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CN116837016B - 一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用 - Google Patents

一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用 Download PDF

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CN116837016B CN202311091014.4A CN202311091014A CN116837016B CN 116837016 B CN116837016 B CN 116837016B CN 202311091014 A CN202311091014 A CN 202311091014A CN 116837016 B CN116837016 B CN 116837016B
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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用。本发明通过阻断脂肪酸β‑氧化分解途径及提高菌株对脂肪酸耐受能力，提高了壬酸的利用效率；进一步利用游离的低拷贝质粒在底盘细胞内表达了合成香草壬酰胺的N‑酰基转移酶和CoA链接酶编码基因并对不同来源基因进行了筛选，构建了可合成香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株。以壬酸和香兰素胺为底物利用细胞转化合成香草壬酰胺，并对生物转化条件进行了优化，香草壬酰胺摇瓶转化产量达到150.7 mg/L，发酵罐水平转化产量达到500.6 mg/L。

Description

一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的 方法及重组菌株和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用。
背景技术
辣椒素是由中长链的脂肪酸（C9 ~ C11）与香兰素胺合成的一类酰胺类物质。天然辣椒素多来源于辣椒。辣椒素是一类物质的总称，成分的具体差异体现在脂肪酸结构上。具体来说，辣椒素有三种类型。第一种类型脂肪酸无侧链且含不饱和双键（如辣椒碱）；第二种类型脂肪酸有侧链（如二氢辣椒碱）；第三种类型脂肪酸无侧链和不饱和双键（如香草壬酰胺）。
辣椒素因具有抗氧化和抗菌的特性而常被用作食品防腐剂。辣椒素具有广泛的抑菌和杀菌功能，也是饲料添加剂中抗生素的优良替代品。辣椒素在减轻疼痛、预防癌症和减肥方面可能有潜在的临床医学价值。
目前，辣椒素可通过植物提取和化学合成两种方法获得。生物合成对人类生产和生活用品的需求越来越受到青睐。近年来，辣椒素的生物合成机制逐渐被揭示。通过对高辣度辣椒和辣度缺失辣椒品种的遗传分析，揭示了一些参与辣椒素生物合成的关键基因。基于此，建立一种能够以低价原料为底物利用生物转化高效合成辣椒素的生产策略极具吸引力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用壬酸和香兰素胺生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的构建及细胞转化合成条件。本发明提供的技术方案如下：
根据本发明的构建生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的方法，包括如下步骤：
通过敲除fadE基因和fadR基因阻断大肠杆菌宿主细胞的脂肪酸β-氧化分解途径，其中，所述fadE基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，所述fadR基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
通过敲除acrR基因、crp基因、dppA基因、dppA基因和yeaR基因提高大肠杆菌宿主细胞对脂肪酸耐受能力，其中，所述acrR基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质，所述crp基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质，所述dppA基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的蛋白质，所述yeaR基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的蛋白质；
