CN115960736B - 一种产香草胺和辣椒碱的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种产香草胺和辣椒碱的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明首次在酿酒酵母中异源表达香草胺合成途径，首次实现了香草胺的生物合成。本发明经前体物供应优化和SAM循环圈优化，使香草胺的产量达到了16.48g/L，使香草胺的合成效率提升了将近155％，是目前优化SAM辅因子策略得到的最高的优化效率。本发明基于酿酒酵母合成香草胺，异源构建8‑甲基‑6‑烯壬酰辅酶A的合成途径，以及异源表达辣椒碱合酶AT3，首次实现了辣椒碱的从头生物全合成，辣椒碱的产量高达80.23μg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种产香草胺和辣椒碱的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
伯苄胺作为化工领域不可或缺的一种大宗类化学品，在生物化合物生产、个人护理产品以及生产聚合物领域占据着重要地位。香草胺，也被称为3-甲氧基-4-羟基苯甲胺，属于一种经典的伯苄胺类化合物，是合成生物活性化合物以及生产聚环氧化物的前体，最新研究表明香草胺在溶栓药物研究领域中存在巨大的优势。在植物中香草胺与8-甲基-6-烯壬酸在辣椒碱合成酶催化下酯化生成辣椒碱。辣椒碱作为一种辣椒中合成活性生物碱，由于具有显著的抗炎、抗菌等活性，在食品、药品等领域被广泛应用。由于其具有特殊的刺激性特征，也被用于生产催泪弹等军用产品；辣椒碱与吗啡类药物同时使用，可以降低对吗啡类药物的成瘾性。目前，辣椒碱的获取主要是依靠从辣椒中提取，但由于辣椒碱在植物中含量低以及结构类似物多，使后续的分离纯化造成为了极大的挑战。目前，以贵金属为催化剂，石油化工产品为反应底物，进行胺化反应可以生成香草胺，但这与绿色化工所倡导的要求不相符。有研究表明工程改造的大肠杆菌可以利用木质素水解液中的香草酸、阿魏酸为底物，生产香草胺，底物转化率最高可达95％。但是，此方法主要受木质素水解液中香草酸、阿魏酸等产物的浓度限制，产量仅达到了2.5g/L。而辣椒碱的生物合成方法尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高产香草胺和辣椒碱的酿酒酵母工程菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌中插入有两个基因模块，基因模块一含有PAL2、C4H、4CL2和HCT基因，基因模块二含有CCoAoMT1、FerB2和pAMT基因。
本发明为实现香草胺生物合成途径在酿酒酵母体内的高效组装，将途径分为两个模块。模块一：以苯丙氨酸为起始物，经过苯丙氨酸裂解酶(PAL)，肉桂酸–4–羟化酶(C4H)，4–香豆酰–CoA连接酶(4CL)，羟基肉桂酰转移酶(HCT)四步酶催化生成咖啡酰辅酶A；模块二：以咖啡酰辅酶A为底物，由咖啡酸转甲氧基酶(CAMT)，阿魏酰辅酶A裂解酶(FerB)，假定氨基转移酶(pAMT)催化生成香草胺。本发明将模块一和二构建到酿酒酵母基因组上，实现香草胺的绿色发酵生产，模式图如图1所示。本发明以模块化的方式简单、高效地实现异源长途径的组装。
本发明还提供了一种上述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：构建TPI1t-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t和ADH1t-4CL2-PGK1p-TEF2p-HCT-CYC1t两个双转化单元，将所述两个双转化单元构建到酿酒酵母基因组的YPRCΔ15位点，获得Z1菌株；构建FBA1p-pAMT-ATP15t基因表达盒和HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t双转化单元后，再共同构建到Z1菌株的YORWΔ17位点。
本发明还提供了一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌为将pheA、Aro9和TAL基因构建至上述酿酒酵母工程菌中。通过过表达莽草酸途径，优化了香草胺合成的前体物供应，进一步提升酿酒酵母工程菌中香草胺产量。构建方法包括如下步骤：构建PFY1p-pheA-PRC1t-ACT1p-Aro9-BAN4t和HXT7p-TAL-PRS28At基因表达盒，将所述两个基因表达盒共同构建到上述酿酒酵母工程菌基因组的delta1位点。
本发明还提供了一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌为将SahH和SAM2基因构建至上述任意一项所述酿酒酵母工程菌中，或所述酿酒酵母工程菌为将mtn、luxS和SAM2基因构建至上述任意一项酿酒酵母工程菌中。通过优化S-腺苷-L-甲硫氨酸的再生能力，优化合成途径中涉及到的甲基化反应，使得香草胺的发酵产量达到了16.48g/L，是目前利用酿酒酵母从头生物合成香草胺的最高水平。
本发明还提供了一种上述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：构建HIS-CYC1P-SahH-ALY2t和ENO2p-SAM2-SCW4t基因表达盒，将构建的两个基因表达盒构建到上述任意一项所述酿酒酵母工程菌基因组的rDNA位点；或构建HIS-FBA1p-mtn-NAT5t-ADH1p-luxS-IDP1t和ENO2p-SAM2-SCW4t基因表达盒，将构建的两个基因表达盒构建到上述任意一项所述酿酒酵母工程菌基因组的rDNA位点。
本发明还提供了一种产辣椒碱的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌为将Kas、Acl、Fat和AT3基因构建至上述任意一项所述酿酒酵母工程菌中。本发明在产香草胺工程菌中进一步表达辣椒碱合成相关的脂肪酸支链途径以及辣椒碱合酶，从而实现了辣椒碱的从头生物合成，模式图如图1所示。由图1可以看出，本发明是将香草胺及其衍生物辣椒碱的合成途径分成三个模块，分别构建到酿酒酵母的基因组上，从而实现香草胺及辣椒碱的从头生物合成。本发明是首次利用酿酒酵母从头生产辣椒碱。
本发明还提供了一种上述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：构建ASP3t-Kas-PGK1p-FBA1p-Acl-HAP4t和YCP4t-Fat-GPM1p-ACT1p-AT3-MDM35t两个双转化单元，将构建的两个双转化单元构建到上述任意一项所述酿酒酵母工程菌基因组的YORWΔ22位点。
本发明还提供了上述任意一项所述酿酒酵母工程菌在香草胺生产中的应用。
本发明还提供了上述任意一项所述酿酒酵母工程菌在辣椒碱生产中的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次在酿酒酵母中异源表达香草胺合成途径，首次实现了香草胺的生物合成。本发明经前体物供应优化和SAM循环圈优化，使香草胺的产量达到了16.48g/L，使香草胺的合成效率提升了将近150％，是目前优化SAM辅因子策略得到的最高的优化效率。
本发明基于酿酒酵母合成香草胺，异源构建8-甲基-6-烯壬酰辅酶A的合成途径，以及异源表达辣椒碱合酶AT3，首次实现了辣椒碱的从头生物全合成，辣椒碱的产量高达80.23μg/L。
本发明的酿酒酵母工程菌利用葡萄糖代谢，直接生成香草胺和辣椒碱，实现了大宗类化学品香草胺，及其复杂衍生物辣椒碱的从头生物合成。本发明构建的工程菌，以组成型启动子配合强终止子控制异源基因的高水平表达，不需要添加诱导物、不需要额外添加高价格底物，简化了发酵工艺，降低了成本，可直接发酵生产香草胺和辣椒碱，与化学合成相比更符合绿色可持续发展的理念。
附图说明
图1为香草胺和辣椒碱途径的分层次设计模式图；
图2为实施例1-4构建所得酿酒酵母工程菌株香草胺产量结果；
图3为C1菌株发酵生产辣椒碱的HPLC-MS/MS定性分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
构建香草胺合成酿酒酵母工程菌
