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KR20190133160A - 항-gprc5d 항체 및 항-gprc5d 항체를 포함하는 분자 - Google Patents

항-gprc5d 항체 및 항-gprc5d 항체를 포함하는 분자 Download PDF

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KR20190133160A
KR20190133160A KR1020197026251A KR20197026251A KR20190133160A KR 20190133160 A KR20190133160 A KR 20190133160A KR 1020197026251 A KR1020197026251 A KR 1020197026251A KR 20197026251 A KR20197026251 A KR 20197026251A KR 20190133160 A KR20190133160 A KR 20190133160A
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KR
South Korea
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amino acid
acid sequence
sequence represented
seq
antibody
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Withdrawn
Application number
KR1020197026251A
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English (en)
Inventor
다카시 차엔
도시아키 오츠카
겐지 이이다
겐스케 나카무라
다카히데 아부라타니
준야 이치카와
쇼타 구도
차인 리 피시텔리
마리오 산체스
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 인간 GPRC5D에 결합하는 신규한 항체 및 그 항체를 포함하고 항원 결합성을 갖는 분자를 제공한다. 인간 GPRC5D에 결합하는 신규한 항체, 그 항체를 포함하고 항원 결합성을 갖는 분자, 그 항체 또는 그 분자를 유효 성분으로서 포함하는 항종양 의약 조성물 등이 제공된다.

Description

항-GPRC5D 항체 및 항-GPRC5D 항체를 포함하는 분자
본 발명은 신규한 항-GPRC5D 항체 및 그 항체를 포함하는 분자에 관한 것이다
G-protein coupled receptor family C group 5 member D(GPRC5D)는 일련의 인간 GPCR의 아미노산 서열을 이용한 EST 데이터베이스의 호몰로지 검색에 의해 발견된 G 단백질 공역 수용체의 하나이다(비특허문헌 1). GPCR family C group 5 수용체(GPRC5 수용체)에는 GPRC5A, GPRC5B, GPRC5C, 및 GPRC5D의 4개의 서브타입이 존재하고, 이 수용체는 레티노산 자극에 의해 발현 유도가 행해지기 때문에 레티노산 유도성 오펀 G 단백질 공역 수용체(RAIG)로서도 알려져 있다(비특허문헌 2). 그러나, GPRC5D의 생리 기능이나 생리적 리간드, 공역되는 G 단백질의 서브타입 등에 대해서는 밝혀져 있지 않다.
GPRC5D 유전자와 암의 관련성에 관해서는, GPRC5D가 다발성 골수종에서 고발현되고 있는 것이 알려져 있다. 구체적으로는, GPRC5D의 과잉 발현이 다발성 골수종 환자의 예후 불량과 상관이 있는 것(비특허문헌 3), 다발성 골수종 환자에게의 약물 치료에 의해 GPRC5D를 발현하고 있는 세포의 비율이 감소하는 것 등이 알려져 있다(비특허문헌 4). 이상과 같이, GPRC5D의 과잉 발현과 암의 관련성으로부터, GPRC5D가 암에 대한 우수한 표적 치료가 될 가능성이 시사되고 있다. 그리고, 항-GPRC5D 항체, 및 그 항체와 항-CD3 항체를 포함하고, GPRC5D를 외인적으로 발현시키고 있는 3T3 세포에 대한 결합성을 나타내는 이중특이성 항체의 보고도 있다(특허문헌 1). 그러나, GPRC5D를 표적으로 한 의료용 의약품은 개발되어 있지 않다.
국제 공개 제2016/090329호
브라우너 외(H Brauner-Osborne, et al.), 바이오키미카 에트 바이오피지카 액터(Biochim Biophys Acta.), 2001년 4월 간행, 1518권(3호), 237 내지 248페이지 이노우에 외(S Inoue, et al.), 저널 오브 인베스티게이티브 더머탈러지(Journal of Investigative Dermatology), 2004년 3월 간행, 122권(3호), 565 내지 573페이지 아타마니우크 외(J Atamaniuk, et al.), 유러피언 저널 오브 클리니컬 인베스티게이션(European Journal of Clinical Investigation), 2012년 5월 간행, 42권(9호), 953 내지 960페이지 코헨 외(Y Cohen, et al.), 헤마탈러지(Hematology), 2013년 11월 간행, 18권(6호), 348 내지 351페이지
본 발명의 하나의 과제는 항암 작용을 갖는 항-GPRC5D 항체, 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 그 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 과제는 상기 항체, 상기 항체의 항원 결합성 단편, 또는 상기 분자를 함유하는 의약 조성물 등을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 과제에는, 상기 항체, 상기 항체의 항원 결합성 단편, 또는 상기 분자가 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터, 그 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 도입된 세포, 및 그 세포를 배양하는 공정을 포함하는 상기 항체, 상기 항체의 항원 결합성 단편, 또는 상기 분자의 제조 방법이 포함된다. 또, 본 발명의 다른 하나의 과제는 상기 항체, 상기 항체의 항원 결합성 단편, 또는 상기 분자를 이용한 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 행하여, 신규한 항-GPRC5D 항체를 창출하고, 그 항체가 항암 작용을 갖는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 이하의 것을 제공한다:
(1) 하기 (I) 내지 (III) 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편:
(II)
서열번호 48로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 49로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 50으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 57로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 58로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 59로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(I)
서열번호 45로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 46으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 47로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 54로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 55로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 56으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
(III)
서열번호 51로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 52로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 53으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 60으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 61로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 62로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(2) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (II)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (1)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(3) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (I)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (1)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(4) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (III)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (1)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(5) 키메라화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(6) 인간화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(7) 인간 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(8) 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 (1), (2) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(9) ·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 상기 (1), (2), (6) 및 (8) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(10) 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기, 또는
서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 상기 (1), (2) 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(11) ·서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 상기 (1), (4), (6) 및 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(12) Fc를 포함하는, 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 인간 GPRC5D에 결합하고, 하기 <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편:
<1>
서열번호 111로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 112로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 113으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 114로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 115로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 116으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
<2>
서열번호 117로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 118로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 119로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 120으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 121로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 122로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
<3>
서열번호 123으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 124로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 125로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 126으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 127로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 128로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
<4>
서열번호 129로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 130으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 131로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 132로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 133으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 134로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(14) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <1>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (13)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(15) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <2>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (13)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(16) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <3>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (13)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(17) 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <4>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 상기 (13)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(18) 서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열, 및
서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열, 및
서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 상기 (13) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(19) ·서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 상기 (13) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(20) ·서열번호 144로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
·서열번호 146으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 147로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
·서열번호 148로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 149로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
·서열번호 150으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 151로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
의 어느 하나의 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(21) 상기 (8) 내지 (12) 및 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(22) 상기 (8) 내지 (12) 및 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(23) 상기 (8) 내지 (12) 및 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(24) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 결합하는 인간 GPRC5D 상의 부위에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(25) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 인간 GPRC5D 상으로의 결합에 있어서 경합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(26) 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) GPRC5D에 결합하는, 상기 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항원 결합성 단편.
(27) 항원 결합성 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv, 또는 sdAb인, 상기 (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(28) 상기 (2), (8) 또는 (9)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(29) 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(30) 상기 (2), (8) 또는 (9)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(31) 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(32) 상기 (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(33) 상기 (32)에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(34) 상기 (32)에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (33)에 기재된 벡터를 포함하거나, 또는 상기 (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 산생하는 세포.
(35) 상기 (32)에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (33)에 기재된 벡터를 포함하거나, 또는 상기 (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 세포 표면 상에 발현하는 인공 면역 세포.
(36) 상기 (34)에 기재된 세포를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 회수하는 공정을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 제조 방법.
(37) 상기 (36)에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
(38) 상기 (1) 내지 (31) 및 (37) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 상기 (32)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 상기 (33)에 기재된 벡터, 또는 상기 (35)에 기재된 인공 면역 세포를 유효 성분으로서 함유하는, 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
(39) 암의 치료 및/또는 예방을 위한, 상기 (38)에 기재된 의약 조성물.
(40) 암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는, 유방암, 자궁 내막암, 난소암, 폐암, 위암, 전립선암, 신암, 간암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 자궁 경부암, 혈액암, 림프종, 또는 악성 흑색종인, 상기 (39)에 기재된 의약 조성물.
(41) 암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 다발성 골수종인, 상기 (40)에 기재된 의약 조성물.
(42) 상기 (1) 내지 (31) 및 (37) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 항원 결합성을 갖는 분자.
(43) 다중특이적인, 상기 (42)에 기재된 분자.
(44) 상기 (1) 내지 (31) 및 (37) 중 어느 하나에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과,
서열번호 183으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 238로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 185로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 186으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 239로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 188로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (42) 또는 (43)에 기재된 분자.
(45) 상기 중쇄 CDR2의
1번째의 Xaa는 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
또한 2번째의 Xaa는 S이거나, 또는
1번째의 Xaa는 N이고,
또한 2번째의 Xaa는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 경쇄 CDR2의
Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 것을 특징으로 하는 상기 (44)에 기재된 분자.
(46) 상기 중쇄 CDR2의
1번째의 Xaa는 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 2번째의 Xaa는 S이며, 또한
상기 경쇄 CDR2의
Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 것을 특징으로 하는 상기 (44) 또는 (45)에 기재된 분자.
(47) 서열번호 240으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
서열번호 240으로 나타나는 아미노산 서열의 1번째의 Xaa는 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 또한 2번째의 Xaa는 S이거나, 또는
1번째의 Xaa는 N이고, 또한 2번째의 Xaa는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의
Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
상기 (42) 내지 (45) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(48) 서열번호 240의
1번째의 Xaa는 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
2번째의 Xaa는 S이며, 또한
서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의
Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
상기 (47)에 기재된 분자.
(49) 상기 (1) 내지 (31) 및 (37) 중 어느 하나에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과,
서열번호 183으로 나타나는 중쇄 CDR1의 아미노산 서열,
서열번호 184로 나타나는 중쇄 CDR2의 아미노산 서열, 및
서열번호 185로 나타나는 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 186으로 나타나는 경쇄 CDR1의 아미노산 서열,
서열번호 187로 나타나는 경쇄 CDR2의 아미노산 서열, 및
서열번호 188로 나타나는 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (42) 내지 (44) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(50) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 155로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 156, 158, 및 160 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 (49)에 기재된 분자.
(51) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv, 또는 sdAb인, 상기 (44) 내지 (50) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(52) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체가, 인간 면역글로불린 정상 영역, 또는 Fc 또는 변이형 Fc를 포함하는 인간화 항체 또는 인간 항체인, 상기 (44) 내지 (51) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(53) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 180, 181, 및 182 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 상기 (44) 내지 (52) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(54) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 상기 (1) 내지 (31) 및 (37) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는, 상기 (40) 내지 (44) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(55) 상기 (2), (8) 또는 (9)에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및
·서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 132번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 130번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 244의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 244의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 245의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 245의 135 내지 241의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 246의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 246의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 247의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 247의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 248의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 248의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 249의 2 내지 119의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 249의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 250의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 250의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 251의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 251의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 252의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 252의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 253의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 253의 135 내지 242의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 254의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 254의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
·서열번호 255의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 255의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (42) 내지 (44) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(56) 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, Hybrid형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(57) 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, Hybrid형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(58) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자.
(59) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, Hybrid형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(60) 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이,
v) 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 133 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역, 또는
vi) 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, FSA형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(61) 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이,
v) 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 133 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역, 또는
vi) 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, FSA형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(62) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
또는
서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, FSA형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(63) 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역과, 추가로 변이형 Fc를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, Dual형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(64) 서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
또는
서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 (55)에 기재된 분자. 적용 가능한 형태에는, Dual형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(65) 상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 상기 (19)에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는, 상기 (53)에 기재된 분자.
(66) 서열번호 171 내지 179 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 상기 (54) 또는 (65)에 기재된, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
(67) 상기 (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) 및 (66) 중 어느 하나에 기재된 분자에 포함되는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
(68) 상기 (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) 및 (66) 중 어느 하나에 기재된 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
(69) 상기 (50), (53), (58), (59), (62), (64), (65) 및 (66) 중 어느 하나에 기재된 분자에 포함되는 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
(70) 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는, 상기 (42) 내지 (69) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(71) 이중특이적인, 상기 (43) 내지 (70) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(72) 폴리펩티드인, 상기 (42) 내지 (71) 중 어느 하나에 기재된 분자.
(73) 상기 (72)에 기재된 분자가 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(74) 상기 (73)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(75) 상기 (73)에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (74)에 기재된 벡터, 또는 상기 (71)에 기재된 분자를 산생하는 세포.
(76) 상기 (75)에 기재된 세포를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및/또는 인간 GPRC5D에 결합하는 분자를 회수하는 공정을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자의 제조 방법.
(77) 상기 (76)에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
(78) 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는, 상기 (77)에 기재된 분자.
(79) 상기 (42) 내지 (72), (77) 및 (78) 중 어느 하나에 기재된 분자, 상기 (73)에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 (74)에 기재된 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
(80) 암의 치료 및/또는 예방을 위한, 상기 (79)에 기재된 의약 조성물.
(81) 암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는, 유방암, 자궁 내막암, 난소암, 폐암, 위암, 전립선암, 신암, 간암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 자궁 경부암, 혈액암, 림프종, 또는 악성 흑색종인, 상기 (80)에 기재된 의약 조성물.
(82) 암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 다발성 골수종인, 상기 (79) 또는 (80)에 기재된 의약 조성물.
(83) 상기 (42) 내지 (72), (77) 및 (78) 중 어느 하나에 기재된 분자, 또는 상기 (79) 내지 (82) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.
(84) GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션(redirection)에 의해, GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해(cytotoxicity)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 상기 (79) 내지 (82) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(85) GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션에 의해, GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도하는 것을 특징으로 하는, 상기 (83)에 기재된 방법.
(86) 상기 (42) 내지 (72), (77) 및 (78) 중 어느 하나에 기재된 분자, 또는 상기 (79) 내지 (82) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션에 의해 GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도하는 방법.
(87) 상기 (42) 내지 (72), (77) 및 (78) 중 어느 하나에 기재된 분자, 또는 상기 (79) 내지 (82) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로 T 세포를 리디렉션하는 방법.
본 발명에 의하면, 인간 GPRC5D에 결합하는 신규한 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 그 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하고 항원 결합성을 갖는 신규한 분자가 얻어진다. 상기 분자에는 항-CD3 항체를 포함할 수 있다.
본 발명이 제공하는 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합성 단편, 및 상기 분자를 이용하는 것에 의해, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 각 암종의 치료 또는 예방, 적합하게는 다발성 골수종의 치료 또는 예방이 가능하게 된다.
도 1은 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 인간 GPRC5D에 대한 결합성을 플로 사이토메트리(flow cytometry)법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 2는 인간 GPRC5D의 아미노 말단 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 1).
도 3은 인간 GPRC5D의 아미노 말단 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 2).
도 4는 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 인간 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다. 펩티드의 분자 내 다이설파이드 결합에 대해서는, 다이설파이드 결합 있음(A) 또는 없음(B)이다.
도 5는 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타낸 도면이다.
도 6은 2A4의 중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 3).
도 7은 2A4의 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 10).
도 8은 2A4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 4).
도 9는 2A4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 5).
도 10은 2B1의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 6).
도 11은 2B1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 7).
도 12는 7B4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 8).
도 13은 7B4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 9).
도 14는 2A4의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 11).
도 15는 2A4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 12).
도 16은 2B1의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 13).
도 17은 2B1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 14).
도 18은 7B4의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 15).
도 19는 7B4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 16).
도 20은 인간 κ쇄 분비 시그널 서열 및 인간 κ쇄 정상 영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 17).
도 21은 경쇄 발현 벡터 프라이머 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 18).
도 22는 경쇄 발현 벡터 프라이머 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 19).
도 23은 인간 중쇄 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 20).
도 24는 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 21).
도 25는 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 22).
도 26은 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 23).
도 27은 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 24).
도 28은 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 25).
도 29는 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-141), 및 정상 영역(142-471))(서열목록의 서열번호 26).
도 30은 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 27).
도 31은 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 28).
도 32는 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 29).
도 33은 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 30).
도 34는 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 31).
도 35는 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 32).
도 36은 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 33).
도 37은 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 34).
도 38은 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 35).
도 39는 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 36).
도 40은 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 37).
도 41은 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-126), 및 정상 영역(127-233))(서열목록의 서열번호 38).
도 42는 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 39).
도 43은 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 40).
도 44는 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 41).
도 45는 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 42).
도 46은 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄용 프라이머 세트 F의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 43).
도 47은 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄용 프라이머 세트 R의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 44).
도 48은 인간 키메라화 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 인간 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 49는 인간 키메라화 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 50은 인간 키메라화 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)가 인간 GPRC5D에 대해서 ADCC 활성을 갖는 것을 나타낸 도면이다.
도 51은 인간 키메라화 2A4(c2A4)의, GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 있어서의 in vivo 종양 증식 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 52는 인간 키메라화 2B1(c2B1)의, GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 있어서의 in vivo 종양 증식 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 53은 인간 키메라화 7B4(c7B4)의, GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 이식 BALB/c-nu/nu 마우스에 있어서의 in vivo 종양 증식 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 54는 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 45).
도 55는 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 46).
도 56은 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 47).
도 57은 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 48).
도 58은 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 49).
도 59는 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 50).
도 60은 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 51).
도 61은 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 52).
도 62는 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 53).
도 63은 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 54).
도 64는 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 55).
도 65는 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 56).
도 66은 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 57).
도 67은 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 58).
도 68은 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 59).
도 69는 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 60).
도 70은 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 61).
도 71은 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 62).
도 72는 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L1)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 63).
도 73은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L1)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 64).
도 74는 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L2)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 65).
도 75는 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L2)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 66).
도 76은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L3)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 67).
도 77은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L3)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 68).
도 78은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L4)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 69).
도 79는 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L4)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 70).
도 80은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L5)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 71).
도 81은 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L5)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-127), 및 정상 영역(128-234))(서열목록의 서열번호 72).
도 82는 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H1)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 73).
도 83은 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H1)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 74).
도 84는 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H2)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 75).
도 85는 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H2)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 76).
도 86은 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H3)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 77).
도 87은 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H3)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 78).
도 88은 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H4)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 79).
도 89는 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H4)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 80).
도 90은 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L1)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 81).
도 91은 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L1)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-126), 및 정상 영역(127-233))(서열목록의 서열번호 82).
도 92는 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L2)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 83).
도 93은 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L2)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-126), 및 정상 영역(127-233))(서열목록의 서열번호 84).
도 94는 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H1)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 85).
도 95는 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H1)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 86).
도 96은 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H2)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 87).
도 97은 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H2)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 88).
도 98은 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H3)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 89).
도 99는 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H3)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 90).
도 100은 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H5)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 91).
도 101은 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H5)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 92).
도 102는 인간화 2B1의 인간 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 103은 인간화 7B4의 인간 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 104는 인간화 2B1 및 인간화 7B4가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타낸 도면이다.
도 105는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 아미노 말단 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 93).
도 106은 scFv의 서열 해석에 이용한 프라이머 A의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 94).
도 107은 scFv의 서열 해석에 이용한 프라이머 B의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 95).
도 108은 인간 항체 C2037 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 96).
도 109는 인간 항체 C2037 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 97).
도 110은 인간 항체 C2037 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 98).
도 111은 인간 항체 C2037 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 99).
도 112는 인간 항체 C3048 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 100).
도 113은 인간 항체 C3048 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 101).
도 114는 인간 항체 C3048 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 102).
도 115는 인간 항체 C3048 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 103).
도 116은 인간 항체 C3015 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 104).
도 117은 인간 항체 C3015 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 105).
도 118은 인간 항체 C3015 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 106).
도 119는 인간 항체 C3015 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 107).
도 120은 인간 항체 C3022 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 108).
도 121은 인간 항체 C3022 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 109).
도 122는 인간 항체 C3022 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 110).
도 123은 인간 항체 C3022 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 135).
도 124는 인간 항체 C2037 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 111).
도 125는 인간 항체 C2037 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 112).
도 126은 인간 항체 C2037 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 113).
도 127은 인간 항체 C2037 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 114).
도 128은 인간 항체 C2037 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 115).
도 129는 인간 항체 C2037 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 116).
도 130은 인간 항체 C3048 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 117).
도 131은 인간 항체 C3048 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 118).
도 132는 인간 항체 C3048 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 119).
도 133은 인간 항체 C3048 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 120).
도 134는 인간 항체 C3048 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 121).
도 135는 인간 항체 C3048 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 122).
도 136은 인간 항체 C3015 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 123).
도 137은 인간 항체 C3015 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 124).
도 138은 인간 항체 C3015 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 125).
도 139는 인간 항체 C3015 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 126).
도 140은 인간 항체 C3015 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 127).
도 141은 인간 항체 C3015 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 128).
도 142는 인간 항체 C3022 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 129).
도 143은 인간 항체 C3022 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 130).
도 144는 인간 항체 C3022 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 131).
도 145는 인간 항체 C3022 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 132).
도 146은 인간 항체 C3022 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 133).
도 147은 인간 항체 C3022 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 134).
도 148은 인간 항체 C2037의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 136).
도 149는 인간 항체 C2037의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 137).
도 150은 인간 항체 C3048의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 138).
도 151은 인간 항체 C3048의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 139).
도 152는 인간 항체 C3015의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 140).
도 153은 인간 항체 C3015의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 141).
도 154는 인간 항체 C3022의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 142).
도 155는 인간 항체 C3022의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열목록의 서열번호 143).
도 156은 인간 항체 C2037의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-134), 및 정상 영역(135-464))(서열목록의 서열번호 144).
도 157은 인간 항체 C2037의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-130), 및 정상 영역(131-236))(서열목록의 서열번호 145).
도 158은 인간 항체 C3048의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-142), 및 정상 영역(143-472))(서열목록의 서열번호 146).
도 159는 인간 항체 C3048의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-130), 및 정상 영역(131-236))(서열목록의 서열번호 147).
도 160은 인간 항체 C3015의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-140), 및 정상 영역(141-470))(서열목록의 서열번호 148).
도 161은 인간 항체 C3015의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-126), 및 정상 영역(127-232))(서열목록의 서열번호 149).
도 162는 인간 항체 C3022의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), 가변 영역(20-134), 및 정상 영역(135-464))(서열목록의 서열번호 150).
도 163은 인간 항체 C3022의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-20), 가변 영역(21-130), 및 정상 영역(131-236))(서열목록의 서열번호 151).
도 164는 인간 항체 scFv의, 인간(A) 또는 사이노몰거스 원숭이(B) 비오틴화 GPRC5D 아미노 말단에 대한 결합성을, ELISA법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 ELISA법에 의해 측정된 발광 강도를 나타낸다.
도 165는 인간 항체 IgG화체의, 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 비오틴화 GPRC5D 아미노 말단에 대한 결합성을, ELISA법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 ELISA법에 의해 측정된 발광 강도를 나타낸다.
도 166은 인간 항체 scFv의, 인간 GPRC5D 발현 암 세포주에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 167은 인간 항체 IgG화체의, 인간 GPRC5D 발현 암 세포주에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 168은 래트 항-CD3 항체 C3-147의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 152).
도 169는 래트 항-CD3 항체 C3-147의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 153).
도 170은 C3E-7000(58-867)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-57), scFv(58-783), 및 FLAG-His 태그(793-867))(서열번호 154).
도 171은 C3E-7034의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 155).
도 172는 C3E-7034의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 156).
도 173은 C3E-7034(58-864)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-57), scFv(61-786), 및 FLAG-His 태그(790-864))(서열번호 157).
도 174는 C3E-7035의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 158).
도 175는 C3E-7035(58-864)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-57), scFv(61-786), 및 FLAG-His 태그(790-864))(서열번호 159).
도 176은 C3E-7036의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 160).
도 177은 C3E-7036(58-858)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-57), scFv(61-780), 및 FLAG-His 태그(784-858))(서열번호 161).
도 178은 발현 벡터 pC2037-C3E-7034의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 162).
도 179는 발현 벡터 pC3048-C3E-7034의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 163).
도 180은 발현 벡터 pC3022-C3E-7034의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 164).
도 181은 발현 벡터 pC2037-C3E-7035의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 165).
도 182는 발현 벡터 pC3048-C3E-7035의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 166).
도 183은 발현 벡터 pC3022-C3E-7035의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 167).
도 184는 발현 벡터 pC2037-C3E-7036의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 168).
도 185는 발현 벡터 pC3048-C3E-7036의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 169).
도 186은 발현 벡터 pC3022-C3E-7036의 ORF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 170).
도 187은 C2037-C3E-7034의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C2037(21-260), 및 C3E-7034(266-507))(서열번호 171).
도 188은 C3048-C3E-7034의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3048(21-268), 및 C3E-7034(274-515))(서열번호 172).
도 189는 C3022-C3E-7034의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3022(21-260), 및 C3E-7034(266-507))(서열번호 173).
도 190은 C2037-C3E-7035의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C2037(21-260), 및 C3E-7035(266-507))(서열번호 174).
도 191은 C3048-C3E-7035의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3048(21-268), 및 C3E-7035(274-515))(서열번호 175).
도 192는 C3022-C3E-7035의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3022(21-260), 및 C3E-7035(266-507))(서열번호 176).
도 193은 C2037-C3E-7036의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C2037(21-260), 및 C3E-7036(266-505))(서열번호 177).
도 194는 C3048-C3E-7036의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3048(21-268), 및 C3E-7036(274-513))(서열번호 178).
도 195는 C3022-C3E-7036의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-19), C3022(21-260), 및 C3E-7036(266-505))(서열번호 179).
도 196은 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(인간 림프종 세포주 A4/FuK 세포)에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 197은 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 198은 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3(PBMC)에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 199는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 CD3(PBMC)에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 200은 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자가 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(인간 림프종 세포주 A4/FuK 세포)에 대해서 세포상해 활성을 갖는 것을 나타낸 도면이다.
도 201은 인간화 2B1의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 202는 인간화 7B4의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 대한 결합성을, 플로 사이토미터(FACS)를 이용하여 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도의 상대치를 나타낸다.
도 203은 C3E-7034(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 180).
도 204는 C3E-7035(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 181).
도 205는 C3E-7036(1-267)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-241), 및 FLAG-His 태그(242-267)(서열번호 182).
도 206은 C3E-7000의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 183).
도 207은 C3E-7000의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 184).
도 208은 C3E-7000의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 185).
도 209는 C3E-7000의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 186).
도 210은 C3E-7000의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 187).
도 211은 C3E-7000의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 188).
도 212는 인간 CD3ε의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 189).
도 213은 E1018 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 190).
도 214는 E1018 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 191).
도 215는 E1018 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 192).
도 216은 E1018 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 193).
도 217은 D1012 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 194).
도 218은 D1012 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 195).
도 219는 D1012 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 196).
도 220은 D1012 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 197).
도 221은 항-GPRC5D 항체(C3022, E1018, C3048, 및 D1012)의 인간 GPRC5D에 대한 결합 활성을 SPR법으로 측정하여 결합 해리 상수를 나타낸 도면이다.
도 222는 h2B1_Fab_HC_1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 198).
도 223은 h2B1_Fab_HC_1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-146), 및 정상 영역(147-475))(서열번호 199).
도 224는 h2B1_Fab_HC_2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 200).
도 225는 h2B1_Fab_HC_2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-146), 및 정상 영역(147-475))(서열번호 201).
도 226은 h2B1_Fab_LC_1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 202).
도 227은 h2B1_Fab_LC_1의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-130), 및 정상 영역(131-237))(서열번호 203).
도 228은 h2B1_Fab_LC_2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 204).
도 229는 h2B1_Fab_LC_2의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-130), 및 정상 영역(131-237))(서열번호 205).
도 230은 C3E-7034_Fab_HC의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 206).
도 231은 C3E-7034_Fab_HC의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(25-142), 및 정상 영역(143-471))(서열번호 207).
도 232는 C3E-7034_Fab_LC의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 208).
도 233은 C3E-7034_Fab_LC의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-132), 및 정상 영역(133-238))(서열번호 209).
도 234는 C3E-7036_Fab_HC의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 210).
도 235는 C3E-7036_Fab_HC의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(25-142), 및 정상 영역(143-471))(서열번호 211).
도 236은 C3E-7036_Fab_LC의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 212).
도 237은 C3E-7036_Fab_LC의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-130), 및 정상 영역(131-236))(서열번호 213).
도 238은 h2B1_Fab_HC_3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 214).
도 239는 h2B1_Fab_HC_3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-146), 및 정상 영역(147-475))(서열번호 215).
도 240은 h2B1_Fab_LC_3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 216).
도 241은 h2B1_Fab_LC_3의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-130), 및 정상 영역(131-237))(서열번호 217).
도 242는 C3E-7034_scFv_Fc의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 218).
도 243은 C3E-7034_scFv_Fc의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-266))(서열번호 219).
도 244는 C3E-7036_scFv_Fc의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 220).
도 245는 C3E-7036_scFv_Fc의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-264))(서열번호 221).
도 246은 인간화 2B1_scFv_Fc(h2B1_scFv_Fc)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 222).
도 247은 인간화_2B1_scFv_Fc(h2B1_scFv_Fc)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-271))(서열번호 223).
도 248은 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 FSA형, B는 Hybrid형, C는 Dual형의 이중특이성 분자의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 249는 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 FSA형, B는 Hybrid형, C는 Dual형의 이중특이성 분자의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 250은 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 FSA형, B는 Hybrid형, C는 Dual형의 이중특이성 분자의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 251은 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 CD3 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 FSA형, B는 Hybrid형, C는 Dual형의 이중특이성 분자의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 252a는 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성을 나타낸 도면이다. A는 FSA형, B는 Hybrid형의 이중특이성 분자의 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 252b는 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성을 나타낸 도면이다. C는 Dual형의 이중특이성 분자의 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 253은 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의, 인간 PBMC와 암세포의 공(共)이식 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 254는 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의, 인간 PBMC 이입 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 255는 C3E-8015의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 224).
도 256은 C3E-8015의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-264))(서열번호 225).
도 257은 C3E-8017의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 226).
도 258은 C3E-8017의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-266))(서열번호 227).
도 259는 C3E-8018의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 228).
도 260은 C3E-8018의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-266))(서열번호 229).
도 261은 C3E-8025의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 230).
도 262는 C3E-8025의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-264))(서열번호 231).
도 263은 C3E-8027의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 232).
도 264는 C3E-8027의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-266))(서열번호 233).
도 265는 C3E-8028의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 234).
도 266은 C3E-8028의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 및 scFv(24-266))(서열번호 235).
도 267은 h2B1_Fab_HC_4의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다(서열번호 236).
도 268은 h2B1_Fab_HC_4의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다(시그널 서열(1-23), 가변 영역(24-146), 및 정상 영역(147-476))(서열번호 237).
도 269는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 C5D-0004와 C5D-0014, B는 C5D-0005와 C5D-0015, C는 C5D-0006과 C5D-0016의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 270은 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 C5D-0004와 C5D-0014, B는 C5D-0005와 C5D-0015, C는 C5D-0006과 C5D-0016의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 271은 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 C5D-0004와 C5D-0014, B는 C5D-0005와 C5D-0015, C는 C5D-0006과 C5D-0016의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 272는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3 발현 세포에 대한 결합 활성을 플로 사이토메트리법에 의해 검증한 도면이다. 세로축은 플로 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도를 나타낸다. A는 C5D-0004와 C5D-0014, B는 C5D-0005와 C5D-0015, C는 C5D-0006과 C5D-0016의 결합 활성을 나타낸 도면이다.
도 273a는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성을 나타낸 도면이다. A는 C5D-0004, B는 C5D-0014의 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 273b는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성을 나타낸 도면이다. C는 C5D-0005, D는 C5D-0015의 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 273c는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성을 나타낸 도면이다. E는 C5D-0006, F는 C5D-0016의 살세포 활성을 나타낸 도면이다.
도 274는 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의, 인간 PBMC와 암세포의 공이식 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 275는 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의, 인간 PBMC 이입 모델에 있어서의 항종양 활성을 나타낸 도면이다. A는 C5D-0004, B는 C5D-0014의 항종양 활성을 나타낸 도면이다.
도 276은 CDR 개변체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열이다(서열번호 238).
도 277은 CDR 개변체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열이다(서열번호 239).
도 278은 C3E-7034의 CDR 개변체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다(서열번호 240).
도 279는 C3E-7034의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다(서열번호 241).
도 280은 C3E-7035의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다(서열번호 242).
도 281은 C3E-7036의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다(서열번호 243).
도 282는 C3E-7078(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 244).
도 283은 C3E-7085(1-267)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-241), 및 FLAG-His 태그(242-267)(서열번호 245).
도 284는 C3E-7086(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 246).
도 285는 C3E-7087(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 247).
도 286은 C3E-7088(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 248).
도 287은 C3E-7089(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 249).
도 288은 C3E-7090(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 250).
도 289는 C3E-7091(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 251).
도 290은 C3E-7092(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 252).
도 291은 C3E-7093(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 253).
도 292는 C3E-7094(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 254).
도 293은 C3E-7095(1-269)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. VH(2-119), VL(135-243), 및 FLAG-His 태그(244-269)(서열번호 255).
1. 정의
본 발명에 있어서, "유전자"란, 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 또는 그의 상보 쇄를 의미하고, 예를 들면, 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 쇄인 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등은 "유전자"의 의미에 포함된다. 이러한 유전자는 1본쇄, 2본쇄 또는 3본쇄 이상의 뉴클레오티드이고, DNA쇄와 RNA쇄의 회합체, 1본의 뉴클레오티드 쇄 상에 리보뉴클레오티드(RNA)와 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)가 혼재하는 것 및 그와 같은 뉴클레오티드 쇄를 포함하는 2본쇄 또는 3본쇄 이상의 뉴클레오티드도 "유전자"의 의미에 포함된다. 본 발명에 있어서 염기 서열과 뉴클레오티드 서열은 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서, "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 동일한 의미이고, 예를 들면, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 프라이머 등도 "폴리뉴클레오티드"의 의미에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 1본쇄, 2본쇄 또는 3본 이상의 쇄로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이고, DNA쇄와 RNA쇄의 회합체, 1본의 폴리뉴클레오티드 쇄 상에 리뉴클레오티드(RNA)와 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)가 혼재하는 것 및 그와 같은 폴리뉴클레오티드 쇄를 포함하는 2본쇄 또는 3본 이상의 쇄의 회합체도 "폴리뉴클레오티드"의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서, "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서, "항원"을 "면역원"의 의미로 이용하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, "세포"에는, 동물 개체에서 유래하는 각종 세포, 계대 배양 세포, 초대 배양 세포, 세포주, 재조합 세포 및 미생물 등도 포함된다.
본 발명에 있어서, "항체"는 면역글로불린과 동일한 의미이다. 단, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 본 발명의 항-CD3 항체라고 하는 경우의 "항체"는 정상 영역과 가변 영역을 갖는 면역글로불린의 의미로 이용한다. 항체는 천연의 것인지 또는 부분적 혹은 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린인지는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항-GPRC5D 항체 및/또는 항-CD3 항체는 후술하는 "분자"에 부품(parts)으로서 포함된다.
기본적인 4쇄 항체의 구조는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된다. 경쇄는 1개의 공유 다이설파이드 결합에 의해 중쇄에 결합한다. 2개의 중쇄는 중쇄의 아이소타입에 따라 1개 또는 복수의 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합하고 있다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 규칙적인 간격을 가지는 쇄 내 다이설파이드 결합을 가진다. 중쇄와 경쇄에는, 아미노산 서열이 매우 높은 유사성을 나타내는 정상 영역과 아미노산 서열의 유사성이 낮은 가변 영역이 존재한다. 경쇄는 정상 영역(CL)이 계속되는 가변 영역(VL)을 아미노 말단에 갖는다. 중쇄는 3개의 정상 영역(CH1/CH2/CH3)이 계속되는 가변 영역(VH)을 아미노 말단에 갖는다. VL과 VH는 쌍이 되고, CL은 중쇄의 제 1 정상 영역(CH1)과 정렬되어 있다. VL과 VH는 쌍이 되어, 단일의 항원 결합 부위를 형성한다.
Fab는 중쇄의 CH1과 그것에 계속되는 VH, 및 경쇄의 CL과 그것에 계속되는 VL로 이루어진다. VH와 VL은 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
Fc는 중쇄의 정상 영역의 카복실 말단 영역으로서, CH2와 CH3을 포함하고, 이량체이다. 본 발명의 Fc는 천연 서열의 Fc(천연형 Fc라고도 기재한다)여도 되고, 천연 서열에 변이가 가해진 변이형의 Fc(변이형 Fc라고도 기재한다)여도 된다.
