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KR20200105849A - 항-tigit 항체 및 치료제 및 진단제로서 이의 용도 - Google Patents

항-tigit 항체 및 치료제 및 진단제로서 이의 용도 Download PDF

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KR20200105849A KR1020207020512A KR20207020512A KR20200105849A KR 20200105849 A KR20200105849 A KR 20200105849A KR 1020207020512 A KR1020207020512 A KR 1020207020512A KR 20207020512 A KR20207020512 A KR 20207020512A KR 20200105849 A KR20200105849 A KR 20200105849A
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Abstract

본 발명은 TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains, WUCAM 또는 Vstm3)에 특이적으로 결합하고, 면역 세포에서 TIGIT-매개 세포 신호전달 및 활성을 억제하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 암, 감염성 질환 또는 TIGIT-매개 기능에 의해 조절될 수 있는 다른 병리학적 장애를 치료 또는 진단하기 위한 이들 항체의 용도를 포함한다.

Description

항-TIGIT 항체 및 치료제 및 진단제로서 이의 용도
본 출원은 TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)는 항-종양 면역에서 T- 및 NK 세포-매개 기능적 활성을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 CD28 단백질 패밀리의 구성원인 I 형 막관통 단백질이다(Boles KS, et al., 2009 Eur J Immunol, 39:695-703; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57).
TIGIT를 코딩하는 유전자 및 cDNA는 마우스 및 인간에서 클로닝되고 특성화되었다. 전장(full length) 인간 TIGIT는 길이 244개의 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지며, 여기서 처음 21개의 아미노산은 신호 펩타이드로 구성된다. 성숙한 인간 TIGIT의 아미노산 서열은 223개의 아미노산(aa) 잔기(NCBI accession number: NM_173799)를 포함한다. 성숙한 인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)은 V-형 Ig-유사 도메인(서열번호 1의 아미노산 39-127에 상응)을 갖는 120개의 아미노산 잔기(서열번호 2, 서열번호 1의 아미노산 22-141에 상응), 이어서 21 aa 막관통 서열 및 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)를 갖는 82 aa 세포질 도메인으로 구성된다(Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57; Stengel KF, et al. 2012 PNAS 109:5399-04). ECD에 있어서, 인간 TIGIT는 마우스 및 시노몰구스 원숭이와 각각 단지 59% 및 87%의 서열 동일성을 공유한다.
TIGIT는 T 세포(활성화된 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T(Treg) 세포 및 폴리큘라 T 헬퍼(Tfh) 세포 포함) 및 NK 세포상에서 발현된다(Boles KS, et al., 2009 Eur J Immunol, 39:695-703; Joller N, et al., 2014 Immunity 40:569-81; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41:902-15; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57).
지금까지, 2개의 TIGIT 리간드, CD155(poliovirus receptor 또는 PVR로도 알려짐) 및 CD112(또한 poliovirus receptor-related 2, PVRL2, nectin-2로도 알려짐)가 확인되었다. 이들 리간드는 주로 APC(예컨대 수지상세포 및 대식세포) 및 종양 세포에서 발현된다(Casado JG , et al., 2009 Cancer Immunol Immunother 58:1517-26; Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41:902-15; Mendelsohn CL et al., 1989 56:855-65; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63; Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol , 10:48-57). 면역 "체크포인트(checkpoint)" 분자로서, TIGIT는 그의 리간드인 CD155 및 CD112와 결합될 때 면역 세포에서 억제 신호전달을 개시한다. CD155에 대한 TIGIT의 결합 친화도(Kd: ~1 nM)는 CD112 보다 훨씬 높고, TIGIT:CD112 상호작용이 억제 신호를 매개하는 데 기능적으로 관련이 있는지 여부는 여전히 밝혀져야 할 것으로 남아있다. 공동 자극 수용체 CD226(DNAM-1)은 동일한 리간드에 낮은 친화도(Kd: ~100 nM)로 결합하지만, 양성 신호를 전달한다(Bottino C, et al., 2003 J Exp Med 198:557-67). 또한, "TIGIT-유사" 수용체 CD96(Tactile)도 동일한 경로에서 유사하게 억제 역할을 한다(Chan CJ, et al., 2014 Nat. Immunol 15:431-8).
TIGIT는 상이한 메커니즘을 통해 면역 반응을 억제할 수 있다. 먼저, 수지상세포(DC) 상의 TIGIT와 PVR 간의 상호작용은 DC에서 "역 신호전달(reverse signaling)"을 전달하여 IL-10의 상향 조절 및 IL-12 분비를 감소시켜, T-세포 활성화를 억제할 수 있다(Yu X, et al. Nat Immunol. 2009 10:48-57). 둘째로, TIGIT는 더 큰 친화도로 CD155에 결합하여 DNAM-1-CD155 상호작용과 경쟁한다. 셋째로, T 세포에서 TIGIT의 직접 결찰은 TCR-매개 활성화를 하향 조절할 수 있고, NK 세포에서 TIGIT의 증식 및 관여는 NK 세포 세포독성을 차단할 수 있다(Joller N, et al. 2011 186: 1338-42; Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63). 넷째로, Tregs에서의 TIGIT 발현은 종양 조직에서 고도로 활성화되고 억제된 표현형과 관련이 있으며, Treg에서의 TIGIT 신호전달은 Treg 안정성을 선호할 수 있다(Joller N, et al. Immunity 2014 40:569-81; Kurtulus S, et al. J Clin Invest. 2015 125: 4053-4062).
TIGIT는 면역글로불린 테일 타이로신(ITT)-유사 모티프에 이어서 그의 세포질 테일에 타이로신 기반 면역수용체 억제화 모티프(ITIM)를 갖는다(Yu X, et al. Nat Immunol . 2009 10:48-57; Engels N, et al. Curr Opin Immunol 2011 23: 324-329). 이들 모티프는 포스파타제 SHIP-1 및 β-아레스틴 2의 보충을 매개할 수 있으며(Li M, et al. J Biol Chem . 2014 289:17647-17657; Liu S, et al. Cell death and differentiation 2013 20: 456 -464), 이에 따라 TIGIT는 억제 신호를 본질적으로 전달하여 활성화 신호를 약화시킬 수 있는 메커니즘을 제공한다.
종양 침윤 림프구(TILs) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)에서 TIGIT 발현의 상향 조절은 폐(Tassi, et al., Cancer Res. 2017 77: 851-861), 식도(Xie J, et al., Oncotarget 2016 7:63669-63678), 유방(Gil Del Alcazar CR, et al . 2017 Cancer Discov), 급성 골수성 백혈병(AML)(Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66) 및 흑색종(Chauvin JM , et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058)과 같은 많은 유형의 암에서 보고되어 왔다. AML에서 TIGIT의 증가된 발현은 환자 생존 결과의 불량한 예후와 관련이 있다(Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66). TIGIT 신호전달의 상향 조절은 암에 대한 면역 내성뿐만 아니라 만성 바이러스 감염에도 중요한 역할을 한다. HIV 감염 동안, T 세포에서 TIGIT의 발현은 바이러스 양 및 질병 진행과 유의하게 더 높고 양의 상관관계가 있었다(Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349). 또한, TIGIT 수용체 단독의 봉쇄 또는 다른 봉쇄와의 조합은 in vitro 및 in vivo에서 기능적으로 "소진된" T 세포를 구제할 수 있다(Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058; Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349; Johnston RJ, et al. Cancer Cell 2014 26:923-937). 암 및 바이러스 감염의 경우, TIGIT 신호전달의 활성화는 면역 세포 기능장애를 촉진하여, 암 성장 또는 늘어난 바이러스 감염을 초래한다. 치료제에 의한 TIGIT-매개 억제 신호전달의 억제는 T 세포, NK 세포 및 수지상세포(DCs)를 비롯한 면역 세포의 기능적 활성을 회복시켜, 암 또는 만성 바이러스 감염에 대한 면역성을 향상시킬 수 있다.
그러므로, 길항성 분자에 의한 TIGIT 신호전달의 조절은 종양 또는 만성 바이러스 감염을 근절하기 위한 효율적인 면역 반응을 유도하여 면역 세포를 내성으로부터 구제할 수 있다.
