KR20210105889A - 지질 나노입자 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지질 나노입자 및 제제를 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.

Description

지질 나노입자 제제

관련 출원에 대한 상호 참조

이 특허 출원은 2018년 11월 9일에 출원된 미국 출원 일련번호 제62/758,088호의 우선권의 이점을 주장하고, 상기 출원은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 배경

지질 나노입자(LNP)는 세포 불투과성인 치료용 핵산, 단백질, 및 펩타이드와 같은 생물학적 활성 화합물에 대한 효과적인 약물 전달 시스템이다. 예를 들어, 시험관내 전사된 메신저 RNA(mRNA)와 같은 큰 핵산 분자뿐만 아니라 메신저 RNA 또는 유전자와 상호작용하는 더 작은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 기반 약물은, 효과적이기 위해 적절한 세포 구획으로 전달되어야 한다. 예를 들어, 예를 들어, siRNA를 포함하는 이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)와 같은 이중 가닥 핵산은 이들을 세포에 불투과성으로 만드는 물리화학적 특성으로 인해 어려움을 겪는다. 적절한 구획으로 전달되면, siRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 고도로 보존된 조절 메커니즘을 통해 유전자 발현을 차단한다. 일반적으로, siRNA는 분자량이 12-17 kDa 범위로 크기가 크고 최대 50 개의 음전하가 있는 포스페이트 뼈대로 인해 매우 음이온성이다. 또한, 두 개의 상보적인 RNA 가닥이 강직한 나선을 생성한다. 이러한 특징은 siRNA의 불량한 "약물 유사" 특성에 기여한다. 정맥내 투여 시, siRNA는 단지 10 분 범위의 전형적인 반감기로 신체로부터 빠르게 배설된다. 또한, siRNA는 혈액 및 기타 체액 또는 조직에 존재하는 뉴클레이스에 의해 빠르게 분해되고 시험관내 및 생체내에서 강력한 면역 반응을 자극하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Robbins et al., Oligonucleotides 19:89-102, 2009을 참조하라. mRNA 분자는 불투과성, 취약성 및 면역원성의 유사한 문제를 겪는다. (WO2016/118697)

지질 나노입자 제제는 생체내 핵산 전달을 개선했다. 예를 들어, 그러한 제제는 생체내 표적 녹다운을 달성하기 위해 필요한 siRNA 용량을 상당히 감소시켰다. Zimmermann et al., Nature 441:111-114, 2006을 참조하라. 전형적으로, 그러한 지질 나노입자 약물 전달 시스템은 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 지질을 포함하는 다성분 제제이다. 양으로 하전된 양이온성 지질은 음이온성 핵산에 결합하는 반면, 다른 성분은 지질 나노입자의 안정한 자가 조립을 지원한다.

지질 나노입자 제제의 전달 효능 개선을 향한 노력이 이루어져 왔다. 그러한 많은 노력은 더 적절한 양이온성 지질을 개발하는 것을 목표로 한다. 예를 들어, Akinc et al., Nature Biotechnology 26:561-569, 2008; Love et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:1864-1869, 2010; Baigude et al., Journal of Controlled Release 107:276-287, 2005; Semple et al., Nature Biotechnology 28:172-176, 2010을 참조하라. 이러한 노력에도 불구하고, 투여 후 높은 효능을 제공하고 더 적은 용량의 핵산의 투여를 허용하는 지질 나노입자 포함 제제의 필요성이 남아 있다.

발명의 요약

본 발명은 특정 지질 나노입자 및 지질 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 지질 나노입자 및 약제학적 조성물은 핵산을 환자(예를 들어 인간)에 또는 세포에 전달하기에 특히 유용하다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 지질 나노입자를 제공하고, 이는 다음을 포함하는 지질 나노입자이다:

(a) 하나 이상의 핵산 분자;

(b) 콜레스테롤;

(c) DSPC;

(d) PEG-C-DMA; 및

(e) 다음 화학식의 양이온성 지질:

또는 이의 염, 여기서 PEG-C-DMA, 양이온성 지질, 콜레스테롤, 및 DSPC에 대한 총 지질의 몰 백분율은 다음과 같다:

PEG-C-DMA: 약 1.5;

양이온성 지질: 약 50.0;

콜레스테롤: 약 38.5; 및

DSPC: 약 10.0.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 지질 나노입자를 제공하고, 이는 다음을 포함하는 지질 나노입자이다:

(a) 하나 이상의 핵산 분자;

(b) 콜레스테롤;

(c) DSPC;

(d) PEG-C-DMA; 및

(e) 다음 화학식의 양이온성 지질:

또는 이의 염, 여기서 PEG-C-DMA, 양이온성 지질, 콜레스테롤, 및 DSPC에 대한 총 지질의 몰 백분율은 다음과 같다:

PEG-C-DMA: 1.5

양이온성 지질: 50.0;

콜레스테롤: 38.5; 및

DSPC: 10.0.

본 발명은 또한 본 발명의 지질 나노입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 세포를 본 발명의 지질 나노입자와 접촉시키는 것을 포함하는 핵산을 세포에 전달하는 방법을 또한 제공한다. 보다 일반적으로, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 살아 있는 세포에 핵산을 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 기능성 단백질의 결핍을 초래하는 유전적 결함을 특징으로 하는 질환 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: 질환이 있는 대상에게, 본 발명의 지질 나노입자를 투여하는 것, 여기서 핵산 분자는 기능성 단백질 또는 기능성 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 mRNA이다.

본 발명은 또한 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질환 치료 방법을 제공하고, 이는 질환이 있는 대상에게 본 발명의 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 과발현된 폴리펩타이드의 발현을 표적으로 하는 siRNA이다.

본 발명은 또한 기능성 단백질의 결핍을 초래하는 유전적 결함을 특징으로 하는 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 본 발명의 지질 나노입자를 제공한다.

본 발명은 또한 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 본 발명의 지질 나노입자를 제공한다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 지질 나노입자를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 지질 나노입자 제조에 유용한 본원에 개시된 과정 및 중간체를 제공한다.

발명의 상세한 설명

정의

본원에서 사용되는 다음 용어는 달리 명시되지 않는 한 그에 주어진 의미를 갖는다.

용어 "약"은 ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%를 의미한다.

용어 "간섭 RNA" 또는 "RNAi" 또는 "간섭 RNA 서열"은 간섭 RNA가 표적 유전자 또는 서열과 동일한 세포에 있을 때 (예를 들어, 간섭 RNA 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개하거나 번역을 억제함으로써) 표적 유전자 또는 서열의 발현을 감소 또는 억제할 수 있는 단일 가닥 RNA(예를 들어, 성숙 miRNA) 또는 이중 가닥 RNA(즉, siRNA, aiRNA, 또는 pre-miRNA와 같은 듀플렉스 RNA)을 지칭한다. 따라서 간섭 RNA는 표적 mRNA 서열에 또는 두 개의 상보적 가닥에 의해 또는 단일한 자기상보적 가닥에 의해 형성된 이중 가닥 RNA에 상보적인 단일 가닥 RNA를 지칭한다. 간섭 RNA는 표적 유전자 또는 서열에 대해 실질적 또는 완전한 동일성을 가질 수 있거나, 미스매치 영역(즉, 미스매치 모티프)을 가질 수 있다. 간섭 RNA의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 이의 하위서열에 해당할 수 있다.

간섭 RNA는 "소-간섭 RNA" 또는 "siRNA," 예를 들어, 약 15-60, 15-50, 또는 15-40 (듀플렉스) 뉴클레오타이드 길이, 더욱 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 (듀플렉스) 뉴클레오타이드 길이의 간섭 RNA를 포함하고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 (듀플렉스) 뉴클레오타이드 길이이다 (예를 들어, 이중 가닥 siRNA의 각 상보적 서열은 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 뉴클레오타이드 길이이고, 이중 가닥 siRNA는 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 18-22, 19-20, 또는 19-21 염기쌍 길이이다). siRNA 듀플렉스는 약 1 내지 약 4 개의 뉴클레오타이드 또는 약 2 내지 약 3 개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행 및 5' 포스페이트 말단을 포함할 수 있다. siRNA의 예는, 제한 없이, 두 개의 분리된 가닥 분자로부터 조립된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하고, 여기서 한 가닥은 센스 가닥이고 다른 가닥은 상보적 안티센스 가닥이고; 단일 가닥 분자로부터 조립된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하고, 여기서 센스 및 안티센스 영역은 핵산-기반 또는 비-핵산-기반 링커에 의해 연결되고; 자기상보적 센스 및 안티센스 영역을 갖는 헤어핀 이차 구조가 있는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하고; 둘 이상의 루프 구조 및 자기상보적 센스 및 안티센스 영역을 갖는 스템이 있는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하고, 여기서 원형 폴리뉴클레오타이드는 생체내 또는 시험관내 처리되어 활성 이중 가닥 siRNA 분자를 생성할 수 있다.

바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. siRNA는 또한 E. coli RNase III 또는 Dicer를 사용하여 더 긴 dsRNA(예를 들어, 길이가 약 25 개 초과의 뉴클레오타이드인 dsRNA)의 절단에 의해 생성될 수 있다. 이들 효소는 dsRNA를 생물학적으로 활성인 siRNA로 처리한다 (예를 들어, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); and Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968) 참조). 바람직하게는, dsRNA는 최소 50 개의 뉴클레오타이드 내지 약 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 뉴클레오타이드 길이이다. dsRNA는 1000, 1500, 2000, 5000 개의 뉴클레오타이드 길이이거나 더 길 수 있다. dsRNA는 전체 유전자 전사물 또는 부분 유전자 전사물에 대해 인코딩할 수 있다. 특정 예에서, siRNA는 플라스미드에 의해 인코딩될 수 있다 (예를 들어, 헤어핀 루프가 있는 듀플렉스로 자동으로 접히는 서열로서 전사됨).

본원에서 사용되는 용어 "미스매치 모티프" 또는 "미스매치 영역"은 표적 서열에 대해 100% 상보성을 갖지 않는 간섭 RNA(예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA) 서열의 일부를 지칭한다. 간섭 RNA는 최소 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 개 이상의 미스매치 영역을 가질 수 있다. 미스매치 영역은 연속일 수 있거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 미스매치 모티프 또는 영역은 단일 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 둘, 셋, 넷, 다섯 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)과 같은 핵산의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 효과, 예를 들어, 간섭 RNA의 부재에서 검출된 정상 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현 억제; 또는 단백질이 발현되는 유기체에서 바람직한 생물학적 효과를 유발하는 양의 단백질의 mRNA-유도된 발현을 발생시키기에 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현의 억제는 대조군에 비해 간섭 RNA로써 획득한 값이 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 0%인 경우에 달성된다. 다른 실시양태에서, 발현된 단백질은 체내 세포 유형에서 정상적으로 발현되는 단백질의 활성 형태이고, mRNA의 치료적 유효량은 건강한 개체의 세포 유형에서 정상적으로 발현되는 단백질의 양의 최소 50%(예를 들어, 최소 60%, 또는 최소 70%, 또는 최소 80%, 또는 최소 90%)인 인코딩된 단백질의 양을 생성하는 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현 측정을 위한 적합한 분석은, 예를 들어, 도트 블랏, 노던 블랏, 제자리 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지인 기술을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사뿐만 아니라 당업자에게 공지인 표현형 분석을 포함한다.

간섭 RNA에 의한 면역 반응의 "감소"("decrease," "decreasing," "reduce," 또는 "reducing")는 주어진 간섭 RNA(예를 들어, 변형된 간섭 RNA)에 대한 면역 반응의 검출 가능한 감소를 의미하는 것으로 의도된다. 변형된 간섭 RNA에 의한 면역 반응의 감소량은 변형되지 않은 간섭 RNA의 존재에서 면역 반응의 수준에 대해 결정될 수 있다. 검출 가능한 감소는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%일 수 있거나, 변형되지 않은 간섭 RNA의 존재에서 검출된 면역 반응보다 더 낮을 수 있다. 간섭 RNA에 대한 면역 반응의 감소는 전형적으로 시험관내에서 응답자 세포에 의한 사이토카인 (예를 들어, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, 또는 IL-12) 생성의 감소 또는 간섭 RNA의 투여 후 포유동물 대상의 혈청에서 사이토카인 생성의 감소에 의해 측정된다.

mRNA에 의한 면역 반응의 "감소"("decrease," "decreasing," "reduce," 또는 "reducing")는 주어진 mRNA(예를 들어, 변형된 mRNA)에 대한 면역 반응의 검출 가능한 감소를 의미하는 것으로 의도된다. 변형된 mRNA에 의한 면역 반응의 감소량은 변형되지 않은 mRNA의 존재에서 면역 반응의 수준에 대해 결정될 수 있다. 검출 가능한 감소는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%일 수 있거나, 변형되지 않은 mRNA의 존재에서 검출된 면역 반응보다 더 낮을 수 있다. mRNA에 대한 면역 반응의 감소는 전형적으로 시험관내에서 응답자 세포에 의한 사이토카인 (예를 들어, IFNγ, IFNα, TNFα, IL-6, 또는 IL-12) 생성의 감소 또는 mRNA의 투여 후 포유동물 대상의 혈청에서 사이토카인 생성의 감소에 의해 측정된다.

본원에서 사용된 용어 "응답자 세포"는 변형되지 않은 siRNA와 같은 면역자극 간섭 RNA와 접촉할 때 검출 가능한 면역 반응을 발생시키는 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 지칭한다. 예시적인 응답자 세포는, 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, 말초혈액 단핵세포(PBMC), 비장세포 등을 포함한다. 검출 가능한 면역 반응은, 예를 들어, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF, 및 이들의 조합과 같은 사이토카인 또는 성장 인자의 생성을 포함한다.

"실질적 동일성"은 엄격한 조건 하에 표준 서열에 혼성화하는 서열, 또는 표준 서열의 특정 영역에 대해 특정 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 지칭한다.

어구 "엄격한 혼성화 조건"은 전형적으로 핵산의 복합 혼합물에서, 핵산이 표적 서열에 혼성화하지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않을 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 상황에 따라 상이할 것이다. 더 긴 서열은 특히 더 높은 온도에서 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(T_m) 보다 약 5-10℃ 더 낮게 선택된다. T_m은 (정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에) 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에서 혼성화되는 온도이다 (표적 서열이 과잉으로 존재하므로, T_m에서, 프로브의 50%가 평형에서 점유된다). 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가하여 달성될 수도 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 있어서, 양성 신호는 배경의 최소 두 배, 바람직하게는 배경 혼성화의 10 배이다.

예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 0.2×SSC, 및 0.1% SDS로 65℃에서 세척. PCR에 있어서, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격성의 증폭에 전형적이지만, 어닐링 온도가 프라이머 길이에 따라 약 32℃와 48℃ 사이에서 변할 수 있다. 높은 엄격성의 PCR 증폭에 있어서, 약 62℃의 온도가 전형적이지만, 높은 엄격성의 어닐링 온도가 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃ 범위일 수 있다. 높은 및 낮은 엄격성의 증폭 모두에 대한 전형적인 사이클 조건은 30 초-2 분 동안 90℃-95℃의 변성 단계, 30 초-2 분 지속되는 어닐링 단계, 및 1-2 분 동안 약 72℃의 연장 단계를 포함한다. 낮은 및 높은 엄격성의 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 지침이, 예를 들어, Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)에 제공된다.

엄격한 조건 하에 서로 혼성화하지 않는 핵산은 이들의 인코딩하는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다면 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어 핵산의 사본이 유전 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴화를 사용하여 생성되는 경우 발생한다. 그러한 경우에, 핵산은 전형적으로 적당히 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다. 예시적인 "적당히 엄격한 혼성화 조건"은 37℃에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 버퍼에서 혼성화, 및 45℃에서 1×SSC에서 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 배경의 최소 두 배이다. 당업자는 유사한 엄격성의조건을 제공하기 위해 대안의 혼성화 및 세척 조건이 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 혼성화 파라미터를 결정하기 위한 추가 지침은 수많은 참고문헌, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds에 제공된다.

둘 이상의 핵산의 맥락에서 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"은, 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 지정 영역 또는 비교 창에 대한 최대 유사성에 대해 비교 및 정렬될 때, 동일하거나 특정 백분율의 동일한 뉴클레오타이드를 갖는 (즉, 특정 영역에 대해 최소 약 60%, 바람직하게는 최소 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성) 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 이 정의는, 문맥이 나타낼 때, 또한 유사하게 서열의 보체를 지칭한다. 바람직하게는, 실질적 동일성은 최소 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 개의 뉴클레오타이드 길이인 영역에 거쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 표준 서열로 작용하고, 여기에 테스트 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 표준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 좌표가 지정되고, 필요한 경우, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 기본 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대체 파라미터가 지정될 수 있다. 이후 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 표준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.

본원에서 사용된 "비교 창"은 약 5 내지 약 60, 일반적으로 약 10 내지 약 45, 더욱 일반적으로 약 15 내지 약 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인접 위치 중 어느 하나의 분절에 대한 표준을 포함하고, 여기서 서열은 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 표준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당해 분야에서 공지이다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해, Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)의 유사성 방법 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 부록) 참조) 수행될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트 결정에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 \BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 각각 Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)에 설명된다. 본 발명의 핵산에 대한 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터와 함께 BLAST 및 BLAST 2.0이 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 입수 가능하다.

BLAST 알고리즘이 또한 두 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))이고, 이는 두 뉴클레오타이드 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 표준 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산이 표준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 용어 "핵산"은 단일- 또는 이중 가닥 형태의, 최소 둘의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 중합체를 지칭하고 DNA 및 RNA를 포함한다. DNA는, 예를 들어, 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, 사전 축합된 DNA, PCR 생성물, 벡터 (P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이들 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. RNA는 siRNA, 비대칭 간섭 RNA (aiRNA), 마이크로RNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, 바이러스 RNA (vRNA), 자가 증폭 RNA, 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산은 합성, 자연 발생, 및 비자연 발생이고, 표준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 뼈대 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 예는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 카이랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 및 펩타이드-핵산 (PNA)을 포함한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 표준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 오쏘로그, SNP, 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "뉴클레오타이드"는 당 데옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기, 및 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트 기를 통해 서로 연결된다. "염기"는 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 추가로 포함하는 푸린 및 피리미딘, 및 제한되는 것은 아니지만 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트, 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성 기를 배치하는 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 푸린 및 피리미딘의 합성 유도체를 포함한다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 전구체 폴리펩타이드의 생성에 필요한 부분 길이 또는 전체 길이 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다.

본원에서 사용된 "유전자 산물"은 RNA 전사물 또는 폴리펩타이드와 같은 유전자의 산물을 지칭한다.

용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 물에 불용성이지만 많은 유기 용매에 가용성임을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 지칭한다. 이들은 일반적으로 최소 세 가지 부류로 나뉜다: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질".

