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KR20150094696A - 세포내 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하여 생물활성제에 의한 세포 표적 결합의 인식 - Google Patents

세포내 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하여 생물활성제에 의한 세포 표적 결합의 인식 Download PDF

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KR20150094696A
KR20150094696A KR1020157018230A KR20157018230A KR20150094696A KR 20150094696 A KR20150094696 A KR 20150094696A KR 1020157018230 A KR1020157018230 A KR 1020157018230A KR 20157018230 A KR20157018230 A KR 20157018230A KR 20150094696 A KR20150094696 A KR 20150094696A
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토마스 커클랜드
토마스 마흐라이트
레이첼 에프. 오하나
매트 로버스
키이스 우드
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Abstract

본 발명은 세포 표적과 생물활성제의 세포내 결합의 검출 및 분석을 위한 조성물과 방법을 제공한다. 특히, 형광단과 테더링된(tethered) 생물활성제, 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적, 또는 생물발광 리포터의 부분, 성분, 또는 하위단위, 그리고 이와 함께 세포 표적과 생물활성제의 상호작용을 검출하고 분석하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.

Description

세포내 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하여 생물활성제에 의한 세포 표적 결합의 인식{RECOGNITION OF CELLULAR TARGET BINDING BY A BIOACTIVE AGENT USING INTRACELLULAR BIOLUMINESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER}
관련된 출원의 교차-참조
본 출원은 2012년 12월 12일에 제출된 미국 특허 가출원 일련 번호 제61/736,429호; 2013년 3월 15일에 제출된 미국 특허 가출원 일련 번호 제61/794,461호; 그리고 2013년 9월 19일에 제출된 미국 특허 가출원 일련 번호 제61/880,048호에 대한 우선권을 주장하며; 이들 각각은 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
분야
본 발명은 세포 표적과 생물활성제의 세포내 결합의 검출 및 분석을 위한 조성물과 방법을 제공한다. 특히, 형광단과 테더링된(tethered) 생물활성제, 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적, 또는 생물발광 리포터의 부분, 성분, 또는 하위단위, 그리고 이와 함께 세포 표적과 생물활성제의 상호작용을 검출하고 분석하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
배경
세포 표적과 분자종과의 상호작용은 세포 생리학을 이해하고 치료적 개입, 가령 새로운 합성 약물 및 생물 약제를 개발하는 데에서 매우 중요하다. 이들 상호작용이 그들의 표현형 반응을 매개하는 경우 특히 생세포 내에서 표적 인게이지먼트(target engagement)를 정확하게 그리고 효율적으로 결정하기 위한 방법을 필요로 한다. 표적 인게이지먼트를 영향적으로 조사하는 능력은 범위가 고속-대량 스크리닝, 유효 약물에서 선도 약물로의 스크리닝의 최적화, 그리고 치료학적으로 관련 있는 세포 표적의 발견 및 특성화에 이르는, 발견 과정에 대한 광범위한 영향을 갖는다.
소분자 라이브러리를 이용한 표현형-기반 스크리닝은 약물 발견 분야에서 중요한 역할을 한다. 이러한 스크리닝 기법을 이용하여, 그들의 기본적인 세포 표적의 사전 지식 없이, 화합물 라이브러리는 표현형 반응을 유발하는, 가령 질병 증상을 완화시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝된다. 이 기법은 생물활성제, 가령 세포 생리학을 조절할 수 있는 소분자를 식별하는 데에 이용될 수 있는 반면에, 이들 소분자 유효물질(hits)의 생물학적 관련 표적을 결정하는 것은 주요한 기술적인 도전이다. 추가로 몇 가지 바람직한 표현형 반응을 촉진하는 소분자는 오프-타깃(off-target) 상호작용으로 인한 생체내 불이익을 제기할 수 있다. 약물 선별성을 예측하고 잠재적인 부작용을 최소화하기 위하여, 오프-타깃 상호작용 (가령, 더 낮은 친화도)을 식별하는 것이 또한 중요하다. 오늘날 생물활성제의 표적을 식별하기 위해 이용되는 대부분의 방법은 선별적인 모이어티 (가령, 생물활성제 또는 관련된 화합물)를 함유한 "이중-기능화된" 화합물을 이용하여 그리고 모이어티를 분류하여 (가령, 친화도 태그 또는 고형 지지체), 복합 세포 용해물로부터 이들 표적의 강화에 의존한다. 강화가 화합물의 결합 특성에 기반하기 때문에, 그들의 표적에 대한 이들 화합물의 내재 친화도가 불충분한 경우, 표적과 공유 결합하도록 (가령, 광-가교) 화합물 유사체가 설계된다. 어느 하나의 기법으로도, 표적 단리의 효능 및 특이성은 필수적이고, 그리고 이들 방법의 실패률은 높다. 이들 기법의 실패는 표적의 불충분한 포획 또는 비-특이적 포획으로 인한 높은 백그라운드(background) 때문일 수 있다. 이 실패에 기여하는 요인은 다음을 포함한다: 검출하기 어려운 이들의 상대적으로 약한 상호작용으로 중저(low to moderate) 친화도를 가진 다수의 표적을 결합시키는 화합물; 검출된 상호작용을 특성화하기 위한 강력하고, 간단하고, 편파적이지 않은 기술의 결핍; 상호작용이 의존할 수 있는 고유 세포 환경 내에서 표적 단리를 수행하는 것에 대한 무능력; 세포내 표적의 결합 효력에 대해 제공된 제한적인 정보; 그리고 고형 지지체 또는 기능화된 소분자와의 비-특이적 결합으로 인한 위양성(false positive) 상호작용의 높은 백그라운드.
요약
몇몇 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 BRET 어세이 시스템을 제공한다: (a) 발색단 (가령, 형광단)과 테더링된 생물활성제; (b) 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적; 및 (c) 생물발광 리포터를 위한 기질. 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 소분자이다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 단백질 기능의 저해제, 가령 효소 저해제 또는 수용체 저해제이다. 몇몇 구체예에서, 발색단은 형광단이다. 몇몇 구체예에서, 형광단은 카르복시 로다민 유사체이다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터는 서열 번호: 1과 적어도 70% 서열 동일성 (가령, 75% 동일성... 80% 동일성... 85% 동일성... 90% 동일성, 95% 동일성... 98% 동일성... 99% 동일성)을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, (b)는 생물발광 리포터의 일부분, 또는 하위단위, 또는 성분과 융합된 세포 표적이다. 몇몇 구체예에서, (b)는 발광을 생성하기 위해 또 다른 폴리펩티드와의 상호작용을 요구하는 폴리펩티드와 융합된 세포 표적이다. 몇몇 구체예에서, (a)와 (b)는 세포 내에 있다. 몇몇 구체예에서, (b)는 관심 단백질, 가령 세포 표적과의 융합 단백질로서 새포 내에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적은 하나보다 더 많은 성분, 하위단위, 또는 폴리펩티드로 구성되고, 가령 세포 표적은 단백질 복합체이다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터는 하나보다 더 많은 성분, 하위단위 또는 폴리펩티드로 구성되고, 가령 생물발광 리포터는 단백질 복합체이다. 몇몇 구체예에서, (a)는 세포외에 첨가되고 세포로 들어간다. 몇몇 구체예에서, (a)는 세포 내에 그리고 세포를 둘러싼 배지에 모두 존재한다. 몇몇 구체예에서, (a)는 세포와 결합되어 그리고 세포를 둘러싼 배지에 모두 존재한다. 몇몇 구체예에서, 주위 배지에 존재하는 (a)의 양은 세포에서의 양 또는 세포와 결합된 양보다 유의적으로 더 크다, 가령, 적어도 2배, 적어도 5배, 10배, 30배, 또는 100배만큼 더 크다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적은 생물활성제의 결합 파트너이다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 방출 스펙트럼은 형광단의 흡수 스펙트럼과 중첩된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적과 생물활성제의 결합시, 생물발광 리포터에 의한 기질에서 반응 산물로의 전환은 BRET에 의한 형광단의 여기(excitation) 및 형광단으로부터 형광 방출을 야기한다. 몇몇 구체예에서, (a)는 발색단과 테더링된 작용제 또는 화합물의 라이브러리(library) 중 하나이다. 몇몇 구체예에서, (a)는 형광단과 테더링된 작용제 또는 화합물의 라이브러리 중 하나이다. 몇몇 구체예에서, (b)는 생물발광 리포터와 융합된 다수의 잠재적인 세포 표적 중 하나이다. 몇몇 구체예에서, (b)는 생물발광 리포터와 융합된 다수의 잠재적인 세포 표적 중 하나이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 세포 표적과 생물활성제의 결합을 검출하고, 분석하고, 특성화하는 등의 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적은 1차 약물 표적일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적은 생체내 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수도 있는 오프-타켓 불이익이다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제에 의한 세포 표적과의 결합은 분별되지 않는 생물학적 효과를 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 (a) 발색단 (가령, 형광단)과 테더링된 생물활성제; (b) 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적; 및 (c) 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적 중 하나 이상 (가령, 각각)을 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적과 생물활성제의 결합은 비-공유성이다. 몇몇 구체예에서, 발색단은 형광단이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 생물활성제 및 세포 표적 사이의 상호작용의 검출을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 제1 파장에서 에너지를 방출하는 생물발광 리포터와 상기 세포 표적의 융합물을 세포에서 발현시키는 단계 (가령, 파장의 범위, 분광 분포 등); (b) 형광단과 테더링된 상기 생물활성제와 상기 세포를 접촉시키는 단계, 여기서 상기 형광단은 상기 제1 파장에서 에너지를 수용하고 제2 파장에서 에너지를 방출함 (가령, 파장의 범위, 분광 분포 등); (c) 상기 생물발광 리포터를 위한 기질과 상기 세포를 접촉시키는 단계; (d) 상기 제2 파장에서 에너지를 검출하는 단계, 여기서 상기 제2 파장에서 상기 에너지의 존재는 상기 세포 표적과 상기 생물활성제의 상호작용을 명시함.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 생물활성제 및 세포 표적 사이의 상호작용의 검출을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 세포 표적 및 생물발광 리포터의 융합물을 제공하는 단계; (b) 발색단 (가령, 형광단)과 테더링된 상기 생물활성제와의 상기 융합물을 접촉시키는 단계; (c) 상기 리포터를 위한 기질과의 상기 융합물을 접촉시키는 단계; (d) 상기 발색단의 부재에서 상기 기질과 접촉된 상기 융합물과 비교하여 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화를 검출하는 단계. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 제2 생물활성제 및 세포 표적의 상호작용의 검출을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 세포 표적 및 생물발광 리포터의 융합물을 제공하는 단계; (b) 발색단 (가령, 형광단)과 테더링된 제1 생물활성제 및 상기 제2 생물활성제 둘 모두와 상기 융합물을 접촉시키는 단계; (c) 상기 리포터를 위한 기질과 상기 융합물을 접촉시키는 단계; (d) 상기 제2 생물활성제의 부재에서 상기 제1 생물활성제 및 상기 기질과 접촉된 상기 융합물과 비교하여 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화를 검출하는 단계. 몇몇 구체예에서, 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화는 상기 제2 생물활성제에 의한 상기 제1 생물활성제의 이동에 의해 야기된다. 몇몇 구체예에서, 상기 이동은 경쟁적 이동이다. 몇몇 구체예에서, 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화는 세포 표적과 생물활성제의 결합 친화도를 추정하는 데에 이용된다. 몇몇 구체예에서, 상기 제2 생물활성제는 다수의 생물활성제 중 하나이다. 몇몇 구체예에서, 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화는 세포 표적과 다수의 생물활성제의 상대적인 결합 친화도를 추정하는 데에 이용된다. 몇몇 구체예에서, 상기 제1 및 상기 제2 생물활성제는 합성 분자이다. 몇몇 구체예에서, 상기 세포 표적은 생세포에서, 투과성 세포 또는 세포 용해물이다. 몇몇 구체예에서, 방출된 빛의 분광 분포에서의 변화는 두 가지 상이한 파장, 또는 파장의 두 가지 상이한 범위에서 빛 강도의 비를 측정함으로써 결정된다. 몇몇 구체예에서, 시간이 지남에 따라 분광 분포에서의 변화가 검출된다. 몇몇 구체예에서, 발색단은 형광단이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 BRET 어세이 시스템을 제공한다: (a) 형광단과 테더링된 생물활성제; (b) 생물발광 리포터의 구조적으로 상보적인 펩티드와 융합된 제1 상호작용 파트너; (c) 생물발광 리포터의 구조적으로 상보적인 폴리펩티드와 융합된 제2 상호작용 파트너; 및 (d) 생물발광 리포터를 위한 기질, 여기서 제1 및 제2 상호작용 파트너는 상호작용 복합체를 형성하기 위해 상호작용하고, 제1 상호작용 파트너, 제2 상호작용 파트너, 및/또는 상호작용 복합체는 생물활성제를 위한 결합 파트너임. 몇몇 구체예에서, 제1 상호작용 및 제2 상호작용은 단백질 또는 단백질 복합체를 형성하기 위해 상호작용하는 폴리펩티드이다. 몇몇 구체예에서, 제1 상호작용 및 제2 상호작용은 구조적으로 상보적인 폴리펩티드의 상호작용에 의해 함께 합쳐진다. 몇몇 구체예에서, 구조적으로 상보적인 폴리펩티드는 제1 상호작용 및 제2 상호작용의 상호작용에 의해 함께 합쳐진다. 몇몇 구체예에서, 제1 상호작용 및 제2 상호작용의 상호작용은 발광에서의 증가에 의해 결정된다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 상호작용 파트너는 생물활성제의 존재 또는 부재에서 상호작용 복합체를 형성한다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 복합체는 생물활성제를 위한 결합 파트너이지만, 제1 또는 제2 상호작용 파트너 단독으로는 어느 것도 생물활성제를 위한 결합 파트너가 아니다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 파트너 중 하나는 생물활성제를 위한 결합 파트너이지만, 다른 하나는 그렇지 않다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 복합체 형성은 상호작용 파트너와 생물활성제의 결합을 요구한다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 복합체 형성은 생물활성제의 결합과 무관하다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 BRET 어세이 시스템을 제공한다: (a) 형광단과 테더링된 생물활성제; (b) 생물발광 리포터의 구조적으로 상보적인 펩티드와 융합된 세포 표적; (c) 생물발광 리포터의 구조적으로 상보적인 폴리펩티드; 및 (d) 생물발광 리포터를 위한 기질. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드는 활성 생물발광 리포터 효소를 형성하는 것에 연관된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적과 생물활성제의 결합시 그리고 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드의 연합시 생물발광 리포터 효소에 의한 기질에서 반응 산물로의 전환은 BRET에 의한 형광단의 여기 및 형광단으로부터의 형광 방출을 야기한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 어세이 시스템을 제공한다: (a) 형광단과 테더링된 생물활성제; (b) 생물발광 리포터의 상보적인 펩티드와 융합된 제1 결합 파트너; (c) 생물발광 리포터의 상보적인 폴리펩티드와 융합된 제2 결합 파트너; 및 (c) 생물발광 리포터를 위한 기질. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드는 활성 생물발광 리포터 효소는 형성하는 것에 연관된다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 결합 파트너가 상호작용할 때, 생물활성제는 상호작용하는 파트너를 결합시키고 그리고 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드의 연합이 일어나며, 생물발광 리포터 효소에 의한 기질에서 반응 산물로의 전환은 BRET에 의한 형광단의 여기 및 형광단으로부터 형광 방출을 야기한다.
몇몇 구체예에서, 생물활성제는 형광 또는 발광 소광제(quencher) (가령, 댑실(Dabcyl))과 테더링된다. 이러한 구체예에서, 테더링되지 않은 생물활성제의 적정은 신호의 증가를 초래한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 시스템 성분 (가령, 생물활성제, 세포 표적 등)의 존재 및/또는 상호작용으로부터 기인한 BRET 신호 및/또는 형광의 위치 (가령, 세포내, 세포외 등)를 확인하고 및/또는 식별하기 위해 본 명세서에서 설명된 임의의 시스템의 이미징(imaging) (가령, 전자결합소자 카메라를 통한 BRET 이미징 등)을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법 (가령, 예시적인 구체예를 위해 실시예 23을 참고)은 추정되는 세포 표적의 패널(panel)에 대하여 생물활성제의 세포내 선별성 및 친화도의 측정을 위해 유용하다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제/세포 표적 복합체가 경쟁적으로 분열되기 때문에 BRET에 미치는 효과가 모니터링된다. 몇몇 구체예에서, 친화도는 경쟁적 분열을 통해 발생된 IC50 값에 의해 추론된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적의 개별적인 도메인에 대한 저해제의 친화도는 세포 표적의 분리된 도메인과 생물발광 리포터의 유전적 융합을 통해 결정된다.
