KR20190140871A

KR20190140871A - 가역적인 졸-겔 현상이 일어나는 박테리얼 셀룰로오스 겔의 용도

Info

Publication number: KR20190140871A
Application number: KR1020190069633A
Authority: KR
Inventors: 박혜림; 김병국; 고정남; 차소윤; 김예향; 이소헌; 김진영; 신송석
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2019-12-20
Also published as: KR20210089127A; KR102317279B1; WO2019240495A1

Abstract

본 발명은 가역적인 졸-겔 현상이 일어나는 박테리얼 셀룰로오스 겔의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 목질계 셀룰로오스를 사용하지 않아 강산 전처리 과정이 생략되어 안전하고 공정이 비교적 간단하다. 또한, 비용적, 환경보호 측면에서도 효율적이다. 특히, 본 발명에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스 겔은 다른 셀룰로오스 유도체들과 달리 가역적인 졸-겔 현상이 일어나며 이로 인해 특이적 사용감이 나타난다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 피부 내에서의 다양한 효능(보습, 항산화, 열보호, 광보호, 안티폴루션)을 나타낸다.

Description

가역적인 졸-겔 현상이 일어나는 박테리얼 셀룰로오스 겔의 용도{Use of bacterial cellulose gel with reversible sol-gel phase transition}

본 발명은 박테리얼 셀룰로오스 겔 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 가역적인 졸-겔 현상이 일어나는 박테리얼 셀룰로오스 겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

박테리얼 셀룰로오스 (Bacterial cellulose)는 미생물 발효를 통해 얻는 셀룰로오스이다. 식물 셀룰로오스는 리그닌 또는 헤미셀룰로오스 등 셀룰로오스 이외 다양한 것들이 포함되어 있지만, 박테리얼 셀룰로오스는 배양을 통해 얻어지기 때문에 순수 셀룰로오스만을 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 식물 셀룰로오스보다 직경이 얇고, 길이가 길어 높은 종횡비를 가지며, 높은 결정화도를 가지는 특징이 있다.

셀룰로오스는 그 자체로는 물에 녹지 않기 때문에 마스크팩, 스크럽제, 필링제 등에는 사용되지만, 화장품 유액 속 첨가물로는 사용이 제한된다. 용해도를 높이기 위해서 화학적 반응을 통한 셀룰로오스 유도체 (카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 등)를 제조하는 경우도 있다. 그러나, 이러한 셀룰로오스 유도체는 특유의 화학취가 나고, 제형 적용 시 끈적임이 나타나는 경우가 많으며, 용해시켜 만든 겔은 가역적인 졸-겔 현상 (틱소트로피, thixotropy)이 일어나지 않는 특성이 있다.

틱소트로피 (thixotropy) 현상이란, 고농도의 콜로이드 용액, 고분자 용액에 흔드는 등의 외력을 가하면 유동성을 보이고, 외력을 제거하면 유동성이 없어지는 현상을 말한다. 전자의 상태는 졸(sol), 후자의 상태는 겔(gel)로, 이는 외력에 의한 등온 가역적 졸-겔 변화이다. 졸-겔 전이가 있는 물질의 레올로지(rheology) 거동을 보면 전단속도에 따라 점도가 변화는 것을 관찰할 수 있다.

화장품 분야에서 제형 흐름성의 조절은 중요한 의미를 가진다. 도포 전 보존상태에서는 낮은 흐름성을 갖다가, 도포 시 마찰이 가해지면서 높은 흐름성을 갖는 유체로 변화하는 것은, 화장료 자체에 특이한 사용감과 다양한 기능을 부여할 수 있기 때문이다. 레올로지에서 흔히 사용하는 파라미터들은 점성(Viscosity)과 전단속도(Shear rate)이다. 특히, 높은 전단속도에서 낮은 점성은 이차적인 사용감을 보다 좋게 해주는데 관련되어 있다.

종래 기술에서는 주로 목질이나 비목질계에서 얻은 셀룰로오스에 황산 또는 염산 등의 강산 전처리를 한 뒤, N-옥실 화합물의 존재하에서 산화제를 첨가하여 산화된 셀룰로오스를 얻었다. 하지만, 강산을 처리한 셀룰로오스는 산업적으로 상용화하는데 큰 어려움이 있다. 또한, 목질에서 얻은 셀룰로오스는 셀룰로오스 이외 다른 부산물이 있기 때문에 그 전처리 과정이 굉장히 까다롭고, 비용이 많이 든다.

따라서, 목질이나 비목질계에서 얻은 셀룰로오스를 산업적으로 이용하기에는 근본적 제한이 따르고, 생태학적으로 훼손이 뒤따르는 문제도 있다.

한편, 셀룰로오스는 물에 녹지 않아 세포 내에서의 효능을 확인하기 어려웠다. 이에, 본 발명자들은 셀룰로오스 겔을 포함하면서 세포 내의 다양한 효능을 가진 조성물을 개발하고자 한다.

대한민국 공개특허공보 제10-2012-0043287호

본 발명은 분쇄된 산화 박테리얼 셀룰로오스를 조성물 총 중량 기준으로 0.01-20 중량% 포함하는, 외력 감응성(thixotropic) 투명 겔 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 화장료 조성물은 피부 내에서 보습, 항산화, 열보호, 광보호 및 안티폴루션 효과 등 다양한 효능을 나타낸다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 분쇄된 산화 박테리얼 셀룰로오스를 조성물 총 중량 기준으로 0.01-20 중량% 포함하는, 외력 감응성(thixotropic) 투명 겔 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스의 피브릴의 길이는 5 nm 내지 5 μm이고, 직경은 5-100 nm이다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스는 N-옥실 화합물, 브로민화 나트륨, 산화제를 포함하는 용액으로 처리된 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 분쇄는 800-1000 bar의 압력 조건의 고압균질기에 의해 이루어진다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 를 포함하는 투명겔은 일반 상태에서는 겔 거동을 유지하다가 특정 힘(shear rate, 마찰, 문지름 등)을 가하면 졸로 변형되는 외력감응성(thixotropy)를 나타낸다. 상기 외력감응성은 가역적이며, 반복적으로 일어난다. 특히, 저장탄성률과 손실탄성률의 수치의 차이에 있어서 HEC(hydroxyethyl cellulose), 또는 CMC(carboxymethyl cellulose) 대비 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 겔은 갭이 더 크고 높은 힘에서 손실탄성률이 증가한다. 따라서, 외력에 감응하여 졸-겔로 상호 변환되는 현상이 더 뚜렷하게 나타난다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 투명겔은 시료를 24시간동안 정치한 후 레올로지분석 시, 저전단속도 (10^-2~10⁰)에서 100배, 50배, 30배, 20배, 10배, 또는 5배 이내의 점도 변화를 나타내며, 바람직하게는 20배 이내, 보다 바람직하게는 10배 이내, 가장 바람직하게는 5배 이내의 점도변화를 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스는 박테리얼 셀룰로오스 질량 대비 0.4 mmol/g 내지 2.0 mmol/g 의 카르복실기를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스는 바람직하게는 박테리얼 셀룰로오스 질량 대비 1.0 mmol/g 내지 2.0 mmol/g의 카르복실기를 포함한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 투과율 90% 이상의 투명한 성상을 가진다.

본 발명의 상기 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 투명 겔 화장료 조성물은 피부 내에서 보습, 항산화, 열보호, 광보호 및 안티폴루션 효과 등 다양한 효능을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 자외선에 대한 피부 보호용, 안티폴루션(anti-pollution)용, 항 피부노화용, 항산화용, 또는 열보호용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물이다.

종래의 셀룰로오스는 물에 녹지 않아 용액 속 첨가물로는 적합하지 않았고 세포 내에서의 효능을 확인하기 어려웠다. 이에, 본 발명자들은 셀룰로오스를 산화시킴으로써 수용성을 향상시켰다. 또한, 본 발명자들은 산화된 셀룰로오스를 고압균질 과정을 통해 미세피브릴화 시킴으로써 가역적인 졸-겔 현상(틱소트로피, thixotropy)에 의해 특이적 점도변화를 나타내는 기능성 박테리얼 셀룰로오스 겔을 개발하였다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 가역적인 졸-겔 현상에 의해 특이적 사용감을 나타내며 제형의 흐름성을 조절할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조방법을 제공한다:

다음 단계를 포함하는 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조방법:

N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 박테리얼 셀룰로오스 시트에 처리하여 산화 반응시키는 단계; 및

상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스를 고압 균질화 하는 단계.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조방법을 제공한다:

박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄하는 단계; 및

N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 상기 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스 시트에 처리하여 산화 반응시키는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 평균 입경 (D₅₀) 1500 μm 이하의 크기로 분쇄된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 바람직하게는 평균 입경 (D₅₀) 1200 μm 이하, 1000 μm 이하, 800 μm 이하, 700 μm 이하, 보다 바람직하게는 600 μm 이하의 크기로 분쇄되며, 가장 바람직하게는 500 μm 이하의 크기로 분쇄된다.