본원에서 사용된 용어 "LNP"는 지질-핵산 입자 또는 핵산-지질 입자(예를 들어, 안정한 핵산-지질 입자)를 지칭한다. LNP는 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 입자의 응집을 방지하는 접합 지질), 핵산으로 만들어진 입자를 나타내고, 여기서 핵산(예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA, ssDNA, dsDNA, ssRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), dsRNA, mRNA, 자가 증폭 RNA, 또는 플라스미드, 간섭 RNA 또는 mRNA가 전사되는 플라스미드 포함)이 지질 내에 캡슐화된다. 한 실시양태에서, 핵산은 지질에 최소 50% 캡슐화되고; 한 실시양태에서, 핵산은 지질에 최소 75% 캡슐화되고; 한 실시양태에서, 핵산은 지질에 최소 90% 캡슐화되고; 한 실시양태에서, 핵산은 지질에 완전히 캡슐화된다. LNP는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질 접합체)를 포함한다. LNP는 정맥내 (i.v.) 주사 후 순환 수명이 연장될 수 있고, 말단 부위(예를 들어, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에 축적될 수 있으며, 이러한 말단 부위에서 형질감염된 유전자의 발현 또는 표적 유전자 발현의 침묵을 매개할 수 있으므로 전신 적용에 매우 유용하다.

본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 전형적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 핵산은, 본 발명의 지질 입자 내에 존재할 때, 뉴클레이스로 인한 분해에 대해 수용액에서 내성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제20040142025호 및 제20070042031호에 개시되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본원에서 사용된 "캡슐화된 지질"은 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 두 가지 모두로 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 제공하는 지질 입자를 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 지질 입자에 완전히 캡슐화된다 (예를 들어, LNP, 또는 다른 핵산-지질 입자를 형성하기 위해).

용어 "양이온성 지질"은 화학식 CL₁의 화합물 또는 이의 염을 지칭한다:

CL ₁

용어 "소수성 지질"은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 사이클로지방족, 또는 헤테로환 기(들)에 의해 임의로 치환된 그러한 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 무극성 기를 갖는 화합물을 지칭한다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N-N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "융해성"은 LNP와 같은 지질 입자가 세포의 막과 융합하는 능력을 지칭한다. 막은 원형질막 또는 소기관, 예를 들어, 엔도솜, 핵, 등을 둘러싸는 막일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "수용액"은 전체적으로, 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "유기 지질 용액"은 전체적으로, 또는 부분적으로 지질을 갖는 유기 용매를 포함하는 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용된 "말단 부위"는 인접 모세관 층으로 제한되지 않지만 유기체 전체에 광범하에 분포된 부위를 포함하는 물리적으로 분리된 부위를 지칭한다.

LNP와 같은 핵산-지질 입자와 관련하여 "혈청-안정성"은 유리 DNA 또는 RNA를 상당히 분해할 혈청 또는 뉴클레이스 분석에 노출된 후 입자가 상당히 분해되지 않음을 의미한다. 적합한 분석은, 예를 들어, 표준 혈청 분석, DNAse 분석, 또는 RNAse 분석을 포함한다.

본원에서 사용된 "전신 전달"은 유기체 내에서 간섭 RNA 또는 mRNA와 같은 핵산의 광범위한 생체분포를 유발하는 지질 입자의 전달을 지칭한다. 일부 투여 기술은 다른 것은 아닌 특정 약제의 전신 전달을 유발할 수 있다. 전신 전달은 유용한, 바람직하게는 치료적 양의 약제가 신체의 대부분에 노출됨을 의미한다. 광범위한 생체분포를 얻기 위해, 투여 부위에 대해 원위부의 질환에 도달하기 전에 (예컨대 초회 통과 기관(간, 폐, 등)에 의해 또는 신속한 비특이적 세포 결합에 의해) 약제가 빠르게 분해되거나 제거되지 않도록 하는 혈액 수명을 일반적으로 필요로 한다. 지질 입자의 전신 전달은, 예를 들어, 정맥내, 피하, 및 복강내를 포함하는 당해 분야에 공지인 임의의 수단에 의한 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의한 것이다.

본원에서 사용된 "국소 전달"은 유기체 내에서 표적 부위에 직접적으로 간섭 RNA 또는 mRNA와 같은 핵산을 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 약제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사함으로써 국소적으로 전달될 수 있다.

용어 "포유동물"은 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니피그, 토끼, 가축 등과 같은 임의의 포유동물 종을 지칭한다.

용어 "암"은 비정상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질병 부류의 모든 구성원을 지칭한다. 상기 용어는 악성, 양성, 연조직, 또는 고형으로 특징지어지는 알려진 모든 암 및 신생물 병태, 및 전이전 및 전이후 암을 포함하는 모든 단계 및 등급의 암을 포함한다. 여러 상이한 유형의 암의 예는 폐암, 결장암, 직장암, 항문암, 담관암, 소장암, 위암, 식도암; 담낭암, 간암, 췌장암, 충수암, 유방암, 난소암; 자궁경부암, 전립선암, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 중추신경계의 암, 교모세포종, 피부암, 림프종, 융모막암종, 두경부암, 골육종, 및 혈액암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 유형의 간암의 비제한적 예는 간세포 암종(HCC), 이차 간암(예를 들어, 일부 다른 비-간암 세포 유형의 전이에 의해 야기됨), 및 간모세포종을 포함한다. 본원에서 사용된 "종양"은 하나 이상의 암 세포를 포함한다.

실시양태의 설명

한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 분자는 siRNA를 포함한다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 분자는 mRNA를 포함한다.

한 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 17 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는다.

한 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 18 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는다.

한 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 19 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는다.

한 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 22 내지 약 25인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는다.

한 실시양태에서, PEG-C-DMA는 PEG2000-C-DMA이다.

한 실시양태에서, 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제제화된다.

특정 실시양태에서, 핵산은, 지질 입자 중의 핵산이 수용액에서, 예를 들어, 뉴클레이스 또는 프로테이스에 의한 효소 분해에 내성이도록, 지질 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된다. 특정한 다른 실시양태에서, 지질 입자는 인간과 같은 포유동물에게 실질적으로 무독성이다.

특정 예에서, 핵산은, 예를 들어, siRNA, aiRNA, miRNA, 또는 이들의 혼합과 같은 간섭 RNA 분자를 포함한다. 특정한 다른 예에서, 핵산은, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합과 같은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함한다. 다른 특정 예에서, 핵산은 하나 이상의 mRNA 분자(예를 들어, 칵테일)을 포함한다.

한 실시양태에서, 핵산은 siRNA를 포함한다. 한 실시양태에서, siRNA 분자는 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드 길이의 (예를 들어, 약 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 뉴클레오타이드) 이중 가닥 영역을 포함한다. 본 발명의 siRNA 분자는 시험관내 및/또는 생체내 표적 서열 발현을 침묵시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, siRNA 분자는 최소 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 바람직한 실시양태에서, siRNA 분자는 이중 가닥 영역에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 개 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 예에서, siRNA는 이중 가닥 영역에서 약 1% 내지 약 100% (예를 들어, 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이중 가닥 영역에서 약 25% 미만 (예를 들어, 약 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만) 또는 약 1% 내지 약 25% (예를 들어, 약 1%-25%, 5%-25%, 10%-25%, 15%-25%, 20%-25%, 또는 10%-20%)의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

다른 실시양태에서, siRNA 분자는 2'-O-메틸 (2'OMe) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오타이드, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는, 예를 들어, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합과 같은 2'OMe 뉴클레오타이드(예를 들어, 2'OMe 푸린 및/또는 피리미딘 뉴클레오타이드)를 포함한다. 특정 예에서, siRNA는 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, siRNA는 헤어핀 루프 구조를 포함한다.

siRNA는 siRNA 분자의 이중 가닥 영역의 한 가닥 (즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드는 siRNA 듀플렉스의 이중 가닥 영역의 선택적 위치에서 변형된다. 우리딘 뉴클레오타이드 변형과 관련하여, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 우리딘 뉴클레오타이드 중 최소 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상이 변형된 우리딘 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 모든 우리딘 뉴클레오타이드는 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드이다. 구아노신 뉴클레오타이드 변형과 관련하여, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 구아노신 뉴클레오타이드 중 최소 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상이 변형된 구아노신 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 모든 구아노신 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드이다.

특정 실시양태에서, siRNA 서열에서 최소 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 또는 그 이상의 5'-GU-3' 모티프가, 예를 들어 5'-GU-3' 모티프를 제거하기 위해 미스매치를 도입함으로써 및/또는 2'OMe 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 도입함으로써 변형될 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 siRNA 서열의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두에 있을 수 있다. 5'-GU-3' 모티프는 서로 인접할 수 있고, 또는 대안으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.

일부 바람직한 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 변형되지 않은 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이다. 그러한 실시양태에서, 면역자극 특성이 감소된 변형된 siRNA 분자는 유리하게는 표적 서열에 대한 RNAi 활성을 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자의 면역자극 특성 및 표적 유전자 발현을 침묵시키는 이의 능력은 예를 들어 siRNA 듀플렉스의 이중 가닥 영역 내와 같은 siRNA 서열 내의 최소이고 선택적인 2'OMe 변형의 도입에 의해 균형을 이루거나 최적화될 수 있다. 특정 예에서, 변형된 siRNA는 상응하는 변형되지 않은 siRNA보다 최소 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 덜 면역자극성이다. 변형된 siRNA 분자 및 상응하는 변형되지 않은 siRNA 분자의 면역자극 특성은, 예를 들어, 적절한 지질 기반 전달 시스템(예컨대 본원에 개시된 LNP 전달 시스템)을 사용하여 포유동물에서 전신 투여 또는 포유동물 응답자 세포의 형질감염 후 약 2 내지 약 12 시간에 INF-α 및/또는 IL-6 수준을 측정하여 결정될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

특정 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 변형되지 않은 siRNA보다 10-배 이하의 IC₅₀(즉, 최대-절반 억제 농도)를 갖는다 (즉, 변형된 siRNA는 상응하는 변형되지 않은 siRNA의 IC₅₀의 10-배 이하의 IC₅₀을 갖는다). 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 변형되지 않은 siRNA 서열의 3 배 이하의 IC₅₀을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA는 상응하는 변형되지 않은 siRNA의 2-배 이하의 IC₅₀을 갖는다. 당업자에게 공지인 방법을 사용하여 용량-반응 곡선이 생성될 수 있고 변형된 siRNA 및 상응하는 변형되지 않은 siRNA에 대한 IC₅₀ 값이 쉽게 결정될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 변형된 siRNA 분자는 상응하는 변형되지 않은 siRNA 서열에 대해 표적 서열의 발현의 최소 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 침묵시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, siRNA 분자는, 예를 들어, 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 포스페이트 뼈대 변형을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, siRNA는, 예를 들어, 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 포스페이트 뼈대 변형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는 포스페이트 뼈대 변형을 포함하지 않는다.

추가의 실시양태에서, siRNA는 예를 들어, 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 추가의 실시양태에서, siRNA는, 예를 들어, 이중 가닥 영역의 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA는 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.

특정 예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 이중 가닥 영역의 3'-말단의 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다. 특정한 다른 예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥에서 이중 가닥 영역의 3'-말단 근처의 (예를 들어, 3'-말단의 하나, 둘, 셋, 또는 넷의 뉴클레오타이드 이내의) 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드가 아니다.

본원에 기재된 siRNA 분자는 이중 가닥 영역의 하나 또는 두 면에 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 가질 수 있거나, 이중 가닥 영역의 하나 또는 두 면에 오버행이 없을 수 있다 (즉, 평활 말단을 갖는다). 바람직하게는, siRNA는 이중 가닥 영역의 각 면에 두 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 갖는다. 특정 예에서, 안티센스 가닥의 3' 오버행은 표적 서열에 대해 상보성을 갖고 센스 가닥의 3' 오버행은 표적 서열의 상보적 가닥에 대해 상보성을 갖는다. 대안적으로, 3' 오버행은 표적 서열 또는 이의 상보적 가닥에 대해 상보성을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 3' 오버행은 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 2'-데옥시 (2'H) 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정한 바람직한 실시양태에서, 3' 오버행은 데옥시티미딘 (dT) 및/또는 우리딘 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 이중 가닥 영역의 하나 또는 두 면의 3' 오버행에서 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드의 비제한적 예는 위에 기재되고 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-2-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 3' 오버행에서 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 2'OMe-아데노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합과 같은 2'OMe 뉴클레오타이드 (예를 들어, 2'OMe 푸린 및/또는 피리미딘 뉴클레오타이드)를 포함한다.

siRNA는 표적 유전자 발현을 침묵시키는 변형되지 않은 및/또는 변형된 siRNA 서열의 최소 하나 또는 칵테일(예를 들어, 최소 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. siRNA의 칵테일은 하나 이상의 표적 유전자의 동일한 영역 또는 도메인 (예를 들어, "핫 스팟") 및/또는 상이한 영역 또는 도메인으로 향하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 하나 이상의 (예를 들어, 최소 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 또는 그 이상) 표적 유전자 발현을 침묵시키는 변형된 siRNA가 칵테일에 존재한다. 특정한 다른 예에서, 하나 이상의 (예를 들어, 최소 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 또는 그 이상) 표적 유전자 발현을 침묵시키는 변형되지 않은 siRNA 서열이 칵테일에 존재한다.

일부 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 대해 최소 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적인 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 100% 상보적인 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 실시양태에서, siRNA 분자의 안티센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부에 특이적으로 혼성화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

추가의 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부와 최소 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 가닥은 표적 서열 또는 이의 일부와 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-하이드록시부틸 에테르, 및 이들의 혼합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 콜레스테릴-2'-하이드록시에틸 에테르의 합성은 본원에 설명된다.

본원에서 사용된 DSPC는 디스테아로일포스파티딜콜린을 의미한다.

본 발명의 지질 입자에서, 핵산은 입자의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화됨으로써, 효소 분해로부터 핵산을 보호할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 또는 mRNA와 같은 핵산을 포함하는 LNP는 입자의 지질 부분 내에 완전해 캡슐화됨으로써, 뉴클레이스 분해로부터 핵산을 보호한다. 특정 예에서, LNP 중의 핵산은 37℃에서 최소 약 20, 30, 45, 또는 60 분 동안 뉴클레이스에 입자를 노출시킨 후 실질적으로 분해되지 않는다. 특정한 다른 예에서, LNP 중의 핵산은 37℃에서 최소 약 30, 45, 또는 60 분 또는 최소 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36 시간 동안 혈청에서 입자의 인큐베이션 후 실질적으로 분해되지 않는다. 다른 실시양태에서, 핵산(예를 들어, siRNA 또는 mRNA와 같은 핵산)은 입자의 지질 부분과 복합된다. 본 발명의 제제의 이점 중 하나는 지질 입자 조성물이 인간과 같은 포유동물에게 실질적으로 무독성이라는 것이다.

용어 "완전히 캡슐화된"은 지질 입자 중의 핵산이 유리 DNA, RNA, 또는 단백질을 상당히 분해할 혈청 또는 뉴클레이스 또는 프로테이스 분석에 노출된 후에도 상당히 분해되지 않음을 나타낸다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, 일반적으로 100%의 유리 핵산을 분해할 치료에서, 바람직하게는 약 25% 미만의 입자 중의 핵산이 분해되고, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 입자 중의 핵산이 분해된다. 핵산 치료제의 맥락에서, 완전한 캡슐화는 Oligreen® 분석에 의해 결정될 수 있다. Oligreen®은 용액에서 올리고뉴클레오타이드 및 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 정량화하기 위한 초고감도 형광 핵산 염색이다 (Invitrogen Corporation; Carlsbad, Calif.로부터 구입 가능). "완전히 캡슐화된"은 또한 지질 입자가 혈청-안정성, 즉, 생체내 투여 시 구성성분 부분으로 빠르게 분해되지 않음을 나타낸다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 지질 입자를 포함하는 지질 입자 (예를 들어, LNP) 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 핵산(예를 들어, 핵산)은, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, %, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 최소 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% (또는 이의 임의의 분율 또는 그 안의 범위)가 그 안에 캡슐화된 핵산을 갖도록, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 지질 부분 내에 완전히 캡슐화된다.

전형적으로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 1 내지 약 100의 지질:활성제(예를 들어, 지질:핵산) 비율(질량/질량 비율)을 갖는다. 일부 예에서, 지질:활성제(예를 들어, 지질:핵산) 비율(질량/질량 비율)은 약 1 내지 약 50, 약 2 내지 약 25, 약 3 내지 약 20, 약 4 내지 약 15, 또는 약 5 내지 약 10 범위이다.

전형적으로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 40 nm 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 40 nm 내지 약 130 nm, 약 40 nm 내지 약 120 nm, 약 40 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 120 nm, 약 60 nm 내지 약 110 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 120 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm, 또는 80 nm 미만 (또는 이의 임의의 분율 또는 그 안의 범위)의 평균 직경을 갖는다.

본 발명은 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 세포를 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP)와 접촉시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)를 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포는 포유동물의 세포이고 포유동물은 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물 대상에게 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, LNP)를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 활성제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)의 생체내 전달 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 투여 방식은 경구, 비강내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 병변내, 기관내, 피하, 및 진피내를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 포유동물 대상은 인간이다.

한 실시양태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 총 주사된 용량의 최소 약 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%가 주사 후 약 8, 12, 24, 36, 또는 48 시간에 혈장에 존재한다. 다른 실시양태에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 총 주사된 용량의 약 20%, 30%, 40% 초과 및 약 60%, 70% 또는 80% 정도까지 주사 후 약 8, 12, 24, 36, 또는 48 시간에 혈장에 존재한다. 특정 예에서, 복수의 입자의 약 10% 초과가 투여 후 약 1 시간에 포유동물의 혈장에 존재한다. 특정한 다른 예에서, 지질 입자(예를 들어, LNP)의 존재는 입자의 투여 후 최소 약 1 시간에 검출 가능하다. 특정 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 또는 mRNA와 같은 핵산의 존재는 투여 후 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96 시간에 세포에서 검출 가능하다 (예를 들어, 폐, 간, 종양, 또는 염증 부위). 다른 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)와 같은 핵산에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 투여 후 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96 시간에 검출 가능하다. 또 다른 실시양태에서, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)와 같은 핵산에 의한 표적 서열의 발현의 하향조절은 종양 세포에서 또는 염증 부위의 세포에서 우선적으로 일어난다. 추가의 실시양태에서, 투여 부위에서 근위 또는 원위 부위의 세포에서 또는 폐, 간, 또는 종양의 세포에서 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 핵산의 존재 또는 효과는 투여 후 약 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 또는 28 일에 검출 가능하다. 다른 실시양태에서, mRNA 또는 자가 증폭 RNA와 같은 핵산에 의한 표적 서열의 발현의 상향조절은 투여 후 약 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 또는 96 시간에 검출 가능하다. 또 다른 실시양태에서, mRNA 또는 자가 증폭 RNA와 같은 핵산에 의한 표적 서열의 발현의 상향조절은 종양 세포에서 또는 염증 부위의 세포에서 우선적으로 일어난다. 추가의 실시양태에서, 투여 부위에서 근위 또는 원위 부위의 세포에서 또는 폐, 간, 또는 종양의 세포에서 mRNA 또는 자가 증폭 RNA와 같은 핵산의 존재 또는 효과는 투여 후 약 12, 24, 48, 72, 또는 96 시간, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 또는 28 일에 검출 가능하다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 비경구로 또는 복강내로 투여된다. 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 근육내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 간섭 RNA 서열(예를 들어, siRNA)을 포함하는 하나 이상의 핵산의 치료적 전달을 위한 방법에서 유용하다. 특히, 본 발명의 목적은 하나 이상의 관심 표적 핵산 서열 또는 유전자의 전사 및/또는 번역을 하향조절하거나 침묵시킴으로써 포유동물(예를 들어, 마우스와 같은 설치류 또는 인간, 침팬지, 또는 원숭이와 같은 영장류)의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 시험관내 및 생체내 방법을 제공하는 것이다. 비제한적 예로서, 본 발명의 방법은 포유동물 대상의 간 및/또는 종양으로의 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 생체내 전달에 유용하다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 유전자의 발현 및/또는 과발현과 관련되고 유전자의 발현 또는 과발현은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)에 의해 감소된다. 특정한 다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 지질 입자(예를 들어, LNP)가 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)가 LNP로 제제화되고, 입자는 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 다른 예에서, 세포가 환자로부터 제거되고, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)가 (예를 들어, 본원에 기재된 LNP를 사용하여) 시험관내 전달되고, 세포가 환자에게 재주사된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 비대칭 간섭 RNA(aiRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 그러한 입자를 사용하여 표적 유전자 발현을 침묵시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, aiRNA 분자는 약 10 내지 약 25 개 (짝지은 염기) 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 (듀플렉스) 영역을 포함하고, 여기서 aiRNA 분자는 5' 및 3' 오버행을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 aiRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다.

