TWI725041B - 用於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之chk1/2抑制劑 - Google Patents
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Abstract
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈及其醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物，其能夠抑制CHK1且適用於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤。
Description
據估計，20%至25%經診斷患有軟組織肉瘤之個體具有不佳的整體存活率及12個月之短暫中值存活期。關於神經母細胞瘤，患有高風險神經母細胞瘤之患者的療效仍然較低，長期存活率小於50%。因此，需要治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之新穎方法。
CHK1為在DNA合成期間對於促進DNA損傷反應及複製叉許可至關重要之多功能蛋白質絲胺酸/蘇胺酸激酶。CHK1小分子抑制劑正在進行用於實體腫瘤及血紅素惡性腫瘤之臨床研究。由於CHK1及CHK2在DNA損傷修復中之作用，CHK1/2之抑制劑已受到關注用於治療癌症。舉例而言，US8314108揭示CHK1/2抑制劑5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲酸鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈氯二氫鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸鹽，及5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物。
然而，仍需要為細胞週期檢查點之有效抑制劑的CHK1抑制劑，其可有效地充當可有益於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之DNA損傷劑的增效劑。本發明係關於一種胺基吡唑化合物或其醫藥學上可
接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物，其為可有益於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤的CHK1之有效抑制劑。該化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物有效地消除在組織培養物及活體內使用DNA損傷劑治療誘發的CHK1介導之細胞週期停滯，從而可有益於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤。此外，本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物亦提供對CHK2之抑制，從而可有益於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤。另外，當使用該化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤時，對某些其他蛋白質激酶(諸如CDK1)之抑制缺乏可由於最小化非所要效應而提供治療效益。
本發明亦提供一種胺基吡唑化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物，其為CHK1之拮抗劑且可解決對更安全及有效治療神經母細胞瘤及/或兒童及成人軟組織肉瘤之需要。
本發明涵蓋涉及5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途或方法，其用於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤。其他非限制性實施例包括5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲酸鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈氯二氫鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸鹽，及5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。
作為特定實施例，本發明提供為5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之化合物，其用於治療或作為
治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之甲酸鹽、氯二氫鹽及甲磺酸鹽，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。
本發明亦提供為5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物之化合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。
本發明提供呈結晶形式之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(該結晶形式之特徵在於X射線粉末繞射圖在2θ±0.02°=12.64°、21.25°及26.15°處具有峰)，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。
本發明涵蓋涉及5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途或方法，其用於治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤。其他非限制性實施例包括5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲酸鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈氯二氫鹽、5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸鹽，及5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤之方法。
作為特定實施例，本發明提供為5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之化合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤之方法。
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之甲酸鹽、氯二氫鹽及甲磺酸鹽，其用於治療或作
為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤之方法。
本發明亦提供為5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物之化合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤之方法。
本發明提供呈結晶形式之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(該結晶形式之特徵在於X射線粉末繞射圖在2θ±0.02°=12.64°、21.25°及26.15°處具有峰)，其用於治療或作為治療包括神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤但不包括脂肪肉瘤之癌症的方法。
本發明提供包含5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中之一或多者的醫藥組合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤之方法。本發明提供包含5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中之一或多者的醫藥組合物，其用於治療或作為治療神經母細胞瘤及/或軟組織肉瘤而非脂肪肉瘤之方法。本發明提供包含5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中之一或多者的醫藥組合物，其用於治療或作為治療癌症之方法；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-
甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。此外，本發明亦提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物以及電離輻射；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物以及至少一種化學治療劑；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物、至少一種化學治療劑及電離輻射；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途，其係用於製造用於治療癌症之藥劑；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。此外，本發明亦提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用
途，其係用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該治療包含與電離輻射之組合療法；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途，其係用於製造藉由組合療法治療癌症之藥劑，其中該組合療法治療包含向同一患者投與該藥劑及投與一或多種其他化學治療劑；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途，其係用於製造藉由組合療法治療癌症之藥劑，其中該組合療法治療包含向同一患者投與該藥劑及投與一或多種其他化學治療劑及電離輻射；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供用於療法之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。本發明亦提供用於治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。
