KR20160125370A

KR20160125370A - 캡사이시노이드의 미생물적 생산을 위한 캡사이신 신타제의 사용 방법

Info

Publication number: KR20160125370A
Application number: KR1020167022008A
Authority: KR
Inventors: 후이 천; 홍슈에 왕; 올리버 위
Original assignee: 코나겐 인크.
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EP3094320A1; CN106456588B; HK1232126A1; CA2937124A1; WO2015109168A1; PL3094320T3; BR112016016508A2; JP6611359B2; JP2017507648A; CN106456588A; US9951358B2; HUE063097T2; EP3094320C0; US20160340701A1; EP3094320B1; AU2015206358A1; MX2016009328A; EP3094320A4

Abstract

세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생합성 제조 방법. 생합성 방법은 세포 시스템 내 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계 및 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계를 추가로 포함한다.

Description

캡사이시노이드의 미생물적 생산을 위한 캡사이신 신타제의 사용 방법{METHODS OF USING CAPSAICIN SYNTHASE FOR THE MICROBIAL PRODUCTION OF CAPSAICINOIDS}

관련 출원의 상호-참조

본 개시내용은 발명의 명칭 [캡사이시노이드의 미생물적 생산을 위한 캡사이신 신타제의 사용 방법]의 PCT 특허 출원이다. 본 출원은 2014년 1월 17일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/928,803호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

개시내용의 분야: 본 개시내용은 일반적으로 특히 아실-CoA 신테타제 (ACS), 아미노트랜스퍼라제 ( pAMT ) 및 캡사이신 신타제 (CS)를 이용한, 캡사이신 및 관련 캡사이시노이드의 생합성 생산 방법에 관한 것이다.

배경 기술: 칠리 페퍼는 솔라나세아에(Solanaceae), 가지과에 속하는 캅시쿰 (Capsicum) 속의 식물의 열매이다. 칠리 페퍼는 이의 자극적인 특성으로 인해 양념이 강하고 매운 요리에서 식품 첨가제로 널리 사용되었다. 캡사이시노이드는 칠리 페퍼의 자극적인 느낌의 원인이 되는 물질이고 이미 언급한 바와 같이, 이의 생산은 캅시쿰 속에 한정된다. 캡사이신 (CP, 8-메틸-N-바닐릴-트랜스-6-노넨아미드) 및 디히드로캡사이신 (DHCP, 8-메틸-N-바닐릴노난아미드)은 칠리 페퍼에서의 얼얼함의 대략 최대 90 %로 원인이 되는 두 가지 주요한 캡사이시노이드이다 (문헌 [Garces-Claver, et al., 2007]).

매운 느낌 및 양념이 강한 풍미를 위한 식품 첨가제로서 주로 사용되는 것에 추가로, 캡사이시노이드는 많은 제약 및 의료 용도를 갖는다. 이는 진통, 항암, 소염, 항산화 및 항비만 활성을 포함하여, 일련의 생리학적 및 약물학적 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌고, 혈관운동비염, 골관절염 및 류마티스관절염과 같은 몇몇 질병에 의한 통증을 완화하도록 고안된 연고, 패치, 오일 및 크림의 주요 성분으로서 사용된다 (문헌 [Aza-Gonzalez, et al., 2011]). 캡사이시노이드는 현재 시장에서 호신용 에어로졸 스프레이 (즉, 페퍼 스프레이)에서의 주요 활성 성분으로서 또한 사용된다 (문헌 [Reilly, et al., 2001]). 최근 캡사이시노이드는 햄스터의 혈장 콜레스테롤을 낮추고 내피 기능을 개선시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Liang, et al., 2013]).

캡사이신은 8-메틸노네노일-CoA로부터 바닐릴아민(vanillylamine)으로 8-메틸노네노일 잔기를 전달하여 아미드 접합체를 형성시키는 아실트랜스퍼라제인 CS에 의해 합성되는 것으로 여겨진다 (도 1). 바닐릴아민은 분지된-사슬 지방산이 분지된-사슬 아미노산, 예컨대 발린으로부터 유도되는 페닐프로파노이드 경로로부터 형성된다 (문헌 [Curry, et al., 1999; Mazourek, et al., et al., 2009]). 아미노트랜스퍼라제 ( pAMT )는 바닐린으로부터 바닐리아민(vanillyamine)의 형성을 촉매 작용한다. 출원인은 고스트 칠리 페퍼로부터 유도된 pAMT를 클로닝하였다. 다른 기질인, 8-메틸노네노일-CoA는 아실-CoA 신테타제 (ACS)의 활성을 통하여 8-메틸-트랜스-6-노넨산으로부터 유도된다.

본 개시내용에서, 출원인은 미생물적 생합성에 의해 캡사이시노이드를 생산하도록 CS의 유전자 산물을 이용하였다. 출원인은 최초로 캡사이시노이드, 특히 캡사이신의 미생물적 생산을 달성한다. 게다가, 본 발명은 미생물적 생합성에 의한 캡사이신 생산이라는 업계에서 오랫동안 필요를 느꼈으나 충족되지 않은 요구를 다룬다.

개시내용의 개요

본 개시내용은 혼합물 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계, 혼합물에 제1 기질을 제공하는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이다.

