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KR20190071802A - 종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 - Google Patents

종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 Download PDF

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KR20190071802A
KR20190071802A KR1020197015545A KR20197015545A KR20190071802A KR 20190071802 A KR20190071802 A KR 20190071802A KR 1020197015545 A KR1020197015545 A KR 1020197015545A KR 20197015545 A KR20197015545 A KR 20197015545A KR 20190071802 A KR20190071802 A KR 20190071802A
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KR
South Korea
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protein
population
tils
cells
aapc
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020197015545A
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English (en)
Inventor
아난드 비이라파트란
아이슈와라 고쿨다스
브라이언 라비노비치
미카엘 티. 롯체
Original Assignee
이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. filed Critical 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority to KR1020247002478A priority Critical patent/KR20240013295A/ko
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Abstract

일부 실시양태에서, 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포, 예컨대 MOLM-14 또는 EM-3 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL 및/또는 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고 골수성 세포를 CD86 및 4-1BBL 및/또는 OX40L 단백질을 발현하도록 형질도입하는 것인, 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 관한 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, aAPC로 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법, 및 aAPC로의 확장 후에 TIL을 사용하여 암을 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

종양 침윤 림프구 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포
관련 출원에 대한 상호-참조
이 국제 출원은 2017년 4월 5일에 출원된 미국 가출원 제62/481,831호, 2017년 3월 22일에 출원된 미국 가출원 제62/475,053호, 2016년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/438,600호, 및 2016년 10월 31일에 출원된 미국 가출원 제62/415,274호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이들의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
종양 침윤 림프구의 확장을 위한 조작된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)가 개시된다.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 입양 자가 전달을 사용한 부피가 큰, 난치성 암의 치료는 빈약한 예측을 갖는 환자에 대한 요법에 대한 강력한 접근법을 대표한다. 문헌 [Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 다수의 TIL은 성공적인 면역요법에 요구되며, 왕성하고 신뢰성 있는 프로세스가 상업화에 필요하다. 이는 세포 확장과 관련된 기술적, 보급적, 및 조절적 쟁점 때문에 달성하는 데 있어 도전과제였다. IL-2-기재 TIL 확장, 이어서 "급속 확장 프로세스" (REP)는 그의 속도 및 효율 때문에 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되었다. 문헌 [Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54]; [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57]; [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39]; [Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41]; [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 그러나, REP는 14-일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 초래할 수 있지만, 이는 공급자 세포로서 종종 다수의 공여자로부터의 큰 과량 (예를 들어, 200배)의 방사선조사된 동종이형 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT-3) 및 고용량의 IL-2를 요구한다. 문헌 [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 그들의 높은 성능에도 불구하고, PBMC는 요구되는 다수의 동종이형 PBMC, 다수의 건강한 공여자로부터의 백혈구성분채집술에 의해 PBMC를 얻을 필요성, 냉동보존 후의 PBMC 생존성의 결과적인 공여자간 가변성 및 가변적인 TIL 확장 결과, 하류 환자 감염을 유발하는 비검출된 바이러스 병원체의 위험, 및 무균성 및 품질을 확인하고 (바이러스 오염물 시험을 포함함), 확장 특성을 시험하기 위한 각각의 개별적 공여자 세포 생성물의 광범위하고 고비용의 실험실 시험을 비롯한 다수의 단점을 갖는다.
불행하게도, TIL의 확장에 사용하기 위해 개발된 aAPC는 PBMC와 비교할 경우, 투입 TIL의 표현형적 특성의 변경, 뿐만 아니라 빈약한 확장 성능 및/또는 확장 결과에 있어서 높은 가변성을 비롯한 빈약한 성능에 시달렸다. aAPC로서 사용하기 위해 순응될 수 있는 다수의 잠재적 세포 및 적합한 후보를 확인하는 비예측가능성 때문에, 지금까지의 폴리클로날 TIL에 대한 aAPC의 개발의 초점은 단지 널리 확립된 K562 세포주에 있었다. 문헌 [Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209]. 예를 들어, 4-1BBL (CD137L)을 발현하도록 변형된 K562 세포를 REP전 배양 (그러나, REP 배양은 아님)에서 시험하여 종양 소화로부터의 TIL 확장의 향상을 측정하였지만, PBMC는 여전히 TIL 확장을 얻기 위해 K562 세포와 함께 사용될 것이 요구되었다. 문헌 [Friedman, et al., J. Immunother. 2011, 34, 651-661]. CD64, CD86, 및 4-1BBL을 발현하도록 변형된 다른 조작된 K562 세포를 시험하였고, 기껏해야 PBMC에 필적한, 및 필시 PBMC 미만인 TIL 확장을 달성하였으며, 또한 덜 바람직한 CD8+/CD4+ T 세포 비로의 폴리클로날 TIL 표현형의 왜곡에 시달렸다. 문헌 [Ye, et al., J. Translat. Med. 2011, 9, 131]. 최근, CD86, 4-1BBL (CD137L), 고친화도 Fc 수용체 (CD64) 및 막-결합된 IL-15를 발현하도록 변형된 K562 세포는 또한 PBMC 공급자에 비해 등가의 수로 TIL을 전파한 것으로 나타났지만 (REP후), 막-결합된 IL-15의 추가의 복잡성을 갖는다. 문헌 [Forget, et al., J. Immunother. 2014, 37, 448-60]. 개발된 다른 시스템은 중요한 공동자극 분자가 결여되었거나, 비바람직한 T 세포 표현형적 왜곡을 초래하였거나, 추가의 인터루킨 (예컨대 IL-21)을 요구하였다. 문헌 [Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209]. 전체적으로, K562 변형된 aAPC는 허용되는 가변성을 갖는 TIL의 일관된 확장을 제공하는 것으로 나타나지 않은 반면, 또한 전체적인 확장 세포 카운트를 비롯한 다른 척도에 있어서는 PBMC보다 더 양호하게 수행하였다. K562 세포 외의 대안적인 aAPC는 다른 세포 확장 방법에서 성공적이었지만, TIL을 구성하는 세포의 고유한 폴리클로날 하위세트를 갖는 PBMC와 동일한 성능을 달성하지 않았다. 문헌 [Maus, et al., Nat. Biotechnol. 2002, 20, 143-148]; [Suhoski, et al., Mol. Ther. 2007, 15, 981-988].
MOLM-14 인간 백혈병 세포주는 재발된 급성 단핵구 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 확립되었으며, 초기 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시하였다: CD4, CD9, CD11a, CD13, CD14, CD15, CD32, CD33, CD64, CD65, CD87, CD92, CD93, CD116, CD118, 및 CD155. 문헌 [Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77]. MOLM-14의 추가의 표현형적 특징화는 보다 높은 수준의 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, CD58, 및 보다 낮은 수준의 CD86을 밝혀내었다. MOLM-14 세포 및 가깝게 관련된 MOLM-13 세포는 종양 면역요법 적용을 위한 세포의 확장을 위한 유용한 aAPC로서 이전에 보고되지 않았다.
EM-3 인간 세포주는 필라델피아 염색체-양성 CML을 갖는 환자의 골수로부터 확립되었다. 문헌 [Konopka, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4]. EM-3 세포 및 가깝게 관련된 EM-2 세포주는 종양 면역요법 적용을 위한 세포의 확장을 위한 유용한 aAPC로서 이전에 보고되지 않았다. EM-3 세포의 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시한다: CD13, CD15, 및 CD33.
본 발명은 CD86 (B7-2), 4-1BBL (CD137L), 및 OX40L (CD134L)을 비롯한 추가의 공동자극 분자로 형질도입된 MOLM-13, MOLM-14, EM-3, 및 EM-2 세포를 비롯한 조작된 골수성 계통 세포가 마스터 세포 뱅크로부터 효율적으로 생산될 수 있는 aAPC를 사용하는 유익을 갖고, 최소의 가변성, 감소된 비용을 갖고, PBMC의 공급원으로서 인간 혈액 샘플에 대한 의존성이 없는 다수로의 TIL의 우수하고 매우 효율적인 확장을 제공한다는 예상치 않은 발견을 제공한다. CD86 및 4-1BBL은 T 세포 활성화를 위한 공동자극 신호를 제공하는 공동자극 분자이다. 추가의 공동자극 분자로 형질도입된 MOLM-14, MOLM-13, EM-3, 및/또는 EM-2 세포는 예를 들어, 암 면역요법 및 다른 요법에 사용하기 위한 TIL의 확장에 유용하다.
발명의 요약
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다.
한 실시양태에서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질의 각각은 인간 단백질이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 aAPC와 접촉된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC를 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, CD86을 코딩하는 핵산 분자는 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자와 상이한 바이러스 벡터 또는 동일한 바이러스 벡터에 포함될 수 있음이 명백할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 TIL의 집단을 약 3000 IU/mL의 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, aAPC가 aAPC와 접촉된 T 세포를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 막-결합된 IL-15가 본질적으로 없는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 EM-3 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, 골수성 세포가 EM-2 세포인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, CD86 단백질이 서열식별번호 (SEQ ID NO): 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, CD86을 코딩하는 핵산 분자가 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자가 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인 aAPC를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하는 aAPC와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하고, TIL의 집단이 확장되는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하는, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, APC의 집단이 TIL의 집단을 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 EM-3 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 골수성 세포가 EM-2 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 분자 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며, 여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 TIL 상의 적어도 2종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 2종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 2종의 공동-자극 리간드가 CD86 및 4-1BBL을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고;
골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입된 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)가 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입된 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고, 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고; 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고; 여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비는 약 1 대 300이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제2 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법으로부터 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입되고, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하고,
골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-2 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 환자를 치료하는 단계;
(e) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
(f) 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 고-용량 IL-2 처방으로 환자를 치료하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 환자를 치료하는 단계;
(e) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
(f) 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 고-용량 IL-2 처방으로 환자를 치료하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고;
추가로, TIL의 집단이 비-골수절제 림프구고갈 처방과 조합으로 환자에게 투여하기 위한 것이고, 비-골수절제 림프구고갈 처방이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것인 시클로포스파미드, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것인 플루다라빈을 포함하고, 추가로, TIL의 집단이 고-용량 IL-2 처방과 조합으로 투여하기 위한 것이고, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여하기 위한 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨을 포함하는 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다. 특정 실시양태에서, TIL의 집단은 고-용량 IL-2 처방 전에 및 비-골수절제 림프구고갈 처방에 후속적으로 투여하기 위한 것이다.
특정 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 골수성 aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다.
한 실시양태에서, TIL의 집단은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 초기 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고; 초기 확장 및/또는 급속 확장이 기체-투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 80 내지 1 대 400인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득되고/되었고, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하고, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 80 내지 1 대 400인 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단을 제공한다.
한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비는 약 1 대 300이다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며,
여기서, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 aAPC를 포함하고, 어플리케이터 및 키트의 사용을 위한 지시 자료를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 aAPC가 렌티바이러스 벡터 (LV)를 사용하여 형질도입된 MOLM-14 세포 또는 EM-3 세포를 포함하고, LV가 알려진 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 알려진 공동-자극 분자와 상기 공동-자극 리간드의 결합이 T 세포를 자극하고 확장시키는 것인, 알려진 공동-자극 분자를 발현하는 종양 침윤 림프구의 증식을 특이적으로 유도하기 위한 키트를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 내인성 CD16 Fc 수용체를 발현하는 복수의 마우스 비만세포종 P815 세포를 제공하며, 여기서, P815 세포가 향상된 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불이 루시페라제에 기초한 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 것인 단계;
(b) 복수의 P815 세포 및 종양 침윤 림프구 (TIL)를 OKT-3과 함께 및 없이 공동-배양하여 T 세포 수용체 (TCR) 활성화 (특이적 살해) 또는 림포카인 활성화된 살해 (LAK, 비-특이적 살해)를 평가하는 단계;
(c) 4시간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 루시페린을 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하는 단계; 및
(f) 퍼센트 세포독성 및 생존을 계산하는 단계
를 포함하는, TIL의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
상기 요약, 뿐만 아니라 하기 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 방사선조사된 동종이형 PBMC 공급자 세포를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. 각각의 TIL 주 (M1015T 및 M1016T) (1.3 × 105개의 세포)를 T25 플라스크에서 7일 동안 46가지 상이한 방사선조사된 공급자 (1.3 × 107개의 세포), IL-2 (3000 IU/mL) 및 OKT-3 (30 ng/mL)과 공동-배양하였다. TIL에 대한 배수 확장 값을 제7일에 계산하였다. 도면은 시험된 46가지 상이한 공급자 로트로의 별개의 자극 실험에서 2가지 TIL 주에 대한 배수 확장의 수를 나타내며, PBMC 공급자 세포를 사용한 확장 결과의 가변성을 강조한다.
도 2는 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 3은 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 4-1BBL PCRP (폴리머라제 연쇄 반응 생성물) 부분의 도해를 예시한다.
도 4는 pLV430G 인간 CD86 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 5는 pLV430G 인간 CD86 벡터의 CD86 PCRP 부분의 도해를 예시한다.
도 6은 pDONR221 인간 CD86 공여자 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 7은 pDONR221 인간 4-1BBL 공여자 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 8은 pLV430G 비어있는 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 9는 pDONR221 비어있는 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 10은 렌티바이러스 제조를 위한 psPAX2 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
도 11은 렌티바이러스 제조를 위한 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
도 12는 조작된 MOLM-14 세포 상의 CD137 및 CD86의 발현을 확인시켜 주는, 렌티바이러스 형질감염 전의 ("비형질감염된") 및 형질감염 후의 ("형질감염된") MOLM-14 세포에 대한 유동 세포측정 실험의 결과를 예시한다.
도 13은 TIL 로트 M1032-T2에 대한 방사선조사된 모 비변형된 MOLM-14 세포 ("모 MOLM14"), 조작된 MOLM-14 세포 (CD86/4-1BBL, "조작된 MOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("공급자")를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. TIL을 PBMC 공급자 또는 모 또는 조작된 MOLM14 세포와 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제6일 및 제11일에 카운팅하고, 분할하였다. 각각의 점은 각각 제0일, 제6일, 제11일 및 제14일에 측정된 세포 수를 나타낸다. 로그 스케일이 사용된다.
도 14는 선형 스케일을 사용하여 나타낸, 도 13에 나타내어진 바와 같은 결과를 예시한다.
도 15는 로그 스케일을 사용한, 도 13에 주어진 바와 같은 다른 파라미터를 갖는 TIL 로트 M1033-T6에 대한 결과를 예시한다.
도 16은 선형 스케일을 사용하여 나타낸, 도 14에 나타내어진 바와 같은 결과를 예시한다.
도 17은 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 조작된 MOLM-14 세포 ("TIL + 조작된 MOLM14 (CD86/41BB) + OKT3") 또는 방사선조사된 PBMC 공급자 ("TIL + 공급자 + OKT3")를 사용한 TIL의 급속 확장의 결과를 예시한다. TIL을 PBMC 공급자 또는 조작된 MOLM-14 세포 (aMOLM14)와 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제6일 및 제11일에 카운팅하고, 분할하였다. 각각의 점은 제14일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 18은 TIL (2 × 104개)을 24-웰 G-렉스 (G-Rex) 플레이트의 웰에서 상이한 비 (1:10, 1:30, 및 1:100, 각각 "10", "30", 및 "100"으로 나타냄)의 모 MOLM-14 ("MOLM14") 세포, CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("PBMC+")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양한 실험의 결과를 예시한다. 대조군은 단지 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 사용하여 수행하였다 ("PBMC-"). 각각의 조건은 삼중으로 배양하였다. 배양물을 제4일 및 제7일에 신선한 배지 및 IL-2로 공급하였다. 생존성 세포를 제7일에 카운팅하였다. 여기에 제시된 막대 그래프는 제11일에 카운팅된 생존성 세포 수의 평균 더하기 표준 편차 (SD)를 나타낸다. p-값은 스튜던트 't' 검정에 의해 계산하였다.
도 19는 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:30, 1:100, 및 1:300, 각각 "30", "100", 및 "300"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 생존성 세포를 제11일에 카운팅하고, 플롯팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 20은 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:50, 1:100, 및 1:200, 각각 "50", "100", 및 "200"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 21은 단일 24 웰 G-렉스 배양 플레이트에서 상이한 비 (1:100, 1:200, 1:400, 및 1:800, 각각 "100", "200", "400", 및 "800"으로 나타냄)의 PBMC 공급자 ("PBMC"), 모 MOLM-14 세포 ("MOLM14"), 또는 CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14")와, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 배양된 TIL의 결과를 예시한다. 세포를 제14일에 카운팅하였다. 다른 조건은 도 18에서와 같다.
도 22는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, T 세포 수용체 (TCR) α/β, CD4, CD8, CD27, CD28, 및 CD57 TIL의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 23은 aMOLM14 aAPC로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4, CD8, CD27, CD28, 및 CD57 TIL의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 24는 살아있는, TCR α/β+, CD4+, 또는 CD8+ TIL 상에 게이팅된 기억 하위세트 (CD45RA+/-, CCR7+/-)를 나타내는 유동 세포측정 등고선 플롯을 나타낸다.
도 25는 SPADE 트리를 사용한 CD3+ 세포 상에 게이팅된 T 세포 하위세트, CD4+ 및 CD8+ REP후 TIL (aMOLM14 aAPC로 확장됨)의 표현형적 특징화를 예시한다. 색상 구배는 LAG3, TIM3, PD1, 및 CD137의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다.
도 26은 SPADE 트리를 사용한 CD3+ 세포 상에 게이팅된 T 세포 하위세트, CD4+ 및 CD8+ REP후 TIL (aMOLM14 aAPC로 확장됨)의 표현형적 특징화를 예시한다. 색상 구배는 MFI CD69, CD154, KLRG1, 및 TIGIT에 비례한다.
도 27은 미토콘드리아 스트레스 시험 동안 측정된 공급자 또는 aMOLM14로의 확장 후의 TIL의 산소 소비 속도 (OCR)를 예시한다. 각각의 데이터 점은 삼중으로 측정된 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 28은 미토콘드리아 스트레스 시험 동안 측정된 공급자 또는 aMOLM14로의 확장 후의 TIL의 세포외 산성화 속도 (ECAR)를 예시한다. 각각의 데이터 점은 삼중으로 측정된 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 29는 목표 벡터 pLV4301G의 벡터 도해를 예시한다.
도 30은 공여자 벡터 1, pMK 7c12 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5의 벡터 도해를 예시한다.
도 31은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2의 벡터 도해를 예시한다.
도 32는 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그의 벡터 도해를 예시한다.
도 33은 목표 벡터 pLV4301G의 벡터 도해를 예시한다.
도 34는 공여자 벡터 1, pMK 8B3 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5의 벡터 도해를 예시한다.
도 35는 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2의 벡터 도해를 예시한다.
도 36은 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그의 벡터 도해를 예시한다.
도 37은 조작된 EM-3 세포 상의 CD137 및 CD86의 발현을 확인시켜 주는, 렌티바이러스 형질감염 전의 ("비형질감염된") 및 형질감염 후의 ("형질감염된") EM-3 세포에 대한 유동 세포측정 실험의 결과를 예시한다.
도 38은 TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 1:100의 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다.
도 39는 TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 1:100의 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다.
도 40은 TIL을 aEM3 또는 PBMC 공급자와 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께, OKT-3 (30 ng/mL)과 함께 또는 없이 공동-배양한 실험의 결과를 예시한다. 막대 그래프는 제11일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 41은 상이한 TIL:aAPC 비로 EM-3 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다.
도 42는 EM-3 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aEM3 (삼중으로)과 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다.
도 43은 EM-3 aAPC 및 MOLM-14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aMOLM14 (삼중으로) 또는 aEM3 (또한 삼중으로)과 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다.
도 44는 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4+, 및 CD8+ TIL (TIL 배치 M1054)의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 45는 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 살아있는, TCR α/β, CD4+, 및 CD8+ TIL (TIL 배치 M1055)의 미세 분포를 나타내는 선버스트 시각화를 예시한다.
도 46은 CD3+ 세포를 사용한 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4+ 및 CD8+ SPADE 트리를 예시한다. 색상 구배는 LAG-3, TIM-3, PD-1, 및 CD137의 MFI에 비례한다.
도 47은 CD3+ 세포를 사용한 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4+ 및 CD8+ SPADE 트리를 예시한다. 색상 구배는 CD69, CD154, KLRG1, 및 TIGIT의 MFI에 비례한다.
도 48은 씨홀스 XF 미토 (Seahorse XF Mito) 스트레스 시험에 의해 측정된 여분 호흡 능력의 요약을 예시한다.
도 49는 씨홀스 XF 미토 스트레스 시험에 의해 측정된 당분해 예비력의 요약을 예시한다.
도 50은 살아있는 세포에서 미토콘드리아를 염색하고, 그에 대한 축적이 막 전위에 의존하는 미토트래커 (MitoTracker) 염료를 사용한 PBMC 또는 aEM3에 대해 확장된 살아있는 TIL의 미토콘드리아 염색을 예시한다. PBMC 또는 aEM3에 대해 확장된 TIL을 L/D 아쿠아 (Aqua), 이어서 미토트래커 적색 염료로 염색하였다. 나타내어진 데이터는 살아있는 집단 상에 게이팅된 미토트래커 양성 (MFI) 세포이다.
도 51은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 세포독성 효능 및 기능적 활성에 대한 P815 BRLA의 결과를 예시한다.
도 52는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 세포독성 효능 및 기능적 활성에 대한 P815 BRLA의 결과를 예시한다.
도 53은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 2가지 배치에 대한 IFN-γ 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 54는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 3가지 배치에 대한 IFN-γ 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 55는 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aMOLM14 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 2가지 배치에 대한 그란자임 (Granzyme) B 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 56은 PBMC 공급자로 확장된 TIL을 aEM3 aAPC를 사용하여 확장된 TIL과 비교하는, 비자극된 ("US") TIL에 비해 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로 밤샘 자극 ("S")한 후의 TIL의 3가지 배치에 대한 그란자임 B 방출을 예시한다. * p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001, ns = 유의하지 않음.
도 57은 TIL 확장 및 치료 프로세스를 예시한다. 본 발명의 aAPC는 REP전 단계 (도면의 상부 반) 또는 REP 단계 (도면의 하부 반) 둘 다에 사용될 수 있으며, IL-2가 각각의 세포 배양물에 첨가되는 경우 첨가될 수 있다. 단계 1은 10개의 G-렉스 10 플라스크 내로의 4가지 종양 단편의 첨가를 지칭한다. 단계 2에서, 대략 40 × 106개 이상의 TIL을 수득한다. 단계 3에서, 분할이 REP에 대해 36개의 G-렉스 100 플라스크 내로 일어난다. TIL을 단계 4에서 원심분리에 의해 수확한다. 신선한 TIL 생성물을 단계 5에서 대략 43일의 총 프로세스 시간 후에 수득하며, 이 시점에서 TIL은 환자 내로 주입될 수 있다.
도 58은 aAPC로 확장된 TIL과 함께 사용하기 위한 치료 프로토콜을 예시한다. 수술 (및 종양 절제)은 시작에서 일어나고, 림프구고갈 화학요법은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 화학요법을 갖는 비-골수절제 림프구고갈을 지칭한다.
