KR20150130396A

KR20150130396A - 감소된 산화를 갖는 제제

Info

Publication number: KR20150130396A
Application number: KR1020157027939A
Authority: KR
Inventors: 스리드하라 알라바탐; 메리 멜라니; 파비르 그레왈
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2015-11-23
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: EP2968467A4; EP2968467A1; CA3135558A1; CA2904169A1; SI2968467T1; RU2019137020A; KR102317151B1; CA2904169C; KR20210040190A; KR102238379B1; MX2015011433A; JP6606059B2; PT2968467T; LT2968467T; HUE049707T2; HK1212613A1; CN105209058A; JP2019167349A; PL2968467T3; EP2968467B1

Abstract

본 발명은 단백질을 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물과 조합하여 포함하는 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 제제를 제조하는 방법 및 이러한 제제를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 단백질 조성물에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물에 대해 스크리닝하는 방법 및 제제에서의 단백질의 산화를 방지하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

감소된 산화를 갖는 제제 {FORMULATIONS WITH REDUCED OXIDATION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2013년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 61/780,852, 및 2013년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 61/909,850을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 단백질을 포함하고 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 추가로 포함하는 제제, 상기 제제를 제조하고 사용하는 방법 뿐만 아니라 단백질 조성물에서의 단백질 산화를 방지하는 화합물에 대해 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

아미노산 잔기의 산화성 분해는 단백질 제약에서 흔히 관찰되는 현상이다. 다수의 아미노산 잔기, 특히 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp), 및 티로신 (Tyr)는 산화에 감수성이다 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). 단백질이 다양한 프로세싱 단계 동안에 과산화수소, 광, 금속 이온 또는 이들의 조합에 노출되는 경우에, 전형적으로 산화가 관찰된다 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). 특히, 광 (Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)), AAPH 또는 펜톤 시약 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009))에 노출된 단백질은 트립토판 잔기 상에서 증가된 수준의 산화를 나타내고, 반면에 과산화수소에 노출된 것들은 전형적으로 단지 메티오닌 산화만을 나타내었다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). 광 노출은 일중항 산소, 과산화수소 및 슈퍼옥시드를 비롯한 반응성 산소 종 (ROS)의 형성을 통해 단백질 산화를 초래할 수 있고 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306 (2005)), 반면에 단백질 산화는 전형적으로 펜톤 매개 반응에서 히드록실 라디칼을 통해 (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)) 및 AAPH 매개 반응에서 알콕실 퍼옥시드를 통해 (Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)) 발생한다. 트립토판의 산화는 히드록시트립토판, 키누레닌, 및 N-포르밀키누레닌을 비롯한 무수한 산화 생성물을 유발하고, 안전성 및 효능에 영향을 미치는 잠재력을 갖는다 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306 (2005)). 생물학적 기능의 상실과 연관있는 모노클로날 항체의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에서의 특정한 트립토판 잔기의 산화가 보고되어 있다 (Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)). 히스티딘 배위된 금속 이온에 의해 매개된 Trp 산화는 최근에 Fab 분자에 대해 보고되어 왔다 (Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)). 다양한 퍼옥시드의 생성을 유발하는 Fab 제제에서의 폴리소르베이트 20의 자가산화는 또한 동일한 보고에서 언급되어 있다. 이들 퍼옥시드의 자가산화-유도 생성은 또한, 단백질에서의 Met 잔기가 내부 항산화제로서 작용하는 것으로 시사되어 있고 (Levine et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(26):15036-15040 (1996)) 퍼옥시드에 의해 용이하게 산화되기 때문에, 약물 제품의 장기 저장 동안에 단백질에서의 메티오닌 산화를 유발할 수 있다. 아미노산 잔기의 산화는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치는 잠재력을 갖는다. 이는 특히 모노클로날 항체 (mAb)에 대해서도 마찬가지일 수 있다. IgG1 mAb에서의 Met254 및 Met430에서의 메티오닌 산화는 잠재적으로 트랜스제닉 마우스에서 혈청 반감기에 영향을 미치고 (Wang et al., Molecular Immunology 48(6-7):860-866 (2011)), 또한 FcRn 및 Fc-감마 수용체에의 인간 IgG1의 결합에 영향을 미친다 (Bertolotti-Ciarlet et al., Molecular Immunology 46(8-9)1878-82 (2009)).

특히 액체 상태의 단백질의 안정성은 약물 제품 제조 및 저장 동안에 평가될 필요가 있다. 제약 제제의 개발은 때때로 활성 성분의 산화를 방지하기 위해 항산화제의 첨가를 포함한다. 제제에의 L-메티오닌의 첨가는 단백질 및 펩티드에서의 메티오닌 잔기 산화의 감소를 가져왔다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11):1250-1255 (1997)). 마찬가지로, L-트립토판의 첨가는 트립토판 잔기의 산화를 감소시키는 것으로 제시되었다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)). 그러나, L-Trp는 UV 영역 (260-290nm)에서의 강한 흡광도를 보유하며, 이는 이것을 광-산화 동안에 1차 표적으로 만든다 (Creed, D., Photochemistry and Photobiology 39(4):537-562 (1984)). Trp는 티로신 (Babu et al., Indian J Biochem Biophys 29(3):296-8 (1992)) 및 다른 아미노산 (Bent et al., Journal of the American Chemical Society 97(10):2612-2619 (1975))의 산소 의존성 광-산화를 증진시키는 내인성 광증감제로서 가정되어 왔다. L-Trp는 광에 노출되는 경우에 과산화수소를 생성할 수 있고 UV 광 하의 L-Trp는 슈퍼옥시드 음이온을 통해 과산화수소를 생산하는 것이 증명되었다 (McCormick et al., Science 191(4226):468-9 (1976); Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)). 추가로, 트립토판은 광에의 노출 시 일중항 산소를 생산하는 것으로 공지되어 있다 (Davies, M.J., Biochem Biophys Res Commun 305(3):761-70 (2003)). 폴리소르베이트 20의 자가산화에 의해 유도된 단백질 산화와 유사하게, 단백질 산화는 정상적인 취급 조건 하에 단백질 제제 (예를 들어 L-Trp)에서 다른 부형제에 의한 ROS 생성 시 발생할 수 있는 것이 가능하다.

단백질을 안정화시키도록 의도되는 단백질 조성물에 표준 부형제, 예컨대 L-Trp 및 폴리소르베이트를 첨가하는 것은 단백질의 ROS-유도 산화와 같은 예상치 못한 및 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다는 것이 최근 연구로부터 명백하다. 따라서, 단백질 조성물에 사용하기 위한 대안적 부형제의 확인 및 이러한 조성물의 개발에 대한 필요성이 존재한다.

단백질 및 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하는 제제, 상기 제제를 제조하는 방법, 및 단백질 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.

한 측면에서, 단백질 및 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제가 본원에 제공된다:

상기 식에서 R²는 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;

R³은 수소, 히드록실, -COOH, -CH₂COOH, 및 -CH₂CHR^3a(NH₂)로부터 선택되고; 여기서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;

R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;

단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:

상기 식에서 R² 및 R³은 독립적으로 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;

단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

상기 식에서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;

R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며, 단 R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁴, R⁵ 또는 R⁷은 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁵는 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 상기 화합물은 5-히드록시 트립토판, 5-히드록시-인돌, 세로토닌 등을 제한 없이 포함하는 5-히드록시 유도체이다.

일부 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 대상체에게 투여하는데 적합한 제약 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 수성이다.

일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 10 mM, 또는 화합물이 제제 중에 가용성인 최고 농도 이하이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 9 mM, 약 0.3 mM 내지 약 8 mM, 약 0.3 mM 내지 약 7 mM, 약 0.3 mM 내지 약 6 mM, 약 0.3 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4 mM, 약 0.3 mM 내지 약 3 mM, 약 0.3 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.25 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 단백질에서의 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 티로신, 및/또는 메티오닌의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 반응성 산소 종은 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 과산화수소, 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 단백질은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 트립토판 아미노산은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 (예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편)이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 단백질 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 제제는 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.

또 다른 측면에서, 단백질의 산화를 방지하는 화합물의 소정량을 제제에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 단백질 제제 (예컨대 액체 제제)를 제조하는 방법이 본원에 제공된다:

단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

또 다른 측면에서, 단백질의 산화를 방지하는 화합물의 소정량을 제제에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 단백질 제제 (예컨대 액체 제제)에서의 단백질의 산화를 방지하는 방법이 본원에 제공된다:

단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:

단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

상기 식에서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;

일부 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 대상체에게 투여하는데 적합한 제약 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 수성이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 10 mM, 또는 화합물이 제제 중에 가용성인 최고 농도 이하이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 9 mM, 약 0.3 mM 내지 약 8 mM, 약 0.3 mM 내지 약 7 mM, 약 0.3 mM 내지 약 6 mM, 약 0.3 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4 mM, 약 0.3 mM 내지 약 3 mM, 약 0.3 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.25 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 1 mM이다.

일부 실시양태에서, 화합물은 단백질에서의 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 티로신, 및/또는 메티오닌의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 반응성 산소 종은 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 과산화수소, 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, L-트립토판과 비교하여 보다 낮은 산화 전위 및 보다 적은 감광성을 갖는 화합물을 선택하는 것, 및 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 선택된 화합물의 효과를 시험하는 것을 포함하는, 단백질 조성물에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.

일부 실시양태에서, 감광성은 광 노출 시 화합물에 의해 생산된 H₂O₂의 양을 기준으로 하여 측정된다. 일부 실시양태에서, L-트립토판에 의해 생산된 H₂O₂의 양의 약 10% 미만을 생산하는 화합물이 선택된다. 일부 실시양태에서, 산화 전위는 순환 전압전류법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 선택된 화합물은 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH), 광 및/또는 펜톤 시약에 의해 생성된 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 효과에 대해 시험된다.

본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 이들 실시양태 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.