또 다른 본 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이다.

또 다른 본 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 단계, 8-메틸-6-노네노일-CoA를 제공하는 단계, 바닐릴아민을 제공하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 복수의 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 복수의 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이고, 여기서 복수 캡사이시노이드는 수치 비 또는 몰비로 약 90 % 초과 캡사이신 및 약 5 % 미만 디히드로캡사이신이다.

또 다른 본 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 단계, 8-메틸-노나노일-CoA를 제공하는 단계, 바닐릴아민을 제공하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 복수의 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 복수의 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이고, 여기서 복수 캡사이시노이드는 비율로 약 90 % 초과 디히드로캡사이신 및 약 5 % 미만 캡사이신이다.

또 다른 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 단계, 지방산-CoA (지방산의 활성화된 형태)를 제공하는 단계, 바닐릴아민을 제공하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생합성 제조 방법이다.

개시내용의 더 나은 이해를 위하여, 첨부 도면을 참조할 수 있으며, 이는 하기와 같다:
도 1은 캡사이신 생합성 경로를 나타낸다. 문헌 [Stewart et al. (2007)]로부터 준용하였음.
도 2는 기질을 공급할 시 유전자 ACS1 및 CS/AT3/ Pun1을 과발현하는 이. 콜라이(E. coli) BL21 세포로부터 추출된 생성물의 HPLC 프로파일을 나타낸다. 1: 캡사이신 (CP) 및 2: 디히드로캡사이신 (DHCP). (A) 시그마(Sigma)로부터 CP 및 DHCP 표준물의 혼합물; (B) 기질의 공급이 없는 대조군; (C) 바닐릴아민 (VN) 및 8-메틸-6-노넨산 (6E)의 공급; (D) VN 및 8-메틸 노난산 (8M)의 공급; (E) VN, 6E 및 8M의 공급.
도 3은 시그마 (카탈로그 번호 360376 시그마, CP 및 DHCP의 혼합물)로부터 얻어진 캡사이신 및 디히드로캡사이신 표준물의 GC/MS 프로파일을 나타낸다.
도 4는 ACS1 및 CS/AT3/ Pun1을 과발현하는 BL21 배양물에 상이한 기질 (예컨대, VN, 6E 및 8M)의 공급으로부터의 생성물의 GC/MS 프로파일을 나타낸다. GC/MS 분석은 GCMS-QP2010S 검출기와 함께 시마즈(Shimadzu) GC-2010 시스템으로 수행되었다. 컬럼 Rtx-5MS (두께 0.25 u; 길이 30 m; 지름 0.25 mm)가 분리에 사용되었다. 주입 온도: 265 ℃; 주입 모드: 갈라짐; 오븐 온도: 140 ℃. 온도 구배: 0-1 분, 140 ℃; 1-11.25 분, 140 ℃ 내지 263 ℃, 속도 12; 11.25-21.25 분, 263 ℃.
도 5는 캡사이신 (CP) 및 디히드로캡사이신 (DHCP) 대조군 프로파일과 비교하여 기질 (6E 및 8M)의 공급으로부터의 생성물의 MS를 나타낸다.
도 6은 BL21 (DE3) 세포에서의 His-SUMO-Pun1 발현의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 0, 20: IPTG 유도 후 시간에서의 총 단백질; C, 가용성 조질 단백질 추출물; E1 내지 E3, Ni-NTA 컬럼으로부터의 용리된 분획. Pun1의 분자량은 약 49 Kd이며, His-SUMO 태그의 분자량은 약 12 Kd이다.
도 7은 VN 및 6E가 기질로서 사용될 때 ACS1 및 Pun1 커플링된 반응의 생성물의 HPLC 프로파일을 나타낸다. #1, 추정상 CP.
도 8은 GC/MS에 의해 분석되는 ACS1 - Pun1 커플링된 효소 시스템에 의한 시험관내 CP (도 7에서 피크 #1)의 형성을 나타낸다.
도 9 옥타노일-CoA 또는 데카노일-CoA가 기질로 사용될 때 Pun1 시험관내 활성의 HPLC 분석을 나타낸다. #1, 추정상 N-바닐릴옥트아미드; #2, 추정상 N-바닐릴데칸아미드.
도 10은 옥타노일-CoA 또는 데카노일-CoA가 기질로 사용될 때 Pun1 시험관내 활성의 GC/MS 분석을 나타낸다. #1, 추정상 N-바닐릴옥트아미드; #2, 추정상 N-바닐릴데칸아미드.
도 11은 도 10의 피크 #1 및 #2의 MS 프로파일을 나타낸다. #1, N-바닐릴옥트아미드; #2, N-바닐릴데칸아미드.
도 12는 pCDFDuet-ACS1 및 pETite N-His SUMO-고스트(ghost) Pun1을 공동-과발현하는 BL21(DE3) 배양물로 바닐리아민 (VN) 50 mg/L 및 8-메틸-6-노넨산 (6E) 50 mg/L의 공급으로부터의 캡사이신 (CP)의 생산에 미치는 배양 배지의 영향을 나타낸다. LB, 루리아 브로스; TB, 테리픽 브로스; M9, M9 최소 배지. 실험은 3 회 반복 수행되었고, 그래프를 그리는 데에는 평균값을 사용하였다.
본 개시내용이 다양한 변형 및 대안적인 형태의 여지가 있는 한편, 그의 구체적인 실시양태들을 도면에 예로써 나타내며, 이는 본원에서 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본원에서 제시되는 도면 및 상세한 설명이 본 개시내용을 개시된 특정 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니며, 오히려 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 개시내용의 기술사상 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안들을 포괄하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.

