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KR20180084136A - 간상 광수용체에서의 유전자의 특이적 발현을 위한 프로모터 SynP161 - Google Patents

간상 광수용체에서의 유전자의 특이적 발현을 위한 프로모터 SynP161 Download PDF

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KR20180084136A
KR20180084136A KR1020187018379A KR20187018379A KR20180084136A KR 20180084136 A KR20180084136 A KR 20180084136A KR 1020187018379 A KR1020187018379 A KR 1020187018379A KR 20187018379 A KR20187018379 A KR 20187018379A KR 20180084136 A KR20180084136 A KR 20180084136A
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KR
South Korea
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nucleic acid
cell
gene
sequence
acid sequence
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Ceased
Application number
KR1020187018379A
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English (en)
Inventor
도미니크 하르틀
디르크 쉬벨러
보톤드 로스카
아르노 크렙스
조세핀 위트너
Original Assignee
프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 filed Critical 프리드리히 미셔 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치
Publication of KR20180084136A publication Critical patent/KR20180084136A/ko
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Abstract

본 발명은 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 또는 상기 서열식별번호: 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 적어도 150 bp의 핵산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 단리된 핵산 분자는 간상 광수용체에서 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 경우에 유전자의 발현을 특이적으로 유도하는 것인 단리된 핵산 분자를 제공한다.

Description

간상 광수용체에서의 유전자의 특이적 발현을 위한 프로모터 SynP161
본 발명은 간상 광수용체 세포에서의 유전자 발현을 특이적으로 유도하는 핵산 서열에 관한 것이다.
발현을 위해 재조합 유전자는 일반적으로, 이종성 유전자가 전사될 수 있도록 허용하는 활성 발현 카세트의 콘텍스트에서 cDNA 구축물로서, 표적 세포, 세포 집단 또는 조직 내로 형질감염된다. DNA 구축물은 인핸서, 사일런서, 인슐레이터 및 프로모터 (본원에서 포괄적으로 "프로모터"로 지칭됨)를 포함한, 시스-조절 요소에서 다수의 트랜스-작용 전사 인자 (TF)의 활성을 수반하는 프로세스에서 세포 전사 기구에 의해 인식된다.
유전자 프로모터는 이들 조절 수준 모두에 수반되며, DNA 서열, 전사 인자 결합 및 후성적 특징의 영향들을 통합함으로써 유전자 전사에서의 결정기로서의 역할을 한다. 이는 예를 들어, 플라스미드 벡터에 의해 코딩되는 트랜스진 발현의 강도 뿐만 아니라, 상기 트랜스진이 발현될 세포 유형 또는 유형들을 결정한다.
포유동물 세포에서 이종성 유전자 발현을 구동시키는데 사용되는 가장 일반적인 프로모터는 인간 및 마우스 시토메갈로바이러스 (CMV) 주요 즉각 조기 프로모터이다. 이는 강력한 발현을 부여하고, 여러 세포 유형에서 강건한 것으로 입증되었다. 다른 바이러스 프로모터, 예컨대, SV40 즉각 조기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터가 또한 발현 카세트에서 빈번하게 사용된다.
바이러스 프로모터 대신, 세포 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 공지된 프로모터 중에는 예컨대, 베타-액틴, 신장 인자 1-알파 (EF-1알파), 또는 유비퀴틴과 같이, 풍부하게 전사된 세포 전사체를 코딩하는 하우스-키핑 유전자로부터의 프로모터가 있다. 바이러스 프로모터와 비교하였을 때, 진핵성 유전자 발현은 더욱 복잡하고, 다수의 상이한 인자들의 정확한 조정을 요구한다.
트랜스진 발현을 위해 내인성 조절 요소를 사용하는 것에 관한 측면들 중 하나는 안정적인 mRNA 생성, 및 이로써, 트랜스-작용 전사 인자가 제공되는 숙주 세포의 천연 환경에서 발현이 이루어질 수 있다는 점이다. 진핵성 유전자의 발현은 시스- 및 트랜스-작용 조절 요소의 복잡한 기구에 의해 제어되는 바, 대부분의 세포 프로모터는 광범위한 기능성 특징 규명 부족으로 인해 어려움을 겪고 있다. 진핵성 프로모터 중 일부는 일반적으로 그의 전사되는 서열의 상류 쪽으로 바로 앞에 위치하고, 전사 개시점으로서의 역할을 한다. 코어 프로모터는 전사 기구에 의해 인식되는데 충분한 전사 출발 부위 (TSS) 바로 그 주위에 위치한다. 인접 프로모터는 코어 프로모터의 상류 쪽 영역을 포함하고, TSS, 및 전사 조절에 필요한 다른 서열 특징부를 함유한다. 전사 인자는 프로모터 및 인핸서 서열 중의 조절 모티프에 결합하여, 뉴클레오솜 구조 및 그의 위치를 변경시키는 크로마틴 및 히스톤 변형 효소를 활성화시킴으로써 최종적으로는 전사가 개시될 수 있게 허용함으로써 서열-특이적 작용을 한다. 기능성 프로모터의 확인은 주로 연관된 상류 또는 하류 인핸서 요소의 존재에 의존한다.
트랜스진 발현을 위해 내인성 조절 요소를 사용하는 것에 관한 또 다른 중요한 측면은 일부 프로모터는 세포 특이적 방식으로 작용할 수 있고, 이는 특이적 유형의 세포에서, 또는 프로모터에 따라, 특정 서브세트의 세포에서 트랜스진의 발현을 유도할 것이라는 점이다.
그러므로, 본 발명의 한 가지 목표는 높은 발현 수준으로 및 세포 유형에 특이적 방식으로 포유동물 세포에서 재조합 유전자를 발현하는데 적합한 새로운 서열을 수득하는 것이다.
상기 서열은 망막 세포 특이적 프로모터 관련 기술분야에서의 신경변성 장애, 시력 회복, 신약 개발, 종양 요법 및 장애 진단 연구를 위한 시스템을 개발하고자 하는 요구를 다룬다.
본 발명자들은 눈에 있을 때 오직 간상 광수용체에서만 유전자 발현을 구동시키는 프로모터를 찾기 위해 후성유전학, 생물 정보학 및 신경과학을 조합하였다.
본 발명의 서열의 핵산 서열은 하기이다:
ATTCCGGTCACACGGCCAAGATTATTCCACCTGCGCTTTGAGCAATAGGGAGAGGGCTCTGGTGCCTCTTCCTGGAATTTGATTAATTCGCTTGAGTCAGTCACAGAATTTGAGGAAGCATTGATATTTGAAGATGTGTTCTTCTAAAGGATACAAATGAATATATGCATAGTGAGAGTTTAGGAGATAGG (서열식별번호: 1).
