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KR20170095893A - 방광암에 대한 치료, 진단, 및 예후 방법 - Google Patents

방광암에 대한 치료, 진단, 및 예후 방법 Download PDF

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KR20170095893A
KR20170095893A KR1020177017321A KR20177017321A KR20170095893A KR 20170095893 A KR20170095893 A KR 20170095893A KR 1020177017321 A KR1020177017321 A KR 1020177017321A KR 20177017321 A KR20177017321 A KR 20177017321A KR 20170095893 A KR20170095893 A KR 20170095893A
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연정 최
오마르 카바라
도리스 김
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은, 암, 예를 들면, 방광암에 대하여 치료, 진단, 및 예후 제공을 위한, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR을 포함한, 하나 이상의 바이오마커의 발현을 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에서 사용을 위한 키트 및 제조 물품을 또한 제공한다.

Description

방광암에 대한 치료, 진단, 및 예후 방법{THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND PROGNOSTIC METHODS FOR CANCER OF THE BLADDER}
본 발명은 암, 예를 들면, 방광암의 치료, 진단, 및 예후 제공 방법에 관한 것이다.
암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협들 중 하나로 남아있다. 미국에서, 암은 해마다 거의 1백 30만 신규 환자를 감염시키고, 대략 1/4 사망을 책임지는, 심장병 다음의 사망의 제2 주된 원인이다. 고형 종양은 대부분의 사망을 책임진다. 악성 종양은 조절되지 않는 방식으로 빠르게 전이 및 성장하여, 시기적절하게 검출 및 치료를 극도로 어렵게 한다.
방광암은, 매년 보고된 400,000 가까이 새로 진단된 사례 및 대략 150,000 관련된 사망으로, 전세계적으로 다섯번째로 가장 흔한 악성종양이다. 대략 75-80%의 방광암 환자가 초기 진단시에 비근침윤성 방광암 (NMIBC)을 일으킨다. 점막고유층으로 국한되고 전형적으로 생명을 위협하지 않아도, 대략 50-80%의 NMIBCs는 재발하여, 종종 고비용의 임상 개입을 필요로 한다. NMIBCs는 더욱 심각한 근침윤성 방광암 (MIBC)에 대해 약 20-30%의 사례에서 진행할 수 있다. MIBCs (T2 및 T3)는 신규 사례의 단지 ~10-15%를 구성하지만, 그러나 이들은 전이성 방광암 (pT4)의 발달에 대하여 더 높은 위험을 부여한다. 전이성 방광암은 음울한 5-년 생존 가능도와 관련되고 현재까지 몇몇 유효한 요법으로 주요 미충족된 의료 필요성을 나타낸다.
따라서, 암, 예를 들어, 방광암의 치료, 진단, 및 예후 제공용 유효한 수단에 대한 필요성이 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 암, 예를 들면, 방광암의 치료, 진단, 및 예후 제공 방법에 관한 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 방광암으로 고통받고 있는 환자의 치료 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 발현 수준은 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 증가되는 것으로 결정되었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 방광암의 진단 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계로서, 참조 수준에 비하여 환자 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 방광암을 갖는 환자를 확인하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 환자에게 그들이 방광암을 갖는 것을 통지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (d) 참조 수준에 비하여 환자 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현의 수준의 증가가 검출된 경우 상기 환자의 치료용 항-암 요법의 선택 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (e) 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 방광암으로 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자의 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 증가되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계. 일부 구현예에서, 예후는 생존의 예후이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 투여에 앞서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (d) 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정된 경우 항-암 요법의 투여로부터 이로울 것으로 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (e), 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정되면, 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생존은 무병 생존 또는 전체 생존이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 방광암을 갖는 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계로서, 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 방광암을 갖는 환자에 대한 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계로서, 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 방광암으로 고통받고 있는 환자의 치료 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 환자에 바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신 이외의 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 포함하고, 여기에서 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 발현 수준은 TP53의 참조 수준에 비하여 증가되는 것으로 결정되었다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 항-암 요법은 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-암 요법은 FGFR3 길항제 및 EGFR 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, FGFR3 길항제, EGFR 길항제, 또는 TP53 길항제는 항체 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, FGFR3 길항제는 항-FGFR3 항체, 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, EGFR 길항제는 항-EGFR 항체, 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, TP53 길항제는 항-TP53 항체, 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 또는 EGFR 길항제는 소분자 길항제이다. 일부 구현예에서, FGFR3 길항제 또는 EGFR 길항제는 티로신 키나아제 저해제이다. 일부 구현예에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 (TARCEVA™)이다. 일부 구현예에서, 항-암 요법은 (i) 항-신생물성 제제, 화학치료제, 성장-저해제, 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제, (ii) 방사선요법, 또는 (iii) 이들의 조합을 추가로 포함한다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현 수준은 mRNA 측정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현 수준은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 검정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, PCR 검정은 정량적 PCR 검정이다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현 수준은 단백질 측정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플내 적어도 하나의 유전자의 발현 수준은 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 결정된다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플은 종양 샘플이다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 종양 샘플이다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자들 중 적어도 2개의 발현 수준의 결정 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자들 중 모든 3개의 발현 수준의 결정 단계를 추가로 포함한다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, FGFR3의 발현 수준은 참조 수준에 비하여 적어도 2-배 증가되는 것으로 결정되었다. 일부 구현예에서, FGFR3의 발현 수준은 참조 수준에 비하여 적어도 4-배 증가되는 것으로 결정되었다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, EGFR의 발현 수준은 참조 수준에 비하여 적어도 4-배 증가되는 것으로 결정되었다. 일부 구현예에서, EGFR의 발현 수준은 참조 수준에 비하여 적어도 8-배 증가되는 것으로 결정되었다.
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 유전자의 발현 수준의 결정 단계를 추가로 포함한다: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9, 및 FGF2 (여기에서 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 상기 발현 수준은 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 참조 수준에 비하여 변화된다).
상기 측면의 어느 하나의 일부 구현예에서, 방광암은 비근침윤성 방광암, 근침윤성 방광암, 또는 전이성 방광암이다. 일부 구현예에서, 비근침윤성 방광암은 재발성 비근침윤성 방광암이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 하기에서 분석되었던 방광암 종양 시료의 임상병리적 특징 및 환자에 관한 정보를 보여주는 표이다: 실시예 섹션 (예를 들면: 실시예 1-6).
도 2A 및 2B는 하기로부터 18,000 유전자의 발현에 관해 주성분 분석 (PCA)을 보여주는 그래프이다:
Figure pct00001
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012 (도 2A) 및 하기에 기재된 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널과 중첩하는 단지 82 유전자의 이용: 실시예 섹션 (참고, 예를 들면, 표 1) (도 2B). 양쪽 분석은 하기에 의해 기재된 방광암 하위유형에 속하는 샘플의 유사한 분포를 보여준다:
Figure pct00002
등 (위에).
도 2C 및 2D는 도심-기반 분류기를 이용한 교차-검증이 하기의 방광암 하위유형의 유사한 분류 정확도를 보여주는 그래프이다:
Figure pct00003
등 (위에) 1,000 유전자에 기반됨 (도 2C) 및 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널과 중첩하는 82 유전자에 기반됨 (도 2D). 도 2A-2D에 나타난 데이터는 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널이 분자적으로-정의된 하위유형으로 방광암을 정확하게 분류할 수 있음을 보여준다. 라인 마커는 명백하게 하기 위해서이고 데이터 지점을 나타내지 않는다.
도 3A 및 3B는, 범용 RNA (uRNA) 대조군의 입력 양이 감소하는 FGFR3 (도 3A) 및 PIK3CA (도 3B)에 대하여 보여준 바와 같이, 플루이다임 검정 성능이 RNA 입력 양에 의해 영향을 받지 않았음을 보여주는 그래프이다.
도 3C 및 3D는 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널의 실행간 데이터 재현성이 임상 조직에 대하여 높았음을 보여주는 그래프이다. 도 3C (HP-52719) 및 도 3D (HP-50331)는 상이한 날로부터 실행 사이에서 >0.98의 R2 값을 각각 보여주는 2개의 대표적인 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE)-유도된 RNA 샘플을 보여준다.
도 3E는 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널의 높은 칩대칩 데이터 재현성을 보여주는 그래프이다.
도 4A는 플루이다임 분석 (조직)으로부터 전사적으로-정의된 조직 클러스터 및 동반조절된 유전자 (유전자)의 그룹의 히트맵이다. 녹색, 황색, 및 적색 조직 그룹은 대다수의 샘플을 함유하였다.
도 4B는 하기를 보여주는 그래프이다: 녹색, 황색, 및 적색 조직 클러스터 (참고, 예를 들면, 도 4A)가 상이한 무병 생존 (DFS) 개연성과 관련된다. 적색 그룹 샘플은 최상의 DFS 프로파일을 가졌고 (적색 대황색: HR=0.54, P=0.03), 그리고 녹색 그룹 샘플은 최악의 DFS 가능도와 관련되었다 (적색 대녹색: HR=0.29, P=0.004).
도 4C는, 주로 침습성 조직 및 모든 전이를 포함하였던, 녹색 및 적색 그룹이 황색 그룹보다 비침윤성 샘플의 유의미하게 더 높은 빈도를 포함하였음을 나타내는 비침윤성 및 침습성/전이 조직학 콜을 보여주는 그래프이다 (녹색 대적색: P=0.1029, 유의미하지 않음 (NS); 녹색 대황색 및 적색 대황색: 모든 비교에 대하여 P<0.0001).
도 4D는 3개의 주요 조직 클러스터에서 미세유두상 조직학을 갖는 종양의 빈도를 보여주는 그래프이다. 미세유두상 조직학의 더 높은 빈도가 황색 그룹에서 관측되었다 (녹색 대적색: P=0.2351, NS; 녹색 대황색: P=0.1167, NS; 적색 대황색: P=0.0063).
도 4E는 면역 침윤-양성 샘플의 유병률에 관하여 녹색, 적색, 및 황색 그룹 사이에서 유의차 없음을 보여주는 그래프이다 (녹색 대적색: P=0.3332, NS; 녹색 대황색: P=0.5197, NS; 적색 대황색: P=1, NS).
도 4F는 3개 그룹에 대하여 치료 빈도 분포를 보여주는 그래프이다. 녹색 그룹은 적색 및 황색 그룹보다 더욱 심하게-치료되었고, 적색 및 황색 그룹은 비교할만한 비율 (P=0.8836, NS)에서 치료되었다 (모든 비교에 대하여 P<0.0001). 치료는 바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신, 화학요법, 방사선, 또는 이들의 조합을 포함하였다.
도 5A는 실시예 2에 기재된 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널 에 의한 발현 분석이 녹색, 황색, 및 적색 그룹에 의해 나타난 조직의 3개의 주요 서브셋, 및 청색 및 자주색 그룹에 의해 나타난 2개의 소수의 하위유형을 확인하였음을 보여주는 히트맵이다.
도 5B는 실시예 2에 기재된 바와 같이 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널에 의한 발현 분석이 상이한 생물학과 관련된 4개의 주요 유전자 발현 클러스터를 확인하였음을 보여주는 히트맵이다. 화살표는, TP53 및 FGFR3 (핑크색 클러스터 I); ZEB1 / 2같은 상피간엽 이행 (EMT) 유전자 및 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 유전자 예컨대 PIK3CA 및 PIK3R1 (담청색 클러스터 II); 다른 PI3K 유전자 예컨대 PTEN 및 AKT1 (심홍색 클러스터 III); 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 리간드 및 수용체 (담갈색 클러스터 IV)를 포함한, 각 클러스터에 대하여 대표적인 유전자를 나타낸다.
도 5C는 도 5A에서 기재된 조직 하위유형이 상이한 무병 생존 (DFS) 가능도와 관련되었음을 보여주는 그래프이다. 라인 마커는 명백하게 하기 위해서이고 데이터 지점을 나타내지 않는다.
도 6A-6D는 (도 6A) 비-근육 침습성 방광암; (도 6B) 근침윤성 방광암; (도 6C) 림프양 침윤-양성 조직; 및 미세유두상 조직학을 갖는 (도 6D) 방광 종양의 조직학적 특징을 보여주는 대표적인 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)-염색된 섹션이다. 기준자는 100 μm를 나타낸다.
도 7A는 녹색, 적색, 및 황색 그룹에서 시료에 대하여 FGFR3 돌연변이 상태, FGFR3 면역조직화학 (IHC), 및 조직병리 콜을 보여주는 컬러 맵이다.
도 7B는 FGFR3 전사체 수준이 플루이다임 유전자 발현 분석에 의해 결정된 바와 같이 야생형 (WT) 샘플과 비교된 돌연변이체 (MT)에서 더 높았음을 보여주는 그래프이다 (P<0.0001).
도 7C는 FGFR3 돌연변이체 샘플이 IHC에 의해 측정된 바와 같이 야생형 조직보다 단백질의 더 높은 수준을 발현시켰음을 보여주는 그래프이다 (P<0.0001).
도 7D는 FGFR3 돌연변이 비율이 모든 적색 및 침습성/전이성 황색 그룹과 비교된 녹색 그룹에서 유의미하게 더 높았음을 보여주는 그래프이다 (모든 비교에 대하여 P<0.0001).
도 7E는 녹색 그룹내 샘플이 적색 및 황색 그룹내 샘플보다 유의미하게 더 높은 FGFR3 전사체 수준을 발현시켰음을 보여주는 그래프이다 (모든 비교에 대하여 P<0.0001).
도 7F는 IHC에 의한 FGFR3 단백질 수준이 적색 그룹보다 녹색 그룹에서 더 높았고, 황색 그룹에서 최저였음을 보여주는 그래프이다 (녹색 대적색: P=0.0343; 적색 대황색: P<0.0001).
도 7G는 비침윤성, 침습성, 및 방광암 전이에서 FGFR3 발현을 보여주는 일련의 파이 차트이다. FGFR3 (IHC 2+/3+)의 높은 단백질 수준은 사례의 66%, 32%, 및 33%에서, 각각 관측되었다.
도 7H는, 모든 셋팅내 높은-발현 종양에서 더 낮은 DFS 비율을 증명하는, FGFR3-높은 및 -낮은 침습성 종양 및 방광암 전이를 갖는 환자에 대한 3- 또는 5-년 DFS 비율을 보여주는 일련의 그래프이다 (발현 컷오프 = 50번째 백분위).
도 7I는 3 및 5 년에서 전체 생존 (OS)의 비율이 FGFR3-높은 대 낮은-발현 사례에 대하여 더 낮음을 보여주는 일련의 그래프이다 (발현 컷오프 = 25번째 백분위; 높은 FGFR3, N=15; 낮은 FGFR3, N=24).
도 7J는 하기로부터 공공적으로-이용가능한 데이터세트의 분석을 보여준다: Kim 등 Mol. Cancer 9:3, 2010 (모든 카플란-마이어 플롯 (좌측 패널)에 의해 및 3- 및 5-년 OS 비율 (우측 패널)에 의해 FGFR3의 높은 ("hi") 대 낮은 ("lo") 수준을 발현시키는 진전된 방광암을 갖는 환자에 대하여 유의미하게 더 나쁜 OS 프로파일을 나타냄 (발현 컷오프=75번째 백분위; 높은 FGFR3, N=10; 낮은 FGFR3, N=52)).
도 8은 INGENUITY® 소프트웨어 (Qiagen, Redwood City, CA) 분석이 비침윤성 빠르게-재발성 녹색 그룹 및 덜-공격성 적색 그룹 사이에서 차별적으로-발현된 경우 p53, PI3K-AKT, EMT, 및 ERBB 및 FGFR3 경로를 확인하였음을 보여주는 그래프이다. 녹색 및 적색 그룹 (P<0.05, 다중 시험 보정으로) 사이에서 유의미하게 차별적으로-발현된 45/96 유전자는 분석용 입력으로서 사용되었다.
도 9A는 플루이다임 분석에 의해 결정된 바와 같이 차세대 서열분석 (NGS) 결과 및 돌연변이 상태의 컬러 맵이다 (MutMap; 참고 Schleifman 등 PloS One 9:e90761, 2014) 녹색, 황색, 및 적색 그룹으로부터 샘플내.입증된 돌연변이는 모든 NGS 및 MutMap에 의해 확인된 것이었다.
도 9B는 녹색, 적색, 및 황색 그룹에 대하여 샘플내 NGS에 의해 확인된TP53 돌연변이를 보여주는 TP53 유전자의 개략도 (막대사탕 플롯)이다. 채색된 박스는 조직 그룹 배정을 나타낸다. 유사한 수치를 갖는 박스는 동일한 샘플에서 공동-검출된 돌연변이를 나타낸다. 대부분의 돌연변이는 DNA-결합 도메인에서 클러스터링하고 비-중첩이다.
도 9C는 더욱 양성 적색 그룹과 비교된 빠르게-재발성 녹색 그룹에서 TP53 돌연변이의 유의미하게 더 높은 비율이었음을 보여주는 그래프이다 (P=0.03). TP53 돌연변이 빈도는 적색 및 황색 또는 녹색 및 황색 그룹 사이에서 유의미하게 상이하지 않았다 (P=0.1227, NS; 및 P=0.3605, NS).
도 9D는, TP53의 발현 수준이 플루이다임 유전자 발현 분석에 의해 결정된 바와 같이, 모든 적색 및 황색 그룹과 비교된 녹색 그룹에서 더 높았음을 보여주는 그래프이다 (P=0.0187 및 P=0.0020, 각각).
도 9E는 TP53 전사 표적 p21의 발현 수준이 플루이다임 유전자 발현 분석에 의해 결정된 바와 같이, 모든 적색 및 황색 그룹과 비교된 녹색에서 유의미하게 더 높았음을 보여주는 그래프이다 (모든 비교에 대하여 P<0.0001).
도 9F는 돌연변이체 TP53 샘플이 IHC에 의해 결정된 바와 같이 야생형 사례 (P=0.0201)를 했던 것보다 TP53 단백질의 더 높은 수준을 발현시켰음을 보여주는 그래프이다.
도 9G는 실시예 1에서 기재된 전체 방광암 코호트로부터 TP53-높은 및 -낮은 사례에 대하여 유사한 DFS 프로파일을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다 (모든 종양 병기; P=0.4218; TP53 높은 N=53; TP53 낮은 N=73). Hi, 높은; Lo, 낮은.
도 9H는 비침윤성 종양에서, 높은 TP53 발현이 더 나쁜 DFS 개연성에 대한 추세와 관련되는 것을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다 (HR=1.99; P=0.1292).
도 9I는 비침윤성 종양 셋팅에서, 높은 TP53 발현이 BCG-치료된 환자에서 유의미하게 더 나쁜 DFS 가능도에 연결되는 것을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다 (HR=4.2; P=0.0405).
도 9J는 비침윤성 종양에서 높은 TP53 발현이 치료를 받지 않았던 환자에 대하여 불량한 DFS 개연성과 관련되지 않는 것을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다 (HR=0.57; P=0.5749).
도 10은 방광암 시료의 서브셋에서 ERBB 경로 리간드 및 수용체 발현의 플루이다임 분석, 및 동일한 샘플내 주요 경로에서 중첩 돌연변이 및 카피수 변경의 컬러 맵이다. ERBB 수용체 및 리간드의 발현 분석, 돌연변이 분석, 및 카피수 분석은 하기에서 수행되었다: 맞춤형 플루이다임 패널 (Schleifman 등 PloS One 9:e90761, 2014). 플루이다임 돌연변이 분석에 대하여:어두운 회색 막대, 돌연변이체; 중간 회색 막대; 기술적 이유 때문에 콜 없음; 백색 막대, 해당 없음; 밝은 회색 막대, 야생형.플루이다임 DNA 카피수 분석에 대하여:어두운 회색 막대, DNA 카피수 이득; 중간 회색 막대, 기술적 이유 때문에 콜 없음; 밝은 회색 막대, DNA 카피수 변화 없음; 백색 막대, 해당 없음.
도 11A는 EGFR이 플루이다임에 의해 결정된 바와 같이, 모든 적색 및 황색 그룹과 비교된 녹색 그룹에서 유의미하게 더 높은 수준으로 발현되었음을 보여주는 그래프이다 (P=0.012 및 P=0.0012, 각각).
도 11B는 비침윤성 방광암 종양에서, 높은 EGFR 발현 수준이 3- 및 5-년 DFS의 감소된 비율과 관련되었음을 보여주는 그래프이다 (발현 컷오프=25번째 백분위; 높은 EGFR, N=22; 낮은 EGFR, N=66).
도 11C는 높은 EGFR 발현 수준이 방광암 전이를 가진 환자에 대하여 감소된 DFS 비율과 관련되었음을 보여주는 그래프이다 (발현 컷오프=25번째 백분위; 높은 EGFR, N=6; 낮은 EGFR, N=4).
도 11D는 방광암 전이를 가진 환자에서, 높은 EGFR 발현 수준이 더 낮은 3- 및 5-년 OS 비율과 관련되었음을 보여주는 그래프이다 (발현 컷오프=50번째 백분위; 높은 EGFR, N=3; 낮은 EGFR, N=7).
도 11E는 하기로부터 독립적인 데이터세트의 분석을 보여주는 그래프이다:
Figure pct00004
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012. 그래프는 높은 EGFR 발현이 더 나쁜 3- 및 5-년 OS 빈도와 관련되었음을 보여준다 (발현 컷오프 = 50번째 백분위; 높은 EGFR, N=23; 낮은 EGFR, N=28).
도 11F는 하기로부터 독립적인 데이터세트의 분석을 보여주는 그래프이다: Kim 등 Mol. Cancer 9:3, 2010. 그래프는 높은 EGFR 발현이 3 및 5 년에서 OS의 더 낮은 비율과 관련되었음을 보여준다 (발현 컷오프 = 25번째 백분위; 높은 EGFR N=48; 낮은 EGFR N=14).
도 11G는 EGFR 저해제 에를로티닙 (TARCEVA™)으로 방광암 세포주의 치료가 >25% 성장 저해 (GI)를 나타내는 3개의 감수성 세포주 (UMUC5, UMUC10, 및 UMUC17), 및 치료에 반응하여 <25% GI를 나타내는 4개의 내성 세포주 (RT112, UMUC3, SW780, 및 BFTC905)를 확인하였음을 보여주는 그래프이다.
도 11H는 EGFR이 치료에 반응하여 최소 GI를 나타내는 세포주에서 보다 에를로티닙 (TARCEVA™)에 감수성인 방광암 세포주 (>25% GI)에서 유의미하게 더 높은 수준으로 발현되는 것을 보여주는 그래프이다 (P=0.0106).
도 12A는 하기에서 기재된 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널을 포함한 유전자를 보여주는 Venn 도식이다: 실시예 1 (예를 들면, 표 1) (하기의 INGENUITY® 분석에 기반된 3개의 주요 경로 그룹에 속하는 중첩 및 고유 유전자를 실증한다: (1) FGFR, RTK, MAPK, 및 PI3K 경로; (2) 발달 및 상피간엽 이행 (EMT) 축; 및 (3) TP53, 게놈 안정성, 및 세포 사이클 조절 네트워크). 수치는 Venn 도식의 각 부분에서 고유 유전자의 수치에 상응하였다.
도 12B는,
Figure pct00005
등, 상기에 의해 정의된 바와 같이, 큰 공공 데이터세트 및 상응하는 종양 등급, 병기, 및 분자 부류로부터 샘플의 자율 계층적 클러스터링의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12C는 하기로부터 종양에 대하여 교차-입증된 오분류 에러를 보여주는 일련의 그래프이다:
Figure pct00006
등 (위에) 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널에 상응하는 프로브와 비교된 일루미나 프로브의 감소 수치에 기반된 데이터세트.각 그래프는 총 유전자의 서브셋을 가진 가장가까운 수축된 센트로이드 분류기를 이용하여 종양 등급, TNM 병기, 또는 분자 부류를 예측하기 위해 시도하면서 작성된 분류의 양을 보여준다. 유전자의 수치는 최하부 x-축상에서 보여진 상응하는 "수축 인자"와 함께 최상부 x-축을 따라 보여진다.
