KR20150021011A

KR20150021011A - 초고도 농축된, 속효성 인슐린 유사체 제형

Info

Publication number: KR20150021011A
Application number: KR20147011706A
Authority: KR
Inventors: 마이클 웨이스
Original assignee: 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2015-02-27
Also published as: EP2771026A4; NZ624493A; EP2771026A1; JP2014533241A; SG11201401835VA; WO2013063572A1; AU2012328407A1; BR112014010139A2; US9908925B2; IN2014CN03888A; US20140323398A1; CN104010652A

Abstract

약학적 제형은 위치 B10에서의 산성 측쇄를 포함하는 아미노산의 치환과 조합하여, 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환을 포함하는 변이성 인슐린 B-사슬 폴리펩타이드를 가지는 인슐린을 포함하며, 상기 인슐린이 0.6 mM 내지 3.0 mM의 농도로 있을 수 있게 한다. 상기 제형은 선택적으로 아연이 없을 수 있다. 위치 B3, B28, 및 B29의 하나 이상에서 아미노산 치환이 추가로 있을 수 있다. 상기 변이성 B-사슬 폴리펩타이드는 프로인슐린 유사체 또는 단일-사슬 인슐린 유사체의 일부일 수 있다. 상기 인슐린 유사체는 인간 인슐린과 같은 포유동물 인슐린의 유사체일 수 있다. 환자의 혈당을 저하시키는 방법은 상기 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염의 생리적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다

Description

초고도 농축된, 속효성 인슐린 유사체 제형{ULTRA-CONCENTRATED RAPID-ACTING INSULIN ANALOGUE FORMULATIONS}

연방정부적으로 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 미국국립보건원 (the National Institutes of Health)에 의해 수여된 협력 약정으로 허여 번호 DK40949 및 DK074176하에서 정부 보조로 이루어 졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수 있다.

발명의 배경

본 발명은 약학 제형에서 보통 사용되는 것 보다 더 큰 농도에서 더 빠른 약물동력학과 같은 향상된 약학적 특성을 나타내는 폴리펩타이드 호르몬 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인슐린 유사체에 관한 것으로, 비표준 아미노산들의 혼입에 의해 개질되어 밀리리터 당 100 단위 (U-100)보다 더 높은 농도에서 그 제형이 가능하게 되어 (i) 속효성 약동학적 (PK) 및 약력학적 (PD) 특성이 야생형 인간 인슐린에 비하여 U-100 농도에서 유지되고 있고, 및 (ii) 이의 유사분열촉진 특성은 야생형 인간 인슐린에 비해 높아지지 않는 인슐린 유사체에 관한 것이다. 그러한 비표준 서열들은 선택적으로 인슐린 유사체의 A 또는 B 사슬 상의 다른 위치에서 표준 아미노산 치환체를 포함할 수 있다.

치료제 및 백신을 위시한 비표준 단백질을 조작하는 것은 넓은 의학적 및 사회적 이점을 가질 수 있다. 의학적 이점의 예는 단백질의 약동학적 특성들을 최적화 할 수 있다는 것이다. 다른 사회적 이점의 예는 고 단백질 농도에서의 제형시 PK/PD 특성의 퇴보가 동반되는 단백질을 조작한다는 것이다. 인슐린은 치료성 단백질의 예이다. 비표준 아미노산 치환체를 포함하는 인슐린의 유사체들은 원칙적으로 PK/PD에 대하여 우수한 특성 또는 제형에서의 인슐린의 농도에 대한 PK/PD의 의존성을 나타낸다. 피하 주사후 인슐린 흡수의 약물동력학에 의해 제기되는 도전은 당뇨병 (DM) 환자의 엄격한 혈당 조절을 달성하는 능력에 영향을 주며 인슐린 펌프의 안전성과 기능을 제한하는 것이다.

비만과 연관된 특정 DM 환자에 의해서, 인슐린 저항성에 유전적 소인과 연관된 특정 DM 환자에 의해서, 및 지방이영양증, 코르티코스테로이드류로 치료 또는 내재적 코르티코이드류의 과분비 (쿠싱 증후군)에 부차적인 DM 환자에 의해서 나타나는 인슐린에 대한 뚜렷한 저항성은 특별한 의학적 필요를 제기하고 있다. 심한 인슐린 저항성을 가진 환자의 수는 선진국 및 개발 도상국에서의 비만 열풍으로 인해 ("당뇨비만(diabesity)"의 증후군을 유래시킴) 및 인슐린 저항성이 비통상적으로 심각할 수 있는 미토콘드리아 DNA에서의 변이로부터 일어나는 DM의 단성적 (monogenic) 형태의 인지 증가로 인하여 증가하고 있다(van den Ouweland, J.M., Lemkes, H.H., Ruitenbeek, W., Sandkuijl, L.A., de Vijlder, M.F., Struyvenberg, P.A., van de Kamp, J.J., & Maassen, J.A. (1992) Mutation in mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) gene in a large pedigree with maternally transmitted type II diabetes mellitus and deafness. Nature Genet. 1, 368-71). 그러한 다양한 환자 세부 군을 치료하기 위해 통상적으로 큰 부피의 일정한 인슐린 제형을 피하 주사하게 된다 (U-100 강도; 보통 0.6 mM 인슐린 또는 인슐린 유사체). 그러한 큰 용적을 주사하면 고통이 따르게 되고, 인슐린 작용 개시와 기간의 비율에서 가변적이 된다. 비록 야생형 인슐린의 U-500 제형이 임상 용도에 이용가능하지만 (Humulin^® R U-500; Eli Lilly and Co.), 0.6 mM에서 3 mM로 인슐린 농도를 증가시키는 것은 인슐린 작용의 개시 및 지속성을 늦추어 Humulin® R U-500, 또는 유사한 그러한 제품의 PK/PD 특성이 프로타민-아연-함유 인슐린 6량체들과 닮게 된다; 이러한 제형은 중성 프로타민 하가돈 (Hagadorn) (NPH)으로 지칭되었다. 피하 주사에 의한 야생형 인슐린의 U-500 제형의 식사에 따라 사용하게 되면 혈당 조절의 효율을 떨어뜨리게 되고 고혈당 증상의 위험을 증가시킬 것으로 예상된다. Humulin^® R U-500, 또는 유사 제품을 연속적인 피하 인슐린 주입 장치 (CSII; "인슐린 펌프")에 사용하게 되면, 혈당 농도의 현재 및 과거 측정치에 근거한 인슐린 주입 속도에서의 효과적인 조정을 할 수 있는 환자의 능력 또는 제어 알고리즘을 방해하게 되고, 이는 최적이 아닌 (suboptimal)혈당 조절 및 고혈당 상황의 위험이 증가되게 한다.

인슐린 약리학의 정립된 이론에 따르면, 주사된 인슐린 분자들의 응집 상태는 데포로부터 모세혈관으로 및 그래서 전신적 순환으로의 흡수의 시간 경과와 관련이 있다. 일반적으로, 인슐린 분자가 고분자량 복합체호 더 많이 응집될 수록, 흡수 지체가 더 커지고, 인슐린 작용이 더 연장된다. 인슐린 분자에서의 자가 조립을 약화시키는 아미노산 치환은 당해분야에서 야생형 인간 인슐린에 비하여 더 빠른 흡수와 연관이 있다고 알려져 있다; 치환 Pro B28 →Asp (인슐린 aspart, Novolog^®의 활성 성분; Novo-Nordisk, Ltd) 및 치환 쌍 Pro B28→Lys 및 Lys →Pro (인슐린 Lispro, Humalog^®의 활성성분; Eli Lilly and Co.)이 그 예이다. 역으로, 등전점 (pI)을 약 pH 5에서 약 pH 7로 전환시키는 인슐린 분자의 아미노산 연장이나 화학적 개질은 피하 데포에서의 상기 개질된 인슐린의 등전점 침전으로 이어지는 것으로 당해분야에 알려져 있다; 그러한 고분자량 복합체는 기본적 인슐린 제형의 연장된 흡수를 제공한다. NovoSol Basal^® (Novo-Nordisk사의 중단된 제품으로, Thr^B27이 Arg으로 치환되었고, Thr^B30의 C-말단 카르복실레이트 분체가 아미드화되었다) 및 인슐린 글라긴 (glargine) (Lantus^®의 활성 성분, B 사슬이 디펩타이드 Arg^B31-Arg^B32에 의해 연장된 기본 제형; Sanofi-Aventis, Ltd.)이 그 예이다. (NovoSol Basal^® 및 Lantus^®, 각각은 Asn^A21→Gly의 추가 치환을 포함하여 산성 조건 (각각 pH 3 및 pH 4)에서 Asn^A21의 탈아미드화로 인하여 화학적 손상없이 용해 제형을 만들 수 있다). 통상적인 미세 결정성 인슐린 현탁액의 서방화(NPH, 반-서방성, 서방성, 및 고도-서방성)는 중간 내지 장기 활동 범위의 PK/PD 특성을 나타내며, 이러한 미세 결정들의 각각의 물리화학적 특성 및 이들의 상대적인 용해 속도를 반영한다.

야생형 인간 인슐린 또는 동물 인슐린을 포함한, 상기 인슐린 제품들은 화학적 안정성을 성취하는 수단으로서, 섬유 형성을 피하는 수단으로서, PK/PD 특성을 조정하는 수단으로서, 또는 이러한 목적들의 조합을 성취하는 수단으로서 인슐린 분자의 자가 조립을 채택하거나 채택하였다. 하지만, 인슐린 자가 조립은 또한 바람직하지 못한 또는 원치 않는 특성을 끌어들일 수 있다. Humulin^® R U-500 (또는 유사 제품)의 이러한 비-최적적 연장된 PK/PD 특성들은, 예를 들어, 상기 제형에서 및 상기 피하 데포에서 6량체-6량체 연합의 결과가 될 가능성이 많다. 실제, 레이저 광 분산에 의한 시험관 내 야생형 소 인슐린 아연 6량체의 연구 결과, 0.3-3 mM의 농도 범위에서 점진적인 6량체-6량체 상호작용이 일어남을 증명하였다. 인슐린 제형들의 조성 및 인슐린 유사체들의 계획에 대한 현재 및 과거 전략들은 따라서 속효성 고도 농축 인슐린 제형의 개발에 부조화적 장벽에 부딪히거나 부딪쳤다: 자가 조립은 화학 및 물리적 안정성을 얻는 데 필요한 반면, 0.6 mM 이상의 이의 점진적 특성은 PK/PD의 바람직하지 못한 지속을 유래한다.

과거 십 년 동안, 단백질의 하나 또는 다른 특별 특성을 선택적으로 개질하여 목적하는 적용을 용이하게 하는 인슐린 분자에 대한 특정 화학적 개질들은 개시되어 있다. 재조합DNA 시대의 초기에 (1980), 야생형 인간 인슐린이 다양한 치료 맥락에서 사용하기에 최적인 것으로 구상된 반면, 과거 십 년간 인슐린 유사체들을 넓게 임상 사용한 결과, 각각 특정의 채우지 못한 필요에 맞춰진, 일군의 비표준 유사체들은 심대한 의학적 및 사회적 장점을 제공할 수 있다고 제시되고 있다. 단백질에서 특정 위치의 하나의 천연 아미노산을 다른 천연 아미노산으로 치환하는 것은 당해 분야에 공지되어 있고, 여기서 표준 치환으로 명명된다. 인슐린에서 비표준 치환으로 0.6 - 3.0 mM 범위에서 인슐린 유사체 농도의 함수로서 PK/PD를 악화시키지 않고 흡수 촉진이 전망된다.

인슐린의 투여는 당뇨병에 대한 치료로서 설정되었다. 인슐린은 척추동물의 대사에 중심 역할을 하는 작은 구형 단백질이다. 인슐린은 두 개 사슬, 21개 잔기를 가지는 A 사슬, 및 30 개 잔기를 가지는 B 사슬을 가진다. 이 호르몬은 췌장 β-세포에서 Zn²⁺-안정된 6량체로서 보관되지만, 혈류에서 무 Zn²⁺ 단량체로서 작용한다. 인슐린은 연결 부위 (35개 잔기)가 B 사슬의 C-말단 잔기 (잔기 B30)를 A-사슬의 N-말단 잔기에 연결시키는 단일-사슬 전구체, 즉 프로인슐린의 생성물이다. 아연 인슐린 6량체가 성숙된 보관 과립체 내에서 결정성으로 나열된 것들이 전자 현미경 (EM)으로 촬영되었다. 인슐린의 서열은 도 1에 도식적으로 나타나 있다. 개별 잔기들은 아미노산 (표준 삼문자 코드를 사용하여), 사슬 및 서열 위치 (통상 첨자로서)를 밝힘으로써 표시된다.

