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KR20190131981A - 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR20190131981A
KR20190131981A KR1020180057084A KR20180057084A KR20190131981A KR 20190131981 A KR20190131981 A KR 20190131981A KR 1020180057084 A KR1020180057084 A KR 1020180057084A KR 20180057084 A KR20180057084 A KR 20180057084A KR 20190131981 A KR20190131981 A KR 20190131981A
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KR
South Korea
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straight
substituted
lrrk2
brain injury
traumatic brain
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020180057084A
Other languages
English (en)
Inventor
최환근
고은화
고이경
박진희
이태관
김희정
이병대
부영민
배진현
배윤희
Original Assignee
재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단
경희대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단, 경희대학교 산학협력단 filed Critical 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단
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Priority to PCT/KR2019/005969 priority patent/WO2019221566A1/ko
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Abstract

외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for use in preventing or treating Traumatic Brain Injury or stroke}
외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
단백질 키나제는 아데노신삼인산(ATP)의 말단 인산기를 단백질의 특정 잔기(타이로신, 세린, 트레오닌)에 전이시키는 반응을 촉매하는 효소로서, 세포 매개체 및 환경의 변화에 대한 세포의 활성, 성장 및 분화를 조절하는 신호에 관여한다.
부적절하게 높은 단백질 키나제 활성은 비정상 세포 작용으로부터 기인하는 다수의 질병과 직접적 또는 간접적으로 연관이 있다. 예를 들면, 돌연변이, 과잉-발현 또는 부적절한 효소 활성에 관련된 키나제의 적절한 조절메카니즘의 실패, 또는 사이토카인 또는 키나제의 업스트림 또는 다운스트림의 신호 전달에 참여하는 인자들의 과잉 또는 결핍 생성에 의해 질병이 야기될 수 있다. 따라서, 키나제 활성의 선택적인 억제는 질병 치료를 위한 신약 개발의 유익한 표적이 될 수 있다.
LRRK2(leucin-rich repeat kinase-2)는 류신 풍부 반복 키나제 집단(leucin-rich repeat kinase family)에 속하는 단백질이며, 종간 유사성이 높은 2527개의 아미노산 배열로 구성되어 있고, 특징적으로 하나의 단백질 안에 GTP 가수분해효소(GTPase)와 세린-트레오닌 키나제(Serine-threonine kinase) 활성을 모두 가지고 있다. 발현된 LRRK2는 뇌를 포함한 다양한 기관과 조직에서 관찰되고 있으며, 세포수준에서는 세포질 또는 세포막 및 미토콘드리아 외막에서 존재하는 것으로 알려져 있다. 현재 LRRK2의 정확한 생체 내 기능에 대해서는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 기능상 중요한 5개의 도메인(domain)을 가지고 있어, 자가 인산화 작용(Autophosphorylation)에 의한 자가활성조절작용과 단백질 상호작용 및 효소작용을 통한 세포기능 조절작용이 예상되고 있으며, 특히 샤페론기전(chaperone machinery), 세포골격 배열(cytoskelecton arrangement), 단백질번역기전(protein translational machinery), 시냅스소포 세포내 유입(synaptic vesicle endocytosis), 미토젠-활성화 단백질 키나제 신호 전달과정(mitogen-activated protein kinases signaling cascades), 유비퀴틴/오토파지단백질 분해과정(ubiquitin/autophage protein degradation pathways)이 LRRK2에 의해 조절되는 것으로 알려져있다.
또한, LRRK2는 알츠하이머병과 관련된 경도인지 손상의 전가, L-도파(Dopa) 유도된 운동 이상증, 뉴런 전구 분화와 관련된 CNS 장애, 암, 예컨대 신장암, 유방암, 전립선암, 혈액암 및 폐암 및 급성 골수성 백혈병, 유두상(papillary) 신장 및 갑상선 암종, 다발성 골수종, 근위축성 측삭 경화증, 류마티스 관절염 및 강직 척추염과 관련된 것으로 보고된 바 있어(특허문헌 1), LRRK2 활성을 조절하는 데에 효과적인 화합물 및 조성물은 신경퇴행성 질환, CNS 장애, 암, 급성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종, 및 염증성 질환등의 치료효과를 제공할 수 있다.
한편, 외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury, TBI)은 외부 충격이 두부에 가해져 뇌에 손상이 발생하는 것으로, 뇌조직은 다른 조직에 비하여 자가 치료능력이 떨어짐으로 인하여 손상에 따른 운동 및 인지 기능의 영구적 손실과 기능 이상이 발생할 가능성이 높다. 신경세포의 기본적 특성으로 인하여 외상성 뇌손상에 수반하는 신경세포의 손실은 되돌릴 수 없으며, 일차적 손상으로 인하여 발생한 신경세포 손실을 최소화하며 더 이상 확장되지 않도록 조절하는 것이 기본적인 치료 전략이며, 현재 외상성 뇌손상의 치료제는 신경세포 사멸을 직접적으로 조절하거나, 뇌염증, 뇌부종, 흥분성 독성을 조절을 통한 간접적 신경세포 사멸을 억제할 수 있는 표적에 대한 치료제 개발이 주를 이루고 있다.
현재까지 외상성 뇌손상 환자에게 사용이 되고 있는 대부분의 약물의 경우 뇌부종 감소, 뇌염증 반응 완화, 흥분성 독성 감소 등의 목적으로 사용이 되고 있으나, 상기 약물들의 경우 신경세포 손상을 직접적으로 조절하지 못하며 간접적 신경보호 효능을 가지는 한계를 가지고 있다.
이에, 그럼으로 현재 사용되고 있는 외상성 뇌손상 치료는 20년간의 진보에도 불구하고 사망률과 후유증의 발생률 감소에 효과적이지 못하며, 현재, 외상성 뇌손상의 병리적 현상을 대변하는 표적에 대한 치료제는 전무한 상황이며, 기존 치료 한계를 극복을 통한 보다 효과적 외상성 뇌손상 치료를 위한 신규 표적 치료제의 개발이 필요하다.
또한, 뇌졸중은 크게 뇌혈관이 막히는 허혈성 뇌졸중(뇌경색)과 뇌혈관이 터지는 출혈성 뇌졸중(뇌출혈)으로 구분된다. 허혈성 뇌졸중의 경우에서는 혈관의 동맥경화증으로 인한 뇌동맥의 혈전이나 색전과 심장질환 등에 의한 심인성 색전이 주된 원인이며, 뇌출혈의 경우는 고혈압에 의한 원발성 뇌출혈과 동정맥 기형이나 동맥류에 의한 지주막하 출혈이 중요한 원인이다.
뇌혈관이 막혀서 발생하게 되는 뇌경색은 다시 뇌혈전증과 뇌색전증으로 구분되는데, 뇌혈전증은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등에 의하여 동맥경화증이 초래되어 동맥의 벽이 두꺼워지거나 딱딱해지게 되고, 이로 인해 혈관이 좁아지고 혈관의 안벽이 상처받기 쉬워 매끄럽지 못해서 피가 엉겨 붙으면서 결국 막히게 되어 혈액의 공급이 현저히 줄거나 중단되어 뇌세포로 가는 산소 및 영양공급이 부족하여 뇌기능의 장애가 초래되는 경우에 해당하며, 뇌색전증은 심장판막증 또는 심방세동 등의 질환에 의하여 심장 내의 피의 흐름에 이상이 생겨 혈액의 일부가 심장 내에 부분적으로 정체, 응고되어 피찌꺼기(혈전)가 생기게 되며, 이것이 떨어져 나가 뇌혈관을 막게되어 뇌경색이 발생하게 된다.
뇌출혈의 경우에는 고혈압으로 인해 뇌혈관 내의 압력도 높아지기 때문에 작은 혈관의 벽이 견디지 못하고 터지는 원발성 뇌출혈, 혈관벽의 일부가 약해서 그 약한 부분의 벽이 늘어나 꽈리모양으로 불거져 나온 상태인 뇌동맥류가 어떤 계기에 터져서 발생하는 지주막하 출혈, 뇌동정맥 기형이 선천적으로 존재해 동맥의 높은 압력정맥으로 직접 전달되어 발생하는 뇌출혈로 나누며, 이 외에 혈액응고의 장애로 출혈 소인을 가진 경우에도 발생하게 된다.
현재 뇌졸중 치료방법으로서는 항혈전제, 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등을 이용한 약물요법이 사용되고 있으나, 현재 유일하게 허가된 약물인 항혈전제(tPA)는 뇌경색 발생 후 4~5 시간 이내에만 효과를 나타낸다. 하지만, tPA는 출혈성 뇌졸중의 경우 병을 더욱 악화시키게 되며, 알러지 등의 부작용을 유발하게 된다. 즉, 뇌졸중은 진단도 쉽지 않고 조기 발견이 어려우며 아직까지도 근본적인 치료법이 없는 상태이다.
WO 2007/149789
본 발명의 일 목적은, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료에 있어서의, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK2 발현 증가 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 mRNA의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 단백질의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현을 조직면역화학법에 의해서 분석한 것이다.
(d): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
(e): 외상성 뇌손상 부위에서의 LRRK2 발현 세포 분석 위치를 표시하여 나타낸 것이다.
(f): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 신경세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(g): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 미세아교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(h): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 성상교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 신경세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 3은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 미세아교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 미세아교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 4는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 성상교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 성상교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5는 추가 LRRK2 항체를 이용한 외상성 뇌손상 조직에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 사용된 LRRK2 항체에 대한 에피토프 표시 그림이다.
(b): 추가 LRRK2 항체를 이용한 면역 블랏 수행 및 이의 정량화 결과이다.
(c): 추가 LRRK2 항체를 이용한 조직면역화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 마우스 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(b): 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 mRNA 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c) 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 단백질 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
도 7은 뇌졸중 동물 모델에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 마우스 뇌졸중 유도 이후 손상 뇌조직 내 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 mRNA의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 단백질의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 면역 현광 염색법을 통한 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 신경 손상 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 글루타민산 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 글루타민산 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차피질 신경세포에 과산화수소 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 과산화수소 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차피질 신경세포에 CoCl2 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(f): CoCl2 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 HIF-1a 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 HIF-1a 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK와 HIF-1a의 발현을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