본 발명의 실험예 7 내지 11에서 입증한 바와 같이, 이러한 산화 반응 이전에 박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄하는 과정은 산화 반응의 효율을 향상시켜 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 품질을 향상시킨다. 상기 분쇄는 물을 가하면서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예 및 실험예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 실시예 3 내지 5에 따라 제조된 박테리얼 셀룰로오스 겔은 모두 우수한 특성을 갖고 있으나 적어도 실시예 3과 같이 1500 μm 이하의 크기로 분쇄되는 것이 겔의 품질(투명성, 틱소그래피성 등)의 측면에서 바람직하다. 한편, 실시예 5에 따라 제조된 겔의 경우에는 시트를 100 μm 이하로 분쇄하는 과정에서 고가의 장비, 장시간 및 고비용이 필요하여, 박테리얼 셀룰로오스 시트를 100 μm 이하의 입경 사이즈로 조절하여 분쇄하기가 어렵다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 산화 반응 용액은 브로민화 나트륨을 더 포함한다. 본 발명의 실험예 7 내지 11에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 산화반응 용액에 브로민화 나트륨을 첨가하면 겔 투명도, 틱소트로피(thixotropy) 및 박테리얼 셀룰로오스의 입도 등, 박테리얼 셀룰로오스 겔의 품질이 향상된다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 산화제는 차아할로겐산 또는 그 염, 아할로겐산 또는 그 염, 및 과할로겐산 또는 그 염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산화제는 차아할로겐산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 예컨대 상기 산화제는 차아염소산 또는 그 염, 아염소산 또는 그 염, 또는 과염소산 또는 그 염일 수 있고, 차아불소산 또는 그염, 아불소산 또는 그 염, 또는 과불소산 또는 그 염일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 산화제는 차아염소산 나트륨이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 산화 반응은 pH 9-11 조건에서 수행된다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 제조방법은 상기 산화 반응 후 N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 제거하는 단계(정제 또는 여과 단계)를 추가적으로 포함한다. 상기 제거단계는 여과(filtration), 보다 구체적으로는 멤브레인 여과(membrane filtration) 방법에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 정제는 N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 이용한 산화 반응을 종료한 후, 그 반응액에 알코올을 첨가하여 식물 분말을 침전시킨 후, 침전된 식물 분말(습체 케이크)에 정제수를 첨가하여 희석한 후 여과하는 단계로 수행될 수 있다. 여기에서 상기 알코올은 C1 내지 C5의 저가 알코올이 사용될 수 있으며 구체적으로는 에탄올이 사용될 수 있다. 또한 알코올 첨가-식물 분말 침전-여과 단계는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 정제는 N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 이용한 산화 반응을 종료한 후, 그 반응액에 정제수를 첨가하여 멤브레인 여과(한외 여과)하는 단계로 수행될 수 있다. 상기 멤브레인 여과 방법을 사용하면 상기 알코올 침전 및 정제수 희석 단계를 수행하지 않아도 단일한 과정으로 식물 분말의 산화 단계에서 발생한 미반응 원료와 불순물을 제거할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 제조방법은 상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스를 고압 균질화 하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 고압 균질화는 예컨대 800-1000 bar의 압력조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 구현예에 따라 고압 균질화 된 산화 박테리얼 셀룰로오스의 피브릴의 길이는 5 nm 내지 5 μm이고, 직경은 5-100 nm이다.

본 발명의 상기 고압 균질화 단계는 1회 이상 수행되는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 입증한 바와 같이, 1회보다는 3회 수행한 겔의 품질이 우수해지는 바, 1회, 또는 2회 이상 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제법에 의해 제조되는 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔은 겔 총 중량을 기준으로 산화 박테리얼 셀룰로오스를 0.01-20 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 다음과 같이 제조될 수 있다:

(a) 박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스 시트에 N-옥실 화합물 및 브로민화 나트륨(sodium bromide)을 첨가하여 교반하는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물에 산화제를 첨가하고 pH를 9-11로 유지하면서 반응시키는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 반응물을 미세피브릴화하는 단계.

이하, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.

단계 (a): 박테리얼 셀룰로오스 시트의 분쇄단계

우선, 박테리얼 셀룰로오스 시트에 물을 가한 후 분쇄한다. 박테리얼 셀룰로오스는 건조상태에서는 수화가 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 수분을 첨가한 상태에서 박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄함으로써, 작은 크기의 박테리얼 셀룰로오스 시트 분쇄입자를 수득할 수 있다.

박테리얼 셀룰로오스 시트 분쇄물(분쇄입자)은 그 크기가 작을수록 카르복실기량의 증가(셀룰로오스 내 -OH 의 -COOH 로의 치환)가 용이하고, 이로 인한 가역적인 졸-겔 전이가 단시간 내에 이루어지는 이점이 있다.

본 명세서 용어, "평균 입경 (D₅₀)"은 입도분포곡선에서 중량 백분율의 50%에 해당하는 입경, 즉 통과질량 백분율이 50%가 되는 입경을 의미한다. 본 발명의 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스 시트는 평균 입경 (D₅₀) 42 μm 내지 1,100 μm의 분쇄입자크기를 가질 수 있다.

단계 (b): 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스에 N- 옥실 화합물 및 브로민화 나트륨(sodium bromide)을 첨가하여 교반하는 단계

이어, 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스에 N-옥실 화합물 및 브로민화 나트륨(sodium bromide)을 첨가한 후 교반한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 N-옥실 화합물은 피페리딘 니트록시옥시 라디칼, 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 옥시 라디칼 (TEMPO) 또는 4-아세트아미드-TEMPO를 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 N-옥실 화합물은 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 옥시 라디칼 (TEMPO)을 사용할 수 있다.

단계 (c): 산화제 첨가하여 반응시키는 단계

다음으로, 단계 (b)의 교반 결과물에 산화제를 첨가하고 pH를 일정하게 유지하면서 반응시킨다.

상기 산화제는 차아할로겐산 또는 그 염, 아할로겐산 또는 그 염, 및 과할로겐산 또는 그 염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산화제는 차아할로겐산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 산화제는 차아염소산 나트륨 수용액을 사용할 수 있다.

차아염소산나트륨은 가장 저가의 산화제이며, 공업에서 범용적으로 사용되는 산화제이다. 본 발명에서는 상기 분쇄 단계 및 N-옥실화합물과 산화제의 사용에 의해, 강산처리 없이도 박테리얼 셀룰로오스 겔을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (c)는 단계 (b)의 교반 결과물에 산화제를 첨가하고 pH를 9-11로 유지하면서 반응시킬 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 단계 (c)는 pH를 9.5-10.5로 유지하면서 반응시킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 단계 (c)는 pH를 약 10으로 유지하면서 반응시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (c)는 단계 (b)의 교반 결과물에 산화제를 첨가하고 pH를 9-11로 유지하면서 2시간 내지 48시간 동안 반응시킬 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 단계 (c)는 2시간 내지 24시간 동안 반응시킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 단계 (c)는 2시간 내지 18시간 동안 반응시킬 수 있다.

단계 (c)에서 산화된 박테리얼 셀룰로오스는, 박테리얼 셀룰로오스 질량 대비 0.4 mmol/g 내지 2.0 mmol/g 의 카르복실기를 포함할 수 있다.

단계 (d): 박테리얼 셀룰로오스의 미세피브릴화 단계

단계 (c)의 반응 종료 후, 상기 반응액을 원심분리하여 침전물과 상등액으로 분리하고, 분리된 침전물을 미세균질화(미세피브릴화) 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 분리된 침전물을 미세균질화(미세피브릴화)하기 전에, 분리된 침전물에 정제수를 넣고 섞어준 후 다시 원심분리기를 이용해서 분리하는 과정을 반복하여 불순물을 제거하는 단계를 추가적으로 실시할 수 있다. 상기 반복과정을 통하여 물에 녹는 미반응 물질들과 불순물들을 제거한다.

본 발명의 다른 구현예에 다르면, 분리된 침전물을 미세균질화(미세피브릴화)하기 전에, 분리된 침전물에 정제수를 넣고 여과하는 공정을 통하여 미반응 물질들과 불순물들을 제거(정제)한다. 상기 여과 공정은 멤브레인 여과에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 불순물이 제거된 침전물을 정제수에 희석하여 호모게나이저(homogenizer) 또는 고압균질기(microfluidizer)를 통해서 미세균질화(미세피브릴화) 할 수 있다. 고압균질기를 이용하는 경우, 박테리얼셀룰로오스 박테리얼 셀룰로오스를 미세균질화(미세피브릴화) 할 수 있다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스를 포함한다. 본 발명의 미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스에서, 박테리얼 셀룰로오스 섬유의 길이는 5 nm 내지 5 μm, 5 nm 내지 3 μm, 5 nm 내지 2 μm, 5 nm 내지 1 μm, 5-800 nm, 5-600 nm, 5-500 nm, 5-400 nm, 또는 5-350 nm, 50 nm 내지 5 μm, 50 nm 내지 3 μm, 50 nm 내지 2 μm, 50 nm 내지 1 μm, 50-800 nm, 50-600 nm, 50-500 nm, 50-400 nm, 또는 50-350 nm, 100 nm 내지 5 μm, 100 nm 내지 3 μm, 100 nm 내지 2 μm, 100 nm 내지 1 μm, 100-800 nm, 100-600 nm, 100-500 nm, 100-400 nm, 또는 100-350 nm, 200 nm 내지 5 μm, 200 nm 내지 3 μm, 200 nm 내지 2 μm, 200 nm 내지 1 μm, 200-800 nm, 200-600 nm, 200-500 nm, 200-400 nm, 또는 200-350 nm 이고, 직경은 5-100 nm, 5-80 nm, 5-50 nm, 20-100 nm, 20-80 nm, 또는 20-50 nm 이고, 구체적으로는 20-50 nm 이다(도 1b 참조).

