를 증가시킨다.
암 세포주가 cGAMP를 유출하는지 여부 및 이온화 방사선 (IR)이 생산된 세포외 cGAMP의 수준에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 이온화 방사선 (IR)은 종양 세포에서 시토졸 DNA를 증가시키고 cGAS-의존성 IFN-β 생산을 활성화시키는 것으로 제시되었다 (Bakhoum et al., Nat. Commun. (2015) 6:1-10; 및 Vanpouille Nat. Commun. (2017) 8:15618). 플레이팅 24시간 후, 세슘 공급원을 사용하여 20 Gy IR로 4T1 세포를 처리하고, 세포 배양물에 존재하는 ENPP1을 억제하기 위해 50 uM의 ENPP1 억제제 (화합물 1)가 보충된 배지로 교체하였다. 배지를 표시된 시간에 수집하고, 1000 x g에서 원심분리하여 잔류 세포를 제거하고, 0.5% 아세트산으로 산성화시키고, 추출 표준물로서 시클릭-13C10,15 5-GMP-13C10,15N5-AMP로 보충하였다 (100 μL 중 2 μM의 최종 농도를 위해 적절한 양). 이전에 기재된 바와 같이 (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2015) 112:E5699-705), cGAMP를 풍부화하기 위해 배지를 하이퍼셉(HyperSep) 아미노프로필 SPE 칼럼 (써모피셔 사이언티픽)에 적용하였다. 용리액을 증발 건조시키고, 500 nM 내부 표준물로 보충된 50:50 아세토니트릴:물 중에 재구성하였다. 배지를 cGAMP의 질량 분광측정 정량화에 적용하였다.
48시간에 걸쳐 4T1 세포에서 연속 cGAMP 유출을 검출하였다. 48시간째에, IR로 처리된 세포는 비처리된 것보다 유의하게 더 높은 세포외 cGAMP 수준을 가졌다.
다음으로, 마우스 4T1 종양 모델에서 종양-연관 수지상 세포의 수에 대한 예시적인 ENPP1 억제제 화합물 1과 조합된 IR의 효과를 조사하였다 (도 20b). 7주령 내지 9주령의 암컷 Balb/c 마우스 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories))에게 50 μL의 PBS 중에 현탁된 1 x 106개의 4T1-루시페라제 종양 세포를 유방 지방 패드 내로 접종하였다. 주사 2일 후에, 종양을 0.5 mm Cu로 필터링된 225 kVp 캐비닛 X선 조사기 (IC 250, 킴트론 인크.(Kimtron Inc.), 코네티컷주)를 사용하여 20 Gy로 조사하였다. 종양이 놓이는 15 x 20 mm 개구를 갖는 3.2 mm 납 차폐물로 마취된 동물을 차폐시켰다. 마우스에게 100 μL의 PBS 중 1 mM 화합물 1 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하였다. 다음날, 종양을 추출하고, 20 μg/mL DNase I 유형 IV (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 1 mg/mL 콜라게나제 (시그마-알드리치)를 함유하는 RPMI + 10% FBS 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 종양을 100 μm 세포 스트레이너 (시그마-알드리치)에 통과시키고, 적혈구를 적혈구 용해 완충제 (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA)를 사용하여 실온에서 5분 동안 용해시켰다. 세포를 라이브/데드 고정가능한 근적외선 사멸 세포 염색 키트 (써모 피셔 사이언티픽)로 염색하고, 트루스테인 fcX(TruStain fcX)를 사용하여 10분 동안 Fc-차단하고, 후속적으로 CD11c, CD45, 및 I-A/I-E (모두 바이오레전드(Biolegend))로 항체-염색하였다. 세포를 SH800S 세포 분류기 (소니(Sony)) 또는 LSR II (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 분석하였다. 통계적 분석을 위해 플로우조(FlowJo) V10 소프트웨어 (트리스타(Treestar)) 및 프리즘(Prism) 7.04 소프트웨어 (그래프패드(Graphpad))를 사용하여 데이터를 분석하고, 웰치 보정과 함께 독립표본 t 검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
화합물 1의 종양내 주사는 PBS 대조군과 비교하여 종양-연관 백혈구 조성을 변화시키지 않았고 (도 20b), 이는 ENPP1이 이러한 종양 모델에서 기저 수준 세포외 cGAMP를 소거하는데 실질적인 역할을 하지 않는다는 것을 시사한다. 그러나, 종양을 IR로 전처리한 경우에, 화합물 1이 종양 연관 CD11c+ 집단을 증가시키는 것으로 관찰되었다 (도 20b).
결과를 도 20a 및 도 20b에 예시한다. 도 20a는 48시간에 걸쳐 4T1 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP를 보여준다. 시간 0에, 세포를 비처리로 두거나 또는 20 Gy IR로 처리하고, 50 μM 화합물 1이 보충된 배지로 리프레싱하였다. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.004 (스튜던트 t 검정). 도 20b는 제0일에 BALB/cJ 마우스에 동소 주사한 4T1 세포 (1x106개)를 보여준다. 종양을 비처리로 두거나 또는 20 Gy IR로 처리하고, 제2일에 PBS (IR (0 Gy)의 경우 n = 5; IR (20 Gy)의 경우 n = 4) 또는 화합물 1 (n = 5)로 종양내로 주사하였다. 종양을 수거하고, 제3일에 FACS에 의해 분석하였다. *P = 0.047 (웰치 t 검정).
실시예 6: ENPP1 억제는 IR 처리 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 항종양 효과를 발휘한다
이온화 방사선 (IR) 및 예시적인 ENPP1 억제제, 예를 들어, 화합물 1을 사용하여 생체내에서 세포외 cGAMP를 추가로 증가시키는 것에 의해 면역 검출 및 종양의 클리어런스가 증가될 수 있는지 여부를 조사하였다.
7주령 내지 9주령의 암컷 Balb/c 마우스 (잭슨 래보러토리즈)에게 50 μL의 PBS 중에 현탁된 5 x 104개의 4T1-루시페라제 세포를 유방 지방 패드 내로 접종하였다. 종양 부피 (길이2 x 폭/2로 결정됨)가 80 mm3 내지 120 mm3에 도달하였을 때, 종양을 0.5 mm Cu로 필터링된 225 kVp 캐비닛 X선 조사기 (IC 250, 킴트론 인크., 코네티컷주)를 사용하여 20 Gy로 조사하였다. 종양이 놓이는 15 x 20 mm 개구를 갖는 3.2 mm 납 차폐물로 마취된 동물을 차폐시켰다. IR 후 제2일, 제4일 및 제7일에, PBS 중 100 μM 화합물 1 및/또는 10 μg cGAMP 100 μL 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하였다. 대안적으로, IR 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 PBS 중 1 mM 화합물 1 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하고, 200 μg의 항-CTLA-4 항체 또는 시리안 햄스터 IgG 항체 (둘 다 바이오엑스셀(BioXCell))를 복강내로 주사하였다. 상이한 처리군으로부터의 마우스를 각각의 케이지에 공동-수용하여 케이지 효과를 제거하였다. 실험자는 전체 연구에 걸쳐 맹검상태였다. 종양 부피를 격일로 기록하였다. 마우스내 상관관계를 설명하기 위해 일반화된 추정 방정식으로 종양 부피를 분석하였다. 각각의 시점에서의 치료군의 쌍별 비교는 다중 비교를 위한 터키 조정과 함께 사후 검정을 사용하여 수행하였다. 동물 사멸을 그래프패드 프리즘 7.03을 사용하여 카플란 마이어 곡선에 플롯팅하고, 로그순위 만텔-콕스 검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. 모든 동물 절차는 실험 동물 관리에 관한 행정 패널에 의해 승인되었다.
화합물 1의 투여는 유의하지는 않지만 IR 처리의 종양 수축 효과를 증진시켰다 (도 21a). cGAMP의 종양내 주사는 IR 처리에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았지만, cGAMP에 더하여 화합물 1의 주사는 종양을 상승작용적으로 수축시키고, 생존을 연장시키고, 10% 치유율을 달성하였다 (도 21a 및 도 21b).
적응성 면역 체크포인트 차단제 항-CTLA-4와의 상승작용적 효과를 또한 시험하였다. IR 없이, 항-CTLA-4 및 화합물 1로의 처리는 생존을 연장시키는 것에 대해 어떠한 효과도 없었다 (도 21c). 그러나, IR 전처리를 화합물 1 및 항-CTLA-4와 조합하는 것은 유의한 상승작용적 효과를 발휘하였고, 10% 치유율을 달성하였다. 종합하면, 이들 결과는 IR 처리를 ENPP1 억제와 조합함으로써 세포외 cGAMP를 증진시키는 것이 종양 면역원성을 증가시키고 항종양 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.
결과를 도 21a에 예시하며, 이는 IR과 조합된 화합물 1의 종양 수축 효과를 보여준다. 확립된 종양 (100 ± 20 mm3)을 20 Gy IR로 1회 처리한 후, IR 후 제2일, 제4일, 및 제7일에 PBS의 3회 종양내 주사 또는 처리에 의해 처리하였다 (처리군당 n = 9). 상이한 처리군으로부터의 마우스를 공동-수용하였고, 실험자는 맹검상태였다. 마우스내 상관관계를 설명하기 위해 일반화된 추정 방정식으로 종양 부피를 분석하였다. 각각의 시점에서의 치료군의 쌍별 비교는 다중 비교를 위한 터키 조정과 함께 사후 검정을 사용하여 수행하였다. 도 21b는 도 21a에 대한 카플란 마이어 곡선을 보여주며, P 값은 로그-순위 만텔-콕스 검정에 의해 결정되었다. 도 21c는, 도 21b에서와 동일한 절차에 더하여, IR 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 복강내로 주사된 항-CTLA4 또는 IgG 이소형 대조군 항체를 보여준다 (IR (0) + 화합물 1 + CTLA-4 처리군의 경우 n = 8; 모든 다른 처리군의 경우 n = 17 - 19). 통계적 분석을 도 21b에서와 같이 수행하였다.
요약하면, 이들 결과는 cGAMP가 세포외 존재하고, 대상 ENPP1 억제제가 세포외 작용할 수 있음을 나타내며; 따라서, 이는 ENPP1의 세포외 억제가 치료 효과를 위해 충분함을 나타낸다. ENPP1은 선천성 면역 체크포인트로서의 자격이 있다. 이들 실험은 ENPP1을 세포외 억제하는 것이 cGAMP가 항암 면역을 강화시키는 것을 가능하게 하고 요법으로서 이미 이용가능한 면역 체크포인트 차단 약물과 상승작용적으로 조합하는 것을 가능하게 한다는 것을 나타낸다 (도 22).
실시예 7: 2'3'-cGAMP는 암 세포에 의해 생산되고 ENPP1에 의해 조절되는 면역전달물질이다
서론
2'3'-시클릭 GMP-AMP (cGAMP)는 시토졸 dsDNA에 반응하여 합성되고 선천성 면역 STING 경로를 활성화시키는 세포내 제2 메신저로서 특징화된다. 그의 세포외 히드롤라제 ENPP1은 세포외 cGAMP의 존재를 암시하였다. 질량 분광측정법을 사용하여, cGAMP가 조작된 세포주에 의해 가용성 인자로서 연속적으로 유출되지만, 이어서 ENPP1에 의해 효율적으로 소거되는 것이 검출되었다. 강력하고 특이적이며 세포 불투과성인 ENPP1 억제제를 개발함으로써, cGAMP 유출이 마우스 종양 모델에 통상적으로 사용되는 암 세포주에서 검출되었다. 종양에서, 중화 단백질을 사용한 세포외 cGAMP의 고갈은 종양-연관 수지상 세포를 감소시켰다. 유전자 녹아웃에 의한 세포외 cGAMP의 부스팅 및 ENPP1의 약리학적 억제는 종양-연관 수지상 세포를 증가시키고, 종양을 수축시키고, 이온화 방사선 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 종양을 치유하였다. 결론적으로, cGAMP는 종양에 의해 방출되고 숙주 선천성 면역에 의해 검출되는 항암 면역전달물질이다.
제2 메신저 2'3'-시클릭 GMP-AMP (cGAMP)는 항바이러스 및 항암 선천성 면역에서 중추적 역할을 한다. 이는 시토졸에서 이중-가닥 DNA (dsDNA)에 반응하여 효소 시클릭-GMP-AMP 신타제 (cGAS)에 의해 합성되며, 세포내 병원체 및 손상 세포 또는 암성 세포에 대한 위험 신호이다. cGAMP는 그의 소포체 (ER) 표면 수용체 인터페론 유전자의 자극인자 (STING)에 결합하고 이를 활성화시켜 제1형 인터페론 (IFN)의 생산을 활성화시킨다. 이들 강력한 시토카인은 하류 선천성 및 적응성 면역 반응을 촉발하여 위협을 소거한다.
그의 기원 세포 내에서 STING를 활성화시키는 것에 더하여, cGAMP는 상피 세포에서 간극 연접을 통해 방관자 세포로 확산될 수 있다. 이러한 세포-세포 소통 메카니즘은 인접 세포가 손상 세포를 의식하게 하고, 또한 불행하게도 약물-유도된 간 독성 및 뇌 전이의 확산을 설명한다. 또한, 시토졸 cGAMP는 출아 바이러스 입자 내로 패키징되고, 다음 감염 라운드 동안 전달될 수 있다. 둘 다의 전달 모드에서, cGAMP는 세포외 공간에 전혀 노출되지 않는다.
유일한 검출가능한 cGAMP 히드롤라제 활성을 담당하는 효소는 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스테라제 1 (ENPP1)이다 (예를 들어, 문헌 [Li, L. et al., Hydrolysis of 2'3'-cGAMP by ENPP1 and design of nonhydrolyzable analogs. Nat. Chem. Biol. 10, 1043-8 (2014)] 참조). 이는 ENPP1이 단일-통과 막횡단 도메인에 의해 앵커링된 막-결합된 형태 및 혈청 내의 절단된 가용성 단백질 둘 다로서 세포외 효소로서 주석이 달려있기 때문에 놀라운 것이다. 2개의 음전하를 갖고 아마도 세포 막을 수동 횡단할 수 없을 cGAMP는 세포에 진입하여 STING를 활성화시킬 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Gao, P. et al., Structure-function analysis of STING activation by c[G(2',5') pA(3',5')p] and targeting by antiviral DMXAA. Cell 154, 748-762 (2013); 및 Corrales, L. et al., Direct Activation of STING in the Tumor Microenvironment Leads to Potent and Systemic Tumor Regression and Immunity. Cell Rep. 11, 1018-1030 (2015)] 참조), 이는 cGAMP에 대한 수송 채널이 있다는 것을 시사한다. 세포에 진입할 수 있기 때문에, cGAMP 유사체는 현재 종양내 주사를 통해 전이성 고형 종양을 치료하기 위해 임상 시험에서 시험되고 있다. 세포외 cGAMP가 유입될 수 있고, 항암 효과를 갖고, 우성 cGAMP 히드롤라제가 세포외라는 것을 알고 있으므로, cGAMP가 세포외 공간으로 유출되어 다른 세포에 신호를 전달하고, 세포외 분해에 의해 조절된다는 가설을 세웠다.
본원에서 암에 의한 cGAMP 유출 및 항암 면역 검출에서의 세포외 cGAMP의 역할이 입증되었다. 유전자 녹아웃 및 약리학적 억제를 사용하여, 세포외 cGAMP 농도, 면역 침윤, 및 종양 진행을 제어하는데 있어서의 ENPP1의 역할을 또한 조사하였다. 종합하면, cGAMP는 ENPP1에 의해 조절되는 면역전달물질로서 특징화되었다.
물질 및 방법
시약, 항체, 및 세포주
[α-32P]ATP (800 Ci/mmol, 10 mCi/mL, 250 μCi) 및 [35S]ATPαS (1250 Ci/mmol, 12.5 mCi/mL, 250 μCi)를 퍼킨 엘머로부터 구입하였다. 아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 아데노신-13C10,15N5, 5'-트리포스페이트, 구아노신-13C10,15N5-트리포스페이트, 4-니트로페닐 포스페이트, 및 비스(4-니트로페닐) 포스페이트는 시그마-알드리치로부터 구입하였고, >98% 원자적으로 순수하였다. 2'3'-cGAMP는 인비보젠(Invivogen)으로부터 구입하였다. Caco-2 검정은 시프로텍스(Cyprotex)로부터 구입하였다. 키놈 스크린은 유로핀스(Eurofins)에 의해 수행하였다. PAMPA 및 MDCK 투과성 검정은 퀸타라 디스커버리(Quintara Discovery)에 의해 수행하였다. 총 단백질 함량은 BCA 검정 (써모피셔)을 사용하여 정량화하였다. 세포 생존율은 셀타이터글로 검정 (프로메가)을 사용하여 정량화하였다. 전장 인간 ENPP1을 pcDNA3 벡터 내로 클로닝하였다. 4 온-타겟플러스(ON-TARGETplus) ENPP1 siRNA (LQ-003809-00-0002) 세트를 다마콘(Dharmacon)으로부터 구입하였다. QS1을 이전에 기재된 바와 같이 합성하였다25. 하기 모노클로날 항체를 웨스턴 블롯팅에 사용하였다: 토끼 항-cGAS (D1D3G 셀 시그널링(Cell Signaling), 1:1,000), 토끼 항-마우스 cGAS (D2O8O 셀 시그널링, 1:1,000), 마우스 항-튜불린 (DM1A 셀 시그널링, 1:2,000), 및 토끼 항-STING (D2P2F 셀 시그널링, 1:1,000), IRDye 800CW 염소 항-토끼 (리-코르(LI-COR), 1:15,000), 및 IRDye 680RD 염소 항-마우스 (리-코르, 1:15,000).