정의

세포 시스템

세포 시스템은 전위 단백질의 발현을 제공하는 임의의 세포이다. 여기에는 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 여기에는 원핵 및 진핵 세포가 포함된다. 여기에는 또한 리보솜과 같은 세포 성분을 이용하는 시험관내 단백질 발현이 포함된다.

세포 시스템의 성장

성장시키는 것에는 세포가 증식 및 분할하는 것을 가능케 하게 되는 배지를 제공하는 것이 포함된다. 여기에는 또한 자원을 제공함으로써 세포 또는 세포 성분이 재조합 단백질을 번역하여 생성시킬 수 있도록 하는 것이 포함된다.

단백질 발현

단백질 생산은 유전자 발현 후에 이루어질 수 있다. 그것은 DNA가 전령 RNA (mRNA)로 전사된 후의 단계들로 이루어진다. mRNA는 이후 폴리펩티드 사슬로 번역되며, 그것은 궁극적으로 단백질로 접힌다. DNA는 형질감염 - 의도적으로 핵산을 세포에 도입하는 과정 -을 통하여 세포에 존재한다. 이 용어는 종종 진핵 세포에서의 비-바이러스적 방법에 사용된다. 그것이 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수도 있기는 하지만, 하기의 다른 용어가 바람직하다: 박테리아, 식물 세포를 포함한 비-동물 진핵 세포에서의 비-바이러스적 DNA 전달을 기술하는 데에는 "형질전환"이 좀 더 자주 사용된다. 바이러스-매개 DNA 전달을 기술하는 데에는 종종 형질도입이 사용된다. 본 출원에서는 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염이 형질감염의 정의하에 포함된다. 또한, 단백질 발현은 단백질이 세포 밖에 있는 세포소기관을 이용하여 발현되는, 시험관내 번역을 포함한다.

생물전환

생물형질전환으로도 공지된, 용어 생물전환은 더 고가거나 비생물학적으로 실현가능하지 않은 화학 반응을 수행하도록 살아있는 유기체 종종 미생물 (예컨대, 박테리아 및 효모)의 사용을 지칭한다. 이들 유기체는 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환한다.

혼합물

혼합물은 동일성이 유지되고 용액, 현탁액 및 콜로이드의 형태에서 혼합되는 두 개 이상의 물질의 물리적 조합을 지칭한다.

유전자 산물

유전자 산물은 유전자의 발현으로부터 얻어지는 생화학적 재료, RNA나 단백질이다.

현재 발명의 개시내용은 혼합물 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계, 혼합물에 제1 기질을 제공하는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이다. CS /AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물은 DNA 서열 서열번호 1을 기재로 한다. 추가적 개시내용에서, CS/AT3/Pun1의 제1 유전자 산물은 서열번호 1에 약 95 % 이상의 동일성을 갖는 DNA 서열을 기재로 한다. 또 다른 실시양태에서, CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 유도된다. 게다가, 제1 기질은 8-메틸-6-노네노일-CoA, 8-메틸 노나노일-CoA, 옥타노일-CoA, 데카노일-CoA 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 활성화된 지방산이다.

또 다른 개시내용은 혼합물 내 ACS, 특히 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계 및 제2 기질을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 혼합물에 제1 기질을 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, ACS1의 제2 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 유도된다. 제2 기질은 8-메틸-6-노넨산, 8-메틸 노난산, 옥탄산, 데칸산 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 지방산이다. 추가로, 또 다른 개시내용에서, 임의의 유전자를 발현하는 단계는 시험관내 번역에 의해 일어난다. 또 다른 개시내용에서, 임의의 유전자를 발현하는 단계는 세포 시스템 내 유전자를 발현하는 단계가 추가로 일어난다. 세포 시스템은 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 미생물을 기재로 한다. 임의의 유전자로부터의 발현 생성물은 재조합 단백질로 정제된다. 추가의 개시내용에서, 제3 기질 바닐리아민이 제공된다.

또 다른 개시내용은 혼합물 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계 및 제4 기질 바닐린을 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, pAMT의 제3 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 유도된다. 개시내용에서, 임의의 유전자는 시험관내 번역에 의해 발현된다. 또 다른 개시내용에서, 임의의 유전자는 세포 시스템 내 발현된다. 세포 시스템은 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 미생물을 기재로 한다. 임의의 유전자로부터의 발현 생성물은 재조합 단백질로 정제될 수 있다.