1)将来源于拟南芥的PAL2、C4H、4CL2基因，来源于烟草的HCT、CCoAoMT1基因，来源于鞘氨醇单胞菌的FerB2基因以及来源于辣椒的pAMT的编码基因经密码子优化后，委托金唯智公司化学合成，合成后的PAL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、C4H的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、4CL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、HCT的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示、CCoAoMT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、FerB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、pAMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2)选择酿酒酵母中的组成型启动子TDH3p、ADH1p、PGK1p和TEF2p使用引物序列1-8，以酿酒酵母基因组为模板利用OE-PCR的方法构建两个头碰头的启动子模块，将启动子模块保存至质粒中。具体方法如下：
a：按照反应体系：TDH3p纯化回收片段60ng，ADH1p纯化回收片段60ng，dNTP(10mM)2μL，PrimeSTAR DNA聚合酶1μL，5×PrimeSTAR Bufer 10μL，补足水至50μL；使用PCR仪，以98℃ 3min；98℃ 10s，65℃ 1min(1Kb/min)，循环30次；68℃ 5min，4℃保存。b：反应结束后，选择天根的PfuDNA聚合酶，以上述不用纯化的反应液为模板，以引物1和引物4进行常规PCR扩增，即可得到TDH3p+ADH1p连接的片段。c：纯化回收后，取TDH3p+ADH1p片段50ng(基因片段长度决定用量，50ng/Kb)，加入pBM16A Vevtor 1μL，10×Toposmart 1μL(试剂选择博迈德公司购买pBM16A Toposmart克隆试剂盒)，加水补足至10μL；混合均匀，使用PCR在25℃条件下保持30min。d：反应结束后10μL反应液加入到100μL刚刚冰上融化的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混合均匀，冰浴30min；e：42℃条件下热击90s后，立即转移置冰水中2min；f：感受态细胞中加入900μLLB培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；g：4000rpm离心1min，去除900μL上清液，细胞用剩余液体重悬，均匀涂布于含100μg/L的AmpLB平板，37℃过夜培养，菌落PCR验证正确单菌落提取质粒送至金唯智公司测序。即可将TDH3p+ADH1p片段保存至质粒pBM16A中备用(pBM16A-TDH3p+ADH1p)；重复步骤a-g，保存制备的备用质粒pBM16A-PGK1p+TEF2p。
3)选择TPI1t，PGI1t，ADH1t，CYC1t组装成两个背靠背的终止子模块(两个终止子中间插入Sap1酶切位点，两端加上同源臂L1-L2，L3-L4)，功能基因分别利用引物9-引物16PCR扩增(功能基因均以委托金唯智公司合成质粒为模板)，且在两端装配与启动子模块和终止子模块相对应Sap1酶切位点。
上述过程中涉及到的引物序列具体如下：
引物1：5’>CCTGCTCTTCACATTTTGTTTATGTGTGTTTATTC<3’，启动子TDH3p扩增上游引物，下划线序列为启动子TDH3p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物2：5’>TCTGTTCTATTGTATATCTCCCCTCCGCCACCTACATGTATACTAGCGTTGAATGTTAG<3’，启动子TDH3p扩增下游引物，下划线序列为与启动子ADH1p重叠序列。
引物3：5’>AAACTTCTTGTTGTTGACGCTAACATTCAACGCTAGTATACATGTAGGTGGCGGAGGGG<3’，启动子ADH1p扩增上游引物，下划线序列为与启动子TDH3p重叠序列。
引物4：5’>CCTGCTCTTCATGTATATGAGATAGTTGATTGTATG<3’，启动子ADH1p扩增下游引物，下划线序列为启动子ADH1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物5：5’>CCTGCTCTTCACATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG<3’，启动子PGK1p扩增上游引物，下划线序列为启动子PGK1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物6：5’>GGAAGCGCCTACGCTTGACATCTACTATATGTAAGTATAACGCACAGATATTATAACAT<3’，启动子PGK1p扩增下游引物，下划线序列为与启动子TEF2p重叠序列。
引物7：5’>GCAAATGCCTATTGTGCAGATGTTATAATATCTGTGCGTTATACTTACATATAGTAGAT<3’，启动子TEF2p扩增上游引物，下划线序列为与启动子PGK1p重叠序列。
引物8：5’>CCTGCTCTTCATGTGGTACTAGTGTTTAGTTAATTATAG<3’，启动子TEF2p扩增下游引物，下划线序列为启动子TEF2p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物9：5’>CCTGCTCTTCAGGTTTAACAAATTGGAATAGGAGCACCGTTC<3’，基因PAL2扩增上游引物，下划线序列为基因PAL2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物10：5’>CCTGCTCTTCAGTAATGGACCAAATTGAGGCAATGTTG<3’，基因PAL2扩增下游引物，下划线序列为基因PAL2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物11：5’>CCTGCTCTTCAACAATGGACTTGTTGTTGTTGGAAAAG<3’，基因C4H扩增上游引物，下划线序列为基因C4H经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物12：5’>CCTGCTCTTCAGATTTAACAATTTCTTGGCTTCATAAC<3’，基因C4H扩增下游引物，下划线序列为基因C4H经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物13：5’>CCTGCTCTTCAGGTTTAACATAACTTAGCTTTTAAATC<3’，基因4CL2扩增上游引物，下划线序列为基因4CL2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物14：5’>CCTGCTCTTCAGTAATGATTACTGCAGCATTGCACG<3’，基因4CL2扩增下游引物，下划线序列为基因4CL2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物15：5’>CCTGCTCTTCAACAATGAAAATTGAAGTTAAAGAATC<3’，基因HCT扩增上游引物，下划线序列为基因HCT经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物16：5’>CCTGCTCTTCAGATTTAAAAATCGTACAAAAATTTCTCAAAC<3’，基因HCT扩增下游引物，下划线序列为基因HCT经Sap1酶切后形成的粘性末端。
4)使用Golden Gate的连接方法，以终止子模块为接收质粒(0.2pmol)，插入启动子模块和两个功能基因(各0.6pmol)，具体Golden Gate方法如下：