293T 세포를 ATCC로부터 구입하고, 마우스 cGAS를 안정하게 발현하도록 바이러스 형질감염시켰다. 인간 ENPP1 (5'-CACCGCTGGTTCTATGCACGTCTCC-3')을 표적화하는 CRISPR sgRNA의 바이러스 형질감염에 의해 293T cGAS ENPP1저 세포를 생성하고, 이러한 풀로부터의 단일 세포 클로닝 후에 293T mcGAS ENPP1-/- 세포를 선택하였다. 마우스 Mb21d1 (5'- CACCGGAAGGGGCGCGCGCTCCACC-3')을 표적화하는 CRISPR sgRNA의 바이러스 형질감염 (렌티CRISPRv2-블라스트, 애드진(Addgene) 플라스미드 #83480을 사용함)에 의해 4T1 및 E0771 cGAS-/- 세포를 생성하였다. 세포를 단일 세포 클로닝 후에 선택하였다. 마우스 Enpp1 (5'- GCTCGCGCCCATGGACCT-3' 및 5'- ATATGACTGTACCCTACGGG -3')을 표적화하는 CRISPR sgRNA (렌티CRISPRv2-블라스트를 사용함) (Sanjana, N. E., Shalem, O. & Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods 11, 783-784 (2014)) 또는 스크램블드 서열의 바이러스 형질감염에 의해 4T1-Luc ENPP1-/- 세포를 생성하였다. 플라스미드 pGH188을 사용하여 shRNA (5'-CAGGATTGAGCTACAAGAATAT-3')의 바이러스 형질감염에 의해 4T1-Luc shcGAS 세포를 생성하였다. shRNA를 보유하는 세포를 블라스티시딘으로 선택하고, GFP 발현에 대해 분류하고, 실험을 위한 풀로서 사용하였다. MDA-MB-231은 ATCC로부터 구입하였고, E0771은 CH3 바이오시스템즈(CH3 BioSystems)로부터 구입하였고, 4T1-루시페라제 및 분비된 mENPP1을 발현하는 HEK293S GnT1- 세포를 입수하였다.
세포 배양
세포주를 10% FBS (아틀란타 바이올로직스) (v/v) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔)으로 보충된 DMEM (코닝 셀그로) (293T, MC38) 또는 RPMI (코닝 셀그로) (4T1-Luc, E0771, MDA-MD-231) 중에 유지시켰다. 전혈로부터의 풍부화된 백혈구 연층을 퍼콜 밀도 구배에 적용함으로써 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. CD14+ 마이크로비즈 (밀테니)를 사용하여 CD14+ PBMC를 단리하였다. CD14+ PBMC를 2% 인간 혈청 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RMPI에서 배양하였다.
재조합 단백질의 발현 및 정제
sscGAS: 돼지 cGAS를 코딩하는 DNA 서열 (잔기 135-497)을 돼지 cDNA 라이브러리로부터 프라이머 쌍 fwd: (5'-CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCATATGGGCGCCTGGAAGCTCCAGAC-3') 및 rev: (5'-GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCCAAAAAACTGGAAATCCATTGT-3')를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 깁슨 어셈블리를 통해 pDB-His-MBP 내로 삽입하고, 로제타 세포에서 발현시켰다. 세포를 카나마이신 (100 μg/ml)을 함유하는 2xYT 배지에서 성장시키고, OD600이 1에 도달하였을 때 0.5 mM IPTG로 유도하고, 16℃에서 밤새 성장하도록 하였다. 단백질 및 세포 용해물을 수반하는 모든 후속 절차는 4℃에서 수행하였다. 세포가 펠릿화되었고, 20 mM HEPES pH 7.5, 400 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM 이미다졸, 1 mM DTT, 및 프로테아제 억제제 칵테일 (콤플리트(cOmplete) EDTA 무함유 정제, 로슈) 중에 용해시켰다. 세포 추출물을 50,000 x g에서 1시간 동안 초원심분리에 의해 청정화하였다. 청정화된 상청액을 HisPur 코발트 수지 (써모피셔 사이언티픽; 박테리아 배양물 리터당 1 mL 수지)와 함께 인큐베이션하였다. 코발트 수지를 20 mM HEPES pH 7.5, 1 M NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM 이미다졸, 1 mM DTT로 세척하였다. 단백질을 20 mM HEPES pH 7.5, 1 M NaCl, 10% 글리세롤, 및 1 mM DTT 중 300 mM 이미다졸을 사용하여 수지로부터 용리시켰다. His-MBP-sscGAS를 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 20 mM HEPES pH 7.5, 400 mM NaCl, 1 mM DTT에 대해 투석하였다. 추후 사용을 위해 단백질을 분취물로 순간 동결시켰다.
STING: 마우스 STING (잔기 139-378)를 pTB146 His-SUMO 벡터 내로 삽입하고, 로제타 세포에서 발현시켰다. 세포를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 2xYT 배지에서 성장시키고, OD600이 1에 도달하였을 때 0.75 mM IPTG로 16℃에서 밤새 유도하였다. 단백질 및 세포 용해물을 사용하는 모든 후속 절차는 4℃에서 수행하였다. 세포가 펠릿화되었고, 50 mM 트리스 pH 7.5, 400 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 2 mM DTT, 및 프로테아제 억제제 (콤플리트, EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일 로슈) 중에 용해시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고, 용해물을 50,000 rcf에서 1시간 동안 초원심분리에 의해 청정화하였다. 청정화된 상청액을 HisPur 코발트 수지 (써모피셔 사이언티픽; 1 L 박테리아 배양물당 1 mL 수지)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 수지-결합된 단백질을 50 칼럼 부피의 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 2% 트리톤 X-114, 50 CV의 50 mM 트리스 pH 7.5, 1 M NaCl (각각의 세척은 1 방울/2-3초의 점적 속도로 설정되었고, 2-3시간이 소요됨), 및 20 CV의 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl로 세척하였다. 단백질을 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl 중 600 mM 이미다졸을 사용하여 수지로부터 용리시켰다. His-SUMO-STING를 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, SUMOlase 효소 His-ULP1과 함께 인큐베이션하면서 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl에 대해 투석하여 His-SUMO 태그를 밤새 제거하였다. 용액을 HisPur 코발트 수지와 함께 다시 인큐베이션하여 His-SUMO 태그를 제거하고, 관통물로부터 STING를 수집하였다. 단백질을 50 mM 트리스 pH 7.5에 대해 투석하고, 악타 FPLC (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 히트랩Q 음이온 교환 칼럼 (지이 헬스케어) 상에 로딩하고, NaCl 구배로 용리시켰다. STING를 함유하는 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS로 교환하고, 사용시까지 4℃에서 저장하였다.
ENPP1: mENPP1은 문헌 [Kato, K. et al., (Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Enpp1. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 68, 778-782 (2012); 및 Crystal structure of Enpp1, an extracellular glycoprotein involved in bone mineralization and insulin signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 16876-81 (2012)]에 기재된 바와 같이 생산하였다.
액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정법
시클릭 GMP-13C10,15N5-AMP를 내부 표준물로서 사용하고, 시클릭 13C10,15 5-GMP-13C10,15N5-AMP를 추출 표준물로서 사용하였다. 1 mM ATP (동위원소 표지됨), 1 mM GTP (동위원소 표지됨), 20 mM MgCl2, 0.1 mg/mL 청어 고환 DNA (시그마), 및 2 μM sscGAS를 100 mM 트리스, pH 7.5 중에서 밤새 인큐베이션하여 동위원소-표지된 cGAMP 표준물을 합성하였다. 반응물을 95℃에서 가열하고, 3 kDa 원심분리 필터를 통해 여과하였다. 물을 회전 증발기 상에서 제거하였다. cGAMP를 UV-vis 검출기 (프로스타(ProStar); 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) 및 분획 수집기 (440-LC; 애질런트 테크놀로지스)에 연결된 정제용 HPLC (1260 인피니티 LC 시스템; 애질런트 테크놀로지스) 상에서 PLRP-S 중합체 역상 정제용 칼럼 (100 Å, 8 μm, 300 x 25 mm; 애질런트 테크놀로지스)을 사용하여 조 반응 혼합물로부터 정제하였다. 유속은 25 mL/분으로 설정하였다. 이동상은 물 중 10 mM 트리에틸암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴로 이루어졌다. 이동상은 처음 5분 동안 2% 아세토니트릴로 시작하였다. 이어서, 아세토니트릴을 5-20분에 30%로 상승시키고, 20-22분에 90%로 상승시키고, 22-25분에 90%에서 유지시키고, 이어서 25-28분에 2%로 하강시켰다. cGAMP를 함유하는 분획을 동결건조시키고, 물 중에 재현탁시켰다. 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 4℃로 설정된 오토샘플러가 구비되고 에이비 사이엑스 4000 QTRAP (캘리포니아주 포스터 시티)에 연결된 시마즈 HPLC (캘리포니아주 샌프란시스코) 상에서 샘플을 cGAMP, ATP, 및 GTP 함량에 대해 분석하였다. 10 μL의 부피를 바이오베이직 AX LC 칼럼, 5 μm, 50 x 3 mm (써모 사이언티픽) 상에 주입하였다. 이동상은 100 mM 탄산암모늄 (A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (B)으로 이루어졌다. 초기 조건은 90% B였고, 0.5분 동안 유지시켰다. 이동상을 0.5분에서 2.0분까지 30% A로 경사지게 하고, 2.0분에서 3.5분까지 30% A로 유지시키고, 3.5분에서 3.6분까지 90% B로 경사지게 하고, 3.6분에서 5분까지 90% B로 유지시켰다. 유량은 0.6 mL/분으로 설정하였다. 질량 분광계를 전극 분무 양이온 방식으로 작동시켰고, 소스 온도는 500℃로 설정하였다. 질소 기체를 사용하여 디클러스터링 및 충돌-유도 해리를 달성하였다. 디클러스터링 전위 및 충돌 에너지는 표준물의 직접 주입에 의해 최적화하였다. 각각의 분자에 대해, MRM 전이(들) (m/z), DP (V), 및 CE (V)는 하기와 같았다: ATP (508 > 136, 341, 55), GTP (524 > 152, 236, 43), cGAMP (675 > 136, 121, 97; 675 > 312, 121, 59; 675 > 152, 121, 73), 내부 표준물 시클릭 GMP-13C10,15N5-AMP (690 > 146, 111, 101; 690 > 152, 111, 45; 690 > 327, 111, 47), 추출 표준물 시클릭 13C10,15N5-GMP-13C10,15N5-AMP (705 > 156, 66, 93; 705 > 162, 66, 73).
293T cGAS ENPP1-/- 세포에서의 유출 검정
293T cGAS ENPP1-/- 세포를 푸르콜 (어드밴스드 바이오매트릭스)로 코팅된 조직 배양 처리 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 배지를 서서히 제거하고, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄-피루브산나트륨 (써모피셔) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 무혈청 DMEM으로 교체하였다. 표시된 시간에, 배지를 제거하고, 세포를 차가운 PBS로 플레이트에서 세척해내었다. 배지 및 세포 둘 다를 1000 rcf에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포를 500 nM 내부 표준물로 보충된 30 내지 100 μL의 50:50 아세토니트릴:물 중에 용해시키고, 15,000 rcf에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 불용성 분획을 제거하였다. 농축이 필요하지 않은 경우, 500 nM의 내부 표준물 및 20% 포름산으로 보충된 배지의 분취물을 제거하였다. 농축이 필요한 경우, 배지를 0.5% 아세트산으로 산성화시키고, 추출 표준물 (100 μL 중 2 μM의 최종 농도에 적절한 양)로 보충하였다. 문헌 [Gao, D. et al., (Activation of cyclic GMP-AMP synthase by self-DNA causes autoimmune diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E5699-705 (2015))]에 기재된 바와 같이, cGAMP를 풍부화하기 위해 배지를 하이퍼셉 아미노프로필 SPE 칼럼 (써모피셔 사이언티픽)에 적용하였다. 용리액을 증발 건조시키고, 500 nM 내부 표준물로 보충된 50:50 아세토니트릴:물 중에 재구성하였다. 배지 및 세포 추출물을 cGAMP, ATP, 및 GTP의 질량 분광측정 정량화에 적용하였다.
293T cGAS ENPP1-/- 세포의 형질감염 자극
293T cGAS ENPP1-/- 세포를 제조업체의 지침서에 따라 퓨진 6 (프로메가) 플러스 표시된 농도의 (공 또는 인간 ENPP1 함유) pcDNA3 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에, 유출 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
조건화 배지 전달
293T cGAS ENPP1저 세포를 플레이팅하고, 상기 기재된 바와 같이 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 배지를 RPMI + 2% 인간 혈청 + 1% 페니실린-스트렙토마이신, +/- 2 μM cGAMP, +/- 20 nM 재조합 mENPP1, 또는 +/- 50 uM 화합물 1로 교체하였다. 배지 교체 24시간 후, 293T cGAS ENPP1저 세포로부터 조건화 배지를 제거하고, 신선하게 단리된 CD14+ PBMC와 함께 인큐베이션하였다. 14-16시간 후에 CD14+ PBMC의 유전자 발현을 분석하였다.
RT-PCR 분석
