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KR20170065026A - 대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법 - Google Patents

대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20170065026A
KR20170065026A KR1020177002592A KR20177002592A KR20170065026A KR 20170065026 A KR20170065026 A KR 20170065026A KR 1020177002592 A KR1020177002592 A KR 1020177002592A KR 20177002592 A KR20177002592 A KR 20177002592A KR 20170065026 A KR20170065026 A KR 20170065026A
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KR
South Korea
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polypeptide
seq
leu
ala
amino acid
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Withdrawn
Application number
KR1020177002592A
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English (en)
Inventor
다린 앤써니 린다우트
라이 할단카르
후이 티안
저-위안 수
Original Assignee
엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨.
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Filing date
Publication date
Application filed by 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. filed Critical 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨.
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Abstract

포도당 대사 장애 및/또는 체중 장애를 가진 개인을 치료하는 방법들, 그리고 이와 연합된 조성물들이 제시된다.

Description

대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR TREATING METABOLIC DISORDERS}
문서 화일로 제공된 서열 목록의 편입
서열 목록른 2015년 7월 22일자로 만들어진 크기가 133 KB인, ＂NGMB-139WO_SeqList.txt＂의 문서 화일로 본 명세서에 제공된다. 이 문서 화일은 본 명세서에 참고 화일로 편입된다.
관련 출원들에 대한 교차-참조
본 출원은 2014년 7월 30일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 62/031,063 그리고 2015년 7월 23 일자로 제출된 미국 가특허 출원 62/195,908에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 다른 것들중에서 대사 관련된 상태 치료에 유용한 폴리펩티드 및 이의 조성물들에 관계한다.
개요
비만은 제한된 에너지 소비 및/또는 신체 운동 결핍과 연결된 과도한 식품섭취가 가장 흔한 원인이다. 비만은 다양한 질환들, 이를 테면, 진성 당뇨병, 고혈압, 죽상경화증, 관상동맥질환, 수면무호흡, 통풍, 류마티즘 및 관절염 발생 가능성을 증가시킨다. 더욱이, 사망 위험은 비만과 직접적으로 관련되어, 예를 들면, 체질량 지수가 40을 초과하면, 평균 수명이 10년 이상 감소된다.
현재 약물학적 치료 방식에는 식욕 억제물질 표적화 수용체 류별 (가령, CB1, 5-HT2C, 및 NPY); 시상하부에서 식욕 회로의 조절물질 및 그렐린의 분자 작용; 그리고 영양소-흡수 저해물질 표적화 리파제를 포함한다. 불행하게도, 현재 방식중 어느 것도 유해효과 야기 없이 비만을 효과적으로 치료하는 것은 없었으며, 이들중 일부는 매우 심각할 수 있다.
고혈당 수준은 췌장 베타-세포에 의한 인슐린 분비를 자극한다. 인슐린은 다시 근육 세포 및 지방 세포들 안으로 포도당의 진입을 자극하고, 글리코겐 및 트리글리세리드의 합성으로 이어지고, 그리고 단백질의 합성으로 이어진다. 다양한 세포 유형들에서 인슐린 수용체들의 활성화는 포도당 취입 및 이용의 증가, 그리고 간의 포도당 배출의 감소에 의해 순환하는 포도당 수준을 감소시킨다. 이러한 조절 네트워크 안에서 붕괴로 인간 집단에 영향을 주는 당뇨병 및 연합된 병리학적 증후군이 많이 그리고 증가추세로 초래될 수 있다.
포도당 대사 장애를 가진 환자들은 고혈당증, 고인슐린혈증, 및/또는 포도당 불내성으로 아플 수 있다. 포도당 및/또는 인슐린의 이상의 수준과 대개 연합된 장애의 예는 인슐린 저항성이며, 이때 간, 지방, 및 근육 세포들은 정상적인 혈액 인슐린 수준에 반응하는 이들의 능력을 상실한다.
비만, 당뇨병 및 연합된 대사성 장애 및 비-대사성 장애의 유병률(prevalence) 및 중증도(severity) 견지에서, 예를 들면, 식욕, 포도당 및/또는 인슐린 수준을 조절하고, 환자에서 포도당 수준을 변동시키기 위하여 생물학적 반응을 강화시키는 치료 방식은 여전히 관심대상으로 남아있다.
MIC-1 (대식세포 억제성 사이토킨-1)로도 알려진 야생형 GDF15는 체중 조절에 연계되어 있었다 (Tsai VW, et al., PLoS One 2013; 8 (2): e55174; US8,192,735).
요약
성숙한 야생형 인간 GDF15 (서열 번호: 1)의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 연속 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들이 제시된다. 본 명세서의 폴리펩티드는 GDF15 뮤테인, 변형된 GDF15, 그리고 변형된 GDF15 뮤테인을 포괄한다. 이들 폴리펩티드의 조성물들 또한 제시된다. 본 명세서는 체중 관련된 장애들 및/또는 포도당 대사 장애들을 치료 또는 방지에 있어서 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드의 사용을 고려한다.
상기에서 명시된 바와 같이, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 연속 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드가 제시된다. 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함한다: i) D5T/S 및 R21N; ii) R16N 및 H18T/S; iii) S23N 및 E25T/S; iv) L24N 및 D26T/S; v) S50N 및 F52T/S 또는 F52N 및 A54T/S; vi) Q51N 및 R53T/S 또는 R53N 및 A55T/S; vi) S64N 및 H66T/S; vii) L65N 및 R67T/S; viii) S82N 및 N84T/S; ix) K91N 및 D93T/S 또는 D93N 및 G95T/S; x) T94N 및 V96T/S 또는 V96N 및 L98T/S; xi) S97N 및 Q99T/S; 및 xii) A106N 및 D108T/S.
예를 들면, 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: i) D5T 및 R21N 또는 D5S 및 R21N; ii) R16N 및 H18T 또는 R16N 및 H18S; iii) S23N 및 E25T 또는 S23N 및 E25S; iv) L24N과 D26T 또는 L24N 및 D26S; v) S50N 및 F52T; S50N 및 F52S; F52N 및 A54T; 또는 F52N 및 A54S; vi) Q51N 및 R53T; Q51N 및 R53S; R53N 및 A55T; 또는 R53N 및 A55S; vi) S64N 및 H66T 또는 S64N과 H66S; vii) L65N 및 R67T 또는 L65N 및 R67S; viii) S82N 및 N84T 또는 S82N 및 N84S; ix) K91N 및 D93T; K91N 및 D93S; D93N 및 G95T; 또는 D93N 및 G95S; x) T94N 및 V96T; T94N 및 V96S; V96N 및 L98T; 또는 V96N 및 L98S; xi) S97N 및 Q99T 또는 S97N 및 Q99S; 그리고 xii) A106N 및 D108T 또는 A106N 및 D108S.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: D5T 및 R21N; S23N 및 E25T/S; R53N 및 A55T/S; S64N 및 H66T/S; K91N 및 D93T/S; D93N 및 G95T/S; S97N 및 Q99T/S; 그리고 A106N 및 D108T/S.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: D5T 및 R21N; D5S 및 R21N; S23N 및 E25T; S23N 및 E25S; R53N 및 A55T; R53N 및 A55S; S64N 및 H66T; S64N 및 H66S; K91N 및 D93T; K91N 및 D93S; D93N 및 G95T; D93N 및 G95S; S97N 및 Q99T; S97N 및 Q99S; A106N 및 D108T; 그리고 A106N 및 D108S.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: D5T 및 R21N; S64N 및 H66T/S; K91N 및 D93T/S; D93N 및 G95T/S; 그리고 S97N 및 Q99T/S.
다른 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: K91N 및 D93T 또는 K91N 및 D93S; 그리고 D93N 및 G95T 또는 D93N 및 G95S. 다른 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다: K91N 및 D93T.
예시적인 구체예들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일할 수 있다.
다른 구체예들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 길이의 아미노산일 수 있고, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일할 수 있으며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응한다.
다른 구체예들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 길이의 아미노산일 수 있고, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일할 수 있으며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응한다.
본 명세서에서 공개된 예시적인 폴리펩티드들은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일하고, 서열 번호: 1과 비교하여 아미노산 결손을 갖는, 최소한 98개 길이의 아미노산인 연속 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드들은 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두(truncation)를 가질 수 있다. 상기 절두는 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 이상의 아미노산, 가령, 1-14개의 아미노산, 3-14개의 아미노산, 6-14개의 아미노산, 또는 3-6개의 아미노산일 수 있다.
특정 경구들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90% 동일하고, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 3개 아미노산에 대응하는 첫 3개 아미노산이 포함되지 않은, 최소한 98개 길이의 아미노산이며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응한다.
특정 경구들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90% 동일하고, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 6개 아미노산에 대응하는 첫 6개 아미노산이 포함되지 않은, 최소한 98개 길이의 아미노산이며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응한다.
특정 경구들에 있어서, 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90% 동일하고, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 14개 아미노산에 대응하는 첫 14개 아미노산이 포함되지 않은, 최소한 98개 길이의 아미노산이며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응한다.
특정 경구들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-말단에서 신호 서열, 이를 테면, IgK 신호 서열을 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은 링커를 통하여 상기 폴리펩티드에 접합될 수 있으며, 이 링커는 절단가능한 링커일 수 있다.
N-말단으로부터 C-말단으로 연속적으로 다음을 포함하는 융합 단백질이 또한 제시된다: 이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-GDF15; 이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-ΔN3-GDF15; 또는 이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-ΔN6-GDF15.
예시적인 구체예들에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 혈청 알부민, 말토즈 결합 단백질, 또는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드일 수 있다. 상기 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민, 시아노(cyno) 혈청 알부민 또는 소의 혈청 알부민일 수 있다. 상기 융합 단백질은 N-말단에서 신호 서열을 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은 IgK 신호 서열일 수 있다.
상기에서 설명된 폴리펩티드들 또는 융합 단백질들을 인코드하는 핵산 분자가 또한 본 명세서에서 제시된다. 상기 핵산 분자는 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질을 인코드하는 핵산 분자의 시험관내 또는 생체내 발현을 부여하는 발현 조절 요소에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 또한 고려된다. 상기 벡터는 바이러스성 벡터일 수 있다.
일부 구체예들은 하나 또는 그 이상의 전술한 폴리펩티드들을 발현시키는 형질변환된 세포들 또는 숙주 세포들을 포함한다.
본 명세서의 특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 전술한 폴리펩티드들은 약학 조성물을 만들기 위하여 제형화되고, 이때 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 희석제들, 운반체들 또는 부형제들을 또한 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 약학 조성물은 최소한 한 가지 추가적인 예방적 또는 치료요법적 물질을 또한 포함한다.
본 명세서의 여전히 추가 구체예들은 전술한 뮤테인 폴리펩티드들중 하나에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 별도 폴리펩티드들에 또는 단일 폴리펩티드에 존재하는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 항체는 약 107 M-1 내지 약 1012 M- 1 의 친화력으로 상기 폴리펩티드에 결합한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 아이소타입(isotype) IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 추가적인 구체예들에 있어서, 상기 항체는 탐지가능하도록 라벨되고, 한편 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 Fv, scFv, Fab, F(ab＇)2, 또는 Fab＇이다.
본 명세서는 공유적으로 연계된 비-폴리펩티드 폴리머 (가령, 폴리(에틸렌 글리콜) 폴리머)를 포함하는 항체들을 또한 고려한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 지질 모이어티, 지방산 모이어티, 다당류 모이어티, 그리고 탄수화물 모이어티로부터 선택된 공유적으로 연계된 모이어티를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서 상기 항체는 단일 쇄 Fv (scFv) 항체이며, scFv는 다른 것들과 다중화된다.
본 명세서의 항체들은 단클론 항체들, 다클론 항체들, 또는 인간화된 항체들일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
더욱이, 본 명세서는 최소한 한 가지 약학적으로 수용가능한 부형제, 운반체 또는 희석제와 함께 제형화된 상기에서 설명된 항체가 포함된 약학 조성물을 고려한다. 이러한 약학 조성물들은 최소한 한 가지 추가적인 예방적 물질 또는 치료요법적 물질을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서의 특정 구체예들은 상기-언급된 약학 조성물들중 하나와 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가적인 성분들을 포함하는 멸균 용기를 고려한다. 예를 들면, 상기 멸균 용기는 주사기일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 여전히 추가 구체예들에 있어서, 상기 멸균 용기는 키트의 한 성분이며, 상기 키트는 예를 들면, 최소한 한 가지 예방적 물질 또는 치료요법적 물질을 포함하는 제 2 멸균 용기를 또한 포함할 수 있다.
전술한 폴리펩티드들 또는 융합 단백질을 만드는 방법을 또한 본 명세서에서 공개한다. 상기 상기 방법은 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질을 발현시키는 숙주 세포를 배양하고; 그리고 상기 발현된 폴리펩티드 또는 융합 단백질를 정제하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서는 또한 대상(가령, 인간)에서 포도당 대사 장애를 치료 또는 방지하는 방법을 고려하는데, 이는 상기 대상에게 치료요법적으로 효과량의 전술한 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 투여함으로써, 치료 또는 방지된다. 일부 방법들에 있어서, 상기 치료 또는 방지로 인하여 대상에게서 혈장 포도당의 감소, 대상에게서 혈장 인슐린의 감소, 대상에게서 체중 및/또는 식품 섭취의 감소, 또는 포도당 내성을 증가시킨다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 포도당 대사 장애는 진성 당뇨병이다.
대상에게서 체중 장애를 치료 또는 방지하는 방법이 또한 공개된다. 상기 방법은 대상에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 이때 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질은 대상의 체중 장애를 치료 또는 방지하는데 효과량으로 투여된다. 일부 방법들에 있어서, 상기 치료 또는 방지로 인하여 대상의 체중 및/또는 식품 섭취가 감소된다.
일부 구체예들에 있어서, 대상은 비만이거나 및/또는 체중 장애를 가지고 있다.
임의의 특정 투여 경로 또는 투약량 섭생(dosing regimen)에 제한되지 않지만, 일부 구체예들에 있어서 상기 투여는 장관외 (가령, 피하) 주사에 의해 실시된다.
도 1은 본 명세서에서 공개된 GDF15 뮤테인의 아미노산 서열과 야생형 (WT) 성숙한 인간 GDF15의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 2는 본 명세서에서 공개된 ΔN3-GDF15 뮤테인의 아미노산 서열과 WT 성숙한 인간 GDF15의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. ΔN3-hGDF15 뮤테인은 성숙한 hGDF15의 N-말단 상에 존재하는 처음 3개의 아미노산 (ARN)이 부족하다.
도 3은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로 다음을 포함하는 2개의 융합 단백질(구조체 M1 및 M2)을 도시한다: IgK 신호 서열 (소문자) (IgK) - 인간 혈청 알부민 아미노산 (D25-L609) 서열 (HSA) - 절단불가능한 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 링커 [(G4S)]3 (밑줄친) - 성숙한 인간 GDF15 아미노산 서열 (hGDF15) (굵은부분). 구조체 M1 (IgK-HSA-[(G4S)]3-hGDF15)는 전장의 성숙한 hGDF15를 포함하는 반면, 구조체 M2 (IgK-HSA-[(G4S)]3-ΔN3-hGDF15)는 ΔN3-hGDF15를 포함하는데, 이때 성숙한 hGDF15의 N-말단에 있는 아미노산들에 상응하는 처음 3개 아미노산 (ARN)들은 결손된다.
도 4는 CHOK1SV GSKO 안정 세포 계통 배지로부터 구조체 M1 및 M2의 비-환원된, 코마시 착색된, SDS-PAGE 발현 겔을 나타낸다. 별표 (*)는 CHOK1SV로부터 배출하는 동안 M1에서 발생되는 클립된 종들(clipped species)을 표시한다. 클립 부위의 LC/MS 확인으로 안정성 증가된 구조체 (M2)가 기획되었으며, 이 구조체는 성숙한 hGDF15의 N-말단에 3개의 아미노산 절두 (ΔARN 또는 ΔN3)을 포함한다.
도 5는 성숙한 인간 GDF15 아미노산 서열 (굵은부분)의 N-말단에 절단불가능한 [(G4S)]5 링커 (밑줄친)을 통하여 융합된 IgK 신호 서열 (소문자)을 갖는 인간 혈청 알부민 아미노산 (D25-L609) 서열을 갖는 2개의 융합 분자를 나타낸다. 구조체 M3 (IgK-HSA-[(G4S)]5-ΔN3-hGDF15)은 성숙한 hGDF15의 N-말단에 3개의 아미노산 절두 (ΔARN)를 포함하는 반면; 구조체 M4 (IgK-HSA-[(G4S)]5-ΔN6-hGDF15)은 성숙한 hGDF15의 N-말단과 비교하여 6개 아미노산 절두 (ΔARNGDH)를 포함한다.
도 6은 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에게 비이클, M1, M3 및 M4 융합 분자 (40 nmol/kg)를 단일 급성 피하 투여한 후, 식품 섭취에서 효과를 나타낸다. 이 도면에서 나타낸 바와 같이, 식품 섭취 매개변수는 24 시간 투여-후 그리고 7 일 투여-후 결정되었다. 마우스의 각 집단에서, n=8 및 p-값 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001)은 각 명시된 시점에서 비이클 집단에 대하여 다양한 투여량 집단을 비교하는 비쌍체 T-테스트(unpaired T-test)에 의해 측정되었다.
도 7은 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에게 비이클, M1, M3 및 M4 융합 분자 (40 nmol/kg)를 단일 급성 피하 투여한 후, 체중에 있어서 효과를 나타낸다. 이 도면에서 나타낸 바와 같이, 식품 섭취 매개변수는 투여전 집단 체중에 대하여 24 시간 투여-후 그리고 7 일 투여-후 시점에서 결정되었다. 마우스의 각 집단에서, n=8 및 p-값 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001)은 각 명시된 시점에서 비이클 집단에 대하여 다양한 투여량 집단을 비교하는 비쌍체 T-테스트(unpaired T-test)에 의해 측정되었다.
도 8a는 N-연계된 당화 콘센수스 부위 (M5-M21)의 도입에 의해 생성된 단일-당화된 뮤테인과 이중-당화된 뮤테인의 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 서열은 성숙한 인간 GDF15 아미노산 서열 (굵은부분)의 N-말단에 융합된 IgK 신호 서열 (소문자)을 포함한다. 도 8b는 도 8a에서 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열을 나타낸다. 도 8c는 ΔN3-M16의 아미노산 서열과 ΔN3-M16을 인코드하는 핵산 서열을 나타낸다. 도 8d는 IgK 신호 서열 (IgK-WT-GDF15)을 포함하는 WT-성숙한 인간 GDF15 아미노산 서열의 아미노산 서열과 IgK-WT-GDF15를 인코드하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 9는 상대적 용해도가 개선된 분비 및 이량체 형성의 요약을 제공하는데, 이들 각각은 도 8a에서 제시하는 바와 같이 N-당화된 인간 GDF15 뮤테인과 ΔN3-M16에 대한 것이다.
도 10은 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 비이클 (PBS), GDF15, M16, ΔN3-M16 및 M17 폴리펩티드들 (1mg/kg (40 nmol/Kg))의 단일 피하 투여 후, 식품 섭취에 있어서 효과를 나타낸다.
도 11은 DIO 마우스에게 비이클 (PBS), GDF15, M16, ΔN3-M16 및 M17 폴리펩티드들 (1mg/kg (40 nmol/Kg))의 단일 피하 투여 후 체중에 있어서 효과를 나타낸다.
상세한 설명
본 명세서의 방법들 및 조성물들을 더 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서는 본 명세서에서 제시되는 특정 구체예들에 한정되지 않으며, 본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 제한하기 위한 의도는 없는 것으로 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공될 때, 다른 언급이 없는 한, 각 사이 값, 하위 한계 단위의 10/1, 그 범위의 상위와 하위 한계 사이, 그리고 다른 언급된 또는 언급된 범위의 중간 값은 이 방법 안에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상위 한계와 하위 한계는 더 작은 범위 안에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 본 발명에 포괄되며, 명시된 범위 안에 임의의 특별히 배제된 한계의 대상이 된다. 언급된 범위에 한계의 하나 또는 두 한계가 포함될 때, 이들 포하된 한계중 하나 또는 모두가 배제된 범위 또한 본 발명에 포함된다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에서 및 첨부된 청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수(＂a＂, ＂an＂ 및 ＂the＂)는 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들면, ＂돌연변이 폴리펩티드＂에 대한 참조는 하나 또는 그 이상의 돌연변이 폴리펩티드들, 그리고 이와 같은 것들에 대한 참조를 포함한다. 청구항은 임의의 선택적 요소를 배제하기 위하여 기술될 수 있음이 더 명시된다. 이와 같이, 이러한 서술은 청구항 요소들의 언급과 관련하여 배타적 용어 이를 테면, ＂오직＂, ＂단지＂ 및 이와 유사한 것의 이용 또는 ＂음성적＂ 제한의 사용에 대하여 전제적 기본으로 작용하도록 의도된다.
본 명세서에서 논의된 공개는 본 출원 출원일 이전에 이들의 공개만을 위하여 제공된다. 본 명세서에서 설명된 발명자들은 본 발명은 선행 발명에의해 이러한 공개를 선행자격이 없는 것을 인정하는 것으로 간주되는 것은 없다. 더욱이, 제공되는 공개 일은 실제 공개일자와 상이할 수 있으며, 이는 개별적으로 확인해볼 필요가 있을 수 있다.
정의
용어 ＂환자＂ 또는 ＂대상＂은 인간 또는 비-인간 동물 (가령, 포유류)를 지칭하는데 호환적으로 이용된다.
용어 ＂치료하다＂, ＂치료하는＂, 치료＂ 및 이와 유사한 것들은 대상을 괴롭히는 질환, 장애 또는 상태의 기저 원인들중 최소한 한가지, 또는 대상을 괴롭히는 질환, 장애, 상태와 연합된 최소한 한 가지 증후를 일시적 또는 영구적으로 제거, 감소, 억제, 완화 또는 개선시키기 위하여, 질환, 장애 또는 상태, 또는 이의 증후가 진단, 관찰 및 이와 유사결과 후, 개시되는 활동 과정(이를 테면, 물질, 가령, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드가 포함된 약학 조성물을 투여) 을 지칭한다. 따라서, 치료는 (가령, 혈류에서 인슐린 및/또는 포도당 수준을 감소시키기 위하여, 포도당 내성을 증가시키기 위하여, 포도당 수준의 변동을 최소화시키기 위하여, 및/또는 포도당 항상성의 파괴로 인하여 야기되는 질환으로부터 보호하기 위하여), 활성 질환을 저해(가령, 상기 질환, 장애 또는 상태 또는 이와 함께 연합된 임상적 징후들)의 발생을 억제 또는 추가 발생을 억제)시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂치료를 요하는＂이란 대상이 치료를 요구하거나 또는 이 치료로 인하여 이익을 볼 것이라고 의사 또는 다른 간병인의 판단을 지칭한다. 이 판단은 의사 또는 간병인의 경험 범위 안에 있는 다양한 요인들에 근거하여 이루어진다.
용어 ＂방지하다＂, ＂방지하는＂, ＂방지＂ 및 이와 유사한 것들은 질환, 장애, 상태 또는 이와 유사한 것들 (예를 들면, 임상적 징후들의 부재에 의해 판단되는)의 발생 위험을 영구적 또는 일시적으로 방지, 억제, 저해 또는 감소시키거나 또는 특정 질환, 장애 또는 상태를 가질 경향이 있는 대상에서 일반적으로 이의 개시를 지연시키기 위한 방식(가령, 질환, 장애, 상태 또는 이의 증후 개시 전)으로 시작되는 활동 과정(이를 테면 물질, 가령, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드가 포함된 약학 조성물을 투여)을 지칭한다. 특정 경우들에 있어서, 상기 용어는 상기 질환, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키거나 또는 상기 질환, 장애 또는 상태가 유해한 또는 바람직하지 않은 상태로의 진행을 저해시키는 것을 또한 지칭한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂방지를 요하는＂이란 대상이 예방적 관리를 요구하거나 또는 이 관리로 인하여 이익을 볼 것이라고 의사 또는 다른 간병인의 판단을 지칭한다. 이 판단은 의사 또는 간병인의 경험 범위 안에 있는 다양한 요인들에 근거하여 이루어진다.
구절 ＂치료요법적으로 효과량＂이란 대상에게 한 물질을 단독으로, 또는 약학 조성물의 일부분으로써 단일 투여분량으로 또는 일련의 투여 분량의 일부분으로써 환자에게 투여되었을 때, 질환, 장애 또는 상태의 임의의 증상, 측면 또는 특징에 임의의 탐지가능한, 긍정적 효과를 가질 수 있는 량의 투여를 의미한다. 상기 치료요법적으로 효과량은 관련 생리학적 효과를 측정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 고혈당 상태의 경우, 혈당이 낮아지거나 감소, 또는 포도당 내성 시험에서 개선되는 것을 이용하여 물질의 양이 고혈당 상태를 치료하는데 효과적인지를 판단할 수 있다. 예를 들면, 치료요법적으로 효과량은 공복혈장 포도당 (FPG)의 임의 수준(가령, 기저 수준)을 감소 또는 줄이는데 충분한 양이며, 이때, 예를 들면, 그 양은 200 mg/dl 이상인 FPG 수준을 200 mg/dl 미만으로 감소시키기에 충분하며, 이때 그 양은 175 mg/dl 내지 200 mg/dl의 FPG 수준을 시작 수준 미만으로 감소시키는데 충분하며, 이때 그 양은 150 mg/dl 내지 175 mg/dl의 FPG 수준을 시작 수준 미만으로 감소시키는데 충분하며, 이때 그 양은 125 mg/dl 내지 150 mg/dl의 FPG 수준을 시작 수준 미만으로 감소시키는데 충분하며, 그리고 기타 등등 (가령, FPG 수준을 125 mg/dl 미만으로, 120 mg/dl 미만으로, 115 mg/dl 미만으로, 110 mg/dl 미만으로 감소, 등등)이다. HbAIc 수준의 경우에 있어서, 상기 효과량은 약 10% 이상에서 9%, 약 9% 이상에서 8%, 약 8% 이상에서 7%, 약 7% 이상에서 6%, 약 6% 이상에서 5%, 및 이와 같이 수준을 낮추거나 감소시키는데 충분한 양이다. 더욱 구체적으로, 약 0.1%, 0.25%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상으로 HbA1c 수준의 삭감 또는 감소가 본 명세서에 의해 고려된다. 상기 치료요법적으로 효과량은 투약량 섭생과 대상의 상태에 대한 진단학적 분석 및 이와 유사한 것들과 연관되어 조정될 수 있다.
구절 ＂변화를 가져오기 위한 충분한 양＂이란 특정 요법의 투여 전에 측정된 지표의 수준 (가령, 기저 수준)과 투여 후의 수준 사이의 탐지가능한 차이가 있다는 것을 의미한다. 지표는 임의의 객관적 매개변수 (가령, 포도당 또는 인슐린 또는 식품 섭취의 수준) 또는 주관적 매개변수 (가령, 대상이 느끼는 행복감 또는 식욕)을 포함한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 구절 ＂포도당 내성＂이란 포도당 섭취가 변동이 있을 때, 혈장 포도당 및/또는 혈장 인슐린의 수준을 조절하는 대상의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 포도당 내성은 120분 안에 포도당을 복용하기 전에 측정된 수준으로 혈장 포도당 수준을 감소시키는 대상의 능력을 포괄한다.
용어 ＂당뇨병＂ 및 ＂당뇨병가 있는(diabetic)＂이란 고혈당증 및 당뇨(glycosuria)에 의해 흔히 특징화되는, 인슐린의 부적절한 생산 또는 이용과 관련된 탄수화물 대사의 진행성 질환을 지칭한다. 용어 ＂전-당뇨병＂ 및 ＂전-당뇨가 있는＂이란 대상에게서 당뇨병에서 전형적으로 관찰되는 특징, 징후들 및 이와 유사한 것들을 가지고 있지는 않지만, 치료를 하지 않고 방치한다면 당뇨병으로 진행될 수 있는 특징들, 징후들 및 이와 유사한 것들을 가지고 있는 상태를 말한다. 이들 상태의 존재는 예를 들면, 공복혈장 포도당 (FPG) 시험 또는 경구 포도당 내성 시험 (OGTT)를 이용하여 판단될 수 있다. 이둘다 보통 시험 시작 전, 최소한 8 시간의 공복 상태를 요구한다. FPG 시험에 있어서, 대상의 혈당은 공복이 종료된 후 측정되며; 일반적으로 대상은 밤새 공복을 유지하고, 대상이 다음날 식사전 아침에 혈당을 측정한다. 건강한 대상은 일반적으로 약 90 내지 약 100 mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이며, ＂전-당뇨병＂이 있는 대상은 일반적으로 약 100 내지 약 125 mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이며, 그리고 ＂당뇨병＂이 있는 대상은 일반적으로 약 126 mg/dl 이상의 FPG 수준을 가질 것이며. OGTT에 있어서, 대상의 혈당은 공복 후 측정되고, 포도당-농축 음료를 복용 후 2시간 후에 다시 측정된다. 포도당-농축 음료를 복용 후 2시간 후, 건강한 대상은 일반적으로 약 140 mg/dl 이하의 혈당 농도를 갖고, 전-당뇨가 있는 대상은 일반적으로 약 140 내지 약 199 mg/dl의 혈당 농도를 갖고, 그리고 당뇨가 있는 대상은 일반적으로 약 200 mg/dl 또는 그 이상의 혈당 농도를 갖는다. 전술한 혈당 값은 인간 대상에 속하며, 뮤린 대상의 경우 정상혈당, 중간 고혈당증 및 명백한 고혈당증으로 차등적으로 등급화된다. 4시간 공복 후 건강한 뮤린 대상은 일반적으로 약 100 내지 약 150 mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이며, ＂전-당뇨병＂을 가진 뮤린 대상은 일반적으로 약 175 내지 약 250 mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이며, 그리고 ＂당뇨병＂이 있는 뮤린 대상은 일반적으로 약 250 mg/dl 이상의 FPG 농도를 가질 것이다.
본 명세서에서 이용된 용어 ＂인슐린 저항성＂이란 정상적인 양의 인슐린이 정상적인 생리학적 또는 분자 반응을 만들지 못하는 상태를 지칭한다. 일부 경우들에 있어서, 내부적으로 생산된 또는 외부에서 투여된 초과-생리학적 양의 인슐린은 전체적으로 또는 부분적으로 인슐린 저항성을 극복하고, 생물학적 반응을 만들어낼 수 있다.
용어 ＂대사 증후군＂이란 고인슐린혈증, 비정상적인 포도당 내성, 비만, 복부 또는 신체 상부에 지방의 재분포, 고혈압, 이상섬유소분해, 그리고 높은 트리글리세리드, 낮은 고밀도 지질단백질 (HDL)-콜레스테롤, 그리고 높은 소밀도 저밀도 지질단백질 (LDL) 입자들에 의해 특징화되는 이상지질혈증을 포함하나, 이에 국한되지 않은 연합된 성향들의 클러스터를 말한다. 대사 증후군을 가진 대상들은 유형 2 당뇨병 및/또는 다른 장애들 (가령, 죽상경화증)의 발생 위험이 있다.