도 1은 250 W/m²에서의 광 노출 8시간 후의 A) mAb1에서의 Fab, 및 B) mAb1에서의 Fc의 산화를 입증하는 일련의 그래프이다. mAb1은 20mM 히스티딘 아세테이트, 250mM 트레할로스, 0.02% 폴리소르베이트 20 중에 5 mg/mL로 존재하였다. mAb1 Ref Mat을 제외하고 모든 바이알을 광상자에 두었다. 호일 CTRL 바이알을 광상자에 두기 전에 호일로 덮었다. "10mM Met, 1mM Trp" (*)가 2개의 실험 바이알의 평균이고 mAb1 Ref Mat가 HPLC 상의 3회의 독립적 주입에 의한 1개의 실험 바이알인 것을 제외하고 각각의 샘플에 대해 3개의 개별 실험 바이알을 평균내었다. 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 2는 L-Trp에 의한 용량 의존성 H₂O₂ 생산을 보여주는 그래프이다. 다이아몬드는 L-Trp 단독을 나타내고; 삼각형은 L-Trp + SOD를 나타내고; 원형 및 정사각형은 L-Trp + NaN₃ ± SOD를 나타낸다. 모든 연구는 20mM L-His HCl, pH 5.5에서 수행하였다.
도 3은 A) 1, 3 및 7일 동안 주위 광 조건에 노출된 경우의 3.2mM L-Trp를 함유하는 50mg/mL mAb1 제제에서의 과산화수소 (H₂O₂) 생산 및 B) 주위 광 조건에의 노출 10일 후의 3.2mM L-Trp를 함유하는 mAb1 제제에서의 퍼센트 (%) Fab 산화를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 4는 250 W/m²에서의 4시간 동안의 광 스트레스 하의 트립토판 유도체 및 인돌 유도체에 의한 과산화수소 생성을 제시하는 일련의 그래프이다. A) 20 mM HisAc pH5.5 제제에서의 과산화수소 (μM) 생성에 대한 트립토판 유도체 (1 mM)의 스크리닝. B) 20 mM HisAc pH5.5 제제에서의 과산화수소 (μM) 생성에 대한 인돌 유도체 (1 mM)의 스크리닝.
도 5는 광 노출 시 다양한 Trp 유도체에 의한 H₂O₂ 생산에 대한 NaN₃의 효과를 제시하는 그래프이다. 데이터는 L-Trp에 의해 생성된 퍼옥시드에 대한 비로서 제시된다.
도 6은 산화 전위와 광-유도 퍼옥시드 형성 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 박스된 영역은 후보 항산화제 화합물을 제시한다.
도 7은 AAPH 인큐베이션 후의 A) mAb1에서의 Fab, 및 B) mAb1에서의 Fc의 산화를 제시하는 일련의 그래프이다. mAb1 Ref Mat 및 AAPH 없음을 제외하고 모든 샘플을 AAPH와 함께 인큐베이션하였다. mAb1 Ref Mat를 제외하고 모든 샘플을 40℃에서 인큐베이션하였다. 제시된 데이터는, 오차 막대가 없는 6개의 HPLC 주입의 평균인 mAb1 Ref Mat를 제외하고 3개의 실험 샘플 ± 1SD의 평균이다.
도 8은 250 W/m²에서의 광 노출 16시간 후의 A) mAb1에서의 Fab, 및 B) mAb1에서의 Fc의 산화를 제시하는 일련의 그래프이다. mAb1 Ref Mat를 제외하고 모든 바이알을 광상자에 두었다. 호일 CTRL 바이알을 광상자에 두기 전에 호일로 덮었다. L-트립토판아미드 (*)가 2개의 실험 바이알의 평균이고 mAb1 Ref Mat가 HPLC 상의 3회의 독립적 주입에 의한 1개의 바이알인 것을 제외하고 각각의 샘플에 대해 3개의 개별 실험 바이알을 평균내었다. 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 10 ppm의 H₂O₂ 및 0.2 mM의 Fe(III)을 사용한 펜톤 반응 후의 A) 3 mg/mL mAb1에서의 Fab, 및 B) 3 mg/mL mAb1에서의 Fc의 산화를 제시하는 일련의 그래프이다. 반응물을 40℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 100 mM L-Met로 켄칭하고, 파파인 소화 후 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다. 모든 샘플은 3개의 개별 바이알의 평균이고, mAb1 대조군 (Ref Mat)은 HPLC 상의 5회의 독립적 주입에 의한 1개의 바이알이었다. 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 A) L-Trp 및 B) 5-히드록시-L-트립토판 여기 및 ¹O₂의 생성 및 켄칭의 추정 메카니즘을 제시하는 일련의 다이어그램이다. k_25C는 ¹O₂의 켄칭에 대한 2차 속도 상수를 나타내고 (Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)), 한편 E_ox는 분자 대 Ag/AgCl의 산화 전위이다.

I. 정의.

본 발명을 상세히 기재하기에 앞서, 본 발명이 특정한 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되는 것이 아니며, 물론 달라질 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어가 단지 특정한 실시양태를 기재하려는 목적을 위한 것일 뿐, 제한하려는 의도를 갖지 않는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제제가 투여될 대상체에게 허용되는 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균성이다.

"멸균" 제제는 무균성이거나, 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자를 함유하지 않거나, 실질적으로 함유하지 않는다.

"안정한" 제제는 저장 시에 내부의 단백질이 본질적으로 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 바람직하게는, 제제는 저장 시 그의 물리적 및 화학적 안정성 뿐만 아니라 그의 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 저장 기간은 일반적으로 제제의 의도되는 저장 수명에 기초하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 시간 주기 동안 선택된 양의 광 노출 및/또는 온도에서 측정될 수 있다. 안정성은 응집체 형성의 평가 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 탁도를 측정함으로써, 및/또는 육안 검사에 의해); ROS 형성의 평가 (예를 들어 광 스트레스 검정 또는 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH) 스트레스 검정을 사용함으로써); 단백질의 특정한 아미노산 잔기 (예를 들어 모노클로날 항체의 Trp 잔기 및/또는 Met 잔기)의 산화; 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전 포커싱 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이종성 평가; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광측정 분석; 환원된 항체 및 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵 (예를 들어 트립신 또는 LYS-C) 분석; 단백질의 생물학적 활성 또는 표적 결합 기능 (예를 들어, 항체의 항원 결합 기능) 평가 등을 비롯한 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 응집, 탈아미드화 (예를 들어 Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들어 Met 산화 및/또는 Trp 산화), 이성질체화 (예를 들어 Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들어 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍형성되지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다.

단백질은, 색상 및/또는 선명도의 육안 검사 시에, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 측정 시에 응집, 침전 및/또는 변성의 징후가 없거나 거의 없는 경우에 제약 제제에서 "그의 물리적 안정성을 보유한다".

단백질은, 주어진 시간에서의 화학적 안정성이, 단백질이 하기 정의된 바와 같은 그의 생물학적 활성을 계속 보유하는 것으로 간주되도록 하는 경우에 제약 제제에서 "그의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출 및 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은, 예를 들어 트립신 펩티드 맵핑, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC/MS)을 사용하여 평가될 수 있는 단백질 산화를 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 단백질의 전하 변경을 포함한다.

단백질은, 주어진 시간에서의 단백질의 생물학적 활성이, 예를 들어 모노클로날 항체에 대한 항원 결합 검정으로 결정 시에 제약 제제가 제조되었을 때 나타나는 생물학적 활성의 약 10% 이내 (검정의 오차 이내)인 경우에 제약 제제에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다".

본원에 사용된, 단백질의 "생물학적 활성"은 그의 표적에 결합하는 단백질의 능력, 예를 들어 항원에 결합하는 모노클로날 항체의 능력을 지칭한다. 이는 시험관내 또는 생체내 측정될 수 있는 생물학적 반응을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 활성은 길항작용 또는 효능작용일 수 있다.

"산화되기 쉬운" 단백질은 산화되기 쉬운 것으로 확인된 1종 이상의 잔기(들), 예컨대, 비제한적으로, 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp), 및 티로신 (Tyr)을 포함하는 것이다. 예를 들어, 모노클로날 항체의 Fab 부분에서의 트립토판 아미노산 또는 모노클로날 항체의 Fc 부분에서의 메티오닌 아미노산은 산화되기 쉬울 수 있다.

"등장성"은 관심 제제가 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 예를 들어, 등장성은 증기압 또는 빙결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.

본원에 사용된 "완충제"는 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 영향을 받지 않는 완충 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 바람직하게는 약 4.5 내지 약 8.0 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 히스티딘 아세테이트는 이 범위의 pH를 제어할 완충제의 예이다.

"보존제"는, 예를 들어 박테리아 작용을 본질적으로 감소시켜 다용도 제제의 생산을 용이하게 하기 위해 제제에 임의로 포함될 수 있는 화합물이다. 가능한 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 보존제는 벤질 알콜이다.

본원에 사용된 "계면활성제"는 표면-활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원의 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스(Pluronics), PF68 등) 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원의 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는" 부형제 또는 담체는 제약상 허용되는 담체, 안정화제, 완충제, 산, 염기, 당, 보존제, 계면활성제, 등장화제 등을 포함하며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Ed., Pharmaceutical Press, 2012). 제약상 허용되는 부형제의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산, L-트립토판 및 메티오닌; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 플루로닉스™를 포함한다. "제약상 허용되는" 부형제 또는 담체는, 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상체에게 합리적으로 투여될 수 있으며 사용된 투여량 및 농도에서 그에 노출된 대상체에 비독성인 것들이다.

제제화된 단백질은 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (예를 들어, 오염 단백질을 함유하지 않음). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 90 중량%의 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체), 바람직하게는 적어도 약 95 중량%를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 99 중량%의 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)을 포함하는 조성물을 의미한다.

용어 "단백질" "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 1종 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 단백질이 포함된다. 본원의 정의에 포괄된 단백질의 예는 포유동물 단백질, 예컨대, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체화 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL); B-세포 성숙 항원 (BCMA); B-림프구 자극제 (BLyS); 증식-유도 리간드 (APRIL); 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 정상 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 패밀리 단백질 (예를 들어, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 P1GF); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리 단백질 (예를 들어, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 및 그의 이량체); 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF4, 및 FGF9; 표피 성장 인자 (EGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예컨대 VEGF 수용체(들) (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, 및 VEGFR3), 표피 성장 인자 (EGF) 수용체(들) (예를 들어, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4 수용체), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 수용체(들) (예를 들어, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 및 섬유모세포 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예컨대 TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 케모카인, 예컨대 CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 시토카인, 예컨대 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 미드카인; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타-유사 리간드 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF); Alk1; Robo4; ESM1; 페를레칸; EGF-유사 도메인, 다중 7 (EGFL7); CTGF 및 그의 패밀리의 구성원; 트롬보스폰딘, 예컨대 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예컨대 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예컨대 NRP1 및 NRP2; 플레이오트로핀 (PTN); 프로그래뉼린; 프로리페린; Notch 단백질, 예컨대 Notch1 및 Notch4; 세마포린, 예컨대 Sema3A, Sema3C, 및 Sema3F; 종양 연관 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원); 이뮤노어드헤신; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체 뿐만 아니라, 예를 들어 임의의 상기-열거된 단백질을 비롯한 1종 이상의 단백질과 결합한 항체, 예컨대 항체 단편을 포함한다.

본원의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (예컨대, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 포괄한다.

"단리된" 단백질 (예를 들어, 단리된 항체)은 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 단백질에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 단백질은 단백질의 자연 환경 중 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 단백질을 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 단백질은 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다.

용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "V_H"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "V_L"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 그의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 주로 베타-시트 배위를 채택하여 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 함께 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

임의의 포유동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린) 의"경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 ("κ") 및 람다 ("λ")로 불리는 2종의 명백하게 별개의 유형 중 1종으로 지정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 IgG "이소형" 또는 "하위부류"는 그의 불변 영역의 화학적 특징 및 항원 특징에 의해 정의된 이뮤노글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있으며, 일반적으로, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co., 2000]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 하기 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편을 생산하며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다. Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 단단히 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv (scFv) 종에서는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 유연한 펩티드 링커에 의해 공유 연결되어 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있다. 이러한 배위에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 갖는다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 완전히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 예를 들어 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 표적 결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선택하는 것을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 과정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생산 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해되어야 한다. 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는, 그의 특이성 이외에도, 이들이 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.

수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

본원의 모노클로날 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (에를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는, 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어 마카크 원숭이를 관심 항원으로 면역화시켜 생산된 항체로부터 유래된 것인 프리마티즈드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 임의의 제조 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는, 항원 접종에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

다수의 HVR 설명이 사용되고 있으며 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기가 하기 기재된다.

HVR은 하기와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대해 카바트 등의 상기 문헌에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 카바트 등의 상기 문헌에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후의 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후의 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 카바트 등의 상기 문헌에 보고된 EU 인덱스). "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "약"은 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 각각의 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 지칭하며, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야에서의 실시당 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 본원의 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 지시된 실시양태를 포함 및 기재한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 내용상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "화합물"에 대한 언급은 2종 이상의 이러한 화합물의 조합물 등을 임의로 포함한다.

본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는 것", 이들로 "이루어진 것", 및 이들로 "본질적으로 이루어진 것"을 포함하는 것으로 이해된다.

II. 단백질 제제 및 제조

본원의 본 발명은 단백질 및 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제에 관한 것이다:

R³은 수소, 히드록실, -COOH, -CH₂COOH, 및 -CH₂CHR^3a(NH₂)로부터 선택되고; 여기서 R^3a는 COOH 또는 수소이고; R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며; 단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

상기 식에서 R² 및 R³은 독립적으로 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고; R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며; 단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

상기 식에서 R^3a는 COOH 또는 수소이고; R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며, 단 R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.