表达香草壬酰胺合成酶系编码基因，所述香草壬酰胺合成酶系编码基因包括N-酰基转移酶编码基因和CoA链接酶编码基因，所述N-酰基转移酶编码基因来源于Capsicum annuum、Solanum lycopersicum和Amycolatopsis mediterranei，为CaNAT基因、SlNAT基因或AmNAT基因，所述CaNAT基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白质，所述SlNAT基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的蛋白质，所述AmNAT基因编码氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示的蛋白质，
所述CoA链接酶编码基因来源于Sphingomonas sp.、Petunia hybrida和Populus tomentosa，为SpCL基因、PhCL基因、PtCL基因或PtmCL基因，所述SpCL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的蛋白质，所述PhCL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的蛋白质，所述PtCL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的蛋白质，所述PtmCL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的蛋白质。
根据本发明的构建生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的方法，其中，所述N-酰基转移酶编码基因为SlNAT基因、所述CoA链接酶编码基因为SpCL基因；所述N-酰基转移酶编码基因为SlNAT基因、所述CoA链接酶编码基因为PhCL基因；所述N-酰基转移酶编码基因为CaNAT基因、所述CoA链接酶编码基因为SpCL基因；所述N-酰基转移酶编码基因为CaNAT基因、所述CoA链接酶编码基因为PhCL基因；或者所述N-酰基转移酶编码基因为CaNAT基因、所述CoA链接酶编码基因为PtCL基因。
本发明还提供了通过上述方法构建的生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株。
所述突变型大肠杆菌底盘细胞为阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高对脂肪酸耐受能力的大肠杆菌宿主。
进一步地，将上述方法中的N-酰基转移酶和CoA链接酶编码基因连接到pCDFDute-1载体上，分别利用各自的启动子进行胞内表达。
上述方法中，所述启动子均为T7启动子。
根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，所述方法包括如下步骤：以壬酸和香兰素胺为底物，使用诱导后的上述大肠杆菌工程菌株通过细胞转化合成香草壬酰胺。
根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，在pH为9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中进行细胞转化。
根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，在25 ℃下合成香草壬酰胺。
根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中， 诱导后的大肠杆菌工程菌株细胞用无菌水清洗2次。
根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，细胞转化的时间为8小时。
本发明的有益技术效果
本发明通过阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高菌株对脂肪酸耐受能力，提高了壬酸的利用效率；进一步利用游离的低拷贝质粒在底盘细胞内表达了合成香草壬酰胺的N-酰基转移酶和CoA链接酶编码基因并对不同来源基因进行了筛选，构建了可合成香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株。以壬酸和香兰素胺为底物利用细胞转化合成香草壬酰胺，并对生物转化条件进行了优化，香草壬酰胺摇瓶转化产量达到150.7 mg/L，发酵罐水平转化产量达到500.6 mg/L。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的大肠杆菌工程菌Ec2、Ec6菌株与野生菌株在含不同浓度壬酸钠的LB培养基中的生长曲线图；
图2为本申请构建的大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在实施例3中以壬酸钠和香兰素胺为底物合成香草壬酰胺的高效液相色谱和质谱的分析结果，其中，A：高效液相色谱分析结果；B：质谱鉴定结果；
图3为本申请构建的大肠杆菌工程菌株在实施例3中以壬酸钠和香兰素胺为底物合成香草壬酰胺的结果；
图4为本申请构建的大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在实施例4中以壬酸钠和香兰素胺为底物在不同pH缓冲条件下合成香草壬酰胺的结果；