구절 ＂포도당 대사 장애＂란 건강한 개인과 비교하여 대상의 포도당 수준이 상승되거나 및/또는 인슐린 수준이 상승된 것과 연합된 임상적 징후 또는 징후들의 조합을 특징으로 하는 임의의 장애를 포괄한다. 상승된 수준의 포도당 및/또는 인슐린은 다음의 질환, 장애들 및 상태에서 나타날 수 있다: 다른 것들 중에서 고혈당증, 유형 II 당뇨병, 임신 당뇨병, 유형 I 당뇨병, 인슐린 저항성, 손상된 포도당 내성, 고인슐린혈증, 손상된 포도당 대사, 전-당뇨병, 다른 대사성 장애들 (이를 테면, 대사 증후군, 이는 증후군 X로 또한 불림), 및 비만. 본 명세서의 폴리펩티드, 및 이의 조성물들은 예를 들면, 포도당 항상성을 획득 및/또는 유지시키는데 이용될 수 있는데, 가령, 혈류에서 포도당 수준을 감소 및/또는 인슐린 수준을 건강한 대상에서 볼 수 있는 범위로 감소시키는데 이용될 수 있다.
용어 ＂고혈당증＂은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 건강한 개인과 비교하여 대상의 혈액 혈장내 순환하는 포도당의 양이 상승된 상태를 말한다. 고혈당증은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 공복혈당 수준의 측정을 포함하는 당분야에 공지된 방법들을 이용하여 진단될 수 있다.
용어 ＂고인슐린혈증＂은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 순환하는 인슐린의 수준이 상승되어 있으며, 동시에 혈당 수준이 상승되거나 또는 정상적인 상태를 말한다. 고인슐린혈증은 이를 테면 높은 트리글리세리드, 높은 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질 (LDL)이 높고, 고밀도 지질단백질 (HDL)은 낮은 이상지질혈증, 높은 요산 수준; 다낭난소 증후군; 유형 II 당뇨병 및 비만과 연합된 인슐린 저항성에 의해 야기될 수 있다. 고인슐린혈증은 약 2 μU/mL 이상의 혈장 인슐린 수준을 가질 때 진단될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 ＂체중 장애＂란 과도한 체중 및/또는 증가된 식욕과 연합된 상태를 말한다. 다양한 매개변수는 대상이 기준이 되는 건강한 개인과 비교하여 과체중인지를 판단하는데 이용되는데, 대상의 나이, 키, 성별 및 건강 상태등이 포함된다. 예를 들면, 대상의 신체 질량 지수 (BMI)의 측정에 의해 과체중 또는 비만으로 판단될 수 있는데, 이는 대상의 체중 kg을 대상의 키 제곱미터(meters squared)로 나누어 산출된다. ~18.5 내지 ~24.9 kg/m2 범위의 BMI를 갖는 성인은 정상적인 체중을 가진 것으로 간주되며; ~25 내지 ~29.9 kg/m2 사이의 BMI를 갖는 성인은 과체중 (전-비만)으로 간주될 수 있으며; 그리고 ~30 kg/m2 또는 그 이상의 BMI를 갖는 성인은 비만으로 성인은 비만으로 간주될 수 있다. 증가된 식욕은 흔히 과도한 체중의 원인이 된다. 증가된 식욕과 연합된 몇 가지 상태가 있는데, 예를 들면, 야식 증후군이 포함되는데, 이는 아침에는 식욕부진이고, 대개 불면과 연합된 밤에는 다식증을 특징으로 하지만, 그러나 시상하부에 손상과 관련될 수도 있다.
용어 ＂활성물질＂이란 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 물질의 활성 또는 기능을 자극, 증가, 활성화, 촉진, 활성화를 강화, 감작화 또는 상향조절하는 물질을 지칭하며, 가령, 대사성 장애를 치료 또는 방지하는데 이용되는 폴리펩티드들이다. 또한, 활성물질은 상기 본 발명의 폴리펩티드들과 동일한 작용 기전을 통하여 작용하고(가령, 상기 폴리펩티드들과 유사한 방식으로 폴리펩티들과 동일한 신호생성 경로를 조절하는 물질들) 그리고 상기 폴리펩티드들과 비교하여 필적할만한(또는 그 이상)의 생물학적 반응을 유도할 수 있는 물질들을 포함한다. 활성물질의 예로는 항진제, 이를 테면 작은 분자 화합물들을 포함한다.
용어 ＂조절물질＂은 집합적으로 본 발명의 폴리펩티드들과 활성물질을 지칭한다.
용어 ＂조절하다＂, ＂조절＂ 및 이와 유사한 것들은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들 (또는 이들을 인코드하는 핵산 분자들)의 기능 또는 활성을 직간접적으로 증가시키는 물질의 능력; 또는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들과 필적할만한 효과를 만들어낼 수 있는 물질 (가령, 활성물질)의 능력을 지칭한다.
용어 ＂폴리펩티드", ＂펩티드", 및 ＂단백질＂은 본 명세서에서 호환사용되며, 그리고 유전적으로 코드화된 그리고 비-유전적으로 비-코드화된 아미노산들, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도화된 아미노산의 폴리머형태, 그리고 변형된 폴리펩티드 기본골격을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 이들 용어는 이종성 아미노산 서열을 가진 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기들과 함께 또는 없이 이종성 및 동종성 리더 서열을 가진 융합 단백질; 면역학적으로 테그된 단백질; 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 융합 단백질을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 이 용어는 유전적으로 코드화된 아미노산이 포함된 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 이 용어는 이종성 아미노산 서열에 융합된 유전적으로 코드화된 아미노산이 포함된 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 이 용어는 임의선택적으로 이종성 서열에 융합된 아미노산 길이가 112개의 아미노산을 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 공개되고 설명된 단백질 및 분자들을 지칭할 때, 적절할 경우, 용어 ＂폴리펩티드", ＂펩티드", 및 ＂단백질＂은 본 명세서에서 정의된 폴리펩티드들을 지칭한다.
본 명세서를 통하여, 단일 문자 또는 3개 문자 코드에 따라 아미노산을 지칭하는 것으로 인지될 것이다. 독자의 편의를 위하여, 하기에 단일 문자 또는 3개 문자 아미노산 코드를 제시한다:
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본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂변이체＂는 자연-발생적 변이체 (가령, 동족체 및 대립 변이체)와 비-자연-발생적 변이체 (가령, 재조합에 의한 변형)를 포괄한다. 자연-발생적 변이체는 동족체, 가령, 종간에 각각 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 상이한 핵산 및 폴리펩티드들을 포함한다. 자연-발생적 변이체는 대립 변이체, 가령, 한 종에 개인에 따라 각각 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 상이한 핵산 및 폴리펩티드들을 포함한다. 비-자연-발생적 변이체는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 안에 변화를 포함하는 차례로 핵산 및 폴리펩티드들을 포함하며, 이때 서열에서 변화는 인위적으로 도입되는데, 가령, 이 변화는 인간의 중재(＂사람의 손＂)에 의해 실험실 또는 다른 시설에서 만들어진다.
GDF15에 있어서 용어 ＂고유한(native)＂ 또는 ＂야생형＂이란 생물학적으로 활성이 있는, 자연-발생적 GDF15 변이체가 포함된 생물학적으로 활성이 있는, 자연-발생적 GDF15를 지칭한다. 이 용어는 112개 아미노산의 인간 GDF15 성숙한 서열 (서열 번호: 1)을 포함한다.
용어 ＂뮤테인＂은 본 명세서에서 사용된 바와 같이 재조합 단백질, 가령, 아미노산 서열에서 인위적으로 도입된 변화, 가령, 인간의 중재(＂사람의 손＂)에 의해 실험실 또는 다른 시설에서 만들어진 아미노산 서열 안에 변화가 포함된 폴리펩티드를 광범위하게 지칭한다. 이들 폴리펩티드는 보통 단일 또는 다중 아미노산 치환들 또는 결손들을 휴대하며, 부위-지향된(site-directed) 또는 무작위(random) 돌연변이생성을 겪은 클론된 유전자로부터 또는 완전하게 합성된 유전자로부터 흔히 유도된다. 본 명세서의 ＂GDF15 뮤테인＂은 따라서 참조 폴리펩티드, 가령, 성숙한 인간 GDF15 (서열 번호: 1)과 비교하여 예를 들면, 아미노산 치환들 및/또는 아미노산 결손들 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 또는 그 이상의 아미노산의 N-말단 절두)을 포괄한다.
고유한 인간 GDF15 또는 GDF15 뮤테인과 관련되어 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂변형된＂, ＂변형＂ 및 이와 유사한 것들은 인간 GDF15, 자연-발생적 GDF15 변이체, 또는 GDF15 뮤테인의 성질을 변형시키는 하나 또는 그 이상의 변화를 지칭하며, 이때 상기 변화는 GDF15의 일차 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 이러한 성질은 예를 들면, 용해도, 순환 반감기, 안정성, 제거, 면역원성 또는 알레르기항원성, 그리고 제조가능성 (가령, 비용 및 효율)을 포함한다. ＂변형(Modification)＂은 GDF15 폴리펩티드 (고유한 또는 뮤테인) 자체의 일차 아미노산 서열을 변경시키지 않은 공유 화학적 변형을 포함한다. 인간 GDF15, 자연-발생적 GDF15 변이체, 또는 GDF15 뮤테인에 실행될 수 있는 변화는 페길화 (하나 또는 그 이상의 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이의 유도체들의 공유적 부착); 당화 (가령, N-당화), 폴리시알화(polysialylation) 및 헤실화(hesylation); 말토즈 결합 단백질 융합; 알부민 융합 (가령, HSA 융합); 예를 들면, 접합된 지방산 쇄 (acylation)를 통한 알부민 결합; Fc-융합; 그리고 PEG 모방체와의 융합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 특정 구체예들은 폴리에틸렌 글리콜이 관련된 변형을 수반하고, 다른 특정 구체예들은 알부민이 관련된 변형을 수반하고, 그리고 여전히 다른 특정 변형들은 당화와 관련된 변형을 수반하거나, 또는 이의 조합을 수반한다.
용어 ＂DNA＂, ＂핵산＂, ＂핵산 분자＂, ＂폴리뉴클레오티드＂ 및 이와 유사한 것들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이건 간에 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태 또는 이의 유사체를 지칭하는데 호환적으로 이용된다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예로는 선형 및 원형 핵산, 메신져 RNA (mRNA), 상보 DNA (cDNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 프로브, 프라이머 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
용어 ＂프로브＂는 유전자 또는 관심 서열에 대응하는 DNA 또는 RNA 단편을 지칭하며, 이때 상기 단편은 방사능활성적으로 (가령, 32P 또는 35S의 혼입에 의해) 또는 일부 다른 탐지가능한 분자, 이를 테면 비오틴, 디곡시게닌 또는 플루오레신으로 라벨되었다. DNA 또는 RNA의 띠가 상보 서열과 혼성화될 때, 프로브는 예를 들면, 관심대상 유전자가 포함된 겔 상에 바이러스성 플락, 박테리아 콜로니 또는 밴드를 라벨화시키는데 이용될 수 있다. 프로브는 클론된 DNA일 수 있거나, 또는 프로브는 합성 DNA 가닥일 수 있고; 후자의 경우, 예를 들면, 해당 단백질의 일부를 마이크로시퀀싱하고, 이 단백질을 인코드하는 핵산 서열을 추정하고, 이 서열을 나르는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이 서열을 방사능라벨링하고, 이를 프로브로 이용하여 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써, 단리된 단백질로부터 cDNA 또는 게놈 클론을 획득하는데 이용될 수 있다.
용어 ＂이종성(heterologous)＂이란 상이한 원천으로부터 유도된 구조에 의해 특정되는 두 성분들을 지칭한다. 예를 들면, 폴리펩티드 내용에 있어서, ＂이종성＂ 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드들 (가령, 제 1 성분은 재조합 폴리펩티드을 포함하고, 제 2 성분은 고유한 GDF15 폴리펩티드로부터 유도된)로부터 유도된 작동가능하도록 연계된 아미노산 서열들을 포함할 수 있다. 유사하게, 키메라 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 내용에 있어서, ＂이종성＂ 폴리뉴클레오티드는 상이한 유전자들로부터 유도될 수 있는 작동가능하도록 연계된 핵산 서열을 포함할 수 있다(가령, 본 명세서에서 공개된 구체예에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 핵산에서 유도된 제 1 성분과 운반체 폴리펩티드를 인코드하는 핵산으로부터 유도된 제 2 성분). 다른 예시적인 ＂이종성＂ 핵산은 발현 구조체를 포함하며, 이때 코딩 서열(가령, 관심 대상의 숙주 세포에서 발현을 제공하기 위하여, 이때 관심대상 숙주는 프로모터, 코딩 서열 또는 이 둘 모두와는 상이한 유전적 기원의 것일 수 있다)이 포함된 핵산은 이 코딩 서열과는 상이한 유전적 원천으로부터 얻은 조절 요소(가령 프로모터)에 작동가능하도록 연계되어 있다. 예를 들면, GDF15 폴리펩티드 또는 이의 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연계된 T7 프로모터는 이종성 핵산이라고 말한다. 재조합 세포들의 내용에 있어서, ＂이종성＂이란 숙주 세포와는 상이한 유전적 원천의 핵산 (또는 유전자 산물, 이를 테면 폴리펩티드) 의 존재를 지칭한다.
용어 ＂작동가능하도록 연계된＂이란 바람직한 기능을 제공하기 위하여 분자들 간에 연계(linkage)를 말한다. 예를 들면, 핵산에서 ＂작동가능하도록 연계된＂이란 핵산 서열 간에 기능적 연계를 말한다. 예를 들면, 핵산 발현 조절 서열 (이를 테면 프로모터, 신호 서열, 또는 전사 인자 결합 부위들의 어레이)은 제 2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연계될 수 있고, 이때 상기 발현 조절 서열은 제 2 폴리뉴클레오티드에 영향을 준다. 폴리펩티드 내용에 있어서, ＂작동가능하도록 연계된＂이란 상기 폴리펩티드의 바람직한 활성을 제공하기 위하여 아미노산 서열(가령, 상이한 도메인) 간에 기능적 연계를 말한다.
폴리펩티드의 구조 내용에서 본 명세서에서 사용된 바와 같이, ＂N-말단＂ (또는 ＂아미노 말단＂) 및 ＂C-말단＂ (또는 ＂카르복실 말단＂)은 상기 폴리펩티드의 차례로 극단 아미노 및 카르복실 단부를 지칭하고, 한편 용어 ＂N-말단＂ 및 ＂C-말단＂이란 N-말단과 C-말단으로 향하는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 상대적 위치를 각각 말하는 것이며, N-말단과 C-말단 각각에 있는 잔기들을 포함할 수 있다. ＂곧바로 N-말단＂ 또는 ＂곧바로 C-말단＂이란 제 2 아미노산 잔기에 대하여 제 1 아미노산 잔기의 위치를 지칭하며, 이때 제 1 및 제 2 아미노산 잔기들은 공유적으로 결합되어 연속 아미노산 서열이 제공된다.
아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 내용에서 ＂~로부터 유도된(derived from)＂ (가령, GDF15 폴리펩티드 ＂로부터 유도된＂ 아미노산 서열)이란 상기 폴리펩티드 또는 핵산이 참조 폴리펩티드 또는 핵산 (가령, 자연 발생 GDF15 폴리펩티드 또는 GDF15-인코딩 핵산)의 서열에 기초한 서열을 가진다는 것을 나타내고, 그리고 이 단백질 또는 핵산이 만들어진 원천 또는 방법에 제한되는 것은 아님을 의미한다. 예를 들면, 용어 ＂~로부터 유도된＂이란 참조 아미노산 서열 또는 DNA 서열의 상동성 또는 변이체를 포함한다.
폴리펩티드 내용에 있어서, 용어 ＂단리된＂이란 폴리펩티드가 자연 발생된 경우, 이 폴리펩티드가 만들어진 자연적으로 발생 환경과는 상이한 환경에 있는 관심 폴리펩티드를 말한다. ＂단리된＂이란 상기 관심 폴리펩티드가 실질적으로 농출된 시료 안에 있는 폴리펩티드 및/또는 관심 대상의 폴리펩티드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 상기 폴리펩티드가 자연 발생된 것이 아닌 경우, ＂단리된＂이란 합성 또는 재조합 수단에 의해 만들어진 환경으로부터 상기 폴리펩티드가 분리되어있다는 것을 나타낸다.
＂농축된(Enriched)＂이란 시료가 비-자연적으로 조작된 경우 (가령, 실험실 안에서, 예를 들면, 과학작 또는 임상의에 의해) 관심 대상의 폴리펩티드가 a) 시작 시료 안에 있는, 이를 테면 생물학적 시료 안에 (가령, 상기 폴리펩티드가 자연적으로 발생되는 시료 안 또는 투여 후 이 폴리펩티드가 존재하는 시료) 있는 폴리펩티드의 농도보다 더 크게 있는 경우(가령, 최소한 3-배 더 큰, 최소한 4-배 더 큰, 최소한 8-배 더 큰, 최소한 64-배 더 큰, 또는 그 이상), 또는 b) 상기 폴리펩티드가 만들어진 환경 (가령, 박테리아 세포 안에) 보다 더 큰 농도로 존재한다는 것을 의미한다.
＂실질적으로 순수한＂이란 한 성분 (가령, 폴리펩티드)은 조성물의 전체 함량의 약 50% 이상으로 구성되며, 그리고 전형적으로 전체 폴리펩티드 성분의 약 60% 이상을 나타낸다. 더욱 전형적으로, ＂실질적으로 순수한＂이란 전체 조성물에서 최소한 75%, 최소한 85%, 최소한 90% 또는 그 이상이 관심 성분인, 조성물을 지칭한다. 일부 경우에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 조성물의 전체 함량의 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 구성할 것이다.
용어 ＂항체들＂ (Abs) 및 ＂면역글로불린＂ (Igs)은 동일한 구조적 특징을 가진 당단백질을 말한다. 항체들은 특이적 항원에 대하여 결합 특이성을 나타나며, 면역글로불린은 항체들과 항원 특이성이 없는 다른 항체-유사 분자들을 모두 포함한다. 항체들은 이하에서 더 상세하게 설명된다.
용어 ＂단일클론 항체＂는 실질적으로 동질성 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 즉, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 자연 발생적 돌연변이를 포함하는 경우를 제외하고 동일하며, 이러한 돌연변이들은 일반적으로 소량 존재한다. 단클론 항체들은 상당히 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대하여 지향된다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 일반적으로 함유하는 다중클론성 항체 조제물과 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자를 지향한다.
항체 내용에 있어서, 용어 ＂단리된＂이란 항체의 자연 환경의 오염 성분으로부터 분리된 및/또는 회수된 항체를 지칭하며; 이러한 오염 성분들은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 간섭할 수 있으며, 그리고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성(proteinaceous) 또는 비단백질성 용질을 함유할 수 있다.
구절 ＂보존성 아미노산 치환＂이란 다음의 집단을 가진 아미노산 잔기들의 치환을 지칭한다: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; 그리고 6) D, E. 보존성 아미노산 치환들은 단백질의 아미노산(들)을 유사한 산성, 염기성, 전하, 극성 또는 측쇄의 크기를 가진 아미노산으로 대체시킴으로써, 이 단백질의 활성을 보존할 수 있다. 치환들, 삽입, 또는 결손들에 대한 지침은 상이한 변이체 단백질의 아미노산 서열 또는 상이한 종의 단백질의 아미노산 서열의 배열에 근거할 수 있다.
성장 분화 인자 15 ( GDF15 )
MIC-1 (대식세포 억제성 사이토킨-1), PDF (전립선 분화 인자), PLAB (태반 골 형태발생 단백질), NAG-1 (비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAIDs) 활성화된 유전자), TGF-PL, 및 PTGFB으로도 알려진 GDF15은 형질변환 성장 인자 β (TGF-β) 슈퍼 패밀리의 구성원이다. 퓨린-유사 프로테아제에 의해 후속적으로 절단되는 62 kDa 세포내 전구물질 단백질로 합성되는 GDF15는 25 kDa 이황화물-연계된 단백질로 분리된다. [가령, Fairlie et al., J. Leukoc. Biol 65:2-5 (1999) 참고]. GDF15 mRNA는 간, 신장, 췌장, 결장 및 태반이 포함된 몇몇 조직에서 볼 수 있고, 간에서 GDF15 발현은 장기, 이를 테면 간, 신장, 심장 및 폐 손상 동안에 상당히 상향-조절될 수 있다.
GDF15 전구물질은 29개의 아미노산 신호 펩티드, 167개의 아미노산 프로-도메인, 그리고 112개 아미노산의 성숙 도메인이 포함된 308개의 아미노산 폴리펩티드 (NCBI Ref. Seq.NP_004855.2)이며, 성숙 도메인은 퓨린-유사 프로테아제에 의해 프로-도메인으로부터 잘려나간다. 308-개 아미노산 GDF15 폴리펩티드는 ＂전장＂ GDF15 폴리펩티드로 지칭되며; 112-개 아미노산 GDF15 폴리펩티드 (＂전장＂ GDF15의 아미노산 197-308의)는 ＂성숙한＂ GDF15 폴리펩티드 (서열 번호: 1)이다. 다른 언급이 없는 한, 용어 ＂GDF15＂는 112개의 아미노산 성숙한 인간 서열을 말한다. 또한, 특정 GDF15 잔기들에 대한 수치적 참조는 112개의 아미노산 성숙한 서열 (가령, 잔기 1은 Ala (A)이며, 잔기 112는 Ile (I)이다; 서열 번호: 1 참고)이다. 물론, GDF15 전구물질 아미노산 서열은 3개 절단 부위에 의해 3가지 추정 형태의 ＂성숙한＂ 인간 GDF15 (가령, 110, 112 및 115개 아미노산)를 만들게 되지만, 112개의 아미노산 성숙한 서열이 정확한 것으로 받아들여진다.
본 명세서의 범위는 마우스 (NP_035949), 침팬지 (XP_524157), 오랑우탄 (XP_002828972), 붉은털 원숭이 (EHH29815), 자이언트 판다 (XP_002912774), 긴팔원숭이 (XP_003275874), 기니아 피그 (XP_003465238), 흰담비 (AER98997), 소 (NP_001193227), 돼지 (NP_001167527), 개 (XP_541938) 그리고 오리너구리 (오르니트로힌쿠스 아나티누스(Ornithorhynchus anatinus); AFV61279)가 포함된 다른 포유류 종 및 이의 용도로부터 GDF15 오르소로그(orthologs) 및 이의 변형된 형태를 포함한다. 인간 GDF15의 성숙한 형태는 마우스 오르소로그에 대하여 대략 67% 아미노산 동일성을 갖는다.
편의성을 위하여, 차후 설명되는 변형된 인간 GDF15 분자, GDF15 변이체 (가령, 뮤테인), 그리고 변형된 GDF15 뮤테인은 집합적으로 이후부터 ＂폴리펩티드(들)＂이라고 지칭된다. 본 명세서의 폴리펩티드들 및 핵산 분자와 관련하여 ＂인간＂에 대한 임의의 언급은 이들 폴리펩티드 또는 핵산이 획득되는 방식 또는 원천에 국한되지 않으며, 오히려 자연 발생 인간 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 서열에 대응하는 서열에 참고된다는 것을 의미하는 것으로 주지되어야 한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 변형된 인간 GDF15 분자는 N-당화된 이량체다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 변형된 인간 GDF15 분자는 N-당화된 동종이량체다. 인간 폴리펩티드들과 이를 인코드하는 핵산 분자에 추가하여, 본 명세서는 다른 종의 GDF15 - 관련된 폴리펩티드들과 이의 상응하는 핵산 분자들을 고려한다.
A. 바람직한 물리적 성질을 가진 폴리펩티드들
본 명세서는 부분적으로 서열 번호: 1 (성숙한 112개 아미노산 길이의 인간 GDF15)의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%에 동일한 연속 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드들을 고려한다. 상기 폴리펩티드들은 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들 및/또는 결손들을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 아미노산 치환들에 추가하여, 본 명세서의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 결손을 또한 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 결손을 포함할 수 있다.
편의성 및 명료성을 위하여, 서열 번호: 1의 아미노산 서열은 본 명세서에서 제시하는 폴리펩티드에 대한 참조 서열로 이용된다. 따라서, 아미노산 잔기 위치는 서열 번호: 1을 참고하여 본 명세서에서 번호매김된다. 서열 번호: 1의 서열은 하기에서 제시된다:
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위(들)을 서열 번호: 1에 존재하지 않는 부위로 도입시키는 하나, 둘, 셋, 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 추가들 또는 결손들을 포함할 수 있다. N-연계된 당화 콘센수스 부위는 서열 NXS/T를 포함하고, 여기에서 N은 Asn이며; X는 프롤린이외의 아미노산이고; 이어서 Ser (S) 또는 Thr (T)이다.
본 명세서의 폴리펩티드의 예로는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 존재하지 않는 아미노산 위치에 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 당화 콘센수스 부위들 (가령, N-연계된 당화 콘센수스 부위들)을 갖는 폴리펩티드들을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이는 이 치환 위치에서 하나의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 제공한다 (가령, 서열 번호: 1에서 NGD 서열은 하나의 치환에 의해 NGT/S로 변화될 수 있다; 밑줄은 치환 위치). 다른 경우들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이는 이 치환 위치에서 하나의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 제공한다 (가령, 서열 번호: 1에서 KTD 서열은 2개 치환에 의해 NTT/S로 변화될 수 있다; 밑줄은 치환 위치). 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있는데, 이는 이 치환 위치에서 하나의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 제공한다 (가령, 서열 번호: 1에서 GPG 서열은 3개 치환에 의해 NTT/S 로 변화될 수 있다; 밑줄은 치환 위치).
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나의 아미노산 결손을 포함할 수 있는데, 이는 이 결손 위치에서 하나의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 제공한다.예를 들면, 서열 번호: 1에서 NGDHCPLGPGRCCRLHT 서열은 H (밑줄친)를 통하여 아미노산 D가 결손되어 변화될 수 있고) 이로 인하여 N-연계된 당화 콘센수스 부위: NGT가 제공된다
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나의 아미노산 추가를 포함할 수 있는데, 이는 이 추가(들) 위치에서 하나의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 제공한다. 하나의 아미노산 추가에 의해 N-연계된 당화 콘센수스 부위의 도입 예는 N을 서열 번호: 1에서 서열 LHT에 추가하고, 이로 인하여 서열 LNHT이 생성되는 것을 포함하며, 이때 NHT는 N-연계된 당화 콘센수스 부위다.
상기에서 명시된 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 하나 또는 그 이상의 치환들을 포함할 수 있으며, 이들 치환은 서열 번호: 1에서 대응하는 아미노산 위치로 번호매김될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 대응하는 아미노산과 비교하여 다음의 치환쌍들 중 최소한 하나를 갖는다:
i) D5T와 R21N 또는 D5S와 R21N;
ii) R16N과 H18T 또는 R16N과 H18S;
iii) S23N과 E25T 또는 S23N과 E25S;
iv) L24N과 D26T 또는 L24N과 D26S;
v) S50N과 F52T; S50N과 F52S; F52N과 A54T; 또는 F52N과 A54S;
vi) Q51N과 R53T; Q51N과 R53S; R53N과 A55T; 또는 R53N과 A55S;
vi) S64N과 H66T 또는 S64N과 H66S;
vii) L65N과 R67T 또는 L65N과 R67S;
viii) S82N과 N84T 또는 S82N과 N84S;
ix) K91N과 D93T; K91N과 D93S; D93N과 G95T; 또는 D93N과 G95S;
x) T94N과 V96T; T94N과 V96S; V96N과 L98T; 또는 V96N과 L98S;
xi) S97N과 Q99T 또는 S97N과 Q99S; 그리고
xii) A106N과 D108T 또는 A106N과 D108S.
예를 들면, 치환들 상기 i)에서 치환들은 상기 폴리펩티드가 서열 번호:1의 아미노산 위치 5에 상응하는 아미노산 위치에 트레오닌 (T) 또는 세린 (S)을 갖고, 이때 서열 번호: 1에서 아스파레이트 (D)가 아미노산 위치 5에 존재함을 나타낸다. 위치 5의 D가 T 또는 S로 치환은 D5T/S로 표시될 수 있다. 서열 번호: 1과 비교하여 폴리펩티드에서 대응하는 아미노산 위치는 아미노산 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 N-당화 콘센수스 서열이 서열 번호: 1에 존재하지 않는 위치에서 단일 N-당화 콘센수스 서열을 제공하는 2개 아미노산 치환들 (한 쌍의 치환)을 포함할 수 있다. 이러한 치환들의 예로는 R16N과 H18T/S; K91N과 D93T/S; T94N과 V96T/S; 그리고 상기에서 열거된 다른 것들을 포함한다. R16N과 H18T/S는 상기 폴리펩티드가 서열 번호: 1에서 R이 존재하는 서열 번호: 1의 위치 16에 상응하는 위치에 N을 갖고, 그리고 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 H가 존재하는 서열 번호: 1의 위치 18에 T 또는 S를 갖는다는 것을 나타낸다. 서열 번호: 1에서 서열 RXH (위치 16-18)는 N-연계된 당화 콘센수스 서열에 대한 임의의 잔기를 포함하고 있지 않기 때문에, 치환 쌍은 N- 연계된 당화 콘센수스 서열의 도입을 유도한다.
대체 구체예들에 있어서, 단일 아미노산 치환으로 N-연계된 당화 콘센수스 서열을 충분히 제공할 수 있는데, 예를 들면, 서열 NGD (위치 3-5)는 서열 번호: 1에 있기 때문에, D를 T 또는 S로의 단일 치환은 차례로 서열 NGT 또는 NGS를 만들고, 이들 둘다 N-당화 콘센수스 서열이다.
특정 경구들에 있어서, 하나 이상의 N-당화 콘센수스 서열이 야생형 GDF15 안에 도입될 수 있다. 예를 들면, 야생형 GDF15 아미노산 서열은 치환들 및/또는 결손들에 의해 변형되어 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 N-당화 콘센수스 서열을 제공할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 112개 아미노산 서열과 최소 90% 서열 동일성을 갖는 112개 연속 아미노산을 포함할 수 있고, 이때 112개의 연속 아미노산은 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 N-당화 콘센수스 서열, 이를 테면, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 N-당화 콘센수스 서열을 포함한다.
2개의 N-당화 콘센수스 서열을 갖는 폴리펩티드의 예로는 위치 5 (서열 번호: 1과 비교하여)에서 T/S를 갖고, 위치 21 (서열 번호: 1과 비교하여)에서 N을 갖는 GDF15 뮤테인을 포함한다.
