KR20190015641A

KR20190015641A - 살모넬라 컨쥬게이트 백신

Info

Publication number: KR20190015641A
Application number: KR1020197003712A
Authority: KR
Inventors: 칼만 알렉산더 맥클레넌; 라우라 바틀 마틴; 프란세스카 미콜리; 앨런 제임스 사울
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2019-02-13
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: CA2929114A1; MX358829B; EP3065781B1; JP2016536317A; US10098947B2; ZA201602834B; CN105828839A; EP3065781A1; JP6289632B2; IL245217A0; WO2015068129A1; KR102112663B1; CN105828839B; CA2929114C; MX2016006001A; BR112016010072A8; IL245217B; EP2870974A1; EA201690857A1; BR112016010072B1

Abstract

본 발명은 단편화되는 Vi 다당류 및 담체 단백질을 기초로 한 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 및 상기 컨쥬게이트 및 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

살모넬라 컨쥬게이트 백신{SALMONELLA CONJUGATE VACCINES}

발명의 배경

박테리아로부터의 당류는 백신에서 수많은 해 동안 사용되어 왔다. 그러나, 당류는 T-독립성 항원임에 따라, 이들은 면역원성이 불충분하다. 또한, 이들은 2세 이하의 영아 또는 유아에서 효과가 없다. 담체로의 컨쥬게이션은 T-독립성 항원을 T-의존성 항원으로 효과적으로 전환시킬 수 있고, 이에 의해 기억 반응을 향상시킬 수 있고, 방어 면역이 발생하도록 할 수 있다. 따라서, 현재까지 가장 효과적인 당류 백신은 글리코컨쥬게이트를 기반으로 하는 것이다. WO95/31994호 및 WO94/03208호 둘 모두(Yeda Research and Development Co. Ltd.), US 5,204,098호 및 WO2008/081022호는 불충분한 면역원성 항원의 컨쥬게이트에 관한 것이다.

많은 컨쥬게이션 공정은 짧은 올리고당류를 이용하며, 이는 주로 제조 과정을 개선(더 나은 제조 일관성의 제어, 더 나은 최종 제품의 특징)시키기 위한 것이다. 당류 사슬 길이가 컨쥬게이트 백신의 면역원성에 영향을 미칠 수 있음이 널리 공지되어 있다(P. Costantino et al. Expert Opin. Drug Discov., 6 (2011) 1045). IN1330MUM2010호(Serum Institute of India Ltd)는 컨쥬게이션에 적합한 다당류 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다. US 6,045,805호는 또한 올리고당류를 제조하기 위한 방법을 기재한다.

장티푸스는 개발도상국에서 심각한 질병으로 남아 있으며, 이는 해마다 수백만 명의 사람을 감염시킨다(Crump JA et al., Bull. Wld. Hlth. Org. 82, 346-353 (2004); Ochai RL et al. and the Domi Typhoid Study Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86, 260-268 (2008)). 지난 10년 간, 컨쥬게이트 백신이 상기 질병에 대해 개발되어 왔다. 예를 들어, Vi(살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피(Typhi)로부터의 다당류) 및 rEPA 단백질 담체를 기초로 한 안전하고 매우 면역원성인 컨쥬게이트 백신이 NICHD/NIH에 의해 개발되었다(Lanh et al., N. Eng. J. Med. 2003; Thiem et al., Clin Vac. Immunol. 2011; Szu, Expert Rev. Vaccines 12(11), 1273-1286 (2013)). 다수의 논문에는 Vi의 면역원성, 이의 컨쥬게이트 백신 및 지금까지 최적으로 간주되는 Vi 사슬 길이가 논의되어 있다(Szu et al., Infection and Immunity, 1989, 3823; Szu et al., Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu et al. Infection and Immunity, 1994, 5545; Kossaczka et al., Infection and Immunity, 1999, 5806; Cui et al., Clin. Vaccine Immunol., 17 (2010), 73-79; Micoli et al., Vaccine, 29 (2011), 712-720; An et al., Vaccine, 29 (2011), 7618-23; Rondini et al., Clin.Vaccine Immunol., 18 (2011), 460-68; An et al., Vaccine, 30 (2012), 1023-1028).

더욱 최근에는, 정제된 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii)(광의(sensu lato))로부터의 Vi 및 CRM₁₉₇ 단백질 담체를 기초로 한 살모넬라 티피(Salmonella Typhi) 백신 컨쥬게이트가 문헌[Micoli et al. Vaccine 2012 and Rondini et al., J. Infect. Dev Ctries, 2012]에 의해 기재되었다. 인간에서 시험하는 경우, Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트 백신은 단일 면역화 후 적은 용량에서 컨쥬게이션되지 않은 Vi에 비해 높은 항-Vi 항체 반응을 제공하였다(문헌[van Damme et al., PlosOne 2011]; 추가 결과는 8^th International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmonelloses, Bangladesh, March 2013에서 제시되었음). 그러나, 재접종 후의 항-Vi 반응은 일차 반응보다 낮았고, 항-Vi 지속성은 요망되는 것보다 짧았다(Bhutta et al. Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119).

따라서, 개선된 컨쥬게이트 백신을 제공하는 것이 여전히 필요하다.

발명의 개요

본 발명은 단편화되는 Vi 다당류 및 담체 단백질을 기초로 한 컨쥬게이트에 관한 것이다. 특히, 단편화된 Vi 다당류는 40 내지 55 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 본 발명은 추가로 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 포유동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 방법, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 포유동물에서 T-독립성 면역 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 면역 반응을 발생시키기 위한 방법, 유효량의 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 장티푸스의 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 상기 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 방법, 및 상기 컨쥬게이트의 제조를 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 컨쥬게이트는 기억 반응을 유도하고, 재접종시 부스터 효과를 제공하고, 항체 수준을 유지시킬 수 있어야 한다. 이상적으로는, 컨쥬게이트는 모든 연령 집단, 특히 2세 이하 연령의 아동에서 효과적이어야 한다.

도 1은 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하기 위한 합성 단계를 제시한다(PS = 단편화된 다당류; prot. = 담체 단백질; RC=N=CR'은 임의의 카르보디이미드, 통상적으로, 예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드일 수 있음).
도 2는 그룹 1 내지 10의 마우스에서의 면역학적 반응을 제시한다. 그룹 1 내지 4는 단편화된 Vi 및 담체 단백질로서 CRM₁₉₇을 포함하는 컨쥬게이트로 면역화되었으며, 여기서 그룹 1의 단편화된 Vi는 9.5 kDa의 평균 분자량(avMW)을 갖고; 그룹 2의 단편화된 Vi는 22.8 kDa의 avMW를 갖고; 그룹 3의 단편화된 Vi는 42.7 kDa의 avMW를 갖고; 그룹 4의 단편화된 Vi는 82 kDa의 avMW를 갖는다. 그룹 5는 CRM₁₉₇에 컨쥬게이션된 천연 Vi가 주사되었고, 그룹 6 내지 9는 각각 그룹 1 내지 4의 avMW를 갖는 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi가 주사되었다. 그룹 10에는 천연 Vi가 투여되었다.
도 3은 살모넬라 티피 Vi 다당류의 반복 단위를 제시하며, 여기서 Ac는 아세틸기이다.
도 4는 천연 Vi 및 단편화된 Vi에서의 O-아세틸화의 양을 나타내는 ¹H NMR 스펙트럼(NaOD 200 mM 중, RT, 500 MHz)(풀 1-4)을 제시한다.
도 5는 단편화된 Vi 혼합물에 비한 천연 Vi의 HPLC-SEC 프로파일(214 nm)을 제시하고, 도 6은 상이한 avMW의 4개의 단편화된 Vi 풀(풀 1-4)을 제시한다. 샘플은 TSK 젤 3000 PWXL 컬럼에서 런닝(running)되고, 0.5 mL/분으로 NaH₂PO₄ 100 mM NaCl 100mM 5% CH₃CN pH 7.2로 용리된다; Vo 10.663분; Vtot 23.326분.
도 7은 단편화된 Vi avMW 42.7 kDa의 HPLC-SEC 프로파일(214 nm)을 제시한다(TSK 젤 3000 PWXL 컬럼, NaH₂PO₄ 100 mM NaCl 100mM 5% CH₃CN pH 7.2, 0.5 mL/분; Vo 10.663분; Vtot 23.326분; 기준으로서 덱스트란 이용). 피크 영역의 80%는 70 내지 25 kDa이다.
도 8은 전장의 컨쥬게이션되지 않은 Vi, 전장의 Vi 컨쥬게이트 및 단편화된 Vi 컨쥬게이트로 면역화되는 경우 T-세포 넉아웃(TCR βδ^-/-)에 대한 야생형 마우스에서 관찰된 반응을 제시한다.
도 9는 CRM₁₉₇, DT 및 TT에 컨쥬게이션된 전장 Vi 컨쥬게이트 및 단편화된 Vi 컨쥬게이트에서 관찰된 반응을 제시한다.

본 발명은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 단편화된 Vi를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.

본 명세서를 설명하기 위한 목적상, 하기 정의가 적용될 것이며, 적절한 때 언제든지, 단수형으로 사용되는 용어는 또한 복수형을 포함할 것이며, 그 반대도 마찬가지이다.

본원에서 사용되는 단수 관사 및 본 발명의 문맥(특히, 청구항의 문맥)에서 이용되는 유사한 용어는 본원에 달리 표시하거나 문맥에 의해 명백히 반대되지 않는 한 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

숫자 값 x와 관련한 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "Vi" 또는 "Vi 다당류"는 시트로박터(Citrobacter)로부터 정제된 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피의 캡슐 다당류를 나타낸다(Rondini et al., J. Infect. Dev. Ctries, 2012).

본원에서 사용되는 용어 "천연 다당류"는 다당류의 크기를 감소시키기 위한 목적인 공정에 적용되지 않은 다당류를 나타낸다.