일반적으로 구형 단백질에서와 같이, 인슐린 내의 방향족 측쇄들은 인접 방향족 고리 뿐 아니라 양성 또는 음성 정전기적 전위의 다른 출처를 포함하는 다양한 소수성 및 약한 극성 상호작용에 관여할 수 있다. 그 예는 펩타이드 결합에서의 주-사슬 카르보닐- 및 아미드 기들을 포함한다. 방향족 측쇄들의 소수성 밀집은 단백질의 중심 내에서 및 단백질 간의 비극성 계면에서 일어난다고 믿어진다. 그러한 방향족 측쇄들은 구조나 기능에 주된 공헌을 반영하면서, 척추동물 단백질 간에 보존될 수 있다. 천연 방향족 아미노산의 예는 페닐알라닌이다. 이의 방향족 고리 시스템은 평면 육각형으로서 배열된 여섯 개 탄소를 포함한다. 방향족성은 이러한 여섯 개 탄소 사이에서의 결합 배열의 집단적 특성이고, 상기 고리 평면 위에 및 아래에 π전자 궤도와 연관된다. 이러한 면들은 부분적 음성 정전기 전위를 나타내는 반면 다섯 개 C-H 분체를 함유하는 상기 고리의 가장자리는 부분적 양성 정전기 전위를 나타낸다. 부분 전하의 이러한 비대칭적 분배는 사극자 (quadrapole) 정전적 모멘트를 일으키고, 단백질 내 다른 정식 또는 부분 전하와의 약한 극성 상호작용에 참여할 수 있다. 방향족 측쇄들의 추가 특징은 그의 용적이다. 이러한 용적의 결정인자들은 그 평면 고지의 가장자리에 있는 다섯 개 C-H 분체의 지리적 등고선을 포함한다. 하나의 C-H 분체를 C-F 분체로 치환하면 그의 방향족성을 보존하게 될 것으로 전망되지만, 불소 원자의 전기음성도로 인하여 그 고리에서 심각한 쌍극자 모멘트가 도입되고 결론적으로 그 고리의 평면 위와 아래에서의 π 전자 궤도가 왜곡된다. C-F 분체의 크기는 천연 C-H 분체의 것과 유사한 (및 그래서 원칙적으로 다양한 단백질 환경에 수용될 수 있다) 반면, 이의 국소적 전기음성도 및 고리-특이적 불소-유도된 정전기적 쌍극자 모멘트는 단백질 내 인접 군과 바람직한 또는 바람직하지 못한 정정기적 상호작용을 유도할 수 있다. 그러한 인접 군의 예는, CO-NH 펩타이드 결합 단위체, 디설파이드 다리에서 황 원자의 비공유 전자쌍, 측쇄 카르복사미드 관능체 (Asn 및 Gin), 다른 방향족 고리 (Phe, Tyr, Trp, 및 His), 및 산성 측쇄 (Asp 및 Glu)의 정규 양성 및 음성 전하 (Lys and Arg), 인슐린 제형에서 사용되는 범위 내의 잠재적 pK_a 로 적정될 수 있는 측쇄 (His), 적정될 수 있는 N- 및 C-말단성 사슬 말단, 결합된 금속 이돈 (Zn²⁺ 또는 Ca²⁺와 같은), 및 단백질-결합 물 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

치료성 단백질 내의 보존된 방향족 잔기의 예는 인슐린의 B 사슬의 B24 위치에 있는 페닐알라닌이다 (Phe^B24로 표시). 이것은 인슐린 내의 세 개 페닐알라닌 (위치 Bl, B24, 및 B25) 중 하나이다. 구조적으로 유사한 타이로신은 위치 B26에 있다. 인슐린 단량체에서 Phe^B24의 구조적 환경은 리본 모형 (도 2A) 및 공간충전 모형 (도 2B)로 나타낸다. 척추동물 인슐린 및 인슐린-유사 성장인자 간에 보존되어 있기 때문에, Phe^B24의 방향족 고리는 소수성 중심에 대하여 (그러나 그 안에는 아니고) 밀집되어 있어서 B 사슬의 초-이차 구조를 안정화시킨다. Phe^B24은 전형적인 수용체-결합 표면에 존재하고, 수용체 결합시 배열의 변형을 주도하는 것으로 제시되어 왔다. Phe^B24는 인슐린의 이량체 계면에서 밀집되며 따라서 인슐린 6량체의 세 개 계면에서 밀집된다. 인슐린 단량체 내의 이의 구조적 환경은 이러한 계면에서 이의 구조적 환경과 상이하다. 특히, 단량체 내에서 Phe^B24의 측쇄에 이용가능한 주위 용적은 이량체 또는 6량체에서보다 더 크다.

당뇨병 환자에서의 인슐린 대체 요법의 주용 목적은 혈당 농도의 면밀한 조절로, 건강한 인간 대상체의 정상 범위 기준 위나 아래로 벗어나는 것을 방지하는 것이다. 정상 범위 아래로 이탈은 즉각적인 교감신경성 또는 신경 포도당 결핍 증상과 연계되며, 이는 심한 경우, 경련, 혼수상태 및 사망에 이르게 된다. 정상 범위 위로의 이탈은 망막증, 실명, 및 신부전을 위시한 미세혈관 병의 장기 위험 증가와 관계 있다. 야생형 인간 인슐린 또는 인간 인슐린 유사체들의 흡수의 약물동력학 - U-100 보다 큰 강도에서 제형시 - 은 식후 대사적 항상성의 생리적 요청에 비하여 종종 너무 느리고, 너무 길고 및 너무 가변적이기 때문에, 심한 인슐린 저항성과 연계된 당뇨 환자들은 종종 최적 혈당 목표를 달성하는 데 실패하며 따라서 즉각적 및 장기 합병증 둘 다의 위험이 증가된 상태에 있게 된다. 따라서, 자가 조립된 인슐린 또는 인슐린 유사체의 농도가 약 0.6 mM 넘어가도록 만들어 지면, 정규적 및 속효성 인슐린 제품의 안정성, 효능 및 실제 편리성은 PK/PD의 연장 때문에 의해 제한된다.

본 발명은 인슐린 자가 조립의 필요성을 기작으로서 우회하여 조절 표준을 만족하거나 이를 뛰어 넘는 충분한 화학적 안전성 및 충분한 물리적 안정성의 제형을 달성한다. 화학적 분해는 Asn의 탈아미드화, 이소-Asp의 형성, 및 디설파이드 다리의 붕괴와 같이, 인슐린 분자 내의 원자들의 배열의 변화를 뜻한다. 화학적 분해에 대한 인슐린의 취약성은 이의 열학적 안정성 (화학적 변성 실험에 의해 나타나듯이)과 상관된다; 화학 분해에 가장 취약한 종은 단량체이기 때문에, 이의 속도는 자가 조립체 내의 단량체의 분리에 의해 감소된다. 생리적 분해는 섬유 형성 (소섬유 형성)으로 지칭되는 데, 이는 자가 조립의 비천연적 형태로서 베타-시트가 많은 배열에서 수천 개 (또는 그 이상) 인슐린 원형체 (protomer)들을 포함하는 선형 구조를 이룬다. 소섬유 형성은 실온 상에서 인슐린 및 인슐린 유사체들의 제조, 보관, 및 사용에서 심각한 문제이다. 소섬유 형성의 속도는 더 높은 온도, 더 낮은 pH, 교반, 또는 우레아, 구아니딘, 에타놀 공용매 또는 소수성 표면의 존재에 의해 촉진된다. 현재 미국 약품 규제는 일 퍼센트 이상에서 소섬유 형성이 일어난다면 인슐린이 폐기될 것을 요구한고 있다. 소섬유 형성이 높은 온도에서 촉진되기 때문에, 당뇨 환자들은 사용 전에 인슐린을 반드시 최적으로 냉장보관해야 한다. 인슐린 또는 인슐린 유사체의 소섬유 형성은 작은 양의 인슐린 또는 인슐린 유사체가 정기적으로 환자 체내로 주입되는 외부 인슐린 펌프를 사용하는 환자에게 특히 문제점이 될 수 있다. 그러한 용법에서, 상기 인슐린 또는 인슐린 유사체는 펌프 장치 내에서 냉장 보관되지 않고, 인슐린의 소섬유 형성은 인슐린 또는 인슐린 유사체를 체내로 주입하는 데 사용되는 카테터를 봉쇄할 수 있고, 이는 잠재적으로 혈당 수준의 예상치 못한 변동 또는 심지어 위험한 고혈당증을 결과할 수 있다. 적어도 하나의 최근 보고서는 인슐린 Lispro (KP-인슐린, 즉, 잔기 B28 및 B29가 야생형 인간 인슐린에서의 그들 위치에 대하여 상호변환된 유사체; 상품명 Humalog^®)가 특히 소섬유 형성 및 결과적으로 인슐린 펌프 카테터 봉쇄에 취약할 수 있다고 나타낸다. 인슐린은 25℃이상의 온도에서 매 10℃ 증가시 10 배 이상의 분해 속도 증가는 나타낸다; 따라서, 온도 < 30℃에서, 바람직하게는 냉장에서 보관하도록 지도된다. 그러한 제형들은 자연적인 인슐린 자가 조립체를 우세하게 포함한다.

단백질 소섬유 형성의 현재 이론에 따르면 소섬유 형성의 기작은 부분적으로 접혀진 중간 상태를 통해서 진행되고, 이 후 응집되어 아밀로이드발생 핵을 형성한다고 가정하고 있다. 이러한 이론에서, 천연 상태를 안정화하는 아미노산 치환들은 부분적으로 접혀진 중간 상채를 안정화 또는 안정화하지 않을 수 있고, 및 상기 천연 상태와 중간 상태 사이에 자유 에너지 장병을 증가 (또는 감소)시킬 수 있거나 없다. 따라서, 현재 이론은, 인슐린 분자에서 주어진 아미노산 치환이 소섬유 형성의 위험을 증가 또는 감소시키는 성향은 매우 예측불가라는 것을 나타낸다; 특히, 감지될 수 있는 소섬유 형성의 개시 전에 관찰되는 지연 시간은 천연 상태 단량체의 열역학적 안정성과 상관관계가 없다 (화학적 변성 실험에서 조사된 바와 같이). 어떤 치환이 전체 천연 상태 및 아밀로이드 발생적 접힘 둘 다를 안정화 -및 그래서 부분 소섬유 형성의 개시를 지연시키는- 시키는 반면, 다른 치환은 천연상태를 안정화시키나 아밀로이드 발생적 부분 접힘을 안정화시키지 않아서 지연 시간에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 또 다른 치환들은 천연 상태를 불안정화 시키나, 아밀로이드 발생적 부분 접힘을 안정화시키고, 따라서, 이의 현시적 안정화 특성에도 불구하고 소섬유 형성을 촉진하게 된다.

인슐린의 0.6 mM 내지 3.0 mM의 넓은 농도 범위 (전형적으로 U-100 내지 U-500 범위의 제형 강도에 상응하는) 하에서 당뇨를 치료하기 위한 빠른 PK/PD를 나타내지만 상응하는 야생형 인슐린의 적어도 일부분 활성을 나타내면서 이의 화학적 및/또는 물리적 안정성의 적어도 일부분을 유지하는 인슐린 유사체에 대한 요구가 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 피하 주사 후, 그들의 제형을 일정 단백질 농도에 있게 하고 빠른 흡수를 나타내는 형태로 있게 하기에 충분한 화학적 안정성 및 물리적 안정성의 무아연 단량체성 및 이량체성 종을 제공하는 인슐린 유사체를 제공하는 것이다. 본 발명은 고도 농도의 인슐린 제형 및 인슐린 유사체 제형에 대한 이전의 한계를 언급하는 바, 즉, 이들은 식후 혈당 조절을 최적화하는 데 또는 인슐린 펌프를 사용할 수 있도록 하는 데 충분히 빨리 작용하지 않는 것을 지적한다. 본 발명은 위치 B24에서 비표준 아미노산의 혼입을 통한 Phe^B24의 치환에 관한 것들을 위시한 이전의 디자인 한계를 우회한다. 위치 B24에서의 상기 비표준 아미노산 측쇄 (2F-Phe^B24; 또한 오소-모노플루오로-Phe^B24로 지칭)는 단리된 인슐린 단량체를 심대하게 안정화시킨다. 이것은 페닐알라닌과 크기 및 모양이 비슷한 할로겐-개질 방향족 유사체로의 치환에 의해 달성되며, 여기서 상기 유사체는 상기 천연 방향족 측쇄를 함유하는 상응하는 인슐린 또는 인슐린 유사체의 적어도 일부분 생물학적 활성을 유지한다. 또한, 상기 개질된 측쇄는 인슐린이 타입-I IGF 수용체 (IGF-IR)에 교차결합하는 것을 감소시키고 및 인슐린 수용체로의 결합을 조절하며 그래서 안정화 치환 His^B10→Asp에 의해 부여된 유사분열 촉진 특성 이상을 우회한다. 본 발명의 다른 관점은 2-F-Phe^B24 개질이 위치 B10 (Asp 또는 Glu)에서 산성 측쇄와 조합하여 결과된 유사체가 야생형 인간 인슐린과 유사하게 IGF-IR에 대하여 결합력을 가지는 것이다. 본 발명의 다른 관점은 그러한 인슐린 유사체가 U-100 강도의 야생형 인간 인슐린의 정규 제형과 유사한 또는 더 빠르고 및 덜 지연되는 PK/PD 특성을 유지하면서, pH 7-8 및 U-100 내지 U-500 (약 0.6 - 3.0 mM) 강도에서, 선택적으로는 무아연 제형에서 제형화 되는 것이다. 일 구체예에서, 상기 제형의 인슐린의 농도는 적어도 2 mM이다. 본 발명의 다른 관점은 2F-Phe^B24 및 위치 B10에서 산성 측쇄를 포함하는 인슐린 유사체가 A 사슬 또는 B 사슬에서 추가 치환을 포함하여 화학 또는 물리적 안정성이 더 향상된 또는 자가 조립이 더 저해되는 것이다.