反应在10μL系统中完成：2.5μLAnzaT4DNA连接酶主混合物、0.5μL Anza10X缓冲液、0.2pmol受体载体、插入片段0.6pmol、0.5μL Anza 36 Eco31l，加无菌水补足至10μL。所有酶均购自ThermoFisher公司。Golden Gate反应在PCR仪中进行：37℃，5分钟；37℃ 1分钟，23℃ 1分钟，反应30循化；37℃保持5分钟；65℃持续10分钟；保存在4℃。将10μL的组装混合物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在37℃下用Amp抗生素在LB琼脂平板上孵育过夜。使用2×Taq Master Mix(天根公司)从LB琼脂平板中随机挑选50个菌落进行PCR验证，挑选正确菌落。经上述方法组装成两个双转化单元DH5α/PUC57T-(TPI1t-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t)和DH5α/PUC57T-(ADH1t-4CL2-PGK1p-TEF2p-HCT-CYC1t)。
5)按下述步骤将含有PAL2、C4H、HCT、4CL2的两个双转化单元(步骤4)构建所得)构建到酿酒酵母基因组的YPRCΔ15位点，实现模块一的组装，形成Z1菌株：
a、酿酒酵母感受态细胞的制备
(1)在固体平板上挑取单克隆，将其转接于不含抗生素的YPD液体培养基中，30℃、200rpm摇床中过夜培养；(2)将培养后的菌液按照10％的体积转接于新鲜不含抗生素的YPD液体培养基中，30℃、200rpm摇床中继续培养5-8h；(3)取1.5ml菌液置于离心管中，5000rpm离心3min，弃去上清；(4)用1ml无菌水重悬细胞，5000rpm离心2min，弃去上清；(5)用1mL100mM LiAc重悬细胞，静置3min，4000rpm离心4min，弃去900ul上清液，重悬菌体，之后置于冰上。酿酒酵母感受态细胞制备完毕。
b、酿酒酵母的转化
(1)将鲑鱼精10％的单链ssDNA 40uL，沸水中变性5min，立即插入冰内待用；(2)在一个新的离心管中加入上述4)中制备的两个双转化单元各500ng，含有YPRCΔ15位点上端序列和筛选标记基因质粒(Δ15 site1)500ng，以及含有YPRCΔ15位点上端序列的质粒(Δ15site2)，之后向其中加入变性的鲑鱼精10％的单链ssDNA 40uL；之后将两者混合物转移到置于冰上的酿酒酵母感受态细胞中，依次加入50％w/v PEG 3350 480uL和1M LiAc72uL。离心管高速涡旋震荡1min，使各成分充分混匀；(3)将转化体系放于30℃培养箱中静置30min；(4)加入72uL二甲基亚砜(DMSO)，涡旋混匀；(5)离心管置于42℃水浴锅中，热激10min，4000rpm离心5min，弃上清；(6)加入200uL5mM CaCl2，重悬混匀，静置10min，4000rpm离心5min，弃上清；(7)使用1mL无菌水重悬清洗细胞，4000rpm离心1min，弃上清；之后加入100uL无菌水重悬细胞，涂布到相应固体培养基上；(8)倒置培养，30℃恒温培养箱中培养2-4d。
6)在Z1菌株的基础上，使用5)的方法将CCoAoMT1、FerB2、pAMT三个编码基因，构建到酿酒酵母的YORWΔ17位点，实现酿酒酵母中模块二的组装，生成最终的酿酒酵母工程菌菌株(Z2)。此步骤中，选择ENO2p，PYK1p，FBA1p启动子和HOG1t，LRP1t，ATP15t终止子控制基因的表达。由于在此模块中只有三个基因，因此pAMT直接按照步骤2)中OE-PCR方法组装pAMT基因表达盒：FBA1p-pAMT-ATP15t。使用上述步骤4)中的方法构建CCoAoMT1、FerB2的双转化单元：HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t。
采用上述方法构建所得的Z2菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上YORWΔ15位点为：
URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t；
YORWΔ17位点为：
TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t。
步骤6)涉及的引物序列如下：
引物17：5’>CCTGCTCTTCACATGGTCTCACATCTATTATTGTATG<3’，启动子ENO2p扩增上游引物，下划线序列为启动子ENO2p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物18：5’>TTGTACATACTAATATATATAAACAAAGTAACGTCTCCTACGCGGCGTTATGTCACTAA<3’，启动子ENO2p扩增下游引物，下划线序列为与启动子PYK1p重叠序列。
引物19：5’>CGCAAGTTGGTGCACGTCGTTAGTGACATAACGCCGCGTAGGAGACGTTACTTTGTTTA<3’，启动子PYK1p扩增上游引物，下划线序列为与启动子ENO2p重叠序列。
引物20：5’>CCTGCTCTTCATGTATAATTTGCGATCGTAGTTGGG<3’，启动子PYK1p扩增下游引物，划线序列为启动子PYK1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物21：5’>CCTGCTCTTCAGGTTTAAGATATTCTTCTGCACAAAG<3’，基因CCoAoMT1扩增上游引物，下划线序列为基因CCoAoMT1经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物22：5’>CCTGCTCTTCAGTAATGGCTACTAACGGTAGACACCAAG<3’，基因CCoAoMT1扩增下游引物，下划线序列为基因CCoAoMT1经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物23：5’>CCTGCTCTTCAACAATGTCTGATGAATTGACATTTG<3’，基因FerB2扩增上游引物，下划线序列为基因FerB2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物24：5’>CCTGCTCTTCAGATTTAATCTTCTCTTCTATAACCAC<3’，基因FerB2扩增下游引物，下划线序列为基因FerB2经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物25：5’>CTTGTATTGTTCTAACGATCCGACCATTTCATCCTGAATATAACAATACTGACAGTACT<3’，启动子FBA1p扩增上游引物，下划线序列为与终止子LRP1t重叠序列。
引物26：5’>CATATCATGACCCATAAATTCGTTTGTAATATTTGCCATTTTGAATATGTATTACTTGG<3’，启动子FBA1p扩增下游引物，下划线序列为与基因pAMT重叠序列。
引物27：5’>TTGTCATATATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGGCAAATATTACAAACGA<3’，基因pAMT扩增上游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。
引物28：5’>CGAGTAAAAAAAGAGCTGCAGTTCCCAGGAAGCGTTAAATTATTGTTTTTGTGACTTCA<3’，基因pAMT扩增下游引物，下划线序列为与终止子AT915t重叠序列。
引物29：5’>GAAAAAAGAGTTGAAGAATTGAAGTCACAAAAACAATAATTTAACGCTTCCTGGGAACT<3’，终止子ATP15t扩增上游引物，下划线序列为与基因pAMT重叠序列。
