KR20170030659A

KR20170030659A - 매트릭스 메탈로프로테이나제 ９에 대한 항체

Info

Publication number: KR20170030659A
Application number: KR1020177006624A
Authority: KR
Inventors: 스콧 앨런 매컬리; 마리아 베이스버그
Original assignee: 길리아드 바이오로직스, 인크.
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2017-03-17
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: PH12016501691A1; KR101518144B1; AU2011293125A1; ZA201507081B; US9120863B2; ECSP13012525A; US8501916B2; MX342413B; PT2608809T; UA109908C2; CN104530238B; US20180086845A1; KR101881724B1; EA201390146A1; PE20131376A1; ZA201301338B; KR101827048B1; US8377443B2; JP2013539365A; BR112013004579B1

Abstract

본 개시내용은 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP9) 단백질(MMP9는 또한 젤라티나제-B로도 알려져 있음)에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 단편을 수반하는 조성물 및 사용 방법을 제공하며, 여기서 결합 단백질은 이뮤노글로불린(Ig) 중쇄 (또는 그의 기능적 단편) 및 Ig 경쇄 (또는 그의 기능적 단편)을 포함한다.

Description

매트릭스 메탈로프로테이나제 ９에 대한 항체{ANTIBODIES TO MATRIX METALLOPROTEINASE 9}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2010년 8월 27일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 61/377,886을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 세포외 효소, 세포외 매트릭스 효소, 프로테아제 및 면역학의 분야에 관한 것이다.

서론

매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 세포외 매트릭스의 형성과 리모델링에 관여하는 세포외 효소의 일족이다. 이들 효소는 아연 원자가 3개의 히스티딘 잔기에 의해 배위되는 보존된 촉매 도메인을 함유하고 있다. 현재, 이 패밀리의 20종이 넘는 구성원이 알려져 있는데, 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜라이신, 매트릴라이신, 에나멜라이신 및 막 MMP를 포함한 다수의 군으로 편성된다.

MMP2 및 MMP9는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 젤라티나제 군에 속한다. 대부분의 MMP에 공통인 신호 펩티드, 프로펩티드, 촉매성, 아연-결합 및 헤모펙신-유사 도메인을 함유하는 것 외에도, 젤라티나제는 또한 복수개의 피브로넥틴-유사 도메인 및 O-글리코실화 도메인도 함유하고 있다.

특정 MMP의 비정상적인 활성이 종양 성장, 전이, 염증 및 혈관 질환에서 소정의 역할을 하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌 [Hu et al. (2007) Nature Reviews: Drug Discovery 6:480-498] 참조. 이러한 이유로 해서, 특정 치료 환경에서는 1종 이상의 MMP의 활성을 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 특정의 다른 MMP의 활성이 정상 기능에 종종 요구된다. 대부분의 MMP 억제제는 보존된 촉매 도메인에 표적화되고, 그 결과 다수의 상이한 MMP를 억제하므로, 그들의 치료적 사용은 필수적인 비-병원성 관련 MMP의 억제에 기인한 부작용을 초래한다.

이러한 문제점에도 불구하고, 특정 MMP에 특이적인 억제제를 개발하기가 어려운 것으로 판명되었는데, 그 이유는 효소 활성의 억제는 일반적으로 억제제가 촉매 도메인에 표적화될 것을 요하기 때문이다. 그 결과로서, 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소 활성의 대부분의 억제제는 촉매 도메인에 있어서 상동성에 기인하여 1종 초과의 MMP와 반응할 가능성이 많다. 따라서, 단일 MMP의 촉매 활성을 특이적으로 억제하고, 다른 MMP와는 반응하지 않는 치료 시약의 필요성이 상존한다.

요약

본 개시내용은 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP9) 단백질(MMP9는 또한 젤라티나제-B로도 알려져 있음)에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 단편을 수반하는 조성물 및 사용 방법을 제공하며, 여기서 결합 단백질은 이뮤노글로불린(Ig) 중쇄 (또는 그의 기능적 단편) 및 Ig 경쇄 (또는 그의 기능적 단편)을 포함한다. 본 개시내용은 추가로, MMP9에 특이적으로 결합하고 다른 관련 매트릭스 메탈로프로테이나제에는 결합하지 않는 MMP9 결합 단백질을 제공한다. 그러한 MMP9 결합 단백질은, 예를 들어 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성에는 직접적으로 영향을 미치지 않으면서, MMP9에 대한 특이적 조절(예를 들어, 억제)을 달성하는 것이 필요하거나 또는 바람직한 적용에서 용도가 발견된다. 따라서, 본원 개시의 특정 실시양태에서, 항-MMP9 항체는 MMP9의 활성의 특이적 억제제이다. 특히, 본원 개시의 MMP9 결합 단백질은 다른 관련 매트릭스 메탈로프로테이나제의 정상 기능을 허용하면서 MMP9의 억제에 유용할 것이다.

따라서, 본 개시내용은 특히 하기를 제공한다:

1. 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 기능적 단편, 및 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 포함하고, MMP9 이외의 매트릭스 메탈로프로테이나제에는 결합하지 않는 MMP9 결합 단백질.

2. 중쇄가 서열 13 내지 15 중 하나 이상으로부터 선택된 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하고, 경쇄가 서열 16 내지 18 중 하나 이상으로부터 선택된 CDR을 포함하는 것인 실시양태 1의 단백질.

3. 중쇄가 서열 3 또는 5 내지 8로 이루어진 군 중에서 선택된 가변 영역을 포함하고, 경쇄가 서열 4 또는 9 내지 12로 이루어진 군 중에서 선택된 가변 영역을 포함하는 것인 실시양태 2의 단백질.

4. 중쇄가 IgG인 실시양태 1의 단백질.

5. 경쇄가 카파 쇄인 실시양태 1의 단백질.

6. MMP9에의 단백질의 결합이 MMP9의 효소 활성을 억제하는 것인 실시양태 1의 단백질.

7. 억제가 비-경쟁적 억제인 실시양태 6의 단백질.

8. 중쇄가 서열 19 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 경쇄가 서열 23 내지 26으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 실시양태 1의 단백질.

9. 서열 19 내지 26으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

10. 실시양태 9의 벡터를 포함하는 세포.