도 59는 개별적 이펙터:표적 비로 P815 클론 G6과 (항-CD3과 함께 또는 없이) 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1의 백분율 세포독성을 나타내는, 생물발광 재지정 용해 검정 (Bioluminescent Redirected Lysis Assay) (BRLA) 결과를 예시한다.
도 60은 상이한 비의 이펙터 대 표적 세포에 대해 방출된 IFN-γ의 양을 나타내는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터를 예시한다.
도 61은 4시간 및 24시간 공동-배양 동안 1:1 이펙터 대 표적 세포의 비로 항-CD3의 존재 하에서 P815 클론 G6과 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1에 의해 표현된 LAMP1 (％)을 예시한다.
도 62는 TIL 배치 M1030에 대한 BRLA 결과를 예시한다. BRLA에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 26 ± 16이다.
도 63은 TIL 배치 M1030에 대한 표준 크로뮴 방출 검정을 예시한다. 크로뮴 방출 검정에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 22이다.
도 64는 BRLA에 의한 TIL의 용해 단위를 70 ± 17로서 나타내는, TIL 배치 M1053에 대한 BRLA 결과를 예시한다.
도 65은 또한 크로뮴 검정에 의한 TIL의 용해 단위를 14 ± 5로서 나타내는, TIL 배치 M1053에 대한 표준 크로뮴 방출 검정 결과를 예시한다. 이 결과와 도 64의 비교는 BRLA 및 크로뮴 방출 검정의 필적하는 성능을 나타낸다.
도 66은 TIL의 IFN-γ 방출 및 세포독성 잠재성 사이의 선형 관계를 예시한다.
도 67은 IFN-γ에 대한 엘리스폿 (ELISpot) 결과를 예시한다.
도 68은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다.
도 69는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다.
도 70은 M1053T 및 M1030T에 의한 그란자임 B 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 이 데이터는 BRLA에 의해 나타난 TIL의 효능을 확인시켜 준다.
도 71은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다.
도 72는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다.
도 73은 M1053T 및 M1030T에 의한 TNF-α 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 이 데이터는 BRLA에 의해 나타난 TIL의 효능을 확인시켜 준다.
도 74는 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다.
도 75는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다.
도 76은 이러한 세포의 집단을 FBS의 hAB 혈청 배지로의 이행 (weaning off)의 경우 aEM3 세포 (C712 (A) 및 8B5 (B))의 세포 집단의 변화를 예시한다.
도 77은 다양한 동결 배지에 현탁된 aEM3 세포 집단으로의 동결-해동-회수 주기 동안 세포 집단의 변화를 예시한다.
도 78은 8-일 시간 과정에 걸친 기체 투과성 세포 배양 플라스크에서의 aEM3 세포의 성장을 예시한다.
도 79는 aEM3 세포의 순도를 측정하기 위한 유동 패널 분석을 예시한다.
도 80은 aEM3 세포의 순도를 측정하는 데 사용된 유동 패널 분석의 결과를 예시한다.
도 81은 OKT3에 의해 자극된 aEM3 공급자 세포 및 PBMC 공급자 사이의 시토카인 발현의 차이를 예시한다.
도 82는 TIL이 혈청 무함유 배지 (즉, CTS 옵티마이저 (Optmizer))로 유리하게 확장되어 (REP전) CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공할 수 있음을 예시한다.
도 83 및 도 84는 TIL이 혈청 무함유 배지 (즉, CTS 옵티마이저)로 유리하게 확장되어 제11일 (REP전) (도 83) 및 제22일 (REP전 및 REP후) (도 84)에 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공할 수 있음을 예시한다.
도 85는 aAPC 세포 (즉, aEM3 세포)가 혈청 무함유 배지를 사용하여 성장될 수 있음을 예시한다. 구체적으로, CTS 옵타마이저 및 프라임 (Prime)-TCDM은 cDMEM (10％ h혈청)에 비해 aEM3을 성장시키는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 나타내어진 데이터는 5회의 개별적 실험의 평균 + SD이었다. p 값은 스튜던트 t-검정에 의해 계산하였다. *P < 0.05.
도 86 및 도 87은 냉동보존 후의 제3일에 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 급속 회수를 입증하는 2가지 실험의 결과를 예시한다. 도 86은 실험 1에 대한 총 세포 카운트를 예시하고, 도 87은 실험 2에 대한 총 세포 카운트를 예시한다.
도 88은 세포를 플레이팅하고, 9일 동안 성장시킨 냉동보존 후의 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 성장을 예시한다. 세포 카운트는 해동 후 3일마다 측정하였다.
도 89는 세포를 GREX 10 플라스크에 플레이팅하고, 8일 동안 성장시킨 냉동보존 후의 TIL-R3 세포주로부터의 aEM3 세포의 성장을 예시한다. 세포 카운트는 해동 후 4일마다 측정하였다.
도 90은 p렌티 (pLenti)-C-Myc-DDK 인간 OX40L 벡터의 벡터 도해를 예시한다.
도 91은 aEM3과 함께 배양된 TIL이 CD8+ TIL 왜곡을 촉진시키는 것을 나타내는, aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 REP에서 확장된 TIL의 유동 세포측정 분석의 결과를 예시한다.
도 92는 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 생존성 세포의 수를 예시한다.
도 93은 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 CD3+ 세포의 수를 예시한다.
도 94는 TIL을 REP에서 aEM3 세포주 및 PBMC 공급자로 확장시킨 실험으로부터 얻어진 CD3- 세포의 수를 예시한다.
도 95는 qPCR 방법을 사용한 텔로미어 길이 분석의 결과를 예시한다.
도 96은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
도 97은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
도 98은 본 발명의 aAPC의 실시양태의 개략적 도해를 예시한다.
서열 목록의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 뮤로모납의 중쇄에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 2는 뮤로모납의 경쇄에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 3은 재조합 인간 IL-2에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 4는 알데스류킨에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 5는 재조합 인간 IL-7에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 6은 재조합 인간 IL-15에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 7은 재조합 IL-21에 대한 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 8은 인간 CD86의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 9는 인간 4-1BBL (CD137L)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 10은 인간 OX40L (CD134L)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 11은 인간 CD28의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 12는 인간 CTLA-4의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 13은 인간 4-1BB (CD137)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 14는 인간 OX40 (CD134)의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 15는 pLV430G 4-1BBL 비어있는 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 16은 pLV430G 인간 4-1BBL 벡터의 4-1BBL CoOP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 17은 4-1BBL PCRP에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 18은 pLV430G hCD86 비어있는 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 19는 pLV430G 인간 hCD86 벡터의 hCD86 CoOP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 20은 pLV430G 인간 hCD86 벡터의 hCD86 CoOP B1 B2 PCRP 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 21은 pDONR221 hCD86 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 22는 pDONR221 4-1BBL 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 23은 pLV430G 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 24는 pDONR221 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 25는 렌티바이러스 제조를 위한 psPAX2 헬퍼 플라스미드에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 26은 렌티바이러스 제조를 위한 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 27은 mFc-7C12 scFv 클론의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 28은 mFc-8B3 scFv 클론의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 29는 mFC-7C12 scFv에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 30은 mFC-8B3 scFv에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 31은 목표 벡터 pLV4301G에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 32는 공여자 벡터 1, pMK 7c12 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 33은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 34는 렌티바이러스 제조를 위해 사용된 최종 벡터, pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 35는 목표 벡터, pLV4301G에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 36은 공여자 벡터 1, pMK 8B3 항 mFC scFv CoOp ECORV SacII L1R5에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 37은 공여자 벡터 2, pMK hCD8a 스캐폴드 TN L5 L2에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 38은 렌티바이러스 제조에 사용된 최종 벡터, pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 39는 렌티바이러스 제조를 위한 p렌티-C-Myc-DDK OX40L 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 40은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 41은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-2b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 42는 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열식별번호: 43은 텔로미어 길이의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 측정에 사용된 Tel-1b 프라이머에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공동-투여", "공동-투여하는", "와 조합으로 투여되는", "와 조합으로 투여하는", "동시" 및 "공동"은 둘 다의 활성 제약 성분 및/또는 그들의 대사물이 동시에 인간 대상체에 존재하도록 인간 대상체에의 2종 이상의 활성 제약 성분의 투여를 포괄한다. 공동-투여는 별개의 조성물에서의 동시 투여, 별개의 조성물에서의 상이한 시간에서의 투여, 또는 2종 이상의 활성 제약 성분이 존재하는 조성물에서의 투여를 포함한다. 별개의 조성물에서의 동시 투여 및 둘 다의 작용제가 존재하는 조성물에서의 투여는 또한 본 발명의 방법에 포괄된다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있거나 죽은 세포가 채용되는 세포-기재 검정을 포괄하며, 또한 무손상 세포가 채용되지 않는 무세포 검정을 포괄한다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 처리하거나 절차를 수행하는 것을 포함하는 사건을 지칭한다. 적절히, 세포, 조직 및/또는 기관은 수술 또는 치료의 방법에서 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
용어 "항원"은 면역 반응을 유도하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가적으로 면역계에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화를 초래하는 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부의 경우, 이는 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결될 것을 요구할 수 있다. 항원은 또한 1개 이상의 에피토프 (예를 들어, B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바람직하게는 전형적으로 고도로 특이적 및 선택적 방식으로 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이며, 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 반응하지 않을 것이다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 질환 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 의도된 적용을 실행하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 인간 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 중량, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 투여의 방식 등에 따라 다양할 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서의 특정 반응 (예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 구체적인 용량은 선택된 특정 화합물, 이어지는 투약 처방, 화합물이 다른 화합물과 조합으로 투여되는지 여부, 투여의 시기, 그것이 투여되는 조직, 및 화합물이 운반되는 물리적 전달 시스템에 따라 다양할 것이다.
용어가 본원에 사용된 바와 같은 "치료 효과"는 인간 대상체에서의 치료 유익 및/또는 예방 유익을 포괄한다. 예방 효과는 질환 또는 상태의 출현을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태의 증상의 발병을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태의 진행을 감속시키거나, 중단시키거나, 반전시키는 것, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
"제약학적으로 허용되는 담체" 또는 "제약학적으로 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 제약 성분을 위한 이러한 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제의 용도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 제약학적으로 허용되는 담체 또는 제약학적으로 허용되는 부형제가 활성 제약 성분와 비혼화성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 추가의 활성 제약 성분, 예컨대 다른 약물은 또한 기재된 조성물 및 방법 내로 혼입될 수 있다.
용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3배 (또는 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9배), 보다 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10배 (또는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90배), 또는 가장 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100배의 항원-특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 다수의 급속 확장 프로토콜이 본원에 기재되어 있다.
본원에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류에 잔존하고, 종양 내로 이동된 백혈구로서 원래 얻어진 세포의 집단을 의미한다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 살해 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 개요된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 수득된 것들이고 (때때로 본원에서 "신선하게 수확된" 또는 "TIL의 제1 집단"으로 지칭됨), "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL (적절할 경우 "REP TIL" 또는 "REP후 TIL", 또는 "TIL의 제2 집단" 또는 "TIL의 제3 집단")을 포함하나 이에 제한되지 않는, 본원에서 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 종양을 침윤시키고 치료를 실행하는 그들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 하기 바이오마커 중 1종 이상을 발현함으로써 범주화될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, 및 CD25. 추가적으로, 및 대안적으로, TIL은 환자 내로의 재도입 시 고형 종양을 침윤시키는 그들의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
본원에서 "냉동보존된 TIL"은 TIL이 약 -150 ℃ 내지 -60 ℃의 범위에서 처리되고 저장된 것을 의미한다. 냉동보존을 위한 일반적 방법은 또한 실시예에서를 비롯한 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 명확성을 위해, "냉동보존된 TIL"은 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과는 구별된다.
본원에서 "해동된 냉동보존된 TIL"은 이전에 냉동보존되었고, 그 후 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는 실온 이상으로 복귀하도록 처리된 TIL의 집단을 의미한다.
본원에서 "세포의 집단" (TIL을 포함함)은 공통적인 특성을 공유하는 다수의 세포를 의미한다.
용어 "중심 기억 T 세포"는 인간에서 CD45R0+이고, CCR7 (CCR7hi) 및 CD62L (CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BCL-6, BCL-6B, MBD2, 및 BMI1을 포함한다. 중심 기억 T 세포는 주로 TCR 촉발 후에 이펙터 분자로서 IL-2 및 CD40L을 분비한다. 중심 기억 T 세포는 혈액에서 CD4 구획에 우세하며, 인간에서 림프절 및 편도에 비례적으로 풍부하다.
용어 "이펙터 기억 T 세포"는 중심 기억 T 세포와 마찬가지로, CD45R0+이지만, CCR7 (CCR7lo)의 구성적 발현을 소실하였으며, CD62L 발현 (CD62Llo)에 대해 이종이거나 낮은 인간 또는 포유동물 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R), 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 이펙터 기억 T 세포는 항원 자극 후에 인터페론-γ, IL-4, 및 IL-5를 비롯한 높은 수준의 염증성 시토카인을 급속하게 분비한다. 이펙터 기억 T 세포는 혈액에서 CD8 구획에 우세하며, 인간에서 폐, 간, 및 장에 비례적으로 풍부하다. CD8+ 이펙터 기억 T 세포는 다량의 퍼포린을 운반한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성", 및 "서열 퍼센트 동일성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬한 경우 (필요할 경우, 갭을 도입함), 동일하거나, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리듬을 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리듬 및 소프트웨어가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 측정하는 적합한 프로그램으로는 예를 들어 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 (U.S. Government's National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹 사이트로부터 이용가능한 BLAST 프로그램의 조를 들 수 있다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리듬 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크 (Genentech), 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코) 또는 DNASTAR로부터 이용가능한 멕얼라인 (MegAlign)은 서열을 정렬하는 데 사용될 수 있는 추가의 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 정렬 소프트웨어에 의해 최대 정렬에 대한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴드 파라미터가 사용된다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 항원에의 항체의 또는 그의 리간드에의 단백질의 결합을 제거하지 않는 아미노산 서열 변형을 의미한다. 보존적 아미노산 치환은 한 부류의 아미노산의 동일한 부류의 아미노산에 의한 치환을 포함하며, 여기서, 부류는 예를 들어, 표준 데이호프 (Dayhoff) 빈도 교환 행렬 또는 BLOSUM 행렬에 의해 측정된 바와 같이, 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서의 공통적인 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6개의 일반적 부류가 범주화되었으며, 부류 I (Cys); 부류 II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III (Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV (His, Arg, Lys); 부류 V (Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI (Phe, Tyr, Trp)을 포함한다. 예를 들어, 또다른 부류 III 잔기, 예컨대 Asn, Gln, 또는 Glu에 대한 Asp의 치환은 보존적 치환이다. 따라서, 4-1BBL 또는 CD86 단백질에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 부류로부터의 또다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 또는 리간드 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187]; [Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999)]; 및 [Burks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417] 참조).
용어 "레트로바이러스"는 그들의 복제 주기 동안 역전사효소를 이용하는 RNA 바이러스를 지칭하며, 여기서, 레트로바이러스 게놈 RNA는 역전사효소에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다. 이중-가닥 DNA 형태는 감염된 세포의 염색체 내로 통합된다 ("프로바이러스"). 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 주형으로서 기능하며, 새로운 바이러스 입자를 생성하는 데 필요한 구조 단백질 및 효소를 코딩하는 RNA 분자의 발현을 지정한다. 프로바이러스의 각각의 말단에 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"로 지칭되는 구조가 있다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 비롯한 다수의 조절 신호를 함유한다. 시스터나바이러스 (Cisternavirus) A, 온코바이러스 (Oncovirus) A, 온코바이러스 B, 온코바이러스 C, 온코바이러스 D, 렌티바이러스 (Lentivirus), 감마레트로바이러스 (Gammaretrovirus), 및 스푸마바이러스 (Spumavirus)를 비롯한 몇몇 속은 레트로비리다에 (Retroviridae) 과 내에 포함된다. 레트로바이러스의 일부는 암유발성 (즉, 종양형성성)인 반면, 다른 것들은 그렇지 않다. 온코바이러스는 감수성 종에서 육종, 백혈병, 림프종, 및 유방 암종을 유도한다. 레트로바이러스는 폭넓게 다양한 종을 감염시키며, 수평적으로 및 수직적으로 둘 다 전파될 수 있다. 이들이 숙주 DNA 내로 통합되기 때문에, 이들은 세포에서 세포로 숙주 DNA의 서열을 전파할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터의 예로는 양생 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV-A)로부터 유래된 것들을 들 수 있으며, 이는 진입을 위해 세포 표면 포스페이트 수송체 수용체를 사용하고, 그 후 증식하는 세포 염색체 내로 영구적으로 통합된다. 양생 MLV 벡터 시스템은 널리 확립되었으며, 유전자 전달을 위한 대중적인 도구이다 (예를 들어, 문헌 [Gordon and Anderson, Curr. Op. Biotechnol., 1994, 5, 611-616] 및 [Miller, et al., Meth. Enzymol., 1993, 217, 581-599] 참조, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨).
용어 "렌티바이러스"는 HIV (인간 면역결핍 바이러스; HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2를 포함함), 양에서 뇌염 (비스나) 또는 폐렴 (마에디)을 유발하는 비스나-마에디, 염소에서 면역 결핍, 관절염, 및 뇌병증을 유발하는 염소 관절염-뇌염 바이러스; 말에서 자가면역 용혈성 빈혈, 및 뇌병증을 유발하는 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소에서 림프절병증, 림프구증가증, 및 가능하게는 중추 신경계 감염을 유발하는 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 아인간 영장류에서 면역 결핍 및 뇌병증을 유발하는 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함하는 속을 지칭한다. 이들 바이러스에 의해 유발되는 질환은 긴 인큐베이션 기간 및 지연된 과정을 특징으로 한다. 통상적으로, 바이러스는 단핵구 및 대식세포를 잠복성으로 감염시키며, 그로부터 이들은 다른 세포로 확산된다. HIV, FIV, 및 SIV는 또한 T 림프구 (즉, T 세포)를 용이하게 감염시킨다.
용어 "항-CD3 항체"는 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지정된 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 지칭하며, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 뮤로모납으로도 공지된 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3ε으로도 공지된 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체로는 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 및 비실리주맙을 들 수 있다.
용어 "OKT-3" (본원에서 "OKT3"으로도 지칭됨)은 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지정된, 인간, 인간화, 키메라, 또는 뮤린 항체를 비롯한 모노클로날 항체 또는 그의 변이체를 지칭하며, 시판되는 형태, 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 밀테니 바이오텍 게엠베하 (Miltenyi Biotec GmbH), 독일 버기쉬 글라드바흐) 및 뮤로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 또는 바이오시밀러를 포함한다. 뮤로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)에 주어진다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁되어 있으며, ATCC 수탁 번호 CRL 8001이 할당되어 있다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 또한 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐스 (European Collection of Authenticated Cell Cultures) (ECACC)에 기탁되어 있으며, 카탈로그 번호 86022706이 할당되어 있다.
<표 1>
뮤로모납의 아미노산 서열.
Figure pct00001
용어 "IL-2" (본원에서 "IL2"로도 지칭됨)는 인터루킨-2로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌 [Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88] 및 [Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79]에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 3)에 주어진다. 예를 들어, 용어 IL-2는 IL-2의 인간, 재조합 형태, 예컨대 알데스류킨 (프로류킨 (PROLEUKIN), 단일 사용 바이알 당 2200만 IU로 다수의 공급자로부터 시판됨), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포츠마우스에 소재하는 셀제닉스, 인코포레이티드 (CellGenix, Inc.) (셀그로 GMP (CELLGRO GMP)) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.) (카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매자로부터의 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비글리코실화된 인간 재조합 형태이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 4)에 주어진다. 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코에 소재하는 넥타 테라퓨틱스 (Nektar Therapeutics)로부터 이용가능한 PEG화된 IL2 프로드러그 NKTR-214를 비롯한, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2의 PEG화된 형태를 포괄한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 PEG화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0328791 A1호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/065086 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 대안적 형태는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4,902,502호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "IL-7" (본원에서 "IL7"로도 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터루킨 7로 공지된 글리코실화된 조직-유래된 시토카인을 지칭한다. 문헌 [Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발달을 자극할 수 있다. IL-7은 흉선 내에서의 T 세포 발달 및 주변부 내에서의 생존에 중요한 일련의 신호인, IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 쇄 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (ThermoFisher Scientific, Inc.) (인간 IL-7 재조합 단백질, 카탈로그 번호 지브코 (Gibco) PHC0071)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 5)에 주어진다.
용어 "IL-15" (본원에서 "IL15"로도 지칭됨)는 인터루킨-15로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-15는 예를 들어, 문헌 [Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. IL-15는 IL-2와 β 및 γ 신호화 수용체 서브유닛을 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 12.8 kDa의 분자 질량을 갖는 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-15는 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 34-8159-82)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 6)에 주어진다.
용어 "IL-21" (본원에서 "IL21"로도 지칭됨)은 인터루킨-21로 공지된 다표현형발현 시토카인 단백질을 지칭하며, 그의 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환, 글리코형, 바이오시밀러, 및 변이체를 비롯한 IL-21의 모든 형태를 포함한다. IL-21은 예를 들어, 문헌 [Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. IL-21은 주로 자연 살해 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 생산된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자 질량을 갖는 132개의 아미노산을 함유하는 단일, 비-글리코실화된 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크에 소재하는 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월텀에 소재하는 써모피셔 사이언티픽, 인코포레이티드 (인간 IL-21 재조합 단백질, 카탈로그 번호 14-8219-80)를 비롯한 다수의 공급자로부터 시판된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2 (서열식별번호: 7)에 주어진다.
<표 2>
인터루킨의 아미노산 서열.
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본원에 사용된 바와 같은 용어 "골수성 세포"는 골수성 계통의 또는 그로부터 유래된 세포를 지칭한다. 골수성 계통은 과립구 (호중구, 호산구, 및 호염기구), 단핵구, 대식세포, 적혈구, 거핵세포, 및 비만 세포의 상이한 하위세트를 비롯한 다수의 형태적으로, 표현형적으로, 및 기능적으로 별개의 세포 유형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 골수성 세포는 골수성 계통의 세포주로부터 유래된 세포이다.
"MOLM-14"는 재발된 급성 단핵구 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 확립된 인간 백혈병 세포주를 지칭하며, 초기 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시하였다: CD4, CD9, CD11a, CD13, CD14, CD15, CD32, CD33, CD64, CD65, CD87, CD92, CD93, CD116, CD118, 및 CD155. 문헌 [Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77]. MOLM-14의 추가의 표현형적 특징화는 보다 높은 수준의 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, CD58, 및 보다 낮은 수준의 CD86을 밝혀내었다. MOLM-14 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC777 하에 기탁되어 있다. 가깝게 관련된 MOLM-13 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC554 하에 기탁되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "MOLM-14 세포"는 MOLM-14 세포 및/또는 기탁된 MOLM-14 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "MOLM-13 세포"는 MOLM-13 세포 및/또는 기탁된 MOLM-13 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다.