본 출원은 2017년 12월 30일자로 출원된 특허 출원 번호 PCT/CN2017/120392의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로 면역 세포에서 TIGIT-매개 세포 신호전달을 억제하고, 면역 세포를 재활성화시키고, TIGIT에 특이적으로 결합함으로써 면역을 강화시키는, 일련의 단일클론 항체(mAbs)의 발견에 기초한다. 따라서, 일 관점에서, 본 출원은 인간 TIGIT(서열번호 1)에 결합할 수 있는 항-TIGIT 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일 관점의 항-TIGIT mAb의 인간화 버전에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 출원의 항체는 서열번호 3, 4, 5 또는 13으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 서열번호 3, 4, 5 또는 13의 아미노산 서열에서 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6, 7 또는 8로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 서열번호 6, 7, 또는 8의 아미노산 서열에서 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
보다 구체적인 실시 양태에서, 본 출원의 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 4 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 또는 하나 이상의 보존적 치환, 예를 들어 하나 또는 두 개의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT에 결합할 수 있고, 서열번호 9, 14, 19로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 9, 14, 19와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 서열의 차이는 프레임워크 영역에 있다. 일 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10, 15 또는 20으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT에 결합할 수 있고, 서열번호 11, 16, 21 또는 24 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 11, 16, 21 또는 24와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 서열의 차이는 프레임워크 영역에 있다. 일 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 12, 17 또는 22로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.
일 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-9 M 내지 약 1x10-12 M의 Kd 값으로 인간 TIGIT에 결합할 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 1x10-9 M 미만, 약 1x10-10 M 미만, 약 1x10-11 M 미만, 또는 약 1x10-12 M 미만의 Kd 값으로 인간 TIGIT에 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 서브클래스의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체, 및 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 유형의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 보다 구체적인 실시 양태에서, 항체의 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열번호 18의 Fc 영역이다.
일 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ의 생성을 촉진한다. 보다 구체적인 실시 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용량-의존적 방식으로 항원-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ의 생성을 촉진한다.
보다 구체적인 실시 양태에서, 본 출원의 항체는 FcγR-매개 트로고사이토시스(trogocytosis), 특히 FcγRIIB-매개 트로고사이토시스를 통해 TIGIT 수용체의 표면 발현을 감소시킨다.
일 실시예에서, 본 출원의 항체는 pH-의존적 항원 결합을 나타내며, 생리적 pH(예: pH 7.4)에서의 인간 TIGIT 대한 결합과 비교하여, 종양 미세환경에서의 약산성 pH(예: pH 6.0)에서 인간 TIGIT에 더 강한 결합을 나타낸다. 보다 구체적인 실시 양태에서, 본 출원의 항체는 (1) pH 7.4/pH 6.0에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상 보다 큰 KD 비, 및/또는 (2) 표면 플라즈몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술에 의해 측정된 바와 같이, pH 7.4에서의 Rmax보다 pH 6.0에서 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 더 큰 Rmax(RU) 값을 갖는다.
본원에 개시된 항-TIGIT mAbs는 암을 치료하고, 바이러스 감염 및 면역 관용(immune tolerance) 또는 "소진(exhaustion)"에 기계적으로 관련된 다른 인간 질병을 제어하는 데 잠재적인 치료 용도를 갖는다. 따라서, 추가의 실시예에서, 본 출원의 항-TIGIT 항체는 암 치료에 사용하기 위한 것이다. 다른 특정 실시 양태에서, 본 출원의 항-TIGIT 항체는 감염 치료, 감염성 질환 치료 및/또는 바이러스 감염 제어에 사용하기 위한 것이다. 다른 특정 실시예에서, 본 출원의 항-TIGIT 항체는 면역 관용과 관련되거나 면역 관용에 의해 유발되는 다른 인간 질병의 치료, 또는 면역 세포 활성을 증가시킴으로써 개선될 수 있는 질병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
다른 측면에서, 본 출원은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 치료적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도 1. TIGIT-mIgG2a(위) 및 TIGIT-huIgG1(아래)의 개략도. TIGIT ECD: TIGIT 세포외 도메인. N: N- 말단. C: C- 말단.
도 2. 항-TIGIT 항체 Vh(A) 및 Vk(B) 영역의 계통수(Phylogenetic trees). 후보 항-TIGIT 항체의 Vh 및 Vk 서열을 DNASTAR's Megalign software를 사용하여 정렬하였다. 계통수에 서열 상동성이 표시되었다.
도 3. 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 정제된 뮤린 항-TIGIT 항체의 친화도 측정.
도 4. 유세포 분석에 의한 TIGIT 결합의 측정.
도 5. (A) 항-TIGIT mAb에 의한 TIGIT-리간드 상호작용의 억제를 나타내는 모식도. (B) TIGIT 리간드-발현 HEK293 세포(HEK293/PVR 또는 HEK293/PVR-L2)에 대한 가용성 TIGIT(TIGIT-huIgG1 융합 단백질)의 결합은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 연속적으로 희석된 항-TIGIT 항체를 첨가하여 TIGIT-리간드 상호작용의 봉쇄를 정량적으로 측정하였다. 결과는 2회 평균 ± SD로 나타냈다.
도 6. 항-TIGIT mAb에 의한 CMV-특이적 인간 T 세포의 활성화. 인간 CMV 펩타이드(NLVPMVATV, 495-503)-민감화된 HLA-A2.1+ PBMCs(4x104)를 항-TIGIT 항체의 존재하에 밤새 CMV 펩타이드-펄스화된 타겟 세포 HCT116 세포(104)로 자극하였다. 배양 상청액 중 IFN-γ는 ELISA에 의해 결정되었다. 모든 조건을 3회 수행하였다. 결과는 평균 ± SD로 표시되었다.
도 7. 항-TIGIT mAbs는 NK 세포-매개 세포독성을 촉진한다. (A) 엔지니어링된 NK92MI/Tigit-DNAM-1 안정 세포주에서의 TIGIT 및 DNAM-1 발현. (B) hu1217-2-2/IgG1mf(0.007-30μg/ml)의 존재하에 SK-MES-1/PVR 세포에 대한 NK92MI/Tigit-DNAM-1 세포의 사멸은 실시예 8에 기재된 바와 같이 LDH(lactate dehydrogenase) 방출 분석에 의해 결정되었다. 결과는 3회 평균 ± SD로 표시되었다.
도 8. 항-TIGIT mAb hu1217-2-2/IgG1wt는 FcγR-매개 트로고사이토시스를 통해 TIGIT 수용체의 표면 발현을 감소시킨다. Jurkat/Tigit 세포를 완전한 배지에서 비오틴-표지된 항-TIGIT mAb의 존재하에 FcγR-발현 HEK293 세포와 함께 밤새 배양하였다. 일부는, 10% 인간 AB 혈청을 첨가하여 트로고사이토시스에 대한 벌크 인간 IgG의 효과를 결정하였다. SA-APC(Biolegend)로 염색하여 TIGIT 수용체의 표면 발현을 측정하였다. 유세포 분석법에 의해 MFI를 측정하였다. 모든 데이터 포인트는 2회 반복되었다. 결과는 평균 ± SD로 나타냈다.
도 9. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 항-TIGIT mAb의 ADCC 효과. (A) 건강한 공여체의 PHA-자극 PBMC에 대한 TIGIT 발현은 유세포 분석으로 결정되었다. CD4+(CD4+Foxp3-), CD8+ T 효과 및 조절 T 세포(Tregs, CD4+ Foxp3+)는 모두 유의한 수준의 TIGIT(18~41%)를 발현했다. 제시된 데이터는 3명의 건강한 공여체로부터 도출한 대표 결과이다. (B) TIGIT mAbs(30μg/mL) 또는 대조군 항체(양성 대조군으로서 5μg/ml OKT3 및 음성 대조군으로서 30μg/ml huIgG)의 존재하에, CD16+ 인간 NK 세포주 NK92MI/CD16V를 효과 세포로 사용하고, PHA-자극 PBMC를 타겟 세포로 사용하여 42시간 동안 ADCC 분석을 수행하였다. CD3+, CD8+ T 세포 및 Treg의 백분율은 유세포 분석으로 결정하였다.