도면
도 1은 본 발명의 구체예의 도식적인 표현이다: (A) 형광단-테더링된 생물활성제 및 생물발광-리포터-테더링된 세포 표적; (B) 세포 표적과 생물활성제의 결합; (C) 리포터 기질의 첨가는 BRET를 야기함; 및 (D) 테더링되지 않은 생물활성제의 과다에 의한 이동은 BRET 및 형광의 손실을 야기함.
도 2는 생세포에서 NANOLUC-HDAC6 융합물에 대한 BRET 수용자로서 2개의 상이한 형광단-SAHA 유도체의 BRET 프로파일을 비교한 그래프를 보여준다.
도 3은 어세이 수행에서 발현의 희석 효과를 도시하는 그래프를 보여준다. 첫 번째 그래프는 NANOLUC-융합된 HDAC6으로부터 형광단-테더링된 SAHA의 경쟁적 이동을 이용하여 BRET 어세이 윈도우에서 낮아진 발현의 효과를 입증한다. 두 번째 그래프는 NanoLuc-히스타민 H1 수용체와 결합한 약물 추적자에 대한 관찰된 화합물 효능 (EC50), 그리고 BRET 어세이 윈도우 둘 모두에서 낮아진 발현의 효과를 보여준다.
도 4는 전구-약물 가공처리를 위한 세포 환경의 필수요건을 입증하는 그래프를 보여준다.
도 5는 불투과성 약물 추적자의 유입을 강화하기 위해 투과화제(permeabilization agent)를 이용하는 능력을 입증하는 그래프를 보여준다.
도 6은 NANOLUC-융합된 p38로부터의 형광단-테더링된 BIRB-유도체의 경쟁적 이동을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 7은 NANOLUC-융합된 p38로부터의 형광단-테더링된 BIRB 유도체의 동력학 측정을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 8은 예시적인 형광단-테더링된 생물활성제 및 본 명세서에서 설명된 구체예에서의 용도를 밝혀낸 다른 화합물을 보여준다.
도 9는 본 명세서에서 설명된 구체예 내에서 Renilla 루시퍼라아제 및 NanoLuc 루시퍼라아제와 p38 융합의 비교를 보여준다.
도 10은 NANOLUC 융합물의 발현이 내인성 수준에 가까울 때 백그라운드에 대해 최적의 신호를 가진 약물 추척자와의 고친화성 상호작용이 성취된다는 점을 보여준다.
도 11은 BIRB-TMR 접합체와 비교하여 BIRB-TOM 접합체와 결합하는 NanoLuc-p38알파에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 12는 BIM-TMR 접합체와 비교하여 BIM-TOM 접합체와 결합하는 PKC알파-NanoLuc에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 13은 생세포에서 특이적인 BRET 반응의 검출을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 14는 Jnk2, p38베타, 및 p38알파에 대한 PBI-4838의 친화도를 보여준다.
도 15는 Jnk2, p38베타, 및 p38알파에 대한 PBI-4838의 친화도를 보여준다.
도 16은 야생형 BRD4 대 돌연변이 BRD4에 대한 PBI-4966의 상대적인 친화도를 보여준다.
도 17은 구조적으로-구별되는 화합물이 본 발명의 방법을 이용하여 약물 추적자의 경쟁적 이동에 의해 식별될 수 있다는 점을 보여준다.
도 18은 세포에서 형광단 약물 접합체를 이용하여 약물/표적 상호작용을 모니터링하는 능력을 보여준다.
도 19는 TNT에서 특이적인 BRET 반응을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 20은 NanoLuc-EGFR과 형광으로-표지된 사이토카인의 결합의 측정을 도시하는 그래프를 보여준다. 치료학적 항체, 벡티빅스(Vectibix), 얼비툭스(Erbitux) 및 헤르셉틴(Herceptin)의 친화도는 또한, 사이토카인의 경쟁적 이동에 의해 입증된다.
도 21은 상보적인 펩티드 단독 (서열 번호: 4) 또는 효율적인 에너지 전이를 입증하는 TMR과의 상보적인 펩티드 (서열 번호: 4) 접합체로 보완된 상보적인 폴리펩티드 (서열 번호: 5)에 대한 파장 스캔을 포함한다.
도 22는 HaloTag (NL-HT)와 융합된 NanoLuc 그리고 형광 Non-ChloroTOM (NCT) 염료 (PBI-5074)와 연결된 상보적인 펩티드로 보완된 상보적인 폴리펩티드 (서열 번호: 6)에 대한 파장 스캔을 포함한다.
도 23은 삼차 상호작용의 도식을 보여주며, 여기서 생물발광 단백질의 구조적으로 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드의 복합체로의 에너지 전이는 상호작용 파트너의 상호작용을 측정하는 데에 또한 이용될 수 있다. 도식에서, 생물발광 단백질의 상보적인 폴리펩티드와 융합된 GPCR (제1 상호작용) 및 생물발광 단백질의 상보적인 펩티드와 융합된 GPCR 상호작용 단백질 (제2 상호작용 파트너)은 그들이 (상호작용 복합체를 형성하기 위해) 상호작용할 때 생물발광 복합체를 형성한다. 이것은 이원 상호작용의 측정을 허용한다. 에너지 전이를 위해 형광 모이어티를 함유한 소분자 GPCR 리간드가 이 시스템과 상호작용한다면, 에너지 전이가 발생한다. 따라서, 이원 단백질-단백질 상호작용 및 삼원 약물-단백질-단백질 상호작용은 동일한 실험으로 측정될 수 있다.
도 24는 11S 펩티드 및 BRD4의 세포 발현 융합물 그리고 BRD4 리간드에 접합된 외인성 첨가 NCT 사이의 BRET 데이터는 PEP-80 (11S에 대한 구조적 보체)의 존재에 의존한다는 점을 입증하는 그래프를 보여준다; (A) 공여자 강도, (B) 수용자 강도.
도 25는 11S 펩티드 및 BRD4의 세포 발현 융합물 그리고 iBET에 접합된 외인성 첨가 NCT 사이의 BRET 데이터는 PEP-80 (11S에 대한 구조적 보체)의 존재에 의존한다는 점을 입증하는 그래프를 보여준다; (A) 1μM PEP-80, (B) PEP-80이 없는 대조.
도 26은 촉진된 11S-BRD4/114-히스톤 H3.3 복합체에 의존하는 BRET 신호 (수용자 및 공여자 강도)를 보여준다.
도 27은 형광 BRD4 리간드 (iBET-NCT/PBI-4966)가 11S-BRD4/114-히스톤 H3.3 복합체를 옮길 수 있다는 점을 보여준다.
도 28은 11S-BRD4/114-히스톤 H3.3 복합체의 비-형광 iBET-151 IC50 경쟁적 이동을 보여준다.
도 29는 클래스 I HDAC (HDAC1, 2, 3, 및 8)는 이들 개별적인 표적에 대한 SAHA 보고된 친화도 및 선별성에 기반하여 예측되는 바와 같이, SAHA-TOM으로 특이적인 BRET 신호를 발생시킨다는 점을 보여준다.
도 30은 클래스 IIb HDAC (HDAC6 및 10), 그리고 HDAC6의 분리된 도메인은 이들 개별적인 표적에 대한 SAHA의 보고된 친화도 및 선별성에 기반하여 예측되는 바와 같이, SAHA-TOM으로 특이적인 BRET를 발생시킨다는 점을 보여준다.
도 31은 클래스 IIa HDAC가 클래스 I 및 IIb HDAC에 대한 SAHA의 보고된 선별성에 기반하여 예측되는 바와 같이, SAHA-TOM으로 유의적인 BRET를 발생시키지 않는다는 점을 보여준다.
도 32는 BRET를 통해 결정되는 바와 같이, SAHA-TOM과 복합된 개별적인 HDAC-NanoLuc 융합물에 대하여 SAHA의 경쟁적 이동 결과를 보여준다. 이들 농도 반응 곡선으로부터, IC-50 값은 그래프 옆의 표에서 나타난 바와 같이, 계산될 수 있다.
도 33 (왼쪽)은 BRET을 통해 결정되는 바와 같이, 개별적인 HDAC-NanoLuc 융합물에 대한 IC-50 값 및 Ki 값 사이의 전환을 보여준다. 이 전환을 위해 Cheng-Prusoff 방정식이 이용되었다. 도 33 (오른쪽)은 BRET을 통해 결정되는 바와 같이, 개별적인 HDAC/NanoLuc 융합 단백질에 대하여 SAHA의 상대적인 친화도를 나타내는 다이어그램을 보여준다.
도 34는 특이성 대조로서 SAHA의 존재 또는 부재에서 세포내 HDAC10-NLuc / PBI-4968 +/- SAHA 복합체의 BRET 이미징을 보여준다.
도 35는 특이성 대조로서 SAHA의 존재 또는 부재에서 세포내 NLuc-HDAC6 / PBI-4968 +/- SAHA 복합체의 BRET 이미징을 보여준다.
도 36은 HDAC10 및 HDAC6을 이용한 SAHA 결합 세포내 SAHA-TOM (PBI-4968) BRET 이미징 실험의 점 도표(dot plot) 분석을 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 세포 표적과 생물활성제의 세포내 결합의 검출 및 분석을 위한 조성물과 방법을 제공한다. 특히, 발색단, 가령 형광단과 테더링된 생물활성제, 생물발광 리포터 단백질과 융합된 잠재적인 세포 표적 그리고 이와 함께 세포 표적과 생물활성제의 상호작용을 검출하고 분석하는 방법이 본 명세서에서 제공된다 (도 1을 참고).
제1 엔티티 (가령, 생물활성제) 및 제2 엔티티 (가령, 세포 표적)의 상호작용은 제1 엔티티에 이어진, 융합된, 테더링된, 연결된 제3 엔티티 (가령, 형광단) 그리고 제2 엔티티에 이어진, 융합된, 테더링된, 연결된 제4 엔티티 (가령, 생물발광 리포터 단백질) 사이의 신호 전달 (가령, 에너지의 전이 (가령, 형광, 빛 에너지, 공명, BRET에 의함 등))에 의해 생성된 신호의 검출/측정을 통해 검출되고, 특성화되고, 정량화되고, 분석된다. 제1 및 제2 엔티티의 상호작용 및/또는 결합은 한 곳에서부터 다른 곳으로 신호 전달 (가령, 에너지 전이)를 허용하도록 매우 충분히 근접하게 제3 및 제4 엔티티를 이동시킨다. 몇몇 구체예에서, 제4 엔티티 (가령, 생물발광 리포터 단백질)는 에너지 (가령, 이의 기질과 상호작용시)를 방출하고, 그리고 그 방출된 에너지는 제3 엔티티 (가령, 형광단)에 의해 흡수되며, 이는 제3 엔티티가 제4 엔티티로부터 측정가능하게 상이한 에너지 (가령, 상이한 파장의 빛)를 방출하도록 야기하는 것이다. 이러한 구체예에서, 제4 엔티티 (가령, 생물발광 리포터)를 위한 기질의 시스템의 첨가시 제3 엔티티 (가령, 제3 엔티티의 최대 방출에서의 빛)로부터 방출된 에너지의 검출은 제1 및 제2 엔티티의 상호작용을 명시한다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 엔티티의 결합의 기간, 동력학, 친화도, 세기, 및/또는 특이성은 여러 가지 조건 하에 제4 엔티티 (가령, 생물발광 리포터 단백질)의 신호 출력의 측정에 기반하여, 검출되고, 측정되고, 정량화되고, 결정되고, 조사된다.
여러 가지 구체예에서, 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적 단백질 및 발색단, 가령, 형광단과 테더링된 생물활성제가 제공된다 (가령, 세포 내에서, 세포 외에서, 용해물에서, 시험관 내에서 등). 생물발광 리포터 단백질을 위한 기질이 시스템에 첨가된다. 생물활성제 및 세포 표적 사이에서 상호작용이 일어났다면 (가령, 결합), 생물발광 리포터 단백질 및 발색단 (가령, 형광단)은 일어나야 할 BRET를 위해 매우 충분히 근접하게 이동되고, 그리고 검출가능한 신호는 발색단 (가령, 형광단)으로부터 방출된다.
몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질 (또는 단백질 복합체)을 형성하기 위해 상호작용 (가령 복합체를 형성)할 수 있는 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드가 이용된다. 몇몇 구체예에서, 상보적인 펩티드는 제1 상호작용 파트너와 융합되고 상보적인 폴리펩티드는 제2 상호작용 파트너와 융합된다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 상호작용 파트너는 복합체를 형성한다 (가령, 서로 결합함으로써). 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 상호작용 파트너는 하나 또는 둘 모두가 생물활성제와 상호작용할 때 상호작용 복합체를 형성한다. 몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 상호작용 파트너는 생물활성제의 존재 또는 부재에서 상호작용 복합체를 형성한다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 복합체의 형성은 생물발광 리포터를 형성하도록 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드를 함께 합친다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 형성은 상호작용 복합체의 형성의 검출을 허용한다. 몇몇 구체예에서, 형광단은 생물활성제와 테더링된다. 몇몇 구체예에서, 상호작용 복합체가 형성되고 생물활성제가 상호작용 파트너 또는 상호작용 복합체 중 하나와 결합될 때 에너지가 생물발광 리포터에서 형광단으로 전이된다. 몇몇 구체예에서, 형광단은 제1 및 제2 상호작용 파트너의 상호작용의 검출 또는 측정을 허용한다. 몇몇 구체예에서, 형광단은 생물활성제와 이의 결합파트너 (가령, 제1 상호작용, 제2 상호작용, 및/또는 상호작용 복합체)의 결합의 검출 또는 측정을 허용한다.
몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 상보적인 펩티드는 관심 표적과 융합된다. 관심 표적과 생물활성제의 상호작용을 검출 또는 측정하기 위해 상보적인 폴리펩티드 및 형광단과 테더링된 생물활성제가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 상보적인 펩티드는 관심 표적과 융합되고 생물발광 리포터 단백질의 상보적인 폴리펩티드 및 형광단과 테더링된 생물활성제는 다성분 발광 공여자의 성분에 복합체의 구성원을 연결시킴으로써 단백질 복합체에 대한 형광으로 표지된 리간드, 가령 생물활성제의 근접성을 검출 (가령, 헤테로다이머 수용체 또는 호모다이머 수용체에 선별적으로 결합한 리간드를 검출)하는 데에 적용된다. 따라서 이러한 적용은 질병 병리에서 역할할 수 있는 단백질 복합체 내에서 표적 인게이지먼트를 모티터링하는 데에 이용될 수 있었다.
몇몇 구체예에서, 세포 표적 및 생물발광 리포터 융합물은 어세이가 수행되어야 하는 세포에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 융합물은 세포 표적에 대해 고유 존재비(abundance)에서 또는 상기 존재비 가까이에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 형광단-테더링된 생물활성제는 세포 외에 첨가되고 (가령, 배양 배지에 첨가됨) 그리고 확산, 능동 수송, 수동 수송, 내포작용, 또는 임의의 적절한 기작을 통해 세포로 들어간다. 몇몇 구체예에서, 결합 동력학을 어세이하기 위해, 결합 친화도를 어세이하기 위해, 충분한 신호를 제공하기 위해 변화하는 양의 형광단-테더링된 생물활성제가 첨가된다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 생물활성제 및 세포 표적 (가령, 공지된 또는 비공지된) 사이의 세포내 상호작용의 검출을 위한 조성물, 방법, 및 시스템을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 및 세포 표적의 융합물은 세포 내에서 발현된다. 형광단과 테더링된, 생물활성제는 세포에 주입된다 (가령, 형광단 및 생물활성제의 접합체는 세포 투과성이고, 세포는 투과가능함). 생물발광 리포터를 위한 기질 단백질은 생물활성제의 첨가 전에, 동시에 또는 후에 세포에 첨가된다. 형광단으로부터의 형광 신호의 검출 (BRET의 결과로서)은 생물활성제 및 세포 표적 사이의 세포내 상호작용 (가령, 결합)을 명시한다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적은 천연 세포 존재비에서 (가령, 융합된 표적의 적절한 생물학적 기능에 적합한 수준에서, 또는 고유 세포 표적에 비례하여) 발현된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적과의 생물활성제의 상호작용은 세포 내에서 검출된다.