일반적으로, 본 발명은 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B10에서, 아스파트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 측쇄를 포함하는 아미노산의 치환과 조합하여, 인간 인슐린의 서열에 관하여, 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환을 함유하는 변이성 인슐린 B-사슬 폴리펩타이드를 가지는 인슐린을 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것으로서, 상기 인슐린은 0.6 mM 및 3.0 mM 사이의 농도에서 존재한다. 특정 구체예에서, 약학적 제형은 인슐린을 적어도 2 mM의 농도로 포함한다. 일 특정 구체예에서, 상기 약학적 제형은 인슐린을 2.4 mM 이상의 농도로 포함한다.

추가로 또는 대안적으로, 상기 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체와 같은 포유동물 인슐린 유사체일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 B-사슬 폴리펩타이드는 서열번호 4-7 및 이의 세 개 이하의 추가 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드들로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 A 사슬은 위치 A8에서 치환을 함유한다 (서열번호 8, 서열번호 4-7로 구성되는 B-사슬 개질에 더하여).

다른 구체예에서, 상기 인슐린 유사체는 B 사슬의 위치 29에서 비표준 아미노산 치환을 조건적으로 포함할 수 있다. 일 예에서, B29에서의 비표준 아미노산은 노르루이신 (Nle)이다. 다른 구체예에서, B29에서의 비표준 아미노산은 오르니틴 (Orn)이다. 다른 구체예에서, 상기 비표준 아미노산은 아미노부티르산, 아미노프로피온산, 디아미노부티르 산 또는 디아미노프로피온 산일 수 있다.

또한, B24에서 비표준 아미노산을 혼입하고 있는 B-사슬 폴리펩타이드를 함유하는 인슐린 유사체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 일례에서, 상기 비표준 아미노산은 핵산 서열 TAG와 같은 종결 코돈에 의해 암호화된다. 발현 벡터는 그러한 핵산을 포함할 수 있고, 숙주 세포는 그러한 발현 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 환자의 혈당을 낮추는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 생리적 유효량의 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염을 투여하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염은 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 (2F-Phe) 및 위치 B10에서 Asp 또는 Glu을 혼입하고 있는 B-사슬 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 인슐린 유사체은 인간 인슐린의 유사체와 같은, 포유동물 인슐린 유사체이다. 특정 구체예에서, 상기 B-사슬 폴리펩타이드는 서열번호 4-7 및 이의 세 개 이하의 추가 아미노산 치환을 가지는 폴리펩타이드들로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 A-사슬 폴리펩타이드는 서열번호 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을, 서열번호 4-7로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 B-사슬 폴리펩타이드와 조합적으로, 포함한다.

본 발명의 다른 관점은, 인간 인슐린의 서열에 관하여 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환을, 인간 인슐린의 서열에 관하여 위치 B10에서 산성 측쇄를 함유하는 아미노산의 치환, 및 인간 인슐린의 서열에 관하여, 위치 B29에서, 오르니틴, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 노르루이신, 아미노부티르산 및 아미노프로피온산으로 구성되는 군으로부터 선택된 비표준 아미노산의 치환과 조합하여, 함유하는 변이성 인슐린 B-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 프로인슐린 유사체 또는 단일-사슬 인슐린 유사체일 수 있다.

도 1은 B 사슬에서 잔기 B24의 위치를 표시하는 인간 인슐린의 서열을 도식적으로 나타낸다.
도 2A는 세 개 디설파이드 다리에 대하여 Phe^B24 의 방향족 잔기를 나타내는 인슐린 단량체의 리본 모형이다. Leu^B15 (화살표) 및 Phe^B24의 인접 측쇄가 도시된다. A- 및 B 사슬들은 각각 밝은 및 어두운 회색으로 달리 나타나며, 시스테인의 황 원자들은 원으로 표시된다.
도 2B는 소수성 중심의 가장자리에 있는 포켓 내부의 Phe^B24 측쇄를 나타내는 인슐린의 공간 충전 모형이다.
도 3A는 페닐알라닌 (Phe)의 일련의 볼-막대 (위) 및 공간충전 (아래) 모형 표시이다.
도 3B는2F-Phe의 일련의 볼과 막대 (위) 및 공간충전 (아래) 모형 표시이다.
도 4는 인슐린 유사체의 수용체 결합 연구의 결과를 나타낸 그래프이다. 인슐린 수용체의 B 이소폼 (IR-B)에 대한 상대적 활성은 수용체 결합된 ¹²⁵I-표지된 인간 인슐린이 인간 인슐린 (●) 또는 이의 유사체: DKP-인슐린 (▲) 및 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▼)의 농도를 증가시킴으로써 대체되는 경쟁적 결합 분석법에 의해 결정된다; 곡선 맞춤의 결과는 표 2와 3에 요약되어 있다.
도 5는 리간드-자극된 IGF-I 수용체 자동인산화의 정도를 나타내는 히스토그램이다. 인간 IGF-I 수용체를 안정적으로 발현하는 IGF-I 수용체-결핍 마우스 배아 섬유아 세포를 밤새 혈청 결핍 처리한 후 10 nM 리간드로 5 분간 처리하고, 세포 용해물을 준비하고 인산화된 IGF-I 수용체 (IGF-IR)에 관하여 ELISA로 분석하였다. 2F-DKP에 의한 자가인산화는 HI와 유사하였다.
도 6은 유사분열 촉진성에 대한 유방암-관련 MCF-7 콜로니 형성 분석의 결과를 나타낸다. MCF-7 인간 유방암 세포들을 1 주일 성장 시킨 후, 10 nM 리간드 존재하에서 유연한 아가 (종양발생성 잠재성을 반영한)에서 콜로니 형성에 대하여 분석하였다. 2F-Phe^B24-DKP의 종양형성적 잠재성은 야생형 인간 인슐린 및 미처리 세포와 비견되었다.
도 7은 CD-검출된 구아니딘 변성의 그래프를 제공한다. 인간 인슐린 (HI, ●), 인슐린 Lispro (KP, □), Asp^B10-KP-인슐린 (DKP, ◆) 및 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (▲) 인슐린 유사체의 화학적 변성. 스펙트럼들을 25℃에서 인산염 생리 완충액 (pH 7.4) 내에서 측정하였다. 언폴딩을 222 nm에서 CD로써 모니터하였다. 2F-Phe^B24-DKP 유사체의 안정성은 DKP-인슐린 및 인간 인슐린에 비하여, 안정성에서 각각 0.6(+0.2) 및 1.6(+0.2) kcal/mol의 이득 (△△G_U)을 나타냈다 (참조 표 4).
도 8은 인슐린 유사체들의 소섬유 형성 지연 시간을 비교한 히스토그램이다. 티오플라빈 T 형광으로 소섬유 형성 지연시간을 모니터하였다. 샘플들을 무아연 인산염 완충생리액 내 37℃ 및 pH 7.4에서, 가볍게 진탕하였다. 2F-DKP-인슐린은 인슐린 Lispro 및 야생형 인간 인슐린에 비하여, 소섬유 형성에 각각 3.7 및 2.4배 더 내성적이었다 (지연 시간으로 측정시).
도 9는 현재의 인슐린 제품 Humalog (U-100 강도; 상부 막대) 및 Humulin R U-500 (바닥 막대)에 대비된, 마취된 돼지에서, U-400 강도의 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) pH 7.4을 함유하는 무아연 릴리 (Lilly) 희석액 내; 중간 막대)의 약력학을 도식적으로 요약한 것을 나타낸다.
도 10은 2F-Phe^B24 의 결정 구조를 아연 KP-인슐린 6량체의 맥락에서 구저적으로 나타낸다. (A) T₃R^f ₃ 아연 6량체로서의 야생형 인간 인슐린의 리본 모형. (B) 동일한 결정 형태로 있는 2F-Phe^B24-KP-인슐린의 상응하는 리본 모델. 변이체 T₃R^f ₃ 구조는 부모 6량체의 것과 유사하였고, 이는 긴 범위의 구조적 혼란이 없고, 천연과 유사한 이량체 계면에서의 불소 원자의 수용을 증명하는 것이다.
도 11은 2.5 Å의 해상도로 측정시, 2F-Phe^B24의 결정 구조에서 2F-Phe^B24를 둘러싼 전자 밀도를 나타내는 것으로, (A)T 상태 원형체에서 2F-Phe^B24 및 인접 전자 밀도. (B) R^f-상태 원형체에서의 2F-Phe^B24 및 인접 전자밀도. B24 고리의 방향 및 플루오로 분체의 상호작용은 두 개 배열 상태 사이에 상이하다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 U-100 내지 U-500의 넓은 인슐린 농도에서 속효적 PK 및 PD가 유지될 수 있도록 하는 인슐린 유사체에 관한 것이다. 다은, 상기 유사체는 상응하는 비개질된 인슐린 또는 인슐린 유사체의 생물학적 활성의 적어도 일부분을 유지하며, 소섬유 형성에 대한 유사 또는 향상된 역역학적 안정성과 저항성을 유지한다. 본 발명자들은 U-100 강도에서의 야생형 인간 인슐린의 조절 제형 (예, Humulin R^® U- 100; Eli Lilly and Co.)과 유사 또는 더 빠른 PK/PD 특성을 가지며 그러한 PK/PD 특성들은 0.6 mM - 3.0 mM 범위의 인슐린 유사체 농도에 의해 유의하게 영향을 받지 않는 인슐린 유사체를 발명하였다.

본 발명은 피하 주사 후, 흡수의 신속성에 대하여, 고도의 농축된 인슐린 제형의 특성을 향상시키는 위치 B24에서의 비표준 불소성 개질에 관한 것이다. 일 예에서, 상기 인슐린 유사체는 위치 B10에서 산성 치환 (Glu 또는 Asp)을 포함하는 조작된 이량체로서, B10에 도입되어 천연 잔기 His^B10에 의한 아연 이온의 결합을 방해하고 및 아연 인슐린 6량체들의 분자 구조에서 정의된 바와 같이, 인슐린의 삼량체 계면을 불안정화시키는 것이다. 다른 예에서, 상기 유사체는, 전술한 위치 B10에서의 산성 치환에 더하여, 위치 B28 및/또는B29에서 추가 치환을 포함하는 조작된 단량체로서, 도입되어, 아연 인슐린 6량체 및 무아연 이량체의 분자구조에서 정의된 바와 같이, 인슐린의 전통적인 이량체 계면을 불안정화시킨다. 다른 예에서, 상기 이량체성 및 단량체성 유사체들은 위치 A8에서 추가 치환을 포함할 수 있다.

두 개 특정 구체예의 어디에서건, (2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (여기서 DKP는 Asp^B10, Lys^B28 및 Pro^B29을 나타낸다), 및 2F-Phe^B24-[Asp^B10, Orn^B29]-인슐린; 여기서 Orn는 오르니틴을 지칭), 본 발명은 야생형 인간 인슐린의 것과 유사한 또는 그 보다 낮은, 타입 I IGF 수용체에 대한 결합력, 야생형 인간 인슐린의 것과 유사한 또는 그 보다 낮은, 타입 I IGF 수용체의 자가인산화를 자극하는 활성, 및 야생형 인간 인슐린의 것과 유사한 또는 그 보다 낮은, 인간 유방암-유래 세포주의 증식을 자극하는 활성을 나타내는 인슐린 유사체를 제공한다. 본 발명은 그러나 인간 인슐린 및 이의 유사체들의 2F-Phe^B24-유도체에 한정되지 않는다. 이러한 치환들은 또한, 비제한적인 예를 들면, 돼지, 소, 및 개 인슐린과 같은 동물 인슐린으로부터 유도된 이량체성 및 단량체성 유사체로 만들어 질 수 있다는 것이 또한 제시된다.

2F-Phe^B24-DKP-인슐린 및 2F-Phe^B24-[Asp^B10, Orn^B29]-인슐린은, Lilly 희석액에 제형화되고 및 스트렙토조토신으로 당뇨성으로 만든 수컷 루이스 래트에 피하 주사했을 때, 동일한 제형의 야생형 인간 인슐린의 것과 유사한 능력으로 혈당 농도를 직접적으로 낮추는 것으로 발견되었다. 또한, 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 및 2F-Phe^B24-[Asp^B10, Orn^B29]-인슐린은, Lilly 희석액에 제형화된 후, 옥트레오타이드를 정맥내 투여함으로써 인슐린의 내재적 b-세포 분비를 억제시킨 마취된 요크셔 돼지에 피하 주사핼을 때, 동일한 제형의 야생형 인간 인슐린의 것과 유사한 능력으로 혈당 농도를 직접적으로 낮추는 것으로 발견되었다.

또한 또는 대안적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 야생형 인슐린에서 라이신 (Lys)인, B 사슬의 위치 29에서 표준 또는 비표준 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 일례에서, 상기 B29에서의 비표준 아미노산은 노르루이신 (Nle)이다. 다른 예에서, B29에서의 비표준 아미노산은 오르니틴 (Orn)이다.