예시적인 본 명세서의 폴리펩티드는 2개 또는 그 이상의 N- 연계된 당화 콘센수스 서열을 갖는 것들을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 다음의 치환쌍중 2개 또는 그 이상의 조합을 포함할 수 있다:
i) D5T와 R21N 또는 D5S와 R21N;
ii) R16N과 H18T 또는 R16N과 H18S;
iii) S23N과 E25T 또는 S23N과 E25S;
iv) L24N과 D26T 또는 L24N과 D26S;
v) S50N과 F52T; S50N과 F52S; F52N과 A54T; 또는 F52N과 A54S;
vi) Q51N과 R53T; Q51N과 R53S; R53N과 A55T; 또는 R53N과 A55S;
vi) S64N과 H66T; 또는 S64N과 H66S;
vii) L65N과 R67T; 또는 L65N과 R67S;
viii) S82N과 N84T 또는 S82N과 N84S;
ix) K91N과 D93T; K91N과 D93S; D93N과 G95T; 또는 D93N과 G95S;
x) T94N과 V96T; T94N과 V96S; V96N과 L98T; 또는 V96N과 L98S;
xi) S97N과 Q99T; 또는 S97N과 Q99S; 그리고
xii) A106N과 D108T 또는 A106N과 D108S.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 대응하는 아미노산과 비교하여 다음의 치환쌍들 중 최소한 하나를 갖는다:
i) D5T와 R21N 또는 D5S와 R21N;
ii) R16N과 H18T 또는 R16N과 H18S;
iii) S23N과 E25T 또는 S23N과 E25S;
iv) S50N과 F52T; S50N과 F52S; F52N과 A54T; 또는 F52N과 A54S;
v) Q51N과 R53T; Q51N과 R53S; R53N과 A55T; 또는 R53N과 A55S;
vi) S64N과 H66T; 또는 S64N과 H66S;
vii) K91N과 D93T; K91N과 D93S; D93N과 G95T; 또는 D93N과 G95S;
viii) T94N과 V96T; T94N과 V96S; V96N과 L98T; 또는 V96N과 L98S;
ix) S97N과 Q99T; 또는 S97N과 Q99S; 그리고
x) A106N과 D108T 또는 A106N과 D108S;
이때 상기 치환으로 서열 NXS/T를 갖는 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들이 생성되고, 여기에서 N은 Asn이고; X는 프롤린이외의 아미노산이고; 이어서 Ser (S) 또는 Thr (T)가 이어지고, 그리고 이때 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들은 N-글리칸에 연계된다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 이량체를 형성한다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 갖는다. 상기 절두는 참조 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상의 아미노산이 될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 GDF15에서 처음 3개의 N-말단 잔기 절두(ΔARN 또는 ΔN3)를 갖는다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면, 완충 용액에서 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 갖는다. 특정 경구들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면, 완충 용액에서 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 갖는다. 상기 완충액은 인산염 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, PIPES 완충액, 또는 이와 유사한 것들, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨염, 염화나트륨, 및 포름산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 완충액은 10 mM-100 mM 트리스 pH7, 1 mM-50 mM 인산칼륨염, 100 mM-200 mM 염화나트륨, 그리고 10 mS/cm-30 mS/cm 포름산을 포함할 수 있다. 추가 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 투여 전과 비교하였을 때 혈당 수준, 체중, 및/또는 식품 섭취를 최소한 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소시킨다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 대응하는 아미노산과 비교하여 다음의 치환쌍들 중 최소한 하나를 갖는다:
i) D5T와 R21N;
ii) S23N과 E25T;
iii) F52N과 A54T;
iv) R53N과 A55T;
v) S64N과 H66T;
vi) K91N과 D93T;
vii) D93N과 G95T;
viii) S97N과 Q99T; 그리고
ix) A106N과 D108T;
이때 상기 치환으로 서열 NXS/T를 갖는 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들이 생성되고, 여기에서 N은 Asn이고; X는 프롤린이외의 아미노산이고; 이어서 Ser (S) 또는 Thr (T)가 이어지고, 그리고 이때 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들은 N-글리칸에 연계된다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 이량체를 형성한다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 갖는다. 상기 절두는 참조 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상의 아미노산이 될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 GDF15에서 처음 3개의 N-말단 잔기 절두(ΔARN 또는 ΔN3)를 갖는다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면, 완충 용액에서 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 갖는다. 특정 경구들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면, 완충 용액에서 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 갖는다. 상기 완충액은 인산염 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, PIPES 완충액, 또는 이와 유사한 것들, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨염, 염화나트륨, 및 포름산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 완충액은 10 mM-100 mM 트리스 pH7, 1 mM-50 mM 인산칼륨염, 100 mM-200 mM 염화나트륨, 그리고 10 mS/cm-30 mS/cm 포름산을 포함할 수 있다. 추가 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 투여 전과 비교하였을 때 혈당 수준, 체중, 및/또는 식품 섭취를 최소한 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소시킨다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음 서열을 포함하거나 또는 필수적으로 다음의 서열로 구성된다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음 서열을 포함하거나 또는 필수적으로 다음의 서열로 구성된다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대하여 최소한 95% 동일한 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1에서 대응하는 아미노산과 비교하여 다음의 치환쌍들 중 최소한 하나를 갖는다:
i) D5T와 R21N;
ii) S64N과 H66T;
iii) K91N과 D93T;
iv) D93N과 G95T; 그리고
v) S97N과 Q99T; 상기 치환으로 서열 NXS/T를 갖는 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들이 생성되고, 여기에서 N은 Asn이고; X는 프롤린이외의 아미노산이고; 이어서 Ser (S) 또는 Thr (T)가 이어지고, 그리고 이때 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들은 N-글리칸에 연계되고; 더욱이 이때 상기 폴리펩티드는 이량체를 형성하고; 그리고 더욱이 이때 상기 폴리펩티드는 완충액 용액 안에서 최소한 1 mg/ml의 용해도를 갖는다.
추가 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 완충액 용액 안에서 최소한 5 mg/ml의 용해도를 갖는다. 상기 완충액은 인산염 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, PIPES 완충액, 또는 이와 유사한 것들, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨염, 염화나트륨, 및 포름산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 완충액은 10 mM-100 mM 트리스 pH7, 1 mM-50 mM 인산칼륨염, 100 mM-200 mM 염화나트륨, 그리고 10 mS/cm-30 mS/cm 포름산을 포함할 수 있다. 추가 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 투여 전과 비교하였을 때 혈당 수준, 체중, 및/또는 식품 섭취를 최소한 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소시킨다. 추가 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 갖는다. 상기 절두는 참조 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상의 아미노산이 될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 GDF15에서 처음 3개의 N-말단 잔기 절두(ΔARN 또는 ΔN3)를 갖는다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음 서열을 포함하거나 또는 필수적으로 다음의 서열로 구성된다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 30. 특정 구체예들에 있어서, 상기 상기 폴리펩티드는 다음 서열을 포함하거나 또는 필수적으로 다음의 서열로 구성된다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96 또는 서열 번호: 100.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 112개 아미노산 서열과 최소 90% 서열 동일성을 갖는 112개 연속 아미노산을 포함할 수 있고, 상기 112개의 연속 아미노산은 상기에서 제시된 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 치환 쌍 세트를 포함한다.
도 1은 야생형 성숙한 인간 GDF15의 아미노산 서열 (WT hGDF15; 서열 번호: 1)과 함께 정렬된 본 명세서에서 고려되는 예시적인 폴리펩티드들의 아미노산 서열(1부터 17까지 번호 매겨짐)을 도시한다. 도 1에서 2개의 N-연계된 당화된 콘센수스 부위들 (1로 번호 매겨진 돌연변이; 서열 번호 : 2)을 포함하는 폴리펩티드들 뿐만 아니라 한 개의 N-연계된 당화된 콘센수스 부위 (2-17로 번호 매겨진 돌연변이; 차례로 서열 번호: 3 내지 18)를 포함하는 폴리펩티드들을 도시한다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 고려하며, 이때 전술한 이량체는 서로 공유적으로 연결된 본 명세서에서 공개된 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 2개 폴리펩티드는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30 또는 최대 5개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 2개 폴리펩티드는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30 또는 최대 2개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 2개 폴리펩티드는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100 또는 최대 5개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 2개 폴리펩티드는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열로 구성된다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100 또는 최대 2개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 추가 구체예들에 있어서, 상기 변형된 GDF15 N-당화된 이량체는 쇄간(interchain) 이황화물 결합에 의해 연결된 동종이량체다. 추가 구체예들에 있어서, 상기 변형된 GDF15 N-당화된 이량체는 본 명세서에서 공개된 2개의 폴리펩티드를 갖는 동종이량체이며, 각 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖고, 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다.
본 명세서은 상기에서 설명된 폴리펩티드들의 활성이 있는 단편들 (가령, 하위서열들)인 폴리펩티드들을 또한 고려한다. 활성이 있는 단편들 또는 하위서열들의 길이는 40개의 아미노산 내지 111개의 아미노산, 가령, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 106, 109, 또는 최대 111개의 아미노산일 수 있다.
상기 폴리펩티드들은 연속 아미노산의 규정된 길이에 걸쳐 (가령, ＂비교 창＂) 참조 서열과 비교하였을 때 규정된 서열 동일성을 갖는다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당분야에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 가령, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat＇l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법의 연구에 의해, 이들 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package, Madison, Wis.에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 그리고 TFASTA)의 자동화된 실행에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 관찰 (가령, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참고)에 의해 실행될 수 있다.
한 예로써, 적합한 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 최대 112개의 아미노산의 연속 구간(stretch)에 대하여 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드들의 예시적인 단편들은 서열 번호: 1과 비교하여 아미노산 결손들을 갖는 폴리펩티드들을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드들은 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 가질 수 있다. 상기 절두는 참조 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상의 아미노산이 될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 관심대상의 폴리펩티드는 N-연계된 당화 콘센수스 서열을 도입하는 하나 또는 그 이상의 치환들, 이를 테면 본 명세서에서 공개된 것, 그리고 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 포함할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드의 길이는 최소한 98개 아미노산이며, 서열 번호: 1에서 98개 아미노산의 대응하는 구간에 최소한 90%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 이 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 처음 3개 내지 처음 14개 아미노산 (가령, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 아미노산)이 부족하고, 한편 서열 번호: 1의 C-말단에 존재하는 아미노산들은 유지할 수 있다. 환언하면, 상기 결손된 아미노산(들)은 서열 번호: 1의 N-말단 아미노산에 대응한다.
특정 구체예들에 있어서, GDF15 뮤테인의 길이는 최소한 106개 아미노산이며, 서열 번호: 1에서 106개 아미노산의 대응하는 구간에 최소한 90%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. GDF15 뮤테인은 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 처음 6개 아미노산이 부족할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드의 길이는 최소한 109개 아미노산이며, 서열 번호: 1에서 109개 아미노산의 대응하는 구간에 최소한 90%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. GDF15 뮤테인은 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 처음 3개 아미노산이 부족할 수 있다.
예시적인 본 명세서의 폴리펩티드는 도 2에 도시된다. 도 1에 도시된 예시적인 폴리펩티드들 (1 내지 17까지 번호매겨진)는 WT hGDF15와 동일한 길이를 갖는다 도 2에 도시된 예시적인 폴리펩티드들 (18에서 34로 번호 매겨진; 서열 번호: 19-35)은 길이가 109개의 아미노산인데, 그 이유는 이들은 WT hGDF15와 비교하여 3개의 N-말단 아미노산 (ΔN3) 결손을 포함하기 ‹š문이다. 그러나, 아미노산 치환들의 위치를 언급할 때, 표시된 잔기 번호는 WT 성숙한 hGDF15 (WT; 서열 번호: 1)에서 이 위치에 상응하는 것이다. 따라서, 상기 폴리펩티드들의 N-말단에서 아미노산 G는 상기 폴리펩티드 아미노산 서열에서 첫번째 아미노산이지만, 잔기 4로 지칭된다.
상기에서 명시된 바와 같이, 이들 폴리펩티드 단편은 서열 번호: 1의 서열과 비교하여 N-당화 콘센수스 서열을 도입시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 이를 테면, 본 명세서에서 공개된 하나, 둘, 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 포함할 수 있다.
상기에서 나타내고, 하기에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 명세서의 폴리펩티드는 예를 들면, 페길화 (하나 또는 그 이상 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이의 유도체들의 공유적 부착); 당화 (가령, N-당화); 폴리시알화; 혈청 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시아노 혈청 알부민, 또는 소의 혈청 알부민 (BSA)이 포함된 알부민 융합 분자); 예를 들면, 접합된 지방산 쇄를 통한 알부민 결합; Fc-융합; 그리고 PEG 모방체와의 융합을 통하여 변형될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 변형들은 부위-특이적 방식으로 도입된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 변형들은 링커를 포함한다. 상기 링커는 변형 모이어티를 상기 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 알부민의 접합에 의해 성숙한 인간 GDF15 및 GDF15 뮤테인 (이를 테면 상기에서 설명된 폴리펩티드들)의 변형을 고려한다. 다른 구체예들에 있어서, 본 명세서는 N-당화 또는 O-당화를 통하여 상기 폴리펩티들의 변형을 고려한다. 알부민과 이의 폴리펩티드 접합물 (가령, 융합 단백질), 그리고 당화된 폴리펩티드들의 특징은 하기에서 더욱 설명된다.
GDF15 기능을 변형시키고 및/또는 모방하기 위한 특정 변형들
폴리펩티드는 요법을 위하여 제형화된 단백질에서 바람직한 성질(가령, 혈청 반감기)을 강화시키고, 탐지 분석 (가령, 에피토프 테그)에 이용을 위한 항체 생성을 가능하게 하고, 단백질 정제의 용이성, 등을 제공하는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 페길화 (하나 또는 그 이상 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이의 유도체들의 공유적 부착); 당화 (N- 및 O-연계된); 폴리시알화; 알부민 융합; 예를 들면, 접합된 지방산 쇄를 통한 알부민 결합; Fc-융합; 그리고 PEG 모방체와의 융합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 제시된 바와 같이, 본 명세서는 성숙한 GDF15 폴리펩티드 (가령, 성숙한 인간 GDF15) 또는 GDF15 뮤테인 폴리펩티드 (가령, 성숙한 인간 GDF15의 뮤테인)을 포함하는 융합 분자들을 고려하고, 이때 상기 성숙한 GDF15 폴리펩티드 또는 GDF15 뮤테인 폴리펩티드는 이의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 최소한 한 가지 변형을 포함하며, 그리고 이때 상기 변형으로 상기 폴리펩티드 또는 뮤테인 폴리펩티드의 최소한 한 가지 물리적 성질이 개선된다. 한 구체예에 있어서, GDF15 폴리펩티드 또는 GDF15 뮤테인 폴리펩티드 변형은 혈청 알부민 (가령, 인간 혈청 알부민 (HSA), 시아노 혈청 알부민, 또는 소의 혈청 알부민 (BSA))과의 접합을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 물리적 성질은 용해도이다.
융합 분자가 변형된 GDF15 폴리펩티드 또는 GDF15 뮤테인 (이를 테면 상기에서 설명된 폴리펩티드들)을 포함하는 구체예들에 있어서, 이들중 하나가 알부민에 접합되면, 접합안된 재조합 인간 GDF15와 비교하여 융합 분자의 용해도는 일반적으로 개선된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 융합 분자는 인산염 완충된 염수 (PBS), pH 7.0에서 최소한 1 mg/ml의 용해도를 갖는다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 분자는 최소한 2 mg/mL, 최소한 3 mg/mL, 최소한 4 mg/mL, 또는 최소한 5 mg/mL의 용해도를 갖는다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 분자는 인산염 완충된 염수 (PBS), pH 7.0에서 최소한 6 mg/ml의 용해도, 최소한 7 mg/mL, 최소한 8 mg/mL, 최소한 9 mg/mL, 또는 최소한 10 mg/mL의 용해도를 갖는다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 융합 분자는 10 mg/mL이상의 용해도를 갖는다.
페길화: 단백질 치료요법적의 임상적 효과는 프로테아제 분해에 민감성으로 인하여 대개 제한된다. 다양한 치료요법적 단백질 (가령, 과립구집락자극인자)의 연구는 상기 폴리펩티드 서열을 임의의 다양한 비단백질 폴리머, 가령, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 (예를 들면, 통상적으로 단백질과 비단백질성 폴리머, 가령, PEG 모두에 공유적으로 결합된 연결 모이어티를 통하여)에 접합 또는 연계시키는 것을 포함하는 다양한 변형에 의해 이러한 난점들이 극복될 수 있음을 보여주었다. 이러한 PEG-접합된 생체분자들은 더 나은 물리적 및 열적 안정성, 효소 분해에 민감성에 대한 보호, 증가된 용해도, 더 긴 생체내 순환하는 반감기 및 감소된 제거, 환원된 면역원성 그리고 항원성, 그리고 환원된 독성이 포함된 임상적으로 유용한 성질들을 보유하는 것으로 나타났다.
폴리펩티드 서열에 접합시키기는데 적합한 PEGs는 일반적으로 실온에서 물에 용해되며, 그리고 일반식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 갖고, 이때 R은 수소 또는 보호기, 이를 테면 알킬 또는 알카놀기이며, 그리고 이때 n은 1 내지 1000의 정수다. R이 보호기인 경우, 일반적으로 1 내지 8개의 탄소를 갖는다. 상기 폴리펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분기형일 수 있다. 분기화된 PEG 유도체들, ＂별모양(star)-PEGs＂ 및 다수의 팔(armed)이 있는 PEGs가 본 명세서에서 고려된다. 본 명세서에서 이용된 PEG의 분자량은 임의의 특정 범위에 국한되지 않지만, 그러나 특정 구체예들은 500 내지 20,000의 분자량을 갖고, 한편 다른 구체예들은 4,000 내지 10,000의 분자량을 갖는다.
본 명세서는 또한 접합 조성물을 고려하는데, 이때 PEGs는 상이한 n 값을 갖고, 따라서 상이한 다양한 PEGs들이 특정 비율로 존재한다. 예를 들면, 일부 조성물들은 접합 혼합물을 포함하고, 이때 n=1, 2, 3 및 4이다. 일부 조성물들에 있어서, n=1인 경우 접합물의 백분율은 18-25%이며, n=2인 경우 접합물의 백분율은 50-66%이며, n=3인 경우 접합물의 백분율은 12-16%이며, 그리고 n=4인 경우 접합물의 백분율은 최대 5%이다. 이러한 조성물들은 반응 조건들과 당분야에 공지된 정제 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 접합물을 분리시킬 수 있고, 그리고 예를 들면, 바람직한 수의 부착 PEGs를 갖는 접합물이 포함된 분획이 확인되고, 변형안된 단백질 서열과 다른 수의 부착된 PEGs를 갖는 접합물로부터 정제될 수 있다.
PEG는 말단 반응성 기(group)를 통하여 본 명세서의 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 상기 말단 반응성 기는 하나 또는 그 이상의 상기 폴리펩티드 서열의 자유 아미노 또는 카르복실기와 폴리에틸렌 글리콜 사이에 결합을 중재할 수 있다. 상기 말단 반응성 기는 별개-길이의 폴리에틸렌 글리콜 스페이스(spacer)에 부착될 수 있다. 이들 PEG 스페이스는 시약 및 접합물 용해도를 증가시키고, 비-PEG 스페이스와 비교하여 독성 및 면역학적 효과를 최소화시키고, 그리고 PEG와 폴리펩티드 사이의 특정 가교 거리를 조절하기 위한 몇 가지 선택권을 제공한다. 반응성 기들을 가진 예시적인 PEG 스페이스는 아민-반응성 페길화된 가교 (가령, 비스(숙시니미딜)펜타(에틸렌 글리콜) (BS(PEG)5)); 술프히드릴-반응성 페길화된 가교 (1,11-비스말레이미도트리에틸렌글리콜 (BM(PEG)3)); 이기능성 페길화된 가교 (NHS-PEGn-말레이미드 숙시니미딜-([N-말레이미도프로피오닌아미도]-에틸렌글리콜)에스테르 (SM(PEG)n); n=2-24)를 포함한다. PEG 스페이스는 자유 아미노 기에 결합될 수 있다. PEG 스페이스는 N-히드록시숙시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜이며, 이는 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스테르를 N-히드록시숙시닐이미드로 활성화시킴으로써 준비될 수 있다. 자유 아미노 기에 결합될 수 있는 또다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진이며, 이는 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르를 시아누릭 클로라이트와 반응시킴으로써 준비될 수 있다. 자유 카르복실 기에 결합되는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시에틸렌디아민을 포함한다.
다양한 통상적인 방법들에 의해 스페이스를 가진 PEG에 하나 또는 그 이상의 본 명세서의 폴리펩티드 서열에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 접합 반응은 5 내지 10의 pH, 4℃ 내지 실온의 온도에서 30 분 내지 20 시간 동안 시약과 단백질의 몰 비율 4:1 내지 30:1을 이용하여 용액에서 실행될 수 있다. 상기 반응을 바람직한 수준의 치환이 우세하도록 만드는 반응 조건이 선택될 수 있다. 일반적으로, 저온, 낮은 pH (가령, pH=5), 그리고 짧은 반응 시간은 부착되는 PEGs의 수를 감소시키는 경향이 있고, 한편 높은 온도, 중성 내지 높은 pH (가령, pH≥7), 그리고 더 긴 반응 시간은 부착되는 PEGs의 수를 증가시키는 경향이 있다. 당분야에 공지된 다양한 수단을 이용하여 상기 반응을 종료시킬 수 있다. 일부 구체예들에 있어서 상기 반응은 상기 반응 혼합물을 산성화시키고, 가령, -20℃에서 동결시킴으로써 종료된다.
본 명세서는 PEG 모방체의 사용을 또한 고려한다. PEG의 속성 (가령, 증가된 혈청 반감기)을 유지하고, 한편 몇 가지 추가적인 유익한 성질들을 부여한 재조합 PEG 모방체들이 개발되었다. 예를 들면, PEG 와 유사한 연장된 배열을 형성할 수 있는 단순 폴리펩티드 쇄 (예를 들면, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser 및 Thr)는 관심 대상의 펩티드 또는 단백질(가령, Amunix＇ XTEN technology; Mountain View, CA)에 이미 융합되어 재조합적으로 만들어질 수 있다. 이는 제조 과정 동안 추가적인 접합 단계의 필요성을 제거한다. 더욱이, 확립된 분자 생물학 기술은 상기 폴리펩티드 쇄의 측쇄 조성물의 조절이 가능하고, 면역원성을 최적화시키고, 제작 성질들의 조절을 허용한다.
당화: 본 명세서의 목적을 위하여, ＂당화＂는 단백질, 지질 또는 다른 유기 분자에 글리칸을 부착시킨 효소 과정을 광범위하게 지칭한다. 본 명세서와 관련하여 용어 ＂당화＂의 사용은 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티를 추가 또는 결손시킴으로써 (근본적인 당화 부위를 제거함으로써, 또는 화학적 및/또는 효소 수단에 의해 당화를 제거함으로써), 및/또는 고유한 서열에 존재할 수 있는 또는 없는 하나 또는 그 이상의 당화 부위들을 추가하는 것을 일반적으로 의미한다. 또한, 구절은 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 성질 및 비율에 있어서 변화와 관련된 고유한 단백질의 당화에서 정량적인 변화를 포함한다.
당화는 단백질의 물리적 성질들에 극적으로 영향을 줄 수 있고, 단백질 안정성, 분비, 그리고 준세포(subcellular) 국소화에 또한 중요할 수 있다. 게다가, 본 명세서에서 설명된 GDF15 뮤테인 폴리펩티드들의 당화는 이들의 물리적 성질들에 유익한 개선을 부여한다. 예를 들면, GDF15 뮤테인의 용해도는 당화에 의해 개선될 수 있지만, 이에 국한되지 않고, 그리고 이러한 개선은 실질적일 수 있다 (실시예 참고). 본 명세서에서 설명된 당화된 GDF15 뮤테인 폴리펩티드들은 당화되지 않은 야생형 GDF15와 비교하여 더 높은 용해도를 갖는다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 당화된 GDF15 뮤테인은 완충액 용액 안에 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 갖는다. 특정 경구들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 당화된 GDF15 뮤테인은 완충액 용액 안에 최소한 0.5 mg/ml의 용해도, 가령, 최소한 1 mg/ml, 최소한 2 mg/ml, 최소한 3 mg/ml, 최소한 4 mg/ml, 최소한 5 mg/ml, 최소한 8 mg/ml, 최소한 10 mg/ml, 최소한 15 mg/ml, 최소한 20 mg/ml, 또는 최소한 25 mg/ml, 예를 들면 0.5mg/ml 내지 25 mg/ml, 0.5mg/ml 내지 20 mg/ml, 1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 3 mg/ml 내지 25 mg/ml, 3 mg/ml 내지 20 mg/ml, 5 mg/ml 내지 25 mg/ml, 5 mg/ml 내지 20 mg/ml, 또는 5 mg/ml 내지 18 mg/ml 범위의 용해도를 가질 수 있다. 상기 완충액은 인산염 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MOPS 완충액, PIPES 완충액, 또는 이와 유사한 것들, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 특정 경구들에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨 및 염화나트륨을 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 완충액은 트리스, 인산칼륨염, 염화나트륨, 및 포름산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 완충액은 10 mM-100 mM 트리스 pH7, 1 mM-50 mM 인산칼륨염, 100 mM-200 mM 염화나트륨, 그리고 10 mS/cm-30 mS/cm 포름산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 공개된 당화된 GDF15 뮤테인 폴리펩티드들은 야생형 성숙한 GDF15 폴리펩티드보다 우수하다. 이들 당화된 GDF15 뮤테인 폴리펩티드들은 야생형 성숙한 GDF15 폴리펩티드와 비교하여 다음중 하나 또는 그 이상이 포함된 개선된 특징들을 갖는다: 세포 배양물에서 더 큰 수율, 개선된 이량체 형성, 더 큰 용해도, 그리고 환원된 면역원성. 이러한 변형된 GDF15 뮤테인에 의해 나타난 용해도 개선은 예를 들면, 비-당화된 GDF15/GDF15 뮤테인보다 약학적 투여에 더 적합한 조제물을 생성하게 할 수 있다. 당화된 GDF15/GDF15 뮤테인 폴리펩티드들은 또한 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 더욱이, 상기 폴리펩티드들은 하나 또는 그 이상의 약리역학적 성질들, 이를 테면 반감기를 개선시킬 수 있다.
당화 부위들의 추가는 상기에서 설명된 바와 같이 아미노산 서열을 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드에 변경은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들 (O-연계된 당화 부위들의 경우) 또는 아스파라긴 잔기들 (N-연계된 당화 부위들의 경우)의 추가 또는 치환에 의해 만들어질 수 있다. N-연계된 그리고 O-연계된 올리고사카라이드의 구조와 각 유형에서 보이는 당 잔기들이 상이해질 수 있다. 이들 모두에서 흔히 발견되는 당의 한 가지 유형은 N-아세틸뉴라민산 (이후 시알산으로 지칭됨)이다. 시알산은 보통 N-연계된 그리고 O-연계된 올리고사카라이드 모두의 말단 잔기이며, 음전하에 의해 당단백질에 산성 성질을 부여할 수 있다. 본 명세서의 특정 구체예는 상기에서 설명된 N-당화 변이체의 생성 및 이용을 포함한다.
상기 폴리펩티드 상에 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 또다른 수단은 상기 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소 결합이다.
디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) - 결함성 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들은 재조합 당단백질의 생산을 위하여 흔히 이용되는 숙주 세포다. 이들 세포는 효소 베타-갈락토시드 알파-2,6-시알일전이효소를 발현시키지 않고, 따라서 이들 세포에서 생산된 당단백질의 N-연계된 올리고사카라이드에 알파-2,6 연계에 시알산을 추가하지 않는다.
폴리시알화: 본 명세서는 이들의 안정성 및 생체내 약리역학을 개선하기 위하여, 자연 발생, 생분해가능한 α-(2→8) 연계된 폴리시알산 (＂PSA＂)에 펩티드 및 단백질의 접합, 폴리시알화의 이용을 또한 고려한다. PSA는 매우 친수성이 높아서 혈액내에 높은 겉보기 분자량을 제공하여, 이의 혈청 반감기를 증가시키는 생분해가능한, 비-독성 천연 폴리머다. 또한, 펩티드와 단백질 치료요법제 범위의 폴리시알화는 상당히 환원된 단백질분해로 이어지고, 생체내 활성 유지 및 면역원성과 항원성에서의 감소로 이어졌다 (가령, G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30 참고). 다른 접합물 (가령, PEG)과의 변형과 마찬가지로, 부위-특이적 폴리시알화를 위한 다양한 기술들이 이용가능하다 (가령, T. Lindhout et al., PNAS 108(18)7397-7402 (2011) 참고).
융합 단백질. 본 명세서는 야생형 성숙한 GDF15 (가령, 인간 GDF15)의 융합 단백질, 뿐만 아니라 본 명세서의 폴리펩티드 (가령, 변형된 인간 GDF15 분자, 인간 GDF15의 뮤테인, 변형된 GDF15 뮤테인, 및 이와 유사한 것들)의 융합 단백질을 고려한다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 비-GDF15 폴리펩티드 (가령, 알부민 (가령, HSA) 또는 이의 단편: 알부민 결합 도메인 (ABD); Fc 폴리펩티드; 말토즈 결합 도메인 (MBD)으로 구성되며, 이는 본 명세서에서 ＂융합 짝＂으로 지칭될 수 있는데, 본 명세서의 야생형 GDF15 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 이의 N-말단 또는 C-말단에 접합된다. 임의선택적으로, 상기 융합 짝은 야생형 GDF15 또는 폴리펩티드에 링커 폴리펩티드를 통하여 접합될 수 있다. 상기 링커 폴리펩티드는 임의선택적으로 절단가능한 링커, 가령, 효소적으로 절단가능한 링커일 수 있다. 융합 짝의 예들은 하기에서 설명된다.
알부민 융합: 접합에 적합한 융합 짝은 알부민, 이를 테면 인간 혈청 알부민 (HSA), 시아노 혈청 알부민, 그리고 소의 혈청 알부민 (BSA)을 포함한다.
~20 일의 혈청 반감기를 갖는 성숙한 HSA, 585개의 아미노산 폴리펩티드 (~67 kDa)는 콜로이드성 삼투성 혈압의 유지, 혈액 pH, 그리고 다수의 내생성 리간드와 외생성 리간드의 운반 및 분포를 주로 담당한다. 상기 단백질은 3개의 구조적으로 동종성 도메인 (도메인 I, II 및 III)을 갖고, 거의 전적으로 알파-나선 형태이며, 그리고 17개의 이황화물 다리에 의해 상당히 안정적이다. 알부민의 3가지 주요 약물 결합 영역은 하위-도메인 IB, IIA 및 IIIA 안에 3개 도메인 각각에 위치한다.
알부민 합성은 간에서 일어나며, 간에서 짧은-수명의 일차 산물 프레프로알부민이 생산된다. 따라서, 전장 HSA는 신호 펩티드, 18개 아미노산, 이어서 프로-도메인, 6개 아미노산을 갖고; 이 24개의 아미노산 잔기 펩티드는 프레-프로(pre-pro) 도메인으로 지칭될 수 있다. HSA는 프레-프로-도메인으로써 이의 내생성 신호 펩티드를 이용하여 발현되고, 분비될 수 있다. 대안으로, HSA는 성숙한 HSA에 융합된 IgK 신호 펩티드를 이용하여 발현되고, 분비될 수 있다. 프레프로알부민은 세포질세망 안에서 이의 아미노 말단에서 신속하게 공동-해독에 의해 절단되어 안정적인 609개-아미노산 전구물질 폴리펩티드, 프로알부민이 생성된다. 그다음 프로알부민은 골지(Golgi) 체로 넘겨지고, 여기에서 퓨린-의존적 아미노-말단 절단에 의해 585개 아미노산의 성숙한 알부민으로 전환된다. 다른 언급이 없는 한, ＂알부민＂ 또는 ＂성숙한 알부민＂은 HSA를 지칭한다.