그러므로, 본 발명은 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 또는 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 적어도 150 bp의 핵산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 단리된 핵산 분자는 유전자를 코딩하는 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 간상 광수용체에서의 발현을 특이적으로 유도하는 것인 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 100% 동일성을 갖는다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는 최소 프로모터, 예를 들면, SV40 최소 프로모터, 예를 들어, SV40 최소 프로모터 또는 본 실시예에서 사용되는 것을 추가로 포함할 수 있다.
엄격한 조건 하에 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 단리된 핵산 분자에 혼성화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트이며, 여기서 상기 프로모터는 적어도 간상 광수용체에서 특이적으로 발현하고자 하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 발현 카세트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 발명은 또한 간상 광수용체에서의 유전자의 발현을 위한, 본 발명의 핵산의, 본 발명의 발현 카세트의, 또는 본 발명의 벡터의 용도를 포함한다.
본 발명은 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단 (예를 들어, 조직)을 본 발명의 발현 카세트로 형질감염시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포가 간상 광수용체이거나, 또는 상기 세포가 간상 광수용체를 포함하는 경우에, 발현하고자 하는 유전자는 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단에 의해 발현될 것인, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단 또는 조직은 인간의 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트 또는 벡터는 상기 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 전형적인 유전자는 할로로돕신 또는 채널로돕신을 코딩하는 유전자이다.
추가로, 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하기 위한 키트를 제공한다.
도 1: 광수용체 층에서의 측면 투영도 및 상면도로서 , 성체 C57BL /6 마우스 눈에의 AAV - synP161 - ChR2 - EGFP의 망막하 주사 후 3주째의, 서열식별번호: 1을 포함하는 프로모터로부터의 EGFP 발현의 레이저 스캐닝 현미경 영상. 간상 광수용체 세포에서의 유도된 발현을 관찰할 수 있다. 녹색 = 서열식별번호: 1에 의해 구동된 EGFP, 적색 = mCAR, 백색 = 훽스트(Hoechst).
본 발명자들은 눈에 있을 때 오직 간상 광수용체에서만 유전자 발현을 구동시키는 프로모터를 찾기 위해 후성유전학, 생물 정보학 및 신경과학을 조합하였다.
본 발명의 서열의 핵산 서열은 하기이다:
ATTCCGGTCACACGGCCAAGATTATTCCACCTGCGCTTTGAGCAATAGGGAGAGGGCTCTGGTGCCTCTTCCTGGAATTTGATTAATTCGCTTGAGTCAGTCACAGAATTTGAGGAAGCATTGATATTTGAAGATGTGTTCTTCTAAAGGATACAAATGAATATATGCATAGTGAGAGTTTAGGAGATAGG (서열식별번호: 1).
그러므로, 본 발명은 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 또는 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 적어도 150 bp의 핵산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 단리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 단리된 핵산 분자는 유전자를 코딩하는 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 간상 광수용체에서의 발현을 특이적으로 유도하는 것인 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 96% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 적어도 150 bp이고, 상기 서열식별번호: 1의 핵산 서열과 적어도 100% 동일성을 갖는다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는 최소 프로모터, 예를 들면, SV40 최소 프로모터, 예를 들어, SV40 최소 프로모터 또는 본 실시예에서 사용되는 것을 추가로 포함할 수 있다.
엄격한 조건 하에 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 단리된 핵산 분자에 혼성화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트이며, 여기서 상기 프로모터는 적어도 간상 광수용체에서 특이적으로 발현하고자 하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 발현 카세트를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 발명은 또한 간상 광수용체에서의 유전자의 발현을 위한, 본 발명의 핵산의, 본 발명의 발현 카세트의, 또는 본 발명의 벡터의 용도를 포함한다.
본 발명은 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단 (예를 들어, 조직)을 본 발명의 발현 카세트로 형질감염시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포가 간상 광수용체이거나, 또는 상기 세포가 간상 광수용체를 포함하는 경우에, 발현하고자 하는 유전자는 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단에 의해 발현될 것인, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단 또는 조직은 인간의 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트 또는 벡터는 상기 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 전형적인 유전자는 할로로돕신 또는 채널로돕신을 코딩하는 유전자이다.
추가로, 본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하기 위한 키트를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 인핸서, 사일런서, 인슐레이터 및 프로모터를 포함한, 임의의 시스-조절 요소를 지칭한다. 프로모터는 일반적으로 전사가 요구되는 유전자의 상류 (5' 영역 쪽)에 위치한 DNA의 영역이다. 프로모터는 그가 제어하는 유전자의 적절한 활성화 또는 억제를 가능하게 한다. 본 발명과 관련하여, 프로모터는 간상 광수용체에서 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 특이적 발현을 유도한다. "오직 특정 유형의 세포에서만 발현"으로도 언급되는 "특이적 발현"이란, 관심 유전자를 발현하는 세포 중 적어도 75% 초과의 세포가 특정화된 유형의 것, 즉, 본 경우에서는 간상 광수용체라는 것을 의미한다.
발현 카세트는 전형적으로, 숙주 세포 내로 발현 카세트의 도입 및 숙주 세포 내에서 발현 카세트의 유지를 촉진시키는 벡터 내로 도입된다. 상기 벡터가 보편적으로 사용되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 상기와 같은 벡터 다수가 예컨대, 인비트로겐(Invitrogen), 스트라타진(Stratagene), 클론테크(Clontech) 등으로부터 상업적으로 입수가능하고, 다수의 가이드, 예컨대, 문헌 [Ausubel], [Guthrie], [Strathem], 또는 [Berger] (모두 상기 참조)에 기술되어 있다. 상기 벡터는 전형적으로 다중 클로닝 부위와 함께, 프로모터, 폴리아데닐화 신호 등 뿐만 아니라, 추가 요소, 예컨대, 복제 기원, 선별가능한 마커 유전자 (예컨대, LEU2, URA3, TRP 1, HIS3, GFP), 동원체 서열 등을 포함한다.
바이러스 벡터, 예를 들면, AAV, PRV 또는 렌티바이러스가 본 발명의 프로모터를 사용하여 유전자를 간상 광수용체로 표적화하고 전달하는데 적합하다.
망막 세포의 출력량은 예컨대, 다전극 어레이 또는 패치-클램프와 같은 전기적 방법을 사용하여, 또는 예컨대, 형광의 검출과 같은, 시각적 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열을 사용하는 방법은 신경계 장애 치료 또는 간상 광수용체를 포함하는 망막 장애의 치료를 위한 치료제를 확인하는데 사용될 수 있으며, 상기 방법은 시험 화합물을, 본 발명의 프로모터 하에 하나 이상의 트랜스진을 발현하는 간상 광수용체와 접촉시키는 단계, 및 상기 시험 화합물의 존재 하에서 수득된 간상 광수용체의 적어도 하나의 출력량을 상기 시험 화합물의 부재 하에서 수득된 동일의 출력량과 비교하는 단계를 포함한다.