另外，本發明亦提供用於與電離輻射同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物。此外，本發明亦提供用於與一或多種化學治療劑同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲
腈或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物。
本發明提供用於治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。另外，本發明亦提供用於與電離輻射同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供用於與一或多種化學治療劑同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。本發明提供用於與一或多種化學治療劑及電離輻射同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途，其係用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑將與電離輻射同時、分別或依序投與；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞
腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物之用途，其係用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑亦包含至少一種化學治療劑或將與至少一種化學治療劑同時、分別或依序投與；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供用於與電離輻射同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供用於與至少一種化學治療劑同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供用於與至少一種化學治療劑及電離輻射同時、分別或依序組合治療癌症之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
本發明提供包含5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受
之鹽的溶劑合物以及醫藥學上可接受之載劑及視情況選用之其他治療成分的醫藥組合物；其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物為CHK1/CHK2小分子抑制劑，其作為單一藥劑在S階段期間引起雙鏈DNA斷裂，導致複製災變及最終有絲分裂災變。此外，5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物介導的對CHK1之抑制消除用諸如小紅莓(doxorubicin)及吉西他濱(gemcitabine)之基因毒劑治療後之DNA損傷反應，從而增強DNA損傷及對此等藥劑之細胞凋亡反應。
可在具有神經母細胞瘤及人類兒童及成人肉瘤之小鼠模型中在活體內量測5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲磺酸單水合物之功效。可使用3天給藥、4天停藥之b.i.d.給藥方案，向負載人類橫紋肌肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤(DSRCT)、骨肉瘤及尤文氏肉瘤之細胞衍生異種移植物(CDX)抑或患者衍生異種移植物(PDX)之裸小鼠皮下投與5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(10mg/kg)。可每週量測腫瘤體積及體重兩次。可藉由免疫組織化學評估腫瘤特異性參數。
5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物在7/13的兒童腫瘤模型中引起強烈的單一藥劑活性，該等模型介於穩定疾病與完全消退之間。值得注意的係，在四個給藥週期之後，在DSRCT之PDX模型中觀測到完全消退。在停止治療後，在治療後50天觀測到腫瘤生長，包括在DSRCT之PDX模型中用5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈
甲磺酸單水合物再刺激時之腫瘤消退。在SJCRH-30 aRMS模型中，在停止服用藥物後，在治療期間觀測到的完全消退立即逆轉，且後續再生長對藉由10mg/kg之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物之進一步治療具有耐受性。然而，在此相同模型中，5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物加上小紅莓引起持久的完全消退，且在停止治療超過兩個月後無可偵測之腫瘤生長。
5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物亦在具有平滑肌肉瘤但非脂肪肉瘤之PDX模型中起作用。5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物單獨及與化學療法組合可顯著阻礙人類PDX及CDX模型之肉瘤生長。
本發明係關於一種胺基吡唑化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物，其抑制CHK1且適用於治療表徵為去氧核糖核酸(DNA)複製、染色體分離或細胞分裂之缺陷的癌症。
化學治療劑之非限制性實例包括5-氟尿嘧啶、羥基脲(hydroxyurea)、吉西他濱、甲胺喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、小紅莓、放線菌素d、依託泊苷(etoposide)、長春新鹼(vincristine)、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、環磷醯胺、順鉑(cisplatin)、紫杉醇(taxol)及其組合。本文所描述之方法及用途的實施例包括選自由膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰臟癌、間皮瘤、腎癌及子宮癌組成之群的其他癌症。此外，本發明提供如本文所描述之方法及用途的實施例，其中橫紋肌肉瘤為肺泡橫紋肌肉瘤及/或胚胎橫紋肌肉瘤。
本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物可以互變異構形式存在。當存在互變異構形式時，本發明涵蓋各種形式及
其混合物。
除非另外定義，否則本發明包括實例3化合物之醫藥上可接受之鹽以及實例3化合物或其醫藥學上可接受之鹽的游離鹼之溶劑合物。如本文所使用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指實例3化合物之鹽類。醫藥學上可接受之鹽的實例及其製備方法為此項技術中習知的。舉例而言，參見：Stahl等人，「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use」，VCHA/Wiley-VCH,(2002)；Gould,P.L.，「Salt selection for basic drugs」，International Journal of Pharmaceutics，33：201-217(1986)；及Bastin等人，「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」，Organic Process Research and Development，4：427-435(2000)。
除醫藥學上可接受之鹽外，其他鹽類亦包括於本發明中。其可在化合物之純化或其他醫藥學上可接受之鹽的製備中充當中間物，或適用於鑑定、表徵或純化。
如本文所使用，術語「患者」係指人類或非人類哺乳動物。更特定言之，術語「患者」係指人類。
術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指涉及減緩、阻斷、遏制、控制、減輕或逆轉症狀、病症、病況或疾病之進展或嚴重性的過程。
如本文所使用，術語「有效量」係指本文所描述之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物，在單次或多次劑量投
與給患者之後，單獨或與電離輻射或化學治療劑組合在接受診斷或治療之患者中提供所要效果的量或劑量。作為熟習此項技術者之主治診斷醫師可藉由考慮多個因素而容易地判定有效量，該等因素諸如：哺乳動物之種類；其大小、年齡及總體健康狀況；若需要，共同投與其他藥劑；所涉及之特定疾病；該疾病之程度或嚴重性；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投藥方式；所投與製劑之生物可用性特徵；所選擇之劑量療程；任何合併用藥之使用；以及其他相關情況。雖然不應理解為以任何方式限制本發明，但20mg/m2至150mg/m2表示有效量的本文所描述化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物。
如本文所使用，術語「組合療法」係指分別、同時或依序投與本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物及至少一種化學治療劑。此外，術語「組合療法」係指分別、同時或依序投與本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物及電離輻射。術語「組合療法」亦係指分別、同時或依序投與本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物、電離輻射以及至少一種化學治療劑。
一般熟習此項技術者將認識到5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物可替代地被稱作2-吡嗪腈、5-[[5-[2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基]-1H-吡唑-3-基]胺基]單甲磺酸單水合物。
