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BR112021016501A2 - Composições e métodos para tratar distrofia cristalina de bietti - Google Patents

Composições e métodos para tratar distrofia cristalina de bietti Download PDF

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BR112021016501A2
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viral vector
promoter
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BR112021016501-0A
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Christie L. Bell
Jacek Krol
Josephine Juettner
Terri MCGEE
Botond Roska
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Novartis Ag
Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research
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Abstract

composições e métodos para tratar distrofia cristalina de bietti. a presente invenção refere-se a vetores virais para entregar um gene cyp4v2 heterólogo à retina, por exemplo, células rpe da retina, fornecidos no presente documento para tratar indivíduos com distrofia cristalina de bietti.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR DISTROFIA CRISTALINA DE BIETTI".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO E INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 do USC § 119(e) do Pedido Provisório US nº 62/810.250, depositado em 25 de fevereiro de 2019, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A listagem de sequências que está contida no arquivo chamado "PAT058467-WO-PCT SL.txt," que tem bytes (medido no sistema operacional MS-Windows) e foi criada em 28 de julho de 2021, é depositada juntamente e incorporada ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES
[002] A distrofia cristalina de Bietti (BCD) é uma doença autossômica recessiva em que vários depósitos do tipo cristalino pequeno, amarelo ou branco se acumulam na retina, que é seguido de atrofia coriorretiniana e perda progressiva da visão. Indivíduos com BCD tipicamente começam a perceber problemas de visão na adolescência ou na faixa dos vinte anos. Os mesmos frequentemente apresentam cegueira noturna, além de uma redução na acuidade visual. Eles geralmente também perdem áreas de visão, na maioria das vezes a visão periférica. A visão das cores também pode ser prejudicada.
[003] Os problemas de visão podem piorar em taxas diferentes em cada olho, e a gravidade e a progressão dos sintomas variam amplamente entre os indivíduos afetados, mesmo dentro da mesma família. Entretanto, a maioria dos indivíduos com BCD se torna legalmente cega aos 40 ou 50 anos de idade. A maioria dos indivíduos afetados retém algum grau de visão, geralmente no centro do campo visual, embora seja tipicamente desfocado e não possa ser corrigido por lentes de prescrição.
[004] BCD é causada por mutações no gene CYP4V2. O gene, localizado no braço longo do cromossomo 4 humano, codifica o membro 2 da subfamília V da família 4 do citocromo P450. Como um membro da família de enzimas do citocromo P450, a ω-hidroxilase está envolvida no metabolismo lipídico, especificamente na oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, como ácido docosaexaenoico (DHA) e o ácido eicosapentaenoico (EPA). Pelo menos 80 mutações de gene CYP4V2 diferentes foram identificadas em indivíduos com BCD (Zhang et al., Mol Vis 24:700-711, 2018). As mutações de gene CYP4V2 que causam BCD prejudicam ou eliminam a função da enzima e acredita-se que afetem a quebra lipídica. Entretanto, é desconhecido como as mesmas levam aos sinais e sintomas específicos de BCD.
[005] Estima-se que BCD afete aproximadamente 65 000 pessoas em todo o mundo (Xiao et al., Biochem Biophys Res Comm 409:181- 186, 2011; e Mataftsi et al., Retina 24:416-426, 2004). É mais comum em pessoas descendentes do Leste Asiático, especialmente aquelas de origem chinesa e japonesa. Atualmente, não há tratamento disponível para BCD.
SUMÁRIO
[006] A presente invenção se refere, em geral, a vetores virais recombinantes e métodos de uso de vetores virais recombinantes para expressar proteínas na retina, por exemplo, células do epitélio pigmentar da retina (RPE), de indivíduos que sofrem de doenças da retina e cegueira, por exemplo, BCD.
[007] A presente invenção, em um aspecto, se refere a vetores virais que têm capacidade de entregar um gene heterólogo à retina. A presente invenção também se refere a vetores virais que têm capacidade de direcionar um gene heterólogo para a retina, por exemplo, células RPE da retina. A presente invenção se refere adicionalmente a vetores virais que são vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV). Em certas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser selecionado dentre qualquer sorotipo AAV conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, AAV1 a AAV12. Em certas modalidades, o capsídeo de vetor rAAV é um sorotipo AAV8. Em certas outras modalidades, o capsídeo de vetor rAAV é um sorotipo AAV9. Em certas modalidades, o capsídeo de vetor rAAV é um sorotipo AAV2. Em certas modalidades, o capsídeo de vetor rAAV é um sorotipo AAV5. Em certas modalidades, o vetor rAAV é um sorotipo AAV sintético inovador derivado de sequências de capsídeo AAV do tipo selvagem modificadas.
[008] Em um aspecto, são fornecidos vetores virais, em que os vetores virais compreendem um genoma de vetor que compreende, em uma direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (iv) uma sequência de sinais de poliadenilação (poliA); e (v) uma ITR 3’. Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) um íntron; (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (v) uma sequência de sinais de poliA; e (vi) uma ITR 3’.
[009] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende,
na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (iv) um elemento regulador; (v) uma sequência de sinais poliA; e (vi) uma ITR 3’.
[0010] Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) um íntron; (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (v) um elemento regulador; (vi) uma sequência de sinais de poliA; e (vii) uma ITR 3’.
[0011] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende um comprimento maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,9 kb. Em outras modalidades, o genoma de vetor compreende um comprimento menor ou cerca de 5 kb.
[0012] Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende uma sequência de preenchimento posicionada entre a sequência de sinais de poliA e a ITR 3’. Em algumas modalidades, a sequência de preenchimento tem entre cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50- 60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400- 500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500 ou 2500- 3000 nucleotídeos de comprimento.
[0013] Em uma modalidade, a ITR 5’ compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:1.
[0014] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor ubíquo, por exemplo, um promotor de citomegalovírus (CMV), promotor CBA ou promotor CAG, por exemplo, em que o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:2, a SEQ ID NO:3 ou a SEQ ID NO:4.
[0015] Em uma modalidade, o promotor é um promotor específico do epitélio pigmentar da retina (RPE), por exemplo, um promotor ProC2, promotor VMD2, promotor CYP4V2 ou promotor RPE65, por exemplo, em que o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:5, a SEQ ID NO:6, a SEQ ID NO:7 ou a SEQ ID NO:8, e promove a expressão do CYP4V2, preferencialmente em células RPE, por exemplo, células RPE humanas.
[0016] A presente invenção, portanto, fornece uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende, ou consiste na sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5. O ácido nucleico isolado da SEQ ID NO: 5 leva à expressão em células da retina humanas ou NHP, por exemplo, células RPE humanas ou NHP, de um gene ligado de modo operacional à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5.
[0017] Em algumas modalidades, a sequência de codificação de CYP4V2 compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:13, a SEQ ID NO:14, a SEQ ID NO:39, a SEQ ID NO:41, a SEQ ID NO:43, a SEQ ID NO:45, a SEQ ID NO:47 ou a SEQ ID NO:49.
[0018] Em uma modalidade, a sequência de sinais de poliA compreende um hormônio do crescimento bovino ou sequência de nucleotídeos de poliA do vírus símio 40, por exemplo, em que a sequência de sinais de poliA compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:18 ou a SEQ ID NO:19.
[0019] Em algumas modalidades, a ITR 3’ compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:22.
[0020] Em uma modalidade, o íntron compreende um hormônio do crescimento humano, vírus símio 40 ou sequência de íntrons da beta gobina humana, por exemplo, em que o íntron compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:9, a SEQ ID NO:10 ou a SEQ ID NO:11.
[0021] Em algumas modalidades, o elemento regulador compreende um vírus da hepatite B ou sequência do vírus da hepatite da marmota, por exemplo, em que o elemento regulador compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:16 ou a SEQ ID NO:17.
[0022] Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende uma sequência de Kozak posicionada imediatamente a montante da sequência de nucleotídeo recombinantes que compreende a sequência de codificação de CYP4V2, por exemplo, em que a sequência de Kozak compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:12, da SEQ ID NO:51, da SEQ ID NO:52 ou da SEQ ID NO:53.
[0023] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22;
iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22.
[0024] Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22;
ii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22.
[0025] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em:
i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22.
[0026] Em uma modalidade, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[0027] Em algumas modalidades, o vetor compreende um capsídeo de sorotipo 8, 9, 2 ou 5 de vírus adenoassociado (AAV). Em uma modalidade, o capsídeo AAV8 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:24, 25 e 26, respectivamente. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV8 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:23. Em uma modalidade, o capsídeo AAV9 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:28, 29 e 30, respectivamente. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV9 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:27. Em uma modalidade, o capsídeo AAV2 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:32, 33 e 34, respectivamente. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:31. Em uma modalidade, o capsídeo AAV5 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:36, 37 e 38, respectivamente. Em algumas modalidades, o capsídeo AAV5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:35.
[0028] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece composições que compreendem um vetor viral descrito no presente documento. Em uma modalidade, as composições compreendem adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições se destinam ao uso no tratamento de um indivíduo com BCD, por exemplo, para uso na melhora da acuidade visual em um indivíduo com BCD.
[0029] É também fornecido um método de expressão de um gene
CYP4V2 heterólogo em uma célula da retina, em que o método compreende colocar a célula da retina em contato com um vetor viral descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a célula da retina é uma célula RPE.
[0030] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo com distrofia cristalina de Bietti (BCD), em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um vetor viral descrito no presente documento, por exemplo, em que a composição compreende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0031] Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de melhorar a acuidade visual, melhorar a função visual ou visão funcional ou inibir o declínio de função visual ou visão funcional em um indivíduo com BCD, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um vetor viral descrito no presente documento, por exemplo, em que a composição compreende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0032] Em um aspecto, é fornecido um ácido nucleico que compreende um cassete de gene, em que o cassete de gene compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (iv) uma sequência de sinais de poliA; e (v) uma ITR 3’.
[0033] Em uma modalidade, o ácido nucleico que compreende o cassete de gene é um plasmídeo.
[0034] Em algumas modalidades, o cassete de gene compreende,
na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22;
xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22;
lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22;
lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
DEFINIÇÕES
[0035] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelos versados na técnica à qual essa invenção pertence.
[0036] O termo "capsídeo" se refere ao revestimento de proteína do vírus ou vetor viral. O termo "capsídeo AAV" se refere ao revestimento de proteína do vírus adenoassociado (AAV), que é composto por um total de 60 subunidades; cada subunidade é uma sequência de aminoácidos, que pode ser proteína viral 1(VP1), VP2 ou VP3 (Muzyczka N e Berns KI (2001) Capítulo 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins).
[0037] O termo "cassete de gene" se refere a um fragmento manipulável de DNA portador, e com capacidade de expressar, um ou mais genes ou sequências de codificação de interesse, por exemplo, entre um ou mais conjuntos de sítios de restrição, embora os sítios de restrição straddling não sejam necessários. Um cassete de gene, ou uma porção do mesmo, pode ser transferido de uma sequência de DNA (frequentemente em um vetor plasmidial) para outra cortando o fragmento com o uso de enzimas de restrição e ligando o mesmo de volta em um novo contexto, por exemplo, em uma nova cadeia principal plasmidial.
[0038] O termo "gene heterólogo" ou "sequência de nucleotídeos heteróloga" se referirá tipicamente a um gene ou sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente no vírus. Alternativamente, um gene heterólogo ou sequência de nucleotídeos heterólogos pode se referir a uma sequência viral que é colocada em um ambiente de ocorrência não natural (por exemplo, por associação a um promotor com o qual não está naturalmente associado no vírus).
[0039] O termo "repetição terminal invertida" ou "ITR" se refere a um trecho de sequências de nucleotídeos que existe nos vírus adenoassociados (AAV) e/ou vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que podem formar uma estrutura palindrômica em formato de T, que é necessária para completar os ciclos de vida lítico e latente de AAV do tipo selvagem (Muzyczka N e Berns KI (2001) Capítulo 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins). Em rAAV,
essas sequências desempenham um papel funcional no empacotamento do genoma e na síntese de segunda fita.
[0040] O termo "ligado de maneira funcional" se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo, DNA). Tipicamente, o termo se refere à relação funcional de uma sequência reguladora transcricional com uma sequência que será transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou intensificadora está ligada de maneira funcional a uma sequência de codificação se a mesma estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada ou outro sistema de expressão. Em geral, sequências reguladoras transcricionais promotoras que são ligadas de maneira funcional a uma sequência transcritível são contíguas à sequência transcritível, ou seja, são cis-atuantes. Entretanto, algumas sequências reguladoras transcricionais, como intensificadoras, não precisam ser fisicamente contíguas ou localizadas em estreita proximidade com as sequências de codificação cuja transcrição intensificam.
[0041] Como usado no presente documento, o termo "porcentagem de identidade de sequência" se refere ao grau de identidade entre qualquer dada sequência de consulta e uma sequência em questão. Uma sequência em questão tem, tipicamente, um comprimento que é de cerca de 80 por cento a 250 por cento do comprimento da sequência de consulta, por exemplo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115 ou 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 por cento do comprimento da sequência de consulta. Para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de nucleotídeos, ou de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas dentre uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos para alinhamento ideal e sequências não homólogas podem ser descartadas com propósitos de comparação). Os nucleotídeos ou resíduos de aminoácido nas posições de nucleotídeos ou posições de aminoácidos correspondentes são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de nucleotídeo ou aminoácido que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usado no presente documento, "identidade" de nucleotídeo ou aminoácidos é equivalente à "homologia" de nucleotídeo ou aminoácido). A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando-se em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidas para alinhamento ideal das duas sequências.
[0042] Em outra modalidade, a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos pode ser avaliada como uma função da conservação de resíduos de aminoácidos dentro da mesma família de aminoácidos (por exemplo, carga positiva, carga negativa, polar e não carregada, hidrofóbica) nas posições correspondentes em ambas as sequências de aminoácidos (por exemplo, a presença de um resíduo de alanina no lugar de um resíduo de valina em uma posição específica em ambas as sequências mostra um alto nível de conservação, porém a presença de um resíduo de arginina no lugar de um resíduo de aspartato em uma posição específica em ambas as sequências mostra um baixo nível de conservação). Com os propósitos da presente invenção, a comparação de sequências e a determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4 e uma penalidade de lacuna de deslocamento de quadro de leitura de 5.
[0043] O termo "promotor" se refere a uma sequência que regula a transcrição de um gene ligado de maneira funcional ou sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. Os promotores fornecem a sequência suficiente para dirigir a transcrição, bem como, os sítios de reconhecimento para RNA polimerase e outros fatores de transcrição necessários para transcrição eficiente e podem dirigir a expressão específica da célula. Além da sequência suficiente para dirigir a transcrição, uma sequência promotora da invenção pode também incluir sequências de outros elementos reguladores que estão envolvidos na modulação da transcrição (por exemplo, intensificadores, promotores mínimos, sequências de Kozak e íntrons). Exemplos de promotores conhecidos na técnica e úteis nos vetores virais descritos no presente documento incluem promotores ubíquos como o promotor CMV (por exemplo, SEQ ID NO:2), promotor CBA (por exemplo, SEQ ID NO:3) e promotor CAG (por exemplo, SEQ ID NO:4). Alternativamente, um promotor específico de RPE pode ser usado para alvejar a expressão de CYP4V2 preferencialmente em células RPE da retina. Exemplos de promotores específicos de RPE incluem um promotor ProC2 (por exemplo, SEQ ID NO:5) e um promotor VMD2 (SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, o promotor CYP4V2 (SEQ ID NO:7) ou um promotor RPE65 (SEQ ID NO:8) pode ser usado como um promotor específico de RPE. Além disso, técnicas padrão são conhecidas na técnica por criarem promotores funcionais misturando-se ou combinando-se elementos reguladores conhecidos. "Promotores truncados" podem também ser gerados a partir de fragmentos promotores ou misturando-se e combinando-se fragmentos de elemento reguladores conhecidos.
[0044] O termo "CYP4V2" se refere ao membro 2 da subfamília V da família 4 do citocromo P450. O gene CYP4V2 humano é encontrado no cromossomo 4 e tem a sequência de codificação de nucleotídeo como apresentado, por exemplo, na SEQ ID NO:13. Em uma modalidade, uma sequência otimizada por códons do gene CYP4V2 humano pode ser usada. Um exemplo de tal gene CYP4V2 otimizado por códons tem a sequência de codificação de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO:14. O "produto de gene CYP4V2" é a proteína codificada por um gene CYP4V2. Em uma modalidade, um produto de gene CYP4V2 humano exemplificativo tem uma sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO:15. Em uma modalidade, uma sequência de codificação de CYP4V2 codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15 ou uma variante funcional ou fragmento da mesma. Exemplos de sequência de codificação de CYP4V2 e produtos de gene CYP4V2 de outras espécies podem ser encontrados na Tabela 2 (por exemplo, SEQ ID NOs:39-50). O termo "sequência de codificação de CYP4V2" ou "CDS de GENE CYP4V2" ou "CDS de CYP4V2" se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene CYP4V2. O versado na técnica compreenderá que uma sequência de codificação de CYP4V2 pode incluir qualquer sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene CYP4V2 ou uma variante funcional ou fragmento da mesma. Em uma modalidade, a sequência de codificação de CYP4V2 codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, 40, 42, 44, 46, 48, 50, ou uma variante funcional ou fragmento da mesma. A sequência de codificação de CYP4V2 pode ou não incluir elementos reguladores intervenientes (por exemplo, íntrons, intensificadores ou outras sequências não codificantes).
[0045] O termo "indivíduo" inclui animais humanos e não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados (por exemplo, mamíferos e não mamíferos), como primatas não humanos (por exemplo, macaco cinomolgo), camundongos, ratos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado, os termos
"paciente" ou "indivíduo" são usados de forma intercambiável no presente documento.
[0046] Como usado no presente documento, o termo "tratando" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio (por exemplo, BCD) se refere a melhorar a doença ou distúrbio como retardar ou parar ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma. "Tratando" ou "tratamento" se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo indivíduo. "Tratando" ou "tratamento" se refere a modular a doença ou distúrbio, seja fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Mais especificamente, "tratamento" de BCD significa qualquer ação que resulta na melhora ou preservação de função visual, visão funcional, anatomia retiniana e/ou Qualidade de Vida em um indivíduo que tem BCD. Como usado no presente documento, "tratamento" pode significar qualquer maneira na qual um ou mais dos sintomas de BCD são melhorados ou, de outro modo, alterados de forma benéfica. Como usado no presente documento, a melhora dos sintomas de BCD se refere a qualquer diminuição, seja permanente ou temporária, duradoura ou transitória, que pode ser atribuída ou associada ao tratamento pelas composições e métodos da presente invenção. "Prevenindo" ou "prevenção" como usado no presente documento, se refere a prevenir ou retardar o aparecimento ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio. "Prevenção" no que se refere a BCD significa qualquer ação que previne ou retarda uma piora na função visual, visão funcional, anatomia retiniana, qualidade de vida e/ou um parâmetro de doença BCD, conforme descrito abaixo, em um paciente com BCD e em risco para a dita piora. Métodos para avaliar o tratamento e/ou prevenção de doença são conhecidos na técnica e descritos no presente documento abaixo.
[0047] O termo "vetor de vírus" ou "vetor viral" se destina a se referir a uma partícula viral recombinante do tipo não selvagem (por exemplo, um parvovírus, etc.) que funciona como um veículo de entrega de gene e que compreende um genoma viral recombinante empacotado dentro de um capsídeo viral (por exemplo, AAV). Um tipo específico de vetor viral pode ser um "vetor de vírus recombinante adenoassociado" ou "vetor rAAV". O genoma viral recombinante empacotado no vetor viral também é chamado no presente documento de "genoma de vetor".
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0048] A Figura 1 são fotomicrografias que mostram a expressão de ChR2d-eGFP em montagens planas da ocular posterior. As oculares foram isoladas de olhos fixados em PFA, cortadas em pétalas e analisadas quanto à fluorescência de eGFP.
[0049] A Figura 2A e a Figura 2B são gráficos que mostram níveis de expressão de mRNA de ChR2d-eGFP como medido por ddPCR. O fold change na expressão relativo a TM073 é mostrado tanto para a ocular posterior (Figura 2A) como para a retina neural (Figura 2B). A expressão de ChR2d-eGFP foi normalizada para expressão de controle Rab7 para cada amostra.
[0050] A Figura 3 mostra imagens confocais de uma retina NHP infectada com AAV-ProC2-CatCh-GFP. Figura 3A e 3B: seções de retina que mostram CatCh-GFP (área verde ou cinza em uma imagem em escala de tons de cinza na parte superior) e mancha nuclear (Hoechst, branco). Figura 3C: imagens confocais de retinas infectadas com AAV (vista superior), CatCh-GFP (preto). Figura 3D e 3E: quantificação de densidade celular CatCh-GFP+ como uma porcentagem de tipo de célula alvo ou densidade de classe celular; valores são a média ± erro padrão da média (EPM) de n = 10 imagens confocais. A quantificação de especificidade de alvejamento de AAV é mostrada como uma porcentagem dos principais tipos de células (preto) entre células que expressam o transgene. T, quarto da retina temporal; N, quarto da retina nasal.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0051] A presente divulgação se baseia, em parte, na constatação de que a expressão de CYP4V2 de vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que têm uma combinação de promotor selecionado, genoma AAV e sorotipo de capsídeo fornece um tratamento potente e eficaz para BCD, por exemplo, a indivíduos com uma mutação em seu gene CYP4V2 (Tabela 1). Consequentemente, a presente divulgação fornece vetores virais recombinantes que dirigem à expressão da sequência de codificação de CYP4V2 para a retina, composições de vetor viral, plasmídeos úteis para gerar os vetores virais, métodos de entrega de uma sequência de codificação de CYP4V2 à retina, métodos de expressão de uma sequência de codificação de CYP4V2 em células RPE da retina e métodos de uso de tais vetores virais. Tabela 1. Mutações de CYP4V2 associadas à BCD Mudança de nucleotídeo Mudança de polipeptídeo c.31C>T p.Q11X c.64C>G p.L22V c.65T>A p.L22H c.71T>C p.L24P c.130T>A p.W44R c.134A>C p.Q45P c.181G>A p.G61S c.197T>G p.M66R c.215–2A>G Aceitador de splicing c.219T>A p.F73L c.237G>T p.E79D c.253C>T p.R85C c.254G>A p.R85H c.283G>A p.G95R c.328-1G>A Exon3del c.332T>C p.I111T c.335T>G p.L112X - terminação c.367A>G p.M123V c.368T>G p.M123R c.400G>T p.G134X - terminação c.413+2T>G Mis-splicing - Aceitador de splicing c.677T>A p.M226L c.694C>T p.R232X (substituição – sem sentido) c.732G>A p.W244X c.791del T deleção c.801+5G>A Exon6del c.802-9A>G Splicing alterado c.802–8_810del17insGC Mis-splicing - Aceitador de splicing c.838G>T p.E280X c.958C>T p.R320X c.992A>C p.H331P c.994G>A p.D332N c.1020G>A p.W340X c.1027T>G p.Y343D c.1061–1062insA deslocamento de quadro de leitura c.1091–2A>G Mis-splicing - Aceitador de splicing c.1168C>T p.R390C c.1169G>A p.R390H c.1187C>T p.P396L c.1198C>T p.R400C c.1199G>A p.R400H c.1216T>C p.C406R c.1278G>T p.L426F c.1400G>A p.C467Y c.1508G>A p.G503E
[0052] Exceto quando indicado em contrário, os métodos padrão conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para a construção de vetores de parvovírus e rAAV recombinantes, usando plasmídeos recombinantes portadores de um cassete de gene viral, plasmídeos de empacotamento que expressam as sequências rep e/ou cap de parvovírus, bem como células de empacotamento transitoriamente e estavelmente transfectadas. Tais técnicas são conhecidas pelos versados na técnica. (por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2a Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Choi et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (2007)).
[0053] Quando um vetor viral expressa uma proteína ou atividade específica, não é necessário que o gene (ou genes) relevante seja idêntico ao gene (ou genes) correspondente encontrado na natureza ou divulgado no presente documento. Desde que a proteína seja funcional, a mesma pode ser usada de acordo com um aspecto da presente invenção. O elemento versado na técnica poderia determinar prontamente se uma sequência de codificação de CYP4V2 codifica uma ω-hidroxilase funcional detectando-se a atividade de hidroxilase. Brevemente, uma proteína de interesse é misturada com ácidos graxos e outros fatores necessários e incubada para permitir que a reação de hidroxilação ocorra. Então, os ácidos graxos hidroxilados podem ser medidos por espectrometria de massa. Consultar, por exemplo, um ensaio funcional, conforme descrito em Nakano et al., Drug Metab Dispos 37:2119-2122, 2009. No entanto, uma identidade de sequência muito alta com a proteína natural é geralmente preferida. Por exemplo,
grandes deleções (por exemplo, mais que cerca de 50 aminoácidos) devem geralmente ser evitadas de acordo com certas modalidades da invenção. Portanto, os profissionais qualificados entenderão que as presentes sequências de vetores virais podem variar das sequências descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos virais tem mais que ou cerca de 80 % de identidade com as sequências fornecidas no presente documento, por exemplo, mais que ou cerca de 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as sequências fornecidas no presente documento.
[0054] Em algumas modalidades, uma mudança de sequência é uma substituição conservativa. Tal mudança inclui substituir qualquer uma dentre isoleucina (I), valina (V) e leucina (L) por qualquer outro desses aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) e vice-versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice- versa; e serina (S) por treonina (T) e vice-versa. Outras substituições podem também ser consideradas conservativas dependendo do ambiente do aminoácido específico e sua função na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) e alanina (A) podem ser frequentemente intercambiáveis, como podem alanina (A) e valina (V). Metionina (M), que é relativamente hidrofóbica, pode ser frequentemente intercambiada com leucina e isoleucina e, às vezes, com valina. Lisina (K) e arginina (R) são frequentemente intercambiáveis em locais em que a característica significativa do resíduo de aminoácido é a sua carga e as diferentes pKs desses dois resíduos de aminoácidos não são significativas. Ainda outras mudanças podem ser consideradas "conservativas" em ambientes específicos (consultar, por exemplo, Tabela III de US 20110201052; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a Ed. Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919, 1992; Lei et al., J Biol Chem
270:11882-11886, 1995). Vetores virais
[0055] A presente invenção se refere a vetores virais que dirigem a expressão de um gene heterólogo para a retina. Em certos aspectos da invenção, a expressão é dirigida preferencialmente para células RPE da retina. Uma variedade de vetores virais conhecidos na técnica pode ser adaptada por um versado na técnica para uso na presente invenção, por exemplo, vírus recombinantes adenoassociados, adenovírus recombinantes, retrovírus recombinantes, poxvírus recombinantes e baculovírus recombinantes.
[0056] Em particular, é contemplado que o vetor viral da invenção pode ser um vetor recombinante adenoassociado (rAAV). AAVs são vírus de DNA de fita simples pequenos que exigem vírus auxiliar para facilitar a replicação eficiente (Muzyczka N e Berns KI (2001) Capítulo 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins). O vetor viral compreende um genoma de vetor e um capsídeo de proteína. O capsídeo de vetor viral pode ser fornecido a partir de qualquer um dos sorotipos AAV conhecidos na técnica, incluindo sorotipos AAV humanos e não humanos atualmente identificados e sorotipos AAV que ainda serão identificados (consultar, por exemplo, Choi et al., Curr Gene Ther 5:299-310, 2005; Schmidt et al., J Virol 82:1399-1406, 2008; Patentes US nº 9.193.956; nº 9.186.419; nº 8.632.764; nº 8.663.624; nº
8.927.514; nº 8.628.966; nº 8.263.396; nº 8.734.809; nº 8.889.641; nº
8.632.764; nº 8.691.948; nº 8.299.295; nº 8.802.440; nº 8.445.267; nº
8.906.307; nº 8.574.583; nº 8.067.015; nº 7.588.772; nº 7.867.484; nº
8.163.543; nº 8.283.151; nº 8.999.678; nº 7.892.809; nº 7.906.111; nº
7.259.151; nº 7.629.322; nº 7.220.577; nº 8.802.080; nº 7.198.951; nº
8.318.480; nº 8.962.332; nº 7.790.449; nº 7.282.199; nº 8.906.675; nº
8.524.446; nº 7.712.893; nº 6.491.907; nº 8.637.255; nº 7.186.522; nº
7.105.345; nº 6.759.237; nº 6.984.517; nº 6.962.815; nº 7.749.492; nº
7.259.151; e nº 6.156.303; Publicações US nº 2013/0295614; nº 2015/0065562; nº 2014/0364338; nº 2013/0323226; nº 2014/0359799; nº 2013/0059732; nº 2014/0037585; nº 2014/0056854; nº 2013/0296409; nº 2014/0335054; nº 2013/0195801; nº 2012/0070899; nº 2011/0275529; nº 2011/0171262; nº 2009/0215879; nº 2010/0297177; nº 2010/0203083; nº 2009/0317417; nº 2009/0202490; nº 2012/0220492; nº 2006/0292117; e nº 2004/0002159; Publicação Europeia Números 2692731 Al; 2383346 Bl; 2359865 Bl; 2359866 Bl; 2359867 Bl; e 2357010 Bl; 1791858 Bl; 1668143 Bl; 1660678 Bl; 1664314 Bl; 1496944 Bl; 1456383 Bl; 2341068 Bl; 2338900 Bl; 1456419 Bl; 1310571 Bl; 1456383 Bl; 1633772 Bl; e 1135468 Bl; e Publicações PCT nº WO 2014/124282; nº WO 2013/170078; nº WO 2014/160092; nº WO 2014/103957; nº WO 2014/052789; nº WO 2013/174760; nº WO 2013/123503; nº WO 2011/038187; nº WO 2008/124015; e nº WO 2003/054197).