도 10. 인간 PBMC에 대한 항-TIGIT mAb의 CDC 효과. CDC 분석은 타겟 세포로서 PHA-자극된 PBMC를 사용하고, 보체의 공급원으로서 자가 혈청을 사용하여 수행하였다. 15% 자가 혈청의 최종 농도에서 항-TIGIT mAb(0.01-100μg/ml)와 함께 전-활성화된 PBMC의 공배양 3일 후, CDC(y-축)의 백분율을 세포-역가 글로우로 측정하고, 실시예 11에 기재된 바와 같이 계산하였다. 공여체 A 및 B로부터의 데이터가 제시되어 있다. HuIgG를 음성 대조군으로 사용하였고, 항-MHC-A, B, C를 양성 대조군으로 사용하였다.
정의
아미노산의 보존적 아미노산 치환은 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 하기 표에 예시적으로 제시되어 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체됨을 의미한다.
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구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 다른 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
청구범위를 포함하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"와 같은 단수 형태의 단어는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 상응하는 복수의 참조(references)를 포함한다.
용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하고, 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서 및 하기의 청구범위 전체에서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함", 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 아미노산 서열, DNA 서열, 단계 또는 이들의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 아미노산 서열, DNA 서열, 단계를 배제하지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "포함하는"이라는 용어는 "함유하는", "포함된" 또는 때때로 "갖는"이라는 용어로 치환될 수 있다.
용어 "TIGIT"는 다양한 포유동물 이소타입, 예를 들어, 인간 TIGIT, 인간 TIGIT의 이종상동체(orthologs) 및 TIGIT 내에 하나 이상의 에피토프를 포함하는 유사체(analogs)를 포함한다. TIGIT의 아미노산 서열, 예를 들어 인간 TIGIT 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "투여", "투여하는", "처리하는" 및 "처리"는 동물, 인간, 실험 대상, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 대한 외인성의 약학적, 치료적, 진단적 제제 또는 조성물의 접촉을 의미한다. 세포의 처리는 시약이 세포에 접촉하는 것뿐만 아니라, 시약이 유체에 접촉하는 것을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉한다. 용어 "투여" 또는 "처리"는 또한, 예를 들어 세포의, 시약, 진단, 결합 화합물 또는 다른 세포에 의한 in vitro 및 ex vivo 처리를 포함한다. 본원에서 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
항체 또는 항체 분자
높은 친화도 및 특이성으로 TIGIT에 결합하는 항체 분자가 본원에 개시된다.
일부 실시 양태에서, 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT에 결합하고, 서열번호 3, 4, 5, 13 또는 서열번호 6, 7, 8 아미노산 서열을 포함하는 최소한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 출원의 항체는 서열번호 3, 4, 5 또는 13에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 하나 이상의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체; 및/또는 서열번호 6, 7 또는 8에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 하나 이상의 보존적 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 항-TIGIT 항체는 분리된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 재조합 항체이다.
일부 실시 양태에서, 항-TIGIT 항체는 하나 이상의 항원 결합 부위 또는 하나 이상의 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항-TIGIT 항체는 본원에 기재된 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 항원, 예를 들어, TIGIT를 인식하는 한, 항체(전장 단일클론 항체 포함) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 일반적으로 단일 특이적(monospecific)이지만, 특정 특이성(idiospecific), 이종 특이성(heterospecific) 또는 다중 특이성(polyspecific)으로 기술될 수도 있다. 항체 분자는 특이적 결합 부위에 의해 항원 상의 특이적 항원 결정기 또는 에피토프에 결합한다.
본원에서, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체의 집단을 의미하고, 즉, 집단에 포함되는 상기 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 돌연변이를 제외하고 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 통상적인(다클론; polyclonal) 항체 제제는 전형적으로 가변 도메인, 특히 상이한 에피토프에 특이적인 상보성 결정 영역(CDR)에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 이의 변형된 표현인 "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 단일클론 항체(mAbs)는 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, Kohler G et al., Nature 1975 256:495-497; U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992; Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988; 및 Colligan JE et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993를 참조할 수 있다. 본원에 개시된 mAb는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 그의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 개별 하이브리도마로부터의 세포가 pristine-primed Balb/c 마우스와 같은 마우스에 복강 내 주사되어 고농도의 원하는 mAbs를 함유하는 복수액을 생성하는 생체 내 생산에 의해 높은 역가의 mAb가 수득될 수 있다. 이소타입 IgM 또는 IgG의 MAb는 당업자에게 공지된 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 이러한 복수액 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체(tetramer)를 포함한다. 각 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 일반적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 구분된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 α, δ, ε, γ 또는 μ로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각각의 경쇄/중쇄(VL/VH) 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 일반적으로 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중 기능성 또는 이중 특이적 항체를 제외하고, 두 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역(framework regions, FR) 사이에 위치한 "상보성 결정 영역(complementarity decision region)"이라고도 하는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특정 에피토프에 결합할 수 있게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두는 FR-1(또는 FR1), CDR-1(또는 CDR1), FR-2(FR2), CDR-2(CDR2), FR-3(또는 FR3), CDR-3(CDR3) 및 FR-4(또는 FR4)를 순차적으로 포함한다. 각 도메인에 아미노산을 할당하는 것은 일반적으로 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5<m> ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 or Chothia, et al, (1989) Nature 342:878-883의 정의에 따른다.
용어 "초가변 영역(hypervariable region)"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "CDR"(즉, 경쇄 가변 도메인에서 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 및 중쇄 가변 도메인에서 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3)의 아미노산 잔기를 포함한다. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)를 참조하며; 또한, Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917(구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)를 참조한다. 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로 정의되는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다.
달리 지시되지 않는 한, "항체 단편(antibody fragment)" 또는 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 의미한다. 항원 결합 단편의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디(diabodies); 선형 항체(linear antibodies); 단일-쇄 항체 분자(single-chain antibody molecules), 예를 들어, 단일쇄 Fv(ScFv); 항체 단편으로부터 형성된 나노바디(nanobodies) 및 다중특이적 항체(multispecific antibodies)를 포함한다.
특정 타겟 단백질에 특이성을 갖고 결합하는 항체는 또한 특정 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는(specifically binding to) 것으로 기술되어 있다. 이는 항체가 다른 단백질과 비교하여 해당 타겟에 우선적으로 결합하는 것을 나타내지만, 이 특이성은 절대적 결합 특이성을 요구하지는 않는다. 항체의 결합이 샘플에서 타겟 단백질의 존재를 결정하는 경우(예를 들어, 위양성(false positives)과 같은 원하지 않는 결과의 생성 없이), 항체는 의도된 타겟에 대해 "특이적(specific)"인 것으로 간주된다. 본 발명에서 유용한 항체 또는 이의 결합 단편은 비-타겟 단백질에 대한 친화도보다 2배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 20배 이상, 가장 바람직하게는 100배 이상의 친화도로 타겟 단백질에 결합할 것이다. 본원의 항체는 주어진 아미노산 서열, 예를 들어 성숙한 인간 TIGIT 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있으며, 해당 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합하지만 그 서열이 결여된 단백질에는 결합하지 않는다.