특정 예에서, aiRNA 분자는 약 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17 개 (짝지은 염기) 뉴클레오타이드 길이, 더욱 전형적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 (짝지은 염기) 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 (듀플렉스) 영역을 포함한다. 특정한 다른 예에서, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 오버행은 표적 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 비표적화 서열을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 오버행 각각은 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 구성된다.

다른 실시양태에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, aiRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다. 비제한적 예로서, 2'OMe 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

관련 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 마이크로RNA (miRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 표적 유전자 발현을 침묵시키기 위해 그러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, miRNA 분자는 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드 길이를 포함하고, 여기서 miRNA 분자는 표적 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다.

특정 예에서, miRNA 분자는 약 15-50, 15-40, 또는 15-30 개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 전형적으로 약 15-25 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드 길이를 포함하고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직한 실시양태에서, miRNA 분자는 관심 RNA 서열을 표적으로 하는 성숙 miRNA 분자이다.

일부 실시양태에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, miRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다. 비제한적 예로서, 2'OMe 뉴클레오타이드는 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 하나 이상의 mRNA 분자의 치료적 전달 방법에서 유용하다. 특히, 본 발명의 한 목적은 하나 이상의 표적 단백질의 발현을 통해 포유동물(예를 들어, 마우스와 같은 설치류 또는 인간, 침팬지, 또는 원숭이와 같은 영장류)의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 시험관내 및 생체내 방법을 제공하는 것이다. 비제한적 예로서, 본 발명의 방법은 포유동물 대상에게 하나 이상의 mRNA 분자의 생체내 전달에 유용하다. 특정한 다른 실시양태에서, 치료적 유효량의 지질 입자(예를 들어, LNP)가 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 mRNA 분자가 LNP로 제제화되고, 입자는 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 다른 예에서, 세포기 환자로부터 제거되고, 하나 이상의 mRNA 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 LNP를 사용하여) 시험관내 전달되고, 세포가 환자에게 재주사된다.

다른 실시양태에서, mRNA 분자는 2'OMe 뉴클레오타이드, 2'F 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-MOE 뉴클레오타이드, LNA 뉴클레오타이드, 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 관련 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 마이크로RNA (miRNA) 분자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, LNP) 및 표적 유전자 발현을 침묵시키기 위해 그러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

그와 같이, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 핵산(예를 들어, siRNA, aiRNA, 및/또는 miRNA; 또는 mRNA와 같은 간섭 RNA)과 같은 활성제 또는 치료제의 대상(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)으로의 투여에서 사용하기에 유리하고 적합한데, 이들이 순환에서 안정하고, 약력학적 거동에 필요한 크기로 혈관외 부위에 접근하고, 표적 세포 집단에 도달할 수 있기 때문이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 천연 발생 염기, 당 및 당간(뼈대) 연결로 이루어진 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 단량체의 중합체 또는 소중합체를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 유사하게 기능하는 비천연 발생 단량체, 또는 이의 일부를 포함하는 중합체 또는 소중합체를 포함한다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 뉴클레이스의 존재에서 향상된 세포 흡수, 감소된 면역원성, 및 증가된 안정성과 같은 특성으로 인해 종종 천연 형태보다 선호된다.

올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보올리고뉴클레오타이드 또는 리보올리고뉴클레오타이드로 분류된다. 데옥시리보올리고뉴클레오타이드는 당의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유적으로 연결된 데옥시리보스로 지칭되는 5-탄소 당으로 구성되어 교번하는 비분지 중합체를 형성한다. 리보올리고뉴클레오타이드는 5-탄소 당이 리보스인 유사한 반복 구조로 구성된다.

본 발명에 따른 지질-핵산 입자에 존재하는 핵산은 공지된 임의의 형태의 핵산을 포함한다. 본원에서 사용된 핵산은 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 이중 가닥 DNA의 예는 본원에 설명되고, 예를 들어, 구조 유전자, 제어 및 종결 영역을 포함하는 유전자, 및 바이러스 또는 플라스미드 DNA와 같은 자가 복제 시스템을 포함한다. 이중 가닥 RNA의 예는 본원에 설명되고, 예를 들어, siRNA 및 aiRNA와 pre-miRNA와 같은 다른 RNAi 작용제를 포함한다. 단일 가닥 핵산은, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 성숙 miRNA, 및 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

핵산은, 일반적으로 핵산의 특정 형태에 따라 다양한 길이일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 플라스미드 또는 유전자는 길이가 약 1,000 내지 약 100,000 개의 뉴클레오타이드 잔기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10 내지 약 100 개의 뉴클레오타이드 범위일 수 있다. 다양한 관련 실시양태에서, 단일 가닥, 이중 가닥, 및 삼중-가닥의 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 약 20 내지 약 50 개의 뉴클레오타이드, 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드, 또는 약 20 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드 길이 범위일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 (또는 이의 가닥)는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화하거나 이에 상보적이다. 본원에서 사용된 용어 "특이적으로 혼성화 가능한" 및 "상보적"은 안정하고 특이적인 결합이 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오타이드 사이에 일어나도록 충분한 정도의 상보성을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드는 특이적으로 혼성화 가능할 표적 핵산 서열에 100% 상보적일 필요가 없음이 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 결합이 표적 서열의 정상적인 기능에 간섭하여 그로부터의 유용성 또는 발현의 손실을 야기할 때 특이적으로 혼성화 가능하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에, 즉, 생체내 분석 또는 치료적 치료의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 분석의 경우에, 분석이 수행되는 조건 하에 비표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 비특이적 결합을 방지하기 위한 충분한 정도의 상보성이 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 표적화하거나 특이적으로 혼성화하는 유전자 또는 mRNA 서열의 영역과 비교하여 1, 2, 3 또는 그 이상의 염기 치환을 포함할 수 있다.

siRNA

본 발명의 핵산-지질 입자의 siRNA 성분은 관심 표적 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있다. siRNA 듀플렉스의 각 가닥은 전형적으로 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 실시양태에서, siRNA는 최소 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 siRNA는 일반적으로 상응하는 변형되지 않은 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이고 관심 표적 유전자에 대한 RNAi 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 변형된 siRNA는 최소 하나의 2'OMe 푸린 또는 피리미딘 뉴클레오타이드, 예컨대 2'OMe-구아노신, 2'OMe-우리딘, 2'OMe-아데노신, 및/또는 2'OMe-사이토신 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드는 siRNA의 한 가닥(즉, 센스 또는 안티센스) 또는 두 가닥 모두에 존재할 수 있다. siRNA 서열은 오버행(예를 들어, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) 또는 Nyk

nen et al., Cell, 107:309 (2001)에 기재된 바와 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 없을 수 있다 (즉, 평활 말단을 갖는다).

변형된 siRNA는 일반적으로 siRNA 듀플렉스의 이중 가닥 영역에서 약 1% 내지 약 100% (예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역에서 약 25% 미만(예를 들어, 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

다른 실시양태에서, siRNA의 이중 가닥 영역에서 약 1% 내지 약 25% (예를 들어, 약 1%-25%, 2%-25%, 3%-25%, 4%-25%, 5%-25%, 6%-25%, 7%-25%, 8%-25%, 9%-25%, 10%-25%, 11%-25%, 12%-25%, 13%-25%, 14%-25%, 15%-25%, 16%-25%, 17%-25%, 18%-25%, 19%-25%, 20%-25%, 21%-25%, 22%-25%, 23%-25%, 24%-25%, 등) 또는 약 1% 내지 약 20% (예를 들어, 약 1%-20%, 2%-20%, 3%-20%, 4%-20%, 5%-20%, 6%-20%, 7%-20%, 8%-20%, 9%-20%, 10%-20%, 11%-20%, 12%-20%, 13%-20%, 14%-20%, 15%-20%, 16%-20%, 17%-20%, 18%-20%, 19%-20%, 1%-19%, 2%-19%, 3%-19%, 4%-19%, 5%-19%, 6%-19%, 7%-19%, 8%-19%, 9%-19%, 10%-19%, 11%-19%, 12%-19%, 13%-19%, 14%-19%, 15%-19%, 16%-19%, 17%-19%, 18%-19%, 1%-18%, 2%-18%, 3%-18%, 4%-18%, 5%-18%, 6%-18%, 7%-18%, 8%-18%, 9%-18%, 10%-18%, 11%-18%, 12%-18%, 13%-18%, 14%-18%, 15%-18%, 16%-18%, 17%-18%, 1%-17%, 2%-17%, 3%-17%, 4%-17%, 5%-17%, 6%-17%, 7%-17%, 8%-17%, 9%-17%, 10%-17%, 11%-17%, 12%-17%, 13%-17%, 14%-17%, 15%-17%, 16%-17%, 1%-16%, 2%-16%, 3%-16%, 4%-16%, 5%-16%, 6%-16%, 7%-16%, 8%-16%, 9%-16%, 10%-16%, 11%-16%, 12%-16%, 13%-16%, 14%-16%, 15%-16%, 1%-15%, 2%-15%, 3%-15%, 4%-15%, 5%-15%, 6%-15%, 7%-15%, 8%-15%, 9%-15%, 10%-15%, 11%-15%, 12%-15%, 13%-15%, 14%-15%, 등)의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 예를 들어, siRNA의 하나 또는 두 가닥이 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드에서 선택적으로 변형되는 경우, 결과적인 변형된 siRNA는 약 30% 미만의 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 약 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 변형된 뉴클레오타이드) 또는 약 1% 내지 약 30% 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 약 1%-30%, 2%-30%, 3%-30%, 4%-30%, 5%-30%, 6%-30%, 7%-30%, 8%-30%, 9%-30%, 10%-30%, 11%-30%, 12%-30%, 13%-30%, 14%-30%, 15%-30%, 16%-30%, 17%-30%, 18%-30%, 19%-30%, 20%-30%, 21%-30%, 22%-30%, 23%-30%, 24%-30%, 25%-30%, 26%-30%, 27%-30%, 28%-30%, 또는 29%-30% 변형된 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.

siRNA 서열의 선택

적합한 siRNA 서열은 당해 분야에 공지인 임의의 수단을 사용하여 확인될 수 있다. 전형적으로, Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001) 및 Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)에 설명된 방법이 Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004)에 제시된 합리적인 설계 규칙과 조합된다.

일반적으로, 관심 표적 유전자로부터의 전사물의 AUG 시작 코돈의 뉴클레오타이드 서열 3'은 디뉴클레오타이드 서열(예를 들어, AA, NA, CC, GG, 또는 UU, 여기서 N=C, G, 또는 U)에 대해 스캐닝된다 (예를 들어, Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001) 참조). 디뉴클레오타이드 서열에 대해 바로 옆의 3'인 뉴클레오타이드는 잠재적인 siRNA 서열(즉, 표적 서열 또는 센스 가닥 서열)로 확인된다. 전형적으로, 디뉴클레오타이드 서열에 대해 바로 옆의 3'인 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 잠재적인 siRNA 서열로 확인된다. 일부 실시양태에서, 디뉴클레오타이드 서열은 AA 또는 NA 서열이고 AA 또는 NA 디뉴클레오타이드에 대해 바로 옆의 3'인 19 개의 뉴클레오타이드가 잠재적인 siRNA 서열로 확인된다. siRNA 서열은 일반적으로 표적 유전자의 길이를 따라 서로 상이한 위치에 배치된다. siRNA 서열의 침묵 효율을 추가로 향상시키기 위해, 예를 들어, 표적 세포 또는 유기체에서 다른 코딩 서열에 대한 상동성의 영역을 포함하지 않는 부위를 확인하기 위해 잠재적인 siRNA 서열이 분석될 수 있다. 예를 들어, 약 21 개의 염기쌍의 적합한 siRNA 서열은 전형적으로 표적 세포 또는 유기체에서 코딩 서열에 대해 16-17 개 이하의 인접 염기쌍의 상동성을 갖지 않을 것이다. siRNA 서열이 RNA Pol III 프로모터로부터 발현되어야 하는 경우, 4 개 초과의 인접 A' 또는 T'가 없는 siRNA 서열이 선택된다.

잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 상보적 서열(즉, 안티센스 가닥 서열)이 설계될 수 있다. 잠재적인 siRNA 서열은 또한 당해 분야에 공지인 다양한 기준을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 침묵 효율을 향상시키기 위해, siRNA 서열은 다음 특징 중 하나 이상을 갖는 서열을 확인하기 위해 합리적인 설계 알고리즘에 의해 분석될 수 있다: (1) 약 25% 내지 약 60% G/C의 G/C 함량; (2) 센스 가닥의 위치 15-19의 최소 3 개의 A/U; (3) 내부 반복 없음; (4) 센스 가닥의 위치 19의 A; (5) 센스 가닥의 위치 3의 A; (6) 센스 가닥의 위치 10의 U; (7) 센스 가닥의 위치 19에서 G/C 없음; 및 (8) 센스 가닥의 위치 13에서 G 없음. 이들 특징 각각의 적절한 값을 할당하고 siRNA의 선택에 유용한 알고리즘을 통합하는 siRNA 설계 도구는, 예를 들어, http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA에서 찾을 수 있다. 당업자는 전술한 특징 중 하나 이상을 갖는 서열이 추가의 분석 및 테스트를 위해 잠재적인 siRNA 서열로서 선택될 수 있음을 이해할 것이다.

추가적으로, 다음 기준 중 하나 이상을 갖는 잠재적인 siRNA 서열은 흔히 siRNA로서 제거될 수 있다: (1) 연속된 동일한 염기의 4 개 이상의 스트레치를 포함하는 서열; (2) Gs의 동종중합체를 포함하는 서열 (즉, 이들 중합체의 구조적 특징으로 인해 가능한 비-특이적 효과를 감소시키기 위해; (3) 삼중 염기 모티프(예를 들어, GGG, CCC, AAA, 또는 TTT)를 포함하는 서열; (4) 연속된 7 개 이상의 G/Cs의 스트레치를 포함하는 서열; 및 (5) 내부 폴드-백 구조를 생성하는 후보 내의 4 개 이상의 염기의 직접 반복을 포함하는 서열. 그러나, 당업자는 전술한 특징 중 하나 이상을 갖는 서열이 추가의 분석 및 테스트를 위해 잠재적인 siRNA 서열로서 여전히 선택될 수 있음을 이해할 것이다.

일부 실시양태에서, 잠재적인 siRNA 서열은, 예를 들어, Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); 및 Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003)에 설명된 바와 같은 siRNA 듀플렉스 비대칭성에 기초하여 추가로 분석될 수 있다. 다른 실시양태에서, 잠재적인 siRNA 서열은 예를 들어, Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004)에 설명된 바와 같이 표적 부위에서 이차 구조에 기초하여 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 표적 부위의 이차 구조는 더 적은 염기-쌍 및 스템-루프 형태의 이차 구조가 존재하는 표적 부위에서 접근성을 선호하는 siRNA 서열을 선택하기 위해 Mfold 알고리즘(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi에서 입수 가능)을 사용하여 모델링될 수 있다.

잠재적인 siRNA 서열이 확인되면, 서열은 예를 들어, 시험관내 사이토카인 분석 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 임의의 면역자극 특성의 존재에 대해 분석될 수 있다. siRNA 서열의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 모티프, 예컨대 GU-농후 모티프(예를 들어, 5'-GU-3',5'-UGU-3',5'-GUGU-3',5'-UGUGU-3', 등)는 또한 서열이 면역자극성일 수 있는지 여부에 대한 표시를 제공할 수 있다. siRNA 분자가 면역자극성인 것으로 밝혀지면, 본원에 설명된 바와 같이 면역자극 특성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 비제한적 예로서, siRNA 서열은 siRNA가 면역자극성 또는 비면역자극성 siRNA인지 여부를 결정하기 위해 세포가 검출 가능한 면역 반응을 생성하는 조건 하에 포유동물 응답자 세포와 접촉될 수 있다. 포유동물 응답자 세포는 나이브 포유동물(즉, 이전에 siRNA 서열의 유전자 산물과 접촉한 적이 없는 포유동물)로부터 유래할 수 있다. 포유동물 응답자 세포는, 예를 들어, 말초혈액 단핵세포(PBMC), 대식세포 등일 수 있다. 검출 가능한 면역 반응은 예를 들어, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12, 또는 이들의 조합과 같은 사이토카인 또는 성장 인자의 생성을 포함할 수 있다. 면역자극성으로 확인된 siRNA 분자는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 변형된 뉴클레오타이드로 대체함으로써 면역자극 특성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, siRNA 듀플렉스의 이중 가닥 영역에서 약 30% 미만(예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만)의 뉴클레오타이드가 2'OMe 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 이후 변형된 siRNA는 면역자극 특성이 감소 또는 폐기되었음을 확인하기 위해 전술한 바와 같이 포유동물 응답자 세포와 접촉될 수 있다.

면역 반응 검출에 적합한 시험관내 분석은 David et al. (미국 특허 번호 4,376,110)의 이중 단일클론 항체 샌드위치 면역분석 기술; 단일클론-다중클론 항체 샌드위치 분석 (Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)); Gordon et al. (미국 특허 번호 4,452,901)의 "웨스턴 블랏" 방법; 표지된 리간드의 면역침전 (Brown et al., J. Biol. Chem., 255:4980-4983 (1980)); 예를 들어, Raines et al., J. Biol. Chem., 257:5154-5160 (1982)에 의해 설명된 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA); 형광색소의 사용을 포함하는, 면역세포화학적 기술 (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); 및 활성의 중화 (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전술한 면역분석에 추가하여, 미국 특허 번호 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876에 설명된 것을 포함하여 다수의 다른 면역분석이 이용 가능하다. 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

면역 반응 검출을 위한 생체내 모델의 비제한적 예는, 예를 들어, Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006)에 설명된 바와 같은 생체내 마우스 사이토카인 유도 분석을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수행될 수 있는 분석은 다음과 같다: (1) siRNA는 측면 꼬리 정맥에서 표준 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다; (2) 혈액은 투여 후 약 6 시간에 심장 천자에 의해 수집될 수 있고 사이토카인 분석을 위해 혈장으로서 가공될 수 있다; 및 (3) 사이토카인은 제조업체의 지시에 따라 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 정량화될 수 있다 (예를 들어, 마우스 및 인간 IFN-α (PBL Biomedical; Piscataway, N.J.); 인간 IL-6 및 TNF-α (eBioscience; San Diego, Calif.); 및 마우스 IL-6, TNF-α, 및 IFN-γ (BD Biosciences; San Diego, Calif.)).