[0057] Com os propósitos da divulgação no presente documento, AAV se refere ao próprio vírus e derivados dos mesmos. Exceto onde indicado em contrário, a terminologia se refere a todos os subtipos ou sorotipos e tanto formas competentes para replicação como recombinantes. O termo "AAV" inclui, sem limitação, AAV tipo 1 (AAV1), AAV tipo 2 (AAV2), AAV tipo 3A (AAV3A), AAV tipo 3B (AAV3B), AAV tipo 4 (AAV4), AAV tipo 5 (AAV5), AAV tipo 6 (AAV6), AAV tipo 7 (AAV7), AAV tipo 8 (AAV8), AAV tipo 9 (AAV9), AAV tipo 10 (AAV 10 ou AAVrh10), AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV caprino, AAV equino, AAV primata, AAV não primata e AAV ovino. "AAV primata" se refere a AAV que infecta primatas, "AAV não primata" se refere a AAV que infecta mamíferos não primatas, "AAV bovino" se refere a AAV que infecta mamíferos bovinos, etc.
[0058] As sequências genômicas de vários serotipos de AAV, bem como as sequências das repetições terminais invertidas (ITR) nativas,
proteínas Rep e subunidades capsidiais, são conhecidas na técnica. Tais sequências podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos, como GenBank. Consultar, por exemplo, Números de acesso ao Genbank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC .001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC 006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC 006261.1 (AAV8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) e AAO88208 (AAVrh10); cujas divulgações estão incorporadas a título de referência no presente documento para ensinar sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de AAV. Consultar também, por exemplo, Srivastava et al., J Virol. 45:555-564, 1983; Chiorini et al., J Virol 71:6823-6833, 1998; Chiorini et al., J Virol 73:1309-1319, 1999; Bantel-Schaal et al., J Virol 73:939-947, 1999; Xiao et al., J Virol 73:3994-4003, 1999; Muramatsu et al., Virology 221:208- 217, 1996; Shade et al., J Virol 58:921-936, 1986; Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:11854-11859, 2002; Publicações PCT nº WO 00/28061, nº WO 99/61601 e nº WO 98/11244; e Patente US nº
6.156.303.
[0059] Os capsídeos de vírus podem ser misturados e combinados com outros componentes de vetor para formar um vetor viral de pseudotipo híbrido, por exemplo, as ITRs e o capsídeo do vetor viral podem ser provenientes de sorotipos de AAV diferentes. Em um aspecto, as ITRs podem ser provenientes de um sorotipo AAV2 enquanto o capsídeo é proveniente de, por exemplo, um sorotipo AAV8, AAV9, AAV2 ou AAV5. Além disso, o versado na técnica reconhecerá que o capsídeo de vetor pode também ser um capsídeo de mosaico (por exemplo, um capsídeo composto por uma mistura de proteínas capsidiais de sorotipos diferentes), ou ainda um capsídeo quimérico (por exemplo, uma proteína capsidial contendo uma sequência de proteínas estranha ou não relacionada para gerar marcadores e/ou alterar o tropismo de tecido). É contemplado que o vetor viral da invenção pode compreender um capsídeo AAV8 (por exemplo, SEQ ID NOs:24, 25 e 26, codificado, por exemplo, pela SEQ ID NO:23). É também contemplado que o vetor viral da invenção pode compreender um capsídeo AAV9 (por exemplo, SEQ ID NOs:28, 29 e 30, codificado, por exemplo, pela SEQ ID NO:27). É também contemplado que o vetor viral da invenção pode compreender um capsídeo AAV2 (por exemplo, SEQ ID NOs:32, 33 e 34, codificado, por exemplo, pela SEQ ID NO:31). É adicionalmente contemplado que o vetor viral da invenção pode compreender um capsídeo AAV5 (por exemplo, SEQ ID NOs:36, 37 e 38, codificado, por exemplo, pela SEQ ID NO:35).
[0060] Em um aspecto, o AAV é um vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV).
[0061] Em aspectos específicos adicionais, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, tem um comprimento maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, por exemplo, maior ou cerca de 4,2 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,3 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,4 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,5 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,6 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,7 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,8 kb e menor ou cerca de 4,9 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,8 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,7 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,6 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,5 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,4 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,3 kb, maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,2 kb, maior ou cerca de 4,2 kb e menor ou cerca de 4,8 kb, maior ou cerca de 4,3 kb e menor ou cerca de 4,7 kb,
maior ou cerca de 4,4 kb e menor ou cerca de 4,6 kb, cerca de 4,1 kb, cerca de 4,2 kb, cerca de 4,3 kb, cerca de 4,4 kb, cerca de 4,5 kb, cerca de 4,6 kb, cerca de 4,7 kb, cerca de 4,8 kb ou cerca de 4,9 kb.
[0062] Em certos aspectos, a invenção se refere a um genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, que compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’, (ii) um promotor, (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, (iv) uma sequência de sinais de poliadenilação (poliA) e (v) uma ITR 3’. Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’, (ii) um promotor, (iii) um íntron, (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, (v) uma sequência de sinais de poliA e (vi) uma ITR 3’. Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’, (ii) um promotor, (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, (iv) um elemento regulador, (v) uma sequência de sinais de poliA e (vi) uma ITR 3’. Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’, (ii) um promotor, (iii) um íntron, (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, (v) um elemento regulador, (vi) uma sequência de sinais de poliA e (vii) uma ITR 3’. Os elementos do vetor podem ter sequências com mais que ou cerca de de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as sequências descritas na Tabela 2. Tabela 2. Sequências de nucleotídeos e aminoácidos de elementos de vetor viral
ELEMENTO IDENTIFICADOR DE SEQUÊNCIA (SEQ ID NO:)E
SEQUÊNCIA ITR 5' 1
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAA GCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAG TGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCC
ATCACTAGGGGTTCCT promotor de CMV 2
TGTTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTAT GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTC AATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC GTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTAC GTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGT AACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGT GTACGGTGGGAGGTCTATATAGCAGAGCTCTCTGGCTAAC
TAGAGAACCACTGCTTACTGGCTTAG promotor CBA 3
CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATG TTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA ATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTA CATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACG TCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTA CATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACT CGAGGCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCC TCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTT GTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGC GCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGG GGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCG GCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGC GGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
GGAG promotor CAG 4
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCA ACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCC CATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGG GTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATC AAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAA TGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATG ACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATT AGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTT CTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCA ATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATG GGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGC GGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGA GGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAA GTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTA TAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGT TGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGC CGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAG GTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAAT TAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCT GCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTG CGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTG TGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGC GGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGC GCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCG GTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAG GCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGG GGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGC ACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGG GTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGC CGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCG GGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGG GGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTG TCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTA ATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAAT CTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCC CCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGC AGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCC GCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTG TCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCA GGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCT AGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCT
ACAG Promotor de 5 ProC2 TCAAGCCTCCTACCGCCTTTGTTATGCAAACATATCAAACG
CCCTCCTTTGTTATGCAAAAGGGCTGGAACGGGGCCTTTG TTATGCAAATCGCCCTCCCCGATCCCTTTGTTATGCAAATT TGACGAATTCCCACCTTTGTTATGCAAACAAATCTCCTACC CTCCTTTGTTATGCAAAGTGAGAGGGGCTGCACCTTTGTT ATGCAAAATGCGGCCCCTGAGACCTTTGTTATGCAAAAAC CATGTACGCTTGCCTTTGTTATGCAAACCGCCTGTTGCTT GGCCTTTGTTATGCAAAGCCACGCGATTGGCGCCTTTGTT ATGCAAAGCTCGGTTATGTACACCTTTGTTATGCAAAGCTA CTTTAAACTTGCCTTTGTTATGCAAATCACGACCTGACCGT CCTTTGTTATGCAAAAACGGTTGAAATAGTCCTTTGTTATG CAAAATGATATTGAATAGTCCTTTGTTATGCAAAAATTTAG ATGCCGACCCTTTGTTATGCAAAGGAATGGGCGTGCTGCC TTTGTTATGCAAATTTTCGCTGCGACAGCCTTTGTTATGCA AACATGCTCGCCACTCACCTTTGTTATGCAAAGGTCTAAC AATGACCCCTTTGTTATGCAAACTACGTGGAATAGATCCTT TGTTATGCAAACCCCGAGTTTTTGAACCTTTGTTATGCAAA ATCAGTAACTTCATTCCTTTGTTATGCAAAATGTGACTTAA CCTCCCTTTGTTATGCAAAGCTCGAGATCTGCGATCTGCA TCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCG CCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTC CGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCC GAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGA
GGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA Promotor de 6 VMD2 TACGTAATTCTGTCATTTTACTAGGGTGATGAAATTCCCAA
GCAACACCATCCTTTTCAGATAAGGGCACTGAGGCTGAGA GAGGAGCTGAAACCTACCCGGCGTCACCACACACAGGTG GCAAGGCTGGGACCAGAAACCAGGACTGTTGACTGCAGC CCGGTATTCATTCTTTCCATAGCCCACAGGGCTGTCAAAG ACCCCAGGGCCTAGTCAGAGGCTCCTCCTTCCTGGAGAG TTCCTGGCACAGAAGTTGAAGCTCAGCACAGCCCCCTAAC CCCCAACTCTCTCTGCAAGGCCTCAGGGGTCAGAACACT GGTGGAGCAGATCCTTTAGCCTCTGGATTTTAGGGCCATG GTAGAGGGGGTGTTGCCCTAAATTCCAGCCCTGGTCTCA GCCCAACACCCTCCAAGAAGAAATTAGAGGGGCCATGGC CAGGCTGTGCTAGCCGTTGCTTCTGAGCAGATTACAAGAA GGGACTAAGACAAGGACTCCTTTGTGGAGGTCCTGGCTTA GGGAGTCAAGTGACGGCGGCTCAGCACTCACGTGGGCA GTGCCAGCCTCTAAGAGTGGGCAGGGGCACTGGCCACAG
AGTCCCAGGGAGTCCCACCAGCCTAGTCGCCAGACC Promotor de 7 CYP4V2 CATTACTTTACACACTCCGTTCTGCAACTTGTTTTGTTCAC
TTGCTATTTCACGTCAGCCCATGCAGATGACTTAAAACAAA TTCAAATGGAGAAAAGCCTTAGGCATGTTTTTCTCTGCACT AAAGAGGCCCTGCAGGTGGCTGTGGCCAACTTATGCAGT GGCTTCGAGTGAACGAACGTAATTAGTAATTAAGCAAAGC GGGCATCCAGGACATTCAGTTTCATCTTCCTGGCACTTTA GTGTTTAGGAAGGGCCTGGCCTCTCGGGGAGCGACACTC CTCGCCCGGCCACTTTGTAAGAAGCATCGAGCGTGGAAA AGGGGCTGGGGTCAGCACTGGGGCCCTCTGCCGGGAAG AGAGACTGGCGGCCAGCACACGCGTCTCCCCAGGCTGAA ATGGGGCACCCTCTCGCGGCCCTTCCCTCCCTTCCCGGG CTGGGTGGCAGGTCTTGGCTCTTCTGCGAGTACCCCGCG GCTGCGGTCTCCCGGCACCCGCTGAGCAGCCTCGCCCG CCTTCCTCTCCCACCCGCCCCTGCGTGCTCTCCGGGGCT CCGGCTTCCTCGGTCTGGTGCCTGGTGCGTATTTTGGAAA ATACCTGGCTCATAACCACCTCATTGAGCTCCCAGTGTCC CAGTGGGCCAGCGGACACACACGGGTAGCTGACTTCCCT AACGTGTCCCCAAAGCCTCCCTGGATTACAGCGCCCGCT GCTCCATGTGACCCCGCGGGAGCCAGGACGCGCCCCGC CTCCCGGGGCTGCAAGTTGCGCAGGGAGCGAGCGATGC GCAGCAGAGCTGGGCTCCGAGCCGGATGCGCCTTCCTTT CCTCTCCAGAGCAGGCTGCCCGCCCGCGGAATCCCGCAC GTAGAGCAACCTCGCAGCACCCTCAGAACAGCCCCGCTG GGGCGCGCCGGGCTGCCGCGGTGACCTTTCCGACGCCC CTGACCCCGCATCCGGAGGCGGCCGGAAGTGTCGCCGG
CCTCCTCCCGGCGCAGCCTCC Promotor de 8 RPE65 CGCGTTACGTAATATTTATTGAAGTTTAATATTGTGTTTGT
GATACAGAAGTATTTGCTTTAATTCTAAATAAAAATTTTATG CTTTTATTGCTGGTTTAAGAAGATTTGGATTATCCTTGTAC TTTGAGGAGAAGTTTCTTATTTGAAATATTTTGGAAACAGG TCTTTTAATGTGGAAAGATAGATATTAATCTCCTCTTCTATT ACTCTCCAAGATCCAACAAAAGTGATTATACCCCCCAAAAT ATGATGGTAGTATCTTATACTACCATCATTTTATAGGCATA GGGCTCTTAGCTGCAAATAATGGAACTAACTCTAATAAAG CAGAACGCAAATATTGTAAATATTAGAGAGCTAACAATCTC TGGGATGGCTAAAGGATGGAGCTTGGAGGCTACCCAGCC AGTAACAATATTCCGGGCTCCACTGTTGAATGGAGACACT ACAACTGCCTTGGATGGGCAGAGATATTATGGATGCTAAG CCCCAGGTGCTACCATTAGGACTTCTACCACTGTCCCTAA CGGGTGGAGCCCATCACATGCCTATGCCCTCACTGTAAG GAAATGAAGCTACTGTTGTATATCTTGGGAAGCACTTGGA TTAATTGTTATACAGTTTTGTTGAAGAAGACCCCTAGGGTA AGTAGCCATAACTGCACACTAAATTTAAAATTGTTAATGAG TTTCTCAAAAAAAATGTTAAGGTTGTTAGCTGGTATAGTAT ATATCTTGCCTGTTTTCCAAGGACTTCTTTGGGCAGTACCT TGTCTGTGCTGGCAAGCAACTGAGACTTAATGAAAGAGTA TTGGAGATATGAATGAATTGATGCTGTATACTCTCAGAGTG CCAAACATATACCAATGGACAAGAAGGTGAGGCAGAGAG CAGACAGGCATTAGTGACAAGCAAAGATATGCAGAATTTC ATTCTCAGCAAATCAAAAGTCCTCAACCTGGTTGGAAGAA TATTGGCACTGAATGGTATCAATAAGGTTGCTAGAGAGGG TTAGAGGTGCACAATGTGCTTCCATAACATTTTATACTTCT CCAATCTTAGCACTAATCAAACATGGTTGAATACTTTGTTT ACTATAACTCTTACAGAGTTATAAGATCTGTGAAGACAGG GACAGGGACAATACCCATCTCTGTCTGGTTCATAGGTGGT ATGTAATAGATATTTTTAAAAATAAGTGAGTTAATGAATGA GGGTGAGAATGAAGGCACAGAGGTATTAGGGGGAGGTGG GCCCCAGAGAATGGTGCCAAGGTCCAGTGGGGTGACTGG GATCAGCTCAGGCCTGACGCTGGCCACTCCCACCTAGCT CCTTTCTTTCTAATCTGTTCTCATTCTCCTTGGGAAGGATT GAGGTCTCTGGAAAACAGCCAAACAACTGTTATGGGAACA GCAAGCCCAAATAAAGCCAAGCATCAGGGGGATCTGAGA GCTGAAAGCAACTTCTGTTCCCCCTCCCTCAGCTGAAGGG GTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGG ATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCT
TCTTCATTCTGCAGTTGGTG Íntron de 9 hormônio do TTCGAACAGGTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAA crescimento TGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGAC humano (hGH) GGGGGCACTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGTGA
GTATCGCCATGTAAGCCCAGTATTTGGCCAATCTCAGAAA GCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAAC AGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCC
GGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAGGTT Íntron de Vírus 10 Símio 40 (SV40) AACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTT
TGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAA TCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAG GCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGA ATTGTACCCGCCCCGGGATCC
Íntron de beta 11 gobina humanA CGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTC
CCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTA TAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTT GTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCA GGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATT CTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGC AATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACT GATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCA GCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGG ATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTT CATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTG CTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGG
GAT Sequência de 12 Kozak GCCACC CYP4V2 de Homo 13 sapiens ATGGCGGGGCTCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAAGCT CDS tipo GCTGCTGTGGGGCGCGGCGAGTGCCCTTTCCCTGGCCG selvagem GCGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCGA NM_207352.4 GCTACGCGCGGAAATGGCAGCAGATGCGGCCCATCCCCA
CGGTGGCCCGCGCCTACCCACTGGTGGGCCACGCGCTG CTGATGAAGCCGGACGGGCGAGAATTTTTTCAGCAGATCA TTGAGTACACAGAGGAATACCGCCACATGCCGCTGCTGAA GCTCTGGGTCGGGCCAGTGCCCATGGTGGCCCTTTATAA TGCAGAAAATGTGGAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAA TTGACAAATCCTCTATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTT GGCCTAGGACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGCT CCAGGAGAAAGATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATT CTGGAAGATTTCTTAGATATCATGAATGAACAAGCAAATAT ATTGGTTAAGAAACTTGAAAAACACATTAACCAAGAAGCAT TTAACTGCTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGATATCA TCTGTGAAACAGCTATGGGGAAGAATATTGGTGCTCAAAG TAATGATGATTCCGAGTATGTCCGTGCAGTTTATAGAATGA GTGAGATGATATTTCGAAGAATAAAGATGCCCTGGCTTTG GCTTGATCTCTGGTACCTTATGTTTAAAGAAGGATGGGAA CACAAAAAGAGCCTTCAGATCCTACATACTTTTACCAACAG TGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAA GACTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAA AATAAACGCAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGAC TGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGA GAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGGCACGATACAA CTGCAGCTGCAATAAACTGGTCCTTATACCTGTTGGGTTC TAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGATCATGAATTGGAT GACGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAA GACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGG AGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGT AGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAGTTC TAAAAGGCACTGAAGCCGTCATCATTCCCTATGCATTGCA CAGAGATCCGAGATACTTCCCCAACCCCGAGGAGTTCCA GCCTGAGCGGTTCTTCCCCGAGAATGCACAAGGGCGCCA TCCATATGCCTACGTGCCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAAC TGTATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGACCA TTCTTTCGTGCATCCTGAGGCACTTTTGGATAGAATCCAAC CAGAAAAGAGAAGAGCTTGGTCTAGAAGGACAGTTGATTC TTCGTCCAAGTAATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGAG
AAATGCAGATGAACGCTAA Sequência 14 CYP4V2 ATGGCCGGACTGTGGCTGGGACTGGTCTGGCAGAAGTTA otimizada por TTACTGTGGGGAGCTGCCTCCGCTCTGTCTTTAGCTGGAG códonS CTTCTTTAGTGCTGTCTTTACTGCAGAGGGTCGCCTCCTA
TGCTAGGAAGTGGCAGCAGATGAGGCCTATTCCTACCGT GGCCAGAGCCTATCCTTTAGTGGGCCACGCTCTGCTGAT GAAACCCGACGGAAGGGAGTTCTTCCAGCAGATCATCGA GTACACCGAAGAGTACAGACACATGCCTTTACTGAAACTG TGGGTGGGACCCGTTCCTATGGTGGCTTTATACAATGCCG AGAATGTGGAGGTGATTTTAACCAGCAGCAAGCAGATCGA CAAGTCCAGCATGTATAAGTTTTTAGAGCCTTGGCTCGGT TTAGGACTGCTGACCTCCACTGGTAATAAGTGGAGGTCTC GTAGGAAAATGCTGACCCCCACCTTTCACTTCACCATTTTA GAGGACTTTTTAGATATCATGAACGAGCAAGCTAACATTTT AGTGAAGAAGCTCGAAAAGCACATTAACCAAGAAGCTTTC AACTGTTTTTTCTACATCACTTTATGCGCCCTCGATATCAT CTGCGAGACAGCCATGGGCAAGAACATTGGCGCTCAGAG CAACGACGATTCCGAGTACGTGAGGGCTGTCTACAGAAT GAGCGAGATGATCTTCAGAAGAATCAAGATGCCTTGGCTG TGGCTGGACCTCTGGTATTTAATGTTTAAGGAAGGCTGGG AGCATAAGAAGTCTTTACAGATTTTACATACATTTACCAAC AGCGTGATCGCCGAGAGGGCCAATGAAATGAACGCCAAC GAGGATTGTCGTGGCGACGGAAGAGGCTCCGCTCCTTCC AAGAACAAGAGGAGAGCCTTTTTAGATCTCTTATTATCCGT GACAGACGATGAGGGCAATAGGCTGAGCCACGAGGACAT CAGAGAAGAGGTGGACACCTTCATGTTCGAGGGACACGA CACAACCGCCGCCGCCATCAATTGGTCTTTATATTTACTC GGCAGCAACCCCGAGGTGCAAAAAAAGGTCGACCACGAG CTCGACGACGTGTTCGGCAAGAGCGATCGTCCCGCCACA GTGGAAGATTTAAAGAAGCTGAGGTATCTCGAGTGCGTGA TCAAAGAGACTTTAAGACTGTTCCCCAGCGTGCCTCTGTT TGCTCGTTCCGTGTCCGAAGACTGCGAGGTGGCTGGATA TCGTGTCCTCAAGGGCACCGAGGCCGTGATCATTCCCTA CGCCCTCCATCGTGATCCCAGATACTTCCCCAATCCCGAG GAGTTCCAGCCCGAAAGGTTCTTCCCCGAAAACGCTCAAG GCAGACACCCTTACGCTTACGTGCCTTTCTCCGCCGGCC CTCGTAACTGCATTGGCCAGAAATTCGCCGTCATGGAGGA AAAGACCATTTTATCTTGTATTTTAAGGCACTTCTGGATCG AAAGCAATCAGAAAAGGGAGGAACTCGGTTTAGAAGGACA GCTGATTTTAAGACCCAGCAACGGCATTTGGATCAAGCTG
AAGAGGAGGAACGCCGACGAGAGGTGA Produto de Gene 15 CYP4V2 DE MAGLWLGLVWQKLLLWGAASALSLAGASLVLSLLQRVASYA
HOMO SAPIENS RKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALLMKPDGREFFQQIIEYTEE NP_997235.3 YRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAENVEVILTSSKQIDKSSMYK
FLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDIMN EQANILVKKLEKHINQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNIGA QSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLWYLMFKEG WEHKKSLQILHTFTNSVIAERANEMNANEDCRGDGRGSAPS KNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGHDTT AAAINWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGKSDRPATVEDL KKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKGTE AVIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPERFFPENAQGRHPYAYVPF SAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLE
GQLILRPSNGIWIKLKRRNADER Elemento 16 regulador do vírus TAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGT da hepatite B GGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGA (HPRE) TATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAA
ACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAA GTAAACAGTATCTGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACG GCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACT GGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGA ACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCC TAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACT CATCGGGACTGACAATTCTGTCGTGCTCTCCCGCAAGTAT ACATCGTTTCCAGGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGG ATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCG CTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGG GCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGACCGAC CACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGT GCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCT CTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGGA ACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTC
AGCAATGTCAACTCGA Elemento 17 regulador do vírus TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTA da hepatite da TTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCT marmota (WPRE) GCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGC
TTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCT TTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGT GGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTG GGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTC GCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCC GCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTG GGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGT CCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCT GCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAA TCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCT GCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAG
TCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCA Sequência de 18 sinais de polIA do GATCTGGATGATGACGACAAGTGAGGATCCCTGTGCCTTC Hormônio do TAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCT Crescimento TCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT Bovino (bGH) AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG
TCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAA GGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGG AGAATTCA
Sequência de 19 sinais de polIA do GATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG Vírus Símio 40 CTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACA (SV40) TAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAG
CTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTC ACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTT
GTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT SEQUÊNCIA 20
INTRÔNICA DA GGGCCCCGGTGTTATCTCATTCTTTTTTCTCCTCTGTAAGT SINUCLEÍNA TGACATGTGATGTGGGAACAAAGGGGATAAAGTCATTATT COMO TTGTGCTAAAATCGTAATTGGAGAGGACCTCCTGTTAGCT SEQUÊNCIA DE GGGCTTTCTTCTATTTATTGTGGTGGTTACTGGAGTTCCTT PREENCHIMEN- CTTCTAGTTTTAGGATATATATATATATTTTTTTTTTTTCTTT TO CCCTGAAGATATAATAATATATATACTTCTGAAGATTGAGA TTTTTAAATTAGTTGTATTGAAAACTAGCTAATCAGCAATTT AAGGCTAGCTTGAGACTTATGTCTTGAATTTGTTTTTGTAG GCTCCAAAACCAAGGAGGGAGTGGTGCATGGTGTGGCAA CAGGTAAGCTCCATTGTGCTTATATCCAAAGATGATATTTA AAGTATCTAGTGATTAGTGTGGCCCAGTATTCAAGATTCCT ATGAAATTGTAAAACAATCACTGAGCATTCTAAGAACATAT CAGTCTTATTGAAACTGAATTCTTTATAAAGTATTTTTAAAA AGGTAAATATTGATTATAAATAAAAAATATACTTGCCAAGA ATAATGAGGGCTTTGAATTGATAAGCTATGTTTAATTTATA GTAAGTGGGCATTTAAATATTCTGACCAAAAATGTATTGAC AAACTGCTGACAAAAATAAAATGTGAATATTGCCATAATTT TAAAAAAAGAGTAAAATTTCTGTTGATTACAGTAAAATATTT TGACCTTAAATTATGTTGATTACAATATTCCTTTGATAATTC AGAGTGCATTTCAGGAAACACCCTTGGACAGTCAGTAAAT TGTTTATTGTATTTATCTTTGTATTGTTATGGTATAGCTATT TGTACAAATATTATTGTGCAATTATTACATTTCTGATTATAT TATTCATTTGGCCTAAATTTACCAAGAATTTGAACAAGTCA ATTAGGTTTACAATCAAGAAATATCAAAAATGATGAAAAGG ATGATAATCATCATCAGATGTTGAGGAAGATGACGATGAG AGTGCCAGAAATAGAGAAATCAAAGGAGAACCAAAATTTA ACAAATTAAAAGCCCACAGACTTGCTGTAATTAAGTTTTCT GTTGTAAGTACTCCACGTTTCCTGGCAGATGTGGTGAAGC AAAAGATATAATCAGAAATATAATTTATATGATCGGAAAGC ATTAAACACAATAGTGCCTATACAAATAAAATGTTCCTATC ACTGACTTCTAAAATGGAAATGAGGACAATGATATGGGAA TCTTAATACAGTGTTGTGGATAGGACTAAAAACACAGGAG TCAGATCTTCTTGGTTCAACTTCCTGCTTACTCCTTACCAG CTGTGTGTTTTTTGCAAGGTTCTTCACCTCTATGTGATTTA GCTTCCTCATCTATAAAATAATTCAGTGAATTAATGTACAC AAAACATCTGGAAAACAAAAGCAAACAATATGTATTTTATA AGTGTTACTTATAGTTTTATAGTGAACTTTCTTGTGCAACAT TTTTACAACTAGTGGAGAAAAATATTTCTTTAAATGAATACT TTTGATTTAAAAATCAGAGTGTAAAAATAAAACAGACTCCT TTGAAACTAGTTCTGTTAGAAGTTAATTGTGCACCTTTAAT GGGCTCTGTTGCAATCCAACAGAGAAGTAGTTAAGTAAGT GGACTATGATGGCTTCTAGGGACCTCCTATAAATATGATAT TGTGAAGCATGATTATAATAAGAACTAGATAACAGACAGGT GGAGACTCCACTATCTGAAGAGGGTCAACCTAGATGAATG GTGTTCCATTTAGTAGTTGAGGAAGAACCCATGAGGTTTA GAAAGCAGACAAGCATGTGGCAAGTTCTGGAGTCAGTGG TAAAAATTAAAGAACCCAACTATTACTGTCACCTAATGATC TAATGGAGACTGTGGAGATGGGCTGCATTTTTTTAATCTTC TCCAGAATGCCAAAATGTAAACACATATCTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AGAGAGACTGAAGTTTGTACAATTAGACATTTTATAAAATG TTTTCTGAAGGACAGTGGCTCACAATCTTAAGTTTCTAACA TTGTACAATGTTGGGAGACTTTGTATACTTTATTTTCTCTTT AGCATATTAAGGAATCTGAGATGTCCTACAGTAAAGAAATT TGCATTACATAGTTAAAATCAGGGTTATTCAAACTTTTTGAT TATTGAAACCTTTCTTCATTAGTTACTAGGGTTGAATGAAA CTAGTGTTCCACAGAAAACTATGGGAAATGTTGCTAGGCA GTAAGGACATGGTGATTTCAGCATGTGCAATATTTACAGC GATTGCACCCATGGACCACCCTGGCAGTAGTGAAATAACC AAAAATGCTGTCATAACTAGTATGGCTATGAGAAACACATT
GGG SEQUÊNCIA 21
INTRÔNICA ATTCTCCAGGTTGAGCCAGACCAATTTGATGGTAGATTTA RLBP1 COMO GCAAATAAAAATACAGGACACCCAGTTAAATGTGAATTTCC
SEQUÊNCIA DE GATGAACAGCAAATACTTTTTTAGTATTAAAAAAGTTCACA PREENCHIMEN- TTTAGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCG TO AGGCAGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAG CCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCCACTAAAAATAC CAAAAATTAGCCAGGCGTGCTGGTGGGCACCTGTAGTTC CAGCTACTCAGGAGGCTAAGGCAGGAGAATTGCTTGAAC CTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGCACCAT TGCACTCTAGCCTGGGCGACAAGAACAAAACTCCATCTCA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTTCACATTTAACTGGGCATT CTGTATTTAATTGGTAATCTGAGATGGCAGGGAACAGCAT CAGCATGGTGTGAGGGATAGGCATTTTTTCATTGTGTACA GCTTGTAAATCAGTATTTTTAAAACTCAAAGTTAATGGCTT GGGCATATTTAGAAAAGAGTTGCCGCACGGACTTGAACCC TGTATTCCTAAAATCTAGGATCTTGTTCTGATGGTCTGCAC AACTGGCTGGGGGTGTCCAGCCACTGTCCCTCTTGCCTG GGCTCCCCAGGGCAGTTCTGTCAGCCTCTCCATTTCCATT CCTGTTCCAGCAAAACCCAACTGATAGCACAGCAGCATTT CAGCCTGTCTACCTCTGTGCCCACATACCTGGATGTCTAC CAGCCAGAAAGGTGGCTTAGATTTGGTTCCTGTGGGTGG ATTATGGCCCCCAGAACTTCCCTGTGCTTGCTGGGGGTGT GGAGTGGAAAGAGCAGGAAATGGGGGACCCTCCGATACT CTATGGGGGTCCTCCAAGTCTCTTTGTGCAAGTTAGGGTA ATAATCAATATGGAGCTAAGAAAGAGAAGGGGAACTATGC TTTAGAACAGGACACTGTGCCAGGAGCATTGCAGAAATTA TATGGTTTTCACGACAGTTCTTTTTGGTAGGTACTGTTATT ATCCTCAGTTTGCAGATGAGGAAACTGAGACCCAGAAAGG TTAAATAACTTGCTAGGGTCACACAAGTCATAACTGACAAA GCCTGATTCAAACCCAGGTCTCCCTAACCTTTAAGGTTTCT ATGACGCCAGCTCTCCTAGGGAGTTTGTCTTCAGATGTCT TGGCTCTAGGTGTCAAAAAAAGACTTGGTGTCAGGCAGGC ATAGGTTCAAGTCCCAACTCTGTCACTTACCAACTGTGACT AGGTGATTGAACTGACCATGGAACCTGGTCACATGCAGGA GCAGGATGGTGAAGGGTTCTTGAAGGCACTTAGGCAGGA CATTTAGGCAGGAGAGAAAACCTGGAAACAGAAGAGCTGT CTCCAAAAATACCCACTGGGGAAGCAGGTTGTCATGTGG
GCCATGAATGGGACCTGTTCTGG ITR 3' 22
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGC GCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTC GCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAG
CGAGCGAGCGCGCAG Sequência de 23 Codificação de ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACA Capsídeo AAV8 ACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAAC
CTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGG ACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACC TCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCA ACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCC TACGACCAGCAGCTGCAGGCGGGTGACAATCCGTACCTG CGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTG CAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCA GTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGT CTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAG AGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCC TCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAACAGCCCGCCAGA AAAAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAG TTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGC CCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTGCAGGCGGTG GCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAG TGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATG GCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTG GGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATC TCCAACGGGACATCGGGAGGAGCCACCAACGACAACACC TACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTA ACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCG ACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTC AGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGC AGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCACCAG CACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTGCC GTACGTTCTCGGCTCTGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCC GTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCCCAGTACGGCTA CCTAACACTCAACAACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGCTC CTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTG AGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGG ACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCT TGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTA CTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAAT ACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACA ATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGT TACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAAC AACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACC ATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGC TATGGCAACACACAAAGACGACGAGGAGCGTTTTTTTCCC AGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCA GAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCG AGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGA ATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACG GCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTAC CCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGG GTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTT CCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACA TCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCT GCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACT CTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGG AAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCT GGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATC TACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTAC TCTGAACCCCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTA
ATCTGTAA Sequência de 24 Capsídeo AAV8 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQD (VP1) DGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQ
QLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQA KKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGK KGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPN TMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVI TTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPW GYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQV KEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCL PPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQML RTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYL SRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYR QQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMA THKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIK TTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQ NRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIK NTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENS KRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTR
NL Sequência de 25 Capsídeo AAV8 MAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQT (VP2) GDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNN
EGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNH LYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPR DWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNL TSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYL TLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVP FHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLG FSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNF AWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIF GKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQ QQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTD GNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLN SFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTS
VDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL Sequência de 26 Capsídeo AAV8 MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVIT (VP3) TSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWG
YFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVK EVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLP PFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLR TGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLS RTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQ QRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMAT HKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKT TNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQN RDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKN TPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSK RWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRN
L Sequência de 27 Codificação de ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACA Capsídeo AAV9 ACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACC
TGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGAC AACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTG GACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAAC GCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTA CGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAA GTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAA AGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGT CTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTG GTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGG CCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCG GGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGA CTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAG ACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAG GTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCAC CAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTA GTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGG GGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCT GCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAAC AGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCG GCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATT CCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATC AACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCA AGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAA TGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTC CAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGC TCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAG CGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCT TAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTAC TGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTA ACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTT CCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACT AATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAA AGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAA ATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGG AAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGT GTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTG CTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAA TAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAA GAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAAT TTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGC GGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACT ACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCC ACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGC TGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGC AGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCA AAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCT GATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGAT CCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACG GCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGT ATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGC TGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCC AGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTT GCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCA
TTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA Sequência de 28 Capsídeo AAV9 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQ (VP1) DNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYD
QQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQ AKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKS GAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTM ASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITT STRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGY FDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKE VTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPP FPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRT GNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSK TINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRV STTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKE GEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNP VATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDR DVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNT PVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR
WNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL Sequência de 29 Capsídeo AAV9 TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTG (VP2) DTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEG
ADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLY KQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRD WQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLT STVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLT LNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPF HSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFS VAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWP GASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGK QGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQS AQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTD GNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLN SFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNN VEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
Sequência de 30 Capsídeo AAV9 MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVIT (VP3) TSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWG
YFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVK EVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLP PFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLR TGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLS KTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQR VSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHK EGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTN PVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQD RDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKN TPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSK RWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRN
L Sequência de 31 Codificação de ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACA Capsídeo AAV2 CTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACC
TGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGA CGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCT CGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAA CGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCT ACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCA AGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTA AAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAG TCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCT GGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAG GCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTC GGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAA GATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACC TGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTC TGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGC ACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGG TAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATG GGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCC CTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCA GCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTA CAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCAC TGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACA ACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCT CTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGT ACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGG TGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGG CTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGA CGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAAC AACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCC TGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAA CTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACA GCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGA ATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAAC AAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAG TTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTA GGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAG TATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTC GTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGA CTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAA GGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTC ATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACA TTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGAC AACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCT ACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCA GATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGC AGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAA AGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCT CATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATT CTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCA CCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTA CTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCT GCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCA GTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTA CTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCAT
TGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA Sequência de 32 Capsídeo AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKD (VP1) DSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDR
QLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAK KRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAG QQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTM ATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITT STRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFD FNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVT QNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFP ADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRT NTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRV SKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKD DEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPV ATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRD VYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPV PANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWN
PEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL Sequência de 33 Capsídeo AAV2 MAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTG (VP2) DADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEG
ADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLY KQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTV QVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLN NGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHS SYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQ AGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTG ATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQ GSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGN RQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGH FHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFI TQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVD
FTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL Sequência de 34 Capsídeo AAV2 MATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVIT (VP3) TSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYF
DFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEV TQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPF PADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRT GNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSR TNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQR VSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHK DDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNP VATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDR DVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNT PVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR
WNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL Sequência de 35 Codificação de ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGT Capsídeo AAV5 TGGTGAAGGTCTTCGCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGG
CCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGCATCAAGATCAA GCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGAC CCGGAAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGG CAGACGAGGTCGCGCGAGAGCACGACATCTCGTACAACG AGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAAGTACA ACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACG ACACATCCTTCGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCA GGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACCTTTTGGCCTGGTTGAA GAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGAC GACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAG GACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGA CCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCA GCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGT GGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGA GTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACG TGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACC TGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAG ATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC TACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTA ACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAA GACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCT CAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACG GTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCT CCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGC CCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCG GCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTT ACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCG AGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAA GATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAAC TTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTC AGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGT ACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGT CCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACAC CTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCA GGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTG TCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGG GCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGA CCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGA ACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCA CCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCA GCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTAC AACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCC ACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAA ATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTAC CTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGG GCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGA CTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGC CTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCG TCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCA CCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCA AGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAA CGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGG GGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTT
ACCCGACCCCTTTAA Sequência de 36 Capsídeo AAV5 MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQ (VP1) ARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQ
LEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKK RVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPST SSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDN NQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWS PRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQY GYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYN FEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQ FNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVS AFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMI FNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQM ATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKI PETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSD VPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNY
NDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL Sequência de 37 Capsídeo AAV5 TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQ (VP2) LQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGD
WHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDG SNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWG FRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDY QLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPT ERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQ NLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYK NWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGAS YQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATY LEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATG TYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAM GGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQ VTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDST
GEYRTTRPIGTRYLTRPL Sequência de 38 Capsídeo AAV5 MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVV (VP3) TKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPW
GYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCL PAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSK MLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLY RFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGW NLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNL QGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQP VNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWM ERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLI KNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENS KRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLT
RPL CDS de CYP4V2 39 de Macaca ATGGCGGGCATCTGGCTGGGGCTCGTGTGGCAGAAGCTG mulatta CTGCTGTGGGGCGCGGCGAGTGCCGTGTCCCTGGCCGG (MACACO CGCCAGTCTGGTCCTGAGCCTGCTGCAGAGGGTGGCGAG RHESUS) CTACGTGAGGAAATGGCAGCAGATGCGGCCCATCCCCAC NM_001193838.1 GGTGGCCCGCGCCTACCCACTGGTGGGCCACGCGCTGC
TGATGAAGCGGGACGGGCGAGAATTTTTTCAGCAGATCAT TGAGTACACAGAGGAATACCGCCACATGCCACTCCTGAAG CTCTGGGTCGGGCCGGTGCCCATGGTGGCCCTTTATAAT GCAGAAAATGTGGAGGTAATTTTAACTAGTTCAAAGCAAAT TGACAAATCCTCTATGTACAAGTTTTTAGAACCATGGCTTG GCCTAGGACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGCTC CAGGAGAAAGATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACCATTC TGGAAGATTTCTTAGATATCATGAATGAACAAGCAAATATA TTGGTTAAGAAACTTGAAAAACATGTTAACCAAGAAGCATT TAACTGCTTTGTTTACATCACTCTTTGTGCCTTAGATATCAT CTGTGAAACAGCTATGGGGAAGAATATTGGTGCTCAAAGT AACGATGATTCCGAGTATGTCCGTGCAGTTTATAGAATGA GTGAGATGATATTTCGAAGAATAAAGATGCCGTGGCTTTG GCTTGACCTCTGGTACCTTATGTTTAAAGAGGGATGGGAA CACAAAAAGAGCCTTAAGATCCTACATGCTTTTACCAACAA TGTTATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGTGGATGAA GACTGTAGAGGTGATGGCAGGGACTCCGCCCCCTCCAAA AATAAACGCAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGAC TGACGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGA GAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGCCACGACACAA CTGCAGCTGCAATGAACTGGTCCTTATACCTGTTGGGGTC TAACCCAGAAGTCCAGAAAAAAGTGGACCATGAACTGGAT GACGTGTTTGGGAGGTCTGACCGTCCCGCTACTGTAGAA GACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGG AGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGC AGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGCAGGTTACAGAGTTC TGAAAGGCACTGAAGCCGTCATCATTCCCTATGCATTGCA TAGAGATCCAAGATACTTCCCCAACCCTGAGGAGTTCCGG CCTGAGCGGTTCTTCCCCGAGAATGCACAAGGGCGCCAT CCATATGCCTACGTGCCCTTCTCTGCTGGCCCCAGGAACT GTATAGGTCAAAAGTTTGCTGTGATGGAAGAAAAGACCAT TCTTTCGTGCATCCTAAGGCACTTTTGGATAGAATCCAACC AGAAAAGAGAAGAACTTGGTCTAGAAGGACAGTTGATTCT TCGTCCAACTAATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGAGA
AATGCAGATGAACCCTAA Produto de Gene 40 CYP4V2 de MAGIWLGLVWQKLLLWGAASAVSLAGASLVLSLLQRVASYV Macaca mulatta RKWQQMRPIPTVARAYPLVGHALLMKRDGREFFQQIIEYTEE (MACACO YRHMPLLKLWVGPVPMVALYNAENVEVILTSSKQIDKSSMYK RHESUS) FLEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDIMN NP_001180767.1 EQANILVKKLEKHVNQEAFNCFVYITLCALDIICETAMGKNIGA
QSNDDSEYVRAVYRMSEMIFRRIKMPWLWLDLWYLMFKEG WEHKKSLKILHAFTNNVIAERANEMNVDEDCRGDGRDSAPS KNKRRAFLDLLLSVTDDEGNRLSHEDIREEVDTFMFEGHDTT AAAMNWSLYLLGSNPEVQKKVDHELDDVFGRSDRPATVEDL KKLRYLECVIKETLRLFPSVPLFARSVSEDCEVAGYRVLKGTE AVIIPYALHRDPRYFPNPEEFRPERFFPENAQGRHPYAYVPF SAGPRNCIGQKFAVMEEKTILSCILRHFWIESNQKREELGLE
GQLILRPTNGIWIKLKRRNADEP CDS DE CYP4V2 41 de Bos taurus ATGCTGGCGCCGTGGTTGCTGAGCGTCGGGCCGAAGCTG NM_001034373.2 CTGCTCTGGAGCGGGCTGTGCGCCGTCTCCCTGGCAGGC
GCCACCCTCACCCTGAACCTCCTGAAGATGGTGGCGAGC TATGCGCGGAAATGGCGTCAGATGCGTCCCGTCCCGACC ATTGGGGACCCCTACCCCTTGGTGGGACACGCGCTGATG ATGAAGCCCGATGCAAGAGATTTTTTTCAGCAGATAATTGA TTTCACTGAAGAATGCCGACACCTGCCACTGCTGAAACTC TGGCTCGGGCCTGTGCCTCTCGTGGCCCTTTATAACGCA GAAACTGTGGAAGTAATTTTAAGCAGTTCAAAGCACATTGA AAAATCCTATATGTACAAGTTCTTAGAACCGTGGCTTGGAC TAGGACTTCTTACAAGTACTGGAAACAAATGGCGATCTAG GAGAAAAATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACAATTCTGG AGGATTTCTTAGATGTCATGAATGAACAAGCAAATATATTG GTTACTAAGCTTGAAAAGCATGTTAACCAAGAAGCGTTTAA CTGCTTTTTTTACGTCACTCTTTGTACCTTAGATATAATCTG TGAAACAGCTATGGGAAAGAACATTGGTGCTCAAAGAAAT GATGATTCCGAGTATGTTCGAGCCGTTTATAGGATGAGTG ATTCGATACATCAAAGAATGAAGATGCCCTGGCTCTGGCT TGACCTTATATTCTATATGTTTAAAAATGGACGAGAACACA GAAGGAGCCTAAAGATTGTACATGATTTTACCAACAATGTC ATCACTGAACGGGCCAATGAAATGAAGAGACATGAAGAAG GTACGAGTAACGACAAGGAGAAGGACTTTCCTCCACGCAA AACTAAATGCAGGGCTTTTCTTGACTTGCTTTTAAATGTGA CTGATGACCAAGGGAACAAGCTGAGTCATGAAGATATAAG AGAAGAAGTCGACACCTTTATGTTTGAGGGCCATGATACA ACTGCAGCTGCAATAAACTGGTCCTTGTATCTGTTGGGTT GGTATCCAGAAGTCCAGCAGAGAGTGGACACTGAGCTGG AAGAAGTGTTTGGGAAGTCTGACCGTCCTGTTACCCTAGA AGACCTGAAGAAACTTAAATATCTGGACTGTGTTATTAAGG AGAGCCTTCGCCTTTTCCCGTCTGTTCCTTTCTTTGCCCGT AATCTTACCGAAGACTGTGAAGTTGCGGGTCACAAAATCG TGCAAGGCTGTCAAGTAATCATTGTGCCCTACGCACTGCA TAGAGATCCAAAGTACTTCCCGGATCCTGAGGAATTCAAG CCAGAACGGTTCTTTCCCGAGAATTTGAAAGGACGTCATA CATACGCATATGTGCCCTTCTCTGCAGGCCCCCGAAACTG TATAGGTCAAAAGTTTGCCATAATGGAAGAAAAGACCATTC TTTCCTGCATCCTTAGGCACTTTTGGGTAGAATCCAACCAA AAAAGAGAAGAACTTGGTCTAGCAGGAGAGCTCATTCTTC GTCCAAGTAACGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGAGAAA
CACAGATGAATCCTAA Produto de Gene 42 de CYP4V2 DE MLAPWLLSVGPKLLLWSGLCAVSLAGATLTLNLLKMVASYAR
BOS TAURUS KWRQMRPVPTIGDPYPLVGHALMMKPDARDFFQQIIDFTEE NP_001029545.1 CRHLPLLKLWLGPVPLVALYNAETVEVILSSSKHIEKSYMYKF
LEPWLGLGLLTSTGNKWRSRRKMLTPTFHFTILEDFLDVMNE QANILVTKLEKHVNQEAFNCFFYVTLCTLDIICETAMGKNIGA QRNDDSEYVRAVYRMSDSIHQRMKMPWLWLDLIFYMFKNG REHRRSLKIVHDFTNNVITERANEMKRHEEGTSNDKEKDFPP RKTKCRAFLDLLLNVTDDQGNKLSHEDIREEVDTFMFEGHDT TAAAINWSLYLLGWYPEVQQRVDTELEEVFGKSDRPVTLED LKKLKYLDCVIKESLRLFPSVPFFARNLTEDCEVAGHKIVQGC QVIIVPYALHRDPKYFPDPEEFKPERFFPENLKGRHTYAYVPF SAGPRNCIGQKFAIMEEKTILSCILRHFWVESNQKREELGLA
GELILRPSNGIWIKLKRRNTDES CDS de CYP4V3 43
DE RATTUS ATGTTGTGGCTGTGGTTAGGGCTCAGCGGGCAGAAGCTA
NORVEGICUS TTGCTTTGGGGCGCAGCGAGCGCGGTCTCCGTGGCCGG NM_001135600.1 CGCCACTGTCTTGCTCAACATCCTGCAGATGTTGGTAAGC
TATGCACGAAAGTGGCAGCAGATGCGGCCAATCCCGTCG GTGGCTCGCGCTTACCCCTTGGTGGGACATGCGCTGTTT ATGAAGCCCAACAACACAGAATTTTTTCAGCAGATAATTCA GTACACAGAAGAATTCCGACACCTGCCCATCATTAAACTC TGGATTGGACCAGTGCCCCTGGTGGCACTTTATAAGGCA GAGAATGTGGAGGTGATTTTGACCAGTTCGAAGCAAATTG ATAAATCCTTTATGTACAAGTTCCTACAGCCATGGCTGGG ACTAGGACTTCTTACAAGTACTGGGAGCAAATGGCGTGCC AGGAGGAAGATGTTAACACCCAGTTTCCATTTTACAATTCT GGAGGATTTCTTAGATGTCATGAATGAGCAAGCAAATATAT TGGTTAACAAGCTTGAAAAACATGTCAATCAAGAGGCCTTT AACTGCTTTTTCCCCATCACTCTTTGTGCTCTGGATATAAT CTGTGAAACGGCTATGGGGAAGAACATTGGAGCTCAAAGT AATGGTGATTCTGAGTATGTCCGTACAGTGTATAGGATGA GCGATATGATATACAGAAGAATGAAGATGCCCTGGTTTTG GTTTGACCTTTGGTACCTTATGTTTAAAGAAGGAAGGGAC CACAAAAAGGGACTAAAGAGTCTACATACTTTTACCAACAA TGTCATTGCTGAACGGGTTAATGCAAGGAAGGCAGAGCAA GACTGCATAGGTGCTGGGAGGGGTCCTCTCCCCTCGAAA ACTAAGCGCAAGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTGAGTGTGA CTGATGAGGAAGGAAACAAATTAAGCCATGAAGACATCCG AGAGGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGTCACGATACA ACTGCTGCTGCCATAAACTGGTCCTTATACCTCCTGGGCT CTAATCCAGAAGTCCAGAGGAAAGTGGACAAGGAGCTGG ATGATGTGTTTGGAAGATCCCATCGCCCTGTCACCTTGGA AGACCTGAAGAAACTTAAATATCTGGATTGTGTCATTAAGG AGACCCTCCGTGTTTTCCCATCTGTCCCTTTATTTGCCCG GAGTCTTAGCGAAGACTGTGAAGTGGCGGGTTACAAAATC TCAAAAGGAACGGAAGCAGTCATCATTCCCTATGCACTAC ATCGAGACCCTAGATACTTCCCAGACCCTGAGGAATTCCA GCCAGAGCGGTTCTTTCCTGAAAACTCCCAAGGACGCCA CCCCTATGCCTATGTGCCATTCTCTGCTGGACCTAGAAAC TGCATTGGTCAAAAGTTTGCGGTCATGGAGGAAAAGACCA TTCTTGCCTGTATCCTGAGGGAGTTTTGGATAGAATCCAA CCAGAAGAGAGAAGAACTCGGCCTGGCTGGAGATTTGAT TCTTAGGCCAAATAATGGCATCTGGATCAAGCTGAAGAGG
AGGCATGAAGATGACCCCTAA Rattus norvegicus 44
PRODUTO DE MLWLWLGLSGQKLLLWGAASAVSVAGATVLLNILQMLVSYA GENE CYP4V3 RKWQQMRPIPSVARAYPLVGHALFMKPNNTEFFQQIIQYTEE NP_001129072.1 FRHLPIIKLWIGPVPLVALYKAENVEVILTSSKQIDKSFMYKFL
QPWLGLGLLTSTGSKWRARRKMLTPSFHFTILEDFLDVMNE QANILVNKLEKHVNQEAFNCFFPITLCALDIICETAMGKNIGAQ SNGDSEYVRTVYRMSDMIYRRMKMPWFWFDLWYLMFKEG RDHKKGLKSLHTFTNNVIAERVNARKAEQDCIGAGRGPLPSK TKRKAFLDLLLSVTDEEGNKLSHEDIREEVDTFMFEGHDTTA AAINWSLYLLGSNPEVQRKVDKELDDVFGRSHRPVTLEDLKK LKYLDCVIKETLRVFPSVPLFARSLSEDCEVAGYKISKGTEAVI IPYALHRDPRYFPDPEEFQPERFFPENSQGRHPYAYVPFSA GPRNCIGQKFAVMEEKTILACILREFWIESNQKREELGLAGDL
ILRPNNGIWIKLKRRHEDDP CDS de CYP4V3 45 de Mus musculus ATGTTGTGGCTGTGGTTAGGGCTCAGTGGGCAGAAACTAT NM_133969.3 TGCTTTGGGGCGCAGCGAGCGCGGTCTCCCTGGCCGGC
GCCACTATCCTGATCAGCATCTTTCCGATGCTGGTAAGCT ACGCGCGGAAATGGCAGCAGATGCGGTCAATCCCGTCGG TGGCCCGCGCCTACCCCTTGGTGGGACACGCGCTTTATA TGAAGCCCAACAACGCAGAATTTTTTCAGCAGCTAATTTAT TACACAGAAGAATTTCGACACCTGCCGATCATTAAACTTTG GATTGGACCCGTGCCCCTGGTGGCACTTTATAAGGCAGA GAATGTGGAGGTGATTTTGACCAGTTCTAAGCAAATTGAT AAATCGTTTTTGTACAAGTTCCTACAGCCATGGCTGGGAC TAGGACTTCTTACAAGTACGGGGAGCAAATGGCGCACCA GGAGGAAGATGCTAACGCCCACTTTCCATTTTACCATTCT GGAGAACTTCTTGGATGTCATGAATGAGCAAGCAAATATA TTGGTTAATAAGCTTGAAAAACACGTCAACCAAGAAGCCTT TAATTGTTTTTTTTACATCACTCTTTGTGCTCTGGATATAAT CTGTGAAACGGCTATGGGGAAGAACATCGGAGCTCAAAG CAATAATGATTCCGAGTATGTCCGTACAGTGTATAGGATG AGTGATATGATATATAGAAGAATGAAGATGCCCTGGCTTT GGTTTGACCTTTGGTACCTTGTGTTTAAAGAAGGACGGGA CCACAAAAGGGGACTCAAATGCCTACATACTTTCACCAAC AATGTCATTGCTGAACGAGTCAAAGAAAGGAAGGCAGAG GAAGACTGGACGGGTGCTGGCAGGGGTCCTATCCCCTCC AAAAATAAGCGCAAGGCTTTCCTTGACTTGCTTTTGAGTGT GACTGATGAGGAAGGAAACAGATTAAGCCAGGAAGACAT CCGAGAGGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGGGTCACGAT ACAACTGCTGCTGCAATCAACTGGTCCTTATACCTATTGG GCACGAATCCAGAAGTCCAGAGGAAAGTGGATCAGGAGC TGGATGAAGTGTTTGGAAGATCCCATCGTCCTGTCACCTT GGAAGACCTGAAGAAACTTAAATATTTGGATTGCGTCATTA AGGAGACTCTCCGAGTTTTCCCATCTGTCCCTTTATTTGCC CGGAGTCTTAGCGAGGACTGTGAAGTGGGCGGTTACAAA GTCACAAAAGGAACGGAAGCAATCATCATTCCCTACGCAC TACACCGAGACCCCAGATACTTCCCAGATCCAGAGGAATT CCGACCAGAGCGGTTCTTTCCTGAAAATTCCCAAGGACGC CATCCCTATGCCTATGTGCCATTTTCTGCTGGACCTCGAA ACTGTATTGGTCAAAAGTTTGCTGTCATGGAGGAGAAGAC CATTCTTGCCTGTATCCTGAGGCAGTTTTGGGTAGAATCC AACCAGAAGAGAGAAGAACTCGGCCTGGCTGGAGATTTG ATTCTTAGGCCAAATAATGGCATCTGGATCAAGCTGAAGA
GGAGACATGAAGATGACCCCTAA Mus musculus 46
PRODUTO DE MLWLWLGLSGQKLLLWGAASAVSLAGATILISIFPMLVSYAR GENE CYP4V3 KWQQMRSIPSVARAYPLVGHALYMKPNNAEFFQQLIYYTEE NP_598730.1 FRHLPIIKLWIGPVPLVALYKAENVEVILTSSKQIDKSFLYKFLQ
PWLGLGLLTSTGSKWRTRRKMLTPTFHFTILENFLDVMNEQ ANILVNKLEKHVNQEAFNCFFYITLCALDIICETAMGKNIGAQS NNDSEYVRTVYRMSDMIYRRMKMPWLWFDLWYLVFKEGRD HKRGLKCLHTFTNNVIAERVKERKAEEDWTGAGRGPIPSKN KRKAFLDLLLSVTDEEGNRLSQEDIREEVDTFMFEGHDTTAA AINWSLYLLGTNPEVQRKVDQELDEVFGRSHRPVTLEDLKKL KYLDCVIKETLRVFPSVPLFARSLSEDCEVGGYKVTKGTEAIII PYALHRDPRYFPDPEEFRPERFFPENSQGRHPYAYVPFSAG PRNCIGQKFAVMEEKTILACILRQFWVESNQKREELGLAGDLI
LRPNNGIWIKLKRRHEDDP Gallus gallus 47 CDS DE CYP4V2 ATGGCAATGGAGATCACGCTAGGATCCATGGAGGGAACA NM_001001879.1 CAGCTGCTGCCCTGGGTGGCTGGAGCCATCACCCTGCTG
CTGACGGTGGTGACTGTACACTTCCTACCCTCTTTGCTGA ACTACTGGTGGTGGTGGTGGGTGATGAAGCCCATCCCAG GCATCCGCCCATGCTACCCCTTTGTGGGAAATGCTCTCCT GTTGGAGCGAAATGGAGAAGGTTTTTTTAAACAGCTACAA CAGTATGCTGATGAGTTCAGGAAAATGCCAATGTTCAAAC TCTGGTTAGGTCCACTGCCTGTCACAGTATTGTTCCATCC TGATAGTGTGGAGGTTATTCTGAGCAGTTCAAAGCATATTA AAAAATCATTCCTGTACACATTTCTGCACCCATGGCTGGG GACTGGACTTTTGACAAGCACTGGAGACAAGTGGCGGTC ACGGAGGAAGATGATAACTCCTACATTCCACTTTGCAATC TTAAATGACTTTCTTGAGGTTATGAATGAACAAGGGGGTG TTTTGTTGGAGAAACTTGAGAAGCATGTTGACAAGGAACC ATTTAATATCTTTACAGACATCACTCTGTGTGCACTTGATA TTATCTGTGAAACTGCAATGGGCAAGAATCTGGGTGCTCA AGACAATAAGGATTCTGAGTATGTTCGTGCTGTCTACAGG ATGAGTGATCTAATCCAACAGCGACAGAAGAGCCCTTGGC TTTGGCATGATCTTATGTATCTTCTGTTCAAGGAAGGAAGA GAGCATGAGCGGAATCTTAAGATTCTGCATGGTTTTACAG ATACGGTAATTGCAGAAAAAGTTGCAGAACTTGAAAACAC CAAGCTAACAAAACACGATACTGACGTGAACACTGAAGAA GAAAGTGGTTCCAAAAAGAGAGAAGCTTTCTTAGACATGC TGCTGAATGCCACAGATGATGAAGGGAAAAAACTCAGCTA CAAGGACATTCGTGAAGAAGTGGATACTTTTATGTTTGAG GGTCATGATACAACAGCAGCTGCTATGAACTGGGTCCTAT ACTTGCTTGGTCATCATCCTGAAGCCCAGAAGAAGGTTCA CCAAGAACTGGATGAGGTGTTTGGCAACACAGAGCGTCC TGTTACAGTGGATGATTTGAAGAAACTTCGATACCTCGAG TGTGTTGTGAAAGAAGCCCTGAGGCTCTTCCCTTCAGTTC CCATGTTCGCCCGTTCCTTGCAAGAGGATTGCTACATTAG TGGATATAAGCTACCAAAAGGCACGAATGTCCTTGTCTTA ACTTATGTGCTGCACAGAGATCCTGAGATCTTCCCTGAGC CAGATGAATTCAGGCCTGAGCGCTTCTTCCCTGAAAATAG CAAAGGAAGGCACCCATATGCTTATGTGCCCTTCTCTGCT GGCCCCAGGAACTGCATTGGCCAACGCTTTGCACAAATG GAAGAGAAAACTCTTCTAGCCCTCATCCTGCGGCGCTTTT GGGTGGACTGTTCTCAAAAGCCAGAAGAGCTTGGTCTGTC AGGAGAACTAATTCTTCGTCCAAATAATGGCATCTGGGTT
CAACTGAAGAGGAGACCAAAAACTGTAACAGAATGA Gallus gallus 48
PRODUTO DE MAMEITLGSMEGTQLLPWVAGAITLLLTVVTVHFLPSLLNYW GENE CYP4V2 WWWWVMKPIPGIRPCYPFVGNALLLERNGEGFFKQLQQYA NP_001001879.1 DEFRKMPMFKLWLGPLPVTVLFHPDSVEVILSSSKHIKKSFLY
TFLHPWLGTGLLTSTGDKWRSRRKMITPTFHFAILNDFLEVM NEQGGVLLEKLEKHVDKEPFNIFTDITLCALDIICETAMGKNL GAQDNKDSEYVRAVYRMSDLIQQRQKSPWLWHDLMYLLFK EGREHERNLKILHGFTDTVIAEKVAELENTKLTKHDTDVNTEE ESGSKKREAFLDMLLNATDDEGKKLSYKDIREEVDTFMFEG HDTTAAAMNWVLYLLGHHPEAQKKVHQELDEVFGNTERPVT VDDLKKLRYLECVVKEALRLFPSVPMFARSLQEDCYISGYKL PKGTNVLVLTYVLHRDPEIFPEPDEFRPERFFPENSKGRHPY AYVPFSAGPRNCIGQRFAQMEEKTLLALILRRFWVDCSQKPE
ELGLSGELILRPNNGIWVQLKRRPKTVTE CDS de CYP4V2 49 de Canis lupus ATGTTAACACCCACTTTCCATTTTACGATTCTGGAAGATTT familiaris CTTAGATGTCATGAATGAACACGCAAATATATTGGTTAATA XM_022404181.1 AGCTTGAAAAACATGTTAACCAAGAAGCATTTAACTGCTTT
TTTTACATCACTCTTTGTGCATTAGATATAATTTGTGAAACA GCTATGGGGAAGAATATTGGGGCTCAAAATAATGAGGATT CTGAGTATGTTCGTGCCATCTACAGAATGAGTGATACGAT ACATCGAAGAATGAAGATGCCCTGGCTCTGGCTTGACTTT TTGTTTCTTATGTTTAAAGAAGGCCGGGAACACAAAAGGA ACCTAGAGATCCTACATAATTTTACCAATAATGTCATCACT GAACGGGCCAGTGAACTGAAGAGAGACGAAGAACATGGA AGTGCTGACAAGGACTGCTCCCCCTCCAAAAATAAACGCA GAGCTTTTCTTGACTTGCTTTTAAATGTGACTGATGATGAA GGGAACAAGCTACGTCATGAAGATGTTCGAGAAGAAGTTG ACACCTTCATGTTTGAGGGCCATGATACGACAGCAGCGG CGATAAACTGGTCCTTATATCTCTTGGGTTCTTACCCAGAA GTCCAGAAACAAGTGGACAGTGAACTGGAGGACGTGTTT GGGAAGTCTGATCGTCCTGCTACCTTAGAAGACCTGAAGA AACTCAAATACCTGGAGTGTGTCATTAAGGAGAGCCTTCG CCTTTTTCCTTCAGTTCCCTTATTTGCCCGTAATCTTAACG AAGATTGTGTAGTTGCGGGTTACAAGGTTGTGAAAGGCTC CCAAGCGATCATCATTCCCTACGCACTTCATAGAGATCCA AGATATTTCCCAAATCCCGAGGAGTTCCAGCCAGAGCGGT TCTTTCCTGAAAATTTGCAAGGACGCCACCCATATGCATA CATTCCCTTTTCTGCTGGACCCAGAAACTGTATAGGTCAA AGGTTTGCCATAATGGAAGAAAAGACTGTTCTTTCCTGTGT CCTGAGGCATTTTTGGGTAGAATCCAACCAGAAAAGAGAA GAACTTGGTCTGGCAGGAGAGTTGATTCTTCGTCCAACTA ATGGCATCTGGATCAAGTTGAAGAGGAGAAATGCAGATGA
ATCTTAA Produto de Gene 50 CYP4V2 de Canis MLTPTFHFTILEDFLDVMNEHANILVNKLEKHVNQEAFNCFFY lupus familiaris ITLCALDIICETAMGKNIGAQNNEDSEYVRAIYRMSDTIHRRM XP_022259889.1 KMPWLWLDFLFLMFKEGREHKRNLEILHNFTNNVITERASEL
KRDEEHGSADKDCSPSKNKRRAFLDLLLNVTDDEGNKLRHE DVREEVDTFMFEGHDTTAAAINWSLYLLGSYPEVQKQVDSE LEDVFGKSDRPATLEDLKKLKYLECVIKESLRLFPSVPLFARN LNEDCVVAGYKVVKGSQAIIIPYALHRDPRYFPNPEEFQPER FFPENLQGRHPYAYIPFSAGPRNCIGQRFAIMEEKTVLSCVL
RHFWVESNQKREELGLAGELILRPTNGIWIKLKRRNADES Sequência de 51 Kozak GCCGCC Sequência de 52 Kozak GACACC Sequência de 53 Kozak GCCACG
[0063] Em algumas modalidades, as ITRs 5’ e 3’ compreendem cerca de 130 a cerca de 145 nucleotídeos cada. As ITRs são necessárias para a multiplicação eficiente do genoma de AAV, e a característica simétrica dessas sequências fornece às mesmas a capacidade de formar um grampo, o que contribui para o chamado auto- priming, que permite a síntese independente de primase da segunda fita de DNA. É contemplado que as ITRs 5’ e 3’ de sorotipo 2 de AAV podem ser usadas (por exemplo, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1 e 22, respectivamente). Em outros aspectos, as ITRs de outros sorotipos adequados podem ser selecionadas dentre qualquer sorotipo de AAV conhecido na técnica, conforme descrito no presente documento, por exemplo, as ITRs podem ser provenientes de AAV8, AAV9 ou AAV5. Essas ITRs ou outros componentes de AAV podem ser prontamente isolados usando técnicas disponíveis para os versados na técnica a partir de um sorotipo de AAV conhecido, ou sorotipos que ainda serão identificados, por exemplo, as sequências de AAV podem ser sintéticas ou obtidas através de outros meios adequados a título de referência a sequências publicadas como disponíveis na literatura ou em bancos de dados como, por exemplo, GenBank, PubMed, ou similares. Alternativamente, tais componentes de AAV podem também ser isolados ou obtidos a partir de fontes acadêmicas, comerciais ou públicas (por exemplo, a American Type Culture Collection, Manassas, VA).
