KR20210032408A - 항-a베타 항체, 그의 항원-결합 단편 및 그의 적용 - Google Patents
항-a베타 항체, 그의 항원-결합 단편 및 그의 적용 Download PDFInfo
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Abstract
특정 CDR 영역을 갖는 뮤린, 키메라성 또는 인간화 항-A베타 항체, 그의 항원-결합 단편, 그의 약학적 조성물, 및 그의 용도. 아밀로이드 베타 단백질에 의해 야기되는 질환 또는 장애(예컨대, 알츠하이머 질환)의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인간화 항-A베타 항체의 용도.
Description
본 개시는 생명공학 분야에 속한다. 더 구체적으로, 본 개시는 항-β-아밀로이드 항체 및 그의 적용에 관한 것이다.
본 명세서의 설명은 본 발명에 대한 배경기술 정보를 제공할 뿐이고, 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아니다.
β-아밀로이드(아밀로이드-베타, A베타, Aβ)는 β- 및 γ-세크레타제 단백질분해에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 생성된 39-43개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 이는 다양한 세포에 의해 생성될 수 있으며 혈액, 뇌척수액 및 뇌간질액에서 순환한다. 대부분의 β-아밀로이드는 샤페론 분자에 결합하고, 일부는 자유 상태로 존재한다. Aβ는 신경독성이다. 그 함량이 증가하면 세포에 의해 대사될 수 없다. 대신, 세포 내에 다량으로 축적되어 Aβ 노인성 플라크를 형성하고, 결과적으로 뉴런 손상 또는 사망을 촉진한다. 인체에서 Aβ의 가장 일반적인 아형은 Aβ1-40 및 Aβ1-42이며, 이 중 Aβ1-42는 더 독성이고 응집하여 Aβ 플라크의 코어를 형성하기 쉬우며 신경독성 효과를 촉발시킨다 ("Medical Review", 2009, 15 (23): 3575-3577).
알츠하이머 질환(알츠하이머 병, AD)은 1906년에 독일 정신과 의사이자 신경학자인 알츠하이머 알로이스가 처음 발견했으며, 그의 이름을 따서 명명되었다. 이는 노인성 치매라고도 알려져 있으며, 만성 신경퇴행성 질환이다. 알츠하이머 질환의 주요 임상적 징후는 점진적인 기억 상실, 인지 장애, 비정상적인 행동, 및 사회적 장애를 포함한다. 연구에 따르면 알츠하이머 질환 환자는 주로 다음과 같은 병리학적 특징을 갖는다: 대뇌 피질과 해마에서 β-아밀로이드의 응집에 의해 형성되는 노인성 플라크, 타우 단백질의 비정상적인 응집에 의해 형성되는 신경섬유 매듭, 및 피질 및 해마 내 감소된 신경 세포. Aβ의 침착(deposition)은 뉴런의 퇴행성 변화와 관련이 있을뿐만 아니라, 성상세포와 소교 세포의 활성화, 혈액-뇌 장벽의 파괴 및 미세순환의 변화 등을 포함하는, 일련의 병리학적 사건을 활성화할 수 있다. 이는 뇌의 노인성 플라크 주변의 신경원 변성 및 알츠하이머 질환 환자 사망의 주요 원인이다 (Oh, E.S., Troncoso, J.C. & Fangmark Tucker, S.M. Neuromol Med (2008) 10: 195).
Aβ의 침착은 알츠하이머 질환의 노인성 플라크에서 발견되었을 뿐만 아니라, 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA, 콩고필릭 아밀로이드 혈관병증이라고도 함)과 같은, 다른 대뇌 아밀로이드 질환에서도 다량으로 발견되었다. CAA에서 발견되는 Aβ의 침착은 주로 짧은 형태의 Aβ(Aβ1-40)로 구성되고, 소량의 Aβ1-42도 수반한다 (Wilcock et al., Journal of Neuroinflammation 1 (24): 1-11 (2004)).
알츠하이머 질환의 발병에서 Aβ의 중요한 역할과, Aβ의 독성이 그 양, 응집 정도 및 제거율에 따라 달라짐에 따라, 연구자들은 Aβ 질환을 방해하는 다양한 방법을 지속적으로 개발하였고, Aβ의 생성을 감소시키고, Aβ 축적 및 침착을 방지하며 Aβ의 독성을 방해함으로써 알츠하이머 질환의 진행을 지연시키거나 차단하려는 시도를 하였다. 아두카누맙(바이오젠), 바피뉴주맙(얀센, 엘란, 화이자), 솔라네주맙(일라이 릴리), 간테네루맙(호프만-라로슈), 및 특허 출원번호 WO1994017197A1, WO1998044955A1, WO2003016466A3, WO2003070760A3, WO2004071408A3, WO2006081171A1, WO2007108756A1, WO2008011348A3, WO2008081008A1, WO2012051498A3 등에 개시된 항-Aβ 항체를 포함하여, Aβ에 대한 다양한 항체가 공개되었다. 그러나, 큰 기대를 받았으나 임상 3상에서 실패했던 바피뉴주맙 및 솔라네주맙을 포함하여 대부분의 항체가 실패로 끝났다. 현재, 아두카누맙만이 임상 3상 단계에 있으며, 알츠하이머 질환 치료 승인을 약속하는 유일한 새로운 항-Aβ 항체로 여겨지지만, 마케팅 적격 여부를 확인하기 위해서는 추가적인 임상 시험 결과가 여전히 필요하다.
따라서, β-아밀로이드(예컨대 AD)에 의해 야기되는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 새로운 구조를 갖는 항-A베타 항체를 개발할 시급한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명자들은 광범위한 실험 연구를 거쳐 완전히 새로운 구조를 갖는 항-A베타 항체 및 그의 항원-결합 단편을 개발하였다. 항-A베타 항체 및 그의 항원-결합 단편은 높은 친화도로 인간 A베타에 특이적으로 결합할 수 있으며, 우수한 효율을 나타낸다. 이는 A베타에 의해 야기되는 질환 또는 장애(예를 들어, 알츠하이머 질환)의 치료 또는 예방에 유용할 것으로 기대된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 인간 A베타에 특이적으로 결합하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 하기 아미노산 서열로부터 선택되거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 CDR 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다:
(1) 서열번호 11, 17 또는 23에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1 영역의 아미노산 서열;
(2) 서열번호 12, 18, 24 또는 52에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR2 영역의 아미노산 서열;
(3) 서열번호 13, 19, 25 또는 27에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR3 영역의 아미노산 서열;
(4) 서열번호 14 또는 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR1 영역의 아미노산 서열;
(5) 서열번호 15 또는 21에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR2 영역의 아미노산 서열; 및
(6) 서열번호 16, 22, 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR3 영역의 아미노산 서열.
위에서 지시된 바와 같은 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 이는 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고; 더 바람직하게는,이는 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 상술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체는 약 10-7M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 Aβ1-42 피브릴 및/또는 Aβ1-42 단량체에 결합하고; 바람직하게는, 약 10-8M, 10-9M 미만, 또는 10-10M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합한다. KD 값은 비아코어 T200 기기에서 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 A베타는 Aβ1-42 피브릴 및 Aβ1-42 단량체이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 중 임의의 하나로 나타낸 바와 같은 HCDR1-3 영역 또는 LCDR1-3 영역을 포함한다:
(i) 각각 서열번호 11, 12 및 13의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
(ii) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
(iii) 각각 서열번호 23, 24 및 25의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
(iv) 각각 서열번호 17, 18 및 27의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
(v) 각각 서열번호 17, 52 및 19의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
(vi) 각각 서열번호 17, 52 및 27의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역;
및/또는
(vii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역;
(viii) 각각 서열번호 20, 21 및 22의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역;
(viiii) 각각 서열번호 20, 21 및 26의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역; 또는
(x) 각각 서열번호 20, 21 및 53의 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역.
일부 실시양태에서, 본 개시의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 A 내지 D로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다:
A) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR3 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR3 영역을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
B) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR3 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR3 영역을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
C) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 23에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 24에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 25에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR3 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR3 영역을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
D) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 27에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR3 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR1 영역, 아미노산 서열 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR2 영역 및 아미노산 서열 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 경쇄 LCDR3 영역을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린, 키메라성, 인간화, 또는 완전한 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 항체이고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 3, 5, 7 또는 9에 나타내거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 및/또는
상기 항체의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8 또는 10에 나타내거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 지시된 바와 같은 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 이는 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고; 더 바람직하게는, 이는 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 상술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 약 10-7M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 약 10-8M, 10-9M 미만, 또는 10-10M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합하고, KD 값은 비아코어 T200 기기에서 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 A베타는 Aβ1-42 피브릴 및 Aβ1-42 단량체이다.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 E 내지 H로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다:
E) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
F) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
G) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
H) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
본 개시의 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간화 항체이다. 바람직하게, 상기 항체의 FR 영역 서열은 인간 생식계열 항체 FR 영역 서열 또는 그의 변이체로부터 유래된다. 바람직하게는, 필요에 따라, 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; 더 바람직하게는, FR 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에서 각각 최대 10개의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 44, 46, 48 또는 50에 나타내거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 및/또는
상기 항체의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 45, 47, 49 또는 51에 나타내거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 지시된 바와 같은 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 이는 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고; 더 바람직하게는, 이는 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 상술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 약 10-7M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 약 10-8M, 10-9M 미만, 또는 10-10M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합하고, KD 값은 비아코어 T200 기기에서 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 A베타는 Aβ1-42 피브릴 및 Aβ1-42 단량체이다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 하기 a) 내지 d)의 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 인간화 항체이고:
a) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 44에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 45에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
b) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 47에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
c) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 48에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 49에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
d) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 서열에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
상술된 적어도 90%의 서열 동일성은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 하기 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 가변 영역을 포함하는 인간화 항체이다:
a) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 1E, 71A 및 94R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역;
b) 각각 서열번호 17 및 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 HCDR1 및 HCDR3, 및 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2, 및 28A 및 82B T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역;
c) 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20 및 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 LCDR1 및 LCDR2, 및 서열번호 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 LCDR3, 및 2V 및 45K로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역; 및
d) 각각 서열번호 17 및 서열번호 27에 나타낸 바와 같은 HCDR1 및 HCDR3, 및 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2를 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 2V의 아미노산 복귀 돌연변이를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 하기 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 가변 영역을 포함하는 인간화 항체이고:
a) 아미노산 서열 서열번호 66에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체; 및 아미노산 서열 서열번호 67에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체;
b) 아미노산 서열 서열번호 68에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체; 및 아미노산 서열 서열번호 69에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체;
c) 아미노산 서열 서열번호 70에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체; 및 아미노산 서열 서열번호 71에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체; 및
d) 아미노산 서열 서열번호 72에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체; 및 아미노산 서열 서열번호 73에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 또는 그의 FR 영역 변이체;
상기 FR 영역 변이체는 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에서 별도로 최대 10개의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 M 내지 P로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다:
M) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 44에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 45에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
N) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 47에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
O) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 48에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 49에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
P) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 불변 영역을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역이고, 바람직하게는, 항체 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 42에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 항체 경쇄 불변 영역은 인간 카파 불변 영역으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는, 항체 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 43에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 지시된 바와 같은 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 이는 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고; 더 바람직하게는, 이는 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 상술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-A베타 항체의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 30, 34, 38 또는 40에 나타낸 바와 같거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고, 및/또는
상기 항체의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 31, 35, 39 또는 41에 나타내거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 지시된 바와 같은 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 이는 바람직하게는 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고; 더 바람직하게는, 이는 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는, 이는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 상술된 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 약 10-7M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 약 10-8M, 10-9M 미만, 또는 10-10M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합하고, KD 값은 비아코어 T200 기기에서 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인간 A베타는 Aβ1-42 피브릴 및 Aβ1-42 단량체이다.
일부 실시양태에서, 상기 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 Q 내지 T로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다:
Q) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 30에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 아미노산 서열 서열번호 31에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
R) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 34에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 아미노산 서열 서열번호 35에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
S) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 38에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 아미노산 서열 서열번호 39에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
T) 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 아미노산 서열 서열번호 40에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 아미노산 서열 서열번호 41에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
일부 실시양태에서, 본 개시의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 이항체, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 A베타에 결합하기 위해 상술된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하거나, 또는 동일한 A베타 항원 에피토프에 결합하기 위해 상술된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 경쟁하는 항-A베타 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 또한 상술된 바와 같은 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 U 내지 Z에서 선택되는 임의의 핵산 분자이다:
U) 서열번호 52에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 53에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
V) 서열번호 54에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 55에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
W) 서열번호 56에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
Z) 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
일 구현예에서, 본 개시는 또한 상술된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일 구현예에서, 본 개시는 또한 상술된 재조합 벡터를 형질전환하여 수득된 숙주 세포를 제공하고; 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포, 바람직하게는 진핵생물 세포, 더 바람직하게는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주) 및 NSO 세포를 포함하는, 포유동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 상술된 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이후 항체를 정제 및 회수하는 단계를 포함하는, 상술된 항 A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 또한 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 또한 A베타에 의해 야기되는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상술된 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 또한 치료학적으로 유효량의 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상술된 약학적 조성물을 질환 또는 장애를 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, A베타에 의해 야기되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 또한 A베타-매개 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상술된 약학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상술된 질환 또는 장애는 알츠하이머 질환, 경증 인지 장애, 전측두엽 치매, 루이 신체 질환, 파킨슨 질환, 픽 질환, 베박 질환, 콩고성 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 다운 증후군, 다발성 경색 치매, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환, AIDS 치매 증후군, 우울증, 불안 장애, 공포증, 벨 마비, 간질, 뇌염, 다발성 경화증, 신경근 장애, 신경종양 장애, 뇌종양, 뇌졸중으로 인한 신경혈관 장애, 신경면역 장애, 신경병성 이과 질환, 척수 손상으로 인한 신경외상, 신경병성 통증으로 인한 통증, 소아 신경 및 신경정신 장애, 수면 장애, 투렛 증후군, 경증 인지 장애, 혈관성 치매, 다발성 경색 치매, 낭포성 섬유증, 고셔 질환 및 기타 운동이상증 및 중추 신경 시스템의 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질환이다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 또한 치료학적으로 유효량의 상술된 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 상술된 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생화학 시험 및 생체내 약력학적 분석 모두에서 우수한 효율을 나타낸다. 예를 들어, 친화도 검출 분석에서, 본 개시의 항-A베타 항체(HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 및 HAB-9001)는 10-8M 미만, 심지어 10-10M 미만의 Aβ1-42 피브릴에 대한 친화도, 및 10-7M 내지 10-8M 미만의 Aβ1-42 단량체에 대한 친화도를 나타낸다. 특히, 항체 HAB-9001은 현재 가장 우수한 항-A베타 항체로 알려진 아두카누맙보다 거의 100배 더 강한 친화도를 나타낸다.
또한, Aβ1-42 단량체의 Aβ1-42 피브릴로의 응집을 차단하는 항체의 효과를 분석한 결과는, 본 개시의 항체 HAB-2401, HAB-5101 및 HAB-9001이 Aβ1-42 단량체의 Aβ1-42 피브릴로의 응집을 효과적으로 억제할 수 있는 반면, 아두카누맙은 억제할 수 없음을 보여준다.
생화학 시험 결과는, 본 개시의 항-A베타 항체 HAB-2401 및 HAB-3601이 랫트 1차 뉴런을 보호하는 데 효과가 있고 1차 미세아교 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용을 촉진할 수 있음을 보여준다.