도 12D는 맞춤형 방광암 플루이다임 유전자 발현 패널 및 상응하는 공개된 기저/내강 상태의 유전자에 상응하는 프로브로부터 신호에 기반된 4개의 공공 데이터세트로부터 샘플의 자율 계층적 클러스터링을 보여주는 일련의 그래프이다 (Damrauer 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:3110-3115, 2014).
도 13A는 범용 RNA (uRNA) 대조군의 증가하는 입력량에 대해 6개의 대표적인 검정의 선형 성능 및 그의 미가공 CT 값을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 13B는 상이한 날에서 2개의 대표적인 FFPE-유도된 RNA 샘플 실행에 대하여 보여진 바와 같이 기록 FFPE 조직에 대하여 실행간 데이터 재현성을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 14A는 공공 데이터 세트로부터 유전자 및 샘플의 자율 클러스터링의 결과, 뿐만 아니라 실시예 1 및 도 1에서 기재된 방광암 FFPE 조직 코호트로부터 NMIBCs, MIBCs, 및 전이 (METs)를 보여주는 히트맵이다. 백색 블록은 각각의 데이터 세트에서 발견되지 않은 유전자를 나타낸다.
도 14B는 하기로부터 계산된 방광암 패널 유전자에 대하여 기저 프로파일 (적색 막대) 및 내강 프로파일 (청색 막대)을 보여주는 그래프이다: Damrauer 등 (위에) 발견 샘플.평균-중심화 및 단위 변동 정규화는 로그 변환 발현 값에 적용되었고, 평균 로그 정규화된 발현 수준은 최종 프로파일을 형성하기 위해 기저 및 내강 샘플 그룹에 대하여 독립적으로 계산되었다.
도 14C는 샘플의 기저/내강 유사성을 측정하기 위해 공공 데이터로부터 기저/내강 서명의 컴퓨팅 및 방광 패널 데이터에 이들 서명의 적용에 사용된 방법론을 보여주는 도식이다.
도 15A는 방광암 패널 유전자 발현 및 상응하는 B/L 스코어, 조직학, 및 암-관련 유전자의 돌연변이 상태에 기반된 204 FFPE 샘플 (참고 실시예 1 및 도 1)의 자율 계층적 클러스터링 (평균-연결, 1 - Pearson 상관관계 거리 미터법)의 결과를 보여준다. 참고 추가 세부사항에 대하여 실시예 6.
도 15B-15E는 도 15A에서 전사적으로-정의된 내강 및 기저 클러스터로부터 B/L 스코어 (도 15B), NMIBCs, MIBCs, 및 METs의 분포 (도 15C), FGFR3 돌연변이의 유병률 (도 15D), 및 샘플내 FGFR3 IHC 스코어 (도 15E)의 통계적인 분석을 보여주는 그래프이다.
도 15F는 도 15A에서 내강 및 기저 샘플 사이에서 유의미하게 차별적으로 발현되었던 유전자의 발현에 기반된 INGENUITY® 경로 활성화 스코어를 보여준다.
도 16A는 동일한 환자로부터 원발 종양 (X-축)에서 B/L 스코어 및 매칭된 전이 (Y-축)에서 상응하는 B/L 스코어 사이의 상관관계 플롯을 보여주는 그래프이다. 점 컬러는 SNP 유전형분석에 기반된 동일한 환자에 매칭되는 샘플의 유의성을 반영한다. Log10 (p-값) = -4 (P=0.0001), Log10 (p-값) = -3 (P=0.001), 및 Log10 (p-값) -2 (P=0.01). 점선은 전이 및 원발 샘플 B/L 스코어가 0.05의 p-값에서 상이함을 넘는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 16B는 원발 종양 ("pri")의 B/L 스코어, 매칭된 전이 ("met"), 및 매칭된 쌍으로 B/L 상태에서 발산에 대하여 상응하는 p-값을 보여주는 표이다.
도 17A 및 17B는 FFPE 조직내 2개의 그룹 사이에서 유의미하게 차별적으로 발현된 유전자에 기반된 기저 샘플과 비교된 내강에서 에스트로겐 수용체의 예측의 활성화를 보여주는 INGENUITY® 분석의 결과를 도시하는 도식이다.
도 18은 적어도 100x 판독 적용범위를 갖는 모든 변이체 부위에서 대립유전자 빈도 및 빈도 > 10%를 비교한 차세대 서열분석 (NGS) AMPLISEQ™ 데이터를 이용한 Pearson 상관관계 매트릭스이다 (평균적으로, 120 부위는 임의의 2개의 샘플 사이에서 비교되었다).
발명의 구현예의 상세한 설명
I. 도입
본 발명은 암, 예를 들어, 방광암을 위한 치료, 진단, 및 예후 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은, FGFR3 , TP53, 및/또는 EGFR을 포함한, 표 1에 제시된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준 (예를 들면, 참조 샘플에 비하여 변화된 발현 수준)의 결정이 암으로부터 고통받고 있는 환자의 치료, 암으로부터 고통받고 있는 환자의 진단, 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 결정, 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정, 및/또는 암을 가진 환자에 대한 항-암 요법의 치료 효능 최적화에 유용하다는 발견에 기반되었다. 일부 구현예에서, 항-암 요법은 그 다음 환자에 대하여 선택될 수 있고, 추가로, 항-암 요법은 환자에 임의로 투여될 수 있다.
II. 정의
용어 "발현 수준", "발현의 수준", 또는 "수준"은 상호교환적으로 사용되고 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 일반적으로 지칭한다. "발현"은 유전자-인코딩된 정보가 세포에서 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 공정을 일반적으로 지칭한다. 따라서, 본 발명에 있어서, 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, mRNA)로의 전사, 폴리펩타이드 (예를 들면, 단백질)로의 번역, 또는 심지어 폴리펩타이드의 번역후 변형을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오타이드, 번역된 폴리펩타이드, 또는 번역후로 변형된 폴리펩타이드의 단편은 또한 이들이 대안적인 스플라이싱 또는 분해된 전사체에 의해 생성된 전사체로부터, 또는, 예를 들면, 단백질분해에 의해 단백질의 번역후 가공으로부터 기원하든 아니든 발현된 것으로 여기질 수 있다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오타이드에 전사되고 그 다음 단백질로 번역되는 것, 및 또한 RNA로 전사되지만 단백질 (예를 들면, 전달 및 리보솜 RNAs)로 번역되지 않는 것을 포함한다.
용어 "마커" 및 "바이오마커"는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 또는 당지질-기반 분자 마커를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 대상체의 또는 환자의 샘플에서 이들의 발현 또는 존재는 표준 방법 (또는 본원에서 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 예를 들어, 방광암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후에 대하여 환자의 방광암 진단, 방광암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정, 방광암을 가진 항-암 환자의 치료 효능의 최적화에, 및/또는 그와 같은 마커의 발현 수준의 발달을 포함하는 치료적 방법에서 유용하다. 상기 바이오마커는, 비제한적으로, 표 1에서 제시된 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자는 하나 이상의 FGFR3, TP53, 및 EGFR일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 FGFR3이다. 일부 구현예에서, 유전자는 TP53이다. 일부 구현예에서, 유전자는 EGFR이다. 다른 구현예에서, 유전자(들)은 하기로부터 선택될 수 있다: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9, 또는 FGF2. 그와 같은 바이오마커의 발현은 참조 수준 보다 환자로부터 수득된 샘플에서 더 높은 또는 더 낮은 것으로 결정될 수 있다. 적어도 하나의 유전자의 참조 발현 수준 초과 또는 미만인 발현 수준을 가진 개인은 방광암으로부터 고통받고 있는 대상체/환자로서, 특정한 예후 (예를 들면, 호의적인 또는 불량한 예후)를 가진 환자로서, 또는 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은 것으로서 확인될 수 있다.
특정 구현예에서, 용어 "참조 수준"은 본원에서 예정된 값을 지칭한다. 숙련가가 인식할 바와 같이, 참조 수준은, 예를 들어, 특이성 및/또는 감수성에 관하여 요건을 충족시키도록 예정되고 설정된다. 이들 요건은, 예를 들면, 조절 신체부터 조절 신체까지 다양할 수 있다. 예를 들어, 검정 감수성 또는 특이성, 각각은, 예를 들면, 하기의 특정 한계로 설정될 수 있다: 80%, 90%, 95% 또는 99%. 요건은 양성 또는 음성 예측의 값에 관하여 또한 정의될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에서 주어진 교시에 기반하여 그 요건을 충족시키는 참조 수준에 도달하는 것이 항상 가능할 것이다. 하나의 구현예에서, 참조 수준은 건강한 개인에서 결정된다. 참조 수준은 하나의 구현예에서 환자가 속하는 질환 독립체 (예를 들면, 암 유형, 예컨대 방광암, 또는 방광암의 아형)에서 예정되었다. 특정 구현예에서, 참조 수준은 조사된 질환 독립체에서 값의 전체 분포의 20번째 및 95번째 백분위 사이의 임의의 백분위로 설정될 수 있다 (예를 들면, 20번째, 25번째, 30번째, 35번째, 40번째, 45번째, 50번째, 55번째, 60번째, 65번째, 70번째, 75번째, 80번째, 85번째, 90번째, 또는 95번째 백분위). 특정 구현예에서, 참조 수준은 조사된 질환 독립체에서 값의 전체 분포의 25번째 백분위로 설정된다. 다른 특정 구현예에서, 참조 수준은 조사된 질환 독립체에서 값의 전체 분포의 50번째 백분위로 설정된다. 다른 구현예에서, 참조 수준은 조사된 질환 독립체에서 또는 주어진 집단에서 값의 전체 분포로부터 결정된 바와 같이 예를 들어, 중앙, 3분위, 4분위, 또는 5분위로 설정될 수 있다. 다른 구현예에서, 참조 수준은 조사된 질환 독립체에서 또는 주어진 집단에서 값의 전체 분포로부터 결정된 바와 같이 예를 들어, 평균으로 설정될 수 있다.
특정 구현예에서, 용어 "증가하다" 또는 "초과"는, 하기에서, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 이상의 전체 증가 또는 참조 수준에서의 수준을 지칭한다: 마커의 수준 (예를 들면, FGFR3, TP53, 또는 EGFR) (참조 샘플로부터 수준에 비교된 바와 같이, 본원에서 기재된 방법에 의해 검출됨).
특정 구현예에서, 용어 "감소하다" 또는 "미만"은, 하기에서, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 전체 감소 또는 참조 수준 미만의 수준을 본원에서 지칭한다: 마커의 수준 (예를 들면, FGFR3, TP53, 또는 EGFR) (참조 샘플로부터 수준에 비교된 바와 같이, 본원에서 기재된 방법에 의해 검출됨).
특정 구현예에서, 용어 "참조 수준에서"는 하기를 지칭한다: 마커의 수준 (예를 들면, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR) (참조 샘플로부터 본원에서 기재된 방법에 의해 검출된, 수준과 동일함).
용어 "진단"은 분자 또는 병리적 상태, 질환 또는 상태 (예를 들면, 방광암을 포함한, 암)의 확인 또는 분류를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어,"진단"은 특정한 유형의 암의 확인을 지칭할 수 있다. "진단"은, 예를 들면, 조직병리적 기준, 또는 분자 특징 (예를 들면, 바이오마커 (예를 들면, 상기 유전자에 의해 인코딩된 특정한 유전자 또는 단백질)의 하나 또는 조합의 발현에 의해 특성규명된 아형)에 의해 암의 특정한 아형의 분류를 또한 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 암의 아형은 비근침윤성 방광암 (NMIBC; T0, T1), 근침윤성 방광암 (MIBC; T2, T3) 또는 전이성 방광암일 수 있다.
환자의 "반응" 또는 치료 또는 요법, 예를 들어 항-암 요법 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법)의 유효량을 포함한 치료에 대한 환자의 "반응성"은, 치료로부터 또는 치료의 결과로서 암 (예를 들면, 방광암)을 가진 또는 암에 대한 위험에 있는 환자에 부여된 임상 또는 치료적 이점을 지칭한다. 상기 이점은 세포성 또는 생물학적 반응, 완벽한 반응, 부분 반응, (진행 또는 재발 없이) 안정한 질환, 또는 길항제를 이용한 치료로부터 또는 이의 결과로서 환자의 추후 재발을 가진 반응을 포함할 수 있다. 숙련된 사람은 환자가 반응성인지를 결정할 위치에 쉽게 있을 것이다. 예를 들어, 방광암에 대하여, 반응은 방광암으로부터 감소된 고통, 예컨대 줄어든 및/또는 중단된 종양 성장, 종양의 크기 감소, 및/또는 방광암의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 소변에서 혈액 (혈뇨), 배뇨에서 변화, 다른 비뇨기 증상, 요통, 또는 골반 통증의 완화에 의해 반영될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응은 암의 전이성 전환의 감소된 또는 줄어든 지수 또는 암의 지수, 예를 들면, 전이의 형성의 예방 또는 전이의 수치 또는 크기의 감소에 의해 반영될 수 있다. 예를 들어, 반응은 하기에 제시된 바이오마커의 하나 이상의 증가된 또는 감소된 수준의 발현시 진단된 환자에서 감소된 종양 크기, 무병 생존, 무진행 생존, 또는 전체 생존일 수 있다: 표 1 (예를 들면, FGFR3, TP53, 및 EGFR) (참조 수준에 비해).
용어 "샘플" 및 "생물학적 샘플"은 체액, 신체 조직 (예를 들면, 종양 조직), 세포, 또는 다른 공급원을 포함한 개체로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 체액은, 예를 들어, 림프, 혈청, 전체의 신선한 혈액, 말초 혈액 단핵 세포, 냉동된 전혈, 플라즈마 (신선한 또는 냉동된 포함), 소변, 타액, 정액, 활막 유체 및 척수액이다. 샘플은 또한 유방 조직, 신장 조직, 결장 조직, 뇌 조직, 근육 조직, 활막 조직, 피부, 모발 소낭, 골수, 및 종양 조직을 포함한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액의 수득 방법은 당해 기술에 공지되어 있다.
"종양 샘플"은 본원에서 환자의 종양으로부터 유도된 샘플, 또는 이로부터 종양 세포를 포함한 샘플이다. 종양 샘플의 예는 본원에서, 비제한적으로, 종양 생검, 순환 종양 세포, 순환 플라즈마 단백질, 복수액, 종양으로부터 유도된 또는 종양-유사 특성을 나타내는 초대 배양 또는 세포주, 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정된, 파라핀-포매 종양 샘플 또는 냉동된 종양 샘플을 포함한다.
당해 폴리펩타이드의 "길항제" (상호교환적으로 일명"저해제")는 당해 폴리펩타이드의 활성화 또는 기능을 방해하는, 예를 들면, 당해 폴리펩타이드에 의해 매개된 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 또는 중화시키는 제제이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 X의 길항제는 폴리펩타이드 X에 의해 매개된 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 또는 중화시키는 임의의 분자를 지칭한다. 저해제의 예는 항체; 리간드 항체; 소분자 길항제; 안티센스 및 저해된 RNA (예를 들면, shRNA) 분자를 포함한다. 바람직하게는, 저해제는 당해 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 소분자이다. 특정 구현예에서, 저해제는 약 1,000 nM 이하의 당해 폴리펩타이드의 결합 친화도 (해리 상수)를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 저해제는 약 100 nM 이하의 당해 폴리펩타이드의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 저해제는 약 50 nM 이하의 당해 폴리펩타이드의 결합 친화도를 갖는다. 특정 구현예에서, 저해제는 당해 폴리펩타이드에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 저해제는 1,000 nM 이하의 절반 최대 저해된 농도 (IC50)로 당해 폴리펩타이드의 신호전달을 저해한다. 또 다른 구현예에서, 저해제는 500 nM 이하의 IC50으로 당해 폴리펩타이드의 신호전달을 저해한다. 또 다른 구현예에서, 저해제는 50 nM 이하의 IC50으로 당해 폴리펩타이드의 신호전달을 저해한다. 특정 구현예에서, 길항제는 당해 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 초과만큼 감소 또는 저해한다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 FGFR3 또는 FGFR3의 리간드이다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 EGFR 또는 FGFR3의 리간드이다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 TP53이다.
용어 "폴리펩타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 레트)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 당해 임의의 천연 폴리펩타이드 (예를 들면, 단백질)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장", 미가공된 폴리펩타이드 뿐만 아니라 세포에서 가공에서 비롯한 폴리펩타이드의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 FGFR3이다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 TP53이다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 EGFR이다.
"폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은, 본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 폴리머에 편입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 이전 또는 이후 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 이후, 예컨대 표지와 콘주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은, 예를 들어, 하기를 포함한다: "캡스", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 뉴클레오타이드간 변형 예컨대, 예를 들어, 미충전된 연결 (예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 충전된 연결 (예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)을 가진 것, 현수 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 단백질 (예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-라이신, 등)을 함유한 것, 삽입제 (예를 들면, 아크리딘, 소랄렌, 등)을 가진 것, 킬레이터 (예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속, 등)을 가진 것, 알킬화제를 함유한 것, 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형된 연결 (예를 들면, 알파 아노머성 핵산, 등), 뿐만 아니라 비변형된 형태를 가진 것.추가로, 당류에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실기는, 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가 뉴클레오타이드에 추가 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고형 또는 반-고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1 내지 20개의 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 인산화 또는 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 표준 보호기에 또한 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머성 당, 에피머 당류 예컨대 아라비노오스, 자일로스 또는 릭소스, 파이라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오사이드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드를 포함한, 당해 기술에서 일반적으로 공지되는 비슷한 형태의 리보오스 또는 데옥시리보스 당류를 또한 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적인 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는, 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"),"(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)또는', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (식중, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르 (-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유한 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-20 C)이다)에 의해 대체되는 구현예를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은, RNA 및 DNA를 포함한, 본원에서 참조된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용한다.
용어 "소분자"는 약 2000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 가진 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 비제한적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한, 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "당해 항-폴리펩타이드 항체" 및 당해 폴리펩타이드"에 결합하는 항체"는 충분한 친화도로 당해 폴리펩타이드를 결합할 수 있는 항체를 지칭하여 이로써 항체는 당해 폴리펩타이드의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하다. 하나의 구현예에서, 당해 항-폴리펩타이드 항체의 관련없는, 비-폴리펩타이드 당해 단백질에의 결합의 정도는, 예를 들면, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 당해 폴리펩타이드에 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 당해 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 하기의 해리 상수 (Kd)를 갖는다: ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M). 특정 구현예에서, 당해 항-폴리펩타이드 항체는 상이한 종으로부터 당해 폴리펩타이드 중에서 보존되는 당해 폴리펩타이드의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 FGFR3이다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 EGFR이다. 일부 구현예에서, 당해 폴리펩타이드는 TP53이다.
"차단 항체" 또는 "길항제 항체"는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해시킨다.
"친화도"는 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이에서 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍 (예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 사이에서 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는, 본원에서 기재된 것을 포함한, 당해 기술에서 공지된 공통의 방법에 의해 측정될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원을 결합시키는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. "기능성 단편"은 전장 항체의 기능을 유지하는 항체 단편이다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일 부분이 특정한 공급원 또는 종으로부터 유도되고, 반면에 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도되는 항체를 지칭한다.
용어 "전장 항체","온전한 항체", 및 "전체의 항체"는 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 또는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 가능한 변이체 항체를 제외하고, 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 함유한 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생한, 동일한 에피토프를 결합하는 및/또는 동일한 집단을 포함한 개별적인 항체를 지칭하고, 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 관련한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는, 폴리클로날 항체 제제와 대조로, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 관련한다. 따라서, 조절제"모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 때 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 필요한 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한 트랜스제닉 동물을 이용한 방법, 모노클로날 항체 제조용 상기 방법 및 다른 예시적 방법을 포함한, 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함한 인간화된 항체를 특이적으로 배제한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVRs)으로부터 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FRs)으로부터 아미노산 잔기를 포함한 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 HVRs (예를 들면, 상보성 결정 영역 (CDRs))는 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일 부분을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 경험한 항체를 지칭한다.
"면역접합체"는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 "섬유아세포 성장 인자 수용체 3" 및 "FGFR3"은 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 레트)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 천연 FGFR3을 지칭한다. 상기 용어는 세포에서"전장", 미가공된 FGFR3 뿐만 아니라 가공에서 비롯된 FGFR3의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 FGFR3의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 FGFR3 폴리펩타이드의 예시적 야생형 서열은 P22607-1 또는 P22607-2의 UniProt 데이터베이스로부터 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "FGFR3 길항제" 및 "FGFR3 저해제"는 당해 기술에서 현재 공지된 또는 미래에 확인될 수 있는 임의의 FGFR3 길항제를 지칭하고, 그의 천연 리간드의 FGFR3에 결합에서 달리 비롯된 임의의 다운스트림 생물학적 효과를 포함한, 환자내 FGFR3의 활성화와 관련된 생물학적 활성의 저해를, 환자에 투여시, 초래하는 임의의 화학 독립체를 포함한다. 상기 FGFR3 길항제는 환자의 암 치료에 관련되는 FGFR3 활성화의 임의의 다운스트림 생물학적 효과 또는 FGFR3 활성화를 차단할 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 상기 길항제는 수용체의 세포내 도메인에 직접적 결합 및 그의 키나아제 활성의 저해에 의해 작용할 수 있다. 대안적으로, 상기 길항제는 FGFR3 수용체의 리간드 결합 부위 또는 이의 부분을 차지함으로써 작용할 수 있고, 그렇게 함으로써 수용체를 그의 천연 리간드에 접근불가능하게 만들어 그의 정상 생물학적 활성이 예방 또는 감소되도록 한다. 대안적으로, 상기 길항제는 FGFR3 폴리펩타이드의 이량체화, 또는 FGFR3 폴리펩타이드의 다른 단백질과의 상호작용 조절에 의해 작용할 수 있거나, 또는 FGFR3의 유비퀴틴화 및 세포내이입 분해를 향상시킬 수 있다. FGFR3 길항제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 소분자 저해제, 항체 또는 항체 단편, 안티센스 작제물, 작은 저해된 RNAs (즉,dsRNA에 의한 RNa 간섭; RNAi), 및 리보자임.바람직한 구현예에서, FGFR3 길항제는 인간 FGFR3에 특이적으로 결합하는 소분자 또는 항체이다. 예시적 FGFR3 길항제 항체는, 예를 들어, 하기에 기재된다: 미국특허 번호8,410,250 (본원에서 참고로 전체적으로 편입된다). 예를 들어, 미국특허 번호8,410,250은 FGFR3 길항제 항체 클론 184.6, 184.6.1, 및 184.6.1N54S (이들 클론은 또한"R3 Mab"로 지칭된다)를 기재한다.
용어 "표피 성장 인자 수용체 (EGFR)","ErbB1","HER1", 및 "EGFR 키나아제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 예를 들어, 하기에 개시된 바와 같이 EGFR을 지칭한다: Carpenter 등 Ann.Rev. Biochem .56:881-914 (1987) (이의 자연 발생 돌연변이체 형태를 포함함 (예를 들면, 하기에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR: Humphrey 등 PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990))). EGFR 또는 ERBB1은 EGFR 단백질 생성물을 인코딩한 유전자를 지칭한다. 예시적 인간 EGFR 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProt 수탁 번호 P00533 하에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "EGFR 길항제" 및 "EGFR 저해제"는 당해 기술에서 현재 공지된 또는 미래에서 확인될 수 있는 임의의 EGFR 길항제를 지칭하고, 그의 천연 리간드의 EGFR에 결합에서 달리 비롯된 임의의 다운스트림 생물학적 효과를 포함한, 환자내 EGF 수용체의 활성화와 관련된 생물학적 활성의 저해를, 환자에 투여시, 초래하는 임의의 화학 독립체를 포함한다. 상기 EGFR 길항제는 환자의 암 치료에 관련되는 EGFR 활성화의 임의의 다운스트림 생물학적 효과 또는 EGFR 활성화를 차단할 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 상기 길항제는 수용체의 세포내 도메인에 직접적 결합 및 그의 키나아제 활성의 저해에 의해 작용할 수 있다. 대안적으로, 상기 길항제는 EGF 수용체의 리간드 결합 부위 또는 그의 부분을 차지함으로써 작용할 수 있고, 그렇게 함으로써 수용체를 그의 천연 리간드에 접근불가능하게 만들어서 그의 정상 생물학적 활성이 예방 또는 감소된다. 대안적으로, 상기 길항제는 EGFR 폴리펩타이드의 이량체의 조절, 또는 EGFR 폴리펩타이드의 다른 단백질과의 상호작용에 의해 작용할 수 있거나, 또는 EGFR의 유비퀴틴화 및 세포내이입 분해를 향상시킬 수 있다. EGFR 길항제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 소분자 저해제, 항체 또는 항체 단편, 안티센스 작제물, 작은 저해된 RNAs (즉,dsRNA에 의한 RNa 간섭; RNAi), 및 리보자임.바람직한 구현예에서, EGFR 길항제는 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 소분자 또는 항체이다.