알부민의 일차 아미노산 서열, 구조, 그리고 기능은 알부민 합성 및 분비의 공정으로써, 종간에 상당히 보존된다. HSA에 필적되는 알부민 혈청 단백질은 예를 들면, 게먹이 원숭이, 소, 돼지, 토끼 그리고 렛에서 발견된다. 비-인간 종의 소의 혈청 알부민 (BSA)이 가장 구조적으로 HSA와 유사하다. [가령, Kosa et al., J Pharm Sci. 96(11):3117-24 (Nov 2007) 참고]. 본 명세서는 비-인간 종에서 유래된 알부민, 예를 들면 상기에서 제시된 것들을 포함하나 이에 국한되지 않은 것들을 예를 들면, GDF15 폴리펩티드의 융합에서의 용도를 고려한다. 특정 구체예들에 있어서, 비-인간 종은 소이다. 다른 구체예들에 있어서, 비-인간 종은 게먹이 원숭이(cynomolgus monkey)다.
본 명세서에 따르면, 알부민은 약물 분자 (가령, 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드)의 카르복실 말단에서, 아미노 말단에서, 카르복실 말단과 아미노 말단 둘 다에서, 또는 내부적으로 접합될 수 있다 (가령, USP 5,876,969 및 USP 7,056,701 참고). 더욱이, 본 명세서는 하나 이상의 동종성 (가령, 다중 GDF15 뮤테인 분자) 또는 이종성 (가령, GDF15 뮤테인 분자 및 구별되는 항-당뇨가 있는 물질) 약물 분자를 포함하는 알부민 융합 단백질을 고려한다.
본 명세서에서 고려되는 HSA - 폴리펩티드 접합물에서, 다양한 형태의 알부민, 이를 테면 HSA 변이체, 이를 테면, 단편들이 이용될 수 있다. 이러한 형태들은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 바람직한 알부민 활성을 보유한다. 추가적인 구체예들에 있어서, 본 명세서는 알부민, 알부민 단편, 그리고 알부민 변이체, 등에 직접 또는 간접적으로 융합된 폴리펩티드 약물 분자가 포함된 융합 단백질에 관련되며, 이때 상기 융합 단백질은 융합안된 약물 분자보다 더 높은 혈장 안정성을 갖고 및/또는 상기 융합 단백질은 융합안된 약물 분자의 치료요법적 활성을 유지한다. 일부 구체예들에 있어서, 간접 융합은 링커, 이를 테면 펩티드 링커 또는 이의 변형된 형태에 의해 초래된다.
HSA는 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드에 링커를 통하여 접합되어, 융합 단백질이 생성될 수 있다. 적합한 링커들의 예들은 본 명세서에서 설명된다. 일부 구체예들은 예를 들면, 4-내지-30개의 아미노산의 펩티드 링커를 고려한다.
상기 융합 단백질이 링커를 포함하는 구체예들에 있어서, 링커는 절단불가능한 링커일 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에 있어서 본 명세서는 융합 분자를 설명하고, 이때 HSA 전구물질 아미노산 서열 또는 성숙한 HSA는 절단불가능한 (G4S)3 링커를 통하여 성숙한 인간 GDF15 또는 GDF15 뮤테인 아미노산 서열의 N-말단에 융합된다.
상기 융합 단백질이 링커를 포함하는 다른 구체예들에 있어서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 예를 들면, 본 명세서는 융합 분자를 고려하는데, 이때 HSA 전구물질 아미노산 서열 또는 성숙한 HSA 아미노산 서열은 프로테아제-민감성 (G4S)2 인자 Xa-절단가능한 링커를 통하여 본 명세서에서 제공되는 성숙한 인간 GDF15 또는 GDF15 뮤테인 아미노산 서열의 N-말단에 융합된다.
HSA-절단가능한 링커-성숙한 재조합 GDF15/GDF15 뮤테인 분자의 구성, 뿐만 아니라 성숙한 재조합 GDF15/GDF15 뮤테인-절단가능한 링커-HSA 융합 분자의 구성은 예를 들면, 용해도의 평가 및 GDF15/GDF15 뮤테인의 생체내 효과 결정을 실행하는데 이용될 수 있다. 이러한 구체예들에 있어서, GDF15/GDF15 뮤테인은 세포내 절단을 통하여 또는 시험관내 효소 절단을 통하여 HSA 보호물(chaperone)로부터 잘라낼 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 절단은 임의의 생존가능 프로테아제를 이용하여 절단가능한 링커의 단백질분해성 절단에 의해 이루어진다. 다른 구체예들에 있어서, GDF15 뮤테인은 본 명세서에서 제공된 폴리펩티드에 융합된 신호 펩티드의 구조를 통하여 비-HSA 융합으로 또한 생성될 수 있다.
세포내 절단은 예를 들면, 퓨린 또는 카스파제에 의해 효소적으로 실행될 수 있다. 상기 융합 단백질을 발현시키는 숙주 세포는 상기 융합 분자의 일부를 세포내에서 절단할 수 있는이들 내생성 효소를 낮은 수준으로 발현시킬 수 있고; 따라서, 상기 폴리펩티드들의 일부는 HSA에 접합되지 않고 세포로부터 방출되는 한편, 상기 폴리펩티드들의 일부는 HSA를 포함하는 융합 분자의 형태로 방출된다. 본 명세서의 구체예들은 다양한 퓨린 융합 구조체의 용도를 고려한다. 예를 들면, 구조체는 서열 RGRR (서열 번호: 36), RKRKKR (서열 번호: 37), RKKR (서열 번호: 38), 또는 RRRKKR (서열 번호: 39)을 포함하도록 기획될 수 있다. 이러한 구조체들은 다음의 일반적인 구조를 가질 수 있다: Igk-HSA-(G4S)2-퓨린 서열-hGDF15.
본 명세서는 세포외 절단 (가령, 생체외(ex-vivo) 절단)을 또한 고려하는데, 이로 인하여 상기 융합 분자는 세포로부터 방출되고, 정제를 겪고, 그 다음 절단된다 (가령, 예를 들면, 인자 Xa 단백질분해-민감성 링커 또는 엔테로키나제를 이용). 상기 절단은 상기 폴리펩티드 (가령, 성숙한 GDF15 또는 GDF15 뮤테인)로부터 전체 HSA-링커 복합체를 해리시키거나, 또는 전체 HSA-링커 복합체보다 적게 해리시킬 수 있다는 것으로 이해된다.
상기에서 설명된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 본 명세서의 폴리펩티드에 알부민의 융합은 예를 들면, 유전적 조작에 의해 이루어질 수 있고, HSA, 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA에 연결된다. 그 다음, 적합한 숙주는 융합 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, 적합한 플라스미드 형태의 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질변환되거나 또는 형질감염될 수 있다. 상기 발현은 예를 들면, 원핵 세포 또는 진핵 세포들로부터 시험관내, 또는 예를 들면, 유전자삽입 유기체에서 생체내로 야기될 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질의 발현은 포유류 세포 계통, 예를 들면, CHO 세포 계통에서 실행된다. 형질전환은 주변으로부터 외생성 유전 물질 (외생성 DNA)의 직접 취입, 혼입 및 발현 그리고 세포 막(들)을 통하여 취입으로 인하여 발생된 세포의 유전적 변경을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 광범위하게 이용된다. 형질전환은 일부 박테리아 종에서 자연적으로 발생되지만, 다른 세포들에서 인위적 수단에 의해 또한 야기될 수 있다.
더욱이, 알부민 자체가 변형되어 이의 순환 반감기가 변경될 수 있다. 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드에 변형된 알부민의 융합은 상기에서 설명된 유전적 조작/재조합 기술에 의해 또는 화학적 접합에 의해 획득될 수 있고; 생성된 융합 분자는 비-변형된 알부민과의 융합의 경우를 초과하는 반감기를 갖는다. (가령, WO2011/051489 참고).
폴리펩티드들 (가령, 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드) 및 재조합 알부민의 유전적 융합 및 화학적 접합을 위하여 잘 확립된 기술 플랫포옴이 존재한다. 예를 들면, ALBUFUSE® 플렉스 플랫포움 (Novozymes Biopharma A/S; Denmark) 을 이용하여 하나 또는 그 이상의 재조합 알부민 분자를 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들에 유전적 융합을 야기할 수 있고, 이로 인하여 상기 폴리펩티드(들)과 알부민(들)을 인코드하는 연속 cDNA가 생성되어 단일 동종성 단백질이 생산된다. 이 플랫포옴은 예를 들면, 효모와 포유류 숙주 발현 시스템과 함께 이용될 수 있다. 추가 예로써, RECOMBUMIN® Flex 플랫포옴 (Novozymes Biopharma A/S; Denmark)을 이용하여 알부민의 임의의 추가 유도화 없이, 본 명세서의 폴리펩티드를 재조합 알부민에 화학적 접합시킬 수 있다. 비록 접합은 몇 개의 아미노산 잔기들 (가령, 리신 및 티로신)에서 실행될 수 있지만, Cys34에서 자유 티올은 더 균질한 최종 산물을 생산하는 부위 특이성으로 인하여 공통적인 전략이다.
대체 알부민 결합 전략: 직접 융합의 대안으로 몇 가지 알부민 - 결합 전략이 개발되었는데, 접합된 지방산 쇄를 통한 알부민 결합 (아실화)이 포함된다. 혈청 알부민은 지방산의 운송 단백질이기 때문에, 알부민 - 결합 활성을 가진 이들 천연 리간드들은 작은 단백질 치료요법제의 반감기 연장에 이용되어왔다. 예를 들면, 당뇨병에 승인된 제품인, 인슐린 데테르미르(determir) (LEVEMIR)는 유전적으로-변형된 인슐린에 접합된 미리스틸 쇄를 포함하여, 장기-작용 인슐린 유사체(analog)가 만들어진다.
본 명세서는 알부민 결합 도메인 (ABD) 폴리펩티드 서열과 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 또한 고려한다. 본 명세서에서 설명된 또는 문헌에서 설명된 임의의 ABD 폴리펩티드 서열은 상기 융합 단백질의 성분일 수 있다. 상기 융합 단백질의 성분들은 링커, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 링커들을 통하여 임의선택적으로 공유 결합될 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 N-말단 모이어티로써 ABD 폴리펩티드 서열과 C-말단 모이어티로써 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서는 실질적으로 알부민 결합을 유지하는 알부민 결합 폴리펩티드의 단편이 포함된 융합 단백질; 또는 알부민 결합 폴리펩티드들 또는 최소한 2개의 알부민 결합 폴리펩티드들이 포함된 이들 단편의 다량체 또는 단량체 단위로써 이들 단편들을 또한 고려한다.
임의의 이론에 결부되는 것을 원하지는 않지만, 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드는 ABD 폴리펩티드 서열에 결합되고, 이로 인하여 대상에서 상기 폴리펩티드들이 격리되어, 대상에서 작용기간이 증가되는 것으로 보인다.
ABD 및 관련 기술에 대한 전반적인 논의는 WO 2012/050923, WO 2012/050930, WO 2012/004384 및 WO 2009/016043을 참고한다.
말토즈 결합 단백질 또는 이의 단편들과의 융합 단백질: 본 명세서는 말토즈 결합 단백질 (MBP), 또는 이의 단편, 그리고 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 또한 고려한다. 일부 구체예들에 있어서, MBP 단편은 말토즈 결합 도메인 (MBD)을 포함한다. 본 명세서에서 설명된 또는 당분야에 공지된 임의의 MBP, 또는 이의 단편, 또는 MBD 폴리펩티드 서열은 본 명세서의 융합 단백질의 성분일 수 있다. 상기 융합 단백질의 성분들은 링커, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 링커들을 통하여 임의선택적으로 공유 결합될 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 N-말단 모이어티로써 MBP, 또는 이의 단편, 또는 MBD 폴리펩티드 서열과 C-말단 모이어티로써 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서는 실질적으로 말토즈 결합 활성을 유지하는 MBP 또는 MBD 폴리펩티드; 또는 말토즈 결합 폴리펩티드들 또는 최소한 2개의 말토즈 결합 폴리펩티드들 또는 이의 단편들이 포함된 이들 단편의 다량체 또는 단량체 단위(가령, 2개 또는 그 이상의 MBD 폴리펩티드들)로써 이들 단편들(가령, MBD의 다랑체)을 또한 고려한다.
MBP 및 MBD 그리고 관련 기술에 대한 전반적인 논의는 가령, Kapust et al. (1999) Protein Sci 8(8):1668-74을 참고한다.
Fc 융합 단백질. 본 명세서는 Fc 폴리펩티드 또는 이의 단편, 그리고 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 (가령, 인간 GDF15 분자, 변형된 인간 GDF15 분자, GDF15 뮤테인, 그리고 변형된 GDF15 뮤테인)의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 또한 고려한다. 본 명세서에서 설명된 또는 당분야에 공지된 임의의 Fc 폴리펩티드 서열은 본 명세서의 융합 단백질의 성분일 수 있다. 상기 융합 단백질의 성분들은 링커, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 링커들을 통하여 임의선택적으로 공유 결합될 수 있다. 본 명세서의 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 N-말단 모이어티로써 Fc 폴리펩티드 서열과 C-말단 모이어티로써 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서는 Fc 폴리펩티드 융합 짝들, 그리고 이러한 것들이 포함된 융합 단백질을 또한 고려하는데, 여기에서 Fc 폴리펩티드 융합 짝은 하전된 Fc 쌍의 하나의 짝이 되도록 변형된다. ＂하전된 Fc 쌍의 짝＂이란 (i) ＂음으로 하전된＂ Fc 서열 (임의선택적으로 힌지 영역이 결여된)을 지칭하며, 하전된 쌍 돌연변이을 포함하거나 또는 (ii) ＂양으로 하전된＂ Fc 서열 (임의선택적으로 힌지 영역가 결여된)을 지칭하며, 하전된 쌍 돌연변이를 포함한다. ＂양으로 하전된＂ 그리고 ＂음으로 하전된＂은 Fc 서열에서 전하 쌍 돌연변이의 성질을 설명하기 위한 사용 편의로 이용되며, 그리고 전체 서열 또는 구조체가 반드시 양전하 또는 음전하를 가져야 한다는 것을 나타내는 것은 아니다. 본 명세서의 폴리펩티드 구조체 (가령, GDF15 뮤테인, 변형된 GDF15 뮤테인)에 이용되는데 적합한 하전된 Fc 아미노산 서열은 예를 들면 WO 2013/113008에서 설명된다.
양으로 하전된 Fc (＂Fc(+)＂)의 예로는 힌지 영역이 결여된 Fc 서열의 아스파르트산이-리신으로의 돌연변이 (E356K) 그리고 글루탐산이-리신으로의 돌연변이 (D399K)가 포함된 Fc를 포함한다. 음으로 하전된 Fc (＂Fc(-)＂)의 예로는 힌지 영역이 결여된 Fc 서열의 2개 리신이-아스파르테이트 돌연변이 (K392D, K409D)가 포함된 Fc를 포함한다. C-말단 리신 (K477)은 또한 임의선택적으로 결손될 수 있다. Fc(+)폴리펩티드 융합 단백질 (가령, Fc(+)GDF15 뮤테인 융합 단백질) 및 Fc(-)폴리펩티드 융합 단백질 (가령, Fc(-)GDF15 뮤테인 융합 단백질)을 함께 항온처리할 때, 아스파르테이트 잔기들은 정전기력에 의해 리신 잔기들과 연합되어, GDF15 폴리펩티드 융합 단백질의 Fc(+) 서열과 Fc(-) 서열 사이에 Fc 이종이량체 형성이 촉진된다.
본 명세서는 ＂hemi＂ 또는 ＂hemiFc＂ 구조체로 지칭된 구조체를 또한 고려하는데, 이것은 제 1 Fc 서열의 N-말단을 제 2 Fc 서열의 C-말단에 연결시키는 링커에 의해 나란하게 연결된 2개의 Fc 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 단량체는 GDF15 서열의 N-말단을 제 1 Fc 서열의 C-말단에 연결시키는 제 1 링커에 의해 제 1 Fc 서열에 연계된 폴리펩티드 (가령, 성숙한 변형된 GDF15 또는 뮤테인 GDF15)를 포함하고, 이때 제 1 Fc 서열은 1 Fc 서열의 N-말단을 제 2 Fc 서열의 C-말단에 연결시키는 제 2 링커에 의해 제 2 Fc 서열에 연계된다. 제 1 및 제 2 Fc 서열은 또한 Fc 힌지 영역에 의해 연합된다. 이러한 2개 단량체는 연합되어 이량체를 형성하고, 이때 단량체는 상기 2개 폴리펩티드 서열 사이에 쇄간 이황화물 결합을 통하여 연계된다. 본 명세서의 GDF15 뮤테인과 사용에 적합한 hemiFc 폴리펩티드들의 예들은 WO 2013/113008에서 볼 수 있다.
본 명세서는 Fc 폴리펩티드들의 다량체, 또는 하전된 Fc 쌍의 짝 (가령, Fc의 다량체)이 포함된 이의 단편들의 다량체를 갖는 융합 단백질을 또한 고려한다.
다른 분자와의 접합: 접합을 위한 추가적인 적합한 성분들과 분자는 예를 들면, 티로글로불린; 파상풍 독소; 디프테리아 독소; 폴리아미노산, 이를 테면 폴리(D-리신:D-글루탐산); 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드들; 인플루엔자인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵단백질; 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH); 그리고 간염 B 바이러스 핵 단백질 및 표면 항원; 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함한다.
따라서, 본 명세서는 폴리펩티드 서열, 이를 테면 또다른 단백질 (가령, 대상 단백질에 이종성인 아미노산 서열을 갖는 단백질), 또는 운반체 분자의 N- 및/또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 추가적인 성분들 또는 분자의 접합을 고려한다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 서열은 또다른 성분 또는 분자와의 접합물로 제공될 수 있다.
접합물 변형으로 제 2 분자의 추가적인 또는 상보 기능 또는 활성과 함께 활성이 유지된 폴리펩티드 서열이 생성될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 서열은 가령, 용해도, 저장, 생체내 또는 반감기 또는 안정성을 촉진시키고, 면역원성의 감소, 생체내 지연된 또는 조절된 방출 등을 위하여, 분자에 접합될 수 있다. 다른 기능 또는 활성은 접합안된 폴리펩티드 서열과 비교하여 독성이 감소된 접합물, 접합안된 폴리펩티드 서열보다 세포 또는 장기의 유형을 더 효과적으로 표적하는 접합물, 또는질환 본 명세서에서 제시된 바와 같은 장애 또는 질환 (가령, 당뇨병)과 연합된 원인 또는 영향과 더 잘 싸우는 약물을 포함한다.
폴리펩티드는 크고 서서히 대사되는 마크로분자, 이를 테면 단백질; 다당류, 이를 테면 세파로스, 아가로스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 비드; 폴리머 아미노산 이를 테면 폴리글루탐산, 폴리리신; 아미노산 코폴리머; 비활성화된 바이러스 입자들; 비활성화된 박테리아 독소, 이를 테면 디프테리아, 파상풍, 콜레라의 톡소이드, 류코톡신 분자; 비활성화된 박테리아; 그리고 수지상 세포들에 또한 접합될 수 있다. 바람직하다면 이러한 접합된 형태를 이용하여 본 명세서의 폴리펩티드에 대항하는 항체들을 만들 수 있다.
접합을 위한 추가적인 후보 성분들과 분자는 단리 또는 정제에 적합한 것들을 포함한다. 특정 비-제한적인 예들로써 결합 분자, 이를 테면 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 고형 지지물, 예를 들면, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비드, 플레이트 또는 비드, 자석 비드, 시험 스트립, 그리고 막을 포함하는 고형 지지물이 포함된 분자를 포함한다.
정제 방법, 이를 테면 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 전하 차이에 의해 접합물을 분리시킬 수 있는데, 이로써 접합물은 이들의 다양한 분자량으로 효과적으로 분리된다. 예를 들면, 양이온 교환 컬럼이 로딩되고, 그 다음 ~20 mM 아세테이트 나트륨, pH ~4으로 세척되고, 그리고 pH 약 3 내지 5.5, 가령, pH ~4.5에서 완충된 선형 (0 M 내지 0.5 M) NaCl 구배로 용리된다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 획득된 분획 내용물은 통상적인 방법, 예를 들면, 질량분광, SDS-PAGE, 또는 분자량에 의해 분자 엔터티를 분리시키는 다른 공지의 방법을 이용하여 분자량에 의해 식별될 수 있다.
다른 변형들: 본 명세서는 상기 폴리펩티드들의 하나 또는 그 이상의 성질들을 개선시키기 위하여 현재 알려진 또는 미래에 개발될 다른 변형의 사용을 고려한다. 본 명세서의 폴리펩티드의 순환 반감기를 연장시키고, 안정성을 증가시키고, 제거를 감소시키고, 또는 면역원성 또는 알레르기항원성을 변경시키는 이러한 방법중 하나는 분자의 특징을 변형시키기 위하여 다른 분자에 연계된 히드록시에틸 전분 유도체를 이용하는, 헤실화에 의해 상기 폴리펩티드 서열의 변형과 관련된다. 헤실화의 다양한 측면들은 예를 들면, U.S. 특허 출원 번호 2007/0134197 및 2006/0258607에서 설명된다.
본 명세서는 융합 테그 (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA)로써 SUMO가 포함된 융합 분자를 또한 고려한다. 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 SUMO에 융합시키면, 몇 가지 유익한 효과, 가령, 발현 강화, 용해도에서 개선, 및/또는 정제 방법의 개발에 도움이 되는 것과 같이 폴리펩티드에 몇 가지 유익한 효과를 전달할 수 있다. SUMO 프로테아제는 SUMO의 3차 구조를 인지하고, SUMO의 C-말단에서 상기 융합 단백질을 절단하고, 따라서 바람직한 N-말단 아미노산을 갖는본 명세서에서 설명된 폴리펩티드가 방출된다.
링커: 본 명세서의 폴리펩티드 서열들을 변형시키기 위하여 이용되는 전술한 성분들 및 분자들중 임의의 것은 임의선택적으로 링커를 통하여 접합될 수 있다. 적합한 링커들은 상기 변형된 폴리펩티드 서열과 연계된 성분들 및 분자 사이에 약간의 움직임을 허용하기 위한 일반적으로 충분한 길이를 가진 ＂유연성(flexible) 링커＂를 포함한다. 상기 링커 분자는 약 6-50개 원자 길이가 될 수 있다. 상기 링커 분자는 예를 들면, 아릴 아세틸렌, 2-10개의 단량체 단위가 포함된 에틸렌 글리콜 올리고머, 디아민, 이산(diacids), 아미노산, 또는 이의 조합이 포함된 에틸렌 글리콜 올리고머가 또한 될 수 있다. 적합한 링커들은 용이하게 선택될 수 있고, 임의의 적합한 길이, 이를 테면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50개의 아미노산일 수 있다.
예시적인 유연성 링커들은 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 글리신-세린 폴리머 (예를 들면, (GmSo)n, (GSGGS)n, (GmSoGm)n, (GmSoGmSoGm)n, (GSGGSm)n, (GSGSmG)n 및 (GGGSm)n, 그리고 이의 조합 및 다른 유연성 링커를 포함하며, 여기에서 m, n, 그리고 o는 각각 독립적으로 최소한 1 내지 20의 정수, 가령, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 또는 10)에서 선택된다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 비구조화되며, 따라서 성분들간에 중성 밧줄(tether)로써 역할을 할 수 있다. 예시적인 유연성 링커는 GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG, 그리고 GSSSG를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
추가적인 유연성 링커들은 글리신 폴리머 (G)n 또는 글리신-세린 폴리머 (가령, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n과 (GGGGS)n를 포함하며, 이때 n=1 내지 50, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50)이다. 예시적인 유연성 링커는 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: GGGS (서열 번호: 40), GGGGS (서열 번호: 41), GGSG (서열 번호: 42), GGSGG (서열 번호: 43), GSGSG (서열 번호: 44), GSGGG (서열 번호: 45), GGGSG (서열 번호: 46), 그리고 GSSSG (서열 번호: 47). 이들 링커 서열의 다량체 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 또는 30-50)는 함께 서로 연계되어 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드들에 이종성 아미노산 서열을 접합시키는데 이용될 수 있는 유연성 링커를 제공한다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 이종성 아미노산 서열은 신호 서열 및/또는 융합 짝, 이를 테면, 알부민, Fc 서열, 및 이와 유사한 것들일 수 있다.
링커의 예로는 가령, (GGGGS)n를 포함하는데, 이때 n은 1 내지 약 10의 정수 (가령, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10); GGGSGGGSIEGR (서열 번호: 48); GGGGG (서열 번호: 49); EGGGS (서열 번호: 50)를 포함한다.
일부 경우에 있어서, 상기 링커는 절단가능한 링커, 가령, 효소적으로 절단가능한 링커일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 상기 링커는 절단불가능한 링커, 가령, 생체내 정상적인 생리학적 조건하에서 효소에 의해 절단되지 않는 링커일 수 있다.
예를 들면, 상기 단백질분해에 의해 절단가능한 링커는 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP) 절단 부위, 가령, 콜라게나제-1, -2, 및 -3 (MMP-1, -8, 및 -13), 겔라티나제 A 및 B (MMP-2 및 -9), 스트로메리신 1, 2, 및 3 (MMP-3, -10, 및 -11), 매트릴리신 (MMP-7), 및 막 금속단백질분해효소 (MT1-MMP 및 MT2-MMP)로 선택된 MMP의 절단 부위를 포함할 수 있다. MMP-9의 절단 서열은 Pro-X-X-Hy (이때, X는 임의 잔기이며; Hy, 소수성 잔기) (서열 번호: 51), 가령, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr) (서열 번호: 52), 가령, Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser (서열 번호: 53) 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr (서열 번호: 54)이다. 프로테아제 절단 부위의 또다른 예는 플라스미노겐 활성물질 절단 부위, 가령, 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성물질 (uPA) 또는 조직 플라스미노겐 활성물질 (tPA) 절단 부위다. uPA 및 tPA의 절단 서열의 특정 예는 Val-Gly-Arg가 포함된 서열을 포함한다. 또다른 예는 트롬빈 절단 부위, 가령, CGLVPAGSGP (서열 번호: 55)이다. 프로테아제 절단 부위들이 포함된 추가 적합한 링커들은 다음의 아미노산 서열들중 하나 또는 그 이상이 포함된 링커들을 포함한다: 1) 카텝신 B에 의해 절단된 SLLKSRMVPNFN (서열 번호: 56) 또는 SLLIARRMPNFN (서열 번호: 57); 입스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 프로테아제에 의해 절단된 SKLVQASASGVN (서열 번호: 58) 또는 SSYLKASDAPDN (서열 번호: 59); MMP-3 (스트로메리신)에 의해 절단된 RPKPQQFFGLMN (서열 번호: 60); MMP-7 (마트릴리신)에 의해 절단된 SLRPLALWRSFN (서열 번호: 61); MMP-9에 의해 절단된 SPQGIAGQRNFN (서열 번호: 62); 테레모리신-유사 MMP에 의해 절단된 DVDERDVRGFASFL (서열 번호: 63); 매트릭스 메탈로프로테아제매트릭스 메탈로프로테아제 2(MMP-2)에 의해 절단된 SLPLGLWAPNFN (서열 번호: 64); 카텝신 L에 의해 절단된 SLLIFRSWANFN (서열 번호: 65); 카텝신 D에 의해 절단된 SGVVIATVIVIT (서열 번호: 66); 매트릭스 메탈로프로테아제 1(MMP-1)에 의해 절단된 SLGPQGIWGQFN (서열 번호: 67); 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성물질에 의해 절단된 KKSPGRVVGGSV (서열 번호: 68); 막 유형 1 매트릭스메탈로프로테아제 (MT-MMP)에 의해 절단된 PQGLLGAPGILG (서열 번호: 69); 스트로메리신 3 (또는 MMP-11), 테레모리신, 섬유아세포 콜라게나제 및 스트로메리신-1에 의해 절단된 HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT (서열 번호: 70) ; 매트릭스 메탈로프로테아제 13 (콜라게나제-3)에 의해 절단된 GPQGLAGQRGIV (서열 번호: 71); 조직-유형 플라스미노겐 활성물질(tPA)에 의해 절단된 GGSGQRGRKALE (서열 번호: 72); 인간 전립선-특이적 항원에 의해 절단된 SLSALLSSDIFN (서열 번호: 73); 칼리크레인 (hK3)에 의해 절단된 SLPRFKIIGGFN (서열 번호: 74); 호중구 엘라스타제에 의해 절단된 SLLGIAVPGNFN (서열 번호: 75); 그리고 칼파인 (칼슘 활성화된 중성 프로테아제)에 의해 절단된 FFKNIVTPRTPP (서열 번호: 76).
도 3은 본 명세서에서 고려되는 2개의 융합 단백질 M1 (서열 번호: 77) 및 M2 (서열 번호: 78)의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 M1은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로, IgK 신호 서열 (소문자), 이에 융합된 HSA 아미노산 서열 그리고 이에 융합된 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 링커 (밑줄친) 및 성숙한 인간 GDF15의 N-말단(굵은부분)을 포함한다. 융합 단백질 M2는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로, IgK 신호 서열 (소문자), 이에 융합된 HSA 아미노산 서열, 이에 융합된 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 링커 (밑줄친) 그리고 이에 연결된 3-아미노산 (ΔARN) 결손이 포함된 성숙한 인간 GDF15의 N-말단(굵은 부분)을 포함한다.
도 5는 본 명세서에서 고려되는 2개의 융합 단백질 M3 (서열 번호: 79) 및 M4 (서열 번호: 80)의 아미노산 서열을 나타낸다. 융합 단백질 M3은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로, IgK 신호 서열 (소문자), 이에 융합된 HSA 아미노산 서열, 이어서 융합된 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5 링커 (밑줄친), 이에 연결된 3-아미노산 결손 (ΔARN 또는 ΔN3로 표시됨)이 포함된 성숙한 인간 GDF15 아미노산의 N-말단(굵은부분)을 포함한다. 융합 단백질 M4는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로, IgK 신호 서열 (소문자), 이에 융합된 HSA 아미노산 서열, 이에 융합된 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5 링커 (밑줄친), 이에 연결된, 성숙한 hGDF15의 N-말단과 비교하여 6개 아미노산 절두 (ΔARNGDH)가 포함된 성숙한 인간 GDF15 아미노산의 N-말단 (굵은 부분)을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에서 설명된 서열, 폴리펩티드들 및 이량체들을 인코드하는 재조합 핵산 서열들을 또한 고려한다. 특정 구체예들에 있어서, 재조합 핵산은 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 연속 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코드하고, 여기에서 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 상응하는 아미노산과 비교하여 다음의 치환쌍들 중 최소한 한 가지를 갖는다:
i) D5T와 R21N 또는 D5S와 R21N;
ii) R16N과 H18T 또는 R16N과 H18S;
iii) S23N과 E25T 또는 S23N과 E25S;
iv) S50N과 F52T; S50N과 F52S; F52N과 A54T; 또는 F52N과 A54S;
v) Q51N과 R53T; Q51N과 R53S; R53N과 A55T; 또는 R53N과 A55S;
vi) S64N과 H66T; 또는 S64N과 H66S;
vii) K91N과 D93T; K91N과 D93S; D93N과 G95T; 또는 D93N과 G95S;
viii) T94N과 V96T; T94N과 V96S; V96N과 L98T; 또는 V96N과 L98S;
ix) S97N과 Q99T; 또는 S97N과 Q99S; 그리고
x) A106N과 D108T 또는 A106N과 D108S;
이때 상기 치환으로 서열 NXS/T를 갖는 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들이 생성되고, 여기에서 N은 Asn이고; X는 프롤린이외의 아미노산이고; 이어서 Ser (S) 또는 Thr (T)가 이어지고, 그리고 이때 하나 또는 그 이상의 N-연계된 당화 콘센수스 부위들은 발현되었을 때 N-글리칸에 연계된다. 추가 구체예에서, 상기 재조합 핵산은 발현될 때 이량체를 형성하는 폴리펩티드를 인코드한다. 추가 구체예에서, 상기 재조합 핵산은 서열 번호: 1과 비교하여 N-말단 절두 및/또는 C-말단 절두를 갖는 폴리펩티드를 인코드한다. 상기 절두는 참조 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 1과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 이상의 아미노산이 될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 상기 재조합 핵산은 GDF15에서 처음 3개의 N-말단 잔기 절두(ΔARN 또는 ΔN3)를 갖는 폴리펩티드를 인코드한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 다음에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 핵산 분자를 고려한다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30 또는 최대 5개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드는 발현되었을 때 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 다음에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드를 인코드하는 재조합 핵산 분자를 고려한다: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30 또는 최대 2개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드는 발현되었을 때 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 재조합 핵산는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드를 인코드한다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100 또는 최대 5개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드는 발현될 때 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 재조합 핵산는 각각 다음에서 선택된 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드를 인코드한다: 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100 또는 최대 2개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드는 발현될 때 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다. 본 명세서는 전술한 재조합 핵산를 포유류 세포, 가령, CHO 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 변형된 GDF15 N-당화된 동종이량체를 만드는 방법을 또한 고려한다. 본 명세서는 전술한 방법에 의해 만들어진 변형된 GDF15 N-당화된 동종이량체를 또한 포괄한다.