또한, 인간과 동물 인슐린들 사이의 유사성, 및 과거 당뇨 인간 환자에서 동물 인슐린의 사용의 관점에서, 인슐린의 서열에서의 다른 소소한 개질, 특히 "보존적"이라고 간주되는 그러한 치환들이 도입될 수 있다. 예를 들어, 아니노산들의 첨가 치환들은 본 발명을 벗어나지 않고, 유사한 측쇄를 가진 아미노산의 군 내에서 이루어 질 수 있다. 이러한 것들은 중성 소수성 아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 발린 (Val 또는 V), 루이신 (Leu 또는 L), 이소루이신 (Ile 또는 I), 프롤린 (Pro 또는 P), 트립토판 (Trp 또는 W), 페닐알라닌 (Phe 또는 F) 및 메티오닌 (Met 또는 M). 유사하게, 상기 중성 극성 아미노산은 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 타이로신 (Tyr 또는 Y), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Glu 또는 Q), 및 아스파라긴 (Asn 또는 N)의 군 내에서 다른 것에 대하여 치환될 수 있다. 염기성 아미노산들은 라이신 (Lys 또는 K), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H)을 포함한다. 산성 아미노산들은 아스파트산 (Asp 또는 D) 및 글루탐산 (Glu 또는 E)이다. 별다른 언급이 없는 한 또는 맥락으로부터 명백한 경우, 여기서 언급된 아미노산들은 L-아미노산들로 간주되어야 한다. 표준 아미노산들 또한 동일한 화학적 군에 속하는 비표준 아미노산들에 의해 치환될 수 있다. 비제한적 예를 들면, 염기성 측쇄 Lys은 더 짧은 측쇄 길이의 염기성 아미노산 (오르니틴, 디아미노부티르산, 또는 디아미노프로피온산)에 의해 치환될 수 있다. Lys은 또한 중성 지방족 등배전자체 노르루이신 (Nle)에 의해 대체될 수 있고, 이는 다음 더 짧은 지방족 측쇄 (아미노부티르산 또는 아미노프로피온산)을 함유하는 유사체에 의해 치환될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 인슐린 유사체는 본 발명의 2F-Phe^B24 및 B10 치환외 다른 4 개 이하의 보존적 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 변이성 B-사슬 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제형은 또한 인간 인슐린에 대하여 위치 B3에서의 Asn 또는 Lys 치환을 포함한다. 또한 또는 대안적으로, 상기 제형은 위치 A8에서 글루탐산 치환 또는 히스티딘 치환을 함유하는 인슐린 A-사슬 폴리펩타이드 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 인슐린 또는 인슐린 유사체에서의 다양한 아미노산들은 구하고자 하는 아미노산 잔기로 표시되고, 조건적으로 첨자로서 그 아미노산의 위치를 표시할 수 있다. 원하는 아미노산의 위치는 치환이 위치한 인슐린의 A- 또는 B 사슬을 포함한다. 따라서, Phe^B24는 인슐린의 B 사슬의 24번째 아미노산에서의 페닐알라닌을 표시한다. 방향족 고리의 플루오로-유도체들은 평면성을 보유하나, π전자의 분포에서 상이하고, 2F-페닐알라닌 (도 3B)에 비하여 페닐알라닌 (도 3 A)의 전면 또는 측면도에서 보여지는 바와 같이, 정전기적 전위에서의 변화로 이끌게 된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 특정 치환의 언급된 위치는 임의의 논의된 특정 구체예에서 사용되는 특정 종에 관계없이, 야생형 인간 인슐린에 대한 위치로 이해되어야 한다. 이러한 방식에서, 치환의 위치는 특정 폴리펩타이드에서의 임의의 삽입, 연장 또는 삭제와 관계없이 확인가능할 수 있다.

본 발명은 Phe^B24 에서의 2F 개질이 전기음성적 원자 및 정전기적 다이폴 모멘트를 도입하게 되고 이는 (i) 인슐린 단량체의 열역학적 안정성 및 (ii) 수용체-결합 표면의 기능적 특성에서의 변화를 결과하게 되는 것에 대한 것이다. 수용체 결합의 증대와 관련하여, 인슐린의 안정성을 향상시키는 치환들이 당해분야에 공지되어 있는 반면, 2F-Phe^B24는 수용체 결합을 감소시키면서 인슐린을 안정화시킨다. 특히, 이러한 변이는 위치 B10에서의 산성 치환 (Asp 또는 Glu)의 효과에 반작용을 작용하게 되어 타입 I IGF 수용체에 결합하는 것 및 이를 통한 신호전달을 향상시킨다; 이러한 변이는 그러한 B10 치환의 효과에 반작용으로 작용하여 인슐린 수용체에 결합하는 것을, 추측상으로는 대부분, 상기 수용체 상의 상기 유사체의 거류 시간을 감소시킴으로써, 향상시키게 된다; 및 이러한 및 다른 가능한 기작에 의해, 2F-Phe^B24는 야생형 인간 인슐린에 비하여 과도한 유사분열 촉진성을 야기하지 않고, B10에서 산성 잔기가 혼입하는 것을 가능하게 한다.

B24에서의 페닐알라닌은 기능성 인슐린에서 불변적 아미노산이고 방향족 측쇄를 포함한다. 인슐린에서 Phe^B24의 생물학적 중요성은 인간 당뇨를 유발하는 임상 변이 (Ser^B24)에 의해 증거된다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, Phe^B24는 전형적인 수용체 결합 표면에서 소수성 중심의 가장자리에서 감싸이게 된다고 여겨진다. 상기 모델은 결정학적 원형체 (2-Zn 분자 1; 단백질 데이터뱅크 식별자 4INS)에 근거한다. B 사슬 (잔기B24-B28)의 β-본쇄의 C- 말단 내에 위치하면서, Phe^B24는 중심 α나선 (잔기 B9-B19)에 인접하고 있다 (도 2A). 인슐린 단량체에서, 방향족 고리의 한면과 가장자리는 Leu^B15 및 Cys^B19 에 의해 정의된 얕은 포켓에 위치한다; 나머지 면과 가장자리는 용매에 노출된다 (도 2B). 이러한 포켓은 부분적으로 주-사슬 카르보닐 및 아미드 기에 의해 둘려싸여지고, 및 그래서 불규칙하고 느슨한 입체 경계를 가진 복합적이고 및 비대칭적 정전기적 환경을 창출한다. 상기 인슐린 이량체에서 및 인슐린 6량체의 세 개 이량성 계면의 각각에서, Phe^B24의 측쇄는 이량체 계면 당 여덟개 방향족 고리의 클러스터(Tyr^B16, Phe^B24, Phe^B25, Tyr^B26 및 이들의 이량체-관련 짝). 의 부분으로서 더욱 단단하게 내포된 공간적 환경 내에 채워진다. 이론과 관계없이, 2F 유도체에 의한 Phe^B24의 방향족 고리의 치환은 인슐린 단량체 내에 유리한 비대칭 정전기 상호작용을 도입하면서 이량체 계면 내로 일반적인 소수성 패킹을 보존하게 된다.

본 발명은 이량체성 또는 단량체성 인슐린 유사체등의 초고도 농축 제형의 특성을 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 유사분열촉진성에 대하여 향상시키기 위한 위치 B24에서 비표준 개질에 관한 것이다. 이러한 향상으로 인하여, 상기 인슐린 유사체들은 U-100 이상 및 최대 U-500까지의 강도에서 제형화될 수 있어서, 인슐린 유사체의 농도에 관계없이, 상기 제형은 피하 주사후, 흡수 및 약학적 활성의 신속성을 통상적 야생형 인간 인슐린 U-100 제형과 유사하게, 유지한다; 후자의 예는 Humulin^® R U-100 (Eli Lilly and Co) 또는 Novalin^® R U-100 (Novo-Nordisk)이다. 일례에서, 상기 인슐린 유사체는 위치 B10에서 산성 치환(Asp 또는 Glu)과 연계하여2F-Phe^B24를 포함한다. 다른 예에서, B24에서 상기 비표준 아미노산 치환은 B10 에서 산성 치환, 및 위치 B29에서의 비표준 치환이나 A- 또는 B 사슬의 다른 곳에서 세 개 이하의 표준 치환 양쪽 다 동반한다.

본 발명의 치환은 많은 기존의 인슐린 유사체들 중 임의의 것에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공된 위치 B24에서의 페닐알라닌의 오소-플루오로 유도체 (2F-Phe^B24)는 인간 인슐린 외에 인슐린 Lispro ([Lys^B28, Pro^B29]-인슐린, 여기서는 KP-인슐린으로 약칭), 인슐린 Aspart (Asp^B28-인슐린), 인슐린 Glulisine ([Lys^B3, Glu^B29]-인슐린), 또는 다른 개질된 인슐린이나 인슐린 유사체의 맥락에서, 또는 정규 인슐린, NPH 인슐린, 서방성 인슐린 또는 고도서방성 인슐린과 같은 다양한 약학적 제형 내, 위치 B10에서 산성 잔기를 포함하는 인슐린 유사체에서 만들어 질 수 있다. 인슐린 Aspart는 Asp^B28 치환을 포함하고 Novalog^®로서 시판되며 인슐린 Lispro는 Lys^B28 and Pro^B29 치환을 포함하고 및 Humalog^®의 상품명으로 판매된다; 인슐린 Glulisine는 치환 Lys^B28 및 Pro^B29을 포함하고 Apidra^® 상품명으로 판매된다. 이러한 유사체들은 미국 특허 번호 제5,149,777호, 제5,474,978호, 및 제7,452,860호에 설명되어 있다. 이러한 유사체들은 각각 속효성 인슐린으로 알려져 있다.

인간 프로인슐린의 아미노산 서열이, 비교 목적상 서열번호 1로 제공된다.

서열번호 1 (인간 프로인슐린)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

인간 인슐린의 A 사슬의 아미노산 서열이 서열번호 2로 제공된다.

서열번호 2 (인간 A 사슬)

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys- Asn

인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 서열이 서열번호 3로 제공된다.

서열번호 3 (인간 B 사슬)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

인간 인슐린의 B 사슬 아미노산 서열이 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 (2F-Phe)의 치환으로 개질될 수 있다. 그러한 서열의 예가 서열번호 4로 제공된다.

서열번호 4

Phe-Val-Xaa₅-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa₄-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly- Xaa₁-Phe-Try-Thr-Xaa₂-Xaa₃-Thr

[Xaa₁은 2F-Phe이고; Xaa₂는 Asp, Pro, Lys, 또는 Arg이고; Xaa₃는 Lys, Pro, 또는 Ala이고; Xaa₄는 Asp 또는 Glu이고; 및 Xaa₅는 Asn 또는 Lys이다]

위치 B24에서의 2F-Phe의 치환은, 서열번호 5에서 제공되는 바와 같이, 조건적으로 위치 B29에서의 비표준 치환과 조합될 수 있다.

서열번호 5

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa₄-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa₁-Phe-Try-Thr- Xaa₂-Xaa₃-Thr

[Xaa₁는 2F-Phe이고; Xaa₂는 Asp, Glu, 또는 Pro이고; Xaa₃는 오르니틴, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 노르루이신, 아미노부티르산, 또는 아미노프로피온산이고; 및 Xaa₄는 Asp 또는 Glu이다]

다른 치환의 조합들 또한 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명의 상기 치환 및/또는 첨가는 선행 공지된 인슐린 유사체들과 또한 조합될 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들어, 2F-Phe^B24 치환이 또한 도입된, 인슐린 Lispro의 Lys^B28 및 Pro^B29 를 함유하는 인간 인슐린의 B 사슬의 유사체의 아미노산 서열을 서열번호 6으로서 제공한다.

서열번호 6

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser- Xaa₂-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys- Gly-Glu-Arg-Gly- Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr

[Xaa₁은 2F-Phe이고 및 Xaa₂ 는 Asp 또는 Glu이다]

유사하게, 2F-Phe^B24 치환이 또한 도입될 수 있는, 인슐린 Aspart의 Asp^B28 치환을 함유하는 인간 인슐린의 B 사슬의 유사체의 아미노산 서열이 서열번호 7로서 제공된다.

서열번호 7

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa₂-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu- Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly- Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고 Xaa₂는 Asp 또는 Glu이다]

다른 구체예에서, 상기 B-사슬 인슐린 유사체 폴리펩타이드는, 서열번호 8로서 제공되는 바와 같이, 위치 B3에서 리신, 위치 B29에서 글루탐산 및 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌을 포함한다.

서열번호 8

Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser- Xaa₂-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu- Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly- Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고, 및 Xaa₂는 Asp 또는 Glu이다]

2F-Phe^B24 치환은 또한 공계류중인 국제출원번호 PCT/US 07/00320 및 미국 출원번호 12/160,187에서 완전히 설명된바와 같이 잔기 A8에서의 치환을 함유하는 인간 인슐린의 유사체와 같은, 다른 인슐린 유사체 치환과 조합하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 2F-Phe^B24치환은 His^A8나 Glu^A8과 같이 존재하며 여기서 변이체 A 사슬은 서열번호 9로 제공된다.

서열번호 9

Gly-Ile-Val- Glu-Gln-Cys-Cys- Xaa₁-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn- Tyr-Cys-Asn;

상기식에서 Xaa₁ 는 His 또는 Glu이다.

서열번호 4-8에서 제공되는 인슐린 유사체들은 트립신-촉매된 반합성으로 제조될 수 있는 데, 여기서 Asp^B10-인슐린, Glu^B10-인슐린, 또는 위치 A8에서 추가 치환을 포함하는 이의 변이체의 des-옥타펩타이드[B23-B30] 단편물이 서열번호 10 및 11로 제공되며, 여기서 A와 B 사슬은 시스테인 A7-B7 및 A20-B19에 의해 연결되며 및 A 사슬은 시스테인 A6-A11을 함유한다.

서열번호 10

(A 사슬)

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys- Asn

상기식에서 Xaa는 Thr, His, 또는 Glu이다

서열번호 11

(B 사슬)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys- Gly-Glu-Arg

상기식에서 Xaa는 His 또는 Glu이다.

