KR20170090495A

KR20170090495A - Ｃｓ1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 ｔ 세포

Info

Publication number: KR20170090495A
Application number: KR1020177018597A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 제이. 포르만; 시우리 왕
Original assignee: 시티 오브 호프
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2017-08-07
Anticipated expiration: 2035-12-07
Also published as: EP3227315B1; US10821161B2; CN114085856A; WO2016090369A1; RU2727451C2; JP7252379B2; MX2021008498A; MX2017007250A; IL252645A0; IL252645B; IL290459A; US20210170001A1; IL290459B2; US20170360910A1; IL290459B1; CN107429253A; CA2969704A1; JP2017537627A; HK1247642A1; CN107429253B

Abstract

악성 흑색종 및 CS1을 발현하는 다른 암을 치료하는 데 사용하기 위한 키메라 항원 수용체를 기술한다.

Description

ＣＳ1 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 Ｔ 세포 {CS1 TARGETED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED T CELLS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2014년 12월 5일 출원된 미국 일반출원 번호 62/088,423 (발명의 명칭: "USE OF CENTRAL MEMORY DERIVED-CS1 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORMODIFIED T CELLS TO TREAT MULTIPLE MYELOMA")의 이점을 주장하고, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 포함된다.

조작된 T 세포를 이용하는 요법을 비롯한, 종양-특이적인 T 세포 기반 면역요법이 항-종양 치료를 위해 연구되어 오고 있다. 일부 경우에서, 상기 요법에서 사용되는 T 세포는 생체내에서 장시간의 충분한 기간 동안 활성 상태 그대로 유지되지 못한다. 일부 경우에서, T 세포의 항종양 활성은 비교적 낮다. 그러므로, 관련 기술분야에서는 장기간 동안 작용하는 항-종양 기능을 가진 종양-특이적인 암 요법이 요구되고 있다.

키메라 항원 수용체 (CAR) 조작된 T 세포를 이용하는 입양 T 세포 요법 (ACT)은, CAR T 세포는 MHC-비의존적인 방식으로 항원과 관련하여 상이한 종양 집단을 특이적으로 인식하도록 조작될 수 있기 때문에, 각종 암의 재발률을 감소시키는 안전하고, 효과적인 방법일 수 있다.

다발성 골수종 (MM)은 형질 세포의 클론 확장을 특징으로 하는 B 세포 악성 종양이다. MM은 미국에서 전체 암의 대략 1%를 차지하며, 혈액암의 10%를 약간 초과하는 비율을 차지한다. 미국에서만 올해 대략 20,000여 건의 신규 사례가 진단받게 될 것이며, 11,000명 초과의 사람이 상기 질환으로 사망하게 될 것이다. MM에 대한 현행 요법은 대개 완화를 유도하지만, 결국에는 거의 모든 환자에서 재발되고, 이들은 사망하게 된다.

CS1은 정상적인 형질 세포 및 MM 세포에서 고도로 및 선택적으로 발현되고, NK 세포 상에서는 더 낮게 발현되며, 정상적인 조직 상에서는 거의 발현되지 않거나, 또는 전혀 발현되지 않는 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 수용체 패밀리의 세포 표면 당단백질이다. MM이 재발된 환자에서 보르테조밉과 함께 제공되는, 인간화 CS1 모노클로날 항체인 엘로투주맙 (HuLuc63)은 환자 중 48%에서 ≥ PR을 일으킨다. CS1는 정상 조직 중 형질 세포로 제한된다는 것과 결부하여 MM 세포 상에서 고도로 발현되므로, CS1는 CAR T 세포 요법을 위해 적당한 표적이 된다 (Hsi et al. 2008 Clin Cancer Res 14:2775).

본원에서는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 기술한다. 세포외 도메인은 CS1-특이적인 scFv 영역 또는 그의 변이체, 및 임의적으로, 예를 들어, 인간 Fc 도메인의 일부를 포함하는 스페이서를 포함한다. 세포외 도메인은 T 세포 표면 상에서 발현될 때 CAR로 하여금 T 세포 활성이 MM의 표면 상에서 발현되는 수용체인 CS1을 발현하는 세포를 향하도록 한다. 막횡단 도메인은 예를 들어, CD4 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 CD3 막횡단 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄 (CD3ζ)로부터의 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 도메인, 예를 들어, 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 세포내 영역 내에 CD3ζ와 함께 연속하여 공동자극 도메인, 예컨대, 4-1BB (CD137) 공동자극 도메인을 포함함에 따라 T 세포는 공동자극 신호를 받을 수 있게 된다. T 세포, 예를 들어, 환자-특이적인, 자가유래성 T 세포는 본원에 기술된 CAR을 발현하도록 조작될 수 있고, 조작된 세포는 확장될 수 있고, ACT에서 사용될 수 있다. 알파 베타 T 세포 및 감마 델타 T 세포, 둘 모두를 포함하는 각종 T 세포 서브세트가 사용될 수 있다. 추가로, CAR은 다른 면역 세포, 예컨대, NK 세포에서 발현될 수 있다. 환자가 본원에 기술된 CAR을 발현하는 면역 세포로 치료받는 경우, 세포는 자가유래성 T 세포 또는 동종이계성 T 세포일 수 있다. 일부 경우에서 세포는 CD62L+, CCR7+, CD45RO+, 및 CD45RA-인, CD4+ 및 CD8+ 중앙 기억 T 세포 (T_CM), 둘 모두를 포함하는 세포 집단이다. 세포 집단은 또한 다른 유형의 T 세포를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 CS1 CAR은 예컨대, 입양 전달 후 항종양 활성 지속 및 증진이라는 특정의 유익한 특징을 가진다.

CS1을 표적화 CAR을 발현하는 T 세포는 암, 예컨대, MM 뿐만 아니라, CS1을 발현하는 다른 암 치료에서 유용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기술된 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 CS1을 발현하는 암을 치료하는 방법을 포함한다.

본원에서는 CS1 scFv (예컨대,

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSSGSTSGGGSGGGSGGGGSSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSYPYTFGQGTKVEIK; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체로부터 선택되는 막횡단 도메인; 공동자극 도메인 (예컨대, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체; 또는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체; 또는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체 및 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체 둘 모두; 및 CD3ζ 신호전달 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체를 포함하는 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 기술한다.

본 개시내용은 또한 본원에 기술된 CAR 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 분자 (예컨대, CAR 중 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터) 및 본원에 기술된 CAR 중 임의의 것을 발현하는 단리된 T 세포이다.