본 발명에서 사용에 적합한 예시적 EGFR 길항제는, 예를 들어, 퀴나졸린 EGFR 키나아제 저해제, 피리도-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피리미도-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피롤로-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피라졸로-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 페닐아미노-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 옥신돌 EGFR 키나아제 저해제, 인돌로카바졸 EGFR 키나아제 저해제, 프탈라진 EGFR 키나아제 저해제, 이소플라본 EGFR 키나아제 저해제, 퀴날론 EGFR 키나아제 저해제, 및 타이르포스틴 EGFR 키나아제 저해제, 예컨대 하기 특허에 기재된 것, 및 EGFR 키나아제 저해제의 모든 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물을 포함한 소분자 EGFR 길항제를 포함한다: 국제 특허 공개 번호WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701, 및 WO 92/20642; 유럽 특허 출원 번호 EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063, 및 EP 682027; 미국특허 번호5,747,498, 5,789,427, 5,650,415, 및 5,656,643; 및 독일 특허 출원 번호 DE 19629652.소분자 EGFR 길항제의 추가 비-제한 예는 하기에 기재된 임의의 EGFR 키나아제 저해제를 포함한다: Traxler, Exp . Opin . Ther . Patents 8(12): 1599-1625 (1998).
본 발명에 따라 사용될 수 있는 소분자 EGFR 길항제의 특이적 바람직한 예는 하기를 포함한다: [6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐) 아민 (또한 OSI-774, 에를로티닙, 또는 TARCEVA™ (에를로티닙 HCl)로서 공지됨; OSI Pharmaceuticals /Genentech/Roche) (미국특허번호 5,747,498; 국제 특허 공개 번호WO 01/34574, 및 Moyer 등 Cancer Res. 57:4838-4848 (1997)); CI-1033 (PD183805로서 예전에 공지됨; Pfizer) (Sherwood 등, Proc . Am. Assoc .Cancer Res. 40:723 (1999)); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (University of California); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (또한 GW-572016 또는 라파티닙 디토실레이트로서 공지됨; GSK); 및 게피티닙 (또한 ZD1839 또는 IRESSA™로서 공지됨; Astrazeneca) (Woodburn 등, Proc . Am. Assoc.Cancer Res. 38:633 (1997)). 본 발명에 따라 사용될 수 있는 특히 바람직한 소분자 EGFR 키나아제 저해제는 하기이다: [6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐) 아민 (즉, 에를로티닙), 그의 하이드로클로라이드 염 (즉, 에를로티닙 HCl, TARCEVA™), 또는 다른 염 형태 (예를 들면, 에를로티닙 메실레이트).
예시적 EGFR 길항제 항체는 하기에 기재된 것을 포함한다: Modjtahedi, 등, Br. J. Cancer 67:247-253 (1993); Teramoto 등, Cancer 77:639-645 (1996); Goldstein 등, Clin . Cancer Res. 1:1311-1318 (1995); Huang, 등, Cancer Res. 15:59(8): 1935-40 (1999); 및 Yang 등, Cancer Res. 59:1236-1243 (1999). 따라서, 일부 구현예에서 EGFR 길항제 항체는 하기일 수 있다: 모노클로날 항체 Mab E7.6.3 (Yang 등 Cancer Res. 59:1236-43 (1999)), 또는 Mab C225 (ATCC 수탁 번호HB-8508), 또는 이들의 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편.적합한 모노클로날 EGFR 길항제 항체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: IMC-C225 (세툭시맙 또는 ERBITUX™로서 또한 공지됨; Imclone Systems), ABX-EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.), 및 MDX-447 (Medarex/ Merck KgaA).
본원에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "TP53","세포성 종양 항원 p53", 및 "p53"은 393 아미노산 인단백질을 인코딩한 강력한 종양 억제제 단백질을 지칭한다. TP53은 많은 암에서 부정적으로 조절되거나 또는 돌연변이된다. TP53의 부재 또는 불활성화는 암에 기여할 수 있다. 다양한 TP53 돌연변이가 존재한다. 일부 사례에서, 암은 TP53, 특히, TP53의 돌연변이체 버전을 과발현시킬 수 있다. "야생형" TP53은 정상 (즉, 비-암성 세포)에서 발견된 TP53 또는 암과 상관된 돌연변이를 갖지 않는 TP53이다. 샘플의 TP53 상태 (예를 들면, 샘플이 야생형 또는 돌연변이체 TP53을 포함하는지)는 예를 들어 하기 기재된 바와 같이 평가될 수 있다: 미국특허번호 6,090,566 (Vogelstein 등에 의해 발행됨), 또는 예컨대 본원에서 기재된 또는 당해 기술에서 공지된 표준 기술 이용.TP53 분자는, 비제한적으로, 예를 들어 하기에 제시된 것과 실질적으로 동일한 서열 및 하기를 함유한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다: UniProt 수탁 번호P04637 및 그 서열에 의해 인코딩된 핵산 분자.
"티로신 키나아제 저해제"는 티로신 키나아제 예컨대 EGFR 수용체 또는 FGFR3 수용체의 티로신 키나아제 활성을 어느 정도까지 저해하는 길항제 분자이다.
"바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신"은 TB의 높은 위험에 있는 또는 TB가 공통인 사람에서 결핵 (TB)을 예방하기 위해 사용된 백신을 지칭한다. TB를 유발하는 박테리아에 유사한, 마이코박테리움 보비스 (바실러스 칼메트-게랑)으로 불리는 박테리움의 약화된 형태로부터 제조된다. 백신은 신체 면역계가 항체로 하여 TB 박테리아를 파괴하도록 만드는데 일조할 수 있다. 면역계가 암 세포를 사멸시키는데 일조할 수 있고, 예를 들어 방광암에서 치료로서 사용된다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장에 의해 전형적으로 특성규명된 포유동물에서 생리적 조건을 지칭 또는 기재한다. 양성 및 악성 암이 상기 정의에 포함된다. "초기 단계 암" 또는 "초기 단계 종양"은 침습성 또는 전이성이 아닌 또는 0, I, 또는 II 기 암으로서 분류되지 않는 암을 의미한다. 암의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종, 및 소도 세포 암 포함), 중피종, 신경집종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양.상기 암의 더욱 특정한 예는 하기를 포함한다: 방광암, 편평상피 세포 암 (예를 들면, 상피 편평상피 세포 암), 소-세포 폐암 (SCLC), 비-소 세포 폐암 (NSCLC)을 포함한 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장 암을 포함한 위 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 간종양, 유방 암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관의 종양, 뿐만 아니라 머리 및 목 암 및 다발성 골수종.
용어 "전-암성"은 암으로 전형적으로 선행하는 또는 발달하는 상태 또는 성장을 지칭한다. "전-암성" 성장은, 세포 사이클 조절, 세포성 증식, 또는 분화의 마커에 의해 결정될 수 있는, 비정상 세포 사이클 조절, 증식, 또는 분화에 의해 특성규명되는 세포를 가질 것이다.
"종양"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 악성 또는 양성이든, 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다용어 "암","암성","세포 증식성 장애", 및 "종양"은 본원에서 지칭되는 바와 같이 상호 배타적이 아니다.
"전이"는 그의 원발 부위부터 신체의 다른 국소까지 암의 확산을 의미한다. 암 세포는 원발 종양으로부터 벗어날 수 있고, 림프 및 혈관에 침투할 수 있고, 혈류를 통해 순환할 수 있고, 신체내 다른 곳에서 정상 조직내 원격 병소에서 성장 (전이)할 수 있다. 전이는 국부 또는 원격일 수 있다. 전이는 순차적인 과정이고, 원발 종양으로부터 끊어지는 종양 세포에 의존하고, 혈류를 통해 이동하고, 그리고 원격 부위에서 정지한다. 신규 부위에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 생명을 위협하는 덩어리를 형성하도록 성장할 수 있다. 종양 세포 내의 모든 자극 및 저해 분자 경로는 상기 행동을 조절하고, 원격 부위에서 종양 세포와 숙주 세포 사이의 상호작용은 또한 유의미하다.
"비-전이성"은 양성인 또는 원발 부위에서 남아있고 원발 부위 이외의 조직에 또는 림프계 또는 혈관계에 침투하지 않는 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0, I, 또는 II 기 암, 및 가끔 III 기 암인 임의의 암이다.
용어 "항-암 요법"은 암 치료에 유용한 요법을 지칭한다. 항-암 치료제의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 길항제, 화학치료제, 성장 저해제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용된 제제, 항-혈관신생 제제, 세포자멸적 제제, 항-튜불린 제제, 및 암을 치료하기 위한 다른 제제, 항-CD20 항체, 혈소판 유도된 성장 인자 저해제 (예를 들면, GLEEVEC™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 저해제 (예를 들면, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, 하나 이상의 하기 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 길항제 (예를 들면, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학 제제, 등. 특정 구현예에서, 길항제는 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 또는 EGFR 길항제이다. 이들의 조합은 본 발명에서 또한 포함된다.
"방사선 요법"은 전적으로 세포를 파괴하도록 또는 정상적으로 기능하도록 그의 능력을 제한하기 위해 세포에 충분한 손상을 유도하는 관련된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 치료의 복용량 및 지속시간을 결정하기 위해 당해 기술에서 공지된 많은 방식이 있을 것이라는 것이 인정될 것이다. 전형적인 치료는 1회용 투여로서 주어지고 전형적인 복용량은 10 내지 200 단위 (Grays) / 1일 범위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료","치료하는 ", 또는 이의 다른 문법적 변이는 치료받는 개체 또는 세포의 자연스로운 과정을 변경하기 위한 시도에서 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리학의 과정의 예방을 위하여 또는 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전이의 예방, 질환 진행의 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-암 요법 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법)은 질환 또는 장애의 발달을 지연하기 위해 사용된다.
"유효량"은, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 및 복용량에서, 유효한 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료적 유효량"은 인자 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력에 따라 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 덜 우세한 것이다. 용어 "치료적 유효량"은 포유동물 (예를 들면, 환자)에서 질환 또는 장애를"치료하기"에 유효한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 길항제의 양을 지칭한다. 암의 경우에서, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고; 주변 기관에 암 세포 침윤을 저해 (즉, 어느 정도까지 저속화 및 바람직하게는 정지)시킬 수 있고; 종양 전이를 저해 (즉, 저속화 및 바람직하게는 정지)시킬 수 있고; 어느 정도까지, 종양 성장을 저해시킬 수 있고; 및/또는 어느 정도까지 암과 관련된 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있다. 어느 정도까지 약물은 현존하는 암 세포를 사멸시킬 수 있고/있거나 성장을 예방할 수 있고, 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료적 유효량은 성장 저해 양이다. 암 요법에 대하여, 생체내 효능은, 예를 들어, 생존의 지속시간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 무병 생존 (DFS)의 지속시간, 무진행 생존 (PFS)의 지속시간, 반응 속도 (RR), 반응의 지속시간, 및/또는 삶의 질의 평가에 의해 측정될 수 있다.
용어 "생존"은 살아남은 환자를 지칭하고, 전체 생존 뿐만 아니라 무병 생존을 포함한다.
용어 "전체 생존"은 규정된 기간, 예컨대 진단 또는 치료의 시간부터 1 년, 5 년, 등 동안 살아남은 환자를 지칭한다.
어구"무진행 생존"은 본 발명의 맥락에서, 치료하는 의사 또는 조사자의 평가에 따라, 환자의 질환이 악화되지 않는, 즉, 진행하지 않는 동안 치료 동안 또는 이후 시간의 길이를 지칭한다. 숙련가가 인식할 바와 같이, 유사하게 자리잡은 환자의 대조 그룹의 평균 또는 중위 무진행 생존 시간과 비교된 경우 질환이 진행하지 않는 동안 환자가 더 긴 시간의 길이를 경험하면 환자의 무진행 생존은 개선 또는 향상된다.
어구"무병 생존 (DFS)"은 환자가 암의 임의의 징후 또는 증상 없이 생존하는 암 목적에 대하여 1차 치료 이후 시간의 길이를 지칭한다.
"확장 생존"은, 미치료된 환자에 비하여 (즉, 항-암 요법 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법)으로 치료되지 않은 환자에 비하여, 또는 지정된 참조 수준에서 FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR을 발현시키지 않는 환자에 비하여 치료된 환자에서, 생존, 예를 들어, 전체 또는 무병 생존의 증가를 의미한다.
용어 "세포독성제"는 본원에서 사용된 바와 같이 세포의 기능을 저해 또는 예방 및/또는 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 하기를 포함하는 의도이다: 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 약물, 효소 및 이의 단편 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소 예컨대, 이들의 단편 및/또는 변이체를 포함한, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성 독소, 및 아래 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제.다른 세포독성제는 아래 기재된다. 종양파괴 제제는 종양 세포의 파괴를 유발시킨다.
"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학 화합물이다. 화학치료제의 예는 하기를 포함한다: 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로스포스파마이드; 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에티일렌포스포르아미드, 트리에티일렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL ®); 베타-라파콘; 라파콘; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 나이트로수레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (참고, 예를 들면, Agnew, Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186 (1994)); 다이네마이신 A를 포함한, 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.),파클리탁셀의 ABRAXANETM 크레모포어-없는, 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 도세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 젬시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틀힐오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 상기 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 2 이상의 조합 예컨대 CHOP (사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 합치된 요법에 대한 약어), 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)을 이용한 치료 레지멘에 대한 약어). 추가 화학치료제는 항체 약물 콘주게이트로서 유용한 세포독성제, 예컨대 메이탄시노이드 (DM1, 예를 들어) 및 아우리스타틴 MMAE 및 MMAF를, 예를 들어 포함한다.
"화학치료제"는 또한 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단, 또는 저해하는 작용을 하는, 및 종종 전신, 또는 전신 치료의 형태인"항-호르몬제"를 포함한다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 예는 하기를 포함한다: 예를 들어, 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), EVISTA® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON® 토레미펜을 포함한, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERMs); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 다운-조절물질 (ERDs); 난소를 억압 또는 폐쇄하는 기능을 하는 제제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제 예컨대 LUPRON® 및 ELIGARD® 류프롤라이드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드 및 바이칼루타마이드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는, 효소 방향화효소를 저해하는 방향화효소 저해제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸.또한, 화학치료제의 상기 정의는 하기를 포함한다: 비스포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), DIDROCAL® 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA® 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX® 알렌드로네이트, AREDIA® 팔미드로네이트, SKELID® 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL® 리센드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예컨대, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 백신 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 저해제; ABARELIX® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로서 또한 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나아제 소-분자 저해제); 및 상기 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
본원에서 사용될 때 "성장 저해제"는 시험관내 또는 생체내 세포 (예를 들면, 방광암 세포)의 성장 및/또는 증식을 저해하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 저해제는 S 상에서 세포의 백분율을 유의미하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 저해제의 예는 (S 상 이외의 국소에서) 세포 사이클 진행을 차단하는 제제, 예컨대 G1 정지 및 M-상 정지를 유도하는 제제를 포함한다. 고전적 M-상 차단제는 하기를 포함한다: 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 저해제 예컨대 안트라사이클린 항생제 독소루비신 ((8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온), 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신.G1을 정지시키는 제제들, 예를 들어, DNA 알킬화제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C는 또한 S-상 정지를 번지게 한다. 추가 정보는 아래에서 발견될 수 있다: "The Molecular Basis of Cancer", Mendelsohn and Israel, eds.,Chapter 1, 명칭"세포 사이클 조절, 종양유전자, 및 항신생물성 약물" Murakami 등 저(WB Saunders:Philadelphia, 1995), 특히 p.13.탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목 나무로부터 모두 유도된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유도된, 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은, 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 어셈블리를 촉진시키고, 세포에서 유사분열의 저해를 초래하는, 해중합의 예방에 의해 미세소관을 안정화시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호교환적으로 사용되고, 치료가 요구되는 임의의 단일 동물, 더 바람직하게는 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양, 및 비-인간 영장류 같은 비-인간 동물을 포함한) 포유동물을 지칭한다. 가장 바람직하게는, 본원에서 환자는 인간이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "투여"는 대상체 (예를 들면, 환자)에 화합물 (예를 들면, 길항제) 또는 약학적 조성물 (예를 들면, 길항제를 포함한 약학적 조성물)의 복용량 제공 방법을 의미한다. 투여는, 비경구, 폐내, 및 비강내를 포함한, 임의의 적합한 수단에 의해, 및, 원한다면 국부 치료, 병소내 투여로 될 수 있다. 비경구 주입은, 예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 잠시 또는 만성인지를 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사로 될 수 있다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 복용 계획은 본원에서 고려된다.
용어 "유효량"은 장애의 치료, 예를 들어, 암의 치료에 유효한 약제의 양을 지칭한다
용어 "약학적 제형"은 약제의 생물학적 활성이 유효하도록 하기 위한 그런 형태인, 및 제형이 투여될 대상체에 허용불가능한 독성인 추가 구성요소를 함유하지 않은 멸균된 제제를 지칭한다.
"멸균된" 제형은 무균성이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없다.
"포장 삽입물"은, 징후, 용법, 복용량, 투여, 사용금지사유, 포장 제품과 조합되는 다른 치료 제품, 및/또는 상기 치료 제품 또는 약제의 사용에 관한 경고, 등에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품 또는 약제의 상업적 패키지에서 관례상 포함된 사용설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
"키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들면, 암 (예를 들면, 방광암)의 치료용 약제를 포함한 임의의 제작품 (예를 들면, 패키지 또는 컨테이너), 또는 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브이다. 상기 제작품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 장치로서 바람직하게는 촉진된, 분포된, 또는 판매된다.
본원에서 사용될 때 단어 "표지"는 시약 예컨대 핵산 프로브 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합 또는 융합되는 그리고 접합 또는 융합되는 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 상기 표지 (예를 들면, 방사선동위원소 표지 또는 형광성 표지)는 자체 검출가능할 수 있거나, 또는 효소 표지의 경우에서, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학 변경을 촉매화시킬 수 있다. 상기 용어는 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질의 커플링 (즉, 물리적으로 연결)에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화, 뿐만 아니라 직접적으로 표지되는 또 다른 시약과 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 의도이다. 간접적인 표지화의 예는 형광성으로 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 형광성으로 표지된 2차 항체를 이용한 1차 항체의 검출 및 바이오틴으로 DNA 프로브의 말단-표지화를 포함한다.
III. 치료적 방법
본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다. 용어 암은, 비제한적으로 전-암성 성장, 양성 종양, 및 악성 종양을 포함한, 증식성 장애의 집합을 포함한다. 양성 종양은 기원의 부위에서 국재화되어 있고 원격 부위를 침투, 침범, 또는 전이하기 위한 수용력을 갖지 않는다. 악성 종양은 그들 주위의 다른 조직을 침범 및 손상시킬 것이다. 이들은, 보통 혈류를 통해 또는 림프절이 위치한 림프계를 통해, 최초 부위로부터 떨어지고 신체의 다른 부분까지 확산하는 (전이하는) 능력을 또한 얻을 수 있다. 원발 종양은 이들이 발생하는 조직의 유형에 의해 분류되고; 전이성 종양은 암 세포가 유도되는 조직 유형에 의해 분류된다. 경시적으로, 악성 종양의 세포는 더욱 비정상이 되고 정상 세포에 덜 비슷하게 보인다. 암 세포의 외관에서 상기 변화는 종양 등급으로 불리우고, 암 세포는 양호하게-분화된 (낮은 등급), 중간-분화된, 저조하게-분화된, 또는 미분화 (높은 등급)으로서 기재된다. 양호하게-분화된 세포는 상당히 정상 외관이고 이들이 유래된 정상 세포를 닮는다. 미분화 세포는 세포의 기원을 결정하는 것이 더 이상 가능하지 않은 매우 비정상이 되는 세포이다. 특정 구현예에서, 발명은 방광암의 치료 방법을 제공한다.
암 병기 시스템은 암이 해부상으로 얼마나 멀리 확산하였는지를 기재하고 동일한 병기 그룹에서 유사한 예후 및 치료로 환자를 평가하기 위한 시도이다. 몇 개의 시험은 생검 및 특정 화상 시험 예컨대 가슴 x-선, 유방조영술, 골 스캔, CT 스캔, 및 MRI 스캔을 포함한 암의 병기화를 돕기 위해 수행될 수 있다. 혈액 검사 및 임상 평가는 환자의 전체 건강을 평가하기 위해 및 암이 특정 기관까지 확산되었는지를 검출하기 위해 또한 사용된다.
암을 병기화하기 위해, 미국 암연합 위원회는 암, 특히 고형 종양을 TNM 분류 시스템을 이용한 문자 카테고리로 최초로 등급을 정한다. 암은 문자 T (종양 크기), N (촉지가능한 결절), 및/또는 M (전이)으로 지정된다. T1, T2, T3, 및 T4는 원발 병변의 크기 증가를 기재하고; N0, N1, N2, N3은 점진적으로 진전하는 결절 관여를 나타내고; 그리고 M0 및 M1은 원격 전이의 부재 또는 존재를 반영한다.
전체 병기 그룹화 또는 로마식 숫자 병기화로서 또한 공지된, 제2 병기화 방법에서, 암은, 원발 병변의 크기 뿐만 아니라 확산된 결절 및 원격 전이의 존재를 편입한, 0 내지 IV 기로 분할된다. 상기 시스템에서, 사례는 로마식 숫자 I 내지 IV로 나타낸 4개의 병기로 그룹화되거나, 또는 "재발성"으로서 분류된다. 일부 암에 대하여, 0 기는 "동소" 또는 "Tis", 예컨대 유방 암에 대해 유관 상피내 암종 또는 유방 상피내 암종으로 지칭된다. 높은 등급 샘종은 0 기로서 또한 분류될 수 있다. 일반적으로, I 기 암은 보통 경화성인 작은 국재화된 암이고, 반면에 IV 기는 보통 수술불가능한 또는 전이성 암을 나타낸다. II 및 III 기 암은 보통 국소로 진전되고/되거나 국부 림프절의 관여를 나타낸다. 일반적으로, 더 높은 병기 숫자는 주변 림프절 및/또는 원발 종양에 인접한 기관까지 암의 확산 및/또는 더 큰 종양 크기를 포함한, 더욱 광범위한 질환을 나타낸다. 이들 병기는 정확하게 정의되지만, 그러나 상기 정의는 암의 각 종류에 대하여 상이하고 숙련가에 공지된다.
많은 암 등록, 예컨대 NCI의 조사, 역학, 및 최종 결과 프로그램 (Surveillance, Epidemiology, and End Results Program; SEER)은, 요약 병기화를 사용한다. 상기 시스템은 모든 유형의 암에 사용된다. 암 사례를 5개의 주요 카테고리로 그룹화한다:
동소는 시작된 세포의 층에서만 존재하는 초기 암이다.
국재화된은, 확산의 증거 없이, 시작된 장기에 제한되는 암이다.
국소는 최초 (원발) 부위를 넘어서 주변 림프절 또는 기관 및 조직까지 확산하는 암이다.
원격은 원발 부위로부터 원격 기관 또는 원격 림프절까지 확산하는 암이다.
미공지된은 병기를 나타내기 위한 충분한 정보가 없는 사례를 기재하는데 사용된다.