11. 실시양태 1의 단백질을 포함하는 제약 조성물.

12. 실시양태 9의 벡터를 포함하는 제약 조성물.

13. 실시양태 10의 세포를 포함하는 제약 조성물.

도 1은 마우스 모노클로날 항-MMP9 항체(AB0041)의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을, 중쇄의 인간화 변이체(VH1 내지 VH4)의 아미노산 서열과 함께 제시하며, 이는 인간화에 기인하는 프레임워크 아미노산 서열에서의 차이를 보여주도록 정렬되어 있다. CDR은 이탤릭체로 나타내었으며, 모 마우스 모노클로날과 비교하여 인간화 변이체에서 상이한 아미노산은 밑줄로 표시하였다.
도 2는 마우스 모노클로날 항-MMP9 항체(AB0041)의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을, 이러한 경쇄의 인간화 변이체(VH1 내지 VH4)의 아미노산 서열과 함께 제시하며, 이는 인간화에 기인하는 프레임워크 아미노산 서열에서의 차이를 보여주도록 정렬되어 있다. CDR은 이탤릭체로 나타내었으며, 모 마우스 모노클로날과 비교하여 인간화 변이체에서 상이한 아미노산은 밑줄로 표시하였다.
도 3은 MMP9 단백질의 개략도를 제시한다.

상세한 설명

본 개시내용의 실시는, 달리 표시하지 않는 한, 세포 생물학, 독물학, 분자 생물학, 생화학, 세포 배양, 면역학, 종양학, 재조합 DNA의 분야 및 당업계의 기술범위에 속하는 관련 분야에서의 표준 방법 및 통상의 기술을 채용한다. 그러한 기술은 문헌에 기재되어 있으며, 따라서 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Alberts, B. et al., "Molecular Biology of the Cell", 5^th edition, Garland Science, New York, NY, 2008]; [Voet, D. et al., "Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level", 3^rd edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008]; [Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]; [Ausubel, F. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 주기적 최신판; [Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 4^th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000]; 및 시리즈물 ["Methods in Enzymology", Academic Press, San Diego, CA] 참조.

또한, 예를 들어 문헌 ["Current Protocols in Immunology", (R. Coico, series editor), Wiley, last updated August 2010] 참조.

MMP9 결합 단백질

본 개시내용은 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP9) 단백질 (MMP9는 또한 젤라티나제-B로도 알려져 있음)에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 개시내용의 결합 단백질은 일반적으로 이뮤노글로불린(Ig) 중쇄 (또는 그의 기능적 단편) 및 Ig 경쇄 (또는 그의 기능적 단편)을 포함한다.

본 개시내용은 MMP9에는 특이적으로 결합하고 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제, 예컨대 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13에는 결합하지 않는 MMP9 결합 단백질을 추가로 제공한다. 그러한 특이적 MMP9 결합 단백질은 따라서 일반적으로 비-MMP9 매트릭스 메탈로프로테이나제와는 현저하게 또는 검출가능하게 교차-반응성을 띠지는 않는다. MMP9에 특이적으로 결합하는 MMP9 결합 단백질은, 예를 들어 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성에는 직접적으로 영향을 미치지 않으면서, MMP9에 대한 특이적 조절(예를 들어, 억제)을 달성하는 것이 필요하거나 또는 바람직한 적용에서 용도가 발견된다.

본원 개시의 특정 실시양태에서, 항-MMP9 항체는 MMP9의 활성의 억제제이며, MMP9의 특이적 억제제일 수 있다. 특히, 본원 개시의 MMP9 결합 단백질은 다른 관련 매트릭스 메탈로프로테이나제의 정상 기능을 허용하면서 MMP9의 억제에 유용할 것이다. "MMP의 억제제" 또는 "MMP9 활성의 억제제"는 효소 프로세싱, 자신의 기질에 미치는 MMP9의 억제 작용(예를 들어, 기질 결합, 기질 절단 등에 대한 억제에 의한) 등을 포함하여(이에 한정되지 않음), MMP9의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.

본 개시내용은 또한 비-마우스 MMP9, 예컨대 인간 MMP9, 시노몰구스 원숭이 MMP9, 및 래트 MMP9에 특이적으로 결합하는 MMP9 결합 단백질을 제공한다.

본 개시내용은 또한 비-경쟁적 억제제로서 작용하는 MMP9 결합 단백질(예를 들어, 항-MMP9 항체 및 그의 기능적 단편)을 제공한다. "비-경쟁적 억제제"란 억제제가 효소의 기질 결합 부위로부터 떨어져 있는 부위에 결합하고, 따라서 효소에 결합할 수 있고 효소가 그의 기질에 결합되는지 여부와는 무관하게 억제 활성을 발휘할 수 있음을 의미한다. 그러한 비-경쟁적 억제제는 예를 들어, 기질 농도와는 실질적으로 무관할 수 있는 억제의 수준을 제공할 수 있다.

본 개시내용의 MMP9 결합 단백질(예를 들어, 항체 및 그의 기능적 단편)은 MMP9, 특히 인간 MMP9에 결합하고, 본원 개시의 중쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 폴리펩티드 (또는 그의 기능적 단편)을 가지는 것들을 포함한다.

본 개시내용의 MMP9 결합 단백질(예를 들어, 항체 및 그의 기능적 단편)은 MMP9, 특히 인간 MMP9에 결합하고, 본원 개시의 중쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 폴리펩티드 (또는 그의 기능적 단편)을 갖는 것들을 포함한다.

본 개시내용의 MMP9 결합 단백질(예를 들어, 항체 및 그의 기능적 단편)은 MMP9, 특히 인간 MMP9에 결합하고, 본원에 개시된 바와 같은 중쇄 폴리펩티드의 상보성-결정 영역(CDR)을 갖는 중쇄 폴리펩티드 (또는 그의 기능적 단편) 및 경쇄 폴리펩티드 (또는 그의 기능적 단편)의 CDR을 갖는 것들을 포함한다.