본 명세서에서 제공된 특이적 아미노산 서열과 핵산 서열에 추가하여, 본 명세서는 아미노산 및 핵산에 대한 서열에 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 또한 고려한다. 2개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 2개 또는 그 이상의 아미노산 서열의 내용에서 용어 ＂동일한＂ 또는 ＂동일성＂ 백분율은 명시된 영역에 걸쳐 최대 대응을 위하여 비교 및 정렬될 때, 동일하거나 또는 동일한 것에 대하여 (가령, 명시된 영역에 걸쳐 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 동일한) 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드들의 명시된 백분율을 갖는 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열들을 지칭한다. 본 명세서는 서열 번호: 2-35 또는 77-97의 아미노산 서열에 대하여 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일한 서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 특히 고려한다.
폴리펩티드들의 생산 방법
본 명세서의 폴리펩티드는 재조합 방법 및 비-재조합 방법 (가령, 화학적 합성)이 포함된 임의의 적합한 방법에 의해 만들어질 수 있다.
A. 화학적 합성
폴리펩티드가 화학적으로 합성될 때, 상기 합성은 액상 또는 고형상을 통하여 진행될 수 있다. 고형-상 펩티드 합성 (SPPS)은 비자연적 아미노산 및/또는 펩티드/단백질 기본골격 변형의 혼입을 허용한다. 다양한 형태의 SPPS, 이를 테면 Fmoc 및 Boc이 본 명세서의 폴리펩티드 합성에 이용가능하다. 화학적 합성의 상세한 내용은 당업계에 공지되어 있다 (가령, Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; 그리고 Camarero J.A. et al., 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8).
고형상 펩티드 합성은 이하에서 설명된 바와 같이 실행될 수 있다. α 기능 (Nα) 및 임의의 반응성 측쇄들은 산-불안정 또는 염기-불안정기로 보호된다. 보호기는 아미드 결합 연결을 위한 조건하에서 안정적이지만, 형성된 펩티드 쌍의 손상없이 용이하게 절단될 수 있다. α-아미노 기능을 위한 적합한 보호기는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Z), o-클로로벤질옥시카르보닐, 바이-페닐이소프로필옥시카르보닐, 삼차-아밀옥시카르보닐 (Amoc), α, α-디메틸-3,5-디메톡시-벤질옥시카르보닐, o-니트로술페닐, 2-시아노-t-부톡시-카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-리덴)에틸 (Dde) 및 이와 유사한 것들.
적합한 측쇄 보호기는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다 : 아세틸, 알릴 (All), 알릴옥시카르보닐 (Alloc), 벤질 (Bzl), 벤질옥시카르보닐 (Z), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카르보닐, t-부틸 (tBu), t-부틸디메틸실일, 2-클로로벤질, 2-클로로벤질옥시카르보닐 (2-CIZ), 2,6-디클로로벤질, 시클로헥실, 시클로펜틸, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸 (Dde), 이소프로필, 4-메톡시-2,3-6-트리메틸벤질술포닐 (Mtr), 2,3,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc), 피발일, 테트라히드로피란-2-일, 토실 (Tos), 2,4,6-트리메톡시벤질, 트리메틸실일 및 트리틸 (Trt).
고형상 합성에 있어서, C-말단 아미노산은 적합한 지지 물질에 결합된다. 적합한 지지 물질들은 합성 공정의 단계별 축합과 절단 반응을 위한 시약 및 반응 조건에 대하여 비활성이며, 이용되는 반응 배지에 용해되지 않는 것들이다. 상업적으로-이용가능한 지지 물질들의 예로는 반응성 기들 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머; 클로로메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머; 히드록시메틸화된 또는 아미노메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 펩티드산을 준비하려는 의도라면, 4-벤질옥시벤질-알코올 (Wang-앵커) 또는 2-클로로트리틸 클로라이드로 유도화된 폴리스티렌 (1%)-디비닐벤젠 또는 TentaGel®는 이용될 수 있다. 펩티드 아미드의 경우, 5-(4＇-아미노메틸)-3＇,5＇-디메톡시페녹시)발레르산 (PAL-앵커) 또는 p-(2,4-디메톡시페닐-아미노 메틸)-페녹시 기 (Rink 아미드 앵커)로 유도화된 폴리스티렌 (1%) 디비닐벤젠 또는 TentaGel®이 이용될 수 있다.
상기 폴리머 지지물에 연계는 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄, 테트라히드로퓨란, N-메틸피롤리돈 또는 유사한 용매들 안에서 실온 또는 상승된 온도 (가령, 40℃ 내지 60℃) 및 가령, 2 내지 72 시간의 반응 시간 동안 활성화 시약의 추가와 함께 C-말단 Fmoc-보호된 아미노산을 지지 물질과 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.
Nα-보호된 아미노산 (가령, Fmoc 아미노산)을 PAL, Wang 또는 Rink 앵커에 결합은 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 존재하에 또는 부재하에서 결합 시약들, 이를 테면 N,N＇-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N＇-di이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 다른 카르보디이미드, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플로오로보레이트 (TBTU) 또는 다른 우로니움 염, o-아실-우레아, 벤조트리아졸-1-일-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플루오르인산염 (PyBOP) 또는 다른 포스포니움 염, N-히드록시숙신이미드, 다른 N-히드록시이미드 또는 옥심의 도움과, 가령, 히드록시벤조트리아졸 (HOBt)의 추가와 함께 TBTU의 도움과, 염기 이를 테면, 예를 들면, 디이소프로필에틸아민 (DIEA), 트리에틸아민 또는 N-메틸몰포리노의 추가와 함께 또는 없이, 가령, 디이소프로필에틸아민과 함께 2 내지 72 시간 (가령, 1.5 내지 3-배 과량의 아미노산 및 결합 시약의 경우 3시간, 가령, 2-배 과량과 약 10℃ 내지 50℃, 가령, 25℃에서 용매, 이를 테면 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 디클로로메탄, 가령, 디메틸포름아미드에서)에서 실행될 수 있다.
결합 시약 대신, 전술한 조건하에서 활성이 있는 에스테르 (가령, 펜타플루오로페닐, p-니트로페닐 또는 이와 유사한 것들), Nα-Fmoc-아미노산의 대칭 무수물, 이의 산 클로라이드 또는 산 플루오르를 이용하는 것 또한 가능하다.
Nα-보호된 아미노산 (가령, Fmoc 아미노산)은 DIEA 추가와 함께, 디클로로메탄에서 2-클로로트리틸 수지에서 10 내지 120 분, 가령, 20 분 동안 결합될 수 있지만, 그러나, 이 용매 및 이 염기 사용에 국한되지 않는다.
보호된 아미노산의 연속 결합은 자동화된 펩티드 합성기에서 일반적으로 펩티드 합성에 있어서 통상적 방법에 따라 실시될 수 있다. 고형상에 연결된 아미노산의 Nα-Fmoc 보호기를 가령, 디메틸포름아미드 안에 피페리딘 (10% 내지 50%)으로 5 내지 20 분, 가령, 50% 피페리딘/DMF로 2 x 2 분, 20% 피페리딘/DMF으로 1 x 15 분 처리 후, 3 내지 10-배 과량, 가령, 10-배 과량의 그 다음 보호된 아미노산은 약 10℃ 내지 50℃의 온도, 가령, 25℃에서 비활성, 비-수성, 극성 용매, 이를 테면 디클로로메탄, DMF 또는 이둘의 혼합물에서 기존 아미노산에 연결된다. PAL, Wang 또는 Rink 앵커에 제 1 Nα-Fmoc 아미노산을 결합시키기 위한 기존 언급된 시약은 결합 시약으로 적합하다. 보호된 아미노산의 활성이 있는 에스테르, 또는 이의 클로라이드 또는 불화물 또는 대칭 무수물이 또한 대안으로 이용될 수 있다.
고형상 합성 종료시, 측쇄 보호기들을 동시에 절단하는 동안, 상기 펩티드는 지지물질로부터 절단된다. 5%-20% V/V의 청소물질(scavengers), 이를 테면 디메틸술피드, 에틸메틸술피드, 티오아니솔, 티오크레솔, m-크레솔, 아니솔 에탄디티올, 페놀 또는 물, 가령, 15% v/v 디메틸술피드/에탄디티올/m-크레솔 1:1:1의 추가와 함께, 0.5 내지 3 시간, 가령, 2 시간 안에 트리플루오르아세트산 또는 다른 강력한 산성 배지에서 절단이 실행될 수 있다. 완전하게 보호된 측쇄들을 가진 펩티드는 2-클로로트리틸 앵커를 빙초산/트리플루오르에탄올/디클로로메탄 2:2:6으로 절단함으로써, 획득될 수 있다. 상기 보호된 펩티드는 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 만일 상기 펩티드가 고형상에 Wang 앵커를 통하여 연계되고, 그리고 C-말단 알킬아미드화된 펩티드를 얻고자 의도한다면, 알킬아민 또는 플루오르알킬아민으로 아미노분해에 의해 상기 절단이 실행될 수 있다. 아미노분해는 약 -10℃ 내지 50℃ (가령, 약 25℃) 온도, 그리고 약 12 내지 24 시간 (가령, 약 18 시간)의 반응 시간에서 실행된다. 또한 상기 펩티드는 가령, 메탄올에 의한 재-에스테르화에 의해 지지대로부터 절단될 수 있다.
획득되는 산성 용액은 상기 펩티드를 침전시키고, 그 다음 에테르 안에 남아있는 청소물질과 절단된 보호기를 분리시키기 위하여, 3 내지 20-배 양의 냉각 에테르 또는 n-헥산, 가령, 10-배 과량의 디에틸 에테르와 혼합될 수 있다. 추가 정제는 상기 펩티드를 빙초산으로부터 몇 차례 재-침전시킴으로써, 실행될 수 있다. 획득되는 침전물은 물 또는 삼차-부탄올 또는 이두 용매의 혼합물, 가령, 삼차-부탄올/물의 1:1 혼합물에서 취입되고, 그리고 동결-건조된다.
획득된 상기 펩티드는 아세테이트 형태의 약한 염기성 수지에 걸쳐 이온 교환; 비-유도화된 폴리스티렌/디비닐벤젠 코폴리머 (가령, Amberlite® XAD)에서 소수성 흡착 크로마토그래피; 실리카겔 상에서 흡착 크로마토그래피; 가령, 카르복시메틸 셀룰로오스 상에서 이온 교환 크로마토그래피; 가령, Sephadex® G-25에서 분포 크로마토그래피; 역전류 분포 크로마토그래피; 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 가령, 옥틸 또는 옥타데실실일실리카 (ODS) 상에서 역상 HPLC가 포함된 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
B. 재조합 생산
폴리펩티드가 재조합 기술을 이용하여 만들어질 때, 상기 폴리펩티드는 임의의 적합한 구조체와 임의의 적합한 숙주 세포를 이용하여 세포내 단백질 또는 분비된 단백질로 만들어질 수 있고, 이때 숙주세포는 원핵 또는 진핵 세포, 이를 테면 차례로 박테리아 (가령, 대장균(E. coli)) 또는 효모 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포들로 이용될 수 있는 진핵 세포의 다른 예들은 곤충 세포들, 포유류 세포들, 및/또는 식물 세포들을 포함한다. 포유류 숙주 세포들이 이용될 때, 이들은 인간 세포들 (가령, HeLa, 293, H9 및 Jurkat 세포들); 마우스 세포들 (가령, NIH3T3, L 세포들, 그리고 C127 세포들); 영장류 세포들 (가령, Cos 1, Cos 7 및 CV1) 및 헴스터 세포들 (가령, 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포들)를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CHO 세포들에서 만들어진다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드는 효모 세포에서 만들어지고, 특정 구체예들에 있어서 이는 포유류-유사 N-글리칸을 가진 당단백질을 만들기 위하여 유전적으로 조작된 효모 세포일 수 있다.
당분야에 공지된 표준 과정에 따라 폴리펩티드의 발현에 적합한 다양한 숙주-벡터계가 이용될 수 있다. 가령, Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, New York; 그리고 Ausubel et al. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons. 참고. 유전적 물질을 숙주 세포들 안으로 도입시키는 방법은 예를 들면, 형질전환, 전기천공, 접합, 칼슘 인산염 방법 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 도입된 폴리펩티드-인코딩 핵산의 안정적 발현을 제공하기 위하여 이전용 방법이 선택될 수 있다. 상기 폴리펩티드-인코딩 핵산은 유전되는 에피좀 요소 (가령, 플라스미드)로써 제공될 수 있거나, 또는 게놈적으로 통합될 수 있다. 관심대상의 폴리펩티드 생산에 이용되는 다양한 적합한 벡터들이 상업적으로 이용가능하다.
숙주 세포에서 염색체외 유지용으로 벡터가 제공되거나 또는 숙주 세포 게놈 안으로 통합을 위하여 벡터가 제공된다. 상기 발현 벡터는 전사 및 해독 조절 서열을 제공하며, 그리고 유도성 또는 구성적 발현을 위하여 제공되며, 이때 코딩 영역은 전사 개시 영역의 전사 조절하에, 그리고 전사 및 해독 종료 영역의 조절하에 작용가능하도록-연계된다. 유반적으로, 전사 및 해독 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위들, 전사 시작과 중단 서열, 해독 시작과 중단 서열, 그리고 인헨서 또는 활성물질 서열을 포함하나, 이에 국한되지 않을 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있고, 그리고 강력한 구성적 프로모터 (가령, T7)일 수 있다.
발현 구조체들은 관심 단백질을 인코드하는 핵산 서열의 삽입을 위하여 프로모터 서열 부근에 위치한 편리한 제한효소 절단 부위를 일반적으로 가진다. 발현 숙주에서 작동하는 선택적 표지는 상기 벡터를 함유하는 세포의 선택을 용이하게 하기 위하여 존재할 수 있다. 더욱이, 상기 발현 구조체는 추가적인 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 하나 또는 2개의 복제 시스템을 보유할 수 있고, 이로써 유기체 안에서, 예를 들면, 발현을 위하여 포유류 또는 곤충 세포 안에, 그리고 클로닝 및 증폭을 원핵 숙주 안에 유지되는 것이 허용된다. 또한, 상기 발현 구조체는 형질변환된 숙주 세포들의 선별을 허용하기 위한 선택성 표지 유전자를 포함할 수 있다. 선택성 유전자들은 당분야에 공지되어 있고, 이용되는 숙주 세포에 따라 변화될 수 있다.
단백질의 단리와 정제는 당분야에 공지된 방법에 따라 실행될 수 있다. 예를 들면, 단백질은 이 단백질을 구성적으로 발현시키거나 및/또는 유도시 단백질이 발현되도록 유전적으로 변형된 세포의 용해물로부터 단리될 수 있거나, 또는 합성 반응 혼합물로부터 면역친화력 정제에 의해 단리될 수 있는데, 이 정제는 일반적으로 상기 시료에 항-단백질 항체를 접촉시키고, 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위하여 세척하고, 그리고 상기 특이적으로 결합된 단백질을 용리시키는 것과 관련된다. 상기 단리된 단백질은 투석 및 단백질 정제 방법에서 보통 이용되는 다른 방법들에 의해 추가 정제될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 상기 단백질은 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법들을 이용하여 단리될 수 있다. 단백질은 단리를 촉진시키기 위한 변형을 포함할 수 있다.
상기 폴리펩티드들은 실질적으로 순수한 또는 단리된 형태 (가령, 다른 폴리펩티드들이 없이)로 준비될 수 있다. 상기 폴리펩티드들은 조성물 안에 존재하는 다른 성분들 (가령, 다른 폴리펩티드들 또는 다른 숙주 세포 성분들)과 비교하여 상기 폴리펩티드가 농축되어 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제된 폴리펩티드가 제공됨에 있어서 다른 발현된 단백질이 실질적으로 없는, 가령, 상기 조성물의 90% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1%미만은 다른 발현된 단백질로 구성될 수 있다.
항체들
본 명세서는 본 명세서의 폴리펩티드 또는 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체들이 포함된, 항체들을 제공한다. 용어 ＂항체＂는 최소한 2개의 고유 항체, 그리고 본 명세서의 폴리펩티드 또는 융합 단백질에 특이적으로 결합한다면 Fab 및 F(ab)＇2이 포함된 항체 결합 단편들로부터 형성된 고유 단클론 항체들, 다클론 항체들, 다중특이적 항체들 (가령, 이중특이적 항체들)을 포괄한다. 기본 전체 항체 구조적 단위는 사량체를 포함하고, 그리고 각 사량는은 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 한 개의 ＂경쇄＂ (약 25 kDa)와 한 개의 ＂중쇄＂ (약 50-70 kDa)를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함한다. 대조적으로, 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 작동체(effector) 기능을 담당하는 불변 영역으로 정의된다. 인간 경쇄는 카파와 람다로 분류되며, 반면 인간 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로 분류되고, 그리고 상기 항체의 아이소타입은 차례로 IgM, IgD, IgG, IgA, 그리고 IgE로 규정된다. 결합 단편들은 재조합 DNA 기술, 또는 고유 항체들의 효소 또는 화학적 절단에 의해 만들어진다. 결합 단편들은 Fab, Fab＇, F(ab＇)2, Fv, 그리고 단일-쇄 항체들을 포함한다.
각 중쇄는 하나의 단부 가변 도메인 (VH)에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각 경쇄는 한 단부에는 가변 도메인 (VL)을 그리고 이의 또다른 단부에는 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 나란하며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 있다. 경쇄와 중쇄 안에, 가변 영역과 불변 영역은 약 12 또는 그 이상의 아미노산으로 된 ＂J＂ 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산으로 된 ＂D＂ 영역을 포함한다. 상기 항체 쇄는 모두 상보성 결정 영역 또는 ＂CDRs＂로 불리는 3개의 초가변 영역에 연결된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR) 구조로 된 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 2개 쇄로부터 CDRs은 기본골격 영역과 나란이 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. N-말단에서 부터 C-말단까지, 경쇄와 중쇄는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 포함한다.
고유 항체는 두 개의 결합 부위를 갖고, 이기능성 또는 이특이적 항체들을 제외하고, 이들 두 결합 부위는 동일하다. 이중특이적 또는 이기능성 항체는 상이한 2개의 중쇄/경쇄 쌍과 상이한 2개의 결합 부위들을 갖는 인공적인 하이브리드 항체다. 이중특이적 항체들은 하이브리도마의 융합 또는 Fab＇ 단편들의 연계가 포함된 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다.
상기에서 제시된 바와 같이, 결합 단편들은 고유 항체들의 효소 또는 화학적 절단에 의해 만들어진다. 항체들을 효소 파파인으로 절단하면, 2개의 동일한 항원-결합 단편들-또한 ＂Fab＂ 단편들로 공지된-, 그리고 항원-결합 활성이 없는 ＂Fc＂ 단편이 생성된다. 항체들을 효소 펩신으로 절단하면 F(ab＇)2 단편이 생성되는데, 이때 상기 항체 분자의 2개 팔은 연계된 상태로 유지되며, 2개의-항원 결합 부위들을 포함한다. F(ab＇)2 단편은 항원을 가교하는 능력을 보유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂Fab＂는 VH 및 VL 영역을 포함하고, 뿐만 아니라 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂Fv＂는 항원-인지와 항원-결합 부위들을 모두 보유하는 항체의 최소 면역 단편을 지칭한다. 2개-쇄 Fv 종에 있어서, 이 영역은 비-공유적 연합으로 한 개의 중쇄와 한 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체를 포함한다. 단일-쇄 Fv 종에 있어서, 한 개의 중쇄와 한 개의 경쇄 가변 도메인은 유연성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연계될 수 있고, 경쇄와 중쇄는 2개의 쇄 Fv 종에서와 유사한 ＂이량체＂ 구조로 연합된다. 각 가변 도메인의 3개 CDRs는 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 특정시키도록 상호작용하는 형상이다. 집합적으로 6개의 CDRs은 이 항체에 항원-결합 특이성을 부여하지만, 단일 가변 도메인 조차도 (항원에 특이적인 오직 3개의 CDRs만으로 구성된 절반의 Fv) 항원을 인지하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂상보성 결정 영역＂ 또는 ＂CDRs＂은 특이적 리간드와 접촉하고, 이의 특이성을 결정하는 면역학적 수용체의 일부분을 지칭한다.
용어 ＂초가변 영역＂은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 말한다. 상기 초가변 영역운 일반적으로 CDR의 아미노산 잔기들 및/또는 ＂초가변 루프＂의 잔기들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂에피토프＂란 단백질 항원 상에서 항체들의 결합 부위를 지칭한다. 에피토프 결정부위는 보통 분자의 화학적으로 활성이 있는 표면 기들, 이를 테면 아미노산 또는 당 측쇄, 뿐만 아니라, 특이적 3차원 구조 및 전하 특징을 포함한다. 항체는 해리 상수가 ≤1 μM, ≤ 100 nM, 또는 ≤ 10 nM인 경우, 항원에 결합된다라고 한다. 평형상수 (＂K D ＂)의 증가는 에피토프와 상기 항체 사이에 친화력이 적다는 것을 의미하고, 반면 평형상수의 감소는 에피토프와 상기 항체 사이에 더 많은 친화력이 있음을 의미한다. ＂단지(no more than) 특정 량＂의 K D 를 가진 항체는 상기 항체가 이 에피토프에 주어진 K D 또는 그 이상으로 강력하게 결합할 것이라는 것을 의미한다. 한편 K D 는 에피토프와 항체의 결합 특징을 설명하고, ＂역가(potency)＂는 이 항체의 기능을 위한 항체 자체의 효과를 설명한다. 평형상수와 역가 사이에 반드시 상관관계가 있는 것은 아니며; 따라서, 예를 들면, 상대적으로 낮은 K D 는 자동적으로 높은 역가를 의미하는 것은 아니다.
항체 언급시 용어 ＂선택적으로 결합한다＂란 상기 항체가 오직 단일 물질에 결합한다는 것을 의미하기 보다는 제 1 물질에 대한 이 항체의 K D 는 제 2 물질에 대한 이 항체의 K D 보다 적다는 것을 의미한다. 에피토프에 배타적으로 결합하는 항체는 오직 이 단일 에피토프에만 결합한다.
인간에 투여될 때, 설치류 (가령, 뮤린 또는 렛) 가변 및/또는 불변 영역들을 포함하는 항체들은 예를 들면, 신체로부터 신속한 제거 또는 이 항체에 대항하여 신체에서 면역 반응의 생성과 때때로 연합된다. 설치류-유도된 항체들의 사용을 회피하기 위하여, 인간 항체 기능을 설치류에 도입을 통하여 이 설치류가 완전한 인간 항체들을 생산하도록 함으로써 완전한 인간 항체들이 만들어질 수 있다. 본 명세서에서 특이적으로 식별되지 않는 한, ＂인간(human)＂ 및 ＂완전한 인간(fully human)＂ 항체들은 호환 이용될 수 있다. 용어 ＂완전한 인간(fully human)＂은 완벽하게, 또는 완전한, 인간인 것과 단지 부분적 인간인 항체들을 구별할 때, 유용할 수 있다. 당업자는 완전한 인간 항체들을 생성하는 다양한 방법들을 인지한다.
가능한 인간 항-마우스 항체 반응을 다루기 위하여, 키메라 또는 그렇지 않으면 인간화된 항체들이 이용될 수 있다. 키메라 항체들은 인간 불변 영역과 뮤린 가변 영역을 보유하고, 그리고, 이렇게 됨으로써, 인간 항-키메라 항체 반응은 일부 환자들에서 관찰될 수 있다. 따라서, 가능한 인간 항-마우스 항체 또는 인간 항-키메라 항체 반응을 회피하기 위하여 다중 효소에 대항하는 완전한 인간 항체를 제공하는 것이 유익하다.
당업자에 공지된 기술에 의해, 예를 들면, 하이브리도마 세포 계통을 만듦으로써, 완전한 인간 단클론 항체들이 준비될 수 있다. 다른 준비 방법은 적합한 포유류 숙주 세포, 이를 테면 CHO 세포의 형질전환을 위한 특정 항체를 인코드하는 서열의 이용이 관련된다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 임의의 공지 방법, 예를 들면, 이 폴리뉴클레오티드를 바이러스 (또는 바이러스성 벡터)에 포장하고, 숙주 세포를 이 바이러스 (또는 벡터)로 형질감염시키거나 또는 당분야에 공지된 형질감염 과정에 의해 이루어질 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포들 안으로 도입시키는 방법들은 당분야에 공지되어 있고, 덱스트란-중재된 형질감염, 칼슘 인산염 침전, 폴리브렌-중재된 형질감염, 원형질 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)을 리포좀 안에 포집, 그리고 DNA를 핵 안에 직접 현미주사하는 것을 포함한다. 발현에 이용가능한 숙주로써 포유류 세포 계통은 당분야에 공지되어 있고, CHO 세포들, HeLa 세포들, 그리고 인간 간세포 암종 세포들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
상기 항체들을 이용하여 본 명세서의 폴리펩티드를 탐지할 수 있다. 예를 들면, 이 항체들은 대상에서 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 수준을 탐지하는 진단으로 이용될 수 있거나, 그리고 탐지된 수준을 표준 제어 수준 또는 대상에서 미리 측정된(가령, 임의의 병이 있기 전)기저수준과 비교되는데 이용될 수 있다.
본 명세서의 또다른 구체예는 하나 또는 그 이상의 인간 도메인 항체들 (dAb)의 용도를 설명한다. dAbs는 인간 항체들 (IgGs)의 최소 기능 결합 단위로써, 호의적인 안정성 및 용해도 특징을 가진다. 이 기술은 HSA에 접합된 dAb(들) (이로 인하여 ＂AlbudAb＂가 형성됨; 가령, EP1517921B, WO2005/118642 및 WO2006/051288 참고) 그리고 관심 대상 분자 (가령, 본 명세서의 폴리펩티드 서열)에 접합된 dAb(들)을 수반한다. AlbudAbs는 대개 더 작고, 그리고 폴리펩티드들의 혈청 반감기를 연장시키는데 이용되는 현재 기술보다 미생물 발현 시스템, 이를 테면 박테리아 또는 효모에서 제작하는데 더 용이하다. HSA의 반감기는 약 3주이기 때문에, 생성된 접합된 분자는 관심 대상 분자의 반감기를 개선시킨다. dAb 기술의 이용은 관심 대상 분자의 효과를 또한 강화시킬 수 있다.
치료요법적 및 예방적 용도
본 명세서는 대사성 질환 및 대사성-연합된 질환, 이를 테면, 비만 및 다른 체중 장애들, 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 그리고 포도당 대사 장애들, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 상기 폴리펩티드들또는 이의 조성물들의 투여에 의해 치료 또는 예방 방법들을 제공한다. 이러한 방법들은 질환, 장애 또는 상태와 연합된 하나 또는 그 이상의 징후들에서 예를 들면, 중증도 또는 증상의 빈도 감소에 의해 유익한 효과를 또한 가질 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 상기 폴리펩티드들, N-당화된 이량체 또는 이의 조성물들의 투여에 의해 포도당 대사 또는 체중 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에 있어서, 본 명세서는 상기 폴리펩티드들, N-당화된 이량체 또는 이의 조성물들의 투여에 의해 식품 섭취의 감소 또는 체중 감소를 위한 방법을 공개한다. 본 명세서는 대사성 질환 및 대사성-연합된 질환, 이를 테면, 비만 및 다른 체중 장애들, 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 그리고 포도당 대사 장애들에서 선택된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 약물 조제에서 전술한 서열, 폴리펩티드들, N-당화된 이량체들 또는 이의 조성물들의 용도를 제공한다. 본 명세서는 포도당 대사 또는 체중 장애 치료에 이용하기 위한 약물 조제에 있어서 전술한 서열, 폴리펩티드들, N-당화된 이량체들 또는 이의 조성물들의 용도를 더 제공한다. 본 명세서는 식품 섭취 또는 체중 감소에 이용하기 위한 약물 조제에 있어서 전술한 서열, 폴리펩티드들, N-당화된 이량체들 또는 이의 조성물들의 용도를 더 제공한다.
본 명세서에서 제시되는 방법에 의해 체중 장애 (가령, 비만)을 치료 또는 방지하는 후보가 될 수 있는 지를 판단하기 위하여, 매개변수, 이를 테면, 대상 상태의 원인 및 정도 (가령, 참조가 되는 건강한 개인과 비교하였을 때 이 대상이 얼마나 과체중인가)가 평가되어야 한다. 예를 들면, BMI ~25 내지 ~29.9 kg/m2를 갖는 성인은 과체중 (전-비만)으로 간주될 수 있고, 한편 ~30 kg/m2 또는 그 이상의 BMI를 갖는 성인은 비만으로 간주될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드들은 식욕 억제 효과를 가질 수 있고, 예를 들면, 식욕의 감소는 체중의 삭감으로 이어진다.
대상이 본 명세서에서 제공되는 방법에 의해 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 및/또는 포도당 장애들의 치료 또는 방지의 후보가 될 수 있는지 판단하기 위하여, 당분야에 공지된 다양한 진단 방법들이 이용될 수 있다. 이러한 방법들은 본 명세서 도처에 설명된 것들(가령, 공복혈장 포도당 (FPG) 평가와 경구 포도당 내성 시험 (oGTT))을 포함한다.
