KR20250004513A

KR20250004513A - Bret-기반 rab11a 활성 바이오센서 및 이를 포함하는 세포주

Info

Publication number: KR20250004513A
Application number: KR1020240077297A
Authority: KR
Inventors: 윤부현; 강현구; 유가은
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2024-06-14
Publication date: 2025-01-08

Abstract

본 발명은 BRET(bioluminescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 육안으로 검출 및 정량 할 수 있는 바이오센서에 관한 것으로, BRET(bioluminescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 검출하기 위해서 발광물질인 RAB11A 단백질의 N 말단에 발광물질인 루시페레이스(Luciferase) 단백질을 결합하고, RAB11FIP 서열 중 RAB11A와 결합하는 FIP-RBD 영역에 해당되는 단백질의 C 말단에 형광물질을 결합하여 하나의 세포에 다중-시스트론 벡터(multi-cistronic vector)를 이용하여 형질도입 함으로써, 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질과 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질이 1:1 비율로 발현되는 바이오센서를 포함하는 형질전환 세포를 제조하였으며, 상기 형질전환 세포에 RAB11FIP 경쟁적 억제제인 RFP26를 처리한 결과 BRET 현상 비율이 유의하게 감소하는 것을 확인함으로써, RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 검출할 수 있는 바이오센서로 제공된다.

Description

BRET-기반 RAB11A 활성 바이오센서 및 이를 포함하는 세포주{BRET-based RAB11A activation biosensor and cell line comprising the same}

본 발명은 BRET(bioluminescence resonance energy transfer)를 이용한 RAB11A 활성 검출용 바이오센서에 관한 것이다.

RAB11A(Ras-related protein Rab-11A) 단백질은 GTPase 슈퍼패밀리의 Rab 패밀리에 속하는 단백질로, 엔도솜(endosome)과 소낭(vesicle)의 수송에 관여하며, 세포 내에서 RAB11FIP와 결합하여 활성화된다. RAB11A 단백질은 분비 경로 및 단백질 수송에 관여하고 있으며, 뇌, 고환, 비장, 심장, 위장, 점막 등 다양한 조직에서 발현된다. RAB11A는 원발성 뇌조증 및 다양한 지능 장애와 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 여러 암종에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 확인되었기에 암 치료를 위한 타겟 바이오마커로 알려졌다. 특히 RAB11A는 뇌종양 4기에 해당되는 교모세포종을 포함하는 암의 악성화와 치료 저항성이 있어, RAB11A의 활성을 억제하는 물질을 암의 후보 치료제로 개발되는 실정이다. 그러나 현재까지 RAB11A의 활성을 저해하는 물질로는 펩타이드 1종(RFP26)만 개발되었을 뿐, 임상에서 사용될 수 있는 치료제는 개발되지 않은 상태이다. 따라서 RAB11A의 활성을 억제할 수 있는 새로운 약물의 개발이 요구되고 있다.

한편, 바이오센서는 헬스케어, 화학 및 생물학 분석, 환경 모니터링, 및 식가공 산업의 영역에서 분석에 활용되는 도구이다. 개발된 바이오센서는 효소, 항체, 수용체, 세포 소기관, 또는 미생물과 같은 생물학적 분자의 물리적, 화학적, 또는 생물학적 특성을 다른 유형의 신호로 전환한다. 바이오센서는 형질 도입 공정에 기반한 전기화학적, 광학적, 압전적(piezoelectric) 및 자기적 바이오센서로 분류된다. 상업적으로 이용가능한 SERS(surface enhanced Raman spectroscopy)에 기반한 광학 바이오센서가 극도로 강한 증폭을 갖는 표지-프리 방법에서 수행되는 검출로서 많은 이점을 갖는다는 것이 알려져 있다. 결론적으로 계속된 노력이 최대 표면 플라스몬 커플링(maximal surface plasmon coupling)을 위한 나노구조의 형상을 조절함으로써 SERS 신호를 향상시켜왔다.