변이형 Fc로서는, WO2013/063702에 개시되는, 향상된 안정성을 갖는 헤테로다량체에 포함되는 개변 Fc 영역(헤테로이량체 Fc 영역을 포함한다), WO96/27011에 개시되는 이종다량체에 포함되는, "돌기" 및 "공극"을 갖는 IgG 항체로부터 유도되는 이뮤노글로불린의 CH3 영역을 포함하는 Fc, WO2009/089004에 개시되는, 1 이상의 아미노산 잔기를 하전 아미노산으로 치환함으로써 정전적으로 유리한 헤테로이량체에 포함되는 CH3 도메인을 포함하는 Fc, WO2014/110601에 개시되는, 입체 구조 변이 및/또는 pI(등전점) 변이를 이용한 이종이량체에 포함되는 이종이량체 Fc 영역, WO2010/151792에 개시되는, 프로테인 A로의 결합을 없애거나 또는 감소시키는 개변을 포함하는 CH3 도메인을 포함하는, 헤테로이량체의 Fc 등이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
가변 영역은, 초가변 영역(HVR: hypervariable region)이라고 칭해지는 극도의 가변성을 갖는 영역과, 그 영역에 의해 분리된 프레임워크 영역(FR: Framework region)이라고 불리는 비교적 불변인 영역으로 이루어진다. 천연 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 3개의 초가변 영역에 의해 접속되는 4개의 FR을 포함하고, 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 극히 근방에 보유되어, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여하고 있다.
항체 분자의 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개소의 상보성 결정 영역(CDR: Complementarity determining region)이 있는 것이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은 초가변 영역이라고도 불리고, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에 있으며, 일차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중쇄 및 경쇄의 폴리펩티드 쇄의 일차 구조 상에서 통상 각각 3개소로 분리되고 있다. 본 발명에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대하여, 중쇄의 상보성 결정 영역을 중쇄 아미노산 서열의 아미노 말단 측으로부터 중쇄 CDR1(CDRH1), 중쇄 CDR2(CDRH2), 및 중쇄 CDR3(CDRH3)으로 표기하고, 경쇄의 상보성 결정 영역을 경쇄 아미노산 서열의 아미노 말단 측으로부터 경쇄 CDR1(CDRL1), 경쇄 CDR2(CDRL2), 및 경쇄 CDR3(CDRL3)으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합되는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 발명에 있어서, CDR의 위치와 길이는 IMGT의 정의(Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77)에 의해 결정하였다.
프레임워크 영역(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역이다. 가변 영역은 일반적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 가지며, 중쇄 및 경쇄의 FR을 FRH1, FRH2, FRH3 및 FRH4, 및 FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4로 각각 표기한다.
중쇄 및 경쇄에 포함되는 CDR과 FR은, 아미노 말단으로부터 카복실 말단을 향하여, FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 및 FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4의 순서로 각각 배치된다.
CDR과 FR의 위치는, 당 기술분야에서 주지된 다양한 정의, 예를 들면, IMGT 이외에도, Kabat, Chothia, AbM, contact 등의 정의에 의해 결정할 수도 있다.
본 발명에 있어서, "항체의 항원 결합성 단편"이란, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성되는, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미한다. "항체의 항원 결합성 단편"으로서는, 예를 들면, Fab, F(ab')2, scFv, Fab', Fv, single-domain antibody(sdAb) 등의 항원 결합 단편을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항체의 항원 결합성 단편은, 항체 단백질의 전장 분자를 파파인, 펩신 등의 효소로 처리함으로써 얻어진 것에 더하여, 재조합 유전자를 이용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 재조합 단백질이어도 된다.
본 발명에 있어서, 항체가 결합하는 "부위", 즉 항체가 인식하는 "부위"란, 항체가 결합 또는 인식하는 항원 상의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조를 의미한다.
본 발명에 있어서는, 이러한 부위를 에피토프, 또는 항체의 결합 부위라고도 부른다.
본 발명에 있어서, "항체 변이체"란, 원래의 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 아미노산이 치환, 결실, 및/또는 부가(부가에는 삽입이 포함된다)(이하, "변이"라고 총칭한다)되어 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 또한 항원에 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 변이체에 있어서의 변이 아미노산의 수는 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50개이다. 이러한 항체 변이체도 본 발명의 "항체"에 포함된다.
본 발명에 있어서, "1 내지 수개"에 있어서의 "수개"란, 2 내지 10개를 가리킨다.
본 명세서 중에 있어서, "분자"는 전술한 항체 또는 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자이고, 또한 항체 또는 그들에서 유래하는 복수의 항원 결합성 단편으로 형성된 다중특이적인 분자여도 된다.
본 명세서 중에 있어서, "다중특이적인 분자", "다중특이적 분자" 및 "다중 특이성 분자"는 동일한 의미이고, 1개의 분자 상의 복수의 서로 다른 에피토프, 및/또는 2개 이상의 분자 상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 것이 가능한 분자이면 특별히 한정되지 않는다. 다중특이적인 분자로서는, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체도 포함된다. 이와 같은 다중특이적인 분자에는, 상이한 2종류 이상의 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전장 항체 분자, 즉 IgG형 다중특이성 분자, 및 2종류 이상의 VL 및 VH를 갖는 항원 결합성 단편으로 이루어지는 분자, 즉, Fab, Fab', Fv, scFv, sdAb 등을 조합하여 파생하는 분자, 즉 탠덤 scFv, 다이아보디, 1본쇄 다이아보디, 트리아보디 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 기타 항원 결합성 단편에 면역글로불린 골격을 갖지 않고 항원 결합성을 갖는 단백질을 유전자적 혹은 화학적으로 연결시키는 것에 의해 생기는 분자도 다중특이성 분자로서 포함된다.
본 발명의 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는 본 발명의 다중특이적인 분자가 갖는 활성·성질로서는, 예를 들면, 생물학적 활성, 이화학적 성질 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 각종 생물 활성, 항원이나 에피토프에 대한 결합 활성, 제조나 보존 시에 있어서의 안정성, 열 안정성 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, "스트린전트한 조건하에서 하이브리드화하는"이란, 5×SSC를 포함하는 용액 중에서 65℃에서 하이브리드화를 행하고, 이어서 2×SSC-0.1% SDS를 포함하는 수용액 중에서 65℃에서 20분간, 0.5×SSC-0.1% SDS를 포함하는 수용액 중에서 65℃에서 20분간, 및 0.2×SSC-0.1% SDS를 포함하는 수용액 중에서 65℃에서 20분간 각각 세정하는 조건 또는 그와 동등한 조건에서 하이브리드화하는 것을 의미한다. SSC란 150mM NaCl-15mM 시트르산 나트륨의 수용액이고, n×SSC는 n배 농도의 SSC를 의미한다.
본 발명에 있어서 "세포상해"란, 어떠한 형태로 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 가리키며, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 의미한다.
본 발명에 있어서 "세포상해 활성"이란 상기 세포상해를 야기하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 "항체 의존성 세포상해 활성"이란, "antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC) 활성"을 가리키며, NK 세포가 항체를 통해서 종양 세포 등의 표적 세포를 상해하는 작용 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서 "T 세포 리디렉션에 의한 세포상해 활성"이란 항종양 항원 등의 항-표적 항원 항체와 항-CD3 항체를 포함하는 다중특이적인 분자를 통해서 상기 세포상해를 야기하는 것을 의미한다. 적합하게는, 항종양 항원 항체가 표적 종양 세포와 결합하고 항-CD3 항체가 T 세포에 결합하는 것에 의해 표적 종양 세포와 T 세포의 거리를 가깝게 하여, T 세포 활성화를 통해서 세포상해를 유도하는 것을 의미한다. 해당 분자는 의약 조성물에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 "천연으로 존재하는 아미노산" 및 "천연으로 존재하는 아미노산 잔기"란, Ala(A), Arg(R), Asn(N), Asp(D), Cys(C), Gln(Q), Glu(E), Gly(G), His(H), Ile(I), Leu(L), Lys(K), Met(M), Phe(F), Pro(P), Ser(S), Thr(T), Trp(W), Tyr(Y) 및 Val(V), 및 그들의 잔기를 의미하고, "천연 아미노산" 또는 "천연 아미노산 잔기"라고도 한다.
2. 항원 단백질
2-1. GPRC5D 항원
본 발명에 있어서, "GPRC5D"는 GPRC5D 단백질과 동일한 의미로 이용하고 있다.
GPRC5D는, 대사형 글루탐산 리셉터 유사 패밀리 C(G-protein coupled receptor family C)의 제 5 군으로 분류되는 일련의 인간 GPCR의 아미노산 서열을 이용한 EST 데이터베이스의 호몰로지 검색에 의해 새롭게 발견된, 인간 GPCR 단백질의 하나이다(비특허문헌 1). 이것은 GenBank에 수탁 번호: AF209923, NM_018654, 및 NP_0611124로서 등록되어 있다. 그러나, GPRC5D의 생리 기능이나 생리적 리간드, 공역되는 G 단백질(α 서브유닛)의 서브타입 등에 대해서는 밝혀져 있지 않다.
2-2. CD3 항원
본 발명에 있어서, "CD3"은 CD3 단백질과 동일한 의미로 이용하고 있다.
CD3은 다분자 T 세포 리셉터 복합체의 일부분으로서 T 세포 상에 발현되고, γ쇄, δ쇄, ε쇄, ζ쇄, 및 η쇄의 5종류의 폴리펩티드(분자량은 순서대로 25000 내지 28000, 21000, 20000, 16000, 및 22000)의 복합체이다.
CD3 복합체로서는, γ, δ, ε, ζ, 및 η쇄를 들 수 있다. 이들은 서브유닛이라고도 칭해진다. 항-CD3 항체가 T 세포에 결합하는 것에 의해, T 세포 활성화를 통해서 세포상해를 유도한다. 많은 항-CD3 항체는 CD3ε에 결합한다.
인간 CD3ε을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 액세션 번호: NM_000733.3으로 등록되어 있다. 사이노몰거스 원숭이 CD3을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 액세션 번호: NM_001283615.1로 등록되어 있다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 189에 기재되어 있다.
2-3. 항원 단백질의 조제
본 발명에서 이용하는 전술한 항원 단백질 GPRC5D 또는 CD3(이하, GPRC5D 및 CD3을 통틀어 해당 항원 단백질이라고도 기재한다)은 동물 조직(체액을 포함한다), 동물 조직 유래의 세포 또는 그 세포 배양물로부터의 정제 및 단리, 유전자 재조합, 인비트로 번역, 화학 합성 등에 의해 조제할 수 있다.
해당 항원 단백질의 cDNA는, 예를 들면, 해당 항원 단백질의 mRNA를 발현하고 있는 장기의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 해당 항원 단백질의 cDNA를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응(이하 "PCR"이라고 한다)(Saiki, R. K., et al., Science (1988) 239, 487-49)을 행하는, 이른바 PCR법에 의해 취득할 수 있다.
인간 또는 래트에 발현되고 있는 해당 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린전트한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 해당 항원 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 해당 항원 단백질의 cDNA에 포함된다.
또한, 인간 또는 래트에 발현되고 있는 해당 항원 단백질 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 변이체, 또는 이것에 스트린전트한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 해당 항원 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 해당 항원 단백질의 cDNA에 포함된다.
인간 또는 래트의 해당 항원 단백질의 아미노산 서열, 또는 이들 서열로부터 시그널 서열이 제외된 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 해당 항원 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열도, 해당 항원 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열에 포함된다.
인간 또는 래트의 해당 항원 단백질의 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 변이체로 코딩되는 아미노산 서열 또는 해당 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 해당 항원 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 해당 항원 단백질에 포함된다.
2-4. 항원 단백질에 대한 결합 특이성
본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 등은 인간 GPRC5D를 인식한다. 즉, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 등은 GPRC5D 항원에 결합하고, 적합하게는 인간 GPRC5D 및 원숭이 GPRC5D에 결합하며, 보다 적합하게는 인간 GPRC5D 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합한다. 후술하는 본 발명의 인간화 항-GPRC5D 항체인 h2B1 항체 및 인간 항체인 C3048은 인간 GPRC5D에 더하여 추가로 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에도 결합한다.
본 발명의 다중특이적 분자에 포함되는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 등은 CD3 항원을 인식한다. 즉, 그것에 결합한다. 본 발명의 다중특이적 분자에 포함되는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 등은 적합하게는 인간 CD3, 원숭이 CD3 등에 결합하고, 보다 적합하게는 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합한다.
인간 및 사이노몰거스 원숭이의 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은, 의약품의 비임상 개발(전임상 개발)에 유용한 영장류, 특히 사이노몰거스 원숭이를 이용한 유효성이나 안전성에 관한 각종 시험에 제공할 수 있어 바람직하다.
한편, 본 발명의 항-GPRC5D 항체는, 적합하게는 마우스 및/또는 래트의 GPRC5D에는 결합하지 않으므로, 인간 GPRC5D 유전자가 도입된 마우스의 세포, 조직, 또는 개체(트랜스제닉 동물, 녹아웃 동물, 및 녹인 동물을 포함한다) 및 해당 항체 또는 본 발명의 다중특이적 분자 등을 이용한 각종 어세이, 면역조직화학적 테스트 등을, 숙주인 마우스 및/또는 래트의 GPRC5D에 의한 영향 없이 실시할 수 있어, 해당 항체 또는 본 발명의 다중특이적 분자 등을 포함하는 의약, 동물약 또는 진단약 등의 마우스를 이용한 연구 및 비임상 개발상 바람직하다.
마찬가지로, 본 발명의 다중특이적 분자에 포함되는 항-CD3 항체는, 적합하게는 마우스 및/또는 래트의 CD3에는 결합하지 않으므로, 인간 CD3 유전자가 도입된 마우스의 세포, 조직, 또는 개체(트랜스제닉 동물, 녹아웃 동물, 및 녹인 동물을 포함한다) 및 해당 항체 또는 본 발명의 다중특이적 분자 등을 이용한 각종 어세이, 면역조직화학적 테스트 등을, 숙주인 마우스 및/또는 래트의 CD3에 의한 영향 없이 실시할 수 있어, 해당 항체 또는 본 발명의 다중특이적 분자 등을 포함하는 의약, 동물약 또는 진단약 등의 마우스를 이용한 연구 및 비임상 개발상 바람직하다.
본 발명에 있어서 "인식", 즉 "결합"이란, 비특이적인 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 인식하고 있는지 여부, 즉 결합하고 있는지 여부의 판정 기준으로서는, 예를 들면, 해리 상수(Dissociation Constant: 이하, "KD라고 한다")를 들 수 있다. 본 발명의 적합한 항체 등의 CD3에 대한 KD 값은 1×10-5M 이하, 5×10-6M 이하, 2×10-6M 이하 또는 1×10-6M 이하이다.
본 발명에 있어서의 항원과 항체의 결합은 SPR법, BLI법 등의 생체 분자간 상호작용 해석 시스템, 혹은 ELISA법, RIA법 등에 의해 측정 또는 판정할 수 있다. 세포 표면 상의 발현하고 있는 항원과 항체의 결합은 플로 사이토메트리법 등에 의해 측정할 수 있다.
SPR법(Surface Plasmon Resonance 해석법)은 반응속도론적(카이네틱스) 해석에 의해 결합 속도 상수(Ka 값)와 해리 속도 상수(Kd 값)를 계측하는 것에 의해 어피니티의 지표가 되는 해리 상수(KD 값) 등을 구하는 분석 수법으로서 이용되고 있다. SPR 해석에 이용하는 기기로서는, Biacore(상표)(GE 헬스케어사제), ProteOn(상표)(BioRad사제), SPR-Navi(상표)(BioNavis사제), Spreeta(상표)(Texas Instruments사제), SPRi-PlexII(상표)(호리바사제), Autolab SPR(상표)(Metrohm사제) 등을 예시할 수 있다.
BLI법(BioLayer Interferometry)은 바이오레이어 간섭을 이용한 생체 분자간 상호작용을 계측하는 방법이다. BLI법을 이용한 상호작용 해석에 이용하는 기기로서는, Octet 시스템(Pall ForteBio사제) 등을 예시할 수 있다.
ELISA법은 시료 용액 중에 포함되는 목적의 항원 혹은 항체를, 특이 항체 혹은 항원으로 포착함과 함께, 효소 반응을 이용하여 검출·정량하는 방법이다. 효소 표지한 항원 혹은 항체를 반응계에 혼입하고, 효소 활성을 검출한다. 효소 활성의 검출에는, 반응에 의해 흡광 스펙트럼이 변화하는 기질이 이용되고, 흡광도 측정으로 수치화한다.
Cell-ELISA는 세포 표면에 있는 측정 대상을 세포마다 포착함과 함께, 효소 반응을 이용하여 검출·정량하는 방법이다.
RIA법(Radio Immunoassay법)은 방사성 물질을 사용하여 항체를 표지하고, 항체로부터의 방사능을 측정함으로써 항체의 정량을 할 수 있다.
플로 사이토메트리는 세포를 유체 중에 분산시키고, 그 유체를 가늘게 흘려, 개개의 세포를 광학적으로 분석하는 수법이다. 형광 색소로 표지된 항체가 항원 항체 반응에 의해 세포 표면 항원에 결합하고, 세포에 결합한 표지된 항체에 의한 형광 강도를 측정하는 것에 의해 항체의 항원 결합성을 정량한다.
3. 항-GPRC5D 항체
3-1. 항-GPRC5D 항체의 종류
본 발명의 항-GPRC5D 항체는 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체 중 어느 것이어도 된다. 폴리클로널 항체로서는, CDR 세트의 일부 또는 전부가 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 모노클로널 항체로서는, 비인간 동물 유래의 항체(비인간 동물 항체), 인간 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체 등을 들 수 있다.
비인간 동물 항체로서는, 포유류, 조류 등의 척추동물에서 유래하는 항체 등을 들 수 있다. 포유류 유래의 항체로서는, 마우스 항체, 래트 항체 등의 설치류 유래의 항체 등을 들 수 있다. 조류 유래의 항체로서는, 닭 항체 등을 들 수 있다. 항-인간 GPRC5D 래트 모노클로널 항체로서는, 본 발명의 2A4, 2B1, 7B4(실시예 1) 등을 들 수 있다.
2A4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 5에, 2B1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 7에, 7B4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 9에 각각 나타나 있다.
2A4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 12에, 2B1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 14에, 7B4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 16에 각각 나타나 있다.
2A4, 2B1, 및 7B4는 ADCC 활성을 갖고 있다(실시예 2).
키메라화 항체로서는, 비인간 동물 항체 유래의 가변 영역과 인간 항체(인간 면역글로불린) 정상 영역을 결합하여 이루어지는 항체 등을 들 수 있다.
래트 항-인간 GPRC5D 항체 2A4 유래의 키메라화 항체는, 서열번호 22의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄와, 서열번호 26의 20 내지 141번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 2A4 유래의 키메라화 항체의 일례로서, 서열번호 22의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄와, 서열번호 26의 20 내지 471번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 해당 항체를 c2A4라고 부른다.
래트 항-인간 GPRC5D 항체 2B1 유래의 키메라화 항체는, 서열번호 30의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄와, 서열번호 34의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 2B1 유래의 키메라화 항체의 일례로서, 서열번호 30의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄와, 서열번호 34의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 해당 항체를 c2B1이라고 부른다.
래트 항-인간 GPRC5D 항체 7B4 유래의 키메라화 항체는, 서열번호 38의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄와, 서열번호 42의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 7B4 유래의 키메라화 항체의 일례로서, 서열번호 38의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄와, 서열번호 42의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 해당 항체를 c7B4라고 부른다.
인간화 항체로서는, 상보성 결정 영역(CDR)만을 인간 유래의 항체에 편입한 항체(Nature (1986) 321, 522-525), CDR 이식법에 의해, CDR의 서열에 더하여 일부의 프레임워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체(국제 특허공개 WO1990/007861호)), 그들 중 몇 개의 비인간 동물 항체 유래의 1개 또는 2개 이상의 아미노산을 인간형의 아미노산으로 치환한 것 등을 들 수 있다.
전술한 키메라화 항체 유래의 인간화 항체는, 전술한 키메라화 항체, 나아가서는 래트 항체에서 유래하는 6종 모두의 CDR 서열을 보유하고, ADCC 활성을 갖고 있다. 따라서, 이하에 나타내는 6종 모두의 CDR 서열을 보유하는 항체로서는, 래트 항체, 키메라화 항체, 또는 인간화 항체가 예시된다.
전술한 2A4 유래의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역은,
서열번호 45로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(GYTFTSYY)
서열번호 46으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(VYPGYGGT)
서열번호 47로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(ARRKGIIRGPGYFDY)
을 보유하고 있고, 경쇄 가변 영역은,
서열번호 54로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(EGISNS)
서열번호 55로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(GAS)
서열번호 56으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(QQGYKYPPT)
을 보유하고 있다.
전술한 2B1 유래의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역은,
서열번호 48로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(GFSLNTYDMG)
서열번호 49로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(IWWDDDK)
서열번호 50으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(ARIETVRVSRKGFAH)
을 보유하고 있고, 경쇄 가변 영역은,
서열번호 57로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(QSVGIN)
서열번호 58로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(GAS)
서열번호 59로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(LQHGSIPPT)
을 보유하고 있다.
전술한 7B4 유래의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역은,
서열번호 51로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1(GYTITSGYD)
서열번호 52로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2(MSYRGST)
서열번호 53으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(ALTRTYWYNYYYVLDA)
을 보유하고 있고, 경쇄 가변 영역은,
서열번호 60으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1(QNINKY)
서열번호 61로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2(NTN)
서열번호 62로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3(LQRNSWYT)
을 보유하고 있다.
전술한 CDR의 아미노산 서열은 도 54 내지 71에도 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, CDR의 위치와 길이는 IMGT의 정의(Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77)에 의해 결정하였다.
인간화 항체의 적합예로서는,
서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 다른 인간화 항체의 적합예로서는,
서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기, 또는
서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 들 수 있다.
인간화 항체의 구체적인 적합예로서는,
·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 다른 인간화 항체의 구체적인 적합한 예로서는,
·서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다.
인간화 항체의 더 적합한 구체예로서는,
·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 또는 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄, 및
·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 234번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄
중 어느 하나의, 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 다른 인간화 항체의 더 적합한 구체예로서는,
·서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄,
·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄, 또는
·서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 472번째의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 233번째의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄
의 어느 하나의, 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다.
전술한 래트 항체, 키메라화 항체, 및 인간화 항체는 각각 Fc를 포함하고 있어도 된다.
또한, 전술한 래트 항체, 키메라화 항체, 및 인간화 항체는 각각 인간 면역글로불린 중쇄 정상 영역을 포함하고 있어도 된다.
인간화 항체의 보다 더 적합한 예로서는, 전술한 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역, 바람직하게는, 2B1 유래의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
을 포함하는 항체를 들 수 있다.
인간화 항체의 특히 적합한 예로서는, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
을 포함하는 항체를 들 수 있다.
이들 중에서도, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
을 포함하는 항체가 보다 바람직하다.
이와 같은 항체의 구체적인 예로서는,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체를 들 수 있다.
인간화 항체의 다른 보다 더 적합한 예로서는, 전술한 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역, 바람직하게는, 2B1 유래의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 천연형 또는 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체를 들 수 있다.
이와 같은 항체의 특히 적합한 예로서는, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 천연형 또는 변이형 Fc를 포함하는 항체를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 천연형 또는 변이형 Fc를 포함하는 항체를 들 수 있다.
인간 항체로서는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 인간화 항체와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체 등도 예시할 수 있다. 예를 들어, h2B1H2L5와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체가 예시된다.
본 발명의 인간 항체로서는, 하기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 예시된다:
(1)
서열번호 111로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 112로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 113으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 114로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 115로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 116으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(2) 서열번호 117로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 118로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 119로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 120으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 121로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 122로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
(3)
서열번호 123으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 124로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 125로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 126으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 127로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 128로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
(4)
서열번호 129로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
서열번호 130으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 131로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 132로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
서열번호 133으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
서열번호 134로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
한편, 전술한 CDR의 아미노산 서열은 도 124 내지 147에도 기재되어 있다.
인간 항체의 적합예로서는,
서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열, 및
서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역,
및
서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열,
서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열, 및
서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다.
인간 항체의 구체적인 적합한 예로서는,
·서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
·서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다. 이와 같은 항체로서는, 1본쇄 항체(scFv라고도 기재한다)가 포함된다(실시예 10)-4).
또한, 인간 항체로서는, 전술한 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역에, 인간 면역글로불린 중쇄 정상 영역(CH1과 Fc 영역) 또는 인간 면역글로불린 경쇄 정상 영역(CL)이 연결된 IgG형의 항체를 들 수 있다. 이와 같은 IgG형의 인간 항체로서는,
·서열번호 144로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
·서열번호 146으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 147로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
·서열번호 148로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 149로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
·서열번호 150으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 151로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
의 어느 하나의 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항-GPRC5D 항체는, 인간 GPRC5D에 결합한다면, 복수의 상이한 항체에서 유래하는 부분으로 구성되는 항체여도 되고, 예를 들면, 복수의 상이한 항체 간에서 중쇄 및/또는 경쇄를 교환한 것, 중쇄 및/또는 경쇄의 전장을 교환한 것, 가변 영역만 또는 정상 영역만을 교환한 것, CDR의 전부 또는 일부만을 교환한 것 등을 들 수 있다. 키메라화 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 상이한 본 발명의 항-GPRC5D 항체에서 유래해도 된다. 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 중의 중쇄 CDR1 내지 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 경쇄 CDR3은 2종 또는 그 이상의 본 발명의 항-GPRC5D 항체에서 유래해도 된다. 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 중의 중쇄 CDR1 내지 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 경쇄 CDR3은 2종 또는 그 이상의 본 발명의 항-GPRC5D 항체가 갖는 CDR의 조합이어도 된다.
본 발명의 항-GPRC5D 항체에는, 항체의 중쇄 및 경쇄의 전장 서열을 적절한 링커를 이용하여 연결한 1본쇄 이뮤노글로불린(single chain immunoglobulin)이 포함된다(Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, 61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2 (1), 1-4). 이와 같은 1본쇄 이뮤노글로불린은 이량체화함으로써, 본래는 사량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 보유하는 것이 가능하다.
본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에는, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편도 포함된다.
본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편으로서는, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이, 상기 (8) 내지 (12) 및 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이어도 된다.
경쇄 가변 영역의 위치와 길이는, IMGT의 정의에 의해 결정하는 경우와 비교하여, IMGT와는 상이한 정의를 이용하여 결정한 경우, IMGT의 정의에 의해 결정한 해당 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 카복실 말단에, 추가로 1개 또는 2개 이상의 아미노산, 예를 들면, 아르기닌(R) 및/또는 글라이신(G)이 포함되는 경우가 있다. 이와 같은 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편에 포함된다.
본 발명의 항체 등으로서는, 본 발명의 항-GPRC5D 항체의 항원 결합성 단편에 변이를 도입하여, GPRC5D, 특히 인간 및/또는 사이노몰거스 원숭이의 GPRC5D에 대한 결합능을 최적화시킨 것이어도 된다. 변이를 도입하는 구체적인 방법으로서, 에러-프론 PCR법을 이용한 랜덤 돌연변이 유발법, NNK 라이브러리를 이용한 부위 특이적 아미노산 변이 도입, 구조 정보를 이용한 부위 특이적 변이 도입, 및 그들의 조합을 들 수 있다.
3-2. 항-GPRC5D 항체의 항체 변이체
본 발명의 항-GPRC5D 항체의 항체 변이체에는, 적합하게는, 단백질의 분해 혹은 산화에 대한 감수성의 저하, 생물 활성이나 기능의 유지, 개선 혹은 저하나 변화의 억제, 항원 결합능의 개선 혹은 조절, 또는 이화학적 성질 혹은 기능적 성질의 부여 등이 이루어질 수 있다. 단백질은 그의 표면에 있는 특정한 아미노산 측쇄가 변화하여 당해 단백질의 기능이나 활성이 변화하는 것이 알려져 있고, 그와 같은 예에는, 아스파라긴 측쇄의 탈아마이드화, 아스파르트산 측쇄의 이성화 등이 포함된다. 그와 같은 아미노산 측쇄의 변화를 막기 위해서 다른 아미노산으로 치환한 것도, 본 발명의 항체 변이체의 범위에 포함된다.
본 발명의 항체 변이체의 예로서, 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 보존적 아미노산 치환되어 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 항체를 들 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측쇄에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 생기는 치환이다.
적합한 아미노산 그룹은 이하와 같다: 산성 그룹 = 아스파르트산 및 글루탐산; 염기성 그룹 = 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 비극성 그룹 = 알라닌, 바린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판; 및 비대전 극성 패밀리 = 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신. 다른 적합한 아미노산 그룹은 다음과 같다: 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌; 아마이드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민; 지방족 그룹 = 알라닌, 바린, 류신 및 아이소류신; 및 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 항체 변이체에 있어서의 아미노산 치환은 원래의 항체가 갖는 항원 결합 활성을 저하시키지 않는 범위에서 행하는 것이 바람직하다.
2A4, 2B1 또는 7B4 등의 본 발명의 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 보존적 아미노산 치환 및/또는 기타의 변이가 이루어진 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 변이체, 그들의 항원 결합 단편, 그들을 포함하는 분자 등; 2A4, 2B1 또는 7B4 등을 포함하는 본 발명의 항체 유래의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 보존적 아미노산 치환 및/또는 기타의 변이가 이루어진 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 해당 CDR을 포함하는 마우스 항체, 래트 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 항원 결합 단편, 그들을 포함하는 분자 등; 및 C2037, C3048, C3015 또는 C3022 등의 본 발명의 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 보존적 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 변이체, 그들의 결합 단편, 그들을 포함하는 분자 등; C2037, C3048, C3015 또는 3022 등의 본 발명의 항체 유래의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 보존적 아미노산 변이가 이루어진 아미노산 서열을 갖고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 해당 CDR을 포함하는 키메라 항체, 인간 항체, 그들의 항원 결합 단편, 그들을 포함하는 분자 등도 본 발명의 항-GPRC5D 항체, 그의 항원 결합 단편, 그의 변이체, 또는 본 발명의 분자에 포함된다.
3-3. 항-GPRC5D 항체의 항원 결합성 단편
본 발명의 하나의 태양으로서, 본 발명의 항-GPRC5D 항체의 항원 결합성 단편을 제공한다. 본 발명의 항-GPRC5D 항체의 항원 결합성 단편에는, 키메라화 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체의 항원 결합성 단편이 포함된다. 항체의 항원 결합성 단편이란, 해당 항체가 갖는 기능 중 적어도 항원 결합성을 보유하는 단편 또는 그의 수식물을 의미한다. 이러한 항체의 기능으로서는, 일반적으로는, 항원 결합 활성, 항원의 활성을 조절하는 활성(예를 들면 아고니스트 활성), 항원을 세포 내에 내재화시키는 활성, 항원과 상호작용하는 물질과의 상호작용을 저해 혹은 촉진하는 활성 등을 들 수 있다.
항체의 항원 결합성 단편으로서는, 해당 항체가 갖는 활성 중 적어도 항원 결합성을 보유하고 있는 해당 항체의 단편이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 항체의 항원 결합성 단편으로서, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fab 경쇄의 카복실 말단과 Fab 중쇄의 아미노 말단이 적당한 링커로 연결된 1본쇄 Fab(scFab), Fv, 중쇄 및 경쇄의 Fv가 적당한 링커로 연결된 1본쇄 Fv(scFv), 단일의 중쇄 가변 영역을 갖고 경쇄 서열을 갖지 않는 단일 도메인 항체(sdAb; 나노보디(nanobody)라고도 불린다)(Muyldemans S. et. al., Protein Eng., (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428), 446-448) 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다. 링커 부분을 보유하는 scFab 및 scFv와 같이, 본 발명의 항체의 항원 결합성 단편 이외의 부분을 포함하는 분자도, 본 발명의 항체의 항원 결합성 단편의 의미에 포함된다.
3-4. 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 수식체 및 복합체
본 발명은 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 수식체를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 수식체란, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격으로의 화학 부분의 결합, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식(예를 들면, N-결합 또는 O-결합으로의 당쇄 부가, 아미노 말단 영역 또는 카복실 말단 영역의 프로세싱, 탈아마이드화, 아스파르트산의 이성화, 또는 메티오닌의 산화)된 것, 원핵생물 숙주 세포를 이용하여 발현시키는 것에 의해 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들면, 효소 표지체, 형광 표지체, 또는 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 수식물은 원래의 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 이러한 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
화학적 수식체에 포함되는 화학 부분으로서는, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜 코폴리머, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐 알코올 등의 수용성 폴리머를 예시할 수 있다.
생물학적인 수식물로서는, 효소 처리나 세포 처리 등에 의해 수식이 실시된 것, 유전자 재조합에 의해 태그 등 다른 펩티드가 부가된 융합체, 및 내인성 또는 외래성의 당쇄 수식 효소를 발현하는 세포를 숙주로 하여 조제된 것 등을 들 수 있다.
이러한 수식은, 항체 또는 그의 항원 결합성 단편에 있어서의 임의의 위치에, 또는 원하는 위치에 있어서 실시되어도 되고, 1개 또는 2개 이상의 위치에 동일 또는 2종 이상의 상이한 수식이 이루어져도 된다.
그러나, 이들 중쇄 서열의 결실, 또는 중쇄 또는 경쇄 서열의 수식은 항체의 항원 결합능 및 이펙터(effector) 기능(보체의 활성화나 항체 의존성 세포상해 작용 등)에는 그다지 영향을 미치지 않는다.
따라서, 본 발명에는 당해 결실 또는 수식을 받은 항체도 포함된다. 예를 들면, 중쇄 카복실 말단에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실된 결실체(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), 중쇄 카복실 말단의 글라이신 및 라이신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아마이드화된 당해 결실체(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)), 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단의 글루타민 또는 글루탐산 잔기가 파이로글루타밀화 수식된 항체(국제 특허공개 WO2013/147153호) 등을 들 수 있다(그들을 통틀어 "결실체"라고 부른다). 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 카복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체가 2본 이상의 쇄(예를 들면 중쇄)를 포함하는 경우, 당해 2본 이상의 쇄(예를 들면 중쇄)는, 완전장 및 상기의 결실체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄의 어느 1종이어도 되고, 어느 2종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양 비 또는 분자수 비는 본 발명에 따른 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 따른 항체의 주성분으로서는 2본의 중쇄의 쌍방에서 카복실 말단의 1개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
또, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편(본 발명의 분자, 다중특이적 분자, 이중특이적 분자 등에 포함되는 것 등)에, 발현 벡터 및/또는 시그널 서열 등에서 유래하는 1 내지 수개의 아미노산이 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에 부가되어(또한 그의 일부 또는 전부가 상기와 같이 수식되어) 있어도, 원하는 항원 결합 활성이 유지되어 있으면, 본 발명의 항체의 수식체 또는 그의 항원 결합 단편의 수식체의 범위에 포함되고, 그와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 수식체를 포함하는 분자도 본 발명의 분자의 범위에 포함된다.
본 발명에 있어서 "항체 또는 그의 항원 결합성 단편"은 "항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수식체"도 그 의미에 포함하는 것이다. 또한, 본 발명의 분자, 다중특이적인 분자, 이중특이적인 분자 등에 포함되는 "항체 또는 그의 항원 결합 단편"은 이러한 "항체 또는 그의 항원 결합 단편의 수식체"도 그 의미에 포함하는 것이다.
또한, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당쇄 수식을 조절하는 것(글리코실화, 탈푸코스화 등)에 의해, 항체 의존성 세포상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당쇄 수식의 조절 기술로서는, 국제 특허공개 WO99/54342호, WO00/61739호, WO02/31140호 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에는, 전술한 항체와 다른 분자가 링커로 연결된 복합체(Immunoconjugate)도 포함된다. 해당 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물(약물)과 결합하고 있는 항체-약물 복합체의 예로서는, ADC(Antibody-Drug Conjugate)를 들 수 있다(Methods Mol Biol. (2013) 1045: 1-27; Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
또 본 발명에는, 이들 항체와 다른 기능성 폴리펩티드를 연결한 복합체도 포함된다. 이와 같은 항체-펩티드 복합체의 예로서는, 해당 항체와 알부민 결합 폴리펩티드의 복합체를 들 수 있다(Protein Eng Des Sel. (2012) (2): 81-8).