[0064] Em algumas modalidades, a região de ITR 5’ ou 3’ de um vetor AAV é mutada para formar uma ΔITR, por exemplo, deletando/mutando o sítio de resolução terminal (trs), e o genoma de AAV resultante se torna autocomplementar (sc) formando moléculas de DNA de repetição invertida diméricas. Em uma modalidade, uma sequência de ΔITR compreende a SEQ ID NO: 54. Sequências de ΔITR adicionais são conhecidas na técnica, por exemplo, conforme descrito em Wang et al., Gene Therapy, 2003, 10: 2105-2111; McCarty et al., Gene Therapy, 2003, 10: 2112-2118; e McCarty et al., Gene Therapy, 2001, 8: 1248-1254, cada um dos quais está incorporado a título de referência em sua totalidade.
[0065] Em certas modalidades, o promotor pode ser um promotor ubíquo, por exemplo, um promotor de CMV, um promotor CBA ou um promotor CAG. Por exemplo, o promotor de CMV pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, o promotor CBA pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:3 e o promotor CAG pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %
de identidade com a SEQ ID NO:4. Alternativamente, um promotor específico de RPE pode ser usado para alvejar a expressão de CYP4V2 preferencialmente em células RPE, por exemplo, células RPE humanas, da retina. Exemplos de promotores específicos de RPE incluem promotor de ProC2, promotor de VMD2, promotor de CYP4V2 e promotor de RPE65. Por exemplo, o promotor de ProC2 pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:5. Em uma modalidade, o promotor de VMD2 pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, o promotor de CYP4V2 pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:7 ou um fragmento da mesma, por exemplo, fragmentos de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 nucleotídeos da SEQ ID NO:7. Em certas modalidades, o promotor RPE65 pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:8.
[0066] Em algumas modalidades, um genoma de vetor AAV compreende um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, em que o promotor pode alvejar a expressão de CYP4V2 em células da retina, por exemplo, células da retina de primata não humano ou humanas, e o promotor é selecionado dentre a Tabela 3 abaixo: Tabela 3. Sequência de ácidos nucleicos de promotores específicos da retina
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA SynP159 (ProD3) 55 WO 2017/093931 ATCCTGGGGTTTAAACAGGACTAGGTCCACTGGGAGAA
GAGGAAGTCAAACAGGACTAGTCATCGATAGGCTAGCCA GCTTAATTAATCAGATTGTCTTTCCTCCCGTCTAAGCATG GAAGCCCTAAATGGCCTACAATTCCTATAGCTTAGTTGC AAATTTGAGAAGTTCCCCCACTGACTCTGGTGGAGGTGG TCTATTCTGTGTCCCTGGTGAAAAGTCTACCCCCTCGGG TTTGTTATGGGGCCCAGAACTTGTACAATGCCCCGTAAG CTTCTTAGAGGAGGCGGGTATTAGGCAGGATTGGATCTG CGTCCCCTGACATGCCCTTCATACCCTTGAATTAGGATT CCTAAGGGAGCCGGCAGGAGGAGAATGGGGTGTTCCTT GTGGTTCCACTTCACACCTACTCTTCGAGACCCCGGATT CTGACAAGTTTCCCGAACTTGGAAGACCCAGATGTCAAG GTCTGAAGGTAAATGATGTGTTTAGGCAGGAGGGTTCAG CCAGGCTCAGCTCTCCTCCCCTCTCGCAGGGGAAGGAG AGAGACCCTCTAGAATTCCTGTAGGAGGTGCACGTGGG CTGATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTA TATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGT
GTTGTTGTGAACTGGAATCCACTATAGGCCA SynP160 (ProD4) 56 WO 2017/093934 ATCCTGGGGTTTAAACAGGACTAGGTCCACTGGGAGAA
GAGGAAGTCAAACAGGACTAGTCATCGATAGGCTAGCCA GCTTAATTAATCAGATCTCCAGTGTTTACCCAGGGCAAG AAGTCCCATTTTTGTTCTTTTACAAGCTGAAGACCAGAAA CACATGCGGCCCATTCCCGTCCGAGGCAGAAATGCTGA GGGATAAGTCTCAGGCTCTGAGCTGAGTTCAGGAAAAG GTCAGTGTCCCGATAGAGCACTCAGGTAGAGTGAATCC GCTTATCACAGAGTGAATCCAGCTTAGTTGTCCTTTGGA ACCTCAGTTGATTGGATAAGTCCTCCAAGTGTGAAAGAG GCATCTCCACTCAGGCCTTGGTTCCAATGGTCTCTCAGG GAACTGCCCTCAGCAGTGCATAGAGCTGAGCCAGCTCT CCGGGAAGTTCAGTCGAGTTTATCCTCACATGGTCCTGC TGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCC AGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCCA
CTATAGGCCA SynP161 (ProD5) 57 WO 2017/093935 ATCCTGGGGTTTAAACAGGACTAGGTCCACTGGGAGAA
GAGGAAGTCAAACAGGACTAGTCATCGATAGGCTAGCCA GCTTAATTAATCAGATTTCCAGGAAGAGGCACCAGAGCC CTCTCCCTATTGCTCAAAGCGCAGGTGGAATAATCTTGG CCGTGTGACCGGAATTCAAAGCAGTTTTGGGAACTGAGC CCCAACCTGTAAGCCCTGATGTTATTTCAAGAAAGATGG TGTCAGAATTAAATTGGATTAGAGAGGAGGATATGGATT AGAGCAGAGCAGCATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTA
GTAGAGGGTA SynP162 (ProD6) 58 WO 2017/093936 CACACAAAACACAAATACAACAAATCTTTTAAAACTGCGA
TAATCCTATGTTGATTCTCTTACCTAAATTAAAAAACAAAA CAAAATATGATAGCCTTGAATAAATTTTTATATGATATTTC ATACTGTAGCCCAGGCTAGCCTCAAACTTGTAGCAATTC
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
TCTTGTCTTCATCTCCTGAACACTGGAATTACAGGTGAGA TCTAGAATGCTTTTCTTTTTTATGAGATACATCATCTTTAA ATGAATTTAACTAACTTTATGTGTATGGATGTTTTGCCTG AATGTATGTGCAGGGCCGAGGGAGTGGGAGAGAACCCA CTGGCTGTGTTAAGCCACTGACATCCTCACATGGTCCTG CTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTC CAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCC
ACTATAGGCCA SynP198 (ProD1) 59 WO 2018/083607 ATCCTGGGGTTTAAACAGGACTAGGTCCACTGGGAGAA
GAGGAAGTCAAACAGGACTAGTCATCGATAGGCTAGCCA GCTTAATTAATCAGATGGTTCATTGTAAGCCACTGTAGTC GTGGGTGACTCACATCAAACCACCCCTTCGGGAACACG ATGCCGACACTGAAACTACATAGGGGAGAGCAAATAAAA CTGTCTTCTCTAGTTTGGGGAAATTGGAGCCTGCCTTAG GGAAACAGTGACTAATTTACAGCTAGTGTTTGGAATGAG ATCATCTGTCAAAATAAATGTATCTTTACTTCCTTCTTGAG AGGAAGCAAGCTGTTTTATGATGTTCCTTGGAATCCTTAA AAATACAGAGCAACATTTACATTATTAATGATACGCTTTAT TGCTGCAGGCTAACTAGGTCCAAAATTGTCCTTCCATAG ATGGAGCTGGAGAGTTACACAGAAGTTTGCATATCGAGC TCTTAGGTCTGCATGTACAGCTAATGTACTTGTGGACCC TGTCACATATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGA GGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTATCACATCC
ACTGTGTTGTTGTGAACTGGAATCCACTATAGGCCA SynP107 60 (ProC17) AACAAGTCTATCATAATAATTACAGGATGTGAACCTGGGA WO 2018/099974 GGATAATTACAGGACCCCGGGCGCAATAAATAATTACAG
GAATCGAATATGGAATTATAATTACAGGATCTGAAGAATC AAGTATAATTACAGGAGCCGTTGTGTGCTGTATAATTACA GGAATGATCATTTATTGCATAATTACAGGATAGGTGTGCC GCTACATAATTACAGGAGGTTTCAGCCCAACTATAATTAC AGGACTAGGCAAGTTCGGTATAATTACAGGATGGCGCTG CCCCCCAATAATTACAGGATAGCTGACTTCGGTAATAATT ACAGGACATTCTCGCCAGACTATAATTACAGGATGCAAC TAGACTCTGATAATTACAGGATCGTCTTAAATTGCCATAA TTACAGGAACAAGCATACGTTGCATAATTACAGGACCCC TATTCTAGTGTATAATTACAGGATGTGCACAACCAAAAAT AATTACAGGATAATTGTCTTGACTGATAATTACAGGAGGG TGTGATACACCTATAATTACAGGAGCTCGAGATCTGCGA TCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCT AACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCG CCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTA TGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCC AGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTT
GCAAA SynPI (ProA6) 61 WO 2018/099975 AGCTAGCACAGCACTAGGCTAAAGCGTACTGAGCCCTTG WO 2017/046084 TCTTCCGTGGGAGCTGCAGAGTGGGATGCATGCGTTGT
GAGCTGAGGCTCAAGCTGCGCTGGCAGAAGAGCAGGG GTTGCCTTGTCAGACTCCAGGGTCTCTTTCTCTCTGAGC
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
CTGGGAAAGTGCCACTTTATTGGATCTATAAAGCCGGGG GGGGGGGGGGGGGAGGAATCTCAAGGTGAAGAGGAAG TTCACAGACCCCTCTAACGCCTCTATTAGAACCTTCCAG CTATTCTCTCATACTTGTACACTGAGCTGGCACACAGTAT AGGCAAGTTCTATTCGCATCACCCCTCTAGTTCCTGTCT CCCTGGTTATGCAAGCCTCATATTTAGGTAGATGTGACC TTAGGAAACCAAAATATCCTTTAAGATCTTACTAACTGGT TGCCTGTTCAGCTTTTCCACATTGATCCTGTAGCCCCCT CGAGGAGGTGAAGGAAAAAAATCTCCTCTTTGTTTCTCT AACTCATTAATGAATTTTAAGGGCACTCTGTAAGGTTCCT TTCCCATTCTGGTCTGGTTCGTACATTCTGAGAAACACAC TGTGTTTGTGTTGAGAGTTGGCTCCCTAGCTACACTGTC TGTCACATTGATGCTCTGAGTAGGGACAGGGTTCATCTA GGAAATATATTTTCACTCACACTCTGTATCTTTTCCTAGTT TGGCATATTCTAGTCTGCATTTGGCTCTCTGTTTAAATAT AAAAGAAAACTAAAACACACCCTTCAGACGCCTATGTCT GAAAAATCTGGCATTTCCGTGGGTTTTTCTTTAAGGAGG CCTTCATTTGTAACCAACACCATGCTCTCCTTAAGGAAAT CAATCTCAATGCCCTATTATCCTTCCCTTTTCTTTCCTCC CAGTTTGAGGCTGCAGTTGCCTTTTTTTTTCTTATCCCCT GCTGAACCTGAAAAACCCTCTCTTTTCTACAGTTTTCTGT TCCCAGGCCCCGCTGACTTCCTTTAGAGCATGGGGGGG GGGGGGATCAGGATTGTGATGTGTGAACTGGGAGGATC TTGACCTACTCCGCTAACCCAGTGGCCTGAGCAAATCAC AAGGAGGATTGGAGCCATCTGCCCAGCCCCTCCCCCAC GGCAGCCTGCTGGAAAGAGACAAGTTAGTCATTCAAATG ATTGGCTTTTTGCCCGCTTCTTCTCTAAATAAGAAGGCAG
CAGCTTCTGCTGAGGT SynP88 (ProA5) 62 WO 2018/146588 GGTGCCCAGGCAGTGGGAGCAGGGCTGACCAGAGTTCT
GCAGAGATTGCCTGGAGGCCTTCCTGGAAGAAGAGATC CTGGCACCGCACAAAGAGAAGCACAGGCTTTCCAGGGC TGAGGAGAGGGAGGTCAAGTGAGGCCCAGGTGCCCCT GCCTGAGCCTGTGTCCCCAGAAACCTCCTCTCCCTCTCA TCACCCCCACATCCTCCCTGCCACTCCCCGCAGCTCCCT GTGGCCAAGTGCACTGCAGCACTCGGCTCTGCTCCACA AACGGTCTGCTCCACTCCAGGAAGGCCACCTCCTCCCC CCCCCCCCACCTCCGGCTGTCACCACTCACCGCTCTAG CCTCCAGGGGGTGGGGACCCCAGAGCTGGACACACCC CATCGAAGCCCCACAGCTCAGCCAGCCGGACAGACTCA CGGTCGGACTCAAGACCCCGGAGCCCTGAGGTGGGCA GCGCGCCAGGGTTCCTCGCAGCCTCTTCAAGGTCAGTG CAAGTTGGGTGTGCAGCCCTTTGGAGCCTTTGAGGTCTG TGGGACTCAGCTCAGAACCCTCATCCCAGACCACGAGC CCCAAGGTGGGCTTCACTCCAGGTGCACCTGAGCCAAG TGCTGGGCAAAGGGCGCCCAGGTCCACAGTCAGCACAG GTCCAGGGGTCCATCAGGAGGGGCCCCAGGCTGGGGG CCAACCCCTTGCTGAGGCCTCTTTGGGGACACTCCCCA CCGGCCATGGGGAGCTAAAATTGGAAAGTGGCGAGTGG GAGGCAGCTGACACAGCTATTTTGTGCGCTCTTCATCCG CTCCGGTTTCACTCTCCTGCTCCACTAACCTGATCCTGT GCTTCCCTCCCCCACCCTGCCGATGAAGAGGTGTCTCA
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
GCCCTCCAGCCACAGTGCAGAGGCTGCTCAGGAGGGCC AGGCCGGGAGCGAGCAGGGCCAGCGTGGTCTGGTCTG AGCCGGGACTCACCAGGAGCACCTGCCCTTCAGAGAAG CTCACTGGATGGCCTCCCGGGTCCCTGACCCTTTGTGA CCCACACCTCTCTGTCAGTGTAGCAAGGAGCGGCCTCC CAGAGCCCCAACTACAGGGCTGGAGGAGACAGATCTGC AACTGGGAGATCTTGGGTTGGGAGAGATGGGGTGACCC TACCCATCTCCAAAAGGGCACTGCACCGTGTTCCCCTTT CCCTCGGTTCCAGGTCTGGACCTAAGCAACCACTGGAA GACTGGCGGCCAGGCTGAAGAGGGTGGGAGGGGCTTA GGTACTGGCCCAGACCCCAGGGATGGCCCAGCAGGGTA GCCAGAGGGAGTGACCAGACACATCCTGGACTTGATAC CAGTCAGCACCTTGGACAGCAGCCAGCACCCTCCCAGT TGCTGCCTGGCCCTGCCTGGTCCAGCTCTGGCCACTCT GGGGCCTCAAAGAGCCCAACATCCAGCCTGCAGCAAGA GCTTAGACTACACAGCACTTCAAGGGGGACAGTGGGTG AACACAGGCAGGGACCTGAGATAAAACAGACTCACGGC TTGGCGGAGGAATGGAGTCAGCAGAGCCCGGAGTTGAG CGAGTCTGGGAAGTTAGTGCTAGAGGAGTTCACGGGAT CTCAGGGGACCTCGTGGGCAGGGCTTTGCTGAGGTTAA GAGAGGCTCACTGTGAGACGGGAGAACTGACAGAGTCT TCCACCATGGGAAAGACCCCATGGTTGGGGAAGTCTTG CAGGAACAGTTTGGTGTCCCAAACTTGTCAGCCCATCAG AGAGGTATGAAGGAGAGGAAGCTAGTCTGTGCGAAGTC TGGGCTTTGGAGAATCTTCAAAGGAAGCAAGATTGAGAG CTGCAGAGGAAAGGAAGAAGGTGTCTGGGTGTGTTGGG GGGGGTAGATTTACTGACAGCATCCCCAGGGGATGGCT GAGTGGACCAGTCTCCTCAGAGGGTCCACCAGGGGAGG CGAGGCAAGGCTGGGACTGGGGGTTCTCACTCATGCTT
CTCCTTCAGCCCTCTCCAGGCC SynPVI (ProA7) 63 WO 2017/046084 CATCCTGAGAGATGAGCCAGGACAAAGAACCAGTAATAG
CTCCTGGAGCAGCACATCTGTTTTGCCAGGATTATCCCT TGGATCTCTTAAAACCGAGACCTTGTAATCTGAAGACTCA ACTTGGGCTGTACCCTTAACCTTCAGCTCTATGATGCAA GTGAGTCCACAGGACCGGAGGCTTTGAGATGAGCTTTTC AGAAGGGAGGAGTTGGCCGCTTGCTCCCAGAGCTCCAG CACCTGCATTCTTCTGGCTATGTCAGAAGCCAGATCATTT CCCTCGTTAAAAACAAAAACAAAAAAACAAACAAACAAAA TGTTAGTCTTTGCCCTTTATCTGCCTGGCAAAGCTTTTAA TTGGCTTGATCTGTCATTCCGCTAGACATAAAGGGGACA ATCCCCGGATTAGGAAGGAGCTCTCCAGCTCGGGTAAG GAGTCTCAAGGCAAGGTAGGCAAGCACCACCGGTCCGC
ACTCTCGCCCAGCTTTTACGGGAAGAAGAGA SynP136 (ProA1) 64 WO 2017/046084 AGAGGCAGGCCGAGTTTGAGGCCAGCCTGGTCTACACA
GGCGTTCTAGGAGAACCTGTCTCATATGCACATGGGCCT GGGATTACACATACAACTGCAATGGCAGCACTTGGAAAG CGGAAGCAGGAGAATCGGAATTTCACACTCATCCTTCAT TATAGAAGTCCAAACCTGTGCTAAGCTACTTGGACATCG CTAAAAAACAGCAAAAATCTTTCTAGGAATTGCCAATGTA
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
TACACACCAAGTTGTATTTTTGTAGGGCAGACTTTTCCAA CTTGCCAGATGATAATAATCATTTATATTAGCTACATTTCA GGCTCCAGAATTAACACTGTTACTGAAATGTATAGGTTCT AAAACATACCATTTCCAAATATTTTAAAGGATTAACATTTT TGAAAAGCATGTGATCTTCCAACCATATTTTAGGGAACAG ACATAAGAAGTAGGCAAGTTTGGGAAGAAACAGTTCCTG AGGGCATTTCTTCCCAACCTTGAATGCCCTGTGGGTTAA CTGAGGTCTTGGTAAAATGTAGATTATTTACTGGACTTTT TGAACTGAGAGTGCATTTCTAACAAAACTCCAGGGTATG TGGTCCTTGCATTACATATGGGGTAGCAACATTCTAAAG CAGTGTTTTTCAACCTGTGGATCAAGACCCACAGAAGTC ACATAGCAGATATCCTGCCTATTAGATATTTACATTAAGA TTCAGAGCAGTAGCAGAATAGGAGTCATCCCAACCTGAG GAACTGCATCAGAGTCCCAGCATCAGGAAGGGTGAGAG CCACTGAGCTAAAGTCCTCTAGGTGAGGGGGCTGCCCC GGAAAGACTCATTTAAATGAAACCACTGACACAGAGAGC TGACAGATGAGGTGGGTTCCGTGTCTGTGAGGCTCTGC TGGTCGTCTCCTCACTCCCATGGAAGAACCACCGAGATG AGGGCGAGGGGCAGAGCTAACCCAGCCTCTAAGTAGGC AGAGTCTAGTGTCCAGCTGCCCAAGGAAGAAGTTTGCTG TGTGAGGTGGCCCTGATGTCCGCACACACAAAATGCCA GTGAAGTCTACTTGACCAAGTGAAGCTGGTGTGGAATGG GAAGAAGCACACACAGTCAGTCTCTCTGCACACACTCTG TCCTTCACTTCTTCACTTACCAGAGATTTGATGAGAACCT ACTAGCAGATCAGATTTGATCCCTGAGTGGAAAAAACGT ACAGTGGGAGATAAAAGAGGAAAACAACGGATCTGAGTT TGAGGTTAGCCTAGTCTGAGCAAGCCGGATACACAGTAA GACCCTGTCTCACATACATCCACTCGCACGCGCGCGCA CACAAACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACATCGTGCTAAGGACAAGATAGGCATCCTGAG AGATGAGCCAGGACAAAGAACCAGTAATAGCTCCTGGA GCAGCACATCTGTTTTGCCAGGATTATCCCTTGGATCTC TTAAAACCGAGACCTTGTAATCTGAAGACTCAACTTGGG CTGTACCCTTAACCTTCAGCTCTATGATGCAAGTGAGTC CACAGGACCGGAGGCTTTGAGATGAGCTTTTCAGAAGG GAGGAGTTGGCCGCTTGCTCCCAGAGCTCCAGCACCTG CATTCTTCTGGCTATGTCAGAAGCCAGATCATTTCCCTC GTTAAAAACAAAAACAAAAAAACAAACAAACAAAATGTTA GTCTTTGCCCTTTATCTGCCTGGCAAAGCTTTTAATTGGC TTGATCTGTCATTCCGCTAGACATAAAGGGGACAATCCC CGGATTAGGAAGGAGCTCTCCAGCTCGGGTAAGGAGTC TCAAGGCAAGGTAGGCAAGCACCACCGGTCCGCACTCT CGCCCAGCTTTTACGGGAAGAAGAGAATGTTACTCTATC CTAACATATTTTTCCTTTTCCTCTATCTCACAGATAGGAAA AATTTAAGAGCCAGAGGGAACGTCCCTTCTCAGAGGAGA
CAGCAGAA SynP155 (ProA4) 65 WO 2017/046084 CTCTCCTCCCATTGATGACTGACTAGGCCATCCTCTGCT
ACATAGGTGGCTGGAGCCTGAGTCCCTCCTTGTGTACTC TTTGGTTGGTGGTTTACTCTGGGGGTACTGGTTAGTTCG TATTGTTGTTCCTCCTAGGGGACTGCAAACCCCTTCAGC TCCTTGGGTCCTTTCTCTAGTTCCTTCTTTGGGGACCCT
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
GTGCTCAGTTCAATGGATGGCCAATTTCCTTCTTAAATGC CCCTAGCAGTAACTGTTAGGTCTCAATCCCAAGACAAAT GTCTGAGGTGCCTATTTAACAGATCAAAGCGGACCTGGC CTCAGGTTATCCCAGTCCCTCCCTGTACCTCAGTCCCTA CCCATCACCAACTCTCCAGCCCAGAGCTTGGGCTGCACT TCCCCCACGGTTCTTCCCATTTTGGCTACATGGTCTTTTT TTTTACCTTTTTGGTTCCTTTGGCCTTTTGGCTTTTGGCTT CCAGGGCTTCTGGATCCCCCCCAACCCCTCCCATACACA TACACATGTGCACTCGTGCACTCAACCCAGCACAGGATA ATGTTCATTCTTGACCTTTCCACATACATCTGGCTATGTT CTCTCTCTTATCTACAATAAATCTCCTCCACTATACTTAG GAGCAGTTATGTTCTTCTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTT CATTCAGTAACATCATCAGAATCCCCTAGCTCTGGCCTA CCTCCTCAGTAACAATCAGCTGATCCCTGGCCACTAATC TGTACTCACTAATCTGTTTTCCAAACTCTTGGCCCCTGAG CTAATTATAGCAGTGCTTCATGCCACCCACCCCAACCCT ATTCTTGTTCTCTGACTCCCACTAATCTACACATTCAGAG GATTGTGGATATAAGAGGCTGGGAGGCCAGCTTAGCAA CCAGAGCTGGAGGCTGATGCGAGCTTCATCTCTTCCCTC AGGTAATATTCTAAATCTCTCTGCTTCTAGCCCATACTAA GTCCACCTCCTTTGCCTTTAGCATCTTCTTTAGGAGGAG AGGGGCATCTTTTCTGATGCAAGCAATGGATTTTTCAGG CTGATGTAAGAGACTTCTAGAACTCAGCACCCCCCCCCA ACTCATCCCTCTGACCAAGCCTACTATGTTTTGAAGGAAA GCACCAGAAAGACATTTCCCTCTCTATGCTTCCCTAGCA CCTTAAGCGTGGGGACAGGATGGAAATGTTTGGGGAAA GTGACAAGAGAGATGATGAGTAAGGGCAAAGAGGGCTT TCGGCCTCCACAGAGGCTTCTACTGCCACCCCCCAAGA AAGTATGAGCGCAACCCTTTCTGTTCTACAGCTTTCCCTC TTCTTTCCCCCACCTCCCCCCTGTTCTTCCTTCTGAGCTG GAGGTCAAAAGCATCCCAATTCAGGGTCAAGTCCAGTAC AGGGACAAAAAGAAATTTCATCCATTCATTTATTTATTCAT ATAGTTAACTGACTGTGTGCCTGTTGAAGTTCAGTATCAA TGCAGCCCAAGGAACGTATTTAAGAGATGGAGTATGAGC AAGTAGGATAAATAGAAGGGGTTAAAAAATAAGATGAGG AGCAATCAAGAAAGACACTGGACATTCCTCTAGCTTTCA CACACATGCACCTGTGCATGCATGGATACATGCACAGGC ATTCGCTCATGCACATACACATGAGAGAGAGAGAGAATG AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGA GAAAGAGAGAAAGAGAATGTAGTGCAATGGTTGGGTAAG TGTGTAACTGAAGAGTTGCCCTAAGAAGAGGAAAAAAAA AAAGGAAGCATTGAGTGTTGGTGTGGTATCTCAGGCAGT TAATTTATATTACACTAGGTGTATCATTATGGAATATTATA GTGCACTAAAAAAAAAAGGATTAAATAACTGAGTGTTCCT
CTTCCCCTCATCTCAGGAAAGATTCAACTGGCCAGC SynP123 (ProC1) 66 WO 2017/046084 AGATCTATTAGTAAAATTAACTACACCTGGTCCTTTATGT
CATTAACTACACGTCAGTCGTTCTATTATTAACTACACAG AACTTACTATATAATTAACTACACCGCGCATTTGGATATA TTAACTACACAACTTTGCTTAATAAATTAACTACACCCGT AACGGATTCTCATTAACTACACGTTTCATTACGAGGGATT
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
AACTACACATAGCCCCCGGAGGCATTAACTACACTTTTT GAGGTCGCGAATTAACTACACTTCGACTCGCAGGACATT AACTACACTATACCGATAACGCAATTAACTACACAAATTT TTTATGAAGATTAACTACACTGTTCGCTCCTGCCTATTAA CTACACGAGGCCGTATTTCCAATTAACTACACCCGAGAC ACAAGATAATTAACTACACTTAACCAGATGGCAGATTAAC TACACGTACGGGCAGGCCCGATTAACTACACCGGCTGT CATTCCTCATTAACTACACATATCACGACTTGTGATTAAC TACACGCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCA GCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCC CCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCG CTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGC CTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTT
TTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA SynP114 67 (ProC22) GTACTGCGGACATCCGCTAATTAGCATAACCCGCAAGGA WO 2017/046084 TGTAGCTAATTAGCATATCACGGGAGACTGGGGCTAATT
AGCATAAAAAGTCTCCCGCCTGCTAATTAGCATACGAGA CTCTAGAATCGCTAATTAGCATATCAGTCAAACCACTTGC TAATTAGCATAAGCATCGCGCTATTTGCTAATTAGCATAA ATGTTACATACATCGCTAATTAGCATATGATAGCACTGTC AAGCTAATTAGCATATCAGCCGCACGCATGGCTAATTAG CATACGAATACCACAAGCTGCTAATTAGCATACGGTTAAA ATAATACGCTAATTAGCATATCAAAGACGACAGAAGCTAA TTAGCATAGATCACCATCACCACGCTAATTAGCATACGTT AATGCTGTTCTGCTAATTAGCATAGAAATTGTTGATCTGG CTAATTAGCATACCCGCCTTCCTGAACGCTAATTAGCATA CGGTACGTCGAGATTGCTAATTAGCATATGTACTGAACC CATAGCTAATTAGCATAATAAATTACTAATCCGCTAATTA GCATAGCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCA GCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCC CCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCG CTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGC CTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTT
TTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA SynP132 (ProB2) 68 WO 2016/174624 GACCATTTAAAAGGGGTATATAAAGATTGCATACAAAAGC
TGAGGGGCCTCACCCTGAATGGATTCTTTCTTGAAAGCC ACTTTTGTTCTTTAAGAGGCGCGGTCCAAATAATGTGCAA GCATGATTGGCTGGAGGCACATTTCGTAGATTAATCCTC TCCCTTGAAAGGATCCAAGTCTGGAAAATAGCCAAAAAC GTGGCTGTTATGCAACCCTTACCCAAGCTCCTCCTCCCA GCTGCCATCCCTCTTACTAAGCAGTGTCATGAGGCTGGG CCAGGCTGGAGATTAATTCTTGACCATTTAAAAGGGGTA TATAAAGATTGCATACAAAAGCTGAGGGGCCTCACCCTG AATGGATTCTTTCTTGAAAGCCACTTTTGTTCTTTAAGAG GCGCGGTCCAAATAATGTGCAAGCATGATTGGCTGGAG GCACATTTCGTAGATTAATCCTCTCCCTTGAAAGGATCCA AGTCTGGAAAATAGCCAAAAACGTGGCTGTTATGCAACC CTTACCCAAGCTCCTCCTCCCAGCTGCCATCCCTCTTAC TAAGCAGTGTCATGAGGCTGGGCCAGGCTGGAGATTAA
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
TTCTT SynP156 69 WO 2017/064642 GTAGGCCTAGAGCGGTGCTGACGTCAGCAATTCCGATC
TAGCTGTGCTGACGTCAGCAGTTTAATTGAGCTGCTGCT GACGTCAGCACATACCATAGCATCGTGCTGACGTCAGCA GTGAGGCTACTATCCTGCTGACGTCAGCATATATGTCGC TCTACTGCTGACGTCAGCAGCACCAACTGTAAATTGCTG ACGTCAGCAATAAGAGACGGGCTTTGCTGACGTCAGCA CGAGTACATAGCAATTGCTGACGTCAGCACTAGTGCGGC CATCGTGCTGACGTCAGCAAGCTTTCAAAGAGTCTGCTG ACGTCAGCATCTTCCTGACGCAACTGCTGACGTCAGCAT TGAGGGCTATGGCTTGCTGACGTCAGCAGCACACGCTA TGGGGTGCTGACGTCAGCAGCTAAGGAGACATGTTGCT GACGTCAGCATTCGTGTCAGACATATGCTGACGTCAGCA GGGGCTAGCCACTAATGCTGACGTCAGCACAGTTGTCG TTGATATGCTGACGTCAGCAATAGACACTTTTATGTGCTG ACGTCAGCAGTTAGGGTCAGAGGCTGCTGACGTCAGCA GCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAAC CATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAAC TCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACT AATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGC CTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGG
AGGCCTAGGCTTTTGCAAA SynP17 (ProB1) 70 PCT/IB2019/0590 TCACCAAGTAGGAGTCCTTCAGTAGATGAAAGGGGTATT 88 TTAAACCGTTGAAGCTATCTTGGTGGCAATCTAGGATGTT