본원에서는 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서 영역; CD28 또는 CD4 막횡단 도메인, CD28 공동자극 도메인 또는 4-IBB 공동자극 도메인, 임의적 GlyGlyGly 링커, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 기술한다.

한 실시양태에서, CS1 CAR은 서열식별번호: 31, 34, 37, 40, 43, 및 46 중 임의의 것의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 그를 포함하거나 (신호 서열이 없는 성숙 CAR), 또는 CS1 CAR은 서열식별번호: 30, 33, 36, 39, 42, 및 45 중 임의의 것의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 그를 포함한다 (GMCSFRa 신호 서열을 가지는 미성숙 CAR). CAR은 신호 서열, 예컨대, 인간 GM-CSF 수용체 알파 신호 서열 (MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP; 서열식별번호: 26)을 포함하는 형태로 발현될 수 있다. CAR은 발현을 모니터링하는 데 유용한 추가 서열, 예를 들어, T2A 스킵 서열 및 말단절단된 EGFRt와 함께 발현될 수 있다. 따라서, CAR은 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있거나, 또는 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. CAR은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 아미노산 변이)를 가지는, 서열식별번호: 29-46중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.

본원에 기술된 CS1 키메라 항원 수용체 (예컨대, 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 아미노산 변이)를 가지는 서열식별번호: 29-46중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 CAR)를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단 또한 개시한다.

다양한 실시양태에서, 인간 T 세포의 집단은 중앙 기억 T 세포 (Tcm), 예컨대, CD8+/CD4+ Tcm이다.

"아미노산 변형"이란, 단백질 또는 펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모체 펩티드 또는 단백질 서열 중의 특정 위치에 있는 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 비보존적인 방식으로 (즉, 특정 크기 또는 특징을 가지는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 또 다른 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변이시킴으로써), 또는 보존적인 방식으로 (즉, 특정 크기 또는 특징을 가지는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 같은 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변이시킴으로써) 치환하여 생성된 단백질 중의 아미노산을 변이시킬 수 있다. 상기 보존적 변이는 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능을 덜 변화시킨다. 하기는 다양한 아미노산 군의 예이다: 1) 비극성 R 기를 가지는 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌; 2) 비하전된 극성 R 기를 가지는 아미노산: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 3) 하전된 극성 R 기를 가지는 아미노산 (pH 6.0 에서 음으로 하전된 것): 아스파르트산, 글루탐산; 4) 염기성 아미노산 (pH 6.0 에서 양으로 하전된 것): 리신, 아르기닌, 히스티딘 (pH 6.0). 또 다른 군은 페닐 기를 가지는 상기 아미노산: 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신일 수 있다.

CS1 ScFv 도메인

CS1 ScFv 도메인은 CS1에 결합하는 임의의 ScFv일 수 있다. 일부 경우에서, CS1 ScFv 도메인은 서열식별번호: 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에서, CS1 scFv는 서열식별번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 변이)를 가진다. ScFv는 인간화 ScFv일 수 있다.

스페이서 영역

본원에 기술된 CAR은 CS1표적화 도메인 (즉, CS1 ScFv 또는 그의 변이체)과 막횡단 도메인 사이에 위치하는 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 각종의 상이한 스페이서가 사용될 수 있다. 그 중 일부는 인간 Fc 영역의 적어도 일부, 예를 들어, 인간 Fc 영역의 힌지 부위 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체를 포함한다. 하기 표 1은 본원에 기술된 CAR에서 사용될 수 있는 다양한 스페이서를 제공한다.

<표 1>

스페이서의 예

일부 스페이서 영역은 면역글로불린 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역 모두 또는 그의 일부를 포함하고, 즉, 면역글로불린의 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치하는 서열, 예컨대, IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 힌지를 포함한다. 일부 스페이서 영역은 면역글로불린 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인 및 CH2 도메인, 둘 모두를 포함한다. 면역글로불린 유래의 서열은 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 예컨대, 오프-타겟 결합을 감소시키는 치환을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 스페이서는 변형되지 않은 힌지에 존재하는 것과 다른 아미노산 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 힌지/링커이다. 하나 이상의 치환된 아미노산 잔기는 제한하는 것은 아니지만, 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339번 위치, 또는 그의 조합의 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 힌지/링커의 변형된 힌지는 하기 아미노산 잔기 치환: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, E333A, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L, 또는 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.

일부 실시양태에서, 변형된 힌지는 서열식별번호: 10 또는 11의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 10 또는 11과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 가지는 인간 IgG4 힌지/CH2/CH3 영역으로부터 유래된 것이다.

특정 실시양태에서, 변형된 힌지는 변형되지 않은 힌지에 존재하는 것과 다른 아미노산 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 IgG4로부터 유래된 것이다. 하나 이상의 치환된 아미노산 잔기는 제한하는 것은 아니지만, 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339번 위치, 또는 그의 조합의 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 변형된 힌지는 하기 아미노산 잔기 치환: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 247I, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 305I, 309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, 또는 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, IgG4로부터 유래된 것으로서, 여기서, 변형되지 않은 힌지 중의 아미노산은 명시된 위치에서 상기 확인된 아미노산으로 치환된 것이다. 한 예에서, 서열은 하기 아미노산 변이 S228P, L235E 및 N297Q를 포함한다.

본원에서 논의되는 면역글로불린 중의 아미노산 위치에 대한 넘버링은 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 체계에 따라 이루어진다 ([Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda] (상기 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다)). EU 인덱스 또는 카바트 (Kabat) 또는 EU 넘버링 체계에서와 같은 EU 인덱스는 EU 항체의 넘버링을 나타낸다 (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).

힌지/링커 영역은 또한 서열 ESKYGPPCPSCP (서열식별번호: 4) 또는 ESKYGPPCPPCP (서열식별번호: 3)를 가지는 IgG4 힌지 영역을 포함할 수 있다.

힌지/링커 영역은 또한 ESKYGPPCPPCP (서열식별번호: 3)에 이어서, 링커 서열 GGGSSGGGSG (서열식별번호: 2)에 이어서, IgG4 CH3 서열 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 12)를 포함할 수 있다. 따라서, 전체 링커/스페이서 영역은 서열: ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열식별번호: 11)를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 스페이서는 서열식별번호: 11과 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 단일 아미노산 변이 (예컨대, 보존적 변이)를 가진다. 일부 경우에서, IgG4 Fc 힌지/링커 영역은 Fc 수용체 (FcR)에의 결합을 감소시키는 방식으로 2개 위치에서 돌연변이화된다 (L235E; N297Q).

막횡단 영역

다양한 막횡단 도메인인 사용될 수 있다. 표 2는 적합한 막횡단 도메인의 예를 포함한다. 스페이서 영역이 존재하는 경우, 막횡단 도메인은 스페이서 영역에 대해 카르복시 말단에 위치한다.