일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁴, R⁵ 또는 R⁷은 히드록실이다. 추가 실시양태에서, 화합물은 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁵는 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 상기 화합물은 5-히드록시 트립토판, 5-히드록시-인돌, 세로토닌 등을 제한 없이 포함하는 5-히드록시 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 10 mM, 또는 화합물이 제제 중에 가용성인 최고 농도 이하이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 티로신, 및/또는 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에서의 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 추가 실시양태에서, 반응성 산소 종은 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 알콕실 라디칼, 퍼옥실 라디칼, 과산화수소 (H₂O₂), 삼산화이수소 (H₂O₃), 히드로트리옥시 라디칼 (HO₃·), 오존 (O₃), 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및/또는 티로신은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 트립토판 및/또는 메티오닌은 산화되기 쉽다. 예를 들어, 모노클로날 항체의 Fab 부분에서의 트립토판 아미노산 및/또는 모노클로날 항체의 Fc 부분에서의 메티오닌 아미노산은 산화되기 쉬울 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 본원의 일부 실시양태에서, 단백질은 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편이다. 추가 실시양태에서, 화합물은 항체의 Fab 부분 중 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 화합물은 항체의 Fc 부분 중 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 대상체에게 투여하는데 적합한 제약 제제이다. 치료 또는 투여의 목적을 위한 본원에 사용된 "대상체" 또는 "개체"는 포유동물, 예컨대 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등으로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 제제는 수성이다. 본원의 일부 실시양태에서, 제제 중의 단백질 (예를 들어, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 제제는 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 모노클로날 항체, 단백질 (예를 들어, 5-히드록시 인돌)의 산화를 방지하는 본원에 제공된 바와 같은 화합물, 및 제제의 pH를 목적하는 수준으로 유지하는 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.

제제 중의 단백질 및 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 제제 중의 항체 (예를 들어, 전장 항체, 항체 단편 및 다중특이적 항체)는 관련 기술분야에 이용가능한 기술, 하기 섹션에서 보다 상세히 기재된 비제한적인 예시적 방법을 사용하여 제조된다. 본원의 방법은 다른 단백질, 예컨대 펩티드-기재 억제제를 포함하는 제제의 제조를 위해 통상의 기술자에 의해 채택될 수 있다. 치료 단백질의 생산을 위해 일반적으로 널리 이해되고 통상적으로 사용되는 기술 및 절차를 위해 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6^th ed., J. Wiley and Sons, 2010)]을 참조하며, 이들 모두는 그의 전체가 본원에 참조로 포함된다.

A. 항체 제조

본원에 제공된 제제 중의 항체는 관심 항원에 대해 지시된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 장애를 앓는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 이러한 포유동물에서 치료 이점을 가져올 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원에 대해 지시된 항체가 또한 고려된다.

항원이 폴리펩티드인 경우에, 이는 막횡단 분자 (예를 들어 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 분자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; 레닌; 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체화 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 정상 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대 골-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스 (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 임의의 상기-열거된 폴리펩티드의 단편을 포함한다.

(i) 항원 제조

임의로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체의 경우에는, 이들의 단편 (예를 들어 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태가 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

(ii) 특정 항체-기반 방법

폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서 R 및 R¹은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어 단백질 또는 접합체 100 μg 또는 5 μg (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에 프로인트 완전 아주반트 중의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하로 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합되었으나 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반은 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.

관심 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재되고, 예를 들어 인간-인간 하이브리도마에 관한 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 천연 IgM 항체의 생산에 관한 미국 특허 번호 7,189,826에 기재된 방법을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

다양한 다른 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 번호 7,078,492 및 7,153,507을 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 하기와 같이 기재된다. 한 실시양태에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시켜, 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 관심 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 아주반트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐. 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.), 몬타나주 해밀턴)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 항체를 생성한다. 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 항원) 또는 그의 단편은 관련 기술분야, 예컨대 재조합 방법에 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 본원에 추가로 기재된다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-항원 항체에 대해 검정하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.

이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는데 적합한 융제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 골수종 세포를 사용할 수 있다. 예시적인 골수종 세포는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center), 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능함), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능함)로부터 유도된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되어 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포를 적합한 배양 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 배지에서 시딩 및 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 태아 소 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법을 사용한다.

하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선시키기 위한 도구로서 올리고펩티드가 문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에 기재되어 있다. 특히, 표준 배양 배지를 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이나 단백질 가수분해물 분획으로 풍부화시키면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해서 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 보다 높은 농도로 존재한다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본원에 기재된 항체에 결합하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 스캐차드 분석에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 고딩(Goding)의 상기 문헌을 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 추가로, 하이브리도마 세포는 동물 생체내에서 복수 종양으로서 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 하나의 절차가 US 2005/176122 및 미국 특허 번호 6,919,436에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소량의 염, 예컨대 액방성 염의 사용을 포함하고, 바람직하게는 또한 용리 과정에서 소량의 유기 용매의 사용을 포함한다.

(iii) 특정 라이브러리 스크리닝 방법

본원에 기재된 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리를 사용하는 것을 통한다.

원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론을 선택한다. 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 파지 라이브러리를 패닝한다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론을 항원에 흡착시키고, 따라서 라이브러리 내의 비결합 클론으로부터 분리한다. 이어서, 결합 클론을 항원으로부터 용리하고, 항원 흡착/용리의 추가의 사이클에 의해 추가로 풍부화할 수 있다. 관심 파지 클론을 선택하는데 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구성함으로써 임의의 항체를 수득할 수 있다.

특정 실시양태에서, 항체의 항원-결합 도메인은 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역 (경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) (둘 다 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 제시)로부터 각각 하나씩)으로부터 형성된다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유적으로 연결된 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 이들이 불변 도메인에 각각 융합되어 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 가변 도메인이 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에 사용된 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭한다.

VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝하여 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합할 수 있고, 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론을 조사할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원 및 또한 자기 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 소량의 코트 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사상 파지가 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일 쇄 Fv 단편으로서, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 쇄는 pIII에 융합되고 다른 하나는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되고, 여기서 일부 야생형 코트 단백질을 대체함으로써 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있다.

일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득한다. 항-항원 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 바람직한 경우, 대상을 항체 반응을 생성하도록 항체로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환성 B 세포, 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)를 라이브러리 구축을 위해 회수한다. 한 실시양태에서, 항-항원 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 갖는 (및 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-항원 항체 반응을 일으킴으로써 수득한다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에서 기재된다.

항-항원 반응성 세포 집단에 대한 추가의 풍부화물은, 예를 들어 항원 친화성 크로마토그래피 또는 형광색소-표지된 항원에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해, 항원-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차를 사용함으로써 수득할 수 있다.

대안적으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써, 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축물이 혼입된 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 줄기 세포를 수득한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 수득할 수 있다.

항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산을 관심 세포로부터 회수하여, 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 목적하는 DNA를 수득할 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. V 유전자는 문헌 [Orlandi et al. (1989) 및 Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-절편 내에 기반한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭시킬 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머가 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손을 기반으로 할 수 있고, 정방향 프라이머가 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역을 기반으로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al. (1989) 또는 Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축중성을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그가 부착된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.

합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 입체형태 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 VH 레퍼토리가 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기초로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.

항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 다양한 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내 재조합되거나, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이(E. coli) 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위해 Fab 절편의 2쇄 속성을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 개별적으로 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 한정된다 (약 10¹²개 클론). 두 벡터는 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 거대 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10^-8 M의 K_d ^- ¹)를 갖는 다양한 항체를 대량으로 제공한다.

대안적으로, 레퍼토리는 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터에 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리된 후에 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는데 PCR 어셈블리가 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합한 다음, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.

나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 적절한 친화도 (약 10⁶ 내지 10⁷ M^-1의 K_d ^- ¹)를 가질 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al. (1994), 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리를 구축하고 그로부터 재선택함으로써 시험관내에서 모방될 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이는 오류-유발 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)]에 보고되어 있음)를 사용하여 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법으로 시험관내에서 무작위로 도입시킬 수 있다. 추가로, 예를 들어 관심 CDR에 스패닝된 무작위 서열을 보유하는 프라이머에 의한 PCR을 사용하여, 선택된 개별적 Fv 클론에서 1종 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화도가 보다 높은 클론을 스크리닝함으로써 친화도 성숙을 수행할 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)는 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하는 방법을 기재하고 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 천연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 여러 라운드의 쇄 재셔플링으로 보다 높은 친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화성이 약 10^-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.

라이브러리의 스크리닝은 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, 항원은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는데 사용하거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현시키거나, 세포 분류에 사용하거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합하거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용할 수 있다.

파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제에 결합시키는데 적합한 조건 하에 고정된 항원과 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체 상에 결합된 파지를 세척한 다음, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차로 항원 경쟁에 의해 용리시킨다. 단일 라운드의 선택으로 파지가 20-1,000배 풍부화될 수 있다. 더욱이, 풍부화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가의 선택 라운드에 적용될 수 있다.

선택 효율은 세척 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부를 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화도)의 항체는 단시간 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체 상 내의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용함으로써 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 장려한다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화도)의 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 장시간 세척 및 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.

항원에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이로부터 선택할 수 있다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 일부 친화도 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는, 대부분 항원에 결합하고 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. 항원을 제한하여, 희귀 고친화도 파지를 경쟁시킬 수 있다. 보다 높은 친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오티닐화 항원과 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오티닐화 항원은 항원에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고친화도-결합 파지가 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이러한 "평형 포획"은 친화도가 더 낮은 과량의 파지로부터 친화도가 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 그의 결합 친화도에 따라 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세척하는데 사용된 조건이 해리 동역학을 기초로 식별하도록 또한 조작될 수 있다.

항-항원 클론은 활성을 기초로 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 자연적으로 항원을 발현하는 살아있는 세포에 결합하거나, 또는 자유 부유 항원 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이러한 항-항원 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기재된 파지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 항원 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-항원 파지 클론을 고정된 항원에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정기와 겹치거나 공유하는 항원-결합 결정기를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용리시키고; (5) 단계 (4) 이어서 흡착되어 남아있는 클론을 용리시킴으로써 선택할 수 있다. 임의로, 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 목적하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론을 추가로 풍부화시킬 수 있다.

하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA를 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성물을 수득할 수 있다. 항체-코딩 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.

Fv 클론을 코딩하는 DNA와 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지된 DNA 서열 (예를 들어 적절한 DNA 서열이 카바트 등의 상기 문헌으로부터 수득될 수 있음)을 조합하여, 전장 또는 부분 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 다음, 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.

하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 코딩하는 DNA는 또한, 예를 들어 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형시킬 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래 항체의 결합 특이성이 있는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

(iv) 인간화 및 인간 항체

비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터의 이에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열에 대해 치환함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

추가로, 항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 실시양태의 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 그의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

본원에 기재된 제제 및 조성물 중의 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)과 상기 기재된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)을 혼합함으로써 구축할 수 있다. 대안적으로, 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.

면역화 시에 내인성 이뮤노글로불린 생산 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체 생산이 완전히 억제되는 것으로 기재되었다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)]을 참조한다.

유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성한다. 항원에 의한 선택의 결과로서, 인간 쇄에 의해 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위가 복원된 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되며, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 프로세스가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일자에 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.

(v) 항체 단편

항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소적 소화, 또는 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 특정 상황에서는, 전체 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.

항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 용이하게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 5,587,458을 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서 이들은 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성하도록 구축될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 다중특이적 항체

다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 여기서 에피토프는 통상적으로 상이한 항원으로부터의 것이다. 이러한 분자는 일반적으로 2개의 상이한 에피토프에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성이 있는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에 사용되는 경우에 이러한 표현에 포괄된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 확인되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 상세내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

WO96/27011에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 하나의 인터페이스는 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "함몰부"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 원치 않는 세포로의 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089)를 위해 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착물화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.

최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산을 기재하고 있다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학적 커플링을 실시하였다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].

(vii) 단일-도메인 항체

일부 실시양태에서, 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.

(viii) 항체 변이체

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 목적하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.

(ix) 항체 유도체

본 발명의 제제 및 조성물 중의 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체에 관한 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1종 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.

(x) 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

(a) 신호 서열 성분

본원에 기재된 제제 및 조성물 중의 항체는 직접적으로, 뿐만 아니라 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 신호 서열을 대체시킨다. 효모 분비의 경우에, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 인자 리더 (사카로미세스(Saccharomyces) 및 클루이베로미세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현 시에는, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.

(b) 복제 기점

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘 다 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ, 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (전형적으로, SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).

(c) 선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실루스의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체-코딩 핵산을 취하는데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 포함한다.

예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이러한 조건 하에, DHFR 유전자를 임의의 다른 공동-형질전환된 핵산과 함께 증폭시킨다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.

대안적으로, GS 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이러한 조건 하에, GS 유전자를 임의의 다른 공동-형질전환시킨 핵산과 함께 증폭시킨다. GS 선택/증폭 시스템을 상기 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합하여 사용할 수 있다.