트립신-매개 반합성은 또한 서열번호 12-14에서 제공되는 바와 같이, 오소-모노플루오로-페닐알라닌 (2F-Phe)을 함유하는 합성 옥타펩타이드를 사용한다.

서열번호 12

Gly- Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Pro- Xaa₂-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고 및 Xaa₂는 그의 ε-아미노 관능기에 부착된 제거가능한 보호기를 포함하는 Lys이다]

서열번호 13

Gly-Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa₂-Thr.

[Xaa₁은 2F-Phe이고 Xaa₂는 Glu이다]

서열번호 14

Gly-Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa₂-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고, Xaa₂는 노르루이신, 오르니틴, 디아미노부티르산, 또는 디아미노프로피온산이다]

서열번호 15

Gly-Xaa₁-Phe-Tyr-Thr-Xaa₂-Pro-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고 Xaa₂는 Asp 또는 Glu이다]

서열번호 16

Gly- Xaa₁ -Phe-Tyr-Thr- Asp- Xaa₂-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이고 Xaa₂ 는 그의 ε-아미노 관능기에 부착된 제거가능한 보호기를 포함하는 Lys이다]

서열번호 17

Gly- Xaa₁-Phe-Tyr-Thr- Lys-Pro-Thr.

[Xaa₁는 2F-Phe이다]

B24에서의 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환이 또한, 미국 특허 번호8,192,957에 예를 들어 개시된 바와 같이, 단일-사슬 인슐린 유사체에 추가 치환으로서 도입될 수 있다.

오소-모노플루오로-페닐알라닌(2F-Phe)이 천연 활성의 조작된 인슐린 단량체로 도입되었는 데 이는 DKP-인슐린으로 명명되었고, 치환 Asp^B10 (D), Lys^B28 (K), 및 Pro^B29 (P)을 포함한다. B 사슬의 표면 상에서 이러한 세 개 치환은 이량체 및 6량체의 형성을 방해하는 것으로 및 아연 이온의 존재나 부존재하에서 및 페놀성 보존제의 존재나 부본재하에서 6량체와 상용될 수 없다고 여겨진다. KP-인슐린 (DKP 인슐린의 Asp^B10 치환이 결여된)은 Humalog^®의 활성 성분이고 (또한 인슐린 Lispro으로 지칭), 현재, 속효성 인슐린 유사체 제형으로서 임상적으로 사용된다. DKP-인슐린의 이러한 변이체에 대한 B-사슬 폴리펩타이드의 서열은 서열번호 6으로서 제공된다. 오소-모노플루오로-페닐알라닌 (2F-Phe)은 또한 위치 B24에서 향상된 활성의 조작된 인슐린 단량체 내로 도입되었고, 이는 DDP-인슐린으로 지칭되고, 서열번호 4에서 제공된 일반 도식에 따라서 DP 치환 Asp^B28 (K) 및 Pro^B29(P)에 더하여 치환 Asp^B10 (D)을 포함한다. 2F-Phe가 또한 서열번호 5에서 제공된 일반 도식에 따라서, 오르니틴 위치 B29를 함유하는 비표준 인간 인슐린 유사체로 도입되었다.

Asp^B10-인슐린의 상기 유사체들을 트립신-촉매된 반-합성법으로 제조하였고 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다 (Mirmira, R.G., and Tager, H.S., 1989. J. Biol. Chem. 264: 6349-6354). 이러한 방법은 (i) 잔기 (N)-GF*FYTKPT를 표시하는 합성 옥타펩타이드 (개질된 잔기 (F*) 및 "KP" 치환 (밑줄)을 포함; 서열번호 15) 및 (ii)절단된 유사체 des-옥타펩타이드[B23-B30]-인슐린 또는, DKP-인슐린 유사체의 경우, Asp^B10-des-옥타펩타이드[B23-B30]-인슐린 (서열번호 11)을 사용한다. 상기 옥타펩타이드가 야생형 B23-B30 서열 (GF*FYTPKT; 서열번호 12)과, Pro^B28 및 Lys^B29 (이태리체)의 상호교환에 의해 상이하기 때문에, 트립신 처리동안 리신 ε아미노기를 보호할 필요가 없다. 상세히, des-옥타펩타이드 (15 mg) 및 옥타펩타이드 (15 mg)를 10 mM 칼슘아세테이트 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트 산 (EDTA) (35:35:30, v/v, 0.4 mL)을 함유한 디메틸아세트아미드/l,4-부탄디올/0.2 M 트리스 아세테이트 (pH 8) 혼합물에 용해하였다. 최종 pH를 N-메틸모르핀 10 μL를 사용하여 7.0으로 조절하였다. 상기 용액을 12℃로 냉각하고, TPCK-트립신1.5 mg를 첨가하여 2일간 12℃에서 항온처리하였다. 트립신1.5 mg을 추가로 24시간 후에 첨가하였다. 반응물을 0.1% 트리플루오로아세트 산으로 산성화시키고 및 조제용 역상 HPLC (C4)로 정제하였다. 각 경우에 MALDI-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용한 질량 분광분석법으로 예상된 값을 얻었다 (미제시). 고상 합성에 대한 일반적 방법은 설명된 바와 같다 (Merrifield 등, 1982. Biochemistry 21: 5020-5031). 9-플루오렌-9-일-메톡시-카르보닐 (F-moc)-보호된 페닐알라닌 유사체를 Chem-Impex International (Wood Dale, IL)로부터 구입하였다.

상기 방법을 또한 사용하여 Phe^B24가 2-F-Phe에 의해 치환되고 및 Pro^B28이 Asp (D)에 의해 치환되고 및 Lys^B29가 Pro (P)에 의해 치환된 Asp^B10-인간 인슐린의 유사체를 제조하였다. 이러한 유사체는 2F-Phe^B24-DDP-인슐린으로 지칭되고, 여기서 두문자 DDP는 각각의 위치 B10, B28, 및 B29에서의 아미노산 잔기의 정체를 나타낸다.

상기 방법을 또한 사용하여 위치 B29에서 오르니틴 (O)을 함유하는 Asp^B10-인간 인슐린의 제조하고 및 이러한 맥락에서 2F-Phe^B24 를 도입한다. 이러한 유사체의 제조 방법은 위치 29에서 비표준 아미노산 치환을 활용하여 B 사슬의 C-말단 옥타펩타이드 내에 통상 존재하는 트립신 부위를 제거하면서 (예, Lys^B29 및 Thr^B30 사이) 위치 28에서의 프롤린 (P)을 유지한다. Pro^B28은 인슐린 6량체 내의 이량체 계면의 안정성에 기여할 것으로 여겨지고, 따라서 이러한 제조 방법은 야생형 인슐린의 근접-등전자 모델을 제공하며 여기서 다른 개질이, 복잡한 측쇄 보호할 필요 없이, 편리하게 혼입될 수 있다. 이러한 유사체는 2F-Phe^B24-DPO-인슐린으로 지칭되며, 여기서 두문자 DPO는 위치 B10, B28, 및 B29의 각 위치에서의 아미노산 잔기의 정체를 나타낸다. 2F-Phe^B24-개질된 인슐린 유사체를 하기 분석의 일부 또는 전체로 처리하였다. 생물학적 능력은 당뇨 래트 모델에서, 및 유글리세믹 클램프법에 의해 마취된 요크셔 돼지에서 산정하였다; 나타난 수용체-결합 활성값은 인간 인슐린에 대한 호르몬-수용체 해리 상수의 비율에 근거한다 (인간 인슐린의 활성은, 따라서, 일반적으로 여느때 같으면 25% 미만인 활성값에서의 표준 편차를 사용한 정의에 의하면 1.0이다 ); 타입 I IGF 수용체의 호르몬-자극 자가인산화의 분석을 인간 IGF-IR을 발현하는 마우스 배아 섬유아세포 (고맙게도 미네소타 주립대의 Deepali Sachdev 및 Douglas Yee박사가 제공한)에서 수행하였다; 인간 세포주에서의 유사분열 촉진성의 분석은 설명한바와 같은 유방암 유래 세포주 MCF-7를 사용하였다 (Milazzo G, Sciacca L, Papa V, Goldfine ID, Vigneri R. (1997) Asp^B10-insulin induction of increased mitogenic responses and phenotypic changes in human breast epithelial cells: evidence for enhanced interactions with the insulin-like growth factor-I receptor. Mol. Carcinog. 18, 19-25); 열역학적 안정성 값 (언폴딩의 자유 에너지; ΔG_U)를 제로 변성제 농도까지 외삽하는 바와 같이, 두 개 상태 모델에 근거하여 25℃에서 계산하였다; 소섬유 형성에 대한 저항성은 무아연 인산염 완충식염수 (pH 7.4)내 30℃에서 개시된 바와 같이 부드럽게 진탕시 단백질 소섬유 형성의 개시에 요구되는 지연 시간 (날 수)를 측정함으로써 평가하였다 (Yang, Y., Petkova, A.T., Huang, K., Xu, B., Hua, Q.X., Y, I.J., Chu, Y.C., Hu, S.Q., Phillips, N.B., Whittaker, J., Ismail-Beigi, F., Mackin, R.B., Katsoyannis, P.G., Tycko, R., & Weiss, M.A. (2010) An Achilles' Heel in an amyloidogenic protein and its repair. Insulin fibrillation and therapeutic design. J. Biol. Chem. 285, 10806-10821). 곡선 맞춤의 결과를 표 4에 요약하고 도 8에 나타냈다.

원편광 이색성 (CD) 스펙트럼을 4℃ 및/또는 25℃에서 Aviv 분광편광계를 사용하여 수득하였다 (Weiss 등, Biochemistry 39: 15429-15440). 샘플은 50 mM 인산 칼륨 (pH 7.4) 내에 약 25 μM DKP-인슐린 또는 유사체를 함유하였다; 샘플을 25℃에서의 구아니딘-유도 변성 연구에 대하여 5 μM 희석하였다. 언폴딩의 자유 에너지를 추출하기 위해, 변성 전이를 Sosnick 등, Methods Enzymol. 317: 393-409에 개시된 바와 같이, 비선형 최소 자승법에 의해 두 개 상태 모델로 일치시켰다. 상세하게, x는 변성체의 농도를 나타내는 CD 데이터

를

에 따른 비선형 최소 자승법에 의해 일치시켰다.

상기식에서 x는 구아니딘의 농도이고 및 θ_A 와 θ_B 는 천연 및 언폴드된 상태에서 기준선 값이다. 기준선은 전이 전 및 전이 후 선

및

에 의해 근사치 값을 구하였다. 상기 변이체 언폴딩 전이를 맞추는 데 있어서 수득한 m 값은 야생형 언폴딩 곡선을 맞추는 데 있어서 수득한 m 값보다 더 낮다. ΔG_u 에서의 이러한 차이와 명백한 변화가 완전히 풀린 상태로부터의 CD 신호를 측정할 수 없는 것에서 유래한 것인지를 시험하기 위해, 상기 데이터를 구아니딘의 더 높은 농도에서 플라토 (plateau) CD 값까지 외삽한 시뮬레이션을 수행하였다; ΔG_u 및 m 의 기본적으로 동일한 견적값을 얻었다. 대표적인 데이터가 도 7에 도시되어 있다. 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 유사체의 원자외선 원편광 이색성 (CD) 스펙트럼은 부모 유사체 DKP-인슐린의 것과 유사하다.

KP-인슐린의 기준선 열역학 안정성은, 25℃에서 변성의 두 개 상태 모델로부터 유추되듯이, 3.0 ± 0.1 kcal/mole 이다. CD-검출된 구아니딘 변성 연구에 따르면, 2F-Phe^B24 치환은 KP-인슐린 (△△G_U 1.1 ± 0.2 kcal/mole)의 맥락에서 및 DKP-인슐린 (△△G_U 0.60 ± 0.2 kcal/mole)의 맥락에서 열역학적 안정성에서의 이득과 연관된다고 나타난다. 또한, 2F-Phe^B24-DKP-인슐린의 물리적 안정성은 배양시 세 겹으로 평가할 때, KP-인슐린의 것 보다 월등히 더 크다는 것이 밝혀졌다; 상기 단백질들은 인산염 완충식염수 (PBS) 내 pH 7.4에서 300 μM로 30℃에서 부드럽게 진탕하면서 만들었다. 상기 샘플을 20일간 또는 유리 바이알의 침전 징후 또는 서리가 낄 때까지 관찰하였다. 결과를 도 8에 나타낸다 (표 4 참조).

상대적인 수용체-결합 활성은, ¹²⁵I-인간 인슐린을 사용한 경쟁적 대체법으로 측정하는 바와 같이, 유사체 대 야생형 인간 인슐린의 호르몬-수용체 해리 상수의 비율로서 정의된다. AU5 IgG (인산염 완충액 내의 40 mg/ml 농도의 100 μl/웰)을 함유한 마이크로타이터 스트립 플레이트(Nunc Maxisorb)를 4℃에서 밤새 배양하였다. 결합 데이터를 두 개 부위 연속 모델로 분석하였다. 데이터를 비특이성 결합에 대하여 교정하였다 (1 μM 인간 인슐린의 존재화 연계된 잔류 막 방사활성의 양). 모든 분석법에서, 경쟁 리간드 부재하에서 결합된 추적자의 백분율을 15% 미만이어서 리간드 결핍 오류를 피하였다. 대표적인 데이터를 도 4에 제공한다.