또한, 동물의 약력학적 분석 결과는, 본 개시의 항체 HAB-2401, HAB-5101 및 HAB-9001이 5×FAD 알츠하이머 마우스의 공간 기억 및 인지 능력을 현저히 향상시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 본 개시의 항체는 양성 항체 아두카누맙과 비교할 때, 뇌 조직에서 사이토카인(예컨대 TNFα, IFN-γ, IL1β, IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, MCP-1 및 KC)의 방출에 더 낮은 영향을 미치고, 이는 본 개시의 항체가 안전 위험성 측면에서 제어가능함을 나타낸다. 본 개시의 항-A베타 항체는 향후 A베타에 의해 야기되는 질환 또는 장애(예컨대 알츠하이머 질환)의 치료 또는 예방에 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 Aβ1-42 단량체의 Aβ1-42 피브릴로의 응집에 대한 항-A베타 항체의 차단 효과의 실험 결과를 보여주는, 티오플라빈(ThT) 형광 분석을 나타낸다;
도 2는 랫트 1차 뉴런에 대한 항-A베타 항체의 보호 효과의 실험 결과를 보여주는, 1차 피질 뉴런에 대한 보호 분석을 나타낸다;
도 3은 BV2 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용을 촉진하는 항-A베타 항체의 실험 결과를 보여주는, BV2 식균작용 분석을 나타낸다;
도 4는 랫트 1차 미세아교 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용에 대한 항-A베타 항체의 효과의 실험 결과를 보여준다;
도 5는 둥지를 만드는 마우스의 능력을 점수매기기 위한 대표적인 사진이다;
도 6은 둥지 실험을 나타내고, 막대 그래프는 5×FAD 트랜스제닉 마우스의 사회적 행동 개선에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 7은 둥지 실험을 나타내고, 산포도는 5×FAD 트랜스제닉 마우스의 사회적 행동 개선에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 8은 물 미로의 개략도를 보여준다. 실선 원과 점선 원은 각각 플랫폼과 플랫폼 구역의 위치를 나타낸다;
도 9는 물 미로 실험에 대한 학습 곡선을 나타내고; 숨겨진 플랫폼 훈련 및 학습의 곡선 결과를 보여준다. 이원 분산분석(two way ANOVA)은 분산의 이원 분석을 지칭한다. 분석 결과는 다음과 같다:
이원 분산분석: WT 대 비히클: # p<0.05; ###: p<0.001;
Amab 대 비히클:
: p<0.05; 
: p<0.01; 
: P<0.001;
HAB-5101-Ch 대 비히클: ^: p<0.05;
HAB-2401-Ch 대 비히클: ◆: p<0.05; ◆◆: p<0.01;
HAB-9001-Ch 대 비히클: *: p<0.05; **: p<0.01; ***: P<0.001.
도 10a-10g는 물 미로 실험의 결과를 보여준다: 수평축은 약물 투여군을 보여준다; 도 10a는 플랫폼에 도착하는 지연 시간(latency time)의 결과를 보여주고, 도 10b는 플랫폼 구역에 도착하는 지연 시간의 결과를 보여주고, 도 10c는 플랫폼을 교차하는 횟수의 결과를 보여주고, 도 10d는 플랫폼 구역을 교차하는 횟수의 결과를 보여주고, 도 10e는 플랫폼에서의 지속시간(duration)의 결과를 보여주고, 도 10f는 플랫폼 구역에서의 지속시간의 결과를 보여주며, 도 10g는 플랫폼 교차 지수의 결과를 보여주고(교차 지수 = 목표 영역을 교차하는 횟수 - (다른 3개 사분면의 해당 영역을 교차하는 횟수의 합계)/3), 도 10b-10g의 범례는 도 10a의 범례와 동일하다(자세한 내용은 도 10a의 범례 참조). 일원 분산분석은 분산의 일원 분석을 지칭한다(도 12 및 13의 경우 동일), 비히클 대비, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 군 사이에 유의한 차이가 검출되지 않음;
도 11a-11d는 Aβ 침착 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 도 11a는 해마에 존재하는 불용성 Aβ1-40의 함량을 보여주고, 도 11b는 해마에 존재하는 불용성 Aβ1-42의 함량을 보여주고(도 11b의 범례는 도 11a의 범례와 동일하고, 자세한 내용은 도 11a 참조), 도 11c는 피질에 존재하는 불용성 Aβ1-40의 함량을 보여주고, 도 11d는 피질에 존재하는 불용성 Aβ1-42의 함량을 보여준다(도 11d의 범례는 도 11c의 범례와 동일하고, 자세한 내용은 도 11c 참조);
도 12는 해마 내 Aβ를 나타내는 그래프로서, Aβ 침착(피질)의 IHC 검출 결과를 나타낸다. 일원 분산분석, 비히클 대비 ***p<0.001;
도 13은 Aβ 침착(해마)의 IHC 검출 결과를 나타내는, 피질 내 Aβ를 보여준다;
도 14a는 뇌 조직에서 사이토카인, TNFα의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14b는 뇌 조직에서 사이토카인, IFN-γ의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14c는 뇌 조직에서 MCP-1의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14d는 뇌 조직에서 KC의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15a는 뇌 조직에서 사이토카인, IL1β의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15b는 뇌 조직에서 사이토카인, IL2의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15c는 뇌 조직에서 사이토카인, IL6의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15d는 뇌 조직에서 사이토카인, IL12p70의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15e는 뇌 조직에서 사이토카인 IL4의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15f는 뇌 조직에서 사이토카인, IL10의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다.
도 2는 랫트 1차 뉴런에 대한 항-A베타 항체의 보호 효과의 실험 결과를 보여주는, 1차 피질 뉴런에 대한 보호 분석을 나타낸다;
도 3은 BV2 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용을 촉진하는 항-A베타 항체의 실험 결과를 보여주는, BV2 식균작용 분석을 나타낸다;
도 4는 랫트 1차 미세아교 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용에 대한 항-A베타 항체의 효과의 실험 결과를 보여준다;
도 5는 둥지를 만드는 마우스의 능력을 점수매기기 위한 대표적인 사진이다;
도 6은 둥지 실험을 나타내고, 막대 그래프는 5×FAD 트랜스제닉 마우스의 사회적 행동 개선에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 7은 둥지 실험을 나타내고, 산포도는 5×FAD 트랜스제닉 마우스의 사회적 행동 개선에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 8은 물 미로의 개략도를 보여준다. 실선 원과 점선 원은 각각 플랫폼과 플랫폼 구역의 위치를 나타낸다;
도 9는 물 미로 실험에 대한 학습 곡선을 나타내고; 숨겨진 플랫폼 훈련 및 학습의 곡선 결과를 보여준다. 이원 분산분석(two way ANOVA)은 분산의 이원 분석을 지칭한다. 분석 결과는 다음과 같다:
이원 분산분석: WT 대 비히클: # p<0.05; ###: p<0.001;
Amab 대 비히클:
HAB-5101-Ch 대 비히클: ^: p<0.05;
HAB-2401-Ch 대 비히클: ◆: p<0.05; ◆◆: p<0.01;
HAB-9001-Ch 대 비히클: *: p<0.05; **: p<0.01; ***: P<0.001.
도 10a-10g는 물 미로 실험의 결과를 보여준다: 수평축은 약물 투여군을 보여준다; 도 10a는 플랫폼에 도착하는 지연 시간(latency time)의 결과를 보여주고, 도 10b는 플랫폼 구역에 도착하는 지연 시간의 결과를 보여주고, 도 10c는 플랫폼을 교차하는 횟수의 결과를 보여주고, 도 10d는 플랫폼 구역을 교차하는 횟수의 결과를 보여주고, 도 10e는 플랫폼에서의 지속시간(duration)의 결과를 보여주고, 도 10f는 플랫폼 구역에서의 지속시간의 결과를 보여주며, 도 10g는 플랫폼 교차 지수의 결과를 보여주고(교차 지수 = 목표 영역을 교차하는 횟수 - (다른 3개 사분면의 해당 영역을 교차하는 횟수의 합계)/3), 도 10b-10g의 범례는 도 10a의 범례와 동일하다(자세한 내용은 도 10a의 범례 참조). 일원 분산분석은 분산의 일원 분석을 지칭한다(도 12 및 13의 경우 동일), 비히클 대비, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 군 사이에 유의한 차이가 검출되지 않음;
도 11a-11d는 Aβ 침착 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 도 11a는 해마에 존재하는 불용성 Aβ1-40의 함량을 보여주고, 도 11b는 해마에 존재하는 불용성 Aβ1-42의 함량을 보여주고(도 11b의 범례는 도 11a의 범례와 동일하고, 자세한 내용은 도 11a 참조), 도 11c는 피질에 존재하는 불용성 Aβ1-40의 함량을 보여주고, 도 11d는 피질에 존재하는 불용성 Aβ1-42의 함량을 보여준다(도 11d의 범례는 도 11c의 범례와 동일하고, 자세한 내용은 도 11c 참조);
도 12는 해마 내 Aβ를 나타내는 그래프로서, Aβ 침착(피질)의 IHC 검출 결과를 나타낸다. 일원 분산분석, 비히클 대비 ***p<0.001;
도 13은 Aβ 침착(해마)의 IHC 검출 결과를 나타내는, 피질 내 Aβ를 보여준다;
도 14a는 뇌 조직에서 사이토카인, TNFα의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14b는 뇌 조직에서 사이토카인, IFN-γ의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14c는 뇌 조직에서 MCP-1의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 14d는 뇌 조직에서 KC의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15a는 뇌 조직에서 사이토카인, IL1β의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15b는 뇌 조직에서 사이토카인, IL2의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15c는 뇌 조직에서 사이토카인, IL6의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15d는 뇌 조직에서 사이토카인, IL12p70의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15e는 뇌 조직에서 사이토카인 IL4의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다;
도 15f는 뇌 조직에서 사이토카인, IL10의 방출에 대한 항-A베타 항체의 효과를 보여준다.
용어
본 개시를 더 쉽게 이해하기 위해, 특정 기술적 및 과학적 용어는 구체적으로 하기에 정의된다. 본 명세서에 달리 명확히 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 개시에서 사용된 아미노산에 대한 3문자 코드 및 단일-문자 코드는 J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)에 서술된 바와 같다.
본 개시에서, "XXX"는 하나 이상의 물질을 지칭한다; 예를 들어, "항-A베타 항체"는 A베타에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체로 이해되어야 한다. 따라서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "아밀로이드 β", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "A베타"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, β-세크레타제 1(BACE1)을 사용하여 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 절단함으로써 생성된 세그먼트, 또는 그의 임의의 변형 또는 임의의 기능적 등가물을 지칭하고, Aβ1-40 및 Aβ1-42를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Aβ는 단량체의 형태로 존재하며, 결합하여 올리고머 및 프로토피브릴 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이러한 Aβ 펩티드의 구조 및 서열은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 펩티드를 생성하거나 뇌 및 기타 조직에서 펩티드를 추출하는 방법도 잘 알려져 있다(예를 들어, Glenner and Wong, Biochem Biophys Res. Comm. 129:885 -890(1984)). 또한, Aβ 펩티드는 상업적으로도 이용가능하다. 인간 Aβ의 아미노산 서열의 예로서, 서열번호 1은 Aβ1-40의 아미노산 서열을 나타내고 서열번호 2는 Aβ1-42의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체"는 면역글로불린을 지칭하고, 이는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 사이의 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 4-펩티드 쇄 구조이다. 상이한 면역글로불린 중쇄 불변 영역(들)은 상이한 아미노산 조성 및 배열을 나타내므로, 상이한 항원성을 제시한다. 따라서, 면역글로불린은 5가지 유형으로 분류될 수 있거나, 또는 면역글로불린 이소타입, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 명명되고, 이는 각각 중쇄 μ, δ, γ, α 및 ε에 상응한다. 힌지(hinge) 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 디설파이드 결합의 수 및 위치에 따라, 동일한 유형의 Ig는 상이한 아형으로 나눠질 수 있고, 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눠질 수 있다. 경쇄는 불변 영역(들)의 차이에 따라서 κ 쇄 또는 λ 쇄로서 나눠질 수 있다. Ig의 5가지 각각의 유형은 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
본 개시에서, 항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체를 포함하는, 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고; 항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는, 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 근접한 약 110개의 아미노산 서열은 매우 가변적이고, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있으며, 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다; C-말단에 근접한 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하고, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 상대적으로 보존적인 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 3개의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(VL) 및 각각의 중쇄 가변 영역(VH)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역(들)으로 구성되고, 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음 순서의 순차적인 순서를 갖는다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 지칭한다. 본 명세서에 서술된 항체 또는 항원 결합 단편의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 넘버링(numbering) 기준 및/또는 코티아(Chothia) 넘버링 기준을 따른다((1983) U.S. Dept. of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest).
본 개시의 항체는 뮤린 항체, 키메라성 항체, 인간화 항체, 바람직하게는 인간화 항체를 포함한다.
본 개시에서 서술된 용어 "뮤린 항체"는 본 기술분야의 지식 및 기술에 따라서 제조된 인간 A베타-결합 단일클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 시험 피험체에게 A베타 항원이 주사되고, 이어서 원하는 서열 또는 기능 특징을 보유한 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 본 개시의 일 실시태양에서, 뮤린 A베타 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 및/또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 서술된 바와 같은 용어 "키메라성 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합함에 의한 항체이고, 키메라성 항체는 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라성 항체를 확립하기 위해, 우선, 특이적 뮤린 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마가 확립되고 뮤린 하이브리도마로부터 가변 영역 유전자가 클로닝된다. 이후, 필요할 경우 인간 항체로부터 불변 영역 유전자가 클로닝된다. 뮤린 가변 영역 유전자는 인간 불변 영역 유전자에 연결되어 키메라성 유전자를 형성하고, 이는 이어서 발현 벡터내로 삽입된다. 최종적으로 키메라성 항체 분자가 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현될 것이다. 본 개시의 일 실시양태에서, 키메라성 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체로부터 유래된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 키메라성 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 YTE 돌연변이(들) 또는 복귀-돌연변이(들)와 같은, 아미노산 돌연변이(들)가 있는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체로부터 유래된 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "인간화 항체"는 CDR-그래프팅된 항체로도 알려져 있고, 뮤린 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역 프레임워크에 그래프팅함으로써 생성되는 항체, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 프레임워크 서열로부터 생성된 항체이다. 인간화 항체는 많은 뮤린 단백질 성분을 보유하는 키메라성 항체에 의해 유도되는 이종 반응을 방지할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열이 기록되어 있는 공개된 DNA 데이터 베이스 또는 공개된 참조로부터 입수될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase) 및 문헌[Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed]에서 발견될 수 있다. 면역원성의 감소에 의해 야기되는 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역의 프레임워크 서열은 활성 유지를 위해 최소 역 돌연변이 또는 복귀 돌연변이(들) 될 수 있다. 또한, 본 개시의 인간화 항체는 파지 디스플레이에 의해 CDR 친화도 돌연변이가 수행된 인간화 항체를 포함한다. 본 개시의 일 실시양태에서, A베타 인간화 항체의 CDR 서열은 서열번호 11-27로부터 선택된다. 인간 항체 가변 영역 프레임워크의 경우, 설계 및 선택 후에, 항체 중쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 IGHV1-24*01 및 hjh6.3, IGHV3-30*01 및 hjh6.3 또는 IGHV2-70D*04 및 hjh6.1, 또는 이의 돌연변이 서열의 FR1, FR2, FR3 및 JH6 영역에서 선택되고; 경쇄 FR 영역 서열은 인간 생식계열 IGKV1-27*01 및 hjk4.1, IGKV1-39*01 및 hjk4.1, IGKV2-40*01 및 hjk4.1, IGKV2-40*01 및 hjk2.1, 또는 이의 돌연변이 서열의 FR1, FR2, FR3 및 JK4, JK2 영역에서 선택된다.