"pH 의존적 결합", "pH 의존적 타겟 결합" 및 "pH 의존적 항원 결합"이라는 표현은 본원에서 상호교환 가능하며, 이는 본 출원의 항체가 그의 타겟/항원, 즉, 인간 TIGIT에 pH 의존적 방식으로 결합함을 의미한다. 구체적으로, 본 출원의 항체는 생리적 pH, 예를 들어 pH 7.4에서의 결합 친화도 및/또는 결합 신호와 비교할 때, 약산성 pH, 예를 들어, 일반적으로 종양 미세환경에서 발견되는 pH 6.0에서 그의 항원에 대해 더 높은 결합 친화도 및/또는 결합 신호를 나타낸다. 본 출원의 항체의 결합 친화도 및/또는 결합 신호의 강도를 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 표면 플라즈몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 표면 플라즈몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술에 의해 측정될 때, 본 출원의 항체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상 보다 더 큰 pH 7.4/pH 6.0에서 KD 비를 가진다. 대안적으로 또는 추가로, 표면 플라즈몬 공명(Biacore) 또는 유사한 기술에 의해 측정될 때, 본 출원의 항체는 pH 7.4에서 Rmax보다 pH 6.0에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 보다 더 큰 Rmax(RU) 값을 갖는다. 항체의 결합 친화도는 25℃ 또는 37℃에서 측정될 수 있다. 종양 미세환경은 생리적 조건 또는 정상 조직보다 비교적 산성인 pH를 나타내는 것으로 밝혀진 바 있다(Zhang et al. Focus on molecular Imaging 2010; Tannock and Rotin et al. Cancer Res 1989). 따라서, 상기 언급된 pH 의존적 결합을 갖는 본 출원의 항체는 종양 미세환경에서 TIGIT-양성 림프구를 선택적으로 표적하고, 림프구의 말초 활성화와 관련된 낮은 독성을 갖는 항-TIGIT 치료제로서 이점이 있다.
본원에서 용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포에서 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우 마우스 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체(mouse antibody)" 또는 "랫트 항체(rat antibody)"는 각각 마우스 또는 랫트 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 항체뿐만 아니라 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 의미한다. 이러한 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 루프와 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역이다. 상기 인간화 항체는 또한 추가적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 접두사 "hum", "hu", "Hu" 또는 "h"는 인간화 항체를 모 설치류 항체와 구별하기 위해 필요할 때 항체 클론 명칭에 추가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체의 동일한 CDR 서열을 포함할 것이나, 인간화 항체의 친화도를 증가시키거나, 안정성을 증가시키거나, 또는 다른 이유로 인해 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
본 출원의 항체는 암 치료에 있어 잠재적인 치료 용도를 갖는다. 본원에서 용어 "암" 또는 "종양"은 일반적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 폐암(소세포 폐암 또는 비소세포 폐암 포함), 부신암, 간암, 위암, 자궁경부암, 흑색종, 신장암, 유방암, 대장암, 백혈병, 방광암, 골암, 뇌암, 자궁내막암, 두경부암, 림프종, 난소암, 피부암, 갑상선 종양 또는 암의 전이성 병변을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 항체는 바이러스 감염 및 면역 관용 또는 "소진"에 기계적으로 관련된 다른 인간 질병을 제어하는 데 잠재적인 치료 용도를 갖는다. 본 출원의 맥락에서, 용어 "소진(exhaustion)"은 만성 바이러스 감염의 장기간 동안 면역 세포가 감염된 바이러스에 대응하는 능력이 고갈되는 과정을 지칭한다.
약학적 조성물 및 키트
일부 측면에서, 본 개시 내용은 조성물, 예를 들어, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제제화된 본원에 기재된 항-TIGIT-3 항체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매질, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 부형제는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 직장, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합할 수 있다.
본원의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들면 액체 용액(예를 들어, 주사용 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 투여 형태를 포함한다. 적합한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 따른다. 전형적인 적합한 조성물은 주사 또는 주입 용액의 형태이다. 하나의 적합한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내)이다. 일부 실시 양태에서, 항체는 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 실시 양태에서, 항체는 근육 내 또는 피하 주사로 투여된다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 질병 또는 장애 또는 적어도 하나 이상의 질병 또는 장애의 임상 증상을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때, 이러한 질병, 장애 또는 증상에 대한 치료에 충분한 효과를 나타내는 항체의 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 항체, 질병, 장애 및/또는 질병 또는 장애의 증상, 질병, 장애의 중증도, 및/또는 질병 또는 장애의 증상, 치료될 대상체의 연령, 및/또는 치료될 대상체의 체중에 따라 달라질 수 있다. 임의의 주어진 예에서 적절한 양은 당업자에게 명백하거나 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 병용 요법의 경우, "치료적 유효량"은 질병, 장애 또는 병태의 효과적인 치료를 위한 병용물에 포함된 활성 제제의 총량을 지칭한다.
본원에 사용된 "대상체(subject)"는 포유동물, 예를 들어, 설치류 또는 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본원에 기술된 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)이다.
실시예
실시예 1: 항- TIGIT 단일클론 항체의 생성
항-TIGIT 단일클론 항체(mAbs)는 통상적인 하이브리도마 융합 기술에 기초하고, 약간의 변형을 가하여 제조하였다(de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1). 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석에서 높은 결합 활성을 갖는 mAb를 추가 특성 결정을 위해 선택하였다.
면역화 및 결합 분석을 위한 TIGIT 재조합 단백질
전장 인간 TIGIT(서열번호 1)를 코딩하는 cDNA는 GenBank 서열(수탁번호: NM_173799)에 기초하여 Sino Biological(중국, 베이징)에 의해 합성하고, 이로부터 구입하였다. 서열번호 1의 아미노산 1-141에 상응하는 전장 인간 TIGIT의 세포외 도메인(ECD)의 코딩 영역을 PCR 증폭시키고, C-말단이 마우스 IgG2a의 Fc 도메인 또는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 도메인에 융합되었으며, pcDNA3.1 기반 발현 벡터 (Invitrogen, 미국, 캘리포니아, 칼즈배드)에 클로닝시켜, 2개의 재조합 융합 단백질 발현 플라스미드인 TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1을 각각 수득하였다. TIGIT 융합 단백질의 개략도는 도 1에 도시되었다. 재조합 융합 단백질 생산을 위해, TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1 플라스미드를 293G 세포(내부 개발)에 일시적으로 형질감염시키고, 회전 진탕기(rotating shaker)가 장착된 CO2 배양기에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고 원심분리로 제거하였다. TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1을 Protein A 컬럼(Cat.: 17127901, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. TIGIT-mIgG2a 및 TIGIT-huIgG1 단백질 모두 인산 완충 식염수에 대해 투석하고(DPBS), 소량으로 나누어 -80℃ 냉동고에 저장하였다.
안정한 발현 세포주
전장 인간 TIGIT(huTigit) 또는 원숭이 TIGIT(mkTigit, 수탁번호: XM_005548101.2)를 발현하는 안정한 세포주를 확립하기 위해, Tigit 유전자(Genescript(중국, 난징)에 의해 합성됨)를 레트로바이러스 벡터 pFB-Neo(Cat.: 217561, Agilent, 미국)에 클로닝하였다. 이원적회귀선(dual-tropic) 레트로바이러스 벡터는 이전 프로토콜에 따라 생성되었다(Zhang T, et al. 2005 , Blood). huTigit 및 mkTigit를 함유하는 벡터를 각각 Jurkat 및 NK92MI 세포(ATCC, Manassas, VA, 미국)로 형질도입시켜, 세포주 Jurkat/huTigit 및 NK92MI/mkTigit를 생성시켰다. 고 발현 세포주는 G418 및 FACS 결합 분석으로 배지에서 배양함으로써 선택되었다.
면역화, 하이브리도마 융합 및 클로닝
8 내지 12주령의 Balb/c 마우스(HFK BIOSCIENCE CO., LTD, 중국, 베이징)를 10μg의 Tigit-mIgG2a 및 수용성 어쥬번트(Cat.: KX0210041, KangBiQuan, 중국, 베이징)를 함유하는 100μL의 항원 혼합물로 복강 내(i.p.) 면역화시켰다. 이 절차는 3주 후에 반복되었다. 2차 면역화 2주 후, 마우스 혈청을 TIGIT 결합에 대해 ELISA 및 FACS로 평가하였다. 혈청 스크리닝 10일 후, 항-TIGIT 항체 혈청 역가가 가장 높은 마우스를 50μg Tigit-mIgG2a의 i.p. 주사를 통해 부스팅하였다. 부스팅 3일 후, 비장세포(splenocytes)를 분리하고, 표준 기술( 1977 Somat Cell Genet, 3: 231)을 사용하여 뮤린 골수종 세포주 SP2/0 세포(ATCC)에 융합시켰다.