핵산 및 폴리펩티드의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 각각 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 정렬에 기초한 두 폴리펩티드 또는 두 핵산 분자 간의 관계를 말한다. 상동성 및 동일성은 비교 목적상 정렬시킬 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 각각 측정될 수 있다. 비교된 서열에서의 동등한 위치가 동일 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우, 그에 따라 그 분자들은 그 위치에서 동일하며; 동등한 부위가 동일 또는 유사 아미노산 잔기(예를 들어, 입체적 및/또는 전자적 성질이 유사한 잔기)에 의해 점유되는 경우, 그에 따라 그 분자들은 그 위치에서 상동성인(유사한) 것으로서 언급될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율로서의 표현은 비교된 서열에 의해 공유된 위치에서의 동일하거나 또는 유사한 아미노산의 개수의 함수를 지칭한다. 두 서열의 비교시, 잔기(아미노산 또는 핵산)의 부재 또는 잉여 잔기의 존재는 또한 동일성 및 상동성/유사성을 감소시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "동일성"이란 즉, 갭과 삽입을 고려하여 서열 매칭이 최대가 되도록 서열을 정렬시킬 때, 두 개 이상의 서열에서 상응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다. 서열은 일반적으로 지정 영역, 예를 들어, 적어도 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 그 초과의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐서 최대 일치하도록 정렬되며, 참조 아미노산 또는 뉴클레오티드의 전장까지일 수 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하며, 이 서열에 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터 프로그램에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열 대비 시험 서열(들)에 대한 % 서열 동일성을 계산한다.

% 서열 동일성의 측정에 적합한 알고리즘의 예로는 블라스트(BLAST) 및 블라스트 2.0 알고리즘이 있으며, 이들은 각각 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌 [Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재되어 있다. 블라스트 분석 수행을 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공적으로 입수가능하다. 추가의 예시적인 알고리즘으로는 www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html에서 입수가능한 클러스탈W(ClustalW)(Higgins D., et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680)가 포함된다.

동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 차이가 날 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 말한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이 있고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 세린 및 트레오닌이 있으며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 아스파라긴 및 글루타민이 있으며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이 있으며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이 있으며; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군으로는 시스테인 및 메티오닌이 있다.

두 핵산 간의 서열 동일성은 또한 엄격한 조건하에서 두 분자의 상호간에의 혼성화의 관점에서 기술될 수 있다. 혼성화 조건은 당업계의 표준 방법(예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)에 따라 선택된다. 엄격한 혼성화 조건의 일례는 50℃ 이상 및 0.1 x SSC(15 mM 염화나트륨/1.5 mM 시트르산나트륨)에서의 혼성화이다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 용액: 50% 포름아미드, 5 x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단처리 연어 정자 DNA 중 42℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 필터를 0.1 x SSC 중 약 65℃에서 세척하는 것이다. 엄격한 혼성화 조건은 최소한 상기 대표적인 조건 정도로 엄격한 혼성화 조건이며, 여기서 조건은 최소한 그들 조건이 상기 특정의 엄격한 조건의 적어도 약 80%만큼 엄격한 정도, 전형적으로는 적어도 90%만큼 엄격한 정도로 엄격해야 하는 것으로 간주된다.

따라서, 본 개시내용은 예를 들어, 본원 기재의 중쇄 가변 영역(예를 들어, 서열 1 또는 5 내지 8)의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드, 및 본원 기재의 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, 서열 2 또는 9 내지 12)의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 개시내용의 항-MMP9 항체의 예는 이하에서 좀더 상세히 기술하기로 한다.

항체

항체 및 그의 기능적 단편을 포함한 MMP9 결합 단백질. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하는 펩티드 서열(예를 들어, 가변 영역 서열)을 포함하는 단리 또는 재조합 폴리펩티드 결합제를 의미한다. 상기 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 구체적으로는 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 나노바디, 디아바디, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fab₂를 포함한(이에 한정되지 않음) 항체 단편을 포괄한다. 용어 "인간 항체"란 존재가능한 비-인간 CDR 영역을 제외한 인간 기원의 서열을 함유하는 항체를 말하며, 이뮤노글로불린 분자의 전체 구조가 존재할 것을 내포하는 것은 아니며, 항체가 인간에서 최소한의 면역원성 효과를 나타내는(즉, 그 자신에 대한 항체의 생성을 유도하지 않는) 정도면 된다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 예를 들어 전장 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 그러한 항체 단편은 본원에서는 또한 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 단편"으로도 지칭될 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각이 단일 항원-결합 부위를 갖는 두 개의 동일한 항원-결합 단편과, 명칭이 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 나머지 하나의 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 두 개의 항원-결합 부위를 보유하고 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')₂단편을 산출한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하고 있는 최소 항체 단편이다. 당해 영역은 밀접한 비-공유결합성 회합 상태로 있는 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어져 있다. 이러한 배치형태로 각 가변 도메인의 3개의 상보성-결정 영역(CDR)은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 규정하게 된다. 종합하면, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 비록 일반적으로 완전 F_v 단편의 경우보다는 낮은 친화도로지만, 심지어는 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 6개의 CDR 중 3개만 포함하는 단리된 V_H또는V_L 영역)도 항원에 대한 인식 및 결합능을 보유한다.