CDR의 그래프팅은 항원과 접촉하는 프레임워크 잔기로 인하여, 생성된 A베타 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원에 대한 친화도의 감소를 야기할 수 있다. 이러한 상호작용은 고도의 체세포 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 따라서, 공여 프레임워크 아미노산을 인간화 항체 프레임워크에 그래프팅하는 것이 여전히 필요할 수 있다. 비-인간 A베타 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 유래된 항원 결합에 수반된 아미노산 잔기는 뮤린 단일클론 항체 가변 영역의 서열 및 구조를 검사함으로써 확인될 수 있다. 공여 CDR 프레임워크와 생식계열 사이에 상이한 아미노산 잔기는 관련된 것으로 간주될 수 있다. 가장 근접한 생식계열이 결정될 수 없는 경우, 서열은 아형에 의해 공유되는 공통 서열 또는 높은 유사도 백분율을 갖는 뮤린 서열과 비교될 수 있다. 희귀 프레임워크 잔기는 체세포에 고도의 돌연변이를 야기하고, 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "항원-결합 단편" 또는 "기능적 단편"은 항원에 대한 결합 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 단편이 특정 항원에 결합하는 기능을 달성하는 데 사용될 수 있음이 제시된 바 있다. 용어 "항원 결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진, Fd 단편; (iv) 단일-팔(one-arm) VH 및 VL 도메인으로 이루어진, Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature341: 544-546); 및 (vi) 별도의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커(linker)에 의해 선택적으로 연결된 2개 이상의 개별 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 VL 도메인 및 VH 도메인은 2개의 개별 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결되어, VL 및 VH 도메인을 짝지음에 의해 형성되는 1가 분자인 단일 단백질 쇄를 생성할 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)로 지칭됨, 문헌[Bird et al. (1988): 423-426; Science 242]; 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883] 참조). 또한, 이러한 단일 쇄 항체는 용어 "항원 결합 단편"에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체는 본 기술분야에 알려진 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 온전한 항체에 대한 것과 동일한 방법을 사용하여 기능적 단편이 선별된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 이소타입의 형태, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, Fab는 IgG 항체 분자를 (H 쇄의 위치 224에서 아미노산 잔기를 절단하는) 파파인으로 처리하여 수득되는 항체 단편이다. Fab 단편은 약 50,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 갖는데, 여기서 H 쇄의 N-말단 쪽의 약 절반 및 전체 L 쇄가 디설파이드 결합을 통해 서로 결합된다. 본 개시의 Fab는 (인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는) 본 발명의 단일클론 항체를 파파인으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab를 발현함으로써 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, F(ab')2는 약 100,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 가지며 힌지 위치에서 결합된 2개의 Fab 영역을 포함하는 항체 단편이고, 이는 IgG의 힌지 영역에서 2개의 디설파이드 결합 하류 부분을 펩신으로 소화시킴으로써 생성될 수 있다. 본 개시의 F(ab')2는 (인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는) 본 발명의 단일클론 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 또한, F(ab')2는 후술되는 Fab'을 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합으로 결합시킴으로써 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, Fab'은 약 50,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'은 상술된 F(ab')2의 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 절단함으로써 수득된다. 본 개시의 Fab'은 (A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는) 본 개시의 F(ab')2를 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리함으로써 생성될 수 있다. 또한, Fab'은 항체의 Fab'을 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab'을 발현함으로써 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단일 쇄 항체", "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 항체 경쇄 가변 도메인 (또는 영역; VL)에 연결된 항체 중쇄 가변 도메인 (또는 영역; VH)를 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반적인 구조를 가질 수 있다. 선행기술의 적합한 링커는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는, 예를 들어 1~4개의 반복물을 갖는 이의 변이체로 이루어진다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448). 본 개시에서 사용될 수 있는 기타 링커는 문헌[Alfthan et al. (1995)], 문헌[Protein Eng.8:725-731, Choi et al. (2001), Eur.J.Immuno l.31:94-106], 문헌[Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999)], 문헌[J. Mol. Biol. 293:41-56] 및 문헌[Roovers et al. (2001), Cancer Immunol]에 기재되어 있다. 본 개시의 scFv는 다음 단계에 의해 생성될 수 있다: 인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 scFv를 발현하는 단계.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이항체(diabody)는 scFv가 이량체화된 항체 단편이고, 이는 2가 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가 항원 결합 활성에서, 2개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 개시의 이항체는 다음 단계에 의해 생성될 수 있다: 인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, 링커 펩티드의 길이가 8 아미노산 잔기 또는 그 이하가 되도록 scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 이항체를 발현하는 단계.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, VH 및 VL 각각에서 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환하고, 이후 치환된 폴리펩티드를 2개의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합을 통해 연결함으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 항체의 3차 구조 예측을 기반으로 공지된 방법(Protein Engineering, 7,697(1994))에 따라 선택될 수 있다. 본 개시의 dsFv는 다음 단계에 의해 생성될 수 있다: 인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, dsFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 dsFv를 발현하는 단계.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, CDR-함유 펩티드는 VH 또는 VL CDR의 하나 이상의 영역으로 구축된다. 다수의 CDR을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적절한 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 개시의 CDR-함유 펩티드는 다음 단계에 의해 생성될 수 있다: 인간 A베타를 특이적으로 인식하고 이의 세포외 영역 또는 3차 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 펩티드를 발현하는 단계. 또한 CDR-함유 펩티드는 Fmoc 방법 또는 tBoc 방법과 같은 화학적 합성 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "CDR"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체 가변 도메인 내의 6개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 6개의 CDR의 정의 중 가장 일반적으로 사용되는 것은 문헌[Kabat E.A. et al. ((1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)]에 제시된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, CDR의 카밧 정의는 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2, 및 CDR3(CDR L1, CDR L2, CDR L3 또는 L1, L2, L3), 및 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3 또는 H2, H3)에 적용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체 프레임워크"는 가변 도메인, VL 또는 VH의 부분을 지칭하고, 이는 가변 도메인의 항원 결합 고리(CDR)에 대한 스캐폴드(scaffold)로서 기능한다. 본질적으로, 이는 CDR을 갖지 않는 가변 도메인이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "에피토프" 또는 "항원 결정인자" 또는 "항원 에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부위(예를 들어 A베타 분자의 특정 부위)를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 인접 또는 비-인접 아미노산을 고유한 3차 형태로 포함한다. (Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합" 및 "특이적으로 결합"은 미리 결정된 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만, 예를 들어 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 이하의 친화도(KD)로 결합한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 개시의 항체는 예를 들어 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술에 의해 비아코어 T200 기기로 측정시, 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 인간 A베타에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "경쟁적 결합" 및 "경쟁적으로 결합"은 본 개시의 단일클론 항체의 것과 동일한 인간 A베타 상의 에피토프(항원 결정인자라고도 함) 또는 동일한 에피토프의 일부를 인식하고 결합하는 항체를 지칭한다. 본 개시의 단일클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 본 개시의 단일클론 항체에 의해 인식되는 인간 A베타 아미노산 서열을 인식하고 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "경쟁"이 동일 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질의 경우에 사용될 때(예를 들어, 항원 결합 단백질 중화(neutralizing) 또는 항체 중화), 이는 항원 결합 단백질들 사이에 경쟁이 일어남을 의미하고, 이는 시험되는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 면역 기능적 단편)은 공통 항원(예를 들어, PD-L1 항원 또는 이의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는(예를 들어, 감소시킴) 분석에 의해 측정된다. 하나의 항원 결합 단백질이 다른 하나와 경쟁하는지 여부를 측정하기 위해 다양한 유형의 경쟁적 결합 분석이 사용될 수 있다. 이들 분석은, 예를 들어, 고상 직접 또는 간접 방사성면역분석(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, Stahli et al., 1983, Methodsin Enzymology 9:242-253 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(에를 들어, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619 참조), 고상 직접 표지 분석, 고상 직접 표지 샌드위치 분석(예를 들어, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(예를 들어, Morel et al., 1988, Molec. Immunol.25:7-15 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552 참조); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)이다. 전형적으로, 분석은 비표지된 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질이 모두 로딩된 고체 표면 또는 세포에 결합될 수 있는 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. (항원 결합 단백질과 경쟁하는) 경쟁 분석에 의해 확인되는 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질; 및 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 근접해 있는 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질(상기 2개의 에피토프는 서로 공간적으로 방해하여 결합을 저해함). 경쟁적 결합을 측정하는 방법에 관한 추가의 세부사항은 본 명세서의 실시예에 제시된다. 전형적으로, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합 중 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상을 억제(예를 들어 감소)할 것이다. 일부 경우에서, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 이상으로 억제된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA일 수 있다. 핵산은 핵산이 또다른 핵산 서열과 기능적 관련성으로 배치될 때 "실시가능하게 연결(operably linked)"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주는 경우, 상기 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 실시가능하게 연결된 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 실시양태에서, 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 다른 DNA 단편이 결찰될 수 있는 고리형 이중 가닥 DNA 고리를 지칭한다. 또다른 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 다른 DNA 단편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 본 명세서에 개시된 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자가-복제가 가능하거나(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터), 숙주 세포로의 도입 후 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기에 용이한 박테리아는 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae)의 구성원, 예컨대 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 균주; 바실라시에(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필러스 인플루엔제(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주) 및 NS0 세포를 포함한다.
항체 및 항원-결합 단편을 생성하고 정제하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15. 예를 들어, 마우스는 인간 A베타 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 생성된 항체는 복원, 정제되고, 본 기술분야에 잘 알려진 통상적인 방법을 사용하여 아미노산 서열로 서열화될 수 있다. 또한, 항원 결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 개시의 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 인간 프레임워크 영역 및 비-인간 항체로부터 유래된 CDR을 함유하도록 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics(IMGT)) 웹사이트 http://imgt.cines.fr를 통해 IMGT로부터, 또는 The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351로부터, IMGT 인간 항체 가변 생식계열 유전자 데이터베이스에 대해 정렬하고 MOE 소프트웨어를 사용하여, 수득될 수 있다.
본 개시의 조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 공지된 방법을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 GS 발현 벡터로 클로닝되고 조작될 수 있다. 재조합 면역글로불린을 발현하는 벡터는 이후 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 본 기술분야에 잘 알려진 보다 권장되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단 부위에서, 글리코실화를 초래할 것이다. 인간 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 안정한 클론이 수득되었다. 양성 클론은 항체 생성을 위한 생물반응기에서 무-혈청 배양 배지에서 확장될 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 정제는 완충액으로 개질된 프로틴 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼에서 수행될 수 있다. 비특이적 결합 성분은 세척된다. 결합된 항체는 pH 구배에 의해 용출되고 항체 단편은 SDS-PAGE에 의해 검출된 후, 풀링된다. 항체는 일반적인 기술을 사용하여 여과 및 농축될 수 있다. 가용성 응집체 및 멀티머는 크기 배제 또는 이온 교환과 같은 일반적인 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 생성된 산물은, 예를 들어 -70℃에서, 즉시 동결되거나, 동결건조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "돌연변이"는 비제한적으로 "복귀-돌연변이", "보존적 돌연변이" 또는 "보존적 치환 또는 대체"를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "보존적 변형" 또는 "보존적 치환 또는 대체"는 단백질 내 아미노산에 대해 유사한 특징(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산의 치환을 지칭하며, 변화는 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 자주 발생할 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.) 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다.
본 개시에서 언급되는 "돌연변이된 서열"은 본 개시의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 적절한 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형시킨 후, 본 개시의 것과 다양한 백분율 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 지칭한다. 본 개시에 서술된 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%, 바람직하게는 적어도 95%일 수 있다. 비제한적인 예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%를 포함한다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 백분율의 결정은 국립 생명공학 정보 센터(National Center For Biotechnology Institute) 웹사이트에서 사용할 수 있는 기본 설정으로 BLASTN/BLASTP 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)" 또는 "일관성(consistency)"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 2개의 비교되는 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유될 때, 이 분자는 그 위치에서 상동이다. 두 서열 사이의 상동성의 퍼센트는 두 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동인 위치의 수를 비교될 위치의 수로 나눈 다음, 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬될 때 두 서열에서 10개의 위치 중 6개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 60%의 상동성을 가지고; 두 서열에서 100개의 위치 중 95개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 95%의 상동성을 갖는다. 일반적으로, 두 서열이 최대 백분율의 상동성을 제공하도록 정렬될 때 비교가 이루어진다.
본 개시에서 언급된 "외인성(exogenous)"은 문맥에 따라 유기체, 세포, 또는 인간 외부에서 생성되는 물질을 지칭한다. "내인성(endogenous)"은 문맥에 따라 세포, 유기체, 또는 인체 내에서 생성되는 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포(cell)", "세포주(cell line)", 및 "세포 배양물(cell culture)"은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체(transformant)" 및 "형질전환된 세포(transformed cell)"는 1차 대상 세포 및 이로부터 유래되는 배양물을 계대 수와 상관 없이 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적 또는 무작위적 돌연변이로 인하여, DNA 내용물에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해하여야 한다. 본래 형질전환된 세포에서와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도되는 경우, 문맥으로부터 명백히 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 핵산, RNA 및/또는 DNA의 극미량의 특정 부분이 예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호에 서술된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록, 관심 영역의 말단에 대한 서열 정보 또는 관심 영역 이외에 대한 서열 정보를 이용할 수 있어야 하며; 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭될 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) 참조. 본 개시에 사용되는 PCR 시험은 시험 핵산 시료를 증폭시키기 위한 하나의, 그러나 유일하지는 않은, 중합효소 반응 방법의 예로 간주된다. 이 방법은 핵산의 특정 부분을 증폭시키거나 생성하기 위하여 프라이머 및 핵산 중합효소로서 공지된 핵산 서열을 사용하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적 조성물"은 본 개시에 따른 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물 및 다른 화학적 성분, 예컨대 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 효과를 발휘하는 것을 목표로 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료하다(treat)"는 작용제(agent)가 공지된 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 갖는 환자에게, 치료제, 예컨대 본 개시의 임의의 결합 화합물을 함유하는 조성물을 체내로 또는 체외로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 작용제는 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 이러한 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 진행을 억제함으로써, 치료될 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 완화시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키기에 효과적인 치료제의 양("치료학적 유효량"으로도 지칭됨)은 다양한 인자, 예컨대 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 그리고 약물이 환자에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지 여부는 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정법에 의해 평가될 수 있다. 본 개시의 실시양태(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 모든 환자에서 대상 질환 증상(들)을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 맨-휘트니에 따른 U 검정, 크루스칼 왈리스 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라 검정 및 윌콕슨 검정과 같은 본 기술분야에 공지된 임의의 통계적 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 대상 질환 증상을 완화시켜야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 완화시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의 대상체에 대한 유효량은 인자, 예컨대 치료될 상태, 환자의 전반적인 건강 상태, 투여 경로 및 용량 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대한의 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 동물, 인간, 실험 피험체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물 유체에 적용하는 경우, "투여" 또는 "치료"는, 외인성 약물, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 동물, 인간, 피험체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물 유체와 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여" 또는 "치료"는, 예를 들면, 치료학적, 약물동력학적, 진단학적, 연구, 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉, 뿐만 아니라 시약과 유체의 접촉을 포함하고, 여기서 유체는 세포와 접촉된다. "투여" 또는 "치료"는 또한 예를 들면, 세포를 시약, 진단약, 결합 조성물에 의해, 또는 또다른 세포에 의해 시험관내 및 생체외 치료함을 의미한다. 인간, 동물, 또는 연구 피험체에게 적용될 경우 "치료"는 치료학적 치료, 예방학적 또는 예방적 측정, 연구 및 진단학적 적용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "A베타에 의해 야기되는 질환 또는 장애"는 A베타 단량체, 또는 프로토피브릴, 또는 중합체, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 β-아밀로이드의 존재 또는 활성에 의해 야기되는 질환 및 장애, 예를 들어 신경퇴행성 질환(예를 들어: 알츠하이머 질환, 경증인지 장애, 전측두엽 치매, 루이 신체 질환, 파킨슨 질환, 픽 질환, 베박 질환 등), β-아밀로이드 침착에 의해 야기되는 다양한 안과 질환(예를 들어, 황반 변성, 드루젠-관련 시신경병증, 녹내장, 백내장 등)을 비제한적으로 포함하는, β-아밀로이드와 관련되거나 이에 의해 야기되는 질환 또는 장애를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "신경퇴행성 질환"은 비제한적으로 다음을 포함한다: 알츠하이머 질환, 경증 인지 장애, 전측두엽 치매, 루이 신체 질환, 파킨슨 질환, 픽 질환, 베박 질환, 콩고성 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 다운 증후군, 다발성 경색 치매, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환, AIDS 치매 증후군, 우울증, 불안 장애, 공포증, 벨 마비, 간질, 뇌염, 다발성 경화증, 신경근 장애, 신경종양 장애, 뇌종양, 뇌졸중을 포함하는 신경혈관 장애, 신경면역 장애, 신경병성 이과 질환, 척수 손상을 포함하는 신경외상, 신경병성 통증을 포함하는 통증, 소아 신경 및 신경정신 장애, 수면 장애, 투렛 증후군, 경증 인지 장애, 혈관성 치매, 다발성 경색 치매, 낭포성 섬유증, 고셔 질환 및 기타 운동이상증 및 중추 신경 시스템의 질환.