바이오센서로 활용되는 수단 중 BRET(bioluminescence resonance energy transfer)는 생물 발광 공명 에너지 전달로 단백질-단백질 상호작용을 모니터링하는 데 널리 사용되는 기술이다. BRET는 생물학적 발광 도너와 형광 수용체 사이의 공명 에너지 전달에 의해 발생되는 현상으로 도너가 본질적으로 광자를 방출하기 때문에 형광 자극이 불필요하다. BRET 현상은 도너와 수용체 사이가 10 nm 미만의 거리에서 발생되는 공명 에너지 전달에 의존하며 대부분의 생물학적 상호작용이 10 nm 미만에서 발생되는 점을 고려하면 BRET 현상은 특정 분자 사이의 상호작용을 인지할 수 있는 수단으로 적합하다.

한국등록특허 제10-2292431호 (2021. 08. 20. 공고) 한국등록특허 제10-1802325호 (2017. 11. 29. 공고)

본 발명의 목적은 BRET(bioluminescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 육안으로 검출 및 정량 할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명은 N-말단에 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질; 및 C-말단에 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질을 포함하는, RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용 검출용 바이오센서를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질감염된, in vitro에서 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용 검출용 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명에 따르면, BRET(bioluminescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 검출하기 위해서 발광물질인 RAB11A 단백질의 N 말단에 발광물질인 루시페레이스(Luciferase) 단백질을 결합하고, RAB11FIP 서열 중 RAB11A와 결합하는 FIP-RBD 영역에 해당되는 단백질의 C 말단에 형광물질을 결합하여 하나의 세포에 다중-시스트론 벡터(multi-cistronic vector)를 이용하여 형질도입 함으로써, 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질과 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질이 1:1 비율로 발현되는 바이오센서를 포함하는 형질전환 세포를 제조하였으며, 상기 형질전환 세포에 RAB11FIP 경쟁적 억제제인 RFP26를 처리한 결과 BRET 현상 비율이 유의하게 감소하는 것을 확인함으로써, RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 검출할 수 있는 바이오센서로 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 평가할 수 있는 바이오센서의 설계 모식도이다.
도 2는 본 발명의 바이오센서를 설계하기 위해서 RAB11A와 FIP-RBD의 결합 구조를 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 바이오센서를 발현시킬 수 있는 다중-시스트론 벡터(multi-cistronic vector)의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 바이오센서가 형질도입된 세포를 선별하기 위한 FACS(Fluorescence activated cell sorting) 분석 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 바이오센서가 형질도입된 세포에서 BRET 비율(ratio) 측정 족건을 설정하기 위한 실험 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 바이오센서가 형질도입된 세포에서 RAB11A 활성 억제제의 투여에 따른 BRET 비율(ratio) 변화를 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 바이오센서가 형질도입된 세포에서 세포에서 RAB11A 활성 억제제의 투여에 따른 세포 생존율 분석 결과이다.
도 8은 GTP-결합 돌연변이(GTP-bound mutant)인 RAB11A Q70L 돌연변이를 나타나내는 모식도이다.
도 9는 본 발명에 따라 RAB11A 야생형(WT) 바이오센서 또는 RAB11A Q70L 돌연변이 바이오센서가 형질도입된 세포의 BRET 비율(ratio)을 비교한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따라 RAB11A Q70L 돌연변이 바이오센서가 형질도입된 세포에서 RAB11A 활성 억제제의 투여에 따른 BRET 비율(ratio) 변화를 분석한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 BRET(bioluminescence resonance energy transfer) 현상에 기반한 RAB11A 활성화 검출용 바이오센서를 제공하고, 상기 바이오센서를 탑재한 안정화 세포주를 제공한다. 본 발명에 따라 제공된 바이오센서 및 세포주는 특정 화합물이 RAB11A 및 RAB11FIP 간의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 검출하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시의 양태에서 상기 RAB11A 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 FIP-RBD 단백질은 RAB11FIP에서 RAB11A 단백질과 결합하는 FIP-RBD 영역에 해당되는 부분으로 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것이다. 상기 RAB11A 단백질은 RAB11A 야생형(WT)이거나 활성화 돌연변이체인 RAB11A Q70L 돌연변이일 수 있다. 상기 RAB11A Q70L 돌연변이는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진다.