생체 내에서 KP-인슐린 또는 야생형 인간 인슐린에 비하여 DKP-인슐린 유사체들, DDP-인슐린 유사체들, 및 DPO 인슐린 유사체들이나 2F-Phe^B24 유도체의 저혈당능을 평가하기 위해, 암컷 루이스 래트 (평균 체중 ~300 그람)들을 스트렙토조토신으로 처리하여 당뇨병으로 만들었다 ((i) 야생형 인슐린, KP-인슐린, 및 Asp^B28-인슐린이 혈당 농도의 효과의 유사 패턴을 나타내고 및 (ii) 이러한 패턴들이 인슐린 6량체들의 조립을 확실히 하기에 충분한 화학양론으로 제형에 아연이 존재하는 것 또는 부재하는 것에 의해 영향을 받지 않음에 따라, 이러한 모델은 약물동력학의 능의 탐침자를 제공하나 약물동력학의 촉진 정도를 제공하지 않는다). 야생형 인간 인슐린, 인슐린 유사체, 또는 완충액 만 (Eli Lilly and Co의 무단백질 멸균 희석액; 16 mg 글리세린, 1.6 mg 메타-크레졸, 0.65 mg 페놀, 및 3.8 mg 인산 소듐염로 구성, pH 7.4.) 을 포함하는 단백질 용액을 피하 주사하고, 혈당의 변화 결과를 임상 혈당측정기(Hypoguard Advance Micro-Draw meter)를 사용하여 연속측정함으로써 관찰하였다. 제형의 균일성을 확고히 하기 위해, 인슐린 유사체들을 각각 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (rp-HPLC)로 다시 정제하고, 분말로 건조시키고, 동일한 최대 단백질 농도 (300 μg/mL)에서 희석액에 용해하고, 및 분석적 C4 rp-HPLC로 다시 정량하였다; 희석물은 상기 완충액을 사용하여 만들었다. 300 g 래트 당 20 μg 인슐린이 포함된 100 μl 완충액을 시간 t = 0에서 피하 주사하였다. 이러한 투여량은 67 μg/kg 체중에 상응하고, 이는 국제 단위 (IU)로 2 IU/kg 체중에 상응한다. KP-인슐린의 용량-반응 연구에 따르면, 이러한 투여량에서, 주사후 처음 한 시간 동안 거의 최대 속도의 글루코즈 처리가 완수되었다. 다섯마리 래트를 2F-Phe^B24-DKP-인슐린, 2F-Phe^B24-DDP-인슐린, 또는 2F-Phe^B24-DPO이 주사되는 군으로 연구되었고, 다른 다섯 마리 래트를 KP-인슐린 또는 야생형 인간 인슐린을 주사하는 대조군으로 연구되었고; 이러한 래트들은 30 마리 당뇨 래트 군으로부터 무작위적으로 선택되었다. 두 개 군이 실험 시작 시 유사한 평균 혈당 농도를 보였다. 혈액을 꼬리의 클립된 끝에서부터 시간 0 및 매 10분마다 90 분까지 얻었다; 특정 연구에서, 상기 시간 기간을 180 분 또는 240 분으로 연장하였다. 혈당 농도를 감소시키는 인슐린 작용의 효능을 시간에 따른 농도 변화 (최소-평균 자승 및 선형적 하강의 초기 부위를 사용하여)를 주사된 인슐린의 농도로 나눠서 계산사였다. 이러한 데이터는 따라서 2F-Phe^B24-DKP-인슐린의 생물학적 능력은 6량체 제형의 KP-인슐린의 것과 동등하다는 것을 제시한다; 다른 2F-Phe^B24 인슐린 유사체들은 상기 래트 모델에서 시험하지 않았다.

인간에서 약리학적 특성을 예측하는, 동물 모델에서의 인슐린 유사체의 PK, PD, 및 능력을 산정하기 위해, Asp^B10-함유 인간 인슐린 유사체들의 2F-Phe^B24 유사체들을 어린 요크셔 농장 돼지 (체중 35-45 kg)에서 조사하였다. 연구 당일에, 각 동물들을 Telazol로 마취유도하고 이소플루란으로 전신마취하였다. 각 동물들을 기관내 삽관하고, 산소 포화 및 호기말 CO₂을 연속적으로 모니터링하였다. 비록 상기 동물들이 당뇨성이 아니지만, 췌도 기능은 클램프 연구 약 30분 전에 및 그 후 2 시간마다 옥트레오타이드 아세테이트 (44 mg/kg)의 피하 주사에서 또는 그에 의해 억제되었다. IV 카테터들을 넣고 기준선 유글리세미아를 10% 덱스트로스 주입으로 설정한 후, 상기 카테터를 통해 인슐린을 피하 주사하였다. 말초 인슐린-매개 글루코즈 섭취량을 정량하기 위해, 다양한 글루코즈 관입율을 사용하여 약 85 mg/dl의 혈당 농도를 유지하였다. 이러한 글루코즈 주입은, 예를 들어, Humulin^® 글루코즈 주입율의 대조군 연구에서, 전형적으로 프레-인슐린 기준선 값으로 되돌아 가는 것이 관찰될 때까지, 5-6 시간이 요구된다. 글루코즈 농도는 10 분 마다 Hemocue 201 휴대용 당 분석기를 사용하여 측정하였다 (표준 오차 1.9%).

글루코즈 클램핑에 대한 전산화된 방법은 개시되어 있다 (Matthews, D. R., and Hosker, J. P. (1989) Diabetes Care 12, 156-159). 상세하게, 인슐린 분석용 2-ml 혈액 샘플을 하기 계획이 따라 수득하였다: 인슐린 전달 후 0 - 40 분: 5-분 간격; 50 - 140 분: 10-분 간격, 및160 분부터 GIR이 기준선으로 되돌아 올때까지: 20-분 간격. PK/PD의 경우, 20-분 이동 평균 곡선 맞춤 및 필터를 적용한다. PD를 반 최대 효과까지의 시간 (초기), 반 최대 효과까지의 시간 (후기), 최대 효과까지의 시간, 및 기준선 위의 곡선하 면적 (AUC)으로서 측정하였다. 이러한 분석 각각의 경우, 원 데이터가 아닌 맞춤된 곡선을 후속 분석에 사용하였다. 세 마리 돼지 각각은 두 가지 연구에 사용되었다: 하나는 Chlorolog를 사용한 것이고, 다른 하나는 동일한 투여량 (0.5 최대 투여량)에서 U-500 비교체 Humulin^® R U-500 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN) 및 U-100 비교체 Humalog^® 및 대조군 Humulin^® (Lilly Laboratories, Indianapolis, IN)을 사용한 것이다. 결과에 따르며, 2F-PheB²⁴-DKP-인슐린 및 2F-PheB²⁴-DDP-인슐린은 U-400 강도 (2.4 mM; 2F-PheB²⁴-DKP-인슐린) 또는 U-500 강도 (3.0 mM; 2F-PheB²⁴-DDP-인슐린)로 농축시 속효성 PD를 유지한다고 나타난다. PD 매개변수들이 표 1, 및 도식형태도 도 9에 요약되어 있다.

마취된 요크셔 돼지^a에서 2F-Phe^B24 유사체의 PD 연구

단백질	강도	첨가제	(1/2)Tmax (초기)	Tmax	(1/2)Tmax (후기)
A. Humulin^® R U-500의 대조군 연구 (돼지 1-4)^b
야생형	U-500	없음	122 분	240 분	357 분
야생형	U-500	없음	77 분	180 분	342 분
야생형	U-500	없음	100 분	180 분	342 분
야생형	U-500	없음	95 분	200 분	217 분
B. 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (돼지 5)^C의 연구
KP-인슐린	U-100	없음^d	61 분	120 분	193 분
2F-DKP-ins	U-100	없음	62 분	130 분	186 분
KP-인슐린	U-400	EDTA^e	105 분	190 분	274 분
2F-DKP-ins	U-400	EDTA^f	28 분	140 분	228 분
C. 2F-Phe^B24-DDP-인슐린 (돼지 6)^g의 연구
KP-인슐린	U-100	없음^d	36 분	100 분	160 분
2F-DDP-ins	U-100	EDTA^h	33 분	100 분	172 분
D. 2F-Phe^B24-DDP-인슐린 (돼지 7)^g의 연구
야생형	U-500b	없음	95 분	200 분	271 분
2F-DDP-ins	U-500	EGTAⁱ	76 분	180 분	280 분

^aPD,약물역학. 주요 결과는 볼드체로 나타냄. ^b네 마리 상이한 돼지를 제작사가 제형한 바와 같이 Lilly U-500의 대조군 연구에 사용하였다 (부분 A). 다음, 이러한 동물들은 2F-Phe^B24 유사체의 연구에 사용한 것과 상이하였다; 그럼에도 불구하고 다양한 돼지들은 나이와 체중이 유사하였다. ^c2F-Phe^B24-DKP-인슐린 (2F-DKP-ins로 약칭)의 세 개 시도를 단일 돼지에서 수행하였다. ^dKP-인슐린을 제조사가 제형한 바와 같이 사용하였다 (Humalog^®; Eli Lilly and Co.). ^eEDTA를 Lilly U-100 Humalog^® 제품에서 사용된 제형 완충에 5 mM 농도까지 첨가하였다. ^g이러한 유사체는 2F-DDP-ins로 약칭되었다. ^hEDTA를 5 mM의 농도까지 무아연 제형에 첨가하였는 데 여기서 인산염 완충액은 THAM 안충액 (2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-l,3-디올)으로 교체되었다; 상기 제형은 별다르지 않는 한 Lilly 희석물과 유사하였다.

미개질 인간 인슐린 상에서의 Asp^B10 치환 (Asp^B10-인슐린)은 스프라그-돌리 래트에서 과도한 유선 종양 형성과 연계되어, 야생형 인슐린에 비하여 향상된 유사분열촉진성을 나타내는 것으로 관찰되기 때문에 (Oleksiewicz, M.B., Bonnesen, C, Hegelund, A.C., Lundby, A., Holm, G.M., Jensen, M.B., & Krabbe, J.S. (2011) Comparison of intracellular signalling by insulin and the hypermitogenic Asp^B10 analogue in MCF-7 breast adenocarcinoma cells. J. Appl. Toxicol. 31, 329-41 및 그 속에서의 참조문헌), 발명자들은 내재적 IGF 수용체들이 결핍된 마우스 배아 섬유아세포에서 타입 I IGF 수용체 (IGF-IR)의 호르몬-자극 자가인산화에 대하여 포유동물 세포-기반 연구를 착수하였고, 및 안정적 형질전환하여 인간 IGF-IR를 발현하였다; 결과를 도 5에 나타낸다. 세포를 75% 콘플루언시로 배양하고, 밤새 혈청없이 배양한 후, 10 nM 호르몬 (야생형 인슐린, IGF-I, Asp^B10-인슐린, Asp^B10-Orn^B29-인슐린, DKP-인슐린, 2F-Phe^B24-DKP-인슐린, 또는 2F-Phe^B24-DPO-인슐린)으로 처리하였다. 각 경우에 세포 용해물을 준비하고, 항-포스포-IGF-IR ELISA를 제작자에 의해 설명된 바와 같이 사용하여 인산화된 IGF-I 수용체에 대하여 분석하였다 (Cell Signaling Technologies, Inc.). 실험은 삼중으로 실시되었다. 결과에 따르면, Asp^B10-인슐린은 인간 인슐린에 비해 더 심대한 자가인산화를 나타내는 반면, 2F-Phe^B24 개질은 자가인산화 수준을 야생형 인간 인슐린의 것과 구별할 수 없을 정도로 회복시켰다는 것이 나타난다. 또한, 호르몬과 유사체 세트를 개시된 바와 같이, 인간 유방암 세포주 MCF-7의 증식을 자극하는 능력에 대하여 시험하였다 (Milazzo G, Sciacca L, Papa V, Goldfine ID, Vigneri R. (1997) Asp^B10-insulin induction of increased mitogenic responses and phenotypic changes in human breast epithelial cells: evidence for enhanced interactions with the insulin-like growth factor-I receptor. Mol. Carcinog. 18, 19-25). 상기 암세포들은, 1 주간 배양 후, 연질 아가에서 (종양발생적 잠재성을 반영) 10 nM 리간드 존재하에 콜로니 형성에 대하여 분석하였다; 결과를 도 6에 도시한다. Asp^B10-인슐린은 야생형 인간 인슐린보다 더 많이 성장을 자극하는 반면, 2F-Phe^B24 개질을 추가하게 되면 유사분열촉진성을 야생형 인간 인슐린의 것과 구별되지 않는 정도로 낮춘다.