또한, 원발 종양이 제거된 몇개월 또는 몇년 이후 암이 되돌아오는 것이 공통이다. 모든 가시적인 종양이 박멸된 이후 재발하는 암은 재발성 질환으로 불리운다. 원발 종양의 영역에서 재발하는 질환은 국재로 재발성이고, 전이로서 재발하는 질환은 원격 재발로 지칭된다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연 조직 종양일 수 있다. 연 조직 종양의 예는 하기를 포함한다: 백혈병 (예를 들면, 만성적 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙한 B-세포 급성 림프아구성 백혈병, 만성적 림프구성 백혈병, 포림프구 백혈병, 또는 모발 세포 백혈병) 또는 림프종 (예를 들면, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 또는 호지킨 질환). 고형 종양은 혈액, 골수, 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 것 및 비-상피 세포 기원의 것으로 추가로 분할될 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예는 방광, 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 머리 및 목, 구강, 위, 십이지장, 작은 창자, 큰 창자, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식기 장기, 비뇨기, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피 기원의 고형 종양은 육종, 뇌 종양, 및 골 종양을 포함한다. 종양의 다른 예는 정의 섹션에서 기재된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 여기에서 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커 (예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커)의 적어도 하나의 발현 수준은 본 발명의 바이오마커의 참조 수준에 비하여 변화되도록 결정되었다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하는 암 (예를 들면, 방광암)의 치료 방법을 제공하고, 여기에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준 (예를 들면, 표 1에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96 유전자)는 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 변화되도록 결정되었다.
또 다른 실시예에서, 일부 구현예에서, 본 발명은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하는 암 (예를 들면, 방광암)의 치료 방법을 제공하고, 여기에서 표 4에 열거된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준 (예를 들면, 표 4에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48 유전자)는 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 변화되도록 결정되었다. 일부 구현예에서, 변화는 증가이다. 다른 구현예에서, 변화는 감소이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 여기에서 하기 유전자의 적어도 하나의 발현 수준:FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR은 환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 증가되도록 결정되었다. 본 발명의 바이오마커의 발현 수준 (예를 들면, 표 1에 열거된 유전자, 예를 들어, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR) 은 본원에서 기재된 임의의 방법 또는 검정 (예를 들면, 본 발명의 상세한 설명의 섹션 IV 또는 실시예에서 기재된 방법 또는 검정)을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 방광암은 NMIBC이다. 다른 구현예에서, 방광암은 MIBC이다. 추가의 다른 구현예에서, 방광암은 전이성 방광암이다. 환자는 암의 진전된, 난치의, 재발성, 및/또는 화학요법-내성 형태를 임의로 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자는 재발성 방광암, 예를 들어, 재발성 NMIBC를 가질 수 있다.
본 발명의 임의의 이전 방법에서, 본 발명의 바이오마커의 발현 수준 (예를 들면, 표 1에 열거된 유전자, 예를 들어, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR)은 환자로부터 수득된 샘플에서 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 변화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 다른 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 감소될 수 있다.
특정 구현예에서, 하기의 발현 수준: 적어도 하나 (예를 들면, 1, 2, 또는 3) 의 하기:FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR는 환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 예를 들어, FGFR3의 발현 수준은 FGFR3의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 또 다른 사례에서, TP53의 발현 수준은 TP53의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 추가의 또 다른 사례에서, EGFR의 발현 수준은 EGFR의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 참조 수준은 주어진 암 유형 (예를 들면, 방광암)에서 바이오마커 (예를 들어, FGFR3, TP53, 또는 EGFR)의 발현 수준의 전체 분포의, 예를 들어, 20번째 백분위와 99번째 백분위 사이의 임의의 백분위 (예를 들면, 20번째, 25번째, 30번째, 35번째, 40번째, 45번째, 50번째, 55번째, 60번째, 65번째, 70번째, 75번째, 80번째, 85번째, 90번째, 95번째, 또는 99번째 백분위)로 설정될 수 있다. 특정 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 25번째 백분위로 설정될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 50번째 백분위로 설정될 수 있다. 다른 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 중앙일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자에 하기를 포함하는 항-암 요법의 투여를 포함한다: 하나 이상 (예를 들면, 1, 2, 또는 3) 의 하기:FGFR3 길항제, TP53, 및/또는 EGFR 길항제.예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법의 투여를 포함한다. 다른 경우에서, 상기 방법은 FGFR3 길항제 및 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법의 투여를 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 상기 방법은 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법의 투여를 포함할 수 있다.
임의의 이전 방법에서, FGFR3 길항제는 FGFR3 길항제 항체 또는 소분자 FGFR3 길항제일 수 있다. 예시적 FGFR3 길항제 항체, 예컨대 184.6, 184.6.1, 및 184.6.1N54S는, 예를 들어, 하기에 기재된다: 미국특허 번호8,410,250 (본원에서 참고로 전체적으로 편입된다). 일부 구현예에서, 소분자 FGFR3 길항제는 티로신 키나아제 저해제이다.
임의의 이전 방법에서, TP53 길항제는 TP53 길항제 항체 또는 소분자 TP53 길항제일 수 있다.
임의의 이전 방법에서, EGFR 길항제는 EGFR 길항제 항체 또는 소분자 EGFR 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자 FGFR3 길항제는 티로신 키나아제 저해제이다. 특정 구현예에서, 소분자 FGFR3 길항제는 에를로티닙 (TARCEVA™)이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 예시적 EGFR 길항제는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 퀴나졸린 EGFR 키나아제 저해제, 피리도-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피리미도-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피롤로-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 피라졸로-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 페닐아미노-피리미딘 EGFR 키나아제 저해제, 옥신돌 EGFR 키나아제 저해제, 인돌로카바졸 EGFR 키나아제 저해제, 프탈라진 EGFR 키나아제 저해제, 이소플라본 EGFR 키나아제 저해제, 퀴날론 EGFR 키나아제 저해제, 및 타이르포스틴 EGFR 키나아제 저해제를 포함한 소분자 EGFR 길항제, 예컨대 하기 특허 공개에 기재된 것, 및 EGFR 키나아제 저해제의 모든 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물:국제 특허 공개 번호WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701, 및 WO 92/20642; 유럽 특허 출원 번호 EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063, 및 EP 682027; 미국특허 번호5,747,498, 5,789,427, 5,650,415, 및 5,656,643; 및 독일 특허 출원 번호 DE 19629652.소분자 EGFR 길항제의 추가 비-제한 예는 하기에 기재된 임의의 EGFR 키나아제 저해제를 포함한다: Traxler, Exp . Opin . Ther . Patents 8(12): 1599-1625 (1998).
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 소분자 EGFR 길항제의 특이적 바람직한 예는 하기를 포함한다: [6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐) 아민 (OSI-774, 에를로티닙, 또는 TARCEVA™ (에를로티닙 HCl)로서 또한 공지됨; OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (미국특허번호 5,747,498; 국제 특허 공개 번호WO 01/34574, 및 Moyer 등, Cancer Res. 57:4838-4848 (1997)); CI-1033 (PD183805로서 예전에 공지됨; Pfizer) (Sherwood 등, 1999, Proc . Am. Assoc.Cancer Res. 40:723); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (University of California); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (GW-572016 또는 라파티닙 디토실레이트로서 또한 공지됨; GSK); 및 게피티닙 (ZD1839 또는 IRESSA™로서 또한 공지됨; Astrazeneca) (Woodburn 등, 1997, Proc. Am. Assoc.Cancer Res. 38:633).
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 예시적 EGFR 길항제 항체는 하기에 기재된 것을 포함한다: Modjtahedi, 등, Br. J. Cancer 67:247-253 (1993); Teramoto 등, Cancer 77:639-645 (1996); Goldstein 등, Clin . Cancer Res. 1:1311-1318 (1995); Huang, 등, Cancer Res. 15:59(8): 1935-40 (1999); 및 Yang 등, Cancer Res. 59:1236-1243 (1999). 따라서, 일부 구현예에서 EGFR 길항제 항체는 하기일 수 있다: 모노클로날 항체 Mab E7.6.3 (Yang 등, Cancer Res. 59:1236-43 (1999)), 또는 Mab C225 (ATCC 수탁 번호HB-8508), 또는 이들의 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편.적합한 모노클로날 EGFR 길항제 항체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: IMC-C225 (세툭시맙 또는 ERBITUX™로서 또한 공지됨; Imclone Systems), ABX-EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.), 및 MDX-447 (Medarex/ Merck KgaA).
특정 구현예에서, 암은 FGFR3, 증폭된 FGFR3, 전위된 FGFR3, 및/또는 돌연변이된 FGFR3을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 활성화된 FGFR3을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 전위된 FGFR3 (예를 들면, t(4;14) 전좌)을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 구성적 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 구성적 FGFR3은 티로신 키나아제 도메인 및/또는 막근접 도메인 및/또는 리간드-결합 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 리간드-독립적인 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 리간드-의존적 FGFR3을 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbS248C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIb S248C 및/또는 FGFR3-IIIcS248C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbK652E에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIb K652E 및/또는 FGFR3-IIIc K650E를 발현시킨다.
FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbS249C 및/또는 FGFR3-IIIc S249C를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbG372C 및/또는 FGFR3-IIIc G370C를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbY375C 및/또는 FGFR3-IIIcY373C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbK652E 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3IIIb G372C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbR248C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbG372C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbR248C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 및 FGFR3-IIIb G372C를 발현시킨다.
특정 구현예에서, 암은 대조군 샘플 (예를 들면, 정상 조직의 샘플) 또는 수준에 비하여 포스포-FGFR3, 포스포-FRS2 및/또는 포스포-MAPK의 증가된 수준을 발현시킨다.
항-암 요법, 예를 들어, 길항제 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제)를 포함한 항-암 요법을 포함한 조성물은 양호한 의료 실시와 일치된 방식으로 제형화, 복용, 및 투여될 것이다. 상기 맥락에서 고려용 인자는 치료받는 암의 특정한 유형, 치료받는 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 조건, 암의 원인, 제제의 전달 부위, 가능한 부작용, 길항제의 유형, 투여의 방법, 투여의 일정, 및 개업의에 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 길항제의 유효량은 상기 고려사항들에 의해 지배될 수 있다.
본 발명의 치료제는, 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼러스로서 정맥내 투여 또는, 근육내, 복강내, 내척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해, 일정 기간에 걸쳐 연속 주입으로, 인간 환자에 투여된다. 생체외 전략은 치료적 적용에 또한 사용될 수 있다. 생체외 전략은 길항제를 인코딩한 폴리뉴클레오타이드를 가진 상기 대상체로부터 수득된 형질감염된 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 형질감염된 또는 형질도입된 세포는 그 다음 상기 대상체에게 되돌려진다. 세포는, 비제한적으로, 조혈 세포 (예를 들면, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포, 케라틴생성세포, 또는 근육 세포를 포함한 임의의 광범위한 유형일 수 있다.
예를 들어, 항-암 요법이 길항제 항체 (예를 들면, FGFR3 길항제 항체, TP53 길항제 항체, 또는 EGFR 길항제 항체)를 포함하면, 항체는, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내를 포함한, 임의의 적합한 수단에 의해, 및, 원한다면 국부 면역억제성 치료, 병소내 투여로 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체의 감소하는 용량으로 적합하게 투여된다. 바람직하게는 투약은, 투여가 잠시 또는 만성적인지에 부분적으로 의존하여, 주사로, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사로 주어진다.
또 다른 실시예에서, 종양의 장애 또는 위치가 허용하는 경우, 및 주사가 주기적으로 반복될 수 있는 경우, 길항제 화합물은, 예를 들어, 직접적인 주사에 의해 국소로 투여된다. 길항제는, 국부 재발 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위해, 상기 대상체에 전신으로 또는 종양 세포, 예를 들면, 종양 또는 종양의 외과 절개후 종양층에 직접적으로 또한 전달될 수 있다.
항-암 요법은, 항-암 특성을 갖는 적어도 하나의 추가 화합물과, 조합 요법으로서 약학적 조합 제형, 또는 투약 레지멘에서 합치될 수 있다. 약학적 조합 제형 또는 투약 레지멘의 적어도 하나의 추가 화합물은 바람직하게는 이들이 서로 부정적으로 영향을 미치지 않도록 길항제 조성물에 대해 상보적 활성을 갖는다.
항-암 요법은 화학치료제, 세포독성제, 사이토카인, 성장 저해제, 항-호르몬제, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합에서 적합하게 존재한다. 예를 들어, 길항제 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제)를 함유한 약학적 조성물은 항-신생물성 제제, 화학치료제 성장 저해제, 세포독성제, 또는 이들의 조합의 치료적 유효량을 또한 포함할 수 있다.
조합으로 치료제의 투여는 전형적으로 정의된 기간 (선택된 조합에 의존하여 보통 분, 시간, 일 또는 주) 동안 수행된다. 조합 요법은 순차적인 방식으로 이들 치료제의 투여 (즉, 여기에서 각 치료제는 상이한 시간에서 투여된다), 뿐만 아니라 실질적으로 동시 방식으로 이들 치료제, 또는 치료제의 적어도 2개의 투여를 포함하는 의도이다.
치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합으로 길항제 항체는 정맥내 주사로 투여될 수 있고 반면에 조합으로 화학치료제는 경구로 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 치료제의 모두는 경구로 투여될 수 있거나, 또는 모든 치료제는, 특이적 치료제에 의존하여, 정맥내 주사로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 서열은 또한 특이적 제제에 의존하여 다양하다.
유형 및 질환의 중증도에 의존하여, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg의 각 치료제는, 예를 들어, 하나 이상의 개별의 투여, 또는 계속되는 주입이든, 환자에 투여를 위한 초기 후보 복용량이다. 전형적인 1일 복용량은, 상기 언급된 인자에 의존하여, 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 초과 범위일 수 있다. 며칠 이상 동안 반복된 투여를 위하여, 조건에 의존하여, 암이 상기 기재된 방법에 의해 측정된 바와 같이 치료되는 때까지, 치료는 지속된다. 하지만, 다른 복용량 요법이 유용할 수 있다. 하기의 구성요소용 제조 및 복용 계획: 항-암 요법, 예를 들어, 하나 이상의 길항제를 포함한 항-암 요법 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제), 화학치료제, 등은 제조자의 사용설명서에 따라 또는 당업자에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 화학요법용 제조 및 복용 계획은 또한 하기에 기재된다: "Chemotherapy Service", Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md (1992).
조합 요법은"시너지효과"를 제공할 수 있고"상승작용", 즉, 함께 사용된 활성 성분이 화합물의 분리 사용에서 비롯된 효과의 합계보다 더 큰 경우 달성된 효과를 증명할 수 있다상승작용 효과는 활성 성분이 하기인 경우 획득될 수 있다: (1) 합치된, 단위 복용량 제형으로 공동-제형화된 및 투여된 또는 동시에 전달된 경우; (2) 분리 제형으로서 대안으로 또는 병렬적으로 전달된 경우; 또는 (3) 일부 다른 레지멘에 의한 경우.대체 요법으로 전달된 경우, 화합물이 순차적으로, 예를 들어, 분리 주사기로 상이한 주사에 의해 투여된 또는 전달된 경우 상승작용 효과는 획득될 수 있다. 일반적으로, 대체 요법 동안, 각 활성 성분의 유효한 복용량은 순차적으로, 즉, 연속으로 투여되고, 반면에 조합 요법에서, 2 이상의 활성 성분의 유효한 복용량은 함께 투여된다.
전술한 바와 같이 전통적 경로에 의한 항-암 요법의 투여를 제외하고, 본 발명은 유전자 요법에 의한 투여를 포함한다. 길항제를 인코딩한 핵산의 상기 투여는 "항-암 요법의 유효량을 투여하는 " 발현에 의해 포함된다. 참고, 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 용도에 관한 WO 1996/07321. 그와 같은 방법은, 예를 들어, 세포내 단백질 예컨대 TP53을 표적화하는데 유용할 수 있다.
환자의 세포에 (벡터에 임의로 함유된) 핵산을 얻기 위한 2개의 주요한 접근법; 생체내 및 생체외가 있다. 생체내 전달을 위하여 핵산은, 보통 길항제가 요구되는 부위에서, 환자에 직접적으로 주사된다. 생체외 치료를 위하여, 환자의 세포는 제거되고, 핵산은 이들 단리된 세포에 도입되고 변형된 세포는 환자에 직접적으로 투여되거나 또는, 예를 들어, 환자에 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화된다 (참고, 예를 들면, 미국특허 번호4,892,538 및 5,283,187). 실행가능한 세포에 핵산의 도입을 위하여 이용가능한 다양한 기술이 있다. 상기 기술은 핵산이 의도된 숙주의 세포에서 시험관내 또는 생체내 배양된 세포에 이동되는지에 의존하여 다양하다. 시험관내 포유동물 세포에 핵산의 도입에 적합한 기술은 리포좀, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법, 등의 사용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위하여 통상적으로 사용된 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노-관련된 바이러스) 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개된 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)으로 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서 표적 세포에 특이적인 제제, 예컨대 표적 세포상의 세포-표면 막 단백질에 특이적인 항체, 표적 세포상의 수용체용 리간드, 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 이용된 경우, 세포내이입과 관련된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질은, 예를 들면, 특정한 세포 유형에 굴성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링에서 내재화를 경험하는 단백질용 항체, 및 세포내 국재화를 표적하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질의 흡수의 표적화에 및/또는 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입의 기술은, 예를 들어, 하기에 의해 기재된다: Wu 등, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); 및 Wagner 등, PNAS USA 87:3410-3414 (1990). 유전자-마킹 및 유전자-요법 프로토콜은, 예를 들어, 하기에 기재된다: Anderson 등, Science 256:808-813 (1992) 및 WO 1993/25673.
IV. 진단 및 예후 방법
본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 진단 방법, 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 결정 방법, 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할지의 결정 방법, 및 암을 가진 환자에 대한 항-암 요법의 치료 효능 최적화 방법을 제공한다. 상기 방법은, 특히, 암의 하위유형의 진단, 치료 결과의 예측, 및 환자에 항-암 요법의 투여가 유효할지의 가능도 증가에 유용하다. 몇몇 구현예에서, 상기 방법은 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커 (예를 들어, 표 1에 열거된 바이오마커)의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 및 본 발명의 바이오마커의 참조 수준과 발현 수준의 비교를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 하기 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계: 환자로부터 수득된 샘플에서 FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR 및 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 발현 수준의 비교 단계. 본 발명의 바이오마커의 발현 수준 (예를 들면, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR)은 아래 기재된 임의의 방법 또는 검정을 이용하여 또는 당해 기술에서 공지된 임의의 방법 또는 검정에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 방광암이다. 일부 구현예에서, 방광암은 NMIBC이다. 다른 구현예에서, 방광암은 MIBC이다. 추가의 다른 구현예에서, 방광암은 전이성 방광암이다. 환자는 암의 진전된, 난치의, 재발성, 및/또는 화학요법-내성 형태를 임의로 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자는 재발성 방광암, 예를 들어, 재발성 NMIBC를 가질 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 표 1에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 1에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 하기의 발현 수준의 결정 단계: 적어도 하나 (예를 들면, 1, 2, 또는 3) 의 하기 유전자:FGFR3, TP53, 및 EGFR, 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 환자에서 수득된 샘플에서 FGFR3의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) FGFR3의 참조 수준과 FGFR3의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 FGFR3의 발현 수준의 증가는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) TP53의 참조 수준과 TP53의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 TP53의 발현 수준의 증가는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 EGFR의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) EGFR의 참조 수준과 EGFR의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 EGFR의 발현 수준의 증가는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
또 다른 실시예에서, 일부 구현예에서, 본 발명은 환자에서 암의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (a) 표 4에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 4에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 암을 가진 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
임의의 이전 방법에서, 상기 방법은 (c) 암을 가진 환자의 통지 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 이전 방법에서, 상기 방법은 (d) 샘플에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현의 수준의 증가가 검출되는 경우, 환자의 치료용 항-암 요법의 선택 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 이전 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 본 발명의 상세한 설명의 섹션 III에 기재된 바와 같이, 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
다른 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 1에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 1에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자에 대한 예후 결정 단계 (여기에서 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 변화되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타낸다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자의 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 증가되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계.
일부 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 FGFR3의 발현 수준의 결정 단계; (b) FGFR3의 참조 수준과 FGFR3의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자에 대한 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 증가되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
다른 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 발현 수준의 결정 단계; (b) TP53의 참조 수준과 TP53 의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자에 대한 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 증가되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 EGFR의 발현 수준의 결정 단계; (b) EGFR의 참조 수준과 EGFR의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자에 대한 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 증가되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
다른 경우에서, 본 발명은 암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 4에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 4에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계; 및 (c) 환자에 대한 예후의 결정 단계 (여기에서 불량한 예후는 참조 수준에 비하여 변화되는 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타낸다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
임의의 이전 방법에서, 예후는 생존의 예후일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 투여에 앞서 수행된다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 투여 동안 수행된다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 투여 이후 수행된다.
임의의 이전 방법에서, 상기 방법은 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정된 경우 항-암 요법의 투여로부터 이로울 것 같은 경우 환자의 확인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 상기 방법은 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정된 경우 항-암 요법의 투여로부터 덜 이로울 것 같은 경우 환자의 확인 단계를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 이전 방법에서, 환자가, 예를 들어, 본 발명의 상세한 설명의 섹션 III에 기재된 바와 같이, 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정되면, 상기 방법은 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 이전 방법에서, 생존은 무병 생존, 무진행 생존, 또는 전체 생존일 수 있다.
다른 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 1에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 1에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계로서, 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 FGFR3의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) FGFR3의 참조 수준과 FGFR3의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 FGFR3의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
다른 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) TP53의 참조 수준과 TP53의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 TP53의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
추가의 다른 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 EGFR의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) EGFR의 참조 수준과 EGFR의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 EGFR의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
다른 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 4에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 4에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자에 대하여 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 1 에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 1에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자에 대하여 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 하기의 발현 수준의 결정 단계: 적어도 하나 (예를 들면, 1, 2, 또는 3) 의 하기 유전자:FGFR3, TP53, 및 EGFR 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계로서, 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계. 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자에 대하여 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 환자로부터 수득된 샘플에서 FGFR3 의 발현 수준의 결정 단계; 및 (b) FGFR3의 참조 수준과 FGFR3 의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 FGFR3 의 발현 수준의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
일부 경우에서, 본 발명은 암을 가진 환자에 대하여 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 표 4 에 열거된 유전자의 적어도 하나의 발현 수준의 결정 단계 (예를 들면, 표 4에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48 유전자) 환자로부터 수득된 샘플에서; 및 (b) 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 비교 단계 (여기에서 참조 수준에 비하여 환자 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 발현 수준의 변화는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인한다). 일부 구현예에서, 변화는 증가일 수 있다. 다른 구현예에서, 변화는 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 방광암이다.
임의의 이전 방법에서, 상기 방법은 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 유전자의 발현 수준의 결정 단계를 추가로 포함하는 추가로 포함할 수 있다: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9, 및 FGF2 (여기에서 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 상기 발현 수준은 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 참조 수준에 비하여 변화된다).
일부 경우에서, 본 발명은 방광암으로부터 고통받고 있는 환자의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에 바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신 이외의 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하고, 여기에서 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 발현 수준이 TP53의 참조 수준에 비하여 증가되는 것으로 결정되었다.
임의의 이전 방법에서, 상기 방법은, 예를 들어, 본 발명의 상세한 설명의 섹션 III에서 기재된 바와 같이, 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 이전 방법에서, 본 발명의 바이오마커, 예를 들면, 표 1에 열거된 유전자, 예를 들어, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR의 발현 수준은 예를 들어 아래 또는 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 기재된 바와 같이 메신저 RNA (mRNA)의 측정에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 검정에 의해 결정된다. 일부 경우에서, PCR 검정은 정량적 PCR 검정이다. 일부 구현예에서, 정량적 PCR 검정은 TAQMAN® 검정이다. 일부 구현예에서, 검정은 플루이다임 검정을 이용하여 수행된다.
임의의 이전 방법에서, 본 발명의 바이오마커, 예를 들면, 표 1에 열거된 유전자, 예를 들어, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR의 발현 수준은 예를 들어 아래 또는 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 기재된 바와 같이 단백질의 측정에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 면역조직화학 방법에 의해 결정된다.