引物30：5’>GTGATGAATTTTGAGAGCCCACTTTTGTTGGGGACGATTGAGAGGCTGAAGGCAGAGAA<3’，终止子ATP15t扩增下游引物，下划线序列为与YORWΔ17位点重叠序列。
上述过程中涉及到的启动子、终止子的核苷酸序列分别为：TDH3p(SEQ ID NO.8)、ADH1p(SEQ ID NO.9)、PGK1p(SEQ ID NO.10)、TEF2p(SEQ ID NO.11)、TPI1t(SEQ IDNO.12)、PGI1t(SEQ ID NO.13)、ADH1t(SEQ ID NO.14)、CYC1t(SEQ ID NO.15)、ENO2p(SEQID NO.16)、PYK1p(SEQ ID NO.17)、FBA1p(SEQ ID NO.18)、HOG1t(SEQ ID NO.19)、LRP1t(SEQ ID NO.20)、ATP15t(SEQ ID NO.21)。
7)Z2菌株发酵试验：平板中挑选经PCR验证正确的单菌落，接种至20mL的YPD培养基中(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉)，在220rpm，30℃条件下培养36h作为种子液；按照初始OD600值0.1的接种量将种子液接种至装有600mL培养基的1L发酵罐中，pH设定为7.0，温度控制在30℃，通气流量设置为0.1，转速为170rpm，培养96h；接种24h后每隔12h补充6g葡萄糖直至发酵结束，每24h取样一次。取5mL发酵液，加入1mL1M的HCl，加热煮沸10min以充分裂解菌体；离心去除菌体，取1mL上清液加入等体积的甲醇以除去盐分等，上清液使用HPLC进行定性和定量分析，测定香草胺含量，结果显示，酿酒酵母工程菌发酵结束后香草胺含量达到6.47g/L。
实施例2
修饰酵母内源途径，提高香草胺产量
1)将来源于大肠杆菌的双功能分支酸变位酶预苯酸脱水酶编码基因pheA(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)、酿酒酵母的转氨酶编码基因Aro9(核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示)与PFY1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)、ACT1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)启动子和PRC1t(核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)、BAN4t(核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示)终止子使用实施例1中的OE-PCR的方法组装成基因表达盒：PFY1p-pheA-PRC1t-ACT1p-Aro9-BAN4t；
上述步骤使用的引物序列如下所示(启动子、终止子均以酿酒酵母基因组为模板，目的基因pheA以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，目的基因Aro9以酿酒酵母的基因组为模板)：
引物31：5’>GCATCCACATCTTCACATGAAAATAGAGGCCAATCAGGCAGGAGACGTTACTTTGTTTA<3’，启动子PFY1p扩增上游引物，下划线序列为与终止子PRS28At重叠序列。
引物32：5’>TTTCTCTCGCAGCGCCAGTAACGGGTTTTCCGATGTCATATAATTTGCGATCGTAGTTG<3’，启动子PFY1p扩增下游引物，下划线序列为与基因pheA重叠序列。
引物33：5’>TACATACACAACATAAACCCAACTACGATCGCAAATTATATGACATCGGAAAACCCGTT<3’，基因pheA扩增上游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。
引物34：5’>CTGATAATAAAAACGGTATGCCTACACATACACGCTTTATCAGGTTGGATCAACAGGCA<3’，基因pheA扩增下游引物，下划线序列为与终止子PRC1t重叠序列。
引物35：5’>TACCCAAGTGAGAACGTAGTGCCTGTTGATCCAACCTGATAAAGCGTGTATGTGTAGGC<3’，终止子PRC1t扩增上游引物，下划线序列为与基因pheA重叠序列列。
引物36：5’>ATTATATTATATGGGTCTGCAAGGTAGAGGCGCGCTTGTGCAGCGATCAGCAATAATGA<3’，终止子PRC1t扩增下游引物，下划线序列为与启动子ACT1p重叠序列。
引物37：5’>ATTCCGCGTTTGCTTCATTTCATTATTGCTGATCGCTGCACAAGCGCGCCTCTACCTTG<3’，启动子ACT1p扩增上游引物，下划线序列为与终止子PRC1t重叠序列。
引物38：5’>GGAAGTGTAATCAACAGGGGGGGCAGAACCAGCAGTCATTGTTAATTCAGTAAATTTTC<3’，启动子ACT1p扩增下游引物，下划线序列为与基因aro9重叠序列。
引物39：5’>CTTTTTTCTTCCCAAGATCGAAAATTTACTGAATTAACAATGACTGCTGGTTCTGCCCC<3’，基因aro9扩增上游引物，下划线序列为与启动子ACT1p重叠序列。
引物40：5’>CCTCTCCTAGCGTACACGGATGGCAAGAATAAACTGGCTTCAACTTTTATAGTTGTCAA<3’，基因aro9扩增下游引物，下划线序列为与终止子BNA4t重叠序列。
引物41：5’>AGTGGCATAAAAGAATTTTTTGACAACTATAAAAGTTGAAGCCAGTTTATTCTTGCCAT<3’，终止子BNA4t扩增上游引物，下划线序列为与基因pheA重叠序列列。
引物42：5’>AGCTGAAATGCAAGGATTGATAAAATAATAGGATAATAGAAGAATGGATCAAAATGGC<3’，终止子PRC1t扩增下游引物，下划线序列为与delta1位点重叠序列。
2)选择来源于拟南芥的酪氨酸裂解酶编码基因TAL(核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)，与启动子HXT7p(核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示)和终止子PRS28At(核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示)使用实施例1中的OE-PCR方法组装成基因表达盒HXT7p-TAL-PRS28At；与步骤1)中组装的基因表达盒，通过醋酸锂转化法(同实施例1步骤5))共同构建到实施例1所得Z2菌株基因组的delta1位点，强化香草胺合成的前体物供应，将获得的酿酒酵母工程菌命名为Z3。Z3菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t
Delta1:LEU-HXT7p-TAL-PRS28At-PFY1p-pheA-PRC1t-HXT7p-Aro9-BAN4t。
上述步骤涉及的引物序列为(启动子、终止子均以酿酒酵母基因组为模板，目的基因TAL以委托金唯智公司合成的基因质粒为模板，LEU筛选标记以从生物风公司购买的LEU筛选标记质粒为模板)：
引物43：5’>ATAACATCTTTTTTTTATTCCTTCTTTGATATTTTGTCAAACTGTGGGAATACTCAGGT<3’，LEU筛选标记扩增上游引物，下划线序列为与delta1位点重叠序列。
引物44：5’>AACACGCAGGGGCCCGAAATTGTTCCTACGAGAAGTAGTTGCTTACCTGTATTCCTTTA<3’，LEU筛选标记扩增下游引物，下划线序列为与启动子HXT7p重叠序列。
引物45：5’>AGGAGAAAAAGGAGGATAGTAAAGGAATACAGGTAAGCAACTACTTCTCGTAGGAACAA<3’，启动子HXT7p扩增上游引物，下划线序列为与LEU筛选标记重叠序列。