몇몇 구체예에서, 생물활성제 및 세포 표적 사이의 상호작용의 특성은 세포 환경 및 시스템의 환경을 변경함으로써 조사된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 세포 표적 (가령, 테더링되지 않은 생물활성제)의 경쟁적 결합제(binder)는 형광단-테더링된 생물활성제와 경쟁하기 위해 세포에 첨가된다.
몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질-태그된 세포 표적의 라이브러리가 제공된다 (가령, 용액에서, 용해물에서, 표면에 고정된, 세포 내에서 발현된 등). 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 공지된 세포 표적이 결핍되고 또는 세포 표적의 지식이 불확실하거나 불완전한 것으로 제공된다. 생물활성제의 세포 표적은 라이브러리에 생물활성제를 첨가함으로써 그리고 어떠한 세포-표적 융합물이 생물활성제-테더링된 형광단의 BRET 유도 형광을 생성하는지를 결정함으로써 결정된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질-태그된 세포 표적의 라이브러리는 단백질 융합물을 인코딩하는 핵산 또는 핵산을 포함한 벡터 (가령, 플라스미드, BacMam 바이러스, 렌티바이러스 등)의 집합으로서 제공된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질-태그된 세포 표적은 세포 내에서 발현된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질-태그된 세포 표적의 라이브러리는 무-세포 번역 반응에서 핵산을 번역함으로써 제공된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적 융합물의 라이브러리, 또는 세포 표적 융합물을 발현하는 세포는 미세평판 형식으로 제공된다. 이러한 구체예에서, 세포 표적의 전체 라이브러리와 생물활성제 (가령, 표현형 에서이 또는 스크린을 통해 식별된 것)의 상호작용은 고속-대량 방식으로 조사될 수 있다 (가령, 용액에서, 용해물에서, 세포 내에서 등). 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터-태그된 세포 표적은 단백질 어레이(array)를 형성하기 위해 고체 표면 상에 고정된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터뿐만 아니라, 세포 표적도 또한 태그와의 융합물로서 발현되거나 단백질 (가령, HALOTAG, Promega)과 커플링되며, 이때 커플링은 단백질이 고체 표면 (가령, 적절한 리간드를 디스플레이하는 표면 (가령, HALOTAG 리간드)) 상에 공유결합으로 고정되도록 한다. 특정한 구체예에서, 잠재적인 생물활성제의 라이브러리 (가령, 유효 화합물(hit compound) 또는 약물-유사 소분자)는 시스템 (가령, 어레이)에 첨가되고 BRET를 초래할 수 있는 임의의 쌍이 식별된다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제의 라이브러리 중 일부 또는 모두에 대한 세포 표적은 공지되지 않는다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 조성물, 방법, 및 시스템은 생물활성제 및 에너지 수용자 (가령, 형광단, 발색단)의 접합을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 임의의 소분자 (가령, > 2000 달톤, >1000 달톤, >500 달톤 등), 거대분자, 합성 분자 또는 세포의 생물학과 상호작용할 수 있는 분자 복합체이다. 몇몇 구체예에서, 에너지 수용자는 에너지 흡수 (가령, 공명 에너지 전이)에 의해 촉발될 때 신호 (가령, 빛, 열, 화학 반응, 형광, 공명 에너지 등)를 발생시키고, 나타내고, 및/또는 방출할 수 있는 엔티티이다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제 및 에너지 수용자 (가령, 형광단, 발색단)는 링커(linker) (가령, 펩티드, 핵산, 중합체, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소 사슬 등)) 의해 연결된, 효소로 연결된, 화학적으로 연결된 (가령, 직접적으로 또는 간접적으로), 임의의 적합한 구조 또는 기작 (가령, 융합 구조체로서 발현됨 (가령, 펩티드 링커와 함께 또는 상기 링커 없이)에 의해 융합되고, 테더링되고, 이어진다. 몇몇 구조체에서, 생물활성제 및 에너지 수용자의 접합 (가령, 형광단과 테더링된 생물활성제)은 비-천연 화학 합성 (가령, 천연 세포에서 존재하지 않은 화학 반응의 의도적인 실행)에 의해 생성된다. 연결 유형은 제한되는 것으로서 검토되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물활성제"는 임의의 생리학적으로 또는 약물학적으로 활성인 물질 또는 검출을 위해 적합한 물질을 일반적으로 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 잠재적인 치료학적 화합물 (가령, 소분자, 펩티드, 핵산 등), 또는 약물-유사 분자이다. 몇몇 구체예에서, 생물활성제는 비-천연 화학 합성 (가령, 천연 세포에서 존재하지 않은 화학 반응의 의도적인 실행)에 의해 생성된다. 본 명세서에서 설명된 구체예에서의 용도를 위한 생물활성제는 크기 또는 구조가 제한되지 않는다.
특정한 구체예에서, 생물활성제의 라이브러리 (가령, >10 작용제, >50 작용제, >100 작용제, >500 작용제, >1000 작용제, >5000 작용제, >10,000 작용제, >50,000 작용제 등)가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 시스템, 방법, 및 조성물이 생물활성제의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 제공된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 표현형 효과 및/또는 활성을 생성하고, 유발하고, 유도하는 것을 담당하는 라이브러리에서 생물활성제를 식별하는 수단을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 생물활성제 (가령, 표현형 효과 및/또는 활성의 원인이 되는 생물활성제)의 세포 표적을 식별하는 수단을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "에너지 수용자"는 임의의 소분자 (가령, 발색단), 거대분자 (가령, 자가 형광 단백질, 피코빌리단백질, 나노입자, 표면 등), 또는 에너지 흡수 (가령, 공명 에너지 전이)에 반응하여 쉽게 검출가능한 신호를 생성하는 분자 복합체를 나타낸다. 특정한 구체예에서, 에너지 수용자는 형광단 또는 검출가능한 발색단이다. 적합한 형광단을 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 크산텐 유도체 (가령, 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 텍사스 레드 등), 시아닌 유도체 (가령, 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌, 메로시아닌 등), 나프탈렌 유도체 (가령, 단실 및 프로단 유도체), 옥사디아졸 유도체 (가령, 피리딜옥사졸, 니트로벤즈옥사디아졸, 벤즈옥사디아졸 등), 피렌 유도체 (가령, 캐스캐이드 블루), 옥사진 유도체 (가령, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170 등), 아크리딘 유도체 (가령, 프로플라빈, 아크리디 오렌지, 아크리딘 옐로우 등), 아릴메틴 유도체 (가령, 아우라민, 크리스탈 바이올렌, 말라카이트 그린 등), 테트라피롤 유도체 (가령, 포르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈 등), CF 염료 (Biotium), BODIPY (Invitrogen), ALEXA FLuoR (Invitrogen), DYLIGHT FLUOR (Thermo Scientific, Pierce), ATTO 및 TRACY (Sigma Aldrich), FluoProbes (Interchim), DY 및 MEGASTOKES (Dyomics), SULFO CY 염료 (CYANDYE, LLC), SETAU 및 SQUARE 염료 (SETA BioMedicals), QUASAR 및 CAL FLUOR 염료 (Biosearch Technologies), SURELIGHT 염료 (APC, RPE, PerCP, Phycobilisomes)(Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech), 자가형광 단백질 (가령, YFP, RFP, mCherry, mKate), 양자점 나노크리스탈 등. 몇몇 구체예에서, 형광단은 로다민 유사체 (가령, 카르복시 로다민 유사체), 가령 미국 특허 출원 일련 번호 제13/682,589호에서 설명된 것들이며, 이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에서 편입된다. 몇 가지 이러한 형광단은 본 명세서의 실시예 8에서 설명된다. 몇몇 구체예에서, BRET 효율은 다른 형광단과 비교하여 에너지 수용자로서 로다민 유사체 (가령, 카르복시 로다민 유사체)의 기술적인 특징에 의해 유의적으로 증진된다. 예를 들어, 이들 염료의 감소된 비특이적 백그라운드 및 좌측 이동된 EC50은 몇몇 구체예에서의 용도를 위해 이롭다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TOM" 및 "NonChloroTOM" (또는 "NCT")는 동일한 유형의 형광단을 나타내고 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.
특정한 구체예에서, 본 명세서의 조성물, 방법, 및 시스템은 세포 표적 및 생물발광 리포터 단백질 (가령, 루시퍼라아제)의 융합물을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적 및 생물발광 리포터 단백질은 링커 (가령, 펩티드, 핵산, 다른 중합체, (가령, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소 사슬 등)) 의해 연결된, 효소로 연결된, 화학적으로 연결된 (가령, 공유결합 또는 비-공유결합을 통해), 임의의 적합한 구조 또는 기작 (가령, 융합 구조체로서 발현됨 (가령, 펩티드 링커와 함께 또는 상기 링커 없이)에 의해 융합되고, 테더링되고, 이어진다. 몇몇 구체예에서, 아미노산 사슬 (가령, 3-100개 아미노산)은 세포 표적과 생물발광 리포터 단백질을 연결시키는 데에 이용된다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적 또는 생물발광 리포터 중 어느 하나의 구조 및/또는 기능도 링커의 존재 또는 융합에 의해 영향 받지 않는다 (가령, 유의적으로 영향 받지 않음). 특정한 구체예에서, 링커는 요소 중 하나 또는 둘 모두 또는 활성의 손실 없이 융합을 허용한다. 다른 구체예에서, 아미노산 링커는 형광단으로 에너지 전이에 대해 보고된 생물발광에 적절하게 간격을 두고 및/또는 상기 생물발광을 배향시킨다.
몇몇 구체예에서, 세포 표적은 생물활성제 (가령, 소분자, 단백질, 핵산, 지질 등)에 대한 임의의 적합한 결합/상호작용 파트너 (가령, 수용체, 효소, 단백질 복합체)를 포함한다. 하지만, 몇몇 구체예에서, 세포 표적 및 생물활성제 사이의 상호작용의 지식은 본 발명을 실시하는 데에 요구되지 않는다. 특정한 구체예에서, 세포 표적은 생물활성제과 결합하거나 그렇지 않으면 상호작용하는 (가령, 소분자 생물활성제에 대한 결합 친화도를 갖는) 단백질 또는 단백질 복합체이다. 더욱 특정한 구체예에서, 세포 표적은 소분자 생물활성제와 결합하거나 그렇지 않으면 상호작용하는 (가령, 소분자 생물활성제에 대한 결합 친화도를 갖는) 수용체 단백질 또는 효소이다. 본 발명은 세포 표적의 독자성, 유형, 또는 클래스에 의해 제한되지 않는다. 특정한 구체예에서, 1000개 이상의 상이한 세포 표적 중 100, 1000, 10개의 라이브러리는 본 발명에서의 용도를 밝혀 낸다. 세포 표적의 예시는 핵산 (가령, DNA 또는 RNA), 폴리사카라이드 또는 이들 중 어느 하나와 폴리펩티드를 포함한 복합체를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적은 G-단백질 커플링된 수용체 또는 단백질 키나아제이다.
특정한 구체예에서, 생물발광 리포터는 루시퍼라아제이다. 몇몇 구체예에서, 루시퍼라아제는 Gaussia, Coleoptera, (가령, 반딧불), Renilla, Vargula, Oplophorus, Aequoria, 이의 돌연변이, 이의 부분, 이의 변이체, 및 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법에 적합한 임의의 다른 루시퍼라아제 효소에서 발견된 것들에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 Oplophorus로부터 변형된, 증진된 루시퍼라아제 효소이다 (가령, Promega Corporation의 NANOLUC 효소, 서열 번호: 1, 또는 이와 적어도 70% (가령, >70%, >80%, >90%, >95%) 동일성을 가진 서열). 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 내열성 포투리스 펜실베니카(Photuris pennsylvanica) 루시퍼라아제 또는 이와 적어도 70% (가령, >70%, >80%, >90%, >95%) 동일성을 가진 서열이다). 예시적인 생물발광 리포터는 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 제2010/0281552호 및 미국 특허 출원 번호 제2012/0174242호에서 설명되며, 이 둘 모두 이들 전체로 참조로서 본 명세서에서 편입된다.
몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 NANOLUC를 포함한다 (미국 특허 출원 번호 제2010/0281552호 및 제2012/0174242호를 참고하며, 이들은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨). 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 생물발광 특성을 보유하는 서열 번호: 1과 적어도 70% 동일성 (가령, >70%, >80%, >90%, >95%)을 가진 폴리펩티트를 포함한다. 특정한 구체예에서, NANOLUC 효소, 또는 이의 변이체의 용도는 본 명세서에서 설명된 BRET 어세이의 용도를 가능하게 하는 특징 (가령, 신호 강도, 밝기, 높은 빛 출력, 좁은 스펙트럼)을 제공한다. 몇몇 구체예에서, NANOLUC의 높은 빛 출력은 생리학적으로 관련된 조건 하에 어세이를 수행하는 데에 유용한, 어세이 성분, 가령 NANOLUC를 인코딩하는 DNA의 저농도 (가령, <1 μM, <100 nM, <10 nm, <1 nm 등)를 가능하게 한다. 몇몇 구체예에서, NANOLUC는 표현형 스크린에서 식별된 세포 표적을 특성화하는 데에서 BRET의 이용을 가능하게 한다.
몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터를 위한 기질 단백질이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 기질을 반응 산물로 전환하고 부산물로서 빛 에너지를 발산한다. 몇몇 구체예에서, 기질은 루시퍼라아제 효소를 위한 기질이다. 몇몇 구체예에서, 기질은 코엘렌테라진(coelenterazine) (가령, 푸리마진(furimazine))의 구조적 변이체 또는 유도체이다. 몇몇 구체예에서, 기질은 Oplophorus로부터 변형된, 증진된 루시퍼라아제 효소, 가령 Promega Corporation의 NANOLUC 효소 (가령, 서열 번호: 1)이다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질을 위한 전-기질이 제공되며, 이는 화학적 또는 물리학적 과정 (가령, 가수분해, 효소 반응, 광-절단 등)을 통해 기질을 생성한다. 몇몇 구체예에서, 전-기질은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진 유도체, 코엘렌테라진의 구조적 및 기능적 균등물, 코엘렌테라진와 실질적으로 동일한 분자 (가령, 구조적으로 및/또는 기능적으로), 또는 코엘렌테라진과 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 분자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진 유도체, 코엘렌테라진의 구조적 또는 기능적 균등물, 또는 코엘렌테라진과의 실질적 균등물을 코엘렌테라미드(coelenteramide), 코엘렌테라미드 유도체, 코엘렌테라미드의 구조적 또는 기능적 균등물, 또는 코엘렌테라미드와의 실질적 균등물로 전환하고 그리고 부산물로서 빛 에너지를 발산한다.
몇몇 구체예에서, 형광단 및 생물발광 리포터는 두 사이에서 효율적인 에너지 전이를 제공하기 위해 (가령, 비-방사성 쌍극자-쌍극자 커플링으로) 방출 (가령, 생물발광 리포터의 것) 및 여기 (가령, 형광단의 것)의 충분한 중첩을 나타내는 것으로 선택된다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터의 피크 방출은 예를 들어 파장에서 적어도 80 nm, 100 nm, 120 nm, 140 nm만큼 형광단의 피크 방출로부터 실질적으로 분리된다. 특정한 구체예에서, 형광단 및 생물발광 리포터 쌍의 포스터(Forster) 거리는 작다 (가령, <20 nm, <10 nm, <5 nm, <3 nm 등). 이러한 구체예에서, 짧은 포스터 거리는 일어나야 할 에너지 전이를 위해 형광단 및 생물발광 리포터가 매우 근접하게 이동되어야 한다는 필요조건을 야기한다. 따라서, 짧은 포스터 거리는 비정상적인 및/또는 백그라운드 신호 (가령, 형광단 및/또는 리포터가 확산함으로써 형성됨)를 감소시킨다.