본 발명의 상세한 설명
하기 실시예는 본 개시를 추가로 설명하기 위해 제공되지만, 본 개시를 제한하려는 것은 아니다. 본 개시의 실시예에서 구체적인 조건을 지시하지 않는 실험 방법은 대체로 통상적인 조건, 예컨대 문헌[Sambrook et al., Antibodies, Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory]; 또는 제조업체에 의해 권고된 조건에 따라 수행된다. 구입처가 구체적으로 지시되지 않은 시약은 상업적으로 이용가능한 시약이다.
실시예 1. A베타 항원의 제조
본 개시의 실시예 및 시험예에 사용된 A베타 항원은 GL 바이오켐, 진스크립트 또는 시그마에 의해 합성되었고, 이후 시험관내에서 제조하였다(상세한 내용은 표 1 참조). 면역화에 사용하기 위한 A베타 항원은 Aβ 1-42 프로토피브릴 및 Aβ1-40 KLH였다; 스크리닝에 사용하기 위한 A베타 항원은 Aβ1-40-BSA 피브릴, Aβ1-40 DMSO 현탁액, Aβ1-42-비오틴 DMSO 현탁액, Aβ1-42 프로토피브릴 및 Aβ1-42 피브릴이었다; 검출에 사용하기 위한 A베타 항원은 Aβ1-42 단량체 및 Aβ1-42 피브릴이었다.
Aβ1-40의 아미노산 서열은 (서열번호 1)에 나타낸다:
Aβ1-42의 아미노산 서열은 (서열번호 2)에 나타낸다:
Aβ1-40 KLH 및 Aβ1-40-BSA는 각각 KLH(키홀-림펫 헤모시아닌) 및 BSA(소혈청 알부민)와 커플링된 합성 Aβ1-40 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서 사용된 Aβ1-40은 커플링 및 검출의 편의를 위해 N-말단에서 아미노산 Cys로 통합되었다;
Aβ1-42 프로토피브릴은 시험관 내에서 프로토피브릴 형태로 제조된 Aβ1-42 폴리펩티드를 지칭한다.
Aβ1-40-BSA 피브릴은 시험관 내에서 피브릴 형태로 제조된 BSA와 커플링된 Aβ1-42 폴리펩티드를 지칭한다.
Aβ1-40 DMSO 현탁액은 Aβ1-42 폴리펩티드를 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 직접 용해시켜 제조된 투명한 용액을 지칭한다.
Aβ1-42-비오틴 DMSO 현탁액은 비오틴 태그가 붙은 Aβ1-42 폴리펩티드를 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 직접 용해시켜 제조된 투명한 용액을 지칭한다.
Aβ1-42 피브릴은 시험관 내에서 피브릴 형태로 제조된 Aβ1-42 폴리펩티드를 지칭한다.
Aβ1-42 단량체는 Aβ1-42 단량체를 지칭한다.
| 용도 | 폴리펩티드 | 공급업체 및 카탈로그 번호 | 제조 방법 |
| 면역화 | Aβ1-42 프로토피브릴 | GL 바이오켐 180231 | Aβ 펩티드 분말을 10mM NaOH (pH>10)에 용해시키고, 2분 동안 흔들고, NaOH의 1/10 부피로 10×PBS를 첨가하여 최종 농도가 443μM이 되도록 하였다. 이러한 용액을 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, PBS로 50μM로 희석하여 Aβ1-42 프로토피브릴을 생성하였다. |
| Aβ 1-40 KLH | GL 바이오켐 KLH-SH-CV-41 479311 | 폴리펩티드를 PBS에 직접 용해시켜 1 ㎎/㎖ 탁한 용액을 생성하였다. | |
| 하이브리도마 스크리닝 | Aβ1-40-BSA 피브릴 | GL 바이오켐 BSA-SH-CV-41 479311 | 합성된 Aβ1-40-BSA 분말을 DMSO에 0.5㎎/10㎕로 용해시킨 후, 434㎕ 탈이온수로 희석하였다. 생성된 Aβ를 10일 동안 37℃에 두어 Aβ1-40-BSA 피브릴을 생성하였다. |
| Aβ1-40 DMSO 현탁액 | GL 바이오켐 DV-40 82357 | 폴리펩티드를 DMSO에 1㎎/㎖로 직접 용해시켰다. | |
| Aβ1-42-비오틴 DMSO 현탁액 | GL 바이오켐 Bio-DA-42 212574 | 폴리펩티드를 DMSO에 1㎎/㎖로 직접 용해시켰다. | |
| Aβ1-42 피브릴 | GL 바이오켐 P160217-SY180231 | 합성된 Aβ1-42 분말을 DMSO에 0.5㎎/10㎕로 용해시킨 후, 434㎕ 탈이온수로 희석하였다. 생성된 Aβ를 10일 동안 37℃에 두어 Aβ1-42 피브릴을 생성하였다. | |
| Aβ1-42 프로토피브릴 | GL 바이오켐 180231 | 제조 방법은 면역에 사용하기 위한 Aβ1-42 프로토피브릴에 대한 것과 동일하였다. | |
| ThT 분석 | Aβ1-42 단량체 | 진스크립트 RP10017 | 합성된 Aβ1-42 폴리펩티드 분말은 미리-냉각된 완충액(2×PBS 및 10mM NaOH, pH>10, 1:1 (v/v) 비율로 혼합됨)에 1㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. |
| 신경 보호 분석 | Aβ1-42 피브릴 | GL 바이오켐 P160427-SY507408 | 합성된 Aβ1-42 분말을 0.5㎎/10㎕로 DMSO에 용해시킨 후, 434㎕ 탈이온수로 희석하였다. 생성된 Aβ를 10일 동안 37℃에 두어 Aβ1-42 피브릴을 생성하였다. |
| BV2 식균작용 분석 | P160802-SY180231 | ||
| 소교세포 식균작용 분석 | P160802-SY180231 | ||
| 비아코어 | Aβ1-42 단량체 | 시그마 A 9810 |
Aβ1-42 폴리펩티드 분말을 최종 농도 2㎎/㎖로 DMSO에 용해시켰다. |
| Aβ1-42 피브릴 | GL 바이오켐, P160217-SY180231 및 P160802-SY180231 | 합성된 Aβ1-42 분말을 0.5㎎/10㎕로 DMSO에 용해시킨 후, 434㎕ 탈이온수로 희석하였다. 생성된 Aβ를 10일 동안 37℃에 두어 Aβ1-42 피브릴을 생성하였다. |
실시예 2. 항-인간 A베타 하이브리도마 단일클론 항체의 제조
1. 면역화
항-인간 A베타 단일클론 항체는 마우스를 면역화하여 생성되었다. 6-8주령의 암컷 SJL 화이트 마우스를 실험에 사용하였다(베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술 주식회사, 동물 생산 허가 번호: SCXK(베이징) 2012-0001). 먹이 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 20-25℃의 온도; 40-60%의 습도에서 1주일 동안, 12/12시간 명암주기로 실험실 환경에 유지하였다. 이후, 마우스를 다음 계획에 따라 면역화하였다. 면역화를 위한 항원은 Aβ1-40-K LH 및 Aβ1-42 프로토피브릴이었다.
면역화 계획 1: 면역화에 사용된 아쥬반트는 퀵안티바디-마우스3W(베이징 Kangbiquan 생명공학 주식회사 Cat No. KX0210042)였다. 항원 대 아쥬반트(퀵안티바디-마우스3W)의 비율은 1:1, 10㎍/마우스/시간이었다. 항원과 아쥬반트를 완전히 혼합하여 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일에 접종에 사용하였다. 0일에, 마우스 뒷다리에 10 ㎍/마우스의 혼합된 항원을 근육내(IM) 주사하였다. 1차 면역화는 7, 14, 21, 28, 35 및 42일에 반복하였고, 유사하게 마우스 뒷다리에 10 ㎍/마우스의 혼합된 항원을 근육내(IM) 주사하였다. 혈액 샘플은 19, 40 및 55일에 채취하고, 마우스 혈청 중 항체 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다. 7~8차 면역화 후, 비장세포 융합을 위해 정점(plateau) 경향의 혈청 항체 역가가 높은 마우스를 선택하였다. 비장세포 융합 3일 전, 추가 면역화를 위해, 식염수로 제조된 항원 용액을 20 ㎍/마우스, 복강내(IP) 주사하였다.
면역화 계획 2: 면역화에 사용된 아쥬반트는 퀵안티바디-마우스5W(베이징 Kangbiquan 생명공학 주식회사 Cat No. KX021004)였다. 항원 대 아쥬반트(퀵안티바디-마우스5W)의 비율은 1:1, 25 ㎍/마우스/시간(첫 번째 면역화의 경우) 및 25㎍/마우스/시간(추가 면역화의 경우)였다. 항원 및 아쥬반트를 완전히 혼합하여 0, 14, 28, 42 및 56일에 접종에 사용하였다. 0일에, 마우스 뒷다리에 25 ㎍/마우스의 혼합된 항원을 근육내(IM) 주사하였다. 1차 면역화는 14, 28, 42 및 56일에 반복하였고, 유사하게 마우스 뒷다리에 25 ㎍/마우스의 혼합된 항원을 근육내(IM) 주사하였다. 혈액 샘플은 20 및 49일에 채취하고, 마우스 혈청 중 항체 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다. 5차 면역화 후, 비장세포 융합을 위해 정점 경향의 혈청 항체 역가가 높은 마우스를 선택하였다. 비장세포 융합 3일 전, 추가 면역화를 위해, 식염수로 제조된 항원 용액을 50 ㎍/마우스, 복강내(IP) 주사하였다.
2. 비장세포 융합
최적화된 PEG-매개 융합 절차를 사용하여 비장 림프구를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287TM)와 융합하여 하이브리도마 세포를 수득하였다. 융합된 하이브리도마 세포를 0.5-1×106/㎖의 밀도로 완전 배지(20% FBS, 1×HAT, 1×OPI를 포함하는 DMEM 배지)에 재현탁하고, 100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 분주하고, 37℃ 및 5% CO2에서 3-4일 동안 인큐베이션하고, 100㎕/웰의 HAT 완전 배지로 보충하고, 핀-모양 클론이 형성될 때까지 3-4일 동안 배양하였다. 상청액을 제거하고, 200㎕/웰의 HT 완전 배지(20% FBS, 1×HT 및 1×OPI를 포함하는 RPMI-1640 배지)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션한 후 ELISA 검출을 실시하였다.
3. 하이브리도마 세포의 스크리닝
융합 10-11일 후, 세포 성장 밀도에 따라, 예비 스크리닝을 위해 다양한 형태의 Aβ 폴리펩티드를 갖는 클론 배양 상청액에 대해 ELISA 결합 분석(효소-결합 면역흡착 분석이라고도 함)을 수행하여, 생성된 하이브리도마 클론의 아형을 분류하였다. 면역원으로서 Aβ1-40-KLH를 갖는 하이브리도마 세포를 스크리닝하기 위해 Aβ1-40-BSA 피브릴, Aβ1-42 비오틴 DMSO 현탁액 및 Aβ1-40 DMSO 현탁액을 사용하였다; 그리고 면역원으로서 Aβ1-42 프로토피브릴을 갖는 하이브리도마 세포를 스크리닝하기 위해 Aβ1-42 프로토피브릴, Aβ1-42 피브릴 및 Aβ1-42-비오틴 DMSO 현탁액을 사용하였다. 양성 웰의 경우, 세포 밀도에 따라 배지를 교체하고 24-웰 플레이트로 확장하였다. 24-웰 플레이트로 옮겨진 세포주를 다시 시험한 후 처음으로 서브-클로닝하였다. 첫 번째 서브-클로닝에서 스크리닝된 일부 양성 세포를 보존하고, 두 번째 서브-클로닝에 사용하였다. 두 번째 서브-클로닝에서 스크리닝된 일부 양성 세포를 보존하고, 단백질 발현에 사용하였다. Aβ 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 하이브리도마 세포는 다중 융합으로부터 생성하였다. 티오플라빈(ThT라고도 함) 형광 분석, 뉴런 보호 분석 및 대식세포 식균작용 분석 후, 하이브리도마 클론 mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 및 mAb-9001을 수득하고 무-혈청 세포 배양으로 항체 제조에 사용하였다. 생성된 항체는 정제 실시예에 따라 정제하였으며, 정제된 항체를 시험예에 사용하였다.
4. 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제
세포에 의해 발현된 상청액 샘플을 고속으로 원심 분리하여 불순물을 제거하고, 하이브리도마에 의해 발현된 상청액을 프로틴 G 컬럼으로 정제하고 재조합 항체에 의해 발현된 상청액은 프로틴 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독 값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 표적 단백질을 100mM 아세트산(pH3.0)으로 용출시키고 1M 트리스-HCl(pH8.0)로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절히 농축한 후 PBS로 미리-평형화한 겔 크로마토그래피 수퍼덱스200(GE)으로 추가로 정제하여 응집체를 제거하였다. 단량체 피크를 수집하고 사용을 위해 분취하였다.
5. 양성 하이브리도마 클론의 서열화
양성 하이브리도마로부터 서열을 클로닝하는 절차는 다음과 같다. 로그 성장기의 하이브리도마 세포를 수집하였다. RNA는 키트의 지침에 따라 트리졸(인비트로겐, Cat No. 15596-018)로 추출하였고 프라임스크립트™ 역전사 키트(타카라, Cat No. 2680A)로 역전사되었다. 생성된 cDNA는 마우스 Ig-프라이머 세트(노바겐, TB326 Rev. B 0503)를 사용하여 PCR로 증폭하고, 회사에 의해 서열화하였다. 하이브리도마 클론 mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 및 mAb-9001의 마우스 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열을 다음과 같이 결정하였다:
참고: 상기 항체의 가변 영역 아미노산 서열은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로 표시된다. 기울임꼴 문자는 FR 서열을 나타내고 밑줄이 있는 문자는 CDR 서열을 나타낸다.
항체 mAb-2401, mAb-3601, mAb-5101 및 mAb-9001의 CDR 영역의 아미노산 서열을 표 2에 나타냈다.
| 항체 | 중쇄 | 경쇄 | ||
| mAb-2401 | HCDR1 | NTYMH 서열번호 11 |
LCDR1 | KSSQSLLNSGNQKNYLT 서열번호 14 |
| HCDR2 | RIDPTNGNTKYAPKFKD 서열번호 12 |
LCDR2 | WASTRES 서열번호 15 |
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| HCDR3 | RVYYYDSTYNY 서열번호 13 |
LCDR3 | QNDYNYPLT 서열번호 16 |
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| mAb-3601 | HCDR1 | TFGMGVG 서열번호 17 |
LCDR1 | RSSQSIVHSNGNTYLE 서열번호 20 |
| HCDR2 | HIWWDDDKYYNPALKS 서열번호 18 |
LCDR2 | KVSNRFS 서열번호 21 |
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| HCDR3 | RPLGSYDYFDY 서열번호 19 |
LCDR3 | FQGSRVPLT 서열번호 22 |
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| mAb-5101 | HCDR1 | TSGMGVS 서열번호 23 |
LCDR1 | RSSQSIVHSNGNTYLE 서열번호 20 |
| HCDR2 | HIYWDDVSLYNPSLKS 서열번호 24 |
LCDR2 | KVSNRFS 서열번호 21 |
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| HCDR3 | RRIITVVDAMDY 서열번호 25 |
LCDR3 | CQGSRVPPT 서열번호 26 |
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| mAb-9001 | HCDR1 | TFGMGVG 서열번호 17 |
LCDR1 | RSSQSIVHSNGNTYLE 서열번호 20 |
| HCDR2 | HIWWDDDKYYNPALKS 서열번호 18 |
LCDR2 | KVSNRFS 서열번호 21 |
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| HCDR3 | RGFHLGSRGDYFDH 서열번호 27 |
LCDR3 | FQGSRVPLT 서열번호 22 |
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실시예 3. 항-인간 A베타 하이브리도마 단일클론 항체의 인간화
표준 구조는 마우스 항체의 경쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 가변 영역 서열에 따라 결정하였다. 동일한 구조를 갖는 인간 생식계열 서열 중에서, 마우스 비-CDR 영역(프레임워크 영역)과 가장 유사한 서열을 인간화를 위한 주형으로서 선택하였다. 이후, 인간화를 위해 선택된 주형에 뮤린 항체 CDR 영역을 그래프팅하여 인간 CDR 영역을 대체하였다. 필요에 따라 일부 FR 영역 서열에서 복귀-돌연변이 또는 점 돌연변이가 만들었다. 이후 가변 영역을 인간 불변 영역(들)(예컨대 인간 IgG1 불변 영역)과 조합하여 인간화된 항-A베타 항체를 생성하였다.