Vi 다당류와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단편화된"은 크기 감소를 겪고 이에 따라 다당류 내에 감소된 수의 반복 단위를 갖는 Vi 다당류를 나타낸다. 따라서, 단편화된 Vi는 천연 Vi에 비해 낮은 avMW를 갖는다. 예를 들어, 천연 Vi에 대한 600개 초과의 반복 단위에 비해 단편화된 Vi는 30 내지 300개의 반복 단위를 포함할 수 있다. Vi 단량체 반복 단위의 구조가 도 3에 제시된다. 본 발명의 단편화된 Vi에서, 바람직하게는 천연 Vi에 비해 반복 단위의 구조에서 변화가 관찰되지 않는다. 이는 ¹H NMR 분석에 의해 확인될 수 있다(도 4 참조). 또한, 단편화된 Vi에서의 O-아세틸기의 백분율은 바람직하게는 천연 Vi와 동일(즉, 약 95% O-아세틸화)하나, 변화될 수 있고, 약 65% O-아세틸화로 감소될 수 있다. O-아세틸화는 ¹H NMR, Hestrin 비색 방법과 같은 표준 측정에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "풀(pool)"은 규정된 평균 분자량 범위를 갖고, 표준 방법에 의해 서로 분리될 수 있는 단편화된 Vi의 그룹을 나타낸다. 풀은 본원에 규정된 바와 같은 단편화된 Vi로 구성된다.

천연 크기에서, Vi 다당류는 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC)에 의해 측정된 약 165kDa의 평균 분자량을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 단편화된 Vi는 40 내지 55 kDa의 avMW를 갖는다. 이러한 값은 HPLC-SEC에 의해 측정된다. 통상적으로, 평균 분자량은 기준(5, 25, 50, 80, 150 kDa)으로서 덱스트란을 이용하여 TSK 젤 3000 PWXL 컬럼(30 cm x 7.8 mm; 입자 크기 7 ㎛; cod. 808021)과 TSK 젤 PWXL 가드(guard) 컬럼(4.0 cm x 6.0 mm; 입자 크기 12 ㎛; cod. 808033)(Tosoh Bioscience) 상에 샘플을 런닝시킴으로써 계산된다. 이동상은 0.5 mL/분의 유량의 0.1 M NaCl, 0.1 M NaH₂PO₄, 5% CH₃CN, pH 7.2(30분 동안의 등용매 방법)이다. 공극 부피 및 충전 부피 교정은 각각 λ-DNA(λ-DNA 분자량 마커 III 0.12-21.2 kb; Roche) 및 소듐 아지드(NaN₃; Merck)로 수행된다.

본 발명의 단편화된 Vi는 상이한 평균 분자량 범위의 풀로 추가로 분리될 수 있다. 이는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 접선 유동 여과에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 단편화된 Vi는 약 40 내지 55 kDa, 더욱 바람직하게는 42 내지 53 kDa, 더욱 더 바람직하게는 45 내지 50 kDa의 avMW를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 단편화된 Vi는 약 41 내지 49 kDa, 바람직하게는 41 내지 48 kDa, 더욱 바람직하게는 42 내지 46 kDa의 avMW를 갖는다. 추가 구체예에서, 단편화된 Vi는 약 43 kDa의 avMW를 갖는다. 추가 구체예에서, 단편화된 Vi는 51 내지 55 kDa, 바람직하게는 52 내지 54 kDa의 avMW를 갖는다. 추가 구체예에서, 단편화된 Vi는 약 53 kDa의 avMW를 갖는다.

Vi 또는 이의 단편의 평균 분자량이 측정 방법에 따라 변할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 평균 분자량에 대해 제공된 값은 통상적으로 본원에 기재된 컬럼, 완충액 및 기준을 이용한 HPLC 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다. 그러나, 당업자는 이용되는 컬럼, 완충액 및/또는 기준에서의 변화가 계산되는 평균 분자량에 영향을 미칠 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 천연 Vi는 본원에 기재된 방법을 이용하여 측정하는 경우의 165 kDa에 비해 0.45 mL/분에서 Acquity UPLC BEH200 1.7 mm 컬럼(4.6 x 150 mm)을 갖는 UPLC-SEC 시스템을 이용하여 측정하는 경우 148 kDa의 계산된 avMW를 갖는다. 따라서, 약 +/- 10%의 측정된 avMW에서의 변화가 발생할 수 있으며, 본 발명은 절대 값에 의해 제한되는 것이 아니라, 측정 변화의 범위 내에서 변할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

본 발명에서 사용되는 단편화된 Vi의 풀은 다분산지수(PDI)에 의해 추가로 특성규명될 수 있는 특정 평균 분자량 범위 분포를 갖는다. 다분산지수는 하기 식에 제시된 바와 같이 계산된다:

PDI = M_w / M_n

여기서, M_w는 중량 평균 분자량이고, M_n은 수 평균 분자량이다.

분자량 분포가 좁을수록, PDI 값은 1에 가깝다.

단편화된 Vi의 풀은 풀의 적어도 80%가 25 kDa 내지 70 kDa의 avMW를 갖는 것을 특징으로 하는 avMW 분포를 가질 수 있다. 이는 풀의 적어도 50%가 35 kDa 내지 60 kDa의 avMW를 갖는 것을 특징으로 하는 avMW 분포를 가질 수 있다. 이는 풀의 적어도 30%가 41 kDa 내지 55 kDa의 avMW를 갖는 것을 특징으로 하는 avMW 분포를 가질 수 있다.

단편화는 당 분야에 공지된 다수의 방법, 예를 들어, 천연 다당류의 화학적 가수분해, 천연 다당류의 효소적 단편화, 천연 다당류의 감마 방사선조사, 또는 기계적 방법, 예를 들어, 천연 다당류의 음파처리, 고압 균질기/미세유체화기/HPCDS(고압 세포 파괴 시스템)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 단편화 방법은 80 kDa 미만, 바람직하게는 60 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 40 내지 55 kDa의 avMW를 갖는 단편화된 Vi를 생성시킬 수 있도록 선택된다.

상기 방법은 또한 바람직하게는 반복 단위의 구조에 대한 변경이 존재하지 않도록 선택된다.

바람직하게는, 단편화는 기계적 방법에 의하지 않는다. 바람직하게는 단편화는 알칼리성 가수분해에 의하지 않는다.

본 발명의 단편화된 Vi는 바람직하게는 과산화수소를 이용한 화학적 가수분해에 의해 획득된다. 상기 방법을 이용하여, Vi 다당류가 반복 단위의 구조를 변경시킴이 없이 크기에 있어서 감소될 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 과산화수소를 이용한 가수분해는 기계적 방법을 이용하는 경우보다 낮은 평균 분자량을 갖는 단편화된 Vi의 형성을 가능케 할 수 있다.

본 발명의 단편화된 Vi가 과산화수소를 이용한 화학적 가수분해에 의해 획득되는 경우, 촉매량의 염화제이철(FeCl₃)의 첨가가 더 가벼운 조건(더 낮은 온도 및 더 짧은 반응 시간) 하에서 반응이 진행되도록 하는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 양태에서, 염화제이철의 존재하에서 천연 다당류와 과산화수소를 반응시키는 단계를 포함하는 다당류를 단편화시키기 위한 방법이 제공된다. 더욱 특히, 본 발명의 양태는 염화제이철의 존재하에서 천연 Vi와 과산화수소를 반응시키는 단계를 포함하는 Vi를 단편화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 더 특히, 상기 방법은 물 및 0.1 mM 염화제이철 중에서 Vi와 약 3% 과산화수소를 반응시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 반응의 온도는 약 20-40℃이다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 황산제일철의 존재하에서 천연 다당류와 과산화수소를 반응시키는 단계를 포함하는 다당류를 단편화시키기 위한 방법이 제공된다. FeCl₃보다 더욱 가용성인 황산제일철의 사용은 더욱 재현성 있는 공정을 발생시킨다. 구체예에서, 본 발명은 촉매로서 황산제일철의 존재하에서 천연 Vi와 과산화수소를 반응시키는 단계를 포함하는 Vi를 단편화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 0.1 mM 황산제일철의 존재하에서 물 중에서 천연 Vi와 약 0.5% 과산화수소를 반응시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 반응의 온도는 약 20-40℃이다. 상기 방법에 의해 획득된 단편화된 Vi는 바람직하게는 본 발명의 컨쥬게이션 방법에서 사용하기 전에 가열 단계(약 80℃)에 적용된다.

일반적으로, 단편화에 이어 정제가 후속된다.

정제는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상적으로, 정제는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된다.

정제는 통상적으로 상이한 길이 및 상이한 평균 분자량 범위의 단편화된 Vi의 "풀"을 발생시킨다.

본 발명의 컨쥬게이트의 담체 단백질은 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 톡소이드로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM₁₉₇이다. 도 9는 CRM₁₉₇, 디프테리아 톡소이드(DT) 및 파상풍 톡소이드(TT)에 컨쥬게이션된 단편화된 Vi의 면역학적 반응에서의 차이를 제시한다. 단편화된 Vi와 CRM₁₉₇ 및 디프테리아 톡소이드(DT)의 컨쥬게이트에 대해 관찰된 반응은 전형적인 T-의존성 면역 반응(첫번째 주사(14일 및 35일) 후 낮은 면역학적 반응 및 이후 두번째 주사(49일) 후 부스터 반응)이다. 비교시, 단편화된 Vi와 파상풍 톡소이드(TT)의 컨쥬게이트는 두번째 용량에 대한 명백한 이차면역 반응 없이 1회 용량의 백신에 대해 높은 항체 반응을 나타내었고, 이러한 발견은 현저한 T-독립성 반응이 존재하는 경우에 관찰된다.

본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는 단편화된 Vi 및 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 톡소이드로부터 선택된 담체 단백질을 포함하는 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다:

a) Vi 다당류를 단편화시켜 40 내지 55 kDa의 avMW를 갖는 단편화된 Vi 다당류를 획득하는 단계;

b) 5 내지 6의 pH에서 단계 a)에서 획득된 단편화된 Vi 다당류와 카르보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드를 반응시켜 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 형성시키는 단계; 및

c) 단계 b)에서 획득된 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 담체 단백질을 반응시켜 상기 컨쥬게이트를 생성시키는 단계.

본 발명의 방법의 구체예는 도 1에 도시되어 있다.

본 발명의 방법에서, 단계 a)에 이어 정제 단계가 임의로 후속된다. 정제 단계는 상이한 평균 분자량 범위의 단편화된 Vi 풀을 발생시킨다. 40 내지 55 kDa의 평균 분자량 범위를 갖는 단편화된 Vi 풀이 본 발명의 방법의 단계 b) 및 c)에서 사용된다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서 이용되는 카르보디이미드는 수성 매질에서 당류와 단백질을 컨쥬게이션시킬 수 있는 임의의 적합한 카르보디이미드일 수 있다. 통상적으로, 이용되는 카르보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드)(EDAC)이다. 대안적으로, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트(CMC)가 이용될 수 있다.