특정한 구체예에서, 형광단 및 생물발광 리포터 쌍은 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적 및/또는 관심 단백질의 고유 존재비 (또는 거의 고유 존재비)에서 전이된 신호의 검출을 허용하도록 충분히 밝은 것으로 선택된다. 몇몇 구체예에서, 선택된 형광단 또는 생물발광 리포터나 불충분한 에너지 (빛) 방출을 초래한다면, 세포 표적 및 생물발광 리포터의 융합물은 과다발현될 필요가 있을 것이고 (가령, 고유 존재비 이상으로, 생물학적으로 관련된 수준 이상으로), 및/또는 형광단-테더링된 생물활성제의 양은 증가되어야 할 것이다 (가령, 잠재적으로 독성 수준까지, 생리학적으로 관련된 수준 이상, 동력학 실험이 수행될 수 있을 때의 양보다 높게). 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 및 형광단의 충분한 밝기는 농도와 비의 범위에서 생물활성제 및 세포 표적 상호작용의 검출을 허용한다.
몇몇 구체예에서, 표현형 어세이 또는 표현형 스크린으로부터 나오는 유효 화합물의 세포 표적의 식별을 위한 조성물, 방법, 및 시스템이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 표현형을 유발할 수 있는 생물활성제의 식별 후, 형광단과 테더링된 "유효 화합물"은 생물발광 리포터 단백질과의 그들의 연결을 통해, 세포 표적을 식별하는 데에 이용된다 (가령, 세포 표적과 생물활성제의 결합은 생물발광 리포터 단백질 및 형광단 사이의 BRET을 야기함). 이러한 구체예는, 표현형이 특정한 생물활성제와 연관되었음에도 불구하고, 그 생물활성에 대한 상호작용 파트너 (가령, 세포 표적)는 비공지되거나 불확실하다. 몇몇 구체예에서, 형광단에 테더링된 생물활성제는 표현형을 재생시킬 수 있고, 따라서 형광단과 생물활성제 (또는 생물발광 리포터와 세포 표적)가 테더링된 것은 세포 결합 패턴에 영향을 주지 않고 및/또는 이의 생물학적 활성을 방해하지 않는다는 점을 확증한다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질 (가령, NANOLUC)과 각각 융합된, 세포 표적 라이브러리의 용도는 다른 검출 방법 (가령, 질량 분광법 분석)과 비교하여 세포 표적의 낮은 고유 존재비 또는 불량한 가용성으로 인해 더 적은 간섭을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 검출 방법은 더 큰 정도의 민감성 또는 특이성을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 생물발광 리포터 단백질과의 연결을 통한 표적 식별은 심지어 표적의 결합이 불충분하거나 불완전할 때도, 에너지 전이를 통한 검출을 가능하게 한다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적과 생물활성제 (가령, 소분자)의 결합은 경쟁적 결합 어세이를 이용하여 특성화된다 (도 1C와 1D를 참고). 몇몇 구체예에서, BRET는 세포 표적 상에서 동일한 부위와 결합하는 형광 추적자 (가령, 형광단)의 경쟁적 이동을 이용하여 생세포에서 유효 화합물의 결합 친화도의 분석을 허용한다. 몇몇 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 표적 식별을 위한 두 가지 별개의 방법을 이용하는 능력을 제공하며, 따라서 세포 표적을 식별하기 위한 더 높은 엄격성을 제공하고, 상보적인 방법은 다른 기법으로의 제한을 다룬다 (가령, BRET는 실험 전체에 걸쳐 표적과 평형상태에 있는 생물활성제를 유지시키는 장점을 제공함).
본 명세서에서 설명된 몇몇 구체예는 약물 발견, 약물 확증, 약물 표적 발견, 또는 약물 표적 확증에서의 용도를 밝혀 낸다. 특정한 구체예에서, 생물활성제 (가령, 약물-유사 소분자) 및 세포 표적 사이의 결합 상호작용은 검출되고, 확증되고, 및/또는 특성화될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포 표적에 대한 생물활성제의 상대적인 결합 친화도 (가령, 용액에서, 용해물에서, 표면 상에서, 세포에서)는 형광단과 테더링된 생물활성제를 이동시키는 그들의 능력에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 제2 생물활성제에 비해 제1 생물활성제의 더 높은 결합 친화도는 제2 생물활성제에 비해 테더링된 생물활성제를 이동시키기 위한 더 낮은 농도의 제1 생물활성제를 요구함으로써 명시된다. 테더링된 생물활성제의 이동은 세포 표적과 융합된 생물발광 리포터 단백질로부터의 에너지 전이의 손실 또는 감소로 결정된다. 몇몇 구체예에서, 테더링된 생물활성제를 이동시키기 위해 필요로 하는 생물활성제의 농도는 생물활성제에 대한 결합 EC50 또는 저해 상수 (Ki)를 추정하는 데에 이용된다. 몇몇 구체예에서, 새로운 또는 변형된 생물활성제의 개발은 생물발광 리포터 단백질과 각각 융합된, 하나 이상의 세포 표적으로부터, 형광단과 각각 테더링된, 하나 이상의 생물활성제를 이동시키는 그들의 능력에 의해 유도된다.
몇몇 구체예에서, 세포 표적과의 비공지 결합 친화도를 가질 수도 있는 화합물의 집합은 형광단과 테더링된 생물활성제를 이동시키는 그들의 능력을 결정함으로써 생물발광 단백질과 융합된 표적을 결합시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 화합물은 제2 생물활성 표적으로부터 제2 테더링된 생물활성제에 비해 제1 세포 표적으로부터 제1 테더링된 생물활성제를 이동시키는 그들의 능력으로 제2 세포 표적에 비해 바람직하게 제1 세포 표적을 결합시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.몇몇 구체예에서, 제1 및 제2 테더링된 생물활성제는 동일하다.
몇몇 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 세포 표적, 가령 표적 단백질의 야생형과 돌연변이 버전(들)에 대한 생물활성제 (가령, 유효 화합물, 연구 선도, 선도 화합물 등)의 친화도를 결정하는 능력을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 질병-관련 돌연변이 단백질에 대한 형광으로-표지된 생물활성제 (가령, 약물)의 친화도 및 선별성은 세포에서 수행될 수 있다. 이러한 시스템 및 방법은 상이하게 야생형 또는 돌연변이 단백질을 선별적으로 결합시키는 생물활성제(들) (가령, 약물)을 식별하는 데에 유용할 수 있다.
1차 표적뿐만 아니라, 의도된 표적, 및/또는 공지된 표적, 생물활성제 (가령, 유효 화합물)는 예상되지 않은 및/또는 의도되지 않는 세포 표적 (오프 타깃)과 또한 결합할 수 있다. 몇몇 경우에, 생물활성제의 오프 표적 결합은 생물활성제의 투여와 연관된 치료학적 효과 및/또는 부작용의 일부의 원인이 된다. 몇몇 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 생물활성제의 오프 타깃을 식별하는 능력을 제공한다. 오프-타깃 생물활성제 결합의 독자성 및 정도를 이해하는 것은 작용제의 약물학에 관한 유익한 정보를 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 시스템 및 방법은 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적과 형광단과 테더링된 생물활성제의 결합 특성 (가령, EC50, Kd, 결합률, 환경적 영향 등)을 평가하는 능력을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 결합 특성은 세포 표적과 관련된 생화학적, 물리적, 또는 표현형 특성과 연관된다. 몇몇 구체예에서, BRET 복합체의 형성 또는 융해의 동력학 프로파일은 테더링되지 않은 생물활성제의 회합 또는 해리율을 추론하는 데에 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이들 회합/해리율은 완전한 세포 내에서 개별적인 표적에 대한 약물 체류 시간을 추정하는 데에 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 시스템 및 방법은 엔트로피 대 엔탈피 상호작용에 대한 작용의 열역학적 분자 기작 (MMOA) 연구에서 유용하다. 몇몇 구체예에서, 분리제에 의한 테더링된 생물활성제의 이동은 세포 표적 상에서 분리된 부위를 통해 일어날 수 있다. 몇몇 구체예에서, 테더링된 생물활성제의 결합 특성은 세포 표적에서 번역-후 변형 (가령, 절단, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 지질화 등), 세포내 전좌 (가령, 핵, 미토콘드리아, 막 등으로 움직임 등), 또는 단백질 상호작용 (가령, 다른 단백질, 핵산, 지질 등과 상호작용)의 영향을 결정하는 데에 이용될 수 있다. 예시는 테더링된 생물활성제의 결합 특성에 미치는 이의 영향에 의해 세포 표적과 항체의 결합 특성을 결정한다. 몇몇 구체예에서, 테더링된 생물활성제의 결합 특성은 생물활성제 또는 테더링된 형광단의 화학적 변형 또는 변환의 영향을 결정하는 데에 이용될 수 있다 (가령, 세포내 대사, 이온 상태의 변화 등).
몇몇 구체예에서, 세포 표적은 한 가지보다 더 많은 분자 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적은 하나 보다 더 많은 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 다른 천연 또는 합성 분자 (가령, 보결 분자단, 보조인자, 대사산물, 핵산, 지질, 탄수화물 등)를 추가로 포함할 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 형광단과 테더링된 생물활성제는 제1 분자 성분과 결합하고, 그리고 생물발광 리포터는 제2 분자 성분과 융합되고, 따라서 테더링된 생물활성제로부터의 신호는 제1 분자 성분과 결합될 때 생성되고 제1 분자 성분은 제2 분자 성분과 매우 근접하게 있다.
생물활성제 및 세포 표적 사이에서 상호작용의 존재의 사전 지식은 본 발명을 실시하는 데에 있어 필요하지 않다. 몇몇 구체예에서, 에너지 전이에 의해 비공지된 또는 이전에 식별되지 않은 상호작용의 검출 및/또는 특성화가 제공된다. 표적 발견의 다른 방법에 비하여, 본 명세서에서 설명된 시스템, 조성물, 및 방법의 장점은 다음을 포함할 수 있다: 광범위한 가능성 있는 생물활성제 농도, 그 이유는 (몇몇 구체예에서) 세포 내에서 발현될 필요가 없기 때문임 (가령, 검출가능 신호를 발생시키기 위해 충분한 수용자 형광단의 첨가를 허용), 세포 표적의 천연 단백질 농도 (가령, 검출을 위해 충분한 신호를 얻기 위한 과발현은 필요 없음), 평판 판독기에서 검출가능한 신호 (가령, 고속 대량 검출, 이미징은 필요하지 않음), 세포 내에서 상호작용의 검출 등.
몇몇 구체예에서, 생물활성제 (가령, 유효 화합물)은 형광 에너지 수용자 염료에 접합되고, 따라서 변형된 작용제와 이의 루시퍼라아제-융합된 (가령, NANOLUC-융합된) 세포 표적의 결합은 NANOLUC에서 수용자 염료로 에너지 전이를 야기한다. 이러한 시스템은 생세포에서 수행될 수 있는 동질 어세이를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 표지된 생물활성제는 낮은 친화도로 유뵌®화합물과 상호작용하는 표적의 검출을 허용하는 실험 전체에 걸쳐 세포 표적과 평형상태로 남아 있는다. 몇몇 구체예에서, BRET는 동일한 결합 부위에 대해 설계된 형광 추적자의 경쟁적 이동에 의해 생세포에서 결합 친화도의 측정을 가능하게 한다.
몇몇 구체예에서, BRET 효율은 다른 루시퍼라아제와 비교하여 에너지 공여자로서 NANOLUC의 기술적 특징에 의해 유의적으로 증진된다. 예를 들어, NANOLUC는 BRET를 위해 일반적으로 이용되는 다른 루시퍼라아제보다 유의적으로 더 밝으며, 따라서 에너지 전이가 세포 내에서 더 낮은 발현에서 정량화되도록 한다. 몇몇 구체예에서, NANOLUC의 좁은 방출 스펙트럼은 수용자 채널에서 스펙트럼의 교차를 감소시키는 동적 범위를 증가시킨다. 몇몇 구체예에서, 동적 범위는 스펙트럼의 거의-적색인 영역 (600 내지 650 nm)에서 방출하는 장-파장 수용자를 이용함으로써 추가로 증가될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 구체예의 전개 동안 다수의 염료 리간드 평가는 로다민 유사체 (가령, 카르복시 로다민 유사체), 가령 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 출원 일련 번호 제13/682,589호에서 설명된 것들이 본 명세서에서 설명된 BRET 적용에서 및/또는 NANOLUC로의 이용을 위한 최적의 동적 범위를 도출하는 것으로 드러났다.
실험적
실시예 1
PBI 추적자 접합체의 개선된 수행을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하고 약물 추적자 적용을 위해 표준 염료로 접합체를 비교하였다. 이 실시예에서, NanoLuc-HDAC 융합 단백질 (서열 번호: 3)을 이용하여 세포내 BRET 어세이에서 수베로일라닐리드 하이드록삼산 (SAHA)의 접합체, 히스톤 데아세틸라아제 6 (HDAC6)의 저해제, 및 PBI 염료 (SAHA-TOM (PBI-4968); 도 8을 참고) 또는 표준 염료 (SAHA-TAMRA (PBI-4967); 도 8을 참고)를 활용하였다.
FuGene HD (Promega Corp.)를 이용하여 NanoLuc-HDAC6 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 프로모터가 없는 담체 DNA (pGEM3Z)로 NanoLuc-HDAC6 DNA를 1:1000 희석시켜 96-웰 평판 형식 (20,000개 세포/웰의 접종 밀도로)에서 50ng/웰의 총 DNA 최종 농도를 수득하였다. 24시간 형질감염-후, 비표지된 SAHA (특이성 대조로서)의 몰 초과의 존재 또는 부재에서 세포를 연속으로-희석된 추적자와 인큐베이션하였다. 약물 추적자와 평형화 후, 푸리마진 (NanoLuc를 위한 코엘렌테라진 유도체 기질; Promega Corp.)을 20uM의 농도로 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 정량화하였다. SAHA 추적자 단독에서 발생된 신호로부터 비-특이적 신호를 (비표지된 SAHA의 존재에서) 공제함으로써 특이적인 BRET 신호를 계산하였다.
도 2에서의 결과는 SAHA-TOM (PBI-4968) 접합체/추적자가 SAHA-TMR (PBI-4967)과 비교하여 우세하고, 특이적인 BRET 신호를 발생시켰고 그리고 또한 생세포 내에서 결합을 위한 좌측-이동 EC50 값을 발생시켰다는 점을 입증한다. BRET 적용을 위한 약물 접합체로서, 일반적으로 이용되는 다른 형광단에 비하여 PBI-4968 TOM 염료의 이점은 NANOLUC 융합 단백질 라이브러리를 이용하여 경쟁적 결합 어세이 또는 표적 식별 (화학 단백질체학) 스크리닝에 적용될 수 있다.
이 실시예는 공지된 고-친화성 표적과 약물 추적자의 결합을 입증하는 반면에, 다른 구체예에서 이러한 추적자는 표적 패밀리에 걸쳐 상대적인 약물 친화도와 특이성을 프로파일링하기 위해 NANOLUC 융합 단백질의 라이브러리와 조합된다. 이러한 구체예에서, 프로파일링 성과는 무차별적 결합 프로파일의 약물 식별을 돕고, 이는 생체내 바람직하지 않은 약물 부작용과 연관시킬 수 있다.
실시예 2
BRET 적용을 위한 NanoLuc의 저 발현 수준의 예상되지 않은 이점을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다.
A) Fugene HD를 이용하여 변화하는 양의 NanoLuc-HDAC6 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 96-웰 평판 형식에 접종하였다. 형질감염을 위하여, 프로모터가 없는 담체 DNA (pGEM3Z)로 NanoLuc-HDAC6 DNA를 희석시켰다. 최종 DNA 농도/웰은 50ng/웰로 남아 있었다; 하지만 NanoLuc-HDAC6 DNA를 1:10, 1:100, 및 1:1000 희석시켰다 (96-웰 형식에서 20,000개 세포/웰의 접종 밀도로). 24시간 형질감염-후, 고정된 농도 (1uM)의 SAHA-TOM (PBI-4968; 도 8을 참고) 접합체의 존재에서 연속으로-희석된 SAHA로 세포를 처리하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 푸리마진을 20uM까지 첨가하고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 검출하였다. 도 3에서의 결과는 BRET 적용을 위한 백그라운드에 대한 적절한 신호를 얻기 위하여 NanoLuc 융합물을 인코딩하는 DNA의 예상치 않게 높은 희석이 요구되었다는 점을 입증한다.