전술한 항체의 수식체, 당쇄 수식이 조절된 항체, 및 복합체는 본 발명의 항체에 포함되고, 전술한 항체의 수식체, 당쇄 수식이 조절된 항체, 및 복합체의 항원 결합성 단편은 본 발명의 항체의 항원 결합성 단편에 포함된다.
3-5. 동일한 부위에 결합하는 항체
본 발명이 제공하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 결합하는 인간 GPRC5D 상의 부위에 결합하는 항체도 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함된다. 어떤 항체와, 동일한 인간 GPRC5D 항원의 부위에 결합하는 항체란, 해당 항체가 인식하는 항원 분자 상의 동일한 부위에 결합하는 다른 항체를 의미한다. 제 1 항체가 결합하는 항원 분자 상의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체는 동일한 부위에 결합한다고 판정할 수 있다.
또한, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 대해서 제 2 항체가 경합하는 것, 즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해하는 것을 확인함으로써, 구체적인 결합 부위의 펩티드 서열 또는 입체 구조가 결정되어 있지 않더라도, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 부위에 결합한다고 판정할 수 있다.
제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 부위에 결합하는 경우, 제 2 항체는 제 1 항체와 마찬가지의 활성을 가질 개연성은 극히 높다.
항체의 결합 부위는 면역 어세이법 등 당업자에게 주지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 항원의 아미노산 서열을 카복실 말단 또는 아미노 말단으로부터 적절히 잘라서 이루어지는 일련의 펩티드를 제작하고, 그들에 대한 항체의 반응성을 검토하여, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 더 짧은 펩티드를 합성하여 그들의 펩티드에 대한 항체의 반응성을 검토하는 것에 의해, 결합 부위를 결정할 수 있다. 항원 단편 펩티드는 유전자 재조합, 펩티드 합성 등의 기술을 이용하여 조제할 수 있다.
3-6. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 세포
본 발명은, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 등)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 그 폴리뉴클레오티드 또는 그 벡터를 포함하는 세포, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 산생하는 세포 등도 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드, 벡터(플라스미드 등의 환상의 형태, 및 염색체에 일체화된 경우를 포함한 비환상의 형태), 및 세포는 후술하는 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 제조에 유용하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 이외에, 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열목록의 서열번호 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 등)에 더하여, 활성 시그널 전달 분자인 펩티드가 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 보조 자극 분자가 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 태양의 일부이다. 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 면역 세포(예를 들면, T 세포, NK 세포, 모노사이트 등)에 도입하여 발현한 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 종양 세포에 대한 결합 활성을 갖는 인공 면역 세포(이하, 본 발명의 인공 면역 세포라고도 기재한다)도 제공한다.
CAR이란, 종양 세포의 표면 항원을 인식하는 모노클로널 항체 유래의 경쇄와 중쇄를 직렬로 결합시킨 scFv와, T 세포 수용체의 CD3ζ나 면역글로불린 분자에 대한 수용체의 FcRγ 등 활성 시그널 전달 분자를, 각각 아미노 말단과 카복실 말단에 가지는 키메라 단백질로, 그 사이에 세포외 힌지 도메인, 막 관통 도메인, 면역 세포를 활성화시키는 보조 자극 분자 등이 연결되어 있다. 본 발명의 세포에서는, 종양 세포의 표면 항원을 인식하는 모노클로널 항체는 본 발명의 항-GPRC5D 항체이다. CAR을 발현한 본 발명의 면역 세포는, scFv의 형상을 취하는 본 발명의 항-GPRC5D 항체를 통해서 종양의 표면의 GPRC5D 단백질을 인식함과 함께, 세포 내의 활성 시그널 전달 분자에 의해 면역 세포 자체의 활성화를 유도하여, 종양 세포를 공격한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 면역 세포로서 T 세포를 이용한 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드를 T 세포에 도입하여 세포 표면에 발현시킨 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해, GPRC5D를 발현하는 세포와 T 세포의 거리를 가깝게 하여, GPRC5D를 발현하는 세포에 대해, T 세포 활성화를 통해서 세포상해를 유도하는 것, 즉 T 세포 리디렉션에 의해 세포상해를 유도하는 것이 가능하다. 본 발명은 그와 같은 CAR을 발현하는 T 세포(이하, 본 발명의 T 세포라고도 기재한다)도 제공한다.
바꾸어 말하면, 본 발명의 T 세포를, GPRC5D를 발현하고 있는 종양 세포로 리디렉션하는 것에 의해, 해당 종양 세포에 대한 세포상해를 유도할 수 있다.
활성 시그널 전달 분자는 면역 세포 리셉터로부터의 시그널을 세포 내에 전달하기 위해서 면역 세포 내에 도입된다. 면역 세포로서, 예를 들면, T 세포를 이용하는 경우, 활성 시그널 전달 분자로서는, CD3ζ, DAP12, FcRγ 등을 들 수 있다.
보조 자극 분자는 면역 세포를 보다 강하게 활성화시키기 위해서 면역 세포 내에 도입된다. 면역 세포로서, 예를 들면, T 세포를 이용하는 경우, 보조 자극 분자로서는, CD2, CD27, CD28, CD49d, CD134, CD152, CD154, ICOS, 4-1BB, RANKL 등을 들 수 있다.
4. 항원 결합성을 갖는 분자
본 발명의 분자는 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함한다.
또한, 본 발명의 분자는 후술하는 시그널 서열, 정제 등을 위한 태그, 아미노 말단의 Gly, ADC의 드러그 링커 부분, 알부민 결합 폴리펩티드, PEG 등의 폴리머, 항-GPRC5D 항체 이외의 항체, 그의 항원 결합성 단편, 면역글로불린 골격을 갖지 않고 항원 결합성을 갖는 단백질 등을 범위로서 포함할 수 있다. 항-GPRC5D 항체 이외의 항체로서 항-CD3 항체를 들 수 있다. 본 발명의 분자의 범위에는, 후술하는 다중특이적인 분자가 포함된다.
4-1. 다중특이적인 분자
본 발명의 다중특이적인 분자는 2개 이상의 항원 결합 부위를 가지는 분자이다. 즉, 본 발명의 다중특이적인 분자는 1개의 분자 상의 2개 이상의 서로 다른 에피토프 또는 2개 이상의 분자 상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 것이 가능한 분자이고, 복수의 서로 다른 항원 결합성 단편을 포함한다. 이와 같은 다중특이적인 분자에는, IgG형 다중 특이성 분자, 2종류 이상의 가변 영역을 갖는 다중 특이성 분자, 예를 들면 탠덤 scFv, 1본쇄 다이아보디, 다이아보디 및 트리아보디와 같은 항체 단편, 및 공유결합 또는 비공유결합하여 연결되어 있는 항체 단편을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적인 분자는 Fc를 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 다중특이적인 분자는 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함한다. 본 발명의 다중특이적인 분자는 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편, 및 1개 또는 2개 이상의, GPRC5D는 갖지 않고 다른 항원에 있는 에피토프에 결합하는, 항-GPRC5D 항체와는 상이한 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함한다.
항-GPRC5D 항체의 항원 결합성 단편으로서는, 예를 들면, Fab, F(ab)', Fv, scFv, 및 sdAb를 들 수 있다.
본 발명의 다중특이적인 분자는 GPRC5D에 특이적으로 결합하거나, 또는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 표적에 추가로 결합해도 된다.
본 발명의 다중특이적인 분자에 포함할 수 있는, 항-GPRC5D 항체와는 상이한 항체로서는, 예를 들면 항-CD3 항체를 들 수 있다.
본 발명의 다중특이적인 분자에 포함할 수 있는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 바람직한 예로서는,
서열번호 183(도 206)으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(GVTFNYYG),
서열번호 238(도 276)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(ITXaaXaaGGRI)(여기에서, 1번째의 Xaa와 2번째의 Xaa는 각각 임의의 천연 아미노산 잔기이다. 이하, 중쇄 CDR2의 1번째의 Xaa 및 2번째의 Xaa를 각각 X1 및 X2라고도 기재한다.),
및
서열번호 185(도 208)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3(TLDGRDGWVAY)을 보유하고 있다.
또한, 본 발명의 적합한 인간화 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 경쇄 가변 영역은,
서열번호 186(도 209)으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(TGNIGSNY),
서열번호 239(도 277)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(RXaaD)(여기에서, Xaa는 임의의 천연 아미노산 잔기이다. 이하, 경쇄 CDR2의 Xaa를 X3이라고도 기재한다.),
및
서열번호 188(도 211)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(QSYSSGFI)을 보유하고 있다.
전술한 중쇄 CDR2(ITX1X2GGRI)에 있어서, 바람직하게는, X1은 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 또한 X2는 S이거나, 또는 X1은 N이고, 또한 X2는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
전술한 경쇄 CDR2(RX3D)에 있어서, 바람직하게는, X3은 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
전술한 중쇄 CDR2(ITX1X2GGRI)에 있어서, 더 바람직하게는, X1은 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 또한 X2는 S이며,
전술한 경쇄 CDR2(RX3D)에 있어서, 더 바람직하게는, X3은 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다중특이적인 분자의 바람직한 예로서는, 서열번호 240(도 278)으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 241(도 279), 242(도 280), 및 243(도 281) 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
서열번호 240으로 나타나는 아미노산 서열의 1번째의 Xaa는 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 또한 2번째의 Xaa는 S이거나, 또는
1번째의 Xaa는 N이고, 또한 2번째의 Xaa는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의 Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분자를 들 수 있다.
본 발명의 다중특이적인 분자에 포함할 수 있는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 보다 바람직한 예로서는, 서열번호 240의 1번째의 Xaa는 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
2번째의 Xaa는 S이며, 또한 서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의 Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는
분자를 들 수 있다.
본 발명의 적합한 인간화 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 구체예로서,
서열번호 183으로 나타나는 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(GVTFNYYG),
서열번호 184로 나타나는 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(ITNSGGRI), 및
서열번호 185로 나타나는 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(TLDGRDGWVAY)
을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
서열번호 186으로 나타나는 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(TGNIGSNY),
서열번호 187로 나타나는 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(RDD), 및
서열번호 188로 나타나는 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(QSYSSGFI)
을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 상기 항-CD3 항체의 CDR의 위치와 길이는 IMGT의 정의에 의해 결정하였다.
전술한 CDR을 갖는 본 발명의 다중특이적인 분자에 포함되는 항-CD3 항체, 그의 항원 결합성 단편 및 그의 가변 영역(이하, 본 발명의 항-CD3 항체 등이라고도 기재한다)은, 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포외 영역에 존재하는 Ig-like 도메인에 결합한다. 또한 이들은 사이노몰거스 원숭이 CD3 복합체의 ε쇄의 세포외 영역에 존재하는 Ig-like 도메인에도 결합한다.
본 발명의 다중특이적인 분자에 포함되는 항-CD3 항체 등이 결합하는 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포외 영역에 존재하는 에피토프는 다음의 아미노산을 포함한다;
Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105.
본 발명의 다중특이적인 분자에 포함되는 항-CD3 항체 등은, 바람직하게는, 이들의 13개의 아미노산으로부터 선택되는 적어도 7개의 아미노산을 포함하는 에피토프 영역에 결합함으로써 인간 CD3과 결합을 유지할 수 있다.
항체가 전술한 아미노산과 4Å 이내의 거리로 인접하고 있는 경우, 그와 같은 항체는 본 발명의 다중특이적인 분자에 포함되는 항-CD3 항체 등과 동일한 에피토프 특이성을 갖는다고 판단할 수 있다. 한편, 전술한 에피토프의 아미노산 중, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105는, 공지의 항-CD3 항체 OKT3이나 UCHT1과 상호작용하는 에피토프 잔기이기도 하다(Lars Kjer-Nielsen et al., PNAS (2004)(Kelly L Arnett et al., PNAS (2004)). 그러나, OKT3과 UCHT1은 인간 CD3에 결합하지만, 사이노몰거스 원숭이 CD3에는 결합하지 않는다.
이와 같은 본 발명의 다중특이적인 분자에 포함되는 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 및 그 항체의 항원 결합성 단편은, 의약품의 비임상 개발(전임상 개발)에 유용한 영장류, 특히 사이노몰거스 원숭이를 이용한 유효성이나 안전성에 관한 각종 시험에 제공할 수 있어 바람직하다. 또한, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 등은 세포상해 활성을 가져, 단독으로 또는 본 발명의 분자로서 사이노몰거스 원숭이에 있어서의 암 등의 질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 의약 조성물에 대해서는 후술한다.
상기 항-CD3 항체는 비인간 동물 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체여도 된다. 상기 항-CD3 항체는 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
상기 항-CD3 항체의 항원 결합성 단편으로서는, Fab, F(ab)', Fv, scFv, 및 sdAb가 예시된다.
상기 CDR을 포함하는 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 예로서는, 서열번호 240(도 278)으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 241(도 279), 서열번호 242(도 280), 및 서열번호 243(도 281) 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 구체적으로는, 예를 들어, 서열번호 155로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 156, 158, 및 160 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다.
상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 구체예로서는, 서열번호 180, 181, 및 182로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 보다 상세하게는,
서열번호 180의 2 내지 243번째의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 181의 2 내지 243번째의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및
서열번호 182의 2 내지 241번째의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편
으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 들 수 있다.
상기 항-CD3 항체는 인간 면역글로불린 정상 영역 또는 Fc를 포함하는 인간화 항체 또는 인간 항체여도 된다. Fc는 변이형 Fc여도 된다.
본 발명의 다중특이적인 분자로, 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자의 적합예로서, 전술한 2B1 유래의 인간화 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과, 추가로, 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편으로서,
·서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 132번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 130번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 244의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 244의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 245의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 245의 135 내지 241의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 246의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 246의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 247의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 247의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 248의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 248의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 249의 2 내지 119의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 249의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 250의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 250의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 251의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 251의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 252의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 252의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 253의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 253의 135 내지 242의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
·서열번호 254의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 254의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
또는
·서열번호 255의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 255의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자 중에서도, 보다 바람직한 분자로서는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
또는
iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자 중에서도, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 상기 iii) 또는 iv)에 나타내는 정상 영역을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인 분자가 보다 더 바람직하다.
이러한 본 발명의 다중특이적인 분자의 구체적인 적합예로서,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 499번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 497번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 497번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 499번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 499번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 498번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 500번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 또는
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 500번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 중에서도, 보다 적합한 구체예로서는,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 497번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 499번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 499번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 498번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 500번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 또는
서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 500번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자의 적용 가능한 형태에는, 후술하는 Hybrid형의 이중특이적인 분자가 포함된다.
본 발명의 다중특이적인 분자의 다른 보다 바람직한 분자의 예로서는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 전술한 2B1 유래의 인간화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 바람직하게는, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 전술한 i), ii), iii) 또는 iv)에 기재된 정상 영역을 추가로 포함하며, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이,
v) 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 132번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역, 또는
vi) 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자 중에서도, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 상기 iii) 또는 iv)에 나타내는 정상 영역을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인 분자가 보다 바람직하다.
이러한 본 발명의 다중특이적인 분자의 구체적인 적합예로서,
서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편,
또는
서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편
을 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자의 적용 가능한 형태에는, 후술하는 FSA형의 이중특이적인 분자가 포함된다.
본 발명의 다중특이적인 분자의 또 다른 적합예로서, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역과, 추가로 변이형 Fc를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 청구항 55에 기재된 분자를 들 수 있다.
이러한 본 발명의 다중특이적인 분자의 구체적인 적합예로서,
서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
또는
서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 분자를 들 수 있다.
이들 분자의 적용 가능한 형태에는, 후술하는 Dual형의 이중특이적인 분자가 포함된다.
본 발명의 분자에는, 상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 부분, 및 인간 GPRC5D에 결합하고, 바람직하게는, 추가로 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 부분을 포함하는 분자도 포함한다.
또한, 본 발명의 분자에는, 상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 부분, 및 인간 GPRC5D에 결합하며, 바람직하게는, 추가로 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 부분을 포함하는 분자도 포함한다.
본 발명의 분자에는, 상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 수식을 받고 있는 아미노산 서열을 갖는 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하며, 바람직하게는, 추가로 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 분자도 포함한다. 이러한 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 예로서는, 중쇄 카복실 말단에 있어서 1 또는 2개의 아미노산이 결실된 결실체(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), 중쇄 카복실 말단의 글라이신 및 라이신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아마이드화된 당해 결실체(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)), 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단의 글루타민 또는 글루탐산 잔기가 파이로글루타밀화 수식된 항체(국제 특허공개 WO2013/147153호) 등을 들 수 있다(그들을 통틀어 "결실체"라고 부른다). 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명의 분자에 포함되는 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 중쇄 및 경쇄의 카복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명의 분자에 포함되는 항체가 2본 이상의 쇄(예를 들면 중쇄)를 포함하는 경우, 당해 2본 이상의 쇄(예를 들면 중쇄)는, 완전장 및 상기의 결실체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄의 어느 1종이어도 되고, 2종 이상을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양 비 또는 분자수 비는 본 발명의 분자를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명의 분자의 주성분으로서는 2본의 중쇄의 쌍방에서 카복실 말단의 1개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
4-2. 본 발명의 이중특이적인 분자
본 발명의 다중특이적인 분자의 적합한 예로서, 이중특이적인 분자를 들 수 있다.
"이중특이적"이란, 동일 분자의 2개의 서로 다른 에피토프 또는 2개 이상의 분자 상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 것이 가능한 것을 의미하고, 이와 같은 이중특이성을 갖는 항체 또는 항원 결합성 단편을 포함한다.
본 발명의 이중특이적인 분자는 GPRC5D에 결합하고, 또한 GPRC5D는 갖지 않고 다른 항원에 있는 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로는, 이러한 이중특이적인 분자는 (i) GPRC5D 상의 어떤 에피토프(에피토프 1)에 결합하고, 또한 (ii) GPRC5D에 있는 에피토프 1과는 상이한 에피토프(에피토프 2)에 결합하거나, 또는 GPRC5D 이외의 항원에 있는 에피토프(에피토프 3)에 결합한다.
예를 들어 BiTE로 대표되는 탠덤 scFv형의 이중특이성 분자에서는, 제 1 항체의 중쇄 가변 영역의 항원 결합 부위와 제 1 항체의 경쇄 가변 영역의 항원 결합 부위가 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 제 1 폴리펩티드를 형성하고 있고, 또한 제 2 항체의 중쇄 가변 영역의 항원 결합 부위와 제 2 항체의 경쇄 가변 영역의 항원 결합 부위가 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 제 2 폴리펩티드를 형성하고 있으며, 제 1 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드가 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 있다. 또한, 제 1 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드가 별도의 분자를 통해서 결합되어 있어도 된다.
다이아보디형의 이중특이성 분자에서는, 제 1 항체의 중쇄 가변 영역의 항원 결합 부위와 제 2 항체의 경쇄 가변 영역의 항원 결합 부위가 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 있고, 또한 제 1 항체의 경쇄 가변 영역의 항원 결합 부위와 제 2 항체의 중쇄 가변 영역의 항원 결합 부위가 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 있다. 또한 다이아보디형 이중특이성 분자를 추가로 이량체화시킨 이중특이성 분자도 제작할 수 있다. 기타 다이아보디형 이중특이성 분자를 Fc의 한쪽 단쇄만 또는 양 쇄와 링커로 연결시켜도 된다(다이아보디 Fc형 이중특이성 분자).
듀얼 scFv형의 이중특이성 분자에서는, 상이한 에피토프에 결합하는 2종의 scFv가 이량체의 Fc의 한쪽과 각각 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 있다. 혹은, 상이한 에피토프에 결합하는 2종류의 scFv가 각각 CH 및 CL에 링커로 연결되고, 추가로 이량체의 Fc의 한쪽과 각각 링커로 연결되어 있다. 듀얼 scFv형의 이중특이성 분자를, 이하 Dual형 이중특이성 분자 또는 간단히 Dual형이라고도 기재한다.
IgG형의 이중특이성 분자에서는, 상이한 에피토프에 결합하는 2종의 Fab가 이량체의 Fc의 한쪽과 각각 링커로 연결되거나 또는 링커 없이 직접 결합되어 있다. IgG형의 이중특이성 분자를, 이하 Full-Size Antibody(FSA)형 이중특이성 분자 또는 간단히 FSA형이라고도 기재한다.
혹은, 본 발명의 이중특이성 분자는 이량체의 Fc의 한쪽에 제 1 항체의 Fab, 다른 한쪽에 제 2 항체의 scFv를 링커로 연결하거나 또는 링커 없이 직접 결합시킨 이중특이성 분자여도 된다. 이와 같은 이중특이성 분자를, 이하 Hybrid형 이중특이성 분자 또는 Hybrid형이라고도 기재한다.
본 발명의 이중특이성 분자에 포함되는 scFv 및 Fab는 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체의 scFv 및 Fab이고, Fc는 바람직하게는 인간 항체의 Fc이다.
링커는 1본쇄 폴리펩티드 또는 1본쇄 올리고펩티드, 또는 PEG, 뉴클레오티드, 당쇄, 화합물 등의 합성품도 포함한다. 그 외에, 2개의 폴리펩티드를 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않고 공지의 링커를 사용하는 것이 가능하다.
링커의 길이로서는, 예를 들어 펩티드 링커의 경우 5 내지 30 아미노산이다. 이중특이성 분자에 복수의 링커가 포함되는 경우, 모두 동일한 길이의 펩티드 링커를 이용해도 되고, 상이한 길이의 펩티드 링커를 이용해도 된다.
펩티드 링커로서는, 예를 들어, (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)의 반복이 예시되지만, 이들에 1 내지 수개의 Gly 및 Ser과는 상이한 아미노산 잔기가 부가되어 있어도 된다.
본 발명의 이중특이적인 분자에 포함되는, GPRC5D 이외의 항원에 있는 에피토프(에피토프 3)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 예로서는, 상기 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 들 수 있다.
본 발명의 이중특이적인 분자의 예로서, 상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는 분자를 나타낼 수 있다. 이와 같은 분자의 바람직한 예로서는, 상기 항-CD3 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 본 발명의 항-GPRC5D 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 각기 scFv이고, 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는 분자를 나타낼 수 있다.
이러한 분자의 적합한 구체예로서, 서열번호 171 내지 179로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하고, 바람직하게는, 추가로 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 분자를 나타낼 수 있다.
5. 항체 및 분자의 제조
5-1. 하이브리도마를 이용하는 방법
본 발명의 항-GPRC5D 항체는, 통상적 방법을 이용하여, GPRC5D 또는 GPRC5D의 아미노산 서열로부터 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 생체내에 산생되는 항체를 채취 및 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, 공지의 방법(예를 들면, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980))에 따라, GPRC5D에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 골수종 세포를 융합시키는 것에 의해 하이브리도마를 수립하여, 모노클로널 항체를 얻을 수도 있다. 이와 같은 방법의 구체적인 예는 국제 공개 제WO09/48072호 팸플릿(2009년 4월 16일 공개) 등에 기재되어 있다.
항원이 되는 GPRC5D의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 GPRC5D를 동물에 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 GPRC5D에 결합하는 항체와 인간 GPRC5D의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
본 발명의 분자에 포함될 수 있는 항-CD3 항체도, 마찬가지로, 통상적 방법을 이용하여, CD3 또는 CD3의 아미노산 서열로부터 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 생체내에 산생되는 항체를 채취 및 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, 공지의 방법에 따라, CD3에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 골수종 세포를 융합시키는 것에 의해 하이브리도마를 수립하여, 모노클로널 항체를 얻을 수도 있다.
항원이 되는 CD3의 생물종도 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 CD3을 동물에 면역시킬 수도 있고, 취득된 이종 CD3에 결합하는 항체와 인간 CD3의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
5-2. 세포 면역법
천연형의 항원을 발현하는 세포, 재조합형 항원 또는 그의 단편을 발현하는 세포 등을 면역원으로서 사용하는 것에 의해, 상기의 하이브리도마법에 의해 항체를 조제할 수 있다.
천연형의 GPRC5D를 발현하는 세포로서는, 인간 형질 세포, 인간 다발성 골수종 환자 유래 초대 배양 세포, 인간 다발성 골수종 환자 유래 배양 세포주 등을 들 수 있다. 천연형의 CD3을 발현하는 세포로서는, 인간 흉선 세포, T 임파구 등을 들 수 있다.
이러한 세포는 1×105 내지 1×109개, 적합하게는 1×106 내지 1×108개, 보다 적합하게는 0.5 내지 2×107개, 보다 한층 적합하게는 1×107개를 1회의 면역에 이용하지만, 항원의 발현량에 따라서 면역에 제공하는 세포수를 바꿀 수 있다. 이러한 면역원은 일반적으로는 복강내에 투여하지만, 피내 등에 투여할 수도 있다.
5-3. DNA 면역법
본 발명의 항-GPRC5D 항체, 및 본 발명의 분자에 포함될 수 있는 항-CD3 항체(이하, 통틀어 본 발명의 항체라고도 기재한다)는 DNA 면역법을 사용하여 얻을 수도 있다. 항원 발현 플라스미드를 마우스나 래트 등의 동물 개체에 유전자 도입하고, 항원을 개체 내에서 발현시킴으로써, 항원에 대한 면역을 유도한다. 유전자 도입의 수법에는, 직접 플라스미드를 근육에 주사하는 방법이나, 리포솜이나 폴리에틸렌이민 등의 도입 시약을 정맥 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 이용하는 수법, 플라스미드를 부착시킨 금 입자를 Gene Gun에 의해 쏘아 넣는 수법, 급속히 대량의 플라스미드 용액을 정맥 주사하는 Hydrodynamic법 등이 존재한다.
이와 같이 하여 수립된 래트 항-인간 GPRC5D 항체의 실례로서, 2A4, 2B1, 및 7B4를 들 수 있다. 2A4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 5에 나타나 있다. 또한 2A4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 12에 나타나 있다. 2B1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 7에 나타나 있다. 또한 2B1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 14에 나타나 있다. 7B4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 9에 나타나 있다. 또한 7B4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 16에 나타나 있다.
5-4. 인간화 항체의 디자인
인간화 항체로서는, 비인간 동물 항체의 CDR만이 인간 유래의 항체에 편입된 항체(Nature (1986) 321, p. 522-525 참조), CDR 이식법에 의해 CDR의 서열에 더하여 일부의 프레임워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식된 항체(WO90/07861호 및 US6972323호 공보 참조), 그들 중 어느 하나에 있어서의 비인간 동물 항체의 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 인간형의 아미노산으로 치환되어 이루어지는 항체 등을 들 수 있지만, 그들에 한정되는 것은 아니다.
5-5. 인간 항체의 디자인
인간 항체란, 인간 유래의 항체의 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 의미한다. 인간 항체는, 인간 항체의 중쇄와 경쇄의 유전자를 포함하는 인간 게놈 DNA 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 이용한 방법(Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, 133-143,; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 722-727 등을 참조)에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 동물은, 구체적으로는, 비인간 포유동물의 내재성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌를 파괴하고, 그 대신에 효모 인공 염색체(Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통해서 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌를 도입함으로써 제작할 수 있다. 또한, 유전자 재조합 기술에 의해, 그와 같은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 cDNA, 바람직하게는 해당 cDNA를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로널 항체를 산생하는 형질전환 세포를 배양하는 것에 의해, 이 항체를 배양 상청 중으로부터 얻을 수도 있다.
여기에서, 숙주로서는 예를 들면 진핵 세포, 바람직하게는 HEK293F 세포, CHO 세포 등의 포유동물 세포를 이용할 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변 영역을 scFv로서 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법을 이용할 수 있다. 항원에 결합하는 것으로 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 밝혀지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제작하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시키는 것에 의해 인간 항체를 취득할 수 있다(WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455).
인간 항체 파지 라이브러리의 구축 방법은 주지이며, 인간 항체 가변 영역의 유전자는, 인간 혈액, 비장 또는 림프절로부터 채취된 cDNA를 템플릿으로 하고, J Biol Chem, 274 (26), 18218-30, (1999)나 Methods Mol Biol, 178, 59-71, (2002) 등을 참고로 한 프라이머를 이용하여 증폭한다. 증폭한 가변 영역은 J Immunol Methods, 201 (1), 35-55 (1997)을 참고로 하여 scFv로 할 수 있다.
5-6. 항체의 항원 결합성 단편의 제조
항체의 항원 결합성 단편은, 항체를 유전자 공학적인 수법에 의해 개변하고 적당한 배양 세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
항체의 항원 결합성 단편으로서, 예를 들면, scFv를 작성하는 방법은 당 기술분야에서 주지이다(예를 들면, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). scFv에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은, 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 통해서 연결된다(Huston, J. S. et al., PNAS (1988), 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 동일한 항체에서 유래해도 되고, 각각 다른 항체에서 유래해도 된다.
가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커로서는, 예를 들면 5 내지 30 잔기로 이루어지는 임의의 1본쇄 펩티드가 이용된다.
scFv를 코딩하는 DNA는, 상기 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 중, 그들 서열 중의 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그의 양단을 규정하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코딩하는 DNA, 및 그의 양단이 각각 중쇄 및 경쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭하는 것에 의해 얻어진다. 혹은, scFv 전체 영역을 코딩하는 DNA를 전(全)합성으로 얻는 경우도 있다.
scFv를 코딩하는 DNA를 이용하여, 해당 DNA를 함유하는 발현 벡터, 및 해당 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 통상적 방법에 따라 조제할 수 있고, 또한 그 숙주 세포를 배양하는 것에 의해, 통상적 방법에 따라 이러한 배양물로부터 해당 scFv를 회수할 수 있다.
그 밖의 항체의 항원 결합성 단편도, 전술한 방법에 준하여 항원 결합성 단편을 코딩하는 유전자를 취득하여 세포에 도입하고, 해당 세포의 배양물로부터 해당 항원 결합성 단편을 회수하는 것에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 항체는 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로서는, 1종류의 항체여도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체여도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로서는, IgG CH3 도메인과 2개의 scFv의 결합, 스트렙트아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.
5-7. 유전자 재조합
본 발명의 항체는, 그의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 폴리뉴클레오티드(중쇄 뉴클레오티드) 및 그의 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 폴리뉴클레오티드(경쇄 뉴클레오티드), 또는 이러한 중쇄 뉴클레오티드가 삽입된 벡터 및 경쇄 뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 해당 세포를 배양한 후 그 배양물로부터 이러한 항체를 회수하는 것에 의해 조제할 수 있다. 하나의 벡터에 중쇄 뉴클레오티드 및 경쇄 뉴클레오티드가 삽입되어 있어도 된다.
숙주 세포로서는, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 이용할 수 있다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진핵 미생물을 이용할 수 있다.
동물 세포로서는, 예를 들면, 포유류 유래의 세포, 즉, 인간 태아 유래 신장 세포 HEK293F 세포(Subedi GP et al., J Vis Exp. (2015) 106), 원숭이 신장 유래의 COS 세포(Gluzman, Y. Cell (1981) 23, 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유아세포 NIH3T3(ATCC No. CRL-1658), 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포, ATCC CCL-61), 그의 다이하이드로엽산 환원효소 결손주(CHOdhfr-: Urlaub, G. and Chasin, L. A. PNAS (1980) 77, 4126-4220), 닭 등 조류 유래의 세포, 곤충 유래의 세포 등을 들 수 있다.
또한, 당쇄 구조의 개변에 의해, 항체의 생물 활성을 높일 수 있도록 개변된 세포도 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합하고 있지 않는 당쇄의 비율이 20% 이상이 되도록 개변된 CHO 세포를 이용하는 것에 의해, ADCC 활성이나 CDC 활성이 높아진 항체를 조제하는 것이 가능하다(국제 특허공개 WO02/31140호).
진핵 미생물로서는, 예를 들면, 효모 등을 들 수 있다. 원핵 세포로서는, 예를 들면, 대장균, 고초균 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체(각종 동물 유래의 모노클로널 항체, 래트 항체, 마우스 항체, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등)를 분비시키기 위한 시그널 펩티드로서는, 당해 항체와 동일한 종, 동일한 타입 및 동일한 서브타입의 항체의 분비 시그널, 및 당해 항체 자체의 분비 시그널에 한정되는 것은 아니고, 다른 타입 혹은 서브타입의 항체의 분비 시그널, 또는 다른 진핵 생물종 혹은 원핵 생물 유래의 단백질의 분비 시그널이면, 임의의 것을 선택하여 이용할 수 있다. 시그널 펩티드는, 통상 대부분의 성숙 경쇄 또는 성숙 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에는 각각 포함되지 않지만, 시그널 펩티드를 포함하고 분비된 항체 등도, 본 발명의 항체 등 또는 본 발명의 분자에 포함된다.
얻어진 항체, 항체의 항원 결합성 단편, 및 분자는 다른 단백질을 포함하지 않도록 균일하게 정제할 수 있다. 항체, 항체의 항원 결합성 단편, 및 분자의 분리 및 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리 및 정제 방법을 사용하면 된다.
예를 들면 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택 및 조합하면 항체를 분리 및 정제할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
적합한 분리·정제법으로서는, 예를 들어, His 태그나 FLAG 태그를 코딩하는 DNA 서열을 항체 가변 영역의 카복실 말단에 부가시켜 발현 벡터를 제작하고, 이 벡터로 세포를 형질전환시키고, 추가로 세포를 배양함으로써 당해 항체 및 항체의 항원 결합성 단편을 발현시키고, 배양 종료 후, 배양 상청을 추출하여, Ni, Co 등의 금속 어피니티 크로마토그래피, 항-FLAG 태그 항체 컬럼, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 등으로 정제할 수 있다.
His 태그나 FLAG 태그 등의 태그의 아미노산 서열을 포함하고 발현된 항체 및 항체의 항원 결합성 단편도, 본 발명의 항체, 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는 본 발명의 분자에 포함된다.
5-8. 폴리클로널 항체의 제조
본 발명의 항체는 폴리클로널 항체여도 된다. 폴리클로널 항체는 상이한 항체의 산생 세포를 혼합 배양하여 그 배양물로부터 회수할 수 있다(WO2004/061104호). 또한, 별개로 조제한 항체를 혼합하는 것도 가능하다. 또, 폴리클로널 항체의 하나의 태양인 항혈청은, 동물을 원하는 항원으로 면역시키고, 정법(定法)에 따라 해당 동물로부터 혈청을 회수하는 것에 의해 조제할 수 있다.
5-9. 종양 세포에 대한 결합 특이성이 부여된 인공 면역 세포의 제조
종양 세포에 대한 결합 특이성이 부여된 인공 면역 세포는, 면역 세포에 본 발명의 항-GPRC5D 항체의 유전자 등을 도입하여 항원 특이성을 부여하는 것에 의해 제조할 수 있다. 면역 세포로서는, T 세포, NK 세포, 모노사이트 등이 예시된다.
면역 세포로서 T 세포를 이용하는 경우를 예시한다. T 세포는, 인간의 말초혈로부터 비중 원심법 등의 방법에 의해 회수한 단핵구를, 항-CD3 항체, IL-2, IL-12, 또는 추가로 항IL-4 항체나 IFN-γ의 존재하에 배지에서 배양하여 유도할 수 있다.
다음으로, 이 T 세포에 대해서 본 발명의 항-GPRC5D 항체의 유전자를 구성 요소로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자를 도입한다. 대표적인 CAR 유전자는 종양 세포의 표면 항원을 인식하는 항체(본 발명에서는 항-GPRC5D 항체)의 유전자와, T 세포 활성화에 필요한 보조 자극 분자(예를 들면, T 세포 수용체 ζ쇄와 CD28 등의 공자극 분자)를 코딩하는 유전자로 구성된다. 항-GPRC5D 항체의 유전자를 포함하는 CAR 유전자는 여러 가지 바이러스 벡터를 이용하여 T 세포에 도입할 수 있다. 이와 같은 벡터로서는, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 리포솜 등을 들 수 있다. 항-GPRC5D 항체의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로부터 재조합 바이러스를 조제하여, 전술한 항원 비특이적으로 활성화한 T 세포에 도입할 수 있다. 유전자 도입 후의 T 세포를 배양하여, 종양 세포에 대한 특이성이 부여된 T 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진, 리디렉션에 의해 세포상해를 유도할 수 있는 본 발명의 T 세포가 항원 특이성이 부여된 것은, T 세포를, GPRC5D를 발현하는 것이 알려져 있는 항원 양성 종양 세포를 마이토마이신 C 처리하여 불활성화한 것과 공배양한 후, 배양 상청 중의 IFN-γ 또는 IL-2의 양을 측정하는 것에 의해 판정할 수 있다.