상기 방법의 단계 b)에서, 단편화된 Vi 다당류는 바람직하게는 COOH 기와 관련하여 50 μmol/mL 내지 200 μmol/mL의 농도로 존재한다.

상기 방법의 단계 b)에서, 단편화된 Vi의 농도는 약 15 mg/mL 내지 약 50mg/mL일 수 있다. 단편화된 Vi의 avMW가 낮을수록, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 존재할 수 있는 Vi의 농도가 높다.

반응 매질에서 카르보디이미드 대 단편화된 Vi의 COOH 기의 몰 비는 1:1 내지 10:1로 다양할 수 있다. 이는 5:1일 수 있다. 단편화된 Vi의 COOH 기의 수는 통상적으로 Vi 반복 단위의 수에 상응한다.

단계 b)에서, 단편화된 Vi의 카르복실산 기와 카르보디이미드의 반응은 O-아실우레아 중간체를 제공하며, 이는 차례로 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 반응하여 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 형성한다.

단계 b)에서 이용되는 NHS의 농도는 바람직하게는 약 0.1M 내지 0.4M이다.

본 발명의 방법을 위한 반응 매질은 통상적으로 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액이다.

단계 b)에 대한 반응 시간은 통상적으로 약 1시간이다. 반응 온도는 통상적으로 약 20-30℃이다.

단계 b)에서 획득된 결과로서 발생된 중간체(에스테르 기로 유도체화된 단편화된 Vi)는 전체 당 함량에 대해 HPAEC-PAD(펄스식 전류측정 검출(Pulsed Amperometric Detection)을 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피) 및 NHS 정량에 대해 이온쌍 HPLC-RP(역상 HPLC)에 의해 분석될 수 있다. 이는 활성화된 단편화된 Vi 반복 단위(즉, NHS와 반응하는 단편화된 Vi)의 %를 결정하는 것을 가능케 한다. 바람직하게는, 활성화된 단편화된 Vi의 %는 10-50%, 더욱 바람직하게는 약 20-30%이다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서 획득된 중간체는 임의로 낮은 pH에서의 탈염 또는 에탄올 침전에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 c)에서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 획득된 N-하이드록시숙신이미드 에스테르가 이후 담체 단백질과 반응되어 단편화된 Vi 및 상기 담체 단백질을 포함하는 컨쥬게이트가 생성된다.

담체 단백질은 백신에서 사용하기 위한 컨쥬게이트의 제조에서 통상적으로 사용되는 단백질이다. 예를 들어, 담체 단백질은 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 톡소이드일 수 있다. 가장 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM₁₉₇이다.

담체 단백질은 본 발명의 방법의 단계 b)에서 획득된 NHS 에스테르와의 반응 전에 유도체화될 수 있다. 단백질 담체는 통상적으로 하이드라지드로 유도체화될 수 있다. 통상적으로, 단백질 담체는 아디프산 디하이드라지드(ADH)로 유도체화된다(도 1에 제시된 바와 같음).

본 발명의 방법의 단계 c)에서 담체 단백질로 CRM₁₉₇이 사용되는 경우, Vi 대 CRM₁₉₇의 w/w 비는 바람직하게는 2:1 내지 1:2이다. 예를 들어, 이는 2:1, 1:1 또는 1:2일 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 c)에서, 반응 매질에서 유도체화된 단편화된 Vi, 즉, N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르의 농도는 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL일 수 있다. 단편화된 Vi의 평균 분자량이 낮을수록, 본 발명의 방법의 단계 c)에서 존재할 수 있는 NHS-에스테르의 농도는 높다.

본 발명의 방법의 단계 c)에 대한 반응 시간은 통상적으로 약 2시간이다. 본 발명의 방법의 단계 c)에 대한 반응 시간은 통상적으로 약 20-30℃이다. 공지된 방법이 반응의 완료를 평가하기 위해 이용될 수 있다.

컨쥬게이션 단계 c)는 바람직하게는 일반적으로 약 20 mM의 농도에서 MES 완충액 pH 6에서 수행된다.

본 발명의 방법의 단계 c)에서, pH는 바람직하게는 약 6이다. 이러한 pH 값은 컨쥬게이션 화학에서 NHS를 이용하는 경우에 보고된 것보다 낮다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 상기 pH 범위에서, NHS 가수분해는 높은 pH에서보다 느려, 더욱 효과적인 컨쥬게이션 공정을 발생시키는 것으로 생각된다.

본 발명의 방법에 의해 획득된 컨쥬게이트는 추가 정제 공정에 적용될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피 또는 접선 유동 여과, 소수성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 단계 b)에서 이용되는 카르보디이미드 및 NHS의 존재는 단편화된 Vi 반복 단위의 구조를 변경시킴이 없이 높은 컨쥬게이션 효율을 갖는 것을 가능케 한다. 카르보디이미드, 예를 들어, EDAC만이 이용되는 경우(즉, NHS의 존재 없음), 공정을 효과적으로 만들기 위해 높은 농도의 상기 카르보디이미드가 요구된다. 또한, 단편화된 Vi의 COOH 기 상에 N-아실 우레아 기가 생성되어, 다당류 구조를 변형시키고, 이의 에피토프를 변경시킨다. NHS의 사용은 이들 유도체의 형성을 회피한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 단편화된 Vi 컨쥬게이트 내의 이들 유도체의 백분율은 몰을 기준으로 2% 미만(카르보디이미드/Vi의 COOH)이고, 또한 잔여 에스테르 기는 몰을 기준으로 1% 미만이다.

본 발명의 방법에 의해 획득된 컨쥬게이트는 또한 20% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만의 자유로운, 즉, 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi의 양을 특징으로 한다. 바람직하게는, 자유로운 단편화된 Vi는 검출되지 않는다. 또한, 바람직하게는 자유로운 단백질이 검출되지 않는다. 본 발명의 컨쥬게이트는 이들의 단편화된 Vi 대 담체 단백질 비에 의해 추가로 특성규명될 수 있다. 예를 들어, 단편화된 Vi:단백질 담체의 w/w 비는 약 1.5:1 내지 약 1:3일 수 있다. 이들 비는 사용되는 단편화된 Vi의 평균 분자량 범위에 따라 변할 수 있다. 이들은 또한 사용되는 담체 단백질에 따라 변할 수 있다. 담체 단백질로서 CRM₁₉₇이 사용되는 경우, Vi 대 CRM₁₉₇의 w/w 비는 약 0.33 내지 약 1.33일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 이는 약 0.33이다. 본 발명의 구체예에서, 이는 약 0.52이다. 본 발명의 구체예에서, 이는 약 0.64이다. 본 발명의 구체예에서, 이는 약 1.33이다.

디프테리아 톡소이드(DT)가 단백질 담체로 사용되는 경우, Vi 대 DT의 w/w 비는 약 0.85일 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트는 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%의 O-아세틸화를 갖는다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 약 95%의 O-아세틸화를 갖는다. 이는 천연 Vi의 O-아세틸화와 동등하며, 단편화된 Vi 단량체 반복 단위의 구조가 단편화에 의해 변경되지 않는 것의 확증이다.

O-아세틸화의 백분율은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, ¹H NMR, Hestrin 비색 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 컨쥬게이트는 5 내지 25 ㎍의 단편화된 Vi를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 컨쥬게이트는 8 ㎍의 단편화된 Vi를 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 컨쥬게이트의 담체 단백질은 CRM₁₉₇이다. 본 발명의 구체예에서, 컨쥬게이트는 5 내지 25 ㎍의 CRM₁₉₇을 포함한다. 한 구체예에서, 컨쥬게이트는 10 내지 15 ㎍의 CRM₁₉₇을 포함한다.

본 발명의 한 컨쥬게이트에서, 단편화된 Vi의 양은 8 ㎍이고, CRM₁₉₇의 양은 12.5 ㎍이다.

본 발명의 컨쥬게이트는 본원에 기재된 방법에 의해 추가로 획득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 컨쥬게이트가 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명의 컨쥬게이트는 약학적 조성물로 추가로 가공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장성 작용제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료 등 및 이들의 조합물을 포함한다(예를 들어, 문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립되지 않는 것을 제외하고는, 치료 또는 약학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다.

본 발명의 화합물의 용어 "치료적 유효량"은 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하거나 질병을 예방하는 등의 본 발명의 컨쥬게이트의 양을 나타낸다. 한 비제한적 구체예에서, 용어 "치료적 유효량"은 대상체에 투여되는 경우 살모넬라 티피에 의해 매개되는 질환 또는 장애 또는 질병을 예방하는데 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물을 나타낸다. 통상적으로, 동물은 포유동물이다. 대상체는 또한, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 남성 또는 여성), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등을 나타낸다. 특정 구체예에서, 대상체는 영장류이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 인간이다.

미생물 감염은 신체의 다양한 영역에 영향을 미치고, 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사 가능하게 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 내 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서 국소 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 캡슐, 또는 시럽(임의로 착향된 시럽)으로서 경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 이용하여, 예를 들어, 흡입기로서 폐 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 페서리로서 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 점적, 스프레이 또는 분말로서 코, 귀 또는 눈 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 함수제에 포함될 수 있다. 조성물은 동결 건조될 수 있다.

약학적 조성물은 바람직하게는 멸균된다. 이는 바람직하게는 발열원을 비함유한다. 이는 바람직하게는, 예를 들어, pH 6 내지 pH 8, 일반적으로 약 pH 7로 완충된다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 컨쥬게이트 및 염수를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물을 함유하는 전달 장치를 제공한다. 장치는, 예를 들어, 주사기 또는 흡입기일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 면역원성 조성물이며, 여기서 이들은 면역학적 유효량의 다당류 면역원을 포함한다. '면역학적 유효량'은 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 개체로의 상기 양의 투여가 예방에 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개체의 연령, 분류 집단(예를 들어, 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 요망되는 보호의 정도, 백신의 제형화, 치료 의사의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 변한다. 상기 양은 비교적 광범위한 범위 내에 해당될 것이며, 이는 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있음이 예상된다. 1 ㎍ 내지 20 ㎍ 용량의 당류, 예를 들어, 약 5 ㎍/용량이 예상된다. 투여량 처리는 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄(예를 들어, 부스터 용량을 포함함)일 수 있다. 조성물은 다른 면역조절 작용제와 함께 투여될 수 있다.

