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ES2385239B1 - Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno. - Google Patents

Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno. Download PDF

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ES2385239B1
ES2385239B1 ES201001255A ES201001255A ES2385239B1 ES 2385239 B1 ES2385239 B1 ES 2385239B1 ES 201001255 A ES201001255 A ES 201001255A ES 201001255 A ES201001255 A ES 201001255A ES 2385239 B1 ES2385239 B1 ES 2385239B1
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Spain
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recombinant
collagenase
preparation
pharmaceutical form
combined preparation
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Juan Ramón MUÑOZ MONTAÑO
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Proteos Biotech SL
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Zurko Res S L
Proteos Biotech SL
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Abstract

Uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.#Uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del tejido conectivo. En concreto se refiere al uso de dichas enzimas, donde la proporción colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante es de 1:3, y a su uso secuencial, administrando primero colagenasa G y después colagenasa H.

Description

Uso
de G H recombinante
recombinante
el tratamiento de enfer medades cursan
con alteraciones del
La presente invención se encuentra dentro del campo de la de la biología molecular, la biotecnología y la medicina, y se refiere al uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno. En concreto se refiere al uso de dichas enzimas, donde la proporción colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante es de 1 :3, y a su uso secuencial, administrando primero colagenasa G y después colagenasa H.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El colágeno es el principal constituyente estructural de los mamíferos y constituye una gran proporción del contenido proteico total de la piel y otras partes del cuerpo. Numerosos traumas de la piel, como quemaduras, cirugías, infecciones, y accidentes, se caracterizan frecuentemente por la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno y con un alto contenido en proteoglucanos. Además de reparar el tejido normal que ha sido destruido o dañado, se acumulan depósitos excesivos y desfigurantes de colágeno. El exceso de colágeno se ha atribuido a un mal balance entre la síntesis y la degradación de colágeno.
Numerosas enfermedades y condiciones patológicas están asociadas con el exceso de depósito y acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno. Tales enfermedades y condiciones patológicas se han denominado colectivamente como "enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno". Las colagenasas se han empleado para tratar varias enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.
Las colagenasas son enzimas proteasas que se unen específicamente a secuencias de aminoácidos Pro-X-Gly-Pro, donde X es normalmente un aminoácido neutro. Estas secuencias son frecuentes en colágenos y raramente se dan en otro tipo de proteínas, de ahí su alta especificidad. Además, así como otros enzimas proteasas son capaces de degradar el colágeno desnaturalizado, las colagenasas G y H son las únicas capaces de atacar y degradar a triple hélice de colágeno en condiciones nativas encontradas comúnmente en tejido conectivo (Seifter y Harper, 1970. Methods Enzymol. 19, 613-635; Harper, 1980. Ann. Rev. Biochem. 49, 1063-1078; Peterkofsky 1982. Methods Enzymol. 82, 453-471)
La PZ-peptidasa se considera un enzima esencial en la degradación del colágeno en colaboración con proteasas colagenolíticas. Las propiedades de la
PZ-Peptidasa son:
(1)
Son metalooligoproteasas;
(2)
Poseen un motivo HEXXH de unión a Zn2+;
(3)
No tienen similitud con las colagenasas ColG y ColH de C.
histolyticum
(4)
Son capaces de degradar oligopéptidos pero no sustratos de
proteínas
Actualmente, el tratamiento de las enfermedades relacionadas con colágeno se lleva a cabo mediante una combinación en relación 1:1 de colagenasa G y H procedente de la fermentación de C/ostridium histolyticum y purificadas cromatográficamente, (W02007/089851A3). Algunas de estas enfermedades son la enfermedad de Dupuytren (US005589171A), o enfermedades oftálmicas (US4174389).
En todos los casos se expone el empleo de una mezcla de colagenasa (Col I y Col 11 o bien Col H y Col G). Este hecho se ha debido a que hasta la fecha todos los procedimientos de obtención de este enzima han sido mediante la purificación del extracto total producido por la fermentación de Closfridium hisfolyticum. En el extracto total de esta fermentación se obtiene ColG y ColH conjuntamente, en proporción 1 :1. Posteriormente se procede a un proceso de purificación mediante cromatografía para alcanzar una mezcla de ColG y ColH suficiente como para ser empleada como medicamento, como es el caso del Xiaflex, el primer medicamento a base de colagenasas aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren.
Xiaflex se facilita como un polvo liofilizado, que debe ser reconstituido en un diluyente antes de su uso. La dosis es de 0.58 mg por inyección en un cordón palpable metacarpofalangeal, o interfalangeal. Administrar cada 2 horas, 3 veces en intervalos de 4 semanas.