대안적으로, 관심 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커에 대한 선택제, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.

효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게는, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

추가로, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다. 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 개시되어 있다. 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

(d) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주와 사용하는데 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 엔올라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제를 포함한다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하는데 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 호환가능하여야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 또한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로 사용할 수 있다.

(e) 인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의해 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 다수의 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 후기 측 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 후기 측의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체-코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

(f) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

(g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원의 벡터에 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 한 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)이 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.

전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예컨대 치료 항체를 그 자체만으로도 종양 세포 파괴에 있어서 효과적인 것으로 나타나는 세포독성제 (예를 들어, 독소)와 접합시킨 경우에 박테리아에서 생산할 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 보다 길다. 이. 콜라이에서의 생산은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기재하고 있는 미국 특허 번호 5,648,237 (카터(Carter) 등), 미국 특허 번호 5,789,199 (졸리(Joly) 등), 미국 특허 번호 5,840,523 (시몬스(Simmons) 등)을 참조한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하고 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후에, 항체를 가용성 분획 중의 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하며 유용한데, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 숙주, 예컨대, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 있다. 치료 단백질을 생산하기 위해 효모 및 사상 진균을 사용하는 것에 관한 논의를 검토하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.

글리코실화 경로가 "인간화"됨으로써 부분적 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산에서 생성된 특정 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] (피키아 파스토리스에서의 글리코실화 경로의 인간화 기재); 및 문헌 [Gerngross et al., 상기 문헌]을 참조한다.

글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실 파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae)), 알팔파 (엠. 트룬카툴라(M. truncatula)), 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수 있고, 배양물 (조직 배양) 중에서 척추동물 세포를 증식시키는 것이 상용 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (베로-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR^- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268]을 참조한다.

숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.

(h) 숙주 세포의 배양

항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), 시그마)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위로 최종 농축물에 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

(xi) 항체의 정제

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포 내에서 생산되거나, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기재하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 소듐 아세테이트 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 여기서 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 다른 단백질 정제 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상에서의 분별증류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하다.

일반적으로, 조사, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하는 다양한 방법론이 관련 기술분야에 널리 확립되고 있고, 이는 상기 기재된 방법론과 일치하고/거나 특정한 관심 항체에 대해 통상의 기술자에게 인지되는 바와 같다.

B. 생물학적 활성 항체의 선택

상기 기재된 바와 같이 생산된 항체를 하나 이상의 "생물학적 활성" 검정에 적용시켜, 치료 관점에서 유익한 특성을 갖는 항체를 선택할 수 있다. 항체는 발생된 항원에 대한 그의 결합 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 항-DR5 항체 (예를 들어, 드로지투맙)의 경우에, 항체의 항원 결합 특성은 사멸 수용체 5 (DR5)에 결합하는 능력을 검출하는 검정으로 평가될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 친화도는, 예를 들어 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 검정 (예를 들어, RIA)에 의해 결정될 수 있다.

또한, 항체는, 예를 들어 치료제로서의 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 검정에 적용될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 항체에 대한 표적 항원 및 의도된 용도에 따라 달라진다.

관심 항원 상의 특정한 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 상용의 교차-차단 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 문헌 [Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여, 항체가 관심 에피토프에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다.

C. 제제의 제조

단백질 및 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하는 제제를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 단백질과 제제 (예컨대 액체 제제)에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제화되는 단백질은 사전 동결건조에 적용되지 않으며, 본원의 관심 제제는 수성 제제이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 특정 실시양태에서, 단백질은 항체이다. 추가 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 한 실시양태에서, 제제 중의 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab')₂이며, 이 경우에 전장 항체에 대해 발생할 수 없는 문제 (예컨대 Fab에의 항체의 클리핑)는 해결될 필요가 있을 수 있다. 제제 중에 존재하는 단백질의 치료 유효량은, 예를 들어 목적하는 용량 부피 및 투여 방식(들)을 고려함으로써 결정된다. 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL가 제제 중의 예시적인 단백질 농도이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 중 1종 이상은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 트립토판은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 메티오닌은 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fab 부분 및/또는 Fc 부분에서 산화되기 쉽다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fab 부분에서의 트립토판 아미노산에서 산화되기 쉽다. 추가 실시양태에서, 산화되기 쉬운 트립토판 아미노산은 항체의 CDR에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체의 Fc 부분에서의 메티오닌 아미노산에서 산화되기 쉽다.

본원에 제공된 제제는 단백질 및 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:

일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁴, R⁵ 또는 R⁷은 히드록실이다. 추가 실시양태에서, 화합물은 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 화합물은 4-히드록시 인돌, 5-히드록시 인돌-3-아세트산, 및 7-히드록시 인돌-2-카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 화학식에서의 R⁵는 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 상기 화합물은 5-히드록시 트립토판, 5-히드록시-인돌, 세로토닌 등을 제한 없이 포함하는 5-히드록시 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 10 mM의 농도, 또는 화합물이 제제 중에 가용성인 최고 농도 이하이다. 특정 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 0.3 mM 내지 약 9 mM, 약 0.3 mM 내지 약 8 mM, 약 0.3 mM 내지 약 7 mM, 약 0.3 mM 내지 약 6 mM, 약 0.3 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4 mM, 약 0.3 mM 내지 약 3 mM, 약 0.3 mM 내지 약 2 mM, 약 0.5 mM 내지 약 2 mM, 약 0.6 mM 내지 약 1.5 mM, 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.25 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 화합물은 약 1 mM이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 단백질에서의 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 트립토판, 메티오닌, 티로신, 히스티딘, 및/또는 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에서의 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 단백질의 산화를 방지한다. 추가 실시양태에서, 반응성 산소 종은 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 알콕실 라디칼, 퍼옥실 라디칼, 과산화수소 (H₂O₂), 삼산화이수소 (H₂O₃), 히드로트리옥시 라디칼 (HO₃·), 오존 (O₃), 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 화합물은 항체의 Fab 부분 중 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 화합물은 항체의 Fc 부분 중 1종 이상의 아미노산의 산화를 방지한다.

일부 실시양태에서, 제제 (예컨대 액체 제제)는 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 pH-완충된 용액으로 제조된다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 7.0 범위의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, pH는 pH 4.5 내지 6.5 범위, pH 4.5 내지 6.0 범위, pH 4.5 내지 5.5 범위, pH 4.5 내지 5.0 범위, pH 5.0 내지 7.0 범위, pH 5.5 내지 7.0 범위, pH 5.7 내지 6.8 범위, pH 5.8 내지 6.5 범위, pH 5.9 내지 6.5 범위, pH 6.0 내지 6.5 범위, 또는 pH 6.2 내지 6.5 범위이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. pH를 이 범위 내로 제어할 완충제의 예는 유기 및 무기 산 및 그의 염을 포함한다. 예를 들어, 아세테이트 (예를 들어, 히스티딘 아세테이트, 아르기닌 아세테이트, 소듐 아세테이트), 숙시네이트 (예를 들어, 히스티딘 숙시네이트, 아르기닌 숙시네이트, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 포스페이트, 푸마레이트, 옥살레이트, 락테이트, 시트레이트, 및 그의 조합. 완충제 농도는, 예를 들어 완충제 및 제제의 목적하는 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 히스티딘 완충제 (예를 들어, 약 5 mM 내지 100 mM의 농도로)를 포함한다. 히스티딘 완충제의 예는 히스티딘 클로라이드, 히스티딘 아세테이트, 히스티딘 포스페이트, 히스티딘 술페이트, 히스티딘 숙시네이트 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 히스티딘 및 아르기닌 (예를 들어, 히스티딘 클로라이드-아르기닌 클로라이드, 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트, 히스티딘 포스페이트-아르기닌 포스페이트, 히스티딘 술페이트-아르기닌 술페이트, 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 등)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 히스티딘을 약 5 mM 내지 100 mM의 농도로 포함하고, 아르기닌은 50 mM 내지 500 mM의 농도로 존재한다. 한 실시양태에서, 제제는 히스티딘 아세테이트 (예를 들어, 약 20 mM)-아르기닌 아세테이트 (예를 들어, 약 150 mM)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 히스티딘 숙시네이트 (예를 들어, 약 20 mM)-아르기닌 숙시네이트 (예를 들어, 약 150 mM)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제 중의 히스티딘은 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM 또는 약 20 mM 내지 약 25 mM이다. 추가 실시양태에서, 제제 중의 아르기닌은 약 50 mM 내지 약 500 mM (예를 들어, 약 100 mM, 약 150 mM, 또는 약 200 mM)이다.

본 발명의 제제 (예컨대 액체 제제)는 사카라이드, 예컨대 디사카라이드 (예를 들어, 트레할로스 또는 수크로스)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "사카라이드"는 일반적 조성물 (CH₂O)n 및 그의 유도체, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 폴리사카라이드, 당 알콜, 환원당, 비환원당 등을 포함한다. 본원의 사카라이드의 예는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 실리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스, 락툴로스, 말툴로스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등을 포함한다.

계면활성제는 임의로 제제 (예컨대 액체 제제)에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188 등)를 포함한다. 계면활성제의 양은 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/거나 제제 중 미립자의 형성을 최소화시키고/거나 흡착을 감소시키도록 첨가된다. 예를 들어, 계면활성제는 제제 중에 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 또는 약 0.03% 내지 약 0.05%의 양으로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 제제 중에 0.04% 또는 약 0.04%의 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 제제 중에 0.02% 또는 약 0.02%의 양으로 존재한다. 한 실시양태에서, 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 제제는 상기-확인된 작용제 (예를 들어, 항체, 완충제, 사카라이드, 및/또는 계면활성제)를 함유하고, 1종 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤제토늄 Cl을 본질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 보존제는, 특히 제제가 다중용량 제제인 경우에 제제 중에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1% 범위일 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것과 같은, 1종 이상의 다른 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 제제에 포함시킬 수 있는데, 단 이들은 제제의 목적하는 특징에 불리한 영향을 미치지 않는다. 본원의 예시적인 제약상 허용되는 부형제는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.

제제는 금속 이온 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이트화제는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 이는 아미노폴리카르복실레이트, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), EDDS (에틸렌 디아민 디숙시네이트), PDTA (1,3-프로필렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), ADA (베타-알라닌디아세트산), MGCA (메틸글리신디아세트산) 등을 포함하나, 이에 필수적으로 제한되지는 않는다. 추가로, 본원의 일부 실시양태는 포스포네이트/포스폰산 킬레이트화제를 포함한다.

등장화제는 조성물 중 액체의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 존재한다. 큰 하전된 생체분자, 예컨대 단백질 및 항체를 사용하는 경우에, 이들은 또한 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하여 분자간 및 분자내 상호작용의 가능성을 줄일 수 있기 때문에 "안정화제"로 작용할 수 있다. 등장화제는 다른 성분의 상대량을 고려하여, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 보다 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.

본원의 제제는 또한 치료될 특정한 징후에 대해 필요에 따라 1종 초과의 단백질 또는 소분자 약물, 바람직하게는 다른 단백질에 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체가 항-DR5 (예를 들어, 드로지투맙)인 경우에, 이는 또 다른 작용제 (예를 들어, 화학요법제, 및 항신생물제)와 조합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제제는 생체내 투여를 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 제제는 멸균된다. 제제는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다. 투여 경로는 공지되고 허용되는 방법에 따라, 예컨대 단일 또는 다중 볼루스 또는 장기간에 걸친 주입에 의해 적합한 방식, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입 또는 지속 방출 또는 연장-방출 수단에 의한다.