제형화된 후, 본 발명의 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 치료되는 대상체는 동물일 수 있고, 특히 인간 대상체가 치료될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 통상적으로 예방적으로(즉, 이후의 감염을 예방함) 사용될 수 있다.

구체예에서, 약학적 조성물은 애쥬번트화되지 않을 수 있다.

또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 애쥬번트를 포함할 수 있다. 애쥬번트는 조성물이 투여된 환자에서 유도되는 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 향상시키는 기능을 할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 애쥬번트는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:

● 칼슘 염 및 알루미늄 염(또는 이들의 혼합물)을 포함하는 무기질 함유 조성물. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트(예를 들어, US 6355271호에 개시된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄 염은 하이드록시드, 포스페이트, 설페이트 등을 포함하며, 염은 임의의 적합한 형태(예를 들어, 젤, 결정형, 무정형 등)을 취한다. 이들 염에 대한 흡착이 바람직하다. 무기질 함유 조성물은 또한 WO2000/0023105호의 금속 염의 입자로서 제형화될 수 있다. 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트로 공지된 애쥬번트가 이용될 수 있다. 이들 명칭은 관습적인 것이나, 단지 편의를 위해 사용되는데, 이는 어느 것도 존재하는 실제 화학적 화합물의 정확한 기재가 아니기 때문이다(예를 들어, 문헌[Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, chapter 9] 참조). 본 발명은 일반적으로 애쥬번트로서 사용되는 "하이드록시드" 또는 "포스페이트" 애쥬번트 중 임의의 것을 이용할 수 있다. "알루미늄 하이드록시드"로 공지된 애쥬번트는 통상적으로 알루미늄 옥시하이드록시드 염이며, 이는 일반적으로 적어도 부분적으로 결정성이다. "알루미늄 포스페이트"로 공지된 애쥬번트는 통상적으로 알루미늄 하이드록시포스페이트이며, 이는 또한 종종 적은 양의 설페이트를 함유(즉, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트)한다. 이들은 침전에 의해 획득될 수 있으며, 반응 조건 및 침전 동안의 농도가 염에서의 하이드록실에 대한 포스페이트의 치환 정도에 영향을 미친다. 본 발명은 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트 둘 모두의 혼합물을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 하이드록시드보다 많은 알루미늄 포스페이트, 예를 들어, 적어도 2:1, 예를 들어, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 등의 중량비의 알루미늄 포스페이트 및 하이드록시드가 존재할 수 있다. 환자로의 투여를 위한 조성물 내의 Al⁺³의 농도는 바람직하게는 10mg/ml 미만, 예를 들어, ≤5　mg/ml, ≤4　mg/ml, ≤3　mg/ml, ≤2　mg/ml, ≤1　mg/ml 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1mg/ml이다. 최대 0.85mg/용량이 바람직하다.

● 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코시드 및 트리테르페노이드 글리코시드의 이종성 그룹인 사포닌(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, chapter 22). 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무의 나무껍질로부터의 사포닌이 애쥬번트로서 광범위하게 연구되었다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르나타(Smilax ornata)(sarsaprilla), 집소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata)(brides veil), 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis)(soap root)로부터 상업적으로 획득될 수 있다. 사포닌 애쥬번트 제형은 정제된 제형, 예를 들어, QS21, 뿐만 아니라 지질 제형, 예를 들어, ISCOM을 포함한다. QS21은 Stimulon™으로 시판된다. 사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 정제되었다. QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함하는 상기 기술을 이용한 특정한 정제된 분획이 확인되었다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의 생성 방법은 US 5,057,540호에 개시되어 있다. 사포닌 제형은 또한 스테롤, 예를 들어, 콜레스테를을 포함할 수 있다(WO96/33739). 면역자극 복합체(ISCOM)로 언급되는 독특한 입자를 형성하는 사포닌 및 콜레스테롤의 조합물이 이용될 수 있다(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, chapter 23). ISCOM은 통상적으로 인지질, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 또한 포함한다. 임의의 공지된 사포닌이 ISCOM에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM은 QuilA, QHA & QHC 중 하나 이상을 포함한다. ISCOM은 WO96/33739호 및 EP 0109942호에 추가로 기재되어 있다. 임의로, ISCOM은 WO00/07621호에서와 같이 추가 세제가 결여되어 있을 수 있다. 사포닌 기반 애쥬번트의 개발의 개관이 참고문헌[Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 & Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338]에서 발견될 수 있다.

● 박테리아 ADP-리보실화 독소(예를 들어, E. 콜리(E.coli) 열 불안정 장독소 "LT", 콜레라 독소 "CT", 또는 백일해 독소 "PT") 및 이의 무독화 유도체, 예를 들어, LT-K63 및 LT-R72로 공지된 돌연변이 독소(Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461). 점막 애쥬번트로서의 무독화된 ADP-리보실화 독소의 사용이 WO95/17211호에 기재되어 있고, 비경구 애쥬번트로서의 사용이 WO98/42375호에 기재되어 있다.

● 생체접착제 및 점막접착제, 예를 들어, 에스테르화 히알루론산 미세구(Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276) 또는 키토산 및 이의 유도체(WO99/27960).

● 생물분해성이고 비독성인 물질(예를 들어, 폴리(α-하이드록시산), 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리카프로락톤 등)으로부터 형성된 미세입자(즉, ~100nm 내지 ~150㎛ 직경, 더욱 바람직하게는 ~200nm 내지 ~30㎛ 직경, 또는 ~500nm 내지 ~10㎛ 직경의 입자), 음성-하전된 표면(예를 들어, SDS를 가짐) 또는 양성-하전된 표면(예를 들어, 양이온성 세제, 예를 들어, CTAB를 가짐)을 갖도록 임의로 처리된 폴리(락티드-코-글리콜리드)가 바람직하다.

● 리포솜(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995, Chapters 13 & 14). 애쥬번트로서 사용하기에 적합한 리포솜 제형의 예는 US 6,090,406호 및 US 5,916,588호에 기재되어 있다.

● 뮤라밀 펩티드, 예를 들어, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민("thr-MDP"), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드("DTP-DPP", 또는 "Theramide™), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민("MTP-PE").

● 폴리옥시도늄(polyoxidonium) 중합체(Dyakonova et al. (2004) Int Immunopharmacol 4(13):1615-23) 또는 다른 N-산화 폴리에틸렌-피페라진 유도체.

● CD1d 리간드, 예를 들어, α-글리코실세라미드(De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496 및 US 5,936,076)(예를 들어, α-갈락토실세라미드), 파이토스핑고신-함유 α-글리코실세라미드, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-(N-헥사코사노일아미노)-1,3,4-옥타데칸트리올], CRONY-101, 3"-O-설포-갈락토실세라미드 등.

● 감마 이눌린(Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80) 또는 이의 유도체, 예를 들어, 알가뮬린(algammulin).

● 수중유 에멀젼. 다양한 상기 에멀젼이 공지되어 있으며, 이들은 통상적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하고, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생물분해성(대사가능성) 및 생체적합성 오일(들) 및 계면활성제(들)이다. 에멀젼 내의 오일 비말은 일반적으로 직경이 5㎛ 미만이며, 이는 심지어 1 마이크론 이하의 직경을 가질 수 있고, 이들 작은 크기는 미세유체화기로 달성되어 안정적인 에멀젼을 제공한다. 220nm 미만의 크기를 갖는 비말이 바람직한데, 이는 이들이 필터 멸균에 적용될 수 있기 때문이다.

● 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, CpG 모티프(포스페이트 결합에 의해 구아노신 잔기에 연결된 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 함유하는 디뉴클레오티드 서열), 또는 CpI 모티프(이노신에 연결된 시토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 이중-가닥 RNA, 또는 회문 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드. 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 변형/유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있으며, 이중-가닥 또는 (RNA 제외) 단일-가닥일 수 있다. 참고문헌[Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400], 및 WO99/62923호에는 가능한 유사체 치환, 예를 들어, 2'-데옥시-7-데아자구아노신에 의한 구아노신의 치환이 개시되어 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 애쥬번트 효과는 문헌[Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835, McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185], WO98/40100호, US 6,207,646호, US 6,239,116호, US 6,429,199호와 같은 참고문헌에 추가로 논의되어 있다. CpG 서열, 예를 들어, 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT가 TLR9에 대해 지정될 수 있다(Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658). CpG 서열, 예를 들어, CpG-A ODN(올리고데옥시뉴클레오티드)가 Th1 면역 반응을 유도하는데 특이적일 수 있거나, 이는 CpG-B ODN과 같이 B 세포 반응을 유도하는데 더욱 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌[Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068, Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65], WO01/95935호에 논의되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오티드는 5' 말단이 수용체 인지를 위해 접근 가능하도록 작제된다. 임의로, 2개의 CpG 올리고뉴클레오티드 서열이 이들의 3' 말단에 부착되어 "이뮤노머(immunomer)"를 형성할 수 있다. 예를 들어, 참고문헌[Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953, Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861], 및 WO03/035836호를 참조하라. 유용한 CpG 애쥬번트는 ProMune™(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)으로도 공지된 CpG7909이다. 또 다른 것은 CpG1826이다. CpG 서열을 이용하는 것에 대한 대안으로서 또는 이에 더하여, TpG 서열이 이용될 수 있고(WO01/22972), 이들 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하지 않을 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 피리미딘이 풍부할 수 있다. 예를 들어, 이는 1개 초과의 연속적 티미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 참고문헌 WO01/22972호에 개시된 바와 같은 TTTT)를 포함할 수 있고/있거나, 이는 >25% 티미딘(예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등)의 뉴클레오티드 조성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 1개 초과의 연속적 시토신 뉴클레오티드(예를 들어, WO01/22972호에 개시된 바와 같은 CCCC)를 포함할 수 있고/있거나, 이는 >25% 시토신(예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등)의 뉴클레오티드 조성을 가질 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하지 않을 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 적어도 20개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이들은 100개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

면역자극성 올리고뉴클레오티드를 기초로 한 특히 유용한 애쥬번트는 IC31™으로 공지되어 있다(Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72). 따라서, 본 발명에서 사용되는 애쥬번트는 (i) 적어도 하나(바람직하게는, 다수)의 CpI 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 15 내지 40개의 뉴클레오티드), 및 (ii) 적어도 하나(바람직하게는, 다수)의 Lys-Arg-Lys 트리펩티드 서열(들)을 포함하는 다가양이온 중합체, 예를 들어, 올리고펩티드(예를 들어, 5 내지 20개의 아미노산)의 혼합물을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 26-머 서열 5'-(IC)₁₃-3'을 포함하는 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 다가양이온 중합체는 11-머 아미노산 Lys-Leu-Lys-Leu₅-Lys-Leu-Lys을 포함하는 펩티드일 수 있다.