미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스를 농축(예를 들면, 진공 농축, 또는 여과, 멤브레인 여과)하여 박테리얼 셀룰로오스 겔을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스를 0.01 - 20 건조중량%의 농도를 가지는 투명한 액상 또는 겔상으로 제조하면, 수 분내에 가역적인 졸-겔 현상(thixotropy)을 나타낸다. 이로써, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 가역적인 외력 감응 졸-겔 현상 (thixotropy)을 나타낸다.

또한, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 투과율 90% 이상의 투명한 성상을 가진다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 천연보습인자 전사체 필라그린(filaggrin) 단백질의 발현을 유도함으로써, 피부 보습능을 나타낸다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 천연보습인자 합성에 관여하는 효소 카스파아제-14 (caspase-14) 단백질의 발현을 유도함으로써, 피부 보습능을 나타낸다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 MMP-1의 유전자 발현을 저해함으로써, 열보호 및 피부 노화 방지 효능을 나타낸다. MMP-1은 열에 의해 활성화되어 피부 노화(콜라겐 분해에 의한 주름 형성에 직접적으로 관여)를 일으킨다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 자외선 조사에 의해 발생하는 세포사멸(Cell apoptosis) 및 세포 손상을 막아줌으로써, 광보호 효능을 나타낸다. 자외선은 UV-A, UV-B 및 UV-C를 포함하며, 각 파장 영역은 다음과 같다. UV-A: 320~400 nm, UV-B: 280~320 nm, UV-C: 200~280 nm.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 CYP1A1 유전자 발현을 저해함으로써, 안티폴루션(anti-pollution) 기능을 나타낸다. CYP1A1 유전자는 환경유해인자인 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene)에 의해 일어나는 세포 내 도 독성 대사에 관여하는 메커니즘과 관련되어 있다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 AhR 유전자 발현을 저해함으로써, 안티폴루션(anti-pollution) 기능을 나타낸다. AhR 유전자 발현은 환경유해인자인 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene)에 의해 일어나는 세포 내 독성 대사에 의해 DNA 손상을 일으킨다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 ROS (reactive oxygen species) 활성을 효과적으로 감소시킴으로써, 항산화능을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 상술한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장료 조성물에 포함되는 박테리얼 셀룰로오스 겔의 함량은 전체 화장료 조성물 중량에 대하여 0.01-20 중량%로 첨가될 수 있다. 박테리얼 셀룰로오스 겔을 0.01 중량% 미만으로 첨가하면, 본 발명 박테리얼 셀룰로오스 겔의 첨가에 따른 효과를 기대하기가 어렵고, 20 중량%를 초과하여 첨가하면, 첨가량 대비 효능의 증대가 미미하여 경제적이지 못하다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 겔, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 스프레이, 수중유 (O/W)형 또는 유중수 (W/O)형의 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 파우더, 립스틱, 립글로스, 아이새도, 치크칼라 또는 아이브로우 펜슬류의 색조화장품 제형; 및, 두피용 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있다.

본 발명 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이 인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로 카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 박테리얼 셀룰로오스 겔과 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 박테리얼 셀룰로오스 겔의 양은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 피부보습, UV 자극(UV-A, UV-B 또는 UV-C)에 대한 보호, 안티폴루션(anti-pollution), 항노화, 항산화, 열에 대한 피부 보호 효능을 달성하는 데 충분한 양으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태는 상술한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 포함하는 피부 외용제에 관한 것이다.

본 발명의 피부 외용제는, 외용 산제, 외용 정제, 외용 액제, 연고제, 크림제, 겔제, 경고제, 드레싱제, 패취제, 스프레이제 및 좌제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제는 의약품 또는 의약외품으로 제조될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제에 함유되는 박테리얼 셀룰로오스 겔의 농도는 바람직하게 전체 피부 외용제 조성물 중량에 대해 0.01-20 중량%로 첨가될 수 있다. 본 발명의 피부 외용제의 사용량은 투여방법, 피투여자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정될 수 있다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 강산 전처리 과정이 생략되어 보다 안정하고, 가역적인 졸-겔 현상에 의해 특이적 사용감과 다양한 기능을 발휘한다. 또한, 목질계 셀룰로오스를 사용하지 않아, 전처리 과정이 비교적 간단하고, 비용적, 환경보호 측면에서도 효율적이다.

특히, 화장품 분야에서 화장료가 가역적인 졸-겔 현상을 가진다는 것은 제형의 흐름성을 조절할 수 있다는 측면에서 중요한 의미를 가진다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 다른 셀룰로오스 유도체들과 달리 가역적인 졸-겔 현상이 일어나며 이로 인해 특이적 사용감과 다양한 기능을 발휘한다.

본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔은 피부세포 내에서 다양한 효능을 나타내며, 보습, 열보호, 광보호, 항노화, 항산화 및/또는 안티폴루션 기능을 가진 화장료 및 의약품 조성물로 널리 이용될 수 있다.

도 1a는 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 입도 분포를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 200배 확대 사진이다(x 200).
도 2는 셀룰로오스 유도체 유도체 (하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 카복시메틸셀룰로오스(CMC)) 및 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 틱소트로피 측정 결과이다. 도 2의 상측 도면은 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC)와 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 는 실시예 4의 거동과 다르게 G" 대비 G'의 값이 선형을 나타냄으로써 졸-겔 틱소트로픽 성질을 나타내지 않는 것을 보여주는 그래프이다. 도 2의 하측 도면은 실시예 4의 cycle/15분 졸-겔 거동을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 필라그린(Filaggrin) 발현량에 따른 실시예 4 박테리얼 셀룰로오스 겔의 보습 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 카스파아제-14(Caspase-14)의 발현량에 따른 실시예 4 박테리얼 셀룰로오스 겔의 보습 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 광 보호 효능을 나타낸 결과이다.
도 5는 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 열 보호 효능을 나타낸 결과이다.
도 6은 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 CYP1A1의 발현량에 따른 안티폴루션 효능을 나타낸 결과이다.
도 7은 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 Ahr의 발현량에 따른 안티폴루션 효능을 나타낸 결과이다.
도 8은 실시예 4의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 항산화 효능을 나타낸 결과이다.
도 9는 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응의 최적 조건 확립을 위하여 실시한 실험예 7에서, 각 조건에 따라 제조한 겔의 외관을 나타낸 도이다.
도 10은 실험예 7의 조건 및 미세피브릴화 횟수에 따라 제조한 겔의 투명도를 나타낸 도이다.
도 11은 실험예 7의 조건 및 미세피브릴화 횟수에 따라 제조한 겔의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.
도 12는 실험예 7의 조건 및 미세피브릴화 횟수에 따라 제조한 겔의 입도를 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13c는 실험예 7의 조건 및 미세피브릴화 횟수에 따라 제조한 겔의 레올로지를 확인하기 위해 전단속도에 따른 점도를 비교하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 내지 실시예 5: 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔

(1) 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조

분쇄

박테리얼 셀룰로오스 시트 (SK바이오랜드 사(社) 제조)에 박테리얼 셀룰로오스의 중량비가 1% (w/v)가 되도록 대량의 물을 첨가하고, 분쇄장비(IM075, ㈜케이엔에스컴퍼니, 대한민국)를 이용하여 하기 표 1에 기재된 바와 같이 분쇄입자크기에 따라 분쇄하였다. 하기 표 1에 기재된 분쇄입자 크기에 따라 실시예 1 내지 5로 지칭하였다. 하기 표에서 입경은 분쇄된 입자의 지름(diameter)를 의미한다.

실험물질	분쇄입자크기
실시예 1	평균 입경 (D₅₀) 98 mm
실시예 2	평균 입경 (D₅₀) 52 mm
실시예 3	평균 입경 (D₅₀) 1.1 mm
실시예 4	평균 입경 (D₅₀) 430 μm
실시예 5	평균 입경 (D₅₀) 67 μm

산화 반응분쇄된 박테리얼 셀룰로오스 100 g에 N-옥실 라디칼 촉매 (TEMPO) 0.016 g과 취화 나트륨 (브로민화 나트륨, sodium bromide) 0.1 g을 첨가하여 교반하였다. 그 다음, 10 중량% 차아염소산 나트륨 수용액을 2.25 ml 넣고 pH 10을 유지하도록 3 내지 18시간 동안 반응하였다.