ELISA 및 FACS에 의한 항체의 TIGIT 결합 활성의 평가
하이브리도마 클론의 상청액은 일부 변형되어 "Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52"에 기술된 바와 같이, ELISA로 초기 스크리닝되었다. 간략하게, Tigit-huIgG1 단백질은 96-웰 플레이트에 코팅되었다. HRP-연결된 항-마우스 IgG 항체(Cat.: 7076S, Cell Signaling Technology, 미국) 및 기질(Cat.: 00-4201-56, eBioscience, 미국)을 사용하여 플레이트 리더(SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, 미국)를 사용하여 측정되는, 450nm의 파장에서 색 흡광도 신호를 개발하였다. ELISA-양성 클론은 상기 기술된 NK92MI/huTigit 또는 NK92mi/mkTigit 세포를 사용하여 FACS에 의해 추가로 검증되었다. TIGIT-발현 세포(105 cells/well)를 ELISA-양성 하이브리도마 상청액과 함께 배양한 후, Alexa Fluro-647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(Cat.: A0473, Beyotime Biotechnology, 중국)와 결합시켰다. 유세포 분석기(Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, 미국)를 이용하여 세포 형광을 정량하였다.
ELISA 및 FACS 스크리닝 둘 모두에서 양성 신호를 나타내는 하이브리도마로부터의 조정배지(conditioned medium)를 인간 면역 세포-기반 분석에서 우수한 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하기 위해, 기능 분석에 적용하였다(다음 섹션 참조). 원하는 기능적 활성을 갖는 항체를 추가로 서브클로닝 하고 특성화하였다.
하이브리도마의 무혈청 (serum-free) 또는 저혈청 (low serum) 배지에 대한 서 브클로닝 및 적응
ELISA, FACS 및 상기 기재된 기능적 분석에 의한 1차 스크리닝 후, 양성 하이브리도마 클론을 제한 희석으로 서브클로닝 하였다. 각 플레이트로부터 ELISA 및 FACS 스크리닝에 기초한 3개의 양성 서브클론을 선택하고, 기능 분석으로 특성화하였다. 기능적 분석을 통해 확인된 상위 항체 서브클론을 3% FBS와 함께 CDM4MAb 배지(Cat.: SH30801.02, Hyclone, 미국)에서 성장하도록 적응시켰다.
단일클론 항체의 발현 및 정제
일시적으로 항체 발현 플라스미드(Cat. No. R79007, Invitrogen)로 형질감염된 하이브리도마 세포 또는 293G 세포를 CDM4MAb 배지(Cat.: SH30801.02, Hyclone) 또는 FreestyleTM 293 발현 배지(Cat.: 12338018, Invitrogen)에서 배양하고, 37℃에서 5 내지 7일 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 조정배지를 원심분리를 통해 수집하고, 정제 전에 0.22μm 막을 통과시켜 여과하였다. 상청액을 함유하는 뮤린 또는 재조합 항체를 제조사의 지침에 따라 Protein A 컬럼(Cat.: 17127901, GE Life Sciences)에 적용시키고 결합시켰다. 절차는 일반적으로 90% 이상의 순도로 항체를 산출하였다. Protein A-친화성 정제된 항체를 PBS에 대해 투석하거나 HiLoad 16/60 Superdex200 컬럼(Cat.: 17531801, GE Life Sciences)을 사용하여 응집물을 제거하였다. 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 측정하였다. 최종 항체 제제는 -80℃ 냉동고에 나누어 저장하였다.
실시예 2: TIGIT 항체의 클로닝 및 서열 분석
뮤린 하이브리도마 클론을 수집하여 제조사의 프로토콜에 기초하여 Ultrapure RNA kit(Cat.: 74104, QIAGEN, 독일)를 사용하여 총 세포 RNA를 준비하였다. Invitrogen의 cDNA 합성 키트(Cat.: 18080-051)를 사용하여 제1가닥 cDNA를 합성하고, PCR 키트(Cat.: CW0686, CWBio, 중국, 베이징)를 사용하여 뮤린 mAbs의 중쇄 가변 영역(Vh) 및 카파 사슬 가변 영역(Vk)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭을 수행하였다. Vh 및 Vk의 항체 cDNA 클로닝에 사용된 올리고 프라이머는 이전에 보고된 서열에 기초하여 Invitrogen(중국, 베이징)에 의해 합성되었다(Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461). 이어서 PCR 생성물을 pEASY-Blunt 클로닝 벡터(Cat.:C B101-02, TransGen, 중국)에 서브클로닝하고, Genewiz(중국, 베이징)에 의해 시퀀싱 되었다. Vh 및 Vk 영역의 아미노산 서열은 DNA 시퀀싱 결과로부터 추론되었다.
뮤린 mAbs는 서열 상동성을 비교하여 분석하고, 서열 유사성에 기초하여 그룹화 하였다(도 2). 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 주석 및 인터넷 기반 서열 분석(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html)에 의해 Kabat(Wu and Kabat 1970 J. Exp . Med . 132:211-250) 및 IMGT(Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212) 시스템에 기초하여 정의되었다. 대표적인 상위 클론 mu1217(Vh 및 Vk)의 아미노산 서열은 표 1(서열번호 9 및 11)에 열거되었다. mu1217의 CDR 서열은 표 2에 열거되었다(서열번호 3 내지 8).
mu1217 Vh 및 Vk 영역의 아미노산 서열
mu1217 Vh 서열번호 9
mu1217 Vk 서열번호 11
mu1217 Vh 및 Vk 영역의 CDR 서열(아미노산)
mAbs CDR1 CDR2 CDR3
mu1217, Vh 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 5
mu1217, Vk 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8
Note: CDR 서열은 Kabat 시스템에 의해 정의됨
실시예 3: SPR에 의한 정제된 뮤린 항- TIGIT 항체의 친화도 측정
ELISA 및 FACS에서 높은 결합 활성과 세포-기반 분석에서 강력한 기능적 활성을 갖는 TIGIT 항체(실시예 1 및 2에 기재)를 BIAcoreTM T-200(GE Life Sciences)을 사용한 SPR 분석으로 결합 동역학적 특성을 규명하였다. 간략하게, 항-인간 IgG 항체를 활성화된 CM5 바이오센서(Cat. No.: BR100530, GE Life Sciences)에 고정시켰다. 인간 Fc-태깅된 TIGIT를 칩 표면 위로 흐르게 하고, 항-인간 IgG 항체로 포획하였다. 이어서, 정제된 뮤린 항체의 연속적 희석물(0.12nM 내지 10nM)을 칩 표면 위로 흐르게 하고, 표면 플라즈몬 공명 신호전달의 변화를 분석하여, one-to-one Langmuir 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용하여 결합속도(k on) 및 해리속도(k off)를 계산하였다. 평형 해리 상수(K D)는 k off/k on 비율로 계산되었다. mu1217, mu1257, mu1226 및 mu242를 포함하는 상위 mAb의 결합 친화도 프로파일은 도 3 및 표 3에 도시되었다.
SPR에 의한 하이브리도마 항체의 결합 친화도
항체 k on (M -1 s -1 ) k off (s -1 ) K D (nM)
mu1217 4.33E+06 3.96E-05 9.15E-12
mu1257 3.99E+06 4.20E-05 1.05E-11
mu1266 1.07E+07 8.49E-05 7.94E-12
mu242 5.12E+06 7.13E-05 1.39E-11
실시예 4: 뮤린 항-인간 TIGIT mAb mu1217의 인간화
mAb 인간화 및 엔지니어링
mu1217의 인간화를 위해, IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/ index.html) 및 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 웹사이트의 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스를 블라스팅함으로써, mu1217 가변 영역의 cDNA 서열과 고도의 상동성을 공유하는 서열에 대한 인간 생식세포계열(germline) IgG 유전자를 검색하였다. 인간화를 위한 주형으로서, 고주파수(Glanville 2009 PNAS 106:20216-20221)를 갖는 인간 항체 레퍼토리에 존재하고, mu1217과 고도의 상동성이 있는 인간 IGVH 및 IGVK 유전자를 선택하였다.