또 다른 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계; 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계; 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함한다. 한 개시내용에서, 캡사이시노이드는 캡사이신이다. 또 다른 실시양태는 8-메틸-6-노네노일-CoA를 제공하는 단계 및 바닐릴아민을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 8-메틸-6-노네노일-CoA의 제공은 세포 시스템 내 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계 및 기질 8-메틸-6-노넨산을 제공하는 단계를 포함한다. 바닐릴아민의 제공은 세포 시스템 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계 및 기질 바닐린을 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 개시내용에서, 캡사이시노이드는 캡사이신이다. 다르게는 또는 추가로, 캡사이시노이드는 디히드로캡사이신이다. 디히드로캡사이신 생산에 관하여, 개시내용은 8-메틸-노나노일-CoA를 제공하는 단계 및 바닐릴아민을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 8-메틸-노나노일-CoA를 제공하는 단계에 관해서, 이는 세포 시스템 내 ACS, 특히 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계 및 8-메틸 노난산을 제공하는 단계를 포함한다. 개시내용은 세포 시스템 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계 및 기질 바닐린을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 제1 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 CS/AT3/ Pun1로부터 발현된다. 하나의 실시양태에서, 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 CS/AT3/ Pun1과 약 95 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 CS/AT3/Pun1로부터 발현된다. 세포 시스템은 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택된다.

또 다른 개시내용은 세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 단계, 지방산-CoA를 제공하는 단계, 바닐릴아민을 제공하는 단계, 배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계 및 캡사이시노이드를 회수하는 단계를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법이다. 한 개시내용에서, 지방산-CoA는 8-메틸-6-노네노일-CoA이고, 캡사이시노이드는 수치 비로 약 90 % 초과 캡사이신이다. 또 다른 개시내용에서, 지방산-CoA는 8-메틸-노나노일-CoA이고, 캡사이시노이드는 수치 비로 약 90 % 초과 디히드로캡사이신이다. 또 다른 개시내용에서, 제공된 지방산-CoA는 옥타노일-CoA이고, 캡사이시노이드 생성물은 N-바닐릴옥트아미드, 더 구체적으로 약 90 % 초과 N-바닐릴옥트아미드이다. 또 다른 개시내용에서, 지방산-CoA는 데카노일-CoA이고, 캡사이시노이드 생성물은 N-바닐릴데칸아미드, 더 구체적으로 약 90 % 초과 N-바닐릴데칸아미드이다.

다양한 실시양태에서 사용되는 세포 시스템에 관해 말하자면, 이는 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택된다. 여기서 생합성 생산을 허용할 임의의 세포 시스템이 제공된다.

페퍼의 얼얼함이 Pun1 유전자좌위에 의해 제어된다는 것은 오랫동안 알려져 있었고, 대응되는 유전자는 추정상 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 AT3으로 최근에 확인되었다 (문헌 [Stewart et al., 2005]). AT3은 BAHD 아실트랜스퍼라제 거대족에 속하고, 추정상 CS/AT3/ Pun1로 제기되었다 (문헌 [Kim et al., 2009]). 그러나, CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물의 생화학적 활성은 이제까지 보고되지 않았다. 생화학적 활성에 대한 증거의 부족은 주로 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물에 대한 아실-CoA 기질이 시판되지 않고 CS/AT3/ Pun1의 재조합 발현이 단백질의 극도의 불용성 때문에 어렵다는 사실에 기인한다 (문헌 [Stewart et al., 2005]). CS는 BAHD 족 외에 아실트랜스퍼라제 족에 속할 수 있다는 것이 또한 추정되었다 (문헌 [Stewart et al., 2005]). 출원인은 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물이 생물전환 반응에서 CS 기능을 가짐을 최초로 보여준다. 출원인은 생물전환 방법에서 캡사이시노이드, 특히 캡사이신 제조라는 오랫동안 느껴졌으나 충족되지 않은 요구를 다뤘다.

추가로, 식품, 의약 및 방위 (예컨대, 페퍼 스프레이)에서 캡사이시노이드의 폭넓은 사용으로 인해, 캡사이시노이드에 대한 증가하는 수요가 있었다. 이제까지, 매운 페퍼는 캡사이시노이드에 대한 유일한 천연 공급원이다. 그러나, 매운 페퍼의 캡사이시노이드의 함량은 일반적으로 낮고 환경 및 성장 조건에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 0.22 내지 20 총 캡사이시노이드 mg/페퍼 g (건조 중량)이 보고되었다 (문헌[Thomas et al., 1998]). 천연 캡사이시노이드의 공급 부족은 천연 캡사이시노이드의 극도로 비싼 값, 예컨대, US$ 2,000-3,000 /kg (http://www.alibaba.com/product- gs /810894171/Natural Capsaicin Capsaicine Powder 97 16. html?s =p)에 기여한다. 수요를 충족할 수 있는 캡사이시노이드에 대한 또 다른 공급원을 갖는 것은 업계에서 오랫동안 충족되지 않은 요구였다.