정제(여과)

반응 종료 후, 상기 반응액을 8500 rpm 으로 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 분리된 침전물에 정제수를 넣고 섞어준 후 다시 원심분리기를 이용해서 분리하는 과정을 반복하였다. 상기 반복과정을 통하여 물에 녹는 미반응 물질들과 불순물들을 제거하였다.

상기 산화 반응 종료 후 정제(여과) 과정은 에탄올 침전법 또는 멤브레인 여과법에 의해 이루어질 수 있다.

상기 반응 종료 후 정제과정을 에탄올 침전법으로 하는 경우에는 상기 N-옥실 라디칼 촉매를 이용한 산화 반응 후의 반응액 부피 대비 동량의 에탄올을 넣고 교반한 후 여과를 진행하였다. 여과된 습체 케이크를 앞 공정의 동일 부피(반응액+에탄올)의 50% 에탄올을 넣고 교반한 후 여과를 진행하였다.

상기 반응 종료 후 정제과정을 멤브레인 여과법으로 하는 경우에는 멤브레인 여과기(FMX-B5, UF의 일종, ㈜부강테크)를 이용하여서 수행될 수 있다. 멤브레인 여과기를 이용한 정제는 물에 녹는 미반응 물질과 불순물(반응에 사용된 TEMPO, NaBr, NaClO 등의 원료 및 반응 부가생성물 NaCl등)이 제거될 때까지 정제수를 계속 첨가하여 이루어진다.

고압 균질 및 정제(농축)

마지막으로, 침전물을 정제수에 희석하여 고압균질기(microfluidizer, MF)를 통해서 800 내지 1000 bar의 압력 하에서 미세피브릴화하고 진공 농축 또는 멤브레인 여과기(FMX-B5, ㈜부강테크)로 농축하여 고형 약 3%의 겔을 제조하였다. 분쇄된 미세입자의 크기는 HORIBA SZ-100 레이저 광산란 나노 입도분석기로 분석하였다.

미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스 섬유의 길이는 100 nm 내지 350 nm 이며, 직경은 20 nm 내지 40 nm 로 측정되었다(도 1b). 도 1a에서 평균입자 크기(particle size)는 155.5 nm 였다.

(2) 카르복실기량의 측정

상기 실시예 1 내지 실시예 5의 실험물질로부터 제조된, 미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스의 카르복실기량을 측정하였다. 각각 셀룰로오스 겔을 0.5 중량% 포함하는 희석액 100 ml를 조제하고, 0.1 M의 염산 수용액으로 pH를 약 3으로 만들었다. 이후, 0.05 M의 수산화나트륨 수용액을 적하하고, 전기전도도를 측정하였다. 측정은 pH가 약 11이 될 때까지 계속하였다. 전기전도도의 변화가 완만한 약산의 중화 단계에 있어 소비된 수산화 나트륨량 (V)으로부터, 하기의 수학식 1에 따라 관능기량 (카르복실기량, a)을 구하였다 (표 2).

[수학식 1]

실험물질	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
카르복실기량	0.14 mmol/g	0.21 mmol/g	0.75 mmol/g	1.30 mmol/g	1.86 mmol/g

(3) 투명도 평가상기 실시예 1 내지 실시예 5 의 실험물질로부터 제조된, 박테리얼 셀룰로오스 겔의 투명도 평가는 분광광도계 (JASCO, 분광광도계 V-650)의 투과율로 측정하였다. 먼저, 셀룰로오스 농도를 0.5%로 조정한 분산액에 10분간 초음파 처리를 하였고, 그 분산액을 광로 길이 1 cm의 석영 셀에 충전한 뒤, 파장 660 nm의 가시광선을 입사했을 때의 투과율을 측정하고 육안관찰 하였다.

* 평가 기준*

○: 투명함 (투과율 95% 이상)

△: 약간 탁함 (투과율 85~95% 미만)

Х: 탁함 (투과율 85% 미만)

실험물질	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
투명도(육안)	Х	Х	△	○	○
투과율	74.3	82.6	94.8	97.8	97.7

(4) 틱소트로피성 평가

실시예 1 내지 실시예 5 의 실험물질로부터 제조된, 박테리얼 셀룰로오스 겔의 틱소트로피 (thixotropy) 효과를 측정하였다. TA 인스트루먼트 점도계 (TA instruments rheometer, 모델명 AR2000)를 사용하여 틱소트로피를 측정하였다 (표 4).

실험물질	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
틱소트로피	Х	Х	△	○	○

상기와 같은 결과에 의하여, 실시예 3 내지 5의 겔은 투명한 성상을 가지며, 가역적인 졸-겔 현상 즉, 틱소트로피 (thixotropy)성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 그 중 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 틱소트로피 측정 결과를 예시적으로 도 2을 통해 보여주고자 한다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 4의 겔은 오실레이션 스트레인 (Oscillation strain) 100%에 가까워질수록 G'는 작아지고 G"는 커지는 현상을 보였다. 하지만, 셀룰로오스 유도체 (하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 카복시메틸셀룰로오스(CMC))는 그러한 특성을 보이지 않았다. 이로 인하여 실시예 4의 겔이 틱소트로피 성질을 가진다는 것을 알 수 있었다. 또 15분 간격으로 3cycle의 졸-겔 전이 반복실험에서도 3회 모두 거동이 동일하게 나타내는 것으로 보아 우수한 가역적인 졸-겔 현상이 유지된다는 것도 확인할 수 있었다.

한편, 하기에서는 실시예 4의 미세피브릴화된 박테리얼 셀룰로오스를 사용하여, 피부 기능성 및 피부 발림성을 테스트하였다.

실험예 1: 실시예 4의 피부 표피 내 천연 보습 인자(natural moisturizing factor; NMF) 합성에 대한 보습 효능 평가

(1) 실시예 4의 피부 표피 내 천연 보습 인자 전사체 ( Filaggrin ) 발현에 대한 평가

필라그린(Filaggrin)은 각질 형성 세포의 분화 과정 동안 특정 과정에서 케라틴-결합 단백질 형태로 피부 표피 내 존재한다. 각질 형성 세포의 분화 과정 동안 전사체인 프로필라그린(Pro filaggrin)에서 필라그린으로 분해되며, 그 이후 최종적으로 천연 보습 인자 분해되어 피부 표피의 수화(hydration)에 매우 중요한 역할을 한다. 상기 실시예 4의 필라그린 발현 효능을 측정하기 위하여, 신생아 포피 유래 각질형성세포 (gibco)에 시료를 처리하였다.

60 mm 디쉬에 인간성장인자 (human growth factor, gibco)가 포함된 Epilife (gibco) 배지와 인간 케라틴 세포 3X10⁵ cells를 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 시료를 무혈청 (serum-free) 배지에 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 칼슘 클로라이드는 본 실험의 양성 대조군으로 사용되었다.

세포를 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 긁어낸 후, 원심분리를 통해 펠렛(pellet)을 가라앉혔다. 이후, 단백질추출용액 (protein extraction solution)을 넣고 인큐베이션한 뒤, Qubit^TM fluorometer를 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질에 로딩 버퍼 (loading buffer)를 첨가한 후, SDS-PAGE에 로딩하였다.

iBlot Dry Blotting 시스템을 이용하여 트랜스퍼(transfer)한 후, 블로킹(blocking)하였다. 이후, 1차 (Filaggrin, β-actin) 및 2차 (GAM-HRP) 항체를 처리하였다. 항체 처리 후, west save cold ECL 용액을 처리한 후, chemi doc LuminoGraphⅡ (ATTO)로 밴드를 촬영하고 이를 수치화한 값을 정량하여 표로 나타내었다 (표 5).

샘플	농도 (mg/ml)	Filaggrin/β-actin (%)
대조군 (무처리군)		100
CaCl₂ 1.2 mM		157
실시예 4	0.03	198
	0.15	210
	0.30	224

실시예 4의 보습 효능을 비교하기 위하여 피부 장벽 및 수화(hydration)에 필수 적인 천연 보습 인자 합성 관련 메커니즘에 대하여 확인하였다. 필라그린(filaggrin)은 피부의 표피에 존재하는 천연 보습 인자 (natural moisturizing factor; NMF)의 전사체로, 피부 보습 유지에 가장 중요한 역할을 하는 인자 중 하나이다. 또한, 천연 보습 인자는 건조한 외부 환경으로부터 저항하는 수분결합용량 (water-binding capacity)를 갖고 있기 때문에 피부 장벽 기능 유지에도 필수적 역할을 한다. 이와 관련된 필라그린 단백질 발현량(도 3a)을 확인한 결과, 실시예 4에 의해 유도된 필라그린 발현량이 대조군 (control) 대비 2배 이상 현저하게 증가한 것이 확인되었다. 따라서 실시예 4는 천연 보습 인자 전사체인 필라그린의 합성을 눈에 띄게 증가시킴으로써 피부 보습 유지에 탁월한 효능이 있음을 확인하였다.