1. mAb-2401의 인간화
mAb-2401 항체 중쇄의 인간화를 위한 주형은 IGHV1-24*01 및 hjh6.3이었다. 즉, 인간 생식계열 중쇄 IGHV1-24로부터 FR1, FR2 및 FR3 영역을 선택하였고, hjh6.3의 JH6 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다. 경쇄를 위한 주형은 IGKV1-27*01 및 hjk4.1이었다. 즉, 인간 생식계열 경쇄 IGKV1-27로부터 FR1, FR2, 및 FR3을 선택하였고, hjk4.1의 JK4 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다.
인간 생식계열(IGHV1-24*01) 중쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 28)에 나타냈다:
인간 생식계열(IGKV1-27*01) 경쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 29)에 나타냈다:
인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 다음과 같았다:
HAB-2401 그래프팅된 VH (서열번호 66):
HAB-2401 그래프팅된 VL (서열번호 67):
선택된 인간화 주형에 뮤린 항체 CDR 영역을 그래프팅하여 인간 주형 CDR 영역을 대체하고, 중쇄에서 위치 1, 72 및 98(자연 서열 넘버링, 카밧 넘버링에 따라 각각 위치 1, 71 및 94에 해당함)(Q1E, E72A 및 T98R; 카밧 넘버링에 따라 Q1E, E71A, T94R)에 복귀-돌연변이를 만든 후, 인간 IgG1의 불변 영역과 조합하여 인간화 항체 HAB-2401을 생성하였다.
HAB-2401의 중쇄 아미노산 서열은 (서열번호 30)에 나타냈다:
HAB-2401의 경쇄 아미노산 서열은 (서열번호 31)에 나타냈다:
참고: 상기 HAB-2401 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에서, 기울임꼴 문자는 FR 서열을 나타내고, 밑줄이 있는 문자는 CDR 서열을 나타내며, 이중 밑줄이 있는 문자는 불변 영역 서열을 나타낸다.
2. mAb-3601의 인간화
mAb-3601 항체 중쇄의 인간화를 위한 주형은 IGHV3-30*01 및 hjh6.3이었다. 즉, 인간 생식계열 중쇄 IGHV3-30으로부터 FR1, FR2 및 FR3 영역을 선택하고, hjh6.3의 JH6 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다. 경쇄를 위한 주형은 IGKV1-39*01/hjk4.1이었다. 즉, 인간 생식계열 경쇄 IGKV1-39로부터 FR1, FR2, 및 FR3을 선택하였고, hjk4.1의 JK4 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다.
인간 생식계열(IGHV3-30*01) 중쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 32)에 나타냈다:
인간 생식계열(IGKV1-39*01) 경쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 33)에 나타냈다:
인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 다음과 같았다:
HAB-3601 그래프팅된 VH (서열번호 68):
HAB-3601 그래프팅된 VL (서열번호 69):
선택된 인간화 주형에 뮤린 항체 CDR 영역을 그래프팅하여 주형으로부터 인간 CDR 영역을 대체하였고, 중쇄에서 위치 28 및 86(자연 서열 넘버링, 카밧 넘버링에 따라 각각 위치 28 및 82B에 해당함)(T28A 및 S86T; 카밧 넘버링에 따라 T28A 및 S82B T)에 복귀-돌연변이를 만든 후, 중쇄에서 위치 58(자연 서열 넘버링)(D58N)에 점 돌연변이를 만들어 잠재적인 아스파르트산 이성질화를 제거한 다음, 인간 IgG1의 불변 영역과 조합하여 인간화 항체 HAB-3601을 생성하였다.
HAB-3601의 중쇄 아미노산 서열은 (서열번호 34)에 나타냈다:
HAB-3601의 경쇄 아미노산 서열은 (서열번호 35)에 나타냈다:
참고: 상기 HAB-3601 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에서, 기울임꼴 문자는 FR 서열을 나타내고, 밑줄이 있는 문자는 CDR 서열을 나타내며, 이중 밑줄이 있는 문자는 불변 영역 서열을 나타낸다.
3. mAb-5101의 인간화
mAb-5101 항체 중쇄의 인간화를 위한 주형은 IGHV2-70D*04 및 hjh6.1이었다. 즉, 인간 생식계열 중쇄 IgHV2-70D로부터 FR1, FR2 및 FR3을 선택하였고, hjh6.1의 JH6 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다. 경쇄를 위한 주형은 IGKV2-40*01 및 hjk4.1이었다. 즉, 인간 생식계열 경쇄 IGKV2-40으로부터 FR1, FR2, 및 FR3을 선택하였고, hjk4.1의 JK4 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다.
인간 생식계열(IGHV2-70D*04) 중쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 36)에 나타냈다:
인간 생식계열(IGKV2-40*01) 경쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 37)에 나타냈다:
인간화 가변 영역은 다음과 같았다:
HAB-5101 그래프팅된 VH (서열번호 70):
HAB-5101 그래프팅된 VL (서열번호 71):
선택된 인간화 주형에 뮤린 항체 CDR 영역을 그래프팅하여 주형으로부터 인간 CDR 영역을 대체하였고, 경쇄에서 위치 2 및 50(자연 서열 넘버링, 카밧 넘버링에 따라 각각 위치 2 및 45에 해당함)(I2V 및 Q50K; 카밧 넘버링에 따라 I2V 및 Q45K)에 복귀-돌연변이를 만든 후, 경쇄에서 위치 94(자연 서열 넘버링)(C94S)에 점 돌연변이를 만들어 잠재적인 이황화 결합 불일치를 제거한 다음, 인간 IgG1의 불변 영역과 조합하여 인간화 항체 HAB-5101을 생성하였다.
HAB-5101의 중쇄 아미노산 서열은 (서열번호 38)에 나타냈다:
HAB-5101의 경쇄 아미노산 서열은 (서열번호 39)에 나타냈다:
참고: 상기 HAB-5101 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에서, 기울임꼴 문자는 FR 서열을 나타내고, 밑줄이 있는 문자는 CDR 서열을 나타내며, 이중 밑줄이 있는 문자는 불변 영역 서열을 나타낸다.
4. mAb-9001의 인간화
mAb-9001 항체 중쇄의 인간화를 위한 주형은 IGHV2-70D*04 및 hjh6.1이었다. 즉, 인간 생식계열 중쇄 IGHV2-70으로부터 FR1, FR2 및 FR3을 선택하였고, hjh6.1의 JH6 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다. 경쇄를 위한 주형은 IGKV2-40*01 및 hjk2.1이었다. 즉, 인간 생식계열 경쇄 IGKV2-40으로부터 FR1, FR2, 및 FR3을 선택하였고, hjk2.1의 JK2 영역을 FR4 영역으로서 선택하였다.
인간 생식계열(IGHV2-70D*04) 중쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 36)에 나타냈다:
인간 생식계열(IGKV2-40*01) 경쇄 주형의 아미노산 서열은 (서열번호 37)에 나타냈다:
인간화 가변 영역은 다음과 같았다:
HAB-9001 그래프팅된 VH (서열번호 72):
HAB-9001 그래프팅된 VL (서열번호 73):
선택된 인간화 주형에 뮤린 항체 CDR 영역을 그래프팅하여 주형으로부터 인간 CDR 영역을 대체하였고, 경쇄에서 위치 2(자연 서열 넘버링, 카밧 넘버링에 따라 위치 2에 해당함)(I2V)에 복귀-돌연변이를 만든 후, 중쇄에서 위치 58(자연 서열 넘버링)(D58N)에 점 돌연변이를 만들어 잠재적인 아스파르트산 이성질화를 제거한 다음, 인간 IgG1의 불변 영역과 조합하여 인간화 항체 HAB-9001을 생성하였다.
HAB-9001의 중쇄 아미노산 서열은 (서열번호 40)에 나타냈다:
HAB-9001의 경쇄 아미노산 서열은 (서열번호 41)에 나타냈다:
참고: 상기 HAB-9001 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에서, 기울임꼴 문자는 FR 서열을 나타내고, 밑줄이 있는 문자는 CDR 서열을 나타내며, 이중 밑줄이 있는 문자는 불변 영역 서열을 나타낸다.
또한, 항체 HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101 및 HAB-9001의 불변 영역 서열에 대하여, 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 서열번호 42에 나타냈고, 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 43에 나타냈고, 가변 영역 아미노산 서열 및 전장 아미노산 서열은 하기 표에 나타냈다:
| 항체 | 중쇄 | 경쇄 | ||
| HAB-2401 | 가변 영역 서열 (VH) | 서열번호 44 | 가변 영역 서열 (VL) | 서열번호 45 |
| 전장 서열 (H) | 서열번호 30 | 전장 서열 (L) | 서열번호 31 | |
| HAB-3601 | 가변 영역 서열 (VH) | 서열번호 46 | 가변 영역 서열 (VL) | 서열번호 47 |
| 전장 서열 (H) | 서열번호 34 | 전장 서열 (L) | 서열번호 35 | |
| HAB-5101 | 가변 영역 서열 (VH) | 서열번호 48 | 가변 영역 서열 (VL) | 서열번호 49 |
| 전장 서열 (H) | 서열번호 38 | 전장 서열 (L) | 서열번호 39 | |
| HAB-9001 | 가변 영역 서열 (VH) | 서열번호 50 | 가변 영역 서열 (VL) | 서열번호 51 |
| 전장 서열 (H) | 서열번호 40 | 전장 서열 (L) | 서열번호 41 | |
| HAB-2401 | HCDR1 | 서열번호 11 | LCDR1 | 서열번호 14 |
| HCDR2 | 서열번호 12 | LCDR2 | 서열번호 15 | |
| HCDR3 | 서열번호 13 | LCDR3 | 서열번호 16 | |
| HAB-3601 | HCDR1 | 서열번호 17 | LCDR1 | 서열번호 20 |
| HCDR2 | 서열번호 52 | LCDR2 | 서열번호 21 | |
| HCDR3 | 서열번호 19 | LCDR3 | 서열번호 22 | |
| HAB-5101 | HCDR1 | 서열번호 23 | LCDR1 | 서열번호 20 |
| HCDR2 | 서열번호 24 | LCDR2 | 서열번호 21 | |
| HCDR3 | 서열번호 25 | LCDR3 | 서열번호 53 | |
| HAB-9001 | HCDR1 | 서열번호 17 | LCDR1 | 서열번호 20 |
| HCDR2 | 서열번호 52 | LCDR2 | 서열번호 21 | |
| HCDR3 | 서열번호 27 | LCDR3 | 서열번호 22 | |
실시예 4. 인간화 항체의 제조
1. 인간화 항체의 분자 클로닝
설계된 인간화 항체 서열에 대해 코돈 최적화를 수행하여 인간 코돈-선호 코딩 유전자 서열을 생성하였다. 설계된 PCR 프라이머로 각 항체의 VH/VK 유전자 단편을 구축한 후, 상동 재조합에 의해 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 불변 영역 유전자 (CH1-FC/CL) 단편을 포함함)에 도입하여 인간화 항체 VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr의 전장을 발현하는 플라스미드를 구축하였다. 정확한 클론은 서열화에 의해 검증하였으며, HAB-2401의 경우, 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 54에 나타냈고, 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 55에 나타냈고; HAB-3601의 경우, 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 56에 나타냈고, 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 57에 나타냈고; HAB-5101의 경우, 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 58에 나타냈고, 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 59에 나타냈고; HAB-9001의 경우, 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 60에 나타냈고, 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 61에 나타냈다.
2. 인간화 항체의 발현 및 정제
HEK293E 세포는 항체 중쇄 및 경쇄를 각각 1:1.5의 비율로 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 6일 후, 발현 상청액을 수집하고, 고속 원심분리하여 불순물을 제거하고, 프로틴 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독 값이 기준선까지 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 100mM 아세트산(pH3.0)으로 용출시키고, 1M 트리스-HCl(pH8.0)로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절히 농축한 후 PBS로 미리-평형화한 겔 크로마토그래피 수퍼덱스200(GE)으로 추가로 정제하여 응집체를 제거하였다. 단량체 피크를 수집하고 사용을 위해 분취하였다.
본 개시의 성능 및 효과는 하기 생화학적 시험 또는 생체내 약리학적 시험에 의해 검증되었다:
시험예 1. BIAcore 분석에 의해 검출된 A베타 항체의 친화도
Aβ1-42 피브릴에 대한 항체의 친화도는 아미노 커플링 방법에 의해 검출하였다. Aβ1-42 피브릴을 CM5 바이오센싱 칩(200 RU)에 커플링한 후, 항체 분자가 칩의 표면을 통해 흐르도록 하였다. 비아코어 T200 기기로 반응 신호를 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 생성하였다. 각 실험 주기가 끝날 때, 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하고 10mM 글라이신-HCl(pH 1.5)로 재생하였다. 양성 항체인 아두카누맙은 WHO에서 발표한 아두카누맙의 서열 정보(WHO Drug Information, Vol. 28, No. 3, 2014 참조)에 따라 제조하였으며, 제조 방법은 본 개시의 실시예 4에 서술하였다.
Aβ1-42 단량체에 대한 항체의 친화도는 칩에 항체를 포획함으로써 검출하였다. IgG를 프로틴 A 바이오센싱 칩에 친화도-포획한 후, 항원 Aβ1-42 단량체가 칩의 표면을 통해 흐르도록 하였다. 비아코어 T200 기기로 반응 신호를 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 생성하였다. 각 실험 주기가 끝날 때, 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하고 10mM 글라이신-HCl(pH1.5)로 재생하였다.