(c): HIF-1a 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포 수의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 이후 HIF-1a 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HIF-1a 발현 조절 및 활성 조절에 따른 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 발현 저해제인 2ME2 처리 및 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HIF-1a 에 의한 LRRK2 전사 조절 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 프로모터 영역에서의 HIF-1a 결합 후보 영역 도식화이다.
(b): HIF-1a 결합 후보 영역들에 대한 돌연변이 제작 모식도이다.
(c): 일차 피질 신경세포에 스크래치 손상 이후 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 siRNA HIF-1a 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에 LRRK2 프로모터 영역 내 HIF-1a 결합 영역 돌연변이 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(g): LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 LRRK2 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 Alama blue 실험 결과(b), LDH 유출 실험 결과(c), 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 LRRK2 인산화 감소 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 Alama blue 실험(b), LDH 유출 실험(c) 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제 실시예 10(도 a), 실시예 21 및 20 (도 b) 처리에 따른 신경 독성 변화를 LDH 유출 실험을 통하여 분석하여 나타낸 것이다.
도 16은 저산소증 환경에서의 LRRK2에 의한 신경 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 HIF-1a shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 LRRK2 shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌손상 보호 효능 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 활성 저해제(실시예 12)처리 및 행동 실험 분석 실험 계획 모식도이다.
(b): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리에 따른 LRRK2 인산화 변화 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(c) 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 균형 빔 테스트 결과를 나타낸 것이다.
(d) 및 (e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 새로운 물건 인지 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌결손 보호 효능 분석 결과이다.
(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌 결손 변화 사진이다.
(b): 크래실 바이올릿 염색을 통한 뇌 손상 부위 분석 이미지이다.
(c): 도 (b)의 결과를 정량화한 것이다.
(d): 신경세포 표지자 (NeuN) 항체를 활용한 조직 면역 화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
(e): 대뇌피질 및 해마 부위에서의 LRRK2 활성 저해제 처리 전후 신경세포 수를 정량화한 것이다.
도 19는 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 신경세포 사멸 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): TUNEL 염색을 통한 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 저해제 (실시예12) 처리 이후 신경세포 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 저해제 (실시예12) 처리 이후 세포사멸 표지자 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌 병리 변화 분석를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 미세아교세포 활성 분석을 위하여 각각의 표지자 항체를 이용한 조직면역화합법을 수행한 결과이다.
(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 성상교세포 활성 분석을 위하여 각각의 표지자 항체를 이용한 조직면역화합법을 수행한 결과이다.
(d): 도 (c)의 결과를 정량화한 것이다.
(e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과이다.
(f): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌혈관장벽 (MMP2, MMP9) 및 뇌부종 (AQP4) 표지자 발현을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 LRK2는 야생형일 수 있다.
하나의 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 또는 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노이고;
R2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이거나, R2는 R3 및 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성할 수 있고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;
R3는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐 C6-10 아릴아미노, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐아미노 C6-10 아릴아미노이거나, R2와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성하고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;
Y는
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
이고,
상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노 또는 하나 이상의 N을 포함하며 하나 이상의 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬으로 치환될 수 있고,
상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시가 치환된 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 -OH, =O, 할로겐 및 O를 하나 포함하는 4 내지 5 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
또한,
상기 R1은 -H, 또는 -NH(CH3)이고;
R2는 -H, 할로겐, 또는 -CF3이거나, R3와 함께 연결되어
Figure pat00004
또는
Figure pat00005
를 형성하고;
R3는 -H, -NH(CH3), -NH(CH2CH3),
Figure pat00006
, 또는
Figure pat00007
이거나, R2 및 R3는 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어
Figure pat00008
또는
Figure pat00009
를 형성하고;
Y는
Figure pat00010
또는
Figure pat00011
이고,
상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, 메톡시, 할로겐,
Figure pat00012
,
Figure pat00013
,
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
이고,
상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, 메틸, 할로겐,
Figure pat00016
또는
Figure pat00017
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(2) N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드;
(6) (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논;
(8) N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(10) 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온;
(11) (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논;
(12) (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논;
(14) 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올;
(16) N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 2]
Figure pat00018
상기 화학식 2에서,
L1 및 L2는 독립적으로 -O-, -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
A1은 비치환 또는 치환된 C3-10의 사이클로알킬이고, 여기서, 상기 치환된 사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다.
또한, 상기 L1 및 L2는 독립적으로 -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
A1은
Figure pat00019
또는
Figure pat00020
이고;
A2는
Figure pat00021
이고;
A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H 또는 메틸일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(7) (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온;
(9) 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 3]
Figure pat00022
상기 화학식 3에서,
L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L4는 N, 또는 C이고;
E1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
Figure pat00023
이고, 상기 E5는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;
E3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 사이클로알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, 할로겐, C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고;
E4는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴;이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 C6-10의 아릴; 및 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고,
여기서, 상기 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환될 수 있다.
또한, 상기 L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L4는 N, 또는 C이고;
E1은 -H, 또는 메틸이고;
E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
Figure pat00024
이고;
E3은 -H,
Figure pat00025
, 또는
Figure pat00026
이고;
E4는