상기 RAB11A 단백질의 N-말단에 결합된 발광물질은 루시페레이스(Luciferase)이다. 상기 루시페레이스(Luciferase)는 루시페린을 산화시키는 효소로 발광성 미생물 등에 존재하는 생물학적 발광 물질이다. 구체적으로 상기 발광물질은 반딧불 루시페레이스(Firefly Luciferase), 레닐라 루시페레이스(Renilla Luciferase), 가우시아 루시페레이스(Gaussia Luciferase), 나노루스 루시페레이스(NanoLuc Luciferase), 또는 에퀴린(Aequorin)일 수 있다.

또한, 상기 형광물질은 특정 파장의 빛을 흡수하고, 그것을 전혀 다른 고유한 빛깔의 광선으로 방사하는 물질이다. 구체적으로 상기 형광물질은 GFP(green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), mCherry, DsRed, EGFP(enhanced green fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), 및 cyOFP(cyan orange fluorescent protein) 중 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있다.

본 발명의 일 실시의 양태에서 상기 발광물질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 나노루스 루시페레이스(NanoLuc Luciferase)이고, 상기 형광물질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산으로 이루어진 cyOFP(cyan orange fluorescent protein)이다.

본 발명의 바이오센서는 N-말단에 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질; 및 C-말단에 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질로 두 개의 융합 단백질을 포함 하지만, 이는 각각의 별개의 벡터에 포함될 수 있고, 하나의 벡터에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 벡터는 N-말단에 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질을 암호화하는 유전자 서열과 C-말단에 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 모두 포함할 수 있으며, 각각의 유전자 서열은 하나의 제한효소 범위 내에 존재할 수 있다.

구체적으로 상기 벡터는 두 융합 단백질 유전자 서열 사이에 P2A(2A peptides) 서열을 삽입하여 리보솜 스키핑(ribosome skipping) 및 아미노산 절단을 유도함으로써 하나의 mRNA로 두 융합 단백질을 동시에 발현시키는 다중-시스트론 벡터(multi-cistronic vector)일 수 있다. 이럴 경우 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자는 FIP2-RBD - cyOFP - P2A - nLuc - RAB11A 순으로 발현되도록 설계될 수 있으며, 본 발명의 일 실시의 양태에서는 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한 본 발명의 다른 일 실시의 양태에서는 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자는 FIP2-RBD - cyOFP - P2A - nLuc - RAB11AQ70L 순으로 발현되도록 설계될 수 있으며, 서열번호 8로 표시되는 아미노산을 암호화는 유전자일 수 있다.

상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 포함하는DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 박테리오파지 또는 렌티바이러스(lentivirus) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질도입(Transduction)된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩타이드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질도입된 세포를 선별할 수 있다.

상기 "형질도입"은 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 목적 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질주입된, in vitro에서 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용 검출용 단리된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질주입된 단리된 세포를 준비하는 단계; 상기 세포에 후보 물질을 처리하고 형광 변화를 분석하는 단계; 및 시약을 처리하지 않은 대조군 세포의 형광과 비교하여 후보 물질을 RAB11A 억제제로 판단하는 단계를 포함하는 RAB11A 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예 1] RAB11A 활성화 진단용 바이오센서 설계

RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 검출하기 위해 활성화 진단 방법은 발광물질과 형광물질이 가까워질 때 발광물질에서 형광물질로 빛 에너지가 전이되는 현상인 BRET(Bioluminescence Resonance Energy Transfer)를 이용하였다. 본 실시예에서는 발광물질로 nLuc(Nano Luc; Luciferase)을 사용하였으며, 형광물질로 cyOFP를 사용하였다. 또한, RAB11FIP 서열 중 RAB11A와 결합하는 FIP-RBD 영역을 이용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 기질(substrate)인 루시페린(luciferin)은 Nano Luc를 발광시키며 해당 에너지는 10 nm 이내에 있는 cyOFP를 자극(excitation) 시킨다. 따라서 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용을 나타내는 RAB11A와 FIP-RBD가 결합시 BRET 반응을 유도하기 위해서 RAB11A 및 FIP-RBD에 각각 결합하는 nLuc 및 cyOFP는 결합 후에 10 nm 이내에 위치되는 자리에 결합하여야 한다. 발광물질과 형광물질은 표적 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. RAB11A 단백질의 C-말단은 RAB11A가 세포막에 침투할 때 필수적인 역할을 하므로, BRET 현상의 공여자에 해당하는 발광물질인 nLuc는 RAB11A의 N-말단과 융합되도록 설계하였다.

또한, BRET 현상이 일어나기 위해서는 공여자와 수여자 간 거리가 10 nm 이하로 가까워야 하므로, BRET 현상의 효율성 향상을 위해 단백질 구조분석을 통해 RAB11A의 N-말단과 10 nm 이하에 위치되는 FIP-RBD의 말단을 분석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, RAB11A와 FIP-RBD가 결합할 때 RAB11A의 N-말단과 FIP-RBD의 C-말단이 1.7nm로 가장 가깝게 위치하는 것으로 확인되었다. 따라서 FIP-RBD의 C-말단에 형광물질인 cyOFP이 융합되도록 설계하였다. 각 RAB11A, FIP-RBD, nLuc, 및 cyOFP의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.

구분	아미노산 서열	서얼번호
RAB11A	EYDYLFKVVLIGDSGVGKSNLLSRFTRNEFNLESKSTIGVEFATRSIQVDGKTIKAQIWDTAGQERYRAITSAYYRGAVGALLVYDIAKHLTYENVERWLKELRDHADSNIVIMLVGNKSDLRHLRAVPTDEARAFAEKNGLSFIETSALDSTNVEAAFQTILTEIY	1
FIP-RBD	MYRSLTYEEVLQELVKHKELLRRKDTHIRELEDYIDNLLVRVMEETPSILRVPYEPS	2
nLuc	MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA	3
cyOFP	MVSKGEELIKENMRSKLYLEGSVNGHQFKCTHEGEGKPYEGKQTNRIKVVEGGPLPFAFDILATHFMYGSKVFIKYPADLPDYFKQSFPEGFTWERVMVFEDGGVLTATQDTSLQDGELIYNVKVRGVNFPANGPVMQKKTLGWEPSTETMYPADGGLEGRCDKALKLVGGGHLHVNFKTTYKSKKPVKMPGVHYVDRRLERIKEADNETYVEQYEHAVARYSNLGGGMDELYK	4

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 설계된 두 BRET 융합 단백질로 구성된 바이오센서를 하나의 벡터에 발현시키기 위해 다중-시스트론 벡터(multi-cistronic vector)를 제작하였다. 상기 다중-시스트론 벡터는 두 융합 단백질 유전자 서열 사이에 P2A(2A peptides) 서열을 삽입하여 리보솜 스키핑(ribosome skipping) 및 아미노산 절단을 유도함으로써 하나의 mRNA로 두 융합 단백질을 동시에 발현시킬 수 있다. 상기 벡터는 세포 내 융합단백질이 1:1 비율로 정밀하게 발현된다는 장점이 있다. 도 3에 나타난 바와 같이, 벡터에 삽입될 디자인은 N 말단에서부터 FIP2-RBD - cyOFP - P2A - nLuc - RAB11A 순으로 발현되도록 설계하였으며, 실제 벡터에 삽입되는 RAB11A 활성 바이오센서(RAB11A activation biosensor)는 하기 표 2의 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖으며, 서열번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열은 pLenti(lentiviral backbone vector)에 삽입하였다.