2F-Phe^B24 개질의 구조적 수용에 대하여 2F-Phe^B24-DKP-인슐린의 2D-NMR 연구를 통해 단량체성 맥락에서 분석하였다. ¹H-NMR 화학 전이 및 핵 오버하우저 효과 (NOE)의 천연형 패턴을 관찰하였다; 거리-지형 및 의태 어닐링에 기초한 분자 모델들은 DKP-인슐린의2D-NMR 연구에서 얻어진 것과 유사하였다. 추가 구조연구를 단일-결정 X-선 결정학으로 실시하였다. 아연 KP-인슐린 6량체에 근거한 결정을 개시된 바와 같이 성장시켰다 (Liu, M., Wan, Z., Chu, Y.C., Aladdin, H., Klaproth, B., Choguette, M., Hua, Q.X., Mackin, R., Rao, J.S., De Meyts, P., Katsoyannis, P.G., Arvan, P. & Weiss, M.A. (2009) The crystal structure of a "nonfoldable" insulin: impaired folding efficiency despite native activity. J. Biol. Chem. 284, 35259-35272). 상세하게, Tris-HCl 완충액 내 Zn²⁺ 대 단백질 단량체의 1:2.5 비율 및 페놀 대 단백질 단량체의 3.7: 1 비율에서 현적 (hanging-drop) 증기 확산법에 의해 결정을 성장시켰다. 현적의 방울은 1 μl 저장 (reservoir) 용액 (0.02 M Tris-HCl, 0.05 M 소듐 시트레이트, 5% 아세톤, 0.03% 페놀, 및 0.01% 아연 아세테이트 pH 8.1)과 혼합된 1 μl 단백질 용액 (10 mg/ml, 0.02 M HC1 내)으로 구성되었다. 각 방울을 1 ml 저장 용액에 현탁하였다. 결정 (공간군 R3)을 이 주간 후에 실온에서 수득하였다. 데이터를 레이온 루프에 적재하고 100 K까지 순간 냉각한 단일 결정들로부터 수집하였다. Argonne National Laboratory, Chicago에 있는 Advanced Photon Source (APS)에서의 싱크로트론 방사선 가동시 24.98-2.50 Å 으로부터의 반사들을 CCD 디코더 상에 측정하였다. 데이터를 프로그램 HKL2000으로 가공하였다 (Z. Otwinowski and W. Minor (1997) Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode ", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography [C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds.], Academic Press (New York), part A, pp. 307-26.). 결정은 단일 세포 매개 변수를 나타냈다: a=b=77.98 Å c=37.14 Å, α=β=90°, γ=120°. CNS를 사용하는 분자 대체법으로 구조를 결정하였다. 따라서, 천연 TR 이량체를 사용하여 모델을 얻었다 (모든 물분자, 아연 및 염화물 이온 제거후 단백질 데이터뱅크 (PDB) 식별자 1LPH). 15.0 및 4.0 Å 해상도 사이의 데이터 분석후 회전 기능에 대한 최고 해법으로부터의 좌표를 사용하여 번역-기능을 탐색하였다. 전체적 이방성 온도 인자 및 벌크-용매 교정을 사용하면서, CNS를 이용한 강체 (rigid-body) 리파인먼트함으로써, 25.0 및 3.0 Å사이의 데이터의 경우, R 및 R_free 에 대하여 각각 0.29 및 0.33 값을 각각 산출하였다. 리파인먼트 주기 사이에, 2F₀-F_C 및 F₀-F_C 지도들을 데이터를 사용하여 2.50 Å 해상도까지 계산하였다; 아연과 염화물 이온 및 페놀 분자들을 프로그램 O를 사용하여 구조로 건축하였다. 지형은 PROCHECK를 사용하여 지속적으로 모니터하였다; 아연이온 및 물분자는 개량되는 것이 진행됨에 따라 차분 지도 (difference map)로 건축되었다. 생략지도 (omit map)의 계산 (특히 각 단량체의 B 사슬 N 말단의 첫 8 개 잔기에서) 및 추가 개량이 CNS를 사용하여 수행되었고, 이는 최대 공산 비틀림각(maximum-likelihood torsion-angle) 역학 및 접합체-구배 개량을 실시하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 상기 구조들은 부모 유사체의 것과 유사하다. 방향족 고리의 위치가 야생형 인슐린에서 비개질 잔기의 것과 유사한 반면, T 및 Rf-상태 원량체는 도 11에 나타난 전자밀도 지도에서 보여지는 바와 같이 독특한 배열을 나타낸다. 각 경우, 개별 인슐린 원량체에 대하여 2F-Phe^B24 방향족 고리를 배향시키면 천연형 외부 이량화 계면을 나타낸다. 이론에 관계없이, T-유형 배향이 단량체성 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 유사체의 2D-NMR 연구에서 또한 관찰되었고 및 유리한 정전기 상호작용을 축적하기 쉽게 하여, 2F-Phe^B24 인슐린 유사체들의 증가된 열역학적 안정화에 기여하였다. 이러한 배열에서, 전기음성적 플루오로 치환체는 두 개 아미드 질소의 부분 양전하 근처에 있다 (Phe^B25 및 Tyr^B26의 주-사슬 펩타이드 NH 분체).

2F-Phe^B24 개질과 이량화와의 양립성을 시험하기 위해 (2F-Phe^B24-DPO-인슐린, 및 잔기 B28 및 B29가 이량화를 손상시키지 않는 관련 유사체에 타당한 바와 같이), 2F-Phe^B24 개질을 여느 때 같으면 6량체를 형성할 수 있는 모체 (framework)으로 도입하여 코발트-매개 (Co²⁺) 6량체 조립의 분광학적 분석 및 6량체 분해체의 동력학 분석을 할 수 있게 하였다. 인슐린 유사체 6량체들의 동력한 안정성을 25℃에서 Co²⁺ 복합체로서 야생형 인간 인슐린 6량체의 것과 대비하여, 6량체 당 2.2 개 코발트 이온 및 50 mM 페놀을 함유한 10 Tris-HCl (pH 7.4)로 구성된 완충액에서 평가하였다. Beals 등의 방법을 개질한 분석법 (Birnbaum, D.T., Kilcomons, M.A., DeFelippis, M.R., & Beals, J.M. Assembly and dissociation of human insulin and Lys^B28, Pro^B29-insulin hexamers: a comparison study. Pharm Res. 14, 25-36 (1997))은 500-700 nm에서의 흡광도를 사용하여 사면체 코발트 이온 좌표에 특징적인 R₆-6량체-특이성 d-d 전이를 모니터하였다. 비록 평형상태의 용액이 코발트 인슐린 6량체 또는 코발트 인슐린 유사체 6량체를 주도적으로 함유하고 있지만, 이러한 평형은 인슐린 조립 및 분해의 상반 속도에 의해 특징지워진다. 이러한 분석을 개시하기 위해, 상기 용액을 에틸렌-디아민-테트라-아세트산 (EDTA)에 2 mM로 만들어 자유 코발트 이온을 격리하였다. EDTA 첨가에 기반한 R₆-특이적 흡수의 감퇴의 시간 과정으로 6량체 분해 속도의 추정치를 제공하게 된다. 야생형 인슐린은 419 ± 51 초의 시간 상수를 보이는 반면, KP-인슐린은, 가속된 약물동력학에 따라 114 ± 13 초의 시간 상수를 보였다. 놀랍게도, 2F-Phe^B24-DPO-인슐린의 기준선 흡수 스펙트럼은 야생형 인간 인슐린의 것과 유사하며, 이는 2F-Phe^B24 개질이 천연형 이량체 계면의 형성을 방지하지 않는 다는 것을 나타낸다.

2F-Phe^B24 개질의 구조적 수용을 2F-Phe^B24-DKP-인슐린의 2D-NMR 연구를 통해 단량체적 맥락에서 분석하였다. ¹H-NMR 화학 전이 및 핵 오버하우저 효과 (NOE)의 천연형 패턴을 관찰하였다; 거리-지형 및 의태 어닐링에 기초한 분자 모델들은 DKP-인슐린의2D-NMR 연구에서 얻어진 것과 유사하였다. 추가 구조연구를 단일-결정 X-선 결정학으로 실시하였다. 아연 KP-인슐린 6량체에 근거한 결정을 개시된 바와 같이 성장시켰다 (Liu, M., Wan, Z., Chu, Y.C., Aladdin, H., Klaproth, B., Choguette, M., Hua, Q.X., Mackin, R., Rao, J.S., De Meyts, P., Katsoyannis, P.G., Arvan, P. & Weiss, M.A. (2009) The crystal structure of a "nonfoldable" insulin: impaired folding efficiency despite native activity. J. Biol. Chem. 284, 35259-35272). 상기 구조들은 도 10에 나타난 바와 같이, 부모 유사체의 것과 유사하다. 특히, 2F-Phe^B24 방향족 고리가 개별 인슐린 원량체에 대하여 내부 배향된 것으로 인하여, 천연형 외부 이량체 계면이 생성된다. 이론에 관계없이, 이러한 내부 배향은 또한 단량체적 2F-Phe^B24-DKP-인슐린 유사체의 2D-NMR 연구에서 또한 관찰되었고, 및 유리한 정전기 상호작용을 축적하려고 하여, 2F-Phe^B24 인슐린 유사체들의 증가된 열역학적 안정화에 기여하였다.

해리 상수 (K_d)는 Whittaker 및 Whittaker (2005. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936)에 의해 설명된 바와 같이, ¹²⁵I-Tyr^A14-인슐린 (Novo-Nordisk에서 제공) 및 상기 정제된 및 용해된 인슐린 수용체 (이소폼 B 또는 A)를 부차 개질을 하면서 마이크로타이터 플레이트 항체 포획 분석법으로 사용하는 경쟁적 대체 분석법에 의해 결정되었다; 형질전환된 수용체들을 FLAG 에피토프 (DYKDDDDK)의 삼중 반복체로 C-말단에서 부착하고, 마이크로타이터 플레이트를 항-FLAG M2 모노클론 항체(Sigma)로 코팅하였다. 경쟁 리간드 부재 하에서 결합된 추적자의 백분율을 15% 미만이어서 리간드 결핍 오류를 피하였다. 결합 데이터 (도 5에 설명된)를 이종 경쟁 모델을 사용하는 비선형 회귀법 (Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111- 114)으로 분석하여 해리 상수들을 얻었다. 결과를 표 2 (KP-인슐린에 대비한 2F-Phe^B24 KP-인슐린 유사체) 및 표 3 (주형 DKP, DDP, 및 DPO; 표 3에 대한 각주 참조); 해리 상수들은 나노몰의 단위로 제공된다. (두 개 연구가 상이한 날 인슐린 수용체 (IR 이소폼 B; IR-B) 및 IGF 수용체 (IGF-IR)의 상이한 제조물을 사용하여 수행되었고 따라서 독립적으로 요약되었다). KP-인슐린의 2F-Phe^B24 개질은 IR-B 수용체-결합 친화도를 2 내지 3배 감소시킨다; 그러한 작은 감소는 일반적으로, 본 발명에서 당뇨 루이스 래트에서 증명되는 바와 같이, 생체 내 천연 또는 유사 천연 저혈당 능력과 연계된다. 2F-Phe^B24-KP-인슐린이 IGF-IR로 교차 결합되는 것에서 유의한 증가가 관찰되지 않았다. DKP-인슐린이 2F-Phe^B24 개질되면 IR-B 수용체-결합력이 2 배 이하로 감소된다; IGF-IR에 대한 증가된 교차 결합 성향이 통계적 유의 한계 근처에서 관찰되었다.

인슐린 유사체의 인슐린 수용체 및 IGF 수용체에 대한 결합

단백질	IR-B 결합	IGF-IR 결합
인슐린	0.063 ±0.014 nM	5.6 ±0.9 nM
KP-인슐린	0.062 ±0.011 nM	8.2 ±1.2 nM
2F-Phe^B24-KP-인슐린	0.472 ±0.011 nM	34.1 ±1.2 nM

IR-B, 인슐린 수용체의 B 이소폼; IGF-IR, 타입 1 IGF 수용체

인슐린 유사체들의 인슐린 수용체 및 IGF 수용체에 대한 결합

단백질	IR-B 결합	IGF-1R 결합
A. DKP 주형
인슐린*	0.063 ±0.014 nM	5.6 ±0.9 nM
DKP-인슐린	0.020 ±0.003 nM	1.8 ±0.3 nM
2F-Phe^B24-DKP-인슐린	0.131 ±0.020 nM	9.2 ±1.2 nM
B. DDP 주형
인슐린	0.059 ±0.010 nM	3.7 ±0.6 nM
KP-인슐린	0.064 ±0.009 nM	6.2 ±1.2 nM
2F-Phe^B24-DDP-인슐린	0.063 ±0.010 nM	4.8 ±0.8 nM
C. DPO 주형
인슐린	0.048 ±0.008 nM	3.1 ±0.5 nM
Asp^B10-Orn^B29-인슐린	0.020 ±0.014 nM	1.2 ±0.2 nM
2F-Phe^B24-DPO-인슐린	0.082 ±0.012 nM	4.0 ±0.6 nM

IR-B, 인슐린 수용체 B 이소폼. *, 표2에서 얻은 값.

위치 B29에서 비표준 아미노산 오르니틴을 함유하는 유사체의 결합력을 B24에서의 2F-Phe 치환이 있고 또한 없는 것 둘 다를 사용하여 유사하게 시험하였다. 결과를 인간 인슐린 수용체 이소폼 B (hIR-B), 및 인간 IGF 수용체 (hIGFR)에 대비한 해리상수로서 표 3에 제공한다. Orn^B29은 각 수용체에 대하여 야생형 인슐린와 유사한 결합력을 보이는 반면, Nle^B29 는 야생형 인슐린에 비해 hIR-B 및 IGFR에 대하여 저하된 친화도를 가진다. 2F-Phe^B24 와 조합하여 Orn^B29를 포함하는 유사체는, 그러나, 인슐린 수용체의 양 쪽 이소폼에 저하된 결합력을 가지고, 및 hIGFR 대하여 약간 증가된 친화도를 가진다. 2F-Phe^B24, Nle^B29 유사체는 hIGFR 대하여 Nle^B29 만의 유사체와 유사한 결합력을 가지지만, hIR-B에 대하여 저하된 결합력을 가진다.