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
, 또는
Figure pat00030
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(3) (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(5) 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린;
(18) 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸;
(20) (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 4]
Figure pat00031
상기 화학식 4에서,
L5는 N, 또는 CH이고;
G1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴아미노이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐 및 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고;
G2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 아릴, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 아릴 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 및 N 및 O를 포함하는 6 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
G3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 하나 이상의 나이트릴이 치환된 C6-10의 아릴 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴 및 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
또한, 상기 G1은 -H, 또는
Figure pat00032
이고;
G2는
Figure pat00033
또는
Figure pat00034
이고;
G3은 나이트릴,
Figure pat00035
또는
Figure pat00036
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(19) 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴;
(21) 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴;
(22) 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 5]
Figure pat00037
상기 화학식 5에서,
M1은 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C6-10의 아릴이고;
M2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
M3는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고,
여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 할로겐 및 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬으로 치환될 수 있다.
또한, 상기 M1은
Figure pat00038
또는
Figure pat00039
이고;
M2는
Figure pat00040
이고; 및
M3는
Figure pat00041
또는
Figure pat00042
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 5로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(4) 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드;
(23) 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 6]
Figure pat00043
상기 화학식 6에서,
Q1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
Q2는 -H, 비치환된 C6-10의 사이클로알킬이고;
Q3은 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고; 및
Q4는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 메틸이 치환된 5 원자의 헤테로아릴이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(13) (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 7]
Figure pat00044
상기 화학식 7에서,
T1은 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 비치환된 C3-8의 사이클로알킬카보닐이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 7로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(15) 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논.
다른 일례로, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 한다.
[화학식 8]
Figure pat00045
상기 화학식 8에서,
Z1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
Z2는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
Z3는 -H, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 8로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
(17) (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논.
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 상기 약학적 조성물의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제와 동일한 것이므로 자세한 설명은 생략한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료에 있어서의, LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서, LRRK2 야생형이 과발현됨을 최초로 규명하였으며, 상기와 같은 효과를 통해 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중을 치료할 수 있음에 대해서도 최초로 규명하였다. 이와 관련한 실험결과는 후술하는 실험예를 통해 상세히 설명한다.
이하, 본 발명을 후술하는 실시예와 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예와 실험예는 본 발명을 일부 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure pat00046
표제 화합물을 WO 2004080980, WO 2005016894, WO 2009102446, WO 2012019132 또는 WO 2015077602 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 2> N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드의 제조
Figure pat00047
표제 화합물을 WO 2009127642 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 3> (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온의 제조
Figure pat00048
표제 화합물을 WO 2010106333 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 4> 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드의 제조
Figure pat00049
표제 화합물을 WO 2011038572 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 5> 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린의 제조
Figure pat00050
표제 화합물을 WO 2011141756 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 6> (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논의 제조
Figure pat00051
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 7> (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온의 제조
Figure pat00052
표제 화합물을 WO 2012058193 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 8> N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure pat00053
표제 화합물을 WO 2012062783 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 9> 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온의 제조
Figure pat00054
표제 화합물을 WO 2012118679 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 10> 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온의 제조
Figure pat00055
표제 화합물을 WO 2010080712 또는 WO 2015176010 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 11> (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure pat00056
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 12> (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure pat00057
실시예 12 화합물은 하기 두가지 방법에 의해 제조할 수 있다.
<방법 1>
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<방법 2>
Figure pat00058
단계 1: 2-클로로-5-요오도-N-메틸피리미딘-4-아민의 제조
2,4-디클로로-5-요오도피리미딘(1.0 당량)을 THF에 녹인 후, 0℃에서 메틸아민(3.5 wt% in EtOH, 1.1 당량)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 뒤, 용매를 제거하고 더 이상의 정제과정 없이 다음 단계에서 사용하였다(수율: 100%).
단계 2: 2-클로로-N-메틸-5-(트리프루오로메틸)피리미딘-4-아민의 제조
Two-necked round-bottom flask를 질소 기채로 채운 후, CuI(5.0당량) 및 KF(5.0 당량)를 넣었다. 혼합물을 150℃로 온도를 가열한 뒤, 감압 상태에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 후, 온도를 상온으로 낮추고 질소하에서 DMF/NMP(1:1)에 용해된 트리메틸(트리플로로메틸)실란(5.0 당량)을 실린지(syringe)를 이용하여 첨가하였다. 30분 동안 반응시킨 뒤, DMF/NMP(1:1)에 용해된 2-클로로-5-요오도-N-메틸피리미딘-4-아민(1.0 당량)을 실린지를 이용하여 첨가하고, 50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 반응물에 물을 첨가하여 침전물을 형성시키고, 형성된 침전물을 여과하여 제거하였다. 수득된 여과액으로부터 EtOAc를 이용하여 유기물을 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인(brine)으로 세척하고, Na2SO4로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 노란빛 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).
단계 3: (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조
2-클로로-N-메틸-5-(트리프루오로메틸)피리미딘-4-아민(1.0 당량)과 (4-아미노-3-메톡시페닐)(모르폴리노)메타논(1.0 당량)을 다이옥세인(dioxane)에 녹이고, 상온에서 p-톨루엔술폰산(p-toluensulfonic acid)(1.0 당량)을 첨가하였다. 이를 100℃에서 16시간 교반한 뒤, 상온으로 식힌다음 용매를 제거하고 얼음물을 첨가하였다. 유기물은 EtOAc를 이용하여 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 흰색 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).
<실시예 13> (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드의 제조
Figure pat00059
표제 화합물을 WO 2012162254 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 14> 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올의 제조