"EM-3"은 필라델피아 염색체-양성 CML을 갖는 환자의 골수로부터 확립된 인간 세포주를 지칭한다. 문헌 [Konopka, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4]. EM-3 세포에 대한 표현형적 특징화는 적어도 하기 마커의 존재를 지시한다: CD13, CD15, 및 CD33. EM-3 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC134 하에 기탁되어 있는 반면, 가깝게 관련된 EM-2 세포주는 DSMZ에 수탁 번호 ACC135 하에 기탁되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "EM-3 세포"는 EM-3 세포 및/또는 기탁된 EM-3 모 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD86 단백질"은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 8에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "4-1BBL" 또는 "CD137L"은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 9에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "OX40L" 또는 "CD137L"은 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열식별번호: 10에 나타내어진 아미노산 서열과 적어도 90％, 예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 지칭할 수 있다.
용어 "바이오시밀러"는 임상적으로 불활성 성분의 사소한 차이에도 불구하고 미국 허가된 참조 생물학적 생성물과 매우 유사하고, 생성물의 안전성, 순도, 및 효능의 관점에서 생물학적 생성물 및 참조 생성물 사이에 임상적으로 유의미한 차이가 없는, 모노클로날 항체 또는 융합 단백질을 비롯한 생물학적 생성물을 의미한다. 더욱이, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약품 기구 (European Medicines Agency)에 의해 이미 사용이 인가된 또다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국립 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 생성물 또는 생물학적 의약은 생물학적 공급원, 예컨대 박테리아 또는 효모에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 이들은 상대적으로 작은 분자, 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복잡한 분자, 예컨대 모노클로날 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 IL-2 단백질이 알데스류킨 (프로류킨)인 경우, 알데스류킨에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 단백질은 알데스류킨"에 대한 바이오시밀러"이거나, 알데스류킨의 "그의 바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 이미 사용이 인가된 또다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용을 위한 관련 법적 기초는 보정된 바와 같은 규칙 (EC) 제726/2004호의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4)이며, 따라서, 유럽에서, 바이오시밀러는 규칙 (EC) 제726/2004호의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4) 하에 인가되거나, 인가를 위해 승인되거나, 인가를 위한 적용의 대상일 수 있다. 이미 인가된 원래 생물학적 의약적 생성물은 유럽에서 "참조 의약적 생성물"로 지칭될 수 있다. 생성물이 바이오시밀러로 간주되기 위한 요건의 일부는 문헌 [CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products]에 개요되어 있다. 또한, 모노클로날 항체 바이오시밀러에 관한 지침을 비롯한 생성물 특이적 지침은 EMA에 의해 생성물 별 기초로 제공되며, 그의 웹사이트 상에 공개되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특징, 생물학적 활성, 작용의 메커니즘, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 의해 참조 의약적 생성물과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 동일한 상태를 치료하는 데 사용되거나, 사용하기 위해 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 품질 특징을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 유사하거나 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽에서 바이오시밀러는 EMA에 의해 인가된 참조 의약적 생성물과 비교된다. 그러나, 일부 예에서, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 구역 (European Economic Area) 외부에서 인가된 생물학적 의약적 생성물 (비-EEA 인가된 "비교자")과 비교될 수 있다. 이러한 연구는 예를 들어 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 인가된 비교자와 비교되었거나, 비교될 수 있는 생물학적 의약적 생성물에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의하게 영향을 미치지 않는 아미노산 구조의 사소한 변형 (예를 들어 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환을 포함함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그의 참조 의약적 생성물의 아미노산 서열과 97％ 이상, 예를 들어, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 차이가 의약적 생성물의 안전성 및/또는 효능의 변화를 초래하지 않는 한, 참조 의약적 생성물의 번역후 변형과 상이한 1개 이상의 번역후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 및/또는 말단절단 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물과 동일하거나 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 그러나 배타적이지는 않게, 바이오시밀러는 차이가 참조 의약적 생성물과 연관된 안전성 문제를 다루거나, 다루도록 의도되는 경우, 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 추가적으로, 바이오시밀러는 의약적 생성물의 안전성 및 효능이 손상되지 않는 경우, 예를 들어 그의 강도, 제약 형태, 제형, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약적 생성물로부터 벗어날 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물에 비해 예를 들어 약동학 (PK) 및/또는 약역학 (PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있지만, 여전히 인가되거나 인가에 적합한 것으로 간주되도록 참조 의약적 생성물과 충분히 유사한 것으로 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약적 생성물에 비해 상이한 결합 특징을 나타내며, 여기서, 상이한 결합 특징은 규제 기관, 예컨대 EMA에 의해 유사한 생물학적 생성물로서의 인가를 위한 장벽이 아닌 것으로 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국립 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열 내의 또는 그에 인접한 특정 위치에서의 1개 이상의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 항체 또는 융합 단백질을 포괄하지만, 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 참조 단백질 또는 항체의 아미노산 서열에 비해 그의 아미노산 서열에서 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은 예를 들어, 유사하게 하전되거나 비하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 참조 단백질 또는 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 용어 "변이체"는 또한 PEG화된 항체 또는 단백질을 포함한다.
"PEG화"는 전형적으로 1개 이상의 PEG 기가 항체, 항체 단편, 또는 단백질에 부착되는 조건 하에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체, 또는 그의 단편, 또는 단백질을 지칭한다. PEG화는 예를 들어, 항체 또는 단백질의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 형태 중 임의의 것, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. PEG화되는 항체 또는 단백질은 비글리코실화된 항체일 수 있다. 예를 들어 유럽 특허 제EP 0154316호 및 제EP 0401384호에 기재된 바와 같이, PEG화를 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 항체 및 단백질에 적용될 수 있다.
용어 "약" 및 "대략"은 통계적으로 유의미한 범위의 값 내를 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 내, 바람직하게는 50％ 내, 보다 바람직하게는 20％ 내, 보다 바람직하게는 여전히 10％ 내, 및 보다 더 바람직하게는 5％ 내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 변형은 연구 하의 특정 시스템에 의존하며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 수 있다. 더욱이, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 및 다른 양 및 특징이 정확하지 않으며 그럴 필요는 없지만, 바람직할 경우, 대략적이고/거나 더 크거나 더 작을 수 있으며, 이는 내성, 전환 인자, 라운딩 오프, 측정 오차 등, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 인자를 반영한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제형, 파라미터, 형상 또는 다른 양 또는 특징은 이러한 것으로 명백하게 언급되든지 그렇지 않든지 "약" 또는 "대략적"이다. 매우 상이한 크기, 형상 및 치수의 실시양태는 기재된 배열을 채용할 수 있음이 주목된다.
전이적 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 원래 및 보정된 형태로 첨부된 청구범위에 사용되는 경우, 존재하는 경우 비인용된 추가의 청구항 요소 또는 단계가 청구항(들)의 범위로부터 배제되는 것에 관하여 청구항 범위를 한정한다. 용어 "포함하는"은 포함적 또는 개방-말단인 것으로 의도되며, 임의의 추가의, 비인용된 요소, 방법, 단계 또는 물질을 배제하지 않는다. 용어 "로 이루어진"은 청구항에 구체화된 것들 외의 임의의 요소, 단계 또는 물질을 배제하며, 후자의 예에서, 구체화된 물질(들)과 통상적으로 연관된 불순물을 배제한다. 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위를 구체화된 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기재된 모든 조성물, 방법, 및 키트는 대체적 실시양태에서 전이적 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진", 및 "로 이루어진" 중 임의의 것에 의해 보다 구체적으로 한정될 수 있다.
인공 항원 제시 세포
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, 및 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하는 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, CD64, CD80, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-13 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-13 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 MOLM-14 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, MOLM-14 또는 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC는 OX40L 및 4-1BBL 둘 다를 발현하도록 변형될 수 있음이 이해될 것이다.
인간 CD86, 인간 4-1BBL (CD137L), 및 인간 OX40L (CD134L)에 대한 서열은 표 3에 주어진다.
<표 3>
인간 CD86, 인간 4-1BBL, 및 인간 OX40L에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00003
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-14 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 MOLM-13 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
인간 CD86이 결합하는 리간드 (CD28 및 CTLA-4), 인간 4-1BBL이 결합하는 리간드 (4-1BB), 및 인간 OX40L이 결합하는 리간드 (OX40)에 대한 서열은 표 4에 주어진다.
<표 4>
인간 CD28, 인간 CTLA-4, 인간 4-1BB, 및 인간 OX40에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00004
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하며, 여기서, aAPC가 EM-3 모 세포주로부터 유래된 것인 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하는 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 도 96에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 97에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 98에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 발현하는 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 및 OX40L을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-3 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-3 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 OX40L 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 OX40L 단백질이 EM-2 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 도 96에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 97에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 98에 나타내어진 바와 같이 변형된 EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, EM-3 또는 EM-2 세포를 포함하는 aAPC는 OX40L 및 4-1BBL 둘 다를 발현하도록 변형될 수 있음이 이해된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CD58을 발현하고, 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 세포를 포함하며, 여기서, aAPC가 K562-계통 모 세포주로부터 유래된 것인 단리된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, K562 계통 모 세포주는 수탁 번호 ATCC CCL-243 하에, 및 또한 유러피안 콜렉션 오브 오텐티케이티드 셀 컬쳐즈에 기탁되어 있다 (ECACCECACC 89121407).
한 실시양태에서, 본 발명은 CD58을 발현하는 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, 세포가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형되고, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, K562-계통 세포가 CD86 및 4-1BBL을 발현하는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD86 단백질, 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 4-1BBL 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하며, 여기서, CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질이 K562-계통 세포의 표면 상에 발현되는 것인 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 99％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 98％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 97％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 96％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 95％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제2 단백질에 결합하는 제1 단백질, 및 서열식별번호: 12 또는 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 90％ 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제4 단백질에 결합하는 제3 단백질을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 aAPC의 상기 실시양태 중 임의의 것을 제조하는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 추가의 증식성 신호를 제공하는 모노클로날 항체, 예컨대 OKT-3의 Fc 도메인에 결합하는, 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인, 예컨대 본원에 기재된 클론 7C12 및 8B3을 발현하도록 변형된 K562-계통 세포를 포함하는 aAPC를 포함한다.
인공 항원 제시 세포를 제조하는 방법
한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 CD86 및 4-1BBL의 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 렌티바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 렌티바이러스 형질도입 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Levine, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77]; [Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75]; [Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71], 및 미국 특허 제6,627,442호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 감마-레트로바이러스 형질도입의 단계를 포함한다. 감마-레트로바이러스 형질도입 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 트랜스포존-매개된 유전자 전달의 단계를 포함한다. 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 트랜스포사제의 장기 발현이 트랜스제닉 세포에서 일어나지 않도록 트랜스포사제가 DNA 발현 벡터로서 또는 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공되는, 예를 들어 트랜스포사제가 mRNA (예를 들어, 캡 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 mRNA)로서 제공되는 시스템을 포함한다. 연어과-유형 Tel-유사 트랜스포사제 (SB 또는 잠자는 미녀 (Sleeping Beauty) 트랜스포사제), 예컨대 SB10, SB11, 및 SB100x, 및 증가된 효소적 활성을 갖는 조작된 효소를 비롯한 적합한 트랜스포존-매개된 유전자 전달 시스템은 예를 들어, 문헌 [Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83] 및 미국 특허 제6,489,458호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 CD86 및 4-1BBL의 일시적 생산을 위한 유전자의 안정한 혼입의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 전기천공의 단계를 포함한다. 전기천공 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306], 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0227237 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 인산칼슘 형질감염의 단계를 포함한다. 인산칼슘 형질감염 방법 (인산칼슘 DNA 침전, 세포 표면 코팅, 및 세포내이입)은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467]; [Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376]; 및 [Chen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752]; 및 미국 특허 제5,593,875호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 리포솜 형질감염의 단계를 포함한다. 리포솜 형질감염 방법, 예컨대 여과수 중 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 디올레오일 포스포티딜에탄올아민 (DOPE)의 1:1 (w/w) 리포솜 제형을 채용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525] 및 [Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417] 및 미국 특허 제5,279,833호; 제5,908,635호; 제6,056,938호; 제6,110,490호; 제6,534,484호; 및 제7,687,070호에 기재되어 있으며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, aAPC를 제조하는 방법은 미국 특허 제5,766,902호; 제6,025,337호; 제6,410,517호; 제6,475,994호; 및 제7,189,705호에 기재된 방법을 사용한 형질감염의 단계를 포함하며, 이들의 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 또한 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, aAPC를 먼저 게이트웨이 (Gateway) 클로닝 방법 (써모피셔, 인코포레이티드로부터 시판됨)을 사용함으로써 형질도입하여 렌티바이러스 형질도입을 위한 벡터를 제조하고, 이어서 벡터 및 1종 이상의 연관된 헬퍼 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스 형질도입을 한다. 게이트웨이 클로닝 방법에서, 유전자를 선택하고 (예컨대 CD86), 그 후 프라이머를 제공하고, attB 태그부착된 프라이머 쌍의 도움으로 PCR 기술을 사용하여 증폭시킨다. 그 후, PCR 단편을 attP 부위를 포함하는 공여자 벡터 (pDONR, 예컨대 pDONR221)와 조합하여 BP 반응을 사용하여 엔트리 클론을 제공한다. attB 및 attP 부위 사이의 통합 반응은 PCR 단편을 공여자 벡터와 조합한다. 생성된 엔트리 클론은 attL 부위에 의해 플랭킹된 관심의 유전자를 함유한다. 그 후, LR 반응을 사용하여 엔트리 클론을 목표 벡터와 조합하여 발현 벡터를 제조한다. LR 반응에서, 재조합 반응은 attL 및 attR 부위 및 클로나제 효소를 사용하여 엔트리 클론을 목표 벡터 (예컨대 pLV430G)와 연결시키는 데 사용된다. attL 부위는 이미 엔트리 클론에서 발견되는 반면, 목표 벡터는 attR 부위를 포함한다. LR 반응을 수행하여 관심의 서열을 동시 반응에서 1종 이상의 목표 벡터 내로 전달한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청-기재 배지 및/또는 혈청 무함유 배지 하에서 성장되고 유지될 수 있다. 예시적인 방법에 따르면, aAPC를 24 웰 플레이트에서 웰 당 약 1 × 106 세포의 세포 밀도로 3 내지 5일 동안 배양할 수 있다. 그 후, 세포를 단리하고/거나 원심분리에 의해 세척하고, 배지에 재현탁시키거나, 적절한 냉동보존 배지 (예를 들어, 크리오스토르 (CryoStor) 10 (바이오라이프 솔루션즈 (BioLife Solutions))에서 냉동보존하고, -80 ℃ 냉동고에서 저장한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC를 인간 혈청 (h혈청) 함유 배지 (예를 들어, 10％ h혈청을 갖는 cDMEM)를 포함하는 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청-기재 배지의 존재 하에서 성장된 aAPC는 aMOLM-13 세포, aMOLM-14 세포, 및 aEM3 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 aAPC는 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보 (Xvivo)-20 (론자 (Lonza)), 프라임 T 세포 CDM (어바인 (Irvine)), XFSM (메센컬트 (MesenCult)) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 성장된 aAPC는 aMOLM-13 세포, aMOLM-14 세포, 및 aEM3 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
종양 침윤 림프구 및 T 세포를 확장시키는 방법
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 TIL의 집단을 본원에 기재된 aAPC와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 aAPC가 TIL의 세포 표면 상에 발현되는 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 상기 공동-자극 분자와 상기 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292]에 기재된 바와 같은 단계를 포함하는, 본 개시내용의 aAPC 중 임의의 것을 사용하여 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 종양을 효소 배지에 정치하고, 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킬 수 있다. 그 후, 혼합물을 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션한 후, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴시킨다. 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서의 인큐베이션 후, 종양을 대략 1분 동안 3번째 기계적으로 파괴시킬 수 있다. 제3 기계적 파괴 후, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우, 1 또는 2회의 추가의 기계적 해리를 37 ℃에서 5％ CO2에서의 추가의 30분의 인큐베이션과 함께 또는 없이 샘플에 적용할 수 있다. 최종 인큐베이션의 종료 시, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, 피콜 (Ficoll)을 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. TIL 배양을 24-웰 플레이트 (코스타 (Costar) 24-웰 세포 배양 클러스터, 평저; 코닝 인코포레이티드 (Corning Incorporated), 미국 뉴욕주 코닝)에서 개시하였으며, 각각의 웰을 IL-2 (6000 IU/mL; 키론 코포레이션 (Chiron Corp.), 미국 캘리포니아주 에머리빌)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM)에서 1×106개의 종양 소화 세포 또는 크기가 대략 1 내지 8 mm3인 1개의 종양 단편으로 시딩할 수 있다. CM은 10％ 인간 AB 혈청, 25 mM 헤페스 (Hepes), 및 10 mg/mL 겐타미신으로 보충된 글루타맥스 (GlutaMAX)를 갖는 RPMI 1640으로 이루어진다. 배양을 40 mL 용량 및 10 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (G-렉스 10; 윌슨 울프 매뉴팩처링 (Wilson Wolf Manufacturing), 뉴 브링톤)에서 개시할 수 있으며, 각각의 플라스크를 IL-2를 갖는 10 내지 40 mL의 CM에서 10 내지 40×106개의 생존성 종양 소화 세포 또는 5-30개의 종양 단편으로 로딩할 수 있다. G-렉스 10 및 24-웰 플레이트를 습화된 인큐베이터에서 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 배양 개시 후 5일에 배지의 반을 제거하고, 신선한 CM 및 IL-2로 대체할 수 있으며, 제5일 후에, 배지의 반을 2 내지 3일마다 교환할 수 있다. TIL의 급속 확장 프로토콜 (REP)은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 aAPC를 사용하여, T-175 플라스크 및 기체-투과성 백 또는 기체-투과성 G-렉스 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. T-175 플라스크에서의 REP를 위해, 1×106개의 TIL을 각각의 플라스크에서 150 mL의 배지에 현탁시킬 수 있다. TIL을 본 개시내용의 aAPC와 함께 본원에 기재된 비로 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 (50/50 배지)에서 배양할 수 있다. T-175 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 배지의 반을 제5일에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교환할 수 있다. 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3L 백에서 합하고, 5％ 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V를 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가할 수 있다. 각각의 백 중의 세포의 수를 매일 또는 2일마다 카운팅할 수 있으며, 신선한 배지를 첨가하여 0.5 내지 2.0×106개 세포/mL의 세포 카운트를 유지할 수 있다. 100 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 플라스크 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 G-렉스 100, 윌슨 울프 매뉴팩처링)에서의 REP를 위해, 5×106 또는 10×106개의 TIL을 aAPC와 함께 본원에 기재된 비 (예를 들어, 1 대 100)로 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 배양할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 제거하고, 원심분리 병 내로 정치하고, 1500 rpm (491 g)에서 10분 동안 원심분리할 수 있다. 수득된 TIL 펠릿을 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 50/50 배지로 재현탁시키고, G-렉스 100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 G-렉스 100 플라스크에서 일련적으로 확장된 경우, 제7일에 각각의 G-렉스 100 중 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁시키고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취액으로 나눌 수 있으며, 이를 사용하여 3개의 G-렉스 100 플라스크를 시딩할 수 있다. 그 후, 5％ 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 약 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. 그 후, G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후, 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 G-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 그 후, 배양의 제14일에 세포를 수확함으로써 REP를 완결할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, TIL은 유리하게는 혈청 무함유 배지의 존재 하에서 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL 확장 방법은 혈청-기재 배지 (예를 들어, 완전 배지 또는 CM1)라기 보다는 혈청 무함유 배지의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL 확장 방법은 혈청-기재 배지라기 보다는 혈청 무함유 배지를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보-20 (론자), 프라임 T 세포 CDM (어바인) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하는, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, APC의 집단이 TIL의 집단을 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 MOLM-13 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 골수성 세포가 EM-3 세포인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하고, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하며,
여기서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인, TIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 TIL 상의 적어도 2종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 2종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 2종의 공동-자극 리간드가 CD86 및 4-1BBL을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법을 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, aAPC는 4-1BBL 외에도 OX40L을 추가로 포함할 수 있거나, 4-1BBL 대신 OX40L을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 암을 확장시키거나 치료하는 방법은 TIL이 환자 종양 샘플로부터 수득되는 단계를 포함한다. 환자 종양 샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, TIL은 샤프한 절개로부터의 효소적 종양 소화물 및 종양 단편 (크기가 약 1 내지 약 8 mm3)으로부터 배양될 수 있다. 이러한 종양 소화물은 효소적 배지 (예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute) (RPMI) 1640 완충제, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 겐타미신, 30 단위/mL의 DN아제 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)에서의 인큐베이션, 이어서 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기를 사용하여)에 의해 생성될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소적 배지에 정치하고, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시키고, 이어서 30분 동안 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션하고, 이어서 단지 작은 조직 조각이 존재할 때까지 상기 조건 하에서 기계적 해리 및 인큐베이션의 반복된 주기에 의해 생성될 수 있다. 이 프로세스의 종료 시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 죽은 세포를 함유하는 경우, 피콜 분지형 친수성 다당류를 사용한 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 미국 특허 출원 공개 제2012/0244133 A1호에 기재된 것들이 사용될 수 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 상기 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대해 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, REP는 기체 투과성 용기에서 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 인터루킨-2 (IL-2) 또는 인터루킨-15 (IL-15)의 존재 하에서 급속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T 세포 수용체 자극은 예를 들어, 약 30 ng/mL의 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT-3, 모노클로날 항-CD3 항체 (미국 뉴저지주 라리탄에 소재하는 오르토-맥네일 (Ortho-McNeil), 또는 미국 캘리포니아주 오번에 소재하는 밀테니 바이오테크 (Miltenyi Biotech)로부터 시판됨) 또는 UHCT-1 (미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 바이오레전드 (BioLegend)로부터 시판됨)을 포함할 수 있다. TIL은 임의로 T 세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에서, 임의로 벡터, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)로부터 발현될 수 있는, 암의, 그의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들)를 비롯한 1종 이상의 항원으로의 시험관내에서 TIL의 추가의 자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원으로는 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원성 부분을 들 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄싱된 암의 동일한 항원(들)으로의 재-자극에 의해 급속하게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어,방사선조사된 자가 림프구로 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종이형 림프구 및 IL-2로 추가로 재-자극될 수 있다.
한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 5000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배양 배지, 약 5000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 5800 mL 내지 약 8700 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 1000 mL 내지 약 2000 mL의 세포 배지, 약 2000 mL 내지 약 3000 mL의 세포 배양 배지, 약 3000 mL 내지 약 4000 mL의 세포 배양 배지, 약 4000 mL 내지 약 5000 mL의 세포 배양 배지, 약 5000 mL 내지 약 6000 mL의 세포 배양 배지, 약 6000 mL 내지 약 7000 mL의 세포 배양 배지, 약 7000 mL 내지 약 8000 mL의 세포 배양 배지, 약 8000 mL 내지 약 9000 mL의 세포 배양 배지, 약 9000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 약 10000 mL 내지 약 15000 mL의 세포 배양 배지, 약 15000 mL 내지 약 20000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 20000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 1종 이하의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어, AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 술페이트, 및 10 μM 겐타미신 술페이트) 세포 배양 배지 (인비트로젠 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스버드)가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명 방법은 유리하게는 배지의 양 및 TIL의 수를 확장시키는 데 요구되는 배지의 유형의 수를 감소시킨다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 3일마다 또는 4일마다 이하의 빈도로 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기에서 세포의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는 데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 간소화한다.