"Fab" 단편은 또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 외에도, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH₁)도 함유한다. Fab 단편은 항체의 파파인 소화 뒤에 최초로 관찰되었다. Fab' 단편은 Fab 단편과는 차이가 나는데, Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하여, 중쇄 CH₁ 도메인의 카르복시 말단에 수개의 부가적인 잔기를 함유한다. F(ab')₂ 단편은 힌지 영역 부근에 디술피드 결합에 의해 결합한 두 개의 Fab 단편을 함유하고 있으며, 항체의 펩신 소화 뒤에 최초로 관찰되었다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 보유하는 Fab' 단편에 대한 본원에서의 명칭이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다로 명명된 두 명백하게 다른 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 이뮤노글로불린은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM에 할당될 수 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 좀 더 세분될 수 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H및V_L 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 V_H및V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하고 있으며, 이러한 점은 sFv로 하여금 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해준다. sFv의 개관을 위해서는, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (Rosenburg and Moore eds.) Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"란 두 개의 항원-결합 부위를 가지고 있으며, 동일한 폴리펩티드 쇄(V_H-V_L)에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하는 소형 항체 단편을 말한다. 지나치게 짧아서 동일 쇄 상에서 두 도메인 간의 쌍형성을 허용하지 않는 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 강제되며, 그에 따라 두 개의 항원-결합 부위가 생성된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161 및 문헌 [Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]에 또한 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수되는 항체이다. 그의 천연 환경의 성분은 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정하여 95 중량% 초과의 항체로, 예를 들어 99 중량% 초과로 정제되거나, (2) 예를 들어, 회전컵 서열 분석기(spinning cup sequenator)의 사용을 통해, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 환원 또는 비-환원 조건하에서 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE)에 의해, 쿠마시 블루 또는 은 염색에 의한 검출을 통해 균질하게 정제된다. 용어 "단리된 항체"는 특히 재조합 세포내 본래 장소에서의(in situ) 항체를 포함하는데, 그 이유는 항체의 천연 환경의 적어도 일 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 특정 실시양태에서, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계로 제조된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "면역반응성"이란 아미노산 잔기의 소정 서열("결합 부위" 또는 "에피토프")에 특이적이고, 다른 펩티드/단백질과 교차-반응성이더라도, 인체 용도로의 투여를 위해 제제화되는 수준에서 유독하지 않은 항체 또는 그의 단편을 말한다. "에피토프"란 항체 또는 그의 항원-결합 단편과의 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원의 그 부위를 의미한다. 에피토프는 선형 펩티드 서열(즉, "연속적")일 수 있거나 또는 비-인접 아미노산 서열(즉, "입체형태적" 또는 "불연속적")로 구성될 수 있다. 용어 "우선적으로 결합한다"는 결합제가 비-관련 아미노산 서열에의 결합보다는 좀 더 큰 친화도로 결합 부위에 결합함을 의미한다.

항-MMP9 항체는 중쇄 및 경쇄의 CDR 관점에서 기술될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성-결정 영역"이란 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원-결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 의해 기술되었으며, 여기서 정의는, 상호간에 대하여 비교될 경우, 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그라프팅된 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 어느 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 안에 두고자 하는 것으로 의도된다. 상기 인용 문헌의 각각에 의해 정의되는 CDR을 포함하는 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 1에 수록하였다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 가변 영역에 관하여 사용될 때 용어 "프레임워크"는 항체의 가변 영역내에서 CDR 영역 외측에 존재하는 모든 아미노산 잔기를 의미하는 것으로 의도된다. 가변 영역 프레임워크는 일반적으로 약 100 내지 120개 아미노산 길이의 불연속 아미노산 서열이지만, CDR의 외측에 있는 아미노산만을 언급하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프레임워크 영역"은 CDR에 의해 분리되는 프레임워크의 각 도메인을 의미하는 것으로 의도된다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 수용능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 이뮤노글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 따라서, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린이다. 비-인간 서열은 주로 가변 영역에, 특히 상보성-결정 영역(CDR)에 위치한다. 일부 실시양태에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 인간화 항체는 수용자 항체에서 뿐만 아니라 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 하나의 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하고, 여기서 CDR의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 이뮤노글로불린의 것들에 상응하고, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 본 개시내용의 목적상, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 단편, 예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂또는다른 항원-결합 하위서열을 또한 포함할 수 있다.

인간화 항체는 적어도 이뮤노글로불린 불변 영역(Fc)의 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 일부를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329]; 및 [Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596] 참조.

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 자체에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입" 또는 "공여자" 잔기로서 언급되는데, 이들은 전형적으로 "이입" 또는 "공여자" 가변 도메인으로부터 수득된다. 예를 들어, 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 일행의 방법에 따라, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., 상기 참조]; [Riechmann et al., 상기 참조]; 및 [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536] 참조. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체(미국 특허 4,816,567)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 임의로는 일부 프레임워크 영역 잔기가 설치류 항체(예를 들어, 뮤린 모노클로날 항체) 중의 유사 부위로부터의 잔기로 치환되는 인간 항체이다.

인간 항체는 또한, 예를 들어 파지 제시 라이브러리를 이용하여 생성될 수 있다. 문헌 [Hoogenboom et al. (1991) J. Mol. Biol, 227:381]; 및 [Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581] 참조. 인간 모노클로날 항체를 제조하는 다른 방법은 문헌 [Cole et al. (1985) "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, p. 77]; 및 [Boerner et al. (1991) J. Immunol. 147:86-95]에 기술되어 있다.

인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)에 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 면역학적 공격시, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레파토리를 포함하여 모든 면에서 인간에서 보이는 것과 아주 비슷하다. 이러한 접근법은 예를 들어, 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 하기 과학 출판물: 문헌 [Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859]; [Morrison (1994) Nature 368:812-813]; [Fishwald et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]; [Neuberger (1996) Nature Biotechnology 14:826]; 및 [Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93]에 기재되어 있다.

항체는 전술한 바와 같은 공지의 선별 및/또는 돌연변이유발 방법을 이용하여 친화도-성숙시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도-성숙 항체는 성숙 항체가 제조되는 출발 항체(일반적으로 뮤린, 토끼, 닭, 인간화 또는 인간 항체)의 친화도보다 5배 또는 그 초과, 10배 또는 그 초과, 20배 또는 그 초과, 또는 30배 또는 그 초과의 친화도를 갖는다.

항체는 또한 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 모노클로날성이고, 적어도 두 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 이 경우에, 두 상이한 MMP에 대하여, 또는 단일 MMP(예를 들어, MMP9) 상의 두 상이한 에피토프에 대하여 두 상이한 결합 특이성이 지정될 수 있다.

본원 개시의 항체는 또한 면역접합체일 수 있다. 그러한 면역접합체는 리포터와 같은 제2 분자에 접합된 항체(예를 들어, MMP9에 대한 항체)를 포함한다. 면역접합체는 또한 화학요법제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체를 포함할 수 있다.