GAGACCTCAGAGAAAATGTCGAAACCTTGGAAAATTTATT TTGACGATTAGAAATTGTTTAATAATAAAACAAAAGACTT CCTTTCTCCAGCCCCACTTTCCCTGTTTCTTTTGTCATAG GTTGTTGTGAACTCGATCTGGGAGGGAATCCTGGACTCG CAACCCGACTCCGCTCGGCGTTGATTGGCTCCTGCCTC AGGACCCCGCCGGACCCGCCCCCCGGCCGTGGGAATC GCCGCCTAGCAGGCGGGCTGCGGCTGCCACTCAGTCG GAGTGGCGGAGGCCGTAGCCCCGCCTCCTCCCCCCTAA
TTGATA SynP27 (ProB12) 71 PCT/IB2019/0590 ACCCTCCTCAGGGGAAGAAACAGTACATTCTCTGAAGCC 89 TCCTGGTTAAATGGGGGAAGTATTTGTATTCCTATCACCA
AGTAGGAGTCCTTCAGTAGATGAAAGGGGTATTTTAAAC CGTTGAAGCTATCTTGGTGGCAATCTAGGATGTTGAGAC CTCAGAGAAAATGTCGAAACCTTGGAAAATTTATTTTGAC GATTAGAAATTGTTTAATATCTCCTTCCAAGATTAATCTAT GATTAAAGGGCACTTAAGAGACTTTTATAATTTCTAAAAT ATTCAATAGCATAGATGATTTGGCCATTACAAACTGCCTA AGATTTCTCCTCAGGCAGAAGCCAGGCCACCCACGGAG AGACCCAGGAACTGGGCCAAGAGCCTAAACAAAAGACTT CCTTTCTCCAGCCCCACTTTCCCTGTTTCTTTTGTCATAG GTTGTTGTGAACTAAAAAAATAGCTCAGTTTCACAAAAGC GATCTGGGAGGGAATCCTGGACTCGCAACCCGACTCCG CTCGGCGTTGATTGGCCCCGCCTCCCAGCAGCTCAATA GTTACAGGGGAGTGGCAGGTCCCTCCCGGCCACGTCTT
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
GGACCCGCCCCCCGGCCGTGGGAATCGCCGCCTAGCA GGCGGACAGACTGGAGAGGTGGATTAATGACCCCAGCA AAAAGCTGGCATGTCCAAGAGATTTAAAATATTTTTTTTAT GTAACAGCTTTAGCCAAAGCTGTTCTAGGGTTCAGAGGA ACTGCCACTCAGTCGGAGTGGCGGAGGCCGTAGCCCCG CCTCCTCCCCCCTAATTGATAGACTGACTTCTTGACTAAT GGCCAATCTCTAAGCAGAGGGGAGGACCTTCCTATTGG CCAGAGAGTCAGCTTTCAAATAAAAGAGGCGGCTCTTCC GGCAACAAAGAAAACAAGGCGAGCCTATAAACAAAGCCA CGTGGGCTTCAAGTTTCCACGGACGCAAGGTTGTGCAA
CGCAGTAGTCACTTATTC SynP57 (ProA14) 72 PCT/IB2019/0590 GCTCAGGCTCTTGGGGACTGGGCTCCAGCCCTCTGGGA 90 TCATCATTTGCTCTAAGAACTGGCCTGGGTGCAGCTCCA
GACCAAAGGCAGCAATTGTTCAGAGCCCTGAAAGCGCC AAGGCGCCAAGGCTTCTTCTACATACTCACCTCTGACCC ACCAGCCCCCCACCCCAGCCCAGGTCTGACGAAAGGTA CCTCTCTCCACTGCAACAACTGGGGTGTGGCAGGCTCT GGTTTATTCGCCTTGTTCTCCCTTCCCCAACCCCCCTTTT CTCATCCCCCTAGCAACCAAACTAGATCCATCAAAGAGC AGGACCTGGCAGCCGAGCTGGGAGAGACTAATAGCCTG GAAGGAAGGCGGGGCCTGGAGAGGAACGGAAGCCTAG GGATGCAAGCCAGCACTGGGCGTTGGCTCTGACCCATC TCGGAGGACACACGGAAGGTGGGGGAGTTCTCTGCTCT GCAGTCTGCAGGGAGCCATCCTCCTTATCCCAGTCAGG CATCCAGCCTAGAACCCCAAGCCTTCTTCTCTTACACCC GTCTCTTTCTCAGGACCCAACTGAGGTAGACTCATCCTG TTTGAGAGTCCCAGGGTCCCCAGTGGTAGCAGACACAT GGCTCTCAGCAAACCCAAAGGGCTTCAGCATCCTTTCTC CTGCAGAGAATCCAGACGGCCTCTGTCCACTCCTGGGA CTGCCTGTGCTGCATTCTGGAAGTAGTGTGTCACACAAA GGTCAGACACCAGCCTTTCTGCTAACTGGGGTGTGGGG GCGCTGTTAAGGGGTGTAGCTGTGTATTCCTGTCATGTC TGTGCACACATGCATATTTGTAGCCTCTACAAAGCTGGC TCAGTGAGTATTGGGCAAGTTATCTGTGGACCTGTCGGA GGACTTCTCTCTCTAACAGGCTGTAGTGGCTGGGTATCT CTCCCATCTCATCTCCCTTTATCTGCACCATGTCTGGGTA CCTGCATCTCCTCTGCACTGGAGACTGGTGCCTACTAGT CTATATGTCTTTCAGCCCTGGCAGCTGCTATCCCCCACC CCCCTCCCCTTCCTACTTCAGGAATTCCTCTGGTTCCCG TAAGGCCCGTGACTGCCCAGCAGATGGTGTGGAGGGGG CACCAATCCAGTAAAGGCTGAAAGTGTACCACAGGCCCA CTCAGCCCCAACAAGAGTGGGCACCTCACAGGCCCTTT CATGGCACAGACCCTTGGAACCCCGACATCCTCAGCAC CCTGTGAGGTGCCCACTCTTGTTGGGGTGGGTGTTACG TCCGAGTTTGGGGGCTGTGTCTTTAAGATGGAAACATCA CCATGCAACTTCTGCTGGTCCAAGGGCGGGGGTGGGGG TGGGAGAGCTGGTCAGTCCATTAGCTGCAGAGCTGGCG CCAATCACCAGCCCTTTACCGTGCCCTGGGGAGTAGGC AGAGATAAGCTCTTCCCCAGCTCCCTCTGCCTCAGCCCT CGGTTGTGGCCAATGATGGGGGGCAGTTGACAACAGGT GAAAGGAGAACCCCAGTTTCAGGAGACAGGAGGAGGCA
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
CGAATTCCCTGGCTTAGGCCAGGTTAGCTCTCCCTCCAC CTACCCCACTTCTCATTGCTCAAAACTTGCCCTTTTCCTC AGGTCCTCATATTCCCTAATTTTTACCCCCTCTTCTGAGA GGGCACCCCAGGTCAAGCCATGTCCTCCCATTCTAGGC TCCAGCGTTGGATGCATGCTCTAAGGTAGACCTTAGCCC ACCTCCATCACATCCCGGATCTCAGCCAGCAACAAGGG GGAATCAAGCAGGCAGGGTGCCAGCAACCAGGAGAGG GAAGGGGTGGTGTCCTCTCTCTGCAGGGTGGGGCATCC CCCTCCCCACACAGCCCAAGGCTGAAGTCAGGCCAGTG GGAGGAGCTGTCGTGGCCCCCCACCCCCCCTCCCCGG AGACCGCAGGGCTATAAAGCCGCCCCGCATCGGTCTGC
AGCTCCTTGCCACCCGGCCTAGTTCTGCCAAGCGCTGA SynP78 (ProA27) 73 PCT/IB2019/0590 GGTCAGTAAAGTGAATGAGATGAGGTCATGTTCCATGTG 91 GGATAAACATGGTTAGTAGACTGCACCAGGTGATGGGG
GAAAGGAGAGAAAAAGATGTGAGAGGGGAGGGGACCAG GAGAAGGGACCAAGAGCGAAGAGAATCAAGATAGCCAA GAGAGCAAATGGCCAAAAATGGCAGGGTTACATAGGAAA GAGAAGCTTGCAGAAGAGTAGCCAGGGCCCCAGGGAG GAGATGTTTAGTTCAGGGGAGAGGTGAGAAAAACTGAGA AGAGCTACAGGTACTGATGGAAGATAGAAGCCAGAATGA ATTTTGGTGTGCTAATAGGTACCACAGTTAGCCAGTTGC TTCTTTGGAACCCAACATAAAGGACTTTTTTTCCTCCTCC TCCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCCT CCTCTTCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCATACATAGGTGTAGCTAGAAACTGGAGCACTGTG ACCTTATTCAAGGGGCCACAAAGGTGCCTCTACACCCCC ATGCACACACCTTACAAAAAAGGATCTCTAGCATTTTTGC AGTCTTTCAGTGGAATTCAAAAAGGAATCATTTGATTGGT AATGAGAATGTTTTTCCTCTCGGCTTTTCACAGCTCAGGA AGGAGTAATTTATCAAGTACTCTGCTTGGAGAAGTAGAG CATAGCCTGGAATGGAGGAACATGGATCCCTGTGGGCG CTTGCAATCTTCTGCTTTCATTTTGTCAGTCATGCAAGCA CAGTTTTAAGTACTCACCAGGGGAGAAAAAGCTCTCTTC CCAGCTTGTGCTTGCCAGTAAGACACTCTCCTTTCAGAG TCAAGGCTGCAGCTGGCCTTGGGAGCTTCTTCCTAGGTC TCTAGCAAGTGGAGCCAGAGCTGCTACAGAGGAGGTAA GGGCCATGGGCAGCATCCCAGGAAGGTGGTTGGCAAGA GGGTGGGAGACCTCTCTGCACGTCCTCCTGGGACCTGC ATGCTCTCCCCATGCCTCACCCTCACCCTAGTTGTGACA CCAGACCAAGAAAGGCGATGTGGTTCCCCAGCCACATC CAAAGCCAAGCCTTTGGCCAGAGGAAGGAAGGCTGTCC CAGTCATGGTTTTGCTTTTGTTTTTCCCCTCAGCTTGCTT TTTGAACCTCTATCTGAGAGGACAGTGCCCTGCTGCTCC ATAGCTTCAATCCTGGCTGCAGGGATGGAGGTTGGGAA GGAAGCTGGTGAGATCCTAGATCCTCAAAAATGATAACT GGATGTAGCCCTGGTAGCTAAACATCCACAGATACACAG CTGTGAATGGCCTGTACTTGGACAAACTGGAGTTCTGAG TTTAGGATCCAGATGGATTAGGAGTGAGTCCCAAGCAGG ACTTGCTTACCCACTTCAGGGACCAGCTTCCTTCCAAAT AGACACAGGAGAGTGTCTCTCTTCCCTGTCACCCATAGC CTGACTAGGGAGAGTGAGTGGCAAACCCAAATTTGCATA
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TTTCATTCCAGCTGAGACTAAAGCCTTGACCTCAGGCAT GGAGGACTGTAACCACTGAGAACTAATATGATAACATTG TTATCTTACGAGAATTCTCCTGTATGCAGAGTAGGTCCAT ATGGTTTTCTGGATTCATTGCACAGATGAATTCGAACCTG ACATCCCACAGGGAGAGAGATGTGTGAGCTCCAGACAG AAGGCTGTGTAGTGTGGGCACTGTGCCAGGACCACCAG CATAATTTCTCCTAAGACACACCTGTCTAGAAAGTTAGAG CCATAAGACAACCTTGGCCCTGGGCCATGTCACTGCTCA TATCTGGCCCCAGCTTTGTGTGCCTAGAGGAGTATTCTT GCCTCTTTGGAAAAATTGGAGGGAGCCGGATTAACCTAC TGCAGGTGCTAGGGGTGGGTGGCAAAGCTGTGATAGGT GTTGGTAGTGTTGTAGCTGGCAAAGCTGATCTCCTGTCT
GTTGCAGCCTTCACC SynP151 74 (ProC29) CTTACCGATTGCAGACGAAACCGAAACTTAGCTGACATC PCT/IB2019/0590 GAGTCGAAACCGAAACTTTTCATGGCCGAAGGCGAAACC 92 GAAACTTGCGTCCGTGTAACGCGAAACCGAAACTTCCCG
AGCATCCTTACGAAACCGAAACTGCAACCGGCTACACTC GAAACCGAAACTACTAATGATACCAACCGAAACCGAAAC TCGGTAAGTGAAACTGCGAAACCGAAACTTGGTGGACAG CCTTCCGAAACCGAAACTGGACGATGTTCGTTCCGAAAC CGAAACTATATTCGTGCCCAAGCGAAACCGAAACTAGGG GGCCGATATCCCGAAACCGAAACTACAGGCCCCGCCCG TCGAAACCGAAACTTACGTCTCAGGAAGTCGAAACCGAA ACTGGCTACCACTGACCACGAAACCGAAACTTCTACTGT TCCGTGACGAAACCGAAACTGACGGACAAGAGTACCGA AACCGAAACTTAGTCAGGCGTCCATCGAAACCGAAACTC AAAGATTCAAAAAACGAAACCGAAACTTTCTGTTGGGAT GTCCGAAACCGAAACTGCTCGAGATCTGCGATCTGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGC CCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTC CGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGC CGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT
GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA SynP194 75 (ProB15) GCCCCTGCCTGCGCGAGGGCGGGAAGACAGCCCCCGG PCT/IB2019/0590 GCCCTCCTCCTCCCTCTGCCTTTTTAAGGGACGCCCTCC 93 AGGGCGACCCCGGAGGGCGGACTTGCCAAGCTGAAGA
GAATCAGTCAAAAATCCGCCCACAGGGGACACATCATTT AAATAAATGTGTTTCTTTGCCCGAACAGAAGTTCAGATAG GCTCGATTATCATTAATTCTGGGTTTCACGTAACGAGAG GAAACACAGGTTGCAATAAAAATAAAAAAATGGTTTGAAA TCAATTTTAACTCATTTTGAACGTCCTCACACGTTTGACA AACCGATTTGTTTCAGGAGACTTGCTAATATCTAAATCGG TGACAGGGTGTTTGCTGTGAGTGTGGCTCTGGAAAAGTT ATTAAGCGTTATAAAAAAAATGATGTAATGAAATTCTAATT AATGGGAGGGAAGTGCCAACAAATCACTCCTTAAAATAT TAACGCTATCAAAGAACAGCTGGAGAAGGAGGAAACTTG ACCCTTGGGGGGGAAAAGAACCCCGAGCACCCTCTGAA TAAGTCAAATAGACAAGGGCTCTAAATGAGGAAATTAATT ATTATTTTCCAAGTTGCACCATTGGCAGGGCACACTCTC
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
CGTAGGCAAACAACAAAAACCTCTCTCACTCACACAAAA GCCCACCTTGCAAATGAATGGAATATTAATGATTAGGAAT TTGGGGGCGGGCCCTGGCCTGGCGAGCTGGTGATCCTT GCAAAACAACAACTCCCTGGTACCCAGATGCACGCTGCC AATGCTCCAGGGAAGATAACCCAGTGGAAAGAAGGAAG AGACTGCAGAAATAACTTCTGGGGCATCGCTAACTTATT CAGCAGGTCTACTTTATGGGTTTAATGAGAAACCCAGGC CAAAGAAGTCCCCAGATGGATAAACTGATCTTTTATTCTG AAAGAGTTAAGGCTTTGCCAGCTCTGCTTAACTGCTTTG CCAGTTTGGTTGAATCCAAAGTGTATTAAAGCGGCCGAA TTCTAAATCTTTCAAAGGTGGGATTTATAAGGGAAGTGCT AACACGACCTCAACCATGCCAGGCTGCCAGGAATTATAC TGGGACCAAGAGCATGCTTTTCCACATTAGAGCCAGAGA TTGTGCAACTGTCAAACAATGCGGGGCGCTGGAGGAGG CGGTCAGGCTGAGGACCAGTGATCTCCCAGCCCCCTCT GTTTGGAACAGGGAATTTTGGACATGCAAAAACACACCT TGTTTTAAACGCAGAGGGCACTCTAAGATCAAGGCTGAA ATTCCCCCTTCCCTCCTTAAGAAGATAAATCACCTGACTT CCTCAAAAGCTCTGAAACACACCCTTTGGCCTCACCTTG GCAGCCAAGCCAGTCCAAGTTGGAGCCGGAGCTGGTAG GGTTATCTGTGTCAGGTTCAGATCTATTCAGGGGAATAG TTCTAGACCCTGACGCAGGCAGGCTGAGGCCCTCTGGG AACCCCACTCCAGCTACTGGCGACTGTGCCTTTAAATTG CTGCTTTCAGAGGGTGCATCTAGGGGGATGTGGGAGGG AGAGAAACATCTTTCTACTGGTCTCTTTCCTCCCTCCCCT CCAGGACTTCCAGGGTTTGGAGAGTGATTGCTACCCAAA GAGAATCAGCAGCCCAAGCTCCTCCCGAGTTGGAGGCT
GGACCTAACACCCTTGACTCCAGGCTAAAA SynP5 (ProA9) 76 PCT/IB2020/0505 GCTGATGTGTCTTACTGATGATGCATCTTTCAGGTGTGT 38 GCTGGTGGCCGGAGGATGCTGTGAGTAGCCTAAGGTTG
ATACTCAGATGGTACAGCCACCGCAGGCTGCTGCTACCA TAGACTTCCAACAGCACTGGACTTCCCCTTTTGTGTCTTT GTTTTTTCTGGGTGCAGCTTGGTAGCTCCTGTCTTCCAC AGACCTTTGTCTAGAGCCTATGTACAGCCTCAGAGGGTC CTTCACTGAAGCCGAGCTTGCAGCCCCCCCTCCCATGC CTCAGAGACCCTTCAGGGCTAAACCTGTGCCTTGTTCCC ATCTGCCTCTAAGGCCTATAGAAGCATACAGCACACCCT CTGTCCACAGTGCATCCATGTTTAGAAAGCCAGAAGGAA CAGTTAGAAACTTAGAAGCCATCTATTTTTGTCCCCTTAA TTTCAGGGGATGGAAAGTGGGGCCTTGAGGTGAAGTGA GTTGCCTAAGGTCTCCCAACTAGATAGGTTTCTCTCAGC TTGCTGGCCAGCACTTGTACTGCGAGGGTGATAGCTGTA GAGTTTAGCTTTGCCTGAAGCATATTCAGGCAGAGGCCA GTCAGCCAACCTGCCCTTGGGGAAGGGCTTTTGGGGGT CAGGGAGGGACATGTTTCTGGAAACTTCCACAGGAGCC TGACCAGTTCAGACCCTACTCAACTCAGGAAATCCCTTC CCAACTCCTGGTTCCCAAGACTCTACCTTTAGCTAGCAG CTGCTCTGACCCTTCCGACCTTCTAATGTTCCCAGAGCT GCTCTGACTGCATTTCATTTGCCTGTCGGAGGCATGGCC TGCCTTGCTGGTTATGCTCTGCTGGCCTTTCCAGAGGGC CTCCCGAATCTGCTTTGCCCCAGGCAAGGCTACCCCTTC
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
CCTCTTAGAGCCATTCTGCCTCTTCATTCCACCCAACCA GCAGATGATCTCTGGATAATTTATGCAGCAAATCCTCTTT AATCTTTAATCTGGGGTCTTGAACAAAAGGAACCTGCCG CTAACCTGTGTCTTTTTCACAGCTTGAGTGGAGGTGGGG AATGTCTGACATTTCCCTCATAGGAGGTGTAGTGTGGGT ATGAGCAATGAGTAACTTGGATGTTCAGTCAGCTCACTC CCCTAAATCCTTGTTGAATCTCCGGGAGGTAACTCCAAC TCTTGCCACAACTCACCCTCCCAGCAGTCTCTCTTCCAG GGATGCCAGGTGGGCAGGTTTATTTTTCTGTGAGAACTG ACTCGAGTTCCTACGGTGCAACACTGCCTGGAGAGACTA TTTTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAGTTGCCCGGTGCA GCCCTGGGCTTCAGGAGAAGCTCACGCAGGCACCGGTT GTGGCTGCAGAGGTACAGGCCCCGCCCCAGGCCCGAC TAGCCCCGCCCCACCCTGCCACCAGCGGACCGCACTCT TGCAAGGCTAGTGGGGGCCCCCGCGGTGCAAAGAGGT CGGTGCGCAGCTCGCATCACGGGTGACTGGGGCGCTGT CCAGGAGGAGCTGGCCCGGCTCGGGCTGCAACCATGG TAAGGAGAGAGGACAGCCAGAAACGCAGGGCCTGCCAC TCCGGGGCTGCTCCGAGGGGACACTCGGCGCTGCAGC TCTGGCTGGGCAGGGCGGGAGGTACTGTCCCCGGCTC CGGGTTCCGAAATGCACTGCTGGCGCTAGGCGCGCCGC GTTGCCGTTCTCAAGTTATTCTTTCTGAGCAGAGCTGCTT TGAGCGGGCCGAGACCCCCAGGGTGCTGCCCAAGGTCT TGGAGGAAGGACTAGGTCAGTTTTGTGGGAGGTGCCTG CTGGTAGCCTCTCGTGATGGAGATAAGGATGGTAGGGG GTCCCCGCCCCGTGCCCGAATAAGCTGTGTTACCTGGA TGGCCCTTCCTCACCTACCTGGGGTACAGAGACCAGCA CCAACTTCCTTTGGAAAACACAGAGGAAATCCGTAAACA
CAGCCAGCCTCACTAGAAGGGATGATGACAGA SynP35 (ProC8) 77 PCT/IB2020/0505 CGAATCCGCGATAGCACCGCCTGAGGGGATTGAGGACT 39 CCGTCAGACCGCCTGAGGGGATGGAAGAAAGATAATCA
CCGCCTGAGGGGATGGCTCGGTTTTGCACACCGCCTGA GGGGATACGAAATTCTATCGCACCGCCTGAGGGGATAA GCTCGTTCCTATGACCGCCTGAGGGGATAATCTCCTCAA TACGACCGCCTGAGGGGATTATAGAATGCATTCAACCGC CTGAGGGGATGAACTACCGGTTTTCACCGCCTGAGGGG ATTGAGCTCCCACGGCTACCGCCTGAGGGGATAAGGCC AGAACTGTCACCGCCTGAGGGGATTCTGACTAATTCGGG ACCGCCTGAGGGGATAGTTTCGGTCTGGATACCGCCTG AGGGGATAACCTCTCCGCGGTGACCGCCTGAGGGGATG CGCCATGGCGGTTAACCGCCTGAGGGGATATTCCGCCT TCTACAACCGCCTGAGGGGATAAAGAGCGAGCCGAGAC CGCCTGAGGGGATCATCCACGGGTCTCTACCGCCTGAG GGGATTCCCCTACGAGTTGGACCGCCTGAGGGGATTCT AACTCAGTGGCAACCGCCTGAGGGGATGCTCGAGATCT GCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGC CCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTT CCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTAT TTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCT TTTGCAAA
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA SynP66 (ProA21) 78 PCT/IB2020/0505 AAGGAATCCCAAGTTTTAAAAATTCGTAGAGAAGCCAAG 40 AGGTGGCGCCAGGCGAGACGCACTTCCTGGGAGGCTG
AAAGTCGGTCGTAGATGCTGCAGGGGAGCTCTGTCCTG ATAGGGGTTATTCTATCCAAACCTCCTCTTTCCTACCTTG TGAAATATGTGTCAATTCTCCTTTCACCCCCACCCCACCC CCCTCTTAACTTTCCGGACACCAAAGAAATCTTAACTTGT ATTCACATCTTTTATTCTTCCTAGATGGGACTGGATGAGG CTTTGGAAGAACTTTAAGACGGAAACTTTTTTTTAGGGGA TGAAGTATTCGCAAAGCGATAAAACGTTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTAAATAT ATATATATATTTTTAAAAAGTCCTTACTCTGAAGCTCAGTC GTGGGACAGAAAAGCACTCTGAGCTCCTGTCTCCGCAG GAGTGATGACCTGGCACATGCATTATTCTGTTCATTTGG CTTTTATCCCGTGCCCTTGTTTGGCTTCTGCTCCTTTGTT TTGGCTATTTATTGCTACTTGATAGGAGTAAGGAGGGCA GAAAGACCTCACAGAGGTTATGGAGGAGAGATTTCACCA TCTAGCTTGAAATTATCTGTGGTCTTCACACTCACTAATG AGGGACTTAGGATGTACATTCCGATCGGGATTTCTAGTC CCGTGGGGGAGCGCACACCAGCCACATTCCTGAGACGC CACGCAGCCTCCATGCTCCACTAGCAAACTCAGTTCCAC CACAGCAAGTTTCACTTGATCCCACAGGACCTGCCTGGA CCCTTTGTTGGGTGGGCGGGAAGCCCCTGGACCCCTCA CCCACCTGGTCACATGGCCTTTCTATGGCCCCTCCCCTC TCTTTCTTTGGAGTCCGCCTTTTTCTCATGGTGACAGTAA TTGTTTCTACAGTCACCCATCACTCCTCCTGCCCGGCCT CTCTGCTAGGGGTCAGTGTCCTCTTCAGTGACAAAAGGC GCCCTAGATCTGGGCTCCCTGGGGAGGGAGGTGGCTG GATCTGGTAGTTAGAATGCTGTCTCTCCCTGGTGCTGCG ACAACCCCTCCCCCGCTGTGCACACAAATGGGCTTTATC CGGCAAACAAAACCGCACCCCCACCCCAGGCTACACAG GCACGTGGACCTAAGCCTCACCAAGGGAAGGGGGTGGT GACAGGCGCCAGAGAAAGACGAGGCAGAAGACAAATAT TCTCCTCGCCCCACTTCTTGCTCTCCACAATCCAGATTTT AAAGTTTGACTTTCCACTCCCCACCTGCTCCCTGAGCCT CCAACTTCTGTTCTCCTATCTCCCGAATCTGAATTCTTTC TGGTTCCAACCAGCTCAACTTCTCTTGGTTTCAGAAACA GGTTCCCCACCAGCAGTCCCATACCACCCAGGGATGTG CTCCTCAGGCAGGGGAATGAGAACACGGTGTCCTGGGA GGGAGAGGTGCGAAACCCCCCTTCCCTGACCGAGAGTT CCAGGGGACACCCGTACGAGCGGCAGTGTAAATAGCAA AGGAAGAGCTCACTCCAGGGTCCTGAGCCAAGGCCAGG GCGCTGGGCTCTGCTGGGCCATCCTGCATGCCTAATCC GCTATTTAAGGAGCTGCTCGGCTGCAGCCCAGGCACCA CCCCCCTCCTCACGTACACCGGTTTCGAGCCACCTTAAA AGCGGGAGGCAACTGTGAAGTTGCTGGCCAGTAAGTGG TGTGGAGATTACGAAGGGACATACGGAGAGGGCAGAGA GAGGAAGAGAGAGAAAGTGAGAGAGGAAGAAATTTATC CTGGGATCCAGAAGTTCGTGTTAACCTGTGGAAAATCAA GTCCCTGGAAGTCTGCAGAGACAGAGACAAGAAGAAAA GAGATAGAACGCCAGAAACTCCTCTCTCTCCCTCCCTCT CCACCTCTCTCTTCTAAACCCCAAATTCCTGGTCCCTTGT
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
ACCCCATTGTGGGGATAAT SynP166 79 (ProA36) GGGAATACGTATGTAGTTCCTGGGGATGCCTTGAAAAAG PCT/IB2020/0505 AGAAATCCCAGTGTGTAAGGTCAGTATTGTATGGAGTAC 41 CAGGTAATAGGGTGGCATCAGAAGGAAGGGGTGGGGTT
TGCTTTCTAAAACTTACTATACACCCCAACAGTCCTCTAG TCTCTAAGGAAATGGCAGGGGCAGCTATGAATAACACAT AAACACAACACCAAAATGTATCTAAAATTACAACCCCTGA GACTACACTCAAATGACACATTCACCATTGCCAATGTGA CAGGCCTCTCTGTCTCTTGCCACCTGCCTGGTCTGCCTG CTCACTCCTCCTAGGCAGCTTTATTCTACCTTTGTTACTT AGGAACAATAACACCAGGGCTTAACTTATAATAGAGACT CACAACGGACCCAGGTCCCCATGACCCAGTCTTGCCTT GAACACACCATAAGTAAACATGTATAGAGCGCATCCAAC ACACTGAACTTTGTAACTCAGGCTTACCCACCTCTGTCC GCTCAGAACACTCACGTTGGACAAAATCCCGGAGAAATA ATCTCCTGTGGTTGTATAAGGCATGTTGTGGTACTGTGG TAAAGTCAAAACATTTAAACTGTGGTAGATTCAAAACATT TAGGTGAGCCTATAGTGAGTCTGGAGCCGTGTTTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAATGAATGTATA TATGTGTATCTGTGTGTGCATGATGTAAATGTGTGTATGT AAATGTGTGTATATGTGTATATGTATGAATTTGTATGTAC ATGTGTATATGTGTGTATATGTGCATATGTATGTGTCAGT GTCTGTGTGTGCATGTATATGTGTGTATGTATATGTGAGT GTCTGTGTGAATGTACATGTGTATCTGTGTGCATGTAAAT GTTTATATGTAAATGTGTGAATGTGTGTGTGTGTATATGT GTATATGTATGAATATATGTGTATGTACATGTGTGTGCAT GTGTCTGTATGAATATGTGTTTATATGTGCATATGTATGT GTATGTTTCTGTGTGTGCATGTATATGTGTGTACATCTAT GAATATGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTCTGTGTGTCTGTG TGTGTCTGTGTGTGAATGTATATATATGTGTCTCTGTGTG TATGTAAATGTGTGTATGTGTGTATATGTGCATATGTATG AATGTGTGTATATGTGTGTATGAATAGGTGTATGTGTGTG AATGTGTCTGTGTGGGCATATATATGTATGTATGAATGTA TGTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATATATATTGTGTGTCTGTGTCTGTGTGTGCACGTGTGT GTGTGTGTGCACATGTGTGTGCACGTGTGTGTTCAGCAC CTTTTCCAGCCAGTTTGAGCTATTTTGTACTGTTCTGGCA GTGGAGATAACAACCCACAGAACACAATCTTTCCCTATC TGGCACTTCCATTCTGGCAGACAGTTTGGGGTTTCCCAG CAGCGGTGAGGAAGGAGCCATCAGAGAGTGATGGATAA AAGGTCTTGCTGAGAAGGTGAAGTGTCTAGGCCCAAATG TGACTGGGGGAGGATTAGAAAAACTCCCATGCAGTGTAG GTTAAGTGGTAGGGCTGCCTTTAGACCCTAAGCTCCCAA ACTCCTGCACTATAAGGTCCCATGGGTGCCCCTCAGATG GGGAAGACAAACAGCAAGCAGTGTGGCTCTTCGGGGGC TTAAATGCCGAGGATGCTTGGTTCAAGGGTCCCTCCTTG TTCCTTTCTTCTCAACAAGCACAGGAAAGGTAAGTGGCT GCTCTTGGCTCTTTATTTTAATCTCAGAAGGGTGCCCCTC CTCCCTCCAAGGACTGGGCAGACCTGGCCGCAAATCCC CCCTAATCCATCAGCACCTGGGTCTCCACCCCATAGCAG CACACAGCCTTGTTAGCCAGGCGACCACACTTGTCCCTC
Promotor & Ref. SEQ ID NO & SEQUÊNCIA
CCGCCCCCCGCGGCGCCTACTCTCCCTCACC Dalkara 80 WO 2017/093566 CACCCACAAGCCAGTTCCTGTCCCTGAGGACTTGGCTCA
GGGACTCTGGGAATGTGGTAGACATGGGGTGGCCCCAC CAAATGCATCCTTATGGGAACCTGCTCCCTGGGAGCCAT GAAAAGAGCGTGGACTTCGAGGTGGGGCCACAGGAAGT GGTCAGGTCCATCTCAGGGGACCTGCTGCCCATCCACA CTGCTGGCCAGGAAATGGGGGGCAATTCATGCCTCCTC AGCACCTTCAGCACTGGGCGGCTCAAAGAAGGCAAGGG ACTATTCTGGGGTCACACAGCATGCAGCCAGAGGCCAA GGCATGAGGAAGTCCTTCATTTCCCCACCCCCACCCACC TCAGATCCTCCAACCGGTTTCATGGCAGCCCAGGGTCCA GCGGCATCCAGGATGCTGGTGGGTAGCTGCACAGCCCA GGCCGCGGGAGGTTGGCTGCTCTCACCTAACAGGCCTA TGTGGCCCTGACCCCTACCTAGGAAGCTGGGGACAATG GCCAAGGCGCCTCCCCTCTCTGTGCCTGTCTGTCCAGG TGCAGCATAGACACAGCACCCCTGGGGCCAAGAGCACC CAGCCAGGGCTGCCCCCATGGGTGGGCAGGGCAGTAA ATGAATGAGGGACAGGTTGGGAGGTGGCCAGCCCCCTC CAGCCCATGGA GGGCACGGGGCAGGAGAGCTGGGCTGAGCCAGCAGGA GCCCAGGGAGCCTGGTCTCTGCCTTCCTATCCTGGAGG AAGGTGAGGCTGAACCTCCTTCCCTCCCTCCCTCCCTCC CCGCCCCCACTGCACGCAGGGCTGGCTGGGCTCCAGCT GGCCTCCGCATCAATATTTCATCGGCGTCAATAGGAGGC ATCGGGGACAGCCGCTGCGGCAGCACTCG AGCCAGCTCAAGCCCGCAGCTCGCAGGGAGATCCAGCT CCGTCCTGCCTGCAGCAGCACAACCCTGCACACCC
[0067] Cada uma das referências acima está incorporada a título de referência em sua totalidade.
[0068] Em uma modalidade, um genoma de vetor AAV compreende um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, em que o promotor compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 55-80. O promotor pode alvejar a expressão de CYP4V2 em células da retina, por exemplo, células da retina de primata não humano ou humanas.
[0069] Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, pode compreender uma sequência de íntrons. Por exemplo, o íntron pode ser um íntron de hormônio do crescimento humano (hGH), íntron de Vírus Símio 40 (SV40) ou um íntron de beta gobina humana, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:9, 10 ou 11, respectivamente.
[0070] Em uma modalidade, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, por exemplo, sequência de codificação de CYP4V2 humana. A sequência de codificação de CYP4V2 pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49. Em uma modalidade específica, o genoma de vetor compreende uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:14.