5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物可經調配作為醫藥組合物之部分用於投藥。因此，包含5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物與一或多種醫藥學上可接受之載
劑、賦形劑或稀釋劑之組合的醫藥組合物為本發明之重要實施例。醫藥組合物之實例及其製備方法為此項技術中所熟知的。舉例而言，參見REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，A.Gennaro等人編，第22版，Pharmaceutical Press(2012)。
本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物可經由使得其生物可用之任何途徑投與。舉例而言，該化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物可經口、經皮下、經肌肉內、經靜脈內、經皮、經局部、經鼻內、經直腸、經頰及類似途徑投與。替代地，該化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物可經由輸注投與。靜脈內輸注(IV infusion)為較佳的投藥途徑。
如本文所使用，以下術語具有所指示之含義：「ATCC」係指美國菌種保存中心；「ATM」係指突變型共濟失調毛細管擴張；「ATP」係指三磷酸腺苷；「ATR」係指共濟失調相關激酶及Rad相關激酶；「BCA」係指雙金雞納酸(bicinchoninic acid)；「b.i.d.」係指一日兩次給藥；「Boc或t-Boc」係指第三丁氧基羰基；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CTG」係指Cell Titer Glow試劑；「DPBS」係指Dulbecco之磷酸鹽緩衝鹽水；「DIAD」係指偶氮二甲酸二異丙酯；「DMF」係指二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「DSRCT」係指促結締組織增生小圓細胞腫瘤；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ERK」係指細胞外信號調節激酶；「EtOH」係指乙醇；「EWS」係指尤文氏肉瘤；「FBS」係指胎牛血清；「G2M」係指細胞週期之G2及M階段；「HBSS」係指漢克(Hank)平衡鹽溶液；「HEPES」係指N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；「hnRNP」係指異質細胞核核糖核蛋白；「HRP」係指辣根過氧化酶；「LMS」係指平滑肌肉瘤；「MEM」係指最低必需培養基；「MeOH」係指甲醇(methanol/methyl alcohol)；「NBM」係指神經母細胞瘤；「OS」係指
骨肉瘤；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PBST」係指磷酸鹽緩衝鹽水Tween-20；「Ph」係指苯基；「pHH3」係指磷酸化組蛋白H3；「PI」係指碘化丙錠；「PKC」係指蛋白激酶C；「RMS」係指橫紋肌肉瘤；「RNAase」係指核糖核酸酶A；「RPMI」係指羅斯威爾帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)；「SDS」係指十二烷基硫酸鈉；「ST」係指軟組織；「TBST」係指tris緩衝鹽水Tween-20；「THF」係指四氫呋喃；「TR-FRET」係指時間分辨螢光能量轉移；「Tris」係指參(羥甲基)胺基甲烷；「TritonTM-X」係指4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇聚乙二醇第三辛基苯基醚；且「Tween-20」係指聚山梨醇酯20。
提供以下製備及實例以進一步詳細說明本發明且呈現化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物的典型合成。
在室溫下，向5-胺基吡嗪-2-甲腈(1.20g，10mmol)及吡啶(2mL)於CH2Cl2(200mL)及THF(25mL)中之溶液中逐滴添加硫光氣(1.86g，15mmol)於THF(4mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物3小時。濃縮混合物，且粗產物用乙酸乙酯稀釋，經過濾且濃縮得到標題化合物。
在室溫下，向3-羥丙基胺基甲酸第三丁酯(2.45g，14.0mmol)、1-(2-羥基-6-甲氧基苯基)乙酮(1.94g，11.7mmol)及三苯膦(3.66g，14.0mmol)於THF(50mL)中之經攪拌溶液中添加DIAD(2.82g，14.0mmol)。攪拌18小時後，在減壓下移除溶劑且粗產物經層析(己烷-乙酸乙酯：0-60%梯度)得到標題化合物(1.60g，42%)。
在室溫下，向3-(2-乙醯基-3-甲氧基苯氧基)丙基胺基甲酸第三丁酯(1.08g，3.17mmol)於無水THF(25mL)中之經攪拌溶液中緩慢添加六甲基二矽氮烷鋰於THF(7.6mL，7.6mmol)中之1M溶液。攪拌10分鐘後，添加含5-異硫氰基吡嗪-2-甲腈(0.510g，3.17mmol)之THF(4mL)且繼續攪拌30分鐘。濃縮反應混合物且再溶解於EtOH(50mL)及乙酸(5mL)中，隨後添加水合肼(2mL)。接著將所得反應混合物加熱至120℃持續2分鐘。接著將反應混合物冷卻至室溫，用水(100mL)稀釋，且用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。有機部分經無水Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。將粗產物再溶解於CH2Cl2(50mL)中，用三氟乙酸(10mL)處理且在室溫下攪拌15分鐘。移除溶劑，且使用製備型HPLC純化粗產物(1.20g)，得到標題化合物(0.046g，3.5%)。LC-ES/MS m/z 366.1[M+H]+。
將燒瓶裝有含1-(2-羥基-6-甲氧基苯基)乙酮(30g，180.5mmol)、碳酸鉀(49.9g，361mmol)、碘化鈉(2.68g，18.1mmol)及4-甲氧基苄基氯(27.0mL，198.6mmol)之THF，且將混合物加熱至回流隔夜。將混合物冷卻至室溫，用水稀釋且用乙酸乙酯萃取。經合併之有機萃取物用鹽水洗滌且經無水MgSO4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析法，使用乙酸乙酯/己烷之溶離劑純化粗產物，得到呈白色固體狀之標題產物(32.51g，57%)。
將500mL圓底燒瓶裝有95% NaH(7.28g，288mmol)，且添加無水DMSO(170mL)。向所得異質混合物中逐滴添加含1-[2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基]乙酮(41.2g，144mmol)之無水DMSO(60mL)。在室溫下攪拌混合物10分鐘，此時逐滴添加二硫化碳(8.69mL，144mmol)，緊接著逐滴添加碘代甲烷(18.0mL，288mmol)。在添加兩種試劑期間有熱量及氣體逸出，提示謹慎添加。在室溫下攪拌均勻溶液18小時，且接著將其緩慢倒入三體積水中。固體產物經過濾
且在高真空下乾燥，得到呈橙色固體狀之標題化合物。
將5-溴吡嗪-2-胺(3.73g，21.4mmol)溶解於THF(30mL)中且將混合物冷卻至-78℃。緩慢添加正丁基鋰於己烷(10.32mL，23.5mmol)中之溶液。在低溫下攪拌反應混合物15分鐘，且接著使其緩慢升至室溫且攪拌額外一小時。將混合物再冷卻至0℃且經由插管添加1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-3,3-雙(甲硫基)丙-2-烯-1-酮(8.39g，21.4mmol)於THF(50mL)中之溶液。溶液變得均勻，且在室溫下攪拌該溶液15分鐘，之後將其加熱至回流10小時。接著將該溶液冷卻至室溫且在減壓下移除溶劑。將固體殘餘物溶解於EtOH(150mL)中且添加冰乙酸(1.3mL，23.5mmol)。添加水合肼(5.25mL，107mmol)，且將溶液回流額外8小時。將混合物冷卻至室溫且在真空下濃縮。藉由矽膠層析法(CH2Cl2/MeOH)純化產物，得到呈棕色固體狀之標題化合物(5.76g，74%)。
將5-溴-N-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-1H-吡唑-3-
基)吡嗪-2-胺(3.1g，6.43mmol)溶解於MeOH(100mL)中。將HCl氣體鼓泡通過反應混合物20分鐘。攪拌混合物2小時且在減壓下移除溶劑。將殘餘物再溶解於3：1氯仿/異丙醇(100mL)中且與飽和NaHCO3溶液(100mL)合併。分離各層且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取水層。濃縮經合併之有機層且用MeOH濕磨，得到呈棕色固體狀之標題化合物(1.5g，64%)。
在室溫下，向3-羥丙基胺基甲酸第三丁酯(0.83mL，4.83mmol)、2-(3-(5-溴吡嗪-2-基胺基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯酚)(1.59g，4.38mmol)及聚苯乙烯三苯膦(5.91g，8.76mmol)於THF(50mL)中之攪拌溶液中添加DIAD(1.73mL，8.76mmol)。攪拌45分鐘後，過濾反應物且在減壓下移除溶劑。所得殘餘物經層析(MeOH/CH2Cl2)，得到呈黃色固體狀之標題化合物(1.27g，54%)。
3-(2-(3-(5-溴吡嗪-2-基胺基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基胺基甲酸第三丁酯(0.378g，0.730mmol)及氰化鋅(0.10g，0.870mmol)於DMF(10mL)中之溶液經氮氣流脫氣一小時，且接著經加熱至80℃。向反應物中添加Pd(Ph3P)4(0.080g，0.070mmol)，且加熱混合物隔夜。將反應物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。藉由矽膠層析(CH2Cl2/MeOH)純化殘餘物，得到標題化合物(0.251g，73%)。
將裝備有空氣攪拌棒及攪拌槳、溫度計、水冷凝器及氮氣鼓泡器之5公升法蘭頸燒瓶裝有氫化鈉(22.4g，560.1mmol)及無水THF(3L)。在1.5小時內向充分攪拌之混合物中逐份添加2-胺基-5-氰基吡嗪(67.0g，557.8mmol)，同時允許任何發泡。內部溫度始終保持在22℃。攪拌混合物35分鐘。接著在22℃下在一小時內添加1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基-苯甲氧基)-苯基)-3,3-雙甲基硫基-丙烯酮(146.0g，373.9