<표 2>

막횡단 도메인의 예

공동자극 도메인

공동자극 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인과의 사용이 적합한 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에서, 공동자극 도메인은

(서열식별번호: 23; LL에서 GG로의 아미노산 변이는 이중 밑줄로 표시)와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 포함하는 CD28 공동자극 도메인이다. 일부 경우에서, CD28 공동-신호전달 도메인은 서열식별번호: 23과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 변이, 및 바람직하게, 밑줄로 표시된 GG 서열에 존재하지 않는 것)를 가진다. 일부 경우에서, 공동-신호전달 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열식별번호: 24)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 포함하는 4-1BB 공동-신호전달 도메인이다. 일부 경우에서, 4-1BB 공동-신호전달 도메인은 서열식별번호: 24와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 변이)를 가진다.

공동자극 도메인(들)은 막횡단 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치한다. 표 3은 CD3ζ 신호전달 도메인의 서열과 함께 적합한 공동자극 도메인의 예를 포함한다.

<표 3>

CD3ζ 도메인 및 공동자극 도메인의 예

다양한 실시양태에서: 공동자극 도메인은 표 3에 제시된 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체, 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형을 가지는 그의 변이체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동자극 도메인, 예를 들어, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체 및 4-1BB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형 (예컨대, 치환)을 가지는 그의 변이체가 존재한다. 다양한 실시양태에서, 1-5개의 (예컨대, 1 또는 2개의) 아미노산 변형은 치환이다. 공동자극 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인에 대해 아미노 말단에 있고, 일부 경우에서, 2 - 10개, 예컨대, 3개의 아미노산 (예컨대, GGG)으로 이루어진 짧은 링커가 공동자극 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치한다.

CD3ζ 신호전달 도메인

CD3ζ 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인과의 사용이 적합한 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에서, CD3ζ 신호전달 도메인은 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열식별번호: 21)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 포함한다. 일부 경우에서, CD3ζ 신호전달은 서열식별번호: 21과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 변이)를 가진다.

말단절단된 EGFR

CD3ζ 신호전달 도메인 다음으로 리보솜 스킵 서열 (예컨대, LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR; 서열식별번호: 27), 및 LVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM (서열식별번호: 28)적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 가지는 말단절단된 EGFR이 이어질 수 있다. 일부 경우에서, 말단절단된 EGFR은 서열식별번호: 28과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변이 (바람직하게 보존적 변이)를 가진다.

CS1 CAR

CS1 CAR은 도 2, 도 6, 도 7, 도 8. 도 9 또는 도 10에 도시된 아미노산 서열 (서열식별번호: 29-46; GMCSFRa 신호 서열을 포함하거나, 배제, 및 T2A 리보솜 스킵 서열 및 말단절단된 EGFRt를 포함하거나, 배제)과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 동일 또는 그와 동일한 서열을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 CS1을 표적화하는 CAR 중에는 각 CAR에 대한 스페이서 영역, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인(들)이 명시되어 있는 것인, 표 4에 요약되어 있는 CAR이 있다.

<표 4>

CS1을 표적화하는 CAR의 예

*SEQ ID NO: GMCSFRa 신호 서열, T2A 및 EGFRt를 포함하는 것으로 도시된 전체 서열//GMCSFRa 신호 서열은 포함하나, T2A 및 EGFRt는 배제된 서열//GMCSFRa 신호 서열, T2A 및 EGFRt가 배제된 서열에 대한 서열.

도 1은 CS1 CAR 발현 렌티바이러스 벡터 (CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28gg-제타(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7)를 개략적으로 도시한 개략도이다. CS1 CAR 구축물은 GMCSF 신호 서열, CS1 scFv, IgG4 힌지 영역, 링커, CH3 도메인, CD28 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. CAR 구축물 다음으로 T2A 리보솜 스킵 서열, 이어서, 자살 유전자 EGFRt 코딩 서열이 이어진다. CAR 및 EGFRt 분자는 단일 전사체로부터 발현된다.
도 2는 신호 펩티드, 리보솜 스킵 서열 및 EGFRt를 포함하는 CS1 CAR의 아미노산 서열 (서열식별번호: 29)을 도시한 것이다.
도 3은 CS1 CAR 재지정된 Tcm이 MM 세포에 대하여 세포독성을 나타냈다는 것을 보여주는 연구 결과를 도시한 그래프 쌍이다. 51Cr-표지된 표적 세포와 공동 배양한 후, 증식된 CS1 CAR T 세포의 세포독성을 4-시간 51Cr 방출 검정법을 사용하여 평가하였다. LCL을 발현하는 OKT3은 모든 TCR을 인게이징(engage)하는 바, 이에 양성 대조군으로서 사용하였고, CS1-음성 AML 세포 (KG1a)는 음성 대조군으로서 사용하였다. 조작되지 않은 모의 T 세포가 아닌, CS1 CAR T 세포는 MM 세포에 대하여 특이적인 세포독성을 나타내었다.
도 4는 CS1 CAR 재지정된 Tcm 세포가 MM 세포의 자극에 대한 반응으로 이펙터 기능을 나타내었다는 것을 보여주는 연구 결과를 도시한 것이다. CS1 CAR T 세포 (10⁵)를 자극인자로서 10⁵개의 MM.1S와 함께 96-웰 조직 배양 플레이트 중에서 6시간 동안 공동 배양하였다. 107a 탈과립화 및 세포내 IFN감마 생산을 유세포 분석법으로 분석하였다. 얼비툭스(Erbitux)에 의해 확인된 대다수의 CAR T 세포는 MM 세포와의 인게이징 이후에 탈과립화를 유도하였고, 항원 자극에 대한 반응으로 IFN감마 양성 세포가 검출되었다.
도 5는 CS1 CAR 재지정된 Tcm 세포가 생체내에서 다발성 골수종를 근절시킨다는 것을 보여주는 연구 결과를 도시한 것이다. 대략 2x10⁶개의 반딧불이 루시페라제 발현 MM.1S 세포를 경골내 주사에 의해 NSG 마우스 내로 접종하였다. 종양 접종 후 7일이 경과하였을 때, 1x10⁶개의 CS-1 CAR T 세포를 정맥내 주사에 의해 종양을 보유하는 마우스에 주입하였다. 제노겐(Xenogen)® 영상화를 이용하여 종양 부담을 주 1회에 걸쳐 모니터링하였다. 조작되지 않은 세포를 받은 마우스가 대조군으로서 사용되었다. CS1 CAR T 세포는 T 세포 주입 후 제14일에 MM 종양을 완전히 근절시킨 반면, 조작되지 않은 T 세포는 종양 억제에 대하여 어떤 영향도 미치지 않았다.
도 6은 CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 32)을 도시한 것이다.
도 7은 CS1scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 35)을 도시한 것이다.
도 8은 CS1scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 38)을 도시한 것이다.
도 9는 CS1scFv-링커-CD4tm-41BB-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 41)을 도시한 것이다.
도 10은 CS1scFv-링커-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 아미노산 서열 (서열식별번호: 44)을 도시한 것이다.
도 11은 CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28gg-제타-T2A-EGFRt_epHIV7의 완전한 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 47)이다.
도 12는 CS1 CAR 재지정된 Tcm 세포가 생체내에서 다발성 골수종을 근절시킨다는 것을 보여주는 연구 결과를 도시한 것이다. 제-7일에 2x10⁶개의 GFPffluc+ MM.1S 세포를 경골내 주사를 통해 NSG 마우스 내로 접종하였다. 제0일에, 1x10⁶개의 중앙 기억 T 세포 (Tcm) 유래의 CS1 CAR+ T 세포를 정맥내로 종양을 보유하는 마우스 내에 주입하였다. 어떤 T 세포도 받지 못하였거나, 또는 같은 공여자로부터의 Tcm이 형질도입되지 않은 마우스가 음성 대조군으로서 사용되었다. 생체광자 영상화에 의해 종양 신호를 모니터링하였다. 여러 마우스로부터의 광자/sec의 평균±SEM이 제시되어 있다. CAR은 도 2 (CH2 CD28); 도 6 (CH2 4IBB); 도 8 (EQ CD28); 도 7 (EQ 4IBB); 도 10 (L CD28) 및 도 9 (L CD4 IBB)의 것이었다.