사이토카인 및 성장 인자에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 다중 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하고 당해 분야에 공지인 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) 및 Harlow and Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999) 참조). 단일클론 항체의 생성은 이전에 설명되었고 당해 분야에 공지인 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다 (Buhring et al., in Hybridoma, Vol. 10, No. 1, pp. 77-78 (1991)). 일부 방법에서, 단일클론 항체는 검출을 용이하게 하기 위해 (예를 들어, 분광학, 광화학, 생화학, 전기, 광학, 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 조성물을 사용하여) 표지된다.

siRNA 분자 생성

siRNA는, 예를 들어, 하나 이상의 단리된 소형-간섭 RNA (siRNA) 듀플렉스, 더 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 DNA 플라스미드에서 전사 카세트로부터 전사된 siRNA 또는 dsRNA를 포함하는 여러 형태로 제공될 수 있다. siRNA 서열은 오버행(예를 들어, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) 또는 Nyk

nen et al., Cell, 107:309 (2001)에 기재된 바와 같은 3' 또는 5' 오버행)을 가질 수 있거나, 오버행이 없을 수 있다 (즉, 평활 말단을 갖는다).

RNA 집단이 긴 전구체 RNA를 제공하기 위해 사용될 수 있거나, 선택된 표적 서열에 대해 실질적 또는 완전한 동일성을 갖는 긴 전구체 RNA가 siRNA를 만들기 위해 사용될 수 있다. RNA는 당업자에게 공지인 방법에 따라 세포 또는 조직으로부터 단리되고, 합성되고, 및/또는 클로닝될 수 있다. RNA는 혼합된 집단일 수 있고 (세포 또는 조직으로부터 수득, cDNA로부터 전사, 감산, 선택 등) 또는 단일 표적 서열을 나타낼 수 있다. RNA는 자연 발생되거나 (예를 들어, 조직 또는 세포 샘플로부터 단리), 시험관내 합성되거나 (예를 들어, T7 또는 SP6 폴리머레이스 및 PCR 산물 또는 클로닝된 cDNA 사용), 화학적으로 합성될 수 있다.

긴 dsRNA를 형성하기 위해, 합성 RNA의 경우, 보체가 또한 시험관내에서 전사되고 혼성화되어 dsRNA를 형성한다. 자연 발생 RNA 집단이 사용되는 경우, 예를 들어, RNA 집단에 상응하는 cDNAs 전사에 의해, 또는 RNA 폴리머레이스 사용에 의해 (예를 들어, E. coli RNAse III 또는 Dicer에 의한 분해를 위한 dsRNA를 형성하기 위해) RNA 보체가 또한 제공된다. 이후 전구체 RNA는 혼성화되어 분해를 위한 이중 가닥 RNA를 형성한다. dsRNA는 대상에게 직접 투여될 수 있거나 투여 전에 시험관내 분해될 수 있다.

RNA 단리, RNA 합성, 핵산 혼성화, cDNA 라이브러리 제조 및 스크리닝, 및 PCR 수행 방법은 당해 분야에 공지이고 (예를 들어, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra 참조), PCR 방법도 마찬가지이다 (미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) 참조). 발현 라이브러리는 또한 당업자에게 공지이다. 본 발명에서 일반적인 사용 방법을 공개하는 추가적인 기본 문서는 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)를 포함한다. 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

바람직하게는, siRNA는 화학적으로 합성된다. 본 발명의 siRNA 분자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997)에 설명된 것과 같은 당해 분야에 공지인 임의의 다양한 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 합성은 일반적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단에서 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서 포스포라미다이트를 사용한다. 비제한적 예로서, 소규모 합성이 0.2 μmol 규모 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems 합성기에서 수행될 수 있다. 대안으로, 0.2 μmol 규모의 합성이 Protogene (Palo Alto, Calif.)의 96-웰 플레이트 합성기에서 수행될 수 있다. 그러나, 더 크거나 더 작은 규모의 합성도 본 발명의 범위 내에 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성에 적합한 시약, RNA 탈보호 방법, 및 RNA 정제 방법은 당업자에게 공지이다.

siRNA 분자는 또한 탠덤 합성 기술을 통해 합성될 수 있고, 여기서 두 가닥이 절단 가능한 링커에 의해 분리된 단일 연속 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 가닥으로서 합성되고, 이는 후속적으로 절단되어 별개의 단편 또는 가닥을 제공하고 이는 혼성화되어 siRNA 듀플렉스를 형성한다. 링커는 폴리뉴클레오타이드 링커 또는 비-뉴클레오타이드 링커일 수 있다. siRNA의 탠덤 합성은 멀티웰/멀티플레이트 합성 플랫폼뿐만 아니라 회분 반응기, 합성 컬럼 등을 사용하는 대규모 합성 플랫폼 모두에 쉽게 개조될 수 있다. 대안으로, siRNA 분자는 두 가지의 별개의 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있고, 여기서 한 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥을 포함하고 다른 것은 siRNA의 안티센스 가닥을 포함한다. 예를 들어, 각 가닥은 개별적으로 합성될 수 있고 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화 또는 결찰에 의해 함께 결합될 수 있다. 특정한 다른 예에서, siRNA 분자는 단일 연속 올리고뉴클레오타이드 단편으로서 합성될 수 있고, 여기서 자기상보적 센스 및 안티센스 영역이 혼성화하여 헤어핀 이차 구조를 갖는 siRNA 듀플렉스를 형성한다.

siRNA 서열 변형

특정 양태에서, siRNA 분자는 두 개의 가닥을 갖는 듀플렉스 및 이중 가닥 영역에서 최소 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 각 가닥은 약 15 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 유리하게는, 변형된 siRNA는 상응하는 변형되지 않은 siRNA 서열보다 덜 면역자극성이지만, 표적 서열의 발현을 침묵시키는 능력을 유지한다. 바람직한 실시양태에서, siRNA 분자에 도입된 화학적 변형의 정도는 siRNA의 면역자극 특성의 감소 또는 폐기 및 RNAi 활성의 유지 사이에 균형을 이룬다. 비제한적 예로서, 관심 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 siRNA 듀플렉스 내의 선택적 우리딘 및/또는 구아노신 뉴클레오타이드에서 최소한으로 변형되어 (예를 들어, 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만 변형) 표적 유전자 발현을 침묵시키는 능력을 유지하면서 siRNA에 의해 생성된 면역 반응을 제거할 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 변형된 뉴클레오타이드의 예는 2'-O-메틸 (2'OMe), 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F), 2'-데옥시, 5-C-메틸, 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE), 4'-티오, 2'-아미노, 또는 2'-C-알릴 기를 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984)에 설명된 것과 같은 노던 형태(Northern conformation)를 갖는 변형된 뉴클레오타이드가 또한 siRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 그러한 변형된 뉴클레오타이드는, 제한 없이, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오타이드 (예를 들어, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오타이드), 2'-O-(2-메톡시에틸) (MOE) 뉴클레오타이드, 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'F) 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-클로로 (2'Cl) 뉴클레오타이드, 및 2'-아지도 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 예에서, 본원에 기재된 siRNA 분자는 하나 이상의 G-클램프 뉴클레오타이드를 포함한다. G-클램프 뉴클레오타이드는 변형이 듀플렉스 내의 상보적 구아닌 뉴클레오타이드의 왓슨-크릭 및 후그스틴 면 모두에 수소 결합하는 능력을 부여하는 변형된 사이토신 유사체를 지칭한다 (예를 들어, Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:8531-8532 (1998) 참조). 또한, 예를 들어, C-페닐, C-나프틸, 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복사미드, 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 및 6-니트로인돌과 같은 뉴클레오타이드 염기 유사체를 갖는 뉴클레오타이드가 (예를 들어, Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001) 참조) siRNA 분자에 혼입될 수 있다.

특정 실시양태에서, siRNA 분자는 말단 캡 모이어티, 포스페이트 뼈대 변형 등과 같은 하나 이상의 화학적 변형을 추가로 포함할 수 있다. 말단 캡 모이어티의 예는, 제한 없이, 역전 데옥시 무염기 잔기, 글리세릴 변형, 4',5'-메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(β-D-에리스로푸라노실) 뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카르보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, α-뉴클레오타이드, 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오타이드, 비환형 3',4'-세코 뉴클레오타이드, 비환형 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 비환형 3,5-디하이드록시펜틸뉴클레오타이드, 3'-3'-역전 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-3'-역전 무염기 모이어티, 3'-2'-역전 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-2'-역전 무염기 모이어티, 5'-5'-역전 뉴클레오타이드 모이어티, 5'-5'-역전 무염기 모이어티, 3'-5'-역전 데옥시 무염기 모이어티, 5'-아미노-알킬 포스페이트, 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트, 6-아미노헥실 포스페이트, 1,2-아미노도데실 포스페이트, 하이드록시프로필 포스페이트, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포라미데이트, 5'-포스포라미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 5'-아미노, 3'-포스포로티오에이트, 5'-포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및 가교 또느 비가교 메틸포스포네이트 또는 5'-머캅토 모이어티를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,998,203; Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993) 참조). 포스페이트 뼈대 변형(즉, 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 생성함)의 비제한적 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트, 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 설포네이트, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 및 알킬실릴 치환을 포함한다 (예를 들어, Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994) 참조). 그러한 화학적 변형은 siRNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두의 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 일어날 수 있다. 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, siRNA 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 4 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4) 개의 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드를 갖는 3'-말단 오버행 및/또는 변형 및 비변형 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드 및 siRNA 분자에 도입될 수 있는 화학적 변형의 유형의 추가 예는, 예를 들어, 영국 특허 번호 GB 2,397,818 B 및 미국 특허 공개 번호 20040192626, 20050282188, 및 20070135372에 설명되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 siRNA 분자는 siRNA의 하나 또는 두 가닥에서 하나 이상의 비-뉴클레오타이드를 임의로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "비-뉴클레오타이드"는 당 및/또는 포스페이트 치환을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위 대신 핵산 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 그룹 또는 화합물을 지칭하고, 나머지여 염기가 활성을 나타내도록 한다. 그룹 또는 화합물은 아데노신, 구아닌, 사이토신, 우라실, 또는 티민과 같은 일반적으로 인식되는 뉴클레오타이드 염기를 포함하지 않으므로 l'-위치에 염기가 없다는 점에서 무염기이다.

다른 실시양태에서, siRNA의 화학적 변형은 접합체를 siRNA 분자에 부착하는 것을 포함한다. 접합체는 예를 들어, 생분해성 링커와 같은 공유적 부착을 통해 siRNA의 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및/또는 3'-말단에 부착될 수 있다. 접합체는 또한 예를 들어 카르바메이트 기 또는 다른 연결 기를 통해 siRNA에 부착될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20050074771, 20050043219 및 20050158727 참조). 특정 예에서, 접합체는 세포로 siRNA의 전달을 용이하게 하는 분자이다. siRNA에 대한 부착에 적합한 접합체 분자의 예는, 제한 없이, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 글리콜, 인간 혈청 알부민 (HSA), 지방산, 카로테노이드, 테르펜, 담즙산, 폴레이트 (예를 들어, 폴산, 폴레이트 유사체 및 이의 유도체), 당 (예를 들어, 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸 갈락토사민, 글루코스, 만노스, 프룩토스, 푸코스, 등), 인지질, 펩타이드, 세포 흡수를 매개할 수 있는 세포 수용체를 위한 리간드, 및 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030130186, 20040110296, 및 20040249178; 미국 특허 번호 6,753,423 참조). 다른 예는 미국 특허 공개 번호 20050119470 및 20050107325에 기재된 친유성 모이어티, 비타민, 고분자, 펩타이드, 단백질, 핵산, 소분자, 올리고당, 탄수화물 클러스터, 인터칼레이터, 마이너 그루브 바인더, 절단제 및 가교제 접합체 분자를 포함한다. 또 다른 예는 미국 특허 공개 번호 20050153337에 기재된 2'-O-알킬 아민, 2'-β-알콕시알킬 아민, 폴리아민, C5-양이온성 변형된 피리미딘, 양이온성 펩타이드, 구아니디늄 기, 아미디니늄 기, 양이온성 아미노산 접합체 분자를 포함한다. 추가의 예는 미국 특허 공개 번호 20040167090에 기재된 소수성 기, 막 활성 화합물, 세포 침투 화합물, 세포 표적화 신호, 상호작용 조절제, 및 입체 안정화제 접합체 분자를 포함한다. 추가의 예는 미국 특허 공개 번호 제20050239739호에 기재된 접합체 분자를 포함한다. 사용된 접합체의 유형 및 siRNA 분자에 대한 접합 정도는 RNAi 활성을 유지하면서 siRNA의 개선된 약동학적 프로파일, 생체이용률, 및/또는 안정성에 대해 평가될 수 있다. 그와 같이, 당업자는 임의의 다양한 공지 시험관내 세포 배양 또는 생체내 동물 모델을 사용하여 개선된 특성 및 완전한 RNAi 활성을 갖는 것을 식별하기 위해 부착된 다양한 접합체를 갖는 siRNA 분자를 선별할 수 있다. 전술한 특허 문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

표적 유전자

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산-지질 입자의 핵산 성분(예를 들어, siRNA)은 관심 유전자의 번역(즉, 발현)을 하향조절하거나 침묵시키기 위해 사용될 수 있다. 관심 유전자는 바이러스 감염 및 생존과 관련된 유전자, 대사 질환 및 장애(예를 들어, 간 질환 및 장애)와 관련된 유전자, 종양형성 및 세포 변환(예를 들어, 암)과 관련된 유전자, 혈관신생 유전자, 염증 및 자가면역 반응과 관련된 것과 같은 면역조절 유전자, 리간드 수용체 유전자, 및 신경퇴행성 장애와 관련된 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 관심 유전자는 간세포에서 발현된다.

바이러스 감염 및 생존과 관련된 유전자는 세포에 결합, 진입, 및 복제하기 위해 바이러스에 의해 발현되는 것을 포함한다. 특히 관심있는 것은 만성 바이러스 질환과 관련된 바이러스 서열이다. 특정 관심 바이러스 서열은 에볼라 바이러스 및 마버그 바이러스와 같은 필로바이러스의 서열 (예를 들어, Geisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006) 참조); 라싸 바이러스, 주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 과나리토 바이러스, 및 사비아 바이러스와 같은 아레나바이러스 (Buchmeier et al., Arenaviridae: the viruses and their replication, In: FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); 인플루엔자 A, B, 및 C 바이러스와 같은 인플루엔자 바이러스, (예를 들어, Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); 및 Neumann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002) 참조); 간염 바이러스 (예를 들어, Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); 및 FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001) 참조); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) (Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)); 헤르페스 바이러스 (Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)); 및 인간 유두종 바이러스 (HPV) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002))을 포함한다.

침묵될 수 있는 예시적인 필로바이러스 핵산 서열은 구조적 단백질 (예를 들어, VP30, VP35, 핵단백질 (NP), 폴리머레이스 단백질 (L-pol)) 및 막-연관 단백질 (예를 들어, VP40, 당단백질 (GP), VP24)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에볼라 바이러스에 대한 완전한 유전체 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-002549; AY769362; NC_-006432; NC_-004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101; AF272001; 및 AF086833에 제시된다. 에볼라 바이러스 VP24 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 U77385 및 AY058897에 제시된다. 에볼라 바이러스 L-pol 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 X67110에 제시된다. 에볼라 바이러스 VP40 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AY058896에 제시된다. 에볼라 바이러스 NP 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AY058895에 제시된다. 에볼라 바이러스 GP 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AY058898; Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992); 및 미국 특허 번호 6,713,069에 제시된다. 추가 에볼라 바이러스 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 L11365 및 X61274에 제시된다. 마버그 바이러스에 대한 완전한 유전체 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-001608; AY430365; AY430366; 및 AY358025에 제시된다. 마버그 바이러스 GP 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AF005734; AF005733; 및 AF005732에 제시된다. 마버그 바이러스 VP35 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AF005731 및 AF005730에 제시된다. 추가 마버그 바이러스 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 X64406; Z29337; AF005735; 및 Z12132에 제시된다. 에볼라 바이러스 및 마버그 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 미국 특허 공개 번호 제20070135370호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

침묵될 수 있는 예시적인 인플루엔자 바이러스 핵산 서열은 핵단백질(NP), 매트릭스 단백질(M1 및 M2), 비구조 단백질(NS1 및 NS2), RNA 폴리머레이스(PA, PB1, PB2), 뉴라미니데이스(NA), 및 헤마글루티닌(HA)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인플루엔자 A NP 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; 및 AY818140에 제시된다. 인플루엔자 A PA 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 AY818132; AY790280; AY646171; AY818132; AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; 및 AY724786에 제시된다. 인플루엔자 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 미국 특허 공개 번호 제20070218122호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

침묵될 수 있는 예시적인 간염 바이러스 핵산 서열은 전사 및 번역에 관련된 핵산 서열 (예를 들어, En1, En2, X, P) 및 구조적 단백질 (예를 들어, C 및 C-관련 단백질을 포함하는 코어 단백질, S, M, 및/또는 L 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는 캡시드 및 외피 단백질)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 상기 FIELDS VIROLOGY 참조). 침묵될 수 있는 예시적인 간염 C 바이러스 (HCV) 핵산 서열은, 5'-비번역 영역 (5'-UTR), 3'-비번역 영역 (3'-UTR), 폴리단백질 번역 개시 코돈 영역, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열, 및/또는 코어 단백질, E1 단백질, E2 단백질, p7 단백질, NS2 단백질, NS3 프로테이스/헬리케이스, NS4A 단백질, NS4B 단백질, NS5A 단백질, 및/또는 NS5B RNA-의존성 RNA 폴리머레이스를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. HCV 유전체 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-004102 (HCV 유전자형 1a), AJ238799 (HCV 유전자형 1b), NC_-009823 (HCV 유전자형 2), NC_-009824 (HCV 유전자형 3), NC_-009825 (HCV 유전자형 4), NC_-009826 (HCV 유전자형 5), 및 NC_-009827 (HCV 유전자형 6)에 제시된다. 간염 A 바이러스 핵산 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-001489에 제시되고; 간염 B 바이러스 핵산 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-003977에 제시되고; 간염 D 바이러스 핵산 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-001653에 제시되고; 간염 E 바이러스 핵산 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-001434에 제시되고; 간염 G 바이러스 핵산 서열은, 예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NC_-001710에 제시된다. 바이러스 감염 및 생존과 관련된 유전자를 인코딩하는 서열의 침묵은 바이러스 병태를 치료하기 위해 사용되는 통상적인 제제의 투여와 조합으로 편리하게 사용될 수 있다. 간염 바이러스 핵산 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 미국 특허 공개 번호 제20060281175호, 제20050058982호, 및 제20070149470호; 미국 특허 제7,348,314호; 및 2009년 3월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/162,127호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