트리졸 (써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 막시마 H 마이너스 리버스 트랜스크립타제 (써모 피셔 사이언티픽)로 역전사시켰다. 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 아큐파워 2X 그린스타 qPCR 마스터 믹스 (바이오니어)로 이중으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 CD14, ACTB, 또는 GAPDH 발현에 대해 데이터를 정규화하였다. 배수 유도는 ΔΔCt를 사용하여 계산하였다. 인간 IFNB1에 대한 프라이머: fwd (5'-AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3'), rev (5'-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3'); 인간 CD14에 대한 프라이머: fwd (5'-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3'), rev (5'-TGAGGGGGCCCTCGACG-3'); 인간 ACTB에 대한 프라이머: fwd (5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3'), rev (5'- AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'); 인간 GAPDH에 대한 프라이머: fwd (5'-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3'); rev (5'-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3').
32P-cGAMP 분해 TLC 검정
비표지된 ATP (1 mM) 및 32P-ATP로 도핑된 GTP (1 mM)를 2 μM 정제된 재조합 돼지 cGAS와 함께 20 mM 트리스 pH 7.5, 2 mM MgCl2, 100 μg/mL 청어 고환 DNA 중에서 실온에서 밤새 인큐베이션하여 방사성표지된 32P cGAMP를 합성하였고, 나머지 뉴클레오티드 출발 물질은 알칼리성 포스파타제로 37℃에서 4시간 동안 분해하였다. 100 μL의 10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1% NP-40, pH 9.0 중에서 1x106개의 세포 (293T) 또는 10x106개의 세포 (4T1-Luc, E0771, 및 MDA-MB-231)를 스크래핑하고 용해시켜, 세포 용해물을 생성하였다. 4T1-Luc, E0771, 및 MDA-MB-231에 대해, BCA 검정 (피어스, 써모 피셔)을 사용하여 용해물의 총 단백질 농도를 측정하고, 샘플을 정규화하여 동일한 양의 단백질을 각각의 용해물 반응에 사용하였다. 프로브 32P-cGAMP (5 μM)를 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 200 μM ZnCl2, pH 7.5 또는 pH 9.0 중에서 mENPP1 (20 nM) 또는 전세포 용해물과 함께 표시된 양의 시간 동안 인큐베이션하였다. 억제 곡선을 생성하기 위해, ENPP1 억제제의 5-배 희석물을 반응에 포함시켰다. TLC에 의해 분해를 평가하였다 (예를 들어, 문헌 [Li, L. et al., Hydrolysis of 2'3'-cGAMP by ENPP1 and design of nonhydrolyzable analogs. Nat. Chem. Biol. 10, 1043-8 (2014)] 참조). 플레이트를 인광체 스크린 (몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics)) 상에 노출시키고, 타이푼 9400(Typhoon 9400) 상에 영상화하고, 32P 신호를 이미지제이(ImageJ)를 사용하여 정량화하였다. 억제 곡선을 피팅하여 그래프패드 프리즘 7.03으로 IC50 값을 수득하였다. 쳉-프루소프 방정식 Ki,app = IC50 /(1 + [S]/Km)을 사용하여 IC50 값을 Ki,app 값으로 전환시켰다.
ALPL 및 ENPP2 억제 검정
반응 성분을 96-웰 플레이트 포맷으로 실온에서 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 (테칸(Tecan))에서 400 nM에서 흡광도를 측정하여 4-니트로페놀레이트의 생산을 모니터링함으로써 다른 엑토뉴클레오티다제에 대한 억제 검정을 수행하였다. ALPL: 실온에서 50 mM 트리스, 20 μM ZnCl2, 1 mM MgCl2를 함유하는 완충제 pH 9.0 중 0.1 nM ALPL, 2 μM 4-니트로페닐 포스페이트, 및 다양한 농도의 억제제. ENPP2: 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 200 μM ZnCl2, 2 mM CaCl2를 함유하는 완충제 pH 9.0 중 2 nM ENPP2, 500 μM 비스(4-니트로페닐) 포스페이트, 및 다양한 농도의 억제제.
암 세포주에서의 유출 검정
4T1-Luc, E0771, 및 MC38 세포를 50 μM 화합물 1로 보충된 새로운 배지로 교체하였다. 표시된 시점에, 배지를 수집하고; 세포를 플레이트에서 PBS로 스크래핑하고, 1000 rcf에서 펠릿화하고, 4 mL 50:50 아세토니트릴:물로 용해시키고, 15,000 rcf에서 원심분리하였다. cGAMP를 하이퍼셉 아미노프로필 SPE 칼럼을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 배지 및 세포 상청액으로부터 풍부화시키고, 질량 분광측정 정량화에 적용하였다.
4T1-Luc 종양 마우스 모델
7주령 내지 9주령의 암컷 BALB/c 마우스 (잭슨 래보러토리즈)에게 50 μL의 PBS 중에 현탁된 5 x 104개 또는 5 x 105개의 4T1-Luc-루시페라제 세포를 유방 지방 패드 내로 접종하였다. 종양 부피 (길이2 x 폭 / 2로 결정됨)가 80 mm3 내지 120 mm3에 도달하였을 때, 종양을 0.5 mm Cu로 필터링된 225 kVp 캐비닛 X선 조사기 (IC-250, 킴트론 인크., 코네티컷주)를 사용하여 20 Gy로 조사하였다. 종양이 놓이는 15 x 20 mm 개구를 갖는 3.2 mm 납 차폐물로 마취된 동물을 차폐시켰다. IR 후 제2일, 제4일 및 제7일에, PBS 중 100 μM 화합물 1 및/또는 10 μg cGAMP 100 μL 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하였다. 대안적으로, IR 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 PBS 중 1 mM 화합물 1 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하고, 200 μg의 항-CTLA-4 항체 또는 시리안 햄스터 IgG 항체 (둘 다 바이오엑스셀)를 복강내로 주사하였다. 상이한 처리군으로부터의 마우스를 각각의 케이지에 공동-수용하여 케이지 효과를 제거하였다. 실험자는 전체 연구에 걸쳐 맹검상태였다. 종양 부피를 격일로 기록하였다. 마우스내 상관관계를 설명하기 위해 일반화된 추정 방정식으로 종양 부피를 분석하였다. 각각의 시점에서의 치료군의 쌍별 비교는 다중 비교를 위한 터키 조정과 함께 사후 검정을 사용하여 수행하였다. 동물 사멸을 그래프패드 프리즘 7.03을 사용하여 카플란 마이어 곡선에 플롯팅하고, 로그-순위 만텔-콕스 검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. 모든 마우스는 스탠포드 대학교에서 스탠포드 대학교 동물 실험 윤리 위원회 규정에 따라 유지되었고, 절차는 실험 동물 관리에 관한 스탠포드 대학교 행정 패널에 의해 승인되었다.
종양의 FACS 분석
7주령 내지 9주령의 암컷 BALB/c WT (4T1-Luc 종양) 또는 C57BL/6 (E0771 종양) WT, cGAS-/-, 또는 STINGgt/gt (STING-/-로 지칭됨) 마우스 (잭슨 래보러토리즈)에게 50 μL의 PBS 중에 현탁된 1 x 106개의 종양 세포를 유방 지방 패드 내로 접종하였다. 주사 2일 후에, 종양을 기재된 바와 같이 조사하고, 100 μL의 PBS 중 1 mM 화합물 1 또는 PBS 단독을 종양내로 주사하였다. STING 및 mENPP1을 사용하는 실험의 경우, 100 μL의 100 μM 중화 STING 또는 비-결합 STING (R237A) 또는 700 nM mENPP1 또는 PBS를 종양내로 주사하였다. 다음날, 종양을 추출하고, 20 μg/mL DNase I 유형 IV (시그마-알드리치) 및 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터의 1 mg/mL 콜라게나제 (시그마-알드리치)를 함유하는 RPMI + 10% FBS 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 종양을 100 μm 세포 스트레이너 (시그마-알드리치)에 통과시키고, 적혈구를 적혈구 용해 완충제 (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA)를 사용하여 실온에서 5분 동안 용해시켰다. 세포를 라이브/데드 고정가능한 근적외선 사멸 세포 염색 키트 (써모 피셔 사이언티픽)로 염색하고, 트루스테인 fcX를 사용하여 10분 동안 Fc-차단하고, 후속적으로 CD11c, CD45, 및 I-A/I-E (모두 바이오레전드)로 항체-염색하였다. 세포를 SH800S 세포 분류기 (소니) 또는 LSR II (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 분석하였다. 통계적 분석을 위해 플로우조 V10 소프트웨어 (트리스타) 및 프리즘(Prism) 7.04 소프트웨어 (그래프패드)를 사용하여 데이터를 분석하고, 웰치 보정과 함께 독립표본 t 검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
생체내 영상화
마우스에게 200 μl 물 중 3mg 제노라이트(XenoLight) D-루시페린 (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))을 ip 주사하고, 라고 X(Lago X) 생체내 영상화 시스템 (스펙트럴 인스트루먼츠 이미징(Spectral Instruments Imaging))을 사용하여 영상화하였다. 물체 높이를 1.5cm로, 비닝을 4로, FStop를 1.2로 설정하였고, 노출 시간은 120초였다. 아우라 2.0.1 소프트웨어 (스펙트럴 인스트루먼츠 이미징)를 사용하여 영상을 분석하였다.
결과
cGAMP는 293T cGAS ENPP1-/- 세포로부터 가용성 인자로서 유출된다
cGAMP가 세포외 존재한다는 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 복합 혼합물로부터 cGAMP를 검출하기 위해 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정 (LC-MS/MS) 방법을 개발하였다. 2개의 동위원소 표지된 cGAMP 표준물을 사용하여 (도 1, 패널 a), 본 발명자들은 기초 세포 배양 배지 및 혈청 함유 배지 둘 다에서 cGAMP 농도를 0.5 nM까지 정량화할 수 있고, 본 발명자들은 동일한 실험에서 세포 추출물로부터 세포내 cGAMP 농도를 정량화할 수 있다 (도 1, 패널 b 및 도 8, 패널 a 및 b). 본 발명자들은 cGAS 또는 STING를 발현하지 않는 293T 세포를 사용하는 것을 선택하였다. 마우스 cGAS를 안정하게 발현시키고 CRISPR을 사용하여 ENPP1을 녹아웃시킴으로써, 본 발명자들은 293T cGAS ENPP1저 세포주를 생성하였다 (도 8, 패널 c). 이어서, 본 발명자들은 단일 클론을 단리하여 293T cGAS ENPP1-/- 세포주를 생성하였다. (도 8, 패널 c). 본 발명자들은 또한 혈청이 단백질분해적으로 절단된 가용성 형태의 ENPP1을 함유하기 때문에 무혈청 배지를 사용하였다. 이러한 ENPP1-무함유 세포 배양 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 임의의 자극의 부재 하에 293T cGAS ENPP1-/- 세포에서 일정한 낮은 마이크로몰 기저 세포내 cGAMP 농도를 검출하였다 (도 1, 패널 c). 이는 잘못된 DNA 분리의 결과로서 암 세포에 풍부한 시토졸 dsDNA가 존재하기 때문에 놀라운 것이 아니다 (예를 들어, 문헌 [Mackenzie, K. J. et al., cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature 548, 461-465 (2017); Harding, S. M. Mitotic progression following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature 548, 466-470 (2017); 및 Bakhoum, S. F. et al., Chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic DNA response. Nature 553, 467-472 (2018)] 참조). 세포에 신선한 배지를 보충한 후, 본 발명자들은 30시간 후에 세포외 cGAMP 농도의 100 nM로의 선형 증가를 측정하였다 (도 1, 패널 d). 30시간째에, 세포 외부의 cGAMP 분자의 수는 내부의 수와 동일하였다 (도 1, 패널 e). 본 발명자들은 세포외 락토스 데히드로게네이트 (LDH) 활성에 기초하여 무시할만한 양의 세포 사멸을 검출하였으며, 이는 배지 중의 cGAMP가 살아있는 세포에 의해 유출되었음을 시사한다 (도 1, 패널 e). 본 발명자들은 유출 속도 (v유출)가 220개 분자 세포-1 s-1 인 것으로 계산하였다 (도 1, 패널 f). 마지막으로, 배지 중의 cGAMP는 세포외 소포 및 단백질을 잔류시켜야하는 10 kDa 필터를 어떠한 체류도 없이 통과할 수 있고, 이는 cGAMP가 자유 가용성 분자로서 유출된다는 것을 시사한다 (도 1, 패널 h).
293T 세포에 의해 분비되는 세포외 cGAMP가 우세하게는 가용성 형태이지만 세포외 소포 내의 것이 아님을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 CD14+ 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 리포터로서 사용하였다. 이들 세포는 가용성 cGAMP를 흡수하고, 이는 IFN-β 생산으로 이어지는 것으로 이전에 밝혀졌다17. 본 발명자들은 CD14+ PBMC가 IFNB1을 상향조절함으로써 가용성 cGAMP의 서브마이크로몰 농도에 반응한다는 것을 관찰하였다 (도 9). DNA-형질감염된 cGAS-발현 293T cGAS ENPP1저 세포로부터의 조건화 배지는 CD14+ 세포에서 IFNB1 발현을 유도하였지만, DNA-형질감염된 cGAS-널 293T 세포로부터의 조건화 배지는 그렇지 않았으며, 이는 활성이 293T 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP의 결과임을 시사한다 (도 1, 패널 h 및 i). 정제된 가용성 재조합 마우스 ENPP1 (mENPP1)의 첨가 (도 8, 패널 d)는 조건화 배지에서 검출가능한 cGAMP를 고갈시켰고, 또한 이러한 활성을 제거하였다 (도 1, 패널 h 및 j). 가용성 ENPP1 (MW = ~100 kDa)은 막을 투과할 수 없고, 따라서 가용성 세포외 cGAMP에만 접근할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 293T 세포가 가용성 cGAMP를 분비한다고 결론지었다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 이러한 인공 암 세포주가 그의 세포내 cGAMP를 가용성 인자로서 세포외 배지로 유출함으로써 정상 상태로 유지한다는 것을 입증한다.