여러 CS1-특이적인 키메라 항원 수용체 ("CAR")의 구조, 구축, 및 특징 규명에 대해 하기에 기술한다. CAR은 세포외 인식 도메인, 막횡단 영역, 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 재조합 생체분자이다. 그러므로, "항원"이라는 용어는 항체에 결합하는 분자가 아닌, 임의의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자로 제한된다. 따라서, "항원"은 CAR의 인식 도메인을 지칭한다. 세포외 인식 도메인 (이는 또한 세포외 도메인으로, 또는 간단하게는 그를 함유하는 인식 요소로 지칭된다)은 표적 세포의 세포 표면 상에 존재하는 분자에 특이적으로 결합하는 인식 요소를 포함한다. 막횡단 영역은 막에서 CAR을 고정시킨다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄로부터의 신호전달 도메인을 포함하고, 임의적으로 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. CAR은 MHC 제한과 관계 없이, 항원에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, T 세포 활성화를 형질도입할 수 있다. 따라서, CAR은 그의 HLA 유전자형과는 상관 없이 항원-양성 종양을 앓는 환자의 집단을 치료할 수 있는 "범용" 면역수용체이다. 종양-특이적인 CAR을 발현하는 T 림프구를 이용하는 입양 면역요법은 암 치료용으로서 매우 효과적인 치료학적 전략법이 될 수 있다.

일부 경우에서, CS1 CAR은, CAR 오픈 리딩 프레임 다음으로 T2A 리보솜 스킵 서열 및 말단절단된 EGFR (EGFRt)이 이어지는 벡터를 사용하여 제조될 수 있으며, 이는 세포질 신호전달 테일은 포함하지 않는다. 상기 배열에서, EGFRt의 공동 발현으로 불활성, 비-면역원성 표면 마커가 수득되며, 이를 통해 유전자 변형된 세포를 정확하게 측정할 수 있고, 유전자 변형된 세포의 양성 선별 뿐만 아니라, 입양 전달 후 생체내에서의 치료학적 T 세포의 효율적인 세포 추적도 가능해질 수 있다. 시토카인 폭풍 및 오프-타겟 독성을 피하기 위해 증식을 효율적으로 제어하는 것이 T 세포 면역요법의 성공을 위해 뛰어넘어야 할 중요한 장애물이다. CS1CAR 렌티바이러스 벡터 내에 도입된 EGFRt는 치료와 관련하여 독성이 있는 경우, CAR+ T 세포를 제거하는 자살 유전자로서 작용할 수 있다.

본원에 기술된 CAR은 비록 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조되는 것이 바람직하기는 하지만, 관련 기술분야에 공지된 임의 수단에 의해 제조될 수 있다. 키메라 수용체의 여러 영역을 코딩하는 핵산은 편리하게는 관련 기술분야에 공지된 표준 분자 클로닝 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, 중복 PCR, 프라이머 지원 라이게이션, 부위 지정 돌연변이유발법 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 제조 및 어셈블리될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 바람직하게 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 세포주, 바람직하게, T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게, 자가유래성 T 림프구 세포주를 형질전환시키는 데 사용된다.

환자로부터 단리된 다양한 T 세포 서브세트가 CAR 발현을 위해 벡터로 형질도입될 수 있다. 중앙 기억 T 세포는 하나의 유용한 T 세포 서브세트이다. 중앙 기억 T 세포는 예를 들어, 원하는 수용체를 발현하는 세포를 면역자기 방식으로 선별하는 클리니MACS(CliniMACS)® 장치를 사용하여 CD45RO+/CD62L+ 세포에 대한 선별에 의해서 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)로부터 단리될 수 있다. 중앙 기억 T 세포에 대하여 강화된 세포는 항-CD3/CD28로 활성화될 수 있고, 예를 들어, 생체내 검출, 제거 및 잠재적인 생체외 선별을 위하여, CS1 CAR 뿐만 아니라, 비-면역원성 표면 마커의 발현을 지시하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 활성화된/유전적으로 변형된 CS1 중앙 기억 T 세포는 시험관내에서 IL2/IL-15와 함께 확장될 수 있고, 이어서, 동결보존될 수 있다.

실시예 1: CS1 -특이적인 CAR의 발현을 위해 사용된 epHIV7의 구축 및 구조

pHIV7 플라스미드는 CS1 CAR을 발현하는 임상적 벡터의 유래 기점이 될 수 있는 모체 플라스미드이다. CAR 발현을 위해 사용된 epHIV7 벡터를 pHIV7 벡터로부터 제조하였다 (Wang et al. 2011 Blood 118:1255). 상기 벡터는 CAR 발현을 구동시키기 위하여 인간 EF1 프로모터를 사용한다는 점이 중요하다. 벡터 5' 및 3' 서열, 둘 모두, 앞서 HXBc2 프로바이러스로부터 유래된 바와 같이, pv653RSN으로부터 유래되었다. 폴리퓨린 트랙 DNA 플랩 서열 (cPPT)은 NIH AIDS 리에이전트 리포지토리(NIH AIDS Reagent Repository)로부터 입수한 HIV-1 균주 pNL4-3으로부터 유래되었다.