한 실시양태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다. 이러한 실시양태는 세포 집단이 약 5 × 105개 세포/cm2로부터 10 × 106 내지 30 × 106개 세포/cm2로 확장되는 것을 허용한다. 한 실시양태에서, 이 확장은 공급 없이 일어난다. 한 실시양태에서, 이 확장은 배지가 기체-투과성 플라스크에 약 10 cm의 높이로 잔류하는 한, 공급 없이 일어난다. 한 실시양태에서, 이는 공급 없이, 그러나 1종 이상의 시토카인의 첨가와 함께이다. 한 실시양태에서, 시토카인은 시토카인을 배지와 혼합할 임의의 필요 없이 볼루스로서 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치, 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, TIL을 확장시키는 데 사용되었으며, 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0377739 A1호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2014/210036 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2013/0115617 A1호, 국제 공개 제WO 2013/188427 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2011/0136228 A1호, 미국 특허 제8,809,050호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2011/072088 A2호, 미국 특허 출원 공개 제US 2016/0208216 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2012/0244133 A1호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/129201 A1호, 미국 특허 출원 공개 제US 2013/0102075 A1호, 미국 특허 제8,956,860호, 국제 특허 출원 공개 제WO 2013/173835 A1호, 및 미국 특허 출원 공개 제US 2015/0175966 A1호에 기재된 것들을 포함하며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 이러한 프로세스는 또한 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292]에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 10 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 10 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 1억 내지 3억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 450 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 1000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교환 없이 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 100L 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교환 없이 10억 내지 30억개의 TIL을 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 24 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 2 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 8 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 웰 당 2000만 내지 6000만개의 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 G-렉스 6 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브링톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 10 cm2 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서, 각각의 웰은 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교환 후에 웰 당 1억 내지 3억개의 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 비여과된다. 비여과된 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장시키는 데 필요한 절차를 간소화할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 중의 세포 배지는 베타-머캅토에탄올 (BME)이 결여된다.
한 실시양태에서, 포유동물로부터의 종양 조직 샘플을 수득하고; 종양 조직 샘플을 그 안의 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 배양하고; 종양 조직 샘플로부터 TIL을 수득하고; TIL의 수를 aAPC를 사용하여 그 안의 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 약 14일 내지 약 42일, 예를 들어, 약 28일의 지속기간 동안 확장시키는 것을 포함하는 방법의 지속기간.
한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 109 내지 약 1 × 1011개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 109개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 1010개의 aAPC를 사용한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 약 1 × 1011개의 aAPC를 사용한다.
한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:105, 1:110, 1:115, 1:120, 1:125, 1:130, 1:135, 1:140, 1:145, 1:150, 1:155, 1:160, 1:165, 1:170, 1:175, 1:180, 1:185, 1:190, 1:195, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 및 1:500으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:90이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:95이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:100이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:105이다. 바람직한 실시양태에서, TIL 대 aAPC의 비 (TIL:aAPC)는 약 1:110이다.
한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서 TIL 대 aAPC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL 내지의 IL-2를 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, TIL에 대한 급속 확장 프로세스는 이전에 기재된 바와 같이 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) 또는 기체 투과성 배양장치 (G-렉스 플라스크, 미국 미네소타주 뉴 브링톤에 소재하는 윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션으로부터 시판됨)를 사용하여 수행될 수 있다. T-175 플라스크에서의 TIL 급속 확장을 위해, 150 mL의 배지에 현탁된 1 × 106개의 TIL을 각각의 T-175 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL을 aAPC와 함께 1 TIL 대 100 aAPC의 비로 배양할 수 있으며, 세포를 mL 당 3000 IU (국제 단위)의 IL-2 및 ml 당 30 ng의 항-CD3 항체 (예를 들어, OKT-3)로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양하였다. T-175 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 배양할 수 있다. 배지의 반을 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 제5일에 교환할 수 있다. 제7일에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 리터 백에서 합하고, 5％ 인간 AB 혈청을 갖는 300 mL의 AIM V 및 mL 당 3000 IU의 IL-2를 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가하였다. 각각의 백 중의 세포의 수를 매일 또는 2일마다 카운팅하고, 신선한 배지를 첨가하여 세포 카운트를 0.5 내지 2.0 × 106개 세포/mL로 유지하였다.
한 실시양태에서, 100 cm 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 기체 투과성 플라스크 (G-렉스 100, 미국 미네소타주 뉴 브링톤에 소재하는 윌슨 울프 매뉴팩처렁 코포레이션으로부터 시판됨)에서의 TIL 급속 확장을 위해, 5 × 106 또는 10 × 106개의 TIL을 aAPC와 함께 1 대 100의 비로 5％ 인간 AB 혈청, mL 당 3000 IU의 IL-2 및 mL 당 30 ng의 항-CD3 (OKT-3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 배양할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 제거하고, 원심분리 병 내로 정치하고, 1500 rpm (분 당 회전수; 491 × g)으로 10분 동안 원심분리할 수 있다. TIL 펠릿을 5％ 인간 AB 혈청, mL 당 3000 IU의 IL-2로 보충된 150 mL의 신선한 배지로 재-현탁시키고, 원래 G-렉스 100 플라스크에 다시 첨가할 수 있다. TIL이 G-렉스 100 플라스크에서 일련적으로 확장되는 경우, 제7일에 각각의 G-렉스 100 중의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지에 현탁시킬 수 있고, 세포 현탁액을 3개의 G-렉스 100 플라스크를 시딩하는 데 사용될 수 있는 3개의 100 mL 분취액으로 나눌 수 있다. 그 후, 5％ 인간 AB 혈청 및 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. G-렉스 100 플라스크를 37 ℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후에 mL 당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 G-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 세포를 배양의 제14일에 수확할 수 있다.
한 실시양태에서, TIL을 하기와 같이 제조할 수 있다. 2 mm3 종양 단편을 2 mM 글루타민 (미디아테크, 인코포레이티드 (Mediatech, Inc.), 미국 버지나아주 마나사스), 100 U/mL 페니실린 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈 (Invitrogen Life Technologies)), 100 μg/mL 스트렙토마이신 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈), 5％ 열-불활성화된 인간 AB 혈청 (밸리 바이오메디칼, 인코포레이티드 (Valley Biomedical, Inc.), 미국 버지니아주 윈체스터) 및 600 IU/mL rhIL-2 (키론 (Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌)로 보충된 AIM-V 배지 (인비트로젠 라이프 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 구성된 완전 배지 (CM)에서 배양한다. 고형 종양의 효소적 소화를 위해, 종양 시편을 RPMI-1640 내로 다이싱하고, 세척하고, 800 rpm에서 5분 동안 15 내지 22 ℃에서 원심분리하고, 효소적 소화 완충제 (RPMI-1640 중 0.2 mg/mL 콜라게나제 및 30 단위/mL의 DN아제)에 재현탁시키고, 이어서 실온에서 밤새 회전시킨다. 단편으로부터 확립된 TIL을 CM에서 3 내지 4주 동안 성장시키고, 10％ 디메틸술폭시드 (DMSO)를 갖는 열-불활성화된 HAB 혈청에서 신선하게 또는 냉동보존하여 확장시키고, 연구의 시간까지 -180 ℃에서 저장할 수 있다. 복수 집합물로부터 수득된 종양 연관된 림프구 (TAL)를 CM에서 24 웰 플레이트의 3 × 106개 세포/웰로 시딩하였다. TIL 성장을 약 2일마다 저-전력 반전 현미경을 사용하여 조사하였다.
한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 용기에서 확장된다. 기체-투과성 용기는 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2005/0106717 A1호에 기재된 것들을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 방법, 조성물, 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장시키는 데 사용되었다. 한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 백에서 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 주리 세포 확장 시스템 (Xuri Cell Expansion System) W25 (GE 헬스케어 (GE Healthcare))를 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 주리 세포 확장 시스템 W5 (GE 헬스케어)로도 공지된 웨이브 바이오리액터 시스템 (WAVE Bioreactor System)을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 11 L, 약 12 L, 약 13 L, 약 14 L, 약 15 L, 약 16 L, 약 17 L, 약 18 L, 약 19 L, 약 20 L, 약 25 L, 및 약 30 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 50 내지 150 mL, 150 내지 250 mL, 250 내지 350 mL, 350 내지 450 mL, 450 내지 550 mL, 550 내지 650 mL, 650 내지 750 mL, 750 내지 850 mL, 850 내지 950 mL, 및 950 내지 1050 mL로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 1 L 내지 2 L, 2 L 내지 3 L, 3 L 내지 4 L, 4 L 내지 5 L, 5 L 내지 6 L, 6 L 내지 7 L, 7 L 내지 8 L, 8 L 내지 9 L, 9 L 내지 10 L, 10 L 내지 11 L, 11 L 내지 12 L, 12 L 내지 13 L, 13 L 내지 14 L, 14 L 내지 15 L, 15 L 내지 16 L, 16 L 내지 17 L, 17 L 내지 18 L, 18 L 내지 19 L, 및 19 L 내지 20 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 0.5 L 내지 5 L, 5 L 내지 10 L, 10 L 내지 15 L, 15 L 내지 20 L, 20 L 내지 25 L, 및 25 L 내지 30 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 및 약 28일의 로킹 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 30분 내지 1시간, 1시간 내지 12시간, 12시간 내지 1일, 1일 내지 7일, 7일 내지 14일, 14일 내지 21일, 및 21일 내지 28일의 로킹 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2 록 (rock)/분, 약 5 록/분, 약 10 록/분, 약 20 록/분, 약 30 록/분, 및 약 40 록/분의 로킹 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2 록/분 내지 5 록/분, 5 록/분 내지 10 록/분, 10록/분 내지 20 록/분, 20 록/분 내지 30 록/분, 및 30 록/분 내지 40 록/분의 로킹 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2°, 약 3°, 약 4°, 약 5°, 약 6°, 약 7°, 약 8°, 약 9°, 약 10°, 약 11°, 및 약 12°의 로킹 각도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2° 내지 3°, 3° 내지 4°, 4° 내지 5°, 5° 내지 6°, 6° 내지 7°, 7° 내지 8°, 8° 내지 9°, 9° 내지 10°, 10° 내지 11°, 및 11° 내지 12°의 로킹 각도를 이용한다.
한 실시양태에서, aAPC를 사용하여 TIL을 확장시키는 방법은 TIL이 우수한 종양 반응성을 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법이 우수한 종양 반응성을 위한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. TIL의 확장에 대해 기재된 본 발명의 상기 실시양태 중 임의의 것은 또한 T 세포의 확장에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 CD8+ T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 CD4+ T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 키메라 항원 수용체 (CAR-T)로 형질도입된 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 aAPC는 변형된 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 T 세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다. CAR-T 세포는 관련 기술분야에, 예를 들어, 이들의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,070,995호; 제7,446,190호; 제8,399,645호; 제8,916,381호; 및 제9,328,156호에 기재된 바와 같이, CD19를 비롯한 임의의 적합한 항원에 대해 표적화될 수 있다. 변형된 TCR 세포는 관련 기술분야에, 예를 들어, 이들의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,367,804호 및 제7,569,664호에 기재된 바와 같이, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2, 또는 그의 항원성 부분을 비롯한 임의의 적합한 항원에 대해 표적화될 수 있다.
암 및 다른 질환을 치료하는 방법
본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 과다증식성 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 이들은 또한 본원에 및 하기 단락에 기재된 바와 같은 다른 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 TIL, 그의 집단 및 조성물은 질환의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL, 집단 및 조성물은 과다증식성 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 및 신세포 암종, 췌장암, 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 확산 거대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 소포 림프종, 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및 (c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 제1 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 제1 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 10배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계; (c) 제2 세포 배양 배지에서 aAPC의 제2 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고, 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계; (d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다. 한 실시양태에서, 초기 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계; (b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 10배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계; (c) 제2 세포 배양 배지에서 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고, 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계; (d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, aAPC는 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터는 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포는 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 급속 확장은 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 환자가 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리학적 허용될 때까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
지시된 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 예방하고/거나, 관리하는 데 있어서 본원에 기재된 화합물 및 화합물의 조합의 효능은 인간 질환의 치료에 대한 지침을 제공하는 관련 기술분야에 공지된 다양한 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 난소암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92]; 및 [Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12]에 기재되어 있다. 췌장암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 문헌 [Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294]에 기재되어 있다. 유방암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212]에 기재되어 있다. 흑색종에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료의 효능을 측정하는 모델은 예를 들어, 문헌 [Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60]; 및 [Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32]에 기재되어 있다.
화학요법으로의 비-골수절제 림프구고갈
한 실시양태에서, 본 발명은 환자가 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료되는 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 TIL의 집단이 비-골수절제 화학요법으로 예비-치료된 환자를 치료하기 위한 것인, 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 TIL의 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리학적 허용될 때까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2 (알데스류킨, 프로류킨으로서 시판됨)의 정맥내 주입을 받는다.
실험적 발견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전의 림프구고갈이 조절성 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ("시토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 있어서 핵심적 역할을 함을 지시한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 aAPC-확장된 TIL의 도입 전에 환자에 대한 림프구고갈 단계 (때때로 "면역억제 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 이용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈 또는 시클로포스파미드 (마포스파미드로 지칭되는 활성 형태) 및 이들의 조합의 투여를 사용하여 달성된다. 이러한 방법은 문헌 [Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85], [Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681], [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239], 및 [Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL 내지 10 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 2 내지 7일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 4 내지 5일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 4 내지 5일 동안 25 mg/kg/일로 투여된다.
일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/ml 내지 10 μg/ml의 농도로 얻어진다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 얻어진다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 이상 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 정맥내로 (i.v.) 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 2 내지 7일 동안 35 mg/kg/일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 4 내지 5일 동안 250 mg/m2/일로 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 4일 동안 250 mg/m2/일로 정맥내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈은 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 함께 환자에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 25 mg/m2/일로 정맥내로 투여되고, 시클로포스파미드는 250 mg/m2/일로 정맥내로 4일에 걸쳐 투여된다.
한 실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
제약 조성물, 투여량, 및 투약 처방
한 실시양태에서, 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 확장된 TIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 aAPC를 사용하여 확장된 TIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, TIL은 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속되는 단일 주입, 예컨대 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여된다. 다른 적합한 투여 경로로는 복강내, 경막내, 및 림프내 투여를 들 수 있다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 특히 암이 흑색종인 경우, 약 2.3×1010 내지 약 13.7×1010개의 TIL이 투여되며, 평균은 약 7.8×1010개의 TIL이다. 한 실시양태에서, 약 1.2×1010 내지 약 4.3×1010개의 TIL이 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013개이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 수는 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013개이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 예를 들어, 제약 조성물의 100％, 90％, 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 19％, 18％, 17％, 16％, 15％, 14％, 13％, 12％, 11％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％, 0.4％, 0.3％, 0.2％, 0.1％, 0.09％, 0.08％, 0.07％, 0.06％, 0.05％, 0.04％, 0.03％, 0.02％, 0.01％, 0.009％, 0.008％, 0.007％, 0.006％, 0.005％, 0.004％, 0.003％, 0.002％, 0.001％, 0.0009％, 0.0008％, 0.0007％, 0.0006％, 0.0005％, 0.0004％, 0.0003％, 0.0002％ 또는 0.0001％ w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 90％, 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 19.75％, 19.50％, 19.25％, 19％, 18.75％, 18.50％, 18.25％, 18％, 17.75％, 17.50％, 17.25％, 17％, 16.75％, 16.50％, 16.25％, 16％, 15.75％, 15.50％, 15.25％, 15％, 14.75％, 14.50％, 14.25％, 14％, 13.75％, 13.50％, 13.25％, 13％, 12.75％, 12.50％, 12.25％, 12％, 11.75％, 11.50％, 11.25％, 11％, 10.75％, 10.50％, 10.25％, 10％, 9.75％, 9.50％, 9.25％, 9％, 8.75％, 8.50％, 8.25％, 8％, 7.75％, 7.50％, 7.25％, 7％, 6.75％, 6.50％, 6.25％, 6％, 5.75％, 5.50％, 5.25％ 5％, 4.75％, 4.50％, 4.25％, 4％, 3.75％, 3.50％, 3.25％, 3％, 2.75％, 2.50％, 2.25％, 2％, 1.75％, 1.50％, 125％, 1％, 0.5％, 0.4％, 0.3％, 0.2％, 0.1％, 0.09％, 0.08％, 0.07％, 0.06％, 0.05％, 0.04％, 0.03％, 0.02％, 0.01％, 0.009％, 0.008％, 0.007％, 0.006％, 0.005％, 0.004％, 0.003％, 0.002％, 0.001％, 0.0009％, 0.0008％, 0.0007％, 0.0006％, 0.0005％, 0.0004％, 0.0003％, 0.0002％ 또는 0.0001％ w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.0001％ 내지 약 50％, 약 0.001％ 내지 약 40％, 약 0.01％ 내지 약 30％, 약 0.02％ 내지 약 29％, 약 0.03％ 내지 약 28％, 약 0.04％ 내지 약 27％, 약 0.05％ 내지 약 26％, 약 0.06％ 내지 약 25％, 약 0.07％ 내지 약 24％, 약 0.08％ 내지 약 23％, 약 0.09％ 내지 약 22％, 약 0.1％ 내지 약 21％, 약 0.2％ 내지 약 20％, 약 0.3％ 내지 약 19％, 약 0.4％ 내지 약 18％, 약 0.5％ 내지 약 17％, 약 0.6％ 내지 약 16％, 약 0.7％ 내지 약 15％, 약 0.8％ 내지 약 14％, 약 0.9％ 내지 약 12％ 또는 약 1％ 내지 약 10％ w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.001％ 내지 약 10％, 약 0.01％ 내지 약 5％, 약 0.02％ 내지 약 4.5％, 약 0.03％ 내지 약 4％, 약 0.04％ 내지 약 3.5％, 약 0.05％ 내지 약 3％, 약 0.06％ 내지 약 2.5％, 약 0.07％ 내지 약 2％, 약 0.08％ 내지 약 1.5％, 약 0.09％ 내지 약 1％, 약 0.1％ 내지 약 0.9％ w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공되는 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 실시양태의 제약 조성물에 제공되는 TIL은 폭넓은 투여량 범위에 걸쳐 유효하다. 정확한 투여량은 투여의 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료되는 대상체의 성별 및 연령, 치료되는 대상체의 체중, 담당 의사의 선호도 및 경험에 의존할 것이다. TIL의 임상적으로-확립된 투여량은 또한 적절할 경우 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여되는 제약 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료되는 인간 또는 포유동물, 장애 또는 상태의 중증도, 투여의 경로, 활성 제약 성분의 성향 및 처방하는 의사의 재량에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투약은 1년 당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투약은 1개월에 1회, 2주마다 1회, 1주에 1회, 또는 2일마다 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 길게 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 및 9×1013개이다. 일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×1011 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×1012 내지 1×1013개의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
TIL의 유효량은 단일 또는 다중 용량으로, 비내 및 경피 경로, 동맥내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소적으로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 비롯한 유사한 유용성을 갖는 작용제의 투여의 수용되는 투여 방식 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
실시예
본원에 포함된 실시양태를 이하 하기 실시예를 참고로 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본원에 포함된 개시내용은 어떤 식으로도 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에서 제공된 교시사항의 결과로서 명백하게 되는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1 - PBMC 공급자 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장의 가변성
PBMC 공급자 세포의 사용에 의해 얻어진 TIL 확장의 가변성은 환자로부터 수득된 TIL의 동일한 주에 대한 다수의 TIL 확장의 결과를 비교함으로써 입증될 수 있다. 도 1은 방사선조사된 동종이형 PBMC 공급자 세포 (PBMC 공급자)를 사용한 TIL의 급속 확장의 전형적인 결과를 예시한다. M1015T 및 M1016T로 표지된 2가지 TIL 주 (1.3 × 105개의 세포)를 46가지 상이한 방사선조사된 공급자 세포 로트 (1.3 × 107개), IL-2 (3000 IU/mL, 재조합 인간 IL-2 (예를 들어, 알데스류킨 또는 등가물), 셀제닉스, 인코포레이티드, 미국 뉴햄프셔주 포츠마우스) 및 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수한, 밀테니 바이오텍 게엠베하, 독일 버기쉬 글라드바흐)과 함께 T25 플라스크에서 7일 동안 공동-배양하였다. TIL에 대한 배수 확장 값을 제7일에 계산하였다. 도면은 별개의 자극 실험에서의 2가지 TIL 주에 대한 배수 확장의 수를 나타낸다. 각각의 TIL 주에 대해, 46가지 상이한 PBMC 공급자 로트를 시험하였다. 결과는 각각의 TIL 주에 대해 100배 초과에 걸친 범위이며, PBMC 공급자 세포를 사용한 확장 결과의 가변성을 강조한다. 본 발명의 aAPC는 하기 실시예에 나타난 바와 같이, PBMC 공급자에 비해 확장 성능의 감소된 가변성, 뿐만 아니라 다른 이점을 제공한다.
실시예 2 - aAPC 개발을 위한 골수성 세포의 선택
표현형적 특징화를 다양한 골수성-계통 세포주에 대해 수행하여 TIL 확장을 위한 aAPC로의 추가의 변형을 위한 잠재적 후보를 확인하였다. 결과를 표 5에 요약한다. MOLM-14 세포주는 CD64의 내인성 발현을 나타내었으며, 추가의 개발을 위해 선택되었다. EM-3 세포주는 ICOS-L의 내인성 발현의 관찰 (동일한 환자로부터 취했음에도 불구하고, EM-2 세포주에 대해서는 관찰되지 않았음)에 기초하여 선택되었다.
<표 5>
aAPC에 대한 후보 세포주 상에 내인적으로 발현된 공동자극 분자의 요약. CML은 만성 골수성 백혈병을 지칭하고, AML은 급성 골수성 백혈병을 지칭한다. "Pop"은 마커를 발현하는 것으로 관찰된 세포의 집단을 지칭한다 (1/2 pop = 50％).
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실시예 3 - MOLM-14 인공 항원 제시 세포 (aMOLM14 aAPC)의 제조
MOLM-14 세포를 라이프니츠-인스티투트 DSMZ-도이치 삼룽 본 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로부터 얻었다. MOLM-14 기재 aAPC를 개발하기 위해, MOLM-14 세포를 공동자극 분자 CD86 및 4-1BBL (CD137L)로 조작하였다. 인간 CD86 (hCD86) 및 인간 4-1BBL (h4-1BBL) 유전자를 시판되는 PLV430G 내로 클로닝하고, 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 PDONR221 벡터 (인비트로젠/써모 피셔 사이언티픽, 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 공동-형질감염시켰다. 게이트웨이 클로닝 방법을 문헌 [Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589]에 기재된 바와 같이 사용하여, hCD86 및 hCD137L 유전자를 PLV430G 및 PDONR221 벡터 상으로 클로닝하였다. 293T 세포주 (거대 T 항원으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포)를 렌티바이러스 제조에 사용하고, MOLM-14 세포에 형질도입하였다. 형질감염된 세포를 APC-접합된 CD86 및 PE-접합된 CD137L을 사용하여 분류하여 (S3e 세포 분류기, 바이오-래드 (Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘레스) 세포를 단리하고 풍부화하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다.