[0071] Além disso, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, pode incluir um elemento regulador ligado de maneira funcional ao gene CYP4V2 heterólogo. O elemento regulador pode incluir sequências de iniciação, terminação e intensificadoras de transcrição adequadas, sinais de processamento de RNA eficientes como sinais de splicing; sequências que estabilizam mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência de tradução; sequências que aumentam a estabilidade de proteína; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências reguladoras é conhecido na técnica e pode ser usado. As sequências de elementos reguladores da invenção incluem aquelas descritas na Tabela 2, por exemplo, elemento regulador do vírus da hepatite B (HPRE) e elemento regulador do vírus da hepatite da marmota (WPRE), que podem ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:16 e 17, respectivamente.
[0072] Em uma modalidade, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende uma sequência de sinais de poliA. As sequências de sinais de poliA da invenção incluem aquelas descritas na Tabela 2, por exemplo, sequência de sinais de poliA do Hormônio do Crescimento Bovino (bGH) e sequência de sinais de poliA do Vírus Símio 40 (SV40), que podem ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:18 e 19, respectivamente. Em uma modalidade específica, o genoma de vetor compreende uma sequência de sinais de poliA bGH, que pode ter uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:18.
[0073] Portanto, em um aspecto, a invenção se refere a um genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, que compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (iv) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19) e (v) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor
(por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) um íntron (por exemplo, SEQ ID NO:9, 10 ou 11), (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (v) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19) e (vi) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (iv) um elemento regulador (por exemplo, SEQ ID NO:16 ou 17), (v) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19) e (vi) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) um íntron (por exemplo, SEQ ID NO:9, 10 ou 11), (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (v) um elemento regulador (por exemplo, SEQ ID NO:15 ou 17), (vi) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19) e (vii) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22).
[0074] Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, pode compreender adicionalmente uma sequência de polinucleotídeos de preenchimento. A sequência de polinucleotídeos de preenchimento pode estar situada na sequência de vetores em qualquer posição desejada de modo que a mesma não impeça uma função ou atividade do vetor. Em um aspecto, a sequência de polinucleotídeos de preenchimento está posicionada entre a sequência de sinais de poliA e a ITR 3’. Tipicamente, uma sequência de polinucleotídeos de preenchimento é inerte ou inócua e não tem função ou atividade. Em vários aspectos específicos, a sequência de polinucleotídeos de preenchimento não é uma sequência de polinucleotídeos bacteriana; a sequência de polinucleotídeos de preenchimento não é uma sequência que codifica uma proteína ou peptídeo; e a sequência de polinucleotídeos de preenchimento é diferente de uma sequência de ITR, o promotor, a sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 e a sequência de sinais de poliA. Em algumas modalidades, a sequência de preenchimento pode ser uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:20 ou 21. Em vários aspectos adicionais, uma sequência de polinucleotídeos de preenchimento tem entre cerca de 1- 10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500 ou 2500-3000 nucleotídeos de comprimento.
[0075] Portanto, em certas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (iv) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19), (v) uma sequência de preenchimento (por exemplo, SEQ ID NO:20 ou 21) e (vi) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i)
uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) um íntron (por exemplo, SEQ ID NO:9, 10 ou 11), (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (v) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19), (vi) uma sequência de preenchimento (por exemplo, SEQ ID NO:20 ou 21) e (vii) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (iv) um elemento regulador (por exemplo, SEQ ID NO:16 ou 17), (v) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19), (vi) uma sequência de preenchimento (por exemplo, SEQ ID NO:20 ou 21) e (vii) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22). Em certos aspectos da invenção, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’ (por exemplo, SEQ ID NO:1), (ii) um promotor (por exemplo, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8), (iii) um íntron (por exemplo, SEQ ID NO:9, 10 ou 11), (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, SEQ ID NO:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49), (v) um elemento regulador (por exemplo, SEQ ID NO:16 ou 17), (vi) uma sequência de sinais de poliA (por exemplo, SEQ ID NO:18 ou 19), (vii) uma sequência de preenchimento (por exemplo, SEQ ID NO:20 ou 21) e (viii) uma ITR 3’ (por exemplo, SEQ ID NO:22).
[0076] Em algumas modalidades, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, pode também compreender uma sequência de Kozak. A sequência de Kozak é uma sequência que ocorre em mRNA eucariótico e tem a sequência consenso (gcc)gccRccAUGG (SEQ ID NO: 81) e exerce uma função na iniciação do processo de tradução. A sequência de Kozak pode ser posicionada imediatamente a montante da sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende a sequência de codificação de CYP4V2. Em algumas modalidades, a sequência de Kozak é GCCACC (SEQ ID NO:12). Alternativamente, o genoma de vetor, por exemplo, genoma de vetor de fita simples, compreende uma sequência de Kozak de GCCGCC (SEQ ID NO:51), GACACC (SEQ ID NO:52) ou GCCACG (SEQ ID NO:53).
[0077] Em certos aspectos da invenção, o vetor viral compreende um capsídeo AAV8 que compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:24, 25 e 26, respectivamente, codificadas, por exemplo, por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:23 e um genoma de vetor que compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22;
viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22;
xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22;
lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22;
xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[0078] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas modalidades, o capsídeo AAV8 pode compreender subcombinações de proteínas capsidiais VP1, VP2 e/ou VP3.
[0079] É também contemplado que o vetor viral da invenção pode compreender um capsídeo AAV9 que compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:28, 29 e 30, respectivamente, codificadas, por exemplo, por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96
%, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:27 e um genoma de vetor que compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22;
xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22;
lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22;
lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[0080] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas modalidades, o capsídeo AAV9 pode compreender subcombinações de proteínas capsidiais VP1, VP2 e/ou VP3.
[0081] Em certos aspectos da invenção, o vetor viral compreende um capsídeo AAV2 que compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:32, 33 e 34, respectivamente, codificadas, por exemplo, por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:31 e um genoma de vetor que compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22;
xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22;
xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22;
lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22;
civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[0082] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas modalidades, o capsídeo AAV2 pode compreender subcombinações de proteínas capsidiais VP1, VP2 e/ou VP3.
[0083] Em certos aspectos da invenção, o vetor viral compreende um capsídeo AAV5 que compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:36, 37 e 38, respectivamente, codificadas, por exemplo, por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO:35 e um genoma de vetor que compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22;
ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22;
xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22;
lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22;
xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[0084] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas modalidades, o capsídeo AAV5 pode compreender subcombinações de proteínas capsidiais VP1, VP2 e/ou VP3.
[0085] Os métodos para gerar vetores virais são bem conhecidos na técnica e poderiam permitir que o versado na técnica gere os vetores virais da invenção (consultar, por exemplo, a Patente US nº 7.465.583), incluindo os vetores virais descritos na Tabela 4. Em geral, os métodos de produzir vetores rAAV são aplicáveis para produzir os vetores virais da invenção; a principal diferença entre os métodos é a estrutura dos elementos genéticos que serão empacotados. Para produzir um vetor viral de acordo com a presente invenção, as sequências dos elementos genéticos descritos na Tabela 2 podem ser usadas para produzir um genoma viral encapsidado.
[0086] Os elementos genéticos, conforme descrito na Tabela 2, estão no contexto de um plasmídeo circular ou um genoma viral, por exemplo, um genoma viral de fita simples ou autocomplementar, porém um versado na técnica entenderá que um substrato de DNA pode ser fornecido em qualquer forma conhecida na técnica, incluindo, porém sem limitação, um plasmídeo, vetor de DNA nu, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um vetor viral (por exemplo, adenovírus, herpesvírus, Vírus Epstein-Barr, AAV, vetores baculovirais, retrovirais e similares). Alternativamente, os elementos genéticos na Tabela 2 necessários para produzir os vetores virais descritos no presente documento podem ser incorporados de maneira estável no genoma de uma célula empacotadora.
[0087] As partículas de vetor viral de acordo com a invenção podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, introduzindo-se as sequências que serão replicadas e empacotadas em uma célula permissiva ou empacotadora, como esses termos são entendidos na técnica (por exemplo, uma célula "permissiva" pode ser infectada ou transduzida pelo vírus; uma célula "empacotadora" é uma célula transformada de maneira estável que fornece funções auxiliares).
[0088] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir um vetor viral CYP4V2, em que o método compreende fornecer uma célula permissiva para replicação de parvovírus: (a) uma sequência de nucleotídeos contendo os elementos genéticos para produzir um genoma de vetor da invenção (conforme descrito em detalhe abaixo e na Tabela 2); (b) sequências de nucleotídeos suficientes para a replicação da sequência de genoma de vetor em (a) para produzir um genoma de vetor; (c) sequência de nucleotídeos suficientes para empacotar o genoma de vetor em um capsídeo de parvovírus, sob condições suficientes para vetores virais que compreendem o genoma de vetor encapsidado dentro do capsídeo de parvovírus que será produzido na célula. De preferência, as sequências de replicação de parvovírus e/ou codificação de capsídeo são sequências de AAV.
[0089] Qualquer método de introduzir a sequência de nucleotídeos portadora dos cassetes de gene descrita a seguir em um hospedeiro celular para replicação e empacotamento pode ser empregado, incluindo, porém sem limitação, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, precipitação de polímero de polietilenimina linear, microinjeção, lipossomas catiônicos ou aniônicos e lipossomas em combinação com um sinal de localização nuclear.
[0090] Os vetores virais descritos no presente documento podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, transfecção tripla ou produção de vírus mediada por baculovírus. Qualquer célula permissiva ou empacotadora adequada conhecida na técnica pode ser empregada para produzir os vetores. Células de mamíferos são preferenciais. São preferenciais, também, linhagens celulares empacotadoras trans-complementares que fornecem funções deletadas de um vírus auxiliar com replicação imperfeita, por exemplo, células 293 ou outras células trans- complementares E1a. São preferenciais, também, células de mamíferos ou linhagens celulares que são defeituosas para reparo de DNA conforme conhecido na técnica, visto que essas linhagens celulares serão prejudicadas em sua capacidade de corrigir as mutações introduzidas nos plasmídeos descritos no presente documento.
[0091] O cassete de gene pode conter alguns ou todos dentre os genes cap e rep de parvovírus (por exemplo, AAV). De preferência, entretanto, algumas ou todas as funções de cap e rep são fornecidas em trans introduzindo-se um vetor (ou vetores) de empacotamento que codifica as proteínas capsidiais e/ou Rep na célula. Com a máxima preferência, o cassete de gene não codifica as proteínas capsidiais ou Rep. Alternativamente, uma linhagem de células empacotadoras que é transformada de maneira estável para expressar os genes cap e/ou rep (consultar, por exemplo, Gao et al., Hum Gene Ther 9:2353-2362, 1998; Inoue et al., J Virol 72:7024-7031, 1998; Patente US nº 5.837.484; documento nº WO 98/27207; Patente US nº 5.658.785; documento nº WO 96/17947).
[0092] Além disso, as funções de vírus auxiliar são, de preferência, fornecidas para o vetor viral propagar novas partículas virais. Tanto o adenovírus quanto o vírus herpes simplex podem servir como vírus auxiliares para AAV. Consultar, por exemplo, Bernard N. Fields et al., VIROLOGY, volume 2, capítulo 69 (3a ed., Lippincott-Raven Publishers). Os vírus auxiliares exemplificativos incluem, porém sem limitação, Herpes simplex (HSV), varicela zóster, citomegalovírus e vírus Epstein-Barr. A multiplicidade de infecção (MOI) e a duração da infecção dependerão do tipo de vírus usado e da linhagem celular empacotadora empregada. Qualquer vetor auxiliar adequado pode ser empregado. De preferência, o vetor auxiliar é um plasmídeo, por exemplo, conforme descrito por Xiao et al., J Virol 72:2224, 1998. O vetor pode ser introduzido na célula empacotadora por qualquer método adequado conhecido na técnica, conforme descrito acima.
[0093] Os estoques de vetores livres de vírus auxiliar contaminantes podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o vírus recombinante de fita simples ou autocomplementar e o vírus auxiliar podem ser facilmente diferenciados com base no tamanho. Os vírus podem também ser separados do vírus auxiliar com base na afinidade por um substrato de heparina (Zolotukhin et al., Gene Ther 6:973-985, 1999). De preferência, vírus auxiliares com replicação imperfeita deletados são usados de modo que qualquer vírus auxiliar contaminante não seja competente para replicação. Como uma alternativa adicional, um auxiliar de adenovírus desprovido de expressão gênica tardia pode ser empregado, como apenas a expressão gênica inicial de adenovírus é necessária para mediar o empacotamento do vírus duplexado. Mutantes de adenovírus defeituosos para expressão gênica tardia são conhecidos na técnica (por exemplo, mutantes de adenovírus ts100K e ts149).
[0094] Um método para fornecer funções auxiliares emprega um miniplasmídeo de adenovírus não infeccioso portador de todos os genes auxiliares necessários para a produção eficiente de AAV (Ferrari et al., Nat Med 3:1295-1297, 1997; Xiao et al., J Virol 72:2224-2232, 1998). Os títulos de rAAV obtidos com miniplasmídeos de adenovírus são quarenta vezes maiores do que aqueles obtidos com métodos convencionais de infecção por adenovírus do tipo selvagem (Xiao et al., J Virol 72:2224-2232, 1998). Essa abordagem evita a necessidade de realizar cotransfecções com adenovírus (Hölscher et al., J Virol 68:7169- 7177, 1994; Clark et al., Hum Gene Ther 6:1329-1341, 1995; Trempe e Yang, (1993), em, Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, FL).
[0095] Outros métodos de produção de estoques de rAAV foram descritos, incluindo, porém sem limitação, métodos que dividem os genes rep e cap em cassetes de expressão separados para impedir a geração de AAV competente para replicação (consultar, por exemplo, Allen et al., J Virol 71:6816-6822, 1997), métodos que empregam linhagens celulares empacotadoras (consultar, por exemplo, Gao et al.,
Hum Gene Ther 9:2353-2362, 1998; Inoue et al., J Virol 72:7024-7031, 1998; Patente US nº 5.837.484; documento n° WO 98/27207; Patente US nº 5.658.785; documento n° WO 96/17947), e outros sistemas isentos de vírus auxiliar (consultar, por exemplo, Patente US nº
5.945.335).
[0096] O herpesvírus pode também ser usado como um vírus auxiliar nos métodos de empacotamento de AAV. Os herpesvírus híbridos que codificam a proteína (ou proteínas) Rep de AAV podem facilitar vantajosamente esquemas de produção de vetor AAV mais escalonáveis. Um vetor híbrido de vírus herpes simplex tipo I (HSV-1) que expressa os genes rep e cap de AAV-2 foi descrito (Conway et al., Gene Ther 6:986-993, 1999, e documento nº WO 00/17377).
[0097] Em suma, o cassete de gene que será replicado e empacotado, genes cap de parvovírus, genes rep de parvovírus adequados, e (de preferência) funções auxiliares são fornecidas a uma célula (por exemplo, uma célula permissiva ou empacotadora) para produzir partículas de rAAV portadoras do genoma de vetor. A expressão combinada dos genes rep e cap codificados pelo cassete de gene e/ou o vetor (ou vetores) empacotador e/ou a célula empacotadora transformada de maneira estável resulta na produção de uma partícula de vetor viral na qual um capsídeo de vetor viral empacota um genoma de vetor viral de acordo com a invenção. Os vetores virais de fita simples podem se reunir dentro da célula e podem, então, ser recuperados por qualquer método conhecido pelos versados na técnica e descrito nos exemplos. Por exemplo, os vetores virais podem ser purificados por métodos padrão de centrifugação de CsCl (Grieger et al., Nat Protoc 1:1412-1428, 2006), métodos de centrifugação de iodixanol, ou por vários métodos de cromatografia em coluna conhecidos pelo versado na técnica (consultar, por exemplo, Lock et al., Hum Gene Ther 21:1259- 1271, 2010; Smith et al., Mol Ther 17:1888-1896, 2009; e Vandenberghe et al., Hum Gene Ther 21:1251-1257, 2010).