대사 질환 및 장애(예를 들어, 간이 표적인 장애 및 간 질환 및 장애)와 관련된 유전자는, 예를 들어, 이상지질혈증 (예를 들어, LXRα 및 LXRβ와 같은 간 X 수용체 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-007121), 파르네소이드 X 수용체 (FXR) (젠뱅크 수탁 번호 NM_-005123), 스테롤-조절 요소 결합 단백질 (SREBP), 사이트-1 프로테이스 (SIP), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소-A 리덕테이스 (HMG 조효소-A 리덕테이스), 아포지질단백질 B (ApoB) (젠뱅크 수탁 번호 NM_-000384), 아포지질단백질 CIII (ApoC3) (젠뱅크 수탁 번호 NM_-000040 및 NG_-008949 영역: 5001.8164), 및 아포지질단백질 E (ApoE) (젠뱅크 수탁 번호 NM_-000041 및 NG_-007084 영역: 5001.8612)); 및 당뇨병에서 발현되는 유전자를 포함한다 (예를 들어, 글루코스6-포스파테이스) (예를 들어, Forman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J. Biol. Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); 및 Peet et al., Cell, 93:693-704 (1998) 참조). 당업자는 대사 질환 및 장애(예를 들어, 간이 표적인 질환 및 장애 및 간 질환 및 장애)와 관련된 유전자가 간 자체에서 발현되는 유전자 및 다른 기관 및 조직에서 발현되는 유전자를 포함함을 인식할 것이다. 대사성 질환 및 장애와 관련된 관련된 유전자를 인코딩하는 서열의 침묵은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 통상적인 제제의 투여와 조합으로 편리하게 사용될 수 있다. ApoB 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 미국 특허 공개 번호 제20060134189호게 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. ApoC3 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 2009년 1월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/147,235호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

종양형성 및 세포 변환(예를 들어, 암 또는 기타 신생물)과 관련된 유전자 서열의 예는 Eg5와 같은 유사분열 키네신 (KSP, KIF11; 젠뱅크 수탁 번호 NM_-004523); 폴로-유사 카이네이스 1 (PLK-1)과 같은 세린/트레오닌 카이네이스 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-005030; Barr et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 5:429-440 (2004)); WEE1과 같은 티로신 카이네이스 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-003390 및 NM_-001143976); XIAP와 같은 세포자멸 억제제 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-001167); CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5와 같은 COP9 시그날로솜 서브유닛 (JAB1; 젠뱅크 수탁 번호 NM_-006837); CSN6, CSN7A, CSN7B, 및 CSN8; COP1과 같은 유비퀴틴 리게이스 (RFWD2; 젠뱅크 수탁 번호 NM_-022457 및 NM_-001001740); 및 HDAC1, HDAC2와 같은 히스톤 디아세틸레이스 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, 등을 포함한다. Eg5 및 XIAP 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 2007년 3월 29일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제11/807,872호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. PLK-1 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 미국 특허 공개 번호 20050107316 및 20070265438; 및 2008년 12월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 12/343,342에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. CSN5 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 2008년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/045,251호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

종양형성 및 세포 변환과 관련된 유전자 서열의 추가 예는 MLL 융합 유전자, BCR-ABL와 같은 전위 서열 (Wilda et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr et al., Blood, 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO, 및 AML1-MTG8 (Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)); 다제 내성 유전자와 같은 과발현된 서열 (Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al, Cancer Res. 63:1515 (2003)), 사이클린 (Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)), 베타-카테닌 (Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)), 텔로머레이스 유전자 (Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, 성장 인자 수용체 (예를 들어, EGFR/ErbB1 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-005228, NM_-201282, NM_-201283, 및 NM_-201284; 또한 Nagy et al. Exp. Cell Res., 285:39-49 (2003) 참조, ErbB2/HER-2 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-004448 및 NM_-001005862), ErbB3 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-001982 및 NM_-001005915), 및 ErbB4 (젠뱅크 수탁 번호 NM_-005235 및 NM_-001042599); 및 RAS와 같은 돌연변이 서열 (Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)에서 검토됨)을 포함한다. EGFR 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자의 비제한적 예는 2007년 3월 29일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제11/807,872호에 기재된 것을 포함하고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

DNA 복구 효소를 인코딩하는 서열의 침묵은 화학요법제의 투여와 조합으로 사용된다 (Collis et al., Cancer Res., 63:1550 (2003)). 종양 이동과 관련된 단백질을 인코딩하는 유전자는 또한 관심 표적 서열이고, 예를 들어, 인테그린, 셀렉틴, 및 메탈로프로테네이스이다. 전술한 예는 배타적이지 않다. 당업자는 종양형성 또는 세포 변환, 종양 성장, 또는 종양 이동을 용이하게 하거나 촉진하는 임의의 전체 또는 부분 유전자 서열이 주형 서열로서 포함될 수 있음을 이해할 것이다.

혈관신생 유전자는 새로운 혈관의 형성을 촉진할 수 있다. 특히 관심있는 것은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)) 또는 VEGFR이다. VEGFR을 표적으로 하는 siRNA 서열은, 예를 들어, GB 2396864; 미국 특허 공개 번호 20040142895; 및 CA 2456444에 제시되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

항-혈관신생 유전자는 혈관신생을 억제할 수 있다. 이들 유전자는 혈관신생이 질환의 병리학적 발달에서 역할을 하는 암 치료에 특히 유용하다. 항-혈관신생 유전자의 예는 엔도스타틴 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,174,861 참조), 안지오스타틴 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,639,725 참조), 및 VEGFR2 (예를 들어, Decaussin et al., J. Pathol., 188: 369-377 (1999) 참조)포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

면역조절 유전자는 하나 이상의 면역 반응을 조절하는 유전자이다. 면역조절 유전자의 예는, 제한 없이, 성장 인자와 같은 사이토카인 (예를 들어, TGF-α, TGF-β, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, 등), 인터루킨 (예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill et al., J. Immunol., 171:691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, 등), 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 등) 및 TNF를 포함한다. Fas 및 Fas 리간드 유전자는 또한 관심 면역조절 표적 서열이다 (Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)). 조혈 및 림프계 세포에서 이차 신호전달 분자를 인코팅하는 유전자가 또한 본 발명에 포함되고, 예를 들어, 브루톤 티로신 카이네이스(Btk)와 같은 Tec 패밀리 카이네이스이다 (Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002)).

세포 수용체 리간드는 세포 표면 수용체 (예를 들어, 인슐린 수용체, EPO 수용체, G-단백질 커플링된 수용체, 티로신 카이네이스 활성이 있는 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 등)에 결합하여 수용체가 관여하는 생리적 경로(예를 들어, 글루코스 수준 조절, 혈액 세포 발달, 유사분열생식 등)를 조절(예를 들어, 억제, 활성화 등)할 수 있는 리간드를 포함한다. 세포 수용체 리간드의 예는 사이토카인, 성장 인자, 인터루킨, 인터페론, 에리스로포이에틴(EPO), 인슐린, 글루카곤, G-단백질 결합 수용체 리간드, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트리뉴클레오타이드 반복(예를 들어, CAG 반복)의 확장을 코딩하는 주형은 척수구근 근위축증 및 헌팅턴병과 같은, 트리뉴클레오타이드 반복의 확장에 의해 야기되는 신형퇴행성 장애에서 병원성 서열 침묵에서 사용된다 (Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)).

유전자의 발현을 하향조절하거나 침묵시키기 위해 핵산에 의해 (예를 들어, siRNA에 의해) 표적화될 수 있는 특정한 다른 표적 유전자는 액틴, 알파 2, 평활근, 대동맥 (ACTA2), 알코올 디하이드로제네이스 1A (ADH1A), 알코올 디하이드로제네이스 4 (ADH4), 알코올 디하이드로제네이스 6 (ADH6), 아파민 (AFM), 안지오텐시노겐 (AGT), 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼레이스 (AGXT), 알파-2-HS-당단백질 (AHSG), 알도-케토 리덕테이스 패밀리 1 멤버 C4 (AKR1C4), 혈청 알부민 (ALB), 알파-1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체 (AMBP), 안지오포이에틴-관련 단백질 3 (ANGPTL3), 혈청 아밀로이드 P-성분 (APCS), 아포지질단백질 A-II (APOA2), 아포지질단백질 B-100 (APOB), 아포지질단백질 C3 (APOC3), 아포지질단백질 C-IV (APOC4), 아포지질단백질 F (APOF), 베타-2-당단백질 1 (APOH), 아쿠아포린-9 (AQP9), 담즙산-CoA:아미노산 N-아실트랜스퍼레이스 (BAAT), C4b-결합 단백질 베타 사슬 (C4BPB), LINC01554 (C5orf27)에 의해 인코딩된 추정상의 비특성화 단백질, 보체 인자 3 (C3), 보체 인자 5 (C5), 보체 성분 C6 (C6), 보체 성분 C8 알파 사슬 (C8A), 보체 성분 C8 베타 사슬 (C8B), 보체 성분 C8 감마 사슬 (C8G), 보체 성분 C9 (C9), 칼모둘린 결합 전사 활성인자 1 (CAMTA1), CD38 (CD38), 보체 인자 B (CFB), 보체 인자 H-관련 단백질 1 (CFHR1), 보체 인자 H-관련 단백질 2 (CFHR2), 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3), 칸나비노이드 수용체 1 (CNR1), 세룰로플라스민 (CP), 카르복시펩티데이스 B2 (CPB2), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), C-X-C 모티프 케모킨 2 (CXCL2), 사이토크롬 P450 1A2 (CYP1A2), 사이토크롬 P450 2A6 (CYP2A6), 사이토크롬 P450 2C8 (CYP2C8), 사이토크롬 P450 2C9 (CYP2C9), 사이토크롬 P450 패밀리 2 서브패밀리 D 멤버6 (CYP2D6), 사이토크롬 P450 2E1 (CYP2E1), 필로퀴논 오메가-하이드록실레이스 CYP4F2 (CYP4F2), 7-알파-하이드록시콜레스트-4-엔-3-온 12-알파-하이드록실레이스 (CYP8B1), 디펩티딜 펩티데이스 4 (DPP4), 응고 인자 12 (F12), 응고 인자 II (트롬빈) (F2), 응고 인자 IX (F9), 피브리노겐 알파 사슬 (FGA), 피브리노겐 베타 사슬 (FGB), 피브리노겐 감마 사슬 (FGG), 피브리노겐-유사 1 (FGL1), 플라빈 함유 모노옥시게네이스 3 (FMO3), 플라빈 함유 모노옥시게네이스 5 (FMO5), 그룹-특이적 성분 (비타민 D 결합 단백질) (GC), 성장 호르몬 수용체 (GHR), 글리신 N-메틸트랜스퍼레이스 (GNMT), 하이알루로난 결합 단백질 2 (HABP2), 헵시딘 항균 펩타이드 (HAMP), 하이드록시산 옥시데이스 (글리콜레이트 옥시데이스) 1 (HAO1), HGF 활성인자 (HGFAC), 합토글로빈-관련 단백질; 합토글로빈 (HPR), 헤모펙신 (HPX), 히스티딘-풍부 당단백질 (HRG), 하이드록시스테로이드 (11-베타) 디하이드로제네이스 1 (HSD11B1), 하이드록시스테로이드 (17-베타) 디하이드로제네이스 13 (HSD17B13),인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H1 (ITIH1), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H2 (ITIH2), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H3 (ITIH3), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H4 (ITIH4), 프리칼리크레인 (KLKB1), 락테이트 디하이드로제네이스 A (LDHA), 간 발현 항균 펩타이드 2 (LEAP2), 백혈구 세포-유래 케모탁신 2 (LECT2), 지질단백질 (a) (LPA), 만난-결합 렉틴 세린 펩티데이스 2 (MASP2), S-아데노실메티오닌 신테이스 이소폼 타입-1 (MAT1A), NADPH 옥시데이스 4 (NOX4), 폴리 [ADP-리보스] 폴리머레이스 1 (PARP1), 파라옥소네이스 1 (PON1), 파라옥소네이스 3 (PON3), 비타민 K-의존성 단백질 C (PROC), 레티놀 디하이드로제네이스 16 (RDH16), 혈청 아밀로이드 A4, 구성 (SAA4), 세린 디하이드라테이스 (SDS), 세르핀 패밀리 A 멤버 1 (세르핀A1), 세르핀 A11 (세르핀A11), 칼리스타틴 (세르핀A4), 코르티코스테로이드-결합 글로불린 (세르핀A6), 안티트롬빈-III (세르핀C1), 헤파린 보조인자 2 (세르핀D1), 세르핀 패밀리 H 멤버 1 (세르핀H1), 용질 운반체 패밀리 5 멤버 2 (SLC5A2), 소듐/담즙산 공수송체 (SLC10A1), 용질 운반체 패밀리 13 멤버 5 (SLC13A5), 용질 운반체 패밀리 22 멤버 1 (SLC22A1), 용질 운반체 패밀리 25 멤버 47 (SLC25A47), 용질 운반체 패밀리 2, 촉진된 글루코스 수송체 멤버 2 (SLC2A2), 소듐-커플링된 중성 아미노산 수송체 4 (SLC38A4), 용질 운반체 유기 음이온 수송체 패밀리 멤버 1B1 (SLCO1B1), 스핑고미엘린 포스포디에스터레이스 1 (SMPD1), 담즙산 염 설포트랜스퍼레이스 (SULT2A1), 티로신 아미노트랜스퍼레이스 (TAT), 트립토판 2,3-디옥시게네이스 (TDO2), UDP 글루쿠로노실트랜스퍼레이스 2 패밀리, 폴리펩타이드 B10 (UGT2B10), UDP 글루쿠로노실트랜스퍼레이스 2 패밀리, 폴리펩타이드 B15 (UGT2B15), UDP 글루쿠로노실트랜스퍼레이스 2 패밀리, 폴리펩타이드 B4 (UGT2B4) 및 비트로넥틴 (VTN)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

치료 목적을 위한 임의의 상기 기재된 유전자의 발현 침묵에서의 유용성에 추가하여, 본원에 기재된 특정 핵산(예를 들어, siRNA)이 또한 연구 및 개발 응용뿐만 아니라 진단, 예방, 예후, 임상 및 기타 보건 응용에서 유용하다. 비제한적 예로서, 특정 핵산(예를 들어, siRNA)이 관심 유전자가 치료 표적이 될 가능성이 있는지 여부를 테스트하기 위한 표적 검증 연구에서 사용될 수 있다. 특정 핵산(예를 들어, siRNA)이 또한 잠재적인 치료 표적으로서 유전자를 발견하기 위한 표적 식별 연구에서 사용될 수 있다.

CRISPR

표적화된 유전체 편집은 니치 기술로부터 많은 생물학 연구자들이 사용되는 방법으로 발전했다. 이러한 발전은 클러스터링되고, 규칙적으로 간격을 두고 있는, 짧은 팔린드롬 반복 (CRISPR) 기술의 출현에 의해 크게 촉진되었다 (예를 들어, Sander et al., Nature Biotechnology, 32(4), 347-355, 추가 정보 (2014) 포함 및 국제 공개 번호 WO 2016/197132 및 WO 2016/197133 참조). 따라서, HBV와 같은 질병을 치료하기 위해 CRISPR 기술과 조합하여 사용될 수 있는 개선점(예를 들어, 지질 나노입자 및 이의 제제)이 본원에 제공된다. CRISPR을 사용하기 위한 표적과 관련하여, CRISPR 기술에서 사용되는 가이드 RNA (gRNA)는 구체적으로 확인된 서열, 예를 들어, 표적 유전자, 예를 들어, HBV 유전체의 표적 유전자를 표적화하도록 설계될 수 있다. 그러한 표적 서열의 예는 국제 공개 번호 WO 2016/197132에 제공된다. 추가로, 국제 공개 번호 WO 2013/151665 (예를 들어, 표 6 참조; 상기 문헌은 부분적으로 표 6 및 관련 서열 목록을 포함하여, 구체적으로 참조로 포함된다)가 mRNA 발현 작제물과 관련하여 청구된 약 35,000 mRNA 서열을 설명한다. 본 발명의 특정 실시양태는 CRISPR 기술을 사용하여 임의의 이들 서열의 발현을 표적화한다. 본 발명의 특정 실시양태는 또한 본원에서 논의된 표적 유전자의 발현을 표적화하기 위해 CRISPR 기술을 이용할 수 있다.

aiRNA

siRNA와 유사하게, 비대칭 간섭 RNA (aiRNA)는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)를 동원하고 안티센스 가닥의 5' 말단에 대해 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 표적 서열의 서열-특이적 절단을 매개하여 포유동물 세포에서 다양한 유전자의 효과적인 침묵을 유도할 수 있다 (Sun et al., Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)). 전형적으로, aiRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 짧은 RNA 듀플렉스를 포함하고, 여기서 듀플렉스는 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에서 오버행을 포함한다. aiRNA는 센스 가닥이 상보적 안티센스 가닥과 비교할 때 양쪽 끝에서 더 짧기 때문에 일반적으로 비대칭이다. 일부 양태에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자에 사용되는 것과 유사한 조건 하에 설계, 합성 및 어닐링될 수 있다. 비제한적 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열을 선택하기 위해 전술한 방법을 사용하여 선택되고 생성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 다양한 길이(예를 들어, 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17 개의 염기쌍, 더욱 전형적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 개의 염기쌍)의 aiRNA 듀플렉스가 안티센스 가닥의 3' 및 5' 말단에서 오버행으로써 설계되어 관심 mRNA를 표적화할 수 있다. 특정 예에서, aiRNA 분자의 센스 가닥은 약 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, 또는 14-17 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 더욱 전형적으로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정한 다른 예에서, aiRNA 분자의 안티센스 가닥은 약 15-60, 15-50, 또는 15-40 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 더욱 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 실시양태에서, 5' 안티센스 오버행은 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 비표적화 뉴클레오타이드 (예를 들어, "AA", "UU", "dTdT", 등)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 3' 안티센스 오버행은 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 비표적화 뉴클레오타이드 (예를 들어, "AA", "UU", "dTdT", 등)를 포함한다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 aiRNA 분자는, 예를 들어, 이중 가닥 (듀플렉스) 영역 및/또는 안티센스 오버행에서 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, aiRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 전술한 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, aiRNA 분자는 예를 들어, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합과 같은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다.

특정 실시양태에서, aiRNA 분자는 siRNA 분자의 안티센스 가닥, 예를 들어, 본원에 기재된 siRNA 분자 중 하나에 상응하는 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, aiRNA 분자는 예를 들어, 바이러스 감염 및 생존과 관련된 유전자, 대사 질환 및 장애와 관련된 유전자, 종양형성 및 세포 변환과 관련된 유전자, 혈관신생 유전자, 염증 및 자가면역 반응과 관련된 것과 같은 면역조절 유전자, 리간드 수용체 유전자, 및 신경퇴행성 장애와 관련된 유전자와 같은 위에 제시된 임의의 표적 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있다.

miRNA

일반적으로, 마이크로RNA (miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 약 21-23 개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 RNA 분자이다. miRNA는 그 DNA로부터 전사되는 유전자에 의해 인코딩되지만, miRNA가 단백질로 번역되지 않고 (비-코딩 RNA); 대신, 각 일차 전사물(pri-miRNA)은 pre-miRNA로 지칭되는 짧은 스템-루프 구조로 그리고 최종적으로 기능성 성숙 miRNA로 가공된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA (mRNA) 분자에 대해 부분적으로 또는 완전히 상보적이고, 이들의 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다. miRNA 분자의 확인은, 예를 들어, Lagos-Quintana et al., Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862; 및 Lee et al., Science, 294:862-864에 설명된다.

miRNA를 인코딩하는 유전자는 가공된 성숙 miRNA 분자보다 훨씬 더 길다. miRNA는 먼저 캡 및 폴리-A 테일이 있는 일차 전사물 또는 pri-miRNA로서 전사되고 세포 핵에서 pre-miRNA로 알려진 짧은, ~70-뉴클레오타이드 스템-루프 구조로 가공된다. 이러한 가공은 뉴클레이스 Drosha 및 이중 가닥 RNA 결합 단백질 Pasha로 구성된 마이크로프로세서 복합체로 알려진 단백질 복합체에 의해 동물에서 수행된다 (Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)). 이후 이러한 pre-miRNA는 엔도뉴클레이스 Dicer와의 상호작용에 의해 세포질에서 성숙 miRNA로 가공되고, 이는 또한 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)의 형성을 개시한다 (Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001). DNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 주형으로 기능하여 miRNA를 생성할 수 있다.