클로닝에 사용된 벡터 및 그의 부분은 도 2 내지 도 11에 나타내고, 각각의 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열은 표 6에 주어진다. pLV430G 인간 4-1BBL 벡터는 도 2에 예시하고, 폴리머라제 연쇄 반응 생성물 (PCRP) 부분은 도 3에 나타낸다. pLV430G 인간 CD86 벡터는 도 4에 예시하고, PCRP 부분은 도 5에 나타낸다. pDONR221 인간 CD86 공여자 및 인간 4-1BBL 공여자 벡터는 각각 도 6 및 도 7에 나타낸다. 게이트웨이 클로닝 방법을 위한 비어있는 pLV430G 목표 벡터 및 비어있는 pDONR221 공여자 벡터의 도해는 각각 도 8 및 도 9에 나타낸다. 도 10 및 도 11은 렌티바이러스 제조에 사용된 psPAX2 및 pCIGO-VSV.G 헬퍼 플라스미드의 벡터 도해를 예시한다.
<표 6>
aAPC의 형질도입을 위한 렌티바이러스의 제조를 위한 뉴클레오티드 서열.
Figure pct00006
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Figure pct00019
조작된 MOLM-14 aAPC (본원에서 aMOLM14 aAPC로도 지칭됨) 상의 CD86 및 4-1BBL의 발현을 유동 세포측정 (칸토 (Canto) II 유동 세포측정기, 벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니 (Becton, Dickinson, and Co.), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 사용하여 확인하였으며, 결과를 도 12에 나타낸다. aMOLM-14 aAPC를 100 Gy에서 γ-선조사하고, 동결시켰다.
실시예 4 - MOLM-14 인공 항원 제시 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장
조작된 MOLM-14 세포를 100 Gy에서 감마-선조사한 후, TIL과 공동-배양하였다. TIL을 방사선조사된, 조작된 MOLM-14 세포와 함께 1:100 비로 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 함유하는 CM2 배지에서 14일 동안 배양함으로써 REP를 개시하였다. REP 수확 시, TIL 확장 속도, 활성화 및 분화 단계 마커에 대한 표현형, 대사 속도, 세포독성 및 재-급속 확장 프로토콜 (재-REP) 검정을 측정하였다.
결과를 도 13, 도 14, 도 15, 및 도 16에 나타내며, 여기서, 환자 TIL의 2개의 세트에 대한 2개의 확장을 비교한다. CD86/4-1BBL 변형된 MOLM-14 세포 ("TIL + 조작된 MOLM14 + OKT3"으로 표지됨)로의 결과는 PBMC 공급자 ("TIL + 공급자 + OKT3"으로 표지됨)와 필적한다.
제14일에서의 결과를 도 17에서 비교하며, 여기서, 2개의 추가의 환자 TIL로부터의 결과를 나타낸다. 결과는 CD86 및 4-1BBL로 조작된 MOLM-14 세포가 동종이형 공급자 세포와 비교할 경우 급속 확장 프로토콜에서 유사한 TIL 확장을 나타내었음을 지시한다. 그러나, 모 MOLM-14와 함께 배양된 TIL은 확장되지 않았다.
또한, MOLM-14에 대해 확장된 TIL은 TIL 표현형을 유지하였고, BRLA를 사용하여 측정된 바와 같이 P815 세포를 살해하는 효능을 나타내었으며, 이는 실시예 9에 상세하게 기재한다. 간략하게, 루시페린-형질도입된 P815 표적 세포 및 관심의 TIL을 항-CD3과 함께 및 없이 공동-배양하여 TIL의 종양 반응성이 TCR 활성화 (특이적 살해) 또는 비-특이적 살해를 통해서인지 여부를 측정하였다. 4시간의 인큐베이션 후, 루시페린을 웰에 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하였다. 백분율 세포독성 및 백분율 생존을 하기 식을 사용하여 계산하였다: ％ 생존 = (실험적 생존-최소)/ (최대 신호-최소 신호) × 100 또는 ％ 세포독성 = 100 - (％ 생존).
도 18에서, TIL 대 MOLM-14 aAPC의 낮은 비로 수행된 확장의 결과를 PBMC 공급자로의 확장의 결과와 비교하여 나타낸다. TIL (2 × 104개)을 상이한 TIL 대 aAPC 또는 PBMC 비 (1:10, 1:30, 및 1:100, 각각 "10", "30", 및 "100"으로 나타내어짐)로, 각각 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 갖는 모 MOLM-14 ("MOLM14") 세포, CD86 및 4-1BBL을 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포 ("aMOLM14"), 또는 PBMC 공급자 ("PBMC+")와 함께 24-웰 G-렉스 플레이트에서 배양하였다. 대조군을 단지 OKT-3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)를 사용하여 수행하였다 ("PBMC-"). 각각의 조건을 삼중으로 배양하였다. 배양물을 제4일 및 제7일에 신선한 배지 및 IL-2로 공급하였다. 생존성 세포를 제7일에 카운팅하였다. 도 18은 제11일에 카운팅된 생존성 세포 수의 평균 더하기 표준 편차 (SD)를 나타내며, p-값은 스튜던트 t-검정에 의해 계산된다. 추가의 대조군 실험을 TIL 단독, PBMC 단독, 및 aMOLM-14 세포 단독을 사용하여 수행하였으며, 이들 모두는 비검출가능한 세포 수를 초래하였다 (데이터는 나타내지 않음). 결과는 OKT-3 및 IL-2를 갖는 1:100 (TIL:aMOLM14)의 비가 OKT-3 및 IL-2를 갖는 PBMC 공급자와 비교할 경우 유사한 확장을 생성함을 나타낸다 (p = 0.0598).
도 19에서, TIL 대 MOLM-14 aAPC의 보다 높은 비로 수행되고, 그렇지 않다면 도 18에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행된 확장의 결과를 PBMC 공급자로의 확장의 결과와 비교하여 나타낸다. 1:300의 비에서, OKT-3 및 IL-2를 갖는 CD86/4-1BBL 변형된 MOLM-14 aAPC는 OKT-3 및 IL-2를 갖는 PBMC 공급자를 유의하게 능가한다. 이들 결과는 도 20 및 도 21에 나타낸 반복 실험에서 상이한 TIL 배치를 사용하여 확인되었다. 특히, 도 21에서 보여지는 바와 같이, 1:200의 TIL 대 aMOLM14 비는 동일한 조건 하에서 PBMC 공급자에 비해 향상된 TIL 확장을 나타낸다. 이들 결과는 aMOLM14 aAPC가 특히 1:200 내지 1:300의 TIL:aMOLM14 비를 사용한 경우 PBMC보다 TIL 수를 확장시키는 관점에서 예상치 않게 우수함을 확인시켜 준다.
도 22 및 도 23에서, aMOLM14 또는 PBMC로 확장된 TIL을 유동 세포측정 분석에 의해 비교하여 TIL이 유사한 표현형을 나타내었으며, 환자 내로의 재주입 시 유사하게 수행할 것으로 예상될 것임을 확인하였다. 간략하게, TIL을 먼저 L/D 아쿠아로 염색하여 생존성을 측정하였다. 다음으로, 세포를 TCR α/β PE-Cy7, CD4 FITC, CD8 PB, CD56 APC, CD28PE, CD27 APC-C7, 및 CD57-PerCP-Cy5.5로 표면 염색하였다. 10,000 내지 100,000개의 세포를 전방 광 산란 (FSC)/측방 광 산란 (SSC)에 따라 칸토 II 유동 세포측정기 (벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 게이팅함으로써 표현형 분석을 수행하였다. 데이터를 시토뱅크 (Cytobank) 소프트웨어에 의해 분석하여 선버스트 도해 및 SPADE (밀도 정규화된 사건의 스패닝 트리 수열 (Spanning Tree Progression of Density Normalized Event)) 분석을 생성하였다. 게이트를 형광 마이너스 원 (FMO) 대조군에 기초하여 설정하였다. aMOLM14에 대해 확장된 TIL은 PBMC 공급자와 비교할 경우 CD8+ TIL을 증가시킨다. 이론에 구애되지는 않지만, 이 향상된 CD8+ TIL 백분율은 MOLM14에 대해 조작된 4-1BBL의 존재에 기인할 수 있다. CD28, CD57, 및 CD27 분화 마커의 발현의 차이는 없다. 추가의 유동 세포측정 데이터는 도 24에 나타내어지고, 살아있는, TCR α/β+, CD4+ 또는 CD8+ TIL 상에 게이팅된 기억 하위세트 (CD45RA+/-, CCR7+/-)를 나타내는 유동 세포측정 등고선 플롯을 나타내며, 이는 PBMC 공급자로 얻어진 기억 하위세트가 aMOLM14 aAPC에 의해 복제됨을 지시한다.
CD3+ 세포를 사용하여 aMOLM14 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4 및 CD8 SPADE 트리를 도 25 및 도 26에 나타낸다. 색상 구배는 LAG3, TIL3, PD1 및 CD137 또는 CD69, CD154, KLRG1 및 TIGIT의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다. 이론에 구애되지는 않지만, 결과는 aMOLM14에 대해 확장된 TIL의 2개의 배치가 확성화를 겪었지만, aMOLM14 aAPC 및 PBMC 공급자 사이에 MFI의 차이는 없었음을 나타내며, 이는 aMOLM14 aAPC가 PBMC 공급자로 얻어진 TIL 표현형적 결과를 효과적으로 복제함을 지시한다.
aMOLM14 또는 PBMC에 대해 확장된 TIL을 또한 대사 프로파일에 대해 분석하였다. 방사선조사된 PBMC 공급자 또는 aMOLM14 aAPC로의 확장 후의 TIL의 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포외 산성화 속도 (ECAR)를 이중 미토콘드리아-당분해 스트레스 시험을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 세포를 pH 7.4에서 10 mM 글루코스, 1 mM 피루브산나트륨, 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 검정 배지 (XF 검정 배지 (XF Assay Medium), 애질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라)에서 세척한 후, 1 × 105개의 생존성 세포를 접착체-코팅된 (셀-탁 (Cell-Tak)™ 코닝) XFp 세포 배양 마이크로플레이트 상으로 플레이팅하였다. 플레이트를 스핀하여 세포를 플레이트에 접착시킨 후, 세포 대사의 분석 전에 37 ℃에서 습화된, 비-CO2 인큐베이터에서 평형화시켰다. 미토콘드리아 및 당분해 스트레스 시험 실험을 하기 화합물을 세포의 미토콘드리아 및 당분해 호흡의 동시 분석을 위한 특정된 간격에서 순차적으로 주사하는 씨홀스 XFp 애널라이저 (Seahorse XFp Analyzer) (애질런트 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 수행하였다: 1 μM 올리고마이신; 0.5 μM FCCP; 50 mM 2-데옥시글루코스; 및 0.5 μM 각각의 로테논 및 안티마이신 A. 결과를 WAVE v2.3.0 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지즈, 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 및 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) v6.07 그래핑 소프트웨어를 사용하여 분석하였고, 도 27 및 도 28에 나타내며, 여기서, 점은 삼중으로 측정된 평균 ± SEM을 나타낸다. aMOLM14 aAPC 및 PBMC 공급자와 함께 성장된 TIL 둘 다는 유사한 산화적 인산화 및 당분해 거동을 나타낸다. 이 데이터는 aMOLM14가 PBMC 공급자와 비교할 경우 TIL의 대사 프로그래밍을 변경하지 않음을 시사한다.
실시예 5 - EM-3 인공 항원 제시 세포 (aEM3 aAPC)의 제조
EM-3 세포를 크리에이티브 바이오어레이, 인코포레이티드 (Creative Bioarray, Inc.) (미국 뉴욕주 셜리)로부터 얻었다. EM-3 기재 인공 APC를 개발하기 위해, EM-3 세포주를 CD86, 4-1BBL, 및 IgG Fc 영역에 대한 항체 (클론 7C12 또는 클론 8B3)로 조작하였다. 인간 CD86 및 인간 4-1BBL/CD137 유전자를 시판되는 PLV430G 내로 클로닝하고, 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 PDONR221 벡터 (인비트로젠)와 공동-형질감염시켰다. 게이트웨이 클로닝 방법을 문헌 [Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589]에 기재된 바와 같이 사용하여, hCD86 및 hCD137L 유전자를 PLV430G 및 PDONR221 벡터 상으로 클로닝하였다. 293T 세포주를 렌티바이러스 제조에 사용하고, EM-3 세포주에 대해 형질도입하였다. 형질감염된 세포를 APC-접합된 CD86 및 PE-접합된 CD137L을 사용하여 분류하여 (S3e 세포 분류기, 바이오래드, 미국 캘리포니아주 허큘레스) 세포를 단리하고 풍부화하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다. 7C12 및 8B3으로 지정된 단일-쇄 Fv (scFv) 항체 클론을 마우스 IgG1, IgG2a 및 IgG2b (비바 바이오테크 리미티드 (Viva Biotech Ltd.), 미국 일리노이주 시카고)의 Fc에 대해 생성하였다. 이들 scFv 클론의 아미노산 서열은 표 7 (서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28)에 주어진다. 생성된 scFv 클론을 OKT-3에 대한 Fc 결합 효율에 대해 스크리닝하고, 공동-리포터로서 eGFP를 함유하는 pLV4301G에 대해 조작하여 렌티바이러스를 제조하였다. 293T 세포주를 패키징 및 렌티바이러스 제조에 사용하였다. 조작된 EM-3 (CD86/CD137L) 세포를 렌티바이러스 시스템을 사용하여 형질도입하고, eGFP를 사용하여 분류하였다. EM37C12CD86CD137L 및 EM38B3CD86CD137L을 유동 세포측정에 의해 각각의 형질도입된 분자의 일관된 발현에 대해 규칙적으로 평가하였다.
<표 7>
scFv 클론 7C12 및 8B3의 아미노산 서열.
Figure pct00020
또한 aMOLM14 aAPC와 함께 사용하기 위해 순응될 수 있는 aEM3 aAPC의 제조를 위한 비-제한적 프로토콜을 하기 단락에 설명한다.
관심의 플라스미드의 분자 클로닝은 하기와 같이 수행될 수 있다. DONR 벡터를 생성하기 위해, 하기 칵테일을 사용할 수 있다: B 부위 플랭킹된 PCR 생성물 또는 목표 벡터 (예를 들어, 게이트웨이-순응된 렌티벡터) 50 내지 100 μg; DONR 벡터 (예를 들어, pDONR222) 50 내지 100 μg; BR 클로나제 II (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies)) 1 μL; 및 TE 완충제 (1 mM 트리스 (Tris), 0.1 mM EDTA, pH 8.0, 5 μL의 부피를 가져오는 충분량). 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 열 충격 방법 또는 전기천공에 의해 박테리아 형질전환을 수행한다. 목표 벡터를 생성하기 위해, 하기 칵테일을 사용할 수 있다: 재조합된 pDONR 벡터 (예를 들어, pDON222-유전자X) 50 내지 100 μg, 목표 벡터 (예를 들어, 게이트웨이 순응된 렌티벡터) 50 내지 100 μg, LR 클로나제 II (라이프 테크놀로지즈) 1 μL, 및 TE 완충제 (1 mM 트리스, 0.1 mM EDTA, pH 8.0, 5 μL의 부피를 가져오는 충분량). 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 화학 적격 형질전환/열 충격 방법에 의해 박테리아 형질전환을 수행한다.
형질전환 및 클로닝된 플라스미드의 선택은 하기와 같이 수행될 수 있다. 화학 적격 형질전환 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 선택을 위한 항생제를 갖는 영양 한천 플레이트 (LB-레녹스 (Lennox) 또는 YT)를 제조한다. 회수 배지 (Recovery Medium) (미국 위스콘신주 미들톤에 소재하는 루시젠 (Lucigen)에 의해 공급됨)는 실온에서 용이하게 이용가능하다. 임의로, 멸균 배양 튜브를 얼음 상에서 냉각시킬 수 있다 (예를 들어, 17 mm × 100 mm 튜브 (14 mL 튜브), 각각의 형질전환 반응에 대해 1개의 튜브). -80 ℃ 냉동고로부터 이. 클로니 (E. cloni) 세포 (루시젠)를 제거하고, 젖은 얼음 상에서 완전히 해동시킨다 (5 내지 15분). 임의로, 40 μL의 이. 클로니 세포를 냉각된 배양 튜브에 첨가한다. 1 내지 4 μL의 DNA 샘플을 40 μL의 세포에 첨가한다. 손가락으로 플리크한다 (공기 방울을 도입하고, 세포를 가온할 수 있는 상하로 피펫팅하여 혼합하지 않음). 세포/DNA 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 배양 튜브를 42 ℃ 수조에 45초 동안 정치함으로써 세포를 열 충격시킨다. 1.7 mL 튜브 또는 배양 튜브를 얼음에 2분 동안 복귀시킨다. 350 μL 실온 회수 배지를 세포에 또는 960 μL의 실온 회수 배지를 배양 튜브 중의 세포에 첨가한다. 튜브를 진탕 인큐베이터에 250 rpm에서 1시간 동안 37 ℃에서 정치한다. 100％ 이하의 형질전환 혼합물을 적절한 항생제를 함유하는 LB-레녹스 또는 YT 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 플레이팅 부피는 DNA에 따라 최적화될 필요가 있을 수 있다. 플레이트를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한다. 형질전환된 클론을 임의의 풍부 배양 배지 (예를 들어, LB 또는 TB)에서 추가로 성장시킬 수 있다.
미니프렙 (Miniprep) (퀴아젠, 인코포레이티드 (Qiagen, Inc.), 미국 캘리포니아주 발렌시아)을 위한 콜로니는 하기와 같이 성장시킬 수 있다. 콜로니가 DNA 조작의 회수된 형질전환 반응 (예를 들어 LR 반응)을 플레이팅하는 것으로부터 형성된 후, 1 mL 바람직한 TB/항생제를 천공된 캡을 갖는 바람직한 수의 2 mL 에펜도르프 (Eppendorf) 마이크로튜브 내로 첨가한다. 바람직한 수의 콜로니를 ART LTS 20 μL 소프트 피펫 팁 (VWR 89031-352) 또는 10 μL 덴빌 (Denville) 팁을 사용하여 피킹한다. 팁을 천공된 캡을 갖는 2 mL 에펜도르프 마이크로튜브에 정치한다. 팁을 그것이 튜브에 적합하도록 커팅하고, 캡을 닫고, 튜브를 진탕기 (VWR 브랜드 15 mL 튜브를 갖는 자주색 15 mL 튜브 홀더) 상에 정치한다. 225 rpm/37 ℃에서 밤새 (16시간 이하 동안) 진탕한다. 밤새 인큐베이션 후, 각각의 팁을 그 안에 멸균수를 갖는 덴빌로부터의 클레이브팩 (ClavePak) 96 플레이트 중의 1 mL 튜브에 정치한다 (플라스미드를 스크리닝하고, 선택한 후에, 박테리아 스톡 생산을 만들기 위한 팁을 저장하기 위해). 미니프렙을 퀴아젠 미니 (Qiagen Mini) 프렙 키트 프로토콜 (퀴아젠, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 발렌시아)에 따라 수행한다. 플라스미드가 용리되면, 제한 소화를 수행하여 올바른 클론을 선택한다. 플라스미드를 선택한 후, 동일한 플라스미드 클론으로부터 저장된 팁을 사용하여 박테리아 스톡을 만드는 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 (E. coli)를 성장시킨다.
렌티바이러스 제조는 하기와 같이 수행될 수 있다. 하기 배지 조성물을 제조한다: 500 mL DMEM/F12 (시그마 (Sigma)); 25 mL FBS 열 불활성화된 (Heat Inactivated) (HI) (하이클론 (Hyclone)); 10 mM 헤페스 (라이프 테크놀로지즈); 1X 프리모신 (Primocin) (인비보젠 (Invivogen)); 1X 플라스모신 (Plasmocin) (인비보젠); 및 1X 2-머캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈). 90％ 융합성 293T 세포를 함유하는 T75 플라스크 (써모 피셔 사이언티픽)를 수확한다. 배지를 흡인한다. 10 ml PBS를 첨가하고, 부드럽게 세정하고, 흡인 제거한다. 2 mL 트립LE 익스프레스 (TrypLE Express) (라이프 테크놀로지즈)를 첨가하고, 이를 세포 층 상에 고르게 분포시키고, 37 ℃에서 3 내지 5분 동안 놓아 둔다 (세포 배양 인큐베이터). 10 mL 배지를 첨가하고, 세포를 상하로 피펫팅함으로써 분산시킨다. 다수의 플라스크가 있는 경우 합한다. 세포를 카운팅한다. 혈구계를 사용하여 농도를 측정하는 경우, 세포/mL = (카운팅된 세포의 수 × 희석율 × 104). T75 플라스크 내로 다시 분할하기 위해, 세포가 충분히 융합하는 데 필요한 시간을 측정하고, 그에 따라 희석한다. (세포는 16 내지 18시간마다 배가되며, 따라서 3일 = 1/27 희석). 일반적으로, 융합도가 2×105개 세포/cm2인 경우, 1일 당 2.5의 증배율이 사용될 수 있다. 부피를 배지의 25 mL까지 가져온다. 스톡의 적정을 위해 플레이팅하기 위해, 검정의 각각의 웰은 0.4 mL의 배지에서 5×104개의 세포를 요구한다. 293T 세포를 배지에서 2×104개 세포/mL로 조정한다. 24 웰 플레이트에 웰 당 1 mL를 플레이팅한다. 예를 들어, 월요일에 플레이팅된 세포는 화요일에 감염되고, 금요일에 유동 세포측정기 상에 구동될 수 있고, 목요일에 플레이팅된 세포는 금요일에 감염되고, 월요일에 유동 세포측정기 상에 구동된다. 패키징 형질감염을 위해 플레이팅하기 위해, T75 플라스크를 형질감염 1일 전에 6.8×106개의 세포로, 또는 형질감염의 아침에 1.7×106개의 세포로 시딩한다. (형질감염의 일에 시딩하는 것은 형질감염 효율의 변이를 감소시킬 수 있음). 플라스크 중의 부피를 배지로 25 mL까지 가져온다. 예를 들어, 월요일에 셋업된 플라스크는 화요일에 형질감염되고, 바이러스는 목요일 및 금요일에 수집된다. 일부의 경우 (예를 들어, 고 적정 구축물), 제2 수집은 생략될 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 패키징하기 위해, 각각의 T75 플라스크 형질감염은 2 μg 바쿨로 (Baculo) p35 플라스미드 (임의적; 단지 사멸 유전자를 패키징하는 경우에만 필요함), 2 μg VSV.G env 플라스미드 (예를 들어, pMD2.G 또는 PCIGO VSV-G); 4.7 μg Gag/폴리머라제 플라스미드 (예를 들어, psPAX2 또는 pCMV-델타R8.91), 및 2.3 μg의 상기 기재된 렌티바이러스 벡터를 요구한다. 모든 샘플에 필요한 VSV 및 R8.2/9.1 (+/-바쿨로) 플라스미드의 양을 측정한다 (많은 샘플을 제조하는 경우, 이들 DNA의 혼합물을 제조함). 각각의 T75 형질감염은 2 mL 옵티 (Opti)-MEM 배지 (써모 피셔 사이언티픽) 중 90 μL 리포펙타민 (LipofectAmine) 2000 (써모 피셔 사이언티픽)을 요구한다. 모든 샘플에 대해 충분한 옵티-Mem 및 리포펙타민 2000을 함유하는 믹스를 제조한다. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 놓아두고, 튜브 A로서 표지한다. 각각의 형질감염을 위해, 패키징 DNA 및 특이적 렌티바이러스 벡터 DNA를 500 μL 실온 옵티-MEM 배지에 마이크로튜브에 첨가하고, 혼합하고, B로서 표지한다. 튜브 B로부터의 500 μL의 DNA를 튜브 A 중의 2 mL의 리포펙타민 2000 믹스에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션한다. 배지를 패키징 플라스크로부터 흡인한다. 2.5 mL의 DNA/리포펙타민 복합체를 5 mL 옵티-MEM 배지에 첨가하고, 세포에 첨가한다 (293T 세포는 단지 반 부착성이기 때문에, 세포 상에 직접적으로 피펫팅하지 않음). 플레이트를 건조를 회피하기 위해 작은 군에서 프로세싱한다. 밤새 인큐베이션하고, 다음날 아침에 배지를 교환한다. 배지 교환의 24시간 후에 상청액을 수집한다. 상청액은 형질감염 후 48시간에 단일 수집으로, 또는 형질감염 후 48 및 72시간에 2개의 수집으로서 수확될 수 있다 (이 경우, 수확물은 풀링함). 이중 수집이 바람직한 경우, 제1일에 상청액을 피펫에 의해 수집하고, 20 mL의 신선한 배지로 대체한다. 플라스크 건조를 회피하기 위해, 한 번에 단지 5개의 플라스크로 작업한다. 수집된 상청액을 다음날 풀링할 때까지 4 ℃에서 유지한다. 상청액을 다음날 다시 냉각시키고, 적절할 경우 풀링한다. 상청액을 2000 rpm에서 5분 동안 스핀하여 임의의 오염성 293T 세포를 침전시킨다. 수확된 상청액을 프리-필터 디스크를 함유하는 0.45 μm 또는 0.8 μm 필터 유닛을 통해 여과한다. 여과 속도가 상대적으로 빠르도록 큰 충분한 여과 유닛을 사용한다. 농축할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 저장한다.