5-10. 다중특이적인 분자 및 이중특이적인 분자의 제조
본 발명의 다중특이적인 분자 및 이중특이적인 분자는, 숙주 세포에 발현 플라스미드를 도입하여, 일과성으로 발현시키는 방법, 숙주 세포에 플라스미드를 도입한 후, 약제 선택에 의해 안정 발현 세포주를 선택하여, 항상적으로 발현시키는 방법, 및 각각의 항체 혹은 항원 결합성 단편을 상기의 방법으로 제작한 후, 합성 펩티드 링커를 이용하여 화학적으로 결합시키는 방법을 들 수 있다.
1본쇄 항체(scFv)에서는, 2개의 scFv를 펩티드 링커로 결합시키거나(탠덤 scFv), 특이성이 상이한 2개의 항체에 있어서의 서로의 도메인을 바꿔 넣어 비공유결합적으로 이량체를 형성하거나(다이아보디), 특이성이 상이한 2개의 항체에 있어서의 서로의 도메인을 바꿔 넣어 1본쇄화하거나(1본쇄 다이아보디), 다이아보디를 1본쇄화한 뒤에 비공유결합적으로 이량체를 형성하는(TandAb, 미국 특허 US7129330) 등의 방법이 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는 항원 등의 수식물을 코딩하는 유전자, 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 또는 벡터가 도입된 세포, 기타 본 발명의 항체를 산생하는 세포도 제공한다.
6. 의약 조성물
본 발명은 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및 인공 면역 세포, 및/또는 이들 중 적어도 하나를 포함하는 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물(이하, 본 발명의 의약 조성물이라고도 기재한다)을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 GPRC5D 혹은 그의 리간드의 과잉 발현, 또는 GPRC5D의 변이 혹은 유전자 증폭에 의한, GPRC5D 시그널 이상 또는 항진에 관련되는 각종 질환(이하, "GPRC5D에 관련되는 질환"이라고 한다), 특히 각종 암의 치료 또는 예방에 유용하다.
이러한 치료 또는 예방의 대상이 되는 암의 야기 또는 증악화의 원인으로서는, GPRC5D의 고발현, GPRC5D 유전자의 인트론 내의 1염기 치환(SNP), GPRC5D를 항상적으로 활성화하는 미스센스 변이, GPRC5D 유전자의 증폭 또는 과잉 발현 등을 예시할 수 있다.
또한, 본 발명의 분자 또는 본 발명의 의약 조성물은, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 등의 면역 세포의 리디렉션에 의해, GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도할 수 있고, 그 때문에, 본 발명의 분자 또는 본 발명의 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 등의 면역 세포 리디렉션에 의해 GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도하는 방법을, 본 발명은 제공한다.
본 발명의 의약 조성물의 치료 또는 예방의 대상이 되는 암종으로서는, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 암, 예를 들면, 유방암, 자궁 내막암, 난소암, 비소세포 폐암 등의 폐암, 위암, 전립선암, 신암, 간암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 자궁 경부암, 혈액암, 림프종, 악성 흑색종 등을 들 수 있고, 적합하게는, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 다발성 골수종을 들 수 있다.
GPRC5D에 관련되는 질환의 치료 또는 예방에는, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 개체에 있어서의 이러한 질환의 발증의 예방, 증악화 혹은 진행의 억제, 또는 저해; 이러한 질환으로 이환한 개체가 나타내는 1개 또는 2개 이상의 증상의 경감, 증악화 혹은 진행의 억제, 또는 관해; 이러한 질환으로 이환한 개체에 있어서의 이차성 질환의 치료 또는 예방 등이 포함되지만, 그들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물에는, 치료 또는 예방에 유효한 양의 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편, 및/또는 이들 중 적어도 하나를 포함하는 분자를 유효 성분으로서 포함하고, 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 추가로 함유시킬 수 있다.
"치료 또는 예방에 유효한 양"이란, 특정 질환, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 나타내는 양을 의미하고, "약리학적으로 유효한 양"과 동일한 의미이다.
본 발명의 의약 조성물에는, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 해당 조성물 또는 그것에 포함되는 항체의 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 침투성, 제형, 강도, 성상, 형상 등을 변화시키거나 유지하거나 보유하거나 하기 위한 물질(이하, "제제용 물질"이라고 한다)을 함유시킬 수 있다. 제제용 물질로서는, 약리학적으로 허용되는 물질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 비독성 또는 저독성인 것은 제제용 물질이 적합하게 구비하는 성질이다.
제제용 물질로서, 예를 들면, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 글라이신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신 등의 아미노산류; 항균제; 아스코브산, 황산 나트륨, 아황산수소 나트륨 등의 항산화제; 인, 시트르산 또는 붕산 버퍼, 탄산수소 나트륨, 트리스 염산(Tris-HCl) 용액 등의 완충제; 만니톨, 글라이신 등의 충전제; 에틸렌다이아민사아세트산(EDTA) 등의 킬레이트제; 카페인, 폴리바이닐피롤리딘, β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 등의 착화제; 글루코스, 만노스, 덱스트린 등의 증량제; 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 덱스트린 등의 다른 탄수화물; 착색제; 향미제; 희석제; 유화제; 폴리바이닐피롤리딘 등의 친수 폴리머; 저분자량 폴리펩티드; 염 형성 대이온; 염화 벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 과산화 수소 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등의 용매; 만니톨, 소르비톨 등의 당 알코올; 현탁제; PEG, 소르비탄 에스터, 폴리소르베이트 20이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소베이이트, 트라이톤(triton), 트로메타민(tromethamine), 레시틴, 콜레스테롤 등의 계면활성제; 수크로스, 소르비톨 등의 안정화 증강제; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 만니톨, 소르비톨 등의 탄성 증강제; 수송제; 희석제; 부형제; 및/또는 약학상의 보조제.
이들 제제용 물질의 첨가량은 항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편, 및/또는 이들 중 적어도 하나를 포함하는 분자의 중량에 대해서 0.001 내지 1000배, 적합하게는 0.01 내지 100배, 보다 적합하게는 0.1 내지 10배이다.
항-GPRC5D 항체 또는 그의 항원 결합성 단편, 및/또는 이들 중 적어도 하나를 포함하는 분자를 리포솜 중에 함유시킨 이뮤노리포솜, 또는 항체와 리포솜이 결합하여 이루어지는 항체 수식체(미국 특허 제6214388호 등)를 함유하는 의약 조성물도, 본 발명의 의약 조성물에 포함된다.
부형제나 담체는, 통상 액체 또는 고체이고, 주사용 물, 생리 식염수, 인공 뇌척수액, 및 기타의, 경구 투여 또는 비경구 투여용 제제에 이용되는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 생리 식염수로서는, 중성의 것, 혈청 알부민을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
완충제로서는, 의약 조성물의 최종 pH가 7.0 내지 8.5가 되도록 조제된 Tris 버퍼, 그의 최종 pH가 4.0 내지 5.5가 되도록 조제된 아세트산 버퍼, 그의 최종 pH가 5.0 내지 8.0이 되도록 조제된 시트르산 버퍼, 그의 최종 pH가 5.0 내지 8.0이 되도록 조제된 히스티딘 버퍼 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 고체, 액체, 현탁액 등이다. 본 발명의 의약 조성물의 다른 예로서는, 동결건조 제제를 들 수 있다. 동결건조 제제를 성형하기 위해서는 수크로스 등의 부형제를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로서는, 경장 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 되고, 예를 들면, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 관절내 투여 등을 들 수 있다.
이러한 의약 조성물의 조성은 투여 방법, 항체의 GPRC5D 단백질 결합 친화성 등에 따라서 결정할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 약리학적으로 유효한 양이면 한정되지 않고, 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 해당 항체의 GPRC5D 단백질 결합 친화성 또는 그의 생물 활성, 기타의 요소에 따라서 적절히 결정할 수 있지만, 통상 0.01 내지 1000mg/kg, 적합하게는 0.1 내지 100mg/kg을, 1 내지 180일간에 1회, 또는 1일 2회 혹은 3회 이상 투여할 수 있다.
의약 조성물의 형태로서는, 주사제(동결건조 제제 및 점적제를 포함한다), 좌제, 경비형 흡수 제제, 경피형 흡수 제제, 설하제, 캡슐, 정제, 연고제, 과립제, 에어졸제, 환제, 산제, 현탁제, 유제, 점안제, 생체 매립형 제제 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 다른 의약과 동시에 혹은 개개로 투여할 수 있다. 예를 들면, 다른 의약을 투여한 후에, 본 발명의 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 의약 조성물을 투여한 후에, 다른 의약을 투여하거나, 또는 당해 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다. 다른 의약으로서는, 화학 요법제, 방사선 요법제 등 각종 항암제 등을 들 수 있다. 그들을 통틀어 본 발명의 항체와 "다른 약제의 병용"이라고 부르고, 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분에 더하여 추가적인 약제를 포함하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 암 등 GPRC5D에 관련되는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법, 해당 질환의 치료용 또는 예방용 의약 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 항체의 사용, 및 해당 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체의 사용도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 치료용 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.
실시예
이하, 실시예에 있어서 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
한편, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, "몰레큘러 클로닝(Molecular Cloning)"(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 1989년 발행)에 기재된 방법 및 기타의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 행하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 이용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 행하였다.
(실시예 1) 래트 항-인간 GPRC5D 항체의 제작
1)-1 인간 GPRC5D 발현 벡터를 이용한 면역
1)-1-1 인간 GPRC5D 발현 벡터(pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D)의 구축
pcDNA3.1(+)을 Gateway Vector Convension System(Thermo Fisher Scientific사)에 의해 Destination Vector로 개변한 pcDNA3.1-DEST를 제작하였다. Gataway LR Clonase Enzyme mix(Life Technologies사)를 이용하여, 인간 GPRC5D 단백질(NP_061124.1)을 코딩하는 cDNA를 pcDNA3.1-DEST 벡터에 클로닝하여 인간 GPRC5D 발현 벡터 pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D를 구축하였다. 인간 GPRC5D 발현 벡터의 대량 조제에는, Endofree Plasmid Giga Kit(QIAGEN사)를 이용하였다.
1)-1-2 래트 면역
면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷(일본 에스엘시사)을 사용하였다. 우선 래트 양다리 하퇴부를 Hyaluronidase(SIGMA-ALDRICH사)로 전처리한 후, 동 부위에 pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D를 근육 주사하였다. 계속해서, ECM830(BTX사)을 사용하고 니들 전극을 이용하여, 동 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 약 2주일에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 래트의 림프절 또는 비장을 채취하여 하이브리도마 제작에 이용하였다.
1)-2 하이브리도마 제작
림프절 세포 또는 비장 세포와 마우스 골수종 SP2/0-ag14 세포(ATCC, No. CRL-1 581)를 LF301 Cell Fusion Unit(BEX사)을 이용하여 전기 세포 융합하고, ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies사)로 희석하여 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마를 제작하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies사)를 이용하여 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 이용하여 항-인간 GPRC5D 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝을 행하였다.
1)-3 Cell-ELISA법에 의한 항체 스크리닝
1)-3-1 Cell-ELISA법에 의한 일차 스크리닝
인테그린 αv 및 인테그린 β3 발현 벡터를 HEK293 세포 내에 안정적으로 형질이입한 세포주 HEK293α 세포를, 10% FBS 함유 DMEM 배지 중 5×105 세포/mL가 되도록 조정하였다. 그에 대해, Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific사)을 이용한 형질이입 순서에 따라, pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 또는 컨트롤로서 pcDNA3.1-DEST를 도입하고, 96-well plate(Corning사)에 100μL씩 분주(分注)하여, 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태 그대로 Cell-ELISA에 사용하였다.
1)-3-2 Cell-ELISA
실시예 1)-1-1에서 조제한 발현 벡터 도입 HEK293α 세포의 배양 상청을 제거한 후, pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 또는 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293α 세포 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. well 중의 세포를 5% FBS 함유 PBS로 1회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 500배로 희석한 Anti-Rat IgG, HRP-Linked Whole Ab Goat(GE Healthcare Bioscience사)를 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. well 중의 세포를 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, OPD 발색액(OPD 용해액(0.05M 시트르산 3나트륨 및 0.1M 인산수소 2나트륨·12물, pH 4.5에 o-페닐렌다이아민 이염산염(와코순약사) 및 H2O2를 각각 0.4mg/mL 및 0.6%(v/v)가 되도록 용해))을 100μL/well로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 행하고, 1M HCL을 100μL/well로 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더(ENVISION: PerkinElmer사)로 490nm의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 인간 GPRC5D에 특이적으로 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 컨트롤인 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293α 세포와 비교하여 pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 발현 벡터 도입 HEK293α 세포 쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 항-인간 GPRC5D 항체 산생 양성으로서 선택하였다.
1)-4 플로 사이토메트리에 의한 항체 스크리닝
1)-4-1 플로 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제
HEK293T 세포(Thermo Fisher Scientific사)를 4×105 세포/mL의 농도로 225cm2 플라스크에 파종하고, 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D와 컨트롤로서 pcDNA3.1-DEST를 각각 HEK293T 세포에 Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여 도입하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 더 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 HEK293T 세포를 TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific사)로 처리하고, 10% FBS 함유 DMEM으로 세포를 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 5×106 세포/mL의 농도로 조제하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로 사이토메트리 해석에 사용하였다.
1)-4-2 플로 사이토메트리 해석
실시예 1)-3의 Cell-ELISA로 양성으로 판정된 하이브리도마가 산생하는 항체의 인간 GPRC5D에 대한 결합 특이성을 플로 사이토메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-4-1에서 조제한 HEK293T 세포 현탁액을 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 도입 HEK293T 세포 및 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁시키고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 1회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배로 희석한 PE Goat Anti-Rat Ab(BD사)를 첨가하여 현탁시키고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS에 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1-DEST 도입 HEK293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대해 pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 도입 HEK293T 세포의 히스토그램이 강한 형광 강도 측으로 시프트하고 있는 샘플을 산생하는 하이브리도마를 항-인간 GPRC5D 항체 산생 하이브리도마로서 취득하였다.
1)-5 ADCC 어세이에 의한 항체 스크리닝
1)-5-1 β-갈락토시다아제 안정 발현 세포의 제작
pLenti6/V5-GW/LacZ 및 ViraPower(상표) Packaging Mix(Thermo Fisher Scientific사)를 첨부 프로토콜에 따라 HEK293FT 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 트랜스펙션하는 것에 의해, β-갈락토시다아제 유전자를 발현하는 재조합 렌티바이러스를 제작하였다. 얻어진 재조합 렌티바이러스를 ViraPower Lentiviral Expression Systems(Thermo Fisher Scientific사)의 프로토콜에 따라 HEK293T 세포에 감염시키고, 10μg/mL의 블라스티사이딘(Thermo Fisher Scientific사)으로 바이러스 감염 세포를 선택하는 것에 의해, β-갈락토시다아제의 안정 발현주를 취득하였다. 이 β-갈락토시다아제를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포(이하 "293T-lacZ 세포"라고 표기)를 표적 세포로 하여 ADCC 활성을 측정하였다.
1)-5-2 표적 세포의 조제
실시예 1)-5-1에서 취득한 293T-lacZ 세포를 5×105 세포/mL의 농도로 75cm2 플라스크에 파종하고, 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D와 컨트롤로서 pcDNA3.1-DEST를 각각 293T-lacZ 세포에 Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여 도입하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 더 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 293T-lacZ 세포를 TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific사)로 처리하고, 5% FBS 함유 페놀 레드 무함유 RPMI1640 배지(Thermo Fisher Scientific사)(이하 "ADCC용 배지"라고 약기한다)로 세포를 2회 세정하고, 생세포 수를 트립판 블루 색소 배제 시험으로 계측하고, ADCC용 배지로 1×105 세포/mL가 되도록 재현탁시킨 것을 표적 세포로서 이용하였다.
1)-5-3 이펙터 세포의 조제
볼런티어의 혈액으로부터 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Bioscience사)를 사용하여 정법에 따라 채취한 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 10% FBS 함유 페놀 레드 무함유 RPMI1640 배지(Thermo Fisher Scientific사)에 현탁시키고, 원심 후 재현탁시켜 생세포 수를 트립토판 블루 색소 배제 시험으로 계측하였다. 원심 후 배지를 제거하고, ADCC용 배지에 현탁시켜 2×106 세포/mL가 되도록 조제하여, 이펙터 세포로 하였다.
1)-5-4 하이브리도마 배양 상청의 조제
실시예 1)-4에서 취득한 래트 항-GPRC5D 항체 산생 하이브리도마 배양 상청의 농도를 FastELISA IgG ELISA Quantification Kit(RD-Biotech사)를 이용하여 측정하고, 최종 농도로 10μg/mL가 되도록 ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies사)로 조제하였다.
1)-5-5 ADCC 어세이
실시예 1)-5-2에서 취득한 293T-lacZ 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 실시예 1)-5-4에서 조제한 하이브리도마 배양 상청, 또는 최종 농도로 10μg/mL가 되도록 조제한 포지티브 컨트롤용 마우스 항-GPRC5D IgG2b 항체(R&D Systems사) 또는 네거티브 컨트롤용 마우스 컨트롤 항체(mIgG2b)(R&D Systems사)를 50μL/well로 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 실시예 1)-5-3에서 조제한 이펙터 세포를 50μL/well로 추가로 첨가하고, 실온에서 1200rpm×5분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 18시간 배양하였다. 상청 50μL를 백색 플레이트(Corning사)에 회수하고, β-Glo 어세이 시스템(Promega사) 용액 50μL를 첨가하고, 발광량을 플레이트 리더(ENVISION: PerkinElmer사)로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 용해율(%) = (A-B)/(C-B)×100
A: 샘플 웰의 카운트.
B: 자연 방출(항체·이펙터 세포 비첨가 웰) 카운트의 평균치(n = 3).
하이브리도마 배양 상청 첨가 시와 이펙터 세포 첨가 시에 ADCC용 배지를 50μL 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 동일한 조작을 행하였다.
C: 최대 방출(표적 세포를 계면활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 하이브리도마 배양 상청 첨가 시와 이펙터 세포 첨가 시에 ADCC용 배지를 50μL 첨가하였다. 측정 시에는, 세포를 포함하는 웰에 150μL의 β-Glo 어세이 시스템 용액을 첨가하여 혼화하고, 그 중 100μL분을 백색 플레이트에 첨가하고 측정을 실시하였다.
상기의 방법에 따라 pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 도입 293T-lacZ 세포와 pcDNA3.1-DEST 도입 293T-lacZ 세포에 대한 ADCC 활성을 각각 산출하여, pcDNA3.1-DEST-hGPRC5D 도입 293T-lacZ 세포 특이적으로 ADCC 활성을 나타내고 또한 포지티브 컨트롤 항체 이상의 ADCC 활성을 나타내는 항체를 산생하는 하이브리도마 클론을 선택하였다.
1)-6 항체의 아이소타입 결정
실시예 1)-4에서 취득한 래트 항-GPRC5D 항체 산생 하이브리도마 중에서, 강하게 인간 GPRC5D에 결합하고 또한 실시예 1)-5로부터 높은 ADCC 활성을 갖는 것이 시사된 2A4, 2B1 및 7B4를 선발하여, 항체 아이소타입을 동정하였다. 아이소타입은 Rat monoclonal isotyping test kit(AbD Serotec사)에 의해 결정되었다. 그 결과, 래트 항-GPRC5D 모노클로널 항체 2A4, 2B1 및 7B4의 아이소타입은 모두 IgG2b 및 κ쇄인 것이 확인되었다.
1)-7 모노클로널 항체의 조제
래트 항-GPRC5D 모노클로널 항체는 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다. 우선, 2A4, 2B1 및 7B4 산생 하이브리도마를 ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies사)에서 충분한 양까지 증식시킨 후, Ultra Low IgG FBS(Thermo Fisher Scientific사)를 20% 첨가한, 5μg/mL의 겐타마이신(Thermo Fisher Scientific사) 함유 Hybridoma SFM(Thermo Fisher Scientific사)으로 배지를 교환하고, 5일간 배양하였다. 본 배양 상청을 회수하고, 0.45μm의 필터를 통해 멸균하였다.
항체는 상기의 하이브리도마 상청으로부터 Protein G 어피니티 크로마토그래피(4 내지 6℃하) 1단계 공정으로 정제하였다. Protein G 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 내지 6℃하에서 실시하였다. 먼저, PBS로 평형화한 Protein G(GE Healthcare Bioscience사)가 충전된 컬럼에 하이브리도마의 배양 상청을 어플라이하였다. 배양 상청액이 컬럼에 모두 들어간 후, 컬럼 용량 2배 이상의 PBS로 컬럼을 세정하였다. 다음으로 0.1M 글라이신/염산 수용액(pH 2.7)으로 용출시켜, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 모은 획분에 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 첨가하여 pH 7.0 내지 7.5로 조제한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(분획 분자량 UF30K, Sartorius사, 4 내지 6℃하)으로 HBSor(25mM 히스티딘/5% 소르비톨, pH 6.0)로의 버퍼 치환을 행함과 함께 농축을 행하여, 항체 농도를 1mg/ml 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter(Sartorius사)로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 2) 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 in vitro 평가
2)-1 취득 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 플로 사이토메트리에 의한 인간 GPRC5D로의 결합성 검토
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포(JCRB 세포 뱅크)를 5% FBS 함유 PBS로 5×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 0.32ng/mL 내지 10μg/mL로 실시예 1)-7에서 조제한 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 PE Goat Anti-Rat Ab(BD사)를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하였다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 2A4, 2B1, 및 7B4는 인간 GPRC5D에 결합하는 것이 나타났다(2A4 MFI(max): 1153, 2A4 Kd: 0.5nM, 2B1 MFI(max): 2386, 2B1 Kd: 14.8nM, 7B4 MFI(max): 2492, 7B4 Kd: 1.3nM). GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KMS-34 세포(JCRB 세포 뱅크)로도 플로 사이토메트리를 실시하여, 마찬가지의 결과를 얻었다(2A4 MFI(max): 2064, 2A4 Kd: 1.4nM, 2B1 MFI(max): 3157, 2B1 Kd: 12.7nM, 7B4 MFI(max): 4471, 7B4 Kd: 2.1nM).
2)-2 취득 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 에피토프의 동정
2)-2-1 ELISA에 의한 에피토프의 동정
카복실 말단 측의 펩티드를 비오틴화하고, 분자 내에서 다이설파이드 결합을 형성하고 있지 않는 인간 GPRC5D 아미노 말단 펩티드 MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE(Biotin)-NH2(SIGMA-ALDRICH사)(서열목록의 서열번호 1: 도 2)와, 카복실 말단에 라이신을 넣어 비오틴화하고, 분자 내에서 다이설파이드 결합을 형성시킨 인간 GPRC5D 아미노 말단 펩티드 MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILE-K(Biotin)-NH2(펩티드 연구소)(서열목록의 서열번호 2: 도 3)를 이용하여, 취득 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)가 결합하는 에피토프를 동정하였다. PBS로 희석한 펩티드를 Nunc Immobilizer(Thermo Fisher Scientific사)에 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정한 후, 1% BSA 함유 FBS를 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정한 후, PBS로 0.1ng/mL 내지 1μg/mL로 희석한 실시예 1)-7에서 조제한 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)를 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정한 후, PBS로 500배로 희석한 Anti-Rat IgG, HRP-Linked Whole Ab Goat(GE Healthcare Bioscience사)를 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. PBST로 3회 세정한 후, SuperSignal(상표) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가하고, 플레이트 리더(ENVISION: PerkinElmer사)로 발광을 측정하였다. 그 결과, 다이설파이드 결합의 유무에 관계없이, 2B1 항체는 인간 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드 서열에 결합하였지만, 2A4 및 7B4 항체는 결합하지 않았다. 따라서, 2B1 항체의 에피토프는 인간 GPRC5D의 아미노 말단 영역에 존재하는 한편, 2A4 및 7B4 항체의 에피토프는 아미노 말단 이외의 영역에 존재하는 것이 시사되었다.
2)-2-2 플로 사이토메트리에 의한 에피토프의 동정
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KMS-34 세포를 5% FBS 함유 PBS로 2×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 7.5μg/mL로 실시예 1)-7에서 조제한 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4) 또는 Rat IgG2b isotype control 항체(MBL사)를 100μL/well 첨가하고, 실시예 2)-2-1에서 사용한 2종류의 펩티드를 PBS로 17ng/mL 내지 34μg/mL로 조제하고, 항체 희석액이 들어 있는 well에 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 PE Goat Anti-Rat Ab(BD사)를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, GPRC5D 항체의 MFI 값으로부터 control 항체의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rMFI)를 산출하였다. 도 4(분자 내 다이설파이드 결합 있음(A) 또는 없음(B))에 나타내는 바와 같이, 다이설파이드 결합의 유무에 관계없이, 2B1은 인간 GPRC5D 아미노 말단 펩티드를 첨가하면 결합이 저해되는 것이 나타났다. 한편, 2A4 및 7B4 항체는 인간 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드의 첨가로는 결합이 저해되지 않는 것이 나타났다. 이상의 결과로부터, 2B1 항체의 에피토프는 인간 GPRC5D의 아미노 말단 영역에 존재하고, 2A4 및 7B4 항체의 에피토프는 아미노 말단 이외의 영역에 존재하는 것이 시사되었다.
2)-3 취득 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 ADCC 활성 평가
2)-3-1 표적 세포의 조제
인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지(Thermo Fisher Scientific사)로 2×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 세포 현탁액 1mL당 100μL의 Chromium-51 Radionuclide(PerkinElmer사)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 2시간 배양하였다. 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 3회 세정한 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 2×105 세포/mL가 되도록 재현탁시킨 것을 표적 세포로서 이용하였다.
2)-3-2 이펙터 세포의 조제
실시예 1)-5-3에서 조제한 PBMC를, BINKIT(일본 바이오세라피 연구소사)를 이용하여 NK 세포에 분화시켰다. 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 1×106 세포/mL가 되도록 조제하여, 이펙터 세포로 하였다.
2)-3-3 ADCC 어세이
실시예 2)-3-1에서 조제한 KHM-1B 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 최종 농도로 0.5081ng/mL 내지 10μg/mL가 되도록 조제한 취득 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4) 및 래트 컨트롤 항체(rIgG2b)를 50μL/well로 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 실시예 2)-3-2에서 조제한 이펙터 세포를 100μL/well로 추가로 첨가하고, 실온에서 1200rpm×3분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양하였다. 상청 50μL를 LumaPlate(PerkinElmer사)에 회수하고, 50℃에서 하룻밤 건조시켜, 플레이트 리더(TopCount: PerkinElmer사)로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 실시예 1)-5-5에 따라 산출하였다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 2A4, 2B1, 및 7B4는 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 3) 래트 항-GPRC5D 항체(2A4, 2B1, 및 7B4)의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 결정
3)-1 2A4의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 결정
3)-1-1 2A4 산생 하이브리도마로부터의 total RNA의 조제
2A4의 가변 영역을 포함하는 cDNA를 증폭하기 위해, 2A4 산생 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent(Ambion사)를 이용하여 total RNA를 조제하였다.
3)-1-2 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA)의 합성
cDNA(5'-RACE-Ready cDNA)의 합성은 실시예 3)-1-1에서 조제한 total RNA의 약 1μg을 이용하고 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사)를 이용하여 실시하였다.
3)-1-3 5'-RACE PCR에 의한 2A4의 중쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA의 증폭과 서열의 결정
2A4의 중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM(Universal Primer A Mix: SMARTer RACE cDNA Amplification Kit에 부속) 및 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'(RG2AR3; 서열번호 3(도 6))의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. UPM은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사)에 부속된 것을 사용하고, RG2AR3은 데이터베이스의 래트 중쇄의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 3)-1-2에서 합성한 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA)를 주형으로 한 5'-RACE PCR에 의해 2A4의 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA를 증폭하였다. PCR은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사)의 매뉴얼에 따라 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR로 증폭한 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA를 MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN사)를 이용하여 정제한 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen사)를 이용하여 클로닝하고, 클로닝한 중쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 2A4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4(도 8)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 5(도 9)에 나타내었다.
3)-1-4 5'-RACE PCR에 의한 2A4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA의 증폭과 서열의 결정
2A4의 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM(Universal Primer A Mix: SMARTer RACE cDNA Amplification Kit에 부속) 및 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'(RKR5; 서열번호 10(도 7))의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. UPM은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사)에 부속된 것을 사용하고, RKR5는 데이터베이스의 래트 경쇄의 정상 영역의 서열로부터 설계하였다.
이 프라이머의 조합과, 실시예 3)-1-2에서 합성한 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA)를 주형으로 한 5'-RACE PCR에 의해 2A4의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA를 증폭하였다. PCR은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사)의 매뉴얼에 따라 터치다운 PCR 프로그램으로 실시하였다.
5'-RACE PCR로 증폭한 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA를 MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN사)를 이용하여 정제한 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen사)를 이용하여 클로닝하고, 클로닝한 경쇄의 가변 영역을 포함하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 2A4의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 11(도 14)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 12(도 15)에 나타내었다.
3)-2 2B1의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 2B1의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 6(도 10)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 7(도 11)에 나타내었다. 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 13(도 16)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 14(도 17)에 나타내었다.
3)-3 7B4의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-1과 동일한 방법으로 서열을 결정하였다.
결정된 7B4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 8(도 12)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 9(도 13)에 나타내었다. 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 15(도 18)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 16(도 19)에 나타내었다.
(실시예 4) 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 제작
4)-1 키메라화 및 인간화 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen사)를 제한 효소 XbaI 및 PmeI로 소화하여 얻어지는 약 5.4kb의 프래그먼트와, 서열목록의 서열번호 17(도 20)에 나타내는 인간 경쇄 분비 시그널 및 인간 κ쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트(CLONTECH사)를 이용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK를 제작하였다.
pcDNA3.3/LK를 주형으로 하여 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하고, 얻어진 약 3.8kb의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션하는 것에 의해, CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트 및 인간 κ쇄 정상 영역을 가지는 키메라화 및 인간화 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK를 구축하였다.
프라이머 세트
5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3'(3.3-F1: 서열목록의 서열번호 18: 도 21)
5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3'(3.3-R1: 서열목록의 서열번호 19: 도 22)
4)-2 키메라화 및 인간화 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1의 구축
pCMA-LK를 XbaI 및 PmeI로 소화하여 경쇄 분비 시그널 및 인간 κ쇄 정상 영역을 없앤 DNA 단편과, 서열목록의 서열번호 20(도 23)으로 표시되는 인간 중쇄 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트(CLONTECH사)를 이용하여 결합하여, CMV 프로모터의 하류에 시그널 서열, 클로닝 사이트 및 인간 IgG1 중쇄 정상 영역을 가지는 키메라화 및 인간화 IgG1 타입 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1을 구축하였다.
4)-3 c2A4 경쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 2A4 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기의 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라화 및 인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK를 제한 효소 BsiWI로 절단한 개소에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트(Clontech사)를 이용하여 삽입하는 것에 의해, c2A4 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-LK/c2A4"라고 명명하였다. c2A4 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 그 경쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 21 및 22(도 24 및 25)에 각각 나타낸다.
c2A4 경쇄용 프라이머 세트
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACACAGTCTCCAGC-3'(c2A4-LF: 서열목록의 서열번호 23: 도 26)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCTTGGTGCCTC-3'(c2A4-LR: 서열목록의 서열번호 24: 도 27)
4)-4 c2A4 중쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 2A4 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라화 및 인간화 항체 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1을 제한 효소 BIpI로 절단한 개소에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트(Clontech사)를 이용하여 삽입하는 것에 의해, c2A4 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-G1/c2A4"라고 명명하였다. c2A4 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 그 중쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 25 및 26(도 28 및 29)에 각각 나타낸다.
c2A4 중쇄용 프라이머 세트
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTCCAGTTGCAGCAATCTGGAGCTG-3'(c2A4-HF: 서열목록의 서열번호 27: 도 30)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3'(c2A4-HR: 서열목록의 서열번호 28: 도 31)
4)-5 c2B1 경쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 2B1 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 실시예 4)-3과 동일한 방법으로 c2B1 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-LK/c2B1"이라고 명명하였다. c2B1 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 그 경쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 29 및 30(도 32 및 33)에 각각 나타낸다.
c2B1 경쇄용 프라이머 세트
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGAAACTGTGATGACCCAGTCTCCCAC-3'(c2B1-LF: 서열목록의 서열번호 31: 도 34)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAATTCCAGCTTGGTGCCTC-3'(c2B1-LR: 서열목록의 서열번호 32: 도 35)
4)-6 c2B1 중쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 2B1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 실시예 4)-4와 동일한 방법으로 c2B1 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-G1/c2B1"이라고 명명하였다. c2B1 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그 중쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 33 및 34(도 36 및 37)에 각각 나타낸다.
c2B1 중쇄용 프라이머 세트
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTG-3'(c2B1-HF: 서열목록의 서열번호 35: 도 38)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGCCTTGGCCCCAG-3'(c2B1-HR: 서열목록의 서열번호 36: 도 39)
4)-7 c7B4 경쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 7B4 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 실시예 4)-3과 동일한 방법으로 c7B4 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-LK/c7B4"라고 명명하였다. c7B4 경쇄의 뉴클레오티드 서열 및 그 경쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 37 및 38(도 40 및 41)에 각각 나타낸다.
c7B4 경쇄용 프라이머 세트
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTC-3'(c7B4-LF: 서열목록의 서열번호 39: 도 42)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG-3'(c7B4-LR: 서열목록의 서열번호 40: 도 43)
4)-8 c7B4 중쇄 발현 벡터의 구축
실시예 3)에서 얻어진 7B4 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 템플릿으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR을 행하는 것에 의해 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 실시예 4)-4와 동일한 방법으로 c7B4 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA-G1/c7B4"라고 명명하였다. c7B4 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 그 중쇄의 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 41 및 42(도 44 및 45)에 각각 나타낸다.
c7B4 중쇄용 프라이머 세트
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGATACACCTGCAGGAGTCAGGACCTG-3'(c7B4-HF: 서열목록의 서열번호 43: 도 46)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACTGAAGCTCCTTGACCCCAG-3'(c7B4-HR: 서열목록의 서열번호 44: 도 47)
4)-9 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체의 조제
4)-9-1 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체의 산생
FreeStyle 293F 세포(Invitrogen사)는 매뉴얼에 따라 계대 및 배양을 행하였다. 대수 증식기의 1.2×109개의 FreeStyle 293F 세포(Invitrogen사)를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING사)에 파종하고, FreeStyle 293 expression medium(Invitrogen사)으로 희석하여 2.0×106 세포/ml로 조제한 후에, 37℃, 8% CO2 인큐베이터 내에서 90rpm으로 1시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine(Polyscience ＃24765) 1.8mg을 Opti-Pro SFM 배지(Invitrogen사) 20ml에 용해시키고, 다음으로 NucleoBond Xtra(TaKaRa사)를 이용하여 조제한 중쇄 발현 벡터(0.24mg) 및 경쇄 발현 벡터(0.36mg)를 20ml의 Opti-Pro SFM 배지(Invitrogen사)에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20ml에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20ml를 첨가하고, 온화하게 교반하고, 5분간 더 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37℃, 8% CO2 인큐베이터에서 4시간 90rpm으로 진탕 배양한 후에 600ml의 EX-CELL VPRO 배지(SAFC Biosciences사), 18ml의 GlutaMAX I(GIBCO사), 및 30ml의 Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO사)를 첨가하고, 37℃, 8% CO2 인큐베이터에서 7일간 90rpm으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter(Advantec ＃CCS-045-E1H)로 여과하였다.
pCMA-G1/c2A4와 pCMA-LK/c2A4의 조합에 의해 취득된 인간 키메라화 2A4를 "c2A4", pCMA-G1/c2B1과 pCMA-LK/c2B1의 조합에 의해 취득된 인간 키메라화 2B1을 "c2B1", pCMA-G1/c7B4와 pCMA-LK/c7B4의 조합에 의해 취득된 인간 키메라화 7B4를 "c7B4"라고 명명하였다.