● 3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A('3dMPL', 'MPL™'으로도 공지됨)(Myers et al. (1990) pages 145-156 of Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions, Ulrich (2000) Chapter 16 (pages 273-282) of Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series), Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-9, Baldrick et al. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398-413). 수성 조건에서, 3dMPL은 상이한 크기, 예를 들어, <150nm 또는 >500nm의 직경을 갖는 마이셀 응집물 또는 입자를 형성할 수 있다. 이들 중 하나 또는 둘 모두가 본 발명에서 이용될 수 있고, 더 나은 입자가 통상적인 검정에 의해 선택될 수 있다. 더 작은 입자(예를 들어, 3dMPL의 투명한 수성 현탁액을 제공하기에 충분히 작음)가 이들의 우수한 활성으로 인해 본 발명에 따라 사용하기에 바람직하다(WO 94/21292). 바람직한 입자는 220nm 미만, 더욱 바람직하게는 200nm 미만 또는 150nm 미만 또는 120nm 미만의 평균 직경을 가지며, 심지어 100nm 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 그러나, 대부분의 경우, 평균 직경은 50nm보다 낮지 않을 것이다.

● 메틸 이노신 5'-모노포스페이트("MIMP")(Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8):1177-86).

● 폴리하이드록실화 피롤리지딘 화합물(WO2004/064715), 예를 들어, 하기 화학식을 갖는 폴리하이드록실화 피롤리지딘 화합물:

상기 식에서, R은 수소, 선형 또는 분지형의 치환되거나 비치환된 포화 또는 불포화 아실, 알킬(예를 들어, 사이클로알킬), 알케닐, 알키닐 및 아릴기, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 예로는 카수아린(casuarine), 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-에피-카수아린, 7-에피-카수아린, 3,7-디에피-카수아린 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

● 이미다조퀴놀린 화합물, 예를 들어, 이미퀴모드(Imiquimod)("R-837")(US 4,680,338, US 4,988,815), 레시퀴모드(Resiquimod)("R-848")(WO92/15582), 및 이들의 유사체; 및 이들의 염(예를 들어, 하이드로클로라이드 염). 면역자극성 이미다조퀴놀린에 관한 추가의 세부사항은 참고문헌[Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577, Wu et al. (2004) Antiviral Res. 64(2):79-83, Vasilakos et al. (2000) Cell Immunol. 204(1):64-74], 미국 특허 4689338호, 4929624호, 5238944호, 5266575호, 5268376호, 5346905호, 5352784호, 5389640호, 5395937호, 5482936호, 5494916호, 5525612호, 6083505호, 6440992호, 6627640호, 6656938호, 6660735호, 6660747호, 6664260호, 6664264호, 6664265호, 6667312호, 6670372호, 6677347호, 6677348호, 6677349호, 6683088호, 6703402호, 6743920호, 6800624호, 6809203호, 6888000호 및 6924293호, 및 참고문헌[Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218]에서 발견될 수 있다.

● 티오세미카르바존 화합물, 예를 들어, 참조 WO2004/060308호에 개시된 티오세미카르바존 화합물. 활성 화합물을 제형화하고, 제조하고, 스크리닝하는 방법이 또한 상기 참조에 기재되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인, 예를 들어, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에서 특히 효과적이다.

● 트립탄트린(tryptanthrin) 화합물, 예를 들어, 참조 WO2004/064759호에 개시된 트립탄트린 화합물. 활성 화합물에 대한 제형화, 제조, 및 스크리닝 방법이 또한 상기 참조에 기재되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인, 예를 들어, TNF-α의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에서 특히 효과적이다.

● 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어, (a) 이사토라빈(Isatorabine)(ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신):

및 이의 프로드러그; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참조 US 6,924,271호, US2005/0070556호, US 5,658,731호에 개시된 화합물, 록소리빈(Loxoribine)(7-알릴-8-옥소구아노신)(미국 특허 5,011,828호).

● 참조 WO2004/87153호에 개시된 화합물, 예를 들어, 아실피페라진 화합물, 인돌레디온 화합물, 테트라하이드라이소퀴놀린(THIQ) 화합물, 벤조사이클로디온 화합물, 아미노아자비닐 화합물, 아미노벤즈이미다졸 퀴놀리논(ABIQ) 화합물(US 6,605,617, WO02/18383), 하이드라프탈아미드 화합물, 벤조페논 화합물, 이속사졸 화합물, 스테롤 화합물, 퀴나질리논 화합물, 피롤 화합물(WO2004/018455), 안트라퀴논 화합물, 퀴녹살린 화합물, 트리아진 화합물, 피라잘로피리미딘 화합물, 및 벤즈아졸 화합물(WO03/082272).

● 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예를 들어, RC-529[Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278, Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229).

● 포스파젠, 예를 들어, 참고문헌[Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115 및 Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196]에 기재된 바와 같은 폴리[디(카르복실라토페녹시)포스파젠]("PCPP").

WO03/011223호에 정의된 바와 같은,

,

예를 들어, 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 또는 'ER 804057', 예를 들어,

.

에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로부터의 지질 A의 유도체, 예를 들어, OM-174(참고문헌[Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491 & Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842]에 기재됨).

● 포스페이트-함유 무고리 백본에 연결된 지질을 함유하는 화합물, 예를 들어, TLR4 길항제 E5564(Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42, US2005/0215517):

.

이들 및 다른 애쥬번트-활성 물질은 참고문헌[Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols]에 더욱 상세히 논의되어 있다.

조성물 내의 항원 및 애쥬번트는 통상적으로 혼합되어 존재할 것이다.

조성물은 상기 애쥬번트 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 유리하게는 수중유 에멀젼 및 3dMPL 등 모두를 포함할 수 있다.

본 발명에서 유용한 특정 수중유 에멀젼 애쥬번트는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:

● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 1 마이크론 이하의 에멀젼. 에멀젼의 조성은 약 5 부피%의 스쿠알렌, 약 0.5 부피%의 폴리소르베이트 80 및 약 0.5 부피%의 Span 85일 수 있다. 중량 조건으로, 이들 비는 4.3%의 스쿠알렌, 0.5%의 폴리소르베이트 80 및 0.48%의 Span 85가 된다. 이러한 애쥬번트는 'MF59'(WO90/14837, Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680)로 공지되어 있으며, 이는 문헌[Chapter 10 of Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 및 chapter 12 of Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)]에 더욱 상세히 기재되어 있다. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어, 10mM 소듐 시트레이트 완충액을 포함한다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Tween 80의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충 염수를 포함할 수 있다. 이는 또한 Span 85(예를 들어, 1%) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 ≤1인데, 이는 이러한 중량비가 더욱 안정한 에멀젼을 제공하기 때문이다. 스쿠알렌 및 Tween 80은 약 5:2의 부피비로 존재할 수 있다. 한 상기 에멀젼은 PBS 중에 Tween 80을 용해시켜 2% 용액을 제공한 후, 이러한 용액 90ml와 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합한 후, 혼합물을 미세유체화시킴으로써 제조될 수 있다. 생성된 에멀젼은, 예를 들어, 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경을 갖는 1 마이크론 이하의 오일 비말을 가질 수 있다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제(예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL(하기 참조)을 포함할 수 있다. 에멀젼은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 약 75:11:10의 질량비(예를 들어, 750 ㎍/ml의 폴리소르베이트 80, 110 ㎍/ml의 Triton X-100 및 100 ㎍/ml의 α-토코페롤 숙시네이트)로 상기 3개의 성분을 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터의 이들 성분의 임의의 기여를 포함해야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL(하기 참조)을 포함할 수 있다. 수성상은 포스페이트 완충액을 함유할 수 있다.

● 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 염수, pH 7.4 중에서 제형화될 수 있다. 이러한 에멀젼은 뮤라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이며, "SAF-1" 애쥬번트(Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25)(0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되어 왔다. 이는 또한 "AF" 애쥬번트(Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55:3486-9)(5% 스쿠알란, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서와 같이 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다. 미세유체화가 바람직하다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. WO95/11700호에 기재된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디오리핀이다. 1 마이크론 이하의 비말 크기가 유리하다.

● 대사 가능하지 않은 오일(예를 들어, 경 무기질유) 및 적어도 하나의 계면활성제(예를 들어, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 1 마이크론 이하의 수중유 에멀젼. 첨가물, 예를 들어, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 컨쥬게이트(예를 들어, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데스아실사포닌으로의 지방족 아민의 첨가에 의해 생성된, US 6,080,725호에 기재된 바와 같은 GPI-0100), 디메티이디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyidioctadecylammonium bromide) 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수 있다.

● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 헬리칼 마이셀로서 회합된 에멀젼(WO2005/097181).

본 발명은 또한 약물에서 사용하기 위한 본 발명의 컨쥬게이트를 제공한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 포유동물에서 항체 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 T-독립성 면역 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 면역 반응을 발생시키기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 질병의 예방을 위한 백신의 제조에서의 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

구체예에서, 본 발명은 또한 포유동물에서 장티푸스를 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.

이들 방법 및 용도에 의해 발생된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 방어 항체 반응을 포함할 것이다. 당류 면역화 후에 항체 반응을 평가하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ELISA 검정(효소 결합 면역흡착 측정법)이 항 Vi IgG 반응을 평가하기 위해 일반적으로 이용된다. 항체 반응은 바람직하게는 글리코컨쥬게이트 백신의 특징인 IgM로부터 IgG로의 통상적인 아이소형 스위칭(isotype switching)을 갖는 IgG 반응이다. 면역 반응은 통상적으로 예방적 면역 반응이다. 포유동물은 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 컨쥬게이트는 Vi 다당류가 단편화되지 않은 컨쥬게이트에 비해 T-의존성 반응을 발생시키는데 더 효과적인 것으로 생각된다. "T-의존성" 반응은 컨쥬게이트가 재주사 후에 항-Vi 반응에서의 증가(통상적인 이차면역 반응)를 유도할 수 있는 것을 의미한다. "T-독립성 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 반응"은 컨쥬게이트가 T-세포 넉아웃 마우스에서 항-Vi 반응을 유도할 수 없음을 의미한다.