대사성 질환 및 대사성-연합된 질환, 이를 테면, 비만 및 다른 체중 장애들, 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 포도당 대사 장애들을 치료 또는 방지하기 위하여 대상에게 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드들과 융합 단백질이 투여될 때, 본 명세서에서 제공되는 폴리펩티드들과 융합 단백질은 혈당 수준의 감소, 체중 감소, 및/또는 식품 섭취의 감소로 이어질 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드들 및 융합 단백질은 이 폴리펩티드들 또는 융합 단백질의 투여가 없는 경우와 비교하였을 때 최소 5% 혈당 수준, 체중, 및/또는 식품 섭취를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드들 및 융합 단백질은 치료 또는 방지 시작 전과 비교하였을 때, 최소한 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 혈당 수준, 체중, 및/또는 식품 섭취를 감소시킬 수 있다.
약학 조성물
본 명세서의 폴리펩티드는 대상에게 투여하는데 적합한 조성물의 형태일 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물들은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 또는 생리학적으로 수용가능한 희석제들, 운반체들 또는 부형제들을 포함하는 ＂약학 조성물＂이다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드들은 치료요법적으로 효과량으로 존재한다. 상기 약학 조성물은 본 명세서의 방법들에 이용될 수 있고; 따라서, 예를 들면, 상기 약학 조성물은 본 명세서에서 설명되는 치료요법적 방법 및 예방적 방법을 실행하기 위하여 대상에게 생체외 또는 생체내 투여될 수 있다.
본 명세서의 약학 조성물은 의도된 방법 또는 투여 경로에 양립될 수 있도록 제형화될 수 있고; 예시적인 투여 경로는 본 명세서에서 제시된다. 더욱이, 상기 약학 조성물은 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 질환, 장애 및 상태들을 치료 또는 예방하기 위하여, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 다른 치료요법적으로 활성이 있는 물질 또는 화합물들 (가령, 포도당을 낮추는 물질)과 복합 이용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 본 명세서에서 고려되는 치료요법적으로 효과량의 최소한 한 가지의 폴리펩티드들과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 그리고 생리학적으로 수용가능한 제형 물질을 전형적으로 포함한다. 적합한 약학적으로 수용가능한 또는 생리학적으로 수용가능한 희석제들, 운반체들 또는 부형제들은 항산화제 (가령, 아스코르브산 및 중황산 나트륨), 보존제 (가령, 벤질 알코올, 메틸 파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-히드록시벤조산염), 유화 물질들, 현탁 물질들, 분산 물질들, 용매, 충전제, 벌크 물질들, 계면활성제, 완충액, 비이클, 희석제들, 및/또는 어쥬번트를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 적합한 비이클은 장관외 투여를 위하여 약학 조성물안에 공통적인 다른 물질들이 가능하면 보충된, 생리학적 염수 용액 또는 구연산염 완충된 염수가 될 수 있다. 중성 완충된 염수 또는 혈청 알부민이 혼합된 염수는 추가 예시적인 비이클이다. 당업자는 상기 약학 조성물과 투약량 형태에 이용될 수 있는 다양한 완충액을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 전형적인 완충액은 약학적으로 수용가능한 약산, 약염기, 또는 이의 혼합물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한 예로써, 상기 완충액 성분들은 물 용해가능한 물질들 이를 테면 인산, 타르타르산, 젖산, 숙신산, 구연산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 글루탐산, 그리고 이의 염일 수 있다. 수용가능한 완충 물질들은 예를 들면, 트리스 완충액, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N＇-(2-에탄술폰산) (HEPES), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 (MES), 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 나트륨 염 (MES), 3-(N-몰포리노)프로판술폰산 (MOPS), 그리고 N-트리스[히드록시메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS)을 포함한다.
약학 조성물이 제형화된 후, 이 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체, 또는 탈수된 분말 또는 동결건조된 분말로 멸균 바이알 안에 보관될 수 있다. 이러한 제형들은 사용준비가 된(ready-to-use) 형태, 사용전 재구성을 요하는 동결건조된 형태, 사용전에 희석을 요하는 액체 형태, 또는 다른 수용가능한 형태로 저장될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 약학 조성물은 단일-용도 용기 (가령, 단일-용도 바이알, 앰플, 주사기, 또는 자기주사기 (가령, EpiPen®와 유사))로 제공되며, 반면 다른 구체예들에 있어서 다중-용도 용기 (가령, 다중-용도 바이알)가 제공된다. 임의의 약물 전달 기구를 이용하여 상기 폴리펩티드들을 운반할 수 있는데, 임플란트 (가령, 삽입할 수 있는 펌프) 및 카테테르 시스템가 포함되며, 이둘은 모두 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로 피하 또는 근육내로 투여되는 데포(Depot) 주사는 정해진 기간에 걸쳐 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드들을 방출하는데 또한 이용될 수 있다. 데포 주사는 통상 고체- 또는 오일-기반이며, 본 명세서에서 제시된 제형 성분들중 최소한 한 가지를 일반적으로 포함한다. 당업자는 가능한 제형과 데포 주사 용도에 친숙하다.
상기 약학 조성물은 주사가능한 무균 수성 또는 유지성(oleagenous) 현탁액 형태일 수 있다. 이 현탁액은 본 명세서에서 언급된 이러한 적합한 분산 또는 습식 물질들과 현탁 물질들을 이용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 상기 멸균 조제물은 비독성 비경구적으로 수용가능한 희석제 또는 용매, 이를 테면 1,3-부탄 디올에서 용액 또는 현탁액, 용액일 수 있다. 이용될 수 있는 수용가능한 희석제들, 용매와 분산 배지는 물, Ringer 용액, 등장성 염화나트륨 용액, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충된 염수 (PBS), 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액체 폴리에틸렌 글리콜), 그리고 이의 적합한 혼합물을 포함한다. 또한, 멸균된 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 이용될 수 있다. 이 목적을 위하여, 합성 모노 또는 디글리세리드가 포함된 임의의 혼합 고정된 오일이 이용될 수 있다. 더욱이, 지방산, 이를 테면 올레산은 주사가능한 조제물에 용도를 찾는다. 특정 주사가능한 제형의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 물질 (가령, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 겔라틴)의 포함에 의해 획득될 수 있다.
활성이 있는 성분 (가령, 본 명세서의 폴리펩티드)이 포함된 약학 조성물은 예를 들면, 테블릿, 캡슐, 트로키제(troches), 당의정(lozenges), 수성 또는 지정 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멸젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽, 용액, 마이크로비드 또는 엘륵시르(elixirs)와 같은 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 경구 사용에 의도된 약학 조성물은 약학 조성물 제조를 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 조제될 수 있으며, 이러한 조성물은 약학적으로 세련되고 맛있는 조제물을 제공하기 위하여 이를 테면, 감미제, 풍미제, 발색제 및 보존제가 포함된 하나 또는 그 이상의 물질을 포함할 수 있다. 테블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것들은 테블릿 제조에 적합한 비-독성 약학적으로 수용가능한 부형제들과 혼합된 활성이 있는 성분을 포함한다. 이용되는 부형제는 예를 들면, 희석제 이를 테면 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화 및 붕해 물질, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 알긴산, 결합제 예를 들면 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 그리고 윤활제, 예를 들면 스테아레이트 마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다.
경구 투여에 적합한 테블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것들은 피복되지 않을 수 있거나, 또는 위장관에서 분해 및 흡수를 지연시키고, 이로 인하여 지속적인 작용을 제공하도록 하기 위하여 공지의 기술에 의해 피복될 수 있다. 예를 들면, 시간-지연 물질 이를 테면 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 이용될 수 있다. 이들은 조절된 방출을 위하여 삼투성 치료요법적 테블릿을 형성하기 위하여 당분야에 공지된 기술에 의해 또한 피복될 수 있다. 투여된 조성물의 전달을 조절하기 위하여, 추가적인 물질들은 생분해가능한 또는 생체적합한 입자들 또는 폴리머 물질, 이를 테면 폴리에스테르, 폴리아민산, 히드로겔, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산 , 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 프로타민 술페이트, 또는 락티드/글리콜리드 코폴리머, 폴리락티드/글리콜리드 코폴리머, 또는 에틸렌비닐아세테이트 코폴리머를 포함한다. 예를 들면, 상기 경구 물질은 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 인터페이셜 중합화에 의해 또는 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-미세구와 폴리(메틸메타아실레이트) 미세구를 이용에 의해 준비된 미세구 안에, 또는 콜로이드성 약물 운반 시스템에 포집될 수 있다. 콜로이드성 분산 시스템은 수중유 에멀션, 미셀, 혼합된 미셀, 그리고 리포좀이 포함된 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 미세구, 마이크로비드비드, 그리고 지질-기반 시스템을 포함한다. 리포좀을 준비하는 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,235,871, 4,501,728, 그리고 4,837,028에서 설명된다. 상기-언급된 제형의 조제 방법은 당분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이다.
경구 사용을 위한 제형은 경질 젤라틴 캡슐로 또한 제시될 수 있는데, 이때 활성이 있는 성분은 비활성 고체 희석제, 예를 들면, 탄산칼슘, 인산 칼슘, 카올린 또는 미소결정 셀룰로오스이며, 또는 연성 겔라틴 캡슐로 제시될 수 있는데, 이때 활성이 있는 성분은 물 또는 오일 매체, 예를 들면 땅콩유, 액체 파라핀, 또는 올리브유와 혼합된다.
수성 현탁액은 이의 제조에 적합한 부형제들과 혼합된 활성이 있는 물질을 포함한다. 이러한 부형제들은 현탁 물질들, 예를 들면 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가탄 및 검 아카시아; 분산 또는 습식 물질들, 예를 들면 자연-발생적 포스파티드 (가령, 레시틴), 또는 지방산 (가령, 폴리옥시-에틸렌 스테아레이트)와 알킬렌 산화물의 축합 산물, 또는 장쇄 지방족 알코올과 에틸렌 산화물의 축합 산물 (가령, 헵타데카에틸렌옥시세탄올의 경우), 또는 지방산과 헥시톨 (가령, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트)로부터 유도된 부분적 에스테르와의 에틸렌 산화물의 축합 산물, 또는 지방산과 헥시톨 무수물 (가령, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트)로부터 유도된 부분적 에스테르와 에틸렌 산화물의 축합 산물일 수 있다. 수성 현탁액은 하나 또는 그 이상의 보존제를 또한 포함할 수 있다.
오일성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들면 아라키스 오일(arachis oil), 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유, 또는 미네랄 오일, 이를 테면 액체 파라핀에서 활성이 있는 성분을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 오일성 현탁액은 농후 물질, 예를 들면 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 포함할 수 있다. 감미 물질들, 이를 테면 전술한 것들, 그리고 풍미 물질들은 맛있는 경구 조제물을 제공하기 위하여 추가될 수 있다.
물의 추가에 의해 수성 현탁액 조제에 적합한 분산가능한 분말과 과립은 분산 또는 습식 물질, 현탁 물질 및 하나 또는 그 이상의 보존제와 혼합된 활성이 있는 성분을 제공한다. 본 명세서에서는 적합한 분산 또는 습식 물질들과 현탁 물질들이 예시된다.
본 명세서의 약학 조성물은 수중유 에멀션의 형태가 또한 될 수 있다. 오일 상태는 식물성 기름, 예를 들면 올리브유 또는 아라키스 오일, 또는 미네랄 오일, 예를 들면, 액체 파라핀, 또는 이들 혼합물일 수 있다. 적합한 유화 물질들은 자연-발생적 검, 예를 들면, 아카시아검 또는 트라가탄 검; 자연-발생적 포스파티드, 예를 들면, 대두, 레시틴, 그리고 지방산으로부터 유도된 에스테르 또는 부분적 에스테르; 헥시톨 안하이드리드, 예를 들면, 소르비탄 모노올레이트; 그리고 에틸렌 산화물과 부분 에스테르의 축합 산물, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다.
제형은 신속한 분해 또는 신체로부터 상기 조성물이 제거되는 것으로부터 이 조성물을 보호하기 위한 운반체들을 또한 포함하는데, 이를 테면 임플란트, 리포좀, 히드로겔, 프로드럭 및 미소캡슐화된 전달 시스템이 포함된 조절된 방출 제형이 포함된다. 예를 들면, 시간 지연 물질, 이를 테면 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트 단독 또는 왁스와 조합이 이용될 수 있다.
본 명세서는 약물의 직장 투여용 좌약 형태로 폴리펩티드들의 투여를 고려한다. 좌약은 약물에 적합한 비-자극 부형제를 혼합시켜 준비될 수 있는데, 이때 상기 부형제는 실온에서는 고체이지만, 직장에서는 액체가 되어 직장 안에서 용융되어 약물을 방출시킬 수 있다. 이러한 물질들은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 폴리펩티드들은 현재 공지된 또는 앞으로 개발되는 임의의 다른 적합한 약학 조성물 (가령, 비강 또는 흡입용 스프레이)의 형태일 수 있다.
제형 안에 폴리펩티드 또는 이의 단편의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고 (가령, 체중의 약 0.1% 미만에서부터, 보통 또는 최소한 약 2%에서 많으면 20% 내지 50% 또는 그 이상) 그리고 예를 들면, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 유체 용적, 점성 그리고 대상-기반의 인자에 근거하여 주로 통상적으로 선택될 것이다.
본 명세서에서 Nano Precision Medical의 데포 전달 기술의 사용을 고려한다 (Nano Precision Medical; Emeryville, CA). 상기 기술은 거대분자, 이를 테면 단백질 및 펩티드 치료요법제의 영차(zero-order) 방출 속도를 만들기 위하여 티타니아 나노튜브를 이용한다. 생체적합성 막은 치료요법적 거대분자의 장기간 (가령, 최대 1년)의 항속 전달을 제공하는 작은 피하 임플란트 안에 내장된다. 상기 기술은 유형 II 당뇨병의 치료용 GLP-1 항진제의 전달을 위하여 현재 평가되고 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드(들)은 막을 가진 제형일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 막 안에 함침될 수 있거나, 막에 의해 에워싸일 수 있다. 이 막은 원판, 튜브 또는 구의 형태일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 이 튜브는 나노튜브이거나, 구는 나노구일 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드는 환자에게 고정될 수 있는 온-바디 전달 시스템을 이용하여 투여될 수 있고, 사전결정된 분량의 상기 폴리펩티드가 환자에게 전달될 수 있다. 예시적인 온-바디(on-body) 전달 시스템은 패취 또는 펌프를 포함한다. 특정 경구들에 있어서, 온-바디 전달 시스템, 이를 테면 Neulasta®를 전달하는데 이용된 온-바디 주사기를 이용하여 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드들을 투여할 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 삼투 펌프, 이를 테면, 삽입할 수 있는 삼투 펌프 (가령, DUROS® 펌프 또는 ALZET® 삼투 펌프)는 본 명세서에서 설명된 폴리펩티드를 환자에게 전달하는데 이용될 수 있다.
투여 경로
본 명세서는 임의의 적절한 방식으로 공개된 폴리펩티드들, 그리고 이의 조성물들의 투여를 고려한다. 적합한 투여 경로는 장관외 (가령, 근육내, 정맥내, 피하 (가령, 주사 또는 임플란트), 복막내, 낭내영역(intracisternal), 관절내, 복막내, 대뇌 (뇌실질내) 및 뇌실내), 경구, 비강, 질, 설하, 안구, 직장, 국소 (가령, 경피), 설하 및 흡입을 포함한다.
일반적으로 피하 또는 근육내로 투여되는 데포(Depot) 주사는 정해진 기간에 걸쳐 본 명세서에서 공개된 폴리펩티드들을 방출하는데 또한 이용될 수 있다. 데포 주사는 통상 고체- 또는 오일-기반이며, 본 명세서에서 제시된 제형 성분들중 최소한 한 가지를 일반적으로 포함한다. 당업자는 가능한 제형과 데포 주사 용도에 친숙하다.
항체들에 있어서 예시적인 구체예에서 본 명세서의 항체 또는 항체 단편은 주사용 무균 등장성 수성 염수 용액 안에 4℃에서 10 mg/ml로 저장되고, 대상에게 투여전 주사용 100 ml 또는 200 ml의 0.9% 염화나트륨에 희석된다. 상기 항체는 0.2 내지 10 mg/kg의 분량에서 1시간 과정에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 15 분 내지 2 시간의 기간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여된다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 투여 과정은 피하 볼루스 주사를 경유한다.
본 명세서는 본 명세서의 폴리펩티드 또는 항체 또는 항체 단편은 대상에게 최소한 이틀에 한 번, 최소한 하루에 한 번, 최소한 매 48 시간 마다 한 번, 최소한 매 72 시간 마다 한 번, 최소한 매주 한 번, 최소한 2주마다 한 번, 최소한 한달에 한 번, 최소한 두달에 한 번, 또는 최소한 3달에 한 번, 또는 덜 비반하게 투여되는 방법을 고려한다.
복합 요법
본 명세서는 하나 또는 그 이상의 활성이 있는 치료요법적 물질들 또는 다른 예방적 또는 치료요법적 형태와 복합된 상기 폴리펩티드의 용도를 고려한다. 이러한 복합 요법에서 다양한 활성이 있는 물질들은 흔히 상이한 작용 기전을 갖는다. 이러한 복합 요법은 하나 또는 그 이상의 물질들의 분량 감소를 허용하고, 이로 인하여 하나 또는 그 이상의 물질들과 연합된 유해효과가 감소 또는 제거됨으로써 특히 유익할 수 있고; 더욱이, 이러한 복합 요법은 기저 질환, 장애, 또는 상태에 있어서 공조적 치료요법적 또는 예방적 효과를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, ＂복합＂이란 별로도 투여될 수 있는, 예를 들면, 별도 투여용으로 별도로 제형화된 (가령, 키트로 제공될 수 있는) 요법, 그리고 단일 제형 안에 함께 투여되는 요법 (가령, ＂공동-제형＂)을 포함하는 의미다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드들은 순차적으로 투여 또는 제공되는데, 가령, 하나 또는 그 이상의 다른 물질들이 투여되기 전, 한 물질이 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 폴리펩티드들은 동시에 투여되는데, 가령, 2개 또는 그 이상의 물질들이 대략 동시 또는 동시에 투여되고; 2개 또는 그 이상의 물질들은 2개 또는 그 이상의 별도 제형 안에 존재하거나 또는 단일 제형 (가령, 공동-제형)안에 존재할 수 있다. 2개 또는 그 이상의 물질들이 순차적으로 또는 동시에 투여되는지에 상관없이, 이들은 본 명세서의 목적을 위하여 복합 투여될 수 있다.
본 명세서의 폴리펩티드는 비만, 식이 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 그리고 다른 포도당 대사 장애들로 고퉁을 받는 대상에게 정상적으로 투여되는 것이 포함된, 본 명세서에서 제시된 질환, 장애 또는 상태의 치료, 방지, 억제 또는 개선에 유용한 다른 물질들과 복합 이용될 수 있다.
본 명세서는 다음 것들이 포함된 다수의 물질들 (그리고 이의 분류별)과의 복합 요법을 고려한다: 1) 술포닐우레아 (가령, 클로로프로파미드, 토라자미드, 아세토헥사미드, 톨부타미드, 글리부리드, 글리메피리드, 글리피지드) 및 메글리티니드 (가령, 미티글리니드, 레파글리니드(PRANDIN)및 나테글리니드 (STARLIX))가 포함된 인슐린 분비 자극이 수반되는 인슐린, 인슐린 모방체와 물질들; 2) 비구아니드 (가령, 메트포르민 (GLUCOPHAGE), 그리고 이의 약학적으로 수용가능한 염, 특히, 메트포르민 히드로클로라이드, 그리고 이의 연장된-방출 제형, 이를 테면 Glumetza™, Fortamet™, 그리고 GlucophageXR™) 및 포도당 이용을 촉진시키고, 간의 포도당 생산을 감소시키고 및/또는 내장의 포도당 배출을 줄이는 작용을 하는 다른 물질들; 3) 알파-글루코시다제 저해물질들 (가령, 아카르보스, 보글리보스 및 미글리톨) 그리고 탄수화물 소화를 지연시키고, 결과적으로 장으로부터 흡수를 지연시키고, 식후 고혈당증을 감소시키는 다른 물질들; 4) 인슐린, 그리고 인슐린 모방체 (가령, 인슐린 데글루덱(degludec), 인슐린 글라르긴(glargine), 인슐린 리스프로(lispro), 인슐린 데테미르(detemir), 인슐린 글루리신(glulisine) 및 각각의 흡입성 제형이 포함된)이 포함된 인슐린 작용(가령, 인슐린 감작화)을 강화시키고, 따라서 주변 조직에서 포도당 이용을 촉진시키는 티아졸리딘디온 (가령, 로시글리타존 (AVANDIA), 트로글리타존 (REZULIN), 피오글리타존 (ACTOS), 글리피지드, 바라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, AMG 131, MBX2044, 미토글리타존, 로베글리타존, IDR-105, 트로글리타존, 엔글리타존, 씨글리타존, 아다글리타존, 다르글리타존; 5) DPP-IV 저해물질들 (가령, 알로글립틴, 오마리글립틴, 리나글립틴, 빌다글립틴 (GALVUS) 및 시테그립틴 (JANUVIA))이 포함된 글루카곤-유사-펩티드 그리고 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 GLP-1 항진제 및 유사체들 (가령, 엑세나티드 (BYETTA 및 ITCA 650 (12-개월 기간에 걸쳐 엑세나티드 유사체를 운반하는 피하로 삽입되는 삼투 펌프; Intarcia, Boston, MA)) 및 GLP-1 수용체 항진제 (가령, 두라글루티드, 세마글루티드, 알비글루티드, 엑세나티드, 리라글루티드, 리시세나티드, 타스포글루티드, CJC-1131, 그리고 BIM-51077, 및 비강을 통한, 경피를 통한 및 주당 일회 이의 제형 포함); 6) 그리고 DPP-IV-저항 유사체 (인크레틴 모방체), PPAR 감마 항진제, PPAR 알파 항진제, 이를 테면 페노피브린산 유도체들 (가령, 겜피브로질, 클로피브레이트, 시프로피브레이트, 페노피브레이트, 벤자피브레이트), 이중-작용 PPAR 항진제 (가령, ZYH2, ZYH1, GFT505, 치글리타자르, 무라글리타자르, 아레글리타자르, 소델글리타자르, 그리고 나제글리타자르), 범-작용 PPAR 항진제, PTP1B 저해물질들 (가령, ISIS-113715 및 TTP814), SGLT 저해물질들 (가령, ASP1941, SGLT-3, 엠파글리플로진, 다파글리플로진, 카나글리플로진, BI-10773, PF-04971729, 레모글로플로진, TS-071, 토포글리플로진, 이프라글리플로진, 그리고 LX-4211), 인슐린 분비촉진제, 앙지오텐신 전환 효소 저해물질들 (가령, 알라세프릴, 베나제프릴, 캅토프릴, 세로나프릴, 칠라자프릴, 델라프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 이미다프릴, 리시노프릴, 모벨티프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 스피라프릴, 테모카프릴, 또는 트란돌라프릴), 앙지오텐신 II 수용체 길항제 (가령, 로사르탄 가령, COZAAR®, 발사르탄, 칸데사르탄, 올메사르탄, 텔메사르탄 그리고 히드로클로로티아지드, 이를 테면 HYZAAR®와 복합되어 이용되는 이들 약물중 임의의 것) 또는 다른 항-고혈압 약물 이를 테면 LCZ 696, RXR 항진제, 글리코겐 합성효소 키나제-3 저해물질들, 면역 조절물질, 교감제( sympatholitics), 베타-아드레날린 차단 약물 (가령, 프로프라놀올, 아테놀올, 비소프롤올, 카르베디롤, 메토프롤올, 또는 메토프롤올 타르테이트), 알파 아드레날린 차단 약물 (가령, 독사조신, 프라조신 또는 알파 메틸도파) 중추 알파 아드레날린 항진제, 말초 기관지확장제 (가령 히드랄라진); 베타-3 아드레날린 수용체 항진제, 11베타-HSD1 저해물질들, 중성 엔도펩티다제 저해물질들 (가령, 티오르판 및 포스포라미돈), 알도스테론 길항제, 알도스테론 합성효소 저해물질들, 레닌 저해물질들 (가령 디- 및 트리-펩티드의 요소 유도물질 (U.S. 특허 번호 5,116,835), 아미노산 및 유도체들 (U.S. 특허 5,095,119 및 5,104,869), 비-펩티드 결합에 의해 연계된 아미노산 쇄들 (U.S. 특허 5,114,937), 디- 및 트리-펩티드 유도체들 (U.S. 특허 5,106,835), 펩티딜 아미노 디올 (U.S. 특허 5,063,208 및 4,845,079) 및 펩티딜 베타-아미노아실 아미노디올 카르바메이트 (U.S. 특허 5,089,471); 또한 다음의 U.S. 특허 5,071,837; 5,064,965; 5,063,207; 5,036,054; 5,036,053; 5,034,512 및 4,894,437에서 공개된 다양한 다른 펩티드 유사체들, 그리고 작은 분자 레닌 저해물질들 (디올 술폰아미드와 술피닐 (U.S. 특허 5,098,924), N-몰포리노 유도체들 (U.S. 특허 5,055,466), N-헤테로시클릭 알코올 (U.S. 특허 4,885,292) 및 피롤이미다졸론 (U.S. 특허 5,075,451) 포함; 또한, 펩스타틴 유도체들 (U.S. 특허 4,980,283) 그리고 스타톤-함유 펩티드들의 플루오르- 및 클로로-유도체들 (U.S. 특허 5,066,643), 에날크레인, RO 42-5892, A 65317, CP 80794, ES 1005, ES 8891, SQ 34017, 알리스키렌 (2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-카르바모일-2-메틸프로필)-5-아미노-4-히드록시-2,7-디이소프로필-8-[4-메톡시-3-(3-메톡시프로폭시)-페닐]-옥타나미드 헤미푸마레이트) SPP600, SPP630 및 SPP635), 엔도테린 수용체 길항제, 포스포디에스테라제-5 저해물질들 (가령 실데나필, 타달필 및 바르데나필), 기관지확장제, 칼슘 채널 차단제 (가령, 암로디핀, 니페디핀, 베라파르밀, 딜티아젬, 갈로파밀, 니루디핀, 니모디핀, 니카르디핀), 칼슘 채널 활성물질 (가령, 니코란딜, 피나시딜, 크로마칼림, 미녹시딜, 아프릴칼림, 로프라조람), 지질 강하 물질들 가령, HMG-CoA 환원효소 저해물질들, 이를 테면 락톤 프로-드럭 형태의 ZOCOR® 및 MEVACOR®으로 시판되고, 투여후 저해제로 기능을 하는 심바스타틴과 로바스타틴, 그리고 디히드록시 개방링 산 HMG-CoA 환원효소 저해물질들의 약학적으로 수용가능한 염, 이를 테면 아토르바스틴 (특히 LIPITOR®으로 시판되는 칼슘염), 로수바스틴 (특히 CRESTOR®으로 시판되는 칼슘염), 프라바스틴 (특히 PRAVACHOL®으로 시판되는 나트륨염), 쎄리바스틴, 그리고 플루바스틴 (특히 LESCOL®으로 시판되는 나트륨염); 콜레스테롤 흡수 저해제, 이를 테면 에제티미베 (ZETIA®) 및 임의의 다른 지질 강하 물질들, 이를 테면 상기에서 명시된 HMG-CoA 환원효소 저해물질들와 복합된, 특히 심바스틴 (VYTORIN®) 또는 아토르바스틴 칼슘과 복합된 에제티미베; HDL-상승 약물, (가령, 니아신과 니코틴산 수용체 항진제, 그리고 이의 연장된- 또는 조절된-방출 형태, 및/또는 HMG-CoA 환원효소 저해제와 함께; 니아신 수용체 항진제, 이를 테면 아시피목스 및 아시프란, 뿐만 아니라 니아신 수용체 부분 항진제; 글루카곤 수용체 길항제 (가령, MK-3577, MK-0893, LY-2409021 및 KT6-971); 담즙산 격리 물질들 (가령, 콜레스틸란, 콜레스티미드, 콜레세발암 히드로클로라이드, 콜레스티폴, 콜레스티라민, 그리고 가교-연계된 덱스트란의 디알킬아미노알킬 유도체들), 아실 CoA:콜레스테롤 아실전이효소 저해물질들, (가령, 아바시미베); 염증 상태에 사용되도록 의도된 물질들, 이를 테면 아스피린, 비-스테로이드성 항-염증성 약물 또는 NSAIDs, 글루코코르티코이드, 그리고 선택성 시클로옥시게나제-2 또는 COX-2 저해물질들; 글루코키나제 활성물질 (GKAs) (가령, AZD6370); 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소 유형 1의 저해물질들, (가령, 이를 테면 U.S. 특허 No. 6,730,690, 그리고 LY-2523199에서 공개된 것들); CETP 저해물질들 (가령, 아나세트라피브, 에바체트라피브, 그리고 토르세트라피브); 과당 1,6-비스포스파타제의 저해물질들 (가령, 이를 테면 U.S. 특허 번호 6,054,587; 6,110,903; 6,284,748; 6,399,782; 그리고 6,489,476에서 공개된 것들); 아세틸 CoA 카르복실라제-1 또는 2 (ACC1 또는 ACC2)의 저해물질들; PCSK9 저해물질들; GPR-40 부분 항진제; SCD 조절물질; 지방산 합성효소의 저해물질들; 아밀린과 아밀린 유사체들 (가령, 파람린티드); 화확적으로 이용가능한 경우 상기 활성이 있는 물질들의 약학적으로 수용가능한 염 형태들을 포함한다.
더욱이, 본 명세서는 체중 감량을 촉진시키기 위한 물질들과 방법들, 이를 테면 대사를 촉진시키거나 또는 식욕 감소시키는 물질들, 그리고 체중 감량을 촉진시키는 변형된 식사 및/또는 운동 섭생과 함께 복합 요법을 고려한다.
본 명세서의 폴리펩티드는 환경하에 적합한 임의의 방식으로 하나 또는 그 이상의 다른 물질과 복합되어 이용될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과 최소한 한 가지 본 명세서의 폴리펩티드를 이용한 치료는 일정 시간에 걸쳐 유지된다. 또다른 구체예에 있어서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과의 치료는 감소 또는 중단되고 (가령, 대상이 안정적인 경우), 한편 본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)을 이용한 치료는 일정한 투약량 섭생으로 유지된다. 추가 구체예에서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과의 치료는 감소 또는 중단되고 (가령, 대상이 안정적인 경우), 한편 본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)을 이용한 치료는 감소된다 (가령, 분량을 더 낮추거나, 투여빈도를 덜 하거나 또는 더 짧은 치료 섭생). 여전히 또다른 구체예에서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과의 치료는 감소 또는 중단되고 (가령, 대상이 안정적인 경우), 그리고 본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)을 이용한 치료는 증가된다 (가령, 분량을 더 높이거나, 투여빈도를 더 자주하거나 또는 더 긴 치료 섭생). 여전히 또다른 구체예에서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과의 치료는 유지되고, 본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단된다 (가령, 분량을 더 낮추거나, 투여빈도를 덜 하거나 또는 더 짧은 치료 섭생). 여전히 또다른 구체예에서, 최소한 한 가지 활성이 있는 물질과의 치료와 본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)을 이용한 치료는 감소 또는 중단된다 (가령, 분량을 더 낮추거나, 투여빈도를 덜 하거나 또는 더 짧은 치료 섭생).