디자인

N 말단 - FIP2-RBD - cyOFP - P2A - nLuc - RAB11A - C 말단

유전자
정보
(SEQ no.5)

MYRSLTYEEVLQELVKHKELLRRKDTHIRELEDYIDNLLVRVMEETPSILRVPYEPSGSGSGSMVSKGEELIKENMRSKLYLEGSVNGHQFKCTHEGEGKPYEGKQTNRIKVVEGGPLPFAFDILATHFMYGSKVFIKYPADLPDYFKQSFPEGFTWERVMVFEDGGVLTATQDTSLQDGELIYNVKVRGVNFPANGPVMQKKTLGWEPSTETMYPADGGLEGRCDKALKLVGGGHLHVNFKTTYKSKKPVKMPGVHYVDRRLERIKEADNETYVEQYEHAVARYSNLGGGMDELYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGSGSGSEYDYLFKVVLIGDSGVGKSNLLSRFTRNEFNLESKSTIGVEFATRSIQVDGKTIKAQIWDTAGQERYRAITSAYYRGAVGALLVYDIAKHLTYENVERWLKELRDHADSNIVIMLVGNKSDLRHLRAVPTDEARAFAEKNGLSFIETSALDSTNVEAAFQTILTEIY

[실시예 3] 바이오센서 발현 세포의 구축

상기 제조된 벡터가 발현될 수 있는 세포주를 구축하기 위해서 HEK293T 세포를 이용하였다. 실시예 2에서 제조한 벡터를 HEK293T 세포에 형질주입(transfection)하여 RAB11A 활성 바이오센서 렌티바이러스(RAB11A activation biosensor lentivirus)를 수득하였다. 10 mL의 MEM(10% FBS 및 1% 항생제 포함) 배지에서 300,000 cell/10mL 농도의 HeLA 세포에 상기 수득한 렌티바이러스를 1 MOI(Multiplicity of Infection) 농도로 처리하여 형질도입(transfection)을 진행하였다. 형질도입(transfection) 72 시간 진행 후에 바이오센서를 많이 발현하는 세포를 선별하기 위해서 FACS(Fluorescence activated cell sorting)를 수행하였다. 3.0 X 10⁵ 개의 세포를 분비하고 선별을 수행하였다. FACSDiva 8.0.1 소프트웨어를 사용하여 FACSAriaTM III Sortor (BD Biosciences, USA)에서 세포를 sorting 하였다.

Forward scattering(FSC)와 side scattering(SSC)을 이용하여 Debris 및 죽은 세포(dead cells)을 제거하였으며 Singlet gating을 통하여 doublet 세포를 제거하였다.

다음으로 unstained cell을 기준으로 형광의 positive 영역에 대한 세포를 분리하였으며, sorting speed는 90% 이상의 sorting efficiency가 유지되도록 조정하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 형질이 도입되지 않은 대조군 세포(unstained Hela (negative control))에서는 확인되지 않은 cyOFP 형광 세기을 분석하였고, 분석된 cyOFP 형광 세기를 기준으로 형질도입 세포의 게이팅(gating)을 수행한 전체 중 1.1%의 세포가 RAB11A 활성 바이오센서(RAB11A activation biosensor)가 도입된 HeLa 세포로 선별되었다.

[실시예 4] BRET 비율 측정

RAB11A 활성 바이오센서(RAB11A activation biosensor)의 대조군(control) BRET 비율(ratio) 조건을 설정하기 위해, nanoLuc 기질(substrate) 처리 후 반응 시간 및 세포 수를 다르게 설정하여 BRET 비율을 측정하였다. BRET ratio 측정을 위해 phenol red free DMEM (10% FBS, 25mM glucose)를 사용하였으며, 최종 nanoLuc 기질(substrate) 농도를 1:1000으로 처리하여 처리 후 10분 후 BRET ratio를 확인하였다. BRET 비율은 fluorescence(cyOFP, acceptor)를 luminescence(nanoLuc, donor)로 나누어(BRET ratio : 590nm/450nm) 측정하였다. 형질 도입된 HeRa 세포는 1.0 X 10⁵ 세포 또는 2.0 X 10⁵ 세포로 진행하였으며, 기질 처리 후 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 후에 BRET 비율을 측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 세포 수에 변화에도 BRET 비율에는 변화가 없는 것으로 확인되었으며, 약물 처리 6 시간 후에 BRET 비율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 따라서 BRET 비율 측정 조건을 10,000 cells/well, 기질 처리 후 6 시간으로 결정하였다.