면역조직화학에 의한 FGFR3에 대하여 발현 수준의 예시적 결정 방법은 아래에서 제공된다. 유사한 검정은 본 발명의 다른 바이오마커에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, FGFR3 과발현은 IHC에 의해 분석될 수 있다. 종양 생검으로부터 파라핀-포매 조직 섹션은 IHC 검정 처리될 수 있고 아래와 같이 FGFR3 단백질 염색 세기 기준을 합치시켰다:
스코어 0:무 염색이 관측되거나 또는 막 염색이 종양 세포의 10% 미만에서 관측된다.
스코어 1+: 희미한/거의 인지가능하지 않은 막 염색은 종양 세포의 10% 초과에서 검출된다. 세포는 그의 막의 단지 부분적으로 염색된다.
스코어 2+: 약 내지 중간의 완벽한 막 염색은 종양 세포의 10% 초과에서 관측된다.
스코어 3+: 중간 내지 강한 완벽한 막 염색은 종양 세포의 10% 초과에서 관측된다.
일부 구현예에서, FGFR3 과발현 평가에 대하여 0 또는 1+ 스코어를 갖는 그 종양은 과발현 FGFR3이 아닌 것으로 특성규명될 수 있고, 반면에 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 그 종양은 과발현 FGFR3으로서 특성규명될 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 과발현 FGFR3은 세포마다 발현된 FGFR3 분자의 카피의 수에 상응하는 면역조직화학 스코어로 평가될 수 있고, 생화학적으로 결정될 수 있다:
0=0-90 카피/세포,
1+=적어도 약 100 카피/세포,
2+=적어도 약 1000 카피/세포,
3+=적어도 약 10,000 카피/세포.
일부 경우에서, 환자로부터 수득된 샘플은 종양 샘플이다.
본 발명의 임의의 이전 방법에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커 (예를 들면, 표 1에 열거된 유전자)의 발현 수준은 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 변화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 다른 구현예에서, 환자로부터 수득된 샘플에서 본 발명의 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 감소될 수 있다.
특정 구현예에서, 하기의 발현 수준: 적어도 하나 (예를 들면, 1, 2, 또는 3) 의 하기:FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR는 환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 예를 들어, FGFR3의 발현 수준은 FGFR3의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 또 다른 사례에서, TP53의 발현 수준은 TP53의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다. 추가의 또 다른 사례에서, EGFR의 발현 수준은 EGFR의 참조 수준에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 또는 초과 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 참조 수준은 주어진 암 유형 (예를 들면, 방광암)에서 바이오마커 (예를 들어, FGFR3, TP53, 또는 EGFR)의 발현 수준의 전체 분포의, 예를 들어, 20번째 백분위와 99번째 백분위 사이의 임의의 백분위 (예를 들면, 20번째, 25번째, 30번째, 35번째, 40번째, 45번째, 50번째, 55번째, 60번째, 65번째, 70번째, 75번째, 80번째, 85번째, 90번째, 95번째, 또는 99번째 백분위)로 설정될 수 있다. 특정 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 25번째 백분위로 설정될 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 50번째 백분위로 설정될 수 있다. 다른 구현예에서, 참조 수준은 방광암에서 값의 전체 분포의 중앙일 수 있다.
상기 개시된 방법 및 검정은 환자 치료용 적절한 또는 유효한 요법의 평가에서 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위해 편리한, 효율적인, 및 잠재적으로 비용-유효한 수단을 제공한다. 예를 들어, 환자는 특정한 암, 또는 암의 아형의 진단용 샘플 (예를 들면, 종양 생검 또는 혈액 샘플)을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 진단은 방광암에 대한 것일 수 있다. 다른 경우에서, 진단은 방광암의 아형, 예를 들어, NMIBC, MIBC, 또는 전이성 방광암에 대한 것일 수 있다. 다른 경우에서, 환자는 항-암 요법을 이용한 치료 이전 샘플 (예를 들면, 종양 생검 또는 혈액 샘플)을 제공할 수 있고 샘플은 환자의 세포가 항-암 요법, 예를 들어, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법에 감수성일 수 있는지를 결정하기 위해 다양한 시험관내 검정의 방식으로 조사될 수 있다.
의술, 특히 진단 시험의 적용 및 치료제를 이용한 치료에 관련한 의술에서 기술 중 하나는, 생물학적 시스템이 어느 정도 가변성이고 항상 전적으로 예측가능하지 않으며, 따라서 많은 양호한 진단 시험 또는 치료제가 가끔 효과없다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 시험 결과, 환자 상태 및 이력, 및 그 또는 그녀의 자가 경험에 기반하여, 개별 환자에 대한 치료의 가장 적절한 과정을 결정하는 것은 궁극적으로 주치의의 판단에 달려 있다. 특히 모든 또는 대부분의 다른 명백한 치료 옵션이 실패하면, 또는 일부 시너지효과가 또 다른 치료와 함께 주어진 경우 기대되면, 예를 들어, 의사가 항-암 요법, 예를 들어, 길항제 (예를 들면, FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제)를 포함한 항-암 요법으로 환자 치료를 선택할 경우, 심지어 환자가 진단 시험으로부터 또는 다른 기준으로부터 데이터에 기반하여, VEGF 길항제에 특히 감수성인 것으로 예상되지 않는 경우가 심지어 있을 수 있다.
샘플은 암 (예를 들면, 방광암)을 갖는 것으로 의심되는, 또는 암을 갖는 것으로 진단되고, 따라서 치료가 필요할 것 같은 환자로부터, 또는 임의의 장애를 갖는 것으로 의심되지 않는 정상 개체로부터 얻어질 수 있다. 마커 발현의 평가를 위하여, 환자 샘플, 예컨대 세포, 또는 이들 세포에 의해 생산된 단백질 또는 핵산을 함유하는 것은, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 바이오마커의 수준은 샘플, 바람직하게는 조직 샘플 (예를 들면, 종양 조직 샘플, 예컨대 생검)에서 마커의 양 (예를 들면, 절대적인 양 또는 농도)를 평가함으로써 결정될 수 있다. 또한, 바이오마커의 수준은 바이오마커의 검출가능한 수준을 함유한 체액 또는 배설물에서 평가될 수 있다. 본 발명에서 샘플로서 유용한 체액 또는 분비물은, 예를 들면, 혈액, 소변, 타액, 대변, 늑막 유체, 림프 유체, 가래, 복수, 전립선 유체, 뇌척수액 (CSF), 또는 임의의 다른 신체상의 분비물 또는 그의 유도체를 포함한다. 상기 단어 혈액은 혈액의 전혈, 플라즈마, 혈청, 또는 임의의 유도체를 포함하는 의미이다. 상기 체액 또는 배설물에서 바이오마커의 평가는 침습성 샘플링 방법이 부적절한 또는 불편한 상황에서 때때로 바람직할 수 있다. 하지만, 체액인 샘플의 경우에서, 본원에서 시험된 샘플은 바람직하게는 혈액, 활막 조직, 또는 활막 유체, 가장 바람직하게는 혈액이다.
샘플은 냉동된, 신선한, 고정된 (예를 들면, 포르말린-고정된), 원심분리된, 및/또는 포매된 (예를 들면, 파라핀-포매된) 것, 등일 수 있다세포 샘플은, 물론, 샘플에서 마커의 양의 평가에 앞서 다양한 공지된 후-수집 준비 및 보관 기술 (예를 들면, 핵산 및/또는 단백질 추출, 고착, 보관, 냉동, 한외여과, 농도, 증발, 원심분리, 등) 처리될 수 있다. 마찬가지로, 생검은 또한 후-수집 준비 및 보관 기술, 예를 들면, 고착 처리될 수 있다.
전술한 바와 같이, 임의의 이전의 방법은, 임의로, 환자에 투여용 항-암 요법의 선택을 추가로 포함할 수 있고, 임의로, 환자에 항-암 요법의 투여를 추가로 포함한다.
A. 유전자 발현의 검출
본원에서 기재된 유전적 바이오마커는 당해 기술에서 공지된 임의의 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 포유동물로부터 조직 또는 세포 샘플은 노던, 닷-블랏, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석, 어레이 하이브리드화, RNase 보호 검정을 이용하여, 또는 DNA 마이크로어레이 스냅샷을 포함한, 상업적으로 이용가능한 DNA SNP 칩 마이크로어레이를 이용하여, 예를 들면, 당해 유전적 바이오마커로부터 mRNAs 또는 DNAs에 대하여 편리하게 검정될 수 있다. 예를 들어, 실시간 PCR (RT-PCR) 검정 예컨대 정량적 PCR 검정은 당해 기술에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 구현예에서, 생물학적 샘플에서 당해 유전적 바이오마커로부터 mRNA의 검출 방법은 적어도 하나의 프라이머를 이용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA의 생산; 상기 생산된 cDNA의 증폭; 및 증폭된 cDNA의 존재의 검출을 포함한다. 또한, 상기 방법은 (예를 들면,"하우스키핑" 유전자 예컨대 액틴 계열 구성원의 비교 대조 mRNA 서열 수준의 동시 시험에 의해) 생물학적 샘플에서 mRNA의 수준 결정을 허용하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 cDNA의 서열은 결정될 수 있다. FGFR3의 발현 수준의 예시적 검출 방법은, 예를 들어, 하기에 제공된다: 미국특허 출원 공개 번호2014/0030259 및 미국특허 번호8,410,250 (이 둘 모두는 전체적으로 본원에서 참고로 편입된다).
1. 핵산의 검출
하나의 특이적 구현예에서, 표 1에 제시된 유전자의 발현은 RT-PCR 기술에 의해 수행될 수 있다. PCR에 사용된 프로브는 검출가능한 마커, 예컨대, 예를 들어, 방사선동위원소, 형광성 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터, 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기 프로브 및 프라이머는 샘플에서 표 1에 제시된 발현된 유전자의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 숙련가에 의해 이해될 바와 같이, 상당히 많은 상이한 프라이머 및 프로브는 본원에서 제공된 서열에 기반하여 제조될 수 있고 표 1 및/또는 표 4에 제시된 발현된 유전자의 존재 및/또는 수준을 증폭, 클론화 및/또는 결정하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR일 수 있다. 일부 경우에서, 정량적 RT-PCR은 미세유체 디바이스, 예를 들어, 플루이다임 BIOMARK™ BMK-M-96.96 플렛폼에서 수행될 수 있다.
다른 방법은 표 1에 제시된 유전자의 적어도 하나로부터 mRNAs를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다 (예를 들면, FGFR3, TP53, 및 EGFR mRNAs), 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 .핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터 시험 및 대조 mRNA 샘플은 cDNA 프로브를 생성하기 위해 역전사되고 표지된다. 프로브는 그 다음 고형 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이로 하이브리드화된다. 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치가 공지되는 정도로 어레이는 구성된다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현되는 잠재력을 갖는 유전자의 선택은 고형 지지체상에 어레이될 수 있다. 특정한 어레이 구성원으로 표지된 프로브의 하이브리드화는 프로브가 유도된 샘플이 그 유전자를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 질환 조직의 차별적인 유전자 발현 분석은 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 단일 실험 내의 수 천의 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 하이브리드화 기술 및 컴퓨팅 기술을 이용한다 (참고, 예를 들면, WO 2001/75166). 참고, 예를 들어, 미국특허 5,700,637, 미국특허 5,445,934, 및 미국특허 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); 및 Cheung 등, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999) 어레이 제작의 논의용.
또한, EP 1753878에 기재된 마이크로어레이를 이용한 DNA 프로파일링 및 검출 방법이 이용될 수 있다. 상기 방법은 짧은 연쇄 반복 (STR) 분석 및 DNA 마이크로어레이를 이용한 상이한 DNA 서열 사이에서 빠르게 확인하고 식별한다. 하나의 구현예에서, 표지된 STR 표적 서열은 상보적 프로브를 담지한 DNA 마이크로어레이에 하이브리드화된다. 이들 프로브는 가능한 STRs의 범위를 포함시키기 위해 길이가 다양하다. DNA 하이브리드의 표지된 단일가닥 영역은 후-하이브리드화 효소 소화를 이용한 마이크로어레이 표면으로부터 선택적으로 제거된다. 미공지된 표적에서 반복의 수는 마이크로어레이에 하이브리드화되어 있는 표적 DNA의 패턴에 기반하여 추론된다.
마이크로어레이 프로세서의 하나의 예는 상업적으로 이용가능한 Affymetrix GENECHIP® 시스템이고 유리 표면에서 올리고뉴클레오타이드의 직접적인 합성에 의해 제작된 어레이를 포함한다. 다른 시스템은 당해 분야의 숙련가에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
RT-PCR 또는 또 다른 PCR-기반 방법 이외의 바이오마커의 수준의 다른 결정 방법은 프로테오믹스 기술, 뿐만 아니라 분자 수준에서 환자 반응에 기반하여 암 치료에 필요한 개별화된 유전적 프로파일을 포함한다. 본원에서 특화된 마이크로어레이, 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 또는 cDNA 마이크로어레이는 하나 이상의 항-암 요법에 대한 감수성 또는 저항성과 상관하는 발현 프로파일을 갖는 하나 이상의 바이오마커를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용을 위하여, 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은, RNA-기반 게놈 분석, 예컨대, 예를 들어, RNASeq를 포함한, 높은 처리량 RNA 서열 발현 분석을 포함한다.
많은 참조는 상기 기술의 적용에서 안내를 제공하도록 이용가능하다 (Kohler 등, Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 및 Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)). 노던 블랏 분석은 당해 기술에서 잘 알려진 종래의 기술이고, 예를 들어, 하기에 기재된다: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. 유전자 및 유전자 생성물의 상태 평가를 위한 전형적인 프로토콜은, 예를 들어 하기에서 발견된다: Ausubel 등 eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) 및 18 (PCR Analysis).
2. 단백질의 검출
단백질 바이오마커 예컨대 표 1에 열거된 것 (예를 들어, FGFR3, TP53, 및/또는 EGFR)의 검출에 관해, 예를 들어, 항체-기반 방법 뿐만 아니라 질량 분광법 및 당해 기술에 공지된 다른 유사한 수단을 포함한 다양한 단백질 검정이 이용가능하다. 항체-기반 방법에서, 예를 들어, 샘플은 항체-바이오마커 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉될 수 있고, 그 다음 상기 복합체를 검출할 수 있다. 단백질 바이오마커의 존재의 검출은 수많은 방식, 예컨대 (면역침강 있거나 없이) 웨스턴 블랏팅, 2-차원 SDS-PAGE, 면역침강, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 유세포측정, 및 플라즈마 또는 혈청을 포함한 다양한 조직 및 샘플 검정용 ELISA 절차에 의해 달성될 수 있다. 그와 같은 검정 방식을 이용한 광범위한 면역검정 기술은 이용가능하다, 참고, 예를 들면, 미국특허 번호4,016,043, 4,424,279, 및 4,018,653. 이들은 비-경쟁적 유형의 모든 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정, 뿐만 아니라 전통적 경쟁적 결합 검정에서 포함한다. 이들 검정은 또한 표적 바이오마커에 표지된 항체의 직접적인 결합을 포함한다.
샌드위치 검정은 가장 유용한 것 중 하나이고 통상적으로 사용된 검정이다. 샌드위치 검정 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두는 본 발명에 의해 포함되는 의도는 아니다. 간단히, 전형적인 순방향 검정에서, 미표지된 항체는 고형 기질상에 고정되고, 시험되는 샘플은 결합된 분자와 접촉하였다. 인큐베이션의 적합한 기간 이후, 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는데 충분한 일정한 기간 동안, 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 리포터 분자로 표지된, 항원에 특이적인 제2 항체는 그 다음 부가되고 인큐베이션되어, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체의 형성에 충분한 시간을 허용한다. 임의의 미반응된 물질은 세정제거되고, 항원의 존재는 리포터 분자에 의해 생산된 신호의 관찰에 의해 결정된다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수 있거나, 또는 바이오마커의 공지된 양을 함유한 대조 샘플과 비교함으로써 정량화될 수 있다.
순방향 검정상의 변형은 동시 검정을 포함하고, 여기에서 모든 샘플 및 표지된 항체는 결합된 항체에 동시에 부가된다. 쉽게 명백해질 바와 같이 임의의 소수 변이를 포함한, 이들 기술은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다. 전형적인 순방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 대하여 특이성을 가진 제1 항체는 고형 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합된다. 고형 표면은 전형적으로 유리 또는 폴리머이고, 가장 통상적으로 사용된 폴리머는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 고형 지지체는 면역검정 수행에 적합한 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 과정은 당해 기술에 공지되고 일반적으로 공유적 결합 또는 물리적 흡착의 가교결합으로 이루어지고, 폴리머-항체 복합체는 시험 샘플의 제조에서 세정된다. 시험되는 분취량의 샘플은 그 다음 고형 상 복합체에 부가되고 하기 및 충분한 일정한 기간 동안 인큐베이션 (예를 들면, 2-40 분 또는 더욱 편리하면 밤새) 및 적합한 조건하에 (예를 들면, 실온 내지 40 ℃ 예컨대 25 ℃ 및 32 ℃ 포괄) 되어 항체에 존재한 임의의 서브유닛의 결합을 허용한다. 인큐베이션 기간 이후, 항체 서브유닛 고형 상은 세정 및 건조되고 바이오마커의 일 부분에 특이적인 제2 항체와 인큐베이션된다. 제2 항체는 분자 마커에 제2 항체의 결합을 나타내기 위해 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
대안적인 방법은 샘플에서 표적 바이오마커의 고정화 및 그 다음 리포터 분자로 표지될 수 있거나 또는 표지되지 않을 수 있는 특이적 항체에 고정된 표적의 노출을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 의존하여, 결합된 표적은 항체를 이용한 직접적인 표지화에 의해 검출가능할 수 있다. 대안적으로, 제1 항체에 특이적인, 제2 표지된 항체는 표적-제1 항체 복합체에 노출되어 표적-제1 항체-제2 항체 3차 복합체를 형성한다. 복합체는 리포터 분자에 의해 방출된 신호에 의해 검출된다. "리포터 분자"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그의 화학 성질에 의해, 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 검정의 상기 유형에서 가장 통상적으로 사용된 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사선동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역검정의 경우에서, 효소는, 일반적으로 글루타르알데하이드 또는 퍼아이오데이트를 이용하여 제2 항체에 접합된다. 쉽게 기술적으로 인식될 바와 같이, 하지만, 숙련가에 쉽게 이용가능한 다양한 상이한 콘주게이션 기술이 존재한다. 통상적으로 사용된 효소는 다른 것들 중에서 홀스래디쉬 페록시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 및 알칼리성 포스파타아제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용되는 기질은, 상응하는 효소에 의한 가수분해시, 검출가능한 색상 변화의 생산을 위하여 일반적으로 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타아제 및 페록시다아제를 포함한다. 상기 나타낸 발색 기질 보다는 형광성 생성물을 수득하는 형광원 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 사례에서, 효소-표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 부가되고, 결합이 허용되고, 그 다음 과잉의 시약이 세정제거된다. 적절한 기질을 함유한 용액은 그 다음 항체-항원-항체의 복합체에 부가된다. 기질은, 보통 분광광도법적으로, 추가로 정량화될 수 있는, 정성적 시각적 신호를 제공한, 제2 항체에 연결된 효소와 반응하여, 샘플에서 존재하였던 바이오마커의 양의 적응증을 제공할 것이다. 대안적으로, 형광성 화합물, 예컨대 플루오레신 및 로다민은 그의 결합능의 변경 없이 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정한 파장의 광을 이용한 조명으로 활성화된 경우, 형광색소-표지된 항체는 분자내 여기성의 상태를 유도하는, 광 에너지를 흡수한 다음, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상으로 광을 방출시킨다. EIA에서와 같이, 형광성 표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 결합이 허용된다. 미결합된 시약의 세정 제거 이후, 잔여 3차 복합체는 그 다음 적절한 파장의 광에 노출되고, 관측된 형광은 당해 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘 모두는 당해 기술에서 매우 잘 확립된다. 하지만, 다른 리포터 분자, 예컨대 방사선동위원소, 화학발광 또는 생물발광 분자는 또한 이용될 수 있다.
B. 키트
바이오마커의 검출에서 사용을 위하여, 키트 또는 제조 물품이 본 발명에 의해 또한 제공된다. 상기 키트는, 예를 들어, 암 (예를 들면, 방광암)으로부터 고통받고 있는, 또는 암으로부터 고통받고 있는 것으로 의심되는 환자를 진단하기 위해, 암, 예를 들면, 방광암으로부터 고통받고 있는 환자에 대하여 예후를 제공하기 위해, 및/또는 암 (예를 들면, 방광암)을 가진 환자가 항-암 요법에 효과적으로 반응성일지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 키트는 매우 제한적으로 하나 이상의 컨테이너 수단 예컨대 바이알, 튜브, 등등을 수용하도록 구분된 캐리어 수단을 포함할 수 있고, 각각의 컨테이너 수단은 상기 방법에서 사용되는 분리 요소들 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 컨테이너 수단들 중 하나는 검출가능하게 표지되는 또는 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 단백질 또는 메신저, 각각에 특이적인 항체 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 하이브리드화를 이용하는 경우, 상기 키트는 표적 핵산 서열의 증폭용 뉴클레오타이드(들)을 함유한 컨테이너 및/또는 리포터 분자, 예컨대 효소, 발광물질, 또는 방사선동위원소 표지에 결합된, 리포터-수단, 예컨대 바이오틴-결합 단백질, 예를 들면, 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한 컨테이너를 또한 가질 수 있다.
상기 키트는 전형적으로 상기 기재된 컨테이너 및, 완충액, 희석제, 필터, 니들, 주사기, 및 사용 설명서를 갖춘 포장 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 물질을 포함한 하나 이상의 다른 컨테이너를 포함할 것이다. 표지는 조성물이 특이적 적용에 사용되는 것을 나타내는 컨테이너에 존재할 수 있고, 또한 생체내 또는 시험관내 사용, 예컨대 상기 기재된 것에 대한 지시를 나타낼 수 있다.
본 발명의 키트는 수많은 구현예를 갖는다. 전형적인 구현예는 컨테이너, 상기 컨테이너상의 표지, 및 상기 컨테이너 내에 함유된 조성물을 포함한 키트이고, 여기에서 조성물은 단백질 또는 자가항체 바이오마커에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 상기 컨테이너상의 표지는 조성물이 샘플에서 상기 단백질 또는 항체의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 나타내고, 여기에서 키트는 특정한 샘플 유형에서 바이오마커 단백질의 존재를 평가하기 위한 항체의 사용 설명서를 포함한다. 키트는 추가로 사용설명서 및 샘플 제조용 및 샘플에 항체의 적용용 물질의 세트를 포함할 수 있다. 키트는 모든 1차 및 2차 항체를 포함할 수 있고, 여기에서 2차 항체는 표지, 예를 들면, 효소 표지에 접합된다.
또 다른 구현예는 컨테이너, 상기 컨테이너상의 표지, 및 상기 컨테이너 내에 함유된 조성물을 포함한 키트이고, 여기에서 조성물은 엄격한 조건 하에서 표 1에 제시된 바이오마커의 보체에 하이브리드화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 컨테이너상의 표지는 조성물이 샘플에서 표 1에 제시된 바이오마커의 존재를 평가하기 위해 사용될 수 있음을 나타내고, 여기에서 키트는 특정한 샘플 유형에서 바이오마커 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하기 위한 폴리뉴클레오타이드(들)의 사용 설명서를 포함한다.
키트의 다른 선택적인 구성요소는 하나 이상의 완충액 (예를 들면, 블록 완충액, 세척 완충제, 기질 완충액, 등), 다른 시약 예컨대 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들면, 색원체), 에피토프 회수 용액, 대조 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조 슬라이드(들), 등을 포함한다. 키트는 또한 키트를 이용하여 수득된 결과를 해석하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
추가 특이적 구현예에서, 항체-기반 키트에 대하여, 키트는, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다: (1) 바이오마커 단백질에 결합하는 (예를 들면, 고형 지지체에 부착된) 제1 항체; 및, 임의로, (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합되는 제2, 상이한 항체.