바이러스를 -80 ℃에서의 장기 저장을 위해 PEG-잇 방법 (시스템 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 (System Biosciences, Inc.), 미국 94303 캘리포니아주 팔로 알토)을 사용하여 농축시킬 수 있다. 상청액을 형질감염 플레이트로부터 수집한다. 상청액 중의 세포 데브리스를 스핀 다운시킨다. 상청액을 또한 여과하여 임의의 패키징 세포를 완전히 제거할 수 있다. 상청액의 부피의 1/4과 동등한 PEG-잇 용액의 양을 상청액에 첨가한다. 현탁액을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한다. 3500 rpm (1500 g)에서 4 ℃에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 3500 rpm에서 4 ℃에서 5분 동안 원심분리한다. 남아있는 상청액을 제거한다. 바이러스를 바람직한 양의 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 재현탁시키고, 분취액을 -80 ℃에서 동결시킨다.
렌티바이러스를 사용한 세포주의 형질도입은 하기와 같이 수행될 수 있다. 세포를 24 웰 플레이트에 웰 당 1×106 현탁액 세포 (형질도입 당 1 웰) 또는 24 웰 플레이트에서 부착 세포에 대해 50％ 융합도 (형질도입 당 1 웰)로 형질도입되도록 조정한다. 현탁된 세포에 대해, 세포의 농도를 1×107개 세포/mL로 조정하고, 24 웰 플레이트에 웰 당 100 μL를 플레이팅한다 (형질도입 당 1 웰). 부착 세포에 대해, 세포/cm2에 기초하여 형질도입의 일에 50％ 융합도를 달성하도록 플레이팅한다 (예를 들어, 293T 세포에 대해, 융합도 = 2×105개 세포/cm2). 웰 당 형질도입의 총 부피는 3 내지 10 μg/mL 폴리브렌 (Polybrene) (헥사디메트린 브로마이드, 시그마-알드리치 컴퍼니 (Sigma-Aldrich Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 갖는 대략 500 μL이어야 한다. 첨가된 농축된 바이러스의 양은 바람직한 MOI (감염의 다중도)에 의존할 것이다. 전형적인 MOI는 10:1이지만, 이는 세포 유형에 따라 다양할 수 있다. 형질감염 웰은 1×106개의 현탁액 세포 또는 50％ 융합성 세포를 함유하는 100 μL의 표준 배지를 함유해야 한다. 10:1의 MOI를 위해 (예를 들어, 바이러스 활성은 1×108 IU/mL이고, 표적은 1×106개의 세포를 감염시키는 경우, 1×107개의 비리온 또는 100 μL의 바이러스가 필요함). 표준 배지를 500 μL로 첨가한다. 폴리브렌을 3 μg/mL (1차 세포) 내지 10 μg/mL (종양 세포주)로 첨가한다. 플레이트(들)를 1800 rpm에서 1.5 내지 2시간 동안 30 ℃에서 스핀시킨다. 플레이트(들)를 37 ℃/5％ CO2에서 조직 배양 인큐베이터를 사용하여 5시간 동안 내지 밤새 인큐베이션한다. 배지를 교환한다. 형질도입의 72시간 후, 충분한 세포가 이용가능한 경우, 유동 세포측정 분석을 수행하여 형질도입 효율을 시험한다.
aAPC의 분류는 하기와 같이 수행될 수 있다. 세포를 상기 기재된 배지에서 세포 카운트가 최소 1000만 내지 2000만에 도달할 때까지 배양한다. 각각의 조건에 대해 1×106개의 세포를 취하고, 형질도입된 단백질에 대한 항체로 염색한다. 세포를 세척하고, 유동 세포측정에 의해 분석하여 형질도입의 안정성을 시험한다. 관심의 단백질의 발현이 분석되고 확인되면, 세포의 나머지를 분류를 위해 준비한다. 세포를 S3 분류기에서 관심의 마커 상에 게이팅함으로써 분류한다. 분류된 세포를 상기 언급된 배지를 사용하여 배양한다. 바이알을 동결시키기 전에, 관심의 단백질 발현의 안정성을 시험한다. 회수 세포 배양 동결 배지 (인비트로젠)를 사용하여 동일한 세포의 세포 뱅크를 제조한다. 세포를 각각의 형질도입 및 분류 절차 후에 뱅킹할 수 있다.
7C12 및 8B3 scFv 클론 (서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30) 및 그들의 렌티바이러스 벡터에 대한 뉴클레오티드 서열 정보는 표 8에 주어진다. pLV4301G 7C12 scFv mIgG hCD8 플래그 벡터의 생성에 사용된 서열은 서열식별번호: 31 내지 서열식별번호: 34로서 제공되며, 도 29 내지 도 32에 나타낸다. pLV4301G 8B3 scFv mIgG hCD8 플래그 벡터의 생성에 사용된 서열은 서열식별번호: 35 내지 서열식별번호: 38로서 제공되며, 도 33 내지 도 36에 나타낸다.
<표 8>
aAPC의 형질도입을 위한 렌티바이러스의 제조를 위한 뉴클레오티드 서열.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
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Figure pct00034
Figure pct00035
본원에 기재된 실험에 사용된 조작된 EM-3 aAPC (본원에서 aEM3 aAPC로도 지칭됨)의 제조에서, CD86 및 4-1BBL의 발현을 유동 세포측정 (칸토 II 유동 세포측정기, 벡톤, 디킨슨, 앤드 컴퍼니, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 사용하여 확인하였으며, 결과를 도 37에 나타낸다. aEM3 aAPC를 100 Gy에서 γ선-조사하고, 동결시켰다.
상기 기재된 바와 같이, CD86, IgG Fc 영역에 대한 항체, 및 4-1BBL (또는 임의로 4-1BBL 없이)을 발현하도록 이전에 형질도입된 aEM-3 세포를 유사한 렌티바이러스 형질도입 접근법을 사용하여 공동-자극 인간 OX-40L로 유전자 조작하였다. 인간 OX-40L을 함유하는 렌티바이러스를 생성하기 위해, VSV-G 외피 플라스미드 (pCIGO-VSV.G)와 함께 p렌티-C-Myc-DDK OX40L (PS100064, 오리진 (Origene), 서열식별번호: 39, 도 90) 벡터를 폴리제트 (PolyJet) (시그나젠 래버러토리즈 (Signagen Laboratories), 미국 매릴랜드주 록빌)를 사용하여 피닉스 (Phoenix)-GP (ATCC CRL-3215) 세포주 내로 공동-형질감염시켰다. 상청액을 60시간 후에 수확하고, 울트라셀 (Ultracel)-100 막을 갖는 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 유닛 (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)을 사용하여 농축시켰다. 그 후, aEM-3 세포를 농축된 렌티바이러스로 감염시키고, 5일 동안 추가로 확장시켰다. 세포를 PE-접합된 항-인간 OX40L, 브릴란트 바이올렛 (Brilliant Violet) 421-접합된 항-인간 CD137L (4-1BBL이 사전 aEM-3 세포에 포함되는 경우), 및 PE/Cy7 접합된 항-인간 CD86으로 염색하고, GFP, OX40L, CD137L (포함되는 경우), 및 CD86의 발현에 기초하여 S3e 세포 분류기 (바이오-래드, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 분류하였다. 분류된 세포의 순도를 유동 세포측정을 사용하여 추가로 확인하였다. 풍부화된 세포를 유동 세포측정에 의해 순도에 대해 확인하였다.
실시예 6 - EM-3 인공 항원 제시 세포를 사용한 종양 침윤 림프구의 확장
TIL을 확장시키는 EM-3 aAPC (aEM3)의 능력을 시험하기 위한 실험을 수행하였다. TIL을 aEM3 (7C12 또는 8B3)과 함께 1:100 비로 OKT-3 (30 mg/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 세포를 제11일 및 제14일에 카운팅하였다. 결과를 도 38 및 도 39에서 TIL의 2개의 배치에 대해 플롯팅한다. 또한, TIL을 aEM3 또는 PBMC 공급자와 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 OKT-3 (30 mg/mL)과 함께 또는 없이 공동-배양하였다. 결과를 도 40에 플롯팅하며, 여기서, 막대 그래프는 제11일에 측정된 세포 수를 나타낸다.
도 41은 상이한 TIL:aAPC 비에서의 EM-3 aAPC (aEM3)로의 TIL 확장의 결과를 예시한다. 결과는 aEM3 aAPC가 특히 1:200의 비에서 보다 긴 배양 시간 (14일)에서, PBMC에 필적하게, 및 일부의 경우 그보다 더 양호하게 수행함을 나타낸다.
도 42는 PBMC 공급자에 비해 EM-3 aAPC (aEM3)로의 TIL 확장으로부터의 세포 카운트의 낮은 가변성을 예시한다. TIL (2 × 104개)을 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aEM3 (삼중으로)과 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였다. 그래프는 제14일에 카운팅된 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다. 도 43은 EM-3 aAPC 및 MOLM-14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 비교하여, TIL (2 × 104개)에 비해 aEM3 및 aMOLM14 둘 다에 대한 세포 카운트의 가변성이 G-렉스 24 웰 플레이트에서 5가지 상이한 PBMC 공급자 로트 또는 aMOLM14 (삼중으로) 또는 aEM3 (또한 삼중으로)과 함께 1:100 비로 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하였음을 예시한다. 생존성 세포를 제14일에 카운팅하였으며, 그래프는 95％ 신뢰 구간을 갖는 생존성 세포 수 (평균)를 나타낸다. aEM3 및 aMOLM14 결과는 훨씬 더 큰 일관성이 종래 기술에서 선호되는 PBMC 공급자 접근법에 비해 둘 다의 aAPC로 얻어질 수 있음을 지시한다.
aEM3 또는 PBMC 공급자에 대해 확장된 TIL을 4개의 상이한 패널 (분화 패널 1 및 2, T 세포 활성화 패널 1 및 2)을 사용한 유동 세포측정 분석에 사용하였다. 간략하게, TIL을 먼저 L/D 아쿠아로 염색하여 생존성을 측정하였다. 다음으로, 세포를 분화 패널 1에 대해 TCR α/β PE-Cy7, CD4 FITC, CD8 PB, CD56 APC, CD28 PE, CD27 APC-Cy7, 및 CD57-PerCP-Cy5.5; 분화 패널 2에 대해 CD45RA PE-Cy7, CD8a PerCP/Cy5, CCR7 PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, CD38 APC, 및 HLA-DR PB; T 세포 활성화 패널 1에 대해 CD137 PE-Cy7, CD8a PerCP-Cy5.5, Lag3 PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, PD1 APC, 및 Tim-3 BV421; 또는 T 세포 활성화 패널 2에 대해 CD69 PE-Cy7, CD8a PerCP/Cy5.5, TIGIT PE, CD4 FITC, CD3 APC-Cy7, KLRG1 ALEXA 647, 및 CD154 BV421로 표면 염색하였다. 10,000 내지 100,000개의 세포를 칸토 II 유동 세포측정기를 사용하여 FSC/SSC에 따라 게이팅함으로써 표현형 분석을 수행하였다. 데이터를 시토뱅크 소프트웨어 (시토뱅크, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 분석하여 선버스트 도해 및 SPADE (밀도-정규화된 사건의 스패닝-트리 수열 분석) 플롯을 생성하였다. 게이트를 형광 마이너스 원 (FMO) 대조군에 기초하여 설정하였다. SPADE 플롯을 세포의 군으로 생성하고, 표면 마커의 발현 수준에 기초하여 관련된 노드의 형태로 특징화하였다. CD4+ 및 CD8+ TIL 하위세트를 CD3+ 게이팅에 기초하여 측정하고, 트리를 생성하였다. 선버스트 시각화를 도 44 및 도 45에 나타낸다. 도 44는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 TIL이 PBMC 공급자에 대해 확장된 동일한 TIL과 비교할 경우 CD8+ 표현형을 유지하였음을 나타낸다. 도 45는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 상이한 환자로부터의 TIL의 제2 배치의 결과를 나타내며, 여기서, CD8+ 세포의 명확한 증가 (65.6％)가 PBMC 공급자를 사용한 확장으로부터의 결과 (25％)에 비해 나타난다.
CD3+ 세포를 사용하여 aEM3 aAPC 또는 PBMC 공급자로 확장된 TIL의 CD4 및 CD8 SPADE 트리를 도 46 및 도 47에 나타낸다. 색상 구배는 LAG3, TIL3, PD1 및 CD137 또는 CD69, CD154, KLRG1 및 TIGIT의 평균 형광 강도 (MFI)에 비례한다. 이론에 구애되지는 않지만, 결과는 aEM3 aAPC로 확장된 TIL이 활성화를 겪었지만, aEM3 aAPC 및 PBMC 공급자 사이에 MFI의 차이가 없었음을 나타내며, 이는 aEM3 aAPC가 PBMC 공급자로 얻어진 표현형적 결과를 효과적으로 복제함을 지시한다.
여분 호흡 능력 (SRC) 및 당분해 예비력을 또한 PBMC 공급자에 비해 aEM3 aAPC로 확장된 TIL에 대해 평가하였으며, 결과를 도 48 및 도 49에 나타낸다. 씨홀스 XF 세포 미토 스트레스 시험은 미토콘드리아에서의 전자 수송 쇄의 성분을 표적화하는 호흡의 조정인자를 사용하여, 세포의 산소 소비 속도 (OCR)를 직접적으로 측정함으로써 미토콘드리아 기능을 측정한다. 시험 화합물 (하기 기재된 올리고마이신, FCCP, 및 로테논 및 안티마이신 A의 믹스)을 일련적으로 주사하여 ATP 생성, 최대 호흡, 및 비-미토콘드리아 호흡을 각각 측정하였다. 그 후, 양성자 누출 및 여분 호흡 능력을 이들 파라미터 및 기저 호흡을 사용하여 계산한다. 각각의 조정인자는 전자 수송 쇄의 특이적 성분을 표적화한다. 올리고마이신은 ATP 신타제 (복합체 V)를 억제하고, 올리고마이신의 주사 후의 OCR의 감소는 세포 ATP 생성과 연관된 미토콘드리아 호흡과 상관된다. 카르보닐 시아나이드-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존 (FCCP)은 양성자 구배를 붕괴시키고, 미토콘드리아 막 전위를 파괴하는 비커플링제이다. 그 결과, 전자 수송 쇄를 통한 전자 유동은 비억제되고, 산소는 복합체 IV에 의해 최대로 소비된다. 그 후, FCCP-자극된 OCR을 사용하여 최대 호흡 및 기저 호흡 사이의 차로서 정의되는 여분 호흡 능력을 계산할 수 있다. 여분 호흡 능력 (SRC)은 증가된 에너지 요구에 반응하는 세포의 능력의 척도이다. 제3 주사는 로테논, 복합체 I 억제제, 및 안티마이신 A, 복합체 III 억제제의 믹스이다. 이 조합은 미토콘드리아 호흡을 폐쇄하며, 미토콘드리아 외부에서의 프로세스에 의해 유도된 비미토콘드리아 호흡의 계산을 가능하게 한다.
도 50은 PBMC 공급자 또는 aEM3 aAPC에 대해 확장된 살아있는 TIL의 미토콘드리아 염색을 예시한다. 미토트래커 염료는 살아있는 세포에서 미토콘드리아를 염색하며, 그의 축적은 막 전위에 의존한다. PBMC 공급자 또는 aEM3에 대해 확장된 TIL을 L/D 아쿠아, 이어서 미토트래커 적색 염료로 염색하였다. 데이터는 살아있는 집단 상에 게이팅된 미토트래커 양성 (MFI) 세포를 나타낸다.
실시예 7 - 조작된 MOLM-14 (aMOLM14) 및 EM-3 (aEM3) aAPC의 비교
이전의 실시예에 기재된 바와 같이, PBMC 공급자 및 aMOLM14 및 aEM3 aAPC로 확장된 TIL을 세포독성 효능에 대해 BRLA를 사용하여 기능적 활성에 대해 평가하였다. P815 BRLA는 실시예 9에 상세하게 기재한다. 결과는 도 51 및 도 52에 나타내며, aAPC로 확장된 TIL이 PBMC 공급자로 확장된 것들과 유사한 기능적 특성 (및 예상되는 임상적 효능)을 가짐을 나타낸다.
상기 기재된 바와 같은 PBMC 공급자 및 aMOLM14 및 aEM3 aAPC로 확장된 TIL로부터의 IFN-γ 방출 및 그란자임 B 방출을 또한 항-CD3/CD28/4-1BB로 코팅된 마이크로비드로의 밤샘 자극 후에 평가하였다. IFN-γ 방출 결과를 도 53 및 도 54에 나타내고, 그란자임 B 방출 결과를 도 55 및 도 56에 나타낸다. IFN-γ 방출 및 그란자임 B 방출의 유의하고 놀라운 증가가 PBMC 공급자로 확장된 것들에 비해 aEM3 aAPC로 확장된 TIL에 대해 관찰되었으나, aMOLM14 aAPC에 의해 확장된 TIL에 대해서는 관찰되지 않았다. 이론에 구애되지는 않지만, 이는 aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL이 암 요법으로서 생체내에서 보다 활성일 수 있음을 시사한다. 관찰된 대부분의 다른 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
aEM3 및 aMOLM14 aAPC로의 TIL 확장의 결과를 표 9에 요약한다.
<표 9>
aAPC로의 TIL 확장 결과의 요약.
Figure pct00036
실시예 8 - aEM3 및 aMOLM14 aAPC에 대한 마스터 세포 뱅크의 제조
aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 하기 배지 조성물에서 성장시켜 마스터 세포 뱅크를 제조할 수 있으며, 이를 aAPC의 공급을 위해 이 배지에서 추가로 성장시킬 수 있다: 500 mL의 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMEM/F12 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스), 50 mL 소 태아 혈청 (FBS) 열 불활성화된 (HI) (하이클론); 10 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (헤페스 완충제) (라이프 테크놀로지즈); 1X 프리모신 (인비보젠); 1X 플라스모신 (인비보젠), 및 1X 2-머캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈).
aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 비롯한 본원에 기재된 aAPC를 또한 세포의 성장에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 마스터 세포 뱅크로부터 성장시킬 수 있다. 한 실시양태에서, aAPC를 해동한 후, 80 내지 90％ RPMI 1640 + 10 내지 20％ h.i. FBS (소 태아 혈청) 배지에서, 포화된 배양물을 1:2 내지 1:3으로 2 내지 3일마다 분할하고, 24-웰 플레이트에서 약 0.5 내지 1×106개 세포/mL로 시딩하고, 37 ℃ 및 5％ CO2에서의 인큐베이션과 함께 약 0.5 내지 1.5×106개 세포/mL에서 유지함으로써 확장시킨다.
인간 요법의 생성에서 본 발명의 특정 실시양태의 aAPC를 사용하는 데 채용될 수 있는 추가의 단계는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 세포주 특징화 (HLA 고해상도 타이핑); 시토카인 방출 시험; aAPC를 성장시키는 FBS를 대체하는 인간 혈청의 시험; aAPC를 동결시키는 동결 배지의 시험; 마스터 세포 뱅킹 (원료 시험 및 안정성 시험을 포함함); 방사선조사의 표준화 (방사선조사 용량 (1000, 3000, 5000, 10000, 15000 rad), 신선한 대 동결된 aAPC, 및 TIL과 함께/없이를 포함함); aAPC의 안정성; aAPC의 오염을 평가하기 위한 패널의 개발; 분자 생물학 검정 (qPCR, DNA 시퀀싱)의 개발; 흑색종, 자궁경부암, 및 두경부암을 비롯한 상이한 종양 유형으로부터의 TIL 확장의 시험 (G-렉스 5M을 사용함); 효능, 순도, 및 동일성 시험; 미코플라스마 및 무균성 검정; 미생물학적 시험 (USP/EP 무균성, 미생물오염도 및 내독소 검정); 및 우발적인 바이러스제 시험을 포함한다.
실시예 9 - TIL을 확장시키는 방법 및 확장된 TIL로 암을 치료하는 방법
TIL은 본 발명의 특정 실시양태의 aAPC, 예컨대 aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 사용하여, 본원에 기재된 확장 방법 중 임의의 것을 사용하여 확장될 수 있다. 예를 들어, TIL을 확장시키는 방법을 도 57에 나타낸다. aAPC를 사용한 TIL의 확장은 본원에 기재된 환자에서 암을 치료하는 임의의 방법과 추가로 조합될 수 있다. 확장이 aAPC (aEM3 및 aMOLM14 aAPC를 포함함)를 사용하는 것인 TIL을 확장시키고, 확장된 TIL로 환자를 치료하는 방법을 도 58에 나타낸다.