유전자 변형된 미생물은 재생 가능한 자원으로부터 약물, 화학약품 및 바이오연료의 생산을 위한 점점 더 중요한 플랫폼이 되었다 (문헌[Du et al., 2011]). 이러한 생명 공학적 생성물은 식품에 사용될 때, 현재 규정에 따라 식품 산업에서 '천연'으로 표지될 수 있다 (문헌 [Haeusler and Muench, 1997]). 미생물적 생산 플랫폼의 개발을 위한 필수 조건은 생물전환 경로에서 대응되는 유전자의 클로닝 및 특징규명이다. 캡사이시노이드의 중요성으로 인해, 캡사이신 신타제를 코딩하는 유전자의 클로닝에 대한 오랜 관심이 있었다. 예를 들어, 100년 전에, 웨버(Webber)는 PUN1 유전자좌위를 페퍼의 얼얼함의 컨트롤러로 보고하였다 (문헌[Webber, 1911]). BAHD 거대족의 아실트랜스퍼라제인, AT3에 대한 유전자 산물을 코딩하는, 대응되는 유전자가 클로닝되었다 (문헌[Stewart et al., 2005]). 그러나, 출원인에 의해 최근에 나타나기까지는, 이러한 추정상 아실트랜스퍼라제의 것인 생화학적 활성은 없었고, CS/AT3/ Pun1에 대한 유전자 산물이 추정상 캡사이신 신타제라는 주장은 의심스러웠다. 게다가, CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물에 대한 아실-CoA 기질의 결핍 때문에, CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물로부터의 활성은 생물전환 메커니즘에서 캡사이신 및 다른 캡사이시노이드를 제조하는 데 결코 효과적으로 포착될 수 없었다. 후에, 효소-대-유전자(enzyme-to-gene) 접근법을 사용하는 또 다른 연구에서, 문헌 [Prasad et al. (2006)]은 얻기 어려운 캡사이신 신타제 유전자로 csyl의 확인을 보고하였다. 그러나, 2 년 후에, 이 연구는 철회되었고 (문헌 [Prasad et al., 2008]), CS 유전자는 확인되지 않고 확정되지 않은 채로 남아있다. 그러므로, 실제 캡사이신 신타제의 생화학적 동일성 및 확정이 업계 내 오랜 목표였을 뿐만 아니라, 캡사이신 및 다른 캡사이시노이드를 제조하기 위한 생물전환 메커니즘에서의 CS 유전자의 활용은 오랫동안 요망되었다.

ACS1에 대한 유전자 산물의 활성에 대한 출원인의 확인에 이어서, 출원인은 아실-CoA 기질을 제조할 수 있었고, 이에 따라, 출원인은 CS/ PUN1 /AT3이 시험관내 및 생체내 모두 CS 활성을 갖는다는 것을 입증할 수 있었다. 이는 "천연" 캡사이시노이드의 생산에 대한 미생물적 발효 방법의 개발 및 최적화에 대한 길을 연, 캡사이시노이드의 이종 생합성의 최초의 예시를 나타낸다. 또한, 이 방법을 개발함에 있어서, 출원인은 상이한 지방산 기질의 공급을 통하여, 자연에서는 일어나지 않을 수 있는 상이한 종의 캡사이시노이드를 제조할 수 있었음을 보여주었다.

실시예 1

CS/ Pun1 /AT3 유전자 산물은 생체내 CS 활성을 갖는다.

페퍼로부터 ACS 활성에 대한 출원인의 최근 발견에 이어서 (문헌[Chen H, Wang H, and Yu O, US 61/898944]), ACS1 및 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물은 이.콜라 이 BL21(DE3) 세포에서 공동-과발현되었다. 출원인은 ACS1의 유전자 산물이 CoA의 첨가에 의해 지방산을 활성화시키는 능력을 가져, 고에너지 지방산의 형태를 만든다는 것을 발견하였다. IPTG에 의한 단백질 발현의 유도 및 바닐리아민 (VN) 및 8-메틸-6-노넨산 (6E)/8-메틸 노난산 (8M)의 공급 후, 추정상 CP/DHCP를 생산하였다 (도 2). 자연에서 (즉, 매운 페퍼로부터 유도되어), 캡사이신 및 디히드로캡사이신은 함께 제조되는 반면에, 생합성 반응에서, 출원인은 특정 활성화된 지방산 (예컨대, 6E-CoA, 8M-CoA, 옥타노일-CoA 및 데카노일-CoA)을 공급하여 캡사이신, 디히드로캡사이신 및 다른 캡사이시노이드의 생산을 제어할 수 있다는 것을 발견하였다.