Figure pat00060
표제 화합물을 WO 2012062783 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 15> 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논의 제조
Figure pat00061
표제 화합물을 WO 2013046029 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 16> N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure pat00062
표제 화합물을 Journal of Medicinal Chemistry (2014), 57(3), 921-936 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 17> (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure pat00063
표제 화합물을 WO 2014106612 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 18> 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸의 제조
Figure pat00064
표제 화합물을 WO 2014137723 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 19> 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴의 제조
Figure pat00065
표제 화합물을 WO 2014170248 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 20> (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린의 제조
Figure pat00066
표제 화합물을 WO 2014137723 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 21> 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴의 제조
Figure pat00067
표제 화합물을 WO 2015092592 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 22> 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴의 제조
Figure pat00068
표제 화합물을 USA 20140005183 A1 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 23> 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드의 제조
Figure pat00069
표제 화합물을 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2012), 22, 5625-5629 문헌을 참조하여 준비하였다.
하기 표 1에 상기 실시예 1-23에서 준비한 화합물의 구조를 나타내었다.
실시예 화학구조 실시예 화학구조
1
Figure pat00070
 2
Figure pat00071
3
Figure pat00072
 4
Figure pat00073
5
Figure pat00074
 6
Figure pat00075
7
Figure pat00076
 8
Figure pat00077
9
Figure pat00078
 10
Figure pat00079
11
Figure pat00080
 12
Figure pat00081
13
Figure pat00082
 14
Figure pat00083
15
Figure pat00084
 16
Figure pat00085
17
Figure pat00086
 18
Figure pat00087
19
Figure pat00088
 20
Figure pat00089
21
Figure pat00090
 22
Figure pat00091
23
Figure pat00092
<실험재료의 준비> 및 <실험방법>
본 발명의 실험예에 사용된 재료(세포, 동물 모델 등)의 제조방법 및 실험방법을 하기에 나타내었다.
1. 일차 피질 신경세포 배양
일차 신경세포 배양은 태아 15일령 ICR 마우스로부터 재취한 대뇌 피질을 이용하여 배양하였다. 대뇌 피질은 분리 후 HBSS 배양액 상태에서 20 U/ml papain 및 10 U/ml DNase를 37°C에서 15분간 처리 한 후 10% FBS 포함 MEM 배양액으로 피질 조직을 3번 닦아주며 이후 신경세포를 분리하였다. 분리된 신경세포는 실험 목적에 맞게 50 mg/ml poly-D-lysine으로 코팅된 세포배양접시에 분주하였다. 이후 하루 밤 배양 이후 1% Glutamax 및 2% B27 supplement를 포함한 Neurobasal A 배양액에서 10-12일간 배양 이후 실험을 수행하였다.
2. 외상성 뇌손상 신경세포 모델
외상성 뇌손상의 신경세포 모델 구축을 위하여 배양된 일차 신경세포에 일정한 간격 (3mm 간격의 격자 모양)으로 파이펫 팁을 활용하여 배양접시 표면을 긁어주었다. 상처 이후 배양액을 교체하며 이후 일정한 시간 간격 이후 추가적인 실험을 수행하였다. 손상을 주지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다.
3. 마우스 외상성 뇌손상 모델 제작
마우스를 활용한 외상성 뇌손상 동물 모델 구축을 위하여 제어피질 충격 동물 모델 (controlled cortical impact)을 사용하였다. 동물 모델의 제작 방법은 다음과 같다. 마우스를 2% isoflurane으로 마취를 시킨 이후 뇌정위 고정 장치에 고정 시킨 이후 정수리점을 기준으로 anterior-posterior (AP) -2 mm와 medial-lateral (ML) 2.0 mm 위치에 4mm 원형 모양으로 두개골을 절개하여 뇌를 노출 시켰다. 이후 대뇌피질 충격 장치 (Impact OneTM Stereotaxic Impactor for CCI, Leica)를 이용하여 2 mm 지름의 원형 충격팁으로 2m/sec 속도, 충격 지속 시간 300 msec, 깊이 2.5 mm, 발사각 25°로 대뇌피질에 충격을 가하였다. 이후 두개골을 복구 시킨 이후 37 ± 0.5℃보온 매트에서 마우스를 회복 시켰다. 대조군은 두개골 절개 이후 대뇌피질 충격을 주지 않은 마우스를 사용하였다.
4. 뇌졸중 동물 모델 제작
마우스를 70% N2O와 30% O2가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인익돌근구개동맥을 전기소작한 뒤, 외경동맥을 자르고 probe를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 10 mm정도 삽입한 후 실로 고정하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복시켰다. 유발 90분 후 같은방법으로 재마취하여 probe를 후퇴시켜 재관류시켰다. 모든 수술과정은 이소플루란을 2%로 유지하면서 수술현미경하에서 시행하였으며 체온이 37±0.5℃ 이하로 떨어지지 않도록 체온 유지장치를 이용하였다.
5. 약물 처리
본 발명의 실험에서, 약물은 본 발명에 따른 LRRK2 활성 저해제(본 발명의 실시예 화합물)를 의미한다.
LRRK2 활성 저해제(본 발명의 실시예 화합물)를 마우스에 처리하기 위하여 5% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 4% Tween 80을 포함한 생리식염수에 녹인 후 복강 주사를 통하여 50 mg/kg 농도로 처리하였다. 약물(본 발명의 실시예 화합물)은 매일 동일한 농도로 처리를 하였으며 대조군의 경우 5% dimethyl sulfoxide (DMSO)와 4% Tween 80을 포함한 생리식염수를 처리하였다.
6. RNA 분리 및 RT-PCR 실험
뇌조직 및 신경세포에서 전체 RNA의 분리는 Trizol를 이용하여 수행하였다. 2 mg 전체 RNA에서 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega)를 활용하여 cDNA를 합성하였으며 아래 기술된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
GAPDH (F: 5'- gtcatcatctccgcc-3', R: 5'-gatgcctgcttcaccaccttcttg-3');
LRRK2 (F: 5'-agctggttctagtcgctctg-3', R: 5'-gtagtctgcacctcagcaac-3');
HIF-1a (F: 5'-ctcatcagttgccacttcc-3', R: 5'-tcatcttcactgtctagaccac-3');
IL-1b (F: 5'-tccaggatgaggacatgagcac-3', R: 5'-gaacgtcacacaccagcaggtta-3');
IL-6 (F: 5'-ccacttcacaagtcggaggctta-3', R: 5'-ccagtttggtagcatccatcatttc-3'); 및
TNF-a (F: 5'-cttctgtctactgaacttcgg-3', R: 5'-caggcttgtcactcgaatttt-3').
7. 면역 블랏 분석
뇌조직과 세포는 40 mM Tri-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM glycerophosphate, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 및 protease inhibitor cocktail을 포함하는 용해액에서 용해 후 SDS-PAGE에서 단백질을 분리 후, PVDF 막으로 단백질을 이동 시켰다. 이후, 각 실험 용도에 맞는 항체를 막에 처리 이후 이차 항체와 면역 활성 복합체를 ECL (enhanced chemiluminescence) 검출 시스템을 이용하여 x-ray 필름에 시각화 하였다.
8. 일차 피질 신경세포 시료에 대한 면역형광법
커버슬립에서 배양한 일차 신경 세포를 4% PFA에서 20분간 처리한 후 0.2% Triton-X100 및 2% bovine serum albumin (BSA)을 포함하는 PBS에 각각 10분 및 30분간 순차적으로 처리하였다. 이후 커버슬립을 적절한 일차 항체와 이차 항체를 각각 처리하였다. 이후 슬라이드에 커버슬립을 올린 이후 lazer scanning confocal microscope (LSM700, Carl Zeiss)으로 형광 이미지를 얻었다.
9. 플라즈미드 및 siRNA 형질 전환
HA-HIF1alpha-pcDNA3은 Addgene (#18949)으로 구입하였으며, 우성 억제 인간 HIF-1a DNA (DNA 결합 및 transactivation 도메인이 제거된 형태)는 PCR을 통하여 제작하였다.
hHIF-1a-DN (F: 5'-ggggatccgccaccatgcgaagtaaagaatctg3', R: 5'-gggcggccgctcatttgtcaaagaggctact-3'). HIF-1a 및 이에 대한 대조군 siRNA는 Bioneer (Daejeon, South Korea)에서 합성하였다. 이에 대한 염기서열은 다음과 같다.
SiHIF-1a-1 (F: 5'-cccauuccucauccgucaau-3', R: 5'-uggauagcgauauggucaaug-3').
일차 신경세포에 cDNA와 siRNA는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였다.
10. shRNA 플라즈미드 제작
마우스 LRRK2 shRNA에 대한 lentiviral vector (pLL3.7) 제작을 위하여 다음과 같은 프라이머를 이용하여 제작하였다.
shLRRK2-1 (F: 5'-tggcttactacttcacttcacgatattttcaagagaatatcgtgaagtagtaagccttttttc-3' R: 5'-tgcttactacttcacgatatttttcaagagaaaatatcgtgaagtagtaagcttttttc-3');
shLRRK2-2 (F: 5'-taagttgatagtcaggctgaatttcaagagaattcagcctgactatcaacttttttttc-3' R: 5'-tcgagaaaaaaagttgatagtcaggctgaattctcttgaaattcagcctgactatcaactta-3'); 및
scramble (F: 5'-tcgctgagtacttcgaaatgtccttcaagagagacatttcgaagtactcagcgttttttc-3' R: 5'-tcgagaaaaaacgctgagtacttcgaaatgtctctcttgaagacatttcgaagtactcagcga-3'.
11. Lenti-virus 제작 및 신경세포에 접종
100 mm 세포배양 접시에, 3-4 x 106 293FT 세포를 24시간 배양 이후, 4.5 mg lentiviral construct (shControl, shLRRK2-1, shLRRK2-2), 3 ug psPAX2 (Addgene), 그리고 1.5 mg pMD2.G (Addgene)를 같이 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 transfection하였다. 이후 48시간 세포를 배양한 이후 배양액을 모으며 이를 Lenti-X concentrator (Clontech)을 이용하여 바이러스를 농축 시켰다. 이후, 6 mg/ml polybrene와 함께 배양 농축액을 신경세포에 처리하였다.
12. 마우스 및 인간 LRRK2 리포터 플라즈미드 제작 및 돌연변이 제작