더욱이, 본 발명의 프로모터를 사용하는 방법은 시험관내에서 시력 회복을 시험하는데 사용될 수 있으며, 상기 방법은 본 발명의 프로모터 하에 하나 이상의 트랜스진을 발현하는 간상 광수용체를 작용제와 접촉시키는 단계, 및 상기 작용제와의 접촉 이후에 수득된 적어도 하나의 출력량을 상기 작용제와의 상기 접촉 이전에 수득된 동일의 출력량과 비교하는 단계를 포함한다.
채널로돕신은 광-게이팅 이온 채널로서 작용하는 옵신 단백질의 서브패밀리이다. 이는 단세포 녹조류에서 주광성, 즉, 빛에 대한 반응으로 움직이는 이동을 제어하면서, 감각 광수용체로서의 역할을 한다. 다른 유기체의 세포에서 발현되었을 때에는 빛이 세포내 산도, 칼슘 유입, 전기적 흥분성, 및 다른 세포 프로세스를 제어하는데 사용될 수 있게 한다. 현재 적어도 3개의 "천연" 채널로돕신: 채널로돕신-1 (ChR1), 채널로돕신-2 (ChR2), 및 볼복스(Volvox) 채널로돕신 (VChR1)이 공지되어 있다. 더욱이, 상기 단백질의 일부 변형된/개선된 버전도 존재한다. 공지된 채널로돕신들 모두 H+, Na+, K+, 및 Ca2+ 이온을 전도하는, 비특이적 양이온 채널이다.
할로로돕신은 클로라이드 이온에 대해 특이적이고, 할로박테리아로 공지된 계통발생학상 고대의 "박테리아" (고세균)에서 발견된 광-유도 이온 펌프이다. 이는 광-유도 양성자 펌프 박테리오로돕신에 상동성이고, (1차 서열 구조가 아니라) 망막에서 빛을 감지하는 색소인 척추동물 로돕신과 3차 구조가 유사한 것인, 레티닐리덴 단백질 패밀리의 7-망횡단 단백질이다. 할로로돕신은 또한 광-유도 이온 채널인 채널로돕신과 서열 유사성을 공유한다. 할로로돕신은 필수적인 광-이성질화가능 비타민 A 유도체 전(all)-트랜스-레티날을 함유한다. 할로로돕신은 그의 결정 구조가 알려져 있는 소수의 막 단백질 중 하나이다. 할로로돕신 이소폼은 에이치. 살리나룸(H. salinarum) 및 엔. 파라오니스(N. pharaonis)를 포함한, 다수의 할로박테리아 종에서 발견될 수 있다. 현재 진행 중인 다수의 연구는 이들 차이를 조사하고, 이를 이용하여 광주기 및 펌프 성질과 별개로 분석한다. 박테리오로돕신 다음으로, 할로로돕신이 연구된 것 중 최상의 I형 (미생물) 옵신일 수도 있다. 할로로돕신 망막 복합체의 피크 흡광도는 약 570 nm이다. 최근, 할로로돕신이 광유전자학에서 도구가 되었다. 청색 광 활성화된 이온 채널 채널로돕신-2가 청색 광의 짧은 펄스로 흥분가능한 세포 (예컨대, 뉴런, 근육 세포, 췌장 세포 및 면역 세포)를 활성화시킬 수 있는 능력을 이용가능하게 한 것과 같이, 할로로돕신도 황색 광의 짧은 펄스로 흥분가능한 세포를 침묵화시킬 수 있는 능력을 이용가능하게 한다. 따라서, 할로로돕신 및 채널로돕신은 함께 다중 색상 광학 활성화, 침묵화 및 신경 활성의 비-동시화를 가능하게 하고, 이는 강력한 뇌신경학 툴박스를 생성한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 생 간상 광수용체에서 검출가능한 적어도 하나의 리포터 유전자를 발현하는 것인, 망막으로 표적화된 벡터의 일부분이다.
본 발명에 적합한 바이러스 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, AAV, PRV 또는 렌티바이러스는 유전자를 간상 광수용체로 표적화하고 전달하는데 적합하다.
단리된 망막을 사용하여 연구할 때, 망막 세포에 최적인 바이러스 전달은 신경절 세포 측면이 아래로 향하게 탑재하고, 이로써, 망막의 광수용체 측면은 노출되고, 그에 따라, 형질감염이 더욱 잘 이루어질 수 있도록 함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 기술은 예를 들어, 면도날로 망막의 내부 경계막을 슬라이싱하는 것이며, 이로써, 전달 바이러스 내막을 투과할 수 있다. 추가 방법은 아가에 망막을 포매시키고, 상기 망막을 슬라이싱하고, 슬라이스의 측면으로부터 전달 바이러스를 적용시키는 것이다.
형질감염된 세포의 출력량은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 예컨대, 다전극 어레이 또는 패치-클램프와 같은 전기적 방법을 사용하여, 또는 예컨대, 형광의 검출과 같은, 시각적 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에서, 내부 경계막은 내부 경계막의 미세 수술에 의해 제거된다. 다른 경우에서, 기록은 내부 경계막에 대하여 수행된 슬라이스를 통해 달성된다.
망막 세포의 임의 공급원이 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 망막 세포는 인간 망막으로부터 유래되거나, 또는 인간 망막에 있는 것이다. 다른 실시양태에서, 망막은 동물로부터, 예를 들어, 소 또는 설치류 기원의 것이다. 인간 망막은, 보통은 상기 망막이 각막 해부 후에 폐기되는 각막 은행으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 성인 인간의 망막은 표면적이 크므로 (약 1100 ㎟), 이에 따라 다수의 실험상의 소영역으로 쉽게 분리될 수 있다. 더욱이, 망막이 뇌의 나머지 부분과 동일한 시냅스를 가지고 있기 때문에, 망막은 또한 시냅스 소통을 위한 정교한 모델로서도 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "동물"이라는 용어는 모든 동물을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 척추동물이다. 동물의 예로는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 말, 닭, 오리, 거위, 고양이, 개 등이 있다. "동물"이라는 용어는 또한 배아 단계 및 태아 단계를 포함한, 모든 발생 단계의 개체 동물을 포함한다. "유전적으로 변형된 동물"은 세포 내 수준에서의 의도적인 유전자 조작에 의해, 예컨대, 표적화된 재조합, 미세주사 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 변경되거나, 또는 받은 유전 정보를 보유하는 하나 이상의 세포를 함유하는 임의의 동물이다. "유전적으로 변형된 동물"이라는 용어는 고전적 교배 육종 또는 시험관내 수정을 포함하는 것으로 의도된다기보다는, 하나 이상의 세포가 재조합 DNA 분자에 의해 변경되거나, 또는 그를 받은 동물을 포함하는 것을 의미한다. 상기 재조합 DNA 분자는 정의된 유전적 유전자좌로 특이적으로 표적화될 수 있거나, 염색체 내에 무작위로 통합될 수 있거나, 또는 이는 염색체외에서 복제성 DNA일 수 있다. "생식 계열이 유전적으로 변형된 동물"이라는 용어는 유전자 변경 또는 유전 정보가 생식 계열 세포 내로 도입되었고, 이로써, 유전 정보를 그의 자손에게로 전달할 수 있는 능력을 부여받은 것인, 유전적으로 변형된 동물을 지칭한다. 실제로 상기 자손이 상기 변경 또는 유전 정보 중 일부 또는 그 모두를 소지하고 있다면, 그 또한 유전적으로 변형된 동물이다.