도 1, 패널 a 내지 j: cGAMP가 293T cGAS ENPP1-/- 세포로부터 가용성 인자로서 유출된다. a, cGAMP 및 단일 동위원소-표지된 cGAMP의 화학 구조. b, cGAMP는 LC-MS/MS에 의해 검출되고, 정량 하한치 = 4 nM이다. (좌측) 0, 4, 및 10 nM의 cGAMP 및 내부 표준물로서 500 nM의 단일 동위원소-표지된 cGAMP (15 Da 더 무거움)의 액체 크로마토그래피 트레이스; (우측) cGAMP의 외부 표준 곡선, R2 = 0.996. 데이터는 > 10회의 독립적인 실험을 대표한다. c-d, LC-MS/MS를 사용하여 측정된 외인성 자극의 부재 하의 293T cGAS ENPP1-/- 세포로부터의 cGAMP의 세포내 및 세포외 농도. 시간 0에, 세포를 무혈청 배지로 보충하였다. 평균 ± SEM (n = 2), 일부 오차 막대는 너무 작아서 시각화할 수 없다. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. e, 세포외/총 락토스 데히드로게네이트 (LDH) 활성의 분율 (우측 y-축)과 비교한 (c) 및 (d)의 데이터로부터 계산된 세포외/총 cGAMP 분자의 분율 (좌측 y-축). f, (d)의 데이터로부터 계산된 시간 경과에 따른 세포당 유출된 cGAMP의 양. 유출 속도는 선형 회귀를 사용하여 확인하였다. g, 배지를 10 kDa 필터에 통과시키기 전 및 후에 측정된 293T cGAS ENPP1-/- 세포에 의해 생산된 세포내 및 세포외 cGAMP 농도. 평균 ± SEM (n = 2). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. h, (i) 및 (j)에 대한 조건화 배지 전달 실험의 개략도. cGAS-널 293T 또는 293T cGAS ENPP1저 세포를 공 pcDNA 벡터로 형질감염시키고, +/- 20 nM 재조합 마우스 ENPP1 (mENPP1)로 처리하였다. 이들 세포로부터의 조건화 배지를 1차 CD14+ 인간 PBMC로 옮겼다. i, IFNB1 mRNA 수준을 CD14에 대해 정규화하고, 비처리 CD14+ 세포 대비 배수 유도를 계산하였다. 평균 ± SEM (n = 4). ***P = 0.0003 (일원 ANOVA). cGAMP 농도를 조건화 배지에서 측정하였다. 평균 ± SEM (n = 2). ***P = 0.0002 (일원 ANOVA). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. j, IFNB1 mRNA 수준을 CD14에 대해 정규화하고, 비처리된 CD14+ 세포 대비 유도 배수를 계산하였다. 평균 ± SEM (n = 2). *P = 0.04 (일원 ANOVA). cGAMP 농도를 조건화 배지에서 측정하였다. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.002 (일원 ANOVA). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 8, 패널 a 내지 d: LC-MS/MS 방법의 개발 및 293T cGAS ENPP1저 및 293T cGAS ENPP1-/- 세포주의 구축. a, 0, 20, 및 80 nM의 cGAMP; 500 nM의 단일 동위원소-표지된 내부 표준물 cGAMP (15 Da 더 무거움); 및 2 μM의 이중 동위원소-표지된 추출 표준물 cGAMP (30 Da 더 무거움)의 액체 크로마토그래피 트레이스. 모든 분석물의 화학 구조. b, LC-MS/MS에 의해 측정된 ATP 농도에 대한 세포 수의 보정. 평균 ± SEM (n = 2). c, 웨스턴 블롯에 의해 분석된 293T, 293T cGAS ENPP1-/-, 및 293T cGAS ENPP1저 세포주의 cGAS 발현 (좌측). TLC 및 자가방사선촬영에 의해 측정된, 각각 1백만개의 293T cGAS, 293T cGAS ENPP1-/-, 및 293T cGAS ENPP1저 세포로부터의 전세포 용해물에서의 32P-cGAMP의 ENPP1 가수분해 활성 (우측). 용해물 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. d, 배지로부터 정제된 재조합 마우스 ENPP1의 쿠마시 겔; 용리 분획을 사용 전에 풀링하였다 (좌측). TLC에 의해 분석된 마우스 ENPP1에 의한 32P-cGAMP 분해 (우측).
도 9, 패널 a: CD14+ PBMC는 세포외 cGAMP에 반응한다. a, 세포외 cGAMP에 의한 CD14+ PBMC의 자극의 개략도. b, 증가하는 농도의 세포외 cGAMP로 16시간 동안 자극된 인간 CD14+ PMBC에 대한 RT-qPCR에 의해 측정된 IFNB1 유도. 평균 ± SEM (n = 2의 기술적 qPCR 복제물).
ENPP1은 세포외 cGAMP만을 조절한다
본 발명자들이 293T 세포로부터 ENPP1을 녹아웃시키고 이를 ENPP1-무함유 배지에서 배양하였을 때, 본 발명자들이 처음으로 세포외 cGAMP를 관찰할 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 이어서 세포외 cGAMP만이 ENPP1에 의해 조절되는지 여부를 조사하였다. 그의 세포외 주석에도 불구하고, 효소 CD38과 같이, ENPP1은 막 상에서 배향을 뒤집는 것이 가능하거나 (예를 들어, 문헌 [Zhao, Y. J., Lam, C. M. C. & Lee, H. C. The membrane-bound enzyme CD38 exists in two opposing orientations. Sci. Signal. 5, ra67 (2012)] 참조), 또는 이는 ER 내강에서 합성될 때 활성일 수 있고, cGAMP는 ER 막을 가로지를 수 있다 (도 2, 패널 a). ENPP1 활성의 국재화를 조사하기 위해, 본 발명자들은 293T cGAS ENPP1-/- 세포를 인간 ENPP1 발현 플라스미드로 형질감염시키고, 전세포 용해물에서 그의 활성을 확인하였다 (도 2, 패널 b). 무손상 세포에서, ENPP1 발현은 세포외 cGAMP를 고갈시키지만, 세포내 cGAMP 농도에는 영향을 미치지 않는다 (도 2, 패널 c). 따라서, 세포외 cGAMP는 이들 세포에서 ENPP1에 의해 조절되지만 세포내 cGAMP는 그렇지 않다.
도 2, 패널 a 내지 c: ENPP1은 세포외 cGAMP만을 조절한다. a, ENPP1 활성의 3개의 가능한 세포 위치. b, 293T cGAS ENPP1-/- 세포를 공 벡터 또는 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 24시간 후에 웨스턴 블롯을 사용하여 ENPP1 단백질 발현에 대해 분석하고 (상부), 박층 크로마토그래피 (TLC)를 사용하여 ENPP1 32P-cGAMP 가수분해 활성에 대해 분석하였다 (하부). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. c, LC-MS/MS를 사용하여 측정된 세포내 및 세포외 cGAMP 농도. BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.002 (스튜던트 t 검정). 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
세포 불투과성 ENPP1 억제제의 개발
세포외 cGAMP의 생리학적 관련성 및 특이적 히드롤라제에 의해 조절될 필요가 있는 이유를 연구하기 위해, 본 발명자들은 ENPP1을 약리학적으로 억제함으로써 그의 농도를 조작하고자 하였다. 본 발명자들은 먼저 비특이적 ENPP1 억제제 QS1을 시험하였다 (도 10, 패널 a) (Patel, S. D. et al., Quinazolin-4-piperidin-4-methyl sulfamide PC-1 inhibitors: Alleviating hERG interactions through structure based design. Bioorganic Med. Chem. Lett. 19, 3339-3343 (2009); 및 Shayhidin, E. E. et al., Quinazoline-4-piperidine sulfamides are specific inhibitors of human NPP1 and prevent pathological mineralization of valve interstitial cells. Br. J. Pharmacol. 172, 4189-4199 (2015)). QS1은 ENPP1을 과다발현하는 세포에서 세포외 cGAMP 분해를 억제할 수 있지만, 이는 또한 ENPP1 녹아웃 세포에서 cGAMP 유출을 부분적으로 차단하였다 (도 10, 패널 b). QS1 처리된 세포는 상승된 세포내 cGAMP를 가지며, 이는 다시 유출이 암 세포에서 cGAMP 항상성을 유지하는 유의한 메카니즘임을 입증한다. 유출 차단 활성은 본 발명자들의 유출 연구에서 세포외 cGAMP를 연구하기 위한 도구로서 QS1을 배제한다. 포스포네이트 유사체인 화합물 1은 ENPP1 촉매 부위에서 Zn2+를 킬레이트화하고, 세포 투과성을 최소화하고, 세포내 오프-타겟을 회피하도록 설계되었다 (도 3, 패널 a). 화합물 1은 110 ± 10 nM의 Ki,app를 가지며 (도 3, 패널 b), 이는 QS1보다 ~60배 더 강력하다 (도 10, 패널 a).
본 발명자들은 3가지 독립적인 투과성 검정: 병행 인공 막 투과성 검정 (PAMPA) (도 11, 패널 a); 장 세포 Caco-2 투과성 검정 (도 11, 패널 b); 및 상피 세포 MDCK 투과성 검정 (도 11, 패널 c)을 수행함으로써 화합물 1이 세포 불투과성임을 확인하였다. 높은 세포 투과성 및 낮은 세포 투과성을 갖는 대조군 화합물과 비교하여, 화합물 1은 모든 3가지 검정에서 불투과성 화합물의 카테고리에 속한다. 또한, 이는 밀접하게 관련된 엑토뉴클레오티다제 알칼리성 포스파타제 (Ki,app > 100 μM) 및 ENPP2 (Ki,app = 5.5 μM)에 대해 낮은 활성을 갖는다 (도 11, 패널 d). 본 발명자들은 화합물 1이 그의 낮은 세포 투과성으로 인해 세포내 오프-타겟을 가질 것으로 예상하지 않지만, 본 발명자들은 그의 특이성을 추가로 결정하기 위해 468종의 키나제의 패널에 대한 그의 결합을 시험하였다. AMP와의 그의 구조적 유사성에도 불구하고, 화합물 1은 1 μM에서 단지 2종의 키나제에 결합한다 (도 11, 패널 e). 화합물 1은 또한 인간 및 마우스 간 마이크로솜 둘 다에서 높은 안정성 (t1/2 > 159분)을 나타낸다. 종합하면, 본 발명자들은 화합물 1이 강력하고, 세포 불투과성이며, 특이적이고, 안정한 ENPP1 억제제임을 입증하였다.
다음으로, 본 발명자들은 ENPP1 과다발현 293T cGAS 세포의 세포외 cGAMP 농도를 유지시키는데 있어서 화합물 1의 효능을 측정하였고, 340 ± 160 nM의 IC50 값을 수득하였으며 (도 3, 패널 c), 10 μM은 세포외 cGAMP 분해를 완전히 차단하기에 충분하였다 (도 3, 패널 d). QS1과 달리, 화합물 1은 세포내 cGAMP에 대해서는 어떠한 효과도 갖지 않았고, 이는 이것이 cGAMP 유출에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다 (도 3, 패널 d). 따라서, 화합물 1은 세포외 cGAMP 농도를 특이적으로 증가시키는 탁월한 ENPP1 억제제 도구 화합물이다.
마지막으로, 본 발명자들은 CD14+ PBMC에 대해 검출가능한 세포외 cGAMP 신호를 부스팅하는데 있어서 화합물 1의 효능을 시험하였다. 본 발명자들은 먼저 화합물 1이 사용된 농도에서 PBMC에 대해 독성이 아님을 확인하였다 (도 11, 패널 f). ENPP1 과다발현 293T cGAS 세포로부터의 조건화 배지는 CD14+ 세포에서 IFNB1 발현을 유도하는데 실패하였다 (도 3, 패널 e 및 f). 그러나, 화합물 1은 배지에서 세포외 cGAMP 수준을 구제하였고, CD14+ 세포에서 IFNB1 발현을 유도하였다 (도 3, 패널 f). 이들 결과는 막횡단 단백질로서의 잠재적 스캐폴딩 효과가 아닌 ENPP1의 효소적 활성이 CD14+ PBMC에 의한 세포외 cGAMP에 대한 반응을 약화시킨다는 것을 입증한다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 세포외 cGAMP 수준이 ENPP1 발현에 의해 감소될 수 있고 ENPP1 억제에 의해 증가될 수 있으며, 이는 시험관내 CD14+ PBMC의 활성화에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
도 3, 패널 a 내지 f: 세포 불투과성 ENPP1 억제제의 활성. a, 화합물 1의 화학 구조. b, pH 7.5에서 기질로서 32P-cGAMP의 존재 하에 정제된 마우스 ENPP1에 대한 화합물 1의 억제 활성 (Ki,app = 110 ± 10 nM). 평균 ± SEM (n = 3 독립적인 실험), 일부 오차 막대는 너무 작아서 시각화할 수 없다. c, 293T cGAS ENPP1-/- 세포에서 일시적으로 발현된 인간 ENPP1에 대한 화합물 1의 억제 활성 (IC50 = 340 ± 160 nM). 평균 ± SEM (n = 2). d, 10 μM 화합물 1의 존재 또는 부재 하에 공 pcDNA 벡터 또는 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염된 293T cGAS ENPP1-/- 세포에 대한 세포내 및 세포외 cGAMP 농도. BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 3). ****P < 0.0001 (일원 ANOVA). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. e, 조건화 배지 실험의 개략도. 293T cGAS ENPP1저 세포를 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염시키고, 화합물 1의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 이들 세포로부터의 조건화 배지를 1차 CD14+ 인간 PBMC로 옮겼다. f, IFNB1 mRNA 수준을 CD14에 대해 정규화하고, 비처리 CD14+ 세포 대비 배수 유도를 계산하였다. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.007 (일원 ANOVA). cGAMP 농도를 조건화 배지에서 측정하였다. 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.006 (일원 ANOVA). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 10, 패널 a 내지 b: QS1 대비 화합물 1의 개선.
a, QS1의 구조 및 pH 7.5에서 기질로서 32P-cGAMP의 존재 하에 정제된 마우스 ENPP1에 대한 그의 억제 활성 (화합물 1과 비교) (QS1 Ki,app = 6.4 ± 3.2 μM). 평균 ± SEM (n = 2 독립적인 실험). b, QS1의 존재 또는 부재 하에 공 벡터 또는 인간 ENPP1을 함유하는 벡터로 형질감염된 293T cGAS ENPP1-/- 세포에 대한 세포내, 세포외, 및 총 cGAMP. 평균 ± SEM (n = 2). *P < 0.05. **P < 0.01 (일원 ANOVA).
도 11, 패널 a 내지 f: 화합물 1은 세포 불투과성이고, ENPP1에 특이적이고, 비독성이다. a, 인공 막 투과성 검정 (PAMPA)에서의 화합물 1의 투과성.
b, 장 세포 Caco-2 검정에서의 화합물 1의 투과성. PA = 피크 면적, IS = 내부 표준물. 화합물 1, 아테놀롤 (낮은 수동 투과성 음성 대조군) 및 프로프라놀롤 (높은 수동 투과성 양성 대조군)을 포함한 화합물을 Caco-2 단층의 정단측 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 기저측 상의 화합물 농도를 LC-MS/MS에 의해 모니터링하였다. 겉보기 투과율 (Papp)을 기울기로부터 계산하였다. 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. c, 상피 세포 MDCK 투과성 검정에서의 화합물 1의 투과성. d, 알칼리성 포스파타제 (ALPL) 및 ENPP2에 대한 화합물 1의 억제 활성. 평균 ± SEM (n = 2). e, 대조군의 퍼센트로서 키나제 억제를 도시한, 화합물 1에 대한 키놈 상호작용 맵 (468종의 키나제가 시험됨). 트리스팟(TREEspot)™ 소프트웨어 도구를 사용하여 영상을 생성하고, 디스커버엑스 코포레이션(DiscoveRx Corporation)의 부서인 키놈스캔(KINOMEscan)®으로부터의 허가 하에 재인쇄하였다. ⓒ디스커버엑스 코포레이션 2010. f, 셀타이터글로에 의해 측정된 세포 생존율. 총 PBMC 및 CD14+ PBMC를 화합물 1과 함께 16시간 동안 인큐베이션한 다음, 셀타이터글로를 사용하여 ATP 수준에 대해 검정하였다. 데이터를 화합물 1 없음에 대해 정규화하여 % 세포 생존율을 계산하였다.
암 세포는 cGAS를 발현하고, 배양물에서 cGAMP를 연속적으로 유출한다
세포외 cGAMP가 생체내에서 암 세포에 의해 분비되는 위험 신호로서 기능할 수 있는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 cGAMP를 유출하는 종양 모델을 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 1종의 인간 (MDA-MB-231) 및 3종의 마우스 암 세포주 (E0771, MC38, 및 4T1-Luc, 이는 생체내 영상화를 위한 루시페라제를 발현하는 4T1 세포주임)를 배양물 중에서 시험하였으며, 이들은 모두 cGAS를 발현한다 (도 4, 패널 a). 이들 세포에서 세포내 cGAMP 농도는 검출하기 어렵다. 그러나, 가외의 농축 및 정제 단계로, 본 발명자들은 4T1-Luc 세포에서 5.8 x 10-10 nmol/세포 (~150 nM) 세포내 cGAMP를 검출할 수 있었다 (도 4, 패널 b). shRNA를 사용하여 cGAS를 녹다운시키는 것은 감소된 cGAS 단백질 수준 및 감소된 세포내 cGAMP 수준으로 이어지며, 이는 cGAS 발현이 4T1-Luc 세포에 존재하는 cGAMP의 양을 제어한다는 것을 입증한다 (도 12, 패널 a 및 b). 세포 배양 배지에서 세포 표면 및 가용성 ENPP1을 억제하는 화합물 1을 사용하여, 본 발명자들은 모든 이들 세포주에서 연속 cGAMP 유출을 검출하였고, 세포외 cGAMP 수준은 48시간 내에 ~6 x 10-9 nmol/세포 (배지 내로 희석되는 경우 ~10 nM)에 도달하였다 (도 4, 패널 c 및 d 및 도 12, 패널 c 및 d). 주목할만한 것으로, 이는 세포 내부에 존재하는 cGAMP의 양의 약 10-배이며, 이는 암 세포가 유출에 의해 그의 cGAMP를 효율적으로 소거한다는 것을 시사한다. 이온화 방사선 (IR)은 종양 세포에서 시토졸 DNA를 증가시키고 cGAS-의존성 IFN-β 생산을 활성화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bakhoum, S. F. et al., Numerical chromosomal instability mediates susceptibility to radiation treatment. Nat. Commun. 6, 1-10 (2015); 및 Vanpouille-Box, C. et al., DNA exonuclease Trex1 regulates radiotherapy-induced tumour immunogenicity. Nat. Commun. 8, 15618 (2017)] 참조). 실제로, IR 처리는 또한 2일 후에 4T1-Luc 세포에서 세포외 cGAMP 생산을 증가시켰다 (도 4, 패널 e 및 도 12, 패널 e). 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 이들 암 세포주가 cGAMP를 끊임없이 생산하고 효율적으로 유출하며, IR에 의해 자극되어 보다 많은 세포외 cGAMP를 생산할 수 있다는 것을 입증한다.