마우스 일차 피질신경세포로부터 얻어진 지놈 DNA로부터 아래 프라이머를 활용하여 LRRK2 프모모터 영역 (-2095 ~ -1-bp, 번역 시작점 기준)을 PCR을 통하여 얻어냄. (F: 5'-gggtaccgctgtggttggccatgtcag-3', R: 5'-gctcgagggtgcagccgggcggggact-3'). 얻어진 PCR 산물은 TOPO TA cloning kit (Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1에 이동 시킴. 이후 Kpn I 및 Xho I 제한 효소 분해를 통하여 pGL3 basic vector (Promega)로 이동시켜 리포터 플라즈미드를 제작함. 네 개의 HIF-1a 결합 예측 영역에 대한 돌연 변이 제작을 위하여 Quick Change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)을 이용하였으며 돌연변이 여부를 automatic DNA sequencing (Macrogen, South Korea)를 통하여 확인함.
13. 크로마틴 면역침전 분석
크로마틴 면역침전 분석은 ChIP assay kit (Millipore)를 활용하여 수행하였다. 일차 신경세포에 대한 스크래치 손상 24시간 이후 1% formaldehyde/phosphate-buffered saline 처리 이후 소니케이션을 통하여 100- ~ 500-bp DNA 조각을 얻었다. 5 mg anti-HIF-1a (Novus) 혹은 rabbit IgG (Sigma-Aldrich)을 이용한 면역 침전법에 의하여 크로마틴을 분리하였다. HIF-1a 결합영역에 대한 결합 여부는 다음의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 확인하였다.
HRE3 (232-bp), (F: 5'-ggttacttggaagcaaatcc-3', R: 5'-gatgggtaagaggtggagg-3').
14. 신경 생존 분석
신경 생존 여부는 AlamarBlue assay (Thermo Scientific)와 LDH assay (Promega)를 이용하여 분석하였다. 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. LDH assay(Lactate dehydrogenase (LDH))는 세포막 손상 및 신경세포 사멸에 대한 마커로 활용하였다. 일차 신경에 대한 손상 및 이후 약물, 유전자 발현 조작 이후 배양액을 모은 뒤 분비된 LDH 양을 CytoTox 96R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promage)를 통하여 분석하였다.
15. TUNEL 염색
NeuN과 TUNEL의 동시 염색을 위하여 먼저 조직 절편을 NeuN 항체를 이용하여 염색을 수행하였으며 이후 ApopTag Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit를 이용하여 TUNEL 염색을 수행하였다. 세포핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 통하여 염색을 하며 이후 형광 현미경 (OLYMPUS DX51)을 통하여 이미지를 얻으며 이후 DP2-BSW software (version 2.2) 및 Image Pro Plus 6.0를 이용하여 이미지를 분석하였다.
16. 면역조직화학검사
마우스를 sodium pentobarbital (50 mg/kg, 복강주사)로 마취를 시킨 후 PBS와 4% PFA (w/v in PBS)로 관류 시켰다. 이후 뇌를 4% PFA 및 30% sucrose (w/v in PBS)에 각각 24시간 처리하였다. 이후 30 mm 관상 절펼을 제작하였다.
17. 뇌 손상 영역 측정
조직 절편을 poly-D-lysine으로 코팅된 슬라이드에 올리고 0.1% cresyl violet 용액에 20분간 처리하였다. 이후 100, 95, 70, 그리고 50% ethanol에서 순차적으로 2분간 탈수 과정을 진행하고 xylene으로 2분간 탈염색 과정을 수행하였다. 이후 손상 받은 전체 뇌반구 영역에 대한 손상 영역을 백분율로 환산하여 측정하였다.
18. 운동 행동 평가-balance beam test
Balance beam test는 약물 처리 전 1일 이후 3일 7일에 수행함. 마우스를 목재 원형 막대 (5 mm 직경, 90 cm 길이, 50 cm 높이)의 중간에 위치한 후 아래의 기준에 따라 점수를 매김. (0 점: 마우스가 30초 이상 막대에 머무르지 못할 경우, 1 점: 마우스가 30 초 동안 막대에 머무르지만 움직이지 못할 경우, 2 점: 마우스가 막대에서 오른쪽이나 왼쪽으로 방향을 틀려고 시도할 경우, 3 점: 마우스가 막대에서 오른쪽이나 왼쪽으로 방향을 트나 이후 걷지 못할 경우, 4점: 마우스가 막대에서 방향을 튼 이후 한 걸음 이상 이동하며 50% 이상의 발 미끄러짐을 보일 경우, 5점: 50% 미만의 발 미끄러짐을 보일 경우 4점에 대한 추가 1점, 6점: 발 미끄러짐이 보이지 않을 경우 5점에 대한 추가 1점.
19. 인지 행동 평가- Novel object recognition test
Novel object recognition (NOR) task는 뇌손상 이후 8일차에 수행하였다. 마우스를 검은색 나무로 제작된 천장이 없는 박스 (45 x 45 cm, 25 cm 높이) 안에 넣은 후 두개의 물건 (old object)에 30 분간 노출을 시켰다. 4시간 이후 마우스를 old object가 들어 있는 박스에 5분간 넣은 후 1시간 뒤, new object와 old object가 들어 있는 박스에 넣어주었다. 이후 마우스가 new object와 old object에 머무는 시간을 5분 동안 측정하였다.
[수학식]
Discrimination index = (time spent exploring the new object - time spent exploring the old object)/(total time spent exploring both objects)
<실험예 1> 제어 피질 충격 (controlled cortical impact) 마우스 뇌손상 동물 모델의 peri-contusional 지역에서 LRRK2 발현 증가 확인
뇌손상 마우스에서, LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타내었다.
뇌 손상에 대한 LRRK2 발현을 연구하기 위해 외상성 뇌 손상을 생성하는 가장 일반적인 방법인 마우스 제어 피질 충격 (CCI) 동물 모델을 적용하였다. CCI 후, 동측 외피의 손상 부위 주변 조직을 수집하였으며, LRRK2 mRNA 및 단백질의 수준을 RT-PCR 및 면역 블롯으로 분석하였다.
LRRK2 mRNA (도 1a)와 단백질 (도 1b)은 모두 CCI 후 2 시간과 6 시간에 피크를 보였다. LRRK2 mRNA의 수준은 24 시간 후에 점차 하향 조절되었지만(도 1a), CCI 후 72 시간까지는 LRRK2 단백질의 수준이 유지되었다(도 1b). 뇌에서 LRRK2 발현을 확인하기 위해 뇌 절편에 면역 염색을 시행하였으며, LRRK2에 대한 면역 활성은 외피 및 해마 영역의 외전근 주변에서 증가됨을 확인하였다 (도 1c 및 1d).
또한, 손상 부위에서의 LRRK2 발현의 세포 특이성 분석을 위하여 신경세포, 성상교세포, 미세아교세포 특이적 표지자인 NeuN (도 1f, 도 2), Iba-1 (도 1g, 도 3), GFAP (도 1h, 도 4)에 대한 항체와 LRRK2 항체의 동시 염색을 수행하였으며, 그 결과, LRRK2 발현이 신경세포에서 주로 증가함을 확인하였다.
나아가, 비특이적 면역 활성의 가능성을 없애기 위해 다른 에피토프(도 5a)를 인식하는 추가 3 가지 LRRK2 항체를 사용하였으며(도 5b 및 도 5c), 추가 LRRK2 항체가 있는 면역 블롯 (도 5b)과 면역조직화합법 (도 5c)은 외상성 뇌손상 후 도 1b 및 도 1c의 결과와 비슷한 LRRK2 발현 패턴으로, 외상성 뇌손상 후, LRRK2의 발현이 증가되었음을 확인하였다.
도 1은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK2 발현 증가 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 mRNA의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 마우스 뇌 조직에서의 LRRK2 단백질의 발현 수준을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현을 조직면역화학법에 의해서 분석한 것이다.
(d): 외상성 뇌손상 이후의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
(e): 외상성 뇌손상 부위에서의 LRRK2 발현 세포 분석 위치 표시하여 나타낸 것이다.
(f): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 신경세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(g): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 미세아교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
(h): 도 e의 표시된 영역에서의 LRRK2와 성상교세포 표지자와 동시 면역염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 신경세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 3은 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 미세아교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 미세아교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 4는 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 성상교세포에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 면역 현광 염색 수행결과를 나타낸 것이다.
(b): 성상교세포 표지자 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5는 추가 LRRK2 항체를 이용한 외상성 뇌손상 조직에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 사용된 LRRK2 항체에 대한 에피토프 표시 그림이다.
(b): 추가 LRRK2 항체를 이용한 면역 블랏 수행 및 이의 정량화 결과이다.
(c): 추가 LRRK2 항체를 이용한 조직면역화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
실험예 1 및 도 1 내지 5에 나타난 결과를 통하여, 뇌손상에서, LRRK2 발현이 신경세포에서 주로 유도됨을 알 수 있으며, 이는, LRRK2가 뇌 병리학에서 기능적 역할을 함축하고 있음을 시사한다.
<실험예 2> 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 증가 확인
뇌손상 마우스에서, LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
뇌졸중에서 LRRK2 발현 변화를 분석하기 위하여 랫트 국소뇌허혈 동물 모델(MCAo))과 저산소 처리 일차 피질신경세포 모델을 동시에 사용을 하였다. 국소뇌허혈 손상 부위 뇌조직에서 LRRK2의 발현의 증가를 보였으며 저산소 환경에서 발현되는 HIF-1a 발현 증가도 확인하였다(도 6a). 또한, 저산소 환경(1% O2)에서 일차 피질신경세포에서의 LRRK2 mRNA 및 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 6b 및 도 6c).
LRRK2 항체를 이용한 면역 형광 염색에서도 뇌졸중에서 LRRK2 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, 뇌졸중 동물 모델에서, 신경세포 표지자와 LRRK2의 동시 염색을 통해서 LRRK2 발현의 신경세포에 특이적으로 많이 발현하여, 신경 특이성이 있음을 확인하였다(도 7).
도 6은 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 마우스 뇌졸중 동물 모델에서의 LRRK2 발현의 시간대별 분석결과를 나타낸 것이다.
(b): 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 mRNA 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c) 저산소증 처리 이후 신경세포에서의 LRRK2 단백질 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
도 7은 뇌졸중 동물 모델에서의 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 마우스 뇌졸중 유도 이후 손상 뇌조직 내 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과이다.
실험예 2, 도 6 및 도 7에 나타난 결과를 통하여, 뇌졸중 또는 저산소증을 포함한 뇌병증 현상에서, LRRK2의 발현이 증가함을 확인하였으며, 이는, 뇌손상에 LRRK2가 연관되어 있음을 시사한다. 또한, 신경세포에 특이적으로 LRRK2가 많이 발현하는 바, LRRK2는 신경 특이성이 있음을 시사한다.
<실험예 3> 손상된 일차 피질신경세포에서 LRRK2 발현 증가 확인
외상성 뇌손상에서의 LRRK2 발현 정도를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury, TBI)은 축삭 손상, 흥분 독성, 산화 스트레스, 저산소 손상 및 신경 염증 등 여러 병리학 질환으로 알려져있다. TBI에서 LRRK2 발현에 대한 병리학 적 단서를 분석하기 위해 배양된 일차 피질 뉴런에 스크래치 손상, 글루카민산, 과산화수소 및 저산소증 등을 유도 후 LRRK2의 발현 여부를 분석하였다.
먼저, 축삭손상 후 LRRK2의 표현을 조사하기 위해 생체 내 외상성뇌손상 유발 병리학을 모방 한 신경세포에 스크래치 손상 동물 모델을 적용하였으며, LRRK2 mRNA(도 8a) 및 단백질(도 8b)은 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 후 유의하게 증가함을 확인하였다(도 8a 및 8b).