B) 비희석 내지 1:10,000의 범위에 있는 변화하는 양의 DNA를 이용하여 HEK293 세포 내로 NanoLuc-히스타민 H1 (GPCR) 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를 형질감염시켰다 (프로모터가 없는 담체 DNA (상기 설명된 바와 같은pGEM3Z)로 희석시켜 상기 설명된 바와 같은 일정량의 DNA/형질감염을 유지시킴). 24시간 형질감염-후, 세포를 연속으로-희석된 메피라민-보디피-633 (CellAura)을 처리하고 2시간 동안 평형시켰다. 이후 세포를 20uM의 농도까지 푸리마진으로 처리하고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 검출하였다.
도 3B에서의 결과는 NanoLuc 융합물을 인코딩하는 DNA의 대량 희석이 최적의 신호-대-백그라운드로 고친화성 상호작용을 발생시키기 위해 요구되었다는 점을 명시한다. 매우 낮은 수준까지 NanoLuc 융합 단백질을 희석시키는 능력은 경쟁적 결합 어세이 또는 표적 식별 (화학 단백질체학) 스크리닝을 비롯하여 여러 가지 BRET 적용에서 이롭다.
실시예 3
전통적인 생화학 (활성-기반) 형식과 비교하여 전구-약물의 결합을 정량화하기 위한 세포내 BRET 측정의 예측 값을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 실시예는 활성화되고 HDAC6과 결합할 수 있는 세포질의 환경을 감소시키는 것을 요구하는 천연 전구-약물, FK228을 포함한다.
이전에 설명된 바와 같은 담체 DNA를 이용한 1:1000 희석에서 NanoLuc-HDAC6을 인코딩하는 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 24시간 형질감염-후, 고정된 농도 (1uM)의 SAHA-TOM (PBI-4968) 접합체의 존재에서; 세포를 연속으로-희석된 천연 전구-약물, FK-228과 인큐베이션하였다. 비교를 위하여, 생화학적, 활성-기반 HDAC6 어세이를 병행하여 수행하였다. 간단하게 설명하자면, 96-웰 평판의 웰내 100% DMSO에서 100X로 FK-228 (Selleckchem 카탈로그 # S3020)의 3-배 연속의 희석을 수행하였다. 이 100X/100% DMSO 적정 시리즈의 분취량 5 μL를 245 μL의 HDAC-Glo™ I/II 어세이 완충액 단독 (Promega Corp.) 또는 2X (0.5mM) DTT 로 보충된 245 μL의 HDAC-Glo™ I/II 어세이 완충액에 첨가하여 96-웰 평판의 웰에서 FK-228의 2X/2% DMSO 마스터 중간 적정 시리즈를 만들었다. 이 마스터 중간 적정 시리즈로부터, 5 μL의 레플리케이트(replicate)를 백색 384-웰 어세이 평판 (Corning 3673)의 웰로 옮겼다. 2X (2nM) HDAC 6 (BPS Bioscience 카탈로그 # 50006)의 5 μL 첨가물을 1nM HDAC6/웰의 최종 농도를 위해 모든 웰에 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 10 μL 효소/저해제 혼합물을 전-인큐베이션하였다. 동일한 부피 (10 μL)의 HDAC-Glo™ I/II 최종 검출 시약 (Promega Corp.)을 모든 웰 (20 μL 최종 어세이 부피)에 첨가하였고, 그리고 실온에서 10분 인큐베이션 후 발광을 측정하였다. 모든 검사 조건에 대해, HDAC-Glo™ I/II 기질의 최종 농도는 50 μM였다. GraphPad의 Prism™ 소프트웨어를 이용하여 데이터를 플로팅 (S자형(sigmoidal) 용량 반응 - 가변적인 기울기)하였다 (DTT없음: 폐쇄형 원형; 0.25 mM DTT: 개방형 정사각형).
도 4A 및 도 4B에서의 결과는 활성화되기 위해 세포에 의해 가공처리되어야만 하는 전구-약물의 결합을 측정하기 위한 세포 환경의 필요조건을 나타낸다.
실시예 4
세포에 불투과성 약물 추적자를 주입하기 위한 투과화제의 용도를 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다.
이전에 설명된 바와 같은 프로모터가 없는 담체 DNA로 DNA의 1:1000 희석에서 PKC알파 (PKCa)-NanoLuc 또는 NanoLuc-PKC알파를 인코딩하는 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 24시간 형질감염-후, 50ug/mL의 최종 농도까지 디기토닌으로 또는 디기토닌 없이 세포를 처리하였다. 이후 연속으로-희석된 세포를 스타우로스포린-PBI-염료 접합체 (PBI-5129; 도 8을 참고)로 세포를 처리하였다. 결합을 위해 특이성 대조로서 5uM 비접합 스타우로스포린의 존재 또는 부재에서 세포를 공동-인큐베이션하였다. 추적자와 2시간의 평형화 후, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET 비를 측정하였다 (도 5A 및 5B).
두 번째 실험에서, 5uM 비표지 스타우로스포린 (특이성 대조)의 존재 또는 부재에서 고정된 농도의 스타우로스포린-TOM (PBI-5129; 도 8을 참고) 추적자 (5uM 최종 농도)로 처리하기에 앞서 연속으로 희석된 디기토닌으로 동일하게-형질감염된 PKCa-NanoLuc 세포를 처리하였다 (도 5C).
도 5 A-C는 불투과성 약물 추적자의 유입을 강화하기 위해 투과화제를 이용하는 능력을 입증하고 그리고 NanoLuc™ 융합 단백질 라이브러리의 BRET-기반 화학 단백질체학 스크린에 적용시켰다.
실시예 5
생세포에서 상대적인 약물 친화도를 측정하기 위한 NanoLuc/BRET의 용도를 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 몇몇 구체예에서, 유사한 실험을 구성하여 고속-대량 화학적 스크린으로부터의 선도물질을 최적화한다.
NanoLuc-p38 융합 단백질을 인코딩하는 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다 (96-웰 형식에서 50ng/웰 DNA의 최종 농도까지). 24시간 형질감염-후, 0.5uM PBI-4838의 존재에서 연속으로 희석된 BIRB-796 또는 PBI-4835로 세포를 처리하였다 (BIRB 접합체 유도체; 가령, US 13/682,589를 참고; 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨).
Figure pct00001
PBI 4835
2시간의 평형화 후, 푸리마진을 20uM의 농도까지 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다.
도 6은 용량-반응 BRET 곡선이 PBI-4835 ("BIRB 유도체")에 비하여 BIRB-796의 더 높은 공지된 친화도를 뒷받침한다는 점을 입증한다. HTS 스크린, 선도물질 최적화 또는 화학 단백질체 적용에 비표지 약물의 상대적인 친화도를 측정하는 능력을 적용시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 유사한 실험을 구성하여 고속-대량 화학적 스크린으로부터 최적화된 유효 화합물을 특성화한다 (가령, 추적자 이동에 대해 더 낮은 IC50 값을 가진 화합물은 관심 표적에 대한 더 높은 결합 효율을 나타낼 것임).
실시예 6
생세포에서 약물 결합의 동력학을 모니터링하기 위한 NanoLuc/BRET의 용도를 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 몇몇 구체예에서, 유사한 실험을 구성하여 고속-대량 화학적 스크린으로부터의 선도물질을 최적화한다.
NanoLuc-p38 융합물을 인코딩하는 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다 (96-웰 형식에서 50ng/웰 DNA의 최종 농도까지). 24시간 형질감염-후, 보호된 푸리마진 (PBI-4378; 도 8을 참고)으로 20uM의 최종 농도까지 2시간 동안 세포를 사전 처리하였다. 37℃로 설정된 Varioskan 광도계에서 시간이 지남에 따른 BRET를 측정하였다. 짧은 전-판독 후, 변화하는 농도의 PBI-4838로 세포를 자극시켰다 (특이성 대조로서 1uM BIRB796의 존재 또는 부재에서). 이후 BRET에서 용량 및 시간-의존 증가를 4시간에 걸쳐 동력학적으로 모니터링하였다.
분리된 실험에서, 형질감염된 세포를 20uM PBI-4377 및 1uM PBI-4838 둘 모두로 전처리하여 안정한 BRET 신호를 발생시켰다.
Figure pct00002
짧은 전-판독 후, 1uM 비표지 BIRB-796으로 세포를 자극시켰고, 그리고 BRET로 경쟁적 이동을 실시간으로 모니터링하였다.
도 7A-B에서의 결과는 생세포에서 표적 인게이지먼트의 동력학 측정을 위한 BRET의 용도를 뒷받침한다. 생세포에서 NanoLuc 융합 단백질의 HTS 또는 화학적 단백질체학 스크리닝을 위해 이러한 형식을 활용할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 유사한 실험을 구성하여 고속-대량 화학적 스크린으로부터 최적화된 선도 화합물 (가령, 관심 표적과의 회합 또는 해리의 변경된 동력학을 가진 화합물)을 특성화한다. 상대적인 화합물 친화도의 척도를 제공하는 것뿐만 아니라, 이러한 동력학 BRET 측정은 완전한 세포 내에서 또는 생화학적으로 표적 체류 시간의 정량적 평가를 가능하게 할 수 있었다.
실시예 7
다음 실시예는 BRET를 이용하여 약물 결합 사건의 준세포 위치측정을 판별하기 위한 특이적인 NANOLUC 기질 (도 8을 참고) 또는 효소 성분의 용도와 관련된다.
상보적인 NANOLUC 효소 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적 분리는 세포외 공간으로 NANOLUC (공여자) 신호의 단리를 허용한다. 예를 들어, 소형 신호 펩티드는 세포 표면 수용체에 유전학적으로 테더링된다. 세포 배지에 대형 신호 폴리펩티드의 외인성 첨가시, 공여자 신호는 세포외 공간으로 단리된다. 이 신호 단리는 약물 추적자 결합/이동을 비롯한 여러 가지 BRET 적용에서 발생된 신호/백그라운드를 증가시킨다.
몇몇 구체예에서, 불투과성 NANOLUC 기질이 적용된다면, 전장 NANOLUC 단백질 융합을 활용한다.
실시예 8
다음은 본 발명의 구체예에서의 용도를 밝혀낸 예시적인 화합물에 대한 합성 계획을 제공한다.
Boc-보호된 SAHA 아민
7-트리틸옥시카르바모일 헵탄산 (200 mg, 463 umol)을 3 mL의 DMF에서 4-[(N-Boc)아미노메틸] 아닐린 (113 mg, 510 umol), HBTU (352 mg, 927 umol) 및 트리에틸아민 (194 uL, 1.4 mmol)과 조합하였다. 반응을 하룻밤 동안 교반하였고, 이후 Celite 상에서 흡수시켰고, 그리고 헵탄에서 0->100% EtOAc의 구배로 용리시키는 칼럼 크로마토그래피로 산물을 얻었다. M+H에 대한 계산: 635.3; 확인 635.9
SAHA 아민
0.25 mL의 TIS가 첨가된 2 mL의 DCM에서 수베로일(4-[(N-Boc)아미노메틸]아닐라이드) 하이드로삼산 (286 mg, 450 mmol)을 녹였다. 이후 트리플루오로 아세트산 (0.9 mL)을 첨가하였고, 그리고 반응을 30분 동안 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하였고, 그리고 미가공 반응 산물을 제조용 HPLC로 정제하거나 추가 정제 없이 이용할 수 있었다.
PBI-4967 SAHA-TAMRA
Figure pct00003
수베로일[4-(아미노메틸)아닐라이드] 하이드로삼산 미가공 반응 산물 (27 mg)을 5 방울의 TEA와 함께 1 mL의 DMF에서 4 mg (7.6 umol)의 테트라메틸로다민6-석신이미딜 에스테르와 조합하였다. 30분 후, 반응을 H2O 및 MeCN으로 희석시켰고, 그리고 산물을 제조용 HPLC (0.1% 수성 TFA에서 5->60% MeCN)로 단리시켰다. 적절한 분획의 동결건조로 자홍색 고체로서 바람직한 산물을 수득하였다. M+H에 대한 계산: 706.3; 확인 706.6.
PBI-4968 SAHA-TOM
Figure pct00004
수베로일[4-(아미노메틸)아닐라이드] 하이드로삼산 미가공 반응 산물 (8 mg)을 3 방울의 TEA와 함께 0.8 mL의 DMF에서 5 mg (7.6 umol)의 TOM 6-석신이미딜 에스테르와 조합하였다. 30분 후, 반응을 H2O 및 MeCN으로 희석시켰고, 그리고 산물을 제조용 HPLC (0.1% 수성 TFA에서 5->60% MeCN)로 단리시켰다. 적절한 분획의 동결건조로 바람직한 산물을 수득하였다. M+H에 대한 계산: 838.4; 확인 838.7
스타우로스포린-아민
스타우로스포린 p-니트로페닐카르바메이트 (3 mg, 4.8 umol)를 0.5 mL의 DMF에서 녹이고 초과 카다베린으로 처리하였다. 반응을 2시간 동안 70℃ 유조(oil bath)에서 데우고, 그 다음 H2O로 희석시키고, 포름산으로 산성화하고, 그리고 10 mM 수성 NH4OAc에서 25%->75% MeCN로 용리시키는 제조용 HPLC를 수행하였다. 적절한 분획을 동결건조하여 약간 황색인 고체를 산출하였다. M+H에 대한 계산: 595.3; 확인 595.5
PBI-5129 스타우로스포린-TOM
Figure pct00005
스타우로스포린 5-아미노펜틸카르복사미드 (5 mg, 8.4 umol)를 1 mL DMF에서 녹이고 트리에틸아민 및 TOM 6-SE (4 mg, 6 umol)로 처리하였다. 반응을 분석적 HPLC로 모니터링하였다. 반응의 완료시, MeCN 및 H2O를 부가하고, 그리고 소량의 AcOH의 첨가로 TEA를 중화시켰다. 제조용 HPLC (10 mM NH4OAc에서 25%->100% MeOH) 및 차후 농도로는 1.8 mg의 짙은 청색 고체를 수득하였다. M+H에 대한 계산: 1139.5; 확인 1139.8.
다사티닙-TOM
TOM-펜틸아민
Figure pct00006
TOM 6-카르복실산 (26 mg, 46 umol)을 2 당량의 트리에틸아민과 함께 1 mL의 DMF에서 교반하고 TSTU (17 mg, 56.5 umol, 1.2 당량)로 처리하였고, 그리고 반응을 HPLC로 모니터링하였다. 40분 후, 반응을 0.5 mL DMF에서 카다베린 (94 mg, 0.92 mmol, 20 당량)의 용액에 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 이후 반응을 TFA의 첨가로 중화시키고 MeCN 및 물로 희석시켰다. 제조용 HPLC (0.1 % 수성 TFA에서 25->100% MeCN) 및 차후 동결건조는 보라색 고체로서 바람직한 산물을 산출하였다. LCMS: ((M+2H)/2)에 대한 계산 324.4; 확인 324.3.
다사티닙-TOM
Figure pct00007
다사티닙 (25 mg, 51 umol)을 0.9 mL의 2: 1 DMF:THF에서 p-니트로페닐 클로로 포르메이트 (14 mg, 69 umol, 1.36 당량) 및 30 uL TEA와 조합하였다. 반응을 하룻밤 동안 교반하고 이후 35 mg의 추가적인 p-니트로페닐 클로로 포르메이트를 첨가하였다. 추가적인 24시간 동안 교반한 후, ½ 부피의 반응을 30 uL TEA 및 0.5 mL의 DMF에서 7 mg (10 umol)의 TOM-펜틸아민의 용액에 첨가하였다. 이후 반응을 1시간 동안 교반하고 그 다음 MeCN 및 물로 희석시키고 그리고 제조용 HPLC로 정제하였다. 동결건조는 보라색 고체로서 바람직한 산물을 산출하였다. MS: ((M+2H)/2)에 대한 계산 580.8; 확인 581.0.