CS/ Pun1 /AT3 의 클로닝

출원인은 CS/AT3/ Pun1 유전자의 유전자 산물로부터 CS 활성 및 세포 시스템 내 기질의 생물전환을 최초로 생화학적으로 보여준다. 특히, 출원인은 활성화된 지방산의 캡사이시노이드로의 전환을 촉매 작용하는 능력을 보여준다. CS/AT3/Pun1 유전자의 초기 클로닝은 pENTR/D_TOPO 벡터에 있었다. CS의 클로닝은 하기 프라이머를 필요로 한다. 프라이머 309-pentr-F: CACCATGGCTTTTGCATTACCATC 및 309-pentr-R: TTAGGCAATGAACTCAAGGAG을 고스트 칠리 페퍼의 풋과일의 cDNA로부터 CS/AT3/ Pun1 유전자를 증폭시키는 데 사용하였고, 얻어지는 PCR 생성물을 pENTR/D_TOPO 벡터로 클로닝하였으며, 이어서 LR 반응 (인비트로겐(Invitrogen))에 의해 pDEST17 벡터에 교환하였다. CS /AT3/ Pun1에 대한 유전자 산물은 그 다음 BL21(DE3)과 같은 박테리아 시스템에서 발현되었고, 이어서 CP 및 DHCP를 필요한 기질을 제공할 시 검출하였다. HPLC는 아클레임(Acclaim)® 120 C18 역상 컬럼 (서모 사이언티픽(Thermo Scientific); 3 μ, 120 Å, 150×3 mm)을 사용하는 디오넥스-얼티메이트(Dionex-UltiMate)® 3000 LC 시스템 (서모 사이언티픽)으로 수행하였다. 이동상은 용매 A (0.1 % 트리플루오로아세트산) 및 용매 B (아세토니트릴)로 이루어졌다. 구배 용리 절차는 하기와 같았다: 0 내지 5 분, B 5 %; 5 내지 9 분, B 5로부터 80 %로의 선형 구배; 9 내지 11 분, B 80 %; 11 내지 12 분, B 5 %. 유량은 0.6 ml/분이었다. 다이오드 어레이 검출기가 200- 내지 400-nm 범위에서 데이터를 수집하였다. 기질 및 생성물의 검출 및 정량화를 위하여, 280 nm에서 피크 면적을 측정하였다.

CP/ DHCP 동일성 확정

CP/DHCP의 동일성을 추가의 GC/MS 분석으로 확정하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이 (GC/MS 프로파일), 시그마로부터의 CP 표준물은 실제로 약 60:40의 비에서의 CP 및 DHCP의 혼합물이다. CP 및 DHCP에 대한 보유 시간은 각각 13.80 및 14.04 분이다. GC/MS 기기에서 MS 라이브러리는 시그마 표준물로부터의 스펙트럼과 일치하는, CP 및 DHCP 모두에 대한 표준 스펙트럼을 포함한다. 도 4에서 나타난 바와 같이, ACS1 및 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 배양물에 6E 및 8M의 공급은 각각 CP 및 DHCP의 생산을 야기시켰다. 생성물의 스펙트럼은 표준물의 스펙트럼과 나란히 비교하여 매우 잘 일치한다 (도 5).

CS/ Pun1 /AT3 유전자 산물은 시험관내 CS 활성을 갖는다.

시험관내 활성을 측정하기 위해, 출원인은 309-sumo-F, CGC GAA CAG ATT GGA GGT GCTTTTGCATTACCATC 및 309-sumo-R, GTG GCG GCC GCT CTA TTA TTAGGCAATGAACTCAAGGAG의 프라이머를 사용하여 고스트 칠리 페퍼의 풋과일로부터 유도된 cDNA로부터의 CS/Pun1/AT3 유전자를 증폭하였다. 얻어지는 PCR 생성물을 1 % 아가로스 겔 상에서 정제하여, 선형 pETite N-His SUMO Kan 발현 벡터 (루시젠(Lucigen), 위스콘신 미들턴 소재)와 혼합하였다. DNA 혼합물을 사용하여 열 충격에 의해 HI-컨트롤(control) 10G 화학적 적격 세포를 형질전환시켰다 (루시젠). 유전자 삽입물을 완전히 서열분석하였고, 캅시쿰 치 넨세(Capsicum chinense)로부터 Pun1 유전자의 서열과 동일하였다 (진뱅크(GenBank): AY819027).

서열번호 1: 고스트 칠리 페퍼로부터 CS/ Pun1 /AT3 의 서열

출원인은 pETite N-His SUMO-고스트 Pun1을 사용하여 HI-컨트롤 BL21(DE3) 세포 (루시젠)를 형질전환시키고, 16 ℃에서 20 시간 동안 0.5 mM IPTG로 His-SUMO-Pun1의 발현을 유도하였다. 융합 단백질을 Ni-NTA 컬럼에 의해 정제하였다 (도 6). Pun1의 유전자 산물은 약 49 Kd의 분자량을 가지며, His-SUMO 태그의 크기는 약 12 Kd이다. SDS-PAGE상 His-SUMO-CS 융합 단백질은 예상 크기 (약 61 Kd)에 가깝게 이동하였다 (도 6).

출원인은 ACS1 및 CS/ Pun1 /AT3 커플링된 효소 시스템을 사용하여 CS/Pun1/AT3의 유전자 산물의 활성을 분석하였다. ACS1의 유전자 산물은 CS/Pun1/AT3의 유전자 산물에 대한 기질의 생산을 촉진하였다. 시스템은 100 mM 트리스, pH8.5, 5 mM ATP, 0.5 mM CoA, 10 mM MgCl₂, 100 mg/L VN 및 1 mM 6E를 포함한다. 정제된 SUMO-ACS1 및 SUMO-Pun1을 동시에 첨가하여 반응을 시작하였다. 아세트산 첨가로 끝내기 전에 반응을 1 시간 동안 지속하였다. 반응 생성물을 HPLC로 처음 분석하였다 (도 7). 대조군과 비교하여, 두 생성물이 형성되었고, 하나는 MS/MS로 이미 확정된, 8-메틸-6-노네노일-CoA이고 (문헌 [Chen H, Wang H, and Yu O, 2013]), 또 다른 생성물 (#1)은 CP의 보유 시간과 일치했다.