특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프"에 특이적으로 결합하는" 또는 "에 대하여 특이적인" 항체는 임의의 여타 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에는 실질적으로 결합함이 없이 상기 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 100 nM 이하, 임의로는 10 nM 미만, 임의로는 1 nM 미만, 임의로는 0.5 nM 미만, 임의로는 0.1 nM 미만, 임의로는 0.01 nM 미만, 또는 임의로는 0.005 nM 미만의 해리상수(K_d)로 인간 MMP9에 특이적으로 결합하며; 모노클로날 항체의 형태로는, 항체의 scFv, Fab, 또는 다른 형태를 약 4℃, 25℃, 37℃ 또는 42℃의 온도에서 측정하였다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 MMP9 중의 하나 이상의 프로세싱 부위(예를 들어, 단백질분해성 절단의 부위)에 결합하며, 이에 따라 프로효소 또는 프리프로효소에서 촉매적 활성 효소로의 프로세싱을 효과적으로 차단하고, 따라서 MMP9의 단백질분해 활성을 감소시키게 된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 또 다른 MMP에 대한 그의 결합 친화도보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 큰 친화도로 MMP9에 결합한다. 결합 친화도는 당업계 공지의 임의의 방법으로 측정될 수 있으며, 예를 들어, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 해리상수(K_d), 평형상수(K_eq) 또는 당업계에서의 임의의 용어로서 표현될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 MMP9의 촉매 활성에 대한 비-경쟁적 억제제이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 MMP9의 촉매 도메인 내에서 결합한다. 부가적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 MMP9의 촉매 도메인 외측에서 결합한다.

본 개시내용은 또한, MMP9에의 결합에 대하여 본원 기재의 항-MMP9 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 고려한다. 따라서, 본 개시내용은 예를 들어, 서열 1 또는 5 내지 8 중 어느 하나의 중쇄 폴리펩티드, 서열 2 또는 9 내지 12의 경쇄 폴리펩티드, 또는 그의 조합을 갖는 항체와의 결합에 대하여 경쟁하는 항-MMP9 항체 및 그의 기능적 단편을 고려한다. 일 실시양태에서, 항-MMP9 항체 또는 그의 기능적 단편은, 인간 MMP9에의 결합에 대하여, AB0041로서 본원에 기재된 항체와 경쟁한다.

MMP9 서열

인간 MMP9 단백질의 아미노산 서열은 다음과 같다:

단백질 도메인을 도 3에 개략적으로 도시하고 이하에 표시한다:

아미노산 번호 특징

1-19 신호 펩티드

38-98 펩티도글리칸 결합 도메인

R98/C99 프로펩티드 절단 부위(절단 효소에 의존)

112-445 Zn 의존성 메탈로프로테이나제 도메인

223-271 피브로넥틴 타입 II 도메인 (젤라틴 결합 도메인)

281-329 피브로넥틴 타입 II 도메인 (젤라틴 결합 도메인)

340-388 피브로넥틴 타입 II 도메인 (젤라틴 결합 도메인)

400-411 Zn 결합 영역

521-565 헤모펙신-유사 도메인

567-608 헤모펙신-유사 도메인

613-659 헤모펙신-유사 도메인

661-704 헤모펙신-유사 도메인

성숙한 전장 인간 MMP9의 아미노산 서열(신호 펩티드가 없는 서열 27의 프로폴리펩티드의 아미노산 서열)은 다음과 같다:

여기에서, 신호 펩티드의 아미노산 서열은

(서열 29)이다.

본 개시내용은 MMP9, 예를 들어 인간 MMP9의 임의의 일부에 결합하는 MMP9 결합 단백질을 고려하며, 다른 MMP에 비해 MMP9에 우선적으로 결합하는 MMP9 결합 단백질이 특히 관심의 대상이 된다.

항-MMP9 항체 및 그의 기능적 단편은 당업계 주지의 방법에 따라 생성될 수 있다. 항-MMP9 항체의 예를 이하에 제공한다.

마우스 모노클로날 항-MMP9

인간 MMP9에 대한 마우스 모노클로날 항체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다. 당해 항체는 마우스 IgG2b 중쇄와 마우스 카파 경쇄를 함유하며, AB0041로 표시한다.

AB0041 중쇄의 아미노산 서열은 다음과 같다:

신호 서열은 밑줄로 표시하였고, IgG2b 불변 영역의 서열은 이탤릭체로 나타내었다.

AB0041 경쇄의 아미노산 서열은 다음과 같다:

신호 서열은 밑줄로 표시하였고, 카파 불변 영역의 서열은 이탤릭체로 나타내었다.

하기 아미노산 서열은 AB0041의 IgG2b 중쇄의 가변 영역의 프레임워크 영역 및 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다(CDR은 밑줄로 표시):

하기 아미노산 서열은 AB0041의 카파 경쇄의 가변 영역의 프레임워크 영역 및 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다(CDR은 밑줄로 표시):

중쇄 변이체

AB0041 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중의 프레임워크 영역 서열을 변경시킴으로써 개별적으로 변형시켰다. 이들 서열 변경의 효과는 인간 T-세포 에피토프의 항체를 결실시키는 것이었고, 이에 따라 인간에서의 그의 면역원성을 감소시키거나 또는 폐지시키게 된다(안티토프(Antitope), 영국 바브라함).

힌지 도메인을 안정화시키는 S241P 아미노산 변화를 함유하는 인간 IgG4 중쇄 백그라운드(Angal et al. (1993) Molec. Immunol. 30:105-108)에서 4종의 중쇄 변이체를 구축하였으며, VH1, VH2, VH3 및 VH4로 표시한다. 그들의 프레임워크 영역 및 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같다:

도 1은 인간화 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 정렬을 제시하며, 4종의 변이체 간에 프레임워크 영역내 아미노산 서열에서의 차이를 표시하고 있다.

경쇄 변이체

4종의 경쇄 변이체를 인간 카파 쇄 백그라운드에서 구축하였으며, Vk1, Vk2, Vk3 및 Vk4로 표시한다. 그들의 프레임워크 영역 및 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같다:

도 2는 인간화 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 정렬을 제시하며, 4종의 변이체 간의 프레임워크 영역내 아미노산 서열에서의 차이를 표시하고 있다.

인간화 중쇄와 경쇄를 모든 가능한 쌍별(pair-wise) 조합으로 조합하여 다수의 기능적 인간화 항-MMP9 항체를 생성한다.

본원 개시의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 또는 99% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 부가적인 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이 또한 제공된다. 추가로, 본원 개시의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 또는 99% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 부가적인 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 또한 제공된다.