引物46：5’>AGACAATCTGTCAGCTTGTCTTTCAACAACTTGAGTCATTTTTTAATTTTAATCAAAAA<3’，启动子HXT7p扩增下游引物，下划线序列为与基因TAL重叠序列。
引物47：5’>AACACAAAAACAAAAAGTTTTTTTAATTTTAATCAAAAAATGACTCAAGTTGTTGAAAG<3’，基因TAL扩增上游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。
引物48：5’>TTTTGTATAGCTGCAACCTTCAATCTGCAAATAAGCTTCTTAACCGAAGTCCTTACCGT<3’，基因TAL扩增下游引物，下划线序列为与终止子PRS28At重叠序列。
引物49：5’>TTTGTTGGTTGACGAAGCTGACGGTAAGGACTTCGGTTAAGAAGCTTATTTGCAGATTGA<3’，终止子PRS28At扩增上游引物，下划线序列为与基因TAL重叠序列。
引物50：5’>TTGTACATACTAATATATATAAACAAAGTAACGTCTCCTGCCTGATTGGCCTCTATTTT<3’，终止子PRS28At扩增下游引物，下划线序列为与启动子PFY1p重叠序列。
3)Z3菌株使用实施例1中步骤7)的方法进行发酵培养，香草胺的产量提升至7.16g/L，与未优化的菌株相比产量提升了11％。
实施例3
重构SAM循环圈，优化香草胺合成
1)本发明中为了优化香草胺的合成，使用引物51和引物52，以酿酒酵母基因组为模板扩增SAH水解酶编码基因sahH(核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示)，使用引物53和引物54实现拟南芥来源的SAM合成酶编码基因SAM2(核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示)的扩增，基因经密码子优化后委托金唯智公司化学合成。
所涉及的引物序列为：
引物51：5’>TATAGACACACAAACACAAATACACACACTAAATTAATAATGTCTGCTCCAGCTCAAAA<3’，基因sahH扩增上游引物，下划线序列为与启动子CYC1p重叠序列。
引物52：5’>TAAGAACAGGAAGGGATGACGTAGGAACCTTGTGCTAGATCAATATCTGTAGTGGTCGG<3’，基因sahH扩增下游引物，下划线序列为与终止子ALY2t重叠序列。
引物53：5’>CATAACACCAAGCAACTAATACTATAACATACAATAATAATGGAAACTTTCTTGTTCAC<3’，基因SAM2扩增上游引物，下划线序列为与启动子ENO2p重叠序列。
引物54：5’>ATCAAGATTTTTTTTGTTTTTTTTTACAATTGAGTAGACTTAAGCTTGTGGCTTGTCCC<3’，基因SAM2扩增下游引物，下划线序列为与终止子SCW4t重叠序列。(以委托金唯智公司合成的基因质粒为模板)
2)使用下列相对应引物，以酿酒酵母基因组为模板，分别扩增得到启动子：CYC1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示)、ENO2p(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)，终止子：ALY2t(核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示)、SCW4t(核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示)；使用引物55和引物56，PCR扩增HIS筛选标记基因，与上步骤中扩增得到的基因片段，使用实施例1中3)a-b步骤组装成基因表达盒：HIS-CYC1P-sahH-ALY2t；ENO2p-SAM2-SCW4t；使用实施例1中5)的转化法分别构建到Z2和Z3菌株的基因组rDNA位点，形成Z4和Z7菌株。
Z4菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t
rDNA:HIS-CYC1P-sahH-ALY2t-ENO2p-SAM2-SCW4t
Z7菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t
Delta1:LEU-HXT7p-TAL-PRS28At-PFY1p-pheA-PRC1t-HXT7p-Aro9-BAN4t。
rDNA:HIS-CYC1P-sahH-ALY2t-ENO2p-SAM2-SCW4t。
上述涉及到的引物序列为：启动子、终止子均以酿酒酵母基因组为模板，模板特殊的已在下方标注
引物55：5’>ACCCTGCCCTCATATCACCTGCGTTTCCGTTAAACTATCCTAGTACACTCTATATTTTT<3’，扩增HIS筛选标记基因上游引物，下划线序列为与rDNA位点重叠序列。
引物56：5’>GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCCTGATGCGGTATTTTCTCC<3’，扩增HIS筛选标记基因下游引物，下划线序列为与启动子CYC1p重叠序列。(以从生物风公司购买的HIS筛选标记质粒为模板)
引物57：5’>ATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAATTTTTTTGGAAAACCAAG<3’，启动子CYC1p扩增上游引物，下划线序列为与HIS筛选标记基因重叠序列。
引物58：5’>GATATCAGCGATTTTGTAGTTTTGAGCTGGAGCAGACATTATTAATTTAGTGTGTGTAT<3’，启动子CYC1p扩增下游引物，下划线序列为与基因sahH重叠序列。
引物59：5’>CTCCTTTATTTGTTCTTTGTCTTTTGACTTCTTCCCGCTACGCGGCGTTATGTCACTAA<3’，启动子ENO2p扩增上游引物，下划线序列为与终止子ALY2t重叠序列。
引物60：5’>TTCGTTAACAGATTCAGAAGTGAACAAGAAAGTTTCCATTATTATTGTATGTTATAGTA<3’，启动子ENO2p扩增下游引物，下划线序列为与基因SAM2重叠序列。
引物61：5’>GAAGAAGGTCCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGATCTAGCACAAGGTTCCTACG<3’，终止子ALY2t扩增上游引物，下划线序列为与基因sahH重叠序列。
引物62：5’>CGCAAGTTGGTGCACGTCGTTAGTGACATAACGCCGCGTAGCGGGAAGAAGTCAAAAGA<3’，终止子ALY2t扩增下游引物，下划线序列为与启动子ENO2p重叠序列。
引物63：5’>GTTGTTAAGCCATTGAAGTGGGACAAGCCACAAGCTTAAGTCTACTCAATTGTAAAAAA<3’，终止子SCW4t扩增上游引物，下划线序列为与基因SAM2重叠序列。
引物64：5’>AGACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGCCAAGAGGATCGAGAAACCA<3’，终止子SCW4t扩增下游引物，下划线序列为与rDNA位点重叠序列。
3)Z4和Z7菌株使用实施例1中步骤7)的方法进行发酵培养，香草胺的产量分别提升至9.21g/L和14.89g/L，与未优化菌株相比香草胺产量分别提升了47％和130％。
实施例4
优选SAH水解途径，优化SAM循环再生能力，提高香草胺合成
1)使用引物65、66和引物67、68两对引物，以大肠杆菌基因组为模板PCR分别扩增mtn(核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示)和luxS(核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示)，使用引物53和引物54实现拟南芥来源的SAM合成酶编码基因SAM2(核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示)的扩增；