피크 #1의 동일성을 추가로 확정하도록, 에틸 아세테이트 추출물을 N2 기체로 건조하였고, MSTFA (N-메틸-N-(트리메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드 - 시그마)로 유도체화하였다. 생성물을 GC/MS에 의해 분석하였다 (도 8). 도 8에서 나타난 바와 같이, 효소 반응으로부터 생산된 CP는 CP 표준물과 동일한 MS 프로파일을 갖는다.

추가로, 출원인은 다른 기질을 사용하여 활성을 또한 시험하였다. 출원인은 시그마로부터 옥타노일 CoA 및 데카노일 CoA를 구매하였다. 이러한 아실-CoA 및 VN이 기질로서 함께 사용될 때, 대응되는 캡사이시노이드 (각각 N-바닐릴옥트아미드 및 N-바닐릴데칸아미드에 대해 #1 및 #2)가 형성되어, Pun1의 효소 활성을 확정하였다 (도 9 및 10). 효소 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였고, N₂ 기체로 건조하였다. MSTFA 유도체를 GC/MS로 분석하였다. 도 11은 도 10의 피크 #1 및 #2의 MS 프로파일을 나타낸다.

실시예 2

클로닝

ACS1 유전자를 ACS1-Bgl ll-F: GAAGATCTATGGCAACAGATAAATTTA 및 ACS1- XhoI-R : CCGCTCGAGTCACTTGGTACCCTTGTAC의 프라이머를 사용하여 pETite N-His SUMO-고스트 ACS1 주형으로부터 PCR 증폭하였고, pCDFDuet-1 벡터의 MCS2 부위로 라이게이션시켰다 (노바겐(Novagen)). 얻어지는 플라스미드 pCDFDuet-ACS1을 사용하여 적격 이.콜라이 BL21 (DE3)세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 스펙티노마이신 100 mg/L을 함유하는 LB 플레이트 상에서 선택하였다. pCDFDuet-ACSl 포함 얻어지는 BL2l(DE3) 세포를 pETite N-His SUMO-고스트 Pun1 벡터로 제2 형질전환하는 데 사용하였다. 형질전환체를 카나마이신 50 mg/L 및 스펙티노마이신 100 mg/L를 함유하는 LB 플레이트 상에서 선택하였다.

상이한 배양 배지

VN (바닐리아민) 및 6E (8-메틸-6-노넨산)의 공급 시 ACS1 및 Pun1 공동-과발현의 BL21(DE3) 배양에서 CP (캡사이신) 생산에 대해 상이한 배양 배지를 시험하였다. 간단하게 말하자면, 카나마이신 50 mg/L 및 스펙티노마이신 100 mg/L를 함유하는 액체 LB, TB 또는 M9 배지 (2 %)를 접종하는 데 밤샘 배양을 사용하였다. 배양물을 0.6의 OD600으로 처음에 37 ℃에서 성장시켰고, 16 ℃까지 냉각시켰다. 이어서 1 mM IPTG를 첨가하여 ACS1 및 Pun1의 발현을 유도하였다. 16 ℃에서 인큐베이션 1h 후, VN 50 mg/L 및 6E 50 mg/L를 배양물에 첨가하였고, 배양물을 16 ℃에서 계속하여 인큐베이션하였다. 기질의 공급 후 0, 18, 22, 26, 42 및 48 h 후에 샘플을 취하였다. CP를 에틸 아세테이트로 추출하였고, HPLC로 분석하였다. 도 12는 시험한 세 배지 가운데, VN 및 6E로부터 CP 생산에 대해 TB가 가장 좋다는 것을 보여준다.

동일성 및 유사성

동일성은 서열 정렬 (서열 정보만, 또는 구조 정보 또는 일부 다른 정보를 사용하여 수행될 수 있지만, 보통은 서열 정보만을 기초로 함) 후 서열 쌍 사이에서 동일한 아미노산의 비율이며, 유사성은 일부 유사성 행렬을 사용한 정렬을 기초로 하여 할당되는 점수이다. 유사성 지수는 BLOSUM62, PAM250 또는 GONNET, 또는 단백질 서열 정렬에 통상의 기술자가 사용하는 임의의 행렬 중 임의의 것일 수 있다.

동일성은 2 종 하위-서열들 사이의 대응 정도이다 (서열들 사이에 갭 없음). 25 % 이상의 동일성은 기능의 유사성을 시사하는 한편, 18-25 %는 구조 또는 기능의 유사성을 시사한다. 2 종의 완전히 무관하거나 무작위인 서열들 (100개 잔기 초과)이 20 %를 초과하는 동일성을 가질 수 있다는 것에 유념해야 한다. 유사성은 그들이 비교되었을 경우의 2 종 서열 사이의 유사 정도이다. 이것은 그의 동일성에 의존한다.

전술한 상세한 설명에서 드러나는 바와 같이, 본 개시내용의 소정 측면들이 본원에서 예시되는 예들의 구체적인 세부사항에 의해 제한되는 것은 아니며, 그에 따라 그의 다른 변형 및 적용 또는 등가물들이 통상의 기술자에게 고려될 것으로 생각된다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않는 모든 그와 같은 변형 및 적용들을 포괄하고자 한다.