본원 개시의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 부가적인 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이 또한 제공된다. 추가로, 본원 개시의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 부가적인 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 또한 제공된다.

상보성-결정 영역(CDR)

본원 개시의 항-MMP9 항체의 중쇄의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:

본원 개시의 항-MMP9 항체의 경쇄의 CDR은 하기 아미노산 서열을 갖는다:

항-MMP9 항체를 코딩하는 핵산

본 개시내용은 항-MMP9 항체 및 그의 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 본원 기재의 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(핵산), 그러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 및 그러한 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사 및 번역하기 위한 숙주 세포 및 발현 시스템을 제공한다.

본 개시내용은 또한 상기한 바와 같은 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물을 고려한다.

본 개시내용은 또한 상기한 바와 같은 1종 이상의 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 및 재조합 숙주 세포에서 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(동일 또는 상이한 숙주 세포에서, 및 동일 또는 상이한 구축물로부터)의 발현을 포함하는, 본원 기재의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산 방법을 제공한다. 발현은 적당한 조건하에서 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후, 항체 또는 항원-결합 단편은 임의의 적당한 기술을 이용하여 단리 및/또는 정제될 수 있고, 이어서 필요에 따라 사용될 수 있다.

각종 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 주지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템이 포함된다. 이종 폴리펩티드의 발현용으로 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 중국 햄스터 난소 세포, 헬라 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 그 밖에 다수가 포함된다. 일반적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이이다.

작동가능하게 연결된 프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및/또는 필요에 따라 기타 서열을 비롯한, 적당한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택 또는 구축될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 예를 들어 "파지", 또는 필요에 따라 파지미드일 수 있다. 더 세부적인 사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 핵산 구축물의 제조, 돌연변이유발, 서열분석, 세포 내로의 DNA의 도입과 유전자 발현, 및 단백질의 분석시에 핵산의 조작을 위한 다수의 공지 기술 및 프로토콜이 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992]에 상세히 기재되어 있다. 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.]의 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포의 게놈에 통합시키거나 또는 안정한 또는 일시적인 에피솜 성분으로서 유지시킬 수 있다.

널리 다양한 발현 조절 서열 - 그것에 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 서열 - 중 임의의 것이 DNA 서열의 발현을 위해 이들 벡터에 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결한 다음, 재조합 MMP9 단백질 또는 그의 일부의 생산 방법에 사용하기 위한 발현 구축물로 제공될 수 있다.

당업자는 본원 개시의 항체 쇄를 코딩하는 핵산이 분자 생물학에서의 표준 지식 및 절차를 이용하여 합성될 수 있음을 인지하고 있다.

본원 개시의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는 다음과 같다:

가변 영역내 CDR과 프레임워크 영역의 병치, 프레임워크 영역의 구조와 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 구조를 포함하여 항체의 구조는 당업계에 주지되어 있기 때문에; 항-MMP9 항체를 코딩하는 관련 핵산을 수득하기 위한 당업계의 기술 안에 충분히 들어온다. 따라서, 본원 개시의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 및 적어도 99% 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 따라서, 본원 개시의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 및 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.

제약 조성물

MMP9 결합 단백질, 및 MMP9 결합 단백질을 코딩하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)은 예를 들어, 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 조합하여 제약 조성물로서 제공될 수 있다. 그러한 제약 조성물은 예를 들어, 생체내 또는 생체외에서의 대상체에의 투여에, 및 MMP9 결합 단백질을 이용하여 대상체를 진단 및/또는 치료하는 데에 유용하다.

제약상 허용되는 담체는 투여된 환자에 생리학상 허용가능하고, 그와 함께 투여되는 항체 또는 펩티드의 치료적 특성을 존속시킨다. 제약상 허용되는 담체 및 그의 제제는 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)]에 일반적으로 기술되어 있다. 하나의 예시적인 제약 담체는 생리식염수이다. 각각의 담체는 제제의 타 성분과 상용성이고 환자에는 실질적으로 유해하지 않다는 점에서 "제약상 허용된"다.

제약 조성물은 특정 투여 경로, 즉 전신 또는 국소 투여에 적합하도록 제제화될 수 있다. 따라서, 제약 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.

제약 조성물은 제약상 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 첨가제의 예로는 당, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 크실리톨, 트레할로스, 소르보스, 수크로스, 갈락토스, 덱스트란, 덱스트로스, 프룩토스, 락토스 및 그의 혼합물을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 제약상 허용되는 첨가제는 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예컨대 덱스트로스와 조합될 수 있다. 첨가제는 또한 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다.

제제 및 전달방법은 일반적으로 치료하고자 하는 부위 및 질환에 따라 적합하게 될 것이다. 예시적인 제제로는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 또는 피하 투여에 적합한 것들을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

비경구 전달용 제약 조성물은 예를 들어, 물, 염수, 인산 완충 염수, 행크 용액, 링거 용액, 덱스트로스/염수, 및 글루코스 용액을 포함한다. 제제는 생리학적 조건에 가깝게 해주기 위한 보조 물질, 예컨대 완충제, 장성 조절제, 습윤제, 디터전트 등을 함유할 수 있다. 첨가제는 또한 부가적인 활성 성분, 예컨대 살박테리아제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용액은 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트 또는 트리에탄올아민 올레에이트를 함유할 수 있다. 부가적인 비경구 제제 및 방법은 문헌 [Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65 75]; [Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31 38]; 및 [Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507 515]에 기술되어 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱 재질의 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.

피내 또는 피하 투여용 제약 조성물은 멸균 희석제, 예컨대 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산, 글루타티온 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절용 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다.