上述步骤涉及的引物序列为：
引物65：5’>TTGTCATATATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGAAAATCGGCATCATTGG<3’，基因mtn扩增上游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。
引物66：5’>AAAAAAAAAAAAAAATTTTTCAGCCATCTGTTAAGAAATTTAGCCATGTGCAAGTTTCT<3’，基因mtn扩增下游引物，下划线序列为与终止子NAT5t重叠序列。
引物67：5’>CAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGCCGTTGTTAGATAGCTT<3’，基因luxS扩增上游引物，下划线序列为与启动子ADH1p重叠序列。
引物68：5’>TGAAAAAAAAAAGTGGTAGATTGGGCTACGTAAATTCGACTAGATGTGCAGTTCCTGCA<3’，基因luxS扩增下游引物，下划线序列为与终止子IDP1t重叠序列。
2)使用下列相对应引物，以酿酒酵母基因组为模板，分别扩增得到启动子：FBA1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)、ADH1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，终止子：NAT5t(核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示)、IDP1t(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)；以及利用引物55和引物74，PCR扩增HIS筛选标记基因，与上步骤中扩增得到的基因片段多次使用实施例1中3)a-b步骤组装基因表达盒：HIS-FBA1p-mtn-NAT5t-ADH1p-luxS-IDP1t；使用引物73和引物64，以实施例3中组装得到的基因表达盒：ENO2p-SAM2-SCW4t模板重新扩增得到新的基因表达盒：ENO2p-SAM2-SCW4t；将上述两个重组的基因表达盒使用实施例1中5)步骤方法转化到Z2和Z3菌株的基因组rDNA位点，实现以来源于大肠杆菌的SAH水解途径优化酿酒酵母体内SAM的再生能力，分别形成Z5和Z8菌株。
Z5菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t
rDNA:HIS-FBA1p-mtn-NAT5t-ADH1p-luxS-IDP1t-ENO2p-SAM2-SCW4t
Z8菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-THS1p-pAMT-MDM35t
Delta1:LEU-HXT7p-TAL-PRS28At-PFY1p-pheA-PRC1t-HXT7p-Aro9-BAN4t。
rDNA:HIS-FBA1p-mtn-NAT5t-ADH1p-luxS-IDP1t-ENO2p-SAM2-SCW4t。
所涉及的引物序列为：(启动子、终止子均以酿酒酵母基因组为模板，特殊已在下方标注)
引物69：5’>ATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGATAACAATACTGACAGTACT<3’，启动子FBA1p扩增上游引物，下划线序列为与HIS筛选标记基因重叠序列。
引物70：5’>AACTTCTTCTTCCATTGCACCAATGATGCCGATTTTCATTTTGAATATGTATTACTTGG<3’，启动子FBA1p扩增下游引物，下划线序列为与基因mtn重叠序列。
引物71：5’>CAGGTGCAGGCTGACCTAATGGAATTTTTATGGTCCCGAACATGTAGGTGGCGGAGGGG<3’，启动子ADH1p扩增上游引物，下划线序列为与终止子NAT5t重叠序列。
引物72：5’>CCGGGTATGATCGACTGTGAAGCTATCTAACAACGGCATTGTATATGAGATAGTTGATT<3’，启动子ADH1p扩增下游引物，下划线序列为与基因luxS重叠序列。
引物73：5’>CACCGTTTTCTTGAAACCAAACACCGAACTCACTACGCAACGCGGCGTTATGTCACTAA<3’，启动子ENO2p-2扩增上游引物，下划线序列为与终止子IDP1t重叠序列。
引物74：5’>GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATCCTGATGCGGTATTTTCTCC<3’，扩增HIS筛选标记基因下游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。(以从生物风公司购买的HIS筛选标记质粒为模板)
引物75：5’>ATGGTTGAGTCACTGGTGCAGAAACTTGCACATGGCTAAATTTCTTAACAGATGGCTGA<3’，终止子NAT5t扩增上游引物，下划线序列为与基因mtn重叠序列。
引物76：5’>TCTGTTCTATTGTATATCTCCCCTCCGCCACCTACATGTTCGGGACCATAAAAATTCCA<3’，终止子NAT5t扩增下游引物，下划线序列为与启动子ADH1p重叠序列。
引物77：5’>GCACTGCCGAAAGAGAAGTTGCAGGAACTGCACATCTAGTCGAATTTACGTAGCCCAAT<3’，终止子IDP1t扩增上游引物，下划线序列为与基因luxS重叠序列。
引物78：5’>CGCAAGTTGGTGCACGTCGTTAGTGACATAACGCCGCGTTGCGTAGTGAGTTCGGTGTT<3’，终止子IDP1t扩增下游引物，下划线序列为与启动子ENO2p重叠序列。
3)Z5和Z8菌株使用实施例1中步骤7)的方法进行发酵培养，香草胺的产量分别提升至11.88g/L和16.48g/L，与未优化菌株相比香草胺产量分别提升了84％和160％。
实施例1-实施例4所得的各酿酒酵母工程菌的香草胺产量比较结果如图2所示。
实施例5
构建辣椒碱合成酿酒酵母工程菌
1)首先，按照实施例1步骤2)中的方法构建两个头碰头的启动子模块：pBM16A-PGK1p+FBA1p和pBM16A-GPM1p(核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示)+ACT1p；以及由金唯智公司化学合成两个背靠背的终止子模块：ASP3t(核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示)--HAP4t(核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示)和YCP4t(核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示)--MDM35t(核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示)，和含有G-418抗性的YORWΔ22位点上端序列的Δ22site1质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示)和YORWΔ22位点下端序列的Δ22site2质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示)，(使用实施例1中2)步骤c-g方法制备Δ22site1和Δ22site2质粒)。
2)使用PCR扩增启动子模块和功能基因Kas(核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示)、Acl(核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示)、Fat(核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示)和AT3(核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示)。使用GoldenGate方法组装成两个双转化单元：DH5α/PUC57T-(ASP3t-Kas-PGK1p-FBA1p-Acl-HAP4t)和DH5α/PUC57T-(YCP4t-Fat-GPM1p-ACT1p-AT3-MDM35t)，利用实施例1中5)步骤的方法将四个基因构建到Z2菌株的基因组上，实现辣椒碱途径在酿酒酵母体内的异源表达，形成菌株命名为C1。