투여(Dosing)
본 명세서의 폴리펩티드는 예를 들면, 투여 목적 (가령, 바람직한 해결 정도); 연령, 체중, 성별, 그리고 건강 및 치료 대상의 신체 상태; 상기 폴리펩티드의 성질, 및/또는 투여되는 제형의 성질; 투여 경로; 그리고 질환, 장애, 상태 또는 이의 증후의 성질 (가령, 포도당/인슐린의 조절이상의 중증도 및 장애 단계)에 의존적인 양으로 대상에게 투여될 수 있다. 투약량 섭생은 투여되는 물질(들)과 연합된 임의의 유해효과의 존재, 성질 및 그 정도를 또한 고려해야 할 수도 있다. 효과적인 투약량과 투약 섭생은 예를 들면, 안전성 및 약량-단계적 확대(escalation) 시험, 생체내 연구 (가령, 동물 모델), 그리고 당업자에게 공지된 다른 방법들로부터 용이하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 투여 매개변수는 투여량은 대상에게 비가역적 독성이 될 수 있는 양 (가령, 최대 내성이 되는 투여량, ＂MTD＂)보다 적어야 하고, 그리고 대상에게서 측정가능한 효과를 만들수 있는데 요구되는 양보다 적지 않아야 한다고 지시한다. 이러한 양은 예를 들면, 투여 경로 및 다른 인자들을 고려하여 흡수, 분포, 대사, 그리고 방출 (＂ADME＂)과 연합된 약리역학적 그리고 약물력학적 매개변수에 의해 결정된다
효과적인 투여량 (ED)은 이를 취하는 대상들중 일부에서 치료요법적 반응 또는 바람직한 효과를 만들어낼 수 있는 물질의 양 또는 투여량이다. 물질의 ＂중간 유효 용량(median effective dose)＂ 또는 ED50이란 이 물질이 투여된 집단의 50%에서 치료요법적 반응 또는 바람직한 효과를 만들어낼 수 있는 물질의 양 또는 투여량이다. 비록 ED50이 물질의 효과를 합리적으로 예측하는 척도로 이용되지만, 반드시 임상의가 모든 관련 인자들을 적절히 고려하여 용량을 생각할 필요는 없다. 따라서, 일부 경우에서 상기 효과량은 산출된 ED50보다 더 많고, 다른 경우들에서 상기 효과량은 산출된 ED50보다 더 적고, 그리고 여전히 다른 상황에서 상기 효과량은 산출된 ED50과 동일하다.
또한, 본 명세서의 폴리펩티드(들)의 효과적인 용량은 대상에게 하나 또는 그 이상의 용량으로 투여될 때, 건강한 대상과 비교하여 바람직한 결과를 만들어내는 양이 될 것이다. 예를 들면, 효과적인 투여량은 상승된 혈장 포도당 및/또는 혈장 인슐린을 갖는 대상에게 투여될 때, 건강한 대상의 것과 비교하여 최소한 약 10%, 최소한 약 20%, 최소한 약 25%, 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 최소한 약 50%, 최소한 약 60%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 또는 80% 이상의 바람직한 감소를 획득하는 양이 될 수 있다.
적절한 투약량 수준은 일반적으로 일일 약 0.001 내지 100 mg/환자 체중 kg이며, 이는 단일 또는 다중 투여분량으로 투여될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 투약량 수준은 일일 약 0.01 내지 약 25 mg/kg이며, 그리고 다른 구체예들에 있어서 일일 약 0.05 내지 약 10 mg/kg이 될 것이다. 적합한 투약량 수준은 일일 약 0.01 내지 25 mg/kg, 약 0.05 내지 10 mg/kg, 또는 약 0.1 내지 5 mg/kg일 수 있다. 이 범위 안에서, 상기 투약량은 일일 0.005 내지 0.05, 0.05 내지 0.5 또는 0.5 내지 5.0 mg/kg일 것이다.
경구 물질의 투여를 위하여, 상기 조성물은 1.0 내지 1000 mg의 활성이 있는 성분, 특히 1.0, 3.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, 그리고 1000.0 mg의 활성이 있는 성분이 포함된 테블릿, 캡슐 및 이와 유사한 형태로 제공될 수 있다. 상기 폴리펩티드(들)은 예를 들면, 일일 1 내지 4회, 그리고 대개 하루에 한 번 또는 두 번의 섭생으로 투여될 수 있다.
본 명세서의 상기 폴리펩티드(들)의 투여는 적절한 빈도로 반복될 수 있는데, 이는 상기 폴리펩티드(들)의 약리역학 (가령 반감기) 및 약물력학적 반응 (가령 상기 폴리펩티드(들)의 치료요법적 효과 기간)에 따라 하루에 한 번 내지 3개월에 한 번의 범위가 될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 투약은 일주일에 한 번 내지 매 3개월에 한 번 사이에서 빈번히 반복된다. 다른 구체예들에 있어서, 폴리펩티드(들)은 대략 한달에 한 번 투여된다.
특정 구체예들에 있어서, 공개된 폴리펩티드(들)의 투약량은 ＂단위 투약량 형태＂ 안에 포함된다. 구절 ＂단위 투약량 형태＂란 물리적으로 별개 단위를 말하는데, 각 단위 안에는 본 명세서의 폴리펩티드(들) 단독으로, 또는 바람직한 효과를 만드는데 충분한 하나 또는 그 이상의 추가적인 물질들과 복합되어 예정된 양이 포함되어 있다. 단위 투약량 형태의 매개변수는 특정 물질 및 얻는 효과에 따라 달라질 것임을 인지할 수 있을 것이다.
키트
본 명세서는 공개된 폴리펩티드(들), 그리고 약학 이의 조성물들이 포함된 키트를 또한 고려한다. 상기 키트는 하기에서 설명된 바와 같이 일반적으로 다양한 성분들을 수용하는 물리적 구조 형태를 하며, 그리고 예를 들면, 상기에서 설명된 상기 방법들 (가령, 폴리펩티드(들)을 체중 삭감이 필요한 대상에게 투여)을 실행하는데 이용될 수 있다.
키트는 본 명세서에서 공개된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드(들) (가령, 멸균 용기에 제공된)를 포함하고, 이는 대상에게 투여하는데 적합한 약학 조성물의 형태일 수 있다. 상기 폴리펩티드(들)은 즉시 사용가능한 형태 또는 예를 들면, 재구성 또는 투여 전 희석을 요하는 형태로 제공될 수 있다. 상기 폴리펩티드(들)이 사용자에 의해 재구성되어야 할 필요가 있는 형태인 경우, 이 키트는 상기 폴리펩티드(들)와 함께 포장되거나 또는 별도로 포함된 완충액, 약학적으로 수용가능한 부형제들, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 복합 요법이 고려될 때, 상기 키트는 몇 가지 물질을 별도로 포함하거나, 이들은 키트안에서 이미 복합되어 있을 수 있다. 키트의 각 성분은 개별 용기 안에 싸여있고, 모든 다양한 용기들은 단일 포장 안에 존재할 수 있다. 본 명세서의 키트는 그 안에 수용된 성분들을 적절하게 유지시키는데 필수적인 상태로 기획될 수 있다 (가령, 냉장 또는 냉동).
키트는 그 안의 성분들에 대한 식별 정도 및 이의 사용 지침 (가령, 투여량 매개변수, 활성이 있는 성분(들)의 작용 기전, 약리역학 및 약물력학, 유해효과, 금기사항, 등등이 포함된 임상 약리학)이 포함된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제작자 정보, 이를 테면 로트 번호와 유효기간을 포함할 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 가령, 물리적 구조 안에 별도 포함된 성분들이 수용된 물리적 구조에 통합되거나, 또는 키트 성분(가령, 앰플, 튜브 또는 바이알)에 부착될 수 있다. 예시적인 지침은 공개된 조절물질, 내지 약학 이의 조성물들로 혈당을 감소 또는 낮추거나, 고혈당증의 치료, 당뇨병의 치료 등등을 위한 것들을 포함한다.
라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독가능한 매체, 이를 테면 디스크 (가령, 하드 디스크, 카드, 메모리 디스크), 광학 디스크 이를 테면 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자석 테이프, 또는 전자적 저장 매체 배지 이를 테면 RAM 및 ROM 또는 이의 하이브리드, 이를 테면 자장/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리-유형 카트를 추가적으로 포함하거나, 이에 통합될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 실질적인 지침에 키트 안에 없지만, 이는 원격 원천, 가령, 인터넷을 통한 지침을 얻는 수단이 제공된다.
실험
다음의 실시예들은 본 발명이 어떻게 만들어지고, 이용되는지에 대한 완벽한 공개 및 설명을 당업계 숙련자들에게 제시하기 위하여 제공되는 것이며, 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 하기 실험등이 실행할 수 있는 모든 또는 유일한 실험으로 제시하려는 의도도 아니다. 이용된 수치(가령, 양, 온도, 등)에 있어서 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험적 오류 및 편차들은 고려되어야 한다.
다른 언급이 없는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 또는 실온이며, 압력은 대기압 또는 그 주변값이다. 다음의 것들이 포함된 표준 약어들이 이용되었다: bp = 염기 쌍(들); kb = 킬로베이스(들); pl = 피코리터(들); s 또는 sec = 초(들); min = 분(들); h 또는 hr = 시간(들); aa = 아미노산(들); kb = 킬로베이스(들); nt = 뉴클레오티드(들); ng = 나노그램; μg = 마이크로그램; mg = 밀리그램; g = 그램; kg = 킬로그램; dl 또는 dL = 데시리터; μl 또는 μL = 마이크로리터; ml 또는 mL = 밀리리터; l 또는 L = 리터; μM = 마이크로몰; mM = 밀리몰; M = 몰; kDa = 킬로달톤; i.m. = 근육내(로); i.p. = 복막내(로); s.c. = 피하(로); bid = 일일 2회; HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피; BW = 체중; U = 단위; ns= 통계적으로 유의성없음; PG = 공복혈장 포도당; FPI = 공복혈장 인슐린; ITT = 인슐린 내성 시험; PTT = 피루베이트 내성 시험; oGTT = 경구 포도당 내성 시험; GSIS = 포도당-자극된 인슐린 분비; PBS = 인산염-완충된 염수; PCR = 중합효소 쇄 반응; NHS = N-히드록시숙신이미드; DMEM = Dulbeco의 Eagle 변형 배지; GC = 게놈 복사수; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산.
물질들과 방법들
다음의 방법들과 물질들이 하기 실시예에서 이용된다:
동물. 식이-유도된 비만 (DIO) 수컷 C57BL/6J 마우스 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)들은 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질 및 20 kcal% 탄수화물이 포함된 고-지방 식사 (D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)를 12-20 주 동안 유지시켰다. 모든 동물 연구는 NGM Institutional Animal Care and Use Committee로부터 승인받았다. DIO C57BL/6J 마우스는 인간과-유사한 비만을 제공하고, 이때 비만은 과도한 칼로리 섭취에 의한 것이다. C57BL/6J 마우스는 비만-경향이 있고, 체중 증가 뿐만 아니라, 고인슐린혈증이 있고, 때로 고혈당증이 관찰된다. 이 계통은 식이-유도된 비만을 모델로 하기 위한 가장 흔히 사용되는 마우스 계통이다. (Nilsson C., et al., Acta Pharmacologica Sinica (2012) 33: 173-181).
핵산 및 아미노산 서열. GenBank 수탁 번호 BC000529.2는 ORF 인코딩 인간 GDF15 변이체의 cDNA를 제공하며, 그리고 GenBank 수탁 번호. NP_004855.2는 cDNA에 의해 인코드된 아미노산 서열을 제공한다. 호모 사피엔스(Homo sapiens) 혈청 알부민 cDNA은 Origene (SC319937), GeneBank 수탁 번호. NM_000477.3, NP_000468)로부터 구입되었다.
Kozak 요소 및 인간 IgK-신호 펩티드 서열 (5＇CACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT3＇) (서열 번호: 98)은 pTT5 벡터 (National Research Council Canada)의 PmeI 부위와 EcoRI 부위 사이에 삽입되었다. 이들 두 제한효소절단 부위는 제거되었지만, 추가 인-프레임(in-frame) 클로닝을 위하여 AgeI 부위가 만들어졌다. hIgK-GDF15 구조체를 만들기 위하여, GDF15 DNA는 포워드 프라이머: 5＇-CTCCGAGGTGCCAGATGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGG 3＇ (서열 번호: 102)와 리버스 프라이머: 5＇-CCTCGAGCGGCCGCTAGCTCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGCTAACAA 3＇ (서열 번호: 99) 및 Sapphire PCR 믹스 (Clontech)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물은 겔-정제되었고 (Qiagen 겔 추출 키트), In-Fusion (Clontech)을 이용하여 pTT5-hIgK (AgeI/HindIII으로 선형화됨) 안에 클론되었다. hIgK-HSA-링커-GDF15 구조체를 만들기 위하여, HSA-링커와 GDF15는 적절한 프라이머를 이용하여 개별적으로 PCR에 의해 증폭되었다. 겔-정제 후, 2개의 PCR 단편들과 선형화된 pTT5 벡터는 Gibson Assembly Master Mix를 이용하여 어셈블되었다. Stellar 또는 NEB 5α-세포들은 In-Fusion 및 Gibson 반응을 각각 이용하여 형질변환되었고, 카르베니실린이 포함된 LB-한천 플레이트 상에 도말되었고, 그리고 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 단일 콜로니를 찍어내어, 서열화에 의해 분석되었다. 양성 콜로니로부터 DNA가 정제되었고 (DNA-Maxi-prep, Qiagen), 완전한 서열이 확인되었으며, 그리고 재조합 단백질 발현을 위하여 포유류 세포에 형질감염시키는데 이용되었다.
특이적 뮤테인을 만들기 위하여, 부위 지향된 돌연변이생성은 QuikChange Lightning 키트 (Agilent)와 적절한 프라이머로 실행되었다.
일시적 발현. 모든 GDF15 뮤테인은 Expi 293F 세포들 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)에 일시적으로 형질감염되었다. 세포들은 통상적으로 Expi 발현 배지 (Invitrogen)에 준-배양되었고(sub-cultured), 그리고 다양한 크기의 교반 플라스크 안에서 현탁 배양물로 유지되었다. 전형적으로, 세포들은 5e5 생존 세포/ml의 밀도로 준-배양되었으며, 그리고 준-배양 전, 3 일 동안 성장시켰다. 플라스크는 37℃, 5% CO2가 유지되는 가습 CO2 배양기에서 유지되었다. 세포들은 120 RPM의 교반 속도에서 New Brunswick 교반 플랫포옴(New Brunswick Scientific Company, Edison, NJ) 상에 유지되었다.
배양물의 세포 밀도가 95% 이상의 생존능에서 2.5e6 생존 세포/ml에 도달되었을 때 형질감염이 실행되었다. 전형적으로, 50 ml 형질감염의 경우, 2.5e6 세포/ml X 50 ml 세포들은 250 ml의 교반 플라스크 안에 42.5 ml 배양물 용적으로 접종되었다. 관심 대상 유전자가 포함된 발현 벡터로 구성된 50 μg의 플라스미드 DNA는 2.5 ml의 OPTI-MEM 환원된 혈청 배지 (Invitrogen)에 우선 희석되었다. 동시에 Expifectamine 형질감염 시약 (Invitrogen), 2.67배 용적(플라스미드 DNA 양의)은 또한 2.5 ml의 OPTI-MEM 환원된 혈청 배지에 희석되었다. 실온에서 5분 항온처리 후, 희석된 형질감염 시약이 상기 희석된 플라스미드 DNA에 서서히 추가되어 형질감염 컴피턴트(competent) 복합물이 형성되었다. 20 분 동안 실온에서 항온처리 후, 5 ml의 형질감염 복합물(complex)이 42.5 ml의 상기 세포 배양물에 추가되었다. 형질감염된 세포들은 그 다음 가습 CO2 배양기의 120 RPM에서 유지된 오비탈 쉐이크 안에 두었다. 형질감염 후 24 시간 후, 상기 형질감염된 배양물에 250 μl의 인헨서 1 용액 (Invitrogen)과 2.5 ml의 인헨서 2 용액 (Invitrogen)이 공급되었다. 그 다음 상기 배양물은 가습 CO2 배양기의 오비탈 쉐이크 상에 두었다. 형질감염 후 6-7 일차에 배양물은 3000 RPM에서 30분 동안 원심분리에 의해 수거되었고, 그 다음 0.2 μm 필터 (Nalgene)를 통하여 여과되었다. 그 다음 시료는 발현에 대하여 코마시(coomassie) 착색 겔 상에서 분석되었다.
안정적인 CHO 세포 발현. GDF15 뮤테인은 CHOK1SV 세포들에 대하여 Lonza의 잘 확립된 발현 시스템에 기초된 CHOK1SV GS-KO 숙주 세포 계통과 함께 GS XceedTM System으로부터 안정적으로 발현되었다. 상기 GS Xceed System은 cGMP 제작에 적합한 고발현 세포 계통을 만들 수 있도록 한다. 상기 시스템은 cGMP 뱅크화된 CHOK1SV GS-KO 숙주 세포들, GS 발현 벡터들, 세포 배양물, 형질감염, 세포 계통의 선별 및 스크리닝, 그리고 v8 생산 공정(배지 및 공급)에 대한 완전한 프로토콜을 포함한다. GDF15 뮤테인을 위한 세포 계통의 개발에 있어서, 제작사의 제안 권고사항은 우선 클론안된 세포 계통을 만들기 위한 것이다. 클론 안된 세포 계통들은 그 다음 고발현 단일 세포 클론을 단리시키기 위하여 제한된 희석 클로닝을 겪는다.
GDF15 재조합 단백질의 정제. HSA-GDF15 융합은 블루 세파로스 친화력 포획 또는 이온-변화(Ion-Change) 포획을 이용하여 배양된 배지로부터 정제되었다. 이 두 경우에서, HSA-GDF15 융합은 최적 용리 및 숙주 세포 단백질 불순물로부터 분리에 좋은 적절한 그라디언트 염/pH 조건을 이용하여 용리되었다. 모든 HSA-GDF15 융합은 그 다음 GE Healthcare Superdex 200 (26/60) 컬럼에서 운용 완충액(running buffer)으로 1X PBS를 이용하여 추가 정제되었다. 정제된 융합은 더 특징화되었고, LC/MS (Agilent 6500-시리즈 Q-TOF)로 서열 확인되었으며, 단분산성(monodispersity)은 겔-여과-HPLC (Agilent 1200-HPLC) 및 코마시 및/또는 은 착색과 함께 SDS-PAGE 겔 (비-환원 그리고 환원)를 통하여 확인되었다. 생체내 실험을 위하여, 내독소(Endotoxin)는 피하 주사용으로 5EU/mg 미만으로 확인되었다.
GDF15 당화 뮤테인은 이온-교환 포획을 통하여 배양된 배지로부터 정제되었다. 이모든 경우에서, GDF15 뮤테인은 최적 용리 및 숙주 세포 단백질 불순물로부터 분리에 좋은 적절한 그라디언트 염/pH를 이용하여 용리되었다. 그 다음 모든 GDF15 뮤테인은 GE HiTrap 페닐 HP, pH 8.0에서 암모늄 황산염의 감소하는 선형 그라디언트를 이용하여 더 정제되었다. 분획들이 평가되었고, 순도 및 비-환원 SDS-PAGE 겔 상에서 겔-변위를 통한 당화 성질에 근거하여 풀링되었다(pooled). 그 다음 각 GDF15 뮤테인의 최종 풀(pools)은 더 특징화되었고, LC/MS (Agilent 6500-시리즈 Q-TOF)와 함께 서열/글리칸 확인되었으며(+/- PNGase F, NEB Cat. #P0704S), 단분산성(monodispersity)은 겔-여과-HPLC (Agilent 1200-HPLC) 및 코마시 및/또는 은 착색과 함께 SDS-PAGE 겔 (비-환원 그리고 환원)를 통하여 확인되었다. 모든 GDF15 뮤테인은 10mM 아세테이트 나트륨 pH 4.0에서 제형화되었다.
인간 GDF15 뮤테인의 용해도 평가. 뮤테인은 0.01% (v/v) 포름산 (pH 2.0)으로 투석되었고, 재생 니트로셀룰로오스 10,000 NMWL (UFC901096)로 구성된 Amicon 한외 원심분리 필터를 이용하여 농축되었고, 일부 경우에 있어서 10mg/mL 이상이었다. 각 뮤테인의 시작 농도는 280nm 파장 및 Beer의 법칙 (흡광계수 = 14400, 분자량 = 12,287Da)에서 흡수도를 이용하여 결정되었다. 그 다음 각 뮤테인은 0.01% 포름산으로 2배-역(fold back) 연속 역희석되었고, 각 희석물 90μL이 96-웰 플레이트에 추가되었다. 10μL의 10X PBS (0.5M 트리스 pH 7.0 함유)가 각 웰에 추가되었고, pH는 7로 확인되었다. 교반하면서 실온 하룻밤 동안 항온처리 후, 탁도는 370nm에서 측정되었다. 탁도가 발생되는 시점에서 굴절점(inflection point)이 각 뮤테인의 최대 용해도로 수용된다. 뮤테인은 용해도 수준에 근거하여 5개 그룹중 하나로 분류된다: < 0.2mg/mL = +; ≥ 0.2mg/mL = ++; ≥ 0.5mg/mL = +++; ≥ 1.0mg/mL = ++++; ≥ 5.0mg/mL = +++++.
실시예 1: 안정화된 HSA - GDF15 융합 분자의 작제
구조체 M1의 발현은 CHOK1SV GSKO 안정 세포 계통에서 생산 검사를 나타내었다 (도 4). HSA-GDF15 이량체 융합 분자의 상당한 클리핑(clipping)이 세포 배양물 배지에서 관찰되었다. 클립된(Clipped) 종들은 이온-교환 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 겔 여과를 이용하여 단리되어, 추가 특징화를 위한 농축된 종의 원천이 만들어졌다. Agilent 6500-시리즈 Q-TOF 상에서 LC/MS 분석 후, HSA 융합의 C-말단, 링커, 그리고 GDF15의 N 말단에서 클리핑 부위들이 눈에 띄었다. 구조체 M1으로부터 주요 종들은 다음과 같이 확인되었다 (링커 = 밑줄친부분, GDF15 = 굵은 부분):
종(Species) 1 (서열 번호:103):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA
종 2 (서열 번호:104):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALG
종 3 (서열 번호:105):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLG
종 3은 성숙한 인간 혈청 알부민 아미노산 서열과 링커 서열의 하나(첫)의 아미노산을 포함한다. 종 1과 종 2는 마지막 8개 아미노산과 성숙한 인간 혈청 알부민 아미노산 서열의 C-말단에서 마지막 한 개 아미노산이 유실되어 있다.
종 4 (서열 번호:106):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGS AR
종 5 (서열 번호:107):
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGS ARN
상기 융합 분자의 링커 영역 부근에서 관찰된 클리핑 문제를 최소화하고 교정하기 위하여, 구조체 M2은 구조체 M1과 대등하지만, 그러나 GDF15에서 첫 3개 N-말단 잔기 절두된 (ΔARN 또는 ΔN3) 것으로 기획되었다 (도 3). 생성된 안정화된 M2 구조체는 CHOK1SV GSKO 안정 세포 계통에서 발현되었을 때, 각 발현된 구조체에 있어서 조건화된 배지에서 비교되었을 때, M1에서 관찰된 클리핑 문제가 최소한으로 나타났다. 도 4는 M1에서 관찰된 상당한 클리핑과 구조체 M2의 안정성을 설명한다.
구조체 M2에서 관찰된 한정성 강화에 근거하여, 최적 링커 길이 및 클리핑 가능성에 대하여 추가 제작이 이루어졌다. [(G4S)]5의 최적화된 링커 길이를 얻었고, 3개 잔기들 (M3 - ΔARN 또는 ΔN3) 또는 6개 잔기들 (M4 - ΔARNGDH 또는 ΔN6)의 GDF15 N-말단 결손과 연결되었다 (도 5 참고).
실시예 2: DIO 마우스 모델에서 체중 및 식품 섭취에 있어서 안정성 증가된 HSA - GDF15 융합 분자의 효과
재조합 인간 GDF15에 융합된 재조합 HSA를 갖는 피하 투여된 융합 분자의 체중 및 식품 섭취에 대한 효과는 7일 기간에 걸쳐 평가되었다. 간략하게 설명하자면, 상기 융합 단백질 M1 (도 3), M3 및 M4 (도 5)는 4nmol/kg, 12nmol/kg 및 40nmol/kg의 투여량으로 단일 피하 볼루스 주사 (10mL/kg)에 의해 DIO 마우스(체중은 대략 38g-40g임)에게 투여되었다. 비이클 대조 또는 상기 융합 단백질의 투여 후, 효과를 관찰하기 위하여 투여 후 24시간 및 7일 시점에서 체중과 식품 섭취를 관찰하였다. 40nmol/kg 투여분량이 투여된 DIO 마우스에서 얻은 결과를 도 6 및 도 7에 제시한다.
도 6에 나타낸 것과 같이, 40nmol/kg (4nmol/kg 및 12nmol/kg은 나타내지 않음) 투여분량에서 상기 융합 단백질의 투여로 식품 섭취 감소에 상당한 개선이 있었다. 각 마우스 집단에서, n = 8 및 p-값 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001, ns=유의적이지 않음)은 각 명시된 시점에서 비이클 대조기와 다양한 농도에서 식품 섭취를 비교하는 스튜던트 비쌍체 T-테스트에 의해 결정되었다.
도 6을 참고하면, 비이클 대조와 비교하여 상기 융합 분자 투여 후 24 시간 (1 일차) 시점에서 다음과 같이 식품 섭취 삭감을 초래하였다 (비이클 = 2.8g +/- 0.13g): 4nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 1.9g +/- 0.25g, **; M3 = 1.8g +/- 0.18g, ***; M4 = 1.8g +/- 0.10g, ***), 12nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 1.5g +/- 0.19g, ***; M3 = 1.9g +/- 0.16g, ***; M4 = 1.7g +/- 0.12g, ***), 그리고 40nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 1.3g +/- 0.11g, ***; M3 = 1.8g +/- 0.06g, ***; M4 = 1.5g +/- 0.15g, ***). 투여 후 7 일 시점에서 비이클 대조와 비교하여 상기 융합 분자는 다음과 같이 식품의 섭취 감소를 초래하였다 (비이클 = 2.7g +/- 0.09g): 4nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 2.0 +/- 0.18g,**; M3 = 2.5g +/- 0.08g, ns; M4 = 2.5g +/- 0.09g, ns), 12nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 2.0g +/- 0.20g, **; M3 = 2.2g +/- 0.17g, *; M4 = 2.4g +/- 0.28g, ns) 그리고 40nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 1.7g +/- 0.14g, ***; M3 = 2.4g +/- 0.25g, ns; M4 = 2.2g +/- 0.24g, ns).
도 7에 나타낸 것과 같이, 40nmol/kg (4nmol/kg 및 12nmol/kg은 나타내지 않음) 투여분량에서 상기 융합 단백질의 투여로 체중 감소에 상당한 개선이 있었다. 각 마우스 집단에서, n = 8 및 p-값 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001, ns=유의적이지 않음)은 각 명시된 시점에서 비이클 대조기와 다양한 농도에서 식품 섭취를 비교하는 스튜던트 비쌍체 T-테스트에 의해 결정되었다.
도 7을 참고하면, 비이클 대조와 비교하여 상기 융합 분자 투여 전 (일차=0) 시점에서, 다음과 같이 체중이 기록되었다 (비이클 = 39.0g +/- 0.92g): 4nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 39.2g +/- 0.66g; M3 = 39.4g +/- 0.91g; M4 = 39.3g +/- 0.77g), 12nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 39.4g +/- 0.78g; M3 = 39.3g +/- 1.09g; M4 = 39.3g +/- 0.81g), 그리고 40nmol/kg 투여량 집단 (M1 = 39.2g +/- 0.64g; M3 = 39.2g +/- 0.68g; M4 = 38.9g +/-0.60g). 비이클 대조와 비교하여 상기 융합 분자의 투여 후 24 시간 (일수=1) 시점에서 다음의 체중이 기록되었다 (감소 % = 델타 차이 vs. 투여량 투여-전 집단 체중). 비이클 = +0.3g +/- 0.11g, +0.6%), 4nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -0.6g +/- 0.21g, -1.5%, ***; M3 = -0.6g +/- 0.17g, -1.6%, ***; M4 = -0.9g +/- 0.13g, -2.4%, ***), 12nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -0.9g +/- 0.11g, -2.3%, ***; M3 = -0.7g +/- 0.18g, -1.6%, ***; M4 = -0.6g +/- 0.16g, -1.7%, ***), 그리고 40nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -1.0g +/- 0.14g, -2.5%, ***; M3 = -0.6g +/- 0.09g, -1.5%, ***; M4 = -0.8g +/-0.22g, -2.1%, ***). 비이클 대조와 비교하여 상기 융합 분자의 투여 후 7일차 시점에서 다음의 체중이 기록되었다 (% 감소 = 델타 차이 vs. 전-투여 투여량 집단 체중). 비이클 = +1.2g +/- 0.25g, +3.1%), 4nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -1.3g +/- 0.30g, -3.3%, ***; M3 = -1.1g +/- 0.32g, -2.8%, ***; M4 = -2.0g +/- 0.29g, -5.0%, ***), 12nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -1.8g +/- 0.34g, -4.7%, ***; M3 = -1.4g +/- 0.43g, -3.6%, ***; M4 = -1.5g +/- 0.32g, -3.7%, ***), 그리고 40nmol/kg 투여량 집단 (M1 = -2.6g +/- 0.28g, -6.7%, ***; M3 = -2.1g +/- 0.28g, -5.4%, ***; M4 = -2.6g +/-0.31g, -6.7%, ***).
도 6 및 도 7의 데이터는 링커 최적화 및 GDF15의 N-말단 절두를 가진 HSA 융합은 활성이 있고, 그리고 이러한 융합 분자는 GDF15 분자의 특정 유익한 성질을 강화시키는 실행가능한 접근방법으로 제시됨을 설명한다.
실시예 3: 물리적 성질들이 개선된 인간 GDF15 뮤테인
실시예 3에서 제시된 데이터는 표면 소수성과 성숙한 인간 GDF15에 고유한 친수성과 연합된 용해도 한계를 해결한다. 또한, 성숙한 인간 GDF15의 서열과 함께 N-연계된 당화 콘센수스 부위(들)의 도입 용해도에서 효과가 평가되었다. 발현 특징; 당화 성질들 그리고 성숙한, 재조합 인간 GDF15 뮤테인의 용해도들의 평가를 용이하게 하기 위하여, 모두다 IgK 신호 펩티드 서열과 융합된 성숭한 뮤테인으로 구축되었고, 이는 도 8a에 도시된다. 17개의 GDF15 뮤테인 (M5-M21로 표시됨; 차례로 서열 번호: 81-97)이 생성되었다. M16의 경우, N-말단 결손된 형태: ΔN3-M16 뮤테인이 생성되었고, 이의 용해도가 결정되었다. M5 뮤테인은 wt GDF15 (서열 번호: 1)의 위치 5의 D를 T로 대체하고, wt GDF15 (서열 번호: 1)의 위치 21에서 R을 N으로 대체시킴으로써, 도입된 2개의 N-연계된 당화 콘센수스 부위를 포함한다. 뮤테인 M6-M21에서 한 개의 N-연계된 당화 콘센수스 부위가 도입되었다 (도 8a 참고). 상기 뮤테인은 치환 위치를 언급하기 위한 목적으로 N-말단에 IgK 신호 서열이 도입되었지만, 잔기들은 서열 번호: 1에서 대응하는 잔기 위치로 번호매김된다. 따라서, 예를 들면, T는 M5 뮤테인에서 위치 27에 있지만, 서열 번호: 1에서 대응하는 D 잔기 위치는 5이기 때문에, 위치 5로 언급된다.