T-의존성 반응을 발생시키는 컨쥬게이트는 T-독립성 반응을 발생시키는 컨쥬게이트에 비해 유리한 것으로 간주되는데, 이는 T-독립성 반응이 기억을 유도하지 않는 것으로 밝혀졌고, 2세 이하의 연령의 아동에서 차선인 것으로 간주되고, 이차 림프 조직의 배중심에서 체세포 과돌연변이 및 이에 따른 항체 반응의 친화성 성숙을 야기하지 않기 때문이다(예를 들어, 문헌[Pollard A.J. et al., Nat. Rev. Immunol., 2009; 9: 213] 참조). 또한, T-독립성 반응은 이후의 예방접종에 대한 과소반응성 상태를 유도할 수 있다(예를 들어, 문헌[Poolman J. et al., Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 307] 참조).

본 발명의 컨쥬게이트는 도 2 및 도 8에 제시된 바와 같이 T-의존성 반응을 발생시키는 것으로 보인다. 도 2는 천연 Vi 컨쥬게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 천연 및 단편화 Vi에 비한 본 발명의 단편화된 Vi 컨쥬게이트에 대한 마우스에서의 항-Vi 항체 반응을 제시한다. 사용되는 물질의 설명은 실시예 5의 표에 제공된다. 그룹 1 내지 4(CRM₁₉₇에 컨쥬게이션된 단편화된 Vi 풀 1 내지 4에 해당함)에 대해, 천연 Vi 컨쥬게이트(그룹 5)에 비한 14일(T14)에서의 더 낮은 항-Vi IgG 반응(천연 Vi에 비해 풀 1-3에 대해 유의함, 각각 p = 0.0418, <0.0001, 0.0297)에도 불구하고, 35일(T49)에서의 두번째 주사 2주 후에 현저한 부스터 효과(p = 0.004-0.008)가 관찰되는 것이 인지될 수 있다. 도 2에 제시되는 바와 같이, 증가된 항-Vi가 첫번째 주사 후에 천연 Vi-CRM₁₉₇(그룹 5)에 의해 유도되었으며, 두번째 주사 후에는 증가하지 않았다. 상기 두번째 주사 후의 증가의 결핍은 또한 더 적은 용량의 천연 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트가 사용된 경우(0.044 ㎍, 0.35 ㎍ 및 2.8 ㎍ - 데이터는 제시되지 않음)에 관찰되었고, 이는 항체 수준에서의 증가의 결핍이 1회 용량 후에 유도되는 최대 반응으로 인한 것이 아님을 나타낸다. 천연 Vi-컨쥬게이트에 대한 반응은 T-독립성 항원으로 작용하는 긴 천연 Vi 사슬의 능력으로 인한 것임이 가정될 수 있다. 이는 컨쥬게이션되지 않은 천연 Vi(그룹 10)가 천연 Vi 컨쥬게이트(그룹 5)보다 낮긴 하지만 더 짧은 Vi 사슬(그룹 6 내지 9)보다 높은 반응을 유도할 수 있다는 사실에 의해 뒷받침된다. 대조적으로, 단편화된 Vi 컨쥬게이트(그룹 1 내지 4)는 14일에서 더 낮은 반응을 유도하였고, 이는 두번째 주사에 의해 추가로 증가되었으며, 2회 용량 후에 천연 Vi 컨쥬게이트와 동등한 항 Vi IgG 역가에 도달하였다. 82 kDa의 Vi 사슬 길이를 특징으로 하는 그룹 4 컨쥬게이트는 더 낮은 평균 분자량을 갖는 단편화된 Vi의 컨쥬게이트(그룹 1 내지 3) 및 천연 Vi 컨쥬게이트(그룹 5)와 비교하는 경우 중간 거동을 나타내었다. 사실, 14일에서의 반응은 더 짧은 단편화된 Vi 컨쥬게이트보다 높았고, 천연 Vi 컨쥬게이트와 유의하게 상이하지 않았다.

도 2에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi는 천연 Vi(그룹 10)에 비해 감소된 Vi IgG 항체 반응(그룹 6 내지 9)을 유도한다. 천연 Vi(165kDa)에 대한 반응은 단편화된 Vi(82kDa - 그룹 9)에 대한 반응보다 크며, 이는 차례로 단편화된 Vi(그룹 6 내지 8에 대해 각각 9.5 kDa, 22.8 kDa, 42.7 kDa)에 대한 반응보다 크다(14일에서, 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi 풀 1 내지 3에 의해 유도된 반응은 천연 Vi와 관련하여 유의하게 낮다, 각각 p = 0.0004, 0.0056, 0.0403). 따라서, 본 발명자는 더 아래에서는 Vi 다당류가 T-독립성 항원으로 더 이상 작용할 수 없는 중요 사슬 길이(약 82 kDa)를 확인하였다. T-독립성 항원의 특징적인 반응을 유도할 수 없는 다당류로부터 제조된 Vi-컨쥬게이트가 바람직하다.

컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi에 대해 T-독립성 항체 반응을 유도하는 능력이 손상되고, 단편화된 Vi 컨쥬게이트가 T-독립성 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 반응을 유도할 수 있다는 가정을 확인하기 위해, 단편화된 Vi-CRM₁₉₇ 및 천연 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트가 T-세포 넉아웃 마우스(TCR βδ^-/- 마우스)에서 시험되었다. 도 8에서 관찰될 수 있는 바와 같이, T-세포 넉아웃 마우스는 컨쥬게이션되지 않은 전장 Vi 및 컨쥬게이션된 전장 Vi에만 반응하고, 단편화된 Vi 컨쥬게이트에는 반응하지 않는다. 또한, 컨쥬게이션된 천연 Vi는 T-세포 넉아웃 마우스에서보다 야생형에서 높은 반응을 유도할 수 있으나(p=0.028 14일; p=0.002 42일) 컨쥬게이션되지 않은 천연 Vi는 그렇지 않으며, 이는 야생형 마우스에서의 높은 반응이 혼합된 T-의존성/T-독립성 활성으로부터 유래됨을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 양태는 본 발명의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 포유동물에서 T-독립성 면역 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 면역 반응을 발생시키기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 양태에서, 포유동물에서 다당류 컨쥬게이트에 의해 발생된 면역 반응을 향상시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기를 포함한다:

a) 컨쥬게이션되지 않은 다당류가 유의한 항-Vi IgG 항체 반응을 유도하는 것을 중단하는 평균 분자량 값을 확인하는 단계;

b) 단계 a)에서 결정된 값 아래의 평균 분자량을 갖는 다당류의 컨쥬게이트를 생성시키는 단계;, 및

c) 단계 b)에서 획득된 컨쥬게이트를 포유동물에 투여하는 단계.

본 발명의 컨쥬게이트, 즉, 본원에 정의된 바와 같은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 단편화된 Vi를 함유하는 컨쥬게이트는 또한 적절한 항체 반응을 유도하는데 있어서 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi보다 더 효과적이다(도 2 참조).

본 발명의 조성물은 일반적으로 대상체에 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사(예를 들어, 피하, 복막내, 정맥내, 근내, 또는 조직의 사이질 공간), 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 피내, 눈, 코, 귀, 또는 폐 투여에 의해 달성될 수 있다. 주사 또는 비내 투여가 바람직하다.

본 발명은 전신 및/또는 점막 면역을 유도하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 아동(유아를 포함함) 및 성인 둘 모두를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 대상체는 1세 미만의 연령, 1-5세 연령, 5-15세 연령, 15-55세 연령, 또는 적어도 55세 연령일 수 있다. 백신을 투여하기 위한 바람직한 대상체는 어린 대상체(예를 들어, ≤5세 연령)이다. 그러나, 백신은 이들 그룹에만 적합한 것이 아니며, 집단에서 더욱 일반적으로 이용될 수 있다.

치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의해 이루어질 수 있다. 다수의 용량이 일차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 이용될 수 있다. 다중 용량 스케줄에서, 다양한 용량이 동일하거나 상이한 경로, 즉, 비경구 프라임 및 점막 부스터, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등으로 제공될 수 있다. 하나 초과의 용량(통상적으로 2회 용량 또는 3회 용량)의 투여가 면역학적 나이브 환자에서 특히 유용하다. 다중 용량은 통상적으로 적어도 1주 간격(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다. 한 예시적 스케줄은 현존하는 유아 면역화와 일치(EPI 백신과의 공동 투여)시키기 위해 6주령에서의 첫번째 용량 및 10주령에서의 두번째 용량을 제공한다. 이러한 일차 스케줄에 이어 아동의 첫번째 생일 후에 부스터 용량이 후속될 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트는 다수의 병원체에 대한 동시 면역화를 위해 다른 항원과 함께 단일 조성물로 조합될 수 있다. 조합된 백신을 제조하는 것에 대한 대안으로서, 컨쥬게이트는 다른 백신과 실질적으로 동시(예를 들어, 동일 의학 상담 또는 건강관리 전문 센터 또는 예방접종 센터 방문 동안)에 대상체에 투여될 수 있다. 이들 조합 백신에서의 사용 또는 동시 투여를 위한 항원은, 예를 들어, 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및/또는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeuruginosa), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)(예를 들어, 당류 또는 컨쥬게이션된 당류, 혈청군 A, C, W135 및/또는 Y), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)(예를 들어, 당류 또는 컨쥬게이션된 당류) 등으로부터의 면역원을 포함한다.

한 구체예에서, 조성물은 이가 장티푸스 백신을 제공하기 위해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 살모넬라 파라티피(Salmonella Paratyphi) A 항원, 예를 들어, H 또는 O 항원(예를 들어, O:2 당류 항원)과 조합된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 항원, 예를 들어, H 또는 O 항원(예를 들어, O:9 당류)과 조합된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 항원, 예를 들어, H 또는 O 항원(예를 들어, O:4,5 당류)와 조합된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 막 항원에 대한 전신 모듈(GMMA) 또는 천연 외막 소포(NOMV)로 언급되는 외막 입자의 형태로 제공되는 항원과 조합될 수 있다. 상기 막 입자의 예는, 예를 들어, WO2012/049662호 및 WO2011/036564호에 개시되어 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 이에 제한되는 것으로 해석되어선 안된다. 온도는 섭씨 온도로 제공된다. 최종 생성물, 중간체 및 시작 물질의 구조는 표준 분석 방법, 예를 들어, 미세분석 및 분광 특징에 의해 확인된다. 사용되는 약어는 당 분야에서 통상적인 것이다.