Dicer가 pre-miRNA 스템-루프를 절단할 때, 두 개의 상보적인 짧은 RNA 분자가 형성되지만, 단지 하나만이 RISC 복합체로 통합된다. 이 가닥은 가이드 가닥으로 알려져 있고 5' 말단의 안정성에 기반하여 RISC 복합체 중의 촉매적 활성 RNase인 아르고나우트 단백질에 의해 선택된다 (Preall et al., Curr. Biol., 16:530-535 (2006)). 안티-가이드 또는 패신저 가닥으로 알려진 나머지 가닥은 RISC 복합체 기질로서 분해된다 (Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)). 활성 RISC 복합체로의 통합 후, miRNA는 이들의 상보적 mRNA 분자와 염기 쌍을 이루고 표적 mRNA 분해 및/또는 번역 침묵을 유도한다.

포유동물 miRNA 분자는 일반적으로 표적 mRNA 서열의 3' UTR의 부위에 대해 상보적이다. 특정 예에서, 표적 mRNA에 대한 miRNA의 어닐링은 단백질 번역 기구를 차단함으로써 단백질 번역을 억제한다. 특정한 다른 예에서, 표적 mRNA에 대한 miRNA의 어닐링은 RNA 간섭(RNAi)과 유사한 과정을 통해 표적 mRNA의 절단 및 분해를 촉진한다. miRNA는 또한 표적화된 mRNA에 해당하는 유전체 부위의 메틸화를 표적화할 수 있다. 일반적으로, miRNA는 miRNP로 통칭되는 단백질의 보체와 관련하여 기능한다.

특정 양태에서, 본원에 기재된 miRNA 분자는 약 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, 또는 15-40 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 더욱 전형적으로 약 15-30, 15-25, 또는 19-25 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 약 20-24, 21-22, 또는 21-23 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정한 다른 양태에서, miRNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, miRNA 서열은 siRNA 서열에 대해 전술한 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, miRNA 분자는 예를 들어, 2'OMe-구아노신 뉴클레오타이드, 2'OMe-우리딘 뉴클레오타이드, 또는 이들의 혼합과 같은 2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다.

일부 실시양태에서, miRNA 분자는 예를 들어, 바이러스 감염 및 생존과 관련된 유전자, 대사 질환 및 장애와 관련된 유전자, 종양형성 및 세포 변환과 관련된 유전자, 혈관신생 유전자, 염증 및 자가면역 반응과 관련된 것과 같은 면역조절 유전자, 리간드 수용체 유전자, 및 신경퇴행성 장애와 관련된 유전자와 같은 위에 제시된 임의의 표적 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 관심 mRNA를 표적으로 하는 miRNA의 활성을 차단하는 하나 이상의 제제는 본 발명의 지질 입자(예를 들어, 핵산-지질 입자)를 사용하여 투여된다. 차단제의 예는 입체 차단 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산 올리고뉴클레오타이드, 및 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 차단제는 miRNA에 또는 표적 mRNA 상의 miRNA 결합 부위에 직접 결합할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드

한 실시양태에서, 핵산은 관심 표적 유전자 또는 서열에 유도되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "안티센스"는 표적화된 폴리뉴클레오타이드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 선택된 서열에 상보적인 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 RNA에 결합하여 상보적 RNA 가닥의 번역을 방지한다. 안티센스 DNA 올리고뉴클레오타이드는 표적 특이적인 상보적 (코딩 또는 비-코딩) RNA를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 결합이 일어나는 경우, 이러한 DNA/RNA 하이브리드는 효소 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 60 개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 30 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 용어는 원하는 표적 유전자에 정확히 상보적이지 않을 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 또한 포함한다. 따라서, 본 발명은 안티센스로써 비-표적 특이적-활성이 발견되거나, 표적 서열과의 하나 이상의 미스매치를 포함하는 안티센스 서열이 특정 용도에 가장 바람직한 경우에 사용될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질 합성의 효과적이고 표적화된 억제제로 입증되었고, 결과적으로, 표적화된 유전자에 의해 단백질 합성을 특이적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 합성 억제에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능은 잘 확립된다. 예를 들어, 폴리갈락타우로네이스 및 무스카린 타입 2 아세틸콜린 수용체의 합성은 각각의 mRNA 서열로 향하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다 (미국 특허 번호 5,739,119 및 5,759,829 참조). 또한, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다제 내성 유전자 (MDR1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA 수용체, 및 인간 EGF로 입증되었다 (Jaskulski et al., Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun., 1:225-32 (1989); Penis et al., Brain Res Mol Brain Res., 15; 57:310-20 (1998); 및 미국 특허 번호 5,801,154; 5,789,573; 5,718,709 및 5,610,288 참조). 더욱이, 다양한 비정상 세포 증식, 예를 들어, 암을 억제하고 이를 치료하기 위해 사용될 수 있는 안티센스 작제물이 또한 기재되었다 (미국 특허 번호 5,747,470; 5,591,317; 및 5,783,683 참조). 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드 생산 방법은 당해 분야에서 공지이고 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 생산을 위해 쉽게 개조될 수 있다. 주어진 표적 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 선택은 선택된 표적 서열의 분석 및 이차 구조, T_m, 결합 에너지, 및 상대적인 안정성의 결정을 기반으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적 결합을 감소 또는 금지할 이량체, 헤어핀, 또는 다른 이차 구조를 형성하는 상대적인 무능력에 기초하여 선택될 수 있다. mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈 또는 그 근처의 영역 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은, 예를 들어, 올리고 프라이머 분석 소프트웨어(Molecular Biology Insights)의 v.4 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)).

리보자임

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 핵산-지질 입자는 리보자임과 결합된다. 리보자임은 엔도뉴클레이스 활성을 보유하는 특정 촉매 도메인을 갖는 RNA-단백질 복합체이다 (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:8788-92 (1987); and Forster et al., Cell, 49:211-20 (1987) 참조). 예를 들어, 다수의 리보자임이 높은 정도의 특이성으로 포스포에스테르 전달 반응을 가속화하여, 흔히 올리고뉴클레오타이드 기질에서 여러 포스포에스테르 중 하나만을 절단한다 (Cech et al., Cell, 27:487-96 (1981); Michel et al., J. Mol. Biol., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357:173-6 (1992) 참조). 이러한 특이성은 화학 반응 전에 기질이 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 대한 특이적 염기-짝지음 상호작용을 통해 결함한다는 요건에 기인한다.

자연 발생 효소 RNA 분자의 최소 여섯 가지 기본 변종이 현재 알려져 있다. 각각은 생리학적 조건에서 트랜스에서 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매화할 수 있다 (따라서 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다). 일반적으로, 효소 핵산은 먼저 표적 RNA에 결합하여 작용한다. 그러한 결합은 표적 RNA를 절단하는 역할을 하는 분자의 효소 부분에 매우 근접하게 유지되는 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통해 발생한다. 따라서, 효소 핵산은 상보적 염기-짝지음을 통해 표적 RNA를 먼저 인식한 다음 결합하고, 일단 올바른 부위에 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 그러한 표적 RNA의 전략적 절단은 인코딩된 단백질의 직접 합성 능력을 파괴할 것이다. 효소 핵산이 RNA 표적에 결합하고 절단한 후, 또 다른 표적을 찾기 위해 해당 RNA로부터 방출되고 새로운 표적에 반복적으로 결합하고 절단할 수 있다.

효소 핵산 분자는 예를 들어 해머헤드, 헤어핀, 간염 δ 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNaseP RNA (RNA 가이드 서열와 관련됨), 또는 뉴로스포라 VS RNA 모티프에서 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 구체적인 예는, 예를 들어, Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20:4559-65 (1992)에 기재된다. 헤어핀 모티프의 예는, 예를 들어, EP 0360257, Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18:299-304 (1990); 및 미국 특허 번호 5,631,359에 기재된다. 간염 δ 바이러스 모티프의 예는, 예를 들어, Perrotta et al., Biochemistry, 31:11843-52 (1992)에 기재된다. RNaseP 모티프의 예는, 예를 들어, Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983)에 기재된다. 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프의 예는, 예를 들어, Saville et al., Cell, 61:685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993)에 기재된다. 그룹 I 인트론의 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,987,071에 기재된다. 본 발명에 따라 사용되는 효소 핵산 분자의 중요한 특징은 이들이 표적 유전자 DNA 또는 RNA 영역 중 하나 이상에 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 갖고, RNA 절단 활성을 분자에 부여하는 기질 결합 부위 내부 또는 주위에 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 점이다. 따라서, 리보자임 작제물은 본원에서 언급된 특정 모티프에 제한될 필요가 없다. 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적으로 하는 리보자임 생산 방법이 당해 분야에서 공지이다. 리보자임은, 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 93/23569 및 WO 94/02595에 설명된 바와 같이 설계될 수 있고, 이에 기재된 바와 같이 시험관내 및/또는 생체내 테스트되기 위해 합성된다. 이들 PCT 공보의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

리보자임 활성은 리보자임 결합 암의 길이를 변경하거나 혈청 리보뉴클레이스에 의한 분해를 방지하는 변형(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162, 및 WO 94/13688; EP 92110298.4; 및 미국 특허 번호 5,334,711 참조, 이들은 효소 RNA 분자의 당 모이어티에 이루어질 수 있는 다양한 화학적 변형을 설명하고, 이들의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 세포에서의 효능을 향상시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 단축하고 화학적 요구사항을 줄이기 위한 스템 II 염기의 제거가 있는 리보자임을 화학적으로 합성하여 최적화될 수 있다.

면역자극성 올리고뉴클레오타이드

본 발명의 지질 입자와 관련된 핵산은 인간과 같은 포유동물일 수 있는 대상에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(ISS; 단일- 또는 이중 가닥)를 포함하는 면역자극성일 수 있다. ISS는, 예를 들어, 헤어핀 이차 구조를 유발하는 특정 팔린드롬 (Yamamoto et al., J. Immunol., 148:4072-6 (1992) 참조), 또는 CpG 모티프뿐만 아니라 기타 알려진 ISS 특징 (예컨대 다중-G 도메인; PCT 공개 번호 WO 96/11266 참조, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)을 포함한다.

면역자극성 핵산은 면역 반응을 유발하기 위해 표적 서열에 특이적으로 결합하고 이의 발현을 감소시킬 필요가 없는 경우 비-서열 특이적인 것으로 간주된다. 따라서, 특정 면역자극성 핵산은 자연 발생 유전자 또는 mRNA의 영역에 해당하는 서열을 포함할 수 있지만, 여전히 비-서열 특이적인 면역자극성 핵산으로 간주될 수 있다.

한 실시양태에서, 면역자극성 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 CpG 디뉴클레오타이드는 메틸화되지 않거나 메틸화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 메틸화 사이토신을 갖는 최소 하나의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산은 단일 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오타이드 중의 사이토신은 메틸화된다. 대안의 실시양태에서, 핵산은 최소 둘의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오타이드에서 최소 하나의 사이토신이 메틸화된다. 추가의 실시양태에서, 서열에 존재하는 CpG 디뉴클레오타이드에서 각 사이토신이 메틸화된다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 복수의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오타이드 중 최소 하나는 메틸화된 사이토신을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 면역자극 올리고뉴클레오타이드의 예는 2008년 12월 31일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US08/88676, PCT 공개 번호 WO 02/069369 및 WO 01/15726, 미국 특허 제6,406,705호, 및 Raney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298:1185-92 (2001)에 기재되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 올리고뉴클레오타이드는 CpG 모티프에서 포스포디에스테르 ("PO") 뼈대 또는 포스포로티오에이트 ("PS") 뼈대, 및/또는 최소 하나의 메틸화 사이토신 잔기를 갖는다.

mRNA

본 발명의 특정 실시양태는 살아 있는 세포(예를 들어, 인체 내의 세포)에서 하나 이상의 mRNA 분자를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. mRNA 분자는 살아 있는 세포 내에서 발현될 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 질환에 걸린 유기체(예를 들어, 인간가 같은 포유동물) 내에서 발현되고, 폴리펩타이드의 발현은 질환의 하나 이상의 증상을 완화시킨다. 본 발명의 조성물 및 방법은 인체 내 기능성 폴리펩타이드의 부재 또는 감소된 수준에 의해 야기되는 인간 질환 치료에 특히 유용하다. 따라서, 특정 실시양태에서, LNP는 하나 이상의 mRNA 분자(예를 들어, mRNA 분자의 칵테일)와 같은 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, mRNA(들)은 핵산-지질 입자(예를 들어, LNP)에 완전히 캡슐화된다. mRNA 칵테일을 포함하는 제제와 관련하여, 칵테일에 존재하는 여러 상이한 유형의 mRNA 종(예를 들어, 여러 상이한 서열을 갖는 mRNA)이 동일한 입자에 공동 캡슐화될 수 있거나, 칵테일에 존재하는 각 유형의 mRNA 종이 별도의 입자에 캡슐화될 수 있다. mRNA 칵테일은 동일하거나, 유사하거나, 상이한 농도 또는 몰비로 둘 이상의 개별 mRNA(각각 고유한 서열을 가짐)의 혼합물을 사용하여 본원에 기재된 입자로 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, mRNA의 칵테일(여러 상이한 서열이 있는 복수의 mRNA에 해당함)은 동일하거나, 유사하거나 상이한 농도 또는 몰비의 각 mRNA 종을 사용하여 제제화되고, 여러 상이한 유형의 mRNA는 동일한 입자에 공동 캡슐화된다. 또 다른 실시양태에서, 칵테일에 존재하는 각 유형의 mRNA 종은 동일하거나, 유사하거나, 상이한 mRNA 농도 또는 몰비로 여러 상이한 입자에 캡슐화되고, 그렇게 형성된 입자(각각 상이한 mRNA 페이로드 포함)는 (예를 들어, 치료 요법에 따라 상이한 시간에) 개별적으로 투여되거나, (예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께) 단일 단위 용량으로서 조합되고 함께 투여된다. 본원에 기재된 입자는 혈청 안정성이고, 뉴클레이스 분해에 내성이 있으며, 인간과 같은 포유동물에게 실질적으로 무독성이다.

mRNA 변형

본 발명의 실시에서 사용되는 mRNA는 하나, 둘, 또는 둘 초과의 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 mRNA는, 상응하는 변형되지 않은 mRNA에 비해 mRNA가 도입되는 세포에서 감소된 분해를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1 -카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1 -프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, l -타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1 -메틸-슈도우리딘, 4-티오- 1 -메틸-슈도우리딘, 2-티오- 1 -메틸-슈도우리딘, 1 -메틸- 1 -데아자-슈도우리딘, 2-티오- 1 -메틸- 1 -데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다.

일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1 -메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오- 1 -메틸-슈도이소시티딘, 4-티오- 1 -메틸- 1 -데아자-슈도이소시티딘, 1 -메틸- 1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시- 1 -메틸-슈도이소시티딘을 포함한다.

다른 실시양태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노푸린, 2, 6-디아미노푸린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2-아미노푸린, 7-데아자-2,6-디아미노푸린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노푸린, 1 -메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.

특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘이다. α-티오 치환된 포스페이트 모이어티는 비천연 포스포로티오에이트 뼈대 연결을 통해 RNA 중합체에 안정성을 부여하기 위해 제공된다. 포스포로티오에이트 RNA는 증가된 뉴클레이스 내성 및 추후 세포 환경에서 더 긴 반감기를 갖는다. 포스포로티오에이트 연결된 핵산은 세포 선천 면역 분자의 약한 결합/활성화를 통해 선천 면역 반응을 또한 감소시킬 것으로 예상된다.

특정 실시양태에서, 예를 들어 단백질 생산의 정확한 타이밍이 요구되는 경우, 세포에 도입되는 변형된 핵산을 세포내에서 분해하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 세포 내에서 지시된 방식으로 작용할 수 있는 분해 도메인을 포함하는 변형된 핵산을 제공한다.

다른 실시양태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1 -메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1 -메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1 -메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.

변형된 핵산의 선택적 성분

추가의 실시양태에서, 변형된 핵산은 일부 실시양태에서 유익할 수 있는 다른 선택적 성분을 포함할 수 있다. 이러한 선택적 성분은 비번역 영역, 코작 서열, 인트론 뉴클레오타이드 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 캡 및 폴리A 테일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 3 ' UTR이 제공될 수 있고, 여기서 하나 또는 둘 모두가 독립적으로 하나 이상의 상이한 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다 그러한 실시양태에서, 뉴클레오사이드 변형은 또한 번역 가능 영역에 존재할 수 있다. 코작 서열을 포함하는 핵산이 또한 제공된다.

추가로, 핵산으로부터 절제될 수 있는 하나 이상의 인트론 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.

비번역 영역(UTR)

유전자의 비번역 영역(UTR)은 전사되지만 번역되지 않는다. 5'UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만 시작 코돈을 포함하지 않는 반면; 3'UTR은 정지 코돈 직후에서 시작하여 전사 종결 신호까지 계속된다. 핵산 분자의 안정성 및 번역 측면에서 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 대한 증거가 늘어나고 있다. UTR의 조절 특징은 분자의 안정성을 증가시키기 위해 본 발명에서 사용되는 mRNA에 통합될 수 있다. 원하지 않는 장기 부위로 잘못 지시된 경우 전사물의 제어된 하향조절을 보장하기 위해 특정 기능이 또한 통합될 수 있다.

5 ' 캡핑

mRNA의 5' 캡 구조는 핵 방출에 관여하여 mRNA 안정성을 증가시키고, CBP와 폴리(A) 결합 단백질의 회합을 통해 세포 내 mRNA 안정성 및 번역 기능을 담당하는 mRNA 캡 결합 단백질(CBP)과 결합하여 성숙 고리형 mRNA 종을 형성한다. 캡은 mRNA 스플라이싱 동안 5' 근위 인트론 제거를 추가로 돕는다.

내인성 mRNA 분자는 5'-말단 캡핑되어 mRNA 분자의 5'-말단 전사된 센스 뉴클레오타이드와 말단 구아노신 캡 잔기 사이의 5'-ppp-5'-트리포스페이트 연결을 생성할 수 있다. 이러한 5'-구아닐레이트 캡은 이후 메틸화되어 N7-메틸-구아닐레이트 잔기를 생성할 수 있다. mRNA의 5' 말단의 말단 및/또는 전말단 전사된 뉴클레오타이드의 리보스 당이 또한 임의로 2'-O-메틸화될 수 있다. 가수분해 및 구아닐레이트 캡 구조의 절단을 통한 5'-디캐핑은 분해를 위해 mRNA 분자와 같은 핵산 분자를 표적으로 할 수 있다.