4)-9-2 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체의 정제
실시예 4)-9-1에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를 rProtein A 어피니티 크로마토그래피(4 내지 6℃하) 1단계 공정으로 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 내지 6℃하에서 실시하였다. PBS로 평형화한 MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience사제)가 충전된 컬럼에 배양 상청을 어플라이하였다. 배양액이 컬럼에 모두 들어간 후, 컬럼 용량 2배 이상의 PBS로 컬럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌 염산염 용액(pH 4.0)으로 용출시켜, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석(Thermo Scientific사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)에 의해 HBSor(25mM 히스티딘/5% 소르비톨, pH 6.0)로의 버퍼 치환을 행하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(분획 분자량 UF10K, Sartorius사, 4℃하)으로 농축하여 IgG 농도를 10mg/ml 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter(Sartorius사)로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 5) 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 in vitro 활성
5)-1 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 플로 사이토메트리에 의한 인간 GPRC5D로의 결합성 검토
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포를 5% FBS 함유 PBS로 5×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 1.2ng/mL 내지 40μg/mL로 조제한 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4) 또는 Human IgG isotype control 항체(CALBIOCHEM사)를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, GPRC5D 항체의 MFI 값으로부터 control 항체의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 산출하였다. 도 48에 나타내는 바와 같이, c2A4, c2B1, 및 c7B4는 인간 GPRC5D에 결합하는 것이 나타났다.
5)-2 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 대한 교차성 검토
5)-2-1 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 벡터(pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D)의 구축
실시예 1)-1-1에서 조제한 pcDNA3.1-DEST 벡터에, Gataway LR Clonase Enzyme mix(Life Technologies사)를 이용하여, 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 단백질(XP_005570249.1)을 코딩하는 cDNA를 클로닝하여 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 벡터 pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D를 구축하였다. 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 벡터의 대량 조제에는, Endofree Plasmid Giga Kit(QIAGEN사)를 이용하였다.
5)-2-2 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포주의 제작
인간 GPRC5D를 발현하고 있지 않는 다발성 골수종 세포주 KMS-11(JCRB 세포 뱅크)을 10% FBS 함유 RPMI1640 배지를 사용하여 3.7×105 세포/mL의 농도로 75cm2 플라스크에 파종하고, pcDNA3.1-DEST-cGPRC5D를 KMS-11 세포에 Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific사)을 이용하여 도입하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 2일간 배양하였다. 배양한 발현 벡터 도입 KMS-11 세포를, 1mg/mL의 제네티신(Thermo Fisher Scientific사) 함유 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 1×106 세포/mL의 농도로 배양하여 약제 스크리닝을 행하였다. 벌크 세포를 1mg/mL의 제네티신(Thermo Fisher Scientific사) 함유 ClonaCell-HY Selection Medium E 배지(StemCell Technologies사)를 사용하여 한계 희석법으로 싱글 클론화하여, 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 다발성 골수종 세포주 KMS-11_cGPRC5D를 수립하였다.
5)-2-3 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 플로 사이토메트리에 의한 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D로의 결합성 검토
실시예 5)-2-2에서 제작한 KMS-11_cGPRC5D 세포를 5% FBS 함유 PBS로 5×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 1.2ng/mL 내지 40μg/mL로 조제한 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4) 또는 Human IgG isotype control 항체(CALBIOCHEM사)를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, GPRC5D 항체의 MFI 값으로부터 control 항체의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 산출하였다. 도 49에 나타내는 바와 같이, c2A4, c2B1, 및 c7B4는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 것이 나타났다. 인간 GPRC5D 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 항체 등은, 의약품의 비임상 개발(전임상 개발)에 유용한 영장류, 특히 사이노몰거스 원숭이를 이용한 유효성이나 안전성에 관한 각종 시험에 제공할 수 있어 바람직하다. 또한, 인간 GPRC5D 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 항체 등은, 세포상해 활성을 가져, 단독으로 또는 본 발명의 분자로서 사이노몰거스 원숭이에 있어서의 암 등의 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
한편, 5)-2와 동일한 방법으로, c2A4, c2B1, 및 c7B4의 래트 GPRC5D 및 마우스 GPRC5D에 대한 교차성을 검토한 바, c2A4, c2B1, 및 c7B4는 어느 것도 래트 GPRC5D 및 마우스 GPRC5D에 결합하지 않았다. 이러한 c2A4, c2B1, 및 c7B4는, 인간 GPRC5D 유전자가 도입된 마우스나 래트의 세포, 조직, 또는 개체(트랜스제닉 동물, 녹아웃 동물, 및 녹인 동물을 포함한다) 및 해당 항체 등을 이용한 각종 어세이, 면역조직화학적 테스트 등을, 숙주인 마우스의 GPRC5D에 의한 영향 없이 실시할 수 있어, 해당 항체 등을 포함하는 의약, 동물약 또는 진단약 등의 마우스나 래트를 이용한 연구 및 비임상 개발상 바람직하다.
5)-3 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 ADCC 활성
실시예 2)-3-1에서 취득한 KHM-1B 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 최종 농도로 0.64ng/mL 내지 2μg/mL가 되도록 조제한, 실시예 4에서 조제한 정제 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4) 및 인간 컨트롤 항체(hIgG1)(CALBIOCHEM사)를 50μL/well로 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 실시예 1)-5-3에서 조제(3×106 세포/mL가 되도록 조제)한 이펙터 세포를 100μL/well로 추가로 첨가하고, 실온에서 1200rpm×3분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양하였다. 상청 50μL를 LumaPlate(PerkinElmer사)에 회수하고, 50℃에서 하룻밤 건조시키고, 플레이트 리더(TopCount: PerkinElmer사)로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 실시예 1)-5-5에 따라 산출하였다. 도 50에 나타내는 바와 같이, c2A4, c2B1, 및 c7B4는 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 6) 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)의 in vivo 활성
1×107 세포의 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포를 100% 마트리겔(BD사)로 현탁시키고, BALB/c-nu/nu 마우스(CanN. Cg-Foxn1nu/CrlCrlj, 일본 찰즈 리버사부터 구입)의 겨드랑이부 피하에 이식하였다. 이식 3 및 10일 후에 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2A4, c2B1, 및 c7B4)를 10mg/kg으로 담암 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다(n = 12 또는 11). 이식 종양의 장경 및 단경을 주 2회, 전자 디지털 캘리퍼(주식회사 미쓰토요제)를 이용하여 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적(mm3) = 1/2×단경(mm)×단경(mm)×장경(mm)
c2A4 항체의 결과를 도 51에 나타내었다. 이식 21일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 96%였다.
c2B1 항체의 결과를 도 52에 나타내었다. 이식 21일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 95%였다.
c7B4 항체의 결과를 도 53에 나타내었다. 이식 21일 후에 있어서의 종양 증식 억제율은 94%였다.
(실시예 7) 인간 키메라화 항-GPRC5D 항체(c2B1 및 c7B4)의 인간화 버전(h2B1 및 h7B4)의 설계
7)-1 항-GPRC5D 항체 2B1의 인간화체 디자인
7)-1-1 2B1의 가변 영역의 분자 모델링
2B1의 가변 영역의 분자 모델링은 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))에 의해 실행되었다. Protein Data Bank(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))에 등록된 인간 면역글로불린의 가변 영역의 1차 서열(X선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다)을, 위에서 결정된 2B1의 가변 영역과 비교하였다. 결과로서 3MBX가 2B1의 중쇄와 경쇄의 가변 영역에 대해서 가장 높은 서열 동일성을 갖는다고 하여 선택되었다. 프레임워크 영역의 삼차원 구조는, 2B1의 중쇄 및 경쇄에 대응하는 3MBX의 좌표를 조합하여 "프레임워크 모델"을 얻음으로써 제작되었다. 이어서, 각각의 CDR에 대한 대표적인 콘퍼메이션이 프레임워크 모델에 혼입되었다. 마지막으로, 에너지의 점에서 2B1의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자간 접촉을 제외하기 위한 에너지 계산을 행하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate(Schrodinger사제)를 이용하여 행하였다.
7)-1-2 인간화 h2B1에 대한 아미노산 서열의 설계
인간화 h2B1의 구축을, CDR 그래프팅(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 행하였다. 억셉터 항체는 프레임워크 영역 내의 아미노산 동일성에 기초하여 선택되었다.
2B1의 프레임워크 영역의 서열을, KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 있어서 규정되는 인간의 서브그룹 컨센서스 서열이나 Germline 서열의 프레임워크 영역과 비교하였다. 결과로서, 중쇄에 대해서는 인간 Germline 서열 IGHV2_5x08 및 IGHJ1x01과 인간 gamma쇄 서브그룹 2의 컨센서스 서열이, 경쇄에 대해서는 인간 Germline 서열 IGKV1_8x01 및 IGKJ4x01과 인간 kappa쇄 서브그룹 4의 컨센서스 서열이, 그 프레임워크 영역에 있어서 높은 서열 동일성을 갖는 것에 기인하여 억셉터로서 선택되었다. 억셉터에 대한 프레임워크 영역의 아미노산 잔기를 2B1에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 위에서 구축된 2B1의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 의해 주어지는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 h2B1의 서열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다. 한편, 중쇄에 관해서는 도너 잔기에 한정하지 않고, 개소에 따라서는 gamma쇄 서브그룹 1의 컨센서스 서열의 잔기를 이입하였다.
7)-1-3 2B1 중쇄의 인간화
7)-1-3-1 인간화 h2B1_H1 타입 중쇄
서열번호 34에 나타내는 키메라 c2B1의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 트레오닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 5째의 라이신을 바린으로, 아미노산 번호 9째의 프롤린을 글라이신으로, 아미노산 번호 11째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 13째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 50째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 51째의 알라닌을 글라이신으로, 아미노산 번호 66째의 아르기닌을 라이신으로, 아미노산 번호 67째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 69째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 73째의 라이신을 바린으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 라이신으로, 아미노산 번호 81째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 84째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 85째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 86째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 아스파르트산을 트레오닌으로, 아미노산 번호 89째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 94째의 트레오닌을 바린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 중쇄를 "인간화 h2B1_H1 타입 중쇄"("h2B1_H1"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_H1 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 74(도 83)에 기재되어 있다. 서열번호 74의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 73(도 82)에 기재되어 있다.
7)-1-3-2 인간화 h2B1_H2 타입 중쇄
서열번호 34에 나타내는 키메라 c2B1의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 트레오닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 5째의 라이신을 바린으로, 아미노산 번호 9째의 프롤린을 글라이신으로, 아미노산 번호 11째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 13째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 50째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 51째의 알라닌을 글라이신으로, 아미노산 번호 66째의 아르기닌을 라이신으로, 아미노산 번호 67째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 69째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 81째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 84째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 85째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 86째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 아스파르트산을 트레오닌으로, 아미노산 번호 89째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 94째의 트레오닌을 바린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 중쇄를 "인간화 h2B1_H2 타입 중쇄"("h2B1_H2"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_H2 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 76(도 85)에 기재되어 있다. 서열번호 76의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 75(도 84)에 기재되어 있다.
7)-1-3-3 인간화 h2B1_H3 타입 중쇄
서열번호 34에 나타내는 키메라 c2B1의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 트레오닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 5째의 라이신을 바린으로, 아미노산 번호 9째의 프롤린을 글라이신으로, 아미노산 번호 11째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 13째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 50째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 66째의 아르기닌을 라이신으로, 아미노산 번호 67째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 69째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 81째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 84째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 85째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 86째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 아스파르트산을 트레오닌으로, 아미노산 번호 89째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 94째의 트레오닌을 바린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 중쇄를 "인간화 h2B1_H3 타입 중쇄"("h2B1_H3"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_H3 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 78(도 87)에 기재되어 있다. 서열번호 78의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 77(도 86)에 기재되어 있다.
7)-1-3-4 인간화 h2B1_H4 타입 중쇄
서열번호 34에 나타내는 키메라 c2B1의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 10째의 글라이신을 알라닌으로, 아미노산 번호 11째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 13째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 15째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 19째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 62째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 66째의 아르기닌을 라이신으로, 아미노산 번호 67째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 72째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 81째의 페닐알라닌을 바린으로, 아미노산 번호 83째의 라이신을 트레오닌으로, 아미노산 번호 84째의 아이소류신을 메티오닌으로, 아미노산 번호 87째의 바린을 메티오닌으로, 아미노산 번호 89째의 트레오닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 90째의 알라닌을 바린으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 중쇄를 "인간화 h2B1_H4 타입 중쇄"("h2B1_H4"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_H4 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 80(도 89)에 기재되어 있다. 서열번호 80의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 79(도 88)에 기재되어 있다.
7)-1-4 2B1 경쇄의 인간화
7)-1-4-1 인간화 h2B1_L1 타입 경쇄
서열번호 30에 나타내는 키메라 c2B1의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 9째의 트레오닌을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 11째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 13째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 15째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 21째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 39째의 트레오닌을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 63째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 67째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78째의 바린을 류신으로, 아미노산 번호 79째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 83째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 100째의 글라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 104째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 106째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 경쇄를 "인간화 h2B1_L1 타입 경쇄"("h2B1_L1"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_L1 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 64(도 73)에 기재되어 있다. 서열번호 64의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 63(도 72)에 기재되어 있다.
7)-1-4-2 인간화 h2B1_L2 타입 경쇄
서열번호 30에 나타내는 키메라 c2B1의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 9째의 트레오닌을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 11째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 13째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 15째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 21째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 39째의 트레오닌을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 63째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 69째의 아르기닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78째의 바린을 류신으로, 아미노산 번호 79째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 83째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 100째의 글라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 104째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 106째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 경쇄를 "인간화 h2B1_L2 타입 경쇄"("h2B1_L2"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_L2 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 66(도 75)에 기재되어 있다. 서열번호 66의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 65(도 74)에 기재되어 있다.
7)-1-4-3 인간화 h2B1_L3 타입 경쇄
서열번호 30에 나타내는 키메라 c2B1의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 9째의 트레오닌을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 11째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 13째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 15째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 21째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 39째의 트레오닌을 라이신으로, 아미노산 번호 43째의 세린을 프롤린으로, 아미노산 번호 63째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78째의 바린을 류신으로, 아미노산 번호 79째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 83째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 100째의 글라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 104째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 106째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 경쇄를 "인간화 h2B1_L3 타입 경쇄"("h2B1_L3"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_L3 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 68(도 77)에 기재되어 있다. 서열번호 68의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 67(도 76)에 기재되어 있다.
7)-1-4-4 인간화 h2B1_L4 타입 경쇄
서열번호 30에 나타내는 키메라 c2B1의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 9째의 트레오닌을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 11째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 12째의 세린을 알라닌으로, 아미노산 번호 13째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 15째의 아이소류신을 류신으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 21째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 39째의 트레오닌을 라이신으로, 아미노산 번호 63째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78째의 바린을 류신으로, 아미노산 번호 79째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 83째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 100째의 글라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 104째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 106째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 경쇄를 "인간화 h2B1_L4 타입 경쇄"("h2B1_L4"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_L4 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 70(도 79)에 기재되어 있다. 서열번호 70의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 69(도 78)에 기재되어 있다.
7)-1-4-5 인간화 h2B1_L5 타입 경쇄
서열번호 30에 나타내는 키메라 c2B1의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 알라닌으로, 아미노산 번호 3째의 바린을 아르기닌으로, 아미노산 번호 9째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 11째의 메티오닌을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 13째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 15째의 아이소류신을 트레오닌으로, 아미노산 번호 17째의 글루탐산을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 21째의 류신을 아이소류신으로, 아미노산 번호 22째의 아스파라긴을 트레오닌으로, 아미노산 번호 39째의 트레오닌을 라이신으로, 아미노산 번호 42째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 60째의 아스파르트산을 세린으로, 아미노산 번호 63째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 77째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 78째의 바린을 류신으로, 아미노산 번호 79째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 80째의 알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 83째의 류신을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85째의 바린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 104째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 106째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h2B1 경쇄를 "인간화 h2B1_L5 타입 경쇄"("h2B1_L5"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h2B1_L5 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 72(도 81)에 기재되어 있다. 서열번호 72의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 71(도 80)에 기재되어 있다.
7)-2 항-GPRC5D 항체 7B4의 인간화체 디자인
7)-2-1 7B4의 가변 영역의 분자 모델링
7B4의 가변 영역의 분자 모델링은 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))에 의해 실행되었다. Protein Data Bank(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))에 등록된 인간 면역글로불린의 가변 영역의 1차 서열(X선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다)을, 위에서 결정된 7B4의 가변 영역과 비교하였다. 결과로서 1BGX가 7B4의 중쇄와 경쇄의 가변 영역에 대해서 가장 높은 서열 동일성을 갖는다고 하여 선택되었다. 프레임워크 영역의 삼차원 구조는, 7B4의 중쇄 및 경쇄에 대응하는 1BGX의 좌표를 조합하여 "프레임워크 모델"을 얻음으로써 제작되었다. 이어서, 각각의 CDR에 대한 대표적인 콘퍼메이션이 프레임워크 모델에 혼입되었다. 마지막으로, 에너지의 점에서 7B4의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자간 접촉을 제외하기 위한 에너지 계산을 행하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate(Schrodinger사제)를 이용하여 행하였다.
7)-2-2 인간화 h7B4에 대한 아미노산 서열의 설계
인간화 h7B4의 구축을, CDR 그래프팅(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 행하였다. 억셉터 항체는 프레임워크 영역 내의 아미노산 동일성에 기초하여 선택되었다.
7B4의 프레임워크 영역의 서열을, KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 있어서 규정되는 인간의 서브그룹 컨센서스 서열이나 Germline 서열의 프레임워크 영역과 비교하였다. 결과로서, 중쇄에 대해서는 인간 gamma쇄 서브그룹 2의 컨센서스 서열이, 경쇄에 대해서는 인간 kappa쇄 서브그룹 3의 컨센서스 서열이, 그 프레임워크 영역에 있어서 높은 서열 동일성을 갖는 것에 기인하여 억셉터로서 선택되었다. 억셉터에 대한 프레임워크 영역의 아미노산 잔기를 7B4에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 위에서 구축된 7B4의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 의해 주어지는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 h7B4의 서열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다. 한편, 경쇄에 관해서는 도너 잔기에 한정하지 않고, 개소에 따라서는 kappa쇄 서브그룹 1의 컨센서스 서열의 잔기를 이입하였다.
7)-2-3 7B4 중쇄의 인간화
7)-2-3-1 인간화 h7B4_H1 타입 중쇄
서열번호 42에 나타내는 키메라 c7B4의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 2째의 아이소류신을 바린으로, 아미노산 번호 3째의 히스티딘을 글루타민으로, 아미노산 번호 17째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 23째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 25째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 40째의 라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 41째의 페닐알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 44째의 아스파라긴을 라이신으로, 아미노산 번호 45째의 라이신을 글라이신으로, 아미노산 번호 46째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 49째의 메티오닌을 아이소류신으로, 아미노산 번호 68째의 아이소류신을 바린으로, 아미노산 번호 69째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 71째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 80째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 82째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 84째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 89째의 글루탐산을 알라닌으로, 아미노산 번호 93째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 117째의 알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 118째의 세린을 류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 중쇄를 "인간화 h7B4_H1 타입 중쇄"("h7B4_H1"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_H1 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 86(도 95)에 기재되어 있다. 서열번호 86의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 85(도 94)에 기재되어 있다.
7)-2-3-2 인간화 h7B4_H2 타입 중쇄
서열번호 42에 나타내는 키메라 c7B4의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 히스티딘을 글루타민으로, 아미노산 번호 17째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 23째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 25째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 40째의 라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 41째의 페닐알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 44째의 아스파라긴을 라이신으로, 아미노산 번호 45째의 라이신을 글라이신으로, 아미노산 번호 46째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 49째의 메티오닌을 아이소류신으로, 아미노산 번호 50째의 알라닌을 글라이신으로, 아미노산 번호 68째의 아이소류신을 바린으로, 아미노산 번호 69째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 71째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 80째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 82째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 84째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 89째의 글루탐산을 알라닌으로, 아미노산 번호 93째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 117째의 알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 118째의 세린을 류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 중쇄를 "인간화 h7B4_H2 타입 중쇄"("h7B4_H2"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_H2 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 88(도 97)에 기재되어 있다. 서열번호 88의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 87(도 96)에 기재되어 있다.
7)-2-3-3 인간화 h7B4_H3 타입 중쇄
서열번호 42에 나타내는 키메라 c7B4의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 히스티딘을 글루타민으로, 아미노산 번호 17째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 23째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 25째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 40째의 라이신을 글루타민으로, 아미노산 번호 41째의 페닐알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 44째의 아스파라긴을 라이신으로, 아미노산 번호 45째의 라이신을 글라이신으로, 아미노산 번호 46째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 49째의 메티오닌을 아이소류신으로, 아미노산 번호 68째의 아이소류신을 바린으로, 아미노산 번호 69째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 71째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 80째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 82째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 84째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 89째의 글루탐산을 알라닌으로, 아미노산 번호 93째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 117째의 알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 118째의 세린을 류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 중쇄를 "인간화 h7B4_H3 타입 중쇄"("h7B4_H3"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_H3 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 90(도 99)에 기재되어 있다. 서열번호 90의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 89(도 98)에 기재되어 있다.
7)-2-3-4 인간화 h7B4_H5 타입 중쇄
서열번호 42에 나타내는 키메라 c7B4의 중쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 3째의 히스티딘을 글루타민으로, 아미노산 번호 17째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 23째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 25째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 41째의 페닐알라닌을 프롤린으로, 아미노산 번호 49째의 메티오닌을 아이소류신으로, 아미노산 번호 68째의 아이소류신을 바린으로, 아미노산 번호 69째의 세린을 트레오닌으로, 아미노산 번호 71째의 트레오닌을 세린으로, 아미노산 번호 80째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 82째의 글루타민을 라이신으로, 아미노산 번호 84째의 아스파라긴을 세린으로, 아미노산 번호 88째의 트레오닌을 알라닌으로, 아미노산 번호 89째의 글루탐산을 알라닌으로, 아미노산 번호 93째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 117째의 알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 118째의 세린을 류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 중쇄를 "인간화 h7B4_H5 타입 중쇄"("h7B4_H5"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_H5 타입 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 92(도 101)에 기재되어 있다. 서열번호 92의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 91(도 100)에 기재되어 있다.
7)-2-4 7B4 경쇄의 인간화
7)-2-4-1 인간화 h7B4_L1 타입 경쇄
서열번호 38에 나타내는 키메라 c7B4의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 1째의 아스파르트산을 글루탐산으로, 아미노산 번호 3째의 글루타민을 바린으로, 아미노산 번호 4째의 메티오닌을 류신으로, 아미노산 번호 9째의 세린을 글라이신으로, 아미노산 번호 10째의 페닐알라닌을 트레오닌으로, 아미노산 번호 13째의 알라닌을 류신으로, 아미노산 번호 15째의 바린을 프롤린으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 40째의 류신을 프롤린으로, 아미노산 번호 42째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 45째의 라이신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 60째의 세린을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 77째의 글라이신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 79째의 글루타민을 글루탐산으로, 아미노산 번호 83째의 바린을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 87째의 페닐알라닌을 티로신으로, 아미노산 번호 99째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 105째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 경쇄를 "인간화 h7B4_L1 타입 경쇄"("h7B4_L1"이라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_L1 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 82(도 91)에 기재되어 있다. 서열번호 82의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 81(도 90)에 기재되어 있다.
7)-2-4-2 인간화 h7B4_L2 타입 경쇄
서열번호 38에 나타내는 키메라 c7B4의 경쇄 중 가변 영역 부분의 아미노산 번호 10째의 페닐알라닌을 세린으로, 아미노산 번호 13째의 알라닌을 류신으로, 아미노산 번호 15째의 바린을 프롤린으로, 아미노산 번호 19째의 바린을 알라닌으로, 아미노산 번호 40째의 류신을 프롤린으로, 아미노산 번호 42째의 글루탐산을 글루타민으로, 아미노산 번호 45째의 라이신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 60째의 세린을 아스파르트산으로, 아미노산 번호 77째의 글라이신을 아르기닌으로, 아미노산 번호 79째의 글루타민을 글루탐산으로, 아미노산 번호 83째의 바린을 페닐알라닌으로, 아미노산 번호 85째의 트레오닌을 바린으로, 아미노산 번호 87째의 페닐알라닌을 티로신으로, 아미노산 번호 99째의 알라닌을 글루타민으로, 아미노산 번호 103째의 류신을 바린으로, 아미노산 번호 105째의 류신을 아이소류신으로 치환하는 것을 수반하여 설계된 인간화 h7B4 경쇄를 "인간화 h7B4_L2 타입 경쇄"("h7B4_L2"라고 부르는 경우도 있다)라고 명명하였다.
인간화 h7B4_L2 타입 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 84(도 93)에 기재되어 있다. 서열번호 84의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 83(도 92)에 기재되어 있다.
(실시예 8) 래트 항-인간 GPRC5D 항체(2B1 및 7B4)의 인간화 항체(h2B1 및 h7B4)의 발현 벡터의 구축과 항체의 조제
8)-1 h2B1의 중쇄 발현 벡터의 구축
8)-1-1 h2B1_H1 타입 중쇄의 구축
서열번호 73에 나타내는 h2B1_H1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h2B1_H1의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h2B1_H1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_H1"이라고 명명하였다.
8)-1-2 h2B1_H2 타입 중쇄의 구축
서열번호 75에 나타내는 h2B1_H2의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h2B1_H2의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1을 제한 효소 BlpI로 절단한 개소에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트(Clontech사)를 이용하여 삽입하는 것에 의해 h2B1_H2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_H2"라고 명명하였다.
8)-1-3 h2B1_H3 타입 중쇄의 구축
서열번호 77에 나타내는 h2B1_H3의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h2B1_H3의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h2B1_H3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_H3"이라고 명명하였다.
8)-1-4 h2B1_H4 타입 중쇄의 구축
서열번호 79에 나타내는 h2B1_H4의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h2B1_H4의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h2B1_H4 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_H4"라고 명명하였다.
8)-2 h2B1의 경쇄 발현 벡터의 구축
8)-2-1 h2B1_L1 타입 경쇄의 구축
서열번호 63에 나타내는 h2B1_L1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381로 나타나는 h2B1_L1의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK를 제한 효소 BsiWI로 절단한 개소에 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트(Clontech사)를 이용하여 삽입하는 것에 의해 h2B1_L1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_L1"이라고 명명하였다.
8)-2-2 h2B1_L2 타입 경쇄의 구축
서열번호 65에 나타내는 h2B1_L2의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381로 나타나는 h2B1_L2의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h2B1_L2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_L2"라고 명명하였다.
8)-2-3 h2B1_L3 타입 경쇄의 구축
서열번호 67에 나타내는 h2B1_L3의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381로 나타나는 h2B1_L3의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h2B1_L3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_L3"이라고 명명하였다.
8)-2-4 h2B1_L4 타입 경쇄의 구축
서열번호 69에 나타내는 h2B1_L4의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381로 나타나는 h2B1_L4의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h2B1_L4 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_L4"라고 명명하였다.
8)-2-5 h2B1_L5 타입 경쇄의 구축
서열번호 71에 나타내는 h2B1_L5의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 381로 나타나는 h2B1_L5의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h2B1_L5 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h2B1_L5"라고 명명하였다.
8)-3 h7B4의 중쇄 발현 벡터의 구축
8)-3-1 h7B4_H1 타입 중쇄의 구축
서열번호 85에 나타내는 h7B4_H1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h7B4_H1의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h7B4_H1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_H1"이라고 명명하였다.
8)-3-2 h7B4_H2 타입 중쇄의 구축
서열번호 87에 나타내는 h7B4_H2의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h7B4_H2의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h7B4_H2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_H2"라고 명명하였다.
8)-3-3 h7B4_H3 타입 중쇄의 구축
서열번호 89에 나타내는 h7B4_H3의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h7B4_H3의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h7B4_H3 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_H3"이라고 명명하였다.
8)-3-4 h7B4_H5 타입 중쇄의 구축
서열번호 91에 나타내는 h7B4_H5의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 426으로 나타나는 h7B4_H5의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-1-1과 동일한 방법으로 h7B4_H5 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_H5"라고 명명하였다.
8)-4 h7B4의 경쇄 발현 벡터의 구축
8)-4-1 h7B4_L1 타입 경쇄의 구축
서열번호 90에 나타내는 h7B4_L1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 378로 나타나는 h7B4_L1의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h7B4_L1 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_L1"이라고 명명하였다.
8)-4-2 h7B4_L2 타입 경쇄의 구축
서열번호 92에 나타내는 h7B4_L2의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 378로 나타나는 h7B4_L2의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 유전자 합성 서비스). 실시예 8)-2-1과 동일한 방법으로 h7B4_L2 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pCMA/h7B4_L2"라고 명명하였다.
8)-5 인간화 항체(h2B1 및 h7B4)의 조제(FreeStyle 293F 세포)
8)-5-1 인간화 항체(h2B1 및 h7B4)의 소규모 생산
FreeStyle 293F 세포(Invitrogen사)는 매뉴얼에 따라 계대 및 배양을 행하였다.
대수 증식기의 1×107개의 FreeStyle 293F 세포(Invitrogen사)를 FreeStyle 293 expression medium(Invitrogen사)으로 9.6mL로 희석한 후에, 30mL Square Storage Bottle(Nalgene사)에 파종하고, 37℃, 8% CO2 인큐베이터 내에서 90rpm으로 1시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine(Polyscience ＃24765) 30μg을 Opti-Pro SFM(Invitrogen사) 200μL에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트(Invitrogen사)를 이용하여 조제한 중쇄 발현 벡터(4μg) 및 경쇄 발현 벡터(6μg)를 Opti-Pro SFM(Invitrogen사) 200μL에 첨가하였다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 200μL에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 200μL를 첨가하고, 온화하게 교반하고, 5분간 더 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37℃, 8% CO2 인큐베이터에서 7일간 90rpm으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Minisart-Plus filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
pCMA/h2B1_H1과 pCMA/h2B1_L1의 조합으로 h2B1_H1/L1을 취득하였다. pCMA/h2B1_H1과 pCMA/h2B1_L2의 조합으로 h2B1_H1/L2를 취득하였다. pCMA/h2B1_H2와 pCMA/h2B1_L2의 조합으로 h2B1_H2/L2를 취득하였다. pCMA/h2B1_H2와 pCMA/h2B1_L3의 조합으로 h2B1_H2/L3을 취득하였다. pCMA/h2B1_H2와 pCMA/h2B1_L4의 조합으로 h2B1_H2/L4를 취득하였다. pCMA/h2B1_H2와 pCMA/h2B1_L5의 조합으로 h2B1_H2/L5를 취득하였다. pCMA/h2B1_H3과 pCMA/h2B1_L3의 조합으로 h2B1_H3/L3을 취득하였다. pCMA/h2B1_H3과 pCMA/h2B1_L4의 조합으로 h2B1_H3/L4를 취득하였다. pCMA/h2B1_H3과 pCMA/h2B1_L5의 조합으로 h2B1_H3/L5를 취득하였다. pCMA/h2B1_H4와 pCMA/h2B1_L1의 조합으로 h2B1_H4/L1을 취득하였다. pCMA/h2B1_H4와 pCMA/h2B1_L3의 조합으로 h2B1_H4/L3을 취득하였다. pCMA/h2B1_H4와 pCMA/h2B1_L4의 조합으로 h2B1_H4/L4를 취득하였다. pCMA/h2B1_H4와 pCMA/h2B1_L5의 조합으로 h2B1_H4/L5를 취득하였다. pCMA/h7B4_H1과 pCMA/h7B4_L2의 조합으로 h7B4_H1/L2를 취득하였다. pCMA/h7B4_H2와 pCMA/h7B4_L2의 조합으로 h7B4_H2/L2를 취득하였다. pCMA/h7B4_H3과 pCMA/h7B4_L1의 조합으로 h7B4_H3/L1을 취득하였다. pCMA/h7B4_H3과 pCMA/h7B4_L2의 조합으로 h7B4_H3/L2를 취득하였다. pCMA/h7B4_H5와 pCMA/h7B4_L1의 조합으로 h7B4_H5/L1을 취득하였다.
8)-5-2 인간화 항체(h2B1 및 h7B4)의 생산
실시예 4)-9-1과 동일한 방법으로 생산하였다. 즉, pCMA/h2B1_H1과 pCMA/h2B1_L1의 조합으로 h2B1_H1/L1을 취득하였다. pCMA/h2B1_H2와 pCMA/h2B1_L5의 조합으로 h2B1_H2/L5를 취득하였다. pCMA/h2B1_H4와 pCMA/h2B1_L5의 조합으로 h2B1_H4/L5를 취득하였다. pCMA/h7B4_H1과 pCMA/h7B4_L2의 조합으로 h7B4_H1/L2를 취득하였다. pCMA/h7B4_H3과 pCMA/h7B4_L1의 조합으로 h7B4_H3/L1을 취득하였다.
8)-5-3 인간화 항체(h2B1 및 h7B4)의 정제
실시예 8)-5-2에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를 rProtein A 어피니티 크로마토그래피(4 내지 6℃하)와 세라믹 하이드록시아파타이트(실온하)의 2단계 공정으로 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록시아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 내지 6℃하에서 실시하였다. PBS로 평형화한 MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience사제, HiTrap 컬럼)에 배양 상청을 어플라이하였다. 배양 상청이 컬럼에 모두 들어간 후, 컬럼 용량 2배 이상의 PBS로 컬럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌 염산염 용액(pH 4.0)으로 용출시켜, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석(Thermo Scientific사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)에 의해 PBS로 치환한 후, 5mM 인산 나트륨/50mM MES/pH 7.0의 버퍼로 5배 희석한 항체 용액을, 5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH 7.0의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(일본 바이오-래드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)에 어플라이하였다. 염화 나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석(Thermo Scientificsha, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)에 의해 HBSor(25mM 히스티딘/5% 소르비톨, pH 6.0)로의 버퍼 치환을 행하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(분획 분자량 UF10K, Sartorius사, 4℃하)으로 농축하여 IgG 농도를 10mg/ml 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter(Sartorius사)로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
(실시예 9) 인간화 항-GPRC5D 항체의 in vitro 활성 평가
9)-1 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1_H1/L1 내지 h2B1_H4/L5 또는 h7B4_H1/L2 내지 h7B4_H5/L1)의 플로 사이토메트리에 의한 인간 GPRC5D로의 결합성 평가
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포를 5% FBS 함유 PBS로 2×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 실시예 8)-3-1에서 얻어진 인간화 항-GPRC5D 항체의 배양 상청 또는 Human IgG isotype control 항체(CALBIOCHEM사)를 14ng/mL 내지 30μg/mL로 조제한 것을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, GPRC5D 항체의 MFI 값으로부터 control 항체의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 산출하였다. 도 102가 인간화 항-GPRC5D 항체 h2B1_H1/L1 내지 h2B1_H4/L5, 도 103이 인간화 항-GPRC5D 항체 h7B4_H1/L2 내지 h7B4_H5/L1의 결과이다. 도 102와 도 103에 나타내는 바와 같이, 인간화 항-GPRC5D 항체는 인간 GPRC5D에 결합하는 것이 나타났다.
9)-2 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1_H1/L1 내지 h2B1_H4/L5 또는 h7B4_H1/L2 내지 h7B4_H5/L1)의 플로 사이토메트리에 의한 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D로의 결합성 평가
실시예 5)-2-2에서 제작한 KMS-11_cGPRC5D 세포를 이용하여, 실시예 9)-1과 동일한 방법으로 염색·해석을 실시하였다. 도 201과 도 202에 나타내는 바와 같이, 인간화 항-GPRC5D 항체는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 것이 나타났다.
9)-3 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 및 h7B4_H3/L1)의 ADCC 활성 평가
실시예 2)-3-1에서 취득한 KHM-1B 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 최종 농도로 0.15ng/mL 내지 15μg/mL가 되도록 조제한 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 및 h7B4_H3/L1) 및 인간 컨트롤 항체(hIgG1)(CALBIOCHEM사)를 50μL/well로 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 실시예 1)-5-3에서 조제한 이펙터 세포를 100μL/well로 추가로 첨가하고, 실온에서 1200rpm×3분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양하였다. 상청 50μL를 LumaPlate(PerkinElmer사)에 회수하고, 50℃에서 하룻밤 건조시키고, 플레이트 리더(TopCount: PerkinElmer사)로 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 실시예 1)-5-5에 따라 산출하였다. 도 104에 나타내는 바와 같이, h2B1_H1/L1, h2B1_H2/L5, h2B1_H4/L5, h7B4_H1/L2 및 h7B4_H3/L1은 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다.
(실시예 10) 인간 항체 파지 라이브러리 유래 항-GPRC5D 항체의 취득, 및 결합 활성 평가
10)-1 GPRC5D 결합 활성을 갖는 scFv의 단리
인간 항체 파지 라이브러리로부터, 인간 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 scFv를 단리하였다. 카복실 말단을 비오틴화한, 인간(서열목록의 서열번호 2: 도 3) 또는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드(펩티드 연구소에서 합성)를 고상화한 Dynabeads Streptavidin M-280(Thermo Scientific사)에 파지를 첨가하고, 결합하지 않는 파지를 마그넷 스탠드(DynaMag-2, Thermo Scientific사)를 이용한 세정 조작에 의해 제거하였다. 이용한 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드의 서열은 이하와 같다.