푸르발라놀 -TOM PBI 5077
Figure pct00008
푸르발라놀 (10 mg, 23 umol)을 20 mg의 TEA (198 umol)와 함께 1 mL의 DMF에서 교반하고 그리고 7.7 mg (25.4 umol, 1.1 당량)의 TSTU로 처리하였다. 30분 후, 반응을 Et2O로 희석시켰고 그리고 총 반응 부피의 ½을 6 mg (9 umol)의 TOM (5-아미노펜틸)-6-카르복사미드를 함유한 유리병에 첨가하였다. 3시간 동안 반응을 교반하였고, 그리고 감압 하에 휘발성 유기물을 제거하였다. 결과적 DMF 용액을 물 및 MeCN으로 희석시키고 TFA로 산성화하였고, 이후 산물을 제조용 HPLC (0.1% 수성 TFA에서 25->100% MeCN) 및 차후 동결건조로 단리시켜 3.5 mg의 보라색 고체를 수득하였다. MS: M+H에 대한 계산: 1061.5, 확인 1061.6.
실시예 9
본 발명의 화합물 식별 방법에서 Renilla 루시퍼라아제 또는 NanoLuc 루시퍼라아제의 용도
3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD(Promega Corporation)를 이용하여 NanoLuc-p38알파 또는 Renilla Luc-p38알파를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다 (50ng/웰의 DNA를 수득하기 위함). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 1uM의 BIRB796의 존재/부재에서 연속으로-희석된 PBI-4838 (TOM 염료에 접합된 BIRB796 유도체)과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. Renilla Luc-발현 샘플에, 고유 코엘렌테라진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과(bandpass) 및 630nm 장파장 통과(longpass) 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다.
도 9는 Renilla 루시퍼라아제 및 NanoLuc 루시퍼라아제 둘 모두가 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다는 점을 입증한다. 연속으로-희석된 PBI-4838로 NanoLuc-p38알파 또는 Renilla Luc-p38알파를 발현하는 세포의 처리시, BRET에서 용량-의존 증가를 관찰하였다. 비표지 BIRB-796의 포화 농도는 이 BRET 신호를 차단할 수 있으며, 이는 p38알파와의 루시퍼라아제 융합을 이용한 결합의 특이성을 명시한다.
실시예 10
NanoLuc-p38 알파에 대하여 TOM-BIRB 대 TMR-BIRB의 비교
상기 설명된 바와 같이, Fugene HD를 이용하여 NanoLuc-p38알파를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 96-웰 평판 내로 접종하였다 (50ng/웰의 DNA를 수득하기 위함). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 1uM의 BIRB796의 존재/부재에서 연속으로-희석된 PBI-4838 (TOM 염료에 접합된 BIRB796 유도체) 또는 PBI-4836 (TMR 염료에 접합된 BIRB 유도체)과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다.
도 11은 세포-기반 형식에서 표적 단백질과 결합하는 것에 대해 TMR 부가물에 비하여 TOM 부가물의 증가된 효력의 또 다른 예시를 입증한다. NanoLuc-p38알파 결합에 대한 용량-반응 곡선은 BIRB-TMR 접합체에 대한 450nM의 EC50과 비교하여, BIRB-TOM 접합체 38nM의 EC50을 명시한다. BIRB-TOM의 보고된 친화도는 BIRB-TMR과 비교한 논문 보고서와 더욱 일치한다 (Chem Biol Drug Des 2009; 74: 547-559).
실시예 11
PKC알파-NanoLuc에 대하여 BIM-TOM 대 BIM-TMR의 비교
상기 설명된 바와 같이, Fugene HD를 이용하여 PKC알파-NanoLuc를 인코딩하는 플라스미드 DNA (pGEM3Z 담체 DNA 내에서 1:1000 희석됨)로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 96-웰 평판 내로 접종시켰다 (50ng/웰의 총 DNA를 수득하기 위함). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 5uM의 스타우로스포린의 존재/부재에서 연속으로-희석된 PBI-5075 (TOM 염료에 접합된 BIM) 또는 PBI-5051 (TMR 염료에 접합된 BIM)과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다. 특이적인 BRET 신호를 결정하기 위해, 추적자 + 비표지 스타우로스포린의 각각의 농도에서의 BRET 비를 비표지 스타우로스포린 없이 추적자의 각각의 농도에서의 BRET 비로부터 공제하였다.
도 12는 투과성 세포 형식에서 표적 단백질과 결합하는 것에 대해 TMR 부가물에 비하여 TOM 부가물의 증가된 효력의 또 다른 예시를 입증한다. PKC알파-NanoLuc 결합에 대한 용량-반응 곡선은 BIM-TMR 접합체에 대한 극적으로 우측-이동 효력과 비교하여, BIM-TOM 접합체에 대한 483nM의 EC50을 명시한다. BIM-TOM의 보고된 친화도는 BIM-TMR과 비교한 논문 보고서와 더욱 일치한다 (J Biol Chem. 1991 Aug 25; 266(24): 15771-81.).
실시예 12
선별성의 p38/MAPK 경로-결정에 걸친 표적 식별
다음 실시예는 주어진 계통발생 표적 패밀리 내에서 추정되는 표적의 패널에 대하여 약물 추적자의 선별성을 프로파일링하는 능력을 입증하는 역할을 한다. 세포에서 BRET를 이용하여 형광으로 표지된 약물의 표적을 식별하는 데에 유사한 실험 구성을 이용할 수 있다. 이 구성은 1차 약물 표적, 그리고 오프-타깃 상호작용자의 식별을 초래할 수 있다. 다수 표적의 인게이지먼트는 약물 무차별 및 잠재적인 약물 부작용을 나타낼 수 있다. 이 실시예는 BRET를 통해 일차, 그리고 이차 표적 상호작용 둘 모두를 측정하는 능력을 입증하는 역할을 한다.
3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD(Promega Corporation)를 이용하여 MAPK 경로 (각각 Jnk1, Jnk2, Jnk3, p38알파, p38베타, p38감마, p38 델타, 또는 PKC알파 또는 MAPK 8, 9, 10, 14, 11, 12, 또는 13, PKC알파)의 다양한 구성원과의 N 또는 C-말단 NanoLuc 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다 (50ng/웰의 DNA를 수득). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 4uM의 BIRB796의 존재 또는 부재에서 2uM PBI-4838과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다. 반응 비를 결정하기 위하여, 추적자를 단독으로 가진 BRET 값을 추적자 + 비변형 BIRB796을 가진 BRET 값으로 나누었다.
도 13은 논문 보고서와 일치하는, Jnk2, p38베타 및 p38알파에 대한 PBI-4838의 선별성을 명시한다. P38알파는 BIRB796의 1차 표적으로서 인식된다. 하지만 Jnk2 및 p38베타와 같은 표적과의 상호작용은 잠재적인 오프-타깃 불이익을 명시할 수 있었다. 예상된 바와 같이, PBI-4838과 조합된 PKC알파-NanoLuc 융합물은 이 표적에 대하여 BIRB796에 대한 불량한 친화도 때문에 상대적으로 작은 특이적 BRET를 보여주었다.
실시예 13
친화도의 p38/MAPK 경로-결정에 걸친 표적 식별
다음 실시예는 주어진 계통발생 표적 패밀리 내에서 추정되는 표적의 패널에 대하여 약물 추적자의 친화도를 프로파일링하는 능력을 입증하는 역할을 한다. 세포에서 BRET를 이용하여 주어진 표적에 대한 형광으로 표지된 약물의 친화도를 특성화하는 데에 유사한 실험 구성을 이용할 수 있다.
3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD(Promega Corporation)를 이용하여 NanoLuc-p38알파, NanoLuc-p38베타, Jnk2-NanoLuc, PKC알파-NanoLuc, 또는 NanoLuc-HDAC6을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다 (50ng/웰의 DNA를 수득). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 4uM의 BIRB796의 존재 또는 부재에서 연속으로-희석된 PBI-4838과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 샘플의 세트를 분리하기 위하여, 1uM PBI-4838의 존재에서 연속으로-희석된 BIRB796으로 형질감염된 세포를 처리하였다. NanoLuc-발현 샘플에, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다.
도 14 및 15는 Jnk2, p38베타, 및 p38알파에 대한 PBI-4838의 명확한 친화도를 입증한다. 예상된 바와 같이, PKC알파 및 HDAC6는 이들 표적에 대한 PBI-4838의 불량한 친화도 때문에 상대적으로 작은 특이적 BRET를 보여주었다. 추가로, 세포에서 경쟁적 이동으로 Jnk2, p38알파, 및 p38베타에 대한 BIRB796의 높은 친화도를 입증한다. 표적의 주어진 세트 (BRET에서의 증가에 의해) 또는 비변형 약물 (경쟁적 이동에 의해)에 대한 약물 추적자의 친화도의 순위를 매기기 위해 유사한 실험을 구성할 수 있었다. 상기 명시된 바와 같이, Jnk2 및 p38 베타와 같은 표적과 고-친화성 상호작용은 잠재적인 오프-타깃 불이익을 명시할 수 있었다.
실시예 14
표적 단백질의 야생형 대 돌연변이 버전에 대한 약물 추적자의 친화도 결정
다음 실시예는 야생형 대 돌연변이 표적 단백질에 대한 약물 추적자의 상대적인 친화도를 측정하는 능력을 입증하는 역할을 한다. 이 실시예에서, BRD4 (브로모도메인-함유 단백질 4)의 야생형 및 돌연변이 버전 (N140A/N433A; iBET에 대한 전체 결합 능력이 결핍)에 대한 형광으로-표지된 iBET 화합물 (BRD4를 결합시키는 소-분자 저해제, 이는 아세틸화된 히스톤과 이의 상호작용을 방지함)의 친화도를 결정하였다. 세포에서 질병-관련 돌연변이 단백질에 대한 형광으로-표지된 약물의 친화도 및 선별성을 특성화하는 데에 유사한 실험 구성을 이용할 수 있다. 이러한 실험은 상이하게 야생형 또는 돌연변이 단백질과 선별적으로 결합하는 약물을 식별하는 데에 유용할 수 있다.
3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD(Promega Corporation)를 이용하여 NanoLuc-BRD4 또는 NanoLuc-BRD4 (N140A/N433A)를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다 (50ng/웰의 DNA를 수득). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 10uM의 iBET의 존재/부재에서 연속으로-희석된 PBI-4966 (TOM 염료에 접합된 iBET)과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다.
도 16은 야생형 BRD4 대 돌연변이 BRD4에 대한 PBI-4966의 상대적인 친화도를 명시한다. 예상된 바와 같이, PBI-4966에 대한 낮아진 친화도를 명시하는 돌연변이 BRD4로 우측-이동 효력을 관찰한다. 표적의 질병-관련 돌연변이에 대한 약물 추적자의 친화도의 순위를 매기기 위해 유사한 실험을 구성할 수 있었다. 이 원리는 경쟁적 추적자 이동으로 야생형 또는 돌연변이 단백질에 대한 약물의 상대적인 친화도를 측정하는 것으로 확장될 수 있었다. 증가된 BRET 신호가 NanoLuc 융합물과의 결합만을 나타나기 때문에, 이 방법은 어세이 샘플에 존재하는 유사한 항원의 복합 혼합물 중에 표적 인게이지먼트의 측정을 가능하게 한다. 이들 항원은 유사한 특성을 가지지만 관심 표적과 비-동일한 표적을 포함할 수 있었다 (예를 들면, 이종 대 내인성 분해물질 또는 돌연변이 대 야생형 분해물질 등을 구별하기 위함).
실시예 15
표적 인게이지먼트를 결정하기 위한 화합물 패널을 스크리닝
다음 실시예는 본 발명의 방법이 표적 인게이지먼트를 결정하기 위한 화합물 패널을 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다는 점을 입증한다. 이 스크리닝 방법은 더 큰 화합물 라이브러리 (가령 LOPAC)로도 확장될 수 있었다.
Fugene HD를 이용하여 NanoLuc-HDAC6 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 96-웰 평판 내로 접종하였다. 형질감염을 위하여, 프로모터가 없는 담체 DNA (pGEM3Z)로 NanoLuc-HDAC6 DNA를 희석시켰다. 최종 DNA 농도/웰은 50ng/웰로 남아 있었다; 하지만 NanoLuc-HDAC6 DNA를 1:1000 희석시켰다 (96-웰 형식에서 20,000개 세포/웰의 접종 밀도로). 24시간 형질감염-후, 고정된 농도 (1uM)의 SAHA-TOM 접합체 (PBI-4968)의 존재에서 연속으로-희석된 저해제 (도 17을 참고)로 세포를 처리하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 푸리마진을 20uM까지 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 검출하였다.
도 17에서의 결과는 본 발명의 방법을 이용하여 약물 추적자의 경쟁적 이동에 의해 구조적으로-구별되는 화합물이 식별될 수 있다는 점을 입증한다. 추가로, 다양한 화합물 클래스의 상대적인 효력을 확인할 수 있다. 결과는 HDAC6과의 파나비노스태트(panabinostat) 또는 SAHA의 높은 결합 효능과 비교하여 HDAC6과의 아피시딘의 결합 효능이 거의 없음/없음을 명시한다. 이것은 직교 어세이 형식을 이용한 논문 보고서와 일치한다. 이 스크리닝 방법은 주어진 표적에 대하여 잠재적인 저해성을 가진 새로운 화학 물질을 식별/특성화하기 위해 거대 화학 라이브러리의 고속-대량 스크리닝을 포함하는 것으로 확장될 수 있었다.
실시예 16
약물-표적 상호작용을 모니터링
유의적인 스펙트럼 중첩의 형광단의 존재에서 고도의 비-특이적 BRET가 루시퍼라아제를 함유한 배지에서 일어난다는 점이 일반적으로 받아들여진다 (Couturier 2012). 이것은 고속-대량 화학적 스크린을 위해 BRET를 이용한 불이익으로서 설명되었다. 다음 실시예는 BRET에 대한 문제점으로서 일반적으로 인식되는 농도 범위의 배지에서, 루시퍼라아제, NanoLuc의 존재에서 형광단-약물 접합체를 이용하여 약물/표적 상호작용을 모니터링하는 능력을 입증하는 역할을 한다.
3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD (Promega Corporation)를 이용하여 CDK2-NanoLuc (pGEM3Z 담체 DNA 내로 1:100 희석됨)를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 그리고 웰당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판의 웰 내에 접종하였다 (50ng/웰의 총 DNA를 수득함). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 10uM의 푸르발라놀 B의 존재/부재에서 연속으로-희석된 PBI-5077 (TOM 염료에 접합된 푸르발라놀 B)과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
NanoLuc-발현 샘플에, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 630nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다 (도 18).
이 실시예는 BRET를 통해 약물/표적 상호작용을 모니터링하기 위한 배지내 형광단 추적자의 용도를 뒷받침한다. 푸르발라놀 B (비변형 약물)과 샘플 (+ 약물 추적자)을 공동-인큐베이션함으로써, NanoLuc 및 추적자 사이의 비-특이적 BRET 신호를 측정할 수 있다. 검사된 추적자 농도 범위에 걸쳐, 이 백그라운드 BRET 신호는 낮았다. 이들 결과는 약물 추적자 및 Nano Luc-표적 융합물 사이의 특이적인 결합이 NanoLuc (공여자) 및 형광단 (수용자) 사이의 유의적인 스펙트럼 중첩에도 불구하고 세포 배지에서 모니터링될 수 있다는 점을 입증한다.
실시예 17
단백질 어레이를 이용하여 표적 ID 스크리닝
다음 실시예는 무-세포 발현을 이용하여 NanoLuc 융합 어레이를 발생시키는 능력 및 BRET로 약물 결합 및 상대적인 친화도를 측정하는 능력을 입증한다.