본 발명의 제제는 액체 또는 비-액체 제제 (예를 들어, 동결건조됨)에 저장될 수 있다. 동결건조 제제는 투여 전에 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단백질, 화합물 및 다른 부형제의 농도는 재구성된 제제에서의 농도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제제는 저장 시 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 21개월, 또는 적어도 약 24개월 (또는 적어도 약 52주) 동안 약 0 내지 5℃에서 저장 시 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 21개월, 또는 적어도 약 24개월 (또는 적어도 약 52주) 동안 약 -20℃에서 저장 시 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 제제 제조 동안에 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 금속 합금 용기 (예를 들어, 스테인레스 스틸 용기) 내에 저장된 경우에 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 유리 바이알 내에 저장된 경우에 안정하다. 일부 실시양태에서, 액체 제제 중의 단백질은 플라스틱 용기 내에 저장된 경우에 안정하다. 일부 실시양태에서, 제제 중의 단백질의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성은 평가 또는 측정된다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법은 안정성 및 생물학적 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정성은 저장 후 제제 (예컨대 액체 제제) 중의 단백질의 산화에 의해 측정된다. 안정성은 제제화하는 동안에 뿐만 아니라 저장 후에 제제 중 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 평가함으로써 시험될 수 있다. 물리적 및/또는 화학적 안정성은 응집체 형성의 평가 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 탁도를 측정함으로써, 및/또는 육안 검사에 의해); 양이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이종성 평가; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광측정 분석; 환원된 항체 및 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵 (예를 들어 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능의 평가 등을 비롯한 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 응집, 탈아미드화 (예를 들어 Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들어 Trp 산화), 이성질체화 (예를 들어 Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들어 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍형성되지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩티드 맵핑 중 하나 이상을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 항체에서의 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신 펩티드 맵핑 중 하나 이상 및 하기 식을 사용하여 백분율로서 결정된다:

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 제제의 제조 전에 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

단백질 제제를 제조하는 방법, 또는 단백질의 산화를 방지하는 화합물의 소정량을 단백질 제제에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 단백질 제제에서의 단백질의 산화를 방지하는 방법이 또한 본원에 제공된다:

일부 실시양태에서, R⁴, R⁵ 또는 R⁷은 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 제제는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R⁵는 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 5-히드록시 트립토판, 5-히드록시-인돌, 세로토닌 등을 제한 없이 포함하는 5-히드록시 유도체이다. 본원에 제공된 바와 같은 단백질의 산화를 방지하는 화합물의 양은 약 0.3 mM 내지 약 10 mM 또는 본원에 개시된 임의의 양이다.

III. 단백질 제제의 투여

제제 (예컨대 액체 제제)는 단백질 (예를 들어, 항체)에 의한 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼루스와 같은 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 포유동물에게 정맥내 투여에 의해 투여된다. 이러한 목적을 위해, 제제는, 예를 들어 시린지를 사용하여 또는 IV 라인을 통해 주사될 수 있다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 포유동물에게 피하 투여에 의해 투여된다.

단백질의 적절한 투여량 ("치료 유효량")은, 예를 들어 치료될 상태, 상태의 중증도 및 경과, 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 단백질은 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여되고, 환자에게 진단 이후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 단백질은 단독 치료법으로서 투여하거나 또는 해당 상태를 치료하는데 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치를 둘 다 지칭한다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 장애가 있는 것 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "장애"는, 포유동물을 해당 장애에 취약하게 하는 병리학적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다.

약리학적 관점에서, 본 발명의 문맥에서, 단백질 (예를 들어, 항체)의 "치료 유효량"은 항체가 효과적인 치료를 위한 장애의 예방 또는 치료에 유효한 양을 지칭한다. 일반적인 제안으로서, 투여되는 단백질의 치료 유효량은 1회 투여 또는 그 초과의 투여이든지 약 0.1 내지 약 50 mg/kg 환자 체중 범위일 것이며, 여기서 사용되는 단백질의 전형적인 범위는, 예를 들어 매일 투여 시 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 1, 2, 3, 또는 4주마다 약 100 또는 400 mg의 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 또는 4주마다 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 15.0, 또는 20.0 mg/kg의 용량으로 투여된다. 용량은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 (예를 들어, 2회 또는 3회 용량)으로서 투여, 예컨대 주입될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술에 의해 용이하게 모니터링된다.

IV. 단백질 산화의 방지를 위한 화합물에 대해 스크리닝하는 방법

단백질 조성물에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 스크리닝하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 L-트립토판과 비교하여 보다 낮은 산화 전위 및 보다 적은 감광성을 갖는 화합물을 선택하는 것, 및 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 선택된 화합물의 효과를 시험하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 감광성은 광 노출 시 화합물에 의해 생산된 H₂O₂의 양을 기준으로 하여 측정된다. 예를 들어, 화합물을 포함하는 액체 조성물은 특정 양의 시간 동안 250 W/m² 광에 노출될 수 있고, 생성된 H₂O₂ 형성은 정량화된다. 보다 적은 감광성을 갖는 화합물은 특정 양의 광 노출 시에, 동일한 양의 광 노출 시에 보다 높은 감광성을 갖는 화합물보다 더 적은 H₂O₂를 생산한다. 일부 실시양태에서, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만의 양의 H₂O₂를 생산하는 화합물이 선택된다. H₂O₂는 산화되기 쉬운 단백질에서의 아미노산 잔기의 산화에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 산화 전위는 순환 전압전류법에 의해 측정된다.

일부 실시양태에서, 선택된 화합물은 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH), 광 및/또는 펜톤 시약에 의해 생성된 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 효과에 대해 시험된다. 본원의 임의의 실시양태에서, 실시예에 기재된 방법은 단백질 조성물에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

V. 제조 물품

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제제를 수용하고 임의로 그의 사용 지침서를 제공하는 용기를 포함하는 제조 물품이 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알 및 시린지를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 금속 합금 (예컨대 스테인레스 스틸) 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 300 cc 금속 합금 용기 (예를 들어, -20℃에서의 저장용)이다. 예시적인 용기는 3-20 cc 단일 용도 유리 바이알이다. 대안적으로, 다중용량 제제의 경우에, 용기는 3-100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제를 수용하고, 용기 상의 또는 용기에 부속된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 제조 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용 지침서가 있는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위에 속할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 통상의 기술자에게 제안될 것이고, 본원의 취지 및 범위, 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.

실시예 1: 항산화제 L-Trp는 단백질 제제에서 모노클로날 항체를 산화시키는 ROS를 생산한다

모노클로날 항체는 항체 촉매된 물 산화 경로 (ACWOP)를 통해 ROS를 생산하는 것으로 제시되었으며, 여기서 항체는 잠재적으로 물과 일중항 산소 사이의 반응을 촉매하여 과산화수소를 생성하였다 (Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); Wentworth et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97(20):10930-5 (2000)). ACWOP에서, 다양한 ROS, 예컨대 슈퍼옥시드 음이온, 삼산화이수소, 오존, 및 심지어 히드로트리옥시 라디칼을 과산화수소의 생산을 통한 경로에서 생성하였다 (Zhu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(8):2247-52 (2004)). 본원에서 mAb1로도 지칭되는 모노클로날 항-DR5 항체인 드로지투맙 (CAS 번호 912628-39-8)에서의 표면 노출된 트립토판은, 심지어 온화한 광 조건 하에 시간 및 농도 의존성 방식에서 ACWOP를 용이하게 하는 기질 (¹O₂ 및 O₂ ^-) 생성기로서 작용하는 것으로 제시되었다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). mAb1이 제약상 관련 조건 하의 저장 동안 특히 산화되기 쉬운 것을 입증하였다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). 산화는 부위 특이적이고, 트립신 펩티드 맵핑에 의해 평가되는 바와 같이 중쇄 CDR (Fab) 상의 Trp53 (W53)에 국재화되는 것으로 나타났다. 추가로, 역상 HPLC 검정을 사용하여 파파인 소화, DTT 환원, 및 역상 분리를 통한 mAb1의 HC Fab 및 Fc 영역에서의 총 산화를 측정하였다. RP-HPLC로부터의 피크는 LC/MS를 사용하여 확인하고, 트립신 펩티드 맵의 결과에 의해 강한 상관관계를 나타냈으며, 이는 RP 방법이 W53 (즉 % Fab) 산화의 검출에 대한 대용물로서 사용될 수 있다는 것을 나타내었다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). RP 파파인 소화 방법에서, Fab 및 Fc 산화 피크는 그의 각각의 주요 피크 이전에 용리되었으며, 이는 그의 총 피크 면적에 대한 % Fab 및 % Fc 산화의 정량화를 가능하게 하였다. 상기 연구는 과산화수소가 다수의 ROS, 예컨대 슈퍼옥시드 및 일중항 산소에 대한 대용물로서 작용할 수 있다는 것을 추가로 나타내었다.

제한된 (즉, 제어된) 광 노출이 단백질 산화를 연구하기 위해 촉진된 스트레스 모델로서 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 동일한 인간 모노클로날 IgG1 항체 (mAb1)를 사용하여 잠재적 항산화제를 스크리닝 및 평가하였다. 단백질 제제에 사용된 L-트립토판 (L-Trp), 항산화제는 최근에 감광성이고 (Igarashi et al., Anal Sci 23(8):943-8 (2007)), 광 노출 시 H₂O₂를 생산하는 능력을 갖는 것으로 제시되었다. 광 스트레스 하의 L-Trp에 대한 mAb1의 감수성을 잠재적 항산화제로서의 L-메티오닌 (L-Met)의 첨가 하에 및 첨가 없이 평가하였다. mAb1을 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현시키고, 일련의 크로마토그래피 방법, 예컨대 단백질 A 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 친화도 정제에 의해 정제하였다. mAb1은 유리 바이알 내에서 및 1mM L-Trp 및 10 mM 내지 100 mM 범위의 다양한 농도의 L-Met를 함유한 20mM 히스티딘 아세테이트, 250mM 트레할로스 및 0.02% 폴리소르베이트 20의 제제 중에 5 mg/mL로 제조하고, 아틀라스 선테스트(Atlas SunTest) CPS+ 크세논 테스트 인스트루먼트(Xenon Test Instrument) (일리노이주 시카고)에서 250 W/m²에서 8시간의 광에 노출시켰다. 대조군 바이알을 알루미늄 호일로 랩핑하고, 유사하게 처리하였다. 광 노출 후, 용액을 역상 HPLC에 의한 분석을 위해 제조하였다. RP-HPLC의 경우에, 스트레스 연구로부터의 mAb1 용액을 0.1 M 트리스, 4.4 mM EDTA, 및 1.1 mM 시스테인 중에 1.1 mg/mL로 제조하였다. 150 μL의 0.1 mg/mL 파파인을 1.35 mL의 mAb1 용액에 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 900 μL의 용액을 100 μL의 1 M 디티오트레이톨 (DTT)과 합하고, 추가 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 배리안, 인크.(Varian, Inc.) 퍼슈트(Pursuit) 3 μm, 2 mm ID x 250 mm 디페닐 칼럼 (캘리포니아주 팔로 알토)과 연결된 280 nm에서의 UV 검출을 구비한 애질런트, 인크.(Agilent, Inc.) 1100/1200 HPLC 시스템 (캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 샘플을 유동시켰다. 이동상 A는 물 중 0.1% TFA였다. 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% TFA였다. 이동상 구배를 0분에서의 34% B에서 50.0분에서의 43% B까지, 이어서 50.1분에서의 95% B까지로 선형적으로 증가시켰다. 구배를 60.1분까지 95% B에서 유지한 다음, 60.1 내지 60.2분 사이에 95% B에서 34% B까지 선형적으로 감소시켰다. 구배를 80.2분에서의 주기의 종결까지 34% B에서 유지하였다. 칼럼 온도는 65℃이고, 총 유량은 0.2 mL/분이고, 각 샘플의 주입 부피는 6 μL였다. 이어서, 크로마토그램을 산화의 정량화를 위해 통합하였다.