도 4, 패널 a 내지 e: 암 세포는 cGAS를 발현하고, 배양물에서 cGAMP를 연속적으로 유출한다. a, 웨스턴 블롯에 의해 분석된 4T1-Luc, E0771, MDA-MB-231, 및 MC38의 cGAS 발현. b, 외인성 자극의 부재 하의 4T1-Luc 세포에서의 세포내 cGAMP 농도의 추정치. 평균 ± SEM (n = 2). c, 48시간에 걸쳐 MC38 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP. 시간 0에, 세포를 50 μM 화합물 1이 보충된 배지로 리프레싱하였다. 평균 ± SEM (n = 2). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 대표한다. d, 50 μM 화합물 1의 존재 하에 48시간 후에 측정된 4T1-Luc, E0771, 및 MDA-MB-231 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP. BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 2). e, 48시간에 걸쳐 4T1-Luc 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP. 시간 0에, 세포를 비처리로 두거나 또는 20 Gy IR로 처리하고, 50 μM 화합물 1이 보충된 배지로 리프레싱하였다. 평균 ± SEM (n = 2). *P = 0.04 (스튜던트 t 검정).
도 12, 패널 a 내지 e: 암 세포는 배양물에서 cGAMP를 연속적으로 유출한다. a, 웨스턴 블롯에 의해 분석된 4T1-Luc WT 및 4T1-Luc shcGAS 세포주의 cGAS 발현. b, 외인성 자극의 부재 하의 4T1-Luc WT 및 4T1-Luc shcGAS 세포주의 세포내 cGAMP. 평균 ± SEM (n = 2). 비교를 위해 도 4, 패널 b로부터 4T1-Luc WT 데이터를 반복하였다. c, 도 4, 패널 c에 제시된 실험의 세포외 cGAMP (배지 농도 단위로 도시됨). d, 도 4, 패널 d에 제시된 실험의 세포외 cGAMP (배지 농도 단위로 도시됨). BQL = 정량화 한계 미만. 평균 ± SEM (n = 2). e, 도 4, 패널 c에 제시된 실험의 세포외 cGAMP (배지 농도 단위로 도시됨). 평균 ± SEM (n = 2). **P = 0.004 (스튜던트 t 검정).
세포외 cGAMP의 격리는 종양 cGAS 및 숙주 STING에 의존성인 종양-연관 수지상 세포를 감소시킨다
종양에서, 세포외 공간은 세포내 공간의 부피의 0.3-0.8-배인 것으로 추정된다28. 그러나, 세포 배양물에서, 세포외 공간의 부피는 세포내 공간의 부피의 대략 250-1000-배이다. 본 발명자들은 1 x 106개 세포당 1 mL의 배양 배지를 사용하고, ~1-4 pL의 세포 부피를 추정하여 이러한 계산을 수행하였다. 따라서, 본 발명자들의 세포 배양 시스템은 종양 미세환경과 비교하여 세포외 공간을 300-3000-배 희석한다. 이러한 희석 배율 및 시험관내에서 암 세포에 의해 유출된 나노몰 세포외 cGAMP의 본 발명자들의 측정을 고려하여, 본 발명자들은 종양 미세환경에서의 세포외 cGAMP가 마이크로몰 범위에 도달할 수 있고, 이는 종양 세포의 선천성 면역 인식으로 이어질 수 있다고 예측한다. 본 발명자들의 시험관내 세포 실험의 한계를 인식하여, 본 발명자들은 세포외 cGAMP의 역할을 조사하기 위해 생체내 실험으로 전환하였다 (도 5, 패널 a). 먼저, 본 발명자들은 종양 세포에서 cGAS를 녹아웃시킴으로써 종양 대 숙주 cGAMP의 중요성을 결정하고자 하였고 (도 13, 패널 a), C57BL/6 배경의 cGAS-/- 및 STING-/- 마우스를 이용하였다. 본 발명자들은 또한 세포외 cGAMP를 특이적으로 격리시키는 도구로서 중화제를 개발하였다 (도 5, 패널 a). 본 발명자들은 73 ± 14 nM의 Kd로 cGAMP에 결합하는 (도 5, 패널 c) STING의 가용성 시토졸 도메인을 이용하였다 (도 5, 패널 b). 본 발명자들은 또한 비-결합 STING 대조군으로서 R237A 돌연변이체 STING (예를 들어, 문헌 [Gao, P. et al., Cell 154, 748-762 (2013)] 참조)를 생성하였다 (도 5, 패널 b-d). 세포 배양물에서 이들 단백질의 중화 효능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 CD14+ PBMC를 사용하였다. 야생형 (WT) STING (중화 STING)는 예측된 2:1 화학량론으로 세포외 cGAMP를 중화시킬 수 있었던 반면, 비-결합 STING는 심지어 200-배 더 높은 농도에서도 효과가 없었다 (도 5, 패널 e).
본 발명자들은 마우스에서 E0771 동소 종양을 확립한 후, 세포외 cGAMP를 고갈시키기 위해 중화 STING를 종양내 주사하고, 종양-연관 백혈구를 염색하기 위해 종양을 절제하였다. WT E0771 종양에서, 중화 STING는 총 CD45+/MHC-II+ 종양-연관 항원 제시 세포 (APC) 집단에서 CD11c+ 수지상 세포 집단을 유의하게 감소시켰고, 이는 세포외 cGAMP가 면역계에 의해 검출될 수 있다는 것을 시사한다 (도 5, 패널 f 및 g 및 도 13, 패널 b). 세포외 cGAMP 고갈은 또한 종양이 cGAS-/- 마우스에서 성장할 때 CD11c+ 집단을 감소시켰고, 이는 숙주 세포가 세포외 cGAMP 생산에 유의하게 기여하지 않는다는 것을 시사한다 (도 5, 패널 g 및 도 13, 패널 b). 대조적으로, 세포외 cGAMP 고갈은 cGAS-/- E0771 세포 (완전한 녹아웃을 달성하되 클론 효과는 최소화하기 위해 다중 클론을 풀링함) 또는 STING-/- 마우스를 사용한 경우에 CD11c+ 집단에 영향을 미치지 않았다. 이는 숙주 세포가 아닌 종양 세포가 세포외 cGAMP의 우세한 생산자이며, 이는 이어서 숙주 STING에 의해 감지된다는 것을 입증한다 (도 5, 패널 g 및 도 13, 패널 b). 본 발명자들은 또한 BALB/c 배경에서 동소 4T1-Luc 종양 모델을 시험하였다. cGAS 및 STING 녹아웃 계통은 이 배경에서 확립되지 않았지만, 본 발명자들은 4T1-Luc 종양에서 cGAS를 녹아웃시켰다. WT 4T1-Luc 종양 내로의 중화 STING의 종양내 주사는 CD45+/MHC II+ 집단에서 종양-연관 CD11c+ 집단을 유의하게 감소시켰다 (도 5, 패널 h 및 도 13, 패널 c). 대조적으로, 세포외 cGAMP 고갈은 cGAS-/- 4T1-Luc 종양에서 효과가 없었다 (도 5, 패널 h 및 도 13, 패널 c). 본 발명자들은 또한 mENPP1 단백질의 종양내 주사에 의해 세포외 cGAMP를 고갈시켰고 (도 8, 패널 d), CD45+/MHC II+ 집단에서 감소된 CD11c+ 세포를 다시 관찰하였다 (도 5, 패널 i 및 도 13, 패널 d). 본 발명자들의 E0771 및 4T1-Luc 모델로부터의 결과는, 종합하면, 종양 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP는 숙주 STING에 의존적이지만 숙주 cGAS에는 독립적인 방식으로 선천성 면역 반응을 활성화시킨다는 것을 입증한다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 암 세포에 의해 생산된 세포외 cGAMP가 선천성 면역 반응을 도출하는 위험 신호임을 입증한다.
도 5, 패널 a 내지 i: 세포외 cGAMP의 격리는 종양-연관 수지상 세포를 종양 cGAS 및 숙주 STING 의존성 방식으로 감소시킨다. a, 생체내에서 세포외 cGAMP의 역할을 평가하기 위한 실험 설정. b, 재조합 마우스 WT STING 및 R237A STING의 쿠마시 겔. c, 프로브로서 방사성표지된 35S-cGAMP를 사용한 막 결합 검정에 의해 결정된 마우스 WT STING (중화) 및 R237A STING (비-결합)의 시토졸 도메인에 대한 결합 곡선. 평균 ± SEM (n = 2, 2회의 독립적인 실험으로부터). d, 분홍색으로 강조된 R237을 갖는 cGAMP와의 복합체로의 마우스 WT STING의 결정 구조 (PDB ID 4LOJ). e, 중화 또는 비-결합 STING (2 μM 내지 100 μM, 2.5-배 희석)의 존재 하에 2 μM cGAMP로 처리된 CD14+ PBMC에서의 IFNB1 mRNA 배수 유도. 평균 ± SEM (n = 2의 기술적 qPCR 복제물). f, WT 또는 cGAS-/- E0771 세포 (1x106개)를 WT, cGAS-/-, 또는 STING-/- C57BL/6J 마우스 내로 제0일에 동소 주사하였다. 중화 (WT 마우스 n = 5; cGAS-/- 마우스 n = 5; STING-/- 마우스 n = 4) 또는 비-결합 STING (WT 마우스 n = 5; cGAS-/- 마우스 n = 4; STING-/- 마우스 n = 5)를 제2일에 종양내로 주사하였다. 제3일에 종양을 수거하고, FACS에 의해 분석하였다. 샘플을 FSC-A/SSC-A, 싱글렛 (FSC-W), 살아있는 세포, CD45+, MHC II+, CD11c+ 집단의 세포에 대해 게이팅하였다. g, 총 APC의 퍼센트 CD11c+ 세포. 평균 ± SD. *P = 0.015. **P = 0.008 (웰치 t 검정). h, WT BALB/cJ 마우스에서 WT (중화 STING n = 3; 비-결합 STING n = 2) 또는 cGAS-/- 4T1-Luc 세포 (n = 5)를 사용하여 (f) 및 (g)에서와 동일한 절차를 수행하였다. 평균 ± SD. *P = 0.011. (웰치 t 검정). i, 4T1-Luc 세포 (1x106개)를 WT BALB/cJ 마우스 내로 제0일에 동소 주사하였다. PBS (n = 5) 또는 재조합 마우스 ENPP1 (mENPP1) (n = 6)을 제2일에 종양내로 주사하였다. 제3일에 종양을 수거하고, FACS에 의해 분석하였다. 평균 ± SD. *P = 0.033. (웰치 t 검정).
도 13, 패널 a 내지 d: 세포외 cGAMP의 격리는 종양-연관 수지상 세포를 종양 cGAS 및 숙주 STING 의존성 방식으로 감소시킨다. a, CRISPR 녹아웃 풀로부터 서브클로닝된 E0771 (좌측) 및 4T1-Luc (우측) cGAS-/- 세포. E0771 cGAS-/- 서브클론 1, 2, 4, 6, 8, 및 9를 풀링한 후, 마우스에 주사하였다. 4T1-Luc cGAS-/- 서브클론 4, 7, 및 8을 풀링한 후, 마우스에 주사하였다. b, 도 5g에 제시된 실험의 기하 평균. 평균 ± SD. *P = 0.049 (WT 종양/WT 숙주). *P = 0.015 (WT 종양/cGAS-/- 숙주). (웰치 t 검정). c, 도 5h에 제시된 실험의 기하 평균. 평균 ± SD. **P = 0.009 (웰치 t 검정). d, 도 5i에 제시된 실험의 기하 평균. 평균 ± SD. *P < 0.015 (웰치 t 검정).
ENPP1 활성을 감소시키는 것에 의해 세포외 cGAMP를 증가시키는 것은 수지상 세포 침윤을 증가시키고, 유방 종양을 더욱 치료가능하게 만든다.
ENPP1은 일부 유방암에서 고도로 발현되고, 그의 수준은 불량한 예후와 상관된다 (예를 들어, 문헌 [Lau, W. M. et al., Enpp1: A Potential Facilitator of Breast Cancer Bone Metastasis. PLoS One 8, 1-5 (2013); Takahashi, R. U. et al., Loss of microRNA-27b contributes to breast cancer stem cell generation by activating ENPP1. Nat. Commun. 6, 1-15 (2015); 및 Umar, A. et al., Identification of a Putative Protein Profile Associated with Tamoxifen Therapy Resistance in Breast Cancer. Mol. Cell. Proteomics 8, 1278-1294 (2009)] 참조). 높은 ENPP1 발현은 세포외 cGAMP를 고갈시키고 면역 검출을 약화시키기 위해 유방암이 사용하는 메카니즘일 수 있다. 본 발명자들은 3종의 삼중 음성 유방암 세포 4T1-Luc, E0771, 및 MDA-MB-231에서 ENPP1 활성을 측정하였고, MDA-MB-231 및 4T1-Luc는 높은 ENPP1 활성을 나타내었다 (도 14, 패널 a). 따라서, 본 발명자들은 종양 면역 검출, 성장, 및 치료에의 반응에 대한 ENPP1의 효과를 프로빙하기 위해 삼중 음성, 전이성, 및 동소 4T1-Luc 마우스 모델을 선택하였다.
본 발명자들은 먼저 종양 침윤 수지상 세포에 대한 ENPP1의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 4T1-Luc 세포에서 ENPP1을 녹아웃시키고, 효소 활성의 결여에 의해 클론을 확인하고 (상업적으로 입수가능한 ENPP1 항체는 녹아웃을 확인하기에 충분히 감수성이지 않음), 클론 효과를 최소화하기 위해 다중 클론을 풀링하였다 (도 14, 패널 b). 4T1-Luc 이식 후, 본 발명자들은 종양을 20 Gy IR 선량으로 처리하여 cGAMP 생산을 유도하고, 24시간 후에 종양을 절제하여 그의 종양-연관 백혈구 조성을 분석하였다. ENPP1-/- 종양은 WT 종양보다 더 큰 종양-연관 CD11c+ 집단을 갖는다 (도 6, 패널 a 및 도 14, 패널 c). 이어서, 본 발명자들은 4T1-Luc 종양의 면역 거부에 대한 ENPP1의 효과를 시험하였다. 이는 전형적으로 종양 이식 2주 내에 폐로 전이되는 공격성 종양 모델이다 (Pulaski, B. A. & Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of Established Spontaneous Mammary Carcinoma Metastases following Immunotherapy with Major Histocompatibility Complex Class II and B7.1 Cell-based Tumor Vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998)). ENPP1-/- 종양이 100 mm3에 도달하기 전에 그의 초기 종양 성장 속도는 WT 종양과 동일하였고, 이는 본 발명자들이 느리게 성장하는 클론은 선택하지 않았음을 시사한다 (도 14, 패널 d). 그러나, 확립된 ENPP1-/- 종양은 덜 공격적이고 (도 6, 패널 b), IR에 대해 보다 반응성이다 (도 6, 패널 b). IR의 부재 하에, 적응성 면역 체크포인트 차단제 항-CTLA-4는 종양을 수축시키는데 있어서 ENPP1-/-와 상승작용하지 않는다 (도 14, 패널 e 및 f). 놀랍게도, 본 발명자들이 cGAMP 생산을 유도하기 위해 IR을 사용한 경우, 항-CTLA-4는 ENPP1-/- 종양의 40%를 치유하였지만, WT 종양은 전혀 치유하지 않았다 (도 6, 패널 c). 세포외 cGAMP의 직접 종양내 주사는 WT 종양에서보다 ENPP1-/- 종양에서 더 효과적이고, IR과 상승작용하여 항-CTLA-4의 부재 하에 마우스의 30%를 치유한다 (도 6, 패널 d). 종합하면, ENPP1은 세포외 cGAMP, 4T1-Luc 종양의 선천성 면역 검출을 약화시키고, IR 및 적응성 면역 체크포인트 차단에 대한 그의 반응에 부정적인 영향을 미친다.