C1菌株的基因序列为在酿酒酵母基因组基础上
YORWΔ15:URA3-TPIt-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t-ADH1t-4CL2-PGKp-TEF2p-HCT-CYC1t
YORWΔ17:TEF1p-hphNT1-CYC1t-HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t-FBA1p-pAMT-ATP15t
YORWΔ22:TEF1p-KanMX-TEF1t-ASP3t-Kas-PGK1p-FBA1p-Acl-HAP4t-YCP4t-Fat-GPM1p-ACT1p-AT3-MDM35t
上述过程涉及的引物序列为：(启动子以酿酒酵母基因组为模板，基因以合成质粒为模板)
引物79：5’>CCTGCTCTTCACATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG<3’,启动子PGK1p扩增上游引物，下划线序列为启动子PGK1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物80：5’>GCCAAGTAGGCAATTATTTAGTACTGTCAGTATTGTTATACGCACAGATATTATAACAT<3’，启动子PGK1p扩增下游引物，下划线序列为与启动子FBA1p重叠序列。
引物81：5’>GCAAATGCCTATTGTGCAGATGTTATAATATCTGTGCGTATAACAATACTGACAGTACT<3’，启动子FBA1p扩增上游引物，下划线序列为与启动子PGK1p重叠序列。
引物82：5’>CCTGCTCTTCATGTTTTGAATATGTATTACTTGGTTATG<3’，启动子FBA1p扩增下游引物，下划线序列为启动子FBA1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物83：5’>CCTGCTCTTCACATATTGTAATATGTGTGTTTGTTTGG<3’，启动子GPM1p扩增上游引物，下划线序列为启动子GPM1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物84：5’>ATTATATTATATGGGTCTGCAAGGTAGAGGCGCGCTTGTCACATGCAGTGATGCACGCG<3’，启动子GPM1p扩增下游引物，下划线序列为与启动子ATC1p重叠序列。
引物85：5’>ATGTAACTTAGCACCATCGCGCGTGCATCACTGCATGTGACAAGCGCGCCTCTACCTTG<3’，启动子ATC1p扩增上游引物，下划线序列为与启动子GPM1p重叠序列。
引物86：5’>CCTGCTCTTCATGTTGTTAATTCAGTAAATTTTCGATC<3’，启动子ATC1p扩增下游引物，下划线序列为启动子ATC1p经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物87：5’>CCTGCTCTTCAGGTTTATGGCTTGTATGGGGCGAAGAC<3’，基因Kas扩增上游引物，下划线序列为基因Kas经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物88：5’>CCTGCTCTTCAGTAATGTCTTCTATCACTTCTTCTTG<3’，基因Kas扩增下游引物，下划线序列为基因Kas经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物89：5’>CCTGCTCTTCAACAATGGCTTCTATCACTGCTTCTTCTTTC<3’，基因Acl扩增上游引物，下划线序列为基因Acl经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物90：5’>CCTGCTCTTCAGATTTAACACTTCTTAGCAACCAAGTCTTC<3’，基因Acl扩增下游引物，下划线序列为基因Acl经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物91：5’>CCTGCTCTTCAGGTTTAGATTCTAGATGGCTTCTTTC<3’，基因Fat扩增上游引物，下划线序列为基因Fat经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物92：5’>CCTGCTCTTCAGTAATGTTGTCTAGAGGTTCTTTCTTG<3’，基因Fat扩增下游引物，下划线序列为基因Fat经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物93：5’>CCTGCTCTTCAACAATGGCTTTCGCTTTGCCATCTTC<3’，基因AT3扩增上游引物，下划线序列为基因AT3经Sap1酶切后形成的粘性末端。
引物94：5’>CCTGCTCTTCAGATTTAAGCGATGAATTCAACCAATTC<3’，基因AT3扩增下游引物，下划线序列为基因AT3经Sap1酶切后形成的粘性末端。
3)C1株使用实施例1中步骤7)的方法进行发酵培养，培养时间延长至120h。发酵结束后，取100mL发酵液，使用离心机以5000rpm离心5min收集菌体；使用清水洗涤两次以去除残留的发酵液，重新离心收集菌体，离心管中加入10mL有机提取液(乙酸乙酯：正丁醇＝3：1)，重悬菌体；加入适量玻璃珠，涡旋震荡30min，以保证菌体充分裂解。菌体裂解液重新离心取上清，上清液经旋转蒸发浓缩至1mL。浓缩液使用HPLC-MS/MS进行定性和定量分析，结果如图3所示，发现C1菌株中辣椒碱的产量为80.23μg/L。本发明首次实现了在酿酒酵母体内辣椒碱的从头生物合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌中插入有两个基因模块，基因模块一含有PAL2、C4H、4CL2和HCT基因，基因模块二含有CCoAoMT1、FerB2和pAMT基因；其中PAL2、C4H、4CL2基因来源于拟南芥，HCT、CCoAoMT1基因来源于烟草，FerB2基因来源于鞘氨醇单胞菌，pAMT基因来源于辣椒。
2.一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为将pheA、Aro9和TAL基因构建至权利要求1所述酿酒酵母工程菌中，所述pheA的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示，所述Aro9的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述TAL基因的核苷酸序列如SEQID NO.28所示。
3.一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为将SahH和SAM2基因构建至权利要求1或权利要求2所述酿酒酵母工程菌中，所述SahH的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，所述SAM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
4.一种产香草胺的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为将mtn、luxS和SAM2基因构建至权利要求1或权利要求2所述酿酒酵母工程菌中，所述mtn的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述luxS的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述SAM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