하기와 같이 pHIV7을 구축하였다. 간략하면, 개재 SL3-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (Neo)와 함께 gag-pol + 5' 및 3' 긴 말단 반복부 (LTR)로부터의 653 bp를 함유하는 pv653RSN을 하기와 같이 p블루스크립트(pBluescript)로 서브클로닝하였다: 단계 1에서, 5' LTR부터 rev-반응성 요소 (RRE)까지의 서열이 p5'HIV-1 51을 제조하였고, 이어서, TATA 박스의 상류쪽 서열을 제거하여 5' LTR을 변형시키고, 먼저 CMV 인핸서에, 이어서, SV40 복제 기점에 라이게이션시켰다 (p5'HIV-2). 단계 2에서, 3' LTR을 p블루스크립트로 클로닝하여 p3'HIV-1을 제조한 후, 3' LTR 인핸서/프로모터에서 400-bp를 결실시켜 HIV U3 중 시스-조절 요소를 제거하고, p3'HIV-2를 형성하였다. 단계 3에서, p5'HIV-3 및 p3'HIV-2로부터 단리된 단편을 라이게이션시켜 pHIV-3을 제조하였다. 단계 4에서, 추가의 상류 HIV 서열을 제거하여 p3'HIV-2를 추가로 변형시킴으로써 p3'HIV-3을 생성하고, WPRE를 함유하는 600-bp BamHI-SalI 단편을 p3'HIV-3에 부가하여 p3'HIV-4를 제조하였다. 단계 5에서, PCR에 의해 pHIV-3 RRE의 크기를 축소시키고, pHIV-3으로부터의 5' 단편에 (제시되지 않음), 및 p3'HIV-4에 라이게이션시켜 pHIV-6을 제조하였다. 단계 6에서, HIV-1 pNL4-3 (55)으로부터의 cPPT DNA 플랩 서열을 함유하는 190-bp BglII-BamHI 단편을 pNL4-3으로부터 증폭시키고, pHIV6 중 RRE와 WPRE 서열 사이에 배치하여 pHIV-7을 제조하였다. 상기 모체 플라스미드 pHIV7-GFP (GFP, 녹색 형광 단백질)를 사용하여 4개의 플라스미드 시스템을 이용함으로써 모체 벡터를 패키징하였다.

패키징 신호인 프사이 ψ는 바이러스 게놈의 벡터 내로의 효율적인 패키징을 위해 요구된다. RRE 및 WPRE는 RNA 전사체 수송 및 트랜스진의 발현을 증진시킨다. WPRE와 함께 조합하여 플랩 서열은 표유동물 세포에서 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증진시키는 것으로 입증되었다.

바이러스 벡터를 제조하는 데 필요한 헬퍼 기능은 재조합을 통한 복제 능력이 있는 렌티바이러스의 생성 가능성을 감소시키기 위해 3가지 다른 별개의 플라스미드로 분류된다: 1) pCgp는 바이러스 벡터 어셈블리에 필요한 gag/pol 단백질을 코딩하고; 2) pCMV-Rev2는, RRE 서열에 작용하여 효율적인 패키징을 위해 바이러스 게놈의 수송을 지원하는 것인 Rev 단백질을 코딩하고; 3) pCMV-G는, 바이러스 벡터의 감염성에 요구되는 것인 수포성 구내염 바이러스 (VSV)의 당단백질을 코딩한다.

pHIV7 코딩 벡터 게놈과 헬퍼 플라스미드 사이에는 최소의 DNA 서열 상동성이 존재한다. 상동성인 영역은 pCgp 헬퍼 플라스미드의 gag/pol 서열에 위치하는, 대략 600개의 뉴클레오티드로 이루어진 패키징 신호 영역; 3개의 헬퍼 플라스미드 모두의 CMV 프로모터 서열; 및 헬퍼 플라스미드 pCgp 중의 RRE 서열을 포함한다. 상기 영역에서의 상동성에 기인하여 복제 능력이 있는 재조합 바이러스가 생성될 수 있는 개연성은 매우 낮은데, 그 이유는 상기 재조합 바이러스는 다중 재조합 이벤트를 필요로 하기 때문이다. 추가로, 임의의 생성된 재조합체는 렌티바이러스 복제에 필요한 기능성 LTR 및 tat 서열을 손실하게 될 것이다.

CMV 프로모터를 EF1α-HTLV 프로모터 (EF1p)로 대체하였고, 신규 플라스미드를 epHIV7로 명명하였다. EF1p는 563 bp를 가지며, CMV 프로모터를 잘라낸 후, NruI 및 NheI를 사용하여 상기 EF1p를 epHIV7 내로 도입하였다.

야생형 바이러스의 병원성에 필요하고, 표적 세포의 증식성 감염에 요구되는 gag/pol 및 rev가 배제된 렌티바이러스 게놈을 상기 시스템으로부터 제거하였다. 추가로, epHIV7 벡터 구축물은 무손상 3'LTR 프로모터를 함유하지 않는 바, 이에 표적화된 세포에서 생성된 발현된 및 역전사된 DNA 프로바이러스 게놈은 불활성 LTR을 가지게 될 것이다. 상기 디자인의 결과로서, 어떤 HIV-I 유래 서열도 프로바이러스로부터 전사되지 않을 것이며, 오직 치료학적 서열만이 각 프로모터로부터 발현될 것이다. SIN 벡터에서 LTR 프로모터 활성 제거가 숙주 유전자의 비의도성 활성화 가능성을 현저히 감소시킬 것으로 예상된다. 표 5에는 epHIV7에 존재하는 다양한 조절인자 요소가 요약되어 있다.

도 1 은 CS1 scFv, IgG4 힌지 영역, 링커 , CD28 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인으로 구성된 CAR 구축물을 함유하는 렌티바이러스 벡터인, CS1 CAR (CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28gg-제타(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7)을 개략적으로 도시한 개략도이다. CAR 구축물 다음으로 T2A 리보솜 스킵 서열, 이어서, 자살 유전자 EGFRt 코딩 서열이 이어진다. CAR 및 EGFRt 분자는 단일 전사체로부터 발현된다. 벡터의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 11에 제시되어 있고, 표 5에는 벡터의 다양한 요소의 위치를 제시되어 있다.