mmol)。在室溫下攪拌黃色懸浮液45分鐘且進行加熱直至反應物處於平緩回流。在65℃下19小時後，將反應混合物冷卻至15℃。接著將混合物分成兩半，且將各批在水(2L)中淬滅且用乙酸乙酯(2×1L)萃取。合併有機萃取物且用鹽水洗滌，經無水Na2SO4乾燥，過濾，且在40℃下在減壓下濃縮，得到呈黃色/橙色固體狀之標題化合物(196g，100%粗物質)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。LC-ES/MS m/z 463.2[M+H]+。
將裝備有空氣攪拌棒及攪拌槳、溫度計、水冷凝器及氮氣鼓泡器之10L法蘭頸燒瓶裝有(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-1-(甲硫基)-3-側氧基丙-1-烯基胺基)吡嗪-2-甲腈(196g，423.8mmol)及無水EtOH(3L)。在氮氣下向攪拌懸浮液添加水合肼(41.0mL，838.7mmol)及冰乙酸(66.0mL，1.15莫耳)。注意到少量發熱。使黃色懸浮液升溫至65℃。接著中斷加熱且使反應混合物冷卻至室溫。使混合物在氮氣氛圍下靜置隔夜。藉由過濾收集固體，用新製EtoH洗滌且在45℃下在真空中乾燥，得到呈亮黃色固體狀之標題化合物(140g，兩個步驟之產率87%)。產物不經進一步純化即用於下一步驟中。LC-ES/MS m/z 429.2[M+H]+。
將裝備有空氣攪拌棒及攪拌槳、溫度計、水冷凝器及通向苛性鹼溶液氣體洗滌器之出口的10L法蘭頸燒瓶裝有5-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈(140g，326.76mmol)及含4N HCl(2500mL，10.0莫耳)溶液之1,4-二噁烷。在60℃至65℃下充分攪拌混合物1.5小時且使其冷卻至50℃。共計4小時後，添加更多含4N HCl之1,4-二噁烷(1000mL)，且重新開始加熱至65℃。在此溫度下一小時後，停止加熱且使混合物在攪拌下冷卻至室溫隔夜。經由較大燒結漏斗過濾混合物。所收集固體用新製1,4-二噁烷洗滌且接著進行簡單乾燥。將塊狀濾餅返回至10L燒瓶且與水(2L)及乙酸乙酯(3.5L)一起劇烈攪拌。接著藉由添加濃縮氨(440mL)將混合物製成鹼。過濾溶液且接著將其轉移至5L分液漏斗。分離水層且再次用乙酸乙酯(0.5L)萃取。經合併之有機層用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。在45℃下在真空中乾燥固體，得到101.3g。將粗產物懸浮於溫熱的無水THF(2.2L)中且將其加至使用異己烷濕潤封裝之二氧化矽墊(1kg)上。用乙酸乙酯溶離產物。部分濃縮經合併之部分，且藉由過濾收集所得沈澱物且在40℃下在真空中乾燥隔夜，得到標題化合物(60.9gm 60%)。LC-ES/MS m/z 309.2[M+1]+。
將裝備有空氣攪拌棒及攪拌槳、溫度計、壓力均衡滴液漏斗及氮氣鼓泡器之5L法蘭頸圓底燒瓶裝有5-(5-(2-羥基-6-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)-吡嗪-2-甲腈(47.0g，152mmol)及無水THF(1.2L)。在氮氣下將攪拌懸浮液冷卻至0℃。將裝備有較大磁性攪拌棒、溫度計及氮氣鼓泡器之另一2L 3頸圓底燒瓶裝有三苯膦(44.0g；168mmol)及無水THF(600mL)。在氮氣下將攪拌溶液冷卻至0℃，且添加偶氮二甲酸二異丙酯(34.2g；169mmol)且形成乳白色溶液。3至4分鐘後，添加第三丁基-N-(3-羥丙基)-胺基甲酸酯(30.3g，173mmol)於無水THF(100mL)中之溶液，且攪拌混合物3至4分鐘。接著在0℃下在5分鐘內將此混合物添加至起始物質之攪拌懸浮液。反應混合物快速變為深色溶液且使其緩慢升溫至室溫。6.5小時後，使用含PPh3(8g)、DIAD(6.2g)及胺基甲酸酯(5.4g)之無水THF(150mL)如上製備更多試劑。將混合物添加至反應混合物，將其冷卻至-5℃，且讓其升溫至室溫隔夜。在真空中移除溶劑。將所得黏稠溶液加至二氧化矽墊上且用乙酸乙酯溶離產物。分別用MeOH濕磨經濃縮部分，且藉由過濾收集所得固體。再次用MeOH(400mL)濕磨經合併之固體，接著藉由過濾分離且在50℃下在真空中乾燥隔夜，得到標題化合物(31.3g，44%)。LC-ES/MS m/z 466.2[M+1]+。
將裝備有空氣攪拌棒及攪拌槳、溫度計及附接有鼓泡器之空氣冷凝器的5L法蘭頸圓底燒瓶裝有3-(2-(3-(5-氰基吡嗪-2-基胺基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基胺基甲酸第三丁酯(30.9g，66.3mmol)及乙酸乙酯(3L)。將機械攪拌之黃色懸浮液冷卻至恰好低於10℃。接著在冰浴仍保留在原位的情況下，經由進氣管劇烈鼓入來自壓縮氣瓶之氯化氫持續15分鐘。5小時後，混合物在外觀上顯著變稠。藉由過濾收集固體，用乙酸乙酯洗滌且隨後在60℃下在真空中乾燥隔夜，得到標題化合物(30.0g，100%)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 2.05(m,2H),2.96(m,2H),3.81(s,3H),4.12(t,J=5.8Hz,2H),6.08(br s,3H),6.777(d,J=8.2Hz,1H),6.782(d,J=8.2Hz,1H),6.88(br s,1H),7.34(t,J=8.2Hz,1H),8.09(br s,1H),8.55(br s,1H),8.71(s,1H),10.83(s,1H),12.43(br s,1H)。LC-ES/MS m/z 366.2[M+1]+。
將5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈氯二氫鹽(3.0g，6.84mmol)懸浮於CH2Cl2(200mL)中。添加1
N NaOH(200mL，200mmol)。在室溫下在氮氣下磁力攪拌混合物5小時。藉由過濾收集固體且用水澈底洗滌。在50℃下在真空中乾燥濾餅隔夜，得到(2.26g，90%)呈黃色固體狀之游離鹼。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.81(m,2H),2.73(t,J=6.2Hz,2H),3.82(s,3H),4.09(t,J=6.2Hz,2H),6.76(t,J=8.2Hz,2H),6.93(br s,1H),7.31(t,J=8.2Hz,1H),8.52(br s,1H),8.67(s,1H)。LC-MS/ES m/z 366.2[M+1]+。
將5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈(1.0g，2.74mmol)懸浮於MeOH(100mL)中。在攪拌下將甲磺酸於MeOH(2.74mL，2.74mmol)中之1M溶液逐滴添加至混合物中。固體幾乎完全溶解且經超聲處理並攪拌15分鐘，過濾，且濃縮至50mL。將溶液在-15℃下冷卻隔夜且藉由過濾收集所形成固體。固體在真空烘箱中乾燥隔夜，得到(0.938g，74%)黃色固體。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.97(m,2H),2.28(s,3H),2.95(m,2H),3.79(s,3H),4.09(t,J=5.9Hz,2H),6.753(d,J=8.4Hz,1H),6.766(d,J=8.4Hz,1H),6.85(br s,1H),7.33(t,J=8.4Hz,1H),7.67(br s,3H),8.49(br s,1H),8.64(s,1H),10.70(s,1H),12.31(s,1H)。LC-ES/MS m/z 366.2[M+1]+。
將1-(2-羥基-6-甲氧基苯基)乙酮(1300g，7.82mol)及DMF(10.4L)添加至22L燒瓶中且攪拌得到溶液。逐份添加碳酸鉀(2700g，19.54mol)且攪拌混合物至少30分鐘。使用加料漏斗，在2.5小時內將4-甲氧基氯苄(14700g，9.39mol)逐滴添加至混合物，同時保持溫度<30℃。使反應混合物升溫至35℃且將反應物保持在彼溫度下12小時。藉由HPLC監測反應轉化且認為反應轉化在35℃下13小時後完成。過濾漿液且用DMF(1L)洗滌所得固體。用乙酸乙酯及水萃取處理濾過物，接著濃縮，得到蠟質黃色固體。向該蠟質黃色固體中添加甲基第三丁基醚(2.6L)。攪動所得漿液。過濾現自由流動之漿液且用甲基第三丁基醚(1L)洗滌。真空乾燥白色固體，得到標題化合物之標題化合物(1539公克，69%)。mp為105℃至107℃。
在氮氣氛圍下，向第三丁醇鋰(602.4g，7.52mol)於無水DMSO(11.0L)中之混合物中添加1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)乙
酮(1000.0g，3.49mol)。攪拌所得混合物30分鐘且在1至1.5小時內緩慢添加CS2(259mL，4.296mol)，同時保持內部溫度低於30℃。在環境溫度下攪拌至少一小時後，緩慢添加碘甲烷(1000g，7.045mol)同時保持內部溫度低於30℃。在環境溫度下攪拌所得混合物30分鐘至一小時。藉由HPLC確認反應完成。冷卻所得反應混合物，接著用水及乙酸乙酯萃取處理。濃縮所得有機部分得到漿液，過濾該漿液且用乙酸乙酯(1L)洗滌，接著用甲基第三丁基醚(2×1L)洗滌。在40℃下在真空烘箱中乾燥經分離之固體，得到標題化合物(1057g，77%)。mp為93℃至94℃；ES/MS m/z 391.2[M+1]+。
向乾式惰性22L燒瓶中添加氫化鈉(159.2g，3.98mol)及THF(10.4L)。將混合物冷卻至5℃至15℃。在30分鐘內分四份添加5-異氰基吡嗪-2-胺(382.2g，3.18mol)以控制氫氣之釋放，從而使發泡在添加期間消退，且將溫度保持在10℃下。攪拌混合物15分鐘至90分鐘，同時使溫度增加至15℃。向反應混合物中逐份添加1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-3,3-雙(甲硫基)丙-2-烯-1-酮(1036g，2.65mol)以控制發泡。攪拌所得漿液15分鐘。在66℃下將混合物加熱至平緩回流。藉由HPLC監測反應轉化。將反應混合物在冷凍水(14.2L)中淬滅，接著用乙酸乙酯萃取處理。濃縮有機部分形成漿液，過濾該漿液
得到標題化合物(957g，78%)。mp為128℃至135℃；ES/MS m/z 463.2[M+1]+。