추가로, mAb1은 pH 6.0에서 L-His 기재 완충제 중에서 안정한 것으로 확인되었다. mAb1 Fab 산화에 대한 L-Trp 및 L-Met의 광 노출 효과의 분석은 mAb1 참조 물질 (광 노출 없음) 및 호일 대조군이 약 2% Fab 산화를 갖는 것으로 나타났다 (도 1A). 호일 대조군 및 참조 물질이 동일한 수준의 Fab 산화를 나타냈기 때문에, 열은 단독으로 Fab의 산화를 야기하지 않을 것이다. mAb1이 광에 노출된 경우에 ("부형제 없음" 샘플), Fab 산화는 4%로 2배가 된다. 1mM L-Trp의 첨가 하에, Fab 산화는 거의 9%로 증가되었으며, 이는 유리 L-Trp는 Fab 상의 W53의 산화를 초래할 수 있는 광 노출 하에 ROS를 생성하는 것을 시사하였다. 1 mM L-Trp를 함유하는 제제에의 10, 25, 50, 및 100mM L-Met의 추가 첨가는 Fab 산화를 약간 감소시키는 것으로 보여지나, 심지어 100 몰 과량의 L-Met는 호일 대조군의 수준으로 Fab 산화를 감소시키지는 않았다 (도 1A).

mAb1의 Fc 영역에서의 산화는 주로 Met 잔기 Met 254 및 Met 430인 것으로 나타났다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). mAb1 Fc 산화에 대한 L-Trp 및 L-Met의 광 노출 효과의 분석은 mAb1 참조 물질 및 호일 대조군이 심지어 광에의 노출 전에 약 8% Fc 산화를 갖는 것으로 제시하였다 (도 1B). 광에의 노출은 제제 완충제 중 mAb1에 대해 단지 소량의 Fc 산화 ("부형제 없음") 증가를 초래하였다. 그러나, 1mM L-Trp와의 인큐베이션은 RP-HPLC 검정에 의해 확인된 바와 같이 Fc 영역에서의 이들 Met 부위에서 20% 초과의 산화를 초래하였다. 심지어 100mM L-Met은 대조군의 수준으로 Fc 산화를 감소시키지 않았지만, 1mM L-Trp를 함유하는 제제에의 다양한 농도의 L-Met (10, 25, 50 및 100 mM)의 첨가는 Fc 산화의 양을 감소시켰다 (도 1B).

L-Trp는 H₂O₂를 슈퍼옥시드 이온을 통해 및 화학량론 미만의 방식으로 생산하고, 한편 유사한 조건 하의 항체는 촉매량을 생산하는 것으로 이전에 보고되었다 (Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)). 제약상 관련 조건 하에, 예컨대 ICH 및 주위 광 조건 둘 다 하에 유리 L-Trp의 감수성을 시험하기 위해, 0.32mM 내지 7.5mM의 L-Trp를 포함하는 제제 (L-Trp는 pH 7.1에서의 인산나트륨 완충액 중에 용해시킴)를 250W/m² UV 광 및 약 150k 룩스 가시 광선에서 3시간 동안 노출시켰다. 샘플을 취하고, 암플렉스(Amplex) 검정을 통해 즉시 분석하여 이러한 조건 하에 생성된 H₂O₂의 양을 검출하였다. 광 노출 시 유리 L-Trp에 의해 다량의 H₂O₂를 농도 의존성 방식으로 생성하였다 (도 2). 이러한 H₂O₂ 생성은 50mM 아지드화나트륨, 일중항 산소의 공지된 켄처의 존재 하에 크게 감소하였다 (도 2). L-Trp를 50mM NaN₃ 및 150 U 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD)의 조합, 또는 SOD 단독과 함께 인큐베이션한 경우에, 상당한 양의 H₂O₂가 NaN₃을 함유하지 않는 샘플에서 여전히 검출되었다. 이는 일중항 산소 이외에도, 슈퍼옥시드 이온이 또한 광-조사 시 생성되어 SOD에 의해 H₂O₂로 전환될 수 있는 것을 나타내었다.

ICH 광 조건 하에 유리 L-Trp의 감광성을 확인하면서, 실험실에서 전형적으로 확인되는 주위 광의 효과를 연구하였다. 다양한 실험실에서의 DLM1 디지털 광도계를 사용한 측정은 실험실 벤치탑 (백색 형광 조명 사용) 상에서 평균 300 룩스, 층류 후드 (백색 형광 조명 사용)에서 평균 3000 룩스, 및 남동쪽 일광에 노출된 창턱에 대해 약 10000 룩스를 나타내었다. 이러한 조건 하에, 50mg/mL mAb1을 함유하는 제제 완충제 중의 L-Trp는 암플렉스 울트라 레드 검정을 사용하여 검출된 바와 같이 마이크로몰 범위의 과산화수소를 생산하였다 (도 3A). 퍼옥시드 생산은 광도 (300, 3000, 및 10000 룩스) 및 시간 (1, 3, 및 7일) 둘 다에 의해 증가하였다. 단백질 샘플을 mAb1 특이적 RP-HPLC 검정을 사용하여 추가로 분석하였으며, 증가된 광도에 의한 W53의 산화에 상응하는 증가된 중쇄 Fab 산화를 나타내었다 (도 3B). 동시에, 이들 조건 하의 mAb1에서의 % Fc 산화는 각각 300 및 10000 룩스 사이에 5 내지 40% 증가하였다. 작업을 수행하기/마치기 전에 및 잠재적으로 약물 제품 바이알을 검사하면서 주위 광 및 온도 하의 약물 물질 취급에 제약상 관련되도록 이들 수준의 광 노출 및 시간을 결정하였다. 이들 결과는 L-Trp가 감광성이고, 이것이 mAb 제품 품질에 유해할 수 있는 몇몇 반응성 산소 종, 예컨대 일중항 산소, 슈퍼옥시드 및 H₂O₂를 생산하고, 완충제를 함유하는 L-Trp를 취급 및 저장하면서 주의하여야 한다는 것을 지지하였다.

실시예 2: 후보 항산화제 화합물의 스크리닝.

트립토판 (Trp)은 ROS, 예컨대 히드록실 라디칼 및 일중항 산소의 존재 하에 산화 및 친전자성 첨가 반응을 겪는 전자 풍부 아미노산이다. 단백질에서의 Trp 산화를 방지하는 임의의 잠재적 항산화제는 이들 ROS에 대해 우월한 반응성은 아닐지라도 유사한 반응성을 가져야 한다. L-Trp 구조를 기재로 하거나 또는 항산화제 특성을 갖는 것으로 보고된 일련의 화합물을 평가하였다. 이 연구에서 항산화제 능력에 대해 스크리닝된 화합물은 트립토판, 인돌, 방향족 산, 예컨대 살리실산 및 안트라닐산, 및 일부 비타민의 유도체를 포함하였다. 사용된 다양한 화합물의 화학 구조는 하기 (A) 트립토판 유도체 (B) 키누레닌 (C) 인돌 유도체 및 (D) 방향족 산 유도체를 기재로 하였다:

(A) 트립토판 유도체

(B) 키누레닌

(C) 인돌 유도체

(D) 방향족 산 유도체

감광성 스크리닝 검정으로부터 수득한 후보 항산화제 화합물.

L-Trp는 특정 상황 하에 유효한 항산화제일 수 있으나, 그의 감광성은 특별한 예방조치 없이 정상적인 프로세싱 동안에 그의 유용성을 제한할 수 있다. 따라서, 상기 분자의 감광성을 조사하고, 분자를 L-Trp에 대한 그의 H₂O₂ 생성 능력에 대해 평가하였다. 스크리닝 도구로서, 항산화제 후보를 4시간 동안 250 W/m²에서 광에 노출시키고, 생성된 H₂O₂ 형성을 암플렉스 울트라 레드 검정에 의해 정성분석하였다. 특히, 항산화제를 pH 5.5에서의 20 mM 히스티딘 아세테이트 완충제 중에 1 mM로 제조하였다. 1 mM 항산화제 용액을 유리 바이알 (2 mL/유리 바이알)로 분취하고, 아틀라스 선테스트 CPS+ 크세논 테스트 인스트루먼트 (일리노이주 시카고)에서 250 W/m²에서 4시간의 광에 노출시켰다. 총 UV 용량은 90 와트-시간/제곱 미터였고, 총 가시광 용량은 4-시간 기간에 걸친 220000 룩스 시간이었다. 대조군 바이알을 알루미늄 호일로 랩핑하고, 유사하게 처리하였다. 광에의 노출 후 생성된 과산화수소의 양을 암플렉스® 울트라 레드 검정 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 제조업체의 권장 절차에 따라 측정하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 첨가한 후, 염료는 1:1 화학량론적으로 H₂O₂와 반응하여 형광 산화 생성물 레조루핀의 생성을 초래하였다. 이 연구에서, 스펙트라 맥스(Spectra Max) M2 마이크로-플레이트 리더(Micro-plate Reader) (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 각각 560 nm 및 590 nm에서의 여기 및 방출 설정에 의해 형광 판독을 수득하였다. 최종 H₂O₂ 농도를 0 μm 내지 20 μm 범위의 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.

광 노출 시 트립토판 유도체에 의한 과산화수소 (H₂O₂)생성의 분석은 광 (4-시간 기간에 걸친 220000 룩스 시간에 상응함) 및 완충제 (20mM L-His-아세테이트, pH 5.5)의 유사한 조건 하에 L-Trp와 비교하여 5-히드록시-L-트립토판 (5-HT)이 약 10분의 1의 H₂O₂를 생성하는 한편, 키누레닌이 약 5분의 1의 H₂O₂를 생성하는 것을 제시하였다 (도 4A). 다른 트립토판 유도체는 대충 L-Trp에 의해 생성된 H₂O₂의 30% 내지 105%를 생산하였다. L-Trp과 비교하여, 트롤록스 (수용성 비타민 E 유도체)는 123배 많은 H₂O₂를 생산하고, 피리독신 (비타민 B6)은 5배 많은 H₂O₂를 생산하였다 (표 1). L-Trp와 유사한 기본 구조를 갖는 인돌은 L-Trp와 유사하게 작용하였으나, 인돌-3-아세트산은 2배의 H₂O₂를 생산하였다 (도 4B). 인돌의 히드록시 유도체는 이들이 광 노출 시 무시할만한 양의 H₂O₂를 생산한다는 점에서 5-HT와 같이 작용하였다. L-Trp의 몇몇 생화학적 관련 유도체, 즉 트립타민, 세로토닌 및 멜라토닌을 또한 시험하였다. 트립타민은 L-Trp와 비교하여 약 절반만큼의 H₂O₂를 생산하였다 (표 1). 흥미롭게도, 세로토닌 (5-히드록시트립타민)은 인돌 및 트립토판의 5-OH 유도체와 같이 작용하여 광 노출 시 매우 적은 H₂O₂를 생산한 한편, 멜라토닌 (N-아세틸-5-메톡시트립타민)은 L-Trp에 의해 생성된 H₂O₂의 3분의 1보다 적게 생산하였다.

<표 1> 시험된 화합물 및 L-Trp 사이의 과산화수소 생산 비

광-조사 동안에 형성된 ROS를 이해하기 위해, 50 mM NaN₃, 공지된 일중항 산소 켄처의 존재 하의 Trp 유도체 중 몇몇을 상기 기재된 바와 같이 광 노출 하에 시험하였다. 모든 시험된 화합물은 이러한 조건 하에 생성된 과산화수소의 양의 실질적인 감소를 나타내었으며, 이는 일중항 산소가 Trp 및 그의 유도체의 광-조사 시 생성된 주요 ROS인 것을 나타내었다 (도 5).

다른 방향족 화합물, 예컨대 살리실산 및 유도체를 또한 그의 보고된 항산화제 특성을 기반으로 시험하였다 (Baltazar et al., Curr Med Chem 18(21):3252-64 (2011)). 살리실산은 광 노출 시 매우 적은 H₂O₂를 생성하는 한편, 그의 5-OH 유도체는 L-Trp와 같이 작용하였다 (표 1). 다른 한편으로는, 안트라닐산은 L-Trp의 2배의 H₂O₂를 생산하였지만, 5-OH-안트라닐산은 L-Trp와 비교하여 절반의 H₂O₂를 생산하였다 (표 1).

CV 스크리닝 검정으로부터 수득된 후보 항산화제 화합물.