일차 피질신경세포 배양에서 스크래치 손상 후 LRRK2의 발현이 현저하게 증가된 것을 알 수 있으며, 이로부터 LRRK2 발현 증가 양상은 외상성 뇌손상을 받은 뇌 조직에서의 LRRK2의 발현 양상과 동일함을 확인할 수 있다. 또한, LRRK2와 NeuN 항체를 이용한 동시 면역 염색을 통하여 LRRK2 면역 활성이 특히, 신경세포에서 많이 증가함을 확인하였다 (도 8c).
또한, 손상된 신경세포는 글루타민산 및 활성산소 등의 여러 가지 유해한 인자를 방출한다. 이에, 손상된 뉴런으로부터 방출 된 성분의 효과를 조사하기 위해, 글루타민산(도 9a 및 9b)과 과산화수소(도 9c 및 9d) 처리 이후 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 발현을 확인한 결과 스크래치 손상과 동일하게 LRRK2 발현이 증가함을 면역 블랏을 통하여 확인하였다(도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d).
나아가, 저산소 상태를 모방하기 위해, 일차 피질 신경세포에 저산도 유도 물질인 CoCl2를 처리하였으며, 저산소 유도시에서도 일차 피질 신경세포에서 LRRK2의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 9e 및 도 9f).
도 8은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 mRNA의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(b): 일차피질 신경세포에 스크래치 손상을 준 이후 LRRK2 단백질의 발현을 분석하여 나타낸 것이다.
(c): 면역 현광 염색법을 통한 신경세포에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 신경 손상 동물 모델에서의 LRRK2 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차피질 신경세포에 글루타민산 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 글루타민산 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차피질 신경세포에 과산화수소 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 과산화수소 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차피질 신경세포에 CoCl2 처리 이후 LRRK2 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(f): CoCl2 처리 이후 신경세포 손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험예 3, 도 8 및 도 9에 나타난 결과를 통하여, 다양한 신경 독성의 병리적 원인들이 LRRK2 발현을 유도 할 수 있음을 확인하였으며, 이는, LRRK2 수준의 상향 조절 즉, LRRK2 발현의 증가에 공통적인 분자 메커니즘이 존재함을 시사한다.
<실험예 4> LRRK2 발현의 HIF-1α 의존적 조절 확인
외상성 뇌손상 동물 모델에서,LRRK2 발현의 분자 메커니즘을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.
외상성 뇌손상 동물 모델에서 LRRK2 발현의 분자 메커니즘을 확인하기 위해 외상성 뇌손상 병리와 관련된 전사 인자에 초점을 맞춰, 하기의 여러 증거를 바탕으로 hypoxia inducible factor-1 (HIF-1)를 타겟으로 하여 실험을 수행하였다.
i) LRRK2 발현은 중대 뇌동맥 폐색(MCAo) 래트 동물 모델에서 증가하였다. 외상성 뇌손상 및 국소 빈혈 / 뇌졸중은 뇌에서 출혈, 저산소증, 신경 염증 및 흥분 독성과 같은 일반적인 병리 현상을 공유하는 것으로 알려져있다.
ii) 저산소 유도제, 글루타민산 및 과산화수소는 배양된 일차 피질 뉴런에서 LRRK2 및 HIF-1α 발현을 증가시켰다(도 9).
iii) 마우스 LRRK2의 프로모터 영역에서 저산소 반응 요소(HRE)의 특정 서열을 발견하였다(도 12).
먼저, HIF-1α가 제어피질충격 및 스크래치 손상 외상성 뇌손상 동물 모델에서 각각 유도되는지 여부를 조사하였다. 도 10a 및 도 10d에 도시 된 바와 같이, HIF-1α 발현은 외상성 뇌손상 동물 및 신경세포 모델 모두에서 증가됨을 확인하였다.
또한, 면역 염색법을 통하여 외상성 뇌손상 동물 모델에서 LRRK2와 HIF - 1α가 동일한 세포에서 발현함을 확인하였다(도 10b). HIF - 1α 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포수를 정량화하여 도 10c에 나타내었다. 도 10b 및 10c에 나타난 바와 같이, HIF - 1α 발현 세포에서 LRRK2의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
LRRK2 발현에서의 HIF-1α의 역할을 분석하기 위해, 일차 피질 신경세포에 pcDNA3-HA-HIF-1α 야생형 또는 우성 억제 돌연변이를 각각 발현 시킨 이후 LRRK2 발현 변화를 분석한 결과 각각의 야생형 또는 우성 억제 돌연변이 HIF - 1α(HIF - 1α DN)에 의해서 LRRK2 증감을 mRNA (도 11a) 및 단백질 (도 11b)수준에서 평가하였으며, 그 결과, 스크래치 손상 전후 모두에서 야생형 HIF - 1α (HIF - 1α WT)존재에서는 LRRK2 발현이 증가하며, 우성 억제 돌연변이 HIF - 1α 존재에서는 LRRK2 발현이 감소함을 확인하였다.
또한, 스크래치 손상 이후 증가된 LRRK2의 발현을 HIF - 1α 우성 억제 돌연변이 및 siRNA HIF - 1α가 mRNA (도 11c) 및 단백질 (도 11d) 수준에서 감소 시킴을 역시 확인하였다.
나아가, HIF - 1α 저해제인 2ME2를 처리하였을 경우, HIF - 1α 및 LRRK2 발현이 모두 감소를 확인하였다 (도 11e).
도 10은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 HIF-1a 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 HIF-1a 단백질 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b): 외상성 뇌손상 이후 마우스 뇌에서의 LRRK와 HIF-1a의 발현을 면역 형광 염색법을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
(c): HIF-1a 발현 세포에서의 LRRK2 발현 세포 수의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포의 스크래치 손상 이후 HIF-1a 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HIF-1a 발현 조절 및 활성 조절에 따른 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(c): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에서 siHIF-1a 발현과 이후 스크래치 손상에 다른 LRRK2 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 발현 저해제인 2ME2 처리 및 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험예 4, 도 10 및 도 11에 나타난 결과를 통하여, HIF-1α가 외상성 뇌손상으로 유도된 LRRK2의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다.
<실험예 5> HIF-1α에 의한 LRRK2의 전사 조절 확인
HIF-1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
HIF-1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 분석하기 위해 LRRK2 전사 개시 부위에 대한 nt -2094와 -1 사이의 마우스 LRRK2 유전자의 프로모터 부위를 루시퍼라제 보고 플라스미드, pGL3- Basic에 서브 클로닝 하였다(도 12a).
루시퍼라제 플라스미드의 형질 감염 후 스크래치 손상을 일차 피질신경세포에 적용하였으며 루시퍼라제 활성 증가 관찰을 통하여 HIF - 1α에 의한 LRRK2 전사 조절을 확인하였다(도 12c). 도 12c에 나타난 바와 같이, HIF - 1α에 의해 LRRK2의 전사량이 증가함을 알 수 있다.
HIF - 1α에 의한 LRRK2 전사 조절의 특이성 분석을 위하여 일차 피질 신경세포에은 루시퍼라제 보고 플라스미드와 HIF - 1α 야생형 혹은 우성억제 발현 플라스미드를 발현시켰으며, 이후 스크래치 손상 이후 루시퍼라제 활성이 각각 증가 및 감소함을 확인하였다(도 12d). 도 12d의 결과를 통하여, 스크래치 손상 이후에도 야생형 또는 우성 돌연변이 HIF - 1α에 의해 LRRK2의 전사량이 증가함을 알 수 있다.
또한, siRNA HIF - 1α에 의한 HIF - 1α 발현 감소를 통하여 HIF - 1α 발현이 감소할수록 LRRK2 발현도 감소함을 확인하였다(도 12e).
나아가, 프로모터 영역은 -1766과 -1770 (HRE1), -1418과 -1422 (HRE2), -1355와 1359 (HRE3), -970과 -974 사이에 위치한 4 개의 추정 HIF - 1α 결합 사이트를 포함한다. LRRK2 프로모터에 HIF - 1α의 결합 사이트를 분석하기 위해, HRE1, 2, 3 및 4에 대한 사이트 지정 돌연변이를 생성하였으며, 각 HRE 돌연변이 루시퍼라제 플라스미드의 형질 감염 후 스크래치 손상을 가하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다(도 12b).
그 결과, HRE3 돌연변이는 극적인 감소를 나타내고 HRE4 돌연변이는 루시퍼 라제 활성의 적당한 감소를 나타내지 만 HRE1 및 HRE2 돌연변이는 나타나지 않으므로, HIF - 1α가 HRE3에 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 12f).
LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과, HIF-1α가 HRE3에 직접 결합하고 있음을 알 수 있었다(도 12g).
도 12는 HIF-1a 에 의한 LRRK2 전사 조절 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 프로모터 영역에서의 HIF-1a 결합 후보 영역 도식화이다.
(b): HIF-1a 결합 후보 영역들에 대한 돌연변이 제작 모식도이다.
(c): 일차 피질 신경세포에 스크래치 손상 이후 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(d): 일차 피질 신경세포에 HIF-1a 야생형 및 우성 억제형 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(e): 일차 피질 신경세포에 siRNA HIF-1a 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에 LRRK2 프로모터 영역 내 HIF-1a 결합 영역 돌연변이 발현 이후 스크래치 손상에 의한 LRRK2 프로모터 영역에 대한 루시퍼레이저 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(g): LRRK2 프로모터 내 세번째 HIF-1a 결합 영역 돌연변이에 대한 크로마틴 면역 침전법 수행 결과를 나타낸 것이다.
실험예 5 및 도 12에 나타난 결과는, 스크래치 손상 후 증가되는 LRRK 2 발현과 관련하여, HIF-1α 의존적으로 LRRK 2 전사 조절이 가능함을 시사한다.
<실험예 6> 스크래치 손상 이후 LRRK2 발현 증가에 따른 신경 독성 유도 확인
스크래치 손상 후 LRRK2 발현 증가의 기능적 결과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 13-15에 나타내었다.
스크래치 손상 후 LRRK2 발현 증가의 기능적 결과를 조사하기 위해, 일차 피질 신경세포에서 스크래치 손상 후 LRRK2 shRNA 및 LRRK2 키나아제 활성저해재를 각각 활용하여 발현 및 활성을 저해 시킨 이후 신경독성을 확인하였다. 신경 독성은 alamar blue 분석, LHD 유출 분석, TUNEL 염색 및 세포 사멸 표지 단백질 발현 측정을 모니터링하여 수행하였다.
먼저, shRNA LRRK2 (pLL3.7-shRNA LRRK2) 형질 도입을 위한 렌티 바이러스를 생성시키고 일차 피질신경세포에 감염시켰다. shRNA LRRK2 형질 도입 후 LRRK2 발현의 효율적인 하향 조절을 확인하였다(도 13a).
또한, shRNA LRRK2는 스크래치 손상에 의해 유도된 신경 독성을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 13b, 도 13c, 도 13d 및 도 13e). 특히, 도 13d를 살펴보면, shControl은 스크래치 손상 후, 신경세포가 현저하게 손상되나, shRNA LRRK2는 스크래치 손상후에도 신경세포가 유지되어, 신경 독성이 감소되었음을 육안으로 확인할 수 있다.
나아가, 스크레치 손상에 의해서 증가된 세포 사멸 표지자, 절단된 caspase-3, 절단된 PARP 및 p53의 감소도 확인하였다, 즉, 신경세포의 사멸이 감소하는 것을 알 수 있었다(도 13f).
또한, 스크래치 손상으로 유발된 신경 독성에 대한 LRRK2 키나아제 활성의 역할을 연구하기 위해 본 발명에 따른 실시예 10, 12, 20, 21 및 23의 총 5 종의 LRRK2 활성 저해제를 손상된 일차 피질 신경세포에 처리하였으며 본 발명에 따른 실시예 화합물이 신경 보호 효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 세포 사멸 표지자 절단된 caspase-3, 절단된 PARP 및 p53의 감소 역시 확인하였다(도 14, 도 15).