Este producto cursa con los siguientes efectos secundarios: Daño en los ligamentos, ruptura de tendones, CRPS (complex regional pain síndrome), edema periférico, contusión, dolor.
Xiaflex contiene colagenasa AUX-I y colagenasa AUX-II, aislados y purificadas' de la fermentación de las bacterias Closfridium hisfolyticum.
La colagenasa AUX-I es una cadena simple de polipéptidos que consiste aproximadamente en 1000 aminoácidos de secuencia conocida. Se observa un peso molecular de 114 kiloDaltons (kDa). Pertenece a la clase I de Colagenasas de Closfridium hysfoliticum.
La colagenasa AUX-II es una cadena simple de polipéptidos que consiste aproximadamente en 1000 aminoácidos de secuencia conocida. Se observa un peso molecular de 113 kiloDaltons (kDa). Pertenece a la clase 11 de Colagenasas de Closridium hysfoliticum.
No obstante, estos tratamientos poseen limitaciones derivadas de la fuente de origen y de la combinación de las colagenasas G y H en proporción 1: 1 que hacen del medicamento, un producto difícil de controlar en su dosificación y tratamiento. Los efectos secundarios más llamativos son:
1.
Ruptura de tendón y daños serios en las extremidades tratadas
2.
Reacciones alérgicas
3.
Problemas de coagulación
Es necesario, por tanto, encontrar un tratamiento alternativo que permita alcanzar un mayor efecto sin los efectos secundarios de los medicamentos actuales.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
Los autores de la presente invención han identificado el efecto terapéutico superior del empleo de la colagenasa G (CoIG ó AUX-I) y H (CoIH ó AUX-II) recombinantes (rCoIG y rCoIH), de forma separada o combinada, y más específicamente en relación 1:3, para alcanzar efectos farmacológicos que actualmente no se pueden alcanzar con los medicamentos actuales que tienen como principio activo colagenasa, y que además permite evitar los efectos laterales negativos derivados del empleo de colagenasas obtenidas por fermentación, y en proporciones 1: 1. Asimismo, los tratamientos farmacológicos promovidos por la PZ-peptidasa pueden ser complementarios a los de la ColG y ColH al actuar sobre sustratos más pequeños (oligopéptidos) y no sobre colágeno completo.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende colagenasa G Y colagenasa H en una proporción 1 :3.
En una realización preferida de este aspecto, la composición de la invención además comprende PZ-Peptidasa. En otra realización preferida, la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización más preferida, la composición de la invención comprende otro principio activo.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento, o alternativamente, al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo, o alternativamente a la composición de la invención para el tratamiento de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con desórdenes del tejido conectivo es una fibromatosis. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la fibromatosis S6 selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar, o la existencia de tejido fibroso en el lóbulo de la oreja
En esta memoria se entiende por desórdenes del tejido conectivo a enfermedades que cursan con acumulaciones de placas subdérmicas de dicha tejido.
El término fibromatosis refiere a un grupo de benigno tejido fino suave tumores cuáles tienen ciertas características en campo común, incluyendo la ausencia de características citológicas y clínicas malignas, a un cuadro histológico constante con la proliferación de fibroblastos bien distinguidos, una estructura de crecimiento infiltrativa, y un comportamiento clínico agresivo con la repetición local frecuente. Incluye diversos subtipos, entre los que se encuentran: fibromatosis juvenil, fibromatosis de colli, fibromatosis digital infantil, miofibromatosis infantil, ipofibromatosis, fibromatosis hialínica juvenil, fibromatosis plantar, enfermedad de Peyronie, y la contractura de Dupuytren.
La enfermedad de Dupuytren (también llamada contractura de Dupuytren, o contractura palmar de Dupuytren) consiste en la retracción de la palma de la mano con la consiguiente flexión fija de algunos dedos; normalmente, empieza con un engrosamiento de la piel de la palma de la mano, el cual se puede convertir en un bulto duro o banda gruesa.
La enfermedad de La Peyronie o induración plástica del pene es un proceso de causa desconocida caracterizado por una banda fibrosa en la túnica albugínea de los cuerpos cavernosos del pene. Suele ser unilateral y tiene como consecuencia la desviación del pene durante la erección. Dependiendo de la extensión de la banda fibrosa, el proceso puede imposibilitar la penetración o hacer que la erección resulte dolorosa.