[0098] Os reagentes e métodos divulgados no presente documento podem ser empregados para produzir estoques de alto título dos vetores virais inventivos, de preferência, em títulos essencialmente do tipo selvagem. É também preferencial que o estoque de parvovírus tenha um título de cerca de 1010 vg/ml a cerca de 1013 vg/ml, por exemplo, pelo menos ou cerca de 1010 vg/ml, 6,6 x 1010 vg/ml, 1011 vg/ml, 5 x 1011 vg/ml, 1012 vg/ml, 5 x 1012 vg/ml, 1013 vg/ml, 5 x 1013 vg/ml, ou mais. Ácidos Nucleicos para uso na Geração do Vetor Viral
[0099] A invenção se refere também a ácidos nucleicos úteis para a geração de vetores virais. Em certos aspectos da invenção, os ácidos nucleicos úteis para a geração de vetores virais podem estar sob a forma de plasmídeos. Os plasmídeos úteis para a geração de vetores virais, também chamados de um plasmídeo de vetor viral, podem conter um cassete de gene. No mínimo, um cassete de gene de um plasmídeo de vetor viral contém: um promotor, um gene CYP4V2 heterólogo, uma sequência de sinais de poliA e ITRs 5’ e 3'.
[00100] A composição do gene heterólogo e de outros elementos dependerá do uso que será dado ao vetor resultante. Por exemplo, um tipo de sequência de gene heterólogo inclui uma sequência repórter, que após a expressão produz um sinal detectável. Essas sequências repórter incluem, sem limitação, sequências de DNA que codificam β- lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase, proteínas ligadas à membrana, incluindo, por exemplo, CD2, CD4, CD8, a proteína hemaglutinina da gripe e outras bem conhecidas na técnica, para o qual existem anticorpos de alta afinidade dirigidos às mesmas ou podem ser produzidos por meios convencionais, e proteínas de fusão compreendendo uma proteína ligada à membrana adequadamente fundida a um domínio de etiqueta de antígeno de, entre outros, hemaglutinina ou Myc. Por exemplo, quando a sequência repórter é o gene LacZ, a presença do vetor portador do sinal é detectada por ensaios de atividade de beta- galactosidase. Quando a sequência repórter é GFP ou luciferase, o vetor portador do sinal pode ser medido visualmente por cor ou produção de luz em um luminômetro.
[00101] As sequências gênicas heterólogas, quando associadas a elementos que dirigem sua expressão, fornecem sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescência ou outros ensaios espectrográficos, ensaios de classificação de células de ativação fluorescente e ensaios imunológicos, incluindo ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e imunoistoquímica.
[00102] O gene heterólogo pode também ser uma sequência não marcadora que codifica um produto que é útil em biologia e medicina, como proteínas, peptídeos, RNA, enzimas, mutantes negativos dominantes ou RNAs catalíticos. As moléculas de RNA desejáveis incluem tRNA, dsRNA, RNA ribossômico, RNAs catalíticos, siRNA, RNA em forma de grampo pequeno, RNA de trans-splicing e RNAs antissenso. Um exemplo de uma sequência de RNA útil é uma sequência que inibe ou extingue a expressão de uma sequência de nucleotídeos alvejada no animal tratado.
[00103] O gene heterólogo pode também ser usado para corrigir ou melhorar as deficiências gênicas, que podem incluir deficiências em que os genes normais são expressos em níveis menores que o normal ou deficiências em que o produto do gene funcional não é expresso. É contemplado na presente invenção que a sequência de genes heterólogos pode ser uma sequência de codificação de CYP4V2. Exemplos de sequências de codificação de CYP4V2 são fornecidos na Tabela 2: SEQ ID NOs:13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 e 49.
[00104] Um aspecto da invenção se refere a ácidos nucleicos que compreendem um cassete de gene compreendendo, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22;
xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22;
lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22;
lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[00105] Em algumas modalidades, o cassete de gene compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas modalidades, o ácido nucleico que compreende o cassete de gene pode ser um plasmídeo.
[00106] Os métodos para incorporar os elementos na Tabela 2 são bem conhecidos na técnica e permitiriam ao versado na técnica gerar os ácidos nucleicos e plasmídeos da invenção usando os métodos descritos no presente documento. Composições Farmacêuticas
[00107] Em um aspecto, a invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem os vetores virais da invenção formulados juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições podem adicionalmente conter um ou mais agentes terapêuticos diferentes que são adequados para o tratamento ou prevenção de BCD. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis intensificam ou estabilizam a composição, ou podem ser usados para facilitar a preparação da composição. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, tensoativos, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis.
[00108] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou o modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É preferencial que a administração seja sub-retiniana. O transportador farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração sub-retiniana, intravítrea, intravenosa, subcutânea ou tópica.
[00109] A composição deve ser esterilizada e fluida. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio, na composição. Em uma modalidade, a composição pode incluir um tampão com 1X PBS e 0,001 % de PLURONIC™ F-68 como um tensoativo, com um pH de cerca de 6,5 a 8,0, por exemplo, pH 6,5 a 7,5 e pH 6,5 a 7,0.
[00110] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Consultar, por exemplo, Remington: "The Science and Practice of Pharmacy", Mack Publishing Co., 20ª edição, 2000; e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. As composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do vetor viral é empregada nas composições farmacêuticas da invenção. Os vetores virais podem ser formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica. Os regimes de dosagem são ajustados de modo a proporcionarem a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, como usado aqui, se relaciona com unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido.
[00111] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração específicos, sem ser tóxica ao paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, a via de administração, o tempo de administração, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado e fatores similares.
[00112] Um médico ou veterinário pode começar com doses dos vetores virais da invenção empregadas na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o necessário para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, doses eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de BCD conforme descrito no presente documento variam dependendo de fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Para administração sub-retiniana com um vetor viral, a dosagem pode estar na faixa de cerca de 1x108 genomas de vetor (vg)/olho a cerca de 1x1012 vg/olho. Por exemplo, a dosagem pode ser maior ou cerca de 1x108 vg/olho, 2,5x108 vg/olho, 5x108 vg/olho, 7,5x108 vg/olho, 1x109 vg/olho, 2,5x109 vg/olho, 5x109 vg/olho, 7,5x109 vg/olho, 1x1010 vg/olho, 2,5x1010 vg/olho, 5x1010 vg/olho, 7,5x1010 vg/olho, 1x1011 vg/olho, 2x1011 vg/olho, 2,5x1011 vg/olho, 5x1011 vg/olho, 7,5x1011 vg/olho ou 1x1012 vg/olho.
[00113] Os vetores virais descritos no presente documento são principalmente usados como doses únicas por olho, com a possibilidade de repetir a dosagem para tratar regiões da retina que não são cobertas na dosagem anterior. A dosagem de administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico.
[00114] As várias características e modalidades da presente invenção, referidas nas seções individuais e modalidades acima, se aplicam, conforme for adequado, a outras seções e modalidades, mutatis mutandis. Consequentemente, as características especificadas em uma seção ou modalidade podem ser combinadas com as características especificadas em outras seções ou modalidades, conforme for adequado. Usos Terapêuticos
[00115] Os vetores virais, conforme descrito no presente documento, podem ser usados em uma concentração terapeuticamente útil para o tratamento de doenças relacionadas aos olhos, administrando-se a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz dos vetores virais da invenção. Por exemplo, o vetor viral pode compreender um capsídeo AAV8 que compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:24, 25 e 26, respectivamente, codificadas, por exemplo, por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou
100 % de identidade com a SEQ ID NO:23 e um genoma de vetor que compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um dos seguintes conjuntos de sequências de nucleotídeos: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22;
xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22;
lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22;
lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[00116] Em algumas modalidades, o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos com mais que ou cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97
%, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18 e 22; SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18 e 22; ou SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22. Em certas outras modalidades, o capsídeo AAV8 pode compreender subcombinações de proteínas capsidiais VP1, VP2 e/ou VP3.
[00117] Os indivíduos em necessidade de tratamento podem incluir aqueles que têm uma ou mais mutações em seu gene CYP4V2, por exemplo, Tabela 1. Mais especificamente, a presente invenção fornece um método de tratamento de BCD, administrando-se a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade eficaz de um vetor viral que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína CYP4V2 humana, por exemplo, SEQ ID NO:15). Em alguns aspectos, é fornecido um método de melhorar a visão em um indivíduo com BCD, administrando-se a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade eficaz de um vetor viral que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína CYP4V2 humana, por exemplo, SEQ ID NO:15). Em alguns aspectos, é fornecido um método de prevenir o declínio de visão em um indivíduo com BCD, administrando-se a um indivíduo que precisa do mesmo uma quantidade eficaz de um vetor viral que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína CYP4V2 humana, por exemplo, SEQ ID NO:15). Em aspectos específicos, a presente invenção fornece vetores virais que compreendem uma sequência de codificação de CYP4V2 para uso no tratamento de BCD em um indivíduo. Em uma modalidade, os vetores virais descritos no presente documento podem ser administrados por via sub-retiniana ou intravítrea usando métodos conhecidos pelos versados na técnica. Em uma modalidade, os métodos podem incluir genotipar um indivíduo para determinar se o mesmo possui uma ou mais mutações de CYP4V2 associadas a BCD (consultar, por exemplo, Tabela 1) e tratar um indivíduo com uma ou mais mutações de CYP4V2 associadas a BCD para BCD por meio da administração de um vetor viral conforme descrito no presente documento. Em modalidades específicas, um vetor viral fornecido no presente documento para uso com métodos de tratamento de BCD compreende uma sequência de codificação de CYP4V2 (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína CYP4V2 humana, por exemplo, SEQ ID NO:15) ligada de maneira funcional a um promotor, por exemplo, promotor ProC2.
[00118] O uso de AAV recombinante revelou ser viável e seguro para o tratamento de doença retiniana. Consultar, por exemplo, Bainbridge et al., N Engl J Med 358:2231-2239, 2008; Bainbridge et al., Gene Ther 15:1191-1192, 2008; Hauswirth et al., Hum Gene Ther 19:979-990, 2008; Maguire et al., N Engl J Med 358:2240-2248, 2008; Bennett et al., Lancet 388:661-672, 2016; e Russell et al., Lancet 390:849-860, 2017. Os vetores virais descritos no presente documento podem ser usados, inter alia, para tratar e evitar a progressão de BCD e reduzir a perda de visão.
[00119] A presente invenção se refere também a um método de expressar uma sequência de codificação de CYP4V2 em células RPE administrando-se vetores virais da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo, por exemplo, um indivíduo com uma ou mais mutações em seu gene CYP4V2, por exemplo, Tabela 1. A presente invenção se refere também a vetores virais da invenção para uso na expressão de uma sequência de codificação de CYP4V2 em células RPE da retina do indivíduo em necessidade da mesma. A invenção também contempla um método de entregar e expressar uma sequência de codificação de CYP4V2 à retina, especificamente a células RPE na retina, de um indivíduo com BCD. É contemplado que a sequência de codificação de CYP4V2 é entregue ao indivíduo em necessidade da mesma colocando-se a retina e/ou células RPE do indivíduo (por exemplo, administração sub-retiniana ou intravítrea) em contato com um vetor viral conforme descrito no presente documento. Alternativamente, uma sequência de codificação de CYP4V2 é entregue a um indivíduo administrando-se ao indivíduo um vetor viral conforme descrito no presente documento.
[00120] Em alguns aspectos, a presente invenção inclui adicionalmente métodos de expressar uma sequência de codificação de CYP4V2 em células RPE na retina de um indivíduo que tem BCD, colocando-se a retina do indivíduo em contato com vetores virais da invenção. Em certos aspectos, as células RPE da retina do indivíduo são colocadas em contato com vetores virais da invenção.
[00121] O tratamento e/ou prevenção de doenças oculares, como BCD, pode ser determinado por um oftalmologista, optometrista ou profissional de saúde usando medições clinicamente relevantes da função visual, visão funcional, anatomia retiniana e/ou Qualidade de Vida. O tratamento de BCD significa qualquer ação (por exemplo, administração de um vetor viral descrito no presente documento) contemplada para melhorar ou preservar a função visual, visão funcional, anatomia retiniana e/ou Qualidade de Vida. Além disso, a prevenção no que se refere à BCD significa qualquer ação (por exemplo, administração de um vetor viral descrito no presente documento) que inibe, previne ou retarda uma piora na função visual, visão funcional, anatomia retiniana e/ou fenótipo de BCD, conforme definido no presente documento, em um indivíduo em risco de tal piora, por exemplo, diminuir o número e/ou tamanho dos depósitos de tipo cristalino amarelo ou branco na retina.
[00122] A função visual pode incluir, por exemplo, acuidade visual,
acuidade visual com baixa iluminação, campo visual, campo visual central, visão periférica, sensibilidade ao contraste, adaptação ao escuro, recuperação após fotoestresse, discriminação de cores, velocidade de leitura, dependência de dispositivos auxiliares (por exemplo, fonte grande, dispositivos de ampliação, telescópios), reconhecimento facial, proficiência em operar um veículo motorizado, capacidade de realizar uma ou mais atividades da vida diária e/ou satisfação relatada pelo paciente relacionada à função visual. Dessa forma, em certas modalidades, pode-se dizer que o tratamento de BCD ocorre quando um indivíduo tem pelo menos uma diminuição de 10 %, 20 % ou 30 % ou falta de um aumento de 10 %, 20 % ou 30 % ou mais no tempo para um grau pré-especificado de adaptação ao escuro. Além disso, pode-se dizer que o tratamento de BCD ocorre quando um indivíduo exibe cegueira noturna intensa precoce e adaptação lenta ao escuro em uma idade jovem, seguida de perda progressiva da acuidade visual, campos visuais e visão de cores, levando à cegueira legal, determinada por um profissional de saúde qualificado, por exemplo, oftalmologista e optometrista.
[00123] Medições exemplificativas da função visual incluem acuidade visual Snellen, acuidade visual ETDRS, acuidade visual de baixa luminância, grade Amsler, campo visual Goldmann, perimetria automatizada padrão, microperimetria, gráficos Pelli-Robson, cartão SKILL, placas de cores Ishihara, teste de cor Farnsworth D15 ou D100, eletrorretinografia padrão, eletrorretinografia multifocal, testes validados para velocidade de leitura, reconhecimento facial, simulações de direção e satisfação relatada pelo paciente. Dessa forma, pode-se dizer que o tratamento do BCD é alcançado após um ganho ou falha na perda de 2 ou mais linhas (ou 10 letras) de visão em uma escala ETDRS. Além disso, em certos aspectos, pode-se dizer que o tratamento de BCD ocorre mediante melhora ou retardo da perda da função retiniana como medido, por exemplo, por eletrorretinografia; melhora ou retardo da progressão da arquitetura da retina como medido, por exemplo, por tomografia de coerência óptica (OCT); melhora ou retardo da perda de navegação ambulatorial, por exemplo, através de um labirinto em várias intensidades de iluminação; e/ou pelo menos 10 %, 20 % ou 30 % de aumento ou falta de 10 %, 20 % ou 30 % de diminuição na velocidade de leitura (palavras por minuto). Além disso, em alguns aspectos, pode- se dizer que o tratamento de BCD ocorre quando um indivíduo exibe um aumento de pelo menos 20 % ou uma falta de uma redução de 20 % na proporção de placas corretamente identificadas em um teste de Ishihara ou discos corretamente sequenciados em um teste de Farnsworth. Dessa forma, o tratamento de BCD pode ser determinado, por exemplo, pela melhora da taxa de adaptação ao escuro, uma melhora na acuidade visual ou retardo da taxa de perda de acuidade visual.
[00124] Aspectos indesejáveis da anatomia da retina que podem ser tratados ou evitados incluem, por exemplo, o acúmulo de depósitos do tipo cristalino pequeno, amarelo ou branco de lipídeos na retina, atrofia da retina, atrofia do epitélio pigmentar da retina, estreitamento de vasos da retina, aglomeração pigmentar e fluido sub-retiniano. Os meios exemplificativos de avaliação da anatomia retiniana incluem fundoscopia, fotografia de fundo, angiografia de fluoresceína, angiografia de indocianina verde, OCT, tomografia de coerência óptica de domínio espectral, oftalmoscopia a laser de varredura, microscopia confocal, óptica adaptativa, autofluorescência de fundo, biópsia, necrópsia e imunoistoquímica. Dessa forma, os vetores virais descritos no presente documento podem ser usados para tratar BCD em um indivíduo, como determinado, por exemplo, por uma redução na taxa de desenvolvimento de atrofia retiniana e/ou uma redução no número e/ou tamanho de depósitos tipo cristalino amarelo ou branco na retina.
[00125] O tratamento de BCD pode também ser determinado, por exemplo, pela melhora ou preservação de Qualidade de Vida. Os profissionais qualificados entenderão que a Qualidade de Vida pode ser determinada por muitos testes diferentes, por exemplo, questionário NEI-VFQ25 do National Eye Institute.
[00126] Os indivíduos que serão tratados com agentes terapêuticos da presente invenção podem também ser administrados com outros agentes ou dispositivos terapêuticos com eficácia conhecida para tratar distrofia retiniana, como preparações de vitaminas e minerais, auxiliares para visão subnormal, cães-guia ou outros dispositivos conhecidos para auxiliar pacientes com visão subnormal.
[00127] Atualmente, não há outros agentes terapêuticos aprovados para o tratamento de BCD. À medida que surgem outras novas terapias, as presentes composições e novas terapias podem ser administradas sequencialmente em qualquer ordem ou simultaneamente, conforme clinicamente indicado.
[00128] O que se segue são modalidades exemplificativas da presente invenção.
[00129] 1. Um vetor viral que compreende um genoma de vetor compreendendo, em uma direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (iv) uma sequência de sinais de poliadenilação (poliA); e (v) uma ITR 3’.
[00130] 2. O vetor viral da modalidade 1, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) um íntron;
(iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (v) uma sequência de sinais poliA; e (vi) uma ITR 3’.
[00131] 3. O vetor viral da modalidade 1, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação CYP4V2; (iv) um elemento regulador; (v) uma sequência de sinais poliA; e (vi) uma ITR 3’.
[00132] 4. O vetor viral da modalidade 1, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) um íntron; (iv) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2; (v) um elemento regulador; (vi) uma sequência de sinais poliA; e (vii) uma ITR 3’.
[00133] 5. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o genoma de vetor compreende um comprimento maior ou cerca de 4,1 kb e menor ou cerca de 4,9 kb.
[00134] 6. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o genoma de vetor compreende uma sequência de preenchimento posicionada entre a sequência de sinais de poliA e a ITR 3’.
[00135] 7. O vetor viral da modalidade 6, em que a sequência de preenchimento tem entre cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50- 60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400- 500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500 ou 2500- 3000 nucleotídeos de comprimento.
[00136] 8. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a ITR 5’ compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:1.
[00137] 9. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o promotor é um promotor ubíquo.
[00138] 10. O vetor viral da modalidade 9, em que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV), promotor CBA ou promotor CAG.
[00139] 11. O vetor viral da modalidade 10, em que o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:2, a SEQ ID NO:3 ou a SEQ ID NO:4.
[00140] 12. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o promotor é um promotor específico do epitélio pigmentar da retina (RPE).
[00141] 13. O vetor viral da modalidade 12, em que o promotor é um promotor ProC2, um promotor VMD2, um promotor CYP4V2 ou um promotor RPE65.
[00142] 14. O vetor viral da modalidade 13, em que o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:5, a SEQ ID NO:6, a SEQ ID NO:7 ou a SEQ ID NO:8, e promove a expressão do CYP4V2 em células RPE.
[00143] 15. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que a sequência de codificação de CYP4V2 compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:13, a SEQ ID NO:14, a SEQ ID NO:39, a
SEQ ID NO:41, a SEQ ID NO:43, a SEQ ID NO:45, a SEQ ID NO:47 ou a SEQ ID NO:49.
[00144] 16. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 15, em que a sequência de sinais de poliA compreende um hormônio do crescimento bovino ou sequência de nucleotídeos poliA do vírus símio
40.
[00145] 17. O vetor viral da modalidade 16, em que a sequência de sinais de poliA compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:18 ou a SEQ ID NO:19.
[00146] 18. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que a ITR 3’ compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:22.
[00147] 19. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 2 e 4, em que o íntron compreende um hormônio do crescimento humano, vírus símio 40 ou sequência de íntrons da beta gobina humana.
[00148] 20. O vetor viral da modalidade 19, em que o íntron compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:9, a SEQ ID NO:10 ou a SEQ ID NO:11.
[00149] 21. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 3 e 4, em que o elemento regulador compreende uma sequência do vírus da hepatite B ou do vírus da hepatite da marmota.
[00150] 22. O vetor viral da modalidade 21, em que o elemento regulador compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:16 ou a SEQ ID NO:17.
[00151] 23. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 22, em que o genoma de vetor compreende uma sequência de Kozak posicionada imediatamente a montante da sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende a sequência de codificação de CYP4V2.
[00152] 24. O vetor viral da modalidade 23, em que a sequência de Kozak compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:12, da SEQ ID NO:51, da SEQ ID NO:52 ou da SEQ ID NO:53.
[00153] 25. O vetor viral da modalidade 1, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22;
xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22.
[00154] 26. O vetor viral da modalidade 2, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22;
xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22.
[00155] 27. O vetor viral da modalidade 3, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22;
xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22.
[00156] 28. O vetor viral da modalidade 4, em que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22;
xx) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[00157] 29. O vetor viral de qualquer uma das modalidades 1 a 28, em que o vetor compreende um capsídeo de sorotipo 8, 9, 2 ou 5 de vírus adenoassociado (AAV).
[00158] 30. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV8 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:24, 25 e 26, respectivamente.
[00159] 31. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV8 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:23.
[00160] 32. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV9 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:28, 29 e 30, respectivamente.
[00161] 33. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV9 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:27.
[00162] 34. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV2 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:32, 33 e 34, respectivamente.
[00163] 35. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:31.
[00164] 36. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV5 compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90 % de identidade com as SEQ ID NOs:36, 37 e 38, respectivamente.
[00165] 37. O vetor viral da modalidade 29, em que o capsídeo AAV5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90 % de identidade com a SEQ ID NO:35.
[00166] 38. Uma composição que compreende o vetor viral de qualquer uma das modalidades anteriores.
[00167] 39. A composição da modalidade 38, em que a composição compreende adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00168] 40. Um método de expressão de um gene CYP4V2 heterólogo em uma célula da retina, sendo que o método compreende colocar a célula da retina em contato com o vetor viral de qualquer uma das modalidades.
[00169] 41. O método da modalidade 40, em que a célula da retina é uma célula RPE.
[00170] 42. Um método de tratamento de um indivíduo com distrofia cristalina de Bietti (BCD), sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição da modalidade 39.
[00171] 43. Um método de melhorar a acuidade visual, melhorar a função visual ou visão funcional ou inibir o declínio de função visual ou visão funcional em um indivíduo com BCD, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição da modalidade 39.
[00172] 44. A composição da modalidade 39 para uso no tratamento de um indivíduo com BCD.
[00173] 45. A composição da modalidade 39 para uso na melhora da acuidade visual em um indivíduo com BCD.
[00174] 46. Um ácido nucleico que compreende um cassete de gene, em que o cassete de gene compreende, na direção 5’ para 3’: (i) uma ITR 5’; (ii) um promotor; (iii) uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação CYP4V2; (iv) uma sequência de sinais poliA; e (v) uma ITR 3’.
[00175] 47. O ácido nucleico da modalidade 46, em que o ácido nucleico é um plasmídeo.
[00176] 48. O ácido nucleico da modalidade 46, em que o cassete de gene compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 18, e 22; ii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 18, e 22; iii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 18, e 22; iv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 18, e 22; v) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 18, e 22; vi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 18, e 22; vii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 18, e 22; viii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 18, e 22; ix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 18, e 22; x) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 18, e 22; xi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 18, e 22; xii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 18, e 22; xiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 18, e 22; xiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 18, e 22;
xv) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 19, e 22; xvi) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 19, e 22; xvii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 19, e 22; xviii) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 19, e 22; xix) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 19, e 22; xx) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 19, e 22; xxi) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 19, e 22; xxii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 19, e 22; xxiii) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 19, e 22; xxiv) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 19, e 22; xxv) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 19, e 22; xxvi) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 19, e 22; xxvii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 19, e 22; xxviii) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 19, e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18, e 22; xxx) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 18, e 22; xxxi) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 18, e 22; xxxii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 18, e 22; xxxiii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 18, e 22; xxxiv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 18, e 22; xxxv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 18, e 22; xxxvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 18, e 22; xxxvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 18, e 22; xxxviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 18, e 22; xxxix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 18, e 22; xl) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 18, e 22; xli) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 18, e 22; xlii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 18, e 22; xliii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 19, e 22; xliv) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 19, e 22;
xlv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 19, e 22; xlvi) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 19, e 22; xlvii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 19, e 22; xlviii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 19, e 22; xlix) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 19, e 22; l) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 19, e 22; li) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 19, e 22; lii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 19, e 22; liii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 19, e 22; liv) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 19, e 22; lv) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 19, e 22; lvi) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 19, e 22; lvii) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 18, e 22; lviii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 18, e 22; lix) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 18, e 22; lx) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 18, e 22; lxi) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 18, e 22; lxii) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 18, e 22; lxiii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 18, e 22; lxiv) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 18, e 22; lxv) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 18, e 22; lxvi) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 18, e 22; lxvii) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 18, e 22; lxviii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 18, e 22; lxix) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 18, e 22; lxx) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 18, e 22; lxxi) SEQ ID NOs:1, 2, 13, 16, 19, e 22; lxxii) SEQ ID NOs:1, 3, 13, 16, 19, e 22; lxxiii) SEQ ID NOs:1, 4, 13, 16, 19, e 22; lxxiv) SEQ ID NOs:1, 5, 13, 16, 19, e 22;
lxxv) SEQ ID NOs:1, 6, 13, 16, 19, e 22; lxxvi) SEQ ID NOs:1, 7, 13, 16, 19, e 22; lxxvii) SEQ ID NOs:1, 8, 13, 16, 19, e 22; lxxviii) SEQ ID NOs:1, 2, 14, 16, 19, e 22; lxxix) SEQ ID NOs:1, 3, 14, 16, 19, e 22; lxxx) SEQ ID NOs:1, 4, 14, 16, 19, e 22; lxxxi) SEQ ID NOs:1, 5, 14, 16, 19, e 22; lxxxii) SEQ ID NOs:1, 6, 14, 16, 19, e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs:1, 7, 14, 16, 19, e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs:1, 8, 14, 16, 19, e 22; lxxxv) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 18, e 22; lxxxix) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 18, e 22; xc) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 18, e 22; xci) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 18, e 22; xcii) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 18, e 22; xciii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 18, e 22; xciv) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 18, e 22; xcv) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvi) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 18, e 22; xcvii) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 18, e 22; xcviii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 18, e 22; xcix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 16, 19, e 22; c) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 13, 16, 19, e 22; ci) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 13, 16, 19, e 22; cii) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 13, 16, 19, e 22; ciii) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 13, 16, 19, e 22; civ) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 13, 16, 19, e 22;
cv) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 13, 16, 19, e 22; cvi) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 14, 16, 19, e 22; cvii) SEQ ID NOs:1, 3, 9, 14, 16, 19, e 22; cviii) SEQ ID NOs:1, 4, 9, 14, 16, 19, e 22; cix) SEQ ID NOs:1, 5, 9, 14, 16, 19, e 22; cx) SEQ ID NOs:1, 6, 9, 14, 16, 19, e 22; cxi) SEQ ID NOs:1, 7, 9, 14, 16, 19, e 22; e cxii) SEQ ID NOs:1, 8, 9, 14, 16, 19, e 22.
[00177] 49. Um vetor viral que compreende um genoma de vetor que compreende um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende uma sequência de codificação de CYP4V2, em que o promotor é um promotor ProC2.
EXEMPLOS
[00178] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar ainda mais a invenção, mas não para limitar seu escopo. Outras variantes da invenção serão prontamente evidentes para um perito na técnica e estão abrangidas pelas reivindicações anexas. Exemplo 1: Construção de plasmídeos de AAV-ITR
1.1. Clonagem de plasmídeos de AAV-ITR:
[00179] As sequências de nucleotídeos dos elementos plasmidiais individuais são descritas na Tabela 2. As sequências foram sintetizadas ou adquiridas comercialmente. A Tabela 4 descreve os elementos que existem em cada plasmídeo que foi construído. Técnicas padrão de clonagem de biologia molecular foram usadas para gerar os plasmídeos descritos na Tabela 4. Uma cadeia principal de plasmídeo com resistência à canamicina foi usada como a cadeia principal e material de partida. Os elementos de sequência individuais foram clonados em sítios de enzima de restrição ou usando clonagem de extremidade cega.
[00180] Como o cassete do gene de resistência a antibióticos contido na cadeia principal do plasmídeo não exerce uma função na produção dos vetores AAV, o versado na técnica poderia usar cadeias principais de plasmídeo e/ou cassetes de genes de resistência a antibióticos alternativos e produzir os mesmos vetores virais.
1.2. Transfecção plasmidial tripla para produzir vetores rAAV:
[00181] Vetores virais AAV recombinantes (rAAV) foram gerados por métodos de transfecção tripla. Métodos de transfecção tripla são conhecidos na técnica (Ferrari et al., Nat Med 3:1295-1297, 1997). Brevemente, plasmídeos contendo AAV-ITR (descritos na Tabela 4), plasmídeo contendo AAV-RepCap (portadores de Rep2 e Cap8) e plasmídeo Adenoauxiliar (portadores de genes que ajudam a concluir o ciclo de replicação de AAV) foram cotransfectados em células 293. As células foram cultivadas por 4 dias. No final do período de cultura, as células foram lisadas e os vetores no sobrenadantes de cultura e no lisado celular foram purificados por cromatografia em coluna usando colunas de afinidade de sepharose AVB (GE Healthcare Life Sciences). Os profissionais qualificados entenderão que um método padrão de centrifugação de gradiente CsCl (método baseado em Grieger et al., Nat Protoc 1:1412-1428, 2006) pode também ser usado.