실시예 10 - P815 생물발광 재지정 용해 검정
이 실시예에서, 생물발광 재지정 용해 검정 (BRLA)에서 TIL의 용해 잠재성을 평가하기 위한 대리 표적 세포주의 개발을 설명한다. BRLA는 자가 종양 세포의 부재 하에서의 T 세포 매개된 살해의 평가를 가능하게 한다. 세포용해 활성을 1 내지 4시간에 T 세포 수용체의 결속과 함께 및 없이 평가할 수 있으며, 이는 T 세포 수용체에 결속하면서, 및 소위 림포카인 활성화된 살해 활성 (LAK) 없이 T 세포 살해를 평가한다.
내인성 CD16 Fc 수용체를 발현하는 마우스 비만세포종 P815 세포는 항-CD3ε (OKT-3)에 결합하여, 표적 세포주로서 강력한 TCR 활성화 신호를 제공한다. P815 클론 G6을 eGFP 및 반딧불이 루시페라제에 기초하여 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 분류하고, BD FACS아리아 (FACSAria) II를 사용하여 클로닝하였다. 클론 G6을 인텔리시트 아이큐 스크리너 (Intellicyt iQue Screener)를 사용하여 분석된 eGFP 강도에 기초하여 선택하였다. 표적 세포 및 관심의 TIL을 +/- OKT-3 공동-배양하여 TCR 활성화 (특이적 살해) 또는 비-특이적 (림포카인 활성화된 살해, LAK)을 각각 평가하였다. 4시간의 인큐베이션 후, 반딧불이 루시페린 ((4S)-2-(6-히드록시-1,3-벤조티아졸-2-일)-4,5-디히드로티아졸-4-카르복실산, 다수의 공급원으로부터 시판됨)을 웰에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션하였다. 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하였다. 퍼센트 세포독성 및 생존을 하기 식을 사용하여 계산하였다: ％ 생존 = (실험적 생존 - 최소)/(최대 신호 - 최소 신호) × 100; ％ 세포독성 = 100 - (％ 생존). 공동-배양된 TIL의 배지 상청액에서의 인터페론 감마 방출을 ELISA에 의해 분석하고, TIL 상의 LAMP1 (CD107a, 클론 eBioH4A3) 발현을 유동 세포측정기 상에서 분석하여 TIL의 세포독성 효능을 평가하였다.
결과를 도 59 내지 도 75에 나타낸다. 도 59는 BRLA에 의한 개별적 이펙터:표적 비에서 P815 클론 G6 (항-CD3과 함께 및 없이)과 공동-배양된 TIL 배치 M1033T-1의 퍼센트 독성을 예시한다. 도 60은 상이한 비의 이펙터 대 표적 세포에 대해 방출된 IFN-γ의 양을 나타내는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터를 예시한다. 도 61은 항-CD3의 존재 하에서 1:1 이펙터 대 표적 세포의 비로 4시간 및 24시간 공동-배양 동안 P815 클론 G6과 공동-배양된 경우 TIL 배치 M1033T-1에 의해 발현된 LAMP1 (％)을 예시한다.
결과를 TIL 배치 M1030에 대한 BRLA를 예시하는 도 62에 나타낸 바와 같은 제2 TIL 배치를 사용하여 확인하였다. BRLA에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 26 ± 16이다. 도 63은 TIL 배치 M1030에 대한 표준 크로뮴 방출 검정의 결과를 예시한다. 크로뮴 방출 검정에 의한 세포독성 (LU50/1 × 106 TIL로서 측정됨)은 22이다.
결과를 제3 TIL 배치를 사용하여 추가로 확인하였다. 도 64는 TIL 배치 M1053에 대한 BRLA 결과를 예시하며, 이는 BRLA에 의한 TIL의 용해 단위를 70 ± 17로서 나타낸다. 도 65는 TIL 배치 M1053에 대한 표준 크로뮴 방출 검정의 결과를 예시하며, 이는 크로뮴 검정에 의한 TIL의 용해 단위를 14 ± 5로서 나타낸다. 2가지 검정 결과의 비교는 크로뮴 방출 검정 결과에 대한 BRLA 결과의 필적하는 성능을 나타낸다.
도 66은 IFN-γ 방출 및 TIL의 세포독성 잠재성 사이의 선형 관계를 예시한다. 도 67은 IFN-γ에 대한 엘리스폿 결과를 예시한다. 도 68은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다. 도 69는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 IFN-γ 방출을 예시한다. 도 70은 M1053T 및 M1030T에 의한 그란자임 B 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 도 71은 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다. 도 72는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 그란자임 B 방출을 예시한다. 도 73은 M1053T 및 M1030T에 의한 TNF-α 방출을 나타내는 엘리스폿 데이터를 예시한다. 도 74는 TIL 배치 M1053에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다. 도 75는 TIL 배치 M1030에 대한 효소적 TNF-α 방출을 예시한다. 도 66 내지 도 76에서의 데이터는 또한 BRLA에 의해 나타내어진 바와 같이 TIL의 이들 배치의 효능을 확인시켜 준다.
결론적으로, BRLA는 방사성핵종을 요구하지 않으며, 전통적인 세포독성 검정만큼 효율적이고 민감성이다. 개별적 시점에서의 TIL의 Lamp 1 발현의 유동 세포측정 평가는 BRLA에 의해 나타난 효능에 비해 세포독성 T 세포의 탈과립화를 입증한다. BRLA는 표준 크로뮴 방출 검정보다 유사하거나 더 양호한 효능을 입증한다. BRLA는 또한 TIL 용해 활성의 효능의 평가를 가능하게 한다. BRLA과 크로뮴 방출 검정의 비교는 BRLA의 효율 및 신뢰성을 나타낸다. BRLA는 TIL에 의한 IFNγ 방출과 선형 관계를 갖는다. 엘리스폿에 의한 IFN-γ, TNFα 및 그란자임 B의 방출 검정은 BRLA에 의해 평가된 TIL의 세포독성 효율과 일치한다.
실시예 11 - EM3 세포를 FBS로부터 hAB 혈청으로 이행하기 위한 프로세스
반응성을 회피하기 위해, 일부 세포주는 한 배지로부터 또다른 배지로 이행될 필요가 있을 수 있다. 여기서, EM3 세포를 FBS로부터 hAB 혈청으로 이행하여 반응성을 회피하였다. 도 76에 나타낸 바와 같이, aEM3 세포는 FBS로부터 hAB 혈청으로 성공적으로 이행하였다.
실시예 12 - 동결 배지 제형 최적화
본원에 기재된 바와 같이 배양된 EM3 세포를 크리오뱅킹하기 위해, 방법은 동결 배지 제형을 최적화하였다. 도 77에 나타난 바와 같이, 3가지 동결 배지를 사용하고, 세포 수에 대한 그들의 효과를 카운팅하였다. 이용된 세포 배지는 크리스토르 (CryStor) 10 (바이오라이프 솔루션즈 (CS10)) (A), hAB [90％] 및 DMSO [10％] (B), 및 DMSO [10％] 및 cDMEM2 [70％]를 갖는 hAB [20％] (C)를 포함하였다. 도 77은 인간 AB 혈청 (90％) 및 DMSO (10％)의 제형이 3일의 회수 후에 예상치 않게 증가된 EM3 세포 수를 제공하였음을 입증한다.
실시예 13 - GREX 플라스크에서의 aEM3 세포의 성장
aEM3 세포를 기체 투과성 세포 배양 플라스크 (즉, GREX 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링))에서 배양하고, 세포 배가 시간에 대한 효과를 8일 시간 과정에 걸쳐 관찰하였다. 도 78에 나타난 바와 같이, GREX 플라스크는 aEM3 세포의 급속 성장을 제공하였다.
실시예 14 - aEM3 세포 순도를 측정하기 위한 유동 패널 분석
본원에 기재된 프로세스에 따라 배양된 세포의 순도를 측정하기 위해, 유동 패널 분석을 사용하여 aEM3 aAPC의 순도를 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 79 및 80에 기재한다. 도 80에 나타난 바와 같이, 분류하기 전에 aEM3 세포 집단은 aEM3 7C12 및 aEM3 8B5 세포에 대해 각각 53.5％ 및 43.2％ eGFP+였다. 분류후, 세포 집단은 aEM3 7C12 및 aEM3 8B5 세포에 대해 각각 96.8％ 및 96.3％ eGFP+로 개선되었다 (도 80).
실시예 15 - PBMC 공급자에 대한 대안으로서 aEM3 공급자 세포
본원에 기재된 바와 같이, aEM3 세포는 PBMC 공급자에 대한 대안으로서 사용될 수 있으며, 이는 TIL 확장 프로세스 및 생성된 TIL 둘 다에 대한 예상치 않은 상이한 특성을 초래한다. 시토카인 발현의 차이를 비교하기 위해, PBMC 및 aEM3 세포를 OKT-3으로의 처리에 의해 자극하였다. 도 81에 나타난 바와 같이, aEM3 세포는 PBMC에 비해 비교적 상이한 시토카인 발현 프로파일을 나타내었다. 놀랍게도, 본 발명의 aEM3 세포는 통상적인 PBMC로 확장된 TIL의 동일한 시토카인 분비 특성을 재현하지 않고, 효율적인 TIL (본원에 나타난 바와 같음)을 제공한다.
실시예 16 - 완전 배지 및 혈청 무함유 배지 TIL 확장 사이의 비교
TIL 확장 프로토콜을 최적화하기 위해, 몇몇 TIL 확장 실험을 본원에 기재된 바와 같이, 그러나 완전 배지 (CM1)라기 보다는 혈청 무함유 배지로 수행하였다.
한 실험에서, 조직 단편을 300 IU/mL의 IL-2를 갖는 CM1 또는 다양한 혈청 무함유 배지로 단일 웰에서 배양하였다. 그 후, 세포를 제11일에 카운팅한 후, REP를 개시하였다. 사용된 다양한 혈청 무함유 배지는 프라임 CDM (어바인), CTS 옵티마이저 (써모피셔), 및 엑스비보-20 (론자)을 포함하였다. 도 82에 나타난 바와 같이, CTS로의 TIL 확장 (REP전)은 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공하였다.
추가적으로, 조직 단편을 제11일까지 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 CM1 또는 다양한 혈청 무함유 배지로 배양하였다. 그 후, REP를 제11일에 PBMC 공급자, OKT-3, 및 IL-2를 사용하여 개시하고, 배양물을 제16일에 분할하였다. 그 후, 배양을 제22일의 종료 시에 종결시켰다. 사용된 다양한 혈청 무함유 배지는 프라임 CDM (어바인), CTS 옵티마이저 (써모피셔), 및 엑스비보-20 (론자)을 포함하였다. 도 83 및 도 84에 나타낸 바와 같이, 제11일 및 제22일에 각각 세포를 카운팅한 경우, 프라임 CDM으로의 TIL 확장 (REP전)은 CM1에 비해 증가된 세포 수를 제공하였다.
실시예 17 - 혈청-기재 배지에 비해 혈청 무함유 배지에서의 aAPC의 성장
혈청의 부재 하에서의 aAPC 성장 및 유지 프로토콜을 최적화하기 위해, aEM3 세포를 다양한 혈청 무함유 배지를 사용하여 배양하였다.
aEM3 세포를 24 웰 플레이트에서 웰 당 1 ×106 세포로 3일 동안, 한 군의 세포는 혈청-기재 배지 (cDMEM (10％ h혈청))를 제공하고, 다른 군의 세포는 혈청 무함유 배지를 제공한 것을 제외하고는 본원에 기재된 바와 같은 일반적 세포 배양 프로토콜을 사용하여 배양하였다. 연구에 이용된 혈청 무함유 배지는 CTS 옵티마이저 (써모피셔), 엑스비보 20 (론자), 프라임-TCDM (어바인), 및 XFSM (메센컬트) 배지를 포함하였다. 그 후, 세포를 제3일에 카운팅하였다.
도 85에 나타낸 바와 같이, CTS 옵티마이저 및 프라임-TCDM 혈청 무함유 배지는 혈청-기재 배지 (즉, cDMEM (10％ h혈청))에 필적한 세포 성장을 제공하였다. 따라서, 혈청 무함유 배지는 혈청-기재 배지에 비해 aAPC를 성장시키고 유지하기 위한 효과적인 대안이다.
실시예 18 - aAPC의 번식, 유지, 및 냉동보존
이 실시예에서, aAPC의 제조 및 보존을 위한 절차가 제공된다. 구체적으로, TIL-Rs3으로 지정된 세포주로부터의 aEM3 세포를 번식시키고, 냉동보존하였다.
aEM3 세포의 해동 및 회수는 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 냉동보존된 aEM3 세포를 CTS 옵티마이저 베이셜 배지 (써모 피셔), CTS 옵티마이저 세포 보충물 (써모 피셔), 겐타미신 (론자), 및 글루타맥스 (라이프 테크놀로지즈)로부터 제조된 예비-가온된 배지 (37 ℃)에서 서시히 가온시켰다. 그 후, 현탁된 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 4 ℃에서 원심분리하였다. 생성된 상청액을 버리고, 나머지 aEM3 세포를 상기 배지에 재현탁시키고, 플레이팅하였다 (6 웰 플레이트의 웰 당 5 × 106개 세포 / 10 mL).
aEM3 세포의 번식은 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 배지의 분취액을 기체 투과성 세포 배양 플라스크 (즉, GREX 10 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링))에서 제조한다. 플레이팅된 aEM3 세포를 원심분리 (즉, 1500 rpm, 5분 동안 4 ℃에서)에 의해 세척하고, 배지에 재현탁시키고, GREX 플라스크에 1 내지 2 × 106개 세포/mL의 세포 밀도로 첨가하였다. aEM3 세포 현탁액을 30 mL의 배지로 희석한 후, GREX 플라스크를 3 내지 4일 동안 37 ℃에서 CO2 하에서 인큐베이션하였다. 3 내지 4일 후, GREX 플라스크를 인큐베이터로부터 제거하고, 생물학적 안전성 캐비넷 (BSC)에 정치하였다. 배양된 aEM3 세포를 피펫에 의해 GREX 플라스크로부터 주의깊게 추출하고, 생성된 추출물을 원심분리하여 증가된 수의 aEM3 세포를 제공하고, 이를 GREX 10 플라스크 당 10 내지 20 × 106 세포의 세포 밀도로 재현탁시킬 수 있다.
aEM3 세포의 대안적 냉동보존은 하기 비-제한적 절차를 사용하여 달성될 수 있다. aEM3 세포를 함유하는 상기 GREX 10 플라스크를 인큐베이터로부터 제거하고, BSC에 정치한다. 배양된 aEM3 세포를 피펫에 의해 GREX 플라스크로부터 주의깊게 추출하고, 생성된 추출물을 원심분리하여 증가된 수의 aEM3 세포를 제공하고, 이를 크리스토르 10 (바이오라이프 솔루션즈)의 부피에 재현탁시켜 크리오바이알 중 10 내지 100 × 106개 세포/바이알의 농도를 제공한다. aEM3 세포 현탁액을 동결 용기에 정치하고, -80 ℃ 냉동고로 옮길 수 있다.
실시예 19 - 냉동보존 후의 aEM3 세포의 급속 회수의 입증
TIL-R3 세포주 (1 내지 2 × 106개의 세포)로부터의 aEM3 세포를 실시예 18에 제시된 절차에 따라 CS-10 냉동보존 배지를 사용하여 냉동보존하였다. 그 후, 이러한 세포의 바이알을 해동시키고, 세포를 카운팅하였다. 세포 카운트를 동결전, 해동후, 및 해동 후 3일 (즉, 해동후 회수)에 취하였다. 도 86 및 도 87에 나타낸 바와 같이, 총 살아있는 세포 카운트는 2회의 별개의 실험에서 해동후 급속하게 회수되었다.
TIL-R3 세포 (1 × 106개의 세포)를 해동시키고 (해동후 제3일), 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 0.5 × 106개 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하였다. 제0일 및 제3일에, 생존성 세포를 카운팅하고, 기록하였다. 제1 계대 시 (제6일), 세포를 2 × 106개 세포/cm2 또는 0.5 × 106개 세포/cm2의 밀도로 분할하였다. 제1 계대의 종료 시, 세포 카운트를 수행하였다. 생성된 세포 카운트를 도 88에 나타내며, 이는 해동후 회수 상 및 성장 상 둘 다를 입증한다.
더욱이, TIL-R3 세포 (20 × 106개의 세포)를 실시예 18에 기재된 절차에 따라 GREX 10 플라스크에서 2 × 106개 세포/cm2의 밀도로 배양하였다. 제4일 및 제8일에, 살아있는 세포를 카운팅하고, 기록하였다. 생성된 세포 카운트를 도 89에 나타내며, 이는 세포가 13.9 ×106개 세포/cm2의 밀도에 도달한 경우 제4일 및 제8일 사이에 플라토에 도달하는 냉동보존 후의 세포의 성장 상을 입증한다.
실시예 20 - aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL의 CD8 왜곡, 확장 성능, 및 CD3 오염
15가지 상이한 REP전 TIL 주 (0.4 × 105개의 세포)를 aEM3 aAPC (상기 기재된 바와 같음) 또는 PBMC 공급자 (10 × 106개), OKT3 (30 ng/mL) 및 IL-2 (3000 IU/mL)와 함께 공동-배양하고, 배양물을 제5일에 6 웰 Grex 플레이트를 사용하여 분할하였다. 배양물을 제11일에 샘플링하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CD8+ 세포의 상대 비를 식 (CD8％ aEM3)/(CD8％ PBMC)에 의해 계산하였다. 도 91에 나타낸 결과는 aEM3 세포와 함께 배양된 TIL이 놀랍게도 CD8+ 왜곡 및 개선된 TIL 생성물을 촉진시킴을 지시한다. 이들 실험의 추가의 결과를 도 92, 도 93, 및 도 94에 나타내며, 여기서, 결과는 aEM3 aAPC와 함께 배양된 TIL이 PBMC 공급자와 함께 배양된 TIL에 비해 필적하는 확장 및 더 적은 비-CD3+ 세포 오염을 나타내었음을 나타낸다.
실시예 21 - 텔로미어 길이 측정
게놈 DNA를 qPCR (정량적 폴리머라제 연쇄 반응) 검정을 위해 REP전 또는 REP후 (CD3+에 대해 분류된 자기 비드) TIL로부터 단리하여 텔로미어 길이를 측정하였다. 실시간 qPCR 방법은 문헌 [Cawthon, Nucleic Acids Res. 2002, 30(10), e47]; 및 [Yang, et al., Leukemia, 2013, 27, 897-906]에 기재되어 있다. 간략하게, 텔로미어 반복 카피 수 대 단일 유전자 카피 수 (T/S) 비를 96-웰 형식에서 PCR 열 시클러 (바이오-래드 래버러토리즈, 인코포레이티드 (Bio-Rad Laboratories Inc.))를 사용하여 측정하였다. 10 ng의 게놈 DNA를 텔로미어 또는 헤모글로빈 (hgb) PCR 반응에 사용하였으며, 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
Tel-1b 프라이머 (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT) (서열식별번호: 40);
Tel-2b 프라이머 (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT) (서열식별번호: 41);
hgb1 프라이머 (GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC) (서열식별번호: 42); 및
hgb2 프라이머 (CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) (서열식별번호: 43).
모든 샘플을 텔로미어 및 헤모글로빈 반응 둘 다에 의해 분석하였으며, 분석을 동일한 플레이트 상에서 삼중으로 수행하였다. 시험 샘플 외에도, 각각의 96-웰 플레이트는 1301 인간 T-세포 백혈병 세포주 (시그마 및 ATCC로부터 이용가능함)로부터 단리된 게놈 DNA를 사용한 0.08 ng 내지 250 ng의 5-점 표준 곡선을 함유하였다. 각각의 샘플에 대한 T/S 비 (-dCt)를, 중위 텔로미어 Ct 값으로부터 중위 헤모글로빈 역치 주기 (Ct) 값을 뺌으로써 계산하였다. 상대 T/S 비 (-ddCt)를 각각의 미지의 샘플의 T/S 비로부터 10.0 ng 표준 곡선 점의 T/S 비를 뺌으로써 측정하였다.