La enfermedad de Ledderhose, también conocido como Morbus Ledderhose, fibromatosis plantar, y aponeurosis plantar, es un relativamente infrecuente espesamiento anómalo del tejido fino conectivo profundo de los pies, o faja. En el principio, donde los nódulos o las cuerdas comienzan a crecer adelante tendones del pie, la enfermedad es de menor importancia, puede ser dolorosa. Eventualmente, sin embargo, las cuerdas espesan, los dedos del pie se atiesan y se doblan, y el caminar llega a ser doloroso. Como en la mayoría de las formas de fibromatosis, es generalmente benigno y su inicio varía con cada paciente. Los nódulos son típicamente de crecimiento lento y encontrado lo más a menudo posible en las porciones centrales e intermedias de la faja plantar. De vez en cuando, los nódulos pueden permanecer inactivos por meses o años para comenzar de repente un crecimiento rápido e inesperado. Necesita solamente ser tratado quirúrgicamente si el malestar obstaculiza caminar.
En esta memoria las enfermedades que cursen con alteraciones del colágeno son fácilmente identificables por diagnóstico médico, mediante la ayuda de pruebas histológicas.
La "colagenasa G" posee una secuencia nucleotídica formada por 3357 nucleótidos (SEO ID NO: 3). Los 330 primeros codifican para un péptido señal (SEO ID NO: 4) ya que el primer aminoácido de la proteína madura secretada es el codificado por el codón ata. El péptido señal se incorpora para permitir la secreción del enzima en el medio extracelular. Una vez en la membrana bacteriana el péptido señal es cortado y el enzima activa es liberada al medio En el caso de la Colagenasa G recombinante, el último codón (stop codón) eS eliminado y en su lugar se añade una secuencia nucleotídica que codifica para 6 histidinas, necesarias para el posterior proceso de purificación o inmovilización en formas farmacéuticas.
La secuencia aminoacídica está formada por 1118 aminoácidos. Los 110 residuos del extremo amino terminal componen el péptido señal (SEO ID NO 5) Y los restantes 1008 para la colagenasa secretada (SEO ID NO: 1).
La colagenasa G con péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:
-
Peso molecular: 127 KOa.
-
Punto isoeléctrico: 5.8.
-
Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 160.
-
Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 142.
-
índice de inestabilidad teórico: 26.61, lo que clasifica a la proteína de
estable.
-
Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10
horas.
La colagenasa G sin péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:
-
Peso molecular: 114.8 KDa.
-
Punto isoeléctrico: 5.53.
-
Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 145.
-
Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 122.
-
índice de inestabilidad teórico: 24.11, lo que clasifica a la proteína de
estable.
-
Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10
horas.
En el contexto de la presente invención, "colagenasa G" (CoIG o AUX-I) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína "colagenasa G", y que comprende diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, ó
d) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucléicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína "colagenasa G". El término incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales.
La "colagenasa H" posee una secuencia nucleotídica formada por 3066 nucleótidos (SEQ ID NO: 6). Los 120 primeros SEQ ID NO: 7) codifican para un péptido señal ya que el primer aminoácido de la proteína madura secretada es el codificado por el codón gta). El péptido señal se incorpora para permitir la secreción del enzima en el medio extracelular. Una vez en la membrana bacteriana el péptido señal es cortado y el enzima activa es liberada al medio. En el caso de la Colagenasa H recombinante, el último codón (stop codón) es eliminado y en su lugar se añade una secuencia nucleotídica que codifica para 6 histidinas, necesarias para el posterior proceso de purificación o inmovilización en formas farmacéuticas.
La secuencia aminoacídica está formada por 1021 aminoácidos. Los 40 residuos del extremo amino terminal que componen el péptido señal (SEQ ID NO: 8) y los restantes 981 para la colagenasa secretada (SEQ ID NO: 2)
La colagenasa H con péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:
-
Peso molecular: 117.2 KOa
-
Punto isoeléctrico: 5.99
-
Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 142
-
Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 128
-
índice de inestabilidad teórico: 35.48, lo que clasifica a la proteína de
estable.
-
Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 1a
horas.
La colagenasa H sin péptido señal tiene los siguientes parámetros físico
químicos:
-
Peso molecular: 112.98 KOa
-
Punto isoeléctrico: 5.76
-
Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 141
-
Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 122
-
índice de inestabilidad teórico: 35.30, lo que clasifica a la proteína de
estable. -Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10 horas.
En el contexto de la presente invención, "colagenasa H" (CoIH o AUX-II) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína "colagenasa H", y que comprende diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, ó
d) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucléicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína "colagenasa H". El término incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales.
Debido a que existen varios tipos de colagenasas y cada una de ellas (G y H) poseen actividades y especificidades diferentes frente al colágeno, es conveniente el empleo de ambas enzimas de forma separada o combinada (en relación 1 :3) para alcanzar determinados efectos farmacológicos que actualmente no se pueden alcanzar con otros medicamentos.