사이노몰거스 원숭이 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드: MYKDCIESTGDYFLPCDSEGPWGIVLEK(Biotin)-NH2(서열목록의 서열번호 93: 도 105)
그 후, GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 결합한 파지를 대장균(XL-1 Blue, 아질렌트 테크놀로지스사)에 감염시키고, GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 결합하는 파지를 회수·증폭하였다. 혹은, 1)-1-1 및 5)-2-1에서 조제한 GPRC5D 발현 벡터를 이용하여, 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D를 일과성으로 발현시킨 Expi293F 세포(Thermo Scientific사)에 파지를 첨가하고, 결합하지 않는 파지를 세정 조작에 의해 제거하였다. 그 후, GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 결합한 파지를 대장균에 감염시키고, GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 결합하는 파지를 회수·증폭하였다. 펩티드 또는 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D를 일과성으로 발현시킨 Expi293F 세포에 대한 합계 3회의 패닝을 실시하고, 폴리클로널인 파지미드로부터, scFv의 카복실 말단에 FLAG 태그 및 His 태그를 부가하는 대장균용 발현 벡터로 바꿔 놓은 후, 대장균을 형질전환하고, IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(Sigma-Aldrich사) 존재하에서 scFv를 발현시켜, ELISA에 의한 스크리닝에 제공하였다.
10)-2 ELISA에 의한 GPRC5D 결합 scFv의 스크리닝
384웰 Maxi-sorp plate(Black, Nunc사)에 PBS(0.138M 염화 나트륨 및 0.0027M 염화 칼륨을 함유하는 0.01M 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4), Sigma-Aldrich사)로 1μg/mL로 희석한 NeutrAvidin(Life Technologies사)을 50μL씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. Tween-20(바이오-래드사)을 0.05% 포함하는 PBS(ELISA 버퍼)로 3회 세정 후, PBS로 1μg/mL로 희석한, 실시예 10)-1에서도 이용한 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 비오틴화 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드를 첨가하고 1시간 실온에서 진탕하였다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, Blocker Casein(Thermo Scientific사)으로 블로킹하고, ELISA 버퍼로 3회 세정하였다. 그 후, scFv를 발현시킨 대장균의 배양액을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, ELISA 버퍼로 5000배로 희석한 Horseradish peroxidase(HRP) 표지 항-FLAG 항체(Sigma-Aldrich사)를 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 5회 세정 후, SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate(Thermo Scientific사)를 첨가하고, 10분 후의 화학 발광을 플레이트 리더(Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer)로 측정하고, GPRC5D 결합 scFv를 분리하였다.
10)-3 ELISA 양성 클론의 뉴클레오티드 서열의 결정
ELISA 양성 클론(C2037, C3048, C3015, 및 C3022)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열의 해석은 Dye Terminator법(BigDye(등록상표) Terminator v3.1, Thermo Scientific사)으로 실시하였다. 서열 해석에 이용한 프라이머 서열은 이하와 같다.
Primer A: 5'-CTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGA-3'(서열목록의 서열번호 94: 도 106)
Primer B: 5'-ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3'(서열목록의 서열번호 95: 도 107)
상기 해석에 의해, C2037 항체, C3048 항체, C3015 항체, 및 C3022 항체의 유전자의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.
결정된 C2037의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 96(도 108)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 97(도 109)에 나타내었다.
결정된 C2037의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 98(도 110)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 99(도 111)에 나타내었다.
결정된 C3048의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 100(도 112)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 101(도 113)에 나타내었다.
결정된 C3048의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 102(도 114)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 103(도 115)에 나타내었다.
결정된 C3015의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 104(도 116)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 105(도 117)에 나타내었다.
결정된 C3015의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 106(도 118)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 107(도 119)에 나타내었다.
결정된 C3022의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 108(도 120)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 109(도 121)에 나타내었다.
결정된 C3022의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 110(도 122)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 135(도 123)에 나타내었다.
10)-4 scFv의 발현 정제
C2037 항체, C3048 항체, C3015 항체 또는 C3022 항체의 scFv를 pcDNA3.1(Thermo Scientific사) 등의 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하여 동물 세포용 scFv 발현 벡터를 구축하였다. Expi293F 세포(Thermo Scientific사)에 상기의 동물 세포용 scFv 발현 벡터를 도입하여 일과성 발현시키고, 필요에 따라서 배양 상청으로부터 scFv를 His Trap 컬럼(GE Healthcare사) 및 겔 여과 컬럼(Superdex 200 Increase, GE Healthcare사)으로 정제하고, scFv가 용해되어 있는 완충액을 PBS로 치환하여, 이하의 공정 "10)-6"에 제공하였다.
10)-5 완전장 IgG화와 IgG의 발현 정제
C2037, C3048, C3015 및 C3022를 포함하는 완전장 IgG화체의 제작은 이하의 방법으로 실시하였다.
상기 10)-3에서 특정한 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 상당하는 뉴클레오티드 서열을, 통상적 방법에 의해, 인간 IgG1의 중쇄의 정상 영역(CH1 + Fc 영역: 서열목록의 서열번호 144(도 156)로 나타나는 아미노산 서열의 135 내지 464번째의 아미노산 서열)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 인간 IgG1의 경쇄의 정상 영역(CL: 서열목록의 서열번호 145(도 157)로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 서열)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 연결하고, pcDNA3.1(Thermo Scientific사) 등의 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하여 동물 세포용 IgG 발현 벡터를 구축하였다.
구축한 IgG 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열을 재해석하여, C2037 항체의 중쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 136(도 148)으로 나타나는 뉴클레오티드 서열이고, 경쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 137(도 149)로 나타나는 뉴클레오티드 서열인 것을 확인하였다.
C3048 항체의 중쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 138(도 150)로 나타나는 뉴클레오티드 서열이고, 경쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 139(도 151)로 나타나는 뉴클레오티드 서열인 것을 확인하였다.
C3015 항체의 중쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 140(도 152)으로 나타나는 뉴클레오티드 서열이고, 경쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 141(도 153)로 나타나는 뉴클레오티드 서열인 것을 확인하였다.
C3022 항체의 중쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 142(도 154)로 나타나는 뉴클레오티드 서열이고, 경쇄 전장의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 143(도 155)으로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것을 확인하였다.
또한, 상기 뉴클레오티드 서열로부터, 당해 서열이 코딩하는 C2037, C3048, C3015 및 C3022 항체의 중쇄 및 경쇄 전장의 아미노산 서열을 결정하였다.
C2037 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 144(도 156)로 나타나는 아미노산 서열이고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 145(도 157)로 나타나는 아미노산 서열이었다.
C3048 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 146(도 158)으로 나타나는 아미노산 서열이고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 147(도 159)로 나타나는 아미노산 서열이었다.
C3015 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 148(도 160)로 나타나는 아미노산 서열이고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 149(도 161)로 나타나는 아미노산 서열이었다.
C3022 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 150(도 162)으로 나타나는 아미노산 서열이고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 151(도 163)로 나타나는 아미노산 서열이었다.
C2037, C3048, C3015 및 C3022 항체의 IgG화체는, FreeStyle 293F 세포(Thermo Scientific사)에 상기의 동물 세포용 IgG 발현 벡터를 삽입하는 것에 의해 일과성 발현시키고, 필요에 따라서 Protein A Affinity 컬럼(HiTrap Mab Select SuRe, GE Healthcare사)으로 정제한 후, Vivaspin 20(7k MWCO, GE Healthcare사)에 의해, IgG가 용해되어 있는 완충액을 PBS로 치환하여, 이하의 공정 10)-7-7 및 10)-9에 제공하였다.
10)-6 scFv를 이용한 ELISA에 의한 GPRC5D로의 결합 확인
96웰 Maxi-sorp plate(Black, Nunc사)에, PBS로 1μg/mL로 희석한 NeutrAvidin을 50μL씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, PBS로 1μg/mL로 희석한, 실시예 10)-1에서 이용한 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 비오틴화 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드를 첨가하고 1시간 실온에서 진탕하였다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, Blocker Casein으로 블로킹하고, ELISA 버퍼로 3회 세정하였다. 그 후, C2037, C3048, C3015 또는 C3022 scFv를 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, ELISA 버퍼로 5000배로 희석한 Horseradish peroxidase(HRP) 표지 항-FLAG 항체를 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 5회 세정 후, SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate를 첨가하고, 10분 후의 화학 발광을 플레이트 리더로 측정하였다.
그 결과, C2037, C3048, C3015 및 C3022 scFv는 인간 GPRC5D(도 164A) 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D(도 164B)의 아미노 말단 펩티드에 결합하는 것이 나타났다.
10)-7 IgG를 이용한 ELISA에 의한 GPRC5D로의 결합 확인
96웰 Maxi-sorp plate에, PBS로 1μg/mL로 희석한 NeutrAvidin을 50μL씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화하였다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, PBS로 1μg/mL로 희석한, 실시예 10)-1에서 이용한 인간 또는 사이노몰거스 원숭이 비오틴화 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드를 첨가하고 1시간 실온에서 진탕하였다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, Blocker Casein으로 블로킹하고, ELISA 버퍼로 3회 세정하였다. 그 후, IgG를 발현시킨 FreeStyle 293F 세포의 배양액을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 3회 세정 후, ELISA 버퍼로 2500배로 희석한 Horseradish peroxidase(HRP) 표지 항인간 Fab 항체(Jackson ImmunoResearch사)를 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. ELISA 버퍼로 5회 세정 후, SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate를 첨가하고, 10분 후의 화학 발광을 플레이트 리더로 측정하였다.
그 결과, C2037, C3048, C3015 및 C3022 IgG는 인간 및 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 결합하는 것이 나타났다(도 165).
10)-8 scFv의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(KMS-34)로의 결합
KMS-34 세포를 원심분리에 의해 회수하고, FACS 버퍼(0.5% BSA 및 2mM EDTA를 포함하는 PBS, pH 7.4)로 2회 세정 후, 동 용액에 현탁시켰다. 얻어진 세포 현탁액에, C2037, C3048, C3015 또는 C3022 scFv를 첨가하고, 4℃에서 2시간 정치하였다. FACS 버퍼로 2회 세정 후, 항-FLAG 항체(Sigma-Aldrich사)를 첨가하여 현탁시키고, 4℃에서 1시간 더 정치하였다. FACS 버퍼로 2회 세정 후, Alexa488 표지 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch사)를 첨가하여 현탁시키고, 4℃에서 1시간 더 정치하였다. FACS 버퍼로 2회 세정 후, 1% PFA(Paraformaldehyde 32% 용액(ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES사)으로부터 조제)로 세포를 고정하고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)를 이용하여 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(TreeStar사)로 행하였다.
그 결과, C2037, C3048, C3015 및 C3022 scFv는 인간 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 166).
10)-9 IgG의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(KHM-1B)로의 결합
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B 세포를 5% FBS 함유 PBS로 2×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 실시예 10)-5에서 얻어진 인간 항-GPRC5D 항체(C2037, C3048, C3015 및 C3022를 포함하는 완전장 IgG화체)의 배양 상청, 또는 Human IgG isotype control 항체(CALBIOCHEM사)를 14ng/mL 내지 30μg/mL로 조제한 것을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정한 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하였다. 세포 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, GPRC5D 항체의 MFI 값으로부터 control 항체의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 산출하였다. 그 결과, C2037, C3048, C3015 및 C3022 IgG는 인간 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 167).
10)-10 C3022 및 C3048 개변체의 제작 및 평가
10)-10-1 개변체의 취득
C3022 및 C3048 유전자를 주형으로 하여 PCR을 이용하여 변이를 도입하는 방법(Zaccolo, et al., J. Mol. Biol. (1996) 255, 589-603), 또는 CDR의 전체 잔기에 대하여 각 잔기마다 야생형의 아미노산 이외의 19종류의 아미노산으로 변이시킨 올리고머를 합성하여 라이브러리를 구축하는 방법(oligo-based 라이브러리)을 이용하여 라이브러리를 구축하고, 고결합능 클론의 스크리닝을 행하여, 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 동정한 고결합성 변이를 조합하여, C3022의 고결합성 변이체 E1018 및 C3048의 고결합성 변이체 D1012를 취득하였다.
취득한 E1018의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 190(도 213)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 191(도 214)에 나타내었다.
취득한 E1018의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 192(도 215)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 193(도 216)에 나타내었다.
취득한 D1012의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 194(도 217)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 195(도 218)에 나타내었다.
취득한 D1012의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 196(도 219)에 나타내고, 아미노산 서열을 서열번호 197(도 220)에 나타내었다.
10)-10-2 Biacore에 의한 GPRC5D로의 결합 확인
Biacore T200을 이용하여 항-GPRC5D 항체의 인간 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드로의 결합 활성을, SPR법으로 검증하였다. Sensor Chip CAP(GE 헬스케어사제)에, HBS-EP+(GE 헬스케어사제)로 2nM로 희석한 인간 비오틴화 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드를 10μL/min으로 180초간 접촉시켜 고정화하였다. 그 후, HBS-EP+로 희석한 복수 농도의 scFv를 애널라이트로 하여 카이네틱스 해석에 의해 Kd를 산출하였다. 그 결과, E1018 및 D1012 scFv는 각각 C3022 및 C3048보다도 인간 GPRC5D의 아미노 말단 펩티드에 대한 결합이 강해져 있는 것이 나타났다(도 221).
(실시예 11) 항-CD3 항체 발현 벡터의 구축
11)-1 래트 항-CD3 scFv 항체 발현 벡터의 구축
DNA 면역법에 의해 면역시킨 래트의 림프절 또는 비장을 사용하여 래트 항-CD3 모노클로널 항체 산생 하이브리도마를 제작하였다. 그 하이브리도마로부터 모노클로널 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 1본쇄 항체 발현 벡터를 제작하였다. 즉, 서열번호 152(도 168)의 VH를 PCR로 증폭한 DNA 단편, VH와 VL 사이에 삽입하는 링커 단편, 및 서열번호 153(도 169)의 VL을 포함하는 영역에 FLAG-His 태그를 코딩하는 DNA 서열을 카복실 말단에 부가시키고 PCR로 증폭한 DNA 단편을, In-Fusion HD 클로닝 키트(CLONTECH사)를 이용하여 결합시켜, 서열번호 154(도 170)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 1본쇄 항체 발현 벡터 pC3E-7000을 제작하였다.
11)-2 인간화 항-CD3 scFv 항체 발현 벡터 pC3E-7034의 구축
서열번호 155(도 171)의 카복실 말단에 15 아미노산 플렉시블 링커를 통해서 서열번호 156(도 172)을 포함하는 영역을 연결한 scFv DNA 서열, 및 전후 15 염기의 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 이것을 주형으로 하여, C3E-7034와 전후의 부가 서열을 포함하는 영역을 PCR법에 의해 증폭하여, 인서트 DNA 단편을 얻었다. 또한 실시예 11)-1에서 제작한 발현 벡터 pC3E-7000을 주형으로 하여, scFv 영역을 제외한 벡터 영역을 PCR법에 의해 증폭하여, 벡터 단편을 얻었다. 각각의 DNA 단편을 In-Fusion HD 클로닝 키트(CLONTECH사)를 이용하여 결합시켜, 서열번호 157(도 173)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3E-7034"라고 명명하였다.
11)-3 인간화 항-CD3 scFv 항체 발현 벡터 pC3E-7035의 구축
서열번호 155(도 171)의 카복실 말단에 17 아미노산으로 이루어지는 플렉시블 링커를 통해서 서열번호 158(도 174)을 연결한 scFv DNA 서열 및 전후 15 염기의 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 11)-2와 동일한 방법으로 서열번호 159(도 175)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3E-7035"라고 명명하였다.
11)-4 인간화 항-CD3 scFv 항체 발현 벡터 pC3E-7036의 구축
서열번호 155(도 171)의 카복실 말단에 15 아미노산으로 이루어지는 플렉시블 링커를 통해서 서열번호 160(도 176)을 연결한 scFv DNA 서열 및 전후 15 염기의 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(GENEART사 인공 유전자 합성 서비스). 실시예 11)-2와 동일한 방법으로 서열번호 161(도 177)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 C3E-7036 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3E-7036"이라고 명명하였다.
(실시예 12) 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 제작
12)-1 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
실시예 10)-4에서 제작한 C2037 항체의 scFv를 주형으로 하여, C2037 항체의 scFv와 인간 항체 중쇄 시그널 서열의 일부, 및 scFv 사이를 연결하는 링커를 부가시킨 영역을 PCR법에 의해 증폭하여, 인서트 DNA를 얻었다. 또한 실시예 11)-2에서 제작한 발현 벡터 pC3E-7034를 주형으로 하여, 시그널 서열, 및 CD3 scFv 항체의 아미노 말단 서열을 코딩하는 프라이머를 이용하여 CD3 scFv를 포함하는 벡터 전체 영역을 PCR법에 의해 증폭하여, 벡터 단편을 얻었다. 각각의 DNA 단편을 In-Fusion HD 클로닝 키트(CLONTECH사)를 이용하여 결합시켜, 서열번호 162(도 178)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC2037-C3E-7034"라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3048 항체의 scFv와 pC3E-7034를 주형으로 하여, 서열번호 163(도 179)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3048-C3E-7034"라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3022 항체의 scFv와 pC3E-7034를 주형으로 하여, 서열번호 164(도 180)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3022-C3E-7034"라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C2037 항체의 scFv와 pC3E-7035를 주형으로 하여, 서열번호 165(도 181)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC2037-C3E-7035"라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3048 항체의 scFv와 pC3E-7035를 주형으로 하여, 서열번호 166(도 182)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3048-C3E-7035"라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3022 항체의 scFv와 pC3E-7035를 주형으로 하여, 서열번호 167(도 183)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3022-C3E-7035"라고 명명하였다.
상기와 같은 방법으로 C2037 항체의 scFv와 pC3E-7036을 주형으로 하여, 서열번호 168(도 184)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC2037-C3E-7036"이라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3048 항체의 scFv와 pC3E-7036을 주형으로 하여, 서열번호 169(도 185)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3048-C3E-7036"이라고 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로 C3022 항체의 scFv와 pC3E-7036을 주형으로 하여, 서열번호 170(도 186)의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 포함하는 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 "pC3022-C3E-7036"이라고 명명하였다.
12)-2 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 발현·정제
C2037-C3E-7034 내지 C3022-C3E-7036의 발현·정제는 실시예 10)-4와 동일한 방법으로 행하였다. C2037-C3E-7034의 아미노산 서열은 서열번호 171(도 187)에 기재되어 있다. C3048-C3E-7034의 아미노산 서열은 서열번호 172(도 188)에 기재되어 있다. C3022-C3E-7034의 아미노산 서열은 서열번호 173(도 189)에 기재되어 있다. C2037-C3E-7035의 아미노산 서열은 서열번호 174(도 190)에 기재되어 있다. C3048-C3E-7035의 아미노산 서열은 서열번호 175(도 191)에 기재되어 있다. C3022-C3E-7035의 아미노산 서열은 서열번호 176(도 192)에 기재되어 있다. C2037-C3E-7036의 아미노산 서열은 서열번호 177(도 193)에 기재되어 있다. C3048-C3E-7036의 아미노산 서열은 서열번호 178(도 194)에 기재되어 있다. C3022-C3E-7036의 아미노산 서열은 서열번호 179(도 195)에 기재되어 있다.
(실시예 13) 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 in vitro 활성 평가
13)-1 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 플로 사이토메트리에 의한 결합 활성 평가
13)-1-1 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(A4/Fuk)로의 결합
림프종 세포주 A4/Fuk 세포(JCRB 세포 뱅크)를 5% FBS 함유 PBS로 적당한 농도로 조제하고, LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit를 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 1×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 5% FBS 함유 PBS로 희석한, 실시예 12에서 조제한 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 C2037-C3E-7034 내지 C3022-C3E-7036을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 60분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 희석한 Penta-His Alexa Fluor 488을 30μL/well 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo로 행하고, 사세포를 제거한 획분의 Alexa Fluor 488의 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, 항체 첨가 샘플의 MFI 값으로부터 항체 미첨가 샘플의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 계산하였다. 도 196에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
13)-1-2 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포로의 결합
실시예 5)-2-2에서 제작한 KMS-11_cGPRC5D 세포를 이용하여, 실시예 13)-1-1과 동일한 방법으로 염색·해석을 실시하였다. 도 197에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
13)-1-3 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3(PBMC)으로의 결합
시판 인간 PBMC(Cellular Technology Limited사)를 5% FBS 함유 PBS로 적당한 농도로 조제하고, LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific사)와 항-CD19 항체(Beckman Coulter사)를 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 1×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 5% FBS 함유 PBS로 희석한, 실시예 12에서 조제한 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 C2037-C3E-7034 내지 C3022-C3E-7036을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 60분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 희석한 Penta-His Alexa Fluor 488(QIAGEN사)을 30μL/well 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II; BD사)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo(Treestar사)로 행하고, 사세포와 CD19 양성 세포를 제거한 획분의 Alexa Fluor 488의 평균 형광 강도(MFI)를 산출하고, 항체 첨가 샘플의 MFI 값으로부터 항체 미첨가 샘플의 MFI 값을 빼서 MFI 값의 상대치(rFMI)를 계산하였다. 도 198에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 인간 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
13)-1-4 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 CD3(PBMC)으로의 결합
SepMate(STEMCELL사)와 Lymphocyte Separation Solution(나카라이사)을 사용하여, 사이노몰거스 원숭이의 혈액으로부터 PBMC를 정법에 따라 채취하였다. 채취한 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 이용하여 실시예 13)-1-3과 동일한 방법으로 염색·해석을 실시하였다. 도 199에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
13)-2 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성 평가
13)-2-1 표적 세포의 조제
A4/Fuk 세포를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지(Thermo Fisher Scientific사)로 1×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 세포 현탁액 1mL당 100μL의 Chromium-51 Radionuclide(PerkinElmer사)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 2시간 배양하였다. 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 2회 세정한 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 1×105 세포/mL가 되도록 재현탁시킨 것을 표적 세포로서 이용하였다.
13)-2-2 이펙터 세포의 조제
시판되는 동결 PBMC(Cellular Technology Limited사)를 37℃에서 해동하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 Anti-aggregate Wash 시약(Cellular Technology Limited사)을 첨가한 용액으로 옮겨 2회 세정한 후에 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 1×106 세포/mL가 되도록 조제하여, 이펙터 세포로 하였다.
13)-2-3 세포상해 어세이
실시예 13)-2-1에서 취득한 A4/Fuk 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 각종 농도로 조제한, 실시예 12에서 조제한 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 50μL/well로 첨가하고, 실시예 13)-2-2에서 조제한 이펙터 세포를 100μL/well 첨가하고, 실온에서 1000rpm×1분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 20 내지 24시간 배양하였다. 상청 50μL를 LumaPlate(PerkinElmer사)에 회수하고, 50℃에서 약 2시간 건조시킨 후, 플레이트 리더(TopCount: PerkinElmer사)로 측정하였다. 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 용해율(%) = (A-B)/(C-B)×100
A: 샘플 웰의 카운트.
B: 백그라운드(항체 비첨가 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체 첨가 시에 어세이용 배지를 50μL 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 마찬가지의 조작을 행하였다.
C: 최대 방출(표적 세포를 계면활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체 첨가 시에 어세이 배지를 50μL 첨가하였다. 계면활성제는 100μL 첨가하고, 샘플 웰과 마찬가지로 50μL분을 LumaPlate로 옮겨 측정을 실시하였다.
도 200에 나타내는 바와 같이, A4/Fuk 세포에 대한 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성이 나타났다.
(실시예 14) Fc 부착 GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 제작
14)-1 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
14)-1-1 Full-Size Antibody(FSA)형 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
실시예 8)-1-2에 있어서 구축한 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1) H2 타입 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 전합성하였다(Genescript사, 커스텀 유전자 합성 서비스). "pCL_＃13540" 및 "pCL_＃13543"은, 얻어진 중쇄 가변 영역 및 2종류의 인간 IgG 유래 CH1 영역, 및 이펙터 기능을 저하시키고 또한 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역(WO2014/190441)을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5(National Research Council, WO2009/137911)에 도입한 것이다. 또한 실시예 8)-2-5에 있어서 구축한 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1) L5 타입 경쇄 가변 영역을 전합성하였다. "pCL_＃12290" 및 "pCL_＃12313"은, 얻어진 경쇄 가변 영역 및 2종류의 인간 IgG 유래 CL 영역을 코딩하는 DNA를 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다.
다음으로, 실시예 11)-2에 있어서 구축한 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7034)의 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 전합성하였다. "pCL_＃13552"는, 얻어진 scFv 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG 유래의 CH1 영역, 및 이펙터 기능을 저하시키고 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다. 또한, 실시예 11)-2에 있어서 구축한 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7034)의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 전합성하였다. "pCL_＃12287"은, 얻어진 scFv 경쇄 가변 영역 및 인간 IgG 유래의 CL 영역을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다. 마찬가지로, 실시예 11)-4에 있어서 구축한 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7036)의 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 전합성하였다. "pCL_＃13541"은, 얻어진 scFv 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG 유래의 CH1 영역, 및 이펙터 기능을 저하시키고 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다. 또한, 실시예 11)-4에 있어서 구축한 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7036)의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 전합성하였다. "pCL_＃12321"은, 얻어진 scFv 경쇄 및 인간 IgG 유래의 CL 영역을 코딩하는 DNA 단편을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다.
pCL_＃13540, pCL_＃13543, pCL_＃12290, pCL_＃12313, pCL_＃13552, pCL_＃12287, pCL_＃13541, 및 pCL_＃12321의 ORF 서열을 각각 서열목록의 서열번호 198(도 222), 서열번호 200(도 224), 서열번호 202(도 226), 서열번호 204(도 228), 서열번호 206(도 230), 서열번호 208(도 232), 서열번호 210(도 234), 및 서열번호 212(도 236)에 나타낸다.
14)-1-2 Hybrid형 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1) H2 타입의 중쇄 가변 영역, 인간 IgG 유래 CH1 영역, 및 이펙터 기능을 저하시키고 또한 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 포유류 세포용 발현 벡터를 제작하여, "pCL_＃13555"라고 명명하였다. 또한 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1) L5 타입 경쇄 가변 영역 및 인간 IgG 유래 CL 영역을 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 포유류 세포용 발현 벡터를 제작하여, "pCL_＃12123"이라고 명명하였다.
다음으로, 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7034), 및 이펙터 기능을 저하시키고 또한 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 코딩하는 DNA 단편을 편입한 포유류 세포용 발현 벡터를 제작하여, "pCL_＃13557"이라고 명명하였다. 또한, 인간화 항-CD3 scFv(C3E-7036), 및 이펙터 기능을 저하시키고 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 코딩하는 DNA 단편이 삽입된 포유류 세포용 발현 벡터 "pCL_＃13561"을 제작하였다.
pCL_＃13555, pCL_＃12123, pCL_＃13557, 및 pCL_＃13561의 ORF 서열을 각각 서열목록의 서열번호 214(도 238), 서열번호 216(도 240), 서열번호 218(도 242), 및 서열번호 220(도 244)에 나타낸다.
14)-1-3 Dual형 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
실시예 8)-1-2에 있어서 구축한 인간화 항-GPRC5D 항체(h2B1) H2 타입의 중쇄 가변 영역과 L5 타입의 경쇄 가변 영역을, GGGGS의 3회 반복 서열로 이루어지는 플렉시블 링커로 연결하여 1본쇄 항체(scFv)로 하였다. "pCL_＃13563"은 이 항-GPRC5D scFv와, 이펙터 기능을 저하시키고 또한 헤테로다량체를 형성시키는 변이를 도입한 Fc 영역을 코딩하는 DNA 단편을 포유류 세포용 발현 벡터 pTT5에 도입한 것이다. pCL_＃13563의 ORF 서열을 서열목록의 서열번호 222(도 246)에 나타낸다.
14)-2 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 생산
CHO-3E7 세포는 매뉴얼에 따라 계대 및 배양을 행하였다(National Research Council Canada, Raymond C. et al., Methods (2011) 55 (1), 44-51). 대수 증식기에 있는 CHO-3E7 세포 배양액을 2×106 cells/mL가 되도록 4mM 글루타민 및 0.1% Kolliphor(Sigma-Aldrich사) 함유 FreeStyle F17 배지(Invitrogen사)로 희석하여, 각종 이중특이성 분자의 생산에 이용하였다.
14)-2-1 Full-Size Antibody(FSA)형 이중특이성 분자의 생산
분주한 FreeStyle F17 배지에 Polyethyleneimine max(PEImax, Polyscience사) 8000μg을 용해시켜, PEImax 용액으로 하였다. 또한 분주한 다른 F17 배지에 벡터 pCL_＃13552, pCL_＃12287, pCL_＃13540, 및 pCL_＃12290을 15:15:53:17의 비율로 혼합한 벡터 혼합물, 또는 벡터 pCL_＃13541, pCL_＃12321, pCL_＃13543, 및 pCL_＃12313을 22:8:17:53의 비율로 혼합한 벡터 혼합물을 1000μg 첨가하여, 벡터 혼합물로 하였다. 추가로 분주한 다른 F17 배지에, pAKT 및 pGFP(모두 National Research Council)와 단편화 완료된 연어 정자 DNA(Sigma-Aldrich사)를 혼합한 DNA 혼합물을 1000μg 첨가하여, DNA 용액으로 하였다. PEImax 용액, 벡터 혼합물, 및 DNA 용액을 합쳐서 온화하게 교반하고, 5분간 방치한 후에 2L의 CHO-3E7 세포 배양액에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1일 진탕 배양한 후, 0.5mM valproic acid(Sigma-Aldrich사) 및 0.1% (w/v) Tryptone N1(organotechnie사)을 첨가하고, 32℃에서 6일간 더 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 7일째에 배양 상청을 회수하고, 0.2μm filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
C3E-7034와 h2B1의 FSA형 이중특이성 분자(v19159)의 발현 조제에는, pCL_＃13552, pCL_＃12287, pCL_＃13540, 및 pCL_＃12290을 이용하였다. C3E-7036과 h2B1의 FSA형 이중특이성 분자(v19140)의 발현 조제에는, pCL_＃13541, pCL_＃12321, pCL_＃13543, 및 pCL_＃12313을 이용하였다.
v19159를 구성하는 각 벡터를 발현시켜 얻어지는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 207(도 231), 209(도 233), 199(도 223), 및 203(도 227)에 나타낸다. 또한, v19140을 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 211(도 235), 213(도 237), 201(도 225), 및 205(도 229)에 각각 나타낸다.
14)-2-2 Hybrid형 이중특이성 분자의 생산
분주한 FreeStyle F17 배지에 Polyethyleneimine max(PEImax, Polyscience사) 8000μg을 용해시켜, PEImax 용액으로 하였다. 또한 분주한 다른 F17 배지에 pCL_＃13557, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123을 1:1:1.5의 비율로 혼합한 벡터 혼합물, 또는 pCL_＃13561, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123을 1:1:1.5의 비율로 혼합한 벡터 혼합물을 1000μg 첨가하여, 벡터 혼합물로 하였다. 추가로 분주한 다른 F17 배지에 pAKT 및 pGFP(모두 National Research Council)와 단편화 완료된 연어 정자 DNA(Sigma-Aldrich사)를 혼합한 DNA 혼합물을 1000μg 첨가하여, DNA 용액으로 하였다. PEImax 용액, 벡터 혼합물, 및 DNA 용액을 합쳐서 온화하게 교반하고, 5분간 방치한 후에 2L의 CHO-3E7 세포 배양액에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1일 진탕 배양한 후, 0.5mM valproic acid(Sigma-Aldrich사) 및 0.1% (w/v) Tryptone N1(organotechnie사)을 첨가하고, 32℃에서 6일간 더 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 7일째에 배양 상청을 회수하고, 0.2μm filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
C3E-7034와 h2B1의 Hybrid형 이중특이성 분자(v19126)의 발현 조제에는, pCL_＃13557, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123을 이용하였다. C3E-7036과 h2B1의 Hybrid형 이중특이성 분자(v19125)의 발현 조제에는, pCL_＃13561, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123을 이용하였다.
v19126을 구성하는 각 벡터를 발현시켜 얻어지는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 219(도 243), 215(도 239), 및 217(도 241)에 나타낸다. 또한, v19125를 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 221(도 245), 215(도 239), 및 217(도 241)에 각각 나타낸다.
14)-2-3 Dual형 이중특이성 분자의 생산
분주한 FreeStyle F17 배지에 Polyethyleneimine max(PEImax, Polyscience사) 8000μg을 용해시켜, PEImax 용액으로 하였다. 또한 분주한 다른 F17 배지에 CL_＃13557과 pCL_＃13563을 4:3의 비율로 혼합한 벡터 혼합물, 또는 pCL_＃13561과 pCL_＃13563을 1:1의 비율로 혼합한 벡터 혼합물을 1000μg 첨가하여, 벡터 혼합물로 하였다. 추가로 분주한 다른 F17 배지에 pAKT 및 pGFP(모두 National Research Council)와 단편화 완료된 연어 정자 DNA(Sigma-Aldrich사)를 혼합한 DNA 혼합물을 1000μg 첨가하여, DNA 용액으로 하였다. PEImax 용액, 벡터 혼합물, 및 DNA 용액을 합쳐서 온화하게 교반하고, 5분간 방치한 후에 2L의 CHO-3E7 세포 배양액에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1일 진탕 배양한 후, 0.5mM valproic acid(Sigma-Aldrich사) 및 0.1% (w/v) Tryptone N1(organotechnie사)을 첨가하고, 32℃에서 6일간 더 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 7일째에 배양 상청을 회수하고, 0.2μm filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
C3E-7034와 h2B1의 Dual-scFv(Dual)형 이중특이성 분자(v19122)의 발현 조제에는, pCL_＃13557과 pCL_＃13563을 이용하였다. C3E-7036과 h2B1의 Dual형 이중특이성 분자(v19121)의 발현 조제에는, pCL_＃13561과 pCL_＃13563을 이용하였다.
v19122를 구성하는 각 벡터를 발현시켜 얻어지는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 219(도 243) 및 223(도 247)에 나타낸다. 또한, v19121을 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 221(도 245) 및 223(도 247)에 각각 나타낸다.
14)-3 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 정제
14)-2에서 얻어진 배양 상청으로부터 각종 이중특이성 분자를 Protein A 어피니티 크로마토그래피와 겔 여과 크로마토그래피의 2단계 공정으로 정제하였다.
PBS pH 7.4로 평형화한 MabSelectSuRe 컬럼(GE Healthcare Bioscience사)에 배양 상청을 어플라이하여, 목적의 이중특이성 분자를 흡착시켰다. 비흡착 성분을 PBS로 제거한 후, 아세트산 버퍼 pH 3.6으로 흡착 성분을 용출시켰다. 용출 획분은 Tris 버퍼 pH 11로 pH를 중성으로 조제한 후, 농축하고, 미리 PBS(pH 7.4)로 평형화한 겔 여과 컬럼 Superdex 200 10/300(GE Healthcare Bioscience사)에 제공하였다. 겔 여과 크로마토그래피로 얻어진 피크 획분을 SDS 캐필러리 전기영동(LabChip-Caliper)으로 해석하여, 목적의 헤테로다이머에 상당하는 획분을 회수하였다. Dual형 이중특이성 분자는, 회수한 획분을 추가로 HBsor(25mM 히스티딘, 5% 소르비톨) pH 6.0으로 미리 평형화한 탈염 컬럼 HiPrep 26/10 Desalting(GE Healthcare Bioscience사)에 제공하고, 버퍼를 HBsor로 교환하였다. 마지막으로 회수한 획분을 0.2μm의 필터로 여과하여, 정제 샘플로 하였다. 정제 샘플은 질량 분석과 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동(SDS-PAGE)에 의해, 목적의 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자가 틀림없이 형성되어 있는 것을 확인하였다.
(실시예 15) Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 in vitro 활성 평가
15)-1 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 플로 사이토메트리에 의한 결합 활성 평가
15)-1-1 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(KHM-1B)로의 결합
GPRC5D를 발현하고 있는 인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B를 5% FBS 함유 PBS로 적당한 농도로 조제하고, LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit를 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 1×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 5% FBS 함유 PBS로 희석한, 실시예 14에서 조제한 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 60분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo로 행하고, 사세포를 제거한 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하였다. 그 결과, Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 인간 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 248).