图5为本申请构建的大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在实施例4中以壬酸钠和香兰素胺为底物在不同温度条件下合成香草壬酰胺的结果；
图6为本申请构建的大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在实施例4中以壬酸钠和香兰素胺为底物在不同细胞处理方式条件下合成香草壬酰胺的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买获得。
实施例1 构建提高大肠杆菌壬酸利用效率的底盘细胞
一、构建敲除大肠杆菌脂肪酸β-氧化分解途径关键基因的菌株Ec2
将含有CRISPR-associated transposases基因组编辑系统的质粒pSL1521（购买自Addgene）以及含有靶向fadE和fadR基因的gRNA表达盒的质粒pUC-gRNA2转化到宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中。在gRNA引导下，CRISPR-associated transposases基因组编辑系统定点识别并插入转座子，获得fadE和fadR基因敲除的Ec2菌株。具体方法如下：
1.合成带有J23119组成型启动子、靶向fadE和fadR基因的gRNA和骨架序列的基因敲除质粒pUC-gRNA2
根据组成型启动子J23119、fadE基因和fadR基因的核苷酸序列，设计靶向fadE和fadR基因的gRNA表达盒的核苷酸序列，并连接到pUC载体上构建pUC-gRNA2质粒。
2.构建大肠杆菌Ec2突变菌株
将pSL1521质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素的固体LB平板上，在30℃恒温培养箱中过夜培养，随后筛选阳性转化子并转接添加50µg/mL链霉素的LB培养基中，置于恒温摇床中30 ℃，200 r/min过夜培养制备种子液。种子液以1%接种量转接新鲜的LB培养基中，当菌液OD600接近0.6 ~ 0.8时制备pSL1521-BL21(DE3) 化学感受态细胞。感受态细胞置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
随后，将pUC-gRNA2质粒转化pSL1521-BL21(DE3) 化学感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素和50µg/mL卡那霉素的固体LB平板上，在30 ℃恒温培养箱中过夜培养，随后利用菌落PCR检测，筛选目的基因成功被敲除的克隆。将上述筛选获得的菌株接种至LB培养基中40 ℃传代培养5代，筛选出无pSL1521和pUC-gRNA2质粒的菌株，最终获得Ec2菌株。
二、构建阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高对脂肪酸耐受能力的菌株Ec6
将含有CRISPR-associated transposases基因组编辑系统的质粒pSL1521（购买自Addgene）以及含有靶向fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因的gRNA表达盒的质粒pUC-gRNA6转化到宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中。在gRNA引导下，CRISPR-associatedtransposases基因组编辑系统定点识别并插入转座子，获得fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因敲除的Ec6菌株。具体方法如下：
1.合成带有J23119组成型启动子、靶向fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因的gRNA和骨架序列的基因敲除质粒pUC-gRNA6。
根据组成型启动子J23119以及fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因的核苷酸序列，设计靶向fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因的gRNA表达盒的核苷酸序列，并连接到pUC载体上构建pUC-gRNA6质粒。
2.构建大肠杆菌Ec6突变菌株
将pSL1521质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素的固体LB平板上于30 ℃恒温培养箱中过夜培养，随后筛选阳性转化子并转接添加50µg/mL链霉素的LB培养基中，置于恒温摇床中30 ℃，200 r/min过夜培养制备种子液。种子液以1%接种量转接新鲜的LB培养基中，当菌液OD600接近0.6 ~ 0.8时制备pSL1521-BL21(DE3) 化学感受态细胞。