실험 결과는 표 4에 나타냈다. HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 및 HAB-9001은 Aβ1-42 피브릴에 대해 10-8 내지 10-10M 범위의 친화도를 가지며, 그 중에서 HAB-9001이 가장 강한 친화도를 가지며, 이는 아두카누맙보다 2 제곱수(order) 더 강한 크기이다. HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601 및 HAB-9001은 Aβ1-42 단량체에 대해 10-7 내지 10-8M 범위의 친화도를 가지며, 그 중에서 HAB-9001은 가장 강한 친화도를 가지며, 이는 아두카누맙보다 2 제곱수(order) 더 강한 크기이다. 네 가지 시험 항체 모두 양성 항체인 아두카누맙보다 더 강한 친화도를 갖는다.
| 항체 | 친화도 (M) | |
| Aβ1-42 피브릴 | Aβ1-42 단량체 | |
| 아두카누맙 | 7.52E-08 | 3.20E-06 |
| HAB-2401 | 1.17E-08 | 2.29E-07 |
| HAB-5101 | 1.22E-09 | 3.33E-07 |
| HAB-3601 | 5.45E-08 | 2.62E-07 |
| HAB-9001 | 2.13E-10 | 2.79E-08 |
시험예 2: Aβ1-42 단량체의 Aβ1-42 피브릴로의 응집 차단에 대한 항-A베타 항체의 효과
Aβ1-42 단량체의 Aβ1-42 피브릴로의 응집 억제에 대한 항-A베타 항체의 효과는 ThT 분석에 의해 검출하였다. ThT(티오플라빈 T, 티오플라빈)는 형광 염료의 일종이고, 일단 ThT가 β-시트 풍부 단백질(예컨대 Aβ 아밀로이드 침착)과 결합하면 450㎚의 여기 파장 및 482㎚의 방출 파장에서 형광 신호가 크게 향상되므로, 전형적으로 Aβ 피브릴의 시험관내 식별에 사용된다. ThT 분석의 구체적인 실험 절차는 다음과 같다. 0.5㎎ 인간 Aβ1-42(진스크립트, CAT# RP10017)를 250㎕ 10mM NaOH에 첨가하고, 완전히 용해시킨 후 중화를 위해 동일한 부피의 미리-냉각된 2×PBS에 첨가하였다. Aβ1-42 단량체 용액을 1㎎/㎖ 농도로 제조하고 ddH2O로 0.25㎎/㎖로 희석하였다. Aβ1-42 단량체(10㎕/웰, 0.25㎎/㎖)를 20μM ThT(시그마, CAT# T3516)와 혼합하고 검은색 384-웰 플레이트(코닝, CAT# 4514)에 넣었고, Aβ1-42 단량체를 첨가하지 않은 웰은 음성 대조군으로서 제공되었다. 이후 구배 희석된 항체(1㎎/㎖에서 시작, 2배 구배 희석, 10㎕/웰)를 상기 혼합물에 첨가하고, 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 형광 신호는 플렉스스테이션3 마이크로플레이트 판독기(분자 장치)를 사용하여 440㎚의 여기 파장과 485㎚의 방출 파장에서 판독하였다.
실험 결과는 도 1에 나타냈다. HAB-2401, HAB-5101 및 HAB-9001은 모두 Aβ1-42 단량체가 Aβ1-42 피브릴로 응집되는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. 반면 HAB-3601 및 아두카누맙은 이러한 기능을 갖지 않는다.
시험예 3. 랫트 1차 뉴런에 대한 항-A베타 항체의 보호
잉태 연령이 16-18일인 SD 태아 랫트에서 대뇌 피질을 해부하고, 트립신(깁코, CAT# 25200-072)으로 소화시키고, 피펫팅하고 단일 세포 현탁액으로 여과하고, 원심분리하고, 계수하였다. 세포를 10% FBS(깁코, CAT#10099-141)를 함유하는 DMEM(깁코, CAT#10564-029)으로 웰당 1E4(1×104/웰)로 희석하고, PDL(폴리-D-라이신, 폴리라이신)(시그마, CAT#P0899)로 코팅된 96-웰 플레이트(코닝, CAT#3903)에 두었다. 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 밤새 인큐베이션한 후, 배지를 뉴로바살(Neurobasal)(깁코, CAT#21103049) + 2% B27(깁코, CAT#17504044)로 교환하고, 배지의 절반을 3~4일마다 교환하였다. 8일에, 10μM Aβ1-42 피브릴(GL 바이오켐, CAT#53819) 및 다양한 농도의 시험 항체를 첨가하였다. 3일 동안 인큐베이션한 후, 30㎕/웰의 세포 타이터-글로(프로메가, CAT#G7571)를 첨가하고, 화학발광법으로 마이크로플레이트 판독기(퍼킨엘머, 벡터3)로 플레이트를 판독하였다.
실험 결과는 도 2에 나타냈다. HAB-2401, HAB-5101, HAB-3601, HAB-9001 및 양성 항체 아두카누맙은 Aβ 피브릴의 독성으로부터 1차 신경 세포를 보호할 수 있으며, 10 내지 100㎍/㎖의 농도 범위에서 용량-의존적 효과가 관찰되었다.
시험예 4. 항-A베타 항체는 BV2 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용을 촉진한다
로그 성장기의 BV2 세포(FuDan IBS 셀 센터, FH0366)를 취하여, 트립신으로 소화시키고, 800rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 24-웰 플레이트의 세포 밀도를 RPMI 1640(10% FBS 함유)으로 1.2×105세포/웰/500㎕로 조정하고, 세포의 단일 층이 형성될 때까지 철저히 흔들고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이터에 두었다. 16시간 후, 100㎕의 구배 희석된 A베타 항체 또는 음성 대조군(무관한 표적에 대한 항-트롬빈 항체를 음성 대조군으로서 사용하였고, 항-트롬빈 항체는 WO2017133673A1에 서술된 H1601-008의 제조 방법에 따라 생성하였다)을 10μM 형광 표지된 A베타 피브릴(100㎕ F-12K 염기성 배지로 희석됨)과 완전히 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 500㎕ 배지를 제거한 24-웰 플레이트에 넣고 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 4℃에서 미리-냉각된 PBS로 3회 부드럽게 세척하였다. 이후 0.25% 미리-냉각된 트립신-EDTA (1×)를 200㎕/웰로 첨가하고 4℃에 20분 동안 두었다. 트립신을 10% FBS를 함유하는 F-12K 배지로 중화하고 원심분리한 후, 세포를 미리-냉각된 PBS로 3회 세척하고, 100㎕의 세포를 수집하여 플로우 세포분석기에 적용하여 FITC 형광 강도를 판독하였다.
실험 결과는 도 3에 나타냈다. HAB-2401 및 HAB-3601은 모두 양성 항체 아두카누맙과 마찬가지로, BV2 세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용을 촉진할 수 있다. 0.03 내지 0.3 ㎍/㎖의 농도 범위에서 용량-의존적 효과가 관찰되었다.
시험예 5. 랫트 1차 미세아교세포에 의한 Aβ 피브릴의 식균작용에 대한 항-A베타 항체의 효과
신생아 SD 랫트로부터 대뇌 피질을 해부하고, 분쇄하고 여과하여 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 20% FBS(깁코, CAT#10099-141)를 함유하는 DMEM에 재현탁하고, PDL(시그마, CAT#P0899)로 미리-코팅된 T75 배양 플라스크(코닝, CAT#3473)로 옮기고 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에 두었다. 배지는 3일에 한 번씩 교환하였다. 8일에, 배양 플라스크를 진탕기에 두고 200rpm으로 1시간 동안 교반하였다. 상청액을 수집하고, 원심분리하고, 계수하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12(GE, CAT#SH30023.01) 배지로 5E4/웰(5×104/웰)로 희석하고, 24-웰 플레이트에 두었다. 6시간 후, 배지를 무-혈청 DMEM/F12 배지로 교환하고 밤새 인큐베이션하였다. 9일에, 다양한 농도의 항체 또는 음성 대조군(무관한 표적에 대한 항-트롬빈 항체를 음성 대조군으로서 사용하였고, 항-트롬빈 항체는 WO2017133673A1에 서술된 H1601-008에 대한 제조 방법에 따라 생성하였다)을 10μM FITC 표지된(써모, CAT#A30006) A베타 1-42(GL 바이오켐, CAT # 53819)와 각각 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하여 과량의 항체를 씻어냈다. 항체와 A베타의 혼합물을 세포에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS(하이클론, CAT#SH30256.01)로 2회 세척하고, 트립신(깁코, CAT#25200-072)을 첨가하고, 4℃에서 10분 동안 냉장고에 두어 세포를 소화시켰다. 이후 혈청을 첨가하여 반응을 종결시키고, 원심분리로 상청액을 제거한 후 세포를 수집하고, 미리-냉각된 PBS를 첨가하고 원심분리에 의해 상청액을 제거하고, PBS로 2회 세포를 세척하였다. FITC 형광 강도는 플로우 세포분석기(BD, 벌스)에 의해 판독하였다.
실험 결과는 도 4에 나타냈다. 랫트 1차 미세아교세포에 의한 식균작용 실험에서, HAB-2401 및 HAB-3601은 양성 항체 아두카누맙과 마찬가지로, 1차 미세아교세포에 의한 Aβ 피르릴의 식균작용을 촉진할 수 있다. 0.03 내지 0.3㎍/㎖의 농도 범위에서 용량-의존적 효과가 관찰되었다.
시험예 6. 항-Aβ 항체의 생체내 약리학적 시험
5×FAD(Five Familial AD 돌연변이) 알츠하이머 마우스 모델을 사용하여 항-Aβ 항체의 생체내 효능을 평가하였다. APP 유전자에 대한 3개 돌연변이(즉, 스웨덴 돌연변이(K670N, M671L), 플로리다 돌연변이(I716V) 및 런던 돌연변이(V717I)) 및 PS1 유전자에 대한 2개 돌연변이(즉, M146L 및 L286V)를 포함하는, APP 및 PS1 유전자의 5개의 가족력의 유전자 돌연변이를 5×FAD 마우스에서 과발현하였다. 따라서, 야생형 마우스(WT)와 비교하여, 5×FAD 마우스는 인지 기능 및 기억에 명백한 손상을 나타냈으며 뇌 조직에 상당한 Aβ 플라크 침착을 가졌다. 본 시험예는 둥지를 만드는 능력, 및 공간 기억(모리스 수중 미로의 공간 기억)을 포함하는, 마우스 행동의 개선을 시험하고, 뿐만 아니라 뇌 조직에서 Aβ 플라크의 함량 변화를 시험함으로써 마우스의 인지 능력을 향상시키고 Aβ 플라크 침착을 감소시키는 시험 항체의 효율성을 평가하도록 설계되었다.
5×FAD 마우스는 상하이 켐파트너 주식회사에서 제공받았다. 3개월령 마우스를 선별하여 23±2℃의 실온에서, 12/12시간의 명암주기로 유지하고, 음식 및 물은 자유롭게 두었다. 시험 항체는 모두 인간-마우스 키메라성 형태였고, 즉, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역(들)을 마우스 불변 영역(들)으로 대체하여 항체의 장기간 투여에 의해 야기되는 ADA(항-약물 항체)를 방지하였다. 6개 군(각 군당 n=15)이 실험에 포함되었으며, 시험할 항체 4군, 양성 대조군으로서 아두카누맙 1군, 음성 대조군으로서 PBS 1군이 포함되었다. HAB-2401 및 HAB-3601은 mIgG1 키메라성 형태인 반면, HAB-5101, HAB-9001 및 아두카누맙은 mIgG2a 키메라성 형태였고, 각각 HAB-2401-Ch, HAB-3601-Ch, HAB-5101, HAB-9001-Ch 및 아두카누맙-Ch로서 지칭하였다. HAB-2401-Ch 및 HAB-3601-Ch는 HAB-2401 및 HAB-3601의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 mIgG1의 중쇄 불변 영역(mIgG1의 중쇄 불변 영역의 아미노산은 서열번호 62에 나타냈다) 및 mIgG1의 경쇄 불변 영역(mIgG1의 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 63에 나타냈다)에 융합하여 생성하였고; HAB-5101-Ch, HAB-9001-Ch 및 아두카누맙-Ch는 HAB-5101, HAB-9001 및 아두카누맙의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 mIgG2a의 중쇄 불변 영역(mIgG2a의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 64에 나타냈다) 및 mIgG2a의 경쇄 불변 영역(mIgG2a의 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 65에 나타냈다)에 융합하여 생성하였다. 항체의 제조 방법은 본 개시의 실시예 4에 서술하였다. 항체는 주 1회 15mpk(㎎/kg, 체중 킬로그램당 밀리그램)로 i.p. 투여하였고, 총 12주 동안, 13:00 내지 16:00에 투여하였다.
모든 5×FAD 마우스는 행동 시험(시험예 8) 후 상응하는 항체를 추가로 주사하였다. 마우스를 각 군에 5 마우스씩 3개의 배치로 나누었다. 항체 처리 후, 상이한 시점에서 BBB를 투과하는 항체의 함량을 정량적으로 검출하기 위해, 추가 투여 후 24시간, 72시간 및 7일에 샘플을 채취하였다. Aβ 침착(시험예 9) 및 사이토카인(시험예 10)의 검출과 관련하여, 동일한 항체의 군에 대해, 추가 투여 후 다양한 시점에서 채취한 모든 샘플을 데이터 처리를 위해 함께 모았다.
시험예 7. 마우스의 둥지 만들기 능력 시험
둥지를 만드는 것은 마우스의 본능이며, 마우스의 사회적 행동을 측정하기 위한 실험 방법으로서 전형적으로 사용된다. Tg2576, APPswe/PS1, 3×Tg-AD, 5×FAD(Transl Psychiatry. 2015 May 5;5:e562)와 같은, APP를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 둥지 만드는 능력에 다양한 정도로 손상을 보였다고 보고되어 있다. 이 시험예는 여러 매개변수로 마우스의 둥지 만드는 능력을 점수매김으로써 5×FAD 트랜스제닉 마우스의 사회적 행동 개선에 대한 시험 항체의 효과를 평가하는 것이다.
마우스 둥지 만들기의 구체적인 절차는 아래 서술하였다. 실험의 첫 번째 날 대략 16:00에, 압축된 솜 조각을 각 우리에 넣고, 각각의 마우스를 개별 우리에 보관하였다. 압축된 솜을 우리에 넣기 전에 칭량하였고(무게 1), 사육 환경은 변함이 없었다. 다음날 아침 10시에, 마우스를 꺼내 원래의 우리로 돌려보냈다. 둥지의 모양과 솜 조각의 위치는 변함없이 유지되었다. 먼저, 디지털 카메라를 사용하여 마우스가 지은 둥지의 사진을 찍었다(둥지의 실제 모양과 높이를 반영하는 정면도 및 측면도). 조각으로 찢어지지 않은 솜을 집어 칭량하였다(무게 2). 남은 솜의 백분율을 계산하였다. 사진을 바탕으로, 둥지의 모양, 높이, 솜이 찢어진 정도에 따라, 병렬적으로 제공된 3개의 독립적인 점수로부터 각 동물에 대한 평균 점수를 구했고, 점수매김 기준에 따르면, 점수는 특정 상황에 따라 적절하게 조정가능하다. 점수매김 기준은 표 5에 나타냈다:
| 둥지의 모양, 높이 및 솜이 찢어진 정도 | 점수 |
| 도 5에 나타낸 바와 같이, 솜 조각은 거의 온전히 남아있었다 (솜이 90% 이상 남음); | 1 |
| 도 5에 나타낸 바와 같이, 솜 조각의 작은 부분이 조각으로 찢어졌고, 솜 조각의 대부분은 온전히 남아있었으며, 남은 솜의 양은 50% 내지 90%였다; | 2 |
| 도 5에 나타낸 바와 같이, 솜 조각의 대부분은 조각으로 찢어졌지만(50%-90%), 솜 조각은 둥지의 예비 모양을 형성하기 위해 우리의 모서리에 모여 있지 않았고; 대신, 솜 조각이 우리의 바닥에 흩어져 있었다; | 3 |
| 도 5에 나타낸 바와 같이, 찢어진 솜 조각의 대부분(90% 이상)이 우리의 모서리에 모여 둥지 모양을 기본적으로 형성했지만, 둥지 높이는 마우스 몸통 높이의 50%를 넘지 않았다; | 4 |
| 도 5에 나타낸 바와 같이, 분화구 구덩이 모양으로, 솜은 거의 완전히 찢어졌고(90% 이상이 찢어짐), 둥지의 높이는 마우스 몸통 높이의 50%를 초과하였다. | 5 |
포토샵 CS4 소프트웨어 패키지의 Lasso 도구를 사용하여 각 동물의 사진을 분석하여 둥지 면적 비율(흩어진 솜 조각의 총 면적에 대한 둥지 면적의 백분율)을 계산하였다. 3개 매개변수의 종합 점수(입방 점수)는 아래 공식에 따라 계산하였다:
3개 매개변수의 종합 점수 = 남은 솜의 백분율 × 둥지 면적의 백분율 × 평균 점수
시험 결과는 도 6 및 도 7에 나타냈다. 시험의 실험적 윈도우를 반영하는, 비히클(용매 블랭크 대조군) 및 WT(야생형) 사이에 약간의 차이가 있었다. 아두카누맙-Ch, HAB-2401-Ch 및 HAB-9001-Ch 군은 비히클 군에 비해 약간의 개선 경향을 나타냈다.