15)-1-2 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포로의 결합
실시예 5)-2-2에서 제작한 KMS-11_cGPRC5D 세포를 이용하여, 실시예 15)-1-1과 동일한 방법으로 염색·해석을 실시하였다. 도 249에 나타내는 바와 같이, Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
15)-1-3 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3(PBMC)으로의 결합
시판 인간 PBMC(Cellular Technology Limited사)를 5% FBS 함유 PBS로 적당한 농도로 조제하고, LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific사)와 항CD19 항체(Beckman Coulter사)를 첨가하고, 4℃에서 30분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 1×106 세포/mL의 농도로 조제하고, 100μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 파종하고, 원심 후 상청을 제거하였다. 5% FBS 함유 PBS로 희석한, 실시예 14에서 조제한 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 60분 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 100배 희석한 R-Phycoerythrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch사)을 100μL/well 첨가하고, 4℃에서 1시간 정치하였다. 5% FBS 함유 PBS로 2회 세정 후, 5% FBS 함유 PBS로 재현탁시키고, 플로 사이토미터(FACSCanto(상표) II)로 검출을 행하였다. 데이터 해석은 Flowjo로 행하고, 사세포를 제거한 획분의 PE 형광 강도의 히스토그램을 작성하여, 평균 형광 강도(MFI)를 산출하였다. 그 결과, Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 인간 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 250).
15)-1-4 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 CD3(PBMC)으로의 결합
실시예 13)-1-4와 동일한 방법으로 채취한 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 이용하여, 실시예 15)-1-3과 동일한 방법으로 염색·해석을 실시하였다. 도 251에 나타내는 바와 같이, Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
15)-2 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성 평가
15)-2-1 표적 세포의 조제
KHM-1B 세포를 실시예 13)-2-1과 동일한 방법으로 조제한 것을 표적 세포로서 이용하였다.
15)-2-2 이펙터 세포의 조제
시판되는 동결 PBMC(Cellular Technology Limited사)를 37℃에서 해동하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 Anti-aggregate Wash 시약(Cellular Technology Limited사)을 첨가한 용액으로 옮겨 2회 세정한 후에 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 1.5×105 세포/mL가 되도록 조제하여, 이펙터 세포로 하였다.
15)-2-3 세포상해 어세이
실시예 15)-2-1에서 취득한 KHM-1B 세포를 50μL/well로 96-well U 바닥 마이크로플레이트에 첨가하였다. 거기에 각종 농도로 조제한, 실시예 14에서 조제한 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 50μL/well로 첨가하고, 실시예 15)-2-2에서 조제한 이펙터 세포를 100μL/well로 첨가하고, 실온에서 1000rpm×1분간 원심 후, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24 내지 48시간 배양하였다. 상청 50μL를 LumaPlate(PerkinElmer사)에 회수하고, 50℃에서 약 2시간 건조시킨 후, 플레이트 리더(TopCount: PerkinElmer사)로 측정하였다. 세포 용해율은 다음 식으로 산출하였다.
세포 용해율(%) = (A-B)/(C-B)×100
A: 샘플 웰의 카운트.
B: 백그라운드(항체 비첨가 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체 첨가 시에 어세이용 배지를 50μL 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 마찬가지의 조작을 행하였다.
C: 최대 방출(표적 세포를 계면활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체 첨가 시에 어세이 배지를 50μL 첨가하였다. 계면활성제는 100μL 첨가하고, 샘플 웰과 마찬가지로 50μL분을 LumaPlate로 옮겨 측정을 실시하였다.
도 252에 나타내는 바와 같이, KHM-1B 세포에 대한 Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성이 나타났다.
(실시예 16) Fc 부착 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 in vivo 활성 평가
16)-1 인간 PBMC와 암세포의 공이식 모델에 있어서의 in vivo 활성 평가
인간 다발성 골수종 세포주 KHM-1B(JCRB) 및 인간 PBMC(Cellular Technology Limited사)를 50% Matrigel(CORNING사) 함유 PBS로 각각 5×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOD-Scid 마우스(암컷, 5주령)의 피하에 0.1mL 공이식하였다. 이식 후에 군 나누기를 실시하고, 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 꼬리 정맥내 투여(0.1mg/kg)하였다. 투여는 이식일(Day 0)부터 Day 2까지 매일 3회 실시하였다. 1주일 후(Day 7)부터 경시적으로 종양의 장경(mm) 및 단경(mm)을 전자 디지털 캘리퍼로 계측하여, 이하에 나타내는 계산식에 의해 추정 종양 체적(Estimated Tumor Volume)을 산출하였다.
추정 종양 체적(mm3) = 각 개체의 추정 종양 체적의 평균치
각 개체의 추정 종양 체적 = 장경×단경2/2
각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 투여군에 있어서 항종양 효과가 확인되었다(도 253).
16)-2 인간 PBMC 이입 모델에 있어서의 in vivo 활성 평가
인간 PBMC를 PBS로 5×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOG 마우스(암컷, 6주령)에 0.2mL 꼬리 정맥내 이식하였다(Day-4). Day 0에 KHM-1B를 50% Matrigel 함유 PBS로 각각 3×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOG 마우스의 피하에 0.1mL 이식하였다. 마우스의 추정 종양 체적이 약 200mm3에 이른 시점(Day 12)에서 종양 체적에 의한 군 나누기를 실시하고, 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 꼬리 정맥내 투여(1mg/kg)하였다. 투여는 Day 12, Day 15, 및 Day 18에 실시하고, 경시적으로 종양의 장경(mm) 및 단경(mm)을 전자 디지털 캘리퍼로 계측하여, 추정 종양 체적을 산출하였다. 도면에 나타내는 바와 같이, 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 투여군에 있어서 종양의 퇴축이 확인되었다. 특히 v19125 처치군에서 강한 종양 퇴축 효과가 확인되었다(도 254).
(실시예 17) CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 제작
17)-1 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 발현 벡터의 제작
17)-1-1 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0004, C5D-0005, 및 C5D-0006) 발현 벡터의 제작
실시예 14)-1-2에 있어서 구축한 Hybrid형 이중특이성 분자(v19125) 발현 벡터 중, 인간화 항-CD3 scFv-Fc를 코딩하는 pCL_＃13561을 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 H쇄 CDR2의 Asn53을 Arg로 개변한 CDR 개변 벡터 pC3E-8015를 제작하였다. 마찬가지로 Hybrid형 이중특이성 분자(v19126) 발현 벡터 중, 인간화 항-CD3 scFv-Fc를 코딩하는 pCL_＃13557을 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 H쇄 CDR2의 Asn53을 Arg로, L쇄 Asp52를 Asn으로 개변한 CDR 개변 벡터 pC3E-8017을 제작하였다. 마찬가지로, pCL_＃13557을 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 H쇄 CDR2의 Asn53을 Ser로, L쇄 Asp52를 Asn으로 개변한 CDR 개변 벡터 pC3E-8018을 제작하였다.
pC3E-8015, pC3E-8017, 및 pC3E-8018의 ORF 서열을 각각 서열목록의 서열번호 224(도 255), 서열번호 226(도 257), 및 서열번호 228(도 259)에 나타낸다.
17)-1-2 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0014, C5D-0015, 및 C5D-0016) 발현 벡터의 제작
실시예 17)-1-1에서 구축한 Hybrid형 이중특이성 분자(C5D-0004) 발현 벡터 중, CDR 개변형 인간화 항-CD3 scFv-Fc를 코딩하는 pC3E-8015를 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 Fc의 C 말단에 Lys를 삽입한 K 부가형 CDR 개변 벡터 pC3E-8025를 제작하였다. 마찬가지로 pC3E-8017 및 pC3E-8018을 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 Fc의 C 말단에 Lys를 삽입한 K 부가형 CDR 개변 벡터 pC3E-8027 및 pC3E-8028을 제작하였다.
실시예 14)-1-2에서 구축한 Hybrid형 이중특이성 분자(v19125 및 v19126) 발현 벡터 중, 항-GPRC5D Fab-Fc를 코딩하는 pCL-＃13555를 주형으로 하여, 부위 특이적 변이 도입법에 의해 Fc의 C 말단에 Lys를 삽입한 K 부가형 벡터 pTAA-＃2를 제작하였다.
pC3E-8025, pC3E-8027, pC3E-8028, 및 pTAA-＃2의 ORF 서열을 각각 서열목록의 서열번호 230(도 261), 서열번호 232(도 263), 서열번호 234(도 265), 및 서열번호 236(도 267)에 나타낸다.
17)-2 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 생산
CHO-3E7 세포는 매뉴얼에 따라 계대 및 배양을 행하였다(National Research Council Canada, Raymond C. et al., Methods (2011) 55 (1), 44-51). 대수 증식기에 있는 CHO-3E7 세포 배양액을 2×10^6 cells/mL가 되도록, 4mM Glutamine 함유 BalanCD Transfectory CHO(Irvine Scientific사)로 희석하여, 각종 이중특이성 분자의 생산에 이용하였다.
ExpiCHO-S 세포는 매뉴얼에 따라 계대 및 배양을 행하였다(Thermo Fisher Scientific사). 대수 증식기에 있는 ExpiCHO-S 세포 배양액을 6×10^6 cells/mL가 되도록 ExpiCHO Expression Medium(Thermo Fisher Scientific사)으로 희석하여, 각종 이중특이성 분자의 생산에 이용하였다.
17)-2-1 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0004, C5D-0005, 및 C5D-0006)의 생산
Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 C5D-0004, C5D-0005, 및 C5D-0006의 발현 배양은 ExpiCHO-S 세포를 숙주로 하여 행하였다. 세포로의 발현 벡터의 트랜스펙션 방법 및 배양 조건은 모두 제품에 부수하는 매뉴얼에 따라 실시하였다(Thermo Fisher Scientific사). 배양은 750mL 규모로 행하고, 피드 첨가와 배양 온도는 매뉴얼에 기재된 Max titer protocol의 조건을 채용하였다. 배양 개시 후 13일째에 배양 상청을 회수하고, 0.2μm filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
pC3E-8015, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0004를, pC3E-8017, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0005를, pC3E-8018, pCL_＃13555, 및 pCL_＃12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0006을 취득하였다.
C5D-0004를 구성하는 각 벡터를 발현시켜 얻어지는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 225(도 256), 215(도 239), 및 217(도 241)에, C5D-0005를 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 227(도 258), 215(도 239), 및 217(도 241)에, C5D-0006을 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 229(도 260), 215(도 239), 및 217(도 241)에 각각 나타낸다.
17)-2-2 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0014, C5D-0015, 및 C5D-0016)의 생산
Opti-PRO SFM 배지(Thermo Fisher Scientific사) 3mL에 PEImax(Polyscience사) 800μg을 용해시켜, PEImax 용액으로 하였다. 또한 Opti-PRO SFM 배지 3mL에, pC3E-8025, pTAA_＃2, 및 pCL_＃12123을 1:1:1.5의 비율로 혼합한 벡터 혼합물 100μg, 및 pAKT 및 pGFP와 단편화 완료된 연어 정자 DNA를 혼합한 DNA 혼합물 100μg을 각각 첨가하였다. PEImax 용액, 벡터 혼합물, 및 DNA 용액을 합쳐서 온화하게 교반하고, 5분간 방치한 후에 200mL의 CHO-3E7 세포 배양액에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1일 진탕 배양한 후, Transfectory Supplement(Irvine Scientific사) 22mL, Anti clumping suppliment(Thermo Fisher Scientific사) 480μL, 및 valproic acid(Sigma-Aldrich사) 500μL를 첨가하고, 32℃에서 9일간 더 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 10일째에 배양 상청을 회수하고, 0.2μm filter(Sartorius사)로 여과하여 평가용의 샘플로 하였다.
pC3E-8025, pTAA_＃2, 및 pCL_12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0014를, pC3E-8027, pTAA_＃2, 및 pCL_＃12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0015를, pC3E-8028, pTAA_＃2, 및 pCL_＃12123의 조합으로부터 Hybrid형 이중특이성 분자 C5D-0016을 취득하였다.
C5D-0014를 구성하는 각 벡터를 발현시켜 얻어지는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 231(도 262), 237(도 268), 및 217(도 241)에, C5D-0015를 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 233(도 264), 237(도 268), 및 217(도 241)에, C5D-0016을 구성하는 아미노산의 서열을 서열목록의 서열번호 235(도 266), 237(도 268), 및 217(도 241)에 각각 나타낸다.
17)-3 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 정제
17)-3-1 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0004, C5D-0005, 및 C5D-0006)의 정제
17)-2-1에서 얻어진 배양 상청으로부터 각종 이중특이성 분자를 Protein A 어피니티 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피의 3단계 공정으로 정제하였다. 상세하게는, PBS pH 7.4로 평형화한 MabSelectSuRe 컬럼(GE Healthcare Bioscience사)에 배양 상청을 어플라이하여, 목적의 이중특이성 분자를 흡착시켰다. 비흡착 성분을 PBS로 제거한 후, 100mM 아세트산 버퍼 pH 3.5로 흡착 성분을 용출시켰다. 용출 획분은 즉시 Tris 버퍼 pH 9.0으로 pH를 중성으로 조제한 후, 50mM HEPES, 10mM 인산 칼륨, 및 100mM 염화 나트륨 용액으로 투석하고, 하이드록시아파타이트 컬럼 Bio-Scale CHT Type-I(BioRad Laboratories사)에 어플라이하였다. 직선적 농도 구배법에 의해 용매 중의 염화 나트륨 농도를 0.1M로부터 1M까지 변화시키는 것에 의해, 흡착한 목적의 이중특이성 분자를 용출시켰다. 얻어진 피크 획분을 SDS-PAGE로 해석하여, 목적의 이중특이성 분자에 상당하는 획분을 회수하였다. 다음으로 회수한 획분의 버퍼를 50mM HEPES pH 8.0 및 20mM 염화 나트륨 용액으로 교환한 후, 양이온 교환 컬럼 Mono S(GE Healthcare Bioscience사)에 어플라이하였다. 직선적 농도 구배법에 의해 용매 중의 염화 나트륨 농도를 20mM로부터 1M까지 변화시키는 것에 의해, 흡착한 목적의 이중특이성 분자를 용출시켰다. 얻어진 피크 획분을 SDS-PAGE로 해석하여, 목적의 이중특이성 분자에 상당하는 획분을 회수하였다. 마지막으로 회수한 획분을 HBsor(25mM 히스티딘, 5% 소르비톨) pH 6.0으로 투석하고, 필터로 여과한 후, 정제 샘플로 하였다. 정제 샘플은 질량 분석, SDS-PAGE, 및 SEC 분석에 의해, 목적의 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자가 틀림없는 것을 확인하였다.
17)-3-2 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자(C5D-0014, C5D-0015, 및 C5D-0016)의 정제
17)-2-2에서 얻어진 배양 상청으로부터 각종 이중특이성 분자를 Protein A 어피니티 크로마토그래피 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피의 2단계 공정으로 정제하였다. 상세하게는, PBS pH 7.4로 평형화한 MabSelectSuRe 컬럼(GE Healthcare Bioscience사)에 배양 상청을 어플라이하여, 목적의 이중특이성 분자를 흡착시켰다. 비흡착 성분을 PBS로 제거한 후, 100mM 아세트산 버퍼 pH 3.0으로 흡착 성분을 용출시켰다. 용출 획분은 즉시 Tris 버퍼 pH 9.5로 pH를 중성으로 조제한 후, 50mM HEPES, 10mM 인산 칼륨, 및 100mM 염화 나트륨 용액으로 투석하고, 하이드록시아파타이트 컬럼 Bio-Scale CHT Type-I(BioRad Laboratories사)에 어플라이하였다. 직선적 농도 구배법에 의해 용매 중의 염화 나트륨 농도를 0.1M로부터 1M까지 변화시키는 것에 의해, 흡착한 목적의 이중특이성 분자를 용출시켰다. 얻어진 피크 획분을 SDS-PAGE로 해석하여, 목적의 이중특이성 분자에 상당하는 획분을 회수하였다. 마지막으로 회수한 획분을 HBsor(25mM 히스티딘, 5% 소르비톨) pH 6.0으로 투석하고, 필터로 여과한 후, 정제 샘플로 하였다. 정제 샘플은 질량 분석, SDS-PAGE 및 SEC 분석에 의해, 목적의 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자가 틀림없는 것을 확인하였다.
(실시예 18) C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 in vitro 활성 평가
18)-1 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 플로 사이토메트리에 의한 결합 활성 평가
18)-1-1 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 내인성 인간 GPRC5D 발현 세포(KHM-1B)로의 결합
실시예 15)-1-1과 동일한 방법으로 세포 조제·염색·해석을 실시하였다. 그 결과, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 인간 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 269).
18)-1-2-2 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포로의 결합
실시예 15)-1-2와 동일한 방법으로 세포 조제·염색·해석을 실시하였다. 도 270에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
18)-1-3 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 인간 CD3(PBMC)으로의 결합
실시예 15)-1-3과 동일한 방법으로 세포 조제·염색·해석을 실시하였다. 그 결과, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 인간 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다(도 271).
18)-1-4 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 사이노몰거스 원숭이 CD3(PBMC)으로의 결합
실시예 15)-1-4와 동일한 방법으로 세포 조제·염색·해석을 실시하였다. 도 272에 나타내는 바와 같이, 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자는 사이노몰거스 원숭이 CD3 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
18)-2 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 및 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성 평가
실시예 15)-2-3과 동일한 방법으로 세포상해 활성의 측정을 실시하였다. 단, 배양 시간은 24 내지 72시간이다. 도 273에 나타내는 바와 같이, KHM-1B 세포에 대한 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 세포상해 활성이 나타났다.
(실시예 19) CDR 개변 Hybrid형 및 C 말단 Lys 부가 CDR 개변 Hybrid형 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자의 in vivo 활성 평가
19)-1 인간 PBMC와 암세포의 공이식 모델에 있어서의 in vivo 활성 평가
KHM-1B 및 인간 PBMC를 50% Matrigel 함유 PBS로 각각 5×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOD-Scid 마우스(암컷, 5주령)의 피하에 0.1mL 공이식하였다. 이식 후에 군 나누기를 실시하고, 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 꼬리 정맥내 투여(1μg/kg)하였다. 투여는 이식일(Day 0)부터 Day 2까지 매일 3회 실시하였다. 1주일 후(Day 7)부터 경시적으로 종양의 장경(mm) 및 단경(mm)을 전자 디지털 캘리퍼로 계측하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 추정 종양 체적을 산출하였다.
추정 종양 체적(mm3) = 각 개체의 추정 종양 체적의 평균치
각 개체의 추정 종양 체적 = 장경×단경2/2
각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자 투여군에 있어서 항종양 효과가 확인되었다(도 274).
19)-2 인간 PBMC 이입 모델에 있어서의 in vivo 활성 평가
인간 PBMC를 PBS로 5×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOG 마우스(암컷, 6주령)에 0.2mL 꼬리 정맥내 이식하였다(Day -4). Day 0에 KHM-1B를 50% Matrigel 함유 PBS로 각각 3×107 세포/mL가 되도록 조제하고, NOG 마우스의 피하에 0.1mL 이식하였다. 마우스의 추정 종양 체적이 약 200mm3에 이른 시점(Day 11)에서 종양 체적에 의한 군 나누기를 실시하고, 각종 항-GPRC5D-항-CD3 이중특이성 분자를 꼬리 정맥내 투여(1mg/kg)하였다. 투여는 Day 11, Day 14, 및 Day 17에 실시하고, 경시적으로 종양의 장경(mm) 및 단경(mm)을 전자 디지털 캘리퍼로 계측하여, 추정 종양 체적을 산출하였다. 도면에 나타내는 바와 같이, C5D-0004 투여군(도 275A) 및 C5D-0014 투여군(도 275B)에 있어서 종양의 퇴축이 확인되었다.
서열번호 1: 인간 GPRC5D의 아미노 말단 서열(도 2)
서열번호 2: 인간 GPRC5D의 아미노 말단 서열(도 3)
서열번호 3: 2A4의 중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머
서열번호 4: 2A4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 8)
서열번호 5: 2A4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 9)
서열번호 6: 2B1의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 10)
서열번호 7: 2B1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 11)
서열번호 8: 7B4의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 12)
서열번호 9: 7B4의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 13)
서열번호 10: 2A4의 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머
서열번호 11: 2A4의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 14)
서열번호 12: 2A4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 15)
서열번호 13: 2B1의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 16)
서열번호 14: 2B1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 17)
서열번호 15: 7B4의 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 18)
서열번호 16: 7B4의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 19)
서열번호 17: 인간 κ쇄 분비 시그널 서열 및 인간 κ쇄 정상 영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편(도 20)
서열번호 18: 경쇄 발현 벡터 프라이머 F(도 21)
서열번호 19: 경쇄 발현 벡터 프라이머 R(도 22)
서열번호 20: 인간 중쇄 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편(도 23)
서열번호 21: 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄의 뉴클레오티드 서열(도 24)
서열번호 22: 인간 키메라화 2A4(c2A4) 경쇄의 아미노산 서열(도 25)
서열번호 23: 인간 키메라화 2A4 경쇄용 프라이머 세트 F(도 26)
서열번호 24: 인간 키메라화 2A4 경쇄용 프라이머 세트 R(도 27)
서열번호 25: 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄의 뉴클레오티드 서열(도 28)
서열번호 26: 인간 키메라화 2A4(c2A4) 중쇄의 아미노산 서열(도 29)
서열번호 27: 인간 키메라화 2A4 중쇄용 프라이머 세트 F(도 30)
서열번호 28: 인간 키메라화 2A4 중쇄용 프라이머 세트 R(도 31)
서열번호 29: 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄의 뉴클레오티드 서열(도 32)
서열번호 30: 인간 키메라화 2B1(c2B1) 경쇄의 아미노산 서열(도 33)
서열번호 31: 인간 키메라화 2B1 경쇄용 프라이머 세트 F(도 34)
서열번호 32: 인간 키메라화 2B1 경쇄용 프라이머 세트 R(도 35)
서열번호 33: 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄의 뉴클레오티드 서열(도 36)
서열번호 34: 인간 키메라화 2B1(c2B1) 중쇄의 아미노산 서열(도 37)
서열번호 35: 인간 키메라화 2B1 중쇄용 프라이머 세트 F(도 38)
서열번호 36: 인간 키메라화 2B1 중쇄용 프라이머 세트 R(도 39)
서열번호 37: 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄의 뉴클레오티드 서열(도 40)
서열번호 38: 인간 키메라화 7B4(c7B4) 경쇄의 아미노산 서열(도 41)
서열번호 39: 인간 키메라화 7B4 경쇄용 프라이머 세트 F(도 42)
서열번호 40: 인간 키메라화 7B4 경쇄용 프라이머 세트 R(도 43)
서열번호 41: 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄의 뉴클레오티드 서열(도 44)
서열번호 42: 인간 키메라화 7B4(c7B4) 중쇄의 아미노산 서열(도 45)
서열번호 43: 인간 키메라화 7B4 중쇄용 프라이머 세트 F(도 46)
서열번호 44: 인간 키메라화 7B4 중쇄용 프라이머 세트 R(도 47)
서열번호 45: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 54)
서열번호 46: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 55)
서열번호 47: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 56)
서열번호 48: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 57)
서열번호 49: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 58)
서열번호 50: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 59)
서열번호 51: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 60)
서열번호 52: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 61)
서열번호 53: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 62)
서열번호 54: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 63)
서열번호 55: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 64)
서열번호 56: 래트 항-GPRC5D 항체 2A4의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 65)
서열번호 57: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 66)
서열번호 58: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 67)
서열번호 59: 래트 항-GPRC5D 항체 2B1의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 68)
서열번호 60: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 69)
서열번호 61: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 70)
서열번호 62: 래트 항-GPRC5D 항체 7B4의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 71)
서열번호 63: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L1)의 뉴클레오티드 서열(도 72), 그 중 뉴클레오티드 번호 1 내지 60은 시그널 서열이고, 통상 대부분의 성숙 h2B1_L1의 뉴클레오티드 서열에는 포함되지 않는다.
서열번호 64: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L1)의 아미노산 서열(도 73)
서열번호 65: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L2)의 뉴클레오티드 서열(도 74)
서열번호 66: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L2)의 아미노산 서열(도 75)
서열번호 67: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L3)의 뉴클레오티드 서열(도 76)
서열번호 68: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L3)의 아미노산 서열(도 77)
서열번호 69: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L4)의 뉴클레오티드 서열(도 78)
서열번호 70: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L4)의 아미노산 서열(도 79)
서열번호 71: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L5)의 뉴클레오티드 서열(도 80)
서열번호 72: 인간화 2B1 경쇄(h2B1_L5)의 아미노산 서열(도 81)
서열번호 73: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H1)의 뉴클레오티드 서열(도 82)
서열번호 74: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H1)의 아미노산 서열(도 83)
서열번호 75: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H2)의 뉴클레오티드 서열(도 84)
서열번호 76: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H2)의 아미노산 서열(도 85)
서열번호 77: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H3)의 뉴클레오티드 서열(도 86)
서열번호 78: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H3)의 아미노산 서열(도 87)
서열번호 79: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H4)의 뉴클레오티드 서열(도 88)
서열번호 80: 인간화 2B1 중쇄(h2B1_H4)의 아미노산 서열(도 89)
서열번호 81: 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L1)의 뉴클레오티드 서열(도 90)
서열번호 82: 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L1)의 아미노산 서열(도 91)
서열번호 83: 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L2)의 뉴클레오티드 서열(도 92)
서열번호 84: 인간화 7B4 경쇄(h7B4_L2)의 아미노산 서열(도 93)
서열번호 85: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H1)의 뉴클레오티드 서열(도 94)
서열번호 86: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H1)의 아미노산 서열(도 95)
서열번호 87: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H2)의 뉴클레오티드 서열(도 96)
서열번호 88: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H2)의 아미노산 서열(도 97)
서열번호 89: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H3)의 뉴클레오티드 서열(도 98)
서열번호 90: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H3)의 아미노산 서열(도 99)
서열번호 91: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H5)의 뉴클레오티드 서열(도 100)
서열번호 92: 인간화 7B4 중쇄(h7B4_H5)의 아미노산 서열(도 101)
서열번호 93: 사이노몰거스 원숭이 GPRC5D 아미노 말단 펩티드(도 105)의 아미노산 서열
서열번호 94: scFv의 서열 해석에 이용한 프라이머 A(도 106)의 뉴클레오티드 서열
서열번호 95: scFv의 서열 해석에 이용한 프라이머 B(도 107)의 뉴클레오티드 서열
서열번호 96: C2037 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 108)
서열번호 97: C2037 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 109)
서열번호 98: C2037 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 110)
서열번호 99: C2037 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 111)
서열번호 100: C3048 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 112)
서열번호 101: C3048 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 113)
서열번호 102: C3048 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 114)
서열번호 103: C3048 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 115)
서열번호 104: C3015 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 116)
서열번호 105: C3015 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 117)
서열번호 106: C3015 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 118)
서열번호 107: C3015 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 119)
서열번호 108: C3022 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 120)
서열번호 109: C3022 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 121)
서열번호 110: C3022 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 122)
서열번호 111: C2037 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 124)
서열번호 112: C2037 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 125)
서열번호 113: C2037 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 126)
서열번호 114: C2037 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 127)
서열번호 115: C2037 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 128)
서열번호 116: C2037 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 129)
서열번호 117: C3048 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 130)
서열번호 118: C3048 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 131)
서열번호 119: C3048 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 132)
서열번호 120: C3048 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 133)
서열번호 121: C3048 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 134)
서열번호 122: C3048 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 135)
서열번호 123: C3015 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 136)
서열번호 124: C3015 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 137)
서열번호 125: C3015 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 138)
서열번호 126: C3015 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 139)
서열번호 127: C3015 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 140)
서열번호 128: C3015 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 141)
서열번호 129: C3022 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 142)
서열번호 130: C3022 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 143)
서열번호 131: C3022 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 144)
서열번호 132: C3022 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 145)
서열번호 133: C3022 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 146)
서열번호 134: C3022 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 147)
서열번호 135: C3022 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 123)
서열번호 136: C2037의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열(도 148)
서열번호 137: C2037의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열(도 149)
서열번호 138: C3048의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열(도 150)
서열번호 139: C3048의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열(도 151)
서열번호 140: C3015의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열(도 152)
서열번호 141: C3015의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열(도 153)
서열번호 142: C3022의 IgG화체 중쇄 뉴클레오티드 서열(도 154)
서열번호 143: C3022의 IgG화체 경쇄 뉴클레오티드 서열(도 155)
서열번호 144: C2037의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열(도 156)
서열번호 145: C2037의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열(도 157)
서열번호 146: C3048의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열(도 158)
서열번호 147: C3048의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열(도 159)
서열번호 148: C3015의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열(도 160)
서열번호 149: C3015의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열(도 161)
서열번호 150: C3022의 IgG화체 중쇄 아미노산 서열(도 162)
서열번호 151: C3022의 IgG화체 경쇄 아미노산 서열(도 163)
서열번호 152: 래트 항-CD3 항체 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 168)
서열번호 153: 래트 항-CD3 항체 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 169)
서열번호 154: C3E-7000의 뉴클레오티드 서열(도 170)
서열번호 155: C3E-7034의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 171)
서열번호 156: C3E-7034의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 172)
서열번호 157: C3E-7034의 뉴클레오티드 서열(도 173)
서열번호 158: C3E-7035의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 174)
서열번호 159: C3E-7035의 뉴클레오티드 서열(도 175)
서열번호 160: C3E-7036의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 176)
서열번호 161: C3E-7036의 뉴클레오티드 서열(도 177)
서열번호 162: C2037-C3E-7034의 뉴클레오티드 서열(도 178)
서열번호 163: C3048-C3E-7034의 뉴클레오티드 서열(도 179)
서열번호 164: C3022-C3E-7034의 뉴클레오티드 서열(도 180)
서열번호 165: C2037-C3E-7035의 뉴클레오티드 서열(도 181)
서열번호 166: C3048-C3E-7035의 뉴클레오티드 서열(도 182)
서열번호 167: C3022-C3E-7035의 뉴클레오티드 서열(도 183)
서열번호 168: C2037-C3E-7036의 뉴클레오티드 서열(도 184)
서열번호 169: C3048-C3E-7036의 뉴클레오티드 서열(도 185)
서열번호 170: C3022-C3E-7036의 뉴클레오티드 서열(도 186)
서열번호 171: C2037-C3E-7034의 아미노산 서열(도 187)
서열번호 172: C3048-C3E-7034의 아미노산 서열(도 188)
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서열번호 174: C2037-C3E-7035의 아미노산 서열(도 190)
서열번호 175: C3048-C3E-7035의 아미노산 서열(도 191)
서열번호 176: C3022-C3E-7035의 아미노산 서열(도 192)
서열번호 177: C2037-C3E-7036의 아미노산 서열(도 193)
서열번호 178: C3048-C3E-7036의 아미노산 서열(도 194)
서열번호 179: C3022-C3E-7036의 아미노산 서열(도 195)
서열번호 180: C3E-7034의 아미노산 서열(도 203)
서열번호 181: C3E-7035의 아미노산 서열(도 204)
서열번호 182: C3E-7036의 아미노산 서열(도 205)
서열번호 183: C3E-7000의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 206)
서열번호 184: C3E-7000의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 207)
서열번호 185: C3E-7000의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 208)
서열번호 186: C3E-7000의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열(도 209)
서열번호 187: C3E-7000의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 210)
서열번호 188: C3E-7000의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열(도 211)
서열번호 189: 인간 CD3ε의 아미노산 서열(도 212)
서열번호 190: E1018 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 213)
서열번호 191: E1018 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 214)
서열번호 192: E1018 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 215)
서열번호 193: E1018 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 216)
서열번호 194: D1012 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 217)
서열번호 195: D1012 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 218)
서열번호 196: D1012 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(도 219)
서열번호 197: D1012 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(도 220)
서열번호 198: h2B1 Fab HC_1의 뉴클레오티드 서열(도 222)
서열번호 199: h2B1 Fab HC_1의 아미노산 서열(도 223)
서열번호 200: h2B1 Fab HC_2의 뉴클레오티드 서열(도 224)
서열번호 201: h2B1 Fab HC_2의 아미노산 서열(도 225)
서열번호 202: h2B1 Fab LC_1의 뉴클레오티드 서열(도 226)
서열번호 203: h2B1 Fab LC_1의 아미노산 서열(도 227)
서열번호 204: h2B1 Fab LC_2의 뉴클레오티드 서열(도 228)
서열번호 205: h2B1 Fab LC_2의 아미노산 서열(도 229)
서열번호 206: C3E-7034 Fab HC의 뉴클레오티드 서열(도 230)
서열번호 207: C3E-7034 Fab HC의 아미노산 서열(도 231)
서열번호 208: C3E-7034 Fab LC의 뉴클레오티드 서열(도 232)
서열번호 209: C3E-7034 Fab LC의 아미노산 서열(도 233)
서열번호 210: C3E-7036 Fab HC의 뉴클레오티드 서열(도 234)
서열번호 211: C3E-7036 Fab HC의 아미노산 서열(도 235)
서열번호 212: C3E-7036 Fab LC의 뉴클레오티드 서열(도 236)
서열번호 213: C3E-7036 Fab LC의 아미노산 서열(도 237)
서열번호 214: h2B1 Fab HC_3의 뉴클레오티드 서열(도 238)
서열번호 215: h2B1 Fab HC_3의 아미노산 서열(도 239)
서열번호 216: h2B1 Fab LC_3의 뉴클레오티드 서열(도 240)
서열번호 217: h2B1 Fab LC_3의 아미노산 서열(도 241)
서열번호 218: C3E-7034 scFv Fc의 뉴클레오티드 서열(도 242)
서열번호 219: C3E-7034 scFv Fc의 아미노산 서열(도 243)
서열번호 220: C3E-7036 scFv Fc의 뉴클레오티드 서열(도 244)
서열번호 221: C3E-7036 scFv Fc의 아미노산 서열(도 245)
서열번호 222: h2B1 scFv Fc의 뉴클레오티드 서열(도 246)
서열번호 223: h2B1 scFv Fc의 아미노산 서열(도 247)
서열번호 224: C3E-8015의 뉴클레오티드 서열(도 255)
서열번호 225: C3E-8015의 아미노산 서열(도 256)
서열번호 226: C3E-8017의 뉴클레오티드 서열(도 257)
서열번호 227: C3E-8017의 아미노산 서열(도 258)
서열번호 228: C3E-8018의 뉴클레오티드 서열(도 259)
서열번호 229: C3E-8018의 아미노산 서열(도 260)
서열번호 230: C3E-8025의 뉴클레오티드 서열(도 261)
서열번호 231: C3E-8025의 아미노산 서열(도 262)
서열번호 232: C3E-8027의 뉴클레오티드 서열(도 263)
서열번호 233: C3E-8027의 아미노산 서열(도 264)
서열번호 234: C3E-8028의 뉴클레오티드 서열(도 265)
서열번호 235: C3E-8028의 아미노산 서열(도 266)
서열번호 236: h2B1 Fab HC_4의 뉴클레오티드 서열(도 267)
서열번호 237: h2B1 Fab HC_4의 아미노산 서열(도 268)
서열번호 238: CDR 개변체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 276), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 239: CDR 개변체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열(도 277), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 240: C3E-7034의 CDR 개변체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 278), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 241: C3E-7034의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 279), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 242: C3E-7035의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 280), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 243: C3E-7036의 CDR 개변체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 281), X는 임의의 천연 아미노산이다.