(2) 실시예 4의 피부 표피 내 천연 보습 인자 합성에 관여하는 효소 (Caspase-14) 발현에 대한 평가

상기 실시예 4의 카스파아제-14 (Caspase-14) 발현 효능을 측정하기 위하여 신생아 포피 유래 각질형성세포 (gibco)에 시료를 처리하였다. 카스파아제-14은 필라그린과 함께 발현되는 단백질 분해 효소 중 하나로, 피부 장벽 형성에도 매우 중요한 역할을 한다.

이를 확인 하기 위해, 60 mm 디쉬에 인간성장인자 (human growth factor, gibco)가 포함된 Epilife (gibco) 배지와 인간 케라틴 세포 3X10⁵ cells를 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 시료를 무혈청 (serum-free) 배지에 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다.

세포를 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 긁어낸 후, 원심분리를 통해 세포의 펠렛(pellet)을 가라앉혔다. 이후, 단백질추출용액 (protein extraction solution)을 넣고 인큐베이션한 뒤, Qubit^TM fluorometer를 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질에 로딩 버퍼 (loading buffer)를 첨가한 후, SDS-PAGE에 로딩하였다.

iBlot Dry Blotting 시스템을 이용하여 트랜스퍼(transfer)한 후, 블로킹(blocking)하였다. 이후, 1차 (caspase-14, β-actin) 및 2차 (GAM-HRP) 항체를 처리하였다. 항체 처리 후, west save cold ECL 용액을 처리한 후, chemi doc LuminoGraphⅡ (ATTO)로 밴드를 촬영하고 이를 수치화한 값을 정량하여 표로 나타내었다 (표 6).

샘플	농도 (mg/ml)	Caspase-14/β-actin (%)
Control		100
CaCl₂1.2 mM		130
실시예 4	0.03	131
	0.15	153
	0.30	206

실시예 4의 보습효능을 확인하기 위하여 카스파아제-14 단백질 발현량을 확인하였다 (도 3b). 실험 결과, 실시예 4에 의해 카스파아제-14의 발현량이 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과에 의해 실시예 4가 천연 보습 인자를 분해하는 효소 카스파아제-14의 발현을 유도함으로써 우수한 보습효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 실시예 4의 광 보호 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 자외선 (UVB)에 대한 광 보호 효과를 확인하기 위해 JC-1 스테이닝 (staining) 분석을 수행하였다.

불멸화된 각질 형성 세포주를 35 mm 플레이트 (plate)에 분주하여 24시간 안정화한 후, 무혈청 배지로 교체하고 시료를 전처리하였다. 1시간 뒤, HBSS로 세척 후, UVB 50 mJ/cm²을 조사하였다. 이를 무혈청 배지로 교체한 뒤 시료를 다시 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. JC-1 용액 (Sigma)을 처리하여 암실상태 (37℃, 5% CO₂)로 2시간 형광반응 시킨 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다 (도 4). 도 4는 실시예 4의 광 보호 효능을 나타낸 결과이다.

초기 세포자연사 현상인 미토콘드리아 막 전위의 변화는 미토콘드리아 내부의 전기 화학적 전위에 민감한 형광 색소를 사용하여 측정할 수 있는데 녹색형광 시아닌 염료(green fluorescent cyanine dye)인 JC-1이 진핵세포의 세포기질 내로 침투하여 전위에 따라 미토콘드리아에 축적되게 된다. 축적 시, JC-1은 녹색 (~529 nm)으로부터 빨강 (~590 nm)으로 형광방출이동(fluorescence emission shift)이 일어나며, 결과적으로 미토콘드리아의 탈분극이 일어나게 되면, 빨강/초록 형광 비강도 (red/green fluorescence intensity ratio)가 감소하게 된다.

실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔을 처리한 각질세포에 JC-1 염색을 수행한 결과, 시료들의 처리 농도가 높아짐에 따라 세포의 빨강 형광이 증가하여 UVB에 의한 손상으로부터 피부 광 보호 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 실시예 4의 열에 의해 유도된 MMP -1의 발현 저해를 통한 열 보호 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 열 보호 효과를 확인하기 위하여, 피부의 주름 형성에 결정적으로 기여하는 유전자 중 하나인 MMP-1 (Matrix Metallo-Proteinase-1) mRNA 발현 저해 효과 측정을 수행하였다.

피부 내의 콜라겐 붕괴를 촉진하는 MMP-1은 42℃에서 발현이 촉진된다. MMP-1의 유전자 발현 저해 효과를 보기 위하여 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다.

섬유아세포를 6-웰 멀티플레이트에 5X10⁵ cells/well 밀도로 분주한 후, 24시간 37℃에서 배양하였다. 42℃ 열을 주고 실시예 4를 농도별로 첨가하여 24시간 37℃에서 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 트리아졸 (Invitrogen, USA) 1 ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 분리하였다.

Qubit? fluorometer(Invitrogen)를 이용하여 RNA 양을 정량하였다. cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (High Capacity RNA-to-cDNA Kit, Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 키트의 방법에 의해 실험을 수행하였다. qRT-PCR은 Power SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 마스터 믹스의 방법에 의해 실험을 수행하였다. Applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System을 이용해 유전자를 증폭한 후, 증폭 산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 MMP-1과 β-actin 프라이머는 코스모진텍에서 합성하여 사용하였으며, 서열은 하기 표 7 및 표 8에 기재하였다.

MMP-1 프라이머
센스	5'-CCACCTATCACTTCAGATCAACAAA-3' (서열번호 1)
안티센스	5'-TTCCTGTAGGCCAGTGTCAAAAT-3' (서열번호 2)

β-actin 프라이머
센스	5'-GGCACCCAGCACAATGAAG-3' (서열번호 3)
안티센스	5'-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3' (서열번호 4)

MMP-1 발현 억제효과를 측정한 결과는 β-actin에 대해 보정을 하여 나타내었다 (표 9, 도 5). 실험 결과, 실시예 4는 열에 의해 유도된 MMP-1의 발현 대비 실시예 4처리 군에 대한 MMP-1 발현을 눈에 띄게 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 4의 셀룰로오스 겔은 열에 의한 주름 형성에 결정적인 역할을 하는 유전자 MMP-1 의 발현을 효과적으로 저해하였다. 이로써 실시예 4의 셀룰로오스 겔이 열 보호 효능이 있는 것을 확인하였다.

샘플	농도 (mg/ml)	MMP-1 발현율 (% 42℃, Actin 보정)
대조군		9.74
42℃		100.00
42℃ + 실시예 4	0.03	72.08
	0.15	50.94
	0.30	34.61

실험예 4: 실시예 4의 안티폴루션 (anti-pollution) 효능 평가

(1) 벤조 -[a]- 피렌에 의해 유도되는 CYP1A1 발현 확인을 통한 실시예 4의 안티폴루션 (anti-pollution) 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 오염원 (pollutants)에 대한 보호 효과를 확인하기 위하여, 최근 대두되고 있는 도시형 노화와 관련한 안티 폴루션 (Anti-pollution) 효능을 평가하였다. 대표적 환경유해인자로 알려진 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene)을 처리한 후, CYP1A1 (Cytochrome P450 family subfamily A member A1), AhR (Aryl hydrocarbon receptor)의 mRNA 발현 저해 효과 측정을 수행하였다.

피부 내의 독성 대사에 관여하는 CYP1A1과 AhR은 벤조피렌에 의해 유도되기 때문에, 실시예 4에 의한 CYP1A1의 유전자 발현 저해 효과를 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다.

각질 형성 세포를 6웰 멀티 플레이트에 1x10⁶cells/well 밀도로 분주한 후 24시간 37℃에서 배양하였다. 이후, 실시예 4를 농도 별로 전 처리 하여 1시간 37℃에서 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene) 1 μg/ml 실시에 4를 농도별로 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 트라이졸(Invitrogen, USA) 1ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 분리하였다. Qubit? fluorometer(Invitrogen)를 이용하여 RNA 양을 정량하였다. cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (High Capacity RNA-to-cDNA Kit, Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 키트의 방법에 의해 실험을 수행하였다. qRT-PCR은 Power SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 마스터 믹스의 방법에 의해 실험을 수행하였다. Applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System을 이용해 유전자를 증폭한 후, 증폭 산물을 정량 분석하였다. 프라이머 염기 서열은 하기 표 10 및 표 11에 기재하였다.