Las colagenasas pueden emplearse por separado. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante segunda composición de la invención, que comprende colagenasa G y no colagenasa H.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante tercera composición de la invención, que comprende colagenasa H y no colagenasa G.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composlclon, de ahora en adelante cuarta composición de la invención, que comprende PZ-peptidasa y no colagenasa H o colagenasa G.
Tanto la segunda como la tercera composición de la invención pueden tener un vehículo farmacéuticamente aceptable, o los excipientes adecuados para su correcta formulación.
En otro aspecto de la invención se describe una preparación combinada (de ahora en adelante preparación combinada de la invención) que comprende, al menos, colagenasa G y colagenasa H en una proporción 1:3 para su uso por separado, simultáneo ó secuencial como medicamento. En una realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende PZPeptidasa. En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende otro principio activo.
Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.
Otro aspecto se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con desórdenes del tejido conectivo es una fibromatosis. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la fibromatosis se selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar, o la existencia de tejido fibroso en el lóbulo de la oreja
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa",. "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialment& proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la __ _ elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una formó modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Tanto las composiciones de la presente invención, así como la preparación combinada pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es una enfermedad que cursa con alteraciones del tejido conectivo, preferiblemente es una fibromatosis, y aún más preferiblemente es contractura palmar de Dupuytren, enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar.
Tales composiciones o preparaciones combinadas y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de colagenasa G, colagenasa H, o PZ-peptidasa que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora e adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende malquiera de las composiciones o preparaciones combinadas de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención la forma farmacéutica de la invención se selecciona de la lista que comprende: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es una solución. En otra realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es una crema.
El empleo de hidrogeles acoplados a los enzimas permite evitar la trasvasación del principio activo y disminuir efectos secundarios por acción en las zonas cercanas a las del tratamiento. Por tanto, en otra realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es un gel, y más preferiblemente un hidrogel.
En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.
Una "crema" es una forma farmacéutica que consiste en una preparación líquida o semisólida que contiene el o los principios activos y aditivos necesarios para obtener una emulsión, generalmente aceite en agua, con un contenido de agua superior al 20 por ciento.
Una "solución" es una forma farmacéutica que consiste en un preparado líquido, transparente y homogéneo, obtenido por disolución de él o los principios activos y aditivos en agua, y que se utiliza para el uso externo o interno. En el caso de soluciones inyectables, oftálmicas y óticas deben ser soluciones estériles.
Un "gel" es una forma farmacéutica que consiste en preparación semisólida, que contiene el o los principios activos y aditivos, sólidos en un liquido que puede ser agua, alcohol o aceite, de tal manera que se forma una red de partículas atrapadas en la fase liquida.
Los hidrogeles son materiales poliméricos entrecruzados en forma de red tridimensional de origen natural o sintético, que se hinchan en contacto con el agua formando materiales blandos y elásticos, y que retienen una fracción significativa de la misma en su estructura sin disolverse. Los geles se pueden clasificar en dos tipos, en función de la naturaleza de las uniones de la red tridimensional que los constituyen: geles físicos y geles químicos,
Todas las enzimas (colagenasa G, colagenasa H y PZ-Peptidasa) poseen una cola de 6 histidinas que permiten conjugar las enzimas a los hidrogeles, como el ácido hialyurónico o azarosa. La cola de 6 histidinas además permite purificar los enzimas empleando cromatografía de afinidad a Níquel.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Efecto sinérgico del empleo de colagenasa G y colagenasa H en proporción 1 :3. Actividad de la colagenasa G y la colagenasa H por separado, yen combinación, en proporción 1 :3.
Fig.2..Esquema del efecto de las colagenasas y la PZ.peptidasa.
Fig. 3. Figura esquemática de la aplicación de las colagensas. Fase 1: Rotura parcial de fibras de colágno. Distensión parcial de fibras. Fase 2: Se alcanza hidrólisis de fibras de colágeno. Distensión casi total de las fibras. Fase 3: Se hidrolizan los oligopéptidos resultantes. Facilitación de la absorción de colágeno.
Fig. 4. Comprobación por SOS -PAGE de la concentración y pureza de la enzima A: Col.H, B: CoI.G.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.
Obtención y características de las colagenasas
Colagenasa H y Colagenasa G son metaloproteinasas (clase 11) capaces de degradar específicamente las regiones helicoidales del colágeno, reconociendo el motivo Gly-Pro-X característico de la macromolécula. Estas proteínas poseen una cola de 6 Histidinas en su extremo carboxilo (Demina & Lysenko. Mikrobiologiía. 1996 May-Jun;65(3):293-304).