随后，将pUC-gRNA6质粒转化pSL1521-BL21(DE3) 化学感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素和50µg/mL卡那霉素的固体LB平板上于30 ℃恒温培养箱中过夜培养，随后利用菌落PCR检测，筛选目的基因成功被敲除的克隆。将上述筛选获得的菌株接种至LB培养基中40 ℃传代培养5代，筛选出无pSL1521和pUC-gRNA6质粒的菌株，最终获得Ec6菌株。
三、大肠杆菌BL21(DE3)、Ec2和Ec6菌株在含有壬酸培养基中的生长曲线测定
选取野生型大肠杆菌BL21(DE3)菌株为对照（Ec0），基因编辑菌株Ec2和Ec6菌株为实验组。3个菌株分别接种到新鲜的LB培养基中制备种子液，随后种子液以1%的接种量转接到新鲜的培养基中，37 ℃，200 r/min培养菌体密度（OD600）约1.0时进行第二次转接，培养基分别为含0.05%、0.10%和0.30%壬酸钠的LB培养基，转接后初始菌体密度约0.08。随后在10 h内检测菌体密度变化，而后绘制菌株的生长曲线，结果如图1所示，随着壬酸浓度的提高，三个菌株的生长均受到一定的抑制。相比菌株Ec2，阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高对脂肪酸耐受能力的菌株Ec6可在阻断壬酸降解的同时保证壬酸的耐受性，即提高了壬酸利用效率。
实施例2 构建可合成香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株
一、构建香草壬酰胺合成酶系的表达质粒
将香草壬酰胺合成酶系包括N-酰基转移酶编码基因CaNAT和CoA链接酶编码基因，分别置于T7启动子调控的表达盒中，进行基因合成，经T4连接酶连接到pCDFDute-1质粒上。具体构建方法如下：
N-酰基转移酶编码基因CaNAT表达盒经限制性内切酶BglII和XhoI消化后的粘性末端片段经T4连接酶连接到经限制性内切酶BglII和XhoI消化的pCDFDute-1质粒上，随后重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素的固体LB平板上于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，挑选平板上的单克隆进行菌落PCR检测。选择阳性转化子转接至含50 µg/mL链霉素的LB液体培养基中过夜培养，随后提取重组质粒pCDF-CaNAT。
CoA链接酶编码基因PhCL表达盒经限制性内切酶NcoI和BamHI消化后的粘性末端片段经T4连接酶连接到经限制性内切酶NcoI和BamHI消化的pCDF-CaNAT质粒上，随后重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素的固体LB平板上于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑选平板上的单克隆进行菌落PCR检测。选择阳性转化子转接至含50 µg/mL链霉素的LB液体培养基中过夜培养，随后提取重组质粒pCDF-CaNAT-PhCL。
根据上述描述组合香草壬酰胺合成酶系，包括N-酰基转移酶编码基因和CoA链接酶编码基因，选择的N-酰基转移酶编码基因来源于Capsicum annuum、Solanum lycopersicum和Amycolatopsis mediterranei，分别命名为CaNAT基因、SlNAT基因和AmNAT基因；选择的CoA链接酶编码基因来源于Sphingomonas sp.、Petunia hybrida和Populus tomentosa，分别命名为SpCL、PhCL、PtCL和PtmCL。构建的重组质粒包括pCDF-SlNAT-SpCL、pCDF-SlNAT-PhCL、pCDF-SlNAT-PtmCL、pCDF-SlNAT-PtCL、pCDF-AmNAT-SpCL、pCDF-AmNAT-PhCL、pCDF-AmNAT-PtmCL、pCDF-AmNAT-PtCL、pCDF-CaNAT-SpCL、pCDF-CaNAT-PhCL、pCDF-CaNAT-PtmCL和pCDF-CaNAT-PtCL。
构建可合成香草壬酰胺的工程菌株
将重组质粒包括pCDF-SlNAT-SpCL、pCDF-SlNAT-PhCL、pCDF-SlNAT-PtmCL、pCDF-SlNAT-PtCL、pCDF-AmNAT-SpCL、pCDF-AmNAT-PhCL、pCDF-AmNAT-PtmCL、pCDF-AmNAT-PtCL、pCDF-CaNAT-SpCL、pCDF-CaNAT-PhCL、pCDF-CaNAT-PtmCL和pCDF-CaNAT-PtCL分别转化突变型大肠杆菌底盘细胞Ec6感受态细胞，孵育后涂布在含50 µg/mL链霉素的固体LB平板上于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，挑选平板上的单克隆进行菌落PCR检测，挑选阳性转化子。将成功构建的工程菌株命名为Ec6-NV1~Ec6-NV12。上述大肠杆菌工程菌株如表1所示。
表1
菌株 遗传特征
Ec2 BL21(DE3)敲除fadE和fadR基因
Ec6 BL21(DE3)敲除fadE、fadR、acrR、crp、dppA和yeaR基因
Ec6-NV1 Ec6菌株已转化质粒pCDF-SlNAT-SpCL