[00182] Alternativamente, vetores rAAV semelhantes a GMP podem ser gerados pelos métodos de transfecção e cultura descritos acima. O material de cultura celular colhido é, então, processado por cromatografia em coluna com base nos métodos descritos por Lock et al., Hum Gene Ther 21:1259-1271, 2010; Smith et al., Mol Ther 17:1888- 1896, 2009; e Vandenberghe et al., Hum Gene Ther 21:1251-1257,
2010. Tabela 4. Composições de Plasmídeo Elemento IDENTIFICADOR Estratégia de Clonagem
DE SEQUÊNCIA (SEQ ID NO:) Composição de Plasmídeo NVS1 ITR 5’ 1 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT.
Promotor ProC2 5 A PCR amplifica o promotor ProC2 adicionando os sítios de restrição MluI e SacII.
Ligar o amplicon digerido por SacII/MluI na cadeia principal de plasmídeo de AAV cortado por SacII/MluI.
SEQUÊNCIA DE 14 Fragmento de síntese de Cyp4V2 flanqueado CODIFICAÇÃO por sítios XbaI e HindIII.
Ligar o fragmento DE CYP4V2 XbaI/HindIII nos sítios XbaI/HindIII de cadeia principal de plasmídeo de AAV. sequência de 18 Ligar o fragmento HindIII/SgrA1 contendo sinais de poliA de sequência de sinais de poliA bGH no bGH plasmídeo de AAV digerido com HindIII/SgrAI.
ITR 3’ 22 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida por MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT.
Composição de Plasmídeo NVS2 ITR 5’ 1 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida por MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT.
Promotor ProC2 5 A PCR amplifica o promotor adicionando os sítios de restrição MluI e SacII.
Ligar o amplicon digerido com SacII/MluI na cadeia principal de plasmídeo de AAV cortado com SacII/MluI.
Íntron hGH 9 A PCR amplifica o íntron hGH adicionando sítios de restrição SacII e XbaI.
Ligar o amplicon cortado com SacII/XbaI na cadeia principal de plasmídeo de AAV cortado com SacII/XbaI.
SEQUÊNCIA DE 14 Fragmento de síntese de Cyp4V2 flanqueado CODIFICAÇÃO por sítios XbaI e HindIII.
Ligar o fragmento DE CYP4V2 cortado com XbaI/HindIII nos sítios XbaI/HindIII de cadeia principal de plasmídeo de AAV. sequência de 18 Ligar o fragmento HindIII/SgrA1 contendo sinais de poliA de sequência de sinais de poliA bGH no bGH plasmídeo de AAV digerido com HindIII/SgrAI.
ITR 3’ 22 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT.
Composição de Plasmídeo NVS3 ITR 5’ 1 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT. Promotor ProC2 5 A PCR amplifica o promotor adicionando os sítios de restrição MluI e SacII. Ligar o amplicon digerido com SacII/MluI na cadeia principal de plasmídeo de AAV cortado com SacII/MluI. SEQUÊNCIA DE 14 Fragmento de síntese de Cyp4V2 flanqueado CODIFICAÇÃO por sítios XbaI e HindIII. Ligar o fragmento DE CYP4V2 cortado com XbaI/HindIII nos sítios XbaI/HindIII de cadeia principal de plasmídeo de AAV. Elemento 16 Digerir o plasmídeo contendo HPRE com XhoI regulador de e blunt. Digerir com SalI. Ligar no plasmídeo HPRE de AAV cortado primeiro com BglII, cego e cortado com SalI. sequência de 18 Ligar o fragmento HindIII/SgrA1 contendo sinais de poliA de sequência de sinais de poliA bGH no bGH plasmídeo de AAV digerido com HindIII/SgrAI. ITR 3’ 22 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT. Composição de Plasmídeo NVS4 ITR 5’ 1 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada em sítios MluI e PmlI de cadeia principal de plasmídeo de AAV contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT. Promotor ProC2 5 A PCR amplifica o promotor adicionando os sítios de restrição MluI e SacII. Ligar o amplicon cortado com SacII/MluI na cadeia principal de plasmídeo de AAV digerido com SacII/MluI.
Íntron hGH 9 A PCR amplifica o íntron hGH adicionando sítios de restrição SacII e XbaI. Ligar o amplicon cortado com SacII/XbaI na cadeia principal de plasmídeo de AAV cortado com SacII/XbaI.
SEQUÊNCIA DE 14 Fragmento de síntese de Cyp4V2 flanqueado CODIFICAÇÃO por sítios XbaI e HindIII. Ligar o fragmento DE CYP4V2 cortado com XbaI/HindIII nos sítios XbaI/HindIII de cadeia principal de plasmídeo de AAV.
Elemento 16 Cortar o plasmídeo contendo o elemento regulador de HPRE com XhoI, então, extremidades cegas e HPRE cortado com SalI. Digerir a cadeia principal de plasmídeo de AAV com BglII, então, extremidades cegas e cortada com SalI. Ligar. sequência de 18 Ligar o fragmento HindIII/SgrA1 contendo sinais de poliA de sequência de sinais de poliA bGH no bGH plasmídeo de AAV digerido com HindIII/SgrAI. ITR 3’ 22 A inserção de plasmídeo de transferência de AAV digerida com MluI e PmlI é ligada na cadeia principal de plasmídeo de AAV MluI e PmlI contendo ITRs 5’ e 3’ de AAV2 WT.
Exemplo 2: Inclusão do íntron hGH, sequência de sinais de poliA bGH e HPRE fornecem expressão intensificada de eGFP
[00183] Os vetores AAV8 que expressam ChR2d-eGFP foram digeridos contendo elementos diferentes, incluindo íntrons diferentes, sequência de sinais de poliA diferentes e com ou sem um HPRE, para determinar a melhor combinação para expressão de gene ideal na retina. Métodos
[00184] Os camundongos C57BL/6 foram injetados por via sub- retiniana com 1 x 109 vg de vetores AAV8 que expressam channelrhodopsin fundida com eGFP (ChR2d-eGFP) e contendo elementos diferentes, por exemplo, íntrons diferentes (por exemplo, íntron hGH e íntron SV40), sequência de sinais de poliA (por exemplo, sequência de sinais de poliA bGH e sequência de sinais de poliA SV40) e com ou sem um HPRE. Quatro semanas depois, os olhos foram colhidos dos camundongos e alguns foram fixados com 1 ml de fixador de paraformaldeído a 4% (PFA) a 4°C de um dia para o outro e, então, colocados em solução salina tamponada com fosfato (STF). Esses olhos foram, então, secos com papel-toalha e transferidos para um prato de 35 mm. Tecido estranho foi removido da parte externa do olho, bem como da córnea e do cristalino e, então, a ocular foi submersa em 1 ml de STF. A retina foi, então, removida da ocular, e ambas foram cortadas em pétalas e montadas em lâminas. Imagens fluorescentes eGFP foram obtidas usando um microscópio fluorescente Zeiss Axio Imager M1 e software AxioVision. Todas as imagens foram feitas com ampliação de 2,5X e com o mesmo tempo de exposição.
[00185] Os outros olhos colhidos foram separados em retina neural e ocular posterior e congelados para análise da expressão de mRNA de ChR2d-eGFP usando PCR digital em gotas (ddPCR). Brevemente, o RNA foi isolado das amostras de tecido usando o kit Qiagen RNeasy Mini Kit e, então, 200 ng de RNA foram usados para gerar cDNA usando o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade de ThermoFisher Scientific. 1 ng de cDNA para cada amostra foi adicionado a ddPCR Supermix e iniciadores e sonda que reconhecem eGFP (Mr04097229_mr; ThermoFisher Scientific) e Rab7 de camundongo (Mm00784318_sH; ThermoFisher Scientific) foram adicionados a cada reação. ddPCR foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Bio-Rad). A expressão de ChR2d-eGFP foi normalizada para expressão de controle Rab7 para cada amostra. Resultados e Conclusões
[00186] Cinco vetores AAV8 diferentes foram construídos e injetados por via sub-retiniana em camundongos. Quatro semanas após a injeção, os olhos foram colhidos dos camundongos e a expressão de ChR2d- eGFP foi examinada por montagem plana e ddPCR. Montagens planas da ocular posterior mostraram que a fluorescência de eGFP foi mais alta nos olhos injetados com vetores contendo o íntron de hGH (Figura 1). Também, a inclusão da sequência de sinais de poliA bGH mostrou fluorescência ligeiramente maior em comparação com o mesmo vetor com a sequência de sinais de poliA SV40 (AAV8-TM078 versus AAV8- TM073).
[00187] Para obter uma análise mais quantitativa de nível de expressão de ChR2d-eGFP, ddPCR foi realizada em mRNA isolado de amostras separadas de retina neural e ocular posterior. Os resultados mostraram que na ocular posterior, a expressão foi mais significativamente acentuada pela adição do HPRE (AAV8-TM075) (Figura 2A). Também, vetores contendo a sequência de sinais de poliA bGH mostraram maior expressão em comparação com os respectivos vetores contendo a sequência de sinais de poliA SV40 (comparar AAV8- TM078 com AAV8-TM073 e AAV8-TM079 com AAV8-TM074). Na retina neural, a adição do HPRE novamente levou a um aumento no nível de expressão de eGFP (AAV8-TM075), porém o maior aumento na expressão foi observado com a adição de sequência de sinais de poliA bGH (AAV8-TM078 e AAV8-TM079) (Figura 2B).
[00188] Tomados em conjunto, esses resultados mostram que o cassete de expressão ideal para expressão gênica na retina pode incluir o íntron hGH, sequência de sinais de poliA bGH e elementos HPRE. Portanto, vetores contendo um, dois, ou todos os três elementos foram construídos para entrega do cDNA de CYP4V2 para o tratamento de BCD. Exemplo 3: Injeção sub-retiniana de vetores AAV-CYP4V2 em camundongos knockout Cyp4v3 previne a progressão da doença.
[00189] Cyp4v3 é o ortólogo de camundongo de CYP4V2 humano (82 % de identidade). O gene Cyp4v3 foi submetido a knockout usando CRISPR/Cas9, e camundongos knockout Cyp4v3 são injetados com vetor AAV que expressa CYP4V2 a aproximadamente 1 x 109 vg por olho. Em pontos de tempo diferentes após a injeção, os camundongos são examinados por imaginologia de fundo e tomografia de coerência óptica para determinar o número e o tamanho dos depósitos cristalinos presentes na retina. Além disso, os camundongos são avaliados quanto à função visual (por exemplo, acuidade visual, adaptação ao escuro) e visão funcional (por exemplo, teste de mobilidade). Em comparação com olhos injetados de controle (vetor AAV-eGFP), os olhos injetados com o vetor que expressa CYP4V2 mostram uma redução no número e/ou tamanho de depósitos cristalinos e/ou uma melhora na função visual e/ou visão funcional, demonstrando expressão bem-sucedida de CYP4V2 nas células RPE e restauração de função da proteína CYP4V2. Exemplo 4: Injeção sub-retiniana de vetores AAV-ProC2 em primatas não humanos leva à expressão de gene nas células RPE
[00190] A sequência promotora ProC2 foi sintetizada quimicamente por GENEWIZ, com flancos curtos contendo sítios de restrição MluI/NheI/AscI e BamHI/EcoRI/BglII. A sequência promotora ProC2 foi subclonado usando uma combinação de sítios de restrição adequada em pAAV-EF1a-CatCh-GFP substituindo os promotores EF1a ou hRO. O plasmídeo pAAV-EF1a-CatCh-GFP foi construído por PCR adaptadora e o kit Clontech In-Fusion usando pcDNA3.1(-)-CatCh-GFP.
[00191] As células HEK293T foram cotransfectadas com um plasmídeo de transgene de AAV, um plasmídeo auxiliar de AAV que codifica as proteínas Rep2 e Cap de AAV para o capsídeo selecionado (BP2), e o plasmídeo auxiliar pHGT1-Adeno1 que abriga os genes adenovirais usando polietilenoimina ramificada (Polysciences). Um prato de cultura celular de 15 cm de diâmetro foi cotransfectado com a mistura de plasmídeo a 80 % de confluência das células HEK293T. Uma mistura de transfecção de células contendo 7 µg de plasmídeo transgene AAV, 7 µg de plasmídeo que codifica Rep2 e Cap, 20 µg de plasmídeo auxiliar de AAV e 6,8 µM de polietilenoimina em 5 ml de DMEM foi incubada à temperatura ambiente por 15 min antes de ser adicionada a um prato de cultura celular contendo 10 ml de DMEM. 60 h após a transfecção, as células foram coletadas e ressuspensas em tampão contendo NaCl 150 mM e Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. As células foram lisadas por ciclos de congelamento–descongelamento repetidos e MgCl2 foi adicionado para produzir uma concentração final de 1 mM. O plasmídeo e o DNA genômico foram removidos por tratamento com
250 U ml − 1 de TurboNuclease a 37 °C por 10 min. Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação a 4000 r.p.m. por 30 min. Partículas de AAV foram purificadas e concentradas em colunas Millipore Amicon 100 K (catálogo nº UFC910008; Merck Millipore). O DNA viral encapsidado foi quantificado por PCR de transcrição reversa TaqMan após desnaturação das partículas de AAV usando protease K; os títulos foram calculados como cópias do genoma por ml.
[00192] Para administração de AAV em camundongos, injeções oculares foram realizadas em camundongos anestesiados com isoflurano a 2,5 %. Uma pequena incisão foi feita com uma agulha 30- G afiada na esclera perto da lente e 2 μl de suspensão de AAV foram injetados através dessa incisão no espaço sub-retiniano/intravítreo usando uma seringa romba Hamilton de 5 μl (Hamilton Company) retida em um micromanipulador.
[00193] Para administração de AAV em primatas não humanos, 50 microlitros de suspensão de partículas de AAV foram injetados por via sub-retiniana em colaboração com um oftalmologista e um contratante terceirizado em Kunming, China. Após 3 meses, as oculares isoladas foram fixadas de um dia para o outro em PFA a 4 % em STF, seguido de uma etapa de lavagem em STF a 4C. Após receber as oculares fixas, a região retiniana infectada foi dissecada e tratada com soro de jumento normal (NDS) a 10 %, BSA a 1 %, Triton X-100 a 0,5 % em STF por 1h à temperatura ambiente. Tratamento com Ab anti-GFP de rato monoclonal (Molecular Probes Inc.; 1:500) e anti-ChAT de cabra policlonal (Millipore: 1:200) em 3 % de NDS, 1 % de BSA, 0,5 % de Triton X-100 em PBS foi conduzido por 5 dias à temperatura ambiente. Tratamento com Alexa Fluor-488 Ab antirrato de jumento secundário (Molecular Probes Inc.; 1:200), Alexa Fluor-633 anticabra e Hoechst, foi realizado por 2 h. Seções foram lavadas, montadas com reagente antifade ProLong Gold (Molecular Probes Inc.) em lâminas de vidro e fotografadas com o uso de um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 (Carl Zeiss Inc.).
[00194] A Figura 3 mostra que a injeção sub-retiniana de AAV- ProC2-CatCh-GFP em macacos cinomolgos (NHP) induziu a expressão em células RPE (áreas cinzas de imagem em escala de tons de cinza na parte superior das Figuras 3A & 3B).
[00195] A Tabela 5 abaixo resume a capacidade de o promotor sintético ProC2 dirigir a expressão em células retinianas de camundongo e NHP. Tabela 5: Expressão de Especificidade Celular em Células Retinianas de Camundongo e NHP Tipos de Células Alvejadas Expressão Alvo Em ordem de Especificidade Densidade celular Retina Retina abundância de alvejamento alvejada como Externa Interna porcentagem de densidade de população alvo Camun- Todas as AC 0 1 Todas as AC, Todas as AC (34 ± dongo (75 %), s-MG s-MG 6,9 %) (25 %) NHP RPE RPE (100 %) RPE (50 ± 7 %) MG = glia de Müller; AC = células amácrinas; Todas as AC = Todas as células amácrinas; s- (como prefixo) = expressão esparsa; RPE = células do epitélio pigmentar da retina.
Exemplo 5: Injeção sub-retiniana de vetores AAV em macacos cinomolgos para determinar o melhor sorotipo capsidial para alvejar células RPE.
[00196] Os vetores AAV2, AAV6, AAV8 e AAV9 que expressam GFP a partir de um promotor CMV foram injetados por via sub-retiniana em macacos cinomolgos em uma dose de 1 x 1011 vg por olho. Quatro semanas após a injeção, a expressão de GFP nos olhos de macaco foi examinada em vida por imaginologia de autofluorescência de fundo e pós-colheita por imunoistoquímica. Além disso, o nível e a localização de mRNA de GFP e DNA genômico de AAV foram avaliados por hibridização in-situ.
[00197] Todos os quatro sorotipos testados facilitaram a expressão de GFP em células fotorreceptoras e RPE. A expressão foi observada perto do local de injeção com grau variado de espalhamento para regiões periféricas. A expressão de GFP não foi detectada no nervo óptico ou seções cerebrais para nenhum dos sorotipos testados. Exemplo 6: Injeção sub-retiniana de vetores AAV em macacos cinomolgos para determinar o melhor promotor para expressão específica de RPE.
[00198] Os vetores AAV que expressam GFP a partir de promotores específicos de RPE são injetados por via sub-retiniana em macacos cinomolgos em uma dose de 1 x 1011 vg por olho. Os promotores específicos de RPE incluem ProC2 e VMD2. Quatro semanas após a injeção, a expressão de GFP nos olhos de macaco é examinada em vida por imaginologia de autofluorescência de fundo e pós-colheita por imunoistoquímica. Além disso, o nível e a localização de mRNA de GFP e DNA genômico de AAV são avaliados por hibridização in-situ. Os dois promotores diferentes mostram expressão de GFP específica de RPE, porém o nível de expressão é variável. Exemplo 7: Expressão de gene dirigida por AAV em tecidos retinianos humanos
[00199] Os tecidos retinianos humanos são preparados a partir de globos oculares humanos enucleados, dos quais a retina é dissecada usando uma tesoura fina. Os vetores AAV que expressam GFP a partir de promotores específicos de RPE são incubados com tecidos retinianos humanos. Os promotores específicos de RPE incluem ProC2 e VMD2. A expressão de GFP induzida por AAV é examinada 6-8 semanas após a administração do vírus. Seis semanas após a injeção, a expressão de GFP nos tecidos retinianos humanos é examinada por meio de imunofluorescência e imaginologia. Os dois promotores diferentes mostram expressão de GFP específica de RPE. Exemplo 8: Expressão dirigida por AAV de CYP4V2 sob o promotor ProC2 em tecidos NHP e humanos
[00200] Os vetores AAV que expressam CYP4V2 humano sob o promotor ProC2 ("vetor AAV-ProC2-CYP4V2") são incubados com tecidos retinianos humanos, conforme descrito no Exemplo 7. A expressão de gene CYP4V2 é examinada 6-8 semanas após a administração do vírus. Seis semanas após a injeção, a expressão de CYP4V2 nos tecidos retinianos humanos é detectada.
[00201] O vetor AAV-ProC2-CYP4V2 é injetado por via sub-retiniana em macacos cinomolgos em uma dose de 1 x 1011 vg por olho. Quatro semanas após a injeção, a expressão de CYP4V2 nos olhos de macaco é examinada pós-colheita por imunoistoquímica. Além disso, o nível e a localização de mRNA de CYP4V2 e DNA genômico de AAV são avaliados por hibridização in-situ. O promotor ProC2 induz a expressão específica de RPE do gene CYP4V2 nos olhos de macaco.
[00202] Tendo descrito a presente divulgação em detalhe, será evidente que modificações, variações e aspectos equivalentes são possíveis sem se afastar da essência e do escopo da presente divulgação como descritos no presente documento e nas reivindicações anexas. Além disso, deve ser entendido que todos os exemplos na presente divulgação são fornecidos como exemplos não limitantes. Quaisquer referências citadas no presente documento, incluindo por exemplo, todas as patentes, pedidos de patente publicados e publicações de não patente estão incorporadas a título de referência em sua totalidade.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende um genoma de vetor, sendo que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’: i. uma repetição terminal invertida 5’ (ITR); ii. um promotor; iii. uma sequência de nucleotídeos recombinantes que compre-ende uma sequência de codificação de CYP4V2; iv. uma sequência de sinais de poliadenilação (poliA); e v. uma ITR 3’.
2. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor VMD2.
3. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o promotor VMD2 compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 6.
4. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado dentre o grupo que consiste em um promotor ProC2, um promotor CYP4V2 e um promotor RPE65.
5. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
6. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é eficaz para promover a expressão de CYP4V2 em células RPE.
7. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor ubíquo.
8. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV),
promotor CBA ou promotor CAG.
9. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que o promotor compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ NOs: 55-80.
10. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de CYP4V2 compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 ou 49.
11. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de CYP4V2 compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14.
12. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliA compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 18 ou 19.
13. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliA compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 18.
14. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de íntrons que compreende uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 9, 10 ou 11.
15. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a sequência de íntrons compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9.
16. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda
1) um elemento regulador que compreende uma sequência do vírus da hepatite B ou do vírus da hepatite da marmota e/ou 2) uma sequência de Kozak posicionada imediatamente a montante da sequência de nucleotídeos recombinantes que compreende a sequência de codificação de CYP4V2.
17. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, sequências de nucleotídeos selecionadas dentre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NOs: 1, 2, 13, 18 e 22; ii) SEQ ID NOs: 1, 3, 13, 18 e 22; iii) SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 18 e 22; iv) SEQ ID NOs: 1, 5, 13, 18 e 22; v) SEQ ID NOs: 1, 6, 13, 18 e 22; vi) SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 18 e 22; vii) SEQ ID NOs: 1, 8, 13, 18 e 22; viii) SEQ ID NOs: 1, 2, 14, 18 e 22; ix) SEQ ID NOs: 1, 3, 14, 18 e 22; x) SEQ ID NOs: 1, 4, 14, 18 e 22; xi) SEQ ID NOs: 1, 5, 14, 18 e 22; xii) SEQ ID NOs: 1, 6, 14, 18 e 22; xiii) SEQ ID NOs: 1, 7, 14, 18 e 22; xiv) SEQ ID NOs: 1, 8, 14, 18 e 22; xv) SEQ ID NOs: 1, 2, 13, 19 e 22; xvi) SEQ ID NOs: 1, 3, 13, 19 e 22; xvii) SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19 e 22; xviii) SEQ ID NOs: 1, 5, 13, 19 e 22; xix) SEQ ID NOs: 1, 6, 13, 19 e 22; xx) SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 19 e 22; xxi) SEQ ID NOs: 1, 8, 13, 19 e 22;
xxii) SEQ ID NOs: 1, 2, 14, 19 e 22; xxiii) SEQ ID NOs: 1, 3, 14, 19 e 22; xxiv) SEQ ID NOs: 1, 4, 14, 19 e 22; xxv) SEQ ID NOs: 1, 5, 14, 19 e 22; xxvi) SEQ ID NOs: 1, 6, 14, 19 e 22; xxvii) SEQ ID NOs: 1, 7, 14, 19 e 22; xxviii) SEQ ID NOs: 1, 8, 14, 19 e 22; xxix) SEQ ID NOs:1, 2, 9, 13, 18 e 22; xxx) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 13, 18 e 22; xxxi) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 13, 18 e 22; xxxii) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 18 e 22; xxxiii) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 13, 18 e 22; xxxiv) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 13, 18 e 22; xxxv) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 13, 18 e 22; xxxvi) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 14, 18 e 22; xxxvii) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 14, 18 e 22; xxxviii) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 14, 18 e 22; xxxix) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 14, 18 e 22; xl) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 14, 18 e 22; xli) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 14, 18 e 22; xlii) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 14, 18 e 22; xliii) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 13, 19 e 22; xliv) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 13, 19 e 22; xlv) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 13, 19 e 22; xlvi) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 19 e 22; xlvii) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 13, 19 e 22; xlviii) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 13, 19 e 22; xlix) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 13, 19 e 22; l) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 14, 19 e 22; li) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 14, 19 e 22;
lii) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 14, 19 e 22; liii) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 14, 19 e 22; liv) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 14, 19 e 22; lv) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 14, 19 e 22; lvi) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 14, 19 e 22; lvii) SEQ ID NOs: 1, 2, 13, 16, 18 e 22; lviii) SEQ ID NOs: 1, 3, 13, 16, 18 e 22; lix) SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 16, 18 e 22; lx) SEQ ID NOs: 1, 5, 13, 16, 18 e 22; lxi) SEQ ID NOs: 1, 6, 13, 16, 18 e 22; lxii) SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 16, 18 e 22; lxiii) SEQ ID NOs: 1, 8, 13, 16, 18 e 22; lxiv) SEQ ID NOs: 1, 2, 14, 16, 18 e 22; lxv) SEQ ID NOs: 1, 3, 14, 16, 18 e 22; lxvi) SEQ ID NOs: 1, 4, 14, 16, 18 e 22; lxvii) SEQ ID NOs: 1, 5, 14, 16, 18 e 22; lxviii) SEQ ID NOs: 1, 6, 14, 16, 18 e 22; lxix) SEQ ID NOs: 1, 7, 14, 16, 18 e 22; lxx) SEQ ID NOs: 1, 8, 14, 16, 18 e 22; lxxi) SEQ ID NOs: 1, 2, 13, 16, 19 e 22; lxxii) SEQ ID NOs: 1, 3, 13, 16, 19 e 22; lxxiii) SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 16, 19 e 22; lxxiv) SEQ ID NOs: 1, 5, 13, 16, 19 e 22; lxxv) SEQ ID NOs: 1, 6, 13, 16, 19 e 22; lxxvi) SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 16, 19 e 22; lxxvii) SEQ ID NOs: 1, 8, 13, 16, 19 e 22; lxxviii) SEQ ID NOs: 1, 2, 14, 16, 19 e 22; lxxix) SEQ ID NOs: 1, 3, 14, 16, 19 e 22; lxxx) SEQ ID NOs: 1, 4, 14, 16, 19 e 22; lxxxi) SEQ ID NOs: 1, 5, 14, 16, 19 e 22;
lxxxii) SEQ ID NOs: 1, 6, 14, 16, 19 e 22; lxxxiii) SEQ ID NOs: 1, 7, 14, 16, 19 e 22; lxxxiv) SEQ ID NOs: 1, 8, 14, 16, 19 e 22; lxxxv) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 13, 16, 18 e 22; lxxxvi) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 13, 16, 18 e 22; lxxxvii) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 13, 16, 18 e 22; lxxxviii) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 16, 18 e 22; lxxxix) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 13, 16, 18 e 22; xc) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 13, 16, 18 e 22; xci) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 13, 16, 18 e 22; xcii) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 14, 16, 18 e 22; xciii) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 14, 16, 18 e 22; xciv) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 14, 16, 18 e 22; xcv) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 14, 16, 18 e 22; xcvi) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 14, 16, 18 e 22; xcvii) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 14, 16, 18 e 22; xcviii) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 14, 16, 18 e 22; xcix) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 13, 16, 19 e 22; c) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 13, 16, 19 e 22; ci) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 13, 16, 19 e 22; cii) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 16, 19 e 22; ciii) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 13, 16, 19 e 22; civ) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 13, 16, 19 e 22; cv) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 13, 16, 19 e 22; cvi) SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 14, 16, 19 e 22; cvii) SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 14, 16, 19 e 22; cviii) SEQ ID NOs: 1, 4, 9, 14, 16, 19 e 22; cix) SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 14, 16, 19 e 22; cx) SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 14, 16, 19 e 22; cxi) SEQ ID NOs: 1, 7, 9, 14, 16, 19 e 22; e cxii) SEQ ID NOs: 1, 8, 9, 14, 16, 19 e 22.
18. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, as sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1, 6, 14, 18 e 22.
19. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o genoma de vetor compreende, na direção 5’ para 3’, as sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1, 6, 9, 14, 18 e 22.
20. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de nucleotídeos de preenchimento posicionada entre a sequência de sinais de poliA e a sequência de nucleotídeos de ITR 3’.
21. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de preenchimento tem entre cerca de 100 e 1500 nucleotídeos de comprimento.
22. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um capsí-deo de sorotipo 8, 9, 2 ou 5 de vírus adenoassociado (AAV).
23. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o capsídeo de sorotipo de vírus adenoassociado (AAV) é um capsídeo de sorotipo 9 de AAV.
24. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o capsídeo de sorotipo 9 de AAV 1) compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90% de identidade com as SEQ ID NOs: 28, 29 e 30, respectivamente; ou 2) é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 27.
25. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 22,
caracterizado pelo fato de que o capsídeo de sorotipo 8 de AAV 1) compreende sequências de aminoácidos VP1, VP2 e VP3 com mais que ou cerca de 90% de identida-de com as SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, respectivamente; ou 2) é codificado por uma sequência de nucleotídeos com mais que ou cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO: 23.
26. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor viral, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
25.
27. Método de expressão de um gene CYP4V2 heterólogo em uma célula da retina, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula da retina em contato com o vetor viral, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
28. Uso de um vetor viral, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que se destina à prepa-ração de uma composição para expressão de um gene CYP4V2 heterólogo em uma célula da retina, melhorar a função visual ou visão funcional, ou inibir o declínio de função visual ou visão funcional em um indivíduo com distrofia cristalina de Bietti (BCD) e/ou para o tratamento e/ou prevenção de um indivíduo com BCD.
29. Invenção, caracterizada pelo fato de que é representada por qualquer uma de suas modalidades ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exemplo, produto, processo ou uso abrangido pelo assunto inicialmente descrito, divulgado ou ilustrado no pedido de patente.
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