시험예 8. 물미로 행동 시험 (모리스 물 미로)
물 미로 실험은 설치류의 공간 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 신경생물학 분야에서 일반적으로 사용되는 행동 시험이다. 이러한 실험에서, 수영장 주변의 공간 신호는 설치류가 훈련에 의해 수영장 물 밑에 숨겨진 탈출 플랫폼을 찾고 기억하도록 안내하기 위해 사용되었다.
모리스 물 미로는 직경 120cm, 높이 50cm의 흰색, 무독성 및 무취 플라스틱 원형 풀과 투명한 퍼스펙스 플랫폼으로 구성되었다. 플랫폼의 높이는 31cm이고, 플랫폼의 윗면은 8.5cm의 직경을 가졌다. 수면이 플랫폼 위 1cm가 될 때까지 풀을 물로 채웠다. 풀은 NE, SE, SW 및 NW의 4개 사분면으로 균등하게 나뉘었고, N, NE, E, SE, S, SW, W 및 NW는 원형 풀의 외부 원을 균등하게 나누어 8개 지점에 표시되었다. 플랫폼은 SW 사분면의 중앙에, 원의 중심에서 30cm 거리, 풀 벽에서 30cm 거리에 위치했다(도 8에 물 미로의 개략도를 나타냈다). 설치된 카메라 장치를 컴퓨터 및 모니터에 연결하였다. 원형 풀을 조명이 밝은 실험실에 배치하였다. 명백한 시각적 신호를 NE, SE, SW 및 NW 마커에 장식하였다. 실험 전에, 적당량의 흰색 플라스틱 입자를 물에 뿌려 수면을 고르게 덮도록 하고, 수온은 23.0±2.0℃로 유지하였다. 물은 5일마다 교체하였다.
다음 모듈은 수중 미로 실험에 포함되었다: 깃발 훈련, 숨겨진 플랫폼 및 프로브 시험.
8.1. 깃발 훈련
동물을 안내하기 위해 플랫폼 상에 물 위로 깃발을 배치하였다. 각각의 실험 동물을 N 지점에서 물에(풀의 벽을 향함) 넣고, 60초 동안, 비디오 추적 및 녹화를 동시에 시작했다. 동물이 60초 이내에 플랫폼에 탑승하지 못하면, 수동으로 플랫폼으로 안내하고 20초 동안 머물도록 한 후 미로에서 제거하였다; 동물이 60초 이내에 플랫폼을 발견했지만 20초 미만 동안 플랫폼에 머무르면, 60초-훈련이 끝난 후, 플랫폼에 20초 동안 머무르게 한 후 미로에서 제거하였다; 동물이 60초 이내에 플랫폼을 발견하고 20초 동안 플랫폼에 머무르면, 미로에서 제거하였다. 훈련 후, 각 동물은 수건으로 말려서 우리로 돌려보냈다. 모든 동물을 훈련시킨 후, 동일한 훈련의 새로운 라운드를 다시 시작하였다. 이런 방식으로, 각 동물은 하루에 4번 훈련되었다.
8.2. 숨겨진 플랫폼
플랫폼을 수면에서 약 1cm 아래에 숨겼다. 동물은 총 12일 동안 하루에 4번 훈련되었다. 마우스를 물에 넣은 위치를 도 8에 나타냈다. 각 훈련 중에, 동물은 풀 벽을 향하도록 배치되었으며, 비디오 추적 및 녹화가 동시에 시작되었다. 각 훈련은 60초 동안 지속되었다. 동물이 60초 이내에 플랫폼을 발견하지 못하면, 수동으로 플랫폼으로 안내하고 15초 동안 머무도록 한 후 미로에서 제거하였다; 동물이 60초 이내에 플랫폼을 발견했지만 15초 미만 동안 플랫폼에 머무르면, 60초-훈련이 끝난 후, 플랫폼에 15초 동안 머무르게 한 후 미로에서 제거하였다; 동물이 60초 이내에 플랫폼을 발견하고 15초 동안 플랫폼에 머무르면, 미로에서 제거하였다. 훈련 후, 각 동물은 수건으로 말려서 우리로 돌려보냈다. 모든 동물을 훈련시킨 후, 동물을 다른 위치에서 물에 넣고 새로운 라운드의 훈련을 다시 시작하였다.
8.3 프로브 시험
12일에 마지막 훈련을 시킨 후 24시간 후에, 프로브 시험을 위해 물 아래 플랫폼을 제거했다. 동물을 NE 지점의 물에(풀의 벽을 향함) 넣었고, 비디오 추적 및 녹화를 동시에 시작하였다. 60초 후, 추적을 종료하였다. 동물을 풀에서 꺼내, 수건으로 말려서 우리로 돌려보냈다. 동물의 트랙을 놀두스 에토비젼(Noldus Ethovision) 소프트웨어로 분석하였다.
8.4. 물 미로 실험의 결과
숨겨진 플랫폼 훈련의 학습 곡선은 도 9에 나타냈다. 결과는 5×FAD Tg 마우스 비히클(용매 블랭크 대조군) 군과 WT 군 사이에, 숨겨진 플랫폼 훈련의 6일째에 유의한 차이가 관찰되고, 10일 및 11일째에 매우 유의한 차이가 관찰되는 것을 보여주었으며, 이러한 차이는 안정된 경향이 있어서, 행동 시험에서 5×FAD 트랜스제닉 마우스와 야생형 마우스 사이에 공간 기억 능력에 차이가 있음을 나타낸다. 이러한 차이는 시험 약물을 시험하는 기초이다; 1일째부터, 양성 대조군 약물 아두카누맙-Ch의 군은 비히클 군보다 플랫폼으로의 지연 시간이 항상 더 짧았고, 11일째에는, 유의한 차이가 관찰되었으며, 이는 아두카누맙-Ch가 이 실험에서 우수한 효능을 보였음을 나타낸다; 아두카누맙-Ch 군과 유사하게, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch 및 HAB-9001-Ch는 11일과 12일째에 유의한 차이를 보였으며, 이는 아두카누맙-Ch와 마찬가지로, 세 가지 약물이 마우스의 공간 기억 및 인지 능력을 크게 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
프로브 시험에서, 우리는 플랫폼으로의 지연시간, 플랫폼 구역으로의 지연시간, 플랫폼 또는 플랫폼 구역 교차 횟수, 플랫폼에서의 지속시간 및 플랫폼 구역에서의 지속시간 및 ACI 지수를 포함하는, 여러 실험 매개변수를 평가하였다.
플랫폼으로의 지연시간의 결과는 도 10a에 나타냈다. WT 및 비히클 군 사이에 분명한 차이가 있었으며, 이는 실험적 윈도우이다. (WT 군의 경우, 프로브 시험에서 플랫폼으로의 지연시간이 깃발 훈련에서의 지연시간보다 길었으며, 이는 프로브 시험에서 오직 하나의 시험을 수행한 반면, 깃발 훈련에서는 4개의 시험을 수행했기 때문에, 실험적 오차에 의해 야기된 것일 수 있다). HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch 및 HAB-9001-ch의 결과는 아두카누맙-Ch 군의 결과와 비슷했고, 비히클 군보다 짧은 지속시간을 보여주었다.
플랫폼 구역으로의 지연시간의 결과는 도 10b에 나타냈다. WT 군은 비히클 군에 비해 약 3배의 유의한 차이를 나타냈다. 아두카누맙-Ch 군은 비히클 군과 비교하여 유의한 차이를 보였고, 아두카누맙-Ch 군의 결과는 WT 군의 결과에 가까웠으며, 이는 양성 분자가 5×FAD 마우스의 기억력을 크게 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 네 가지 시험 항체 모두 비히클 군과 비교할 때 유의한 차이를 보였으며, 그 중에서 HAB-9001-Ch는 아두카누맙-Ch보다 훨씬 더 나은 효능을 보여주었다.
플랫폼 또는 플랫폼 구역을 교차하는 횟수의 실험 결과는 도 10c 및 도 10d에 나타내고, 플랫폼에서의 지속시간 및 플랫폼 구역에서의 지속시간에 대한 실험 결과는 도 10e 및 도 10f에 나타냈으며, ACI 지수의 실험 결과는 도 10g에 나타냈다. 프로브 시험에서, 플랫폼은 제거되었으며, 플랫폼에 대한 마우스의 기억은 이들 매개변수와 이론적으로 양의 상관관계가 있다. 이들 5개의 매개변수의 경우, WT 군과 비히클 군 사이에 분명한 차이가 있었고, 이는 실험 결과의 실험적 윈도우를 나타낸다. 비히클 군에 비해, 아두카누맙-Ch는 개선된 경향을 보였다. 비히클 군에 비해, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch 및 HAB-9001-Ch는 모두 다른 정도의 개선을 보였고, HAB-9001-Ch가 최고의 성능을 보였다.
요약하면, 프로브 시험에서, 비히클 군에 비해, HAB-2401-Ch, HAB-5101-Ch 및 HAB-9001-Ch는 플랫폼으로의 지연시간, 플랫폼 구역으로의 지연시간, 플랫폼에서의 지속시간, 플랫폼 구역에서의 지속시간, 플랫폼 교차 횟수, 플랫폼 구역 교차 횟수 및 ACI 지수에서 상이한 정도의 개선을 나타냈고, 이는 이들 3개의 시험 항체가 5×FAD 알츠하이머 마우스 모델의 공간 기억 및 인지 능력을 크게 향상시킬 수 있음을 시사한다.
시험예 9. Aβ 침착의 검출
모든 샘플은 행동 시험(시험예 8)에 사용된 마우스에서 채취했다. 각 마우스를 PBS(pH 7.4)로 관류시키고 뇌를 채취하였다. 좌반구를 4% PFA에 즉시 담그고 72시간 동안 고정하고, 우반구를 얼음 위에서 해부하여 전두엽과 해마를 채취하고, 별도로 칭량하고, 액체 질소에서 신속하게 냉동시키고, 후속 샘플 처리를 위해 -80℃에서 냉장 보관하였다.
우반구를 균질화하는 구체적인 절차는 다음과 같다: 시험 조직을 칭량하고 균질화 튜브로 옮기고, 10배-부피의 디에틸아민 용해물(50mM NaCl, 0.2% DEA 함유 프로테아제 억제제)을 첨가하였다. 즉, 10㎎의 조직을 100㎕의 용해 용액에 넣고, 균질기로 균질화하고, 얼음물에서 15-20초 동안 초음파처리하였다. 균질물을 원심분리 튜브로 옮기고, 100,000×g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 가용성 Aβ를 함유하는 생성된 상청액을 수집하여 -80℃에서 보관하였다. 10배-부피의 구아니딘 히드로클로라이드 용해 용액(PBS 중 5M GuHCl)을 원심분리 튜브에 넣고, 펠릿을 재현탁하고 얼음물에서 15-20초 동안 초음파처리하였다. 샘플을 100,000×g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 불용성 Aβ를 함유하는 생성된 상청액을 수집하여 -80℃에서 보관하였다.
뇌 조직 균질물 내 Aβ 침착은 ELISA 방법(인간 아밀로이드 베타 (aa1-40) 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트: R&D 시스템즈, DAB140B; 인간 아밀로이드 베타 (aa1-42) 퀀티카인 ELISA 키트: R&D 시스템즈, DAB142)에 의해 검출되었다. 첫째, 뇌 균질물(즉, 시험될 샘플) 및 표준물 내 불용성 성분을 희석제로 희석하였다; 미리-코팅된 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고; 희석된 표준물과 샘플을 첨가하였다; 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척 완충액으로 3-4회 세척하였다; 미리-냉각된 2차 항체를 첨가하였다; 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다; 플레이트를 세척 완충액으로 3-4회 세척하였다; 기질 발색 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다; 정지 용액을 첨가하고 OD450을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
ELISA 시험의 결과는 도 11a-11d에 나타냈으며, 비히클(용매 블랭크 대조군) 군은 WT 군에 비해 상당한 Aβ1-40 및 Aβ1-42 침착을 나타냈고, 이는 Aβ 침착이 5×FAD 마우스 뇌 조직에서 과-발현되었음을 나타낸다. 비히클 군과 비교하여, 아두카누맙-Ch에서 Aβ1-40 및 Aβ1-42가 감소하는 경향이 관찰되었다. 4개의 시험된 항체 중에서, HAB-3601-Ch는 비히클에 비해 가장 우수한 성능을 가졌으며 불용성 Aβ1-40(해마 불용성 Aβ1-40) 및 불용성 Aβ1-42(해마 불용성 Aβ1-42)는 감소하는 경향이 있었다.
좌반구 조직의 면역조직화학적 염색 절차는 다음과 같았다. 단리된 뇌의 탈수: 뇌를 4% PFA로 72시간 동안 고정한 후, 탈수를 위해 30% 수크로스 용액에 넣고, 밤새 4℃에서 냉장고에 두고, 탈수 절차를 1회 반복하였다; 조직을 포매하였다: 이소펜탄을 드라이 아이스에 수분 동안 두어 이소펜탄의 액체가 -70℃에 도달하도록 하였다; 여분의 부분을 제거한 후 뇌 조직을 압지로 건조하고 이소펜탄에 넣어 수초간 동결시킨 후, 이소펜탄에서 뇌 조직을 꺼내, 건조하고 OTC(포매제)로 포매 박스에 포매한 다음, 포매 박스를 드라이 아이스 위에 두어 OTC를 고형화시켰다. 포매 뇌 조직을 -80℃에서 냉장고에 보관하였다; 절편화: 뇌 조직을 절편당 20㎛로, 저온유지장치에서 시상단면으로 절단하였다; 내인성 퍼옥시다제의 불활성화: 뇌 절편을 PBS에서 3회, 매회 5분씩 헹구고, 0.3% H2O2(PBS로 제조됨)와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다; 투과성: 뇌 절편을 PBS에서 3회, 매회 5분씩 헹구고, TBST(0.25% 트리톤 X-100을 함유하는 TBS)와 함께 3회, 매회 5분씩 인큐베이션하였다; 차단: PBS 중 0.3% 트리톤 X-100 및 5% BSA와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다; 1차 항체와 함께 인큐베이션: 1차 항체 3D6을 TBST 중 2% BSA로 10㎍/㎖의 작업 농도로 희석하고, 뇌 절편을 1차 항체의 작업 용액에 넣고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다; 2차 항체와 함께 인큐베이션: 뇌 절편을 TBST로 3회, 매회 5분씩 헹구고, 2차 항체를 2% BSA를 함유하는 TBST로 희석하여 5㎍/㎖의 작업 농도를 수득하였고, 뇌 절편을 2차 항체의 작업 용액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다; 색상을 발색함: 뇌 절편을 TBST로 3회, 매회 5분씩 헹구고, 암실에서 색상 발색 용액에 5분 동안 담근 후, 순수한 물에 2회 침지하여 발색 반응을 멈추었다. 장착: 뇌 절편을 PBS에 넣었다 꺼내고, 건조하고, 순수한 물에 담가 염을 제거하고, 건조하고, 구배 농도의 에탄올(75%, 95%, 절대 에탄올)로 고정하고, 수지로 장착하고, 건조하였다; 스캐닝 및 정량 분석: 절편 뭉치를 디지털 절편 스캐너(하마마츠 나노주머 S210)로 스캐닝하여 절편의 스캐닝 이미지를 생성하였다. 각 뇌 절편 사진에 대해, 먼저 마우스 대뇌 좌표에 따라 피질과 해마 영역을 표시한 다음, BIOTOPIX™ 분석 시스템 소프트웨어에 의해 Aβ 양성 신호 영역을 표시하였다. 마지막으로, 피질과 해마에 대해 각각 양성 신호의 비율을 계산하였다. 즉, 피질 내 Aβ 양성 신호의 비율 = 피질 내 Aβ 양성 신호의 면적/피질의 총 면적; 해마 내 Aβ 양성 신호의 비율 = 해마 내 Aβ 양성 신호의 면적/해마의 총 면적.