변경 또는 유전 정보는 수혜자가 속하는 동물 종에 대해서 외부 것일 수 있거나, 또는 특정 개별 수혜자에게만 외부 것일 수 있거나, 또는 수혜자가 이미 소지하고 있는 유전 정보일 수 있다. 마지막 경우에서, 변경된 또는 도입된 유전자는 천연 유전자와 다르게 발현될 수 있거나, 또는 전혀 발현되지 않을 수 있다.
표적 유전자를 변경시키는데 사용되는 유전자는 게놈 공급원으로부터의 단리, 단리된 mRNA 주형으로부터의 cDNA의 제조, 직접 합성, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 매우 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다. 트랜스진 도입을 위한 표적 세포 유형은 ES 세포이다. ES 세포를 시험관내에서 배양되고, 배아와 융합된 이식 전 배아로부터 수득할 수 있다 ([Evans et al. (1981), Nature 292:154-156]; [Bradley et al. (1984), Nature 309:255-258]; [Gossler et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069]; [Robertson et al. (1986), Nature 322:445-448]; [Wood et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4582-4584]). 트랜스진을 표준 기술, 예컨대, 전기천공을 사용하는 DNA 형질감염에 의해, 또는 레트로바이러스 매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 효율적으로 도입할 수 있다. 이후, 생성된 형질전환된 ES 세포를 응집에 의해 상실배와 조합하거나, 비-인간 동물로부터의 배반포 내로 주사할 수 있다. 이후, 도입된 ES 세포는 배아를 정착시키고, 생성된 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다 (Jaenisch (1988), Science 240:1468-1474). 유전자 표적화된 유전적으로 변형된 마우스 생성에서의 유전자 표적화된 ES 세포의 용도는 1987년에 기술되었고 ([Thomas et al. (1987), Cell 51:503-512]), 이는 다른 문헌에도 리뷰되어 있다 ([Frohman et al. (1989), Cell 56:145-147]; [Capecchi (1989), Trends in Genet. 5:70-76]; [Baribault et al. (1989), Mol. Biol. Med. 6:481-492]; [Wagner (1990), EMBO J. 9:3025-3032]; [Bradley et al. (1992), Bio/Technology 10:534-539]).
특이적 변이를 염색체 대립유전자 내로 삽입하기 위해 표적화된 상동성 재조합을 사용함으로써 임의의 원하는 돌연변이로 임의의 유전자 영역을 불활성화시키거나, 또는 변경시키는 기술이 이용가능하다.
본원에서 사용되는 바, "표적화된 유전자"는 본원에 기술된 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 인간 개입에 의해 비-인간 동물의 생식 계열 내로 도입된 DNA 서열이다. 본 발명의 표적화된 유전자는 동족 내인성 대립유전자를 특이적으로 변경시키도록 디자인된 DNA 서열을 포함한다.
본 발명에서, "단리된"이란, 물질이 그의 원래의 환경 (예를 들어, 그가 천연적으로 발생된 것이라면, 자연 환경)으로부터 제거되고, 따라서, "인공적으로" 그의 천연 상태로부터 변경되었다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드는 벡터 또는 물질 조성물의 일부일 수 있거나, 또는 세포 내에 함유되어 있을 수 있으며, 상기 벡터, 물질 조성물, 또는 특정 세포는 상기 폴리뉴클레오티드의 원래의 환경이 아니기 때문에, 이는 여전히 "단리된" 것일 수 있다. "단리된"이라는 용어는 게놈 또는 cDNA 라이브러리, 전세포 전체 또는 mRNA 제제, 게놈 DNA 제제 (전기영동에 의해 분리되고, 블롯 상으로 전달된 것 포함), 전단된 전세포 게놈 DNA 제제 또는 관련 기술분야에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드/서열의 뚜렷이 구별되는 특징이 입증되지 않는 다른 조성물을 지칭하지 않는다. 단리된 DNA 분자의 추가 예로는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자, 또는 용액 중 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 DNA 분자를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 그러나, (예를 들어, 클론 및 라이브러리의 다른 구성원을 함유하는 균질 용액 형태의) 라이브러리의 다른 구성원으로부터 단리되지 않은, 라이브러리 (예를 들어, 게놈 또는 cDNA 라이브러리)의 구성원인 클론 중에 함유된 핵산, 또는 세포 또는 세포 용해물로부터 제거된 염색체 (예를 들어, 핵형에서와 같은 "염색체 스프레드"), 또는 무작위로 전단된 게놈 DNA의 제제, 또는 하나 이상의 제한 효소로 절단된 게놈 DNA의 제제는 본 발명의 목적을 위해 "단리된" 것이 아니다. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 천연적으로, 재조합적으로, 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥, 또는 더욱 전형적으로, 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 추가로, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는, 삼중-가닥 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기, 또는 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 백본을 함유할 수 있다. "변형된" 염기로는 예를 들어, 트리틸화된 염기 및 드문 염기, 예컨대, 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA가 다양하게 변형될 수 있고; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
"폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 표현은 오직 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
"엄격한 혼성화 조건"이란, 50% 포름아미드, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 μg/ml 변성된, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 약 50℃에서 필터를 0.1x SSC 중에서 세척하는 것을 지칭한다. 혼성화의 엄격도 및 신호 검출 변화는 주로 포름아미드 농도 (포름아미드의 백분율이 낮을수록 엄격도는 더 낮아진다); 염 조건, 또는 온도 조작을 통해 달성된다. 예를 들어, 중간 정도로 높은 엄격도 조건은 6X SSPE (20X SSPE = 3M NaCl; 0.2M NaH2PO4; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 μg/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후; 50℃에서 1XSSPE, 0.1% SDS로 세척하는 것을 포함한다. 추가로, 더욱 낮은 엄격도에서 달성하기 위해서는 엄격한 혼성화 이후에 수행되는 세척이 더 높은 염 농도 (예를 들어, 5X SSC)에서 수행될 수 있다. 상기 조건은 혼성화 실험에서 배경을 억제시키는데 사용되는 대체 차단 시약의 포함 및/또는 치환을 통해 변동될 수 있다. 전형적인 차단 시약으로는 덴하르트 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA, 및 상업적으로 이용가능한 전매 제제를 포함한다. 특이적 차단 시약을 포함하기 위해서는 화합성과 관련된 문제에 기인하여 상기 기술된 혼성화 조건을 변형시켜야 할 수도 있다.