또한, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 바람직한 방법 및 물질들이 상기에서 기술되기는 하였지만, 본 개시내용의 실시 또는 시험에는, 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 그에 등가인 어떠한 방법 및 물질들도 사용될 수 있다.

본 개시내용의 다른 측면, 목적 및 장점들은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 얻을 수 있다.

참고문헌

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Claims

혼합물 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계;
혼합물에 제1 기질을 제공하는 단계; 및
캡사이시노이드를 회수하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계는 DNA 서열 서열번호 1을 기재로 하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계는 서열번호 1에 약 95 % 이상의 동일성을 갖는 DNA 서열을 기재로 하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계는 고스트 칠리 페퍼로부터 유도되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, 제1 기질은 8-메틸-6-노네노일-CoA, 8-메틸 노나노일-CoA, 옥타노일-CoA, 데카노일-CoA, 다른 중간- 내지 긴- 사슬 아실 CoA 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 활성화된 지방산인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, 혼합물에 제1 기질을 제공하는 단계는 혼합물 내 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계 및 제2 기질을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제6항에 있어서, ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계는 고스트 칠리 페퍼로부터 유도되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제6항에 있어서, 제2 기질은 8-메틸-6-노넨산, 8-메틸 노난산, 옥탄산, 데칸산, 다른 중간- 내지 긴- 사슬 지방산 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 지방산인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제6항에 있어서, 임의의 유전자를 발현하는 단계가 시험관내 번역에 의해 유전자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제6항에 있어서, 임의의 유전자를 발현하는 단계가 세포 시스템 내 유전자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제9항에 있어서, 세포 시스템이 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 미생물을 기재로 하는 것인 캡사이시노이드 산의 생물전환 제조 방법.
제9항에 있어서, 임의의 유전자로부터의 발현 생성물이 재조합 단백질로 정제되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제1항에 있어서, 제3 기질 바닐리아민(vanillyamine)을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제13항에 있어서, 제3 기질 바닐리아민을 제공하는 단계는 혼합물 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계 및 제4 기질 바닐린을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제14항에 있어서, pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계는 고스트 칠리 페퍼로부터 유도되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제14항에 있어서, 임의의 유전자를 발현하는 단계는 시험관내 번역에 의해 유전자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제14항에 있어서, 임의의 유전자를 발현하는 단계가 세포 시스템 내 유전자를 발현하는 단계를 추가로 포함하는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제17항에 있어서, 세포 시스템은 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 미생물을 기재로 하는 것인 캡사이시노이드 산의 생물전환 제조 방법.
제9항에 있어서, 임의의 유전자로부터의 발현 생성물이 재조합 단백질로 정제되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 제1 유전자 산물을 발현하는 단계;
배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계; 및
캡사이시노이드를 회수하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제20항에 있어서, 캡사이시노이드는 캡사이신인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제21항에 있어서,
8-메틸-6-노네노일-CoA를 제공하는 단계; 및
바닐릴아민(vanillylamine)을 제공하는 단계
를 추가로 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제22항에 있어서, 8-메틸-6-노네노일-CoA를 제공하는 단계는
세포 시스템 내 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계; 및
8-메틸-6-노넨산을 제공하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제22항에 있어서, 바닐릴아민을 제공하는 단계는
세포 시스템 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계; 및
바닐린을 제공하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제20항에 있어서, 캡사이시노이드는 디히드로캡사이신인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제25항에 있어서,
8-메틸-노나노일-CoA를 제공하는 단계; 및
바닐릴아민을 제공하는 단계
를 추가로 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제26항에 있어서, 8-메틸-6-노나노일-CoA를 제공하는 단계는
세포 시스템 내 ACS1의 제2 유전자 산물을 발현하는 단계; 및
8-메틸 노난산을 제공하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제26항에 있어서, 바닐릴아민을 제공하는 단계는
세포 시스템 내 pAMT의 제3 유전자 산물을 발현하는 단계; 및
바닐린을 제공하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제20항에 있어서, 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 CS/AT3/Pun1로부터 발현되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제20항에 있어서, 유전자 산물은 고스트 칠리 페퍼로부터 클로닝된 CS/AT3/Pun1과 약 95 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 CS/AT3/ Pun1로부터 발현되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제20항에 있어서, 세포 시스템은 박테리아, 효모 및 이의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
세포 시스템 내 CS/AT3/ Pun1의 유전자 산물을 발현하는 단계;
지방산-CoA를 제공하는 단계;
바닐릴아민을 제공하는 단계;
배지 내 세포 시스템을 성장시키는 단계; 및
캡사이시노이드를 회수하는 단계
를 포함하는 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제32항에 있어서, 지방산-CoA는 8-메틸-6-노네노일-CoA이고; 캡사이시노이드는 수치 비로 약 90 % 초과 캡사이신인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제32항에 있어서, 지방산-CoA는 8-메틸-노나노일-CoA이고; 캡사이시노이드는 수치 비로 약 90 % 초과 디히드로캡사이신인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제32항에 있어서, 지방산-CoA는 옥타노일-CoA인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.
제32항에 있어서, 지방산-CoA는 데카노일-CoA인 캡사이시노이드의 생물전환 제조 방법.