合併EtOH(11.28L)及乙酸(318mL，5.545mol)。在氮氣吹洗下將反應物排出至漂白洗滌器中。將(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-1-(甲硫基)-3-側氧基丙-1-烯基胺基)吡嗪-2-甲腈(940g，1.931mol)及EtOH/乙酸溶液添加至22L反應燒瓶中。向所得棕色漿液中添加肼單水合物(197g，3.935mol)，引起略微發熱。將所得黃色漿液緩慢加熱至65℃至70℃且藉由HPLC監測。反應持續時間少於一小時。在1小時至2小時內將黏稠漿液緩慢冷卻至低於30℃。過濾該漿液且用冷EtOH洗滌。在40℃下真空乾燥該物質，得到標題化合物(820g，99.1%)。mp為215℃至117℃；ES/MS m/z 429.2[M+1]+。
下文所有操作排出至苛性鹼洗滌器系統以控制HCl產氣。將5-(5-
(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苯甲氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈(1.24kg，2.89mol)及含4N HCl之二噁烷(26.06kg，99.28mol)裝入60L玻璃反應器中。將漿液緩慢加熱至60℃至70℃。藉由HPLC監測反應。9小時後，判定反應完成。將棕色漿液冷卻至20℃且保持隔夜。過濾酸性反應混合物且用乙酸乙酯(7L)洗滌濾餅。將濕濾餅真空乾燥至恆重，得到標題化合物(1010g，91.84%校正產率)。mp為225℃至228℃(游離鹼)；ES/MS m/z 309.2[M+1]+。
將5-(5-(2-羥基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈(618g，1.62mol)在THF(6.18L，10體積)中製成漿液，且用丙酮/冰浴冷凍至-5℃至0℃。在-5℃至5℃下，經由加料漏斗在30分鐘至40分鐘內添加三乙胺(330g，3.25mol)。在-5℃至5℃下攪拌所得漿液60分鐘至90分鐘。過濾不溶的三乙胺鹽酸鹽，且在適當反應容器中收集酚((5-(2-羥基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈)之溶液。用THF(1.24L)沖洗濾餅。將該酚之THF溶液保持在15℃至20℃下直至需要。在室溫下將三苯膦(1074g，4.05mol)溶解於THF(4.33L)中。用丙酮/冰浴將澄清無色溶液冷卻至-5℃至5℃。經由加料漏斗在40分鐘至60分鐘內逐滴添加偶氮二甲酸二異丙酯(795g，3.89mol)，保持溫度低於10℃。將所得黏稠白色漿液冷卻回至-5℃至0℃。將3-
羥丙基胺基甲酸第三丁酯(717g，4.05莫耳)溶解於最低量之THF(800mL)中。在-5℃至5℃下，經由加料漏斗在20分鐘至30分鐘內將3-羥丙基胺基甲酸第三丁酯/THF溶液添加至試劑漿液。在-5℃至0℃下，在冰浴中攪拌所製備試劑直至準備使用。
在15℃至20℃下，將所製備試劑漿液(20%)添加至受質溶液中。將剩餘試劑返回至冰浴。在環境溫度下攪拌受質溶液30分鐘且取樣用於HPLC。將大約20%之第二部分試劑添加至受質中，在環境下攪拌且如前所述取樣。繼續添加試劑，同時藉由HPLC監測反應完成度。濃縮完成之反應物且用溫熱的MeOH(4.33L，50℃至60℃)濕磨，接著在冰浴中冷卻。過濾所得黃色沈澱，用冷MeOH(2L)沖洗，且經乾燥至恆重，得到標題化合物之標題化合物(544g，72%)。mp為214℃至216℃；ES/MS m/z 466.2[M+1]+。
在30L反應器中將3-(2-(3-(5-氰基吡嗪-2-基胺基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基胺基甲酸第三丁酯(1430g，3.07mol)與丙酮(21.5L)製成漿液。經由加料漏斗以適中液流添加甲磺酸(1484g，15.36mol)。在約52℃下將漿液升溫至回流1至3小時，且藉由HPLC分析監測反應完成度。在4.5小時內，將完成之反應物自回流冷卻至15℃至20℃。過濾5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺
基)吡嗪-2-甲腈二甲磺酸鹽之黃色漿液，用丙酮(7L)沖洗且在真空烘箱中乾燥。將二甲磺酸鹽(1608g，2.88mol)與水(16L)製成漿液。將氫氧化鈉(含水50%，228g，2.85mol)緩慢倒入漿液中。將漿液加熱至60℃且攪拌1小時。接著在4小時內將其冷卻至16℃且過濾。用丙酮(4L)沖洗濕濾餅且在40℃下在真空烘箱中乾燥至恆重，得到標題化合物(833g，94%)。mp為222.6℃；ES/MS m/z 366.2[M+1]+。
使用以下程序純化粗物質5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物。將工業級5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(1221g，2.55mol)在1：1丙酮/水(14.7L)之溶劑混合物中製成漿液。藉由使混合物升溫至50℃至55℃來溶解固體。在50℃至55℃下，經由0.22μ桶式過濾器高純化過濾溶液。將溶液緩慢冷卻至約42℃至45℃之接種溫度且進行接種。在下一30至60分鐘內繼續緩慢冷卻以確保晶核生成。在3小時內將漿液自38℃冷卻至15℃。設置真空蒸餾且在110mm至90mm處及20℃至30℃下移除丙酮。在14小時內將混合物自30℃冷卻至15℃，保持在15℃下2小時，且接著過濾。用19：1水/丙酮(2L)沖洗再結晶物質，且接著用水(6L)沖洗且在40℃下在真空烘箱中乾燥至恆重，得到標題化合物(1024g，83.9%)。mp為222.6℃；ES/MS m/z 366.2[M+1]+。
可在裝備有CuKα源(λ=1.54056埃)、在40kV及40mA下操作、帶位置靈敏偵測器之Bruker D8高級粉末繞射儀上獲得X射線粉末繞射(XRPD)圖。每一樣本在°2θ±0.02中之4°與35°之間進行掃描，使用步長為2θ±0.02中之0.026°，且步進時間為0.3秒，發散狹縫為0.6mm且
檢測器狹縫為10.39mm。初級及二級索勒(Soller)狹縫分別在2°處；防散射狹縫為6.17mm；空氣散射接收器在適當位置。
差示掃描熱量測定(DSC)分析可在梅特勒-托萊多(Mettler-Toledo)DSC單元(型號DSC822e)上進行。在50mL/分鐘之氮氣吹洗下，在具有氣孔之閉合鋁盤中以10℃/分鐘將樣本自25℃加熱至350℃。熱解重量分析(TGA)可在梅特勒托萊多TGA單元(型號TGA/SDTA 851e)上進行。在50mL/分鐘之氮氣吹洗下，在具有氣孔之密封鋁盤中以10℃/分鐘將樣品自25℃加熱至350℃。DSC之熱量變曲線顯示在80℃至140℃之間存在較弱的寬廣吸熱，接著在222℃處有劇烈熔融吸熱，起始(225℃，峰值)。藉由TGA可見25℃至140℃之間的質量損失為4%。
以下分析之結果表明本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或該鹽之溶劑合物適用作CHK1抑制劑、CHK2抑制劑及作為抗癌劑之證據。如本文所使用，「IC50」係指藥劑可能產生50%之最大抑制反應的藥劑之濃度，且「EC50」係指藥劑可能產生50%之最大反應的藥劑之濃度。
可使用TR-FRET分析測定化合物對CHK1生物化學活性之作用。
在此分析中，使用經鋱標記之抗體檢測由激酶、經螢光素標記之受質及ATP之反應形成的磷酸化產物。抗體結合至磷酸化受質，導致經計算為受體信號(螢光素)與供體信號(鋱)之比的TR-FRET值增加。
激酶反應(25μL反應體積)在96孔半區域黑色聚苯乙烯培養盤(Costa，目錄號3694)中進行。藉由添加ATP起始反應。最終反應條件為50mM HEPES pH 7.5、0.005%(v/v)TritonTM X-100、2mM DTT、2mM MgCl2、104nM螢光素-PKC受質(Invitrogen，目錄號PV3506)、30μM ATP、1.5nM活性CHK1酶(Millipore，目錄號14-346)、4%(v/v)DMSO及實例2化合物之連續稀釋(1：3連續稀釋，以20μM開始，10點)。在添加ATP之後，在室溫下培育反應物75分鐘，且接著藉由添加25μL含有10mM EDTA及2.1nM Tb-pSer抗體(Invitrogen，目錄號PV3574)之TR-FRET稀釋緩衝液(Invitrogen，編號PV3574)終止反應。在室溫下培育經淬滅之反應物60分鐘，且接著使用來自PerkinElmer、具有波長為Ex340nm、Em495nm及Em520nm之濾波器的Envision盤讀取器量測TR-FRET。
對於IC50測定，使用各培養盤上進行之對照的TR-FRET比計算各濃度之抑制百分比。隨後使用ActivityBase 4.0使十點化合物濃度資料符合四參數對數方程式。根據所得曲線計算絕對IC50值。實例2化合物在此分析中經量測具有<0.001μM之IC50。此證實本發明化合物為CHK1之有效抑制劑。
可使用TR-FRET分析測定化合物對CHK2生物化學活性之作用。在此分析中，使用經鋱標記之抗體檢測由激酶、經螢光素標記之受質及ATP之反應形成的磷酸化產物。抗體結合至磷酸化受質，導致經計算為受體信號(螢光素)與供體信號(鋱)之比的TR-FRET值增加。
激酶反應(25μL反應體積)在96孔半區域黑色聚苯乙烯培養盤
(Costa，目錄號3694)中進行。藉由添加ATP起始反應。最終反應條件為50mM HEPES pH 7.5、0.005%(v/v)TritonTM X-100、2mM DTT、2mM MgCl2、104nM螢光素-PKC受質(Invitrogen，目錄號PV3506)、30μM ATP、2.5nM活性CHK2酶(Millipore，目錄號14-347)、4%(v/v)DMSO及實例2化合物之連續稀釋(1：3連續稀釋，以20μM開始，10點)。在添加ATP之後，在室溫下培育反應物75分鐘，且接著藉由添加25μL含有10mM EDTA及2.1nM Tb-pSer抗體(Invitrogen，目錄號PV3574)之TR-FRET稀釋緩衝液(Invitrogen，編號PV3574)終止反應。在室溫下培育經淬滅之反應物60分鐘，且接著使用來自PerkinElmer、具有波長為Ex340nm、Em495nm及Em520nm之濾波器的Envision盤讀取器量測TR-FRET。
對於IC50測定，使用各培養盤上進行之對照的TR-FRET比計算各濃度之抑制百分比。隨後使用ActivityBase 4.0使十點化合物濃度資料符合四參數對數方程式。根據所得曲線計算絕對IC50值。實例2化合物在此分析中經量測具有0.0047μM之IC50。此證實本發明化合物為CHK2之有效抑制劑。