폴리펩티드를 언급할 때, "단편," "유도체" 및 "유사체"라는 용어는 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 유사체는 프로-단백질 일부의 절단에 의해 활성화됨으로써 활성 성숙한 폴리펩티드를 생성할 수 있는 프로-단백질을 포함한다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 쇄를 생성하는데 수반되는 DNA 세그먼트를 의미하며; 이는 코딩 영역 전후의 영역 "리더 및 트레일러" 뿐만 아니라, 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론)도 포함한다.
폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산, 즉, 펩티드 등배전자체로 구성될 수 있고, 20개의 유전자 코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 천연 프로세스, 예컨대, 번역 후 프로세싱에 의해, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 상기 변형은 기본 교재에 및 더욱 상세한 논문에 뿐만 아니라, 방대한 연구 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한, 폴리펩티드 중의 어디에서나 이루어질 수 있다. 같은 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드 중의 여러 부위에 같은 정도로 또는 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어, 유비퀴틴화의 결과로서 분지화될 수 있고, 분지를 포함하거나, 또는 포함하지 않는 시클릭일 수 있다. 시클릭, 분지형, 및 분지형 시클릭 폴리펩티드는 번역후의 천연 프로세스로부터 생성될 수 있거나, 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, 비오티닐화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교 결합, 고리화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 아이오딘화, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 연결, 메틸화, 미리스토일, 산화, 페길화, 단백질 가수분해 프로세싱 (예를 들어, 절단), 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 전달 RNA 매개의 아미노산의 단백질에의 부가, 예컨대, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. (예를 들면, [PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)]; [POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. I-12 (1983)]; [Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990)]; [Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)] 참조).
"생물학적 활성을 가진" 폴리펩티드 단편이란, 용량 의존적, 또는 용량 비의존적 방식으로, 특정 생물학적 검정법에서 측정된 바, 성숙한 형태를 포함한, 원래의 폴리펩티드의 활성과 유사하지만, 꼭 동일한 것은 아닌 활성을 보이는 폴리펩티드를 지칭한다. 용량 의존성이 존재하는 경우, 이는 폴리펩티드의 것과 동일할 필요는 없고, 오히려 원래의 폴리펩티드와 비교하였을 때, 주어진 활성에서의 용량 의존성과 실질적으로 유사하여야 한다 (즉, 후보 폴리펩티드는 원래의 폴리펩티드와 비교하였을 때, 더욱 큰 활성을 보이거나, 또는 약 25배 이하의 더 작은, 및 일부 실시양태에서, 약 10배 이하의 더 작은 활성, 또는 약 3배 이하의 더 작은 활성을 보일 것이다).
종 상동체는 단리될 수 있고, 본원에서 제공된 서열로부터 적합한 프로브 또는 프라이머를 제조하고, 원하는 상동체에 대한 적합한 핵산 공급원을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
"변이체"란, 원래의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하지만, 그의 본질적인 특성을 보유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 변이체는 원래의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 전반적으로 매우 유사하고, 다수의 영역에서는 동일하다.
실제로, 임의의 특정 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한지 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 전체 서열 정렬로도 또한 지칭되는, 질의 서열 (본 발명의 서열)과 대상 서열 사이의 최고 전체 매치를 결정하는 바람직한 방법은 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App. Blosci. (1990) 6:237-245)]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환시킴으로써 비교될 수 있다. 상기 전체 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 제시된다. DNA 서열의 FASTDB 정렬에서 퍼센트 동일성을 계산하는데 사용되는 바람직한 파라미터는 행렬=단위, k-튜플=4, 미스매치 패널티--1, 연결 패널티--30, 무작위화 기 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 패널티--5, 갭 크기 패널티 0.05, 윈도우 크기=500 또는 어느 것이든 더 짧은, 대상 뉴클레오티드 서열의 길이이다. 내부 결실이 아니라, 5' 또는 3' 결실로 인해 대상 서열이 질의 서열보다 더 짧다면, 결과에 대한 수동 보정이 수행될 수 있다. 이는 퍼센트 동일성을 계산할 때, FASTDB 프로그램이 대상 서열의 5' 및 3' 말단절단을 처리하지 않았기 때문이다. 질의 서열과 비교하였을 때, 5' 또는 3' 단부에서 말단절단된 대상 서열의 경우, 퍼센트 동일성은 질의 서열의 전체 염기에 대한 퍼센트로서, 매칭/정렬되지 않는, 대상 서열의 5' 및 3'인 질의 서열의 염기의 개수를 계산함으로써 보정된다. 뉴클레오티드의 매칭/정렬 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 측정된다. 이어서, 상기 백분율을, 특정화된 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성으로부터 감산하여 최종 퍼센트 동일성 점수에 도달하게 된다. 상기 보정된 점수는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 질의 서열과 매칭/정렬되지 않는, FASTDB 정렬에 의해 제시된 것과 같은, 대상 서열의 5' 및 3' 염기 바깥쪽의 염기만이 퍼센트 동일성 점수를 수동적으로 조정하는 목적을 위해 계산된다. 예를 들어, 90개의 염기로 된 대상 서열을 100개의 염기로 된 질의 서열에 대해 정렬하여 퍼센트 동일성을 결정한다. 결실이 대상 서열의 5' 단부에서 발생되고, 그러므로, FASTDB 정렬은 5' 단부의 처음 10개의 염기의 매칭/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 손상된 염기는 서열 중 10% (매칭되지 않는 5' 및 3' 단부의 염기 개수/질의 서열 중의 전체 염기 개수)를 차지하는 바, 이에 10%를 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 점수로부터 감산한다. 남은 90개의 염기가 완벽하게 매칭된다면, 최종 퍼센트 동일성은 90%가 될 것이다. 또 다른 예에서, 90개의 염기로 된 대상 서열을 100개의 염기로 된 질의 서열과 비교한다. 이때, 결실은 내부 결실이고, 이에, 질의와 매칭/정렬되지 않는 염기는 대상 서열의 5' 또는 3'에 존재하지 않는다. 상기 경우에서, FASTDB에 의해 계산된 퍼센트 동일성은 수동으로 보정되지 않는다. 한 번 더, 질의 서열매칭/정렬되지 않는, 대상 서열의 5' 및 3' 염기만 오직 그에 대해 수동 보정된다.
본 발명의 질의 아미노산 서열과 적어도, 예를 들어, 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의해, 대상 폴리펩티드 서열이 질의 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산당 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하면, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열은 질의 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말해, 질의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 대상 서열 중의 아미노산 잔기 중 최대 5%가 삽입, 결실, 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 참조 서열의 이러한 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복실 말단 위치에서, 또는 참조 서열 내 잔기 중에 개별적으로 또는 참조 서열 내에 하나 이상의 인접해 있는 군 중에 산재된, 상기 말단 위치 사이의 어느 위치에서나 일어날 수 있다.