[실시예 5] RAB11A의 활성 억제제 처리에 따른 BRET 비율 변화

은 본 발명에 따라 바이오센서가 형질도입된 HeLa 세포에 RAB11A 활성 억제제의 투여에 따른 BRET 비율이 변화되는지 여부를 평가하였다. RAB11A 활성 억제제는 기존에 RAB11FIP 경쟁적 억제제로 확인된 RAB11A 활성 억제 펩타이드인 RFP26을 사용하였다. RFP26 펩타이드의 아미노산 서열은 하기 표 3과 같다.

구분	아미노산 서열	서얼번호
RFP26	βRINFRLQNS₅IDRS₅IVRIN_LETNPSILRVK	6

RFP26의 처리 농도는 공동 면역침강반응(co-immunoprecipitation)을 통해 확인된 RAB11A 및 FIP-RBD의 결합 감소를 확인한 10μM과 더 높은 농도인 50μM로 처리하였다. 플레이트에 RAB11A 활성 바이오센서(RAB11A activation biosensor)가 형질도입된 HeLa 세포를 10,000 cells/well 농도로 접종한 후, RFP26을 10 μM 또는 50 μM 처리하고, phenol red free DMEM (FBS free, antibiotics free)에 100분의 1로 희석하고, well 당 25ul씩 분주한다. 이때 well의 최종 volum은 125ul로 nanoLuc 기질(substrate)는 5x가 된다. Seeding 후 1시간 뒤에 약물을 treat하며, 5시간 후 nanoLuc substrate를 분주한 뒤 10분간 상온에서 incubation한 뒤에 luminescence (450nm)와 fluorescence (590nm) 파장을 찍어준다. 이후 fluorescence 값을 luminescence 값으로 나누어 BRET ratio를 측정한 뒤 non-treat group에 대하여 약물 treat group을 relative ratio로 나타내어 binding 감소를 확인하였다

또한, RFP26 처리로 인한 세포의 생존율에 변화가 나타나는지 여부를 분석하였다. 세포 생존율은 Celltiter-glo luminescent cell viability assay로 진행하였으며, Celltiter-glo substrate와 buffer를 섞은 용액을 well 당 75ul씩 분주하여 10분간 상온에서 incubation한 뒤 monochromator로 luminescence를 측정하였다. cell viability 역시 non-treat group을 기준으로 treat group의 viability를 relative ratio로 나타내어 분석하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, RFP26 처리 농도가 증가함에 따라 BRET 비율이 감소하는 것으로 나타났다. RFP26의 경우 RAB11A와 효과기 단백질(effector protein)인 FIP 두 단백질의 결합(binding)을 저해함으로써 활성을 억제한다. RAB11A에 RFP26이 결합하는 경우 발광물질인 nanoLuc와 형광물질 간의 사이가 멀어져 BRET 비율이 감소한다. 50 μM의 RFP26을 처리하였을 때 대조군(control)에 비해 BRET 비율(ratio)이 30% 수준으로 감소하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 세포 생존율을 분석한 결과 10 μM의 RFP26를 처리한 경우는 세포가 90% 이상 생존하였으나, 50 μM RFP26을 처리한 경우 대조군에 비해 1% 세포만 생존한 것으로 확인되었다.

상기 결과에서 RFP26을 50 μM 이상 처리하는 경우 세포의 생존율 저하가 영향을 준 것으로 판단되며, 10 μM의 RFP26을 처리하는 경우가 세포의 생존에 영향을 주지 않으면서 RAB11A 활성을 억제하기 때문에 실험에 적합한 농도임이 확인되었다.