CYP1A1 프라이머
센스	5'- CAC AGA CAG CCT GAT TGA GCA -3' (서열번호 5)
안티센스	5'- GTG TCA AAC CCA GCT CCA AAG A -3' (서열번호 6)

GAPDH 프라이머
센스	5'-GGCACCCAGCACAATGAAG-3' (서열번호 7)
안티센스	5'-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3' (서열번호 8)

샘플	농도 (mg/ml)	CYP1A1 발현율 (GAPDH보정)	표준 편차.
대조군		7.3	0.51
벤조피렌	0.001	100.0	0.00
벤조피렌 + 레스베라트롤 (μM)	40	57.2	2.37
벤조피렌 + 실시예 4	0.03	89.3	3.42
	0.15	78.2	2.46
	0.30	65.7	2.42

CYP1A1 유전자 발현에 대한 결과는 GAPDH에 대해 보정을 하여 나타내었다 (도 6, 표 12). 실험 결과, 실시예 4에 의해 벤조피렌에 의해 유도된 CYP1A1의 발현이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 이 실험 결과를 통해 외부 자극에 의해 활성화된 피부 내 독성 대사 메커니즘에 실시예 4의 셀룰로오스가 관여함으로써 안티폴루션 효능이 있는 원료로 사용될 수 있음을 확인하였다. 환경 오염 물질 중 하나로 대표적으로 알려져 있는 벤조피렌에 의해 유도된 CYP1A1을 실시예 4 전 처리군에서 효과적으로 저해되는 것으로 나타났다.

(2) 벤조 -[a]- 피렌에 의해 유도되는 AhR발현 확인을 통한 실시예 4의 안티폴루션 (anti-pollution) 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 오염원 (pollutants)에 대한 보호 효과를 확인하기 위하여, 최근 대두되고 있는 도시형 노화와 관련한 안티폴루션 (Anti-pollution) 효능을 평가하였다. 대표적 환경유해인자로 알려진 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene)을 처리한 후, CYP1A1 (Cytochrome P450 family subfamily A member A1), AhR (Aryl hydrocarbon receptor)의 mRNA 발현 저해 효과 측정을 수행하였다.

피부 내의 독성 대사에 관여하는 CYP1A1과 AhR은 벤조피렌에 의해 유도되기 때문에, 실시예 4에 의한 AhR의 유전자 발현 저해 효과를 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다.

각질 형성 세포를 6-웰 멀티플레이트에 1x10⁶cells/well 밀도로 분주한 후 24시간 37℃에서 배양하였다. 이후, 실시예 4를 농도별로 전 처리하여 1시간 37℃에서 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 벤조피렌 (Benzo-[a]-pyrene) 1 ㎍/㎖와 실시에 4를 농도별로 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 트리아졸 (Invitrogen, USA) 1 ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 분리하였다. Qubit? fluorometer (Invitrogen)를 이용하여 RNA 양을 정량하였다. cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (High Capacity RNA-to-cDNA Kit, Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 키트의 방법에 의해 실험을 수행하였다. qRT-PCR은 Power SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, 마스터 믹스의 방법에 의해 실험을 수행하였다. Applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System을 이용해 유전자를 증폭한 후, 증폭 산물을 정량 분석하였다. 프라이머 염기 서열은 하기 표 13 및 표 14에 기재하였다.

AhR 프라이머
센스	5'-ATC ACC TAC GCC AGT CGC AAG-3' (서열번호 9)
안티센스	5'-AGG CTA GCC AAA CGG TCC AAC-3' (서열번호 10)

샘플	농도 (mg/ml)	AhR 발현율 (GAPDH보정)
Control		73.1
벤조피렌	0.001	100.0
벤조피렌 + 레스베라트롤 (μM)	40	72.1
벤조피렌 + 실시예 4	0.03	97.5
	0.15	80.2
	0.30	74.3

AhR 유전자 발현에 대한 결과는 GAPDH에 대해 보정을 하여 나타내었다 (도 7 및 표 15). 실험 결과, 실시예 4에 의해 벤조피렌에 의해 유도된 AhR의 발현이 유의하게 감소하였다. 실시예 4의 세포 전 처리를 통해 벤조피렌에 의해 활성화되는 독성 대사 메커니즘 중 AhR을 효과적으로 저해시켰다. 이 실험 결과를 통해 실시예 4의 셀룰로오스가 안티폴루션 효능이 있는 우수한 원료로 사용될 수 있음을 확인 하였다. 따라서, 실시예 4는 환경 공해나 일상생활 속에서 환경요인의 자극으로 민감해진 피부를 보호할 수 있는 원료로 사용될 수 있는 것이다.

실험예 5: 실시예 4의 항산화 (Anti-oxidation) 효능 평가

상기 실시예 4에서 제조한 셀룰로오스 겔의 오염원 (pollutants)에 대한 항산화 효과를 확인하기 위하여 위해 과산화수소 (H₂O₂)를 이용한 ROS 어세이를 진행하였다. 생체 내에서 생성되는 활성산소는 인체의 노화와 질병을 유발하는 주요 원인으로서 세포와 조직에 해로운 독성을 일으켜 질병을 유발하는 것으로 알려졌다. 초과산화물 음이온기 (superoxide anion radical), 일중항 산소(singlet oxygen), 및 과산화수소 등과 같은 활성산소 유도체들은 산화력이 매우 강하다. 이 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스를 유발하게 되며, 이러한 산화적 스트레스는 지질과산화를 유도하고 단백질, 세포막 및 DNA 등을 손상시켜 암을 비롯한 다양한 질환을 유발하는 것으로 알려졌다.

각질 형성 세포를 96-웰 멀티 플레이트에 3x10⁴cells/well 밀도로 분주한 후 24시간 37℃에서 배양하였다. 실시예 4를 첨가하여 24시간 37℃에서 배양하였다. H₂DcFDA 용액을 첨가하여 형광 염색 후, H₂O₂ 용액을 처리하였다. H₂O₂의 ROS 를 확인하기 위해 흡광도를 측정하였다. 그리고 BCA 용액을 이용하여 단백질량을 측정하며 BSA를 통해 표준곡선(standard curve)을 얻었다.

샘플	농도	ROS 활성(%)	표준편차.
Control (무처리군)		10.24	0.74
H₂O₂		100.00	8.99
H₂O₂ + 실시예 4 (mg/ml)	0.03	91.20	7.83
	0.15	85.21	8.18
	0.30	69.32	2.56

실시예 4의 ROS 생성 저해효과를 측정한 결과는 표 16에 나타내었다. 도 8은 실시예 4의 항산화 효능을 나타낸 결과이다. 실험 결과, 실시예 4는 고농도는 H₂O₂에 의해 유도된 ROS를 저해하는 효능이 있음으로 뛰어난 항산화 효능이 있다고 판단된다.

실험예 6: 사용감 평가

실시예 4와 통상적으로 이용하는 셀룰로오스 유도체 [카복시메틸 셀룰로오스 (비교예 1, carboxymethylcellulose), 하이드록시에틸 셀룰로오스 (비교예 2, hydroxyethylcellulose)]의 사용감을 평가하였다. 각각 1.0 중량%로 정제수에 용해하여 화장품 연구경력 1년 이상의 20명을 대상으로 제품을 사용하면서 느껴지는 관능(sensory) 테스트를 이중맹검(double blind)으로 수행하였다. 관능평가는 항온항습 조건(25±1℃, 50±5% RH)에서 수행하였다. 제품을 도포하여 바르는 방법은 제품을 일정양 취하여 피부에 도포한 후, 10회 손가락으로 돌린 후 평가하였다. 이후 흡수될 때까지 두드리고 나머지를 평가하였다. 평가 척도로는 제품을 도포할 때(rub-out)느끼는 관능척도와 제품을 도포하고 난 후(after feel, 제품을 도포한 후 2분이 지난 후에 평가) 느끼는 관능척도로 구분하여, 15점 척도기준으로 평가하였다.

구분	평가기준	평가척도
제품을 도포할 때 (rub-out)	발림성, 미끌거림, 유분감, 수분감, 끈적임, 흡수속도	(0)-----------------------(15) 낮음----------------------높음
제품 도포 후(after feel)	촉촉함, 유분감, 끈적임, 잔여감	(0)-----------------------(15) 낮음----------------------높음

구분	평가기준	실시예4	비교예1	비교예2
제품을 도포할 때 (rub-out)	발림성	13.1	10.2	9.8
	미끌거림	7.8	10.5	12.1
	유분감	3.7	5.4	6.8
	수분감	14.1	11.7	10.2
	끈적임	5.8	7.5	8.4
	흡수속도	13.3	9.7	10.3
제품 도포 후 (after feel)	촉촉함	12.8	8.1	7.4
	유분감	4.7	5.9	8.0
	끈적임	3.8	6.4	5.8
	잔여감	4.4	8.8	7.7

사용감 관능 테스트 결과를 통해, 제품을 도포할 때와 도포 후 느끼는 관능평가 척도에서 실시예 4가 망대 특성인 발림성, 수분감, 흡수속도, 촉촉함에서 비교예 1, 2보다 우수한 결과를 보였고, 망소 특성인 미끌거림, 유분감, 끈적임, 잔여감에서 비교예 1 및 비교예 2 보다 우수한 결과를 나타내었다.