CHK1之抑制劑將防止蛋白質之激酶活性磷酸化DNA損傷反應已被活化之細胞中的受質。CHK1之容易偵測的受質為CHK1自身上之自體磷酸化位點，絲胺酸296。可使用以下免疫印跡分析量測CHK1上絲胺酸296之磷酸化的量且間接量測CHK1蛋白激酶之活性位準。在24孔細胞培養盤中之每孔中，在補充有10%(v/v)熱失活FBS(GibcoTM)、1×MEM非必需胺基酸(GibcoTM)、1×丙酮酸鈉(GibcoTM)及接種於600μL(上述)MEM培養基中之1×105細胞的MEM w/Earle鹽(Invitrogen)w/L-麩醯胺酸(GibcoTM)中培育HeLa細胞(購自ATCC)。在37℃、5% CO2及95%至100%濕度下培育細胞24小時。將培育基中之4μM小紅莓
(Sigma)儲備液中的十六μL添加至各合適孔中，使最終濃度為100nM小紅莓。將培養盤返回至培育箱中額外24小時，之後添加CHK1抑制劑化合物。化合物以10mM溶解於100% DMSO中，接著在40%(v/v)DMSO中稀釋至2mM，且接著用培養基加4%(v/v)DMSO稀釋至100μM。在100μM至0.005μM範圍內製備化合物之後續連續稀釋液(1：3)。將六十六μL之化合物儲備液添加至培養盤中之合適孔中，使得最終DMSO濃度為0.4%(v/v)且最終化合物濃度在1μM與0.0005μM範圍內。將培養盤返回至培育箱額外兩小時，且接著移除以用於細胞裂解及處理。接著自培養盤移除培養基，用0.5ml冰冷的DPBS(GibcoTM)洗滌各孔一次，移除所有液體，且在程序剩餘時間內將培養盤置放在冰上。向各孔中添加75μL冰冷的裂解緩衝液，該裂解緩衝液由含有磷酸酯抑制劑(Sigma)及蛋白酶抑制劑(Roche Diagnostics)之細胞萃取緩衝液(Invitrogen)組成。在10分鐘之後，刮擦各孔且將裂解物轉移至冰上之1.5mL聚丙烯微量離心管中。在將每一裂解物懸浮於水/冰浴中時，藉由盤杯式超音波發生器(Misonix)超聲處理每一裂解物45秒。將五十μL各樣本轉移至0.5mL含有25μL 4×勒姆利(Laemmli)樣本緩衝液(240mM Tris-HCl、pH 6.8、40%甘油、0.05%溴酚藍、8% w/v SDS及20%(v/v)β-縮硫醇乙醇)之聚丙烯微量離心管中，在95℃下加熱5分鐘且在-80℃下凍結儲存。剩餘裂解物用於測定蛋白質濃度(BCATM蛋白質分析套組，Thermo Scientific)。將樣本緩衝液中之五μg各細胞裂解物塗覆至E-Page 96孔凝膠(Invitrogen)且根據製造商的說明進行電泳。根據此項技術中熟知之程序將蛋白質自凝膠電轉移至Immobilon-P薄膜(Millipore)[Towbin等人，1979]。薄膜用10mM Tris/HCl pH 8.0、150mM NaCl及0.05%(v/v)Tween 20(TBST)簡單沖洗，且在25℃下浸沒於經TBST/5%(v/v)重建之Carnation®即溶牛乳中一小時。薄膜用TBST洗滌四次(五分鐘)，接著在4℃下浸沒於具有兔
抗磷酸CHK1(絲胺酸296)(細胞信號傳遞)之適當稀釋液的TBST/5%(w/v)BSA中24小時。薄膜在25℃下用TBST洗滌四次(五分鐘)，接著在25℃下浸沒於含有共軛至HRP(Amersham)之驢抗兔IgG之適當稀釋液的TBST/5%牛乳中兩小時，以檢測自體磷酸化之CHK1蛋白質。在25℃下用TBST再次洗滌薄膜四次(五分鐘)。使用化學發光影像儀(Fujifilm)，藉由如製造商建議之Super Signal Western Femto HRP檢測試劑(Pierce)檢測固定在薄膜上之抗原-抗體-報導子共軛物。使用「Total Lab」軟體(Nonlinear Dynamics)計算磷酸化CHK1(絲胺酸296)譜帶強度。使用以下公式計算CHK1自體磷酸化誘發的小紅莓之抑制百分比：%抑制=(樣本磷酸化CHK1譜帶強度-無小紅莓陰性對照磷酸化CHK1譜帶強度)/(小紅莓陽性對照磷酸化CHK1譜帶強度-無小紅莓陰性對照磷酸化CHK1譜帶強度)×100。實例2化合物在此分析中經量測具有<0.0005μM之EC50。此證實本發明化合物為CHK1之有效抑制劑。
CHK1之抑制劑將禁用經拓撲異構酶II抑制劑、小紅莓治療之p53-負腫瘤細胞中之G2M DNA損傷檢查點。G2M檢查點消除之量測為絲胺酸10上之組蛋白H3在細胞跨越G2M檢查點且進入有絲分裂後發生之磷酸化。可使用以下高含量成像分析量測細胞中組蛋白H3之磷酸化。將HeLa細胞(購自ATCC)在補充有10%(v/v)FBS之MEM培養基(GibcoTM)中培養且以每孔2000個細胞接種於經聚D-離胺酸塗佈之透明底黑色培養盤(BD Biocoat，目錄號3504640)中，每孔100μL體積。接著將培養盤在細胞培養恆溫箱中培育18至24小時(37℃、5% CO2及95%相對濕度)。在初步培育之後，將20μL含有625nM小紅莓之GibcoTM MEM培養基10% FBS添加至培養盤中之合適孔中，使得最終濃度為125nM。將培養盤返回至恆溫箱24小時，此時間足以使
G2M檢查點處之細胞停滯。次日，用實例2化合物處理該等細胞。實例2化合物以10mM溶解於100% DMSO中，且接著在4%(v/v)DMSO-MEM中以50μM開始稀釋至10X儲備液。在50μM至0.39μM範圍內製備化合物(1：2)之後續連續稀釋液。將十三μL化合物儲備液添加至培養盤中之合適孔中，使得最終DMSO濃度為0.4%且最終化合物濃度在5μM與0.039μM範圍內。將培養盤返回至恆溫箱額外七小時，且接著移除以用於固定。自各孔謹慎移除液體且添加100μL PREFERTM固定劑(Anatech LTD.目錄號414)。將培養盤在室溫下保持20分鐘，移除固定劑，且接著藉由添加100μL/孔的含0.1%(v/v)Triton® X 100(Pierce目錄號28314)之DPBS(GibcoTM目錄號14040)對細胞進行滲透化10分鐘。移除溶液且用100μL DPBS/孔洗滌培養盤兩次，之後添加100μL含有50μg/mL RNAase(Sigma目錄號R-6513)之DPBS，在室溫下保持一小時。移除RNAase溶液，且藉由向各孔添加50μL含有1：500稀釋之兔抗-pHH3(絲胺酸10)(UBI目錄號06-570)加1%(w/v)BSA(GibcoTM目錄號15260)之RNAase溶液給細胞染色，以呈現在絲胺酸10(pHH3)上磷酸化之組蛋白H3。密封培養盤且在4℃下保持隔夜。初級抗體藉由用100μL DPBS/孔洗滌各培養盤兩次而移除且由50μL在DPBS加1%(w/v)BSA中結合至Alexa染料488(Invitrogen目錄號A11008)的1：750稀釋之山羊抗兔IgG替換。室培養盤在室溫下保持一小時且用鋁箔覆蓋以避光。培養盤再次用100μL/孔DPBS洗滌兩次且由100μL 15nM PI(自原始溶液用PBS進行1：100稀釋，Molecular Probes目錄號P3566)替換。用黑色密封膠密封培養盤以使培養盤避光。培育培養盤30分鐘以給細胞核染色。藉由ACUMEN EXPLORERTM雷射掃描螢光微量盤細胞儀使用488nm激勵(TTP LABTECH LTC)掃描培養盤以量測包括2N及4N之pHH3及DNA含量。藉由Alexa 488之519nm平均強度鑑定pHH3陽性細胞。PI/DNA之655-705nm總強度用以鑑定細胞週期中之
個別細胞及亞群(2N細胞、4N細胞)。藉由歸一化成總細胞之百分比測定各群體之最終讀數，得到最終分析輸出%pHH3、%2N及%4N。接著藉由用最大濃度100nM之抑制劑對照化合物處理細胞來測定100%活性，以測定各化合物之最終活性百分比。0%活性係基於無化合物處理。使用ACTIVITY BASETM、excel擬合、使用四參數對數擬合之曲線擬合、方程式205來測定相對EC50，以測定相對於100%之對照最大值的%pHH3。實例2化合物在此分析中經量測具有0.0105μM之EC50。此證實本發明化合物將禁用G2M DNA損傷檢查點。
CHK1之抑制劑可經由消除S階段內檢查點來強化吉西他濱(或其他細胞毒劑)之抗增生活性，從而產生持久且增強的DNA損傷。在DNA損傷之後，可藉由測定細胞複製其DNA之能力來分析持續腫瘤細胞增生之能力。此分析法評估細胞在其具有修復DNA損傷之機會後複製其DNA之能力。在此分析中，細胞經吉西他濱處理，接著經實例2化合物處理。在恢復期之後，分析細胞在S階段期間將放射性胸苷併入DNA中之能力。ECtfs參數為在無CHK1抑制的情況下在此分析中所量測的使吉西他濱之GI90濃度減半所必需之CHK1抑制劑之濃度量測值。HT-29細胞(自ATCC獲得)在RPMI 1640加(GibcoTM)10%(v/v)熱失活FBS中生長。此等細胞以1.3×103/孔接種在Corning Costar 96孔組織培養盤上。在接種細胞之後，組織培養盤在室溫下保持45分鐘，之後返回至37℃。培育培養盤24小時，之後添加吉西他濱。添加吉西他濱之前，自所有孔移除介質且用150μL/孔之新製RPMI介質替換。在PBS中製備10mM之吉西他濱儲備液。在RPMI介質中製備4×濃度之吉西他濱稀釋液且以50μL/孔添加至孔中。使用吉西他濱之最高最終濃度為80μM且繼續以四重步驟稀釋。兩小時之後，自孔移除含吉西他濱之介質且用150μL/孔之新製RPMI介質替換。實例2化合物(10mM
於DMSO中)首先在DMSO中稀釋至2000×最終濃度，且接著在RPMI介質中稀釋至1：500以產生用於添加至孔之4×儲備液。添加體積為50μL。以兩重步驟繼續進行化合物稀釋，以5000nM開始。在添加實例2化合物二十四小時後，藉由抽吸移除含有抑制劑之介質且用200μL/孔之新製RPMI介質替換。在移除實例2化合物七十二小時後，開始氚化胸苷標記。3H-胸苷(NET 027X001，PerkinElmer，比活性20Ci/mmol)在完全RPMI中以1：20稀釋，得到0.05mCi/mL之濃度。將二十μL之此溶液添加至各孔中，得到1μ Ci/孔之3H-胸苷。標記細胞二十二小時。自孔澈底移除含有3H-胸苷之介質。接著將培養盤在-20℃下凍結若干小時。為收集含有經併入3H-胸苷之DNA，解凍培養盤幾分鐘，且接著將120μL/孔之0.1N NaOH添加至各孔中。接著在旋轉器上緩慢混合的情況下，將各培養盤在37℃下培育10分鐘。DNA藉由Filtermate 196收集器(PerkinElmer)收集且聚集在96孔Unifilter GF/C培養盤(PerkinElmer編號6005174)上。用水(5×)洗滌其上細胞已經標記之組織培養盤之孔。用額外4.5mL/孔(3×1.0mL及最後1.5mL洗滌)洗滌Unifilter培養盤薄膜。用Backseal接著片(PerkinElmer)密封該Unifi，且添加50μL/孔之MicroScint-20(PerkinElmer)。接著用Topseal透明接著片(PerkinElmer)密封各培養盤。在Topcount閃爍計數器(PerkinElmer)上以1分鐘/孔計數培養盤。將3H-胸苷之每分鐘計數(cpm)輸出至Prism(GraphPad)以用於分析及繪圖。針對各濃度之實例2化合物測定吉西他濱劑量反應。為進行此操作，歸一化cpm，將在無吉西他濱情況下之100%併入設定為實例2化合物之平均cpm，且將無併入(100%抑制)設定為cpm=0(每分鐘無計數)。為在Prism中繪製資料，將吉西他濱濃度轉換成對數值，且藉由非線性消退擬合劑量-反應曲線。既不限制頂部擬合亦不限制底部擬合。ECtfs值為0.3nM。此外，3nM之實例2化合物將HT29結腸癌瘤細胞中之吉西他濱的EC50