약어

ADH 아디프산 디하이드라지드

avMW 평균 분자량

BCA 비신코닌산 검정

EDAC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드

h 시간(들)

HPAEC-PAD 펄스식 전류측정 검출과 커플링된 고성능 음이온-교환 크로마토그래피

HPLC 고압 액체 크로마토그래피

HR 고해상도

IR 적외선 분광법

kDa 킬로달톤

LCMS 액체 크로마토그래피 및 질량분광법

M 몰

MS 질량분광법

min 분

mL 밀리리터(들)

mM 밀리몰

NHS N-하이드록시숙신이미드

NMR 핵 자기 공명

PS 다당류

rpm 분 당 회전수

RT 실온

SEC 크기 배제 크로마토그래피

TFF 접선 유동 여과

실시예 1

단편화된 Vi 풀 제조 및 분리 방법.

Vi를 물에 용해시키고, 2.5 mg/mL Vi 및 5%(wt/v) H₂O₂의 최종 농도를 갖도록 H₂O₂ 30% wt를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 80±0.5℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 Hiscreen Capto Q 컬럼(100 mg 이하의 단편화된 Vi 혼합물을 로딩하는 4.7 mL의 수지)에 주입하고, 상이한 평균 분자량(avMW)의 4개의 집단을 구배 단계 방법을 이용하여 분리시켰다. 완충액 A 및 B로서 각각 NaH₂PO₄ 20 mM pH 7.2 및 NaH₂PO₄ 20 mM NaCl 1M pH 7.2를 사용하였다. 단편화된 Vi 혼합물을 물에 로딩하고, 증가하는 avMW의 풀을 각각 25, 30, 37 및 45%의 완충액 B에서 용리시켰다. 각각의 수거된 풀을 SEC Sephadex G-15 컬럼 상에서 물에 대해 탈염시켰다.

획득된 단편화된 Vi 풀을 avMW 계산을 위해 HPLC-SEC(도 6 참조), Vi 함량에 대해 HPAEC-PAD(Micoli et al., Vaccine 2011), CHO 그룹 결정을 위해 마이크로 BCA(기준으로서 NAcGlcN을 이용함)에 의해 특성규명하였다(Meeuwsen et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(1): 107-109). Vi 정체를 확인하고, O-아세틸화 수준을 계산하기 위해 ¹H NMR을 이용하였다(도 4 참조)(Micoli et al. Vaccine 2011). 도 7은 42.7 kDa의 avMW를 갖고, 영역(214 nm)의 80%가 25 내지 70 kDa인 단편화된 Vi 풀 3의 HPLC-SEC 프로파일을 제시한다.

실시예 2

H₂O₂ 및 FeCl₃을 이용한 단편화된 Vi 제조 및 분리 방법.

100 mg Vi PS를 물에 용해시키고, 2.5 mg/mL Vi, 0.1 mM FeCl₃ 및 3%(wt/v) H₂O₂의 최종 농도를 갖도록 FeCl₃ 10 mM 및 H₂O₂ 30% wt를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 30±0.1℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 수지 mL 당 5 mg의 단편화된 Vi 혼합물을 로딩하는 Capto Q 컬럼에 주입하였다. 완충액 A 및 B로서 각각 NaH₂PO₄ 20 mM pH 7.2 및 NaH₂PO₄ 20 mM NaCl 1M pH 7.2를 이용하였다. 단편화된 Vi 혼합물을 350 mM NaCl에 로딩하고, 관심 집단을 40%의 완충액 B에서 용리시켰다. 단편화된 Vi 풀을 TFF 30-kDa에 의해 10 부피의 물에 대해 정용여과시켰다. 단편화된 Vi 풀을 avMW 계산을 위해 HPLC-SEC, Vi 함량에 대해 HPAEC-PAD, Vi 정체를 확인하고 O-아세틸화 수준을 계산하기 위해 ¹H NMR에 의해 특성규명하였다. 특히, 한 제조를 위해, avMW 53.8 kDa의 단편화된 Vi를 획득하였다(17% 미만의 영역 < 30 kDa 및 16% 미만의 영역 > 80 kDa). O-아세틸화 수준은 높게 남아 있었다(88%).

실시예 3

H₂O₂ 및 FeSO₄를 이용한 단편화된 Vi 제조 및 분리 방법.

100 mg Vi PS를 물에 용해시키고, 2.5 mg/mL Vi, 0.1 mM FeSO₄ 및 0.5%(wt/v) H₂O₂의 최종 농도를 갖도록 FeSO₄ 10 mM 및 H₂O₂ 30% wt를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 30±0.1℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 촉매를 켄칭시키기 위해 EDTA를 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 과산화수소를 접선 유동 여과(30-kDa 막)에 의해 제거하고, NaH₂PO₄ 10 mM pH 7로 완충액 교환하였다. 혼합물을 2시간 동안 80℃에서 가열한 후, 수지 mL 당 5 mg의 단편화된 Vi 혼합물을 로딩하는 Capto Q 컬럼에 주입하였다. 완충액 A 및 B로서 각각 NaH₂PO₄ 20 mM pH 7.2 및 NaH₂PO₄ 20 mM NaCl 1M pH 7.2를 이용하였다. 단편화된 Vi 혼합물을 완충액 A에 로딩하고, 요망되는 MW의 집단을 선형 구배(50 컬럼 부피로 100% 완충액 A로부터 100% 완충액 B)로 분획화시켰다. 선택된 단편화된 Vi 풀을 TFF 30-kDa에 의해 10부피의 물에 대해 정용여과시켰다. 단편화된 Vi 풀을 avMW 계산을 위해 HPLC-SEC, Vi 함량에 대해 HPAEC-PAD, Vi 정체를 확인하고 O-아세틸화 수준을 계산하기 위한 ¹H NMR에 의해 특성규명하였다. 특히, 한 제조를 위해, avMW 43.4 kDa의 단편화된 Vi를 획득하였다(20% 미만의 영역 < 25 kDa 및 20% 미만의 영역 > 70 kDa). O-아세틸화 수준은 높게 남아 있었다(85%).

실시예 4

단편화된 Vi 컨쥬게이트 제조 방법

단편화된 Vi 풀 1-3(실시예 1에서 획득됨)의 컨쥬게이션을 위해, 컨쥬게이트 제조에 대해 하기 절차를 이용하였다. 단편화된 Vi를 50 mg/mL의 농도로 MES 100 mM pH 6에 용해시켰다. 5의 EDAC/Vi 반복 단위 몰비 및 0.33 M의 NHS 농도를 갖도록 NHS 및 이후 EDAC를 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 RT에서 혼합하였다. 이 시간 후, 문헌[Micoli et al. Vaccine 2011]에 이전에 기재된 바와 같이 제조된 CRM₁₉₇-ADH를 MES 20 mM pH 6 중 7.8 mg/mL의 Vi 및 단백질 농도(1의 Vi 대 단백질 w/w 비)를 갖도록 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 RT에서 혼합하였다. 컨쥬게이트 형성을 HPLC-SEC(TSK 젤 3000 PWXL 컬럼)에 의해 확인하였고, 잔여 단백질이 반응 혼합물에서 관찰되지 않았다. 컨쥬게이트를 1.6 cm x 60 cm Sephacryl 100 HR 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의한 미반응된 PS에 의해 분리시켰다. 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi를 함유하지 않는 분획을 함께 풀링시키고, 특성규명하였다.

정제된 컨쥬게이트를 전체 Vi 함량에 대해 HPAEC-PAD(Micoli et al. Vaccine 2011), 전체 단백질 함량에 대해 마이크로 BCA, 컨쥬게이트의 avMW 분포를 결정하고 자유 단백질 및 자유 당류의 양을 평가하기 위한 HPLC-SEC에 의해 특성규명하였다. 풀 3 및 풀 4 컨쥬게이트에 대해, 자유 당류를 Capto Adhere/HPAEC-PAD 방법에 의해 평가하였다. 하기 표는 실시예 5에서 시험된 컨쥬게이트의 주요 특징을 보고한다.

실시예 1에서 획득된 단편화된 Vi 풀 4에 대해, 상기 기재된 반응 조건은 아마도 상기 집단의 더 높은 avMW로 인해 젤 형성을 발생시켰다. 상기 특정 풀에 대해, EDAC/NHS를 이용한 활성화 단계를 15 mg/mL의 Vi 농도, 0.1 M의 NHS 농도 및 5의 EDAC/Vi 반복 단위 몰비로 수행하였다. CRM₁₉₇-ADH를 이용한 컨쥬게이션 단계를 위해 동일 조건을 이용하였다.

Capto Adhere/HPAEC-PAD 방법에 의한 컨쥬게이트에서의 자유 Vi의 양의 결정

20 mM AcONa 30% CH₃CN pH 5로 세척된 500 μL의 Capto Adhere 수지 현탁액으로부터 유래되는 펠렛을 샘플의 처리를 위해 이용하였다. 1.3 mL의 20 mM NaH₂PO₄ pH 7.2 중 컨쥬게이트(60-150 ㎍/mL 범위 내의 전체 Vi 농도)를 390 μL CH₃CN에 첨가하였다(생성된 용액은 여기서 로딩된 샘플로 표시된다). 1 밀리리터의 로딩된 샘플을 수지에 첨가하고, 회전 휠 상에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 샘플을 원심분리(14000 rpm에서 4℃에서 5분)시키고, 상층액(유통(flow through)으로 표시됨)을 따로 빼내었다. 펠렛을 1 mL 20 mM AcONa 30% CH₃CN pH 5로 세척(2회)(수지로의 용매 첨가, 수작업에 의해 혼합됨)하였다. 펠렛을 원심분리(14000 rpm에서 4℃에서 5분)에 의해 회수하였다. 수거된 상층액(2 mL 전체 부피)을 세척 용액으로 표시하였다. 펠렛에 500 μL의 1 M AcONa 30% CH₃CN pH 5를 첨가하고, 수작업에 의해 혼합하고, 원심분리(14000 rpm에서 4℃에서 5분)에 의해 분리시켰다. 이러한 작업을 6회 반복하였고, 스트립 용액(3 mL 전체 부피)으로 표시된 상층액을 풀링시켰다. 스트립 용액, 세척 용액, 유통 및 0.5 mL의 로딩된 샘플을 speedvac에서 건조시키고, 동일 부피의 물에서 재구성시켰다. 모든 샘플을 HPLC-SEC(형광 방출)에 의해 분석하여 유통, 세척 및 스트립 용액에서 컨쥬게이트의 부재를 확인하였다. 로딩된 샘플 및 스트립 용액을 HPAEC-PAD에 의해 Vi 함량에 대해 검정하였다.