실제로, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를 들면, 서열로 제시된 아미노산 서열과, 기탁된 DNA 클론에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한지 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 전체 서열 정렬로도 또한 지칭되는, 질의 서열 (본 발명의 서열)과 대상 서열 사이의 최고 전체 매치를 결정하는 바람직한 방법은 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245)]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 둘 다 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 전체 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 제시된다. FASTDB 아미노산 정렬에서 사용되는 바람직한 파라미터는 행렬=PAM 0, k-튜플=2, 미스매치 패널티--1, 연결 패널티=20, 무작위화 기 길이=0, 컷오프 점수=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 패널티--5, 갭 크기 패널티--0.05, 윈도우 크기=500 또는 어느 것이든 더 짧은, 대상 아미노산 서열이다. 내부 결실이 아니라, N- 또는 C-말단 결실로 인해 대상 서열이 질의 서열보다 더 짧다면, 결과에 대한 수동 보정이 수행될 수 있다. 이는 전체 퍼센트 동일성을 계산할 때, FASTDB 프로그램이 대상 서열의 N- 및 C-말단의 말단절단을 처리하지 않았기 때문이다. 질의 서열과 비교하였을 때, N- 및 C-말단에서 말단절단된 대상 서열의 경우, 퍼센트 동일성은 질의 서열의 전체 염기에 대한 퍼센트로서, 상응하는 대상 잔기와 매칭/정렬되지 않는, 대상 서열의 N- 및 C-말단인 질의 서열의 잔기의 개수를 계산함으로써 보정된다. 잔기의 매칭/정렬 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 상기 백분율을, 특정화된 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성으로부터 감산하여 최종 퍼센트 동일성 점수에 도달하게 된다. 상기 최종 퍼센트 동일성 점수는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 질의 서열과 매칭/정렬되지 않는, 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 퍼센트 동일성 점수를 수동적으로 조정하는 목적을 위해 고려된다. 즉, 오직 질의 잔기만이 대상 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 바깥쪽에 위치한다. 질의 서열과 매칭/정렬되지 않는, FASTDB 정렬에 의해 제시된 것과 같은, 대상 서열의 N- 및 C-말단 단부 바깥쪽에 위치하는 잔기만이 수동 보정된다. 본 발명의 목적을 위해 다른 수동 보정은 진행되지 않아야 한다.
천연적으로 발생된 단백질 변이체는 "대립유전자 변이체"로 불리며, 이는 유기체의 염색체 상의 주어진 유전자좌를 점유하는 유전자의 여러 대체 형태 중 하나를 지칭한다. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985).) 상기 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 수준에서 달라질 수 있다. 대안적으로, 비-천연적으로 발생된 변이체는 돌연변이유발 기술에 의해, 또는 직접 합성에 의해 생성될 수 있다.
"표지"란, 직접, 또는 신호 생성 시스템의 하나 이상의 추가 구성원과의 상호작용을 통해 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 작용제를 지칭한다. 직접 검출가능하고, 본 발명에서 사용될 수 있는 것으로 간주될 수 있는 표지로는 형광 표지를 포함한다. 구체적인 형광단으로는 플루오레세인, 로다민, BODIPY, 시아닌 염로 등을 포함한다.
"형광 표지"란, 또 다른 파장의 빛에 의해 활성화되었을 때, 특정 파장의 빛을 방출할 수 있는 능력을 갖는 임의의 표지를 지칭한다.
"형광"이란, 강도, 스펙트럼, 파장, 세포내 분포 등을 포함한, 형광 신호의 임의의 검출가능한 특징을 지칭한다.
형광을 "검출하는"이란, 정성적 또는 정량적 방법을 사용하여 세포의 형광을 사정하는 것을 지칭한다. 본 발명의 실시양태 중 일부에서, 형광은 정성적 방식으로 검출될 것이다. 다시 말해, 형광 마커는 존재하거나, 또는 존재하지 않을 수 있는데, 이는 재조합 융합 단백질의 발현 여부를 나타내는 것이다. 다른 경우에서는, 형광은 상이한 조건 하에 수득된 값들의 통계학적 비교를 허용하면서, 정량적 수단을 사용하여, 예컨대, 형광 강도, 스펙트럼 또는 세포내 분포를 측정하여 결정될 수 있다. 상기 수준은 또한 정성적 방법, 예컨대, 시각적 분석, 및 예컨대, 형광 현미경 또는 다른 광학 검출기 (예컨대, 영상 분석 시스템 등)를 사용하여 검출된 샘플과 같은 다중 샘플의 인간에 의한 비교를 사용하여 결정될 수 있다. 형광에서의 "변경" 또는 "변조"란, 또 다른 조건과의 비교로서 나타나는 특정 조건 하에의 강도, 세포내 분포, 스펙트럼, 파장 또는 형광의 다른 측면에서의 임의의 검출가능한 차이를 지칭한다. 예를 들어, "변경" 또는 "변조"는 정량적으로 검출되고, 차이는 통계학상 유의적인 차이이다. 형광에서의 임의의 "변경" 또는 "변조"는 표준 기기 장치, 예컨대, 형광 현미경, CCD, 또는 임의의 다른 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있고, 자동화 시스템, 예컨대, 통합 시스템을 사용하여 검출될 수 있거나, 인간 관찰자에 의한 주관적인 변경 검출을 반영할 수 있다.
"녹색 형광 단백질" (GFP)은 원래 청색 광에 노출되었을 때, 녹색 형광을 발하는 해파리 아에쿼레아 빅토리아(Aequorea victoria)/아에쿼레아 아에쿼레아(Aequorea aequorea)/아에쿼레아 포르스칼레아(Aequorea forskalea)로부터 단리된, 238개의 아미노산으로 구성된 (26.9 kDa) 단백질이다. 에이. 빅토리아(A. victoria)로부터의 GFP는 파장 395 nm에서 주요 여기 피크 및 475 nm에서 부차적 여기 피크를 갖는다. 그의 방출 피크는 509 nm에 존재하는데, 이는 가시 스펙트럼 중 더 낮은 녹색 부분에 있다. 바다 팬지 (레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis))로부터의 GFP는 498 nm에 단일의 주요 여기 피크를 갖는다. 광범위하게 사용될 수 있는 잠재성 및 연구원들의 요구 사항의 변화에 기인하여, GFP의 다수의 상이한 돌연변이체가 조작되어 왔다. 최초의 주된 개선은 1995년 로저 첸(Roger Tsien)에 의해 네이처 (Nature)에서 보고된 단일 점 돌연변이 (S65T)였다. 상기 돌연변이는 GFP의 스펙트럼 특징을 크게 개선시켰고, 이를 통해 형광 증가, 광안정성 및 방출 피크는 509 nm로 그대로 유지되면서, 주요 여기 피크의 488 nm로의 이동이 이루어졌다. 상기 스캐폴드에 37℃ 폴딩 효율 (F64L) 점 돌연변이체를 부가함으로써 증강된 GFP (EGFP)를 얻었다. EGFP는 55,000 L/(mol·cm)로도 또한 인용되는, 9.13x10-21 ㎡/분자인 그의 광학 단면적으로도 공지된, 흡광 계수 (ε으로 표시)를 갖는다. 심지어 충분히 폴딩하지 못하는 펩티드에 융합되었을 때에도 GFP가 신속하게 폴딩되고, 성숙화될 수 있도록 허용하는 돌연변이 시리즈인 슈퍼폴더 GFP는 2006년에 보고되었다.