BIRB796의 추정되는 표적 (가령 MAPK 및 Jnk 패밀리의 구성원), 다사티닙의 추정되는 표적 (가령 Src 및 LCK) 그리고 무관한 HDAC6 음성 대조를 비롯하여 11개 키나아제 (N- 및 C-말단 NanoLuc 융합물)의 패널을 제조자에 의해 권장된 바와 같은 TNT® T7 Quick Coupled Reticulocyte Transcription/Translation System (Promega Corporation)에서 발현시켜 23개의 상이한 NanoLuc 융합물으로의 어레이를 형성하였다. 각각의 TNT® 반응을 PBS에서 1:100 희석시키고 그리고 96-웰 평판의 웰 내에 반복하여 도말하였다. 초과된 무관련 약물의 존재 및 부재에서 2개의 상이한 TOM-약물 추적자 (BIRB-TOM;PBI-4838 및 다사티닙-TOM; PBI-5170)로 NanoLuc 융합 어레이를 스크리닝하였다. 각각의 TNT® 반응을 위하여, 2uM BIRB TOM으로 4회 반복실험/ 2uM BIRB-TOM +4uM BIRB796으로 4회 반복실험 (전체 2x 96-웰 평판) 및 1uM 다사티닙-TOM으로 4회 반복실험/ 1uM 다사티닙-TOM+5uM 다사티닙으로 4회 반복실험 (전체 2x 96-웰 평판)을 수행하였다. 실온에서 2시간 동안 일정하게 혼합하면서 반응을 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 610nm 장파장 통과 여과기가 장착된 Varioskan 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 610 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다. 반응 비를 결정하기 위하여, 추적자를 단독으로 가진 BRET 값을 추적자 + 비변형을 가진 BRET 값으로 나누었다.
결과 (도 19)는 논문 보고서와 일치하는 JNk2, JNk3, MAPK14, MAPK11 및 MAPK13에 대한 BIRB-TOM 추적자의 선별성 그리고 ABL1, Src, LCK, MEK5, MAPK11 및 MAPK14에 대한 다사티닙-TOM 추적자의 선별성을 입증한다. 이들 결과는 무세포 발현 시스템에서 발현된 추정되는 표적의 패널에 대하여 약물 추적자의 것을 프로파일링하는 능력 및 유효물질을 식별하는 능력을 입증한다. 이 무세척 단백질 NanoLuc 융합 어레이 구성은 1차 약물 표적, 그리고 오프-타깃 상호작용자의 식별을 초래할 수 있다.
상기 스크린 후, BIRB-TOM 추적자에 대한 결합 친화도 및 BIRB796과 BIRB TOM 추적자의 경쟁적 이동에 대해 BIRB-TOM 유효물질을 추가로 분석하였다. 10uM의 BIRB796의 존재/부재에서 연속으로-희석된 BIRB-TOM 추적자와의 3회 반복의 희석된 TNT 반응을 인큐베이션함으로써 BIRB-TOM 추적자에 대한 결합 친화도 실험을 수행하였다. 2시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 반응을 인큐베이션하고 그리고 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가한 후 상기 설명된 바와 같이 분석하였다. 2uM의 BIRB-TOM 추적자의 존재에서 연속으로-희석된 BIRB796과의 3회 반복의 희석된 TNT 반응을 인큐베이션함으로써 경쟁적 이동 실험을 수행하였다. 2시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 반응을 인큐베이션하고 그리고 푸리마진을 20uM의 최종 농도까지 첨가한 후 상기 설명된 바와 같이 분석하였다. 도 19에서의 경쟁적 이동 실험 결과는 BIRB796이 MAPK11, MAPK13, 및 Jnk3에 대한 더 낮은 친화도와 함께 MAPK14 및 Jnk2에 대한 가장 높은 친화도를 가졌다는 점을 명시한다. 논문 보고서와 일치하여, BIRB796은 MAPK14와 효율적으로 결합하지만, 또한 BIRB-796에 대한 오프-타깃 불이익을 명시하는 다른 MAPK 및 Jnk 패밀리와 맞물리기도 한다. 이들 결과는 무세포 발현 시스템에서 발현되고 단백질 어레이 스크린에서 식별된 유효물질이 약물에 대한 결합 친화도를 위해 BRET로 추가 분석될 수 있다는 점을 입증한다. 추가로, 이들 결과는 표적 인게이지먼트 적용을 위한 적합한 분해물질로서 NanoLuc 단백질 융합물을 발생시키기 위해 무-세포 발현 시스템의 용도를 뒷받침한다.
실시예 18
NanoLuc 융합물의 발현 수준
다음 실시예는 NanoLuc 융합물의 발현이 내인성 수준에 근접할 때 백그라운드에 대한 최적 신호와 약물 추적자와의 고친화성 상호작용이 성취된다는 점을 입증한다. 이전에 설명된 바와 같이, 담체 DNA로 NanoLuc HDAC6 DNA의 1:1000 희석이 고친화성 상호작용을 성취하기 위해 요구된다는 점을 입증하였다. 이 실시예에서, NanoLuc HDAC6 DNA의 연속 희석의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 내인성 HDAC6의 발현과 비교하였다.
HEK293 세포를 2.5x105 세포/웰로 6-웰 평판의 웰 내에 접종하고 변화하는 양의 NanoLuc HDAC6 DNA를 가진 PEI로 형질감염시켰다. 비-발현 담체 DNA (pCI 네오)로 NanoLuc HDAC6 DNA를 희석시켰다. DNA의 최종 농도는 2ug/웰로 남아 있었던 반면에 NanoLuc HDAC6 DNA는 1:0, 1:10, 1:100, 1:1000 및 1:10000 희석시켰다. 대조는 형질감염되지 않은 세포였다. 24시간 형질감염 후, 배지를 제거하였고, 그리고 세포를 PBS로 세척하고 400ul의 포유류 용해 완충액 (Promega) +1:50 RQ1 DNase (Promega) +1x RQ1 완충액으로 10분 동안 용해시켰다. 용해 후, 133ul의 4X SDS-로딩 완충액을 각각의 웰에 첨가하였고, 그리고 세포 용해물을 수집하고 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 그리고 PVDF 막 (Invitrogen) 상에서 전기-이동시켰다. 막을 TBS 완충액에서 5 % BSA (Promega)로 1시간 동악 차단시키고 0.1% 트윈 (TBST)으로 보충된 TBS에서 HDAC6 항체 (Millipore)의 1:500 희석으로 4℃에서 하룻밤 동안 탐색하였다. TBST에서 3 x 세척 후, 막을 1시간 동안 TBST에서 항-토끼 HRP 항체 (Jackson)와 인큐베이션하고, 그 다음 TBST로 5 x 그리고 TBS로 1 x 세척하였다. 이후 막을 Promega로부터의 ECL 기질로 1분 동안 인큐베이션하고 그리고 Image Quant LAS4000 (GE)에서 스캔하였다. 결과 (도 10)는 NanoLuc HDAC6 DNA의 1:1000 희석이 내인성 HDAC6의 발현 수준과 유사한 발현 수준으로 결과로서 생긴다는 점을 명시한다. 이것은 백그라운드에 대해 최적의 신호를 가진 약물 추적자와의 고친화성 상호작용을 제공하였던 동일안 희석이다.
실시예 19
세포 표면 수용체 및 NanoLuc의 융합물과 형광 사이토카인의 결합의 정량화
형광으로-표지된 사이토카인의 경쟁적 이동으로 세포 표면 수용체에 대하여 치료학적 항체의 상대적인 친화도를 측정하는 능력을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 이 실시예에서, NanoLuc-EGFR (Her1) 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 이용하여 상업적으로-이용가능한 TAMRA-표피 성장 인자 (TMR-EGF; Life Technologies)를 세포 BRET 어세이에서 적용한다. TMR-EGF 및 NanoLuc-EGFR 사이에서 발생된 BRET 신호는 EGF의 결합을 방해하는 것으로 공지된 치료학적 항체로 처리시 저해될 수 있다.
pF5 NanoLuc-EGFR 플라스미드 DNA (Promega Corp.) 및 FuGene HD (Promega Corp.)의 형질감염으로 HEK293 안정한 세포주를 발생시켰다. 형질감염 후, 안정한 세포주를 G418 선별, 그 다음 제한된 희석 클로닝(cloning)으로 발생시켰다. NanoLuc-EGFR을 발현하는 클론에 의하여-유래된 세포를 웰 당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다. 접종 후 20시간에, 배지를 무-혈청 OptiMEM으로 교체하였고 그리고 세포를 혈청 결핍시켰다. 결핍 후, 세포를 연속으로-희석된 TMR-EGF (Life Technologies)로 처리하였다. TMR-EGF로 평형화 후, 푸리마진 (NanoLuc를 위한 코엘렌테라진 유도체 기질; Promega Corp.)을 20uM의 농도로 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 정량화하였다. 차후 실험에서, TMR-EGF (10ng/mL 최종 농도)로 자극하기에 앞서 벡티빅스, 얼비툭스, 또는 헤르셉틴 (음성 대조)으로 세포를 전처리함으로써 TMR-EGF의 항체-매개된 이동을 측정하였다.
도 20에서의 결과는 BRET가 NanoLuc와 테더링된 세포 표면 수용체와 형광 사이토카인의 결합을 정량화하는 데에 이용될 수 있다는 점을 입증한다. 추가로, 사이토카인 결합을 저해할 수 있는 치료학적 항체의 친화도를 형광 사이토카인의 경쟁적 이동으로 측정할 수 있다. 벡티빅스 및 얼비툭스는 NanoLuc-EGFR과 TMR-EGF의 결합을 저해할 수 있었던 반면에, 헤르셉틴 (Her1에 대해 무시해도 될 정도의 친화도를 가진 Her2 결합제)은 TMR-EGF 결합을 저해할 수 없었다. 이 실시예는 공지된 고-친화성 표적과 형광 사이토카인의 결합은 형광 사이토카인의 경쟁적 이동으로 치료학적 항체 (가령 벡티빅스, 얼비툭스 등) 또는 다른 결합제 (가령 사이토카인 생물학)의 결합을 모니터링하기 위해 쉽게 구성될 수 있는 형식에서, BRET으로 정량화될 수 있다는 점을 입증한다. 이것은 세포 형식에서 생물학적 약물의 상대적인 효력을 측정하기 위한 기술로서 BRET를 이용하는 능력을 입증한다.
실시예 20
BRET 적용
몇몇 구체예에서, 본 발명은 합쳐진 다음의 세 가지 모이어티의 검출/측정을 가능하게 한다: (1) 생물발광 리포터 단백질의 펩티드 및 (2) 복합체를 형성하기 위해 구조적 상보성을 통해 상호작용하는 생물발광 리포터 단백질의 폴리펩티드, 및 (3) 형광 제3 모이어티 (가령, 형광 소분자).
A) 이 실시예는 에너지가 생물학적 복합체를 형성하는, 구조적으로 상보적인 펩티드 (서열 번호: 6) 및 폴리펩티드 (서열 번호: 7)로부터 형성된 생물발광 복합체로부터 전이한다는 점을 입증한다. 형광 염료는 상보적인 펩티드 서열에 부착되었다. 대안으로, 형광 단백질은 펩티드 또는 폴리펩티드 (가령, 유전적 구조체로부터 형성됨)와 융합될 수 있었다 (가령, 융합 단백질).
상보적인 폴리펩티드 서열을 발현하는 대장균(E. coli) 정화된 용해물을 제조하였다 (폴리 용해물). 40uL의 폴리 용해물을 10uL의 상보적인 펩티드 (pep) 또는 형광으로-표지된 상보적인 펩티드 (pep-TMR)와 혼합하고 그리고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 50mM HEPES pH 7.4에서 복합체 (푸리마진)를 위한 50uL 100uM 기질을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. TECAN M1000에서 400-700nm에 걸쳐 발광을 측정하였다.
도 21은 Poly/Pep 복합체 (공여자)에서부터 TMR (수용자)로의 매우 효율적인 에너지 전이, 그리고 방출되는 빛의 파장에서 상응하는 적색 이동을 예증한다.
B) 이 실시예는 검출에서 BRET를 이용하는 것, 가령 소분자 농도 또는 효소 활성을 검출하는 것을 입증한다. 에너지 전이가 거리에 매우 의존적이기 때문에, 에너지 전이의 규모는 종종, 시스템의 형태와 관련될 수 있다. 예를 들면, 에너지 전이의 조절을 통해 칼슘 농도를 측정하는 데에 칼슘을 킬레이트화하는 폴리펩티드의 삽입을 이용할 수 있다.
상기와 같이 센서의 형태 변화를 야기하는 것을 통해 또는 형광 모이어티로부터 센서의 절단을 통해, 거리를 또한 변화시키는 효소는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 시스템을 통해 측정할 수 있다. 복합체의 구조적으로 상보적인 하나의 구성원은 생물발광 리포터 단백질의 구조적으로 상보적인 펩티드 및 폴리펩티드가 상호작용할 때, 이의 에너지를 전이하는 형광 모이어티와 결합된다. 이것의 한 가지 예시는 만들어진 펩티드 센서이며 여기서 펩티드는 링커 (가령, DEVD 카스파제-3 절단 부위)를 통해 형광 염료에 접합된다. 상보적인 폴리펩티드에 노출될 때, 에너지 전이가 관찰된다. 카스파제-3에 노출될 때, 복합체로부터 형광 모이어티가 방출되고, 그리고 에너지 전이는 제거되지만 460nm에서 발광은 남아 있는다.
상보적인 폴리펩티드 (서열 번호: 8) 및 NL-HT (HaloTag와 융합된 NanoLuc)를 정제하였다. 20uL의 8pM NL-HT를 20uL의 100nM PBI-3781과 혼합하고 (가령, 미국 특허 출원 일련 번호 제13/682,589호를 참고하며, 이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨) 그리고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 40uL NanoGlo+100uM 푸리마진을 첨가하였고, 그리고 TECAN M1000에서 300-800nm에 걸쳐 발광을 측정하였다.
20uL의 33ng/uL의 상보적인 폴리펩티드 (서열 번호: 6)를 20uL의 ~500uM PBI-5074 (형광 염료-링커-상보적인 펩티드)와 혼합하였다. 40uL NanoGlo+100uM 푸리마진을 첨가하였고, 그리고 TECAN M1000에서 300-800nm에 걸쳐 발광을 측정하였다.
도 22는 상보적인 펩티드/폴리펩티드 복합체 (공여자)에서부터 PBI-5074의 TOM-염료 (수용자)로의 에너지 전이, 그리고 방출되는 빛의 파장에서 상응하는 적색 이동을 예증한다.
C) 3원 상호작용
구조적으로 상보적인 한 쌍의 생물발광 리포터 단백질로의 에너지 전이를 또한 3개의 분자 상호작용을 측정하는 데에 이용할 수 있다. 하나의 예시는 생물발광 리포터 단백질의 상보적인 폴리펩티드와 융합된 GPCR 및 생물발광 리포터 단백질의 상보적인 펩티드와 융합된 GPCR 상호작용 단백질이며 그들은 그들이 상호작용할 때 생물발광 복합체를 형성한다. 이것은 2원 상호작용의 측정을 허용한다. 에너지 전이를 위해 형광 모이어티를 포함한 소분자 GPCR 리간드가 복합체와 상호작용한다면, 에너지 전이가 일어난다. 따라서, 2원 단백질-단백질 상호작용 및 3원 약물-단백질-단백질 상호작용은 동일한 실험에서 측정된다. 또한, 형광 분자는 오로지, 단백질 쌍과 상호작용할 때 신호를 야기하며, 이는 불활성 단백질과 상호작용하는 리간드로부터의 임의의 신호를 제거한다 (도 23).
실시예 21
다-성분 공여자로 BRET
다음 실시예는 리간드-수용체 상호작용이 다-성분 발광 공여자로부터의 에너지 전이를 통해 모니터링될 수 있고, 여기서 빛 방출은 공여자 성분의 동시 존재를 요구한다는 점을 입증한다. 이 실시예에서, 공여자는 두 개의 상보적인 하위단위, 11S 폴리펩티드 및 PEP-80 펩티드로 구성된다. 11S 폴리펩티드는 HEK293 세포에서 발현된 융합 단백질, 그리고 BRD4의 N-말단과 유전적으로 테더링되었다. 푸리마진 () 및 PEP-80 상보적인 폴리펩티드 둘 모두의 존재에서만 융합 단백질로부터 발광이 발생되었다 (도 24A). 푸리마진 단독 (Pep-80 펩티드 없음)과 인큐베이션된 세포 용해물은 유의적인 공여자 신호 또는 수용자 신호를 발생시키지 않았다 (도 24A, 25 A). 형광 BRD4 리간드 (iBET-NCT)의 용액이 적용되었을 때, 용량-의존 BRET 신호는 PEP-80 펩티드의 존재에서만 발생되었다 (도 24B, 25A, 25B). 추가로, 이 BRET 신호는 신호 특이성을 입증하는 비-형광 BRD4 리간드의 경쟁적 결합을 통해 감소될 수 있었다 (도 25 A).