<표 5>

실시예 2: 환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터 제조

각 플라스미드 (CS1 CAR_epHIV7; pCgp; pCMV-G; 및 pCMV-Rev2)를 위해, 충분한 양의 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 발효조에 접종하는 데 사용되는 시드 뱅크를 생성한다. 플라스미드 DNA를, 렌티바이러스 벡터를 제조하는 데 그를 사용하기 이전에 아이덴티티, 멸균성 및 내독소에 대하여 시험한다.

간략하면, 시험을 통해 멸균성 및 바이러스 오염 부재에 대하여 확인이 된 293T 작업용 세포 (WCB)로부터 세포를 확장시킨다. 293T WCB로부터의 293T 세포의 바이알을 해동시킨다. 충분한 개수의 세포가 존재할 때까지 세포를 성장시키고, 확장시켜 벡터 제조 및 세포 트레인 유지를 위해 적절한 개수의 10층 세포 공장 (CF)을 플레이팅한다. 제조에는 세포의 단일 트레인이 사용될 수 있다.

렌티바이러스 벡터를 최대 10 CF의 서브배치에서 제조하였다. 2개의 서브배치를 같은 주에 제조하여 대략 20 L의 렌티바이러스 상청액/주로 제조할 수 있다. 한 로트의 생성물을 제조하기 위해 하류 프로세싱 단계 동안 모든 서브배치로부터 제조된 물질을 풀링하였다. 293T 세포를 293T 배지 (10% FBS를 포함하는 DMEM) 중 CF에서 플레이팅하였다. 공장을 37℃ 인큐베이터에 배치하고, CF의 모든 층 상에 있는 세포가 고르게 분포될 수 있도록 하기 위해 수평으로 평평하게 만들었다. 2일 경과 후, CaPO4 방법을 사용하여 트리스(Tris):EDTA, 2 M CaCl2, 2X HBS, 및 4개의 DNA 플라스미드의 혼합물을 포함하는, 상기 기술된 4개의 렌티바이러스 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 제3일에, 분비된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 수집하고, 정제시키고, 농축시켰다. CF로부터 상청액을 제거한 후, 각 CF로부터 생산 종료 세포를 수집하였다. 세포를 각 공장으로부터 트립신 처리하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 냉동 배지 중에 재현탁시키고, 동결보존하였다. 상기 세포를 추후에 복제 능력이 있는 렌티바이러스 (RCL) 검사에 사용하였다.

벡터를 정제하고, 제제화하기 위해, 막 여과에 의해 조 상청액을 정화시켜 세포 파편을 제거하였다. 숙주 세포 DNA 및 잔류 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 분해 (벤조나제(Benzonase)®)에 의해 분해하였다. 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 세포 파편으로부터 바이러스 상청액을 정화시켰다. 안에 벤조나제®가 첨가되어 있는 (최종 농도 50 U/mL) 미리 측량되어 있는 용기 내로 정화된 상청액을 수집하였다. 잔류 플라스미드 DNA 및 숙주 게놈 DNA 에 대한 엔도뉴클레아제 분해를 37℃에서 6 h 동안 수행하였다. 엔도뉴클레아제로 처리된 상청액의 초기 접선 유동 한외여과 (TFF) 농축을 사용하여 조 상청액으로부터 잔류 저분자량 성분을 제거하면서, 동시에 바이러스를 ~20배로 농축시켰다. 정화된 엔도뉴클레아제로 처리된 바이러스 상청액을, 동시에 플럭스 속도를 최대화 시키면서, ~4,000 sec-1 이하의 전단 속도를 유지시키도록 디자인된 유량으로 500 kD NMWCO와 함께 중공사 카트리지를 통해 순환시켰다. 카트리지 성능을 지속시키기 위해 농축 프로세스 동안 뉴클레아제로 처리된 상청액의 투석 여과를 개시하였다. 투석 여과 완충제로서 PBS 중 4% 락토스를 사용하여 80%의 투과물 교체율을 확립하였다. 바이러스 상청액을, 조 상청액의 20배 농도를 나타내는 표적 부피로 만들었고, 4회 추가의 교환 부피를 위해 투석 여과를 계속 수행하였고, 여기서, 투과물 교체율은 100%가 되었다.

고속 원심분리 기술을 사용하여 바이러스 생성물을 추가로 농축시켰다. 6℃ 에서 16-20 h 동안 6,000 RPM (6,088 RCF)으로 소르발(Sorvall) RC-26 + 원심분리기를 사용하여 렌티바이러스의 각 서브배치를 펠릿화하였다. 이어서, 각 서브배치로부터의 바이러스 펠릿을 PBS 중 4% 락토스와 함께 50 mL 부피로 재구성하였다. 상기 완충제 중 재구성된 펠릿은 바이러스 제조를 위한 최종 제제를 나타낸다. 전체 벡터 농축 프로세스를 통해 부피가 대략 200배 감소되었다. 모든 서브배치의 완료 후, 이어서, 물질을 -80℃에 놓고, 동시에 각 서브배치로부터의 샘플을 멸균성에 대하여 시험하였다. 샘플 멸균성을 확인한 후, 빈번하게 교반시키면서, 서브배치를 37℃에서 신속하게 해동시켰다. 이어서, 물질을 풀링하고, 바이러스 벡터 스위트 중의 클래스 II 타입(Class II Type) A/B3 생물안전 작업대에서 수동으로 분취하였다. O-링 냉동바이알이 외부 장착된, 멸균 USP 부류 6 중 1 mL의 농축된 렌티바이러스의 필 컨피규레이션이 사용되었다. COH의 응용 기술 개발 센터 (Center for Applied Technology Development: CATD)의 품질 관리 시스템(Quality Systems: QS)은 CBG를 위한 정책 및 표준 운영 절차(Policies and Standard Operating Procedures for the CBG)에 따라, 및 현행 우수 제조 관리 기준 (current Good Manufacturing Practices: cGMPs)을 준수하여 모든 물질을 출시하였다.

렌티바이러스 벡터 제제의 순도를 확인하기 위해, 잔류 숙주 DNA 오염물질, 및 잔류 숙주 및 플라스미드 DNA의 전달에 대해 시험한다. 다른 시험들 중에서도, RT-PCR에 의해 벡터 아이덴티티를 평가하여 올바른 벡터가 존재하는지 확인한다. 본 연구에서 사용하기 위한 것으로 의도된 벡터는 모든 출시 기준을 충족시킨다.