올리고뉴클레오타이드-기반 키트에 대하여, 키트는, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다: (1) 바이오마커 단백질을 인코딩한 핵산 서열에 하이브리드화하는, 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 바이오마커 핵산 분자의 증폭에 유용한 한 쌍의 프라이머.키트는 또한, 예를 들면, 완충제, 보존제, 또는 단백질 안정제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지 (예를 들면, 효소 또는 기질)의 검출에 필요한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한, 검정될 수 있고 시험 샘플에 비교될 수 있는 대조 샘플 또는 일련의 대조 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각 구성요소는 개별 컨테이너 내에 봉입될 수 있고 모든 다양한 컨테이너는, 키트를 이용하여 수행된 검정의 결과를 해석하기 위한 사용설명서와 함께, 단일 패키지 내에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에서 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 서열 식별 번호:1-51을 포함한다,
V. 약학적 제형
본 발명에 따라 사용된 본원에서 기재된 항-암 요법 (예를 들면, 길항제 예컨대 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함한 항-암 요법)의 치료제(들)의 치료적 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 선택적인 약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정제와 원하는 정도의 순도를 가진 치료제(들)의 혼합에 의해 보관용으로 제조된다. 제형에 관한 일반 정보에 대하여, 참고, 예를 들면, Gilman 등, (eds.)(1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A.Gennaro (ed.),Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co.,Eastori, Pennsylvania; Avis 등, (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman 등, (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker, New York; 및 Lieberman 등, (eds.)(1990), Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A.Walters (ed.)(2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker.
허용가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정제는 이용된 복용량 및 농도에서 수령체에 비-독성이고, 하기를 포함한다: 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
피하 투여에 적응된 동결건조된 제형은, 예를 들어, 하기에 기재된다: 미국특허 번호6,267,958 (Andya 등). 상기 동결건조된 제형은 높은 단백질 농도까지 적합한 희석제로 재구성될 수 있고 재구성된 제형은 본원에서 치료되는 포유동물에 피하로 투여될 수 있다.
결정화된 형태의 치료제(들)이 또한 고려된다. 참고, 예를 들어, US 2002/0136719A1.
본원에서 제형은 또한 1 초과 활성 화합물 (전술한 바와 같이 제2 약제), 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기 약제의 유형 및 유효량은, 예를 들어, 제형에서 존재한 치료제(들)의 양 및 유형, 및 대상체의 임상 파라미터에 의존한다. 바람직한 상기 제2 약제는 상기 기재된다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다. 상기 기술은 하기에 개시된다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
지속-방출 제제는 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유한 고형 소수성 폴리머의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 하기를 포함한다: 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국특허번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 코폴리머 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글라이콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로구형체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산.
생체내 투여에 사용된 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
실시예
하기 실시예는 비제한적으로 현재 청구된 발명을 실증하기 위해 제공된다.
실시예 1. 물질 및 방법
종양 샘플
204 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 방광암 종양 샘플의 수집은 하기로부터 수득되었다: Cureline, Inc.(South San Francisco, CA) the Ethics Committee of Saint Petersburg City Clinical Oncology Hospital의 승인 및 서면 고지에 의한 동의의 적절한 확인에 따라, 또는 Institutional Review Board 승인 (Sterling Institutional Review Board)에 따라 The MT Group (Van Nuys, CA). 임상 샘플은 방광암에서 전형적으로 관측되는 예상된 ~80%/20% 남성/여성 비율을 충실하게 반복하였고, 비근침윤성 방광암 (NMIBCs; T0, T1), 근침윤성 방광암 (MIBCs; T2, T3) 및 전이의 분율은, 방광암 집단에서 이들 병기의 임상 발생정도와 일치된, ~75% 및 ~25%, 각각 (도 1)이었다 (Jemal 등 CA Cancer J. Clin . 61(2): 69-90, 2011; Heney, Urol . Clin . North Am.19(3): 429-433, 1992; Hall 등 Urology 52(4): 594-601, 1998). 사례의 서브셋은 각각의 그룹에 대하여 예상된 임상 파라미터와 유사한 수행 치료 정보, 무병 생존 (DFS), 및 전체 생존 (OS) 주석을 가졌다 (도 1, 표 3).
헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색된 섹션은 2명의 독립적인 병리학자에 의해 평가되었고, 70% 미만 신생물성 세포충실도를 가진 사례에 대한 종양 면적은 거대-해부용 병리학자에 의해 마킹되었다. 전체, 종양 함량은 70-90% 범위이었다. RNA 및 DNA는 이전에 기재된 바와 같이 거대해부된 샘플로부터 추출되었다 (Schleifman 등 PLoS One 9(3): e90761; Schleifman 등 PLoS One 9(2): e88401).
발현 분석
유전자 발현 분석은 이전에 기재된 바와 같이 ENVIRENE™로 탈-파라핀화 이후 높은 순수한 FFPE RNA Micro 키트 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 이용하여 거대해부된 FFPE 종양 샘플로부터 추출된 RNA상에서 수행되었다 (Schleifman 등 PLoS One 9(2): e88401). 방광암-관련 유전자 (참고 표 1)의 96 고유 mRNa 전사체의 유전자 발현 분석은 SUPERSCRIPT® III/PLATINUM® 및 사전-증폭 반응 믹스 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 단일 반응에서 cDNA로 역-전사되었고 사전-증폭되었던 100 ng 총 RNA로 시작하는 환자 시료 상에서 수행되었다. 전체 96 TAQMAN® 프라이머/프로브 세트는 0.05x 최초 TAQMAN® 검정 농도 (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 최종 희석으로 사전-증폭 반응에 포함되었다. 열순환 조건은 아래와 같았다: 50 ℃ 15분 동안 1 사이클, 70 ℃ 2분 동안 1 사이클, 95 ℃ 15초 동안 14 사이클 및 60 ℃ 4분 동안 1 사이클.사전-증폭된 cDNA는 2-배 희석되었고 그 다음 제조자의 사용설명서에 따라 BIOMARK™ BMK-M-96.96 플렛폼 (플루이다임, South San Francisco, CA)상에서 TAQMAN® Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 증폭되었다. 전체 샘플은 3중으로 검정되었다. 사이클 역치 (Ct) 값은 2-Δ Ct 방법을 이용하여 상대적 발현으로 전환되었고 (Livak 등 Methods 25(4): 402-408, 2001), 여기에서 ΔCt는 각각의 환자 시료에 대하여 계산된 96 Ct 값의 평균을 뺀 표적 유전자의 평균이다. 표 2는 나타낸 유전자에 대하여 사용된 맞춤형 TAQMAN® 프로브 및 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
돌연변이 분석 및 차세대 서열분석
돌연변이 분석은 하기를 이용한 탈파라핀화 이후 QIAAMP® FFPE 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 거대해부된 FFPE 조직으로부터 추출된 게놈 DNA상에서 수행되었다: ENVIRENE™ (Schleifman 등 PLoS One 9(3): e90761). PIK3CA, EGFR, KRAS, NRAS, HRAS, FGFR3, MET, BRAF, KIT, AKT1, 및 FLT3에서 돌연변이는 이전에 기재된 바와 같이 돌연변이-특이적 qPCR을 이용하여 검출되었다 (Schleifman 등 PLoS One 9(3): e90761). 차세대 서열분석 (NGS)은 제조자 지침에 따라 ION AMPLISEQ™ Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하는 ION TORRENT™ 차세대 서열분석을 이용하여 수행되었다 (참고, 예를 들면, Tsongalis 등 Clin . Chem . Lab. Med . 52(5): 707-714, 2014). 표 3은 방광암 샘플 (WT, 야생형; MUT, 돌연변이체)의 NGS 돌연변이 분석의 결과의 요약을 보여준다.
Figure pct00011
Figure pct00012
FGFR3 면역조직화학
면역조직화학 (IHC)은 Ventana DISCOVERY® XT Autostainer 플랫폼 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ)을 이용하여 4-μm 두께 FFPE 조직 섹션상에서 수행되었다. FGFR3의 검출을 위하여, 슬라이드는 CC1 확장된 항원 회수를 이용하여 사전-치료를 경험하였고 그 다음 1 μg/mL까지 희석된 항-FGFR3, 클론 15C3 (Genentech) 1차 항체로 염색되었고 60 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. FGFR3 신호의 증폭을 위하여, 비접합된 토끼 항-마우스 링커 항체 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)는 1 μg/mL에서 적용되었고 32 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 그 다음 항-토끼-OMNIMAP™ 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 키트 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) 처리되었다.
섹션은 헤마톡실린으로 대비-염색되었고, 탈수되었고, 청소되었고 시각용 덮개유리처리되었다.
세포주 생존력 연구
방광암 세포주는 하기로부터 수득되었다: American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) 또는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Germany). 세포주는 Genentech 세포 은행의 초기 계대에서 달성되었고 멀티플렉스 짧은 연쇄 반복 검정에 의해 또는 이전에 기재된 바와 같이 인증되었다 (O'Brien 등 Clin . Cancer Res. 16(14): 3670-3683, 2010). 전체 세포주는 하기로 보강된 RPMI 1640 또는 DMEM에서 유지되었다: 10% 우태 혈청 (Sigma, St. Louis, MO), 비필수 아미노산, 및 2 mmol/L L-글루타민.
에를로티닙 (TARCEVA™)은 EGFR의 선택적 및 강력한 저해제이다. 그의 구조, 선택성, 및 생물학적 특성의 세부사항은 이전에 기재되었다 (Stamos 등 J. Biol. Chem. 277(48): 46265-46272, 2002). 세포 생존력 연구는 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다 (O'Brien 등 Clin . Cancer Res. 16(14): 3670-3683, 2010). 세포는 정상 성장 배지내 384-웰 플레이트에서 2,500 세포 / 웰의 밀도로 4회 플레이팅되었고 밤새 부착시켰다. 에를로티닙 용량-반응은 5uM 용량으로 시작하는 3-배 희석 시리즈에 기반하여 10개 농도로 처리에 의해 결정되었다. 세포 생존력은 CELLTITER-GLO® 발광성 세포 생존력 검정 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 72 시간 후 측정되었다. 각 농도에서 퍼센트 생존력은 단지 DMSO로 처리된 대조군과 비교로 계산되었다.
통계적인 분석
조직 샘플 클러스터 (하위그룹)를 확인하기 위해, 자율 계층적 클러스터링은 유클리드 거리 및 완벽한 연결을 이용하여 수행되었다. Nonparametric Mann-Whitney 시험 (참고, 예를 들면, Mann and Whitney, Annals of Mathematical Statistics 18(1): 50-60, 1947) 및 본페로니 교정 (참고, 예를 들면, Bonferroni, Pubblicazioni del R Instituto Superiore di Scienze Economiche e Commerciali di Firenze 8:3-62, 1936 및 Miller, Simultaneous Statistical Inference, 2nd Ed., Springer Verlag, 페이지 6-8, 1981)은 방광 샘플 클러스터 중에서 차별적으로 발현된 유전자를 추가로 확인하기 위해 적용되었다. DFS는 수술의 날짜부터 재발 또는 사망의 날짜까지 시간으로서 정의되었다. OS는 수술의 날짜부터 사망의 날짜까지 시간으로서 유사하게 정의되었다. 생존 결과는 환자가 (DFS에 대하여) 무재발 또는 (OS에 대하여) 생존인 것으로 공지되었던 경우 최근 관측된 시점에서 검열받았다. 카플란-마이어 추정 (참고, 예를 들면, Kaplan 및 Meier, Journal of the American Statistical Association 53(282): 457-481, 1958)은 경시적으로 DFS 개연성 및 생존 개연성을 추정하기 위해 사용되었다. 3-년 및 5-년 DFS 비율 및 생존 비율은 카플란-마이어 DFS/OS 곡선 추정으로부터 또한 계산되었다. 클러스터 사이에서 차별적인 돌연변이 빈도의 유의성을 위하여, 피셔 정확 검정이 수행되었다. 피셔 정확 검정 (참고, 예를 들면, Fisher, Journal of the Royal Statistical Society 85(1): 87-94, 1922) 및 2-꼬리 T-검정 (참고, 예를 들면, Student, Biometrika 6(1): 1-25, 1908)은 통계적인 비교에 대하여 나타낸 바와 같이 사용되었다.
실시예 2: 맞춤형 미세유체공학-기반 방광암 유전자 발현 패널의 발달 및 기록 방광암 임상 샘플의 계층화에서 그의 적용
게놈 분석이 방광암의 분자 기초에 귀중한 통찰력을 제공하는 반면, 대다수의 이전의 연구는 고-품질 핵산을 수득하는 냉동된 조직의 사용에 의존하고 임상시험으로부터 기록 시료의 특성규명에 일반적으로 적절하지 않다. 하지만, 임상시험으로부터 기록 시료는 수반하는 치료 정보, 무병 생존 (DFS) 및 전체 생존 (OS) 정보, 및 암 게놈 분석에 대하여 탁월한 플렛폼을 만드는 다른 정보와 종종 관련된다. 여기에서 우리는 포르말린-고정된, 파라핀-포매 조직의 분석에 최적화되는 미세유체공학-기반 방광암 유전자 발현 패널을 발달하였다. 맞춤형 방광암 플루이다임 패널은 방광암 생물학의 주요 속성을 포착하기 위해 선택되었던 96 유전자로 구성된다 (참고 표 1). 표 1에 기재된 맞춤형 방광암 플루이다임 패널은, 91 고유 방광암-관련 유전자와 함께, 데이터 품질관리 및 정규화를 위한 2개의 하우스키핑 유전자를 포함한다 (참고 도 12A).
우리는 대규모, 공공-이용가능한 데이터세트에서 방광암 하위유형을 성공적으로 확인하기 위해 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 능력을 평가하였다 (
Figure pct00013
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012). 하기 비교 (
Figure pct00014
등 로부터 18,000 유전자의 발현에 기반된 주요한 구성요소 분석 (PCA) 플롯 (위에)과 맞춤형 방광암 플루이다임 패널로부터 82 중첩 유전자를 이용한 PCA 플롯)은 샘플 분리의 비교할만한 패턴을 보여주었다 (도 2A-2B). 다음으로, 우리는 하기를 수행하였다: 대각선형 판별 분석 (Diagonal Linear Discriminant Analysis; DLDA) 분석 (Diaz-Uriarte 등 BMC Bioinformatics 7:3, 2006)
Figure pct00015
연구로부터 방광암의 정확한 분류에서 우리 패널의 정확도를 평가하기 위해.우리는 하기를 발견하였다: 하기로부터 18000 유전자 중 대략 200:
Figure pct00016
등 (위에)이 >80% 정확도로 그들의 연구에서 보고된 대부분의 하위유형을 정확하게 분류하는데 필요하였다 (도 2C). 비교하자면, 방광암 플루이다임 패널로부터 겨우 20개의 유전자가 >80 % 정확도 (도 2D)로
Figure pct00017
데이터세트를 정확하게 분류하였다. 이는 패널상의 주의하여-선택된 유전자가 고도의 정확도로 질환의 주요 전사 클래스를 포착하는 것을 나타냈다.
FFPE 샘플내 유전자 발현 측정에서 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 강건성 및 재현성을 확인하기 위해, 우리는 일련의 품질관리 실험을 수행하였다 (도 3A-3E). 첫 번째로, 우리는, 전체 시험에 대하여 선형 표준 희석 곡선을 달성하기 위해, 필요할 때 검정을 재설계하는, 각각의 96 검정의 성능을 평가하는 연속 희석을 수행하였다 (도 3A 및 3B). 두 번째로, 우리는 FFPE-유도된 RNA 샘플의 세트를 시행하였고 상이한 날에 복제 샘플 시행에 대한 결과에서 높은 일치를 관측하였다 (도 3C 및 3D; R2 > 0.98). 세 번째로, 우리는 각 7개의 독립적인 시행에서 포함했던 대조 RNA 샘플에 대한 고도의의 칩대칩 데이터 재현성을 나타내었다 (도 3E; R2 > 0.92). 전체적으로, 우리의 정성적 및 정량적 평가로부터 결과는 맞춤형 방광암 플루이다임 패널이 방광암의 전사적 계층화에 대하여 강력한 및 생물학적으로-관련 플렛폼을 제공한다는 것을 나타낸다.
우리는 204 FFPE 방광암 조직의 세트의 분석에서 맞춤형 방광암 플루이다임 패널을 이용하였다 (참고 실시예 1 및 도 1). 플루이다임 유전자 발현 데이터의 자율 계층적 분석은 상이한 DFS 개연성과 관련되었던 5개의 전사적으로-정의된 방광암 조직 클러스터를 드러냈다 (도 4A-4F, 도 5A 및 5C). 조직 클러스터링의 구동은 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 신호전달 유전자, 예컨대 섬유아세포 성장 인자 (FGFR) 및 표피 성장 인자 (EGF) 경로 구성원, 종양 억제제 유전자 TP53를 포함한 세포자멸사 유전자, 뿐만 아니라 상피간엽 이행 (EMT) 유전자를 포함한 동반조절된 유전자의 5개 주요 그룹이었다 (도 5B).
이들이 대다수의 환자 샘플을 포함하였고 녹색, 황색, 및 적색 그룹으로서 순방향으로 이 지점부터 이들을 지칭하기 때문에 우리는 3개의 주요 조직 클러스터에 우리의 주의력을 집중하였다 (도 4A). 카플란-마이어 분석은 적색 그룹이 황색 그룹보다 더 나은 DFS 개연성과 관련되었고 (도 4B; HR=0.54, P=0.03), 황색 그룹이 녹색 그룹보다 유의미하게 더 나은 DFS 프로파일을 가졌다는 것을 드러냈다 (도 4B; HR=0.29, P =0.004). 방광암 조직학과 환자 결과 사이에서 정착된 관련이 주어지면 (Nargund 등 Semin . Oncol .39(5): 559-572, 2012; Resnick 등 Curr.Opin.Oncol.25(3): 281-288, 2013), 우리는 녹색, 적색, 및 황색 조직 그룹의 조직병리학적 속성을 다음으로 조사하였다. 놀랄 것 없이, 우리는, 최상의 DFS 프로파일과 관련된, 적색 그룹내 대다수의 샘플이 NMIBC 조직학인 것을 관측하였다 (도 4B 및 4C, 도 6A-D). 황색 그룹은 적색 그룹보다 유의미하게 더 높은 분율의 MIBC 사례로 구성되었고, 전이성 사례는 자율 분석에 대한 임의의 필요성 없이 상기 그룹에서 배타적으로 클러스터링하였다 (도 4C).
놀랍게도, 최악의 DFS 가능도와 관련된, 녹색 그룹은 거의 전적으로 전형적으로 비-공격성 NMIBC 조직학의 샘플로 구성되었다 (도 4B 및 4C, 도 6A-D). 이는 맞춤형 플루이다임 패널이 근접한 임상 모니터링 및 치료 중재로부터 이로울 수 있는 신속-재발성 NMIBCs를 갖는 환자의 그룹을 확인하였음을 시사한 놀라운 관찰이었다. 녹색 그룹이 공격성 조직학적 변이체를 나타낼 가능성을 배제하기 위해, 우리는 녹색, 적색, 및 황색 그룹으로부터 조직의 포괄적인 시험을 수행하였다 (참고, 예를 들면, 도 4D 및 4E). 예상대로, NMIBC 적색 그룹과 비교된 전이성 황색 그룹 및 MIBC에서 사전-침습성 미세유두상 조직학의 유의미하게 더 높은 발생정도가 있었다 (도 4D; P=0.0063, 도 6A-6D). 하지만, 우리는 적색 그룹과 비교된 공격성 NMIBC 녹색 그룹에서 미세유두상 조직학의 발생정도에서 통계적으로-유의차를 관측하지 못했다 (도 4D; P=0.2351, 도 6A-6D). 우리는 방광암 환자 임상 결과와 관련되는 것으로 보고되는 면역 침윤물을 또한 조사하였고 (Otto 등 World J. Urol. 30(6): 875-877, 2012) 3개의 조직 그룹에서 그리고 이들 사이에서 유의차를 관측하지 못했다 (도 4E). 녹색 및 적색 그룹에 속하는 샘플의 종양 병기 및 등급에서 유의차가 없었다. 따라서, 전사적으로-정의된 녹색 그룹은 호의적인 결과 적색 그룹과 조직학적으로 상이한 질환 아형을 나타내는 것으로 보이지 않는다.
다음으로, 우리는 녹색 그룹에서 관측된 급속 질환 재발이 상기 환자 집단의 부적절한 치료 때문일 수 있는지를 결정하였다. 우리는 3개의 전사적으로-정의된 그룹에서 바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신, 화학요법, 또는 방사선 요법, 뿐만 아니라 이들의 조합을 이용한 치료의 빈도를 조사하였다 (도 4F). NMIBC 적색 및 침습성/전이성 황색 그룹으로부터 환자의 비교할만한 분율 (>60%)이 치료를 받았다 (도 4F; P=0.8836). 신속-재발성 NMIBC 녹색 그룹의 환자는 모든 적색 및 황색 그룹보다 유의미하게 더 높은 비율로 치료되었다 (도 4F; 모든 비교에 대하여 P<0.0001). 이들 결과는, 녹색 그룹으로부터 사례의 신속 재발이 부적절한 아쥬반트 치료에 기인되지 않았고, 상기 NMIBC 아형으로부터 공격성 종양의 분자 드라이버일 수 있음을 나타냈다.
따라서, 맞춤형 방광암 플루이다임 패널은 기록 방광암 조직의 계층화에 강력한 플렛폼을 제공한다. 상기 패널에서 방광암 샘플의 임상적으로-주석을 단 세트의 분석은, 불량한 DFS 가능도와 관련된 NMIBC 녹색 그룹을 포함한, 3개의 전사적으로-상이한 방광암 하위유형을 드러냈다.
실시예 3: FGFR3은 신속-재발성 NMIBCs에서 과도-돌연변이 및 과발현되고, 침습성 및 전이성 종양의 서브셋에서 높은 발현은 불량한 임상 결과와 관련 된다
NMIBCs의 특징적인 특성들 중 하나는 이들이 사례의 대략 60-70%로 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3)에서 체세포 활성화 돌연변이를 담지하는 것이다 (van Rhijn 등 J. Pathol .198(2): 245-251; Tomlinson 등 J. Pathol .213(1): 91-98, 2007; Martinez-Torrecuadrada 등 Clin . Cancer Res. 11(17): 6280-6290, 2005; Kompier 등 PLoS One 5(11): e13821, 2010; Juanpere 등 Hum. Pathol .43(10): 1573-1582, 2012; Gust 등 Mol. Cancer Ther . 12(7): 1245-1254, 2013; Cappellen 등 Nat.Genet.23(1): 18-20, 1999; Ah-Ahmadie 등 J. Pathol .224(2): 270-279, 2011). 대다수의 FGFR3 돌연변이는 리간드-독립적인 수용체 이량체화 및 후속의 활성화를 초래하는 세포외 또는 막근접 도메인에서 미스센스 치환이다 (Tomlinson 등 상기; Cappellen 등 상기). FGFR3에서 돌연변이 빈도가 침습성 및 전이성 질환에서 11-16%까지 떨어진다는 사실은 FGFR3이 진전된 질환에서 종양형성을 계속해서 구동시키는지, 또는 그의 종양형성 역할이 방광암 발달의 초기 단계에 주로 국한되는지에 관한 불확실성을 초래하였다 (Tomlinson 등 상기; Al-Ahmadie 등 상기, Qing 등 J. Clin. Invest. 119(5): 1216-1229, 2009; Liu 등 Genet.Mol. Res. 13(1): 1109-1120, 2014).