Fugene HD를 이용하여 11S-BRD4 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시키고 96-웰 평판 형식에 접종하였다. 형질감염을 위하여, 프로모터가 없는 담체 DNA (pGEM3Z)로 11S-BRD4 DNA를 희석시켰다. 최종 DNA 농도/웰은 50ng/웰로 남아 있었다; 하지만 11S-BRD4 DNA를 1:10 (96-웰 형식에서 20,000개 세포/웰의 접종 밀도로) 희석시켰다. 24시간 형질감염-후, 1uM PEP-80 펩티드의 존재 또는 부재에서 세포를 OptiMEM + 50ug/mL 디기토닌에서 용해시켰다. 이후 특이성 대조로서 10uM iBET의 존재 또는 부재에서 연속으로-희석된 iBET-NCT (PBI-4966)로 세포를 처리하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 푸리마진을 10uM까지 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 검출하였다.
다성분 발광 공여자의 성분에 복합체의 구성원을 연결시킴으로써 단백질 복합체에 대한 형광으로 표지된 리간드의 근접성을 검출하는 것 (가령 헤테로이합체 또는 호모이합체 수용체에 선별적으로 결합하는 리간드를 검출하는 것)에 이 실시예에 의해 예증된 개념을 적용시킬 수 있다. 따라서 질병-관련 단백질 복합체 내에서 표적 인게이지먼트를 모니터링하는 데에 이 적용을 이용할 수 있었다.
실시예 22
세포내 리간드-수용체 상호작용은 단백질 복합체로부터의 에너지 전이를 통해 모니터링될 수 있고, 여기서 빛 방출은 단백질 간의 상호작용에 의해 촉진되는, 발광 공여자 성분의 근접성을 요구하다는 점을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 이 실시예에서, 공여자는 두 가지 하위단위, 11S 펩티드 및 114 펩티드로 구성된다. 11S 펩티드는 BRD4의 N-말단과 유전적으로 테더링되었고, 그리고 114 펩티드는 히스톤 H3.3의 C-말단과 유전적으로 테더링되었다. 이들 융합 단백질은 HEK293 세포에서 동시에 발현되었다. 발광은 두 융합 구조체 모두의 존재에서만 융합 단백질로부터 발생되었다 (도 26A). 11S-BRD4 단독, H3.3-114 단독 또는 다양한 대조 구조체를 발현하는 세포는 유의적인 공여자 신호 또는 수용자 신호를 발생시키지 않았다 (도 26). 형광 BRD4 리간드 (iBET-NCT/PBI-4966)의 용액이 적용되었을 때, 용량-의존 수용자 신호는 11S-BRD4 및 히스톤 H3.3-114로 공동-형질감염된 샘플에서만 발생되었다 (도 27). BRET 비 (610/450)로서 발현되었을 때, 11S 및 114 하위단위 그리고 iBET-NCT 또는 NANOLUC-BRD4 및 iBET-NCT의 촉진된 복합체에서만 특이적인 BRET를 관찰하였다. 추가로, 이 BRET 신호는 신호 특이성을 입증하는 비-형광 BRD4 리간드 (IBET 151)의 경쟁적 결합을 통해서 용량-의존 방식으로 감소되었다 (도 28).
Fugene HD를 이용하여 BRD4 DNA 융합 구조체 +/- 히스톤 H3.3 DNA 융합 구조체로 HEK293 세포를 형질감염시키고 96-웰 평판 형식에 접종하였다. 형질감염을 위하여, 프로모터가 없는 담체 DNA (pGEM3Z)로 리포터 구조체를 희석시켰다. 최종 DNA 농도/웰은 50ng/웰로 남아 있었다; 하지만 각각의 DNA 발현 구조체를 1:10 (96-웰 형식에서 20,000개 세포/웰의 접종 밀도로) 희석시켰다. 24시간 형질감염-후, 특이성 대조로서 10uM iBET 151의 존재 또는 부재에서 연속으로-희석된 iBET-NCT (PBI-4966)로 세포를 처리하였다. iBET-151이 용량-의존 방식으로 iBET-NCT 추적자와 경쟁할 수 있는지 결정하기 위하여, 고정된 농도 (2uM)의 iBET-NCT/PBI-4966 추적자의 존재에서 연속으로 희석된 iBET-151로 형질감염된 세포를 처리하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 푸리마진을 10uM까지 첨가하였고, 그리고 Varioskan 광도계에서 BRET를 검출하였다.
다성분 발광 공여자의 성분에 복합체의 구성원을 연결시킴으로써 단백질 복합체에 대한 형광으로 표지된 리간드의 근접성을 검출하는 것 (가령 헤테로이합체 또는 호모이합체 수용체에 선별적으로 결합하는 리간드를 검출하는 것)에 이 실시예에 의해 예증된 개념을 적용시킬 수 있다. 단백질 복합체 내에서 표적 인게이지먼트를 모니터링하는 데에 이 적용을 이용할 수 있었다. 더욱이, 이 기술은 질병-관련 세포내 단백질 복합체에 선별적인 화합물의 식별 또는 특성화를 가능하게 하였다.
실시예 23
BRET를 이용하여 주어진 계통발생 표적 패밀리 내에서 추정되는 표적의 패널에 대하여 약물의 세포내 선별성 및 친화도를 프로파일링하는 능력을 입증하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안 실험을 수행하였다. 이 실시예에서, 세포 내에서 클래스 I/II/IV (비-시르투인) HDAC의 전체 패널에 걸쳐 Vorinostat (SAHA)의 인게이지먼트를 프로파일링한다. 첫 번째로, BRET를 이용하여 다양한 NANOLUC/HDAC 융합물에 대하여 형광 SAHA 유도체 (SAHA-NCT)를 프로파일링한다. 일단 개별적인 NANOLUC/HDAC 융합물 및 SAHA 추적자 사이에서 에너지 전이가 확인되면, 각각의 에너지 전이 복합체의 경쟁적 방해로 SAHA의 친화도가 결정된다. 이후 각각의 실험에서 발생된 IC50 값으로 친화도를 추론할 수 있다. 추가로, 표적 단백질의 분리된 도메인과의 NANOLUC의 유전적 융합을 통해 개별적인 도메인에 대한 저해제의 친화도를 결정할 수 있다.
세포 내에서 개별적인 HDAC에 대한 SAHA 추적자 친화도의 결정. 비-시르투인 히스톤 데아세틸라아제 (HDAC 1-11)의 전체 패밀리와의 NANOLUC 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HeLa 세포를 형질감염시켰다. pGEM3Z 담체 DNA 내로 1:100의 질량 비로 각각의 DNA 구조체를 희석하고 그리고 3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD (Promega Corporation)를 이용하여 지질 DNA 복합체를 형성함으로써 세포를 형질감염시켰다. 이후 형질감염된 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 96-웰 평판 내에 접종하였다 (총 수득량 50ng/웰의 DNA). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 20uM의 SAHA의 존재 또는 부재에서 연속으로-희석된 PBI-4968와 인큐베이션하였다 (비-특이적 BRET를 정량화하는 데에 이용된 후자 샘플). 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NANOLUC-발현 샘플에, 푸리마진을 10uM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후 450nm 대역 통과 및 610nm 장파장 통과 여과기가 장착된 BMG Clariostar 광도계에서 BRET를 측정하였다. 450 주파수대에서의 신호로 630 주파수대에서의 신호를 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다. 특이적인, 백그라운드 보정된 BRET 값을 결정하기 위하여, 추적자 단독으로의 BRET 값으로부터 추적자의 각각의 농도에서 비특이적 BRET 값을 공제하였다.
실시예 24
다음 실시예는 BRET 이미징을 이용하여 단세포 해상도를 가진 세포간 표적과 화합물의 결합을 측정하는 능력을 입증하는 역할을 한다. 이 실시예는 생세포에서 NanoLuc-HDAC6 및 HDAC10-NanoLuc와 SAHA 및 이의 형광 유도체인, SAHA-NCT (PBI-4968)의 결합을 보여준다.
BRET 이미징으로 생세포에서 HDAC6 및 HDAC10과 결합하는 SAHA 및 SAHA-NCT의 측정. 각각 HDAC6 및 HDAC10과의 NanoLuc 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 HeLa 세포를 형질감염시켰다. pGEM3Z 담체 DNA 내에서 1:100의 질량 비로 각각의 DNA 구조체를 희석시키고 그리고 3:1 지질:DNA 비로 Fugene HD (Promega Corporation)를 첨가함으로써 지질 DNA 복합체를 형성함으로써 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 복합체를 세포 현탁액 (ml당 1e5 세포)과 혼합하고 그 다음 접시당 200,000개 세포의 밀도로 유리-바닥 35 mm 접시에 도말하였다 (총 수득량 50ng/웰의 DNA). 24시간 형질감염-후, 세포 배지를 무-혈청 배지 (Opti-MEM)로 교체하고 그리고 10 mM의 SAHA의 존재 또는 부재에서 2 mM PBI-4968과 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. NanoLuc-발현 샘플에 푸리마진을 10uM의 최종 농도까지 첨가하였다. Olympus LV200 생물발광 현미경을 이용하여 샘플을 이미징하였다. BRET로 NanoLuc-HDAC6 또는 HDAC10-Nanoluc 중 하나에 대한 PBI-4968의 결합 및 이동을 측정하기 위하여, 각각 495 단파장 통과 및 590 nm 장파장 통과 여과기를 이용하여 순차적인 이미지를 획득하였다 (도 34 및 35). 이미지 분석 프로그램 ImageJ를 이용하여 개별적인 세포를 나타내는 이미지 섹션을 정량적으로 분석하였다. 450 주파수대에서의 값으로 590 주파수대에서의 값을 나눔으로써 BRET 비를 결정하였다. 각각의 샘플에 대해 최소 100개의 개별적인 세포를 분석하였다. 모든 데이터를 점 도표 형식으로 요약한다 (도 36). 세 가지 상이한 샘플로부터 얻은 BRET 값의 경쟁적 분석으로 SAHA 및 SAHA-NCT의 특이적인 결합을 입증하였다:
샘플 1 - 음성 대조 (처리되지 않음),
샘플 2 - 양성 대조 (2 mM PBI-4968),
샘플 3 - 추적자 이동 (2 mM PBI-4968 + 10 mM SAHA)
결과는 단세포 수준에서 HDAC 패밀리 (HDAC6 및 10)의 상이한 구성원과의 PBI-4968 그리고 SAHA의 특이적인 결합 및 세포 흡수를 입증한다. 결과는 흡수 및/또는 결합의 정도가 세포 모집단에 의해 상당히 변한다는 점을 제시한다. 이미지 기반 BRET 어세이 형식은 세포 유형, 세포 밀도, 세포 주기 상태 및 분석을 위해 단세포 해상도를 요구하는 다른 생리학적 파라미터에 기반한 차이를 결정하기 위해 단일 세포 수준에서 표적 특이적인 화합물 결합의 분석을 가능하게 한다.
본 출원 및/또는 하기 열거된 것에서 언급된 모든 문헌 및 특허는 참조로서 본 명세서에 편입된다. 본 발명의 설명된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에 벗어남 없이 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이다. 본 발명이 특이적이고 바람직한 구체예와 연결하여 설명되었음에도 불구하고, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특이적인 구체예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 관련된 분야의 통상의 기술자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 설명된 방식의 다양한 변형은 다음 청구항이 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Hitko, Carolyn W. Kirkland, Thomas Machleidt, Thomas Ohana, Rachel Friedman Robers, Matt Wood, Keith <120> Recognition of Cellular Target Binding by a Bioactive Agent Using Intracellular Bioluminescence Resonance Energy Transfer <130> PRMG-33031/US-3/PRO <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 169 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 1 Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu Phe Gln 20 25 30 Ala Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Val Val Leu Ser Gly 35 40 45 Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly 50 55 60 Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys Val Val 65 70 75 80 Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg 100 105 110 Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr 115 120 125 Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Arg Leu Ile Asn 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atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tggtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt 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ccagaccacc tcagaggaga ctgtgggagg agccattctg 3420 gaccagacca cctcagagga tgctgttggg ggagccacgc tgggccagac tacctcagag 3480 gaggctgtag gaggagctac actggcccag accacctcgg aggcagccat ggagggagcc 3540 acactggacc agactacgtc agaggaggct ccagggggca ccgagctgat ccaaactcct 3600 ctagcctcga gcacagacca ccagaccccc ccaacctcac ctgtgcaggg aactacaccc 3660 cagatatctc ccagtacact gattgggagt ctcaggacct tggagctagg cagcgaatct 3720 cagggggcct cagaatctca ggccccagga gaggagaacc tactaggaga ggcagctgga 3780 ggtcaggaca tggctgattc gatgctgatg cagggatcta ggggcctcac tgatcaggcc 3840 atattttatg ctgtgacacc actgccctgg tgtccccatt tggtggcagt atgccccata 3900 cctgcagcag gcctagacgt gacccaacct tgtggggact gtggaacaat ccaagagaat 3960 tgggtgtgtc tctcttgcta tcaggtctac tgtggtcgtt acatcaatgg ccacatgctc 4020 caacaccatg gaaattctgg acacccgctg gtcctcagct acatcgacct gtcagcctgg 4080 tgttactact gtcaggccta tgtccaccac caggctctcc tagatgtgaa gaacatcgcc 4140 caccagaaca agtttgggga ggatatgccc cacccacacg tttaa 4185 <210> 5 <211> 1394 <212> PRT <213> 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Claims (16)

  1. 다음을 포함하는 어세이 시스템:
    (a) 형광단과 테더링된(tethered) 생물활성제;
    (b) 생물발광 리포터와 융합된 세포 표적; 및
    (c) 생물발광 리포터를 위한 기질.
  2. 제1항에 있어서, 생물활성제는 소분자인 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 형광단은 카르복시 로다민 유사체인 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 생물발광 리포터는 서열번호: 1과 적어도 70% 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제1항에 있어서, (a)와 (b)는 세포 내에 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제5항에 있어서, (b)는 융합물로서 세포 내에서 발현되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제5항에 있어서, (a)는 세포외에 첨가되고 세포로 들어가는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 세포 표적은 생물활성제의 결합 파트너인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 생물발광 리포터의 방출 스펙트럼은 형광단의 흡수 스펙트럼과 중첩되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 세포 표적과 생물활성제의 결합시, 생물발광 리포터에 의한 기질에서 반응 산물로의 전환은 BRET에 의한 형광단의 여기(excitation) 및 형광단으로부터 형광 방출을 야기하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제1항에 있어서, (a)는 형광단과 테더링된 생물활성제의 라이브러리(library) 중 하나인 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제1항에 있어서, (b)는 생물발광 리포터와 융합된 다수의 세포 표적 중 하나인 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 생물활성제 또는 형광단이 테더링된 생물활성제는 비-천연 화학 합성에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 하나의 시스템을 포함한 세포 표적과 생물활성제의 결합을 검출하는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 하나의 시스템을 포함한 세포.
  16. 생물활성제 및 세포 표적 사이의 상호작용의 검출을 위한 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제1 파장에서 에너지를 방출하는 생물발광 리포터와 상기 세포 표적의 융합물을 세포에서 발현시키는 단계;
    (b) 형광단과 테더링된 상기 생물활성제와 상기 세포를 접촉시키는 단계, 여기서 상기 형광단은 상기 제1 파장에서 에너지를 수용하고 제2 파장에서 에너지를 방출함;
    (c) 상기 생물발광 리포터를 위한 기질과 상기 세포를 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 제2 파장에서 에너지를 검출하는 단계, 여기서 상기 제2 파장에서 상기 에너지의 존재는 상기 세포 표적과 상기 생물활성제의 상호작용을 명시함.
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