CDR-grafting(Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press)으로 인간화를 수행하였고, 자체 개발된 발현 벡터를 이용하여 인간 IgG1mf 포맷으로서 인간화 항체(hu1217s)를 엔지니어링하였다. 인간화 초기 라운드에서, 프레임워크 영역에서의 뮤린으로부터 인간 아미노산 잔기로의 돌연변이는 시뮬레이션된 3D 구조에 의해 유도되었고, CDR의 표준 구조를 유지하기 위해 구조적으로 중요한 뮤린 프레임워크 잔기는 인간화 항체 1217(hu1217-1-1, 서열번호 3, 13, 5(중쇄 CDRs) 및 서열번호 6, 7, 8(경쇄 CDRs)의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CDRs, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지며 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 영역 포함)의 제1 버전에서 유지되었다. 구체적으로, mu1217 Vκ의 CDR(서열번호 6 내지 8)을 1개의 뮤린 프레임워크 잔기(V58)가 유지된 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGVκ3-15의 프레임워크에 이식하여 Hu1217-1-1(서열번호 16의 아미노산 서열 및 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열)의 인간화 Vκ 서열을 수득하였다. mu1217 Vh의 H-CDR2(서열번호 4), H-CDR1 및 H-CDR3(서열번호 3 및 5)의 N-말단을 2개의 뮤린 프레임워크 잔기(서열번호 10의 T24 및 I37)가 유지된 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGVH3-7의 프레임워크에 이식하였다. hu1217 인간화 변이체에서, 시뮬레이션된 3D 구조에 따르면, N-말단 절반만이 항원 결합에 중요할 것으로 예측되었기 때문에, Kabat H-CDR2의 N-말단 절반만을 이식하였다. 생성된 Hu1217-1-1의 인간화 Vh 서열의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 14 및 서열번호 15로 나타내었다.
Hu1217-1-1은 쉽게 조정할 수 있는 서브클로닝 위치와 함께 각각 IgG1mf(서열번호 18) 및 카파 사슬로 명명된 인간 IgG1 변이체의 불변 영역을 함유하는 자체 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간 전장 항체 포맷으로 구축되었다. 상기 2개의 구조물의 293G 세포로의 공동-형질감염 및 protein A 컬럼(Cat.: 17543802, GE Life Sciences)을 이용한 정제에 의해 hu1217-1-1 항체의 발현 및 제조가 달성되었다. 정제된 항체를 PBS에서 0.5-5mg/mL로 농축시키고, -80℃ 냉동고에 나누어 저장하였다.
hu1217-1-1 주형에 기초하여, 본 발명자들은 Vκ의 프레임워크 영역에서 유지된 뮤린 잔기를 상응하는 인간 생식세포계열 잔기로 전환시키는 몇몇 단일 돌연변이를 만들었으며, 이는 Vκ의 V58I 및 Vh의 T24A 및 I37V를 포함한다. hu1217-2A-1(T24A), hu1217-2B-1(I37V) 및 hu1217-1-2a(V58I)는 모두 hu1217-1-1과 유사한 결합 및 기능적 활성을 가졌다. 모든 인간화 돌연변이는 특정 위치에서 돌연변이를 함유하는 프라이머 및 위치 지정 돌연변이유발 키트(Cat. No. FM111-02, TransGen, 중국, 베이징)를 사용하여 이루어졌다. 원하는 돌연변이는 시퀀싱 분석에 의해 확인되었다. 이들 hu1217-유래 변이체 항체는 전술한 바와 같이, 결합 및 기능 분석에서 시험되었다.
Hu1217 항체는 CDR 및 프레임워크 영역에 돌연변이를 도입함으로써 인간에서 치료적 사용을 위한 분자 및 생물물리학적 특성을 개선하기 위해, 추가로 엔지니어링 되었다. 기능적 활성을 유지하면서, 고려 사항은 아미노산 조성물, 열 안정성(Tm), 표면 소수성 및 등전점(pIs)을 포함한다.
종합하면, 잘 엔지니어링 된 인간화 단일클론 항체, hu1217-2-2(서열번호 3, 5 내지 8, 13 및 19 내지 21)는 상기 기재되고, 상세하게 묘사된 돌연변이 과정으로부터 유래되었다. 결과는 hu1217-2-2 및 hu1217-1-1 모두 결합 친화도 및 TIGIT-매개 다운스트림 신호전달을 억제하는 것과 같은 기능적 활성에서 매우 유사하다는 것을 보여 주었다.
친화도 측정을 위해, 항체를 항-인간 Fc 표면에 의해 포획하고, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 기초하여 친화도 분석에 사용하였다. 항-TIGIT 항체의 SPR-결정된 결합 프로파일의 결과는 표 4에 요약되었다. Hu1217-2-2 및 hu1217-1-1은 각각 0.415nM 및 0.266nM에서 평균 해리 상수를 갖는 매우 유사한 결합 프로파일을 나타내었으며, 이는 ch1217과 유사하다.
SPR에 의한 hu1217 항체의 결합 친화도
항체 Test 1 Test 2 평균
k on (M -1 s -1 ) k off (s -1 ) K D (nM) k on (M -1 s -1 ) k off (s -1 ) K D (nM) K D (nM)
ch1217* 1.56 x 106 4.43 x 10-4 0.283 - - - NA**
hu1217-1-1 1.45 x 106 4.48 x 10-4 0.309 1.33 x 106 6.94 x 10-4 0.520 0.415
hu1217-2-2 1.80 x 105 2.29 x 10-4 0.127 1.50 x 106 6.08 x 10-4 0.404 0.266
* ch1217은 인간 IgG1mf/ 카파 불변 영역에 융합된 mu1217 가변 도메인으로 구성됨.
** NA: not available.
hu1217 항체의 CDRs
항체 CDR1 CDR2 CDR3
hu1217-1-1, Vh 서열번호 3 서열번호 13 서열번호 5
hu1217-2-2, Vh 서열번호 3 서열번호 13 서열번호 5
hu1217-1-1, Vκ 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8
hu1217-2-2, Vκ 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8
상기 제시된 모든 인간화 항체는 또한, 건강한 공여체로부터 분리된 일차 인간 면역 세포에 대한 기능적 활성에 대해 확인되었다(실시예 7에 기재됨).
실시예 5: 천연(native) TIGIT에 대한 다른 버전의 1217의 결합 활성
살아있는 세포에서 천연 TIGIT에 대한 항-TIGIT 항체의 결합 활성을 평가하기 위해, 인간 TIGIT를 과발현하도록 NK92mi 세포를 엔지니어링 하였다. 살아있는 NK92mi/Tigit 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 항-TIGIT 항체의 일련의 희석물과 함께 배양하였다. 염소 항-인간 IgG를 2차 항체로 사용하여 세포 표면에 대한 항체 결합을 검출하였다. 인간 천연 TIGIT에 대한 용량-의존적 결합의 EC50 값은 용량-반응 데이터를 GraphPad Prism과 함께 4-파라미터 로지스틱 모델에 맞춤으로써 결정되었다. 도 4 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 인간화 1217 항체, hu1217-1-1 및 hu1217-2-2는 살아있는 세포에서 천연 TIGIT에 대한 우수한 결합 친화도를 나타냈다.
천연 TIGIT에 대한 인간화 1217 변이체의 용량-의존적 결합의 EC50
항체
EC 50 ( ug /mL)
Test 1 Test 2
Ch1217 0.100 -
hu1217-1-1 0.114 0.084
hu1217-2-2 0.068
실시예 6: 항- TIGIT 항체에 의한 TIGIT와 그의 리간드 PVR 및 PVR -L2의 상호작용 차단
TIGIT는 CD266-PVR 상호작용과 경쟁할 수 있는 높은 친화도(Kd: ~1 nM)로 PVR에 결합한다(Yu et al., 2009 ).