우리는 광대한 대다수의 공지된 FGFR3 돌연변이를 포착한 맞춤형 멀티플렉스 PCR 패널을 이용하여 FGFR3의 돌연변이 상태를 평가하였다 (Schleifman 등 PLoS One 9(3): e90761). 적색 그룹의 NMIBC 샘플의 분석은 대략 60%의 예상된 FGFR3 돌연변이 빈도를 드러냈고, 기대된 바와 같이, MIBC 및 전이성 황색 그룹의 샘플은 대략 15%의 유의미하게 더 낮은 FGFR 돌연변이 빈도를 나타냈다 (도 7A). FGFR3에서 돌연변이는 FGFR3의 더 높은 발현 수준을 구동한다고 보고되었다 (Tomlinson 등 상기). 이들 보고와 일치로, 우리는 모든 전사 및 단백질 수준에 관해 야생형 샘플에 비교된 돌연변이체에서 FGFR3 발현의 유의미하게 더 높은 수준을 검출하였다 (도 7B 및 7C; 모든 비교에 대하여 P<0.0001). 우리는 녹색 그룹에서 FGFR3 돌연변이의 높은 빈도의 존재가 NMIBC 아형에 속하는 추가 확인일 수 있다는 것을 판단하였다. 사실상, 우리는 신속-재발성 NMIBC 녹색 그룹에서 빈번한 FGFR3 돌연변이를 관측하였다 (도 7A). 놀랍게도, 하지만, 녹색 그룹으로부터 광대한 대다수의 샘플은, NMIBC 적색 그룹에서 관측된 것보다 심지어 유의미하게 더 높은 빈도로, FGFR3에서 돌연변이를 서식시켰다 (도 7A 및 7D; P<0.0001). 녹색 그룹에서 과도-FGFR3 돌연변이는 모든 전사 (도 7E; 모든 비교에 대하여P<0.0001) 및 단백질 수준에 관해 NMIBC 적색 및 침습성/전이성 황색 그룹에서보다 유의미하게 더 높은 FGFR 발현과 관련되었다 (도 7F; 하기에 대해 P=0.0343: 녹색 대적색, 및 하기에 대해 P<0.0001: 적색 대황색).
상기 기재된 데이터는 FGFR3 발현의 과도-돌연변이 및 수반되는 과발현이 신속-재발성 NMIBCs와 상관한다는 것을 나타낸다. FGFR3이 질환의 후기에서 암 드라이버로서 계속해서 작용하면, 상승된 FGFR3 발현이 적어도 사례의 서브셋에서 방광암 발달 동안 유지되어야 한다. 이것이 사실인지를 결정하기 위해, 우리는 RNA 및 단백질 수준 모두에서 FGFR3의 발현 수준을 조사하였고 NMIBCs의 66%가 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 바와 같이 FGFR3의 높은 수준을 발현시켰다는 것을 알아내었다 (도 7G). 높은 FGFR3-발현 사례의 발생정도가 MIBCs 및 방광암 전이에서 감소되었어도, 이들의 더욱 진전된 병기로부터 종양의 >30%은, 진전된 질환에서 FGFR3에 대하여 계속된 요건과 일치된, FGFR3의 높은 발현 수준을 유지시켰다 (도 7G, IHC 스코어 2+/3+).
우리 연구의 전체 방광암 코호트에서, 우리는 이전에 공개된 보고와 일치되는, 높은 FGFR3-발현 사례에 대하여 호의적인 DFS 및 OS 생존 개연성을 관측하였다 (
Figure pct00018
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Dyrskjot 등 Nat.Genet.33(1): 90-96, 2003; Kim 등 Mol. Cancer 9:3, 2010). 예상외로, 하지만, 모든 MIBCs 및 전이성 셋팅에서 높은 FGFR3 발현은 감소된 3- 및 5-년 DFS 개연성과 관련되었다 (도 7H). 더욱이, 우리의 샘플 시리즈에서 진전된 질환 (MIBC 및 전이성 방광암)내 높은 FGFR3 발현은 감소된 3- 및 5-년 OS 가능도와 연결되었다 (도 7I). 이들 관찰을 입증하기 위해, 우리는 모든 FGFR3 발현 및 OS 데이터를 제공한 몇 개의 공공 데이터세트를 조사하였다 (
Figure pct00019
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Kim 등 Mol. Cancer 9:3, 2010). FGFR3의 높은 수준이, 우리의 데이터세트에서 관찰과 유사한, 그 2개의 연구에서 전체 집단내 양호한 예후를 부여하여도, 우리는 Kim 등 상기에 의한 연구로부터 낮은 FGFR3-발현 침습성/전이성 방광암과 많은 비교로 유의미하게 더 나쁜 OS 가능도를 나타냈고, 따라서 우리의 발견에 독립적인 확인을 제공하였다 (도 7J). 우리는 하기에 의한 연구로부터 진전된 병기의 FGFR3-높은 대 -낮은 종양에서 더 나쁜 OS에 대한 추세를 또한 관측하였다:
Figure pct00020
등 (위에).
합쳐서, 이들 데이터는 신속-재발성 NMIBCs의 드라이버, 뿐만 아니라 침습성 (MIBC) 및 전이성 셋팅에서 공격성 질환의 프로모터로서 FGFR3에 대한 역할을 지지한다. 몇 개의 연구는 FGFR3의 저해가 시험관내 및 생체내 높은 FGFR3-발현 방광암의 종양 성장을 억제한다는 것을 입증하였다 (Martinez-Torrecuadrada 등 Clin. Cancer Res. 11(17): 6280-6290, 2005; Gust 등 Mol. Cancer Ther . 12(7): 1245-1254, 2013; Qing 등 J. Clin . Invest. 119(5): 1216-1229, 2009; Gomez-Roman 등 Clin . Cancer Res. 11(2 Pt 1): 459-465, 2005; Lamont 등 Br. J. Cancer 104(1) 75-82, 2011; Tomlinson 등 Oncogene 26(40): 5889-5899, 2007). 따라서, 암이 높은 FGFR3을 발현시키는 고-위험 방광암 환자 (예를 들어, 신속-재발성 NMIBC, MIBC, 또는 전이성 방광암을 가진 환자)는 FGFR3 길항제를 이용한 치료에 양호한 후보자를 나타낸다.
실시예 4: 종양 억제제 TP53은 신속-재발성 NMIBCs에서 돌연변이 및 과발현된다
맞춤형 방광암 플루이다임 패널은 NMIBCs의 전사적으로-정의된 공격성 서브셋을 확인하였다. 비교 발현 분석은 45/96 유전자 (47%)가 신속 재발성 NMIBC 녹색 및 더욱 양성 적색 그룹 사이에서 유의미하게 차별적으로 발현시켰음을 보여주었다 (P<0.05, 다중 검정 보정으로). 차별적으로-발현된 유전자는, 상기 기재된 바와 같이, FGFR3 경로, 및 또한 종양 억제제 TP53, 조류 적모구증 종양유전자 B (ERBB), 상피간엽 이행 (EMT), 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 및 단백질 키나아제 B (PI3K-AKT) 경로에 속하였다 (도 8).
돌연변이 수준에 관해 우리의 샘플을 추가로 특성규명하기 위해, 우리는 NGS 분석을 실시하였다 (Tsongalis 등 Clin . Chem . Lab. Med . 52(5): 707-714, 2014). 예상대로, NGS 데이터는 상기 기재된 및 도 7A에 나타낸 FGFR3 돌연변이의 존재를 확인하였다 (도 9A, 표 3). 추가로, NGS 분석은 다른 것들 중에서 TP53, PIK3CA, KRAS, VHL, EGFR, PTEN, 및 IDH2를 포함한 몇 개의 다른 유전자에서 돌연변이를 드러냈다 (도 9A, 표 3). TP53에서 돌연변이는 침습성 및 전이성 방광암에서 그리고 표층 질환에 덜한 정도로 보고되었다 (George 등 J. Clin . Oncol .25(34): 5352-5358, 2007). 우리는 침습성/전이성 황색 그룹에서, 그리고 NMIBC 적색 그룹의 몇몇 사례에서 TP53 돌연변이의 존재를 나타냈다 (도 9A). 놀랍게도, 하지만, 우리는 신속-재발성 NMIBC 녹색 그룹에서 TP53 돌연변이의 높은 빈도를 관측하였다 (도 9A). 3개를 제외한 모든 사례에서, TP53의 DNA-결합 도메인에 맵핑된 돌연변이, 및 각각의 황색, 적색, 및 녹색 그룹에서 TP53 돌연변이 부위는 주로 비-중첩이었다 (도 9B).
우리는 TP53에서 돌연변이가 녹색 그룹에서 관측된 불량한 DFS 가능도에 기여될 수 있다는 것을 가정하였다. 이와 일치로, 우리는 적색 그룹과 비교된, 그러나 침습성/전이성 황색 그룹에서 관측된 것과 통계적으로 상이하지 않은 신속-재발성 녹색 그룹의 NMIBCs에서 TP53 돌연변이의 유의미하게 더 높은 빈도를 나타냈다 (도 9C; P=0.03 및 P=0.3605, 각각). TP53의 발현 수준은 적색 및 황색 그룹에서보다 녹색에서 또한 유의미하게 더 높았다 (도 9D; P=0.0187 및 P=0.002, 각각). TP53 전사 표적 p21의 발현 수준은 다른 2개의 그룹에 비교된 녹색에서 또한 유의미하게 더 높았고, 추가로 TP53의 증가된 발현 수준을 확인하였다 (도 9E; 모든 비교에 대하여 P<0.0001). 우리는 돌연변이체에서 유의미하게 더 높은 TP53 단백질 수준이 연구 코호트로부터 야생형 샘플과 비교하는 것을 관측하였다 (도 9F; P=0.0201). 이들 발견은 TP53 유전자가 녹색 그룹의 신속-재발성 NMIBCs에서 돌연변이되고 우선적으로 과발현되는 것을 나타낸다.
우리는 다음으로 우리의 환자 코호트에서 TP53 과발현의 임상 영향을 결정하였다. 우리는 우리의 전체 방광암 집단에서 높은 TP53 발현 수준을 갖는 종양이 낮은-발현 종양보다 더욱 호의적인 DFS 프로파일을 갖는 경향이 있다는 것을 알아내었다 (도 9G; P=0.4218). 흥미롭게도, 높은 TP53 발현 및 더 나은 DFS 개연성 사이의 상기 관계는 다른 그룹으로부터 분리하여 NMIBC 그룹에서 TP53 발현을 관찰하였던 경우 역전되었다 (도 9H). NMIBC 그룹에서, 우리는 종양 억제제의 상승된 수준이, 통계적으로 유의미하지 않을지라도, 낮은-발현 사례에 비교된 더 나쁜 DFS 가능도를 부여하였다는 것을 알아내었다 (도 9H; HR=1.99, P=0.1292). TP53 서명은 침습성 방광암 셋팅에서 화학요법에 내성과 관련되는 것을 나타냈다 (Choi 등 Cancer Cell 25(2): 152-165, 2014). 우리 연구 코호트의 NMIBC 서브셋에서, 높은 TP53 발현은 BCG-치료된 환자에서 유의미하게 더 나쁜 DFS, 방광암 환자에 통상적으로 투여된 치료와 관련되었다 (도 9I; HR=4.2, P=0.0405). 높은 TP53 발현 및 NMIBCs내 불량한 DFS 사이의 상기 관련은, 하지만, 미치료된 환자 (즉, 치료 미접촉 환자)에서 보여지지 않았다 (도 9J; HR=0.57, P=0.5749). 우리의 데이터는 TP53 돌연변이의 높은 빈도가 NMIBCs를 가진 환자에서 공격성 종양 행동에 기여할 수 있다는 것을 시사하고, 이는, 부분적으로, 상기 환자 집단에서 BCG 치료의 비생산적 효과에 기인될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5: 높은 EGFR 발현은 불량한 임상 결과와 관련되고 방광암 세포주에서 에를로티닙에 감수성을 부여한다
ERBB2에서 돌연변이는 공격성 미세유두상 조직학의 종양에서 보고되었다 (Ross 등 Clin Cancer Res. 20(1): 68-75, 2014). 우리의 환자 코호트에서, 우리는 ERBB2 돌연변이를 검출하지 않았지만; 하지만, 우리는 더욱 양성 표층 적색 그룹으로부터 또는 침습성/전이성 황색 그룹으로부터 종양이 아닌 신속-재발성 NMIBC 녹색 그룹으로부터 종양내 EGFR에서 돌연변이를 확인하였다 (도 3A). 우리는 방광암의 드라이버로서 상기 경로에 대한 잠재적 역할을 조사하기 위해 ERBB 계열 리간드 및 수용체의 면밀한 게놈 분석을 수행하였다 (도 10). 우리는 황색 그룹으로부터 샘플의 4/39 (~10%)에서 ERBB2 및 2/39 (~5%)에서 EGFR 카피수 이득, 뿐만 아니라 적색 그룹으로부터 1/30 (~3%) 샘플에서 ERBB2 카피수 이득을 관측하였다 (도 10). 이들 발견은 이전의 보고와 일치되고 (Weinstein 등 Nature 507(7492): 315-322, 2014; Capellen 등 Nat.Genet.23(1): 18-20, 1999), 경로가 방광 발암에서 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
우리가 신속-재발성 NMIBCs에서 ERBB 계열 구성원내 DNA 카피수 변경을 검출하지 못했어도, 플루이다임 데이터 분석은 EGFR의 발현 수준이 모든 더욱 양성 NMIBC 적색 그룹 뿐만 아니라 침습성/전이성 황색 그룹으로부터 샘플에 비교된 신속-재발성 NMIBC 녹색 그룹에서 유의미하게 더 높았음을 드러냈다 (도 11A; P=0.012 및 P=0.0012, 각각). EGFR이, 적어도 부분적으로, NMIBCs에서 공격성 방광암 행동에 기여될 수 있다는 가능성을 조사하기 위해, 우리는 종양이 EGFR의 높은 대 낮은 수준을 발현시킨 환자의 DFS 개연성을 조사하였다. 비침윤성 셋팅에서, EGFR의 높은 수준을 발현시킨 NMIBCs을 가진 환자가 낮은-발현 악성종양을 가진 환자에 비교된3- 뿐만 아니라 5-년 DFS 가능도를 감소시켰다 (도 11B). 진전된 전이성 셋팅에서, 높은 EGFR 발현 수준은 또한 감소된 3- 및 5-년 DFS 개연성과 관련되었다 (도 11C). 더욱이, 전이성 질환을 가진 우리의 코호트로부터 환자에서 높은 EGFR 발현은 낮은-발현 사례에 비교된 비호의적인 3- 및 5-년 OS 가능도와 관련되었다 (도 11D).
이들 발견을 입증하기 위해, 우리는 2개의 독립적인 데이터세트에서 EGFR 발현 수준의 예후 값을 평가하였다 (
Figure pct00021
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Kim 등 Mol. Cancer 9:3, 2010). 이들 두 연구로부터 침습성/전이성 사례에서, 우리는 높은 EGFR 발현이 모든 3- 및 5-년 후속조치 기간에서 감소된 OS 개연성에 의해 동반되었음을 관측하였다 (도 11E 및 11F). 따라서, 우리의 코호트로부터 데이터 뿐만 아니라 2개의 독립적인 연구로부터 데이터는 높은 EGFR 발현이, 적어도 부분적으로, 방광암의 공격성 행동에 기여하고 있을 수 있다는 것을 시사한다.
방광암에서 항-EGFR 요법에 대한 반응용 예측의 바이오마커로서 EGFR 발현 수준을 평가하기 위해, 우리는 EGFR 소분자 저해제 에를로티닙에 대한 감수성에 대하여 방광암 세포주의 패널을 스크리닝하였다 (Stamos 등 J. Biol. Chem. 277(48): 46265-46272, 2002). UMUC-5, UMUC-10 및 UMUC-17 세포주는, UMUC-5에 대하여 >75% 성장 저해 (GI) 내지 UMUC-17에 대하여 대략 40% GI 범위인, 에를로티닙에 대한 감수성의 다양한 정도를 나타냈다 (도 11G). 다른 한편으로, 4개의 세포주 (RT-112, UMUC-3, SW780, 및 BFTC905)는 에를로티닙 치료에 대한 반응에서 최소 GI를 나타냈다 (도 11G). 다음으로, 우리는 우리의 세포주에서 EGFR 발현의 수준을 조사하였다. 감수성 (>25% GI)이었던 세포주는 비감수성 방광암 세포주 (<25%의 최소 GI)에 비교된 EGFR의 유의미하게 더 높은 수준을 발현시켰다 (도 11H; P=0.0106). 이들 결과는 방광암에서 EGFR의 발현 수준이 EGFR 경로 저해제 (예를 들면, 에를로티닙)에 대해 그의 감수성을 예측한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 맞춤형 방광암 플루이다임 패널은 방광암 샘플을 기저 및 내강 하위유형으로 정확하게 분류한다
본 실시예는, 기록 FFPE 방광암 임상 샘플을 포함한, 방광암의 전사 분석용 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 의 추가 발달 및 인실리코 검증을 기재한다. 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, 패널의 유전자는 하기를 포함한다: 수용체 티로신 키나아제 (RTK) 경로 예컨대 FGFR, ERBB, MET, PI3K/AKT, 및 MAPK 축의 구성요소; TP53 유사 세포 사이클 및 게놈 안정성 유전자; 뿐만 아니라 세포 분화 및 발달의 조절, 및 상피간엽 이행 (EMT)에 관여된 유전자 (도 12A).
인실리코, 우리는 대규모 공공 데이터세트로부터 샘플의 조직학적 속성 및 주요 분자를 포착하기 위해 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 (참고 표 1) 의 능력을 평가하였다 (
Figure pct00022
등 Clin . Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012). 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 에서 유전자에 상응하는 125 프로브의 발현에 기반된 샘플의 자율 계층적 클러스터링은 2개의 주요 분지를 드러냈다 (도 12B). 좌측 분지는, 하기에 의해 정의된 바와 같이, 저등급 (G1/G2) 종양, T1 기의 암, 및 MS1 분자 부류가 풍부하였다:
Figure pct00023
등 (위에) (도 12B). 우측 분지 하에서 우리는 G3/G4 종양의 우세, 및 T3/T4 악성종양, 방광암의 MS2a 부류의 코-클러스터링, 및
Figure pct00024
-정의된 분자 아형으로부터 MS2b 종양의 공동-분리가 풍부함을 나타냈다 (도 12B).
다음으로, 우리는 하기에 의해 정의된 바와 같이 종양 등급, TNM 기, 및 전사 클래스에 대하여 오분류 오차율을 계산하였고:
Figure pct00025
등 (위에), 전체 24,394 일루미나 프로브 세트 또는 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 내용물과 중첩인 125 프로브 세트 이용, 그리고 도심 분류기에서 사용된 및 교차-검증을 통해 평가된 경우 약화하는 유전자 서브셋의 예측의 능력을 결정하였다 (Tibshirani 등 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:6567-6572, 2002) (도 12C). 우리는 종양 등급 및 TNM 기에 대하여 대략 40%의 비교할만한 오분류 오차율, 및 MS1, MS2a, 및 MS2b 클래스에 대하여 대략 20% 오분류 오차 빈도를 알아내었다 (도 12C). 오분류 오차율에서 유사한 증가는 프로브의 수가 감소됨에 따라 모든 사례에서 관측되었다 (도 12C). 이들 결과는 하기에서 사용된 일루미나 마이크로어레이의 전체 내용을 사용할 경우 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 의 유전자가 고도의 정확도를 갖는 분자 클래스, 뿐만 아니라 종양 등급 및 유사한 유효성을 가진 TNM 기를 포착하는 것을 시시한다:
Figure pct00026
등 (위에).
방광암의 최근에 기재된 기저 및 내강 하위유형의 생물학적 및 임상 관련성이 주어지면 (Damrauer 등 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 111:3110-3115, 2014; Choi 등 PLoS One 7:e30206, 2012), 우리는 몇 개의 공공 데이터세트에서 이들 2개의 분자 하위그룹 사이를 식별하기 위해 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 능력을 조사하였다. 하기에 의해 결정된 기저/내강 배정을 이용하여: Damrauer 등 (위에) 및 Choi 등 (Cancer Cell 25:152-165, 2014) 그의 발견 및 검증 집단에서, 우리는 방광암 플루이다임 패널에서 유전자에 상응하는 프로브의 발현에 기반된 계층적으로 클러스터 샘플에 대한 자율 접근법을 이용하였다 (도 12D). 상기 접근법은 하기를 정확하게 분류하였다: 하기로부터 내강의 39/44 (80%) 및 기저 샘플의 42/47 (89%):
Figure pct00027
l 등 (위에) 데이터세트, 및 하기로부터 내강의 10/12 (83%) 및 기저 종양의 17/18 (94%): Kim 코호트 (Kim 등 Molecular Cancer 9:3, 2010) (도 12D). 더욱이, 상기 접근법은 각각 사례의 33/33 (100%) 및 23/28 (82%)에서 내강 및 기저 하위유형으로 Damrauer 발견 세트 (Damrauer 등, 상기)로부터 시료를 정확하게 분류하였다 (도 12D). 마지막으로, 맞춤형 방광암 플루이다임 패널에서 유전자는 하기로부터 내강 및 기저 상태에 기반하여 샘플을 정확하게 분류할 수 있었다: Choi 발견 데이터세트 (Choi 등 2012, 상기) 23/24 (96%) 및 23/23 (100%) 사례에서, 각각.요약하면, 상기 인실리코 분석으로부터 발견은 맞춤형 방광암 플루이다임 패널에서 주의하여 선택된 유전자가 4개의 공공 데이터세트에서 기저/내강 상태를 정확하게 검출한다는 것을 입증한다.
맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 강건성 및 FFPE 샘플에서 유전자 발현 측정의 재현성을 평가하기 위해, 우리는 일련의 품질관리 실험을 수행하였다. 먼저, 우리는, 전체 시험에 대한 선형 표준 희석 곡선을 달성하기 위해, 필요할 때 프라이머를 재설계하는, 각각의 검정의 성능을 평가하도록 연속 희석을 수행하였다 (도 13A). 우리는 FFPE-유도된 RNA 샘플의 세트를 또한 시행하였고 상이한 날에 복제 샘플로부터 패널상에 각 유전자의 정규화된 발현에서 높은 일치를 관측하였다 (도 13B, R2 범위 = 0.98-0.99). 마지막으로, 우리는 각각의 7개 독립적인 시행에서 포함되었던 범용 인간 RNA 대조군에 대한 고도의 칩대칩 데이터 재현성을 나타냈다 (도 3E, R2 범위 = 0.91-0.98).
합쳐서, 우리의 정성적 및 정량적 평가로부터 결과는 맞춤형 방광암 플루이다임 패널이 기술적으로 강력하고 FFPE 방광암 조직의 전사 계층화에 사용될 수 있음을 나타낸다. FFPE 조직의 전사 특성규명에 대한 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 의 유용성을 추가로 입증하기 위해, 우리는, 실시예 1 및 표 1에 상기 기재된, 원발 NIMBCs, MIBCs, 뿐만 아니라 림프절 및 원위 METs로 구성된 204 샘플의 세트를 분석하였다. 우리는 이들 샘플이 기저/내강 전사 특징에 대하여 몇 개의 공공 데이터세트로부터의 것과 비교한 방법을 조사하였다. 예상대로, 4개의 공공 데이터세트로부터 샘플의 자율 계층적 클러스터링 (Damrauer 등 2014, 상기; Kim 등 2010, 상기;
Figure pct00028
등 2012, 상기; 및 Choi 등 2014, 상기)은 우리의 패널상에 유전자에 상응하는 프로브로부터 중앙 중심에 있는 발현을 이용하여 기저 및 내강 샘플의 명백한 분리를 드러냈다 (도 14A). 현저히, Kim 내강 샘플은 3개의 다른 데이터세트로부터 기저 샘플로 클러스터링하였고, 따라서, 상기 분석에서 분리물이었다 (도 14A). 우리는 실시예 1 및 도 1에 기재된 방광암 코호트에서 NMIBCs가 내강 샘플로 클러스터링하였고, 반면에 MIBCs 및 METs가 공공 데이터세트로부터 기저 샘플을 끼고 클러스터링되었고 더욱 기저인 것으로 보여졌음을 관측하였다 (도 14A).