5.一种产辣椒碱的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为将Kas、Acl、Fat和AT3基因构建至权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌中，所述Kas的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示，所述Acl的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，所述Fat的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，所述AT3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
6.权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建TPI1t-PAL2-TDH3p-ADH1p-C4H-PGI1t和
ADH1t-4CL2-PGK1p-TEF2p-HCT-CYC1t两个双转化单元，将所述两个双转化单元构建到酿酒酵母基因组的YPRCΔ15位点，获得Z1菌株；
构建FBA1p-pAMT-ATP15t基因表达盒和
HOG1t-CCoAoMT1-ENO2p-PYK1p-FerB2-LRP1t双转化单元后，再共同构建到Z1菌株的YORWΔ17位点；
所述TDH3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，ADH1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，PGK1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，TEF2p的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，TPI1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，PGI1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，ADH1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，CYC1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，ENO2p的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，PYK1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，FBA1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，HOG1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，LRP1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，ATP15t的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
7.权利要求2所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建PFY1p-pheA-PRC1t-ACT1p-Aro9-BAN4t和HXT7p-TAL-PRS28At基因表达盒，将所述两个基因表达盒共同构建到权利要求1所述酿酒酵母工程菌基因组的delta1位点；
所述PFY1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，ACT1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，PRC1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，BAN4t的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，HXT7p的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，PRS28At的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
8.权利要求3所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建HIS-CYC1P-SahH-ALY2t和ENO2p-SAM2-SCW4t基因表达盒，将构建的两个基因表达盒构建到权利要求1所述酿酒酵母工程菌基因组或权利要求2所述酿酒酵母工程菌基因组的rDNA位点；
CYC1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，ENO2p的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，ALY2t的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，SCW4t的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
9.权利要求4所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建HIS-FBA1p-mtn-NAT5t-ADH1p-luxS-IDP1t和ENO2p-SAM2-SCW4t基因表达盒，将构建的两个基因表达盒构建到权利要求1所述酿酒酵母工程菌基因组或权利要求2所述酿酒酵母工程菌基因组的rDNA位点；
Mtn的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，luxS的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，NAT5t的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，IDP1t的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
10.权利要求5所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建ASP3t-Kas-PGK1p-FBA1p-Acl-HAP4t和
YCP4t-Fat-GPM1p-ACT1p-AT3-MDM35t两个双转化单元，将构建的两个双转化单元构建到权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌基因组的YORWΔ22位点；
ASP3t的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，HAP4t的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，YCP4t的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示，MDM35t的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。
11.权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌在香草胺生产中的应用。
12.权利要求1-4任意一项所述酿酒酵母工程菌或权利要求5所述酿酒酵母工程菌在辣椒碱生产中的应用。
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