결과를 도 95에 나타낸다. 나타내어진 각각의 데이터 점은 상대 T/S 비의 중위 측정이다. 결과는 aEM3과 함께 배양된 TIL이 그들의 텔로미어 길이를 유지함을 지시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. <120> ENGINEERED ARTIFICIAL ANTIGEN PRESENTING CELLS FOR TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTE EXPANSION <130> 116983-5002-WO <150> 62/415,274 <151> 2016-10-31 <150> 62/438,600 <151> 2016-12-23 <150> 62/475,053 <151> 2017-03-22 <150> 62/481,831 <151> 2017-04-05 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 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cttgagatcc tttttttctg 9120 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 9180 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 9420 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 9480 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 9540 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 9600 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 9660 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 9720 ctggcctttt gctggccttt ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac 9780 agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840 aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862 <210> 32 <211> 3334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 1, pMK 7c12 anti mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5 <400> 32 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcata aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg 420 atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa agctgaacga tatcgccacc 480 atgggcagca cagccattct ggccctgctg ctggcagtgc tgcagggcgt gtcagctcag 540 gtgcagctgg tgcagtctgg cggcggactc gtgaaacctg gcggcagcct gagactgagc 600 tgtgccgcca gcggcttcaa cttcaacgac cagtacatga gctggatccg gcaggcccct 660 ggcaagggac tggaatgggt gtccttcatc agcggcagcg gcggcaccac ctactacacc 720 gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca ccaaggacag cctgtacctg 780 cagatgaaca gcctgaccgt ggaagatacc 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ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 1680 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1740 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 1800 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 1860 tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 1920 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 1980 gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 2040 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 2100 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 2160 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 2220 agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 2280 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 2340 atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 2400 tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc 2460 ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc 2520 gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg 2580 caatcaataa agccgctaaa acggccattt tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca 2640 ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc 2700 tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca tccagatcat cctgatccac caggcccgct 2760 tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc 2820 gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc 2880 ggcgccagat ggctagacag cagatcctga cccggcactt cgcccagcag cagccaatca 2940 cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc 3000 cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc 3060 acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca 3120 atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc 3180 gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 3240 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 3300 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 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atgacaagta ataggatatc ggttcagctt 780 tcttgtacaa agttggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg 840 tcactatcag tcaaaataaa atcattattt ctgggcctca tgggccttcc tttcactgcc 900 cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960 tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020 aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860 aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920 tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980 gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040 ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100 agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160 ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220 gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280 tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340 gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400 accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460 gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520 cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580 caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640 tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760 tttccccgaa aagtgccac 2779 <210> 34 <211> 9338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Final vector used for lentiviral production, pLV4301G 7C12 scFV mIgG hCD8 flag <400> 34 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caccaacttt gtacaaaaaa gctgaacgat atcgccacca tgggcagcac agccattctg 2760 gccctgctgc tggcagtgct gcagggcgtg tcagctcagg tgcagctggt gcagtctggc 2820 ggcggactcg tgaaacctgg cggcagcctg agactgagct gtgccgccag cggcttcaac 2880 ttcaacgacc agtacatgag 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cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 8640 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 8700 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 8760 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 8820 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 8880 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 8940 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 9000 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 9060 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 9120 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 9180 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 9240 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 9300 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 9360 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 9420 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 9480 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 9540 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 9600 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 9660 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 9720 ctggcctttt gctggccttt ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac 9780 agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg 9840 aaggccatcc agcctcgcgt cg 9862 <210> 36 <211> 3340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor vector 1, pMK 8B3 anti mFC scFV CoOp ECORV SacII L1R5 <400> 36 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg 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cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttattag 1860 aaaaattcat ccagcagacg ataaaacgca atacgctggc tatccggtgc cgcaatgcca 1920 tacagcacca gaaaacgatc cgcccattcg ccgcccagtt cttccgcaat atcacgggtg 1980 gccagcgcaa tatcctgata acgatccgcc acgcccagac ggccgcaatc aataaagccg 2040 ctaaaacggc cattttccac cataatgttc ggcaggcacg catcaccatg ggtcaccacc 2100 agatcttcgc catccggcat gctcgctttc agacgcgcaa acagctctgc cggtgccagg 2160 ccctgatgtt cttcatccag atcatcctga tccaccaggc ccgcttccat acgggtacgc 2220 gcacgttcaa tacgatgttt cgcctgatga tcaaacggac aggtcgccgg gtccagggta 2280 tgcagacgac gcatggcatc cgccataatg ctcacttttt ctgccggcgc cagatggcta 2340 gacagcagat cctgacccgg cacttcgccc agcagcagcc aatcacggcc cgcttcggtc 2400 accacatcca gcaccgccgc acacggaaca ccggtggtgg ccagccagct cagacgcgcc 2460 gcttcatcct gcagctcgtt cagcgcaccg ctcagatcgg ttttcacaaa cagcaccgga 2520 cgaccctgcg cgctcagacg aaacaccgcc gcatcagagc agccaatggt ctgctgcgcc 2580 caatcatagc caaacagacg ttccacccac gctgccgggc tacccgcatg caggccatcc 2640 tgttcaatca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2700 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2760 tttccccgaa aagtgccac 2779 <210> 38 <211> 9344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Final vector used for lentiviral production, pLV4301G 8B3 scFV mIgG hCD8 flag <400> 38 cgataaccct aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg 60 gttagtctgg atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttcac 120 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcta atgtgagtta gctcactcat 180 taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 240 ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac 300 cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct 360 tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 420 accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 480 agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 540 ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 600 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 660 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 720 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 780 gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 840 cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 900 agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 960 tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 1020 ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 1080 aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 1140 taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 1200 agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 1260 cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 1320 aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 1380 tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 1440 cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 1500 tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 1560 tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 1620 gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 1680 ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 1740 acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 1800 taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 1860 aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 1920 tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 1980 tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 2040 ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 2100 ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggtttta aaagaaaagg ggggattggg 2160 gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa 2220 ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatt ttatttagtc tccagaaaaa 2280 ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 2340 caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca gatcaaggtt aggaacagag 2400 agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag 2460 ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc 2520 agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca 2580 atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc 2640 cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtaccgatat 2700 caccaacttt gtacaaaaaa gctgaacgat atcgccacca tgggcagcac agccattctg 2760 gccctgctgc tggcagtgct gcagggcgtg tcagctcagg tgcagctgca gcagtctggc 2820 gccgaagtga agaaacccgg cagcagcgtg aaggtgtcct gcaaggctag cggcggcacc 2880 ttcagcagct acgccatttc ttgggtgcgc caggcccctg gacagggcct ggaatggatg 2940 ggctggatca gcccctacaa cggcaacacc gactacgccc agaaagtgca gggcagagtg 3000 accctgacca ccgacaccag cacctccacc gcctacatgg aactgcggag cctgagaagc 3060 gacgacaccg ccgtgtacta ctgtgccaca ggcggcggaa cctggtacag cgatctgtgg 3120 ggcagaggca ccctcgtgac agtgtctgct ggcggcggag gatctggcgg aggcggaagt 3180 ggcgggggag gaagcggagc acctgagatc gtgctgaccc agagccctag cacactgagc 3240 gccagcgtgg gcgacagagt gtccatcacc tgtagagcca gccagagcat cggaggcagc 3300 ctggcctggt atcagcagaa gcctggcaag gcccccaagc tgctgatctc tgaggccagc 3360 accctggaaa gaggcgtgcc cagcagattt tccggcagcg gctctggcac cgacttcacc 3420 ctgacaatca gcagcctgca gcccgaggac gtggccacct actactgcca gaagtacaac 3480 agcgtgcccc tgaccttcgg ccctggcacc aaggtggaaa tcaagccgcg ggccaacttt 3540 gtatacaaaa gtggcccgcg gacaacaacc cctgccccca gacctcctac cccagcccct 3600 acaattgcca gccagcctct gagcctgagg cccgaggctt gtagacctgc tgctggcgga 3660 gccgtgcaca ccagaggact ggatttcgcc tgcgacatct acatctgggc ccctctggcc 3720 ggcacatgtg gcgtgctgct gctgagcctc gtgatcaccc tgtactgcgg ctccaccagc 3780 ggctccggca agcccggctc tggcgagggc tccaccagcg gcgactacaa ggacgacgat 3840 gacaagtaat aggatatcgg ttcagctttc ttgtacaaag ttgggattcg agttaattaa 3900 gttaacgaat tccccccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg 3960 gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 4020 aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 4080 cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 4140 gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 4200 ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 4260 caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 4320 agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 4380 ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc 4440 ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 4500 atgggaggcg gaagcggcgg aggctcccct cgaggcacca tggtgagcaa gggcgaggag 4560 ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 4620 ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 4680 atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 4740 ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 4800 gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 4860 aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 4920 ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 4980 agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 5040 atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 5100 cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 5160 ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 5220 gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaac gcgtcccggg tctagagcta 5280 gcggtaccat gcattacgta gtcgacgact taattaagct agcctagtgc catttgttca 5340 gtggttcgta gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg 5400 ggggccaagt ctgtacagca tcttgagtcc ctttttaccg ctgttaccaa ttttcttttg 5460 tctttgggta tacatttaaa ccctaacaaa acaaagagat ggggttactc tctaaatttt 5520 atgggttatg tcattggatg ttatgggtcc ttgccacaag aacacatcat acaaaaaatc 5580 aaagaatgtt ttagaaaact tcctattaac aggcctattg attggaaagt atgtcaacga 5640 attgtgggtc ttttgggttt tgctgcccct tttacacaat gtggttatcc tgcgttgatg 5700 cctttgtatg catgtattca atctaagcag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc 5760 tttctgtgta aacaatacct gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc aggtctgtgc 5820 caagtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcttgg tcatgggcca tcagcgcatg 5880 cgtggaacct tttcggctcc tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt 5940 gctcgcagca ggtctggagc aaacattatc gggactgata actctgttgt cctatcccgc 6000 aaatatacat cgtttccatg gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg 6060 tcctttgttt acgtcccgtc ggcgctgaat cctgcggacg acccttctcg gggtcgcttg 6120 ggactctctc gtccccttct ccgtctgccg ttccgaccga ccacggggcg cacctctctt 6180 tacgcggact ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct 6240 ctgcacgtcg catggagacc accgtgaacg cccaccaaat attgcccaag gtcttacata 6300 agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac ttcaaagact 6360 gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag 6420 gaggctgtag gcataaattg gtctgcgcac cagcaccatg gcgcaatcac tagagcgggg 6480 tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 6540 aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatctgctt tttgcttgta 6600 ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc 6660 cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt 6720 tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta 6780 gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag aaatgaatat 6840 cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 6900 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 6960 tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg cccctaactc cgcccatccc 7020 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 7080 ttatgcagag gccgaggccg gatcccttga gtggctttca tcctggagca gactttgcag 7140 tctgtggact gcaacacaac attgccttta tgtgtaactc ttggctgaag ctcttacacc 7200 aatgctgggg gacatgtacc tcccaggggc ccaggaagac tacgggaggc tacaccaacg 7260 tcaatcagag gggcctgtgt agctaccgat aagcggaccc tcaagagggc attagcaata 7320 gtgtttataa ggcccccttg ttaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 7380 tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 7440 aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 7500 catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 7560 tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 7620 tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 7680 ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 7740 ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 7800 cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 7860 ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 7920 tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 7980 gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 8040 ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc 8100 aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 8160 acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 8220 tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 8280 cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 8340 gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 8400 taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 8460 tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 8520 cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 8580 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 8640 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 8700 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 8760 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 8820 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 8880 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 8940 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 9000 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 9060 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 9120 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 9180 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct ttttgaagct gtccctgatg 9240 gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 9300 agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcg 9344 <210> 39 <211> 6924 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLenti-C-Myc-DDK OX40L <400> 39 gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240 ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420 ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600 catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660 tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720 ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780 cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020 cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080 gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140 tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200 gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260 attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320 gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380 aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440 aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500 aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560 atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620 ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680 ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740 atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800 ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860 cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920 atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980 agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040 attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100 aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160 ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220 ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280 ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340 gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400 cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460 gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520 taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580 cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagaca tgtccaatat gaccgccatg 2640 ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2700 cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2760 caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2820 gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2880 tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2940 ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 3000 attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 3060 gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 3120 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca 3180 aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 3240 tcagaatttt gtaatacgac tcactatagg gcggccggga attcgtcgac tggatccggt 3300 accgaggaga tctgccgccg cgatcgccat ggaaagggtc caacccctgg aagagaatgt 3360 gggaaatgca gccaggccaa gattcgagag gaacaagcta ttgctggtgg cctctgtaat 3420 tcagggactg gggctgctcc tgtgcttcac ctacatctgc ctgcacttct ctgctcttca 3480 ggtatcacat cggtatcctc gaattcaaag tatcaaagta caatttaccg aatataagaa 3540 ggagaaaggt ttcatcctca cttcccaaaa ggaggatgaa atcatgaagg tgcagaacaa 3600 ctcagtcatc atcaactgtg atgggtttta tctcatctcc ctgaagggct acttctccca 3660 ggaagtcaac attagccttc attaccagaa ggatgaggag cccctcttcc aactgaagaa 3720 ggtcaggtct gtcaactcct tgatggtggc ctctctgact tacaaagaca aagtctactt 3780 gaatgtgacc actgacaata cctccctgga tgacttccat gtgaatggcg gagaactgat 3840 tcttatccat caaaatcctg gtgaattctg tgtccttacg cgtacgcggc cgctcgagca 3900 gaaactcatc tcagaagagg atctggcagc aaatgatatc ctggattaca aggatgacga 3960 cgataaggtt taaacggccg gccgcggtct gtacaagtag gattcgtcga gggacctaat 4020 aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atacatgttt aagggttccg gttccactag 4080 gtacaattcg atatcaagct tatcgataat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 4140 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 4200 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 4260 tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 4320 actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 4380 tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 4440 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 4500 aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 4560 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 4620 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4680 tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgatcga gacctagaaa aacatggagc 4740 aatcacaagt 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cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5640 gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5700 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5760 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5820 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5880 gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5940 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 6000 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6060 tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6120 tttggtcatg attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc 6180 attctgccga catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc 6240 agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg 6300 tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg 6360 aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc 6420 acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc 6480 gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat 6540 atcaccagct caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg 6600 gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa 6660 aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat 6720 gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt 6780 tttttctcca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 6840 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt cccgcgcaca 6900 tttccccgaa aagtgccacc tgac 6924 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel-1b primer <400> 40 cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel-2b primer <400> 41 ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hgb1 primer <400> 42 gcttctgaca caactgtgtt cactagc 27 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hgb2 primer <400> 43 caccaacttc atccacgttc acc 23

Claims (99)

1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 골수성 세포를 포함하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 공동자극 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하는 것인, 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
제1항에 있어서, aAPC가 aAPC와 접촉된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC.
제1항 또는 제2항에 있어서, aAPC가 TIL의 집단을 약 3000 IU/mL의 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 농도의 OKT-3 항체를 포함하는 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인 aAPC.
제1항 또는 제2항에 있어서, aAPC가 aAPC와 접촉된 T 세포를 자극하고 확장시킬 수 있는 것인 aAPC.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인 aAPC.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 EM-3 세포인 aAPC.
제7항에 있어서, EM-3 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 형질도입된 것인 aAPC.
제8항에 있어서, scFv 결합 도메인이 클론 7C12 (서열식별번호 (SEQ ID NO): 27) 또는 클론 8B3 (서열식별번호: 28), 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19를 포함하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 4-1BBL 단백질을 포함하는 것인 aAPC.
제12항에 있어서, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 aAPC.
제12항에 있어서, 4-1BBL 단백질을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 서열식별번호: 16을 포함하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 OX40L 단백질을 포함하는 것인 aAPC.
제15항에 있어서, OX40L 단백질이 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 aAPC.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC가 혈청 무함유 배지에서 성장된 것인 aAPC.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 aAPC와 접촉시키며, 여기서, TIL의 집단이 확장되는 것인 단계를 포함하는, TIL을 확장시키는 방법.
(a) 골수성 세포를 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 집단을 수득하며, 여기서, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 1종 이상의 공동자극 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함하고, 골수성 세포가 CD86 단백질 및 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하는 것인 단계, 및
(b) 종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 세포 배양 배지에서 aAPC의 집단과 접촉시키는 단계
를 포함하는, TIL의 집단을 확장시키는 방법.
제19항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, APC의 집단이 TIL의 집단을 세포 배양 배지에서 7일의 기간에 걸쳐 적어도 50배 확장시키는 것인 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하는 것인 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 MOLM-14 세포인 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 세포가 EM-3 세포인 방법.
제24항에 있어서, EM-3 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 형질도입된 것인 방법.
제25항에 있어서, scFv 결합 도메인이 클론 7C12 (서열식별번호: 27) 또는 클론 8B3 (서열식별번호: 28), 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, CD86 단백질이 서열식별번호: 8, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, CD86을 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 19를 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 4-1BBL 단백질을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 4-1BBL 단백질이 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 4-1BBL 단백질을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 서열식별번호: 16을 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공동자극 분자가 OX40L 단백질을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, OX40L 단백질이 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열, 또는 1개 이상의 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인 방법.
제35항에 있어서, TIL의 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인 방법.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 CD86 및 TIL 상의 적어도 1종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 1종의 공동-자극 리간드가 4-1BBL을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 CD86 및 TIL 상의 적어도 1종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 1종의 공동-자극 리간드가 OX40L을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단을 포함하는 TIL의 집단을 골수성 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 골수성 aAPC가 CD86 및 TIL 상의 적어도 2종의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 2종의 공동-자극 리간드를 포함하고, 공동-자극 분자와 공동-자극 리간드의 결합이 TIL의 증식을 유도함으로써 TIL을 특이적으로 확장시키고, 적어도 2종의 공동-자극 리간드가 4-1BBL 및 OX40L을 포함하는 것인, TIL을 확장시키는 방법.
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계; 및
(c) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제2 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하며;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고;
골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하도록 형질도입된 것인, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법.
제40항에 있어서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 방법.
제42항에 있어서, EM-3 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 형질도입된 것인 방법.
제43항에 있어서, scFv 결합 도메인이 클론 7C12 (서열식별번호: 27) 또는 클론 8B3 (서열식별번호: 28), 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법.
제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인 방법.
제48항에 있어서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인 방법.
제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 신세포 암종, 췌장암, 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 TIL의 제2 집단을 투여하기 전에 환자를 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 비-골수절제 림프구고갈 처방이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 것인 방법.
제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에의 TIL의 제2 집단의 투여 다음날에 시작하여 환자를 고-용량 IL-2 처방으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제53항에 있어서, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제1 집단을 수득하는 단계;
(b) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(c) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계;
(d) 치료학적 유효 부분의 TIL의 제3 집단을 암을 갖는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, TIL의 집단으로 암을 치료하는 방법.
제55항에 있어서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, MOLM-14 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 방법.
제55항에 있어서, 골수성 aAPC가 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산 및 4-1BBL을 코딩하는 핵산을 포함하고, EM-3 세포가 CD86 단백질 및 4-1BBL 단백질을 발현하는 것인 방법.
제57항에 있어서, EM-3 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 형질도입된 것인 방법.
제58항에 있어서, scFv 결합 도메인이 클론 7C12 (서열식별번호: 27) 또는 클론 8B3 (서열식별번호: 28), 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인 방법.
제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법.
제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 급속 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 80 내지 1 대 400인 방법.
제64항에 있어서, 급속 확장에서 TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인 방법.
제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 신세포 암종, 췌장암, 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 TIL의 제3 집단을 투여하기 전에 환자를 비-골수절제 림프구고갈 처방으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 비-골수절제 림프구고갈 처방이 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여의 단계를 포함하는 것인 방법.
제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에의 TIL의 제3 집단의 투여 다음날에 시작하여 환자를 고-용량 IL-2 처방으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제69항에 있어서, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인 방법.
제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 배양 배지가 골수성 aAPC의 제2 집단을 추가로 포함하고, 골수성 aAPC의 제2 집단이 1종 이상의 바이러스 벡터로 형질도입된 MOLM-14 또는 EM-3 세포를 포함하고, 1종 이상의 바이러스 벡터가 CD86을 코딩하는 핵산, 및 4-1BBL, OX40L, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동-자극 분자를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함하고, 골수성 aAPC가 CD86 단백질 및 공동-자극 분자를 발현하는 것인 방법.
유효량의 aAPC를 포함하고, 어플리케이터 및 키트의 사용을 위한 지시 자료를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 aAPC가 렌티바이러스 벡터 (LV)를 사용하여 형질도입된 MOLM-14 세포 또는 EM-3 세포를 포함하고, LV가 알려진 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하는 적어도 1종의 공동-자극 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 알려진 공동-자극 분자와 상기 공동-자극 리간드의 결합이 T 세포를 자극하고 확장시키는 것인, 알려진 공동-자극 분자를 발현하는 종양 침윤 림프구의 증식을 특이적으로 유도하기 위한 키트.
(a) 내인성 CD16 Fc 수용체를 발현하는 복수의 마우스 비만세포종 P815 세포를 제공하며, 여기서, P815 세포가 향상된 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불이 루시페라제에 기초한 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 것인 단계;
(b) 복수의 P815 세포 및 종양 침윤 림프구 (TIL)를 OKT-3과 공동-배양하여 특이적 살해에 대한 T 세포 수용체 (TCR) 활성화를 평가하고, OKT-3 없이 배양하여 비-특이적 살해에 대한 림포카인 활성화된 살해 (LAK)를 평가하는 단계;
(c) 공동-배양물을 4시간 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 루시페린을 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 공동-배양물로부터의 생물발광 강도를 발광측정기를 사용하여 판독하는 단계; 및
(f) 퍼센트 세포독성 및 생존을 계산하는 단계
를 포함하는, 암 세포에 대한 TIL의 효능을 평가하는 방법.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제1 집단이고,
(a) 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제1 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 이전에 수득되고, 추가로, TIL의 제2 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 큰 것인 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고;
여기서, 골수성 aAPC가 HLA-A/B/C, ICOS-L, 및 CD58을 내인적으로 발현하고;
골수성 aAPC가 CD86 단백질, 및 4-1BBL 단백질, OX40L 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동-자극 분자를 발현하도록 형질도입된 것인,
암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단.
제74항에 있어서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 TIL의 집단.
제74항 또는 제75항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인 TIL의 집단.
제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 TIL의 집단.
제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 1 대 200 내지 1 대 400인 TIL의 집단.
제78항에 있어서, TIL의 제2 집단 대 aAPC의 집단의 비가 약 1 대 300인 TIL의 집단.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 집단이 TIL의 제3 집단이고,
(a) 제1 세포 배양 배지에서 TIL의 제1 집단의 초기 확장을 수행하여 TIL의 제2 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제1 집단이 환자로부터 절제된 종양으로부터 수득가능하고, 추가로 TIL의 제2 집단이 TIL의 제1 집단보다 수에 있어서 적어도 5배 더 크고, 제1 세포 배양 배지가 IL-2를 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 세포 배양 배지에서 골수성 인공 항원 제시 세포 (골수성 aAPC)의 집단을 사용하여 TIL의 제2 집단의 급속 확장을 수행하여 TIL의 제3 집단을 수득하며, 여기서, TIL의 제3 집단이 급속 확장의 시작으로부터 7일 후에 TIL의 제2 집단보다 수에 있어서 적어도 50배 더 크고; 제2 세포 배양 배지가 IL-2 및 OKT-3을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 것인,
환자에서의 암의 치료에 사용하기 위한 TIL의 집단.
제80항에 있어서, 급속 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 TIL의 집단.
제80항 또는 제81항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 배양 배지에 IL-2가 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체가 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장이 14일 이하의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 확장 및/또는 급속 확장이 기체 투과성 용기를 사용하여 수행되는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 aAPC가 CD86 단백질, 및 4-1BBL 단백질, OX40L 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동-자극 분자를 발현하도록 형질도입된 MOLM-14 세포를 포함하는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 골수성 aAPC가 CD86 단백질, 및 4-1BBL 단백질, OX40L 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동-자극 분자를 발현하도록 형질도입된 EM-3 세포를 포함하는 것인 TIL의 집단.
제87항에 있어서, EM-3 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 형질도입된 것인 TIL의 집단.
제87항에 있어서, scFv 결합 도메인이 클론 7C12 (서열식별번호: 27) 또는 클론 8B3 (서열식별번호: 28), 또는 그의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 암, 두경부암, 신장암, 신세포 암종, 췌장암, 및 교모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 비-골수절제 림프구고갈 처방을 받고 있는 환자에 후속적으로 환자에게 투여하기 위한 것인 TIL의 집단.
제91항에 있어서, 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여, 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량의 플루다라빈의 투여에 후속적으로 투여하기 위한 것인 TIL의 집단.
제80항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 고-용량 IL-2 처방 전날에 투여하기 위한 것인 TIL의 집단.
제93항에 있어서, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인 TIL의 집단.
(1) 제80항 내지 제94항 중 어느 한 항의 TIL의 집단, (2) 시클로포스파미드 및 (3) 플루다라빈의 조합물이며, 여기서, 시클로포스파미드가 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것이고, 이어서 플루다라빈이 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로 투여하기 위한 것인 조합물.
제80항 내지 제92항 중 어느 한 항의 TIL의 집단 및 고-용량- IL-2 처방의 조합물이며, 여기서, 고-용량 IL-2 처방이 허용될 때까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여하기 위한 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨, 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인 조합물.
CD86, 및 4-1BBL, OX40L, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 공동자극 분자를 발현하도록 유전자 조작된 골수성 세포를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
제97항에 있어서, 골수성 세포가 EM-3 세포이고, 골수성 세포가 OKT-3 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 단일 쇄 단편 가변 (scFv) 결합 도메인을 발현하도록 추가로 유전자 조작된 것인 aAPC.
제98항에 있어서, EM-3 세포가 4-1BBL 및 OX40L을 발현하도록 유전자 조작된 것인 aAPC.
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