항-TIGIT 항체가 TIGIT-PVR 및 TIGIT-PVR-L2 상호작용을 차단할 수 있는지 확인하기 위해, 높은 수준의 PVR 또는 PVR-L2를 발현하도록 HEK293 세포를 엔지니어링 하였다. 생성된 세포주는 각각 HEK293/PVR 및 HEK293/PVR-L2로 명명되었다. 가용성 TIGIT(TIGIT-mIgG2a 융합 단백질)의 PVR 또는 PVR-L2에 대한 결합은 유세포 분석에 의해 확인되었다(도 5A). 연속적으로 희석된 항-TIGIT 항체를 첨가하여 TIGIT-리간드 상호작용의 차단을 정량적으로 측정하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1(야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하고, hu1217-2-2/IgG1mf와 동일한 VH 및 VL 서열을 갖는 인간화 버전) 및 hu1217-2-2/IgG1mf는 각각 0.64 및 0.55 μg/mL에서 IC50을 가지며 용량-의존적 방식으로 PVR에 대한 TIGIT 결합을 차단할 수 있다. 이와 유사하게, TIGIT-PVR-L2 상호작용을 차단하는 데 있어서, hu1217-2-2/IgG1 및 hu1217-2-2/IgG1mf의 IC50은 각각 0.25 및 0.18 μg/mL였다.
실시예 7: 항- TIGIT 항체에 의한 CMV -특이적 인간 T 세포의 활성화
TIGIT 항체의 기능적 활성은 추가로, 인간 CMV PP65 펩타이드(NLVPMVATV, 495-503, HLA-A2.1-restricted)를 인식하는 천연 유래 T-세포를 이용하여 평가되었다(Boeckh M, Boeckh M and Geballe AP, 2011 J Clin Invest . 121:1673-80). 간략하게는, HLA-A2.1+ 건강한 공여체로부터의 PBMC를 10% FBS의 완전한 RPMI에서 일주일 동안 PP65 펩타이드(> 98% 순도, GL Biochem(상하이)에 의해 합성됨)로 자극하였다. pp65-프라임된 PBMC를 효과 세포로 사용하였다. 분석 전에, 타겟 세포, HCT116 세포(HLA-A2.1+, 104)를 30분 동안 pp65 펩타이드(5 μg/mL)로 펄스화하고, 항-TIGIT 항체 또는 블랭크 대조군(배지 only)의 존재 또는 부재하에 96-웰에서 동일한 수의 pp65-감작된 PBMC와 밤새 공배양 하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1은 세포 배양 상청액에서 pp65-특이적 T 세포가 양 공여체 모두에 대해 용량-의존적 방식으로 IFN-γ를 분비하도록 촉진시켰다.
실시예 8: 항- TIGIT 항체에 의한 NK 세포-매개 세포독성 향상
TIGIT는 자연 살해(NK) 세포에서 비교적 높은 수준으로 본질적으로 발현되는 것으로 알려져 있으며, TIGIT와 그의 리간드 사이의 상호작용은 NK 세포-매개 세포독성을 억제한다(Wang F, et al. 2015 Eur . J. Immunology 45:2886-97; Stanietsky N et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106 :17858-63).
인간화 항-TIGIT 항체가 NK-매개 세포독성을 촉진할 수 있는지 확인하기 위해, 전술한 프로토콜(Zhang et al, 2006 Cancer Res. 66: 5927 - 5933)에 따라 레트로바이러스 형질도입으로, TIGIT 및 DNAM-1 수용체(NK92MI/Tigit-DNAM-1)를 효과 세포로서 공발현하도록 NK 세포주 NK92MI를 엔지니어링 하였다. PVR-발현 폐암 세포주 SK-MES-1/PVR이 타겟과 유사하게 확립되었다.
SK-MES-1/PVR 세포에 대한 NK92MI/Tigit-DNAM-1 세포의 세포독성은 CytoTox 96 Non-Radioactive 세포독성 분석 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 LDH 방출 분석에 의해 결정되었다. 요약하면, 96-웰 V-바닥 플레이트에서 NK92MI/Tigit-DNAM-1 세포(8x105)를 항-TIGIT Ab(0.007-30μg/mL)의 존재하에 5시간 동안 SK-MES-1/PVR 세포(2x104)와 공배양 하였다. LDH-방출 분석은 다음의 식을 사용하여 특이적 용해를 결정하였다: 특이적 용해(specific lysis)의 백분율 = [(실험 - 효과 자발적 - 타겟 자발적)/(타겟 최대 - 타겟 자발적)] x 100. 그 결과, 항-TIGIT 항체 hu1217-2-2/IgG1mf는 용량-의존적 방식으로 NK 세포 사멸을 강화시켰다(EC50: 0.185 μg/mL) (도 7).
실시예 9: 항- TIGIT 항체에 의한 FcγR -매개 트로고사이토시스(trogocytosis)를 통한 TIGIT 수용체의 표면 발현 감소
트로고사이토시스는 세포 표면 분자가 공여체 세포에서 수용체 세포로 옮겨지는 현상이다(Joly E, et al. 2003 Nat. Immunol ; Machlenkin A, et al. 2008 Cancer Res.; Beum PV et al. 2008 J. Immunol ; Rossi EA , et al. 2013 Blood). Fc γ 수용체(FcγR)를 통한 항체-유도 트로고사이토시스는 세포 표면에서 수용체의 하향 조절을 유발한다(Carlsten M, et al. 2016 Clin Cancer Res; Beum PV , et al. 2011 J. Immunology). 따라서, 트로고사이토시스에 의한 타겟 수용체의 하향 조절은 약화 신호전달을 일으킬 수 있다. 이러한 관찰에 비추어, hu1217-2-2/IgG1이 FcγR+ 세포 존재하에서 TIGIT 수용체의 트로고사이토시스를 유발할 수 있고, 표면 발현이 더 낮아질 가능성이 있다. 이러한 가능성을 해결하기 위해, Jurkat/Tigit 세포를 비오틴-표지된 hu1217-2-2/IgG1wt(hu1217-2-2/IgG1mf와 동일한 VL 및 VH 서열과 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 인간화 항체) 또는 hu1217-2-2/IgG1mf와 함께 다양한 FcγRs(FcγRIIAH131, FcγRIIB, FcγRIIIAV158 포함)을 발현하는 HEK 세포와 밤새 배양하였다. TIGIT 수용체의 표면 발현은 SA-APC(Biolegend)로 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1mf와 달리, hu1217-2-2/IgG1는 음성 대조군 인간 IgG-처리된 세포와 비교하여 TIGIT 표면 발현의 현저한 감소를 유발하였으며, 이는 Jurkat/Tigit 세포에서 표면 TIGIT의 감소가 FcγR-결합 의존적임을 의미한다. 또한, 10% 인간 혈청(높은 수준의 내인성 IgG 함유)의 존재는 TIGIT 수용체의 FcγRIIB-매개 트로코사이토시스와 달리, FcγRIIAH131- 또는 FcγRIIIAV158-매개 트로코사이토시스를 부분적으로 감소시킬 수 있으며, 이는 FcγRIIB가 in vivo에서 항-TIGIT mAbs(예를 들어, hu1217-2-2/IgG1wt)에 의한 TIGIT 표면 발현을 감소시키는 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 또한 이전의 발견과 일치한다(Ganesan LP, et al. 2012 J Immunol 189:4981-8; Taylor RP, et al. 2015 Blood 125:762-6).
실시예 10: 항- TIGIT 항체의 ADCC 및 CDC 이펙터 기능
인간 일차 PBMC에서 ADCC 및 CDC를 유도하는 항-TIGIT 항체의 능력은 하기 기재된 바와 같은 in vitro 분석을 이용하여 확인되었다.