도 6, 패널 a 내지 d: ENPP1-/- 종양은 선천성 면역 침윤을 동원하고, 덜 공격적이고, IR 및 항-CTLA-4 요법에 보다 감수성이다. a, WT 또는 ENPP1-/- 4T1-Luc 세포 (1x106개)를 WT BALB/cJ 마우스 내로 제0일에 동소 주사하였다 (각각의 군의 경우 n = 5). 종양을 제2일에 20 Gy의 IR로 처리하였다. 제3일에 종양을 수거하고, FACS에 의해 분석하였다. 다중 ENPP1-/- 4T1-Luc 세포 클론을 주사 전에 풀링하여 클론 효과를 최소화하였다. **P = 0.008 (웰치 t 검정). b, 확립된 WT 또는 ENPP1-/- 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 0 Gy 또는 20 Gy IR로 1회 처리한 후, IR 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 IgG를 3회 복강내 주사하였다. (WT 4T1-Luc의 경우 n = 9, ENPP1-/- 4T1-Luc의 경우 n = 10). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제20일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다. ****P < 0.0001. c, 확립된 WT 또는 ENPP1-/- 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 0 Gy 또는 20 Gy IR로 1회 처리한 후, IR 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 항-CTLA-4를 3회 복강내 주사하였다 (모든 군의 경우 n = 10). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제20일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다. ****P < 0.0001. ENPP1-/- 4T1-Luc + IR (20) + 항-CTLA-4 처리군에서, 4/10마리 (40%)의 마우스는 생물발광 영상화에 의해 확인된 무종양 생존자이다. d, 스크램블드 sgRNA 서열로 감염된 확립된 4T1-Luc 종양 또는 ENPP1-/- 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 20 Gy IR로 1회 처리한 후, IR 후 제2일, 제4일, 및 제7일에 10 μg cGAMP를 3회 종양내 주사하였다 (둘 다의 군의 경우 n = 10). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제20일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다. *P < 0.05, ****P < 0.0001. ENPP1-/- 4T1-Luc + IR (20) cGAMP 처리군에서, 3/10마리 (30%)의 마우스는 생물발광 영상화에 의해 확인된 무종양 생존자이다. b-d의 상이한 처리군으로부터의 마우스를 공동-수용하였고, 실험자는 맹검상태였다.
도 14, 패널 a 내지 f: 확립된 ENPP1-/- 종양은 종양-연관 수지상 세포 증가를 유도하고, 덜 공격적이고, IR 및 항-CTLA-4 요법에 보다 감수성이다. a, 32P-cGAMP 분해 검정을 사용한 4T1-Luc, E0771, 및 MDA-MB231 세포에서의 ENPP1 활성. 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. b, 32P-cGAMP 분해 검정을 사용한 ENPP1-/- 4T1-Luc 클론의 확인. 상이한 클론으로부터의 용해물을 단백질 농도에 의해 정규화하였다. ENPP1-/- 4T1-Luc 클론 2-6 및 13-18을 풀링한 후, 마우스 내로 주사하였다. c, 도 6a에 제시된 실험의 기하 평균. 평균 ± SD. *P = 0.012 (웰치 t 검정). d, (좌측) 처리일에 WT (n = 55) vs ENPP1-/- (n = 55) 4T1-Luc 세포의 종양 부피; (우측) 100 mm3 ± 20 mm3의 크기에 도달하는데 필요한 종양 부피/일로서 표현된 초기 종양 성장 속도. 평균 ± SD (웰치 t 검정). e, 종양-보유 마우스의 생물발광 영상. f, IgG 및 항-CTLA-4 처리군 사이의 비교를 강조하기 위한 도 6a, b에 제시된 데이터의 재플롯팅. 확립된 WT 또는 ENPP1-/- 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 종양이 필요한 크기에 도달한 후 제2일, 제5일, 및 제7일에 IgG 또는 항-CTLA-4의 3회 복강내 주사로 처리하였다. (WT 4T1-Luc + IgG의 경우 n = 9, 다른 모든 군의 경우 n = 10). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제20일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다.
본 발명자들의 유전자적 결과는 ENPP1이 약리학적 억제에 대한 잠재적 표적임을 시사한다. 본 발명자들이 개발한 ENPP1 억제제인 화합물 1은 종양내로 주사되는 경우에 빠른 클리어런스를 나타낸다. 제약 회사가 전형적으로 약물 개발의 후기 단계에서 수행하는 투여 경로 및 상응하는 제제 최적화의 광범위한 연구 없이, 본 발명자들은 화합물 1이 생체내에서 효과를 갖는지 여부를 질문하였다. 본 발명자들은 IR 처리 직후에 종양에 화합물 1을 주사하였고, 24시간 후에 종양-연관 CD11c+ 집단의 증가를 관찰하였다 (도 7, 패널 a 및 도 15). 놀랍게도, 화합물 1은 IR 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 10% 치유율을 달성하였다 (도 7, 패널 b). 마지막으로, 화합물 1은 IR 및 cGAMP와 상승작용하여 종양을 수축시키고, 생존을 연장시키고, 10% 치유율을 달성하는 것으로 관찰되었다 (도 7, 패널 c). 종합하면, 이들 결과는 ENPP1이 암의 선천성 면역 인식을 증진시키기 위해 약리학적으로 표적화될 수 있음을 입증한다.
도 7, 패널 a 내지 c: ENPP1 억제는 IR 처리 및 항-CTLA-4와 상승작용하여 항종양 효과를 발휘한다. a, 4T1-Luc 세포 (1x106개)를 WT BALB/cJ 마우스에 제0일에 동소 주사하였다. 제2일에 종양을 20 Gy IR로 처리하고, PBS (n = 4) 또는 화합물 1 (n = 5)로 종양내로 주사하였다. 제3일에 종양을 수거하고, FACS에 의해 분석하였다. *P = 0.047 (웰치 t 검정). b, 확립된 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 20 Gy IR로 1회 처리한 후, 제2일, 제4일, 및 제7일에 PBS 또는 화합물 1을 3회 종양내 주사하고, 제2일, 제5일, 및 제7일에 항-CTLA-4를 복강내 주사하였다 (모든 처리군의 경우 n = 17-19). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제40일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다. c, 확립된 4T1-Luc 종양 (100 ± 20 mm3)을 20 Gy IR로 1회 처리한 후, IR 후 제2일, 제4일, 및 제7일에 cGAMP 단독 또는 cGAMP + 화합물 1을 3회 종양내 주사하였다 (처리군당 n = 9). 종양 부피 및 카플란 마이어 곡선을 제시한다. 제40일에 터키 조정 (종양 부피) 및 로그-순위 만텔-콕스 검정 (카플란 마이어)에 의한 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교에 의해 P 값을 결정하였다.
도 15는 ENPP1 억제가 IR 처리와 상승작용하여 종양-연관 수지상 세포를 증가시킨다는 것을 보여준다. 실험의 기하 평균은 도 7, 패널 a에 제시된다. 평균 ± SD. *P < 0.05 (웰치 t 검정).
도 16: 합성 세포로부터 표적 세포로의 상이한 모드의 cGAMP 전달. (1) 간극 연접을 통해 확산됨; (2) 출아 바이러스 입자 내로 패키징되고, 다음 감염 라운드 동안 전달됨; 및 (3) 세포외 공간 내로 유출됨.
도 17: cGAMP는 암 위험 신호이다. APC는 상이한 cGAS-의존성 메카니즘: (1) 종양-유래 dsDNA에 의한 APC cGAS의 활성화, (2) 종양 세포에 의해 분비된 유형 I IFN의 APC 감지, 및 (3) 종양 세포에 의해 구성적으로 생산되고 유출된 cGAMP의 APC 감지를 통해 종양 세포를 감지할 수 있다.
논의
본 개시내용의 결과는 cGAMP 유출의 증거를 제공한다. 세포-세포 cGAMP 전달은 간극 연접 및 바이러스 입자를 통해 발생할 수 있다. 본 개시내용은 cGAMP가 세포외 공간을 통해 이동할 수 있다는 시험관내 및 생체내 증거를 제공한다 (예를 들어, 도 16 참조). 본 발명자들이 시험한 모든 세포주가 외부 자극의 부재 하에 cGAMP를 합성하고 유출하기 때문에, cGAMP 유출은 암 세포의 특징이다. 염색체 불안정성 및 이상 시토졸 dsDNA는 종양 고유의 특성으로 간주되고 종양 세포는 cGAS를 거의 불활성화시키지 않기 때문에 (예를 들어, 문헌 [Bakhoum, S. F. et al., Chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic DNA response. Nature 553, 467-472 (2018)] 참조), 본 발명자들은 일정한 cGAMP 생산 및 유출이 또한 종양 세포에 고유한 특성일 수 있다고 생각한다. 시토졸 cGAMP 히드롤라제는 확인된 바 없고 ENPP1은 세포내 cGAMP를 분해할 수 없기 때문에, 유출은 현재 cGAMP가 시토졸로부터 제거되는 유일한 메카니즘이고, 유비퀴틴 매개된 STING 분해에 더하여 세포내 STING 신호전달을 끄는 또 다른 방식을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Konno, H., Konno, K. & Barber, G. N. Cyclic dinucleotides trigger ULK1 (ATG1) phosphorylation of STING to prevent sustained innate immune signaling. Cell 155, 688-698 (2013)] 참조). 그러나, 이러한 클리어런스 메카니즘은 암 세포를 면역 검출에 노출시킨다.
실제로, 본 발명자들의 결과는 암 세포에 의해 유출된 cGAMP가 면역계에 의해 검출되는 위험 신호임을 입증한다. 암 세포로부터의 신생항원은 APC에 의해 제시되어, 최종적으로 암-특이적 사멸을 수행하는 세포독성 CD8+ T 세포를 교차 프라이밍한다. 그러나, APC가 어떻게 초기에 암 세포를 검출하는지에 대해서는 잘 이해되지 않고 있다. 면역원성 종양은 중요한 유형의 APC인 CD11c+ 수지상 세포에 대한 위험 신호로서 dsDNA를 방출한다 (예를 들어, 문헌 [Xu, M. M. et al., Dendritic Cells but Not Macrophages Sense Tumor Mitochondrial DNA for Cross-priming through Signal Regulatory Protein a Signaling. Immunity 47, 363-373 (2017)] 참조). 또한, 암 세포는 방사선에 의해 유도된 그 자신의 시토졸 dsDNA에 반응하고, 위험 신호로서 IFN을 생산한다 (Vanpouille-Box, C. et al., DNA exonuclease Trex1 regulates radiotherapy-induced tumour immunogenicity. Nat. Commun. 8, 15618 (2017)). 종양 cGAS의 촉매 활성은 B16 흑색종 모델에서 숙주 STING 의존성 방식으로 종양 면역과 상관되며 (예를 들어, 문헌 [Marcus, A. et al., Tumor-Derived cGAMP Triggers a STING-Mediated Interferon Response in Non-tumor Cells to Activate the NK Cell Response. Immunity 49, 754-763.e4 (2018)] 참조), 이는 cGAMP가 미지의 메카니즘으로 종양 세포로부터 숙주 세포로 전달될 수 있음을 시사한다. 본원에서, 본 발명자들은 암 세포가 위험 신호로서 가용성 세포외 cGAMP를 생산하며, 이는 종양 미세환경에서 수지상 세포의 증가된 수로 이어진다는 직접 증거를 제공한다 (도 17). cGAMP 유출은 물리적으로 연결되지 않았지만 매우 근접한 세포 사이에서의 cGAMP 소통의 중요한 모드이다. 시토카인과 달리, cGAMP는 그의 유효 농도 미만으로 분해 및/또는 희석되지 않으면서 세포외 공간에서 장거리를 이동할 수 없다. 이러한 특성은 신경전달물질과 공유되고, cGAMP를 최초로 확인된 면역전달물질로서 적격화되게 한다.
따라서, 세포외 공간으로의 cGAMP의 방출은 암이 그것을 신속하게 소거할 수 없는 경우 암의 치명적인 약점이다. 본 발명자들은 ENPP1이 시험관내에서 세포외 cGAMP 신호전달 및 마우스에서 그의 하류 항암 면역 활성화를 음성 조절한다는 것을 입증한다. 종양-유래 가용성 cGAMP는 자유롭게 확산가능하기 때문에, 하나의 세포 표면 상에서의 ENPP1의 과다발현은 인근 미세환경에서 cGAMP를 확실하게 소거할 수 있고, 그의 이웃에게 건강을 제공할 수 있다. 인간에서, 유방암에서의 ENPP1 발현 수준은 약물 내성 (예를 들어, 문헌 [Umar, A. et al., Mol. Cell. Proteomics 8, 1278-1294 (2009)] 참조), 골 전이 (예를 들어, 문헌 [Lau, W. M. et al., PLoS One 8, 1-5 (2013)] 참조), 및 불량한 예후 (Takahashi, R. U. et al., Nat. Commun. 6, 1-15 (2015))와 상관된다. ENPP1은 암 면역요법에서의 적용을 위한 선천성 면역 체크포인트로서 억제를 위해 표적화될 수 있다.
상기 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 예에 의해 일부 상세히 기재되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구범위의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 그에 대해 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백하다.
따라서, 상기의 것은 단지 본 발명의 원리를 예시한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 명백하게 기재되거나 제시되지 않았지만 본 발명의 원리를 구현하고 그의 취지 및 범주 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있을 것임이 인지될 것이다. 또한, 본원에 언급된 모든 예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 원리 및 본 발명자들에 의해 부여된 개념을 이해하여 관련 기술분야를 발전시키는 것을 돕도록 의도되며, 이러한 구체적으로 열거된 예 및 조건으로 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 측면, 및 실시양태 뿐만 아니라 그의 구체적 예를 열거하는 본원의 모든 진술은 그의 구조적 및 기능적 등가물 둘 다를 포괄하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 이러한 등가물은 현재 공지되어 있는 등가물 및 향후 개발될 등가물, 즉 구조에 상관없이 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범주는 본원에 제시되고 기재된 예시적인 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 취지는 하기에 의해 구현된다.
따라서, 본 발명의 범주는 본원에 제시되고 기재된 예시적인 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 취지는 첨부된 청구범위에 의해 구현된다. 청구범위에서, 35 U.S.C. §112(f) 또는 35 U.S.C. §112(6)는 정확한 어구 "~를 위한 수단" 또는 정확한 어구 "~를 위한 단계"가 청구범위에서 이러한 제한의 초기에 열거되는 경우에만 청구범위에서 제한에 대해 행사되는 것으로 명백하게 정의되고; 이러한 정확한 어구가 청구범위에서 제한에 사용되지 않은 경우, 35 U.S.C. §112 (f) 또는 35 U.S.C. §112(6)는 행사되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY LI, Lingyin SMITH, Mark CAROZZA, Jacqueline A BOEHNERT, Volker <120> ENPP1 INHIBITORS AND METHODS OF MODULATING IMMUNE RESPONSE <130> STAN-1591WO <140> PCT/US20/15968 <141> 2020-01-20 <150> US 62/800,283 <151> 2019-02-01 <150> US 62/814,745 <151> 2019-03-06 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 1 caccgctggt tctatgcacg tctcc 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 2 aaactcatga gcagtctgca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 aggagatctt cagtttcgga gg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 4 gccttccgtg tccccactgc 20 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 5 tgagggggcc ctcgacg 17