減小7倍，自37nM減小至5nM。實例2化合物之作用亦增加增生抑制百分比，自吉西他濱之52增加至組合之73。單獨使用時，3nM之實例2化合物對HT29細胞之增生幾乎無作用。
在生長培養基(MEM及Earle鹽(Invitrogen)及補充有10%(v/v)熱失活FBS(GibcoTM)、1×MEM非必需胺基酸(GibcoTM)、1×丙酮酸鈉(GibcoTM)之L-麩醯胺酸(GibcoTM))中培養Calu-6細胞(ATCC)且進行擴增。收集細胞且用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次，且將生長培養基(無漿液)中之1×106個細胞與相同體積之BD MatrigelTM基質(BD Bioscience，Franklin，NJ)混合，接著經皮下注射入經預輻射(4.5Gy)裸鼠(無胸腺裸鼠，來自Harlan,Indianapolis,IN)之側腹。在植入後第15天(腫瘤大小=150-200mm3)，將每天在生理鹽水(Hospira，Lake Forest,IL)中新調配之吉西他濱以150mg/kg劑量經腹膜內途徑投與給動物。六小時後，經靜脈內途徑向動物投與以莫耳比甲磺酸/20%卡布迪索(Captisol)(CYDEX,Overland Park,KS)調配之實例2化合物，劑量自15mg/kg向下變化。在CHK1抑制劑給藥2小時後處死動物，收集腫瘤且立即在含有磷酸酶抑制劑(Sigma)及蛋白酶抑制劑(Roche Diagnostics)之冰冷細胞萃取緩衝液(Invitrogen目錄號FNN0011)中進行處理。使用設定為較高15秒之機動組織均質器(Powergen 700)在冰的15mL聚丙烯錐形管中之1.5-2.0mL裂解緩衝液中處理腫瘤。使樣本保持在冰上，經由具有25規格針頭之1mL注射器抽取裂解物四次。然後，將0.35mL腫瘤裂解物轉移至含有0.15mL之4×勒姆利樣本緩衝液(240mM Tris-HCl、pH 6.8、40%甘油、0.05%溴酚藍、8% w/v SDS及20%(v/v)β-縮硫醇乙醇)之1.5mL聚丙烯微量離心管中。接著混合樣本且在95℃下加熱5分鐘，且在Misonix 3000盤杯式超音波發生器上用大功率超聲處理一分鐘。接著將樣本儲存於冰上，或儲存在-80℃
下以供藉由西方墨點法進行靶向抑制評定。剩餘裂解物用於測定蛋白質濃度(BCATM蛋白質分析套組，Thermo Scientific)。將樣本緩衝液中之五μg各腫瘤裂解物塗覆至E-Page 96孔凝膠(Invitrogen)且根據製造商的說明進行電泳。根據此項技術中熟知之程序將蛋白質轉移至Nitrocellulose Protran BA83薄膜(Whatman)[Towbin等人，1979]。接著處理薄膜以量測在絲胺酸296上自體磷酸化之CHK1蛋白質。薄膜用水、接著用10mM Tris/HCl pH 8.0、150mM NaCl及0.05%(v/v)Tween 20(TBST)簡單沖洗，且在25℃下浸沒於經TBST/5%(w/v)重建之Carnation®即溶牛乳中一小時。接著用TBST洗滌薄膜四次(5分鐘)。薄膜在4℃下浸沒於兔抗磷酸化CHK1(絲胺酸296)(細胞信號傳遞)之適當稀釋液中之TBST/5%(w/v)BSA中16小時。然後，在25℃下用TBST洗滌薄膜四次(5分鐘)，且接著在25℃下浸沒於含有共軛至HRP(Amersham)之驢抗兔IgG之適當稀釋液的TBST/5%牛乳中兩小時以檢測磷酸化CHK1(絲胺酸296)。在25℃下用TBST再洗滌薄膜4次(5分鐘)，藉由如製造商建議之Super Signal Western Femto HRP-檢測試劑(Pierce)檢測固定在薄膜上之抗原-抗體-報導子共軛物。
使用FUJI LAS-4000成像系統偵測及捕捉信號。使用「Total Lab」軟體(Nonlinear Dynamics)計算磷酸化CHK1(絲胺酸296)譜帶強度。使用以下公式計算吉西他濱誘發之CHK1自體磷酸化的抑制百分比：%抑制=(樣本磷酸化CHK1譜帶強度-平均吉西他濱(最大)陽性對照磷酸化CHK1譜帶強度)/(平均陰性對照(最小)磷酸化CHK1譜帶強度-平均吉西他濱(最大)陽性對照磷酸化CHK1譜帶強度)×100。
實例2化合物在此分析中經量測具有0.03mg/kg之CHK1自體磷酸化之靶向調節有效劑量50(TMED50)。
可使用Calu-6肺及HT-29結腸腫瘤異種移植功效模型在活體內測
定CHK1抑制劑影響腫瘤殺傷的能力。在生長培養基(具有補充有10%(v/v)熱失活FBS(GibcoTM)、1×MEM非必需胺基酸(GibcoTM)、1×丙酮酸鈉(GibcoTM)之L-麩醯胺酸(GibcoTM)的MEM w/Earle鹽(Invitrogen))中培養Calu-6肺癌細胞(ATCC)，且在生長培養基(補充有10% FBS(GibcoTM)之McCoy 5A介質(GibcoTM))中培養HT-29結腸癌細胞(ATCC)。收集細胞且用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次，且將生長培養基(無血清)中之5×106細胞(HT-29)或1×106細胞(Calu-6)與相同體積之BD MatrigelTM基質(BD Bioscience，Franklin，NJ)混合，接著經皮下注射入裸鼠(CD-1nu/nu，來自Charles River Labs，Wilmington，MA)之側腹。在植入後約第16天(150-200mm3)，每天在生理鹽水中新調配吉西他濱且經腹膜內途徑以60mg/kg劑量投與給動物。二十四小時後，經靜脈內途徑向動物投與以莫耳比甲磺酸/20%卡布迪索(CYDEX，Overland Park，KS)調配之實例2化合物。停藥一天之後，重複給藥3個多週期(Q3Dx4與CHK1抑制劑偏移+24小時)。每一給藥組由九個動物組成。藉由在治療療程期間一週進行兩次腫瘤體積量測而判定腫瘤反應。腫瘤生長抑制(TGI)經計算為經化合物治療組之平均腫瘤大小比經媒劑治療對照組之平均腫瘤大小的減小百分比。單獨給藥及與吉西他濱組合給藥之實例2化合物在HT-29及Calu-6腫瘤異種移植模型兩者中顯示優良的劑量依賴性抗腫瘤活性，腫瘤生長抑制比單獨給藥吉西他濱時增加高達六倍。
可使用Calu-6肺異種移植功效模型在活體內測定CHK1抑制劑影響腫瘤殺傷之能力。如上文所描述培養Calu-6肺癌細胞(ATCC)。收集細胞且用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次，且將生長培養基(無血清)中之1×106細胞(Calu-6)與相同體積之BD MatrigelTM基質(BD Bioscience，Franklin，NJ)混合，接著經皮下注射入裸鼠(CD-1nu/nu，來自
Charles River Labs，Wilmington，MA)之側腹。在植入後約第16天(150-200mm3)，實例2化合物以15mg/kg給藥(經皮下(SC)，每兩日(BID×5停藥2天)×3個週期)。藉由在治療療程期間一週進行兩次腫瘤體積量測而判定腫瘤反應。按照5天BID方案(15mg/kg)給藥之實例2化合物提供比先前所描述之吉西他濱加實例2化合物組合方案更優良的生長抑制。完全腫瘤消退快速且持久。
CHK1抑制劑之效能的一個量測值為其抑制培養中癌細胞因不可控複製病因活化而增生之能力。(Conti等人，Cell Cycle 6：2760-2767，2007)測定CHK1抑制劑在自廣泛範圍腫瘤類型衍生之細胞株中之抗增生活性指示哪些腫瘤類型可對用CHK1抑制劑之化學治療具有臨床上反應。下文所描述細胞增生分析在德國之Oncotest，GmbH處進行。三十個實體腫瘤細胞株係衍生自13種不同腫瘤組織型，每一種由1至6個不同細胞株代表(Oncotest，GmbH)。其自膀胱癌、腦癌、結腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌及子宮體癌建立，以及自黑素瘤及胸膜間皮瘤建立。所有細胞株在Oncotest處自患者衍生之腫瘤異種移植建立(Roth等人，1999)。Fiebig等人描述了供體異種移植之來源(Fieberg等人，1992及1999)。細胞株按常規每週傳代一次或兩次且保持在培養基中直至20次傳代。所有細胞在37℃下、在5% CO2之潮濕氛圍中、在補充有10%(v/v)胎牛血清(PAA，Cölbe，德國)及0.1mg/mL慶大黴素(gentamicin)(PAA，Cölbe，德國)之RPMI 1640介質(PAA，Cölbe，德國)中生長。使用經修改PI分析來分析化合物對此等細胞株之細胞毒性活性。簡言之，藉由胰蛋白酶消化自指數期培養基收集黏附細胞，計數且以取決於細胞株之細胞密度(4.000至20.000細胞/孔)接種於96孔扁平底微量滴定盤中。在允許該等細胞黏附並恢復指數生長之24小時恢復期之後，添加10μL培養基(6
個對照孔/培養盤)或含有實例2化合物之培養基。在DMSO中以1mM之濃度製備實例2化合物之儲備溶液。如下用完全RPMI 1640細胞培養基進行後續稀釋：首先1：22稀釋DMSO儲備溶液(含有4.5%(v/v)DMSO)。使用此溶液，製備於細胞培養基中之連續稀釋液(半對數或2倍)。對於最後稀釋步驟(1：15)，將10μL/孔之各別最終化合物溶液直接添加至140μL/孔培養基中。最終DMSO濃度
0.3%(v/v)。以十點濃度曲線重複施加實例2化合物三次且繼續處理4天。在處理4天之後，移除培養基且由200μL含水的7μg/mL PI溶液代替。為量測活細胞之數量，藉由凍結細胞滲透化，從而使得仍附著至孔之所有細胞在經化合物處理之後死亡。最後，使用Cytofluor 4000微量盤讀取器(激勵λ=530nm，發射λ=620nm)量測PI螢光以測定總活細胞數。生長抑制經表達為測試/對照×100(% T/C)值。基於T/C值，使用非線性消退(對數[抑制劑濃度]比反應(% T/C))測定相對IC50值。實例2化合物抑制此等腫瘤細胞株中之絕大多數的生長，EC50為20nM。