인간 PBMC를 타겟 세포로 사용하는 ADCC
TIGIT 항체가 TIGIT+ T 세포에서 ADCC를 유도할 수 있는지 확인하기 위해 유세포 분석 기반 ADCC 분석을 설정하였다. CD16 V158 (V158 대립유전자(allele)) 및 FcRγ cDNAs를 함유하는 발현 플라스미드를 공동 형질도입함으로써, NK92MI 세포(ATCC)로부터 검정 효과 세포주(assay effector cell line) NK92MI/CD16V 세포를 생성하였다. TIGIT 발현을 상향 조절하기 위해 건강한 공여체로부터의 인간 PBMC를 PHA(1 μg/ml)로 자극하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, CD4+ 효과(CD3+CD4+Foxp3-), CD8+ 및 조절 T 세포(CD4+Foxp3+)를 포함한 T 세포는 모두 상당한 양의 TIGIT을 발현하였다. 이들 활성화된 PBMC(3개의 건강한 공여체로부터)를 타겟 세포로 사용하였다. 형광 염료 CFSE-표지된 NK92MI/CD16V 세포(5x104)를 TIGIT 항체(hu1217-2-2/IgG1mf 또는 hu1217-2-2/IgG1wt, 30μg/mL) 또는 대조군 항체(양성 대조군 항-CD3 항체 OKT3(5μg/ml, Biolegend) 또는 음성 대조군 인간 IgG, 30μg/mL)의 존재하에 동일한 수의 타겟 세포와 40시간 동안 공배양 하였다. 인간 IgG 및 hu1217-2-2/IgG1mf와 비교하여, hu1217-2-2/IgG1wt는 ADCC를 통해 Tregs를 적당히 감소시킬 수 있었다. 그러나, 총 T 세포 및 CD8+ T 세포에서 유의한 ADCC 효과는 관찰되지 않았다(도 9).
인간 PBMC를 타겟 세포로 사용하는 CDC
hu1217-2-2/IgG1mf 및 hu1217-2-2/IgG1wt가 CDC를 유발하는지 여부는 건강한 공여체로부터의 사전 활성화된 인간 PBMC 및 신선한 자가 혈청을 사용하여 결정되었다. CDC에 의한 세포 용해는 Celltiter glo assay 키트(Promega, 중국, 베이징)에 의해 결정되었다. 요약하면, PBMC를 3일 동안 PHA(10μg/mL)로 사전 활성화시킨 후, RPMI1640 + 자가 혈청(15%) 및 항-TIGIT 또는 대조군 항체(0.01-100μg/mL)에서 37℃, 밤새 배양하였다. CDC로 인한 세포 사멸은 반응 종료시 세포 용해 후 생존 세포로부터 방출된 ATP의 감소에 의해 분석되었다. 항-MHC-1 A, B, C를 양성 대조군으로 사용하였다. 형광 판독은 96-웰 형광계(PHERA Star FS, BMG LABTECH)를 사용하여 수행되었고, CDC 활성은 다음과 같이 상대 형광 단위(RFU) 판독으로부터 계산되었다: % CDC 활성 = [(RFU 테스트 - RFU 백그라운드) / (전체 세포 용해에서 RFU - RFU 백그라운드)] x 100. 실험 결과는 hu1217-2-2/IgG1mf 및 hu1217-2-2/IgG1wt 모두 두 개의 다른 공여체로부터 분리된 PBMC를 갖는 탐지가능한 CDC를 갖지 않음을 입증하였다. 대조적으로, 양성 대조군 항체, 항-MHC-I는 상당한 CDC 활성을 유도한다(도 10).
실시예 11: Hu1217 -2-2/ IgG1의 pH 의존적 결합 친화도
pH가 hu1217-2-2/IgG1의 결합 특성에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 타겟 결합 SPR 시험을 pH 7.4 및 pH 6.0 running 버퍼에서 수행하여 비교하였다. 항체 hu1217-2-2/IgG1을 CM5 칩(GE)에 고정시켰다. TIGIT-his의 연속 희석물을 pH 7.4 또는 pH 6.0 running 버퍼 HBS에서 고정화된 hu1217-2-2/IgG1 위로 흘렸다.
하기 표 7에 기재된 결과에 의해 나타낸 바와 같이, hu1217-2-2/IgG1은 pH 7.4(생리적 pH)에서 얻은 데이터와 비교할 때, pH 6.0(종양 미세환경의 pH와 유사한 산성 pH)에서 인간 TIGIT에 대해 더 높은 결합 친화도(KD) 및 더 강한 결합 신호(Rmax)를 나타냈다. 이러한 결과들은 종양 환경에서 TIGIT-양성 림프구를 표적으로하는 치료제로서 항체의 잠재적 이점을 나타내며, 이는 hu1217-2-2/IgG1이 말초 림프구의 활성화와 관련된 잠재적 독성은 더 낮은 반면, 종양 미세환경에서 TIGIT-양성 림프구를 보다 선택적으로 표적할 수 있기 때문이다.
SPR에 의한 pH 7.4 및 pH 6.0에서 hu1217-2-2/IgG1의 결합 친화도
pH k on (M -1 s -1 ) k off (s -1 ) K D (M) Rmax ( RU )
7.4 4.34E+05 9.53E-05 2.19E-10 21
6.0 2.54E+06 7.60E-05 2.99E-11 37
<110> BeiGene, Ltd. <120> Anti-TIGIT antibodies and their use as therapeutics and diagnostics <130> Pi20-B120 <150> PCT/CN 2017/120392 <151> 2017-12-30 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn 20 25 30 Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser 35 40 45 Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln 85 90 95 Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr 100 105 110 Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu 115 120 125 Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly 130 135 140 Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val 145 150 155 160 Val Ala 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Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcatctgca aggccagtca ggatgtgggt acttctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcaatctc ctaacctact gatttactgg gcatccgccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtacagtct 240 gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagtt atcctctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu1217-1-1 HCDR2 <400> 13 Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu1217-1-1 VH pro <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 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attcggcggc 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 18 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1mf <400> 18 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 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Claims (19)

  1. 다음을 포함하는 인간 Tigit에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 3, 4, 5 또는 13으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) 서열번호 6, 7 또는 8로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  2. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 3의 VH-CDR1 아미노산 서열, 서열번호 4의 VH-CDR2 아미노산 서열 및 서열번호 5의 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 6의 VL-CDR1 아미노산 서열, 서열번호 7의 VL-CDR2 아미노산 서열 및 서열번호 8의 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (b) 서열번호 3의 VH-CDR1 아미노산 서열, 서열번호 13의 VH-CDR2 아미노산 서열 및 서열번호 5의 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 6의 VL-CDR1 아미노산 서열, 서열번호 7의 VL-CDR2 아미노산 서열 및 서열번호 8의 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체 분자인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 9, 14 또는 19의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 11, 16 또는 21의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 9의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 11의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (c) 서열번호 9의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (d) 서열번호 14의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 11의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (e) 서열번호 14의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (f) 서열번호 14의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (g) 서열번호 19의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 11의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (h) 서열번호 19의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (i) 서열번호 19의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인.
  7. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 9의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 11의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
    (b) 서열번호 14의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 서열번호 19의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인.
  8. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인;
    (b) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다음 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 14의 24번째 위치가 T에서 A로 돌연변이된 중쇄;
    (b) 서열번호 14의 37번째 위치가 I에서 V로 돌연변이된 중쇄;
    (c) 서열번호 16의 58번째 위치가 V에서 I로 돌연변이된 경쇄.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv(ScFv)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 서브클래스의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체, 및 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 유형의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 제2 치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 면역 반응을 자극하는 데 효과적인 양으로, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 면역 반응을 자극하는 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암 또는 종양을 치료하는 데 효과적인 양으로, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 종양 치료방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제2 치료제 또는 제2 치료절차와 병용 투여되고, 상기 제2 치료제 또는 제2 치료절차는 화학 요법(chemotherapy), 표적 치료(targeted therapy), 종양용해 약물(oncolytic drug), 세포독성제(cytotoxic agent), 면역 기반 치료(immune-based therapy), 사이토카인(cytokine), 수술 절차(surgical procedure), 방사선 절차(radiation procedure), 공자극 분자의 활성화제(activator of a costimulatory molecule), 억제 분자의 억제제(inhibitor of an inhibitory molecule), 백신(vaccine) 또는 세포 면역요법(cellular immunotherapy)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항의 항체를 감염성 질환을 치료하는 데 효과적인 양으로, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환(infectious disease)의 치료방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 암, 종양 또는 감염성 질환의 치료를 위한 약제 제조에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항-Tigit 항체 분자의 용도.
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