IHC 검출의 실험 결과는 도 12 및 도 13에 나타냈다. WT 군과 비교하여, 비히클 군은 ELISA 분석과 일치하는, Aβ1-40 및 Aβ1-42의 명백한 침착을 나타냈다. 비히클 군에 비해, HAB-3601-Ch, HAB-9001-Ch 및 아두카누맙-Ch는 Aβ 침착을 상당히 감소시킬 수 있으며, 이는 HAB-3601-Ch 및 HAB-9001-Ch가 아두카누맙-Ch와 마찬가지로, Aβ 침착을 상당히 감소시킬 수 있음을 시사한다.
시험예 10. 뇌 조직에서 사이토카인의 방출에 대한 항체의 효과
본 시험예에서 사용한 샘플은 시험예 9의 뇌 균질액의 가용성 성분이었으며, 사용된 검출 방법은 고감도 전기화학발광 분석기 MSD(메조 스케일 디스커버리)를 사용하였다. 특정 실험 절차는 제품 설명서(U-PLEX 바이오마커 그룹 (마우스) 멀티플렉스 분석 키트: MSD, N05235A-1)에 설명되어 있다. 간단히 말해서, 각 사이토카인에 대해 비오틴화된 포획 항체를 U-PLEX의 각 링커에 연결하고, 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응을 종료시켰다; 제조된 U-PLEX-연결 항체 용액을 혼합하고 U-PLEX 플레이트에 코팅하고, 실온에서 진탕하면서 1시간 또는 4℃ 밤새 인큐베이션하였다; 표준물 및 시험 샘플(즉, 뇌 조직 균질액의 가용성 성분)을 설명서에 따라 희석하였다; 코팅된 플레이트를 PBST 또는 1×MSD 세척 완충액(1×MSD 세척 시약)으로 3회 세척하고, 25㎕ 샘플 희석제, 및 25㎕ 희석된 표준물 및 시험될 샘플을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 코팅된 플레이트를 PBST 또는 1×MSD 세척 완충액으로 3회 세척하고, 희석된 검출 항체 혼합물 50㎕를 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 코팅된 플레이트를 PBST 또는 1×MSD 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 2×리드(Read) 완충액 시약을 첨가하였다. 마지막으로, MSD 기기에서 플레이트를 판독하였다.
실험 결과는 도 14a 내지 도 14d 및 도 15a 내지 도 15f에 나타냈다. TNFα, IFN-γ, IL1 β, IL2, IL6, IL12p70, IL4, IL10, MCP-1 및 KC와 같은 모든 사이토카인의 수준은 매우 낮았으며 검출 방법의 하한에 거의 도달했다. 개별 마우스 사이에 명백한 차이가 있었고, 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 요약하면, 4개의 시험 항체 군은 양성 대조군 아두카누맙과 비교할 때 더 높은 수준의 사이토카인을 나타내지 않았으며, 이는 시험 항체가 안전함을 나타낸다.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.
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<223> mAb-5101, HAB-5101 HCDR2 amino acid sequence
<400> 24
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1 5 10 15
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 25
Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<400> 27
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1 5 10
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<213> Artificial Sequence
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sequence
<400> 28
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
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sequence
<400> 29
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro
85 90 95
<210> 30
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 heavy chain amino acid sequence
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
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305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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sequence
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Ala Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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sequence
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 heavy chain amino acid sequence
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
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Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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195 200 205
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
<210> 35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 light chain amino acid sequence
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human germline (IGHV2-70D*04) heavy chain template amino acid
sequence
<400> 36
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ile
100
<210> 37
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human germline(IGKV2-40*01)light chain template amino acid
sequence
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro
100
<210> 38
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 heavy chain amino acid sequence
<400> 38
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
450
<210> 39
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 light chain amino acid sequence
<400> 39
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 40
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 heavy chain amino acid sequence
<400> 40
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
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Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 41
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 light chain amino acid sequence
<400> 41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101, HAB-9001 heavy chain constant
region amino acid sequence
<400> 42
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401, HAB-3601, HAB-5101, HAB-9001 light chain constant
region amino acid sequence
<400> 43
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 heavy chain variable region amino acid sequence
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 light chain variable region amino acid sequence
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 46
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 heavy chain variable region amino acid sequence
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 light chain variable region amino acid sequence
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 heavy chain variable region amino acid sequence
<400> 48
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 light chain variable region amino acid sequence
<400> 49
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 heavy chain variable region amino acid sequence
<400> 50
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100 105 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 light chain variable region amino acid sequence
<400> 51
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601, HAB-9001 HCDR2 amino acid sequence
<400> 52
His Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 LCDR3 amino acid sequence
<400> 53
Ser Gln Gly Ser Arg Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 54
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 heavy chain nucleotide sequence
<400> 54
gaggtgcagc tggtgcagag cggtgccgag gtgaagaagc cgggagcgag cgtgaaagtg 60
agctgcaagg tgagcggcta caccctgacc aacacctaca tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctgggaagg gcctggagtg gatgggcagg atcgacccca ccaacggcaa caccaagtac 180
gcccccaagt tcaaggacag ggtgaccatg accgccgaca ccagcaccga cactgcgtac 240
atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagggtc 300
tactactacg acagcaccta taactactgg ggtaagggca ccactgtaac cgtgagctct 360
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 55
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 light chain nucleotide sequence
<400> 55
gacatccaga tgacccaaag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtggggga cagggtgact 60
atcacctgca agagcagcca gagcctgctg aactcaggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg caaggtgccc aagcttctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccagcag gttcagtggc agcggtagcg gaaccgactt cacccttaca 240
atctcaagcc tgcagcccga ggacgttgcc acctactact gccagaacga ctacaactac 300
cccctcacct tcggcggagg gactaaggtg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
660
<210> 56
<211> 1353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 heavy chain nucleotide sequence
<400> 56
caggtgcagc tggtggagag cggcggtggc gtggtgcaac ccggcaggag cctgaggctg 60
agctgcgctg ccagcggctt cgccttcagc accttcggca tgggcgtggg ctgggtgagg 120
caggcacccg gaaagggcct ggagtgggtg gcccatatct ggtgggacga caacaagtac 180
tacaatccag ccctgaagag caggttcacc atcagcaggg acaacagcaa aaacaccctg 240
tacctgcaga tgaataccct gagggccgag gataccgccg tgtactactg cgccaggagg 300
cccctgggct cctacgatta cttcgactac tggggcaagg gaaccaccgt gaccgtgagc 360
agcgcttcga ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 57
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 light chain nucleotide sequence
<400> 57
gacatccaga tgacccagag ccccagcagt ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtcacc 60
atcacctgta ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg 120
tatcagcaaa agcccggcaa ggcccccaag cttctgatat acaaggtgag caacaggttc 180
tcaggcgttc ccagtaggtt cagcggaagc ggcagcggga ccgacttcac cctgaccatc 240
agctccctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgct tccagggcag ccgggtgcct 300
ctgacctttg gtgggggcac caaggtggag attaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 58
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 heavy chain nucleotide sequence
<400> 58
caggtgaccc tgaaagaaag cggccctgct ctggtgaagc ccacccagac cctcaccctg 60
acctgcacct tcagcggctt cagcttgagc accagcggca tgggcgtgag ctggatcagg 120
cagcctcccg gcaaggccct ggagtggctg gcccacatct actgggacga cgtgagcctg 180
tacaacccta gcctgaagag ccgcctgaca atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccaggagg 300
aggatcatca ccgtggtgga cgccatggac tattggggcc agggcaccac tgtgaccgtg 360
agcagcgctt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210> 59
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 light chain nucleotide sequence
<400> 59
gacgtcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg 120
tacctgcaga agcccggtca gagccccaag ctgctgatat acaaggtgag caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt ttccggcagc ggaagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca gtcagggaag ccgagtgccc 300
cccacctttg gaggcggaac taaggtggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 60
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 heavy chain nucleotide sequence
<400> 60
caggtgaccc tcaaggaatc tggccctgca ctggtgaagc ccacccagac cctgacgctg 60
acctgcacct ttagcggctt cagcttgagc accttcggca tgggcgtggg ctggatcagg 120
cagcctcccg gaaaggccct ggagtggctg gcccacatct ggtgggacga caacaagtac 180
tacaaccccg ctctgaagag ccgcctgaca atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccaggagg 300
ggcttccacc ttggcagcag gggcgactac ttcgaccact ggggccaagg caccactgtg 360
accgtgagca gcgcttcgac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 840
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1020
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1260
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1362
<210> 61
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 light chain nucleotide sequence
<400> 61
gacgtcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgcccgtga ccccaggaga acccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggagtgg 120
tacctgcaga agcctggcca aagcccccag ctgctgatat acaaggtgag caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgataggtt ctctggcagt ggcagcggga ccgacttcac cctgaagatt 240
agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggcag ccgcgtgccc 300
ctgaccttcg gccagggcac taagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 62
<211> 324
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIgG1 heavy chain constant region amino acid sequence
<400> 62
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIgG1 light chain constant region amino acid sequence
<400> 63
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIgG2a heavy chain constant region amino acid sequence
<400> 64
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIgG2a light chain constant region amino acid sequence
<400> 65
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 grafted VH
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Lys
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-2401 grafted VL
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 68
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 grafted VH
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Pro Leu Gly Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-3601 grafted VL
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 grafted VH
<400> 70
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Val Ser Leu Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Thr Val Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-5101 grafted VL
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 72
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 grafted VH
<400> 72
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Phe His Leu Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Phe Asp
100 105 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAB-9001 grafted VL
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Arg Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Claims (22)
- 인간 A베타에 특이적으로 결합하고 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역 및 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 여기서:
a) 중쇄 HCDR1 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11, 17 또는 23에 나타낸 바와 같고;
b) 중쇄 HCDR2 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12, 18, 24 또는 52에 나타낸 바와 같고;
c) 중쇄 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 13, 19, 25 또는 27에 나타낸 바와 같고;
d) 경쇄 LCDR1 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14 또는 20에 나타낸 바와 같고;
e) 경쇄 LCDR2 영역의 아미노산 서열은 서열번호 15 또는 21에 나타낸 바와 같고; 및
f) 경쇄 LCDR3 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16, 22, 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 1에 있어서,
항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 및 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
여기서:
i) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 11, 12 및 13에 나타낸 바와 같고; 또는
ii) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 18 및 19에 나타낸 바와 같고; 또는
iii) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 23, 24 및 25에 나타낸 바와 같고; 또는
iv) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 18 및 27에 나타낸 바와 같고; 또는
v) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 52 및 19에 나타낸 바와 같고; 또는
vi) 항체 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 52 및 27에 나타낸 바와 같고;
그리고 여기서:
vii) 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 14, 15 및 16에 나타낸 바와 같고; 또는
viii) 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 20, 21 및 22에 나타낸 바와 같고; 또는
viiii) 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 20, 21 및 26에 나타낸 바와 같고; 또는
x) 항체 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 20, 21 및 53에 나타낸 바와 같은 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 2에 있어서,
하기 A 내지 D에서 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
A) 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1, 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 HCDR2 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 HCDR3, 및 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 LCDR1, 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 LCDR2, 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 LCDR3을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
B) 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1, 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2, 및 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 HCDR3, 및 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 LCDR1, 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 LCDR2, 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR3을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
C) 서열번호 23에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1, 서열번호 24에 나타낸 바와 같은 HCDR2 및 서열번호 25에 나타낸 바와 같은 HCDR3, 및 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 LCDR1, 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 LCDR2, 및 서열번호 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 LCDR3을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
D) 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 중쇄 HCDR1, 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2, 및 서열번호 27에 나타낸 바와 같은 HCDR3, 및 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 LCDR1, 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 LCDR2, 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR3을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 뮤린, 키메라성 또는 인간화 항체인 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 4에 있어서,
상기 항체가 뮤린 항체이고, 상기 항체는 서열번호 3, 5, 7 또는 9에 나타낸 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는
서열번호 4, 6, 8 또는 10에 나타낸 바와 같거나, 또는 그와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 5에 있어서,
하기 E 내지 H로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
E) 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
F) 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
G) 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
H) 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 4에 있어서,
상기 항체가 인간화 항체이고, 상기 항체의 FR 영역 서열은 인간 생식계열 FR 영역 또는 그의 변이체를 포함하고, 상기 FR 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에서 각각 최대 10개의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 7에 있어서,
하기 a) 내지 d)로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
a) 서열번호 44에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 45에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
b) 서열번호 46에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 47에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
c) 서열번호 48에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 49에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
d) 서열번호 50에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 51에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 7에 있어서,
상기 항체가 인간화 항체이고 하기 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 가변 영역을 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
a) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 1E, 71A 및 94R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역;
b) 각각 서열번호 17 및 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 HCDR1 및 HCDR3, 및 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2, 및 28A 및 82B T로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역;
c) 각각 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25에 나타낸 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20 및 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 LCDR1 및 LCDR2, 및 서열번호 26 또는 53에 나타낸 바와 같은 LCDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역; 및 2V 및 45K로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 복귀 돌연변이(들)를 포함하는 FR 영역(들); 또는
d) 각각 서열번호 17 및 서열번호 27에 나타낸 바와 같은 HCDR1 및 HCDR3, 및 서열번호 18 또는 52에 나타낸 바와 같은 HCDR2를 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 2V의 아미노산 복귀 돌연변이를 포함하는 FR 영역(들)을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 불변 영역(들)을 포함하고; 바람직하게는, 항체 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 42에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 가지며, 항체 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 43에 나타낸 바와 같거나 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 10에 있어서,
상기 항체는 서열번호 30, 34, 38 또는 40에 나타낸 바와 같거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및/또는 서열번호 31, 35, 39 또는 41에 나타낸 바와 같거나, 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 11에 있어서,
하기 Q 내지 T로부터 선택되는 임의의 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
Q) 서열번호 30에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 서열번호 31에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
R) 서열번호 34에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 서열번호 35에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
S) 서열번호 38에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 서열번호 39에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
T) 서열번호 40에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 서열번호 41에 나타낸 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 이항체, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인간 A베타에 경쟁적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
- 청구항 15에 있어서,
하기 U 내지 Z에서 선택되는 임의의 핵산 분자인 핵산 분자 :
U) 서열번호 52에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 53에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
V) 서열번호 54에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 55에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
W) 서열번호 56에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
Z) 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 및/또는 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자. - 청구항 15 또는 청구항 16에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
- 청구항 17의 재조합 벡터를 형질전환하여 수득된 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포, 바람직하게는 진핵생물 세포, 더 바람직하게는 포유동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
- 청구항 18의 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 이후 항체를 정제 및 회수하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및
하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)
을 포함하는 약학적 조성물. - A베타-매개 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 항-A베타 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 청구항 20에 따른 약학적 조성물의 용도.
- 청구항 21에 있어서,
상기 질환은 알츠하이머 질환, 경증 인지 장애, 전측두엽 치매, 루이 신체 질환, 파킨슨 질환, 픽 질환, 베박 질환, 콩고성 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 다운 증후군, 다발성 경색 치매, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환, AIDS 치매 증후군, 우울증, 불안 장애, 공포증, 벨 마비, 간질, 뇌염, 다발성 경화증, 신경근 장애, 신경종양 장애, 뇌종양, 뇌졸중으로 인한 신경혈관 장애, 신경면역 장애, 신경병성 이과 질환, 척수 손상으로 인한 신경외상, 신경병성 통증으로 인한 통증, 소아 신경 및 신경정신 장애, 수면 장애, 투렛 증후군, 경증 인지 장애, 혈관성 치매, 다발성 경색 치매, 낭포성 섬유증, 고셔 질환 및 기타 운동이상증 및 중추 신경 시스템의 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질환인 용도.
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