可自經5nM及50nM最終濃度之5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)處理24小時之胚胎及肺泡橫紋肌肉瘤(分別為RD及SJCRH30)、骨肉瘤(Saos-2)及尤文氏肉瘤(RD-ES)細胞株獲得細胞裂解物。
可使用上述細胞裂解物進行西方墨點法。對該等西方墨點之分析指示當該等細胞株經5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)處理時CHK1蛋白質含量不變且磷酸化CHK1(S345)含量隨治療增加。在CHK1抑制的情況下可觀測到更高位準之DNA損傷。因此，γ H2AX之含量(DNA損傷之信號)在經5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)
吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)治療後提高。已知在CHK1抑制後提高之磷酸化ERK 1/2(T202/Y204)含量在四分之三細胞株中亦增加，無反應RD-ES細胞株為四個活體外中最不敏感的。磷酸化-hnRNP-C含量(在RD-ES細胞株中亦不受影響之CHK1抑制的標記物)之增加亦支援此等資料。在經5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)治療之後，磷酸化AKT之含量並不呈現變化。
以下方案可用以量測回應於有效藥劑成份之腫瘤體積之減小。在培養基中擴增人類NBM癌細胞SH-SY5Y(ATCC，編號CRL-2226)，收集且將200μL HBSS與Matrigel®之1：1溶液中之5×106細胞經皮下注射入雌性CD-1nu/nu小鼠(20g至24g，Charles River Laboratories)之右後側腹。在培養基中擴增人類NBM癌細胞KELLY(Sigma，編號92110411)，收集且將200μLHBSS與Matrigel®之1：1溶液中之5×106細胞經皮下注射入雌性CB-17 SCID小鼠(20g至24g，Charles River Laboratories)之右後側腹。在培養基中擴增人類NBM癌細胞IMR-32(ATCC，編號CCL-127)，收集且將200μL HBSS與Matrigel®之1：1溶液中之5×106細胞經皮下注射入雌性CB-17 SCID小鼠(20g至24g，Charles River Laboratories)之右後側腹。
在培養基中擴增人類RMS癌細胞SJCRH-30(St.Jude兒童研究醫院)，收集且將200μL之HBSS中之5×106細胞經皮下注射入雌性無胸腺裸鼠(20g至22g，Harlan Laboratories)之右後側腹。在培養基中擴增人類橫紋肌肉瘤癌細胞RD(ATCC，編號CCL-136)，收集且將200μL之HBSS中之5×106細胞經皮下注射入雌性無胸腺裸鼠(20g至22g，Harlan Laboratories)之右後側腹。
對於所有「CTG」模型(涵蓋人類RMS、DSRCT、EWS、OS及
LMS患者衍生之異種移植模型)，將自供體動物收集之腫瘤片段單側植入雌性NCr裸露自發突變小鼠(5週至8週大，Taconic)之側腹區域，分別自特定傳代批次植入。
對於所有「ST」模型(涵蓋RMS及LMS)，患者衍生之異種移植自活人類腫瘤組織建立且在動物中連續傳代有限次數以維持腫瘤異質性。在皮下模型中，將自宿主動物收集之腫瘤片段單側注入或植入無胸腺裸鼠(Crl：NU(NCr)-Foxn1nu)或CB-17 SCID小鼠(CRL-CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)之側腹，分別自特定傳代批次植入。對於所有研究，在植入後第七天開始每週兩次量測腫瘤生長及體重。當腫瘤大小達到150-300mm3時，使動物隨機化且將其分成4至7個動物之組。在適當媒劑(例如，媒劑可為含20% Captisol®之無菌水)中製備測試化合物且經皮下連續三天給藥接著四天停止給藥並重複最少四週。藉由在治療療程期間進行每週兩次腫瘤體積量測而判定腫瘤反應。
發現5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)具有如下表2中所提供之%T/C或%消退值。此等結果表明5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)在一系列人類異種移植模型中展現顯著抗腫瘤活性，該等人類異種移植模型包括骨肉瘤(CTG-0242)；尤文氏肉瘤(CTG-0994)；DSRCT(CTG-0926)；RMS(CTG-1213、CTG-1116、SJCRH-30及ST162)；及NBM(SH-SY5Y、KELLY、IMR-32)；LMS(CTG-1006、ST1547)。
1T/C係指治療組比對照組之值
組合療法為可有效阻斷腫瘤生長且克服通常回應於單一藥劑而形成之獲得性腫瘤抗性之癌症治療的方法。在SJCRH-30 RMS模型活體內，5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)可與肉瘤治療標準、小紅莓組合測試。(參見表3。)此組合功效研究可在如上文所描述之無胸腺裸鼠中進行。用於此研究之媒劑為含20% Captisol®之無菌水且經皮下連續三天給藥接著四天停止給藥並重複最少四週。小紅莓(含5%右旋糖之無菌水)每週經靜脈內投與一次，同時以含20% Captisol®之無菌水投與5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)且經皮下連續三天給藥接著四天停止給藥。治療週期持續4週。
5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)作為單一藥劑投與引起初步完全反應直至第38天，此時出現腫瘤再生。用5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)加小紅莓
治療腫瘤引起完全反應且無腫瘤再生。(參見表3；-87%消退，p<0.001。)5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)及小紅莓之組合呈現為耐受性的，因為不存在顯著體重損耗。此等結果表明5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)及小紅莓之組合相比於單獨投與任一藥劑可更有效抑制腫瘤生長。
1T/C係指治療組比對照組之值
25-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)
15-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-
2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)
如表4中所說明，兒童肉瘤細胞株對用5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)之活體內治療高度敏感。5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)作為單一藥劑在接近41%(7/17)之受測試兒童肉瘤活體內小鼠模型中有效，具有介於穩定疾病至完全反應之結果。活體內評估之大部分成人肉瘤模型(10/12；83%)對用5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)之單一藥劑治療敏感。5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物(實例5)與小紅莓、異環磷醯胺或伊立替康之組合在SJCRH30異種移植中呈現避開獲取性抗性。
Claims (13)
- 一種5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物之用途，其係用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該癌症係選自由神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、促結締組織增生小圓細胞腫瘤及平滑肌肉瘤組成之群。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為神經母細胞瘤。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為橫紋肌肉瘤。
- 如請求項3之用途，其中該橫紋肌肉瘤為肺泡橫紋肌肉瘤或胚胎橫紋肌肉瘤。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為骨肉瘤。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為尤文氏肉瘤。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為促結締組織增生小圓細胞腫瘤。
- 如請求項1之用途，其中該癌症為平滑肌肉瘤。
- 如請求項1至8中任一項之用途，其中5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物係呈結晶形式，該結晶形式之特徵在於X射線粉末繞射圖在2θ±0.02°=12.64°、21.25°及26.15°處具有峰。
- 如請求項1至8中任一項之用途，其中5-(5-(2-(3-胺基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基胺基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸單水合物係用於與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑中之一或多者一起投與。
- 如請求項1至8中任一項之用途，其中該藥劑係用於與電離輻射 併用。
- 如請求項1至8中任一項之用途，其中該藥劑係用於與一或多種化學治療劑併用。
- 如請求項1至8中任一項之用途，其中該藥劑係用於與一或多種選自由5-氟尿嘧啶、羥基脲(hydroxyurea)、吉西他濱(gemcitabine)、甲胺喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、小紅莓、依託泊苷(etoposide)、順鉑(cisplatin)、長春新鹼(vincristine)、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、環磷醯胺及紫杉醇(taxol)組成之群的化學治療劑併用。
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