도 13은 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 발현 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 LRRK2 발현 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 Alama blue 실험 결과(b), LDH 유출 실험 결과(c), 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 LRRK2 shRNA 발현 이후 스크래치 손상에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 LRRK2 인산화 감소 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b), (c), (d) 및 (e): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 Alama blue 실험(b), LDH 유출 실험(c) 및 TUNEL 실험(d, e)을 통한 신경손상 분석 결과를 나타낸 것이다.
(f): 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제(실시예 12, 실시예 23) 처리에 따른 세포사멸 표지자 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 외상성 뇌손상 신경세포 모델에서의 LRRK2 활성 조절에 따른 신경독성 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 일차 피질 신경세포에서의 스크래치 손상 이후 LRRK2 활성 저해제 실시예 10(도 a), 실시예 21 및 20 (도 b) 처리에 따른 신경 독성 변화를 LDH 유출 실험을 통하여 분석하여 나타낸 것이다.
실험예 6 및 도 13 내지 도 15에 나타난 결과는, 스크래치 손상 이후 증가된 LRRK2 발현이 신경 독성에 관여함을 시사하며, 본 발명의 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 손상된 신경세포를 보호하는 효과를 나타냄을 입증한다.
<실험예 7> 저산소 손상 이후 LRRK2 발현 증가에 따른 신경 독성 유도 평가
저산소증 신경세포 모델에서 증가된 HIF-1a 및 LRRK2 발현 억제를 통한 신경독성 변화를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
저산소증 신경세포 모델에서 증가된 HIF-1a 및 LRRK2 발현 억제를 통한 신경독성 변화를 측정하였다.
저산소 환경에 신경세포를 노출 시킨 이후 증가된 신경 손상이 HIF-1a shRNA를 통하여 HIF-1a 및 LRRK2의 발현을 감소시켰을 때 세포 생존율이 급상승하는 것을 확인하여, 신경 독성이 감소됨을 확인하였다. 또한, LRRK2 shRNA를 통하여 LRRK2의 발현을 감소시켰을 때 역시 세포 생존율이 급상승하여, 신경손상이 감소됨을 확인하였다(도 16a 및 16b).
도 16은 저산소증 환경에서의 LRRK2에 의한 신경 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 HIF-1a shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 일차 피질 신경세포에서의 저산소증 처리 이후 신경 독성 확인 및 LRRK2 shRNA 발현에 따른 신경 독성 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험예 7 및 도 16에 나타난 결과를 통하여, 저산소 환경에서 유도되는 신경손상에서, LRRK2 발현이 증가됨을 확인하였으며, 이는, 외상성 뇌손상과 동일하게, 저산소 환경에서 유도되는 신경 손상도 LRRK2 발현 증가와 연관되어 있음을 시사한다. 또한, LRRK2 발현을 감소시킴으로써, 세포 생존율을 급격하게 상승시킬 수 있는 바, LRRK2 발현 조절을 통해 신경 손상을 예방 또는 회복 시킬 수 있을 것임을 알 수 있다.
<실험예 8> LRRK2 활성 저해제에 의한 제어피질 충격 유도 뇌손상 보호 효능 확인
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 운동 및 인지 기능 향상을 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
LRRK2 활성의 저해제에 의한 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 운동 및 인지 기능 향상을 분석하기 위하여 균형 빔 및 새로운 대상물 인식 (NOR) 테스트를 수행하였다(도 17a).
대조군 및 뇌손상 마우스 실험군에 본 발명의 실시예 12의 처리 후 LRRK2 활성의 억제를 확인하기 위해, 각 실험군에서 뇌조직을 면역 블랏을 이용하여 LRRK2 활성을 pS935 LRRK2 항체를 사용하여 확인하였으며, 본 발명의 실시예 화합물을 처리하여 효과적으로 LRRK2 활성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 17b).
이후, 각각의 실험군에 대한 균형 빔 및 새로운 대상물 인식 (NOR) 테스트를 수행하였으며, 실시예 12 처리에 의해서 뇌손상에 의해서 유도된 운동 및 인지 기능의 감소가 개선됨을 확인하였다(도 17c, 도 17d 및 도 17e).
도 17은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌손상 보호 효능 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): LRRK2 활성 저해제(실시예 12)처리 및 행동 실험 분석 실험 계획 모식도이다.
(b): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리에 따른 LRRK2 인산화 변화 분석 및 이의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
(c) 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 균형 빔 테스트 결과를 나타낸 것이다.
(d) 및 (e): 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 실시예 12 처리 이후 새로운 물건 인지 테스트 결과를 나타낸 것이다.
실험예 8 및 도 17에 나타난 결과를 통하여, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2)저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라, 외상성 뇌손상 후, 신경 행동 결과를 개선시킴을 알 수 있다.
<실험예 9> LRRK2 활성 저해제에 의한 제어피질충격 유도 뇌조직 결손 회복 효능 평가
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 뇌조직 손상 회복 및 신경세포 보호 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 18 및 19에 나타내었다.
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제로서, 실시예 12 화합물을 사용하였으며, 실시예 12의 화합물을 처리한 후 뇌조직 손상 회복 및 신경세포 보호 여부를 확인하기 위하여, 병변 면적, 신경 세포 손실 및 세포 사멸 표지자 발현을 분석하였다.
손상 후 8 일째에, 뇌손상 부위에 대한 관찰 결과 실시예 12처리 실험군에서 유의미한 손상 감소를 확인하였다(도 18a).
뇌절편의 크레실 바이로릿 (cresyl violet) 염색을 통하여 뇌 조직을 염색 한 후, 손상 부위에 대한 면적을 측정한 결과 실시예 12 화합물 처리 실험군에서 뇌손상이 감소하였음을 확인하였다(도 18b 및 18c).
대뇌피질과 해마 부위에서의 신경세포 생존 여부를 측정하기 위하여 NeuN 항체를 통하여 면역 염색법을 수행하였으며 각 영역별 신경세포의 수를 측정한 결과 실시예 12 화합물 처리 실험군에서 신경세포가 대조군에 비하여 증가함을 확인하였다(도 18d 및 도 18e).
또한, TUNEL 염색을 통하여 손상 부위에서의 세포 사멸 측정하고, 세포사멸 표지자 발현을 확인한 결과 실시예 12 처리 실험군에서 세포 사멸 감소와 세포사멸 표지자 발현 감소를 확인하였다(도 19a, 도 19b 및 도 19c).
도 18은 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 뇌결손 보호 효능 분석 결과이다.
(a): 외상성 뇌손상 동물 모델에서 실시예 12 처리 이후 뇌 결손 변화 사진이다.
(b): 크래실 바이올릿 염색을 통한 뇌 손상 부위 분석 이미지이다.
(c): 도 (b)의 결과를 정량화한 것이다.
(d): 신경세포 표지자 (NeuN) 항체를 활용한 조직 면역 화학법 수행 결과를 나타낸 것이다.
(e): 대뇌피질 및 해마 부위에서의 LRRK2 활성 억제제 처리 전후 신경세포 수를 정량화한 것이다.
도 19는 외상성 뇌손상 동물 모델에서의 LRRK2 활성 억제에 따른 신경세포 사멸 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
(a): TUNEL 염색을 통한 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 억제제 (실시예12) 처리 이후 신경세포 독성 분석 결과를 나타낸 것이다.
(b): 도 (a)의 결과를 정량화한 것이다.
(c): 외상성 뇌손상 마우스 뇌에서의 LRRK2 활성 억제제 (실시예12) 처리 이후 세포사멸 표지자 발현 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험예 9 및 도 18 내지 도 19에 나타난 결과는, 외상성 뇌손상에 의해 유도된 신경병증 현상이 LRRK2 활성에 의한 신경세포 손상과 연관됨을 시사하며, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 외상성 뇌손상에 의해 유도된 신경병증 현상을 개선시키고, 신경세포 손상을 회복시킴을 입증한다.
<실험예 10> LRRK2 활성 저해제에 의한 CCI 유도 뇌병리 현상 완화 확인
외상성 뇌손상은 뇌 속 다양한 병리적 현상을 유도한다. 대표적으로 신경염증, 뇌혈관 장벽 손상 및 뇌부종이 있다.
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 상기와 같은 외상성 뇌손상으로 인한 뇌속 다양한 병리 현상을 완화 또는 개선시키는 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제로는, 실시예 12 화합물을 사용하였으며, 상기 실시예 12 화합물에 의한 이상의 뇌병리 현상 개선 효능 분석을 수행하였다.
뇌염증의 경우 성상 교세포 및 미세아교세포의 활성을 각각의 표지자인 GFAP와 Iba-1으로 면역 염색을 수행하였으며, HG-11-31-01 실험군에서 각각 성상교세포 (도 20a 및 20b) 및 미세아교세포 (도 20c 및 20d)의 활성이 감소함을 확인하였다.
또한, 뇌염증 관련 사이토카인 변화 분석을 통하여 IL-1b, IL-6 및 TNF-a의 감소를 확인하였다(도 20e).
나아가, 뇌혈관 장벽 손상 및 뇌부종 개선 효과를 확인하기 위하여 각각의 표지자인 MMP-2/9및 AQP4에 대한 면역 블랏의 수행 결과 실시예 12에 의한 각각의 표지자 감소를 확인하였다(도 20f).
실험예 10 및 도 20에 나타난 결과는, 외상성 뇌손상에 의한 뇌병리 현상이 LRRK2 발현과 연관됨을 시사하며, 본 발명에 따른 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시킬수 있음을 입증한다.
따라서, 본 발명에 따른 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 저해제를 유효성분으로 함유하며, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중에서 과발현하는 야생형 LRRK2의 발현을 억제하고, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중으로 인해 유도된 손상된 신경세포를 보호 또는 회복시키고, 외상성 뇌손상 후 발생된 신경 행동 결과 또는 신경병증 현상을 개선시키고, 외상성 뇌손상에 의해 발생된 뇌병리 현상을 치료, 완화 또는 개선시키는 효과가 우수하므로, 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<제제예 1> 산제의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<제제예 2> 정제의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 3> 캡슐제의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 4> 주사제의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 100 ㎎
만니톨 180 ㎎
Na2HPO4ㆍ2H2O 26 ㎎
증류수 2974 ㎎
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
<제제예 5> 건강식품의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 500ng
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70mg
비타민 E 1.0mg
비타민 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산 칼슘 0.5mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제제예 6> 건강음료의 제조
본 발명에 따른 LRRK2 저해제 500ng
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (23)