주사용 제약 조성물은 수용액(수용성의 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) ELTM (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니) 또는 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 항박테리아제 및 항진균제로는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시킬 수 있다. 생성되는 용액은 그 자체로 사용을 위해 포장되거나, 또는 동결건조될 수 있으며; 동결건조 제제는 추후에 투여에 앞서 멸균 용액과 조합될 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 흡수 또는 클리어런스를 안정화, 증가 또는 지연시키는 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 화합물로는 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란; 저분자량 단백질; 펩티드의 클리어런스 또는 가수분해를 감소시키는 조성물; 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제가 포함된다. 흡수를 지연시키는 작용제에는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴이 포함된다. 디터전트 또한 리포솜 담체를 포함하여 제약 조성물의 흡수를 안정화 또는 증감시키는 데 사용될 수 있다. 소화로부터 보호하기 위하여, 화합물을 조성물로 복합체화하여 화합물이 산 및 효소적 가수분해에 저항성이 되게 할 수 있거나, 또는 화합물을 적절히 저항성을 띠는 담체, 예컨대 리포솜 중에 복합체화할 수 있다. 화합물을 소화로부터 보호하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764]; [Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135]; 및 치료제의 경구 전달용 지질 조성물에 대하여 기술하고 있는 미국 특허 5,391,377 참조).

본 발명의 조성물은 본원에서 제공되는 다른 치료 모이어티 또는 촬상/진단 모이어티와 조합될 수 있다. 치료 모이어티 및/또는 촬상 모이어티는 별도의 조성물로서, 또는 MMP9 결합 단백질 상에 존재하는 접합 모이어티로서 제공될 수 있다.

생체내 투여용 제제는 일반적으로 멸균성이다. 일 실시양태에서, 제약 조성물은 발열물질을 함유하지 않도록 제제화되어 인간 환자에의 투여에 허용가능하게 된다.

각종 다른 제약 조성물 및 이들의 제조 및 사용을 위한 기술은 본원 개시에 비추어 당업자에게 알려지게 될 것이다. 적합한 약리학적 조성물 및 관련 관리 기술의 세부적인 목록에 대해서는 본원에서의 상세한 교시내용을 참조할 수 있으며, 이러한 내용은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins 2003)] 등의 교재로 더 보충될 수 있다.

제약 조성물은 치료를 요하는 환자/대상체의 신체 특성, 투여의 경로 등을 토대로 제제화될 수 있다. 그러한 조성물은 병원 및 진료소로의 배포를 위해 적당한 라벨을 부착하여 적합한 제약 패키지로 포장될 수 있으며, 여기서 라벨은 대상체에서 본원 기재의 장애 치료의 표시를 위해 부여된다. 의약은 단회 또는 다회 단위로서 포장될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 투여에 대한 사용설명서가 후술되는 제약 패키지 및 키트에 동봉될 수 있다.

사용 방법

본 개시내용의 MMP9 결합 단백질은 예를 들어, 샘플 중 MMP9의 검출 방법, 치료 방법(예를 들어, 혈관신생의 억제 방법에서처럼), 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 사용 방법의 예를 이하에서 기술한다.

치료 방법

본원에서는 MMP9 활성과 관련된 질환 및 장애의 치료 방법이 제공된다. 질환 및 장애는 MMP9를 발현하거나 또는 MMP9를 발현하는 조직에 자리 잡는 종양(예를 들어, 원발성 또는 전이성)을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료"는 본원 기재의 질환 또는 장애와 관련된 증상 발생의 정지 또는 연기를 의미한다. 상기 용어는 현존하는 통제되지 않은 또는 원치않는 증상의 개선, 부가적인 증상의 예방, 및 증상의 근원적인 대사성 원인의 개선 또는 예방을 추가로 포함한다. 따라서, 해당 용어는 질환 또는 증상이 있거나, 또는 그러한 질환 또는 증상의 발생 가능성이 있는 포유동물 대상체에 유익한 결과가 부여됨을 의미한다. 반응은 환자가 질병의 징후 또는 증상의 부분적 또는 완전한 경감 또는 감소를 경험할 때 달성되고, 구체적으로는 제한 없이 생존의 연장을 포함한다. 예상 무진행 생존 기간은 재발 횟수, 병기(病期), 및 기타 요인을 포함한 예후 인자에 따라 수개월 내지 수년으로 측정될 수 있다.

본 개시내용은 그러한 방법과 관련하여 사용하기 위한 제약 조성물을 고려한다. 조성물은 임의의 적당한 경로에 의해 국소 또는 전신 투여하기에 적합할 수 있다.

일반적으로, MMP9 결합 단백질은 치료 유효량으로, 예를 들어 대상체에서 종양 성장의 억제를 달성하는 양으로 및/또는 전이를 억제하는 양으로 투여된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"이란 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 대상체에 투여시 질환의 병상(病狀) 또는 진행을 예방하거나 또는 개선하기에 유효한 치료제의 양을 말한다. 치료 유효 용량이란 또한 증상의 개선, 예를 들어, 관련 의학적 상태의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 그러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 개선의 속도 증가를 도출하기에 충분한 화합물의 양을 말한다. 단독으로 투여된 개별 활성 성분에 적용되는 경우, 치료 유효 용량은 그 성분 단독을 지칭한다. 조합에 적용되는 경우, 치료 유효 용량은, 조합하여 투여하든, 순차적으로 투여하든 또는 동시 투여하든 간에, 치료 효과를 도출하는 활성 성분의 합산량을 지칭한다. 예를 들어, 항-MMP9 항체의 생체내 투여가 채용되는 경우, 정상적인 투여량은, 투여 경로에 따라, 포유동물 체중 kg당 1일당 약 10 ng 내지 100 mg 이상, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg/일 내지 50 mg/kg/일, 임의로는 약 100 ㎍/kg/일 내지 20 mg/kg/일, 500 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 또는 1 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 변동될 수 있다.

선택된 투여 처방은 MMP9 결합 단백질의 활성, 투여 경로, 투여 횟수, 사용되는 특정 화합물의 배설율, 치료 지속기간, 채용되는 특정 조성물과 조합되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 과거 병력, 및 의술에서의 주지의 유사 요인을 포함한 각종 요인에 좌우될 것이다.

당업계 통상의 기술을 지닌 임상의는 요구되는 제약 조성물의 유효량(ED50)을 쉽사리 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 내과의 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명 화합물의 용량을 목적하는 치료 효과의 달성에 요구되는 것보다 낮은 수준으로 시작하여, 목적하는 효과가 성취될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 염소 및 양을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 보유하며, 후술하는 바와 같이 본 발명의 작용제로 치료될 수 있다.

필요하다면, 암 치료의 경우, 방법은 암의 외과적 제거 및/또는 MMP9 결합 단백질 이외에 항암제 또는 치료의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 항암제 또는 치료의 투여는 본원 개시 조성물의 투여와 공동으로 행해질 수 있다.