실험예 7: 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응의 최적 조건 확립

본 발명자들은 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔을 제조하기 위한 산화 반응의 최적 조건을 확립하고자, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응에 영향을 미치는 조건들을 i) 박테리얼 셀룰로오스 시트의 분쇄 여부, ii) 브로민화 나트륨(NaBr)의 사용 여부로 구분하였다. 이를 표로 정리하면 하기 표 19와 같다. 하기 표 19의 조건 4는 상술한 실시예 4의 제조방법과 같은 조건이다.

구분	조건 1	조건 2	조건 3	조건 4
산화 반응 전 분쇄	X	O	X	O
TEMPO 사용	O	O	O	O
NaBr 사용	X	X	O	O
NaClO 사용	O	O	O	O

상기 표 19의 각 조건 별로 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응을 수행하고, 반응 후 결과를 도 9에 나타내었다.도 9에 나타낸 바와 같이, (1) 조건 1에 따라 박테리얼 셀룰로오스 시트를 산화 반응 전 분쇄하지 않고, 브로민화 나트륨(NaBr)을 반응물에 첨가하지 않고 제조된 샘플은 미반응 된 시트가 존재하여 물과 미반응 시트가 상분리되어 화장료 용도로 사용하기에는 적합하지 않은 것을 확인할 수 있었다. (2) 조건 2에 따라 산화 반응 전 박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄하고, 브로민화 나트륨을 반응물에 첨가하여 제조된 샘플은 조건 1의 샘플보다는 겔화가 진행되었으나 물과 상분리 되는 현상이 일부 관찰되었으며 제조된 겔의 투명도가 매우 낮았다. (3) 조건 3에 따라 박테리얼 셀룰로오스 시트는 분쇄하지 않고, 브로민화 나트륨을 반응물에 첨가하여 제조된 샘플은 분산성은 우수하나 겔의 투명도가 낮았다. (4) 마지막으로 조건 4에 따른 박테리얼 셀룰로오스 시트를 분쇄하고, 브로민화 나트륨을 반응물에 첨가하여 제조된 샘플은 분산성도 우수하고, 겔의 투명도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응 조건 및 미세피브릴화 공정 유무에 따른 제품의 투명도 확인

본 발명자들은 상기 실험예 7에서 실시한 산화 반응 조건이 박테리얼 셀룰로오스 겔 최종 제품의 품질에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상술한 본 발명의 실시예 1 내지 4에 따른 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조공정은 다음과 같다:

분쇄 - 산화 반응 - 정제(여과) - 미세피브릴화(고압균질) - 정제(농축) - 완제품

본 발명자들은 표 19의 각 조건 별로 상기 공정 중 미세피브릴화 수행여부에 따른 제품의 품질(투명도)을 확인하였다. 투명도(탁도)는 시료를 고형분이 0.5%가 되도록 희석한 뒤 UV-Visible spectrophotometer (V-650, JASCO)를 이용하여 660nm에서 탁도를 측정하였다. 결과는 도 10 및 표 20에 나타내었다.

미세피브릴화 회수	투명도(%)
미세피브릴화 회수	조건 1	조건 2	조건 3	조건 4
0	-	80.63	82.36	88.56
1	-	87.71	93.37	96.84
3	-	91.91	96.72	97.65

도 10 및 표 20에 나타낸 바와 같이, 반응조건별 샘플들은 미세피브릴화(Microfluidizer) 공정을 진행할수록 미세화 되어 최종 제품의 성상과 투명도를 개선시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 최종 제품의 투명도는 상기 실험예 7에서 확인한 산화 반응 결과물의 품질과도 상응하였다. 즉, 산화 반응시 시트의 분쇄 및 NaBr의 사용여부가 최종 제품의 품질에도 영향을 준다는 것을 확인하였다. 이는 시트의 분쇄로 인해 초기 반응물인 시트의 크기가 작아질수록 표면적이 증가하여 반응(carboxylation) 진행률이 높아지고 NaBr 촉매 사용에 의해 반응속도가 더욱 빨라져 제품의 품질이 우수해지는 것으로 생각된다.

실험예 9: 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응 조건 및 미세피브릴화 공정에 따른 제품의 투과전자현미경(TEM) 사진 확인

본 발명자들은 상기 실험예 8과 관련하여 산화 반응 조건 (조건 2 내지 4) 및 미세피브릴화 공정 횟수(0회, 1회, 및 3회)가 박테리얼 셀룰로오스 겔 제품의 품질에 미치는 영향을 확인하고자, 제작된 겔을 투과전자현미경(transmissible electron microscope)으로 관찰하였다.

결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 반응조건별 샘플들은 미세피브릴화(Microfluidizer, MF) 공정을 진행할수록 미세화되어 박테리얼 셀룰로오스 피브릴의 폭과 길이가 작아지며, 조건 2, 조건 3 및 조건 4의 순으로 미세피브릴의 폭과 길이가 점점 작아지는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 산화 반응 조건(초기 시트의 분쇄 및 NaBr 사용여부)이 미세피브릴화 공정 이후까지 겔의 품질에 영향을 줌을 확인할 수 있었다. 또한, 미세피브릴화 공정의 횟수가 높아질수록 비교군들 대비 섬유의 폭과 길이가 작아져 투과율(투명도)이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

실험예 10: 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응 조건 및 미세피브릴화 공정에 따른 제품의 입도 확인

본 발명자들은 살기 실험예 8과 관련하여 산화 반응 조건 (조건 2 내지 4) 및 미세피브릴화 공정 횟수(0회, 1회, 및 3회)가 박테리얼 셀룰로오스 겔 제품의 품질에 미치는 영향을 확인하고자, 제작된 겔의 입도를 DLS 분석기(Dynamic light scattering analyzer)을 이용하여 2회씩 반복 분석하였다.

결과는 표 21 및 도 12에 나타내었다.

반응조건	구분	MF 0회	MF 1회	MF 3회
조건 2 (분쇄 O NaBr X)	1	1415.2 nm	599.1 nm	508.6 nm
	2	1228.1 nm	603.9 nm	533.4 nm
	평균	1321.7 nm	601.5 nm	521.0 nm
조건 3 (분쇄 X, NaBr O)	1	968.9 nm	501.0 nm	480.6 nm
	2	971.6 nm	474.7 nm	491.0 nm
	평균	970.3 nm	487.9 nm	485.8 nm
조건 4 (분쇄 O, NaBr O)	1	741.7 nm	329.2 nm	254.3 nm
	2	732.0 nm	323.2 nm	255.8 nm
	평균	736.9 nm	326.2 nm	255.1 nm

표 21 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 반응조건별 샘플들은 미세피브릴화(Microfluidizer, MF) 공정을 진행할수록 미세화되어 박테리얼 셀룰로오스 피브릴의 입도가 점점 감소하는 것을 확인하였다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 겔의 피브릴은 도 11과 같이 섬유의 형태이나, 상기 입도 분석 결과로부터 본 발명의 겔의 미세화의 경향성을 확인할 수 있으며, 이러한 반응 조건 별 미세화 경향이 실험예 7 내지 9 에서 확인한 제품의 품질과 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 11: 박테리얼 셀룰로오스 산화 반응 조건 및 미세피브릴화 공정 유무에 따른 제품의 레올로지 확인

본 발명자들은 살기 실험예 8과 관련하여 산화 반응 조건 (조건 2 내지 4) 및 미세피브릴화 공정 횟수(0회, 1회, 및 3회)가 박테리얼 셀룰로오스 겔 제품의 품질에 미치는 영향을 확인하고자, 제작된 겔(분석 농도: 고형 3.0~3.5%)의 레올로지를 분석하였다. 레올로지는 Rheometer (HR-1, Ta Instruments) 기기를 이용하여 40 mm cone plate, 25℃ 조건에서 전단속도 10^-3~10² 범위의 점도를 분석하였다.

결과는 표 22 및 도 13a-13c(조건 2 내지 4)에 나타내었다.