실시예 3: ACT에서 사용하는 데 적합한 Tcm 세포 제조

백혈구 성분 채집술에 의해 환자로부터 T 림프구를 수득하고, 적절한 동종이계성 또는 자가유래성 T 세포 서브세트, 예를 들어, 중앙 기억 T 세포 (Tcm)를 CAR을 발현하도록 유전적으로 변경시킨 후, 이를 다시 임의의 임상적으로 허용되는 수단에 의해 환자에게 투여하여 항암 요법을 달성한다.

CD8+인 Tcm을 본질적으로 문헌 [Wang et al. (J Immunology 35:689, 2012)]에 기술되어 있는 바와 같이 단리시킨다. 간략하면, 백혈구 성분 채집술 수행 당일, 피콜-플라크(Ficoll-Paque) 상에서 밀도 구배 원심분리한 후, PBS/EDTA 중에서 2회 세척하여 PBMC를 단리시켰다. 이어서, PBMC를 PBS 중에서 1회 세척하고, 10% 우태아 혈청 (FCS)을 함유하는 X 비보15(X Vivo15) 배지 중에 재현탁시키고, 300 cc 전달 백으로 옮겨 놓고, 3-D 로레이터 상에서 실온 (RT)하에 밤새도록 보관하였다. 다음 날, 최대 5x10⁹개의 PBMC를 임상 등급의 항-CD4 (2.5 mL), 항-CD14 (1.25 mL), 및 항-CD45RA (2.5 mL) 마이크로비드 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec))와 함께 300 cc 전달 백에서 10% FCS를 함유하는 X 비보15 중에서 RT하에 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, CD4+, CD14+ 및 CD45RA+ 세포를 즉시 제조사의 설명서 (밀테니이 바이오테크)에 따라 클리니MACS™ 고갈 모드로 고갈시켰다. 원심분리 후, 표지되지 않은 음성 세포 분획을 0.5% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 클리니MACS™ PBS/EDTA 완충제 (밀테니이 바이오테크) 중에 재현탁시킨 후, RT에서 30분 동안 0.1 mg/10⁶개의 세포로 임상 등급의 비오티닐화된-DREG56 mAb (COHNMC CBG)를 이용하여 표지하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 0.5% HSA를 함유하는 클리니MACS™ PBS/EDTA 최종 부피 100 mL 중에 재현탁시키고, 새 300 cc 전달 백으로 옮겨 놓았다. 1.25 mL 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니이 바이오테크)와 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBMC의 CD62L+ 분획 (CD8+ TCM)을 제조사의 설명서에 따라 클리니MACS™ 상에서의 양성 선별을 이용하여 정제시키고, 10% FCS를 함유하는 X 비보15 중에 재현탁시켰다.

CD4+, CD14+ 및 CD45RA+ 선별을 CD14+ 및 CD45RA+ 선별로 변형시켜 상기 프로세스의 변형법을 이용함으로써 CD8+/CD4+인 Tcm을 제조한다. 본 방법은 먼저 CD14+ 및 CD45RA+ 세포를 고갈시킨 후, 이어서, CD62L+ 세포를 양성 선별하기 위해 클리니MACS™ 장치 상에서 2 단계 프로세스를 이용한다. 상기 변형된 플랫폼은 단일 백혈구 성분 채집술로부터 50x10⁶개의 벌크 Tcm을 생성한다.

강화시킨 후, Tcm 세포를 완전 X-비보 15 + 50 IU/mL IL-2 및 0.5 ng/mL IL-15 중에서 제제화하고, 테플론(Teflon) 세포 배양 백으로 옮겨 놓고, 여기서, 세포는 다이날 클린EX™ 비보(Dynal ClinEx™ Vivo) CD3/CD28 비드로 자극을 받게 된다. 자극 후 최대 5일 경과 후, CS1 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다중 감염도 (MOI) 약 3으로 세포에 형질도입시킨다. 세포 확장을 위해 필요에 따라 완전 X-비보 15 및 IL-2 및 IL-15 시토카인을 첨가하면서, 최대 42일 동안 배양을 유지시킨다 (세포 밀도를 3x10⁵ 내지 2x10⁶개의 생존가능한 세포/mL로 유지, 및 배양하는 동안 매주 월요일, 수요일, 및 금요일마다 시토카인 보충). 세포는 전형적으로 21일 이내에 상기 조건하에서 대략 10⁹개의 세포로 확장된다. 배양기 종료 시점에 세포를 수거하고, 2회에 걸쳐 세척하고, 임상 등급의 동결보존 배지 중에서 제제화한다.

T 세포 주입 당일(들), 동결보존되고, 출시된 생성물을 재주입을 위해 해동시키고, 세척하고, 제제화한다. 출시된 세포 생성물을 함유하는 동결보존된 바이알을 액체 질소 보관으로부터 이동시키고, 해동시키고, 냉동시키고, PBS/2% 인간 혈청 알부민 (HSA) 세척 완충제로 세척한다. 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 세포를 보존제 무함유 생리 식염수 (PFNS)/2% HSA 주입 희석제 중에 재현탁시킨다. 샘플을 품질 관리 검사를 위해 이동시킨다.

실시예 4: CS1 CAR ( CS1scFv - IgG4 ( HL -CH3)- CD28tm - CD28gg -제타- T2A - EGFRt )의 아미노산 서열

CS1scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm- CD28gg-제타-T2A-EGFRt의 완전한 아미노산 서열이 도 2에 도시되어 있다. 전체 서열 (서열식별번호: 29)은 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 26), CS1 scFv 서열 (서열식별번호: 1); IgG4 힌지 서열 (서열식별번호: 3; S에서 P로의 아미노산 치환은 음영 표시되어 있다); 10개의 아미노산 링커 (서열식별번호: 2); IgG4 CH3 서열 (서열식별번호: 12); 28개의 아미노산 CD28 막횡단 도메인 서열 (서열식별번호: 14); CD28gg 공동자극 도메인 서열 (서열식별번호: 23; LL에서 GG로의 아미노산 변이는 강조 표시되어 있다); 3개의 아미노산 Gly 링커; 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 21); 24개의 아미노산 T2A 스킵 서열 (서열식별번호: 27); 및 EGFRt 서열 (서열식별번호: 28)을 포함한다.

실시예 5: CS1 CAR의 활성

51Cr-표지된 MM 세포 (MM.1S)와 공동 배양한 후, 도 2에 제시된 CAR을 발현하는 증식된 CS1 CAR T 세포의 세포독성을 4-시간 51Cr 방출 검정법을 사용하여 평가하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, 조작된 CS1 CAR T 세포는 특이적이고, 효율적인 MM 세포 사멸을 보인 반면, 조작되지 않은 모의 T 세포는 MM 세포에 대해 어떤 세포독성도 보이지 않는다. MM 세포와 함께 공동 배양하였을 때, 도 4에 제시된 바와 같이, 조작된 CS1 CAR Tcm-매개의 강력한 이펙터 기능이 107a 탈과립화 및 IFN감마로 나타난다. MM 종양을 보유하는 NSG 마우스 내로 입양 전달하였을 때, CS1 특이적인 T 세포는 도 5에 제시된 바와 같이 효율적인 항종양 활성을 나타내었다.