"황색 형광 단백질" (YFP)은 아에쿼레아 빅토리아로부터 유래된, 녹색 형광 단백질의 유전자 돌연변이체이다. 그의 여기 피크는 514 nm이고, 그의 방출 피크는 527 nm이다
본원에서 사용되는 바, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
"바이러스"는 숙주 세포 외부에서는 성장 또는 복제가 불가능한 초현미경적 감염체이다. 각 바이러스 입자, 또는 비리온은 캡시드라 불리는 보호 단백질 외피 내의 유전 물질인 DNA 또는 RNA로 이루어진다. 캡시드 형상은 간단한 나선형 및 20면체 (다면체 또는 거의 구형) 형태에서부터 테일 또는 외피가 있는 더욱 복잡한 구조까지 다양하다. 바이러스는 세포성 생물 형태를 감염시키고, 이는 감염되는 숙주 유형에 따라 동물, 식물 및 박테리아 유형으로 분류된다.
본원에서 사용되는 바, "트랜스시냅스성 바이러스"라는 용어는 시냅스를 통해 한 뉴런에서 또 다른 연결 뉴런으로 이동할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 상기 트랜스시냅스성 바이러스의 예로는 랍도바이러스, 예를 들어, 광견병 바이러스, 및 알파헤르페스바이러스, 예를 들어, 가성 광견병 또는 단순 헤르페스 바이러스가 있다. 본원에서 사용되는 바, "트랜스시냅스성 바이러스"라는 용어는 또한 그 스스로 시냅스를 통해 한 뉴런에서 또 다른 연결 뉴런으로 이동할 수 있는 능력을 갖는 바이러스 서브유니트, 및 상기 서브유니트를 도입하고, 시냅스를 통해 한 뉴런에서 또 다른 연결 뉴런으로 이동할 수 있는 능력을 입증하는 생물학적 벡터, 예컨대, 변형된 바이러스를 포함한다.
트랜스시냅스성 이동은 전진성 또는 역행성일 수 있다. 역행성 이동 동안, 바이러스는 시냅스후 뉴런에서 시냅스전 뉴런으로 이동할 것이다. 따라서, 전진성 이동 동안, 바이러스는 시냅스전 뉴런에서 시냅스후 뉴런으로 이동할 것이다.
상동체란, 공통의 조상을 공유하는 단백질을 지칭한다. 유사체는 공통의 조상을 공유하지 않고, 그들이 한 부류에 포함될 수 있도록 하는 (구조적 유사성보다는) 일부 기능적 유사성을 갖는다 (예를 들어, 트립신, 예컨대, 세린 프로테이나제 및 서브틸리신은 명백하게 관련이 없고 - 활성 부위 바깥쪽 그의 구조는 완전히 상이하지만, 그는 실제로 기하학상 동일한 활성 부위를 가지며, 따라서, 이는 유사체에 대한 수렴 진화의 예로서 간주된다).
상동체에는 2가지 하위부류 - 오르토로그 및 파라로그가 있다. 오르토로그는 다른 종에서의 같은 유전자 (예를 들어, 시토크롬 'c')이다. 같은 유기체에서의 두 유전자는 오르토로그일 수 없다. 파라로그는 유전자 중복의 결과이다 (예를 들어, 헤모글로빈 베타 및 델타). 두 유전자/단백질이 상동성이고, 같은 유기체에 있다면, 이는 파라로그이다.
본원에서 사용되는 바, "장애"라는 용어는 질병, 질환, 병, 임상적 병태 또는 병리학적 병태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 활성 성분의 생물활성 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이고, 투여받는 환자에게 독성을 띠지 않는 담체 매질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 유도체"라는 용어는 예를 들어, 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 확인되는, 대상체에게 비교적 비-독성인 작용제의 임의의 상동체, 유사체 또는 단편을 지칭한다.
"치료제"라는 용어는 장애, 또는 장애의 합병증의 예방 또는 치료에 도움을 주는 임의의 분자, 화합물 또는 치료를 지칭한다.
치료를 위해 화합성 제약 담체 중에서 제제화된 상기 작용제를 포함하는 조성물을 제조하고, 패키징하고, 표지할 수 있다.
복합체가 수용성일 경우, 적절한 완충제, 예를 들어, 포스페이트 완충처리된 염수 또는 다른 생리학상 화합성인 용액 중에서 제제화될 수 있다.
대안적으로, 생성된 복합체가 수성 용매 중에서 난용성일 경우, 이때는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(Tween) 또는 폴리에틸렌 글리콜과 함께 제제화될 수 있다. 따라서, 화합물 및 그의 생리학상 허용되는 용매화물은 흡입 또는 통기법 (입 또는 코를 통해)에 의한 투여용, 또는 경구, 협측, 비경구, 직장 투여용으로 제제화될 수 있거나, 또는 종양의 경우, 고형 종양 내로 직접 주사될 수 있다.
경구 투여를 위하여, 제약 제제는 액체 형태로, 예를 들어, 액제, 시럽제, 또는 현탁제일 수 있거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 약물 제품으로써 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 제약상 허용되는 첨가제, 예컨대, 현탁화제 (예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제 (예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예컨대, 아몬드 오일, 오일 에스테르, 또는 분별 식물성 오일); 및 보존제 (예컨대, 메틸- 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용하여 통상의 수단에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어, 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 결합제 (예컨대, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예컨대, 락토스, 미세질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제 (예컨대, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예컨대, 소듐 라우릴 술페이트)를 이용하여 통상의 수단에 의해 제조된, 예를 들어, 정제 또는 캡슐제 형태를 취할 수 있다. 정제는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물을 조절 방식으로 방출할 수 있도록 적합하게 제제화될 수 있다.
화합물은 주사에 의한, 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구적 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태로, 예컨대, 앰플로, 또는 다회 투약용 용기로 제공될 수 있다.
조성물은 오일성 또는 수성 부형제 중 현탁제, 액제 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열성 물질 제거수와 함께 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
화합물은 또한 국소 적용으로서, 예컨대, 크림 또는 로션으로서 제제화될 수 있다.
앞서 기술된 제제 이외에도, 화합물은 또한 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 상기 장기간 작용성 제제는 이식에 의해 (예를 들어, 안구내, 피하 또는 근육내), 또는 안구내 주사에 의해 투여될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제제화될 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 친수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체에 관한 널리 공지된 예이다.
원하는 경우, 조성물은 활성 성분을 함유한 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 수반할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 치료 요법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 하나 이상의 용기 중에 제약상 허용되는 형태의 조성물을 치료학상 또는 예방학상 유효량으로 포함한다.