감광성 스크리닝 검정으로부터의 결과를 기준으로 하여, 방향족 고리 치환을 갖는 화합물은 생성된 과산화수소의 양에 영향을 미치는 것으로 보였다. 단백질 약물 보다 부형제의 우선적인 산화가 목표였기 때문에, 낮은 산화 전위를 갖는 부형제는 유효한 항산화제로 작용할 수 있었다. 화합물의 산화/환원 특징을 조사하였다. 몇몇 화합물, 예컨대 L-Trp 및 유도체는 순환 전압전류법 (CV)을 사용하여 단백질에서의 Trp 산화의 보호에 대해 평가하였으며, 그의 산화 전위를 기준으로 하여 등급을 순서매겼다 (표 2). 구체적으로, 후보 항산화제를 탈이온수 중에 용해시킨 다음, 0.2 M 과염소산리튬 전해질 용액에 첨가하였다. 작업 전극으로서 모델 616 RDE 유리질 탄소 전극을 갖는 EG&G 프린스턴 어플라이드 리서치(Princeton Applied Research) 모델 264A 폴라로그래프/전압전류계를 사용하여 용액을 특성화하였다. 용액을 100 또는 500 mV/초의 스캔 속도에서 -0.10 V에서 +1.50 V까지 스캐닝하였다. 분석 세포를 4분 동안 질소로 퍼징한 후, 각각의 항산화제 용액을 스캐닝하였다. 입력은 작업 전극의 전위의 선형 스캔이고, 출력은 생성된 전류의 측정이었다. 전위를 스캐닝함 (선형적으로 증가 또는 감소시킴)에 따라, CV 세포에서의 전기화학적 활성 종은 연속적으로 측정되는 전류를 초래하는 작업 전극의 표면에서 산화 및 환원 반응을 겪었다. 산화환원 반응은 전류의 급격한 증가 또는 감소 (피크)에 의해 특성화하였다. 산화 반응이 일어나는 전위는 애노드 피크 전위 (또는 산화 전위)로 지칭되고, 환원이 일어나는 전위는 캐소드 피크 (또는 환원) 전위로 지칭된다.

이 연구에서의 부형제의 산화 전위는 0.410 내지 1.080 V vs Ag/AgCl 범위였다 (표 2). 이들 조건 하에, L-Trp는 0.938 V vs Ag/AgCl의 비가역적 산화 전위를 가졌다. 9종의 화합물은 0.535 내지 0.600 V vs Ag/AgCl의 산화 전위를 갖는 모든 5-OH 화합물을 비롯하여, L-Trp보다 낮은 산화 전위를 갖는 것으로 확인되었다. 시험된 모든 화합물 중, 5-아미노-DL-트립토판이 0.410 V에서의 최저 산화 전위를 갖는 반면에, N-아세틸 화합물 (0.730-0.880 V), 및 5-메톡시-DL-트립토판 (0.890 V)이 또한 L-Trp 미만이었다. 7종의 화합물은 L-Trp보다 높은 산화 전위를 가졌다 (표 2). 이들은 인돌-3-아세트산, 5-플루오로-L-트립토판, 트립타민, L-트립토판아미드, L-키누레닌, 5-니트로-DL-트립토판, 및 살리실산이었다. 살리실산은 이 연구에서 최고 산화 전위를 가졌다 (1.080 V vs Ag/AgCl). 모든 시험된 화합물은 일단 산화되면 종이 전자를 받는 경향이 없고 아마도 추가의 전기화학 반응에 관여할 수 없는 것을 나타내는 비가역적 CV를 보였다.

<표 2> 부형제의 산화 전위

L-Trp의 것 초과 및 미만의 산화 전위, 및 L-Trp의 것 초과 및 미만의 H₂O₂ 생산 수준을 갖는 16종의 화합물에 대한 산화 전위와 광-유도 H₂O₂ 생성 사이의 상관관계를 결정하였다 (도 6). 인돌 및 트립토판은 광 노출 하에 H₂O₂ 생산에서 유사하게 작용하기 때문에, 5원 고리의 C₃ 위치 상의 치환이 이 특성에 영향을 미치지 않는 것이 가능하다. 그러나, -CH₂CH₂NH₂ 치환을 갖는 트립타민 및 C₃ 위치에서의 -CH₂COOH 치환을 갖는 인돌-3-아세트산은 각각 L-Trp보다 2배 미만 및 2배 초과의 H₂O₂를 생산하였다. 이들 데이터는 C₃ 치환이 광-활성화 및 퍼옥시드 생성에 역할을 하는 것으로 나타내었다. C₃ 치환은 분자의 산화 전위에 영향을 미치지 않는 반면에, 인돌 그 자체는 이러한 실험 조건 하에 L-Trp보다 유의하게 낮은 산화 전위를 가졌다. 6-원 방향족 고리의 C₅에서의 치환은 꽤 예측가능하게 작용하였다. 일반적으로, 전자 주는 기, 예컨대 -NH₂ 및 -OH를 갖는 화합물은 그의 모 화합물보다 낮은 산화 전위를 가졌으며 또한 광-활성화 시 낮은 수준의 H₂O₂ 생산을 나타내었다 (예를 들어 5-아미노-DL-트립토판, 5-히드록시인돌-3-아세트산, 5-히드록시-L-트립토판, 5-히드록시인돌, 세로토닌). 유사하게는, 높은 산화 전위를 갖는 화합물은 이러한 조건 하에 많은 H₂O₂를 생산하였다 (5-메톡시-DL-트립토판, L-Trp, 인돌-3-아세트산, 5-플루오로-L-트립토판). 이 상관관계에 예외가 존재하며; 일부 화합물은 높은 산화 전위를 가졌지만 많은 H₂O₂를 생산하지는 않았으며 (예를 들어 살리실산 및 L-키누레닌), 이는 L-Trp의 인돌 백본을 함유하는 화합물에 의해 관찰되지 않을 수 있는 이들 6원 방향족 화합물에 대해 중요한 역할을 하는 잠재적으로 다른 메카니즘이 존재한다는 것을 나타낸다. 광 노출 시 L-Trp보다 낮은 산화 전위 및 낮은 H₂O₂ 생산을 갖는 화합물을 함유하는 사분면이 관심 영역이었다 (도 6, 파선 상자). 이러한 2종의 특성을 갖는 화합물은 이들이 (1) 단백질 상의 Trp보다 빨리 산화되고 (2) 약물 제품 생산 동안의 장기간 저장 및/또는 주위 프로세싱 중에 매우 적은 H₂O₂를 생산할 수 있고, 따라서 이러한 조건 하에 추가의 산화로부터 단백질을 보호할 수 있기 때문에 새로운 후보 항산화제로서 고려되었다.

실시예 3: 후보 항산화제 화합물은 모노클로날 항체 제제의 산화를 감소시켰다.

L-Trp와 비교하여 광 처리 시 보다 적은 H₂O₂를 생산하는 화합물 뿐만 아니라 L-Trp보다 낮은 산화 전위를 갖는 것들을 산화성 스트레스 모델로서 AAPH, 광, 및 펜톤 반응을 사용하여 그의 가능한 항산화제 특성의 평가를 위해 선택하였다 (표 3). mAb1을 모델 단백질로서 사용하여 상이한 산화 스트레스 모델에 의한 Trp 산화에 대해 보호하는 선택 후보 항산화제의 유효성을 평가하였다. 각각의 스트레스 모델은 상이한 메카니즘을 통해 산화를 생산하였고, 따라서 각각은 생물제약 안정성의 평가에서 유익하였다. AAPH, 또는 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드를 스트레스 모델로서 사용하여 제제 부형제, 예컨대 분해된 폴리소르베이트로부터 잠재적으로 생성된 알킬 퍼옥시드를 모방하였다. AAPH의 분해는 단백질에서의 아미노산 잔기, 예컨대 메티오닌, 티로신, 및 트립토판 잔기를 산화시키는 것으로 나타난 알킬, 알콕실, 및 알킬 퍼옥실 라디칼을 생성하였다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Chao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):2969-74 (1997)). 유사하게는, 제어된 광을 스트레스 모델로서 사용하여 약물이 프로세싱 및 저장 동안에 겪을 수 있는 주위 광 노출을 모방할 수 있었다. 생물제약의 광-유도 산화는 일중항 산소 (¹O₂) 및/또는 슈퍼옥시드 음이온 (O₂ ^-) 메카니즘을 통해 진행하는 것으로 제시되었다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). 펜톤 반응이 또한 산화성 스트레스 모델로서 통상적으로 사용된다. H₂O₂ 및 Fe 이온의 이 혼합물은 금속 촉매된 히드록실 라디칼 메카니즘을 통해 산화를 생성하였으며 (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)), 약물 제조 및 저장에 사용된 스테인레스 스틸 표면으로부터 모델 금속 잔기에 사용되었다.

<표 3> 산화 스트레스 모델

mAb1 상의 트립토판 (W53) 산화를 RP-HPLC 및 LC-MS 방법을 사용하여 사전에 완전히 특성화하였다 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). 간략하게는, mAb1을 파파인으로 소화시켜 중쇄 (HC) Fab, HC Fc, 및 경쇄 단편을 생성하였다. 단편을 DTT로 환원시킨 다음, 분리하고, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)을 통해 확인하였다. HC Fab 및 HC Fc의 산화된 버전은 그의 천연 대응물보다 빨리 용리시키는 것으로 확인되었다. 산화된 것 및 천연 피크 하에 통합된 면적의 비교를 사용하여 HC Fab 및 Fc 산화를 정량화하였다. 추가로, LC-MS/MS 펩티드 맵 (트립신 소화에 의함 및 Lys-C 소화에 의함)은 HC Fab의 산화가 주로 Trp 잔기인 W53인 한편, HC Fc의 산화는 주로 2개의 Met 잔기인 M254 및 M430의 산화에 기인하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 파파인 소화 RP-HPLC 방법을 사용함으로써, HC Fab 산화의 정량화에 의한 Trp 잔기 산화, 및 HC Fc 산화의 정량화에 의한 Met 잔기 산화를 조사하는 것이 가능하였다.

% Fab 산화 및 % Fc 산화를 하기와 같이 계산하였다 (각 항체 분자가 2개의 Fab를 가지며; 따라서, 수득한 % Fab 산화는 Fab 산화를 함유하는 % 산화된 무손상 항체를 반영하지 않는다는 것을 주목함):

mAb1 광 스트레스 연구의 경우에, mAb1를 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20의 제제 중에 5 mg/mL로 제조하였다. 항산화제를 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20 중에 제조한 10 mM 원액으로부터 1 mM (최종 농도)로 첨가하였다. 예외적으로, L-Met는 동일한 완충제 (즉, 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20) 중 200 mM L-Met의 원액으로부터 1, 10, 25, 50, 및 100 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 이들 제제를 함유하는 유리 바이알을 주위 온도에서 아틀라스 선테스트 CPS+ 크세논 테스트 인스트루먼트 (일리노이주 시카고)에서 250 W/m² 광에 노출시켰다. 대조군 바이알을 알루미늄 호일에 랩핑하고, 유사하게 처리하였다. 광 노출 후, 용액을 상기 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의한 분석을 위해 제조하였다.

mAb1 AAPH 스트레스 연구의 경우에, mAb1을 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20의 제제 중에 4 mg/mL로 제조하였다. 항산화제를 20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20 중에 제조한 10 mM 원액으로부터 1 mM (최종 농도)로 첨가하였다. 200 μL의 10 mM AAPH를 2 mL의 각 mAb1 용액에 첨가한 다음, 40℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 최종 mAb1 농도가 2.3 mg/mL이도록 PD-10 칼럼을 사용하여 각각의 용액을 제제 완충제 (20 mM 히스티딘 아세테이트 pH 6.0, 250 mM 트레할로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 20)와 완충제 교환하였다. 완충제 교환 후, 각각의 용액을 상기 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의한 분석을 위해 제조하였다.

mAb1 펜톤 스트레스 연구의 경우에, mAb1을 20 mM 히스티딘 히드로클로라이드 pH 6.0의 제제 중에 3 mg/mL로 제조하였다. 항산화제를 20 mM 히스티딘 히드로클로라이드 중에 제조한 10 mM 원액으로부터 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 0.2 mM FeCl₃의 최종 농도 및 10 ppm H₂O₂를 각각의 mAb1 용액에 첨가한 다음, 40℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 반응물을 100 mM L-Met (20 mM 히스티딘 히드로클로라이드 중 200 mM L-Met의 원액으로부터 제조함)의 첨가에 의해 켄칭한 다음, 상기 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의한 분석을 위해 제조하였다.