MMP9의 검출 방법

본 개시내용은, 예를 들어 MMP9를 발현하는 종양 또는 종양-관련 조직을 검출하기 위하여, 대상체에서 MMP9를 검출하는 방법을 또한 고려한다. 따라서, MMP9 활성을 갖는 종양을 진단, 모니터링, 병기분류 또는 검출하는 방법이 제공된다.

MMP9 결합 단백질의 결합의 존재 또는 부재를 검출함으로써 MMP9 발현과 관련된 종양을 보유한 것으로 의심이 가는 개체로부터의 샘플을 수집 및 분석할 수 있다. 이러한 분석은 본원 기재의 MMP9 결합 단백질을 사용하여 치료의 개시에 앞서 수행될 수 있거나, 또는 암 치료의 진척 상태에 대한 모니터링의 일부로서 행해질 수 있다. 그러한 진단 분석은 조직, 그러한 조직으로부터 단리된 세포 등을 포함하여(이에 한정되지 않음) 임의의 샘플을 사용하여 수행될 수 있다. 조직 샘플은 예를 들어, 포르말린-고정 또는 동결 조직 절편을 포함한다.

MMP9의 검출 및 분석을 위한 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 당업계 공지의 다양한 진단 검정 기술, 예컨대 경쟁 결합 검정, 직접 또는 간접 샌드위치 검정 및 불균일상 또는 균일상에서 수행되는 면역침전 검정을 그러한 목적에 적합하게 개조할 수 있다.

검출 방법에 사용하기 위한 MMP9 결합 단백질은 검출성 모이어티로 표지시킬 수 있다. 검출성 모이어티는 직접적으로 또는 간접적으로 검출성 신호를 생성한다. 예를 들어, 검출성 모이어티는 본원에 기재된 것들 중 임의의 것, 예컨대, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 예컨대 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 텍사스 레드(Texas red), 시아닌, 포토시안, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다.

검출은 MMP9에의 MMP9 결합 단백질 결합에 적합한 조건하에서 샘플을 접촉시키고, MMP9 결합 단백질-MMP9 복합체의 존재(예를 들어, 수준) 또는 부재를 평가함으로써 달성될 수 있다. 참고 샘플의 수준과 비교하여 샘플 중 MMP9의 수준은 MMP9 활성을 갖는 종양 또는 종양-관련 조직의 존재를 표시할 수 있다. 참고 샘플은 조기 시점에서 대상체로부터 취한 샘플 또는 또 다른 개체로부터의 샘플일 수 있다.

실시예

실시예 1: 인간 MMP9에 대한 항체의 제조

신호 펩티드가 없는 서열 28의 전장 인간 MMP9 단백질을 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 면역화 마우스로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 라이브러리를 생성하였다. 모노클로날 배양물을 제조 및 스크리닝하여 항-MMP9 모노클로날 항체를 발현하는 배양물을 동정하였다.

항체(AB0041)를 배양물 중 하나로부터 정제하여 특성분석하였다. 항체는 IgG2b 중쇄 및 카파 경쇄를 함유하였다. 특성분석에는 다른 인간 MMP에의 AB0041의 결합, 및 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스를 포함한 다른 종으로부터의 MMP9 단백질에의 AB0041의 결합에 대한 시험을 포함하였다. AB0041 항체는 인간 및 시노몰구스 MMP9에 강하게 결합하였고, 래트 MMP9에는 보다 덜 강하게 결합하였으며, 뮤린 MMP9 또는 다수의 인간 비-MMP 매트릭스 메탈로프로테이나제에는 결합하지 않은 것으로 밝혀졌다.

부가적인 특성분석에는, 특정 아미노산이 인간 MMP9 서열에 좀 더 밀접하게 대응하도록 변경된 마우스 MMP9에 대한 항체의 결합을 검정하는 것이 포함되었다. 추가로, 인간 MMP9 단백질을 돌연변이유발시키고, 다양한 돌연변이체를 항체에 의해 결합되는 그들의 능력에 대해 시험하여 항체 결합에 중요한 아미노산을 결정하고 그에 따라 치료 에피토프를 규정하였다. 이러한 분석은 MMP9 아미노산 서열의 위치 162의 아르기닌 잔기(R162)가 항체 결합에 중요한 것으로 확인시켜 주었다. AB0041 항체의 결합에 중요한 MMP9 중의 다른 아미노산 잔기로는 E111, D113, 및 I198이 포함된다. MMP9의 최근 결정 구조는 E111, D113, R162, 및 I198이 MMP9의 Ca²⁺ 이온 결합 포켓 부근에 상호 근접하여 그룹지어 있음을 보여주었다. 임의의 특정 과학 이론에 구애됨이 없이, AB0041은 이들 잔기가 위치하고 있는 MMP9 상의 영역에 결합할 수 있다. 별법으로, 이들 MMP9 잔기는 AB0041과 직접 접촉하고 있을 수 있다.

MMP9에 대한 효소 검정에서, AB0041 항체는 비-경쟁적 억제제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 2: 인간 MMP9에 대한 항체의 인간화

마우스 AB0041 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 그들의 가변 영역의 프레임워크(즉, 비-CDR) 부분 중의 특정 위치에서 변경시켜 인간에서 덜 면역원성을 띠는 단백질을 생성하였다. 이들 아미노산 서열 변화를 도 1 및 2에 나타내었다. 인간화 항체(AB0045로서 지칭)의 교차-반응성을 상기 표 2에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> GILEAD BIOLOGICS, INC. MCCAULEY, Scott Alan KOVALENKO, Maria <120> ANTIBODIES TO MATRIX METALLOPROTEINASE 9 <130> 246102008040 <140> PCT/US2011/049448 <141> 2011-08-26 <150> US 61/377,886 <151> 2010-08-27 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 470 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)...(470) <223> AB0041 heavy chain <220> <221> PEPTIDE <222> (1)...(19) <223> signal peptide <220> <221> misc_feature <222> (135)...(470) <223> IgG2b constant region <400> 1 Met Ala Val Leu Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Leu Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr 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Claims

인간에 대한 치료방법.