IRES 서열

내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 mRNA가 또한 본 발명의 실시에서 유용하다. IRES는 유일한 리보솜 결합 부위로 작용할 수 있거나, mRNA의 다중 리보솜 결합 부위 중 하나로 작용할 수 있다. 하나 초과의 기능적 리보솜 결합 부위를 포함하는 mRNA는 리보솜에 의해 독립적으로 번역되는 여러 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다 ("멀티시스트론 mRNA"). mRNA가 IRES와 함께 제공되는 경우, 두 번째 번역 가능 영역이 임의로 추가로 제공된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 IRES 서열의 예는 제한 없이, 피코르나바이러스 (예를 들어 FMDV), 페스트 바이러스 (CFFV), 폴리오 바이러스 (PV), 뇌심근염 바이러스 (ECMV), 수족구병 바이러스 (FMDV), C형 간염 바이러스 (HCV), 돼지열병 바이러스 (CSFV), 쥐 백혈병 바이러스 (MLV), 유인원 면역 결핍 바이러스 (S1V) 또는 귀뚜라미 마비 바이러스 (CrPV)로부터의 서열을 포함한다.

폴리-A 테일

RNA 가공 동안, 안정성을 증가시키기 위해 아데닌 뉴클레오타이드의 장쇄(폴리-A 테일)가 mRNA 분자와 같은 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 전사 직후, 전사물의 3' 말단이 절단되어 3' 하이드록실을 유리화할 수 있다. 이후 폴리-A 폴리머레이스가 아데닌 뉴클레오타이드의 사슬을 RNA에 부가한다. 폴리아데닐화로 지칭되는 과정이, 100 내지 250 개의 잔기 길이일 수 있는 폴리-A 테일을 추가한다.

일반적으로, 폴리-A 테일의 길이는 30 개 초과의 뉴클레오타이드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리-A 테일은 35 개 초과의 뉴클레오타이드 길이이다 (예를 들어, 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2,000, 2,500, 및 3,000 개 이상 또는 초과의 뉴클레오타이드).

이러한 맥락에서 폴리-A 테일은 변형된 mRNA보다 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 더 길 수 있다. 폴리-A 테일은 또한 그것이 속하는 변형된 핵산의 일부로서 설계될 수 있다. 이러한 맥락에서, 폴리-A 테일은 변형된 mRNA의 총 길이 또는 변형된 mRNA의 총 길이 마이너스 폴리-A 테일의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 이상일 수 있다.

mRNA 분자 생성

RNA 단리, RNA 합성, 핵산 혼성화, cDNA 라이브러리 제조 및 스크리닝, 및 PCR 수행 방법은 당해 분야에 공지이고 (예를 들어, Gubler and Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 참조); PCR 방법도 마찬가지이다 (미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) 참조). 발현 라이브러리는 또한 당업자에게 공지이다. 본 발명에서 일반적인 사용 방법을 공개하는 추가적인 기본 문서는 Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)를 포함한다. 이들 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

인코딩된 폴리펩타이드

본원에 기재된 핵산-지질 입자의 RNA 성분이 관심 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 인간의 특정 질환은 단백질이 정상적으로 존재하고 활성인 세포 유형에서 기능성 단백질의 부재 또는 손상에 의해 야기된다. 기능성 단백질은, 예를 들어, 인코딩 유전자의 전사 비활성으로 인해 또는 단백질을 완전히 또는 부분적으로 비기능적으로 만드는 인코딩 유전자의 돌연변이의 존재로 인해, 완전히 또는 부분적으로 부재할 수 있다. 단백질의 완전 또는 부분 불활성화에 의해 야기된 인간 질환의 예는 X-연관 중증 복합 면역결핍 (X-SCID) 및 부신백질이영양증 (X-ALD)을 포함한다. X-SCID는 면역계 내에서 B 및 T 세포의 발달 및 성숙에 관여하는 여러 인터루킨에 대한 수용체의 구성요소인 공통 감마 사슬 단백질을 인코딩하는 유전자에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 야기된다. X-ALD는 ABCD1로 지칭되는 퍼옥시좀 막 수송체 단백질 유전자에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 야기된다. X-ALD에 걸린 개체는 신체 전체의 조직에서 매우 높은 수준의 장쇄 지방산을 가지며, 이는 정신 장애 또는 사망으로 이어질 수 있는 다양한 증상을 야기한다.

단백질이 정상적으로 존재하고 활성인 세포 유형에서 기능성 단백질의 부재 또는 손상에 의해 야기되는 일부 질환을 치료하기 위해 유전자 요법을 사용하려는 시도가 있었다. 유전자 요법은 전형적으로 영향을 받은 단백질의 기능적 형태를 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 병에 걸린 사람에게 도입하는 것 및 질환을 치료하기 위한 기능적 단백질의 발현을 포함한다. 지금까지, 유전자 치료는 제한된 성공을 거두었다. 추가로, LNP를 사용하여 mRNA를 전달하는 특정 양태는, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2018/006052 및 WO 2015/011633에 설명된다.

그와 같이, 기능성 단백질의 완전한 또는 부분적 부재에 의해 야기되는 질환을 앓고 있는 인간 내에서 기능적 형태의 단백질 발현을 위한 개선이 지속적으로 요구되고 있으며, 예를 들어, 치료법에 대한 면역 반응을 더 적게 촉발할 수 있는 방법 및 조성물을 통한 핵산(예를 들어, mRNA)의 개선된 전달이 요구된다. 본 발명의 특정 실시양태가 이러한 맥락에서 유용하다. 따라서, 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드의 발현은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화시킨다. 본 발명의 특정 조성물 및 방법은 인체 내 기능성 폴리펩타이드의 부재 또는 감소된 수준에 의해 야기되는 인간 질환 치료에 유용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 특정 조성물 및 방법이 암 치료를 위한 백신 항원 발현에 유용할 수 있다.

자가 증폭 RNA

특정 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 자가 증폭 RNA 분자이다. 자가 증폭 RNA(sa-RNA)는 자가 복제 RNA, 복제 가능 RNA, 레플리콘 또는 RepRNA로도 지칭될 수 있다. 자가 증폭 mRNA로 지칭되는 RepRNA는 양성-가닥 바이러스로부터 유래하는 경우, 적어도 하나의 구조 유전자가 없는 바이러스 유전체로부터 생성되며; 감염성 자손 바이러스를 생성하지 않고 번역 및 복제할 수 있다 (따라서"자가 증폭"). 특정 실시양태에서, RepRNA 기술은 원하는 관심 항원을 인코딩하는 유전자 카세트를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 알파바이러스 유전체는 두 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로 나뉜다: 첫 번째 ORF는 RNA 의존성 RNA 폴리머레이스 (레플리케이스)에 대한 단백질을 인코딩하고, 두 번째 ORF는 구조적 단백질을 인코딩한다. sa-RNA 백신 구성에서, 바이러스 구조적 단백질을 인코딩하는 ORF는 임의의 선택한 항원으로 대체될 수 있는 반면, 바이러스 레플리케이스는 백신의 필수 부분으로 남아 있으며 면역 후 RNA의 세포내 증폭을 추진한다.

PEG-C-DMA

당업자는 PEG-C-DMA의 농도가 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 핵산-지질 입자가 융해성이 되는 속도는, 예를 들어, PEG의 분자량을 변경함으로써 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, PEG-C-DMA는 다음 구조를 갖는다:

여기서 n은 생성된 중합체 사슬이 약 1000 내지 약 3000의 분자량을 갖도록 선택된다. 또 다른 실시양태에서, n은 생성된 중합체 사슬이 약 2000의 분자량을 갖도록 선택된다. PEG-C-DMA는 Heyes et al, Synthesis and Characterization of Novel Poly (Ethylene Glycol)-lipid Conjugates Suitable for use in Drug Delivery," Journal of Controlled Release, 2006, 및 미국 특허 제8,936,942호에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다.

지질 입자의 제조

특정 실시양태에서, 본 발명은 연속 혼합 방법, 예를 들어, 핵산을 포함하는 수용액을 제1 저장소에 제공하는 단계, 유기 지질 용액을 제2 저장소에 제공하는 단계 및 유기 지질 용액이 수용액과 혼합되어 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)을 캡슐화하는 리포솜을 실질적으로 즉시 생성하도록 수용액을 유기 지질 용액과 혼합하는 단계를 포함하는 과정을 통해 생성된 LNP를 제공한다. 이 과정 및 이 과정을 수행하기 위한 장치는 미국 특허 공개 번호 제20040142025호에 상세히 설명되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

지질 및 버퍼 용액을 혼합 챔버와 같은 혼합 환경에 연속으로 도입하는 작업은 버퍼 용액으로 지질 용액으로 연속 희석하여, 혼합되면 실질적으로 즉시 리포솜을 생성하는 것을 야기한다. 본원에서 사용된 어구 "버퍼 용액으로 지질 용액을 연속 희석" (및 변형)은 일반적으로 지질 용액이 소포 생성을 유발하기에 충분한 힘으로 수화 과정에서 충분히 빠르게 희석됨을 의미한다. 핵산을 포함하는 수용액을 유기 지질 용액과 혼합함으로써, 유기 지질 용액은 버퍼 용액(즉, 수용액)의 존재에서 연속 단계적 희석을 거쳐 핵산-지질 입자를 생성한다.

연속 혼합 방법을 사용하여 형성된 LNP는 전형적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집되지 않고 균일한 입자 크기를 얻기 위해 선택적으로 크기조정된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 리포솜 용액을 형성하는 단계 및 리포솜 용액을 제어된 양의 희석 버퍼를 포함하는 수집 용기에 즉시 그리고 직접 도입하는 단계를 포함하는 직접 희석 과정을 통해 생성된 LNP를 제공한다. 바람직한 양태에서, 수집 용기는 희석을 용이하게 하기 위해 수집 용기의 내용물을 교반하도록 구성된 하나 이상의 요소를 포함한다. 한 양태에서, 수집 용기에 존재하는 희석 버퍼의 양은 도입되는 리포솜 용액의 부피와 실질적으로 동일하다. 비제한적 예로서, 동일한 부피의 희석 버퍼를 포함하는 수집 용기에 도입될 때 45% 에탄올 중의 리포솜 용액은 유리하게 더 작은 입자를 생성할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 희석 버퍼를 포함하는 제3 저장소가 제2 혼합 영역과 유체 결합되는 직접 희석 과정을 통해 생성된 LNP를 제공한다. 이 실시양태에서, 제1 혼합 영역에서 형성된 리포솜 용액은 제2 혼합 영역에서 희석 버퍼와 즉시 그리고 직접 혼합된다. 바람직한 양태에서, 제2 혼합 영역은 리포솜 용액 및 희석 버퍼 흐름이 대향하는 180° 흐름으로서 만나도록 배열된 T-커넥터를 포함하지만; 예를 들어, 약 27° 내지 약 180°와 같이 더 얕은 각도를 제공하는 커넥터가 사용될 수 있다. 펌프 메커니즘은 제어 가능한 버퍼 흐름을 제2 혼합 영역으로 전달한다. 한 양태에서, 제2 혼합 영역에 제공되는 희석 버퍼의 유량은 제1 혼합 영역으로부터 도입되는 리포솜 용액의 유량과 실질적으로 동일하도록 제어된다. 이 실시양태는 유리하게는 제2 혼합 영역에서 리포솜 용액과 혼합되는 희석 버퍼의 흐름, 따라서 제2 혼합 공정 전반에 걸친 버퍼 중의 리포솜 용액의 농도를 더 잘 제어하도록 한다. 그러한 희석 버퍼 유량의 제어는 유리하게는 감소된 농도에서 작은 입자 크기 형성을 허용한다.

이러한 직접 희석 공정을 수행하기 위한 공정 및 장치는 미국 특허 공개 번호 20070042031에 상세히 설명되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

직접 희석 과정을 사용하여 형성된 LNP는 전형적으로 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 크기를 갖는다. 이렇게 형성된 입자는 응집되지 않고 균일한 입자 크기를 얻기 위해 선택적으로 크기조정된다.

필요한 경우, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 리포솜 크기조정에 이용 가능한 임의의 방법에 의해 크기조정될 수 있다. 크기조정은 원하는 크기 범위 및 비교적 좁은 입자 크기 분포를 얻기 위해 수행될 수 있다.

입자를 원하는 크기로 크기조정하기 위해 여러 기술을 이용할 수 있다. 리포솜에 사용되고 본 입자에 동일하게 적용 가능한 한 크기조정 방법이 미국 특허 제4,737,323호에 설명되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 배스 또는 프로브 초음파 처리에 의한 입자 현탁액 초음파 처리는 크기가 약 50 nm 미만인 입자까지 점진적인 크기 감소를 발생시킨다. 균질화는 전단 에너지에 의존하여 더 큰 입자를 더 작은 것으로 부수는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, 입자는 선택된 입자 크기, 전형적으로 약 60 내지 약 80 nm가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질화기를 통해 재순환된다. 두 가지 방법 모두에서, 입자 크기 분포는 통상적인 레이저-빔 입자 크기 식별, 또는 QELS에 의해 모니터링될 수 있다.

소기공 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 입자의 압출은 또한 입자 크기를 비교적 잘 정의된 크기 분포로 감소시키는 효과적인 방법이다. 전형적으로, 현탁액은 원하는 입자 크기 분포가 달성될 때까지 막을 통해 한 번 이상 순환된다. 입자는 점진적인 크기 감소를 달성하기 위해 연속적으로 더 작은 기공의 막을 통해 압출될 수 있다.

일부 실시양태에서, LNP 중의 핵산은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제09/744,103호에 설명된 바와 같이 예비축합되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

다른 실시양태에서, 방법은 본 조성물을 사용하는 세포의 리포펙션(lipofection)에 영향을 미치기에 유용한 비-지질 다가양이온 첨가를 추가로 포함할 것이다. 적합한 비-지질 다가양이온의 예는, 헥사디메트린 브로마이드 (미국, 위스콘신, 밀워키 소재의 Aldrich Chemical Co.로부터 상품명 POLYBRENE®으로 판매) 또는 헥사디메트린의 다른 염을 포함한다. 다른 적합한 다가양이온은, 예를 들어, 폴리-L-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 폴리알릴아민, 및 폴리에틸렌이민의 염을 포함한다. 이들 염의 첨가는 바람직하게는 입자가 형성된 후이다.

지질 입자의 투여

일단 형성되면, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 핵산을 세포에 도입하기에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)과 같은 핵산을 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 먼저 전술한 바와 같이 입자를 형성한 다음 핵산을 세포에 전달하기에 충분한 시간 동안 입자를 세포와 접촉시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 수행된다.

본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 이들이 혼합되거나 접촉되는 거의 모든 세포 유형에 흡착될 수 있다. 일단 흡착되면, 입자는 세포의 일부에 의해, 세포내 이입될 수 있고, 지질을 세포막과 교환하거나, 세포와 융합한다. 입자의 핵산(예를 들어, 핵산) 부분의 전달 또는 혼입은 이러한 경로 중 어느 하나를 통해 일어날 수 있다. 특히, 융합이 일어나는 경우, 입자막이 세포막에 통합되고 입자의 내용물이 세포내 액과 조합된다.

본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 단독으로 또는 투여 경로 및 표준 제약 실시에 따라 선택된 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 생리 식염수 또는 포스페이트 버퍼)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 일반 완충 식염수(예를 들어, 135-150 mM NaCl)가 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 것이다. 다른 적합한 담체는, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등이며, 알부민, 지질단백질, 글로불린, 등과 같은 향상된 안정성을 위한 당단백질을 포함한다. 추가적인 적합한 담체는, 예를 들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에 기재된다. 본원에서 사용된 "담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 버퍼, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 어구 "약제학적으로 허용되는"은 인간에게 투여될 때 알러지 또는 유사한 부반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.

약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 입자 형성 후 첨가된다. 따라서, 입자가 형성된 후, 입자는 일반 완충 식염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체로 희석될 수 있다.

약제학적 제제 중의 입자의 농도는, 즉, 중량으로 약 0.05% 미만으로부터, 일반적으로 약 2 내지 5% 이상, 약 10 내지 90%까지 변할 수 있고, 주로 선택된 특정 투여 방식에 따른 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다. 예를 들어, 치료와 관련된 유체 부하를 낮추기 위해 농도가 증가될 수 있다. 이는 죽상경화증과 관련된 울혈성 심부전 또는 중증 고혈압이 있는 환자에서 특히 바람직할 수 있다. 대안으로, 자극성 지질로 구성된 입자가 저농도로 희석되어 투여 부위의 염증을 줄일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 공지 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에 여과 및 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 생리적 조건에 가깝게 하기 위해 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 등장성 조절제 등, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 및 칼슘 클로라이드를 포함할 수 있다. 추가로, 입자 현탁액은 저장 시 자유 라디칼 및 지질-과산화 손상에 대해 지질을 보호하는 지질 보호제를 포함할 수 있다. 알파토코페롤과 같은 친유성 자유 라디칼 퀀처 및 페리옥사민과 같은 수용성 철 특이적 킬레이터가 적합하다.

생체내 투여

생체내 치료법을 위한 전신 전달, 예를 들어, 순환과 같은 신체 시스템을 통한 원위 표적 세포로의 치료 핵산의 전달은 PCT 공개 번호 WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152, 및 WO 04/002453에 기재된 것과 같은 핵산-지질 입자를 사용하여 달성되었고, 이들의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 또한 혈청에서 뉴클레이스 분해로부터 핵산을 보호하고, 비면역원성이고, 크기가 작고, 반복 투여에 적합한 완전히 캡슐화된 지질 입자를 제공한다.

생체내 투여에 있어서, 투여는 당해 분야에 공지인 임의의 방식, 예를 들어, 주사, 경구 투여, 흡입(예를 들어, 비강내 또는 기관내), 경피 적용, 또는 직장 투여에 의한 것일 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 용량을 통해 이루어질 수 있다. 약제학적 조성물은 비경구로, 즉, 관절내로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여된다 (예를 들어, 미국 특허 제5,286,634호 참조). 세포내 핵산 전달은 Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); 및 Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993)에서 또한 논의되었다. 지질 기반 치료제를 투여하는 또 다른 방법이 예를 들어, 미국 특허 제3,993,754호; 제4,145,410호; 제4,235,871호; 제4,224,179호; 제4,522,803호; 및 제4,588,578호에 설명된다. 지질 입자는 질환 부위에서 직접 주사 또는 질환 부위로부터 먼 부위에서 주사에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71 (1994) 참조). 전술한 참고 문헌의 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 조성물은, 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합으로, 흡입을 통해 (예를 들어, 비강내로 또는 기관내내) 투여될 에어로졸 제형으로 만들어질 수 있다 (즉, 이들은 "분무화"될 수 있다) (Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989) 참조). 에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용되는 추진제에 넣어질 수 있다.

특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 비강내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 핵산 조성물을 전달하는 방법이 예를 들어, 미국 특허 번호 5,756,353 및 5,804,212에 설명된다. 마찬가지로, 비강내 미세입자 수지 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용하는 약물 전달이 (미국 특허 제5,725,871호) 또한 제약 분야에서 공지이다. 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점먁 약물 전달이 미국 특허 제5,780,045호에 설명된다. 전술한 특허의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

예를 들어, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 버퍼, 정균제, 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명의 실시에서, 조성물은 바람직하게는 예를 들어, 정맥내 주입에 의해, 경구로, 국소로, 복강내로, 방광내로, 또는 척수강내로 투여된다.