실시예 1 및 도 1에 기재된 204 FFPE 샘플의 기저/내강 (B/L) 전사 서명을 추가로 평가하기 위해, 우리는 각각의 이들 종양에 대하여 B/L 유사성 스코어의 계산 방법을 다음으로 확립하였다. 먼저, 우리는 공공 데이터세트에서 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 의 유전자에 상응하는 전체 프로브의 발현을 중앙-중심화하였고 하기에 의해 배정된 바와 같이 기저 및 내강 그룹에서 평균 유전자 발현 값을 계산하였다: Damrauer 등 (위에) 및 Choi 등 (위에) (도 14B). 이는 공공 데이터세트로부터 내강 및 기저 그룹에서 각각의 이들 유전자의 발현의 평균 시각을 수득하게 하였다 (도 14B 및 14C). 예를 들어, FGFR3은 우리의 패널상에 임의의 다른 유전자보다 내강 샘플에서 최고 평균 발현 값을 가졌고, 평균 FGFR3 발현 수준은 공공 데이터세트로부터 기저 샘플에서 최저 중 하나이었다 (도 14B). 우리는 그 다음 공공 기저 및 내강 프로파일에 대한 상관관계를 계산함으로써 각 FFPE 샘플에 대하여 B/L 유사성 스코어를 유도하였다 (도 14C).
실시예 1 및 도 1에 기재된 204 FFPE 샘플의 자율 계층적 클러스터링은 유전자 발현의 상이한 패턴을 갖는 2개의 주요 분지를 보여주었다: (1) 낮은 B/L 유사성 스코어 (내강-유사)를 가진 샘플이 코-클러스터링되었던 우측 분지; 및 (2) 높은 B/L 스코어 (기저-유사)를 가진 샘플로 구성되었던 좌측 분지 (도 15A). 통계적인 분석은 내강 상태를 나타내는 좌측 분지에서 유의미하게 더 낮은 B/L 스코어, 및 계층적 트리의 우측 아암하에 기저 상태와 일치된 유의미하게 더 높은 B/L 스코어를 확인하였다 (도 15B, 최상부 좌측). 우리는 기저 그룹에 비교된 내강에서 NMIBCs의 유의미하게 더 높은 분획을 관측하였다 (도 15B, 최상부 우측). MIBCs는 모든 기저 및 내강 그룹에서 나타내었지만; 하지만, MIBCs의 유의미하게 더 높은 분율은 기저 그룹에서 관측되었다 (도 15B). 흥미롭게도, 거의 전체 METs는 계층적 트리의 기저 아암하에 클러스터링하였고, 실시예 1 및 도 1에 기재된 방광암 코호트에서 대다수의 METs가 기저 전사 프로파일을 나타냈음을 시사한다 (도 15A 및 15C).
상기 기재된 바와 같이, NMIBCs의 특징적인 특성들 중 하나는 이들이 사례의 대략 60-80%로 FGFR3에서 체세포 활성화 돌연변이를 담지한다는 것, 및 대략 15%의 훨씬 더 낮은 빈도가 MIBCs 및 METs에서 보고되었다는 것이다. 우리는 맞춤형 대립유전자-특이적 PCR 패널을 이용하여 코호트로부터 샘플에서 FGFR3 및 다른 암-관련 유전자의 돌연변이 상태를 평가하였다 (Schleifman 등 상기; Tomlinson 등 상기; van Rhijn 등 상기; Martinez-Torrecuadrada 등 상기; Cappellen 등 상기, 1999; 및 Al-Ahmadie 등 상기). 예상대로, 우리는 종양의 대략 75%가 내강 표지하에 코-클러스터링하였고, 대략 20%보다 유의미하게 더 높은 분율이 기저 그룹으로부터 샘플에서 관측되었음을 알아내었다 (도 15A 및 15D). FGFR3에서 돌연변이는 FGFR3 단백질의 더 높은 발현 수준을 구동하기 위해 보고되었다. 이들 보고와 일치로, 우리는 기저 그룹으로부터의 것과 비교된 내강 그룹으로부터 샘플에서, IHC에 의해 측정된 바와 같이, FGFR3 단백질의 유의미하게 더 높은 수준을 나타냈다 (도 15A 및 15D). FGFR3 돌연변이 및 발현 데이터는 우리의 샘플의 내강 및 기저 상태의 분자 확인을 제공한다.
B/L 전사 특징을 넘어, 우리는 방광 발암에 관여되는 것으로 공지된 경로, 예컨대 TP53 경로, PI3K/AKT 경로, ERK/MAPK 경로, 및 세포 사이클 신호전달 축의 구성요소에 속하는 유전자의 발현 측정에서 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 유용성을 평가하였다. 우리는 다중 가설 검정용 대조군에 순열-조정된 p-값을 사용하였고, 기저 및 내강 그룹 사이에서 유의미하게 차별적으로 발현되는 경우 49/91 고유 유전자를 확인하였고 (표 4), INGENUITY® 소프트웨어를 이용하여 경로에 이들 유전자를 맵핑하였다 (도 15F).
Figure pct00029
Figure pct00030
내강 종양에서 유의미한 활성화 스코어를 나타내었던 경로는 NF-κB, TP53, ERK/MAP, G1/S 세포 사이클 체크포인트, HGF, 및 VEGF 신호전달 경로를 포함하였다 (도 15F). 다른 한편으로, 기저 그룹에서 유의미하게 활성화되었던 경로는 PTEN, PI3K/AKT, 세라미드, 및 세포 사이클 조절 신호전달 경로를 포함하였다 (도 15F). INGENUITY® 소프트웨어를 이용한 업스트림 경로 활성화 분석은 내강 그룹에 속하는 샘플이, FGFR3, GATA3, CCND1, 및 ERBB3의 높은 수준, AXL1, CXCL1, FGFR1, 및 BCL2의 낮은 수준, 뿐만 아니라 EMT 유전자, 예컨대 SNAI1 및 ZEB1의 낮은 발현 수준을 포함한, 에스트로겐 수용체 (ER) 활성화와 일치된 발현 프로파일을 가졌음을 또한 드러냈다 (도 17A). 그에 반해서, 기저 그룹에 속하는 샘플은 이들 유전자에 대한 반대 발현 프로파일을 나타내었다 (도 17B). 이들 발견은 우리의 패널이 FFPE 조직에서 방광암-관련 경로의 전사 상태 측정을 위하여 통지를 입증한다.
원발 방광암의 조직병리적 특징은 방광암 환자에 대하여 역사적으로 유도된 임상 관리 결정을 갖는다. 방광암의 유전적 드라이버의 증가된 이해로, 신규 방법이 질환의 분자 속성에 기반하여 치료 중재에 길을 내고 있다. 하지만, 원발 종양의 분자 특징은, 심지어 전이성 셋팅에서 발달되고 있는 약물에 대하여, 표적화된 제제를 이용한 임상 결정을 안내하기 위해 종종 사용된다. 원발 종양의 주요 분자 특징이 전사 수준에 관해 방광암 전이에서의 것을 대표하는지를 다루기 시작하기 위해, 우리는 동일한 환자로부터 9개의 매칭된 원발 종양/MET 쌍의 B/L 스코어를 비교하였다. 우리는 먼저 차세대 서열분석 (NGS) 데이터를 조사하였고 전체 9개의 원발/전이 쌍으로부터 변이체가 크게 상관되었음을 알아내었고, 따라서 매칭된 종양이 사실상 동일한 환자로부터였음을 확립하였다 (도 16A 및 18). 원발 종양 및 매칭된 METs의 B/L 스코어 사이에서 상관관계 분석은 5/9 쌍이 거의 동일한 B/L 스코어를 가졌고, 2/9가 그의 B/L 상태에서 유의차로 나타내었음을 나타냈다 (도 17A 및 17B). 흥미롭게도, 우리는 2/9 사례에서 B/L 스코어에 유의미한 변화를 관측하였고, 이 둘 모두는 내강 원발 종양 및 기저 METs를 갖는 것으로서 특성규명되었다 (도 17A 및 17B). 이들 발견은 원발 종양의 B/L 상태가 전이성 병변에서 관측된 것을 항상 반영하지 않는다는 것을 시사하고, 방광암 전이의 분자 특성규명이 병상에서 치료 결정을 더욱 정확하게 안내하기 위해 보증될 수 있음을 나타낸다.
실시예 6 을 위한 추가 물질 및 방법
공공 데이터 세트의 분석
몇 개의 공공 데이터세트는 종양 병기, 등급, 및 질환의 주요 전사 특징, 예컨대 기저/내강 상태를 포착하는 맞춤형 방광암 플루이다임 패널 유전자 예측의 능력을 확인하기 위해 사용되었다.
Figure pct00031
일루미나 인간 HT-12 V3.0 유전자 발현 데이터 (
Figure pct00032
등 2012, 상기)는 Gene Expression Omnibus (GEO) 웹사이트 (ncbi.nlm.nih.gov/geo/GSE32894)로부터 다운로드되었다. 발현 데이터는 하기를 이용하여 정규화되었다: 중간값 다듬기 (Tukey 등 Exploratory Data Analysis, Addison -Wesley, publishers, 1977). 자율 계층적 클러스터링 분석은 샘플 그룹화, 및 보고된 샘플 종양 등급, TMN 병기를 찾기 위한 평균-연결, 1 - Pearson 상관관계 거리 미터법을 이용하여 적용되었고, 분자 부류는 사용되었다 (
Figure pct00033
등 2012, 상기). 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 91 고유 유전자의 능력은 종양 등급, TNM 병기의 정확한 확인을 위하여 평가되었고, 분자 부류는 도심 분류기 접근법을 이용하여 결정되었다. 교차-입증된 오분류 오차 곡선은 PAMR R 라이브러리를 이용하여 창출되었다 (Tibshirani 등 Proc. Natl . Acad . Sci . USA 99:6567-6572, 2002) (전체 어레이 또는 하기의 상응하는 125 프로브 서브셋 이용:
Figure pct00034
등 (위에) 발현 데이터 세트). 전사 프로파일링을 통해 기저-유사 및 내강-유사 샘플을 확인하기 위한 맞춤형 방광암 플루이다임 패널의 유전자의 능력은 4개의 문헌 데이터 세트 (GSE32894, GSE5287, GSE13507, GSE48075)에서 평가되었다.
이들 공공 데이터에서 작성된 기저 또는 내강 분류는 하기에 의해 기재된 바와 같았다: Damrauer 등 (위에). 간단히, Damrauer 등 (위에) 발견 샘플 (N=30, Affymetrix Human Genome U133A Array)은 NCBI Gene Expression Omnibus (GSE5287)로부터 다운로드되었다. 맞춤형 방광암 플루이다임 패널에서 유전자에 상응하는 Affymetrix 프로브 세트가 사용되었다. 로그 변환 발현 데이터의 잔여 서브셋은 그 다음 평균 중심화되었고 단위 변동으로 정규화되었다. 평균 유전자 발현 값은 그 다음 기저 및 내강 발현 프로파일을 생산하기 위해 기저-유사 (입안자 관련성을 통한 분류)로서 분류된 18 샘플 및 내강-유사로서 분류된 12 샘플을 거쳐 91 고유 유전자에 대하여 계산되었다. 상기 과정은 3개의 다른 공공 데이터세트 (GSE32894, GSE13507, GSE48075)에 대하여 반복되었다.
종양
실시예 1에 기재된 바와 같이 204 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 방광 종양 샘플의 수집은 본 실시예에서 기재된 실험에서 사용되었다. RNA 및 DNA는 실시예 1에 기재된 바와 같이 거대 해부된 샘플로부터 추출되었다.
FFPE 종양의 플루이다임 발현 분석
유전자 발현 분석은, 이전에 기재된 바와 같이, ENVIRENE®를 이용한 탈-파라핀화 이후 높은 순수한 FFPE RNA Micro 키트 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 이용하여 거대해부된 FFPE로부터 추출된 RNA에서 수행되었다 (O'Brien 등 Clin . Cancer Res. 16:3670-3683, 2010). 방광암-관련 유전자의 96 고유 mRNa 전사체의 유전자 발현 분석은 cDNA로 역-전사된 및 Superscript III/ Platinum Taq 및 사전-증폭 반응 믹스 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용한 단일 반응에서 사전-증폭된 100 ng 총 RNA로 시작하는 환자 시료에서 수행되었다. 전체 96 Taqman 프라이머/프로브 세트는 0.05x 최초 TAQMAN® 검정 농도 (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 최종 희석으로서 사전-증폭 반응에서 포함되었다. 열순환 조건은 아래와 같았다: 50 ℃ 15분 동안 1 사이클, 70 ℃ 2 분 동안 1 사이클, 95 ℃ 15 초 동안, 및 60 ℃ 4 분 동안 14 사이클.사전-증폭된 cDNA는 2-배 희석되었고 그 다음 제조자의 사용설명서에 따라 BIOMARK™ BMK-M-96.96 플렛폼 (플루이다임, South San Francisco, CA)에서 TAQMAN® 범용 PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 증폭되었다. 전체 샘플은 3중으로 검정되었다. 사이클 역치 (Ct) 값은 ΔCt 방법 (O'Brien 등 상기)을 이용하여 상대적 발현에 대해 전환되었고, 여기에서 ΔCt는 표적 유전자의 평균 빼기 각각의 환자 시료에 대하여 계산된 참조 유전자의 기하 평균이었다. 맞춤형 방광암 플루이다임 패널에 관해 평가된 유전자에 대하여, 사이클 역치 (Ct) 값은 중간값 다듬기 (Tukey 등 상기)를 이용하여 정규화되었다. 차별적으로 발현된 유전자의 계층적 클러스터링은 거리 미터법으로서 1 - Pearson 상관관계를 이용한 평균-연결 방법으로 정규화된 데이터에서 수행되었고, 그 후에 R을 사용하여.시각화되었다.
돌연변이 분석
돌연변이 분석은 하기로 탈파라핀화 이후 QIAamp FFPE 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 거대해부된 FFPE 조직으로부터 추출된 게놈 DNA에서 수행되었다: ENVIRENE® (Lindgren 등 PLoS One 7:e38863, 2012). PIK3CA, EGFR, KRAS, NRAS, HRAS, FGFR3, MET, BRAF, KIT, AKT1, FLT3에서 돌연변이는 이전에 기재된 바와 같이 돌연변이-특이적 qPCR을 이용하여 검출되었다 (Schliefman 등 PLoS One 9:e88401, 2014).
면역조직화학
면역조직화학은 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
기저/내강 유사성 스코어의 계산, 매칭된 원발 종양 및 전이의 분석, 및 통계적인 분석
실시예 1에 기재된 204 방광암 코호트 FFPE 샘플로부터 샘플에 대한 기저/내강 유사성 스코어는, 이전에 기재된 바와 같이, 공공 Damrauer 등 발견 데이터 세트로부터 제1 유도 기저/내강 발현 프로파일에 의해 결정되었다 (Damrauer 등 상기). 다음으로, 각 프로파일과 각 평균 중심화된, 단위 변동-정규화된 FFPE 샘플 사이에서 기저 및 내강 Pearson 상관관계는 결정되었다. 이들 두 상관관계 스코어는 전체 B/L 유사성 스코어를 생산하기 위해 합치되었다: B/L 스코어 = (기저 프로파일 상관관계 - 내강 프로파일 상관관계)/2.0.B/L 스코어는 +1.0 내지 -1.0의 범위를 가졌고, 0 초과의 스코어는 기저-유사 샘플을 나타내고, 0 미만의 스코어는 내강-유사 샘플을 나타낸다. 유사하게, 9개의 매칭된 원발 및 전이 샘플의 B/L 유사성 스코어는 유사한 방식으로 계산되었다. 매칭된 샘플이 동일한 환자로부터인지를 확인하기 위해, 차세대 서열분석 (NGS)은 제조자 지침에 따라 ION AMPLISEQ™ Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 수행되었고 (Tsongalis 등 CCLM / FESCC 52:707-714, 2014), 그리고 Pearson 상관관계는 모든 샘플이 적어도 100x 판독 적용범위를 가졌고 적어도 하나의 샘플이 대립유전자 빈도 > 10%를 가졌던 전체 변이체 부위에서 대립유전자 빈도를 비교함으로써 계산되었다 ((평균적으로, 120 부위는 임의의 2개의 샘플 사이에서 비교되었다). 원발-전이 샘플이 불일치된 가능도는 그의 상관관계 스코어와 랜덤 샘플 짝짓기의 3,500 상관관계와의 비교에 의해 알아내었다. 원발과 매칭된 전이 사이에서 B/L 스코어의 차이는 전형적인 체계적 오차 때문에 예상된 차이에 비교되었다. 체계적 오차의 추정은 무작위로 선택된 샘플에 대한 대체를 이용한 맞춤형 방광암 플루이다임 패널로부터 유전자의 샘플링 및 100,000 순열에서 B/L 스코어의 재계산에 의해 달성되었다. 클러스터 사이에서 차별적인 돌연변이 빈도의 유의성을 위하여, 피셔 정확 검정이 수행되었다. 피셔 정확 검정 및 2-꼬리 t-검정은 전체 다른 통계적인 비교에 사용되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. F. Hoffmann-La Roche AG <120> THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND PROGNOSTIC METHODS FOR CANCER <130> 50474-105WO2 <150> US 62/096,741 <151> 2014-12-24 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 ctggctgcag acccggtcct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 aggtggtgtg tgtggatcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 ccgcatcatc tgagctagg 19 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 tgcacacctg gatcc 15 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 cctgtggatg actgagtacc tgaa 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 gggccgtaca gttccacaaa 20 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 aggctgggta ggtgca 16 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Claims (53)

  1. 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하는, 방광암으로부터 고통받고 있는 환자의 치료 방법으로서, 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준이, 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준에 비하여 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  2. 하기의 단계를 포함하는, 환자에서 방광암의 진단 방법:
    (a) 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및
    (b) 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준의 비교 단계로서, 상기 참조 수준에 비하여 상기 환자 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준에서의 증가는 방광암을 갖는 환자를 확인하는 단계.
  3. 청구항 2에 있어서, (c) 방광암을 갖는 상기 환자의 통지 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, (d) 상기 참조 수준에 비하여 상기 환자 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 발현의 상기 수준에서의 증가가 검출된 경우 상기 환자의 치료를 위하여 항-암 요법의 선택 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 청구항 2 내지 4 중 임의의 하나에 있어서, (e) 상기 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 하기 단계를 포함하는, 방광암으로부터 고통받고 있는 환자의 예후 방법:
    (a) 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계;
    (b) 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준의 비교 단계; 및
    (c) 상기 환자에 대한 예후의 결정 단계로서, 불량한 예후는 상기 참조 수준에 비하여 증가되는 상기 환자 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 단계.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 예후가 생존의 예후인, 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 방법이 상기 환자에 항-암 요법의 투여에 앞서 수행되는, 방법.
  9. 청구항 6 내지 8 중 임의의 하나에 있어서, (d) 상기 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정된 경우 항-암 요법의 투여로부터 이로울 것으로서 상기 환자의 확인 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 청구항 6 내지 9 중 임의의 하나에 있어서, (e) 상기 환자가 생존의 불량한 예후를 갖는 것으로 결정되면, 상기 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 청구항 6 내지 10 중 임의의 하나에 있어서, 상기 생존이 무병 생존 또는 전체 생존인, 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 방광암을 가진 환자가 항-암 요법을 이용한 치료에 반응할 것 같은지의 결정 방법:
    (a) 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및
    (b) 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준의 비교 단계로서, 상기 참조 수준에 비하여 상기 환자 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준에서의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계.
  13. 하기 단계를 포함하는, 방광암을 가진 환자에 대하여 항-암 요법의 치료 효능의 최적화 방법:
    (a) 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기 유전자: FGFR3, TP53, 및 EGFR의 적어도 하나의 상기 발현 수준의 결정 단계; 및
    (b) 상기 적어도 하나의 유전자의 참조 수준과 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준의 비교 단계로서, 상기 참조 수준에 비하여 상기 환자 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준에서의 증가는 항-암 요법을 포함한 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인하는 단계.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, (c) 상기 환자에 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 청구항 1, 4, 5, 또는 8 내지 14 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-암 요법이 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 및/또는 EGFR 길항제를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항-암 요법이 FGFR3 길항제 및 EGFR 길항제를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 FGFR3 길항제, EGFR 길항제, 또는 TP53 길항제가 항체 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 FGFR3 길항제가 항-FGFR3 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 EGFR 길항제가 항-EGFR 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 TP53 길항제가 항-TP53 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  21. 청구항 15 또는 16에 있어서, 상기 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 또는 EGFR 길항제가 소분자 길항제인, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 FGFR3 길항제 또는 EGFR 길항제가 티로신 키나아제 저해제인, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 EGFR 길항제가 에를로티닙 (TARCEVA™)인, 방법.
  24. 청구항 15 내지 23 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-암 요법이 (i) 항-신생물성 제제, 화학치료제, 성장-저해제, 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제, (ii) 방사선요법, 또는 (iii) 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준이 mRNA의 측정에 의해 결정되는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준이 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 검정에 의해 결정되는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 PCR 검정이 정량적 PCR 검정인, 방법.
  28. 청구항 1 내지 24 중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준이 단백질의 측정에 의해 결정되는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 유전자의 상기 발현 수준이 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 결정되는, 방법.
  30. 청구항 1 내지 29 중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플이 종양 샘플인, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 종양 샘플이 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 종양 샘플인, 방법.
  32. 청구항 1 내지 31 중 임의의 하나에 있어서, 상기 유전자의 적어도 2개의 상기 발현 수준의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 유전자의 전체 3개의 상기 발현 수준의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 33 중 임의의 하나에 있어서, FGFR3의 상기 발현 수준이 참조 수준에 비하여 적어도 2-배 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, FGFR3의 상기 발현 수준이 참조 수준에 비하여 적어도 4-배 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  36. 청구항 1 내지 35 중 임의의 하나에 있어서, EGFR의 상기 발현 수준이 참조 수준에 비하여 적어도 4-배 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, EGFR의 상기 발현 수준이 참조 수준에 비하여 적어도 8-배 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  38. 청구항 1 내지 37중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 유전자의 상기 발현 수준의 투여를 추가로 포함하는, 방법: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9, 및 FGF2 (여기에서 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 상기 발현 수준은 상기 적어도 하나의 추가 유전자의 참조 수준에 비하여 변화된다).
  39. 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 있어서, 상기 방광암이 비근침윤성 방광암, 근침윤성 방광암, 또는 전이성 방광암인, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 비근침윤성 방광암이 재발성 비근침윤성 방광암인, 방법.
  41. 상기 환자에 바실러스 칼메트-게랑 (BCG) 백신 이외의 항-암 요법의 치료적 유효량의 투여를 포함하는, 방광암으로부터 고통받고 있는 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 TP53의 상기 발현 수준이 TP53의 참조 수준에 비하여 증가되는 것으로 결정되는, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 항-암 요법이 FGFR3 길항제, EGFR 길항제, 및/또는 TP53 길항제를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 항-암 요법이 FGFR3 길항제 및 EGFR 길항제를 포함하는, 방법.
  44. 청구항 42 또는 43에 있어서, 상기 FGFR3 길항제, EGFR 길항제, 또는 TP53 길항제가 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 FGFR3 길항제가 항-FGFR3 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  46. 청구항 44에 있어서, 상기 EGFR 길항제가 항-EGFR 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  47. 청구항 44에 있어서, 상기 TP53 길항제가 항-TP53 항체, 또는 이의 기능성 단편인, 방법.
  48. 청구항 42 또는 43에 있어서, 상기 FGFR3 길항제, TP53 길항제, 또는 EGFR 길항제가 소분자 길항제인, 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 소분자 길항제가 티로신 키나아제 저해제인, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 EGFR 길항제가 에를로티닙 (TARCEVA™)인, 방법.
  51. 청구항 41 내지 50 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-암 요법이 (i) 항-신생물성 제제, 화학치료제, 성장-저해제, 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제, (ii) 방사선요법, 또는 (iii) 이들의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 청구항 41 내지 51 중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 TP53의 상기 발현 수준이 mRNA의 측정에 의해 결정되는, 방법.
  53. 청구항 41 내지 51 중 임의의 하나에 있어서, 상기 환자로부터 수득된 상기 샘플에서 TP53의 상기 발현 수준이 단백질의 측정에 의해 결정되는, 방법.
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