Ec6-NV2 Ec6菌株已转化质粒pCDF-SlNAT-PhCL
Ec6-NV3 Ec6菌株已转化质粒pCDF-SlNAT-PtmCL
Ec6-NV4 Ec6菌株已转化质粒pCDF-SlNAT-PtCL
Ec6-NV5 Ec6菌株已转化质粒pCDF-AmNAT-SpCL
Ec6-NV6 Ec6菌株已转化质粒pCDF-AmNAT-PhCL
Ec6-NV7 Ec6菌株已转化质粒pCDF-AmNAT-PtmCL
Ec6-NV8 Ec6菌株已转化质粒pCDF-AmNAT-PtCL
Ec6-NV9 Ec6菌株已转化质粒pCDF-CaNAT-SpCL
Ec6-NV10 Ec6菌株已转化质粒pCDF-CaNAT-PhCL
Ec6-NV11 Ec6菌株已转化质粒pCDF-CaNAT-PtmCL
Ec6-NV12 Ec6菌株已转化质粒pCDF-CaNAT-PtCL
实施例3 以壬酸和香兰素胺为底物利用大肠杆菌工程菌株合成香草壬酰胺
Ec6-NV~Ec6-NV12菌株分别接种至含50 µg/mL链霉素的 LB培养基中，恒温摇床中（37 ℃，200 r/min）过夜培养以制备种子液。次日，转接至含50 µg/mL链霉素的新鲜的LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养菌密度（OD600）接近0.8时添加终浓度为0.5 mM的IPTG，随后4℃，200 r/min诱导培养16 h。
5000 r/min离心5 min收集诱导后的菌体，使用等体积的水清洗菌体，随后再次离心收集菌体并重复一次。使用含20 g/L葡萄糖的0.1 M pH 6.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液重悬菌体，菌密度（OD600）调成5.0左右。细胞转化体系中含有2 g/L壬酸钠、2 g/L香兰素胺、0.5g/L Tween-80和10 mL/L微量元素。细胞转化液体积为15 mL，置于100 mL三角摇瓶中，恒温摇床中30 ℃（250 r/min）进行转化反应，分别取24 h和48 h转化样品测定香草壬酰胺产量。
其中所述LB培养基成分为：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl。所述微量元素水溶液成分为：10 g/L FeSO4、2.25 g/L ZnSO4、1.0 g/L CuSO4、0.5 g/LMnSO4、0.23 g/L Na2B4O7、2.0 g/L CaCl2和0.1 g/L (NH4)6Mo7O24。
菌液OD600测定：利用可见光分光光度计，测定波长600 nm下菌液的吸光度值。
高效液相色谱和质谱分析和鉴定香草壬酰胺：取3.0 mL转化液，添加3.0 mL乙酸乙酯后充分混匀，随后4500 r/min离心5 min后吸取1.5 mL上清有机相旋转干燥1.5 h，取0.3 mL甲醇充分溶解样品，随后12,000 r/min离心10 min后LC-MS鉴定产物并由HPLC测定产物产量。
液相-质谱联用仪（LC-MS）装备XDB-C18色谱柱对香草壬酰胺样品进行鉴定。样品注入色谱柱中，随后在70%流动相A（乙腈）和30%流动相B（0.1%甲酸水）作用下进行柱分离。色谱柱样品进入质谱仪中在ESI(+)离子源下带电，毛细管电压设置为2.5 kV，载气为氮气，载气流速为12 L/min，干燥温度为350 ℃，一级质谱检测并捕捉到目标母离子后，随后进一步赋能击碎母离子后对碎片离子进行二级质谱分析，离子捕捉范围设置为200 ~ 900（m/z）。
高效液相色谱（HPLC）装备紫外检测器（SPD-20A），样品注入ZORBAX Eclipse PlusC18色谱柱中，随后在流速为1.0 mL/min的流动相作用下进行梯度柱分离。流动相A为乙腈，流动相B为0.1%的三氟乙酸（TFA）水，流动相程序分为三个过程，首先乙腈在10 min内以5%的初始浓度提升至80%，随后乙腈以80%浓度维持8 min，最后乙腈在4 min内浓度降回5%并维持3 min。
以壬酸和香兰素胺为底物，上述的大肠杆菌工程菌株可通过细胞转化合成香草壬酰胺，高效液相色谱和质谱分析和鉴定结果如图2所示（图2中A图，高效液相色谱分析结果；图2中B图，质谱鉴定结果），经过细胞转化合成的香草壬酰胺与标准品的色谱图一致。大肠杆菌工程菌株Ec6-NV1–Ec6-NV12菌株合成香草壬酰胺的结果如图3所示，香草壬酰胺合成效率最高的为Ec6-NV10菌株，即CaNAT和PhCL的组合为最优组合。在24 h时，细胞转化反应已达到平台期，香草壬酰胺的最高产量可达到150.7 mg/L。
实施例4 反应条件优化及发酵罐水平转化
选取摇瓶转化反应中香草壬酰胺合成效率最高的Ec6-NV10菌株进行发酵罐水平转化反应条件优化。
Ec6-NV10菌株按照5%接种量转接至含50 µg/mL链霉素的发酵培养基中，37 ℃，pH7.0条件下培养至菌密度（OD600）接近30时，添加终浓度为1 mM的IPTG，16 ℃诱导培养16 h。随后5000 r/min离心5 min收集诱导后的菌体，使用等体积的无菌水清洗菌体，随后再次离心收集菌体并重复一次。使用含20 g/L葡萄糖的0.1 M pH 9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液重悬菌体，调整菌密度至20.0左右。细胞转化体系中加入2 g/L壬酸钠、2 g/L香兰素胺，随后在25 ℃，500 r/min条件下进行转化反应。