Claims (90)

  1. 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 전구-약물, 제약상 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00133

    여기서,
    X1은 친수성 머리기 (예를 들어, 아연 이온에 결합할 수 있는 인-함유 기)이고;
    A는 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 고리계이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 공유 결합 또는 링커이고;
    Z3은 부재하거나 또는 NR22, O 및 S로부터 선택되고;
    Z2는 CR12 또는 N이고;
    Z1은 CR11 또는 N이고;
    R1은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 치환된 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 (예를 들어, 에테닐아릴), 치환된 알케닐아릴, 알케닐헤테로아릴 (예를 들어, 에테닐헤테로아릴), 치환된 알케닐헤테로아릴, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택되고;
    R11 및 R12는 독립적으로 H, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되고;
    R22는 H, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되고;
    R2 내지 R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택되거나; 또는 여기서 R2 및 R3, R3 및 R4, 또는 R4 및 R5는 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 헤테로사이클, 치환된 헤테로사이클, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택된 융합된 고리 (예를 들어, 5- 또는 6-원 모노시클릭 고리)를 제공한다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (II)을 갖고:
    Figure pct00134

    여기서 Z31은 NR22, O 및 S로부터 선택된 것인
    화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    Z31이 NR22이고;
    R22가 H, C(1-6)알킬 및 치환된 C(1-6)알킬로부터 선택된 것인
    화합물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 화학식 (III)을 갖고:
    Figure pct00135