[실시예 6] RAB11A 돌연변이 바이오센서 제작

BRET 비율(ratio)의 감소 재현성 및 확연한 감소 폭을 확인하기 위해서 GTP-결합 돌연변이(GTP-bound mutant) 세포주를 제작하였다. GTP-결합 돌연변이(GTP-bound mutant) 형의 경우 항상 활성(active) 상태이기 때문에 RAB11A와 FIP의 결합이 증가하여 BRET 비율(ratio)이 증가할 것으로 예상되며, RFP26에 의한 감소가 더 높을 것으로 예측된다. GTP-결합 돌연변이(GTP-bound mutant)인 RAB11A Q70L 돌연변이 위치는 도 8과 같으며, RAB11A Q70L 돌연변이 아미노산 서열은 하기 표 4와 같다.

구분	아미노산 서열	서얼번호
RAB11A Q70L	EYDYLFKVVLIGDSGVGKSNLLSRFTRNEFNLESKSTIGVEFATRSIQVDGKTIKALIWDTAGQERYRAITSAYYRGAVGALLVYDIAKHLTYENVERWLKELRDHADSNIVIMLVGNKSDLRHLRAVPTDEARAFAEKNGLSFIETSALDSTNVEAAFQTILTEIY	7

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 RAB11A Q70L 돌연변이가 발현되도록 바이오센서를 설계하여 벡터에 삽입하였다. 벡터에 삽입되는 RAB11A Q70L 활성 바이오센서(RAB11A Q70L activation biosensor) 유전자 정보는 하기 표 5와 같다. 이후 실시예 3과 동일한 방법으로 바이오센서 발현 세포를 구축하였다.

디자인

N 말단 - FIP2-RBD - cyOFP - P2A - nLuc - RAB11AQ70L - C 말단

유전자 정보
(SEQ no.8)

BRET 비율 측정 및 RFP26 처리 방법은 실시예 5와 동일하게 수행하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, RAB11A 야생형(WT) 바이오센서가 형질도입된 세포의 BRET 비율(ratio)이 100%인 경우 RAB11A Q70L 돌연변이 바이오센서가 형질도입된 세포의 BRET 비율(ratio)은 221.5%로 2.2배 정도 증가하는 것으로 나타났다.

또한, RFP26 처리에 따른 BRET 비율(ratio) 변화를 비교하였다. 도 6에서 RAB11A 야생형(WT) 바이오센서가 형질도입된 세포의 경우 10 μM의 RFP26 처리시 미처리 대조군에 비해 66.3% 수준으로 BRET 비율(ratio) 감소하였다. 반면, 도 10에 나타난 바와 같이, RAB11A Q70L 돌연변이 바이오센서가 형질도입된 세포의 경우 10 μM의 RFP26 처리시 미처리 대조군에 비해 46.5% 수준으로 BRET 비율(ratio) 감소하였다.

상기 결과는 RAB11A Q70L 돌연변이 바이오센서가 RAB11A 억제제에 대한 반응이 더 민감하게 나타난다는 것을 입증한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

N-말단에 발광물질이 결합된 RAB11A 단백질; 및 C-말단에 형광물질이 결합된 FIP-RBD 단백질을 포함하는, RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용 검출용 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 RAB11A 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 FIP-RBD 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 RAB11A 단백질은 RAB11A Q70L 돌연변이인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제4항에 있어서, 상기 RAB11A Q70L 돌연변이는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 발광물질은 루시페레이스(Luciferase)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항에 있어서, 상기 형광물질은 GFP(green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), mCherry, DsRed, EGFP(enhanced green fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), 및 cyOFP(cyan orange fluorescent protein) 중 선택된 어느 하나의 단백질인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터.
제8항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 5 또는 서열번호 8로 표시되는 아미노산을 암호화하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질주입된, in vitro에서 RAB11A 및 RAB11FIP의 상호작용 검출용 단리된 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오센서를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질주입된 단리된 세포를 준비하는 단계;
상기 세포에 후보 물질을 처리하고 형광 변화를 분석하는 단계; 및
시약을 처리하지 않은 대조군 세포의 형광과 비교하여 후보 물질을 RAB11A 억제제로 판단하는 단계를 포함하는 RAB11A 억제제 스크리닝 방법.