일반적으로, 정맥내로 투여되는 경우, 지질 입자 제제는 적합한 약제학적 담체와 함께 제제화된다. 많은 약제학적으로 허용되는 담체가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제제가, 예를 들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에서 발견된다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있고, 알부민, 지질단백질, 글로불린 등과 같이 향상된 안정성을 위한 당단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 일반 완충 식염수(135-150 mM NaCl)가 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 것이지만, 다른 적합한 담체도 충분할 것이다. 이러한 조성물은 여과와 같은 통상적인 리포좀 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리적 조건에 가깝게 하기 위해 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 등장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 및 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 위에서 언급한 기술을 사용하여 멸균될 수 있거나, 대안으로, 멸균 조건 하에서 생성될 수 있다. 생성된 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에 여과 및 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다.

특정 투여에서, 본원에 개시된 지질 입자는 개체에 대한 경구 투여를 통해 전달될 수 있다. 입자는 부형제와 함께 혼입되고 섭취 가능 정제, 박칼정, 트로키, 캡슐, 환제, 로젠지, 엘릭시르, 구강세정제, 현탁액, 구강 스프레이, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,515, 5,580,579, 및 5,792,451 참조, 이들의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 이들 경구 제형은 다음을 또한 포함할 수 있다: 결합제, 젤라틴; 부형제, 윤활제, 및/또는 풍미제. 단위 제형이 캡슐인 경우, 상기 물질에 추가하여, 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 물론, 임의의 단위 제형 제조에서 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다.

전형적으로, 이러한 경구 제제는 최소 약 0.1% 이상의 지질 입자를 포함할 수 있지만, 입자의 백분율은 물론, 다양할 수 있고 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1% 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 이상일 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중의 입자의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어질 방식으로 준비될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감시, 투여 경로, 제품 저장 수명 및 기타 약리학적 고려사항과 같은 요인이 그러한 약제학적 제제를 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 그와 같이 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.

경구 투여에 적합한 제제는 다음으로 이루어질 수 있다: (a) 액체 용액, 예컨대 물, 식염수, 또는 PEG 400와 같은 희석제에 현탁된 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)와 같은 유효량의 포장된 치료제; (b) 캡슐, 사쉐, 또는 정제, 각각 액체, 고체, 과립, 또는 젤라틴으로서 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)과 같은 소정량의 치료제를 포함함; (c) 적절한 액체 중의 현탁액; 및 (d) 적합한 에멀젼. 정제 형태는 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 칼슘 포스페이트, 옥수수 전분, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 젤라틴, 콜로이드 실리콘 다이옥사이드, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 기타 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 풍미제, 염료, 붕해제, 및 약제학적으로 상용성인 담체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 풍미제, 예를 들어, 수크로스에 있는 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)과 같은 치료제뿐만 아니라, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 에멀젼, 겔 등과 같은 불활성 기제에 치료제를 포함하는 패스틸을 포함할 수 있고, 치료제에 추가하여, 당해 분야에 공지인 담체를 포함한다.

이들의 사용의 또 다른 예에서, 지질 입자는 광범위한 국소 제형으로 통합될 수 있다. 예를 들어, LNP와 같은 핵산-지질 입자를 포함하는 현탁액이 제제화되고 겔, 오일, 에멀젼, 국소 크림, 페이스트, 연고, 로션, 폼, 무스 등으로서 투여될 수 있다.

본 발명의 지질 입자의 약제학적 제제를 제조할 때, 빈 입자 또는 외부 표면과 관련된 핵산과 같은 치료제가 있는 입자를 감소시키거나 제거하기 위해 정제된 입자의 양을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 다양한 숙주에서 실시될 수 있다. 바람직한 숙주는 영장류(예를 들어, 인간 및 침팬지뿐만 아니라 다른 비인간 영장류), 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 설치류(예를 들어, 래트 및 마우스), 토끼, 및 돼지와 같은 포유동물 종을 포함한다.

투여되는 입자의 양은 치료제(예를 들어, 핵산) 대 지질의 비율, 사용되는 특정 치료제 (예를 들어, 핵산), 치료되는 질환 또는 장애, 환자의 연령, 체중, 및 상태, 및 임상의의 판단에 따라 달라질 것이지만, 일반적으로 체중 킬로그램당 약 0.01 내지 약 50 mg, 바람직하게는 체중의 약 0.1 내지 약 5 mg/kg, 또는 투여당 약 10⁸-10¹⁰ 입자(예를 들어, 주사)일 것이다.

시험관내 투여

시험관내 적용을 위해, 핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)과 같은 치료제는 식물 또는 동물 기원, 척추 동물 또는 무척추 동물, 및 임의의 조직 또는 유형의 배양에서 성장한 임의의 세포로 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

시험관내에서 수행될 때 세포와 지질 입자 사이의 접촉은, 생물학적으로 상용성인 배지에서 일어난다. 입자의 농도는 특정 응용분야에 따라 크게 달라지지만, 일반적으로 약 1 μmol 내지 약 10 mmol이다. 지질 입자를 사용한 세포의 처리는 일반적으로 약 1 내지 48 시간, 바람직하게는 약 2 내지 4 시간의 기간 동안 생리학적 온도(약 37℃)에서 수행된다.

바람직한 실시양태의 한 그룹에서, 지질 입자 현탁액은 약 10³ 내지 약 10⁵ 세포/ml, 더욱 바람직하게는 약 2×10⁴ 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 60-80% 포화(confluent) 플레이팅된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가되는 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 내지 0.2 μg/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.1 μg/ml이다.

엔도솜 방출 파라미터(ERP) 분석을 사용하여, LNP 또는 본 발명의 다른 지질 입자의 전달 효율이 최적화될 수 있다. ERP 분석은 미국 특허 공개 번호 제20030077829호에 상세히 설명되고, 이의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 더욱 구체적으로, ERP 분석의 목적은 엔도솜 막에 대한 결합/흡수 또는 막과의 융합/막의 불안정화에 대한 상대적 효과를 기반으로 LNP의 다양한 양이온성 지질 및 헬퍼 지질 성분의 효과를 구별하는 것이다. 이 분석은 LNP 또는 다른 지질 입자의 각 성분이 전달 효율에 어떻게 영향을 미치는지 정량적으로 결정하여, LNP 또는 다른 지질 입자를 최적화하도록 한다. 일반적으로, ERP 분석은 리포터 단백질(예를 들어, 루시퍼레이스, β-갈락토시데이스, 녹색 형광 단백질 (GFP), 등)의 발현을 측정하고, 일부 예에서, 발현 플라스미드에 최적화된 LNP 제제가 간섭 RNA 또는 mRNA 캡슐화에도 적절할 것이다. 다른 예에서, ERP 분석은 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 존재 또는 부재에서 표적 서열의 전사 또는 번역의 하향조절을 측정하도록 조정될 수 있다. 다른 예에서, ERP 분석은 mRNA의 존재 또는 부재에서 표적 단백질의 발현을 측정하도록 조정될 수 있다. 다양한 LNP 또는 다른 지질 입자 각각에 대한 ERP를 비교함으로써, 최적화된 시스템, 예를 들어, 세포에서 가장 많이 흡수되는 LNP 또는 다른 지질 입자를 쉽게 결정할 수 있다.

지질 입자의 전달을 위한 세포

본 발명의 조성물 및 방법은, 생체내 및 시험관내에서 다양한 세포 유형을 처리하기 위해 사용된다. 적합한 세포는, 예를 들어, 조혈 전구체 (줄기) 세포, 섬유모세포, 각질세포, 간세포, 내피 세포, 골격 및 평활근 세포, 골모세포, 뉴런, 휴지 림프구, 말기 분화 세포, 느린 또는 비순환 일차 세포, 실질 세포, 림프계 세포, 상피 세포, 뼈 세포 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 또는 mRNA)와 같은 핵산은, 예를 들어, 폐암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 항문암 세포, 담관암 세포, 소장암 세포, 위암 세포, 식도암 세포, 담낭암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 충수암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 전립선암 세포, 신장암 세포, 중추신경계의 암 세포, 교모세포종 종양 세포, 피부암 세포, 림프종 세포, 융모막암종 종양 세포, 두경부암 세포, 골육종 종양 세포, 및 혈액암 세포와 같은 암 세포에 전달된다.

하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 또는 mRNA)를 캡슐화하는 LNP와 같은 지질 입자의 생체내 전달은 임의의 세포 유형의 세포 표적화에 적합하다. 방법 및 조성물은 예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 설치류(예를 들어, 마우스,래트 및 기니피그), 토끼, 돼지 및 영장류(예를 들어 원숭이, 침팬지 및 인간)와 같은 포유동물을 포함하는 다양한 척추 동물의 세포와 함께 사용될 수 있다.

세포의 조직 배양이 요구될 수 있는 경우에, 이는 당해 분야에서 공지이다. 예를 들어, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), 및 여기에 인용된 참고문헌이 세포의 배양에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 배양된 세포 시스템은 흔히 세포의 단층 형태일 것이지만, 세포 현탁액도 사용된다.

지질 입자의 검출

일부 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 시간 이상에서 대상에서 검출 가능하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, LNP)는 입자의 투여 후 약 8, 12, 24, 48, 60, 72, 또는 96 시간, 또는 약 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25, 또는 28 일에 대상에서 검출 가능하다. 입자의 존재는 대상의 세포, 조직, 또는 기타 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 입자는, 예를 들어, 입자의 직접 검출, 간섭 RNA (예를 들어, siRNA) 서열 또는 mRNA 서열과 같은 치료적 핵산의 검출, 관심 표적 서열의 검출에 의해 (즉, 관심 서열의 발현 변화 검출에 의해), 또는 이들의 조합에 의해 검출될 수 있다.

입자의 검출

LNP와 같은 본 발명의 지질 입자는 당해 분야에서 공지인 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 표지는 당해 분야에서 공지인 방법을 사용하여 지질 입자의 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 다양한 표지가 사용될 수 있고, 표지의 선택은 요구되는 감도, 지질 입자 성분과의 접합 용이성, 안정성 요건, 및 이용 가능 기기 및 폐기 규정에 따른다. 적합한 표지는 스펙트럼 표지, 예컨대 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 Oregon Green™; 로다민 및 유도체, 예컨대 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 등, 이콕시게닌, 비오틴, 피코에리트린, AMCA, CyDyes™, 등; 방사성표지, 예컨대 ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P, ³³P, 등; 효소, 예컨대 호스 래디쉬 퍼옥시데이스, 알칼라인 포스퍼테이스 등; 스펙트럼 비색 표지, 예컨대 콜로이드 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 비드, 예컨대 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표지는 당해 분야에 공지인 임의의 수단을 사용하여 검출될 수 있다.

핵산의 검출

핵산(예를 들어, 간섭 RNA 또는 mRNA)은 당해 분야에서 공지인 여러 수단 중 임의의 것에 의해 본원에서 검출되고 정량화된다. 핵산의 검출은 서던 분석, 노던 분석, 겔 전기영동, PCR, 방사성표지, 섬광방출 계수 및 친화성 크로마토그래피와 같은 공지 방법에 의해 진행될 수 있다. 분광광도법, 방사선촬영, 전기영동, 모세관 전기용도, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC), 및 과확산 크로마토그래피와 같은 추가적인 분석 생화학 방법이 또한 사용될 수 있다.

핵산 혼성화 형식의 선택은 중요하지 않다. 다양한 핵산 혼성화 형식이 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 일반적인 형식은 샌드위치 분석 및 경쟁 및 변위 분석을 포함한다. 혼성화 기술은 일반적으로, 예를 들어, "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985)에 설명된다.

혼성화 분석의 민감도는 검출되는 표적 핵산을 증식시키는 핵산 증폭 시스템의 사용을 통해 향상될 수 있다. 분자 프로브로 사용하기 위한 서열 증폭 또는 후속 서브클로닝을 위한 핵산 단편 생성에 적합한 시험관내 증폭 기술이 공지이다. 폴리머레이스 사슬 반응(PCR), 리게이스 사슬 반응(LCR), Qβ-레플리케이스 증폭 및 기타 RNA 폴리머레이스 매개 기술(예를 들어, NASBA™)을 포함하여 그러한 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자에게 안내하기에 충분한 기술의 예가 Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); and Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2002); 및 미국 특허 번호 4,683,202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Landegren et al., Science, 241:1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89:117 (1990); 및 Sooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563 (1995)에서 발견된. 시험관내 증폭된 핵산 클로닝의 개선된 방법은 미국 특허 제5,426,039호에 설명된다. 당해 분야에서 설명된 다른 방법은 핵산 서열 기반 증폭(NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) 및 Qβ-레플리케이스 시스템이다. 이들 시스템은 선택 서열이 존재하는 경우에만 PCR 또는 LCR 프라이머가 연장되거나 결찰되도록 설계된 돌연변이체를 직접 식별하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 선택 서열은 일반적으로, 예를 들어, 비특이적 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고 증폭된 표적 영역은 추후 돌연변이를 나타내는 특이적 서열에 대해 프로빙된다. 전술한 참고 문헌의 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

프로브로서 사용하기 위한 핵산, 예를 들어, 시험관내 증폭 방법에서, 유전자 프로브로서, 또는 억제제 성분으로서 사용하기 위한 핵산은 전형적으로 Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22:1859 1862 (1981)에 설명된 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라, 예를 들어, Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)에 설명된 바와 같이 자동화 합성기를 사용하여 화학적으로 합성된다. 폴리뉴클레오타이드의 정제는, 필요한 경우, 일반적으로 Pearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983)에 기재된 바와 같이 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온 교환 HPLC에 의해 수행된다. 합성 폴리뉴클레오타이드의 서열은 Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499의 Maxam and Gilbert (1980)의 화학적 분해 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

전사 수준 결정을 위한 대체 수단은 제자리 혼성화이다. 제자리 혼성화 분석은 공지이고 일반적으로 Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649 (1987)에 설명된다. 제자리 혼성화 분석에서, 세포는 고체 지지체, 전형적으로 유리 슬라이드에 고정된다. DNA가 프로브로 되어야 할 경우, 세포는 열 또는 알칼리로써 변성된다. 이후 세포는 적당한 온도에서 혼성화 용액과 접촉되어 표지되는 특정 프로브의 어닐링을 허용한다. 프로브는 바람직하게는 방사성 동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.

실시예

본 발명은 특정 실시예를 통해 더 상세히 설명될 것이다. 다음의 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 임의의 방식으로 본 발명의 제한하도록 의도되지 않는다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 산출하도록 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 비필수 파라미터를 인식할 것이다.

실시예

실시예 1

본 발명의 예시적인 액체 제제가 하기 표에 나타나고, 여기서:

CL₁은

또는 이의 염이다.

예시적인 지질 제제

제제는 다음 절차를 사용하여 제조되었다.

기재된 지질 동일성 및 몰비를 사용하여 100% 에탄올 중의 지질 스탁이 제조되었다 (약 7 mg/mL 총 지질 함량). mRNA를 아세테이트 pH 5 및 뉴클레이스가 없는 물에 희석하여 100 mM 아세테이트 pH 5 중의 0.366 mg/mL mRNA의 농도에 도달했다. 미국 특허 번호 9,404,127에 설명된 직접 희석 방법을 사용하여 동일한 부피의 각 용액을 T-커넥터에서 400 mL/분으로 블렌딩하고, 약 4 부피의 PBS, pH 7.4로 희석했다. 이후 제제를 Slide-A-Lyzer 투석 유닛(MWCO 10,000)에 넣고 밤새 10 mM 트리스, 500 mM NaCl pH 8 (트리스/NaCl 버퍼) 투석했다. 투석 후 제제를 VivaSpin 농축기 유닛 (MWCO 100,000)을 사용하여 약 0.6mg/mL로 농축한 다음 0.2 um 주사기 필터를 통해 여과했다.

실시예 2 생체내 분석

일반적으로, LNP가 5-8 주령 암컷 Balb/C 마우스에게 0.5 mg/kg으로 정맥내 주사되었고, 혈액이 투여 후 4-6 시간에 수집되었다; 혈액이 K2EDTA로 수집되고 혈장으로 가공된 다음, 분석까지 -80^oC에서 냉동 보관되었다. 제조업체의 지시에 따라 StemCell(카타로그 # 01630) 또는 R&D Systems(카타로그 DEP00)의 인간 EPO ELISA 키트를 사용하여 인간 EPO 발현에 대한 혈장을 테스트하여 활성이 분석되었다. 데이터는 다음 표에 제공된다.

표 1의 데이터로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 조성물은 TTR 아밀로이드증의 치료용으로 승인된 LNP 제품인 파티시란(Onpattro)에서 사용된 MC3 조성물보다 훨씬 더 효력이 있다.

표 1. Balb/C 마우스(n=4)에서 IV 투여 4 시간 후 인간 EPO mRNA를 포함하는 0.5 mg/kg 액체 1 조성물 및 파티시란 조성물의 효능

지질 조성물	EPO (mU/mL)	Stdev (mU/mL)
CL1이 있는 지질 1 조성물 (1.5 : 50.0 : 38.5 : 10.0)	136439	17373
MC3가 있는 파티시란 조성물 (1.5 : 50.0 : 38.5 : 10.0)	42230	2697

상기 설명은 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 의도된 것임을 이해해야 한다. 상기 설명을 읽으면 많은 실시양태가 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로 본 발명의 범위는 상기 설명을 참조하여 결정되어야 하는 것이 아니라, 대신 첨부된 청구범위를 참조하여, 그러한 청구항이 권리를 부여하는 균등물의 완전한 범위와 함께 결정되어야 한다. 특허 출원, 특허, PCT 공보, 및 젠뱅크 수탁 번호를 포함하는 모든 논문 및 참고 문헌의 개시는 모든 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다.

Claims (14)

1. 다음을 포함하는 지질 나노입자:
   (a) 하나 이상의 핵산 분자;
   (b) 콜레스테롤;
   (c) DSPC;
   (d) PEG-C-DMA; 및
   (e) 다음 화학식의 양이온성 지질:
   

   

   
   또는 이의 염, 여기서 PEG-C-DMA, 양이온성 지질, 콜레스테롤, 및 DSPC에 대한 총 지질의 몰 백분율은 다음과 같다:
   PEG-C-DMA: 약 1.5;
   양이온성 지질: 약 50.0;
   콜레스테롤: 약 38.5; 및
   DSPC: 약 10.0.
2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 분자는 siRNA를 포함하는 지질 나노입자.
3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산 분자는 mRNA를 포함하는 지질 나노입자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 17 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는 지질 나노입자.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 18 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는 지질 나노입자.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 19 초과인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는 지질 나노입자.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 22 내지 약 25인 (총 지질):(핵산) 중량비를 갖는 지질 나노입자.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 지질 나노입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
9. 피하 투여용으로 제제화되는 제8항의 약제학적 조성물.
10. 세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 지질 나노입자와 접촉시키는 것을 포함하는 핵산을 세포에 전달하는 방법.
11. 기능성 단백질의 결핍을 초래하는 유전적 결함을 특징으로 하는 질환 치료 방법으로서, 다음을 포함하는 방법: 질환이 있는 대상에게, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 지질 나노입자를 투여하는 것, 여기서 핵산 분자는 기능성 단백질 또는 기능성 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 mRNA임.
12. 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질환 치료 방법으로서, 질환이 있는 대상에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 지질 나노입자를 투여하는 것을 포함하는 방법, 여기서 핵산 분자는 과발현된 폴리펩타이드의 발현을 표적으로 하는 siRNA임.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 단백질의 결핍을 초래하는 유전적 결함을 특징으로 하는 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 지질 나노입자.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 과발현을 특징으로 하는 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 지질 나노입자.