서열번호 244: C3E-7078의 아미노산 서열(도 282)
서열번호 245: C3E-7085의 아미노산 서열(도 283)
서열번호 246: C3E-7086의 아미노산 서열(도 284)
서열번호 247: C3E-7087의 아미노산 서열(도 285)
서열번호 248: C3E-7088의 아미노산 서열(도 286)
서열번호 249: C3E-7089의 아미노산 서열(도 287)
서열번호 250: C3E-7090의 아미노산 서열(도 288)
서열번호 251: C3E-7091의 아미노산 서열(도 289)
서열번호 252: C3E-7092의 아미노산 서열(도 290)
서열번호 253: C3E-7093의 아미노산 서열(도 291)
서열번호 254: C3E-7094의 아미노산 서열(도 292)
서열번호 255: C3E-7095의 아미노산 서열(도 293)
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> ANTI-GPRC5D ANTIBODY AND MOLECULE COMPRISING THE ANTIBODY <130> FP-1804 <140> PCT/JP2018/003888 <141> 2018-02-06 <150> JP2017-020220 <151> 2017-02-07 <160> 255 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> (27) Xaa is biotinylated Glutamic Acid <400> 1 Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys 1 5 10 15 Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Xaa 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> (28) Xaa is biotinylated Lysine <400> 2 Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys 1 5 10 15 Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Xaa 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying cDNA encording 2A4 VH by PCR <400> 3 ctccagagtt ccaggtcacg gtgactggc 29 <210> 4 <211> 366 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 4 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tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416 <210> 90 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of h7B4_H3 <400> 90 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Ile Gln Leu 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cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416 <210> 92 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of h7B4_H5 <400> 92 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ile 35 40 45 Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Asn Lys 50 55 60 Met Glu Trp Ile Ala Tyr Met Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Trp Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Val 115 120 125 Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 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nucleotide sequence of C2037 VH <400> 96 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtgggaag 300 agtaactacc cctggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 97 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C2037 VH <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala 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Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 100 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3048 VH <400> 100 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc aggtatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggaac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacaatt accgcggacc aatccacgag aacagcctac 240 atggacctgg gcagactgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc tctcgaggga 300 ttcagggact cattaaaacg aaatcctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 101 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 VH <400> 101 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Gly Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Glu Gly Phe Arg Asp Ser Leu Lys Arg Asn Pro Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3048 VL <400> 102 cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaggcaccac caacattggg agtaattatg tatcctggta tcagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaatt cctcatgtat gaaaataata agcgaccctc aggcattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 240 actggggacg aggccactta ttactgctca acatgggata gcagcctgaa tactgggcta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 103 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 VL <400> 103 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Thr Thr Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Phe Leu 35 40 45 Met Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Thr Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 104 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3015 VH <400> 104 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg aactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta ctggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagga cacactatat 240 ctgcaattga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatcccgt 300 agtatgagta tcaactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 105 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3015 VH <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Ser Met Ser Ile Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3015 VL <400> 106 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agtcagcatc 60 acctgctctg gagataattt gggtgataga tatgcctcct ggtatcagca gaagccaggc 120 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agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcgggctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagtggtagt 300 gtaaggcatc cctggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 109 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3022 VH <400> 109 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Ser Val Arg His Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 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amino acid sequence of C2037 L CDR1 <400> 114 Asn Ser Asn Ile Gly Ser Arg Thr 1 5 <210> 115 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C2037 L CDR2 <400> 115 Gly Asn Asn 1 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C2037 L CDR3 <400> 116 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val 1 5 10 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 H CDR1 <400> 117 Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Ala 1 5 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 H CDR2 <400> 118 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 H CDR3 <400> 119 Ala Leu Glu Gly Phe Arg Asp Ser Leu Lys Arg Asn Pro Phe Asp Ile 1 5 10 15 <210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3048 L CDR1 <400> 120 Thr Thr Asn Ile Gly Ser Asn Tyr 1 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aagggacaat ggtcaccgtc 420 agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540 gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416 <210> 139 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3048 L in IgG form <400> 139 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 cagtctgtcg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 120 tcctgctctg gaggcaccac caacattggg agtaattatg tatcctggta tcagcagctc 180 ccaggaacag cccccaaatt cctcatgtat gaaaataata agcgaccctc aggcattcct 240 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tggccatcac cggactccag 300 actggggacg aggccactta ttactgctca acatgggata gcagcctgaa tactgggcta 360 ttcggcggag ggaccaagtt aactgtgctt ggccagccta aggctgcccc tagcgtgacc 420 ctgttccctc cttccagcga ggagcttcaa gctaacaagg ccaccctggt gtgtcttatc 480 tctgacttct accctggcgc tgtgaccgtg gcctggaagg ctgacagctc ccctgtgaag 540 gccggagtgg agaccaccac acctagcaag cagtctaaca 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cctgaaactc 60 tcctgtgtag tctctggagt cacattcaat tactacggga tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttgcatcc attactaatt ctggtggtag aatttactat 180 ccagactctg tgaagggccg attcactatc tccagagaaa atacacaaaa gaccctatac 240 ctacaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac tctcgatggt 300 cgcgatggtt gggttgctta ctggggccaa ggcactctgg tcactgtctc ttca 354 <210> 153 <211> 327 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 153 cagtttgtgc ttactcagcc aaactctgtg tctacgaatc tcggaaccac agtcgaactg 60 tcttgcaagc gcaacactgg gaacattgga agcaattatg tgaactggta ccagcagcat 120 gagggaagat ctcccaccac tattatttat agggatgata agagaccaga tggagtttct 180 gacaggttct ctgggtccat tgacagatct tccaagtcag ccctcctgac aatcaataat 240 gtgcagactg aagatgaagc tgactacttc tgtcagtctt acagtagtgg ttttattttc 300 ggcggtggaa ccaagctcac tgtccta 327 <210> 154 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3E-7000 <400> 154 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcctg gtgcagcctg gaagggccct gaaactctcc 120 tgtgtagtct ctggagtcac attcaattac tacgggatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt tgcatccatt actaattctg gtggtagaat ttactatcca 240 gactctgtga agggccgatt cactatctcc agagaaaata cacaaaagac cctataccta 300 caaatgaaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtactct cgatggtcgc 360 gatggttggg ttgcttactg gggccaaggc actctggtca ctgtctcttc aggtggaggc 420 ggttcaggcg gaggtggcag cggcggtggc gggagtcagt ttgtgcttac tcagccaaac 480 tctgtgtcta cgaatctcgg aaccacagtc gaactgtctt gcaagcgcaa cactgggaac 540 attggaagca attatgtgaa ctggtaccag cagcatgagg gaagatctcc caccactatt 600 atttataggg atgataagag accagatgga gtttctgaca ggttctctgg gtccattgac 660 agatcttcca agtcagccct cctgacaatc aataatgtgc agactgaaga tgaagctgac 720 tacttctgtc agtcttacag tagtggtttt attttcggcg gtggaaccaa gctcactgtc 780 ctaggcgcgt ctgcggccgc aggatccggt ggtgattaca aagatgatga cgataaaggt 840 gcagcggcgc atcaccatca tcaccac 867 <210> 155 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7034_VH <400> 155 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 156 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7034_VL <400> 156 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Ser Ser Pro Thr Thr Ile 35 40 45 Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly 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tccaaccaca 600 atcatctacc gggacgataa gagacccgac ggggtgtccg atcgattctc cggatctatc 660 gaccggtcaa gcaagagtgc ttcactgacc attagcaatc tgaaaacaga ggacgaagca 720 gattactttt gccagtccta ttcctctggc ttcatctttg gaggcgggac taaactgacc 780 gtgctgggcg cggccgcagg tgcaggtggt gattacaaag atgatgacga taaaggtgca 840 gcggcgcatc accatcatca ccac 864 <210> 158 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7035_VL <400> 158 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Phe Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe 85 90 95 Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 159 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C3E-7035 <400> 159 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgga 60 gaagtgcagc tggtggaatc cggggggggc ctggtgcagc ctggggggag cctgagactg 120 agttgtgccg cctctggggt gacatttaac tactatggca tgtcttggat ccgccaggca 180 cctggaaagg gcctggagtg ggtggccagc atcactaatt ccggcgggcg aatctactat 240 cccgacagcg tcaagggcag gttcacaatt tcccgcgaga acacacagaa aactctgtac 300 ctgcagatga atagcctgag agccgaagat acagctgtgt actattgcac tctggacggc 360 agggatgggt gggtcgccta ttgggggcag ggaaccctgg tgacagtcag ctccggagga 420 ggaggatctg gcggaggagg cagtggggga ggcgggtcaa tggcccaggc tgtgctcact 480 cagccgtcct ctgtttctgg cgtacctggc caacgggtga ccattagctg taaaaggaat 540 accgggaata tcgggtctaa ctacgtgaac tggtatcagc agcttccagg gacagctccc 600 aagttgctga tctatcgcga cgacaaaaga ccctcagggg tccctgaccg atttagtggc 660 agcaaaagcg gtacttccgc ttccctggcg ataaccggct ttcaggccga agatgaggca 720 gactactatt gccagtcata ttccagcggc ttcatcttcg gaggcggaac taagctgaca 780 gtgctgggcg cggccgcagg tgcaggtggt gattacaaag 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ggggtgacat ttaactacta tggcatgtct 900 tggatccgcc aggcacctgg aaagggcctg gagtgggtgg ccagcatcac taattccggc 960 gggcgaatct actatcccga cagcgtcaag ggcaggttca caatttcccg cgagaacaca 1020 cagaaaactc tgtacctgca gatgaatagc ctgagagccg aagatacagc tgtgtactat 1080 tgcactctgg acggcaggga tgggtgggtc gcctattggg ggcagggaac cctggtgaca 1140 gtcagctccg gaggaggagg atctggcgga ggaggcagtg ggggaggcgg gtcaatggcc 1200 caggctgtgc tcactcagcc gtcctctgtt tctggcgtac ctggccaacg ggtgaccatt 1260 agctgtaaaa ggaataccgg gaatatcggg tctaactacg tgaactggta tcagcagctt 1320 ccagggacag ctcccaagtt gctgatctat cgcgacgaca aaagaccctc aggggtccct 1380 gaccgattta gtggcagcaa aagcggtact tccgcttccc tggcgataac cggctttcag 1440 gccgaagatg aggcagacta ctattgccag tcatattcca gcggcttcat cttcggaggc 1500 ggaactaagc tgacagtgtt gggcgcggcc gcaggtgcag gtggtgatta caaagatgat 1560 gacgataaag gtgcagcggc gcatcaccat catcaccac 1599 <210> 168 <211> 1593 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C2037-C3E-7036 <400> 168 atgaaacacc 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nucleotide sequence of E1018 VH <400> 190 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcgggctgag atctgacgac acggccgttt attactgtaa gagtggtagt 300 gtaaggcctc cctggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 191 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of E1018 VH <400> 191 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Ser Gly Ser Val Arg Pro Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 192 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of E1018 VL <400> 192 cagcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcaggtc caacatcgga ggtaatattg taagttggta ccagcagttc 120 ccaggaacgg cccccagact cctcacttat cggaatactc ggcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag 240 tctgaggatg aggctgacta ttattgtgca gcatgggatg acagcctggg gggtgttgtg 300 ttcggaggag gcaccaagct gaccgtccta 330 <210> 193 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of E1018 VL <400> 193 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Thr Tyr Arg Asn Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys 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acid sequence of D1012 VL <400> 197 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Pro Cys Ser Gly Gly Thr Thr Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Phe Leu 35 40 45 Met Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Glu 65 70 75 80 Thr Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 198 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of h2B1 Fab HC_1 <400> 198 atgaggccta cctgggcctg gtggctgttc ctggtgctgc tgctggccct gtgggccccc 60 gcccggggcc aggtgcagct ggtggagtcc ggcggcggcc tggtgaagcc cagccagacc 120 ctgtccctga cctgcacatt cagcggcttt tccctgaaca catacgatat gggagtggga 180 tggatcagac agccacctgg caagggcctg gagtggatcg gcaacatctg gtgggacgat 240 gacaagtact ataatccctc tctgaagagc agagtgacca tctctaagga tacaagcaac 300 aatcaggcct ccctgaagct gagctccgtg accgccgccg acacagccgt gtactattgc 360 gccaggatcg agacagtgcg ggtgagccgg aagggattcg cacactgggg acagggcacc 420 ctggtgacag tgtctagcgc tagcacaaag ggacctagcg tgttcccact ggccccttcc 480 tctaagtcca cctctggagg aacagccgcc ctgggctgta gggtgaagga ctatttccct 540 gagccagtga ccgtgtcctg gaactctggg gccctgacca gcggagtgca cacatttcct 600 gccgtgctgc agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgaccgt gccatcctct 660 agcctgggca cccagacata tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa tacaaaggtc 720 gacaagcggg tggagcccaa gtcctgtgac aagacccaca catgcccacc ctgtccggcg 780 ccagaggctg caggaggacc aagcgtgttc ctgtttccac ccaagcctaa agacacactg 840 atgatttccc gaacccccga agtcacatgc gtggtcgtgt ctgtgagtca cgaggaccct 900 gaagtcaagt tcaactggta cgtggatggc gtcgaggtgc ataatgccaa gactaaacct 960 agggaggaac agtacaactc aacctatcgc gtcgtgagcg tcctgacagt gctgcaccag 1020 gattggctga acggcaaaga atataagtgc aaagtgagca ataaggccct gcccgctcct 1080 atcgagaaaa ccatttccaa ggctaaaggg cagcctcgcg aaccacaggt ctacgtgctg 1140 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cagcggcttt tccctgaaca catacgatat gggagtggga 180 tggatcagac agccacctgg caagggcctg gagtggatcg gcaacatctg gtgggacgat 240 gacaagtact ataatccctc tctgaagagc agagtgacca tctctaagga tacaagcaac 300 aatcaggcct ccctgaagct gagctccgtg accgccgccg acacagccgt gtactattgc 360 gccaggatcg agacagtgcg ggtgagccgg aagggattcg cacactgggg acagggcacc 420 ctggtgacag tgtctagcgc tagcaccaag ggacctagcg tgttcccaga ggccccttcc 480 tctaagtcca cctctggagg aacagccgcc ctgggctgtc tggtgaccga ctatttccct 540 gagccagtga cagtgtcctg gaactctggg gccctgacca gcggagtgca cacatttcct 600 gccgtgctgg agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgaccgt gccatcctct 660 agcctgggca cccagacata tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa tacaaaggtc 720 gacaagagag tggagcccaa gtcctgtgac aagacccaca catgcccacc ctgtccggcg 780 ccagaggctg caggaggacc aagcgtgttc ctgtttccac ccaagcctaa agacacactg 840 atgatttccc gaacccccga agtcacatgc gtggtcgtgt ctgtgagtca cgaggaccct 900 gaagtcaagt tcaactggta cgtggatggc gtcgaggtgc ataatgccaa gactaaacct 960 agggaggaac agtacaactc aacctatcgc 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tcattcaaca gaggggagtg c 711 <210> 205 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of h2B1 Fab LC_2 <400> 205 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Ala Thr Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 35 40 45 Ser Gln Ser Val Gly Ile Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg His Thr Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 100 105 110 Gln His Gly Ser Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Arg Val Gly Cys Trp Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 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gcctgtgacc 540 gtgtcctgga actctggggc cctgaccagc ggagtgcaca catttccagc cgtgctgcag 600 agctccggcc tgtatagcct gtctagcgtg gtgacagtgc cctccagtag cctgggcact 660 cagacttata tctgtaatgt caaccacaaa ccatcaaaca ccaaagtcga caagaaagtg 720 gagcccaaga gctgtgataa aactcatacc tgcccacctt gtccggcgcc agaggctgca 780 ggaggaccaa gcgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acacactgat gatttcccga 840 acccccgaag tcacatgcgt ggtcgtgtct gtgagtcacg aggaccctga agtcaagttc 900 aactggtacg tggatggcgt cgaggtgcat aatgccaaga ctaaacctag ggaggaacag 960 tacaactcaa cctatcgcgt cgtgagcgtc ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020 ggcaaagaat ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaacc 1080 atttccaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtct acgtctaccc cccatcaaga 1140 gatgaactga caaaaaatca ggtctctctg acatgcctgg tcaaaggatt ctacccttcc 1200 gacatcgccg tggagtggga aagtaacggc cagcccgaga acaattacaa gaccacaccc 1260 cctgtcctgg actctgatgg gagtttcgct ctggtgtcaa agctgaccgt cgataaaagc 1320 cggtggcagc agggcaatgt gtttagctgc tccgtcatgc acgaagccct gcacaatcac 1380 tacacacaga agtccctgag cctgagccct ggc 1413 <210> 207 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7034 Fab HC <400> 207 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 100 105 110 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp 115 120 125 Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Trp Leu Gly Cys Asp Val Thr Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro 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ggcgcccagc 420 gtgactctgt ttccacccag ctccgagcag ctgcaggcca ataaggctag actggtctgt 480 ctgatttccg acttctaccc cggggctgtg acagtcgcat ggaaggccga ttctagtcct 540 gtgaaagcag gagtcgagac cacaactcca tcaaagcaga gcaacaacaa gtacgcagcc 600 tcaagctatc tgtctctgac acctgaacag tggaaaagcc accggtctta tagttgtcag 660 gtgactcacg agggctcaac agtggaaaag acagtcgcac ccgcagaatg ctca 714 <210> 209 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7034 Fab LC <400> 209 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser 20 25 30 Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn 35 40 45 Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu 50 55 60 Gly Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser 85 90 95 Ala Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 100 105 110 Phe 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aggatctact atcccgactc cgtgaagggc cggtttacaa tctctagaga gaacacccag 300 aagacactgt acctgcagat gaacagcctg cgggccgagg ataccgccgt gtactattgt 360 acactggacg gcagagacgg atgggtggca tattggggac agggcaccct ggtgacagtg 420 agctccgcta gcactaaagg accaagcgtg tttccactgg ctccatcatc caaaagcaca 480 agcggcggga ctgcctggct gggctgtaag gtgaaggact acttccccga gcctgtgacc 540 gtgtcctgga actctggggc cctgaccagc ggagtgcaca catttccagc cgtgctgcag 600 agctccggcc tgtatagcct gtctagcgtg gtgacagtgc cctcctcaag cctgggcact 660 cagacctata tttgtaatgt caaccataaa ccttccaaca ctaaagtcga caagaaagtg 720 gagcccaaga gctgtgataa aactcatacc tgcccacctt gtccggcgcc agaggctgca 780 ggaggaccaa gcgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acacactgat gatttcccga 840 acccccgaag tcacatgcgt ggtcgtgtct gtgagtcacg aggaccctga agtcaagttc 900 aactggtacg tggatggcgt cgaggtgcat aatgccaaga ctaaacctag ggaggaacag 960 tacaactcaa cctatcgcgt cgtgagcgtc ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020 ggcaaagaat ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaacc 1080 atttccaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtct acgtctaccc cccatcaaga 1140 gatgaactga caaaaaatca ggtctctctg acatgcctgg tcaaaggatt ctacccttcc 1200 gacatcgccg tggagtggga aagtaacggc cagcccgaga acaattacaa gaccacaccc 1260 cctgtcctgg actctgatgg gagtttcgct ctggtgtcaa agctgaccgt cgataaaagc 1320 cggtggcagc agggcaatgt gtttagctgc tccgtcatgc acgaagccct gcacaatcac 1380 tacacacaga agtccctgag cctgagccct ggc 1413 <210> 211 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7036 Fab HC <400> 211 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 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gtgacaatct cctgcaccgg caacacaggc aatatcggct ctaactacgt gaattggtat 180 cagcagctgc ccggcacagc ccctaagctg ctgatctacc gggacgataa gcggcccagc 240 ggagtgccag acaggttctc cggctctaag agcggcacct ccgcctctct ggccatcaca 300 ggctttcagg ccgaggacga ggccgattac tattgtcagt cctattctag cggcttcatc 360 tttggaggag gaaccaagct gacagtgctg ggccagccca aggcggcgcc cagtgtcaca 420 ctgtttcccc ctagctccga ggaactgcag gctaacaccg caacactgga ctgtctgatc 480 agcgacttct accctggagc tgtgactgtc gcctggaagg ctgattctag tccagtgaaa 540 gcaggcgtcg agaccacaac tccctctaag cagagtaaca acaagtacgc agcctcaagc 600 tatctgtcac tgaccccaga acagtggaag agccaccgga gctattcctg ccaggtcact 660 cacgaaggct ccactgtcga gaaaaccgtc gctcccaccg aatgttca 708 <210> 213 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-7036 Fab LC <400> 213 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ser Ser 20 25 30 Val Ser Gly Val Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser 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sequence of h2B1 Fab HC_3 <400> 214 atgaggccta cctgggcctg gtggctgttc ctggtgctgc tgctggccct gtgggccccc 60 gcccggggcc aggtgcagct ggtggagtcc ggcggcggcc tggtgaagcc cagccagacc 120 ctgtccctga cctgcacatt cagcggcttt tccctgaaca catacgatat gggagtggga 180 tggatcagac agccacctgg caagggcctg gagtggatcg gcaacatctg gtgggacgat 240 gacaagtact ataatccctc tctgaagagc agagtgacca tctctaagga tacaagcaac 300 aatcaggcct ccctgaagct gagctccgtg accgccgccg acacagccgt gtactattgc 360 gccaggatcg agacagtgcg ggtgagccgg aagggattcg cacactgggg acagggcacc 420 ctggtgacag tgtctagcgc tagcacaaag ggacctagcg tgttcccact ggccccttcc 480 tctaagtcca cctctggagg aacagccgcc ctgggctgtc tggtgaagga ctatttccct 540 gagccagtga ccgtgtcctg gaactctggg gccctgacca gcggagtgca cacatttcct 600 gccgtgctgc agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgaccgt gccatcctct 660 agcctgggca cccagacata tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa tacaaaggtc 720 gacaagagag tggagcccaa gtcctgtgac aagacccaca catgcccacc ctgtccggcg 780 ccagaggctg caggaggacc aagcgtgttc ctgtttccac ccaagcctaa agacacactg 840 atgatttccc gaacccccga agtcacatgc gtggtcgtgt ctgtgagtca cgaggaccct 900 gaagtcaagt tcaactggta cgtggatggc gtcgaggtgc ataatgccaa gactaaacct 960 agggaggaac agtacaactc aacctatcgc gtcgtgagcg tcctgacagt gctgcaccag 1020 gattggctga acggcaaaga atataagtgc aaagtgagca ataaggccct gcccgctcct 1080 atcgagaaaa ccatttccaa ggctaaaggg cagcctcgcg aaccacaggt ctacgtgctg 1140 ccccctagcc gcgacgaact gactaaaaat caggtctctc tgctgtgtct ggtcaaagga 1200 ttctaccctt ccgacatcgc cgtggagtgg gaaagtaacg gccagcccga gaacaattac 1260 ctgacctggc cccctgtgct ggactctgat gggagtttct ttctgtattc aaagctgaca 1320 gtcgataaaa gccggtggca gcagggcaat gtgttcagct gctccgtcat gcacgaagca 1380 ctgcacaacc attacactca gaagtccctg tccctgtcac ctggc 1425 <210> 215 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of h2B1 Fab HC_3 <400> 215 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr 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aaaggattct acccttccga catcgccgtg gagtgggaaa gtaacggcca gcccgagaac 1320 aattacaaga ccacaccccc tgtcctggac tctgatggga gtttcgctct ggtgtcaaag 1380 ctgaccgtcg ataaaagccg gtggcagcag ggcaatgtgt ttagctgctc cgtcatgcac 1440 gaagccctgc acaatcacta cacacagaag tccctgagcc tgagccctgg c 1491 <210> 225 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C3E-8015 <400> 225 Met Arg Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Ala Arg Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Arg Ser Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 100 105 110 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp 115 120 125 Val Ala Tyr Trp Gly 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agagtgacca tctctaagga tacaagcaac 300 aatcaggcct ccctgaagct gagctccgtg accgccgccg acacagccgt gtactattgc 360 gccaggatcg agacagtgcg ggtgagccgg aagggattcg cacactgggg acagggcacc 420 ctggtgacag tgtctagcgc tagcacaaag ggacctagcg tgttcccact ggccccttcc 480 tctaagtcca cctctggagg aacagccgcc ctgggctgtc tggtgaagga ctatttccct 540 gagccagtga ccgtgtcctg gaactctggg gccctgacca gcggagtgca cacatttcct 600 gccgtgctgc agagctccgg cctgtacagc ctgtctagcg tggtgaccgt gccatcctct 660 agcctgggca cccagacata tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa tacaaaggtc 720 gacaagagag tggagcccaa gtcctgtgac aagacccaca catgcccacc ctgtccggcg 780 ccagaggctg caggaggacc aagcgtgttc ctgtttccac ccaagcctaa agacacactg 840 atgatttccc gaacccccga agtcacatgc gtggtcgtgt ctgtgagtca cgaggaccct 900 gaagtcaagt tcaactggta cgtggatggc gtcgaggtgc ataatgccaa gactaaacct 960 agggaggaac agtacaactc aacctatcgc gtcgtgagcg tcctgacagt gctgcaccag 1020 gattggctga acggcaaaga atataagtgc aaagtgagca ataaggccct gcccgctcct 1080 atcgagaaaa ccatttccaa ggctaaaggg cagcctcgcg 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The second Xaa is any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 238 Ile Thr Xaa Xaa Gly Gly Arg Ile 1 5 <210> 239 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_modified_L_CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 239 Arg Xaa Asp 1 <210> 240 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_VH_of_variant_of_C3E-7034 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(54) <223> The first and second Xaa's are any naturally occurring amino acid <400> 240 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Xaa Xaa Gly Gly Arg Ile 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Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 247 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7087 <400> 247 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Arg Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Gln Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 248 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7088 <400> 248 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Arg Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Asn Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 249 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7089 <400> 249 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Arg Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Ser Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 250 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7090 <400> 250 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Arg Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Ala Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 251 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7091 <400> 251 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Ser Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Gly Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 252 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7092 <400> 252 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Ser Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Gln Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 253 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7093 <400> 253 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Ser Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Asn Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 254 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7094 <400> 254 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Ser Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Ser Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265 <210> 255 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino_acid_sequence_of_C3E-7095 <400> 255 Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr 20 25 30 Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Ile Thr Ser Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Thr Leu Asp Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val 130 135 140 Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Thr Thr Ile Ile Tyr Arg Ala Asp Lys Arg Pro Asp Gly 180 185 190 Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Gly Ala Ala Ala His His His His His His 260 265

Claims (87)

  1. 하기 (I) 내지 (III) 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편:
    (II)
    서열번호 48로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 49로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 50으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 57로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 58로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 59로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (I)
    서열번호 45로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 46으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 47로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 54로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 55로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 56으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    (III)
    서열번호 51로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 52로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 53으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 60으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 61로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 62로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (II)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  3. 제 1 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (I)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  4. 제 1 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 (III)에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  8. 제 1 항, 제 2 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기, 및
    서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
    서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  9. 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 74로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 78로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70으로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    ·서열번호 80으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  10. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기, 또는
    서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기,
    서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기, 및
    서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  11. 제 1 항, 제 4 항, 제 6 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ·서열번호 86으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 88로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 90으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    ·서열번호 92로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 126번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc를 포함하는, 항체.
  13. 인간 GPRC5D에 결합하고, 하기 <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편:
    <1>
    서열번호 111로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 112로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 113으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 114로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 115로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 116으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    <2>
    서열번호 117로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 118로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 119로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 120으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 121로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 122로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    <3>
    서열번호 123으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 124로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 125로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 126으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 127로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 128로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    <4>
    서열번호 129로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1,
    서열번호 130으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 131로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 132로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1,
    서열번호 133으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 134로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  14. 제 13 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <1>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  15. 제 13 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <2>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  16. 제 13 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <3>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  17. 제 13 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 <4>에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열,
    서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열,
    서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열, 및
    서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역,
    및
    서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열,
    서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열,
    서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열, 및
    서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  19. 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ·서열번호 97로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 99로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 101로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 103으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 105로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 107로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는
    ·서열번호 109로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 135로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    의 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  20. ·서열번호 144로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 145로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    ·서열번호 146으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 147로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
    ·서열번호 148로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 149로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    ·서열번호 150으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 151로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    의 어느 하나의 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  21. 제 8 항 내지 제 12 항 및 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  22. 제 8 항 내지 제 12 항 및 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  23. 제 8 항 내지 제 12 항 및 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  24. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 결합하는 인간 GPRC5D 상의 부위에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  25. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 인간 GPRC5D 상으로의 결합에 있어서 경합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) GPRC5D에 결합하는, 항체 또는 항원 결합성 단편.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합성 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv, 또는 sdAb인, 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  28. 제 2 항, 제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및
    i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
    을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  29. 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역
    을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  30. 제 2 항, 제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  31. 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  33. 제 32 항에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
  34. 제 32 항에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 제 33 항에 기재된 벡터를 포함하거나, 또는 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 산생하는 세포.
  35. 제 32 항에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 제 33 항에 기재된 벡터를 포함하거나, 또는 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 세포 표면 상에 발현하는 인공 면역 세포.
  36. 제 34 항에 기재된 세포를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 회수하는 공정을 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 제조 방법.
  37. 제 36 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편.
  38. 제 1 항 내지 제 31 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 제 32 항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 제 33 항에 기재된 벡터, 또는 제 35 항에 기재된 인공 면역 세포를 유효 성분으로서 함유하는, 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    암의 치료 및/또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  40. 제 39 항에 있어서,
    암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는, 유방암, 자궁 내막암, 난소암, 폐암, 위암, 전립선암, 신암, 간암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 자궁 경부암, 혈액암, 림프종, 또는 악성 흑색종인, 의약 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서,
    암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 다발성 골수종인, 의약 조성물.
  42. 제 1 항 내지 제 31 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 항원 결합성을 갖는 분자.
  43. 제 42 항에 있어서,
    다중특이적인 분자.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 31 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과,
    서열번호 183으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 238로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 185로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 186으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 239로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 188로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 중쇄 CDR2의
    1번째의 Xaa는 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    또한 2번째의 Xaa는 S이거나, 또는
    1번째의 Xaa는 N이고,
    또한 2번째의 Xaa는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    상기 경쇄 CDR2의
    Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 것을 특징으로 하는 분자.
  46. 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서,
    상기 중쇄 CDR2의
    1번째의 Xaa는 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 2번째의 Xaa는 S이며, 또한
    상기 경쇄 CDR2의
    Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 것을 특징으로 하는 분자.
  47. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 240으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    서열번호 240으로 나타나는 아미노산 서열의 1번째의 Xaa는 (A, E, G, H, I, L, T, V, R, 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 또한 2번째의 Xaa는 S이거나, 또는
    1번째의 Xaa는 N이고, 또한 2번째의 Xaa는 (E, R, F, Y, L, V, I, K, 및 T)로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
    서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의
    Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
    분자.
  48. 제 47 항에 있어서,
    서열번호 240의
    1번째의 Xaa는 (R 및 S)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    2번째의 Xaa는 S이며, 또한
    서열번호 241, 242, 및 243 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열의
    Xaa는 (Q, A, G, S, N, 및 D)로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
    분자.
  49. 제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 31 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과,
    서열번호 183으로 나타나는 중쇄 CDR1의 아미노산 서열,
    서열번호 184로 나타나는 중쇄 CDR2의 아미노산 서열, 및
    서열번호 185로 나타나는 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 186으로 나타나는 경쇄 CDR1의 아미노산 서열,
    서열번호 187로 나타나는 경쇄 CDR2의 아미노산 서열, 및
    서열번호 188로 나타나는 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 155로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 156, 158, 및 160 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 분자.
  51. 제 44 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체의 항원 결합성 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv, 또는 sdAb인, 분자.
  52. 제 44 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체가, 인간 면역글로불린 정상 영역, 또는 Fc 또는 변이형 Fc를 포함하는 인간화 항체 또는 인간 항체인, 분자.
  53. 제 44 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 180, 181, 및 182 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편인, 분자.
  54. 제 40 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 제 1 항 내지 제 31 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는, 분자.
  55. 제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항, 제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 이하에 나타내는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자:
    ·서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 132번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 130번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 244의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 244의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 245의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 245의 135 내지 241의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 246의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 246의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 247의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 247의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 248의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 248의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 249의 2 내지 119의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 249의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 250의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 250의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 251의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 251의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 252의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 252의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 253의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 253의 135 내지 242의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    ·서열번호 254의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 254의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    또는
    ·서열번호 255의 2 내지 119의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 255의 135 내지 243의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  56. 제 55 항에 있어서,
    인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 분자.
  57. 제 55 항에 있어서,
    인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 분자.
  58. 제 55 항에 있어서,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  59. 제 55 항에 있어서,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 225로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 227로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 229로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 231로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 233으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 또는
    서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 235로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  60. 제 55 항에 있어서,
    인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    i) 서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    ii) 서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이,
    v) 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 133 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역, 또는
    vi) 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는, 분자.
  61. 제 55 항에 있어서,
    인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
    iii) 서열번호 215로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역,
    또는
    iv) 서열번호 237로 나타나는 아미노산 서열의 147 내지 476번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 217로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함하고,
    인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이,
    v) 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 133 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역, 또는
    vi) 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 143 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역과, 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 131 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 추가로 포함하는, 분자.
  62. 제 55 항에 있어서,
    서열번호 199로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 203으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 207로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 209로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 238번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    또는
    서열번호 201로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 475번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 205로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 237번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 211로 나타나는 아미노산 서열의 25 내지 471번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 213으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 236번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  63. 제 55 항에 있어서,
    인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 서열번호 76으로 나타나는 아미노산 서열의 20 내지 142번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72로 나타나는 아미노산 서열의 21 내지 127번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역과, 추가로 변이형 Fc를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이, 추가로 변이형 Fc를 포함하는, 분자.
  64. 제 55 항에 있어서,
    서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 219로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 266번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편,
    또는
    서열번호 223으로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 271번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 GPRC5D에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 및 서열번호 221로 나타나는 아미노산 서열의 24 내지 264번째의 아미노산 잔기로 표시되는 아미노산 서열과 변이형 Fc를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는, 분자.
  65. 제 53 항에 있어서,
    상기 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 제 19 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편이 링커에 의해 결합하여 이루어지거나, 또는 링커 없이 결합하여 이루어지는, 분자.
  66. 제 54 항 또는 제 65 항에 있어서,
    서열번호 171 내지 179 중 어느 하나로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는, 분자.
  67. 제 50 항, 제 53 항, 제 58 항, 제 59 항, 제 62 항, 제 64 항, 제 65 항 및 제 66 항 중 어느 한 항에 기재된 분자에 포함되는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보 쇄와 스트린전트한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
  68. 제 50 항, 제 53 항, 제 58 항, 제 59 항, 제 62 항, 제 64 항, 제 65 항 및 제 66 항 중 어느 한 항에 기재된 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
  69. 제 50 항, 제 53 항, 제 58 항, 제 59 항, 제 62 항, 제 64 항, 제 65 항 및 제 66 항 중 어느 한 항에 기재된 분자에 포함되는 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편에 포함되는 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 이루어지는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
  70. 제 42 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 분자.
  71. 제 43 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적인 분자.
  72. 제 42 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드인 분자.
  73. 제 72 항에 기재된 분자가 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  74. 제 73 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  75. 제 73 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 74 항에 기재된 벡터, 또는 제 71 항에 기재된 분자를 산생하는 세포.
  76. 제 75 항에 기재된 세포를 배양하는 공정, 및 그 배양물로부터 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및/또는 인간 GPRC5D에 결합하는 분자를 회수하는 공정을 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자의 제조 방법.
  77. 제 76 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 인간 CD3 및 사이노몰거스 원숭이 CD3, 및 인간 GPRC5D에 결합하는 분자.
  78. 제 77 항에 있어서,
    사이노몰거스 원숭이 GPRC5D에 결합하는 분자.
  79. 제 42 내지 제 72 항, 제 77 항 및 제 78 항 중 어느 한 항에 기재된 분자, 제 73 항에 기재된 폴리뉴클레오티드, 또는 제 74 항에 기재된 벡터를 유효 성분으로서 함유하는, 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  80. 제 79 항에 있어서,
    암의 치료 및/또는 예방을 위한, 의약 조성물.
  81. 제 80 항에 있어서,
    암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는, 유방암, 자궁 내막암, 난소암, 폐암, 위암, 전립선암, 신암, 간암, 췌장암, 대장암, 식도암, 방광암, 자궁 경부암, 혈액암, 림프종, 또는 악성 흑색종인, 의약 조성물.
  82. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
    암이, GPRC5D 단백질을 발현하고 있는 다발성 골수종인, 의약 조성물.
  83. 제 42 항 내지 제 72 항, 제 77 항 및 제 78 항 중 어느 한 항에 기재된 분자, 또는 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.
  84. 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
    GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션(redirection)에 의해, GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해(cytotoxicity)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  85. 제 83 항에 있어서,
    GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션에 의해, GPRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  86. 제 42 항 내지 제 72 항, 제 77 항 및 제 78 항 중 어느 한 항에 기재된 분자, 또는 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로의 T 세포 리디렉션에 의해 PRC5D를 발현하고 있는 세포에 대한 세포상해를 유도하는 방법.
  87. 제 42 항 내지 제 72 항, 제 77 항 및 제 78 항 중 어느 한 항에 기재된 분자, 또는 제 79 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 투여하는 공정을 포함하는, GPRC5D를 발현하고 있는 세포로 T 세포를 리디렉션하는 방법.
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