  1. LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00093

    (상기 화학식 1에서,
    R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 또는 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노이고;

    R2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이거나, R2는 R3 및 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성할 수 있고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
    여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;

    R3는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐 C6-10 아릴아미노, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬설포닐아미노 C6-10 아릴아미노이거나, R2와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴을 형성하고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고,
    여기서, 상기 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고;

    Y는
    Figure pat00094
    또는
    Figure pat00095
    이고,
    상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐이고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 디C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬아미노 또는 하나 이상의 N을 포함하며 하나 이상의 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬으로 치환될 수 있고,

    상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시가 치환된 C1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 -OH, =O, 할로겐 및 O를 하나 포함하는 4 내지 5 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다).
  3. 제2항에 있어서,
    R1은 -H, 또는 -NH(CH3)이고;
    R2는 -H, 할로겐, 또는 -CF3이거나, R3와 함께 연결되어
    Figure pat00096
    또는
    Figure pat00097
    를 형성하고;
    R3는 -H, -NH(CH3), -NH(CH2CH3),
    Figure pat00098
    , 또는
    Figure pat00099
    이거나, R2 및 R3는 이들이 결합된 탄소원자와 함께 연결되어
    Figure pat00100
    또는
    Figure pat00101
    를 형성하고;

    Y는
    Figure pat00102
    또는
    Figure pat00103
    이고,
    상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, 메톡시, 할로겐,
    Figure pat00104
    ,
    Figure pat00105
    ,
    Figure pat00106
    또는
    Figure pat00107
    이고,
    상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, 메틸, 할로겐,
    Figure pat00108
    또는
    Figure pat00109
    인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
    (2) N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드;
    (6) (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논;
    (8) N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
    (10) 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온;
    (11) (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논;
    (12) (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논;
    (14) 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올; 및
    (16) N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00110

    (상기 화학식 2에서,
    L1 및 L2는 독립적으로 -O-, -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
    A1은 비치환 또는 치환된 C3-10의 사이클로알킬이고, 여기서, 상기 치환된 사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
    A2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 원자의 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
    A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다).
  6. 제5항에 있어서,
    L1 및 L2는 독립적으로 -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
    A1은
    Figure pat00111
    또는
    Figure pat00112
    이고;
    A2는
    Figure pat00113
    이고;
    A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (7) (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온; 및
    (9) 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 3]
    Figure pat00114

    (상기 화학식 3에서,
    L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
    L4는 N, 또는 C이고;

    E1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;

    E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
    Figure pat00115
    이고, 상기 E5는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고;

    E3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 사이클로알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
    여기서, 상기 치환된 사이클로알킬 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, 할로겐, C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고;

    E4는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬카보닐 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴;이고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 및 헤테로아릴은 독립적으로 C6-10의 아릴; 및 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고,
    여기서, 상기 치환된 6 원자의 헤테로사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환될 수 있다).
  9. 제8항에 있어서,
    L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
    L4는 N, 또는 C이고;
    E1은 -H, 또는 메틸이고;
    E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
    Figure pat00116
    이고;
    E3은 -H,
    Figure pat00117
    , 또는
    Figure pat00118
    이고;
    E4는
    Figure pat00119
    ,
    Figure pat00120
    ,
    Figure pat00121
    , 또는
    Figure pat00122
    인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (3) (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온;
    (5) 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린;
    (18) 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸; 및
    (20) (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 4]
    Figure pat00123

    (상기 화학식 4에서,
    L5는 N, 또는 CH이고;

    G1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴아미노이고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐 및 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 치환될 수 있고;

    G2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 아릴, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬이고,
    여기서, 상기 치환된 아릴 및 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 및 N 및 O를 포함하는 6 원자의 비치환된 헤테로사이클로알킬 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;

    G3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 비치환 또는 하나 이상의 나이트릴이 치환된 C6-10의 아릴 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고, 상기 치환된 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴 및 C1-3의 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어지는군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다).
  12. 제11항에 있어서,
    G1은 -H, 또는
    Figure pat00124
    이고;
    G2는
    Figure pat00125
    또는
    Figure pat00126
    이고;
    G3은 나이트릴,
    Figure pat00127
    또는
    Figure pat00128
    인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (19) 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴;
    (21) 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴; 및
    (22) 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 5]
    Figure pat00129

    (상기 화학식 5에서,
    M1은 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C6-10의 아릴이고;
    M2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
    M3는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 원자의 헤테로아릴이고,
    여기서, 상기 치환된 헤테로아릴은 할로겐 및 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 원자의 헤테로사이클로알킬 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬으로 치환될 수 있다).
  15. 제14항에 있어서,
    M1은
    Figure pat00130
    또는
    Figure pat00131
    이고;
    M2는
    Figure pat00132
    이고; 및
    M3는
    Figure pat00133
    또는
    Figure pat00134
    인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (4) 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드; 및
    (23) 2-(벤질옥시)-5-(2-플루오로피리딘-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 6]
    Figure pat00135

    (상기 화학식 6에서,
    Q1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
    Q2는 -H, 비치환된 C6-10의 사이클로알킬이고;
    Q3은 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고; 및
    Q4는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 메틸이 치환된 5 원자의 헤테로아릴이다).
  18. 제17항에 있어서,
    상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (13) (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 7]
    Figure pat00136

    (상기 화학식 7에서,
    T1은 -H, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 비치환된 C3-8의 사이클로알킬카보닐이다).
  20. 제19항에 있어서,
    상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (15) 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제는 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 8]
    Figure pat00137

    (상기 화학식 8에서,
    Z1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이고;
    Z2는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 원자의 헤테로아릴이고; 및
    Z3는 -H, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시이다).
  22. 제21항에 있어서,
    상기 화학식 8로 표시되는 화합물은 하기 화합물인 것을 특징으로 하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    (17) (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논.
  23. LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 저해제를 유효성분으로 함유하는 외상성 뇌손상 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.

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