키트의 바이알 중의 조성물은 예컨대, 멸균 염수, 덱스트로스 용액 또는 완충처리된 용액, 또는 다른 제약상 허용되는 멸균 유체와 함께 조합된 제약상 허용되는 액제 형태일 수 있다. 대안적으로, 복합체는 동결건조되거나, 건조될 수 있고; 이러한 경우, 키트는 임의적으로 주사용 액제를 형성하기 위해 복합체를 재구성하기 위한 제약상 허용되는 용액 (예컨대, 염수, 덱스트로스 용액 등), 바람직하게, 멸균 용액을 용기 내에 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 바람직하게, 복합체를 주사하기 위해 멸균 형태로 패키징된 니들 또는 시린지, 및/또는 패키징된 알콜 패드를 추가로 포함한다. 임상의에 의한 또는 환자에 의해 조성물 투여를 위해 임의적으로 설명서를 포함한다.
간상 광수용체, 간상 세포, 또는 간상체는 다른 유형의 시각 광수용체인 원추 세포보다 강도가 더 낮은 빛에서 작용할 수 있는, 눈의 망막에 존재하는 광수용체 세포이다. 간상체는 망막의 바깥쪽 주변부에 집중되어 있고, 주변시에 사용된다. 평균적으로, 대략 90백만개의 간상 세포가 인간 망막에 존재한다. 원추 세포보다 더 고감도인 간상 세포는 거의 전적으로 야간 시력을 담당한다. 그러나, 인간 원추 세포가 3가지 유형의 색소를 가지고 있는 것과 달리, 간상 세포는 오직 단 한가지 유형의 감광성 색소를 가지고 있기 때문에, 색각에서의 간상체의 역할은 있다해도 극히 적다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수는 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에서 기술된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 예들은 단지 예시적인 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 안된다.
실시예
유전자 구축물
후보 조절 영역을 확인하기 위해 관심 세포 유형 (간상체)에서 전체 게놈 고해상도 DNA 메틸화 지도를 작성하였다. 세포 유형 특이적 DNA 저메틸화 존재에 기초하여 후보 인핸서를 선별하였다. 상기와 같이 선별된 요소를 원추체 및 간상체에서 생체내 고처리량 리포터 검정법을 사용하여 발현에 대하여 스크리닝하였다. 이어서, 간상체 특이적 서열 요소를 합성하고, 최소 프로모터 서열 ATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCCACTATAGGCCA (서열식별번호: 2) 앞에서 클로닝하였다. ChR2-eGFP 코딩 서열을 상기 프로모터 및 최적화된 코작 서열(Kozak) (GCCACC) 바로 뒤에 삽입하고, 그 다음으로 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 및 SV40 폴리아데닐화 부위가 이어졌다. 3.43E+11 내지 1.75E+12 GC/mL 범위의 역가로 AAV 혈청형 2/8을 사용하여 망막 뉴런을 표적화하였다.
바이러스 형질감염 및 조직 제조
AAV 투여를 위해, 마취된 동물의 눈을 예리한 30 게이지 니들에 의해 수정체에 인접해 있는 공막에서 천공시켰다. 2 마이크로L의 AAV 입자 현탁액을 해밀턴(Hamilton) 시린지에 의해 망막하에 주사하였다. 3주 후, 단리된 망막을 PBS 중 4% PFA에서 30 min 동안 고정시킨 후, 4℃에서 PBS 중에서 세척 단계를 수행하였다. 전체 망막을 실온에서 1 h 동안 10% 정상 당나귀 혈청 (NDS), 1% BSA, PBS 중 중 0.5% 트리톤(Triton) X-100으로 처리하였다. 실온에서 5일 동안 3% NDS, 1% BSA, PBS 중 0.5% 트리톤 X-100 중 모노클로날 래트 항-GFP 항체 (몰레큘라 프로브즈 인크.(Molecular Probes Inc.); 1:500) 및 폴리클로날 토끼 항-마우스 콘 아레스틴(Cone Arrestin) 항체 (밀리포어(Millipore): 1:200)로 처리하였다. 2 hr 동안 2차 당나귀 항-래트 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-488 Ab (몰레큘라 프로브즈 인크.; 1:200), 항-토끼 알렉사 플루오르-633 및 훽스트로 처리하였다. 절편을 세척하고, 유리 슬라이드 상에 프로롱 골드(ProLong Gold) 안티페이드 시약 (몰레큘라 프로브즈 인크.)과 함께 탑재하고, 자이스 LSM 700 악시오 이미저 Z2(Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2) 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (칼 자이스 인크.(Carl Zeiss Inc.))을 사용하여 촬영하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research <120> SynP161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors <130> PAT057174 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 191 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 attccggtca cacggccaag attattccac ctgcgctttg agcaataggg agagggctct 60 ggtgcctctt cctggaattt gattaattcg cttgagtcag tcacagaatt tgaggaagca 120 ttgatatttg aagatgtgtt cttctaaagg atacaaatga atatatgcat agtgagagtt 180 taggagatag g 191 <210> 2 <211> 106 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atcctcacat ggtcctgctg gagttagtag agggtatata atggaagctc gacttccagc 60 tatcacatcc actgtgttgt tgtgaactgg aatccactat aggcca 106

Claims (12)

  1. 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지거나, 또는 상기 서열식별번호: 1의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 적어도 150 bp의 핵산 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 단리된 핵산 분자는 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 상기 단리된 핵산 분자에 작동가능하게 연결되는 경우에 간상 광수용체에서의 유전자의 특이적 발현을 유도하는 것인 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 최소 프로모터, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 최소 프로모터를 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  3. 엄격한 조건 하에 제1항 또는 제2항에 따른 단리된 핵산 분자에 혼성화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  4. 특이적 세포에서의 유전자 발현을 촉진시키는 요소로서 제1항 또는 제2항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 발현 카세트이며, 여기서 상기 단리된 핵산은 적어도 간상 광수용체에서 특이적으로 발현하고자 하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 발현 카세트.
  5. 제4항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 벡터.
  7. 간상 광수용체에서의 유전자의 발현을 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 핵산의, 제4항에 따른 발현 카세트의, 또는 제5항에 따른 벡터의 용도.
  8. 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단을 제4항에 따른 발현 카세트로 형질감염시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포가 간상 광수용체이거나, 또는 상기 세포가 간상 광수용체를 포함하는 경우에, 발현하고자 하는 유전자는 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단에 의해 특이적으로 발현될 것인, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하는 방법.
  9. 제4항에 따른 발현 카세트, 또는 제5항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  10. 제9항에 있어서, 발현 카세트 또는 벡터가 상기 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되는 것인 세포.
  11. 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 산물이 감광성 분자, 예를 들면, 할로로돕신 또는 채널로돕신인, 단리된 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 용도, 방법 또는 세포.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는, 간상 광수용체에서 유전자를 발현하기 위한 키트.
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