희석을 위해 교정된 스트립 용액(컨쥬게이션되지 않은 Vi) 및 로딩된 용액(전체 Vi) 내의 Vi 함량의 비는 샘플 내의 자유 Vi의 %를 나타낸다.

HPLC-SEC에 의한 컨쥬게이트 특성규명

자유 단백질 및 자유 당류에 의해 컨쥬게이트를 특성규명하기 위해 HPLC-SEC를 이용하였다. 모든 샘플을 TSK 젤 G3000 PW_XL 컬럼(30 cm x 7.8 mm; 입자 크기 7 ㎛; cod. 808021)과 함께 TSK 젤 PW_XL 가드 컬럼(4.0 cm x 6.0 mm; 입자 크기 12 ㎛; cod. 808033)(Tosoh Bioscience)에서 용리시켰다. 이동상은 0.5 mL/분의 유량의 0.1 M NaCl, 0.1 M NaH₂PO₄, 5% CH₃CN, pH 7.2(30분 동안 등용매 방법)였다. 컨쥬게이트 샘플 내의 컨쥬게이션되지 않은 단백질(형광 방출 검출) 및 단편화된 Vi(풀 1 및 2에 대함))(굴절 지수 검출)의 양을 평가하기 위해 HPLC-SEC를 또한 이용하였다. 반응되지 않은 단백질의 영역을 5-50 ㎍/mL 범위 내의 단백질 샘플로 제조된 교정 곡선과 관련하여 정량하였다. HPLC-SEC에 의해 검출된 자유 단백질의 양을 마이크로 BCA에 의해 샘플에서 정량된 단백질의 전체 양으로 나누어 컨쥬게이션되지 않은 단백질의 백분율을 계산하였다. 유사하게, 컨쥬게이션되지 않은 단편화된 Vi의 양을 20-50 ㎍/mL 범위 내의 단편화된 Vi(동일 avMW의 단편화된 Vi)의 교정 곡선과 관련하여 정량하였다. HPLC-SEC에 의해 검출된 자유 Vi의 양을 HPAEC-PAD에 의해 샘플에서 정량된 당류의 전체 양으로 나누어 컨쥬게이션되지 않은 당류의 백분율을 계산하였다.

실시예 5

단편화된 Vi 컨쥬게이트(담체로서 DT 및 TT)

담체 단백질로서 DT(디프테리아 톡소이드) 및 TT(파상풍 톡소이드)를 이용하여 Vi 풀 3(실시예 1에서 획득됨)의 컨쥬게이션을 수행하였다. 단편화된 Vi를 실시예 3에 기재된 바와 같이 활성화시키고, DT-ADH 또는 TT-ADH(CRM₁₉₇-ADH로서 제조됨)를 실시예 3에 기재된 동일한 반응 조건(1의 Vi 대 단백질 w/w 비)을 이용하여 컨쥬게이션 단계에서 첨가하였다. 단백질 당 도입된 ADH 링커의 더 높은 수에 의해 DT-ADH 및 TT-ADH를 특성규명하였다(6의 CRM₁₉₇에 대해 각각 12 및 23.5). 생성된 컨쥬게이트의 주요 특징이 하기 표에 보고되어 있다.

실시예 6

마우스에서의 생체 내 시험

10개 그룹의 10주령의 CD1 암컷 마우스를 상이한 사슬 길이의 Vi를 갖는 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트(실시예 3에서 획득됨, 하기 표에서 그룹 1 내지 4), 천연 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트(하기 표에서 그룹 5) 및 상응하는 컨쥬게이션되지 않은 Vi 다당류(그룹 6 내지 10)로 면역화시켰다. 하기 표에서 연구 계획이 요약되어 있다. 8 ㎍의 Vi 항원을 각각 함유하는 200 μL의 2회의 피하 주사를 0 및 35일에 제공하였고, 14, 35 및 49일에 채혈하였다. 항원을 애쥬번트 없이 염수 용액 중에서 주사하였다. 항-Vi 및 항-CRM₁₉₇ 반응을 ELISA에 의해 평가하였다(도 2에 제시된 바와 같음).

도 2에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 컨쥬게이션되지 않은 Vi(그룹 6-10) 중에서, 전장 Vi(그룹 10)가 첫번째 주사 후에 명백한 반응을 유도할 수 있었던 유일한 것이었다. 상응하는 컨쥬게이트(그룹 5)에 대해서도 동일하게 해당하였다. 천연 Vi-CRM₁₉₇이 첫번째 주사 후에 이미 높은 반응을 유도할 수 있는 유일한 것이었고, 두번째 주사 후에 부스터가 없었다. 상이하게, 모든 단편화된 Vi 컨쥬게이트(그룹 1-4)를 이용하여, 반응은 첫번째 주사 후에 낮았고, 재주사 후에 유의하게 더 높았다.

야생형 및 TCR βδ^-/- 마우스에서 천연 및 단편화된 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트를 비교하기 위해 이후의 연구를 수행하였다(도 8). 10개 그룹의 10주령의 암컷 CD1 야생형(하기 표에서 그룹 1-5) 및 T-세포 넉아웃 마우스(하기 표에서 그룹 6-10)를 상이한 사슬 길이의 Vi를 갖는 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트, 천연 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트 및 천연의 컨쥬게이션되지 않은 Vi 다당류로 면역화시켰다. 8 ㎍의 Vi 항원을 각각 함유하는 200 μL의 2회의 피하 주사를 0 및 28일에 제공하였고, 14, 28 및 42일에 채혈하였다. 항원을 애쥬번트 없이 염수 용액 중에서 주사하였다. 항-Vi 및 항-CRM₁₉₇ 반응을 ELISA에 의해 평가하였다(도 8에 제시된 바와 같음).

획득된 데이터는 단편화된 Vi가 T-독립성 반응을 유도할 수 없으며, 상응하는 Vi-CRM₁₉₇ 컨쥬게이트가 마우스에서 T-독립성 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 반응을 유도할 수 있다는 가정을 확증한다.

실시예 7 - 상이한 담체 단백질에 컨쥬게이션된 전장 및 단편화된 Vi(fVi)(실시예 1에 기재된 풀 3)의 마우스에서의 생체 내 시험

6개 그룹의 10주령의 8 CD1 암컷 마우스를 하기 표에 보고된 컨쥬게이트로 면역화시켰다.

1 ㎍의 Vi 항원을 각각 함유하는 200 μL의 2회의 피하 주사를 0 및 35일에 제공하였고, 14, 35 및 49일에 채혈하였다. 항원을 애쥬번트 없이 염수 용액 중에서 주사하였다. 항-Vi를 ELISA에 의해 평가하였다(도 9에 제시된 바와 같음).

도 9에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 모든 천연 Vi 컨쥬게이트를 이용하여, 14일에서 높은 반응이 관찰되었고, 두번째 주사 후에 부스트가 없었다. 항-Vi IgG 반응이 사용된 담체와 상관 없이 모든 전장 천연 Vi 컨쥬게이트에서 유사하였다. 단편화된 Vi 컨쥬게이트를 이용하여, 두번째 주사 후에 항-Vi IgG 반응의 증가(부스터 효과)가 CRM₁₉₇ 및 DT에 대해 관찰되었고, TT에 대해서는 관찰되지 않았는데, 이는 CRM197 또는 DT에 컨쥬게이션된 단편화된 Vi가 T-독립성 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 면역 반응을 유도할 수 있음을 암시한다. 두번째 주사 후, 항-Vi IgG 반응은 사용된 담체와 상관 없이 유사하였다.

Claims

단편화된 Vi 다당류 및 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 톡소이드로부터 선택된 담체 단백질을 포함하는 백신에서 사용하기에 적합한 컨쥬게이트로서, 단편화된 다당류가 40 내지 55 kDa의 평균 분자량을 갖는, 컨쥬게이트.
제 1항에 있어서, 단편화된 다당류가 41 내지 49 kDa의 평균 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
제 1항에 있어서, 단편화된 다당류가 51 내지 55 kDa의 평균 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 CRM₁₉₇인 컨쥬게이트.
약학적으로 허용되는 담체와 조합된 제 1항 또는 제 2항의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 조성물이 애쥬번트화되지 않은(unadjuvanted) 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 조성물이 애쥬번트를 포함하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 T-독립성 면역 반응이 본질적으로 부재하는 T-의존성 면역 반응을 발생시키기 위한 방법.
질병의 예방을 위한 백신의 제조에서의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물의 용도.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 장티푸스(typhoid fever)의 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 장티푸스를 예방하기 위한 방법.
단편화된 Vi 다당류 및 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 독소로부터 선택된 담체 단백질을 포함하는 컨쥬게이트를 제조하기 위한 방법으로서,
a. Vi 다당류를 단편화시켜 40 내지 55 kDa의 평균 분자량을 갖는 단편화된 Vi 다당류를 획득하는 단계,
b. 5 내지 6의 pH에서 단계 a)에서 획득된 단편화된 Vi 다당류와 카르보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드를 반응시켜 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 형성시키는 단계, 및
c. 단계 b)에서 획득된 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 Vi 유도체와 담체 단백질을 반응시켜 컨쥬게이트를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
제 12항에 있어서, 담체 단백질이 CRM₁₉₇인 방법.
제 10항 또는 제 11항에 따른 방법에 의해 획득 가능한 백신에서 사용하기에 적합한 컨쥬게이트.
컨쥬게이트 백신의 제조에서의 40 내지 55 kDa의 평균 분자량을 갖는 단편화된 Vi 다당류 및 CRM₁₉₇ 또는 디프테리아 톡소이드로부터 선택된 담체 단백질의 용도.