반응조건	전단속도 (shear rate)	점도 (viscosity, Pa·S)
반응조건	전단속도 (shear rate)	MF 0회	MF 1회	MF 3회
조건 2 (분쇄 O NaBr X)	10^-2	3562.84	2461.32	65.9418
	10^-1	353.575	243.011	30.4929
	10⁰	38.6736	31.9133	5.31971
	10¹	3.89047	3.87907	0.79664
	10²	0.47168	0.51722	0.13505
조건 3 (분쇄 X, NaBr O)	10^-2	1251.07	65.3470	25.8330
	10^-1	136.225	25.4786	15.6118
	10⁰	16.4066	4.62290	3.19361
	10¹	2.27829	0.69213	0.56464
	10²	0.41864	0.11324	0.10251
조건 4 (분쇄 O, NaBr O)	10^-2	2121.41	70.1172	9.84520
	10^-1	212.743	40.1240	9.61530
	10⁰	21.5049	9.21181	7.02140
	10¹	2.18030	1.30020	1.02410
	10²	0.27303	0.16562	0.15240

상기 표 22 및 도 13a-13c에 나타낸 바와 같이, 상기 반응조건 별 미세피브릴화 공정(MF) 횟수에 따른 레올로지 거동을 분석한 결과, 전체적으로 조건 2 내지 4의 미세피브릴화 공정(MF) 0회에서는 모두 비슷한 선형 레올로지 거동(■)을 나타내었다. 그러나 미세피브릴화 공정(MF) 횟수가 증가될수록 반응조건별 미세피브릴화 공정(MF) 횟수에 따른 레올로지 거동은 다음과 같은 차이를 나타내었다. 1) 미세피브릴화 공정(MF) 횟수 증가할수록 초기 점도가 낮아지고 점도 유지구간 발생

미세피브릴화 공정(MF)의 횟수가 증가할수록 초기 점도가 낮아 졌으며, 조건 2에서는 MF 3회시 점도 유지구간이 발생하였고, 조건 3과 조건 4의 경우 MF 2회 및 3회시 점도 유지구간이 발생하였다.

2) 반응진행률이 높으면서(반응이 제대로 진행했을 경우) 미세피브릴화 공정(MF) 횟수가 증가할수록 점도 유지력이 증가

조건 3과 조건 4에서 전단속도의 증가에도 점도가 유지되는 구간이 MF 2회보다 MF 3회에서 더 길어져 MF 횟수가 증가할 수도록 점도 유지력이 증가됨을 알 수 있었다. 이는 셀룰로오스가 미세화 됨에 따라 수분산력이 향상되고 셀룰로오스의 표면적이 증가하여 셀룰로오스 간의 상호작용이 강해지면서 높은 전단속도에서도 점도가 유지되는 것으로 판단된다.

특히, 조건 4의 제조방법으로 제조한 경우(분쇄 O, NaBr O, MF 3회) 다른 비교군들과 비교하여 10⁰ 1/s에서도 점도가 유지되었다. 이러한 점도 유지력을 화장품의 사용감 측면에서 설명하면, 제품을 바르는 초기에는 점도유지력에 기인하여 촉촉함, 부드러움, 지속감, 영양감, 무게감을 나타내고, 이후 수차례 문지름, 마찰 등의 행동 후에는 점도가 감소하면서 발림성, 퍼짐성, 매끈성 등 1,2차적으로 다양한 사용감을 구현할 수 있음을 의미한다.

다시 말해, 조건 2 또는 3의 제조방법으로 제조한 겔의 경우 점도 유지력이 약하여, 적용 초기의 촉촉함, 부드러움, 지속감, 영양감, 무게감 및 이후 피부에 펴 바를 때의 발림성, 퍼짐성, 매끈성 등의 다양한 사용감이 나타나지 않고, 단순히 물을 피부에 바르는 정도의 사용감만을 제공할 것이다.

한편, 본 발명 박테리얼 셀룰로오스 겔을 포함하는 조성물의 제제예를 하기에 기술하였다. 다만, 하기의 제제예는 본 발명의 사용예를 구체적으로 설명하고자 하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 하기의 제제예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

제제예 1: 영양 화장수 (로션)의 제조

하기 표 23에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 영양화장수 (로션)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	10.0
2	시토스테롤	1.7
3	폴리길리세릴 2-올레이트	1.5
4	세테아레스-4	1.2
5	콜레스테롤	1.5
6	디세틸포스페이트	0.4
7	농글리세롤	5.0
8	카르복시비닐폴리머	10.0
9	선플라워 오일	0.2
10	산탄검	0.3
11	방부제	미량
12	향료	미량
13	정제수	잔량

제제예 2: 유연 화장수 ( 스킨 )의 제조

하기 표 24에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 유연화장수 (스킨)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	5.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	프리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

제제예 3: 영양크림 제조

하기 표 25에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	10.0
2	시토스테롤	4.0
3	폴리길리세릴 2-올레이트	3.0
4	세테아레스-4	2.0
5	콜레스테롤	3.0
6	디세틸포스페이트	0.4
7	농글리세롤	5.0
8	선플라워 오일	22.0
9	카르복시비닐폴리머	0.5
10	트리에탄올아민	0.5
11	방부제	미량
12	향료	미량
13	정제수	잔량

제제예 4: 에센스의 제조

하기 표 26에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	5.0
2	시토스테롤	1.7
3	폴리길리세릴 2-올레이트	1.5
4	세테아레스-4	2.0
5	콜레스테롤	3.0
6	디세틸포스페이트	0.4
7	농글리세롤	5.0
8	선플라워 오일	22.0
9	카르복시비닐폴리머	0.5
10	트리에탄올아민	0.5
11	방부제	미량
12	향료	미량
13	정제수	잔량

제제예 5: 파운데이션의 제조

하기 표 27에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 파운데이션을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	1.0
2	밀납	2.0
3	사이크로메치콘	2.0
4	유동파라핀	5.0
5	스쿠알란	5.0
6	스테아린산	2.0
7	친유성 모노스테이린산 글리세린	3.0
8	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
9	글리세린	4.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	부틸렌글리콜	3.0
12	트리에탄올아민	1.0
13	알루미늄마그네슘실리케이트	0.5
14	안료	12
15	방부제	미량
16	향료	미량
17	정제수	잔량

제제예 6: 헤어컨디셔너의 제조

하기 표 28에 기재된 바에 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 헤어컨디셔너를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	5.0
2	에탄올	3.5
3	글리세린	1.5
4	프로필렌글리콜	2.5
5	염화스테아릴트리에틴암모늄	2.0
6	색소	미량
7	향료	미량
8	정제수	잔량

제제예 7: 의약외품 및 약학 조성물의 제조

하기 표 29에 기재된 바와 같이, 실시예 4에서 수득한 박테리얼 셀룰로오스 겔을 함유하는 피부외용제 (연고)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료	함량 ( 중량% )
1	실시예 4	10
2	백색 바세린	23
3	유동 파라핀	29.6
4	밀납	2.8
5	세탄올	7.8
6	폴리솔베이트60	6.4
7	모노스테아린소르비탄	3.4
8	프로필렌 글리콜	16.6
9	파라옥시안식향산 메칠	0.2
10	파라옥시안식향산 프로필	0.2

<110> SK bioland Co., Ltd. <120> Use of bacterial cellulose gel with reversible sol-gel phase transition <130> PN180195P <150> KR 10-2018-0067728 <151> 2018-06-12 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 sense primer <400> 1 ccacctatca cttcagatca acaaa 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 antisense primer <400> 2 ttcctgtagg ccagtgtcaa aat 23 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin sense primer <400> 3 ggcacccagc acaatgaag 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin antisense primer <400> 4 ccgatccaca cggagtactt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP1A1 sense primer <400> 5 cacagacagc ctgattgagc a 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP1A1 antisense primer <400> 6 gtgtcaaacc cagctccaaa ga 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 7 ggcacccagc acaatgaag 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 8 ccgatccaca cggagtactt g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhR sense primer <400> 9 atcacctacg ccagtcgcaa g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AhR antisense primer <400> 10 aggctagcca aacggtccaa c 21

Claims

분쇄된 산화 박테리얼 셀룰로오스를 조성물 총 중량 기준으로 0.01-20 중량% 포함하는, 외력 감응성(thixotropic) 투명 겔 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분쇄된 박테리얼 셀룰로오스의 피브릴의 길이는 5 nm 내지 5 μm이고, 직경은 5-100 nm인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스는 N-옥실 화합물, 브로민화 나트륨, 산화제를 포함하는 용액으로 처리된 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분쇄는 800-1000 bar의 압력 조건의 고압균질기에 의해 이루어지는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스는 박테리얼 셀룰로오스 질량 대비 0.4 mmol/g 내지 2.0 mmol/g 의 카르복실기를 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 투과율 90% 이상의 투명한 성상을 가지는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 보습용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 자외선에 대한 피부 보호용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 안티폴루션(anti-pollution)용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항 피부노화용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항산화용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 열보호용인, 화장료 조성물.
다음 단계를 포함하는 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔의 제조방법:
N-옥실 화합물 및 산화제를 포함하는 용액을 박테리얼 셀룰로오스 시트에 처리하여 산화 반응시키는 단계; 및
상기 산화된 박테리얼 셀룰로오스를 고압 균질화 하는 단계.
제13항에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 평균 입경 (D₅₀) 1500 μm 이하의 크기로 분쇄된 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 산화 반응 용액은 브로민화 나트륨을 더 포함하는 것인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 고압 균질화는 800-1000 bar의 압력조건 하에서 수행되는 것인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 고압 균질화 된 산화 박테리얼 셀룰로오스의 피브릴의 길이는 5 nm 내지 5 μm이고, 직경은 5-100 nm인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 산화 박테리얼 셀룰로오스 겔은 겔 총 중량을 기준으로 산화 박테리얼 셀룰로오스를 0.01-20 중량% 포함하는 것인, 방법.