성숙한 인간 GDF15과 비교하여 뮤테인에서 용해도 개선에 대하여 평가하기 위하여, 용해도 평가는 스트린젼트 완충액, 10X PBS + 0.5M 트리스 pH 7.0에서 스파이크를 통하여 뮤테인 (0.01% 포름산 안에서) 실시되었다.
용해도의 평가는 흡광계수 (성숙한 인간 GDF15 = 14,400/단량체) 및 분자량 (성숙한 인간 GDF15 = 12,278Da/단량체)을 이용하여 산출된 Beer 규칙을 이용하여 280nm에서의 흡수도에 근거하여 결정되었다.
용해도 평가에 앞서, 작제된 N-글리칸 뮤테인 각각은 도 8a에서 제시되며, ΔN3-M16 뮤테인은 폴드된(folded) GDF15 동종이량체로써 포유류 조직 배양물 배지 안으로 분비 및 N-글리칸 부위 점유(occupancy)에 대하여 모두 평가되었다. 도 9에서 제시된 바와 같이, 18개의 당화된 뮤테인중 14개는 폴드된 GDF15 동종이량체로 분비되었고, 반면 M8, M10, M14 및 M15는 이량체 형성이 되지 않고, 응집물(aggregates)로 발현되었다. 동종이량체로 분비된 14개의 모든 발현된 당화 뮤테인은 조건화 배지로부터 정제 후, 콘센수스 부위에서 N-글리칸 기 점유를 결정하기 위하여 LC/MS와 SDS-PAGE 겔 변위에 의해 평가되었다. 14개 경우 모두에서 상기 발현된 뮤테인은 높은 수준의 점유를 포함하고 있으며, 물리적 성질들, 이를 테면 용해도에 개선에 대하여 하위-세트들이 분석되었다.
성숙한 인간 GDF15와 비교하여 용해도 개선에 대하여 동종이량체로 분비되고, 콘센수스 부위 안에 높은 글리칸 점유를 가진 작제된 N-글리칸 GDF15 뮤테인을 관찰하였다. 탁도가 발생되는 시점에서 굴절점(inflection point)이 각 뮤테인의 최대 용해도로 수용된다. 뮤테인은 용해도 수준에 근거하여 5개 그룹중 하나로 분류된다: < 0.2mg/mL = +; ≥ 0.2mg/mL = ++; ≥ 0.5mg/mL = +++; ≥ 1.0mg/mL = ++++; ≥ 5.0mg/mL = +++++. 평가된 각 N-글리칸 GDF15 뮤테인은 성숙한 인간 GDF15와 비교하여 개선된 용해도를 나타내었다: M5: ++++, M7: +++, M11: +++, M12: +++, M13: ++++, M16: +++++, ΔN3-M16: +++++, M17: +++++, M20: ++++, M21: +++.
실시예 4: DIO 마우스 모델에서 식품 섭취에 있어서 M16, ΔN3 -M16 및 M17 뮤테인의 효과
식품 섭취에 있어서 피하 투여된 글리코뮤테인의 효과가 평가되었다. 글리코뮤테인 M16 (서열 번호: 92) 및 M17 (서열 번호: 93)는 상기 실시예 3에서 설명된다. ΔN3-M16로 명시된 글리코뮤테인 또한 평가되었다. ΔN3-M16 글리코뮤테인의 서열은 하기와 같이 제시된다:
mdmrvpaqllgllllwlrgarcGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQNTTTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열 번호: 100)
마우스에 투여된 폴리펩티드들은 IgK 신호 서열 (mdmrvpaqllgllllwlrgarc, 서열 번호: 101)을 포함하고 있지 않는데, 그 이유는 IgK 신호 서열이 세포들 (293 세포들)에 의해 발현된 신호 펩티다제에 의해 분비된 폴리펩티드로부터 절단되기 때문이다.
도 10을 참고하면, 17주령의 수컷 DIO 마우스 (n = 9)에게 단일 1.0 mg/kg (40 nmol/Kg) 투여량의 PBS 비이클, 성숙한 인간 GDF15 또는 N-글리칸 뮤테인의 피하 투여되었다. 피하 투여 후 24시간에 걸쳐 식품 섭취 (g/동물)가 관찰되었다. P-값은 비이클 (PBS) 대조군과 비교하여 비-쌍체 스튜던트 T-테스트에 의해 결정되었다.
도 10을 참고하면, 글리코뮤테인의 투여로 식품 섭취가 감소되었다. 각 마우스 집단에서, p-값은 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) 비이클 대조군과 비교하여 식품 섭취를 비교하는 스튜던트 비쌍체 T-테스트에 의해 결정되었다. 야생형 GDF15 또한 식품 섭취를 감소시켰다.
실시예 5: DIO 마우스 모델에서 체중에 있어서 M16, ΔN3 -M16 및 M17 뮤테인의 효과
체중에 있어서 피하 투여된 글리코뮤테인의 효과가 평가되었다. 17주령의 수컷 DIO 마우스 (n = 9)에게 단일 1.0 mg/kg (40 nmol/Kg) 투여량의 PBS 비이클, 성숙한 인간 GDF15 또는 N-글리칸 뮤테인 (M16, M17, 그리고 ΔN3-M16)의 피하 투여되었다. 피하 투여 후 24시간에 걸쳐 체중이 관찰되었다. P-값은 비이클 (PBS) 대조군과 비교하여 비-쌍체 스튜던트 T-테스트에 의해 결정되었다.
글리코뮤테인의 투여로 체중이 감소되었다(도 11). 각 마우스 집단에서, p-값은 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) 비이클 대조군과 비교하여 식품 섭취를 비교하는 스튜던트 비쌍체 T-테스트에 의해 결정되었다. 야생형 GDF15 또한 체중을 감소시켰다.
본 발명의 특정 구체예들이 본 명세서에서 기술되며, 이는 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 공지된 최적의 방식을 포함한다. 전술한 것들을 읽을 때, 공개된 구체예들의 설명 및 변이들은 당업자들에게 자명할 것이며, 당업자는 이러한 변이를 적절하게 이용할 수 있을 것으로 기대한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 본 명세서에 첨부된 청구범위에서 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 이의 가능한 변형 모두에서 상기-기술된 요소의 임의의 조합이 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 본 발명에 포괄된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 출원들, 수탁 번호들 및 다른 참조들은 각 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고문헌에 통합된 것과 참고자료에 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> NGM Biopharmaceuticals, Inc. Lindhout, Darrin A Haldankar, Raj Tian, Hui <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR TREATING METABOLIC DISORDERS <130> NGMB-139WO <150> US 62/031,063 <151> 2014-07-30 <160> 127 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 2 Ala Arg Asn Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Asn Ala Ser Leu Glu Asp 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Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Asn Gln 35 40 45 Thr Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 24 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 24 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Asn 35 40 45 Phe Thr Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 25 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 25 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Asn Arg Thr Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 26 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 26 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Asn Ala Thr Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 27 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 27 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Asn Leu Thr Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 28 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 28 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Asn His Thr 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 29 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 29 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Asn Tyr 65 70 75 80 Thr Pro Met Val Leu Ile Gln Lys 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Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 32 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 32 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Asn Gly Thr Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 33 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 33 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Asn Ser Thr Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 34 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 34 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Asn Leu Thr 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 <210> 35 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 35 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 1 5 10 15 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 20 25 30 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 35 40 45 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 50 55 60 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 85 90 95 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Asn Lys Thr Cys His Cys Ile 100 105 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 36 Arg Gly Arg Arg 1 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 37 Arg Lys Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 38 Arg Lys Lys Arg 1 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 39 Arg Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 40 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 42 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 43 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 44 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 45 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 46 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 47 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 48 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 49 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 50 Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> the amino acid at this position may be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> the amino acid at this position may be any hydrophobic amino acid <400> 51 Pro Xaa Xaa Xaa 1 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> the amino acid at this position may be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> the amino acid at this position may any hyrdrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> the amino acid at this position may be Ser or Thr <400> 52 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> the amino acid at this position may be Leu or Gln <400> 53 Pro Xaa Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> the amino acid at this position may be Leu or Gln <400> 54 Pro Xaa Gly Met Thr 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 55 Cys Gly Leu Val Pro Ala Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 56 Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 57 Ser Leu Leu Ile Ala Arg Arg Met Pro Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 58 Ser Lys Leu Val Gln Ala Ser Ala Ser Gly Val Asn 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 59 Ser Ser Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Ala Pro Asp Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 60 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Asn 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence 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synthetic polypeptide sequence <400> 73 Ser Leu Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Phe Asn 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 74 Ser Leu Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Phe Asn 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 75 Ser Leu Leu Gly Ile Ala Val Pro Gly Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 76 Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro 1 5 10 <210> 77 <211> 734 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide sequence <400> 77 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 30 Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 35 40 45 Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu 50 55 60 Val Asn Glu Val Thr 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Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn 595 600 <210> 108 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 108 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggac tcactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtcaacg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 109 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 109 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg caatctgacc 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 110 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 110 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgaacctgac ggacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 111 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 111 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgaatga aaccctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 112 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgaaccaga cccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 113 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagcaact tcacggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 114 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 114 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccaga accggacggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 115 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 115 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tcaacgcgac gaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 116 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgaacct gacgcgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 117 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 117 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcaa ccacaccctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca ta 402 <210> 118 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 118 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca actacactcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 119 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 119 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaca ccaccaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 120 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 120 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccaacaccac ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 121 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 121 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaacgg gacgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 122 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 122 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg gaactcgacc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 123 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 123 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgaacctc 360 acgacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405 <210> 124 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 124 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt aaacaaaacc tgccactgca tatga 405 <210> 125 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 125 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgggg accactgtcc gctcgggccc gggcgttgct gccgtctgca cacggtccgc 120 gcgtcgctgg aagacctggg ctgggccgat tgggtgctgt cgccacggga ggtgcaagtg 180 accatgtgca tcggcgcgtg cccgagccag ttccgggcgg caaacatgca cgcgcagatc 240 aagacgagcc tgcaccgcct gaagcccgac acggtgccag cgccctgctg cgtgcccgcc 300 agctacaatc ccatggtgct cattcaaaac accaccaccg gggtgtcgct ccagacctat 360 gatgacttgt tagccaaaga ctgccactgc atatga 396 <210> 126 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 126 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly 20 25 30 Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp 35 40 45 Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr 50 55 60 Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His 65 70 75 80 Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro 85 90 95 Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln 100 105 110 Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala 115 120 125 Lys Asp Cys His Cys Ile 130 <210> 127 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 127 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120 acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180 gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240 gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300 gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360 cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405

Claims (55)

  1. 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 연속 아미노산 서열이 포함된 폴리펩티드에 있어서,
    이때 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함할 수 있다:
    i) D5T/S와 R21N;
    ii) R16N과 H18T/S;
    iii) S23N과 E25T/S;
    iv) S50N과 F52T/S 또는 F52N과 A54T/S;
    v) R53N과 A55T/S;
    vi) S64N과 H66T/S;
    vii) K91N과 D93T/S 또는 D93N과 G95T/S;
    viii) T94N과 V96T/S 또는 V96N과 L98T/S;
    ix) S97N과 Q99T/S; 그리고
    x) A106N과 D108T/S.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함하는, 폴리펩티드:
    D5T와 R21N;
    S23N과 E25T 또는 S23N과 E25S;
    R53N과 A55T 또는 R53N과 A55S;
    S64N과 H66T 또는 S64N과 H66S;
    K91N과 D93T 또는 K91N과 D93S;
    D93N과 G95T 또는 D93N과 G95S;
    S97N과 Q99T 또는 S97N과 Q99S; 그리고
    A106N과 D108T 또는 A106N과 D108S.
  3. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함하는, 폴리펩티드:
    D5T와 R21N;
    S64N과 H66T;
    K91N과 D93T;
    D93N과 G95T; 그리고
    S97N과 Q99T.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 1에서 다음과 같이 대응하는 아미노산의 치환쌍들 중 최소한 하나를 포함하는, 폴리펩티드:
    K91N과 D93T/S; 그리고
    D93N과 G95T/S.
  5. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 연속 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한, 폴리펩티드.
  6. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 길이의 아미노산이고, 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일하며, 여기에서 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응하는, 폴리펩티드.
  7. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 아미노산 길이이며, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 3개 아미노산에 상응하는 첫 3개 아미노산을 포함하지 않으며, 이때 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응하는, 폴리펩티드.
  8. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 아미노산 길이이며, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 6개 아미노산에 상응하는 첫 6개 아미노산을 포함하지 않으며, 이때 상기 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 서열 번호: 1에서 위치 112에서 이소류신에 상응하는, 폴리펩티드.
  9. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 연속 아미노산 서열은 최소한 98개 아미노산 길이이며, 서열 번호: 1의 N-말단에 존재하는 첫 14개 아미노산에 상응하는 첫 14개 아미노산을 포함하지 않는, 폴리펩티드.
  10. 전술한 임의의 한 항에 있어서, N-말단에서 신호 서열이 포함된 폴리펩티드.
  11. 청구항 10에 있어서, 이때 상기 신호 서열은 IgK 신호 서열인, 폴리펩티드.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 이때 상기 신호 서열은 링커를 통하여 상기 폴리펩티드에 접합되는, 폴리펩티드.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 상기 링커는 절단가능한 링커인, 폴리펩티드.
  14. 청구항 1-13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 융합된, 폴리펩티드.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 혈청 알부민, 말토즈 결합 단백질, 또는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
  16. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 혈청 알부민이고, 그리고 상기 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민, 시아노 혈청 알부민 또는 소의 혈청 알부민인, 폴리펩티드.
  17. 청구항 15에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
  18. 청구항 14-17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 N-말단에 접합된, 폴리펩티드.
  19. 청구항 14-17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 C-말단에 접합된, 폴리펩티드.
  20. N-말단으로부터 C-말단 방향으로 연속적으로 다음을 포함하는 융합 단백질:
    이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-GDF15;
    이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-ΔN3-GDF15; 또는
    이종성 폴리펩티드-[(G4S)]5-ΔN6-GDF15.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 혈청 알부민, 말토즈 결합 단백질, 또는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드인, 융합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서, 이때 상기 이종성 폴리펩티드는 혈청 알부민이고, 그리고 상기 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민, 시아노 혈청 알부민 또는 소의 혈청 알부민인, 융합 단백질.
  23. 전술한 20-22중 임의의 한 항에 있어서, N-말단에서 신호 서열이 포함된 융합 단백질.
  24. 청구항 23에 있어서, 이때 상기 신호 서열은 IgK 신호 서열인, 융합 단백질.
  25. 변형된 GDF15 N-당화된 이량체에 있어서, 이때 전술한 이량체는 서로 공유적으로 연결된 청구항 1의 2개 폴리펩티드를 포함하며, 전술한 이량체는 N-당화된, 이량체.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 2개 폴리펩티드 각각은 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 GDF15 N-당화된 이량체: 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 30 또는 최대 5개 아미노산이 상이한 아미노산; 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함한다.
  27. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 2개 폴리펩티드 각각은 서열 번호: 81, 서열 번호: 83, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97 또는 서열 번호: 100로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된, 변형된 GDF15 N-당화된 이량체.
  28. 청구항 25-27중 임의의 한 항에 있어서, 2개의 폴리펩티드를 갖는 동종이량체이며, 각 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖고, 이때 전술한 폴리펩티드들은 N-당화된 최소한 한 개의 N-당화 부위를 포함하는, 변형된 GDF15 N-당화된 이량체.
  29. 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 인코드하는 핵산 분자.
  30. 청구항 29에 있어서, 이때 상기 핵산 분자는 시험관내 또는 생체내에서 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질을 인코드하는 핵산 분자의 발현을 부여하는 발현 조절 요소에 작동가능하도록 연계된, 핵산 분자.
  31. 청구항 29 또는 30의 핵산 분자가 포함된 벡터.
  32. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 벡터는 바이러스성 벡터를 포함하는, 벡터.
  33. 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 발현시키는 숙주 세포.
  34. 청구항 29-30중 임의의 한 항의 핵산 분자 또는 청구항 31-32중 임의의 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체와 약학적으로 수용가능한 희석제, 운반체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 최소한 한 가지의 추가적인 예방적 또는 치료요법적 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
  37. 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체에 특이적으로 결합하는 항체.
  38. 청구항 37의 항체와 약학적으로 수용가능한 희석제, 운반체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 최소한 한 가지의 추가적인 예방적 또는 치료요법적 물질을 더 포함하는, 약학 조성물.
  40. 청구항 35, 36, 38 또는 39중 임의의 한 항의 약학 조성물이 포함된 멸균 용기.
  41. 청구항 40에 있어서, 이때 상기 멸균 용기은 주사기인, 멸균 용기.
  42. 청구항 40-41중 임의의 한 항에 따른 멸균 용기를 포함하는 키트.
  43. 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 만드는 다음을 포함하는 방법:
    상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질을 발현시키는 숙주 세포를 배양하고; 그리고
    상기 발현된 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 정제한다.
  44. 대상의 체중 장애를 치료 또는 방지하는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질은 대상의 체중 장애를 치료 또는 방지하는데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
  45. 대상의 포도당 대사 장애를 치료 또는 방지하는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1-19중 임의의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 청구항 20-24중 어느 한 항에 따른 융합 단벡질, 또는 청구항 25-28중 어느 한 항에 따른 변형된 GDF15 N-당화된 이량체를 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 폴리펩티드 또는 상기 융합 단백질은 대상의 포도당 대사 장애를 치료 또는 방지하는데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
  46. 청구항 44-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 대상에게서 식품 섭취를 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  47. 청구항 44-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법은 대상에게서 체중을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  48. 청구항 44-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 치료 또는 방지는 대상에게서 체중 감소를 포함하는 방법.
  49. 청구항 44-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 치료 또는 방지는 대상에게서 식품 섭취 감소를 포함하는 방법.
  50. 청구항 44-45중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 치료 또는 방지는 대상에게서 혈당 감소를 포함하는 방법.
  51. 청구항 45에 있어서, 이때 포도당 대사 장애는 진성 당뇨병인 방법.
  52. 청구항 44-51중 임의의 한 항에 있어서, 이때 대상은 인간인, 방법.
  53. 청구항 44-52중 임의의 한 항에 있어서, 이때 대상은 비만인, 방법.
  54. 청구항 44-53중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 투여는 장관외 주사에 의한 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 이때 장관외 주사는 피하 주사인, 방법.
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014018575A2 (pt) 2012-01-26 2017-07-04 Amgen Inc polipetídeos de fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf-15)
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
AU2014212640B2 (en) 2013-01-30 2017-10-19 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
EP3099304B1 (en) 2014-01-31 2024-07-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research Chroman derivatives and their use in the treatment of glaucoma
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
SG10201802098UA (en) 2014-07-30 2018-04-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2016069921A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
KR102630655B1 (ko) 2016-03-31 2024-01-30 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 결합 단백질 및 이의 사용 방법
US10336812B2 (en) 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
CA3025251A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Novo Nordisk A/S Mic-1 compounds and uses thereof
EP4056196A1 (en) * 2016-10-07 2022-09-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions comprising relaxin and methods of use thereof
JOP20190095A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
US20200131225A1 (en) * 2017-04-20 2020-04-30 Novo Nordisk A/S Methods of purification of albumin fusion proteins
WO2019048660A1 (en) 2017-09-10 2019-03-14 Novo Nordisk A/S MIC-1 AND GLP-1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OBESITY
US11267863B2 (en) 2018-01-19 2022-03-08 Pepgene Inc. N-terminal fusion partner for producing recombinant polypeptide, and method for producing recombinant polypeptide using same
TWI724392B (zh) 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
CA3096097A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 fusion proteins
CN112543869A (zh) 2018-08-10 2021-03-23 诺华股份有限公司 Gfral细胞外结构域和使用方法
US11590161B2 (en) 2018-08-13 2023-02-28 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
US11524029B2 (en) 2018-08-13 2022-12-13 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
CA3116983A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Janssen Pharmaceutica Nv Glucagon like peptide 1 (glp1)-growth differentiation factor 15 (gdf15) fusion proteins and uses thereof
CN114651003A (zh) 2019-09-10 2022-06-21 黑曜石疗法公司 用于可调调节的ca2-il15融合蛋白
EP4041281A1 (en) 2019-10-04 2022-08-17 Amgen Inc. Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions
AU2020394255A1 (en) * 2019-11-26 2022-06-09 Yuhan Corporation Long-acting GDF15 fusion protein and pharmaceutical composition comprising same
EP4071166A4 (en) * 2019-12-11 2023-07-26 Lg Chem, Ltd. Fusion polypeptide comprising gdf15 and polypeptide region capable of o-glycosylation
WO2021119503A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Qlaris Bio, Inc. Controlled-delivery cromakalim prodrugs
EP4085077A4 (en) 2019-12-31 2024-01-17 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. FUSION PROTEINS FROM GLP-1 AND GDF15 AND CONJUGATES THEREOF
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1994003599A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
US6180602B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
JPH07250688A (ja) 1994-01-28 1995-10-03 Sagami Chem Res Center ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ
JPH07258293A (ja) 1994-03-23 1995-10-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な蛋白質ならびにその製造方法
WO1996018730A1 (en) 1994-12-15 1996-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Prostatic growth factor
US5994102A (en) 1994-12-15 1999-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US6521227B1 (en) 1999-11-18 2003-02-18 Peter L. Hudson Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2225377C (en) 1995-06-22 2013-08-13 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Novel tgf-.beta. like cytokine
US6524802B1 (en) 1996-03-29 2003-02-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-14
CN1233289A (zh) 1996-09-11 1999-10-27 奥索·麦克尼尔药品公司 治疗前列腺癌的TNF－β－样蛋白,相关的核酸分子,药物组合物和方法
AU8591198A (en) 1997-07-31 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Growth differentiation factor-15
EP1100822A1 (en) 1998-07-23 2001-05-23 Smithkline Beecham Corporation Secreted cysteine rich protein-6 (scrp-6)
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6465181B2 (en) 1999-03-25 2002-10-15 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6974684B2 (en) 2001-08-08 2005-12-13 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
EP1179067B1 (en) 1999-05-17 2006-12-13 BIOPHARM Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung und zum Vertrieb von Pharmaka mbH Neuroprotective properties of gdf-15, a member of the tgf-beta superfamily
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
HU228091B1 (en) * 2000-03-22 2012-10-29 Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
EP1276856A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
ATE470863T1 (de) 2000-04-20 2010-06-15 St Vincents Hosp Sydney Diagnostischer assay mit makrophagenhemmendem zytokin-1 (mic-1)
AU2001288770A1 (en) 2000-09-08 2002-03-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services A non-steroidal anti-inflammatory drug activated gene with anti-tumorigenic properties
US7276593B2 (en) 2000-12-29 2007-10-02 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
JP4524074B2 (ja) 2001-03-09 2010-08-11 アーナソン， バリー ジー． 低親和性Ｆｃγレセプターを標的化する重合体の免疫グロブリン融合タンパク質
EA010435B1 (ru) 2001-05-11 2008-08-29 Амген, Инк. Связывающиеся с tall-1 молекулы и их применение
GB0115195D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Bae Systems Plc Split-pin drill jig
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20030053431A1 (en) 2001-09-10 2003-03-20 Lila Madour Method for performing handoff in a radio telecommunications network
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
AU2002364586A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Delta Biotechnology Limited Albumin fusion proteins
US7157235B2 (en) 2002-06-17 2007-01-02 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
US7919084B2 (en) 2002-06-17 2011-04-05 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
AU2003295424A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Barnes-Jewish Hospital Methods and compositions for prostate epithelial cell differentiation
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DK2441466T3 (da) 2004-04-13 2014-10-27 St Vincents Hosp Sydney MIC-1-inhiberende middel
WO2005113585A2 (en) 2004-05-20 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Modified tgf-beta superfamily polypeptides
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
KR20070084069A (ko) 2004-10-08 2007-08-24 도만티스 리미티드 Ｔｎｆｒ1에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 사용 방법
SI1844337T1 (sl) 2005-01-24 2013-11-29 Pepscan Systems B.V. Povezovalne spojine, imunogene spojine in peptidomimetiki
JP2007258293A (ja) 2006-03-22 2007-10-04 Fuji Electric Holdings Co Ltd はんだ濡れ性評価装置およびはんだ濡れ性評価方法
US7566565B2 (en) 2006-03-24 2009-07-28 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. PC5 as a factor IX propeptide processing enzyme
US8974748B2 (en) 2007-04-05 2015-03-10 Corning Incorporated Dual inlet microchannel device and method for using same
WO2007143161A2 (en) 2006-06-02 2007-12-13 Wyeth Use of proteins and peptides of the tgf-beta superfamily for purification and therapeutic methods
US7754689B2 (en) 2006-06-02 2010-07-13 Wyeth Llc Finger-1 peptide analogs of the TGF-β superfamily
WO2008013454A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Pepscan Systems B.V. Immunogenic compounds and protein mimics
EP2315034A3 (en) 2006-08-04 2011-08-17 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for assessing the risk of cardiac interventions based on GDF-15
US8278096B2 (en) 2007-04-25 2012-10-02 Stem Cells Spin Spolka Akcyjna Stem cell lines from deer antlers, their application and culture methods
BRPI0814465B1 (pt) 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica
CN104710518A (zh) 2007-07-31 2015-06-17 阿菲博迪公司 新白蛋白结合组合物、方法及应用
EP2783698A1 (en) 2007-08-16 2014-10-01 St Vincent's Hospital Sydney Limited Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine (MIC-1) activity
JP2011502106A (ja) 2007-10-09 2011-01-20 セントビンセンツ ホスピタル シドニー リミテッド マクロファージ阻害性サイトカイン−１を除去又は不活性化して悪液質を治療する方法
WO2009052557A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 St Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of prognosis
JP2011501958A (ja) * 2007-10-29 2011-01-20 バージニア テック インテレクチュアル プロパティーズ インコーポレーテッド ブタＤＣ−ＳＩＧＮ、ＩＣＡＭ−３およびＬＳＥＣｔｉｎならびにそれらの使用
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
EP2227696A1 (en) 2008-01-08 2010-09-15 Roche Diagnostics GmbH Means and methods for assessing the risk of patients presenting to emergency units based on gdf-15
US20100286067A1 (en) 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
JP2011517561A (ja) * 2008-03-31 2011-06-16 グラクソ グループ リミテッド 薬物融合体および複合体
EP2279419A1 (en) 2008-05-20 2011-02-02 Roche Diagnostics GmbH Gdf-15 as biomarker in type 1 diabetes
JP2011528115A (ja) 2008-07-14 2011-11-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 心不全を有する患者の診断、モニター及び治療の選択のためのマルチマーカーパネル
WO2010019263A2 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Genzyme Corporation Soluble flt constructs for treating cancers
CA2740632A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of prognosis in chronic kidney disease
RU2528861C2 (ru) 2008-10-31 2014-09-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
EP2211182A1 (en) 2009-01-16 2010-07-28 Roche Diagnostics GmbH Method for the assessment of severity of liver cirrhosis
EP2209003A1 (en) 2009-01-16 2010-07-21 F. Hoffmann-Roche AG Means and methods for differentiating between fibrosis and cirrhosis
CA2752157A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Stryker Corporation Peripheral administration of proteins including tgf-.beta. superfamily members for systemic treatment of disorders and disease
GB0902737D0 (en) 2009-02-19 2009-04-01 Univ Gent GDF15 as a differential marker for spondyloarthropathy
CA2752647A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 The Salk Institute For Biological Studies Designer ligands of tgf-beta superfamily
SG10201707763PA (en) 2009-05-05 2017-11-29 Amgen Inc FGF21 Mutants And Uses Thereof
CA2766166A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Amgen Inc. Design of stable and aggregation free antibody fc molecules through ch3 domain interface engineering
US20130323835A1 (en) 2009-07-15 2013-12-05 Zirus, Inc. Mammalian Genes Involved in Infection
WO2011050407A1 (en) 2009-10-28 2011-05-05 St Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosing and prognosing colonic polyps
EP2496601B1 (en) 2009-11-05 2017-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
CA2782218C (en) 2009-11-30 2018-07-31 Janssen Biotech, Inc. Antibody fc mutants with ablated effector functions
WO2011064758A2 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
US9212221B2 (en) 2010-03-03 2015-12-15 Detroit R & D, Inc. Form-specific antibodies for NAG-1 (MIC-1, GDF-15), H6D and other TGF-β subfamily and heart disease and cancer diagnoses
JP5791335B2 (ja) 2010-04-07 2015-10-07 花王株式会社 オルガノポリシロキサン化合物の製造方法
US20130202564A1 (en) 2010-04-09 2013-08-08 University Of Southern California Systems and Methods of Cell Activated, Controlled Release Delivery of Growth Factors for Tissue Repair and Regeneration
EP2383571A1 (en) 2010-05-02 2011-11-02 Prof. Hess Medical Consulting GmbH Growth differntioation factor 15 (GDF 15) for risk prediction of diabetic foot ulcer
EP2796874B1 (en) 2010-08-26 2017-03-08 Roche Diagnostics GmbH Use of biomarkers in monitoring a medication in a subject suffering from heart failure
EP2439535A1 (en) 2010-10-07 2012-04-11 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis of diabetes related heart disease and GDF-15 and Troponin as predictors for the development of type 2 diabetes mellitus
EP2670847B1 (en) * 2011-02-03 2016-10-05 XOMA Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
CN103533951B (zh) 2011-04-08 2017-04-19 安姆根有限公司 使用生长分化因子15(gdf‑15)治疗或改善代谢障碍的方法
SI2697257T1 (sl) 2011-04-13 2017-02-28 Bristol-Myers Squibb Company FC fuzijski proteini, ki vsebujejo nove linkerje ali razmestitve
BR112013032630B1 (pt) 2011-06-30 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg
SG194932A1 (en) 2011-06-30 2013-12-30 Genentech Inc Anti-c-met antibody formulations
BR112014018575A2 (pt) 2012-01-26 2017-07-04 Amgen Inc polipetídeos de fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf-15)
WO2013148117A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9492448B2 (en) 2012-06-20 2016-11-15 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating glucose homeostasis and insulin action
WO2014000042A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Prince Henry's Institute Of Medical Research COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TGF-β FAMILY LIGANDS
EP2882774B1 (en) 2012-08-08 2018-10-03 Roche Glycart AG Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
EA038645B1 (ru) 2012-12-21 2021-09-28 Авео Фармасьютикалз, Инк. Антитела к gdf15
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
AU2014212640B2 (en) 2013-01-30 2017-10-19 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
TR201809571T4 (tr) 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
CN203123206U (zh) * 2013-04-01 2013-08-14 宋艳丽 一种简易式一次性防污染无菌注射器
WO2015017548A2 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Amgen Inc. Stabilization of fc-containing polypeptides
AR097181A1 (es) 2013-07-31 2016-02-24 Amgen Inc Construcciones del factor de diferenciación de crecimiento 15 (gdf-15)
SG10201802098UA (en) 2014-07-30 2018-04-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2016069921A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
JP6946304B2 (ja) 2015-12-22 2021-10-06 ノバルティス アーゲー 増殖分化因子１５（ｇｄｆ−１５）を使用して代謝障害を処置するまたは軽快させる方法

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