Punto isoeléctrico y Peso molecular: CoI,H: pi 5.76, PM 112.98 KDa; CoI,G: pi
5. 53, PM 114.8 KDa
Pureza: 99,9% Purificación en columnas de afinidad por Níquel
Se presenta como liofilizada y estéril. Se emplea agua estéril desionizada para su óptima reconstitución:
Preparación del Stock. Para la preparación Colagenasa G/H 1:3 la presentación liofilizada contiene 800 CDUs (aprox 0.3mg). Para su administracón se recomienda resuspender el contenido del vial en 1 mi de agua mQ estéril (incluida) para obtener una disolución de la enzima 800 CDUs/ml en buffer Tris 20 mM pH 8.0. Se recomienda preparar esta solución en el momento de su utilización. La dosis recomendada dependerá del grado de evolución de la enfermedad variando entre 100-800 CDUs por aplicación. La colagenasas G y H recombinantes presenta una actividad 4-10 veces mayor que las mejores enzimas comerciales del mercado (ensayada in vitro a pH 8.0;
37 OC).
La colagenasas G y H recombinantes no presenta actividad proteasa inespecífica (caseinasa) Test Ladd-Butler negativo. No contiene endotoxinas (test Gen Script negativo).
Obtención y características de la PZ-Peptidasa
Organismo de origen: Bacillus licheniformis Producida de forma recombinante en: Escherichia coli BL21 DE3 rosetta y Bacillus megaterium Descripción: La PZ-peptidasa de PROTEOS Biotech se considera un enzima esencial en la degradación del colágeno en colaboración con proteasas colágeno líticas. Las propiedades de la PZ-Peptidasa son:
(1)
Metalooligoproteasas;
(2)
Poseen un motivo HEXXH de unión a Zn2+;
(3)
No tienen similitud con las colagenasas ColG y ColH de C.
histolyticum
(4) Capaces de degradar oligopeptidos pero no sustratos de proteínas
Son proteasas de gran pureza al ser producidas en condiciones recombinantes y purificadas por cromatografía de afinidad. La Pl peptidasa procede de Baeillus Iieheniformis cepa PWD y producidas en Baeillus megaferium y E. eoli.
5 Punto isoeléctrico y Peso molecular Pl peptidasa: pi 5.16, PM 76,95 KDa Pureza: 99,9% Purificación en columnas de afinidad por Níquel Presentación: Liofilizada y estéril. Se acompaña de agua estéril desionizada para su óptima reconstitución: Disponible en viales de 100 y 300 Unidades. Preparación del Stock. Se recomienda resuspender el contenido del vial en agua mQ estéril
10 (incluida) para obtener una disolución de la enzima en buffer Tris 20 mM pH
8.0. Se recomienda preparar esta solución en el momento de su utilización.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3.
  2. 2.
    La composición según la reivindicación anterior, que además comprende PZ-Peptidasa recombinante.
  3. 3.
    La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  4. 4.
    La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que además comprende otro principio activo.
  5. 5.
    El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la elaboración de un medicamento.
  6. 6.
    Una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3.
  7. 7.
    La preparación combinada según la reivindicación anterior, que además comprende PZ-Peptidasa recombinante.
  8. 8.
    La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  9. 9.
    La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que además comprende otro principio activo.
  10. 10.
    El uso de una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, para su uso por separado, simultáneo o secuencial como medicamento.
  11. 11.
    El uso de una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3, para la elaboración de un medicamento, caracterizado porque se administra primero la colagenasa G recombinante, y después la colagenasa H recombinante.
  12. 12.
    El uso de una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1:3, y además PZ-peptidasa recombinante, para la elaboración de un medicamento, caracterizado porque se administra primero la colagenasa G recombinante, después la colagenasa H recombinante, y por último la PZPeptidasa recombinante.
  13. 13.
    Forma farmacéutica que comprende la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9.
  14. 14.
    Forma farmacéutica según la reivindicación anterior que se selecciona de la lista que comprende: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, jalea, gel, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones.
  15. 15.
    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es una solución.
  16. 16.
    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es una crema.
  17. 17.
    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es un gel.
  18. 18.
    El uso de la composición según cualquiera de las composiciones 1-4, de
    5 una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, o de una forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursen con alteraciones del tejido conectivo.
    10 19. El uso de la composición, de una preparación combinada o de una forma farmacéutica según la reivindicación 18, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibromatosis.
  19. 20. El uso de la composición, de una preparación combinada o de una forma
    15 farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18-19, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren, enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar.
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