이는 24시간 동안 40℃에서 AAPH와 함께 mAb1을 인큐베이션하는 것은 27% Fab (Trp 잔기) 산화 (도 7A) 및 47% Fc (Met 잔기) 산화 (도 7B)를 초래하는 것으로 결정하였다. 광 스트레스 및 순환 전압전류법을 사용하여 사전에 스크리닝된 7종의 부형제를 AAPH 조건 하에 mAb1와 함께 인큐베이션하여 항산화제 능력을 평가하였다. 7종의 화합물 중 6종은 AAPH-유도 Fab 산화를 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다 (도 7A). 이들 화합물 중 모든 6종은 인돌 백본을 함유하였다. 더욱이, 시험된 모든 히드록시 유도체 (5-히드록시-L-Trp, 5-히드록시인돌, 7-히드록시인돌, 및 세로토닌)는 대조군 수준 (약 2%)과 근접하게 Fab 산화를 감소시켰다. 한편, 살리실산은 AAPH 스트레스 하에 Fab 산화에 대한 효과가 거의 없었다. 부형제 중 어느 것도 AAPH-유도 Fc 산화의 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 보여졌다 (도 7B).

광 스트레스 연구의 경우에, 상기 언급된 7종의 부형제를 시험하면서, mAb1을 250 W/m²에서 16시간의 광에 노출시켰다 (도 8). 광에의 mAb1의 노출 ("부형제 없음")은 대조군 수준 ("mAb1 Ref Mat", 도 8A)에 비해 Fab 산화를 3.5배 증가시켰다. 이는 L-Trp가 모델 단백질 부갑상선 호르몬 (PTH)에서 Trp 산화에 대해 보호할 수 있다는 것을 이전에 확인하였다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). 그러나, 이 연구는 mAb1에의 1mM L-Trp의 첨가가, 아마도 광-노출 L-Trp에 의한 ROS, 예컨대 일중항 산소의 생산을 통해 Fab 산화를 11-배 초과로 증가시키는 것을 확인하였다 (도 2). 히드록시 화합물 (5-히드록시-L-Trp, 5-히드록시인돌, 7-히드록시인돌, 및 세로토닌)의 첨가는 거의 대조군 수준으로 Fab 산화를 감소시키면서, 광-유도 Fab 산화에 대해 보호하였다 (도 8A). 다른 한편으로는, 살리실산은 대조군 수준에 비해 Fab 산화를 8-배 증가시키면서, L-트립토판아미드와 유사하게 수행하였다. 광 스트레스 하의 Fc 산화에 대해 유사한 결과가 관찰되었다 (도 8B). mAb1의 광 노출은 대조군 수준에 비해 Fc 산화의 40% 증가를 초래하는 반면, L-Trp의 첨가는 Fc 산화를 대조군 수준 7배로 증가시켰다. 대조군 (부형제 없음)과 비교하여, L-트립토판아미드 및 살리실산은 또한 많은 Fc 산화를 초래하였다. 히드록시 화합물은 광 노출 하에 L-Trp보다 훨씬 적은 ROS를 생산하기 때문에 잠재적으로 부형제 없음 대조군과 유사한 Fc 산화를 생산하였다. 실시예 2에서의 광 스크리닝 및 NaN₃ 연구 결과는 부형제에 의해 생성된 H₂O₂의 양과 mAb1의 Fc Met 산화 사이의 우수한 상관관계를 나타내었다.

H₂O₂ 및 Fe 이온의 혼합물을 사용한 펜톤 반응은 금속 촉매된 히드록실 라디칼 반응을 통한 산화를 생성하였다 (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)). 이 반응은 mAb1에서의 Fab, 즉 트립토판, 산화를 생성하였다. 상기 보고된 바와 같이 AAPH 및 광 유도 산화 둘 다에 대해 유용한 선택 항산화제의 존재 하에 반응을 또한 수행하였다. 펜톤 매개 반응에 대한 항산화제 특성과 관련된 데이터를 상기 기재된 바와 같은 RP-HPLC 검정을 사용하여 분석하였다 (도 9). 시험된 조건 하에, 펜톤 반응은 대조군에 비해 mAb1의 Fab 영역에서 산화를 약 4배 생산하였다. 살리실산을 제외한 대부분의 시험된 항산화제는 L-Trp에 유사한 히드록실 라디칼 켄칭 특성을 제시하였으며, 이는 부형제 없음 경우에 대해 Fab 산화를 약 25% 보호하였다 (도 9A). Fc 산화에 대한 보호와 관련하여, (살리실산 이외의) 시험된 부형제는 L-Trp보다 약간 우수하게 수행하였다 (도 9B).

방향족 고리 상의 전자 주는 치환은 인돌릴 라디칼 양이온의 형성 및 라디칼과의 잠재적으로 보다 빠른 반응성을 용이하게 할 수 있다. 산소 원자가, 보다 낮은 산화 전위 및 친전자성 공격에의 잠재적으로 보다 큰 감수성으로 이어지는 공명 구조에 관여할 수 있는 전자의 고립 쌍을 갖기 때문에, 방향족 고리에 부착된 히드록실 기는 전자 공여자이다. 표 2에서 확인된 바와 같이, 히드록실 치환은 실질적으로 보다 낮은 산화 전위로 이어지며, 이는 이들 화합물이 L-Trp 및/또는 인돌보다 우수한 항산화제를 제조할 수 있다는 것을 나타내었다. 히드록실 치환된 인돌 및 Trp 유도체는 또한 광 조사 시 최소량의 과산화수소를 생산하였다 (표 1). 이는 5-히드록시-L-트립토판에 대해 입증된 바와 같은 그의 높은 켄칭 상수와 연관된, 광 에너지를 분자 산소에 전달함에 있어 이들 분자의 낮은 양자 효율로 인한 것일 수 있다 (Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)). 도 7 및 도 8에 제시된 바와 같이, 히드록실 치환된 인돌 및 트립토판 유도체는 mAb1의 Fab 영역에서 W53에의 AAPH, 광 및 펜톤 유도 산화에 대한 상당한 보호를 제공하였다. 그러나, 이들 화합물 중 어떤 것도 AAPH 유도 분해에서 mAb1의 Fc 영역에서의 Met 산화에 대한 유의한 항산화제 보호를 제공하지는 않았다. 대조적으로, 인돌 및 트립토판 유도체는 광 매개 산화 하에 기대된 바와 같이 작용하였다. 광활성화 시 보다 높은 양의 퍼옥시드를 생산하는 분자 (예를 들어, L-Trp 및 Trp-아미드)는 또한 mAb1의 Fc 영역에서 보다 높은 Met 산화를 생산하는 한편, -OH 유도체는 보다 낮은 H₂O₂를 생산하고, 또한 광-산화 조건 하의 Fc 영역에서의 최저량의 Met 산화를 생산하였다. 메티오닌은 친핵성 치환 반응을 통해 H₂O₂ 및 알킬 퍼옥시드에 의해 메티오닌 술폭시드로 용이하게 산화되었다 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). 메티오닌 술폭시드으로의 메티오닌의 광-산화는 일중항 산소를 통해 발생하지만, 이 반응은 상이한 중간체를 통해 발생한다 (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). AAPH는 열 스트레스 하에 분해되어 각각 Met 및 Trp에 대한 상이한 반응성을 갖는 알킬 퍼옥시드 및 알콕실 라디칼 둘 다를 제공하였다 (Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)). 이전 연구는 L-Trp가 AAPH에 의해 유도된 PTH에서 Trp 산화를 방지할 수 있으며 L-Trp가 동일한 조건 하에 PTH에서 Met 산화를 방지하지 않는다는 것을 제시하였다 (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). 유사하게는, L-Met는 AAPH 유도 산화에 대해 PTH를 보호할 수 있지만, Trp 산화를 보호하지 않았다. 이러한 관찰은 Met 산화가 주로 친핵성 치환 반응을 통하는 반면에 Trp 산화가 주로 자유 라디칼 메카니즘을 통하는 반응 메카니즘과 유사하였다.

일중항 산소로 및 궁극적으로 H₂O₂로 이어지는 L-Trp의 광활성화의 추정 메카니즘 및 5-HT에 의한 일중항 산소의 형성 및 켄칭을 도 10에 제시하였다.

Claims

단백질 및 액체 제제에서의 상기 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 액체 제제.

상기 식에서 R²는 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;
R³은 수소, 히드록실, -COOH, -CH₂COOH, 및 -CH₂CHR^3a(NH₂)로부터 선택되고; 여기서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;
단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.

상기 식에서 R² 및 R³은 독립적으로 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;
단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.

상기 식에서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;
R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며, 단 R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제1항에 있어서, R⁴, R⁵ 또는 R⁷이 히드록실인 제제.
제1항에 있어서, 화합물이 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여하는데 적합한 제약 제제인 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수성인 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 화합물이 약 0.3 mM 내지 약 5 mM인 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 화합물이 약 0.3 mM 내지 약 1 mM인 제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 단백질에서의 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 티로신, 및/또는 메티오닌의 산화를 방지하는 것인 제제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지하는 것인 제제.
제11항에 있어서, 반응성 산소 종이 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 과산화수소, 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 산화되기 쉬운 것인 제제.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에서의 트립토판이 산화되기 쉬운 것인 제제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체인 제제.
제15항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편인 제제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인 제제.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 제제.
제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는 제제.
단백질의 산화를 방지하는 화합물의 소정량을 단백질 제제에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 단백질 제제를 제조하는 방법.

상기 식에서 R²는 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;
R³은 수소, 히드록실, -COOH, -CH₂COOH, 및 -CH₂CHR^3a(NH₂)로부터 선택되고; 여기서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;
단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
단백질의 산화를 방지하는 화합물의 소정량을 제제에 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 단백질 제제에서의 단백질의 산화를 방지하는 방법.

상기 식에서 R²는 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;
R³은 수소, 히드록실, -COOH, -CH₂COOH, 및 -CH₂CHR^3a(NH₂)로부터 선택되고; 여기서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;
단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제20항 또는 제21항에 있어서, 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.

상기 식에서 R² 및 R³은 독립적으로 수소, 히드록실, -COOH, 및 -CH₂COOH로부터 선택되고;
R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며;
단 R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제20항 또는 제21항에 있어서, 화합물이 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.

상기 식에서 R^3a는 COOH 또는 수소이고;
R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷은 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되며, 단 R², R⁴, R⁵, R⁶, 및 R⁷ 중 1개는 히드록실이다.
제20항 또는 제21항에 있어서, R⁴, R⁵ 또는 R⁷이 히드록실인 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 화합물이 5-히드록시-트립토판, 5-히드록시 인돌, 7-히드록시 인돌, 및 세로토닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여하는데 적합한 제약 제제인 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 수성인 방법.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 화합물이 약 0.3 mM 내지 약 5 mM인 방법.
제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 화합물이 약 0.3 mM 내지 약 1 mM인 방법.
제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 단백질에서의 트립토판, 시스테인, 히스티딘, 티로신, 및/또는 메티오닌의 산화를 방지하는 것인 방법.
제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 반응성 산소 종이 일중항 산소, 슈퍼옥시드 (O₂-), 과산화수소, 히드록실 라디칼, 및 알킬 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 산화되기 쉬운 것인 방법.
제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질에서의 트립토판이 산화되기 쉬운 것인 방법.
제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체인 방법.
제35항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편인 방법.
제20항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중의 단백질 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인 방법.
제20항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 안정화제, 완충제, 계면활성제 및 등장화제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는 것인 방법.
L-트립토판과 비교하여 보다 낮은 산화 전위 및 보다 적은 감광성을 갖는 화합물을 선택하는 것, 및 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 선택된 화합물의 효과를 시험하는 것을 포함하는, 단백질 조성물에서의 단백질의 산화를 방지하는 화합물을 스크리닝하는 방법.
제40항에 있어서, 감광성이 광 노출 시 화합물에 의해 생산된 H₂O₂의 양을 기준으로 하여 측정되는 것인 방법.
제41항에 있어서, L-트립토판에 의해 생산된 H₂O₂의 양의 약 10% 미만을 생산하는 화합물이 선택되는 것인 방법.
제40항에 있어서, 산화 전위가 순환 전압전류법에 의해 측정되는 것인 방법.
제40항에 있어서, 선택된 화합물이, 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드 (AAPH), 광 및/또는 펜톤 시약에 의해 생성된 반응성 산소 종에 의한 단백질의 산화를 방지하는 것에 대한 효과에 대해 시험되는 것인 방법.