추가의 CS1 CAR을 이용한 또 다른 연구에서 (도 2 및 도 6-10), 제-7일에 2x10⁶개의 GFPffluc+ MM.1S 세포를 경골내 주사를 통해 NSG 마우스 내로 접종하였다. 제0일에, 1x10⁶개의 중앙 기억 T 세포 (Tcm) 유래의 CS1 CAR+ T 세포를 정맥내로 종양을 보유하는 마우스 내에 주입하였다. 어떤 T 세포도 받지 못하였거나, 또는 같은 공여자로부터의 Tcm이 형질도입되지 않은 마우스가 음성 대조군으로서 사용되었다. 생체광자 영상화에 의해 종양 신호를 모니터링하였다. 여러 마우스로부터의 광자/sec의 평균±SEM이 제시되어 있다. 본 분석의 결과는 도 12에 제시되어 있다.

Claims

CS1 scFv; 임의적 스페이서 영역; 막횡단 도메인; 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 공동-신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치하는 1 내지 15개의 아미노산의 링커 서열을 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 공동-신호전달 도메인이 CD28 공동-신호전달 도메인 및 4-IBB 공동-신호전달 도메인으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인 및 CD4 막횡단 도메인으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, CS1 scFv가 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제2항에 있어서, 링커 서열이 3-10개의 연속적인 Gly를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 IgG 불변 영역 또는 힌지 영역의 적어도 10개의 인접하는 아미노산을 포함하는 것인 핵산 분자.
제7항에 있어서, IgG가 IgG4인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 IgG4 CD3 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 IgG4 Fc 도메인 또는 그의 변이체를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 4-12개의 아미노산을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 서열 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSG 및 서열 GGGSSGGGSG로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 a) IgG4 Fc 도메인; b) IgG4 힌지 영역, 링커 서열, 및 IgG4 CH3 도메인; 및 c) 링커 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 서열식별번호: 2-12 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 스페이서 영역으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, IgG4 Fc 힌지 영역이 서열식별번호: 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제3항에 있어서, CD28 공동-신호전달 도메인이 서열식별번호: 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제3항에 있어서, 4-1BB 공동-신호전달 도메인이 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, CD3ζ 신호전달 도메인이 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, CD28 막횡단 도메인이 서열식별번호: 14 또는 15를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, CD4 막횡단 도메인이 서열식별번호: 16을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, CD3ζ 신호전달 도메인이 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CD28 공동-신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치하는 링커 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제23항에 있어서, 링커 아미노산 서열이 GlyGlyGly인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서가 IgG4 힌지 영역, 링커 서열 및 IgG4 CH3 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, IgG4 힌지 영역이 서열식별번호: 6을 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 7을 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, IgG4 CH3 도메인이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, 링커 영역이 서열식별번호: 25를 포함하는 것인 핵산 분자.
제22항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 1과 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열이 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열 바로 뒤에 있는 것인 핵산 분자.
제32항에 있어서, 신호 서열이 서열식별번호: 4를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 힌지/링커 영역; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제34항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 4-1BB 공동-신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치하는 링커 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제35항에 있어서, 링커 아미노산 서열이 GlyGlyGly인 핵산 분자.
제34항에 있어서, 힌지/링커 영역이 IgG4 힌지 영역, 링커 서열 및 IgG4 CH3 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제34항에 있어서, IgG4 힌지 영역이 서열식별번호: 3 또는 4를 포함하는 것인 핵산 분자.
제34항에 있어서, 스페이서 서열이 서열식별번호: 2를 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서가 서열식별번호: 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 스페이서 영역이 서열식별번호: 2-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제34항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 29-46 중 임의의 것과 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열이 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열 바로 뒤에 있는 것인 핵산 분자.
제44항에 있어서, 신호 서열이 서열식별번호: 26을 포함하는 것인 핵산 분자.
제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
제46항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 4-1BB 공동-신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치하는 링커 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제47항에 있어서, 링커 아미노산 서열이 GlyGlyGly인 핵산 분자.
제46항에 있어서, 힌지/링커 영역이 IgG4 힌지-CH2-CH3 영역을 포함하는 것인 핵산 분자.
제46항에 있어서, IgG4 힌지-CH2-CH3 영역이 서열식별번호: __를 포함하는 것인 핵산 분자.
제46항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: __의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제46항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: __와 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제46항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열이 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열 바로 뒤에 있는 것인 핵산 분자.
제53항에 있어서, 신호 서열이 서열식별번호: 26을 포함하는 것인 핵산 분자.
CS1 scFv; 임의적 스페이서 영역; 막횡단 도메인; 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 및 45로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 각각은 5개 초과의 아미노산 치환을 가지는 것인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포 중 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%가 중앙 기억 T 세포인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 형질도입된 중앙 기억 T 세포 중 적어도 10% 또는 20%가 CD4+인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 형질도입된 중앙 기억 T 세포 중 적어도 10% 또는 20%가 CD8+인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 형질도입된 중앙 기억 T 세포 중 적어도 10%가 CD4+이고, 적어도 10%가 CD8+인 인간 T 세포의 집단.
제55항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포 중 적어도 80%가 CD4+ 또는 CD8+ 및 CD62L+인 인간 T 세포의 집단.
암 치료를 필요로 하는 환자에게 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항의 인간 T 세포를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제70항에 있어서, 인간 T 세포의 집단이 환자에게 자가유래성인 것인 방법.
제70항에 있어서, 인간 T 세포의 집단이 환자에게 동종이계성인 것인 방법.
제70항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포가, T 세포를 환자로부터 수득하거나, 또는 환자에게 동종이계성인 T 세포를 수득하는 단계, 수득된 T 세포를 처리하여 CD4+/CD8+ 중앙 기억 T 세포가 강화된 세포 집단을 단리시키는 단계, 및 단리된 세포 집단의 적어도 일부에 CS1 scFv; 스페이서; 막횡단 도메인; 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 스페이서; CD 28 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CS1 scFv; 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD4 막횡단 도메인; 4-1BB 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
제73항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 2-5 및 9-12로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 스페이서; CD28 막횡단 도메인; CD28 공동-신호전달 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.