    여기서 각각의 R31 내지 R34는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬 및 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R31 및 R32 또는 R33 및 R34는 시클릭 연결되고, 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 치환된 헤테로시클릴 고리를 제공하고;
    n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 6 (예를 들어, 0-3)의 정수인
    화합물.
  5. 제4항에 있어서, n+m이 0 내지 3 (예를 들어, 0, 1, 2 또는 3)인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 고리계 A가 페닐, 치환된 페닐, 피리딜, 치환된 피리딜, 피리미딘, 치환된 피리미딘, 피페리딘, 치환된 피페리딘, 피페라진, 치환된 피페라진, 피리다진, 치환된 피리다진, 시클로헥실 및 치환된 시클로헥실로부터 선택된 것인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 고리계 A가 하기로부터 선택되며:
    Figure pct00136

    여기서
    Z5는 N 및 CR6으로부터 선택되고;
    각각의 R6은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
    p는 0 내지 4의 정수이고;
    q는 0 내지 2의 정수인
    화합물.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (IV)을 갖고:
    Figure pct00137

    여기서
    Z11 및 Z21은 독립적으로 N 및 C(CN)로부터 선택되고;
    각각의 R6은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸 및 할로겐으로부터 선택되고;
    p는 0 내지 4의 정수인
    화합물.
  9. 제8항에 있어서, 화학식 (V)을 갖고:
    Figure pct00138

    여기서
    R41 내지 R44는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택된 것인
    화합물.
  10. 제9항에 있어서, 화학식 (VIa)-(VIb) 중 하나를 갖는 화합물:
    Figure pct00139
    .
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 치환된 알킬헤테로아릴, 알케닐아릴 (예를 들어, 에테닐아릴), 치환된 알케닐아릴, 알케닐헤테로아릴 (예를 들어, 에테닐헤테로아릴), 치환된 알케닐헤테로아릴, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택된 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, R1이 H, 에테닐아릴, 치환된 에테닐아릴, 에테닐헤테로아릴 및 치환된 에테닐헤테로아릴로부터 선택된 것인 화합물.
  13. 제10항에 있어서, 화학식 (VIIa)-(VIIb) 중 하나를 갖는 화합물:
    Figure pct00140
    .
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 것인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된 것인 화합물.
  16. 제14항에 있어서,
    R3 및 R4가 독립적으로 알콕시이고;
    R2 및 R5가 수소인
    화합물.
  17. 제14항에 있어서,
    R3이 알콕시이고;
    R2, R4 및 R5가 수소인
    화합물.
  18. 제14항에 있어서,
    R4가 알콕시이고;
    R2, R3 및 R5가 수소인
    화합물.
  19. 제14항에 있어서,
    R2, R3 및 R4가 H이고;
    R5가 알콕시인
    화합물.
  20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, n이 0이고, m이 1인 화합물.
  21. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1이고, m이 0인 화합물.
  22. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, n 및 m이 둘 다 1인 화합물.
  23. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, n 및 m이 둘 다 0인 화합물.
  24. 제1항에 있어서, Z3이 부재하고, Z2가 CR12이고, 여기서 R12는 시아노이고, 화합물이 화학식 (X)을 갖고:
    Figure pct00141

    여기서 L11 및 L12는 독립적으로 공유 결합 또는 링커인
    화합물.
  25. 제24항에 있어서, 고리계 A가 페닐, 치환된 페닐, 피리딜, 치환된 피리딜, 피리미딘, 치환된 피리미딘, 피페리딘, 치환된 피페리딘, 피페라진, 치환된 피페라진, 피리다진, 치환된 피리다진, 시클로헥실 및 치환된 시클로헥실로부터 선택된 것인 화합물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 화학식 (XI)을 갖고:
    Figure pct00142

    여기서
    각각의 Z5는 독립적으로 N 및 CR16으로부터 선택되고;
    각각의 R16은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
    r은 0 내지 8의 정수인
    화합물.
  27. 제26항에 있어서, 화학식 (XII)을 갖는 화합물:
    Figure pct00143
    .
  28. 제27항에 있어서, Z5가 N인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, 화학식 (XIII)을 갖고:
    Figure pct00144

    여기서 s는 0 내지 6 (예를 들어, 0 내지 3)의 정수인
    화합물.
  30. 제29항에 있어서, 화학식 (XIV)을 갖는 화합물:
    Figure pct00145
    .
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 것인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된 것인 화합물.
  33. 제31항에 있어서,
    R3 및 R4가 독립적으로 알콕시이고;
    R2 및 R5가 수소인
    화합물.
  34. 제31항에 있어서,
    R3이 알콕시이고;
    R2, R4 및 R5가 수소인
    화합물.
  35. 제31항에 있어서,
    R4가 알콕시이고;
    R2, R3 및 R5가 수소인
    화합물.
  36. 제31항에 있어서,
    R2, R3 및 R4가 H이고;
    R5가 알콕시인
    화합물.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, s가 1인 화합물.
  38. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, s가 2인 화합물.
  39. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, s가 3인 화합물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 아연 이온에 결합할 수 있는 하전된 인 함유 기를 차폐하는 프로모이어티를 포함하는 것인 화합물.
  41. 제41항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 포스폰산, 포스포네이트, 포스포네이트 에스테르, 포스페이트, 포스페이트 에스테르, 티오포스페이트, 티오포스페이트 에스테르, 포스포르아미데이트 및 티오포스포르아미데이트로부터 선택된 것인 화합물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 화학식 (XV)을 갖고:
    Figure pct00146

    여기서
    Z6은 부재하거나, 또는 O 및 CH2로부터 선택되고;
    Z7 및 Z9는 각각 독립적으로 O 및 NR10으로부터 선택되고, 여기서 R10은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
    Z8은 O 및 S로부터 선택되고;
    R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아실, 치환된 아실, 비-방향족 헤테로사이클, 치환된 비-방향족 헤테로사이클, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬 및 프로모이어티로부터 선택된 것인
    화합물.
  43. 제42항에 있어서, X1이 화학식 (XVa) 내지 (XVf) 중 어느 하나로부터 선택되고:
    Figure pct00147

    여기서
    R10 및 R11은 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아실, 치환된 아실 및 프로모이어티로부터 선택된 것인
    화합물.
  44. 제43항에 있어서, X1이
    Figure pct00148

    또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된 것인 화합물.
  45. 제13항에 있어서, 하기 구조로부터 선택된 화합물:
    Figure pct00149
    .
  46. 제30항에 있어서, 하기 구조로부터 선택된 화합물:
    Figure pct00150
    .
  47. ENPP1 기능을 억제하기 위한 수단; 및
    제약상 허용되는 부형제
    를 포함하는 제약 조성물.
  48. 제47항에 있어서, ENPP1 기능을 억제하기 위한 수단이 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제인 제약 조성물.
  49. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제; 및
    제약상 허용되는 부형제
    를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  50. ENPP1을 포함하는 샘플을 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제와 접촉시켜 ENPP1의 cGAMP 가수분해 활성을 억제하는 것
    을 포함하는, ENPP1을 억제하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, ENPP1 억제제가 세포 불투과성인 방법.
  52. 제50항에 있어서, ENPP1 억제제가 세포 투과성인 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포 샘플인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 샘플이 cGAMP를 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, cGAMP 수준이 세포 샘플에서 (예를 들어, ENPP1 억제제와 접촉되지 않은 대조군 샘플에 비해) 상승되는 것인 방법.
  56. 암을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제를 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것
    을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  57. 암을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 기능을 억제하기 위한 수단을 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것
    을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 암이 고형 종양 암인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 부신암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 결장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 식도암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암 (소세포암 및 비소세포암 둘 다), 갑상선암, 암종, 육종, 교모세포종, 흑색종 및 다양한 두경부 종양으로부터 선택된 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  61. 제56항 또는 제57항에 있어서, 암이 림프종인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 암이 교모세포종인 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 1종 이상의 추가의 활성제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제가 화학요법제 또는 면역요법제인 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제가 소분자, 항체, 항체 단편, 항체-약물 접합체, 압타머, 또는 단백질인 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제가 체크포인트 억제제를 포함하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 체크포인트 억제제가 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4) 억제제, 프로그램화된 사멸 1 (PD-1) 억제제 및 PD-L1 억제제로부터 선택된 것인 방법.
  68. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제가 화학요법제를 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 화학요법제가 cGAMP-유도 화학요법제인 방법.
  70. 제69항에 있어서, cGAMP-유도 화학요법제가 대상체에서 cGAMP의 생산을 유도하는데 효과적인 양으로 투여되는 항유사분열제 또는 항신생물제인 방법.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 방사선 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 억제제가 방사선 요법 전에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 억제제가 대상체의 방사선 요법에 대한 노출 후에 투여되는 것인 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 방사선 요법이 대상체에서 cGAMP의 생산을 유도하는 것인 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선 요법이 대상체에 대한 방사선 손상을 감소시키는데 효과적인 선량 및/또는 빈도로 투여되는 것인 방법.
  76. 제56항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, ENPP1 억제제가 세포 불투과성인 방법.
  77. 제56항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, ENPP1 억제제가 세포 투과성인 방법.
  78. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 ENPP1 억제제.
  79. 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제의 용도.
  80. 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 ENPP1 억제제를 투여하여 대상체에서 염증성 상태를 치료하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법.
  81. 대상체에게 치료 유효량의 ENPP1 기능을 억제하기 위한 수단을 투여하여 대상체에서 염증성 상태를 치료하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조정하는 방법.
  82. 제1항에 있어서, Z3이 부재하고, Z2가 CR12이고, 여기서 R12는 시아노, 할로겐 또는 NH이고, 화합물이 화학식 (X)을 갖고:
    Figure pct00151

    여기서 L11 및 L12는 독립적으로 공유 결합 또는 링커인
    화합물.
  83. 제82항에 있어서, 고리계 A가 페닐, 치환된 페닐, 피리딜, 치환된 피리딜, 피리미딘, 치환된 피리미딘, 피페리딘, 치환된 피페리딘, 피페라진, 치환된 피페라진, 피리다진, 치환된 피리다진, 시클로헥실 및 치환된 시클로헥실로부터 선택된 것인 화합물.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 화학식 (XI)을 갖고:
    Figure pct00152

    여기서
    각각의 Z5는 독립적으로 N 및 CR16으로부터 선택되고;
    각각의 R16은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 카르복시, 카르복시아미드, 치환된 카르복시아미드, 술포닐, 치환된 술포닐, 술폰아미드 및 치환된 술폰아미드로부터 선택되고;
    r은 0 내지 8의 정수인
    화합물.
  85. 제82항에 있어서, 화학식 (XII)을 갖는 화합물:
    Figure pct00153
    .
  86. 제85항에 있어서, Z5가 N인 화합물.
  87. 제84항에 있어서, 화학식 (XIII)을 갖고:
    Figure pct00154

    여기서 s는 0 내지 6 (예를 들어, 0 내지 3)의 정수인
    화합물.
  88. 제84항에 있어서, 화학식 (XIV)을 갖는 화합물:
    Figure pct00155
    .
  89. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, -OCF3, 할로겐, 시아노, 아민, 치환된 아민, 아미드, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클로부터 선택된 것인 화합물.
  90. 제89항에 있어서, R2 내지 R5가 독립적으로 H, OH, C(1-6)알콕시, -OCF3, C(1-6)알킬아미노, 디-C(1-6)알킬아미노, F, Cl, Br 및 CN으로부터 선택된 것인 화합물.
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