其中所述发酵培养基成分为：20 g/L葡萄糖、13.3 g/L KH2PO4、4 g/L (NH4)2HPO4、1.2 g/L MgSO4·7H20、1.7 g/L 柠檬酸、1.68 mg/L EDTA·2Na、0.5 mg/L CoCl2·6H2O、3mg/L MnCl2·4H2O、0.3 mg/L CuCl2·2H2O、0.6 mg/L H3BO3、0.5 mg/L Na2MoO4·2H2O、2.6mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O、20 mg/L 柠檬酸铁。
为测定细胞转化的最适pH缓冲液条件，配制0.1 M的系列缓冲液，分别为pH 1.0 ~pH 3.0的HCl-KCl缓冲液、pH 3.0 ~ pH 8.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液、pH 9.0 ~ pH 12.0的甘氨酸-NaOH缓冲液以及pH 6.0 ~ pH 8.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液，30 ℃下进行转化反应。为测定细胞转化的最适温度，在最适pH缓冲体系下把温度设置为16 ℃ ~ 37 ℃进行细胞转化。为测定细胞通透性处理方式对转化的影响，诱导后的细胞用如下方式处理：未处理（CK）、添加20 mg/L十六烷基三甲基溴化铵（G1）、添加20 mg/L曲拉通-100（G2）和细胞用无菌水清洗2次（G3）。
大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在不同pH缓冲条件下合成香草壬酰胺的结果如图4所示，最适缓冲液为甘氨酸-NaOH缓冲液，最适pH为9.0。大肠杆菌工程菌株Ec6-NV10在不同温度条件下合成香草壬酰胺的结果如图5所示，最适温度为25 ℃。 诱导后的细胞处理方式对转化的影响如图6所示，细胞用无菌水清洗2次可以显著提升香草壬酰胺的转化效率。在最优的条件下，经8小时的转化，发酵罐水平香草壬酰胺转化产量达到500.6 mg/L。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (2)

1.一种生产香草壬酰胺的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 以壬酸和香兰素胺 为底物，使用诱导后的生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株通过 在 pH 为9.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液中进行细胞转化合成香草壬酰胺，其中，
诱导后的生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株细胞用无菌水清洗 2 次，细胞转化的时间为 8 小时，
所述生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株被敲除 fadE基因、fadR基因、acrR基因、 crp基因、dppA基因和 yeaR基因、并表达外源表达香草壬酰胺合成酶系编码基因，其中，所述 fadE基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示的蛋白质，所述 fadR基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示的蛋白质，所述 acrR基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示的蛋白质，所述 crp基因编码氨基酸序列 如 SEQ ID NO:4 所示的蛋白质， 所述dppA基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:5 所示的蛋白质，所述 yeaR基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:6 所示的蛋白质；所述外源表达香草壬酰胺合成酶系编码基因包括 N-酰基转移酶编码基因和 CoA 链接酶编码基因， 所述 N-酰基转移酶编码基因为 CaNAT 基因，所述 CaNAT 基因编码氨基酸序列如 SEQ ID NO:7 所示的蛋白质，所述 CoA 链接酶编码基因为 PhCL 基因， 所述 PhCL 基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:11 所示的蛋白质。
2.根据权利要求 1 所述的生产香草壬酰胺的方法，其特征在于，在 25 ℃进行细胞转化，合成香草壬酰胺。
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