인슐린 유사체의 열역학적 안정성

단백질	ΔGu (kcal/mole)	단백질	ΔGu (kcal/mole)
인슐린	3.6 ±0.1	2F-인슐린^b	ND
KP-인슐린	2.8 ±0.1	2F-KP-인슐린	3.6±0.1
DKP-인슐린	4.3±0.1	2F-DKP-인슐린	4.9 ±0.1
DDP-인슐린	ND^a	2F-DDP-인슐린	4.7 ±0.1
Orn^B29-인슐린	ND^a	2F-Orn^B29-인슐린	4.0 ±0.1
DPO-인슐린	ND^a	2F-DPO-인슐린	5.0 ±0.1

^a 언폴딩의 자유에너지(△G_u)는 두 개 상태의 적용에 근거하여 CD-검출된 구아니딘 변성으로부터 추정되었다. ND, 미정. ^b2F는 인슐린에서 개질 2F-Phe^B24을 지칭한다 (또한 오소-모노플루오로-Phe^B24로 명명됨). 유사체 약어: DDP, 치환 [Asp^B10, Asp^B28, Pro^B29]; DKP, 치환 [Asp^B10, Lys^B28, Pro^B29]; DPO, 치환 [Asp^B10, Orn^B29] 야생형 인슐린에서와 같이 B28 위치에서 Pro 보유; KP, 치환 [Lys^B28, Pro^B29]; 및 Orn, 오르니틴.

환자를 치료하는 방법은 2F-Phe^B24개질 또는 A 또는 B 사슬에서 당해분야에 공지된 또는 본 발명에서 설명된 바와 같은 추가 아미노산 치환을 함유하는 인슐린 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 일례에서, 2F-Phe^B24 치환된 인슐린 유사체는 DKP-인슐린의 맥락에서 위치 B24에서 2F-Phe를 함유하는 인슐린 유사체이다. 다른 예에서, 2F-Phe^B24는 위치 B29에서 비표준 개질 (오르니틴 또는 노르루이신)을 포함하는 Asp^B10-인간 인슐린 유사체내에서 치환된다. 비표준 아미노산 치환을 사용하여 비보호 옥타펩타이드를 사용하는 트립신-매개 반-합성법으로 인슐린 유사체를 신혹하고 효과적으로 제조하는 방법을 가능하게 하는 것이 본 발명의 다른 관점이다.

다른 예에서, 상기 인슐린 유사체를 외부 또는 이식성 인슐린 펌프에 의해 투여된다. 본 발명의 인슐린 유사체는 또한, 미국 특허 번호8,192,957에 개시된 바와 같이, B 사슬의 C-말단과 A 사슬의 N-말단 사이에 끈과 같은 다른 개질을 또한 포함할 수 있다.

약학 조성물을 그러한 인슐린 유사체를 포함하며, 조건적으로 아연을 포함할 수 있다. 아연 이온은 상기 인슐린 유사체의 6량체 당 2.2 내지 3.0 사이의 몰비의 수준에서 그러한 조성물에 포함될 수 있다. 그러한 제형에서, 상기 인슐린 유사체의 농도는 일반적으로 약 0.1 내지 약 3 mM 사이일 수 있다; 최대 3 mM까지의 농도를 인슐린 펌프의 저장소에 사용될 수 있다. 식사 시간 인슐린 유사체들의 개질물을 (a) Humulin^® (Eli Lilly and Co.), Humalog^® (Eli Lilly and Co.), Novalin^® (Novo-Nordisk), 및 Novalog^® (Novo-Nordisk)의 "정식" 제형 및 인간 사용에 현재 승인된 다른 속효성 인슐린 제형, (b) 상기 및 다른 인슐린 유사체들의 "NPH" 제형, 및 (c) 그러한 제형들의 혼합물에 대하여 설명된 바와 같이 제형화될 수 있다.

부형제는 글리세롤, 글리세린, 아르기닌, 트리스, 다른 완충액과 염, 및 페놀과 메타-크레졸과 같은 항미생물 보존제를 포함할 수 있다; 후자 보존제는 인슐린 6량체의 안정성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 그러한 약학적 조성물을 사용하여 당뇨 도는 다른 의학적 상태를 가진 환자에 상기 조성물의 생리적 유효량을 투여함으로써 상기 환자를 치효할 수 있다. 본 발명의 인슐린 유사체들은 아연 이온 부재 및 5-10 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 또는 에틸렌글리콜 테트라아세트산 (EGTA)의 존재하에서 제형화될 수 있다.

위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌을 가진 인슐린의 적어도 B 사슬을 암호화하는 서열을 포함하고 있는, 인슐린 유사체를 암호화하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 또한 제시된다. 이것은 위치 B24에서 종결 코돈 (앰버 코돈 TAG과 같은)을 억제자 tRNA (앰버 코돈 사용시 앰버 억제자) 및 상응하는 tRNA 신세타제와 연계하여 도입함으로써 이루어 질 수 있는 데, 상기 신세타제는 이전 개시된 바와 같이, 상기 종결 코돈에 반응하여 비표준 아미노산을 혼입시킨다 (Furter, 1998, Protein Sci. 7:419-426; Xie 등, 2005, Methods. 36: 227-238). 특정 서열은 핵산 서열이 도입될 종의 선호되는 코돈 용례에 의존할 수 있다. 상기 핵산은 또한 야생형 인슐린의 다른 변이를 암호화할 수 있다. 상기 핵산 서열은 폴리펩타이드 또는 개질된 프로인슐린 유사체 임의의 곳에서 비관련 치환 또는 연장을 포함하는 개질된 A- 또는 B-사슬 서열을 암호화할 수 있다. 상기 핵산은 또한 발현 벡터의 일부일 수 있고, 그 벡터는 E. coli 세포주와 같은 원핵 숙주 세포, 또는 S. 세레비지에 또는 피스키아 파스토리스 균주나 세포주와 같은 진핵 세포주와 같은 숙주 세포에 삽입될 수 있다.

예를 들어, 합성 유전자들을 합성하여 효모 피스키아 파스토리스 및 다른 미생물에서 B-사슬 폴리펩타이드의 발현을 주도할 수 있다. 오소-모노플루오로-페닐알라닌을 위치 B24에 혼입시키기 위해, 그 위치에서 종결 코돈을 이용하는 B-사슬 폴리펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 하기의 것 또는 이의 변이체 중 하나일 수 있다:

(a) 인간 코돈 우선권을 가짐:

TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGC GGGGAACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGACC (서열번호 18)

(b) 피키아 코돈 우선권을 가짐:

TTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTG GTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACT (서열번호 19)

유사하게, 인간 코돈 우선권을 가지며 위치 B24 에서 오소-모노플루오로 페닐알라닌을 혼입시키기 위히 그 위치에서 종결코돈을 이용하는 전장 프로인슐린 cDNA는 서열번호 20의 서열을 가질 수 있다.

TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (서열번호 20)

유사하게, 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌을 혼입시키기 위해 그 위치에서 종결 코돈을 이용하며 및 P. 파스토리스에 의해 선호되는 코돈들을 가지는 전장 인간 프로-인슐린 cDNA는 서열번호 21의 서열을 가질 수 있다.

TTTGTTAACC AACATTTGTG TGGTTCTCAT TTGGTTGAAG CTTTGTACTT GGTTTGTGGT GAAAGAGGTT AGTTTTACAC TCCAAAGACT AGAAGAGAAG CTGAAGATTT GCAAGTTGGT CAAGTTGAAT TGGGTGGTGG TCCAGGTGCT GGTTCTTTGC AACCATTGGC TTTGGAAGGT TCTTTGCAAA AGAGAGGTAT TGTTGAACAA TGTTGTACTT CTATTTGTTC TTTGTACCAA TTGGAAAACT ACTGTAACTA A (서열번호 21)

유전 코드에서 동의어가 주어지면, 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 이러한 서열의 다른 변이체들이 가능하다.

선행 개시내용에 기반하여, 제공된 인슐린 유사체들은 상기 설정된 목적을 수행할 것이 명백해진다. 즉, 이러한 인슐린 유사체들은, 넓은 범위의 단백질 농도 0.6-3.0 mM (야생형 인슐린 및 식후 인슐린 유사체들의 경우 통상적으로 강도 U-100 내지 U-500에 상응하는)하에서 제형될 때, 야생형 인슐린의 생물학적 활성의 적어도 일부를 유지하면서, 피하 데포로부터의 흡수 및 혈당 농도의 조절에서의 약리적 작용의 속도 향상을 나타낼 것이다. 또한, 이의 속효성 약동학적 및 약력학적 특성이 3.0 mM (U-500 강도) 정도로 높은 인슐린 유사체의 농도에서 유지되는 제형은 심각한 인슐린 저항성의 대면 상황에서, 당뇨의 안전하고 효과적인 치료에 개선된 유용성을 제공할 것이다. 따라서, 임의의 변형은 본 청구된 발명의 범위에 속하는 것임이 이해될 것이고, 따라서, 특정 성분 요소의 선택은 본 명세서에서 개시되고 설명된 발명의 사상으로부터 이탈되지 않고 결정될 수 있다.

하기 문헌은 본 명세서에서 설명된 실험과 분석법이 당해분야의 통상적 기술자에 의해 이해될 수 있는 것을 증명하기 위해 인용된 것이다.

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20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is N or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is Ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is D or P or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is K or P or A <400> 4 Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is Ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is D or E or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is Ornithine or Diaminobutyric acid or Diaminoproprionic acid or Norleucine or Aminobutric acid or Aminoproprionic acid <400> 5 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is Ortho-monofluoro-Phe <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <2l3> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is Ortho-monofluoro-Phe <400> 7 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <2l3> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is Ortho-monofluoro-Phe <400> 8 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is H or E <400> 9 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is T or H or E <400> 10 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is H or E <400> 11 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg 20 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is K <400> 12 Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is E <400> 13 Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISe_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is Norleucine or Ornithine or Diaminobutyric Acid or Diaminopropionic Acid <400> 14 Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> halogenated amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is ortho-monofluoro-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is D or E <400> 15 Gly 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sequence <400> 20 tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60 gaacgaggct agttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120 caggtggagc tgggcggcgg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180 tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240 ctggagaact actgcaacta g 261 <210> 21 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified proinsulin sequence <400> 21 tttgttaacc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60 gaaagaggtt agttttacac tccaaagact agaagagaag ctgaagattt gcaagttggt 120 caagttgaat tgggtggtgg tccaggtgct ggttctttgc aaccattggc tttggaaggt 180 tctttgcaaa agagaggtat tgttgaacaa tgttgtactt ctatttgttc tttgtaccaa 240 ttggaaaact actgtaacta a 261

Claims

인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B10에서, 아스파트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 측쇄를 포함하는 아미노산의 치환과 조합하여, 인간 인슐린의 서열에 관하여, 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환을 함유하는 변이성 인슐린 B-사슬 폴리펩타이드를 가지는 인슐린을 포함하는 약학적 제형으로서, 상기 인슐린은 0.6 mM 및 3.0 mM 사이의 농도에서 존재하는 약학적 제형.
제1항에 있어서, 상기 인슐린은 적어도 2 mM의 농도로 존재하는, 약학적 제형.
제2항에 있어서, 상기 변이성 B-사슬 폴리펩타이드는 또한 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B29에서 비표준 아미노산 치환을 함유하며, 상기 치환은 노르루이신, 아미노부티르산, 아미노프로피온산, 오르니틴, 디아미노부티르산, 및 디아미노프로피온산으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 제형.
제1항 내지 3항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 변이성 B 사슬은 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B28에서, 아스파트산, 프롤린 및 리신으로 구성되는 군으로부터 선택된 치환을 추가적으로 포함하는 약학적 제형.
제1항, 2항 또는 4항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 변이성 B 사슬은 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B29에서 치환을 포함하며, 상기 치환은 리신, 프롤린 및 알라닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 제형.
제1항 내지 5항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 변이성 B 사슬은 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B3에서 리신 치환을 포함하는, 약학적 제형.
제1항 내지 6항 중 임의의 한 항에 있어서, 위치 B28에서 리신 치환을 가지면서 위치 B29에서 프롤린 치환을 가지는, 또는 위치 B28에서 아스파트산 치환을 가지면서 위치 B29에서 프롤린 치환을 가지는 쌍의 치환체를 포함하는 것으로, 상기 치환 위치는 인간 인슐린의 서열을 기준한, 약학적 제형.
제1항 내지 7항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 인슐린은 포유동물 인슐린의 유사체인 약학적 제형.
제8항에 있어서, 상기 포유동물 인슐린은 인간 인슐린의 유사체인 약학적 제형.
제1항에 있어서, 서열번호 4-8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 A-사슬 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 약학적 제형.
제1항 내지 10항 중 임의의 한 항에 있어서, 위치 A8에서 글루탐산 치환을 포함하는 인슐린 A-사슬 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 약학적 제형.
제1항 내지 10항 중 임의의 한 항에 있어서, 위치 A8에서 히스티딘 치환을 포함하는 인슐린 A-사슬 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 약학적 제형.
인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염의 생리적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자의 혈당을 저하시키는 방법에 있어서, 상기 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염은 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌을 및 위치 B10에서 아스파트산 또는 글루탐산 치환을 혼입하고 있는 변이성 B-사슬 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염은 0.6 mM 내지 3.0 mM의 농도로 존재하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 인슐린 유사체 또는 이의 생리적 허용 염은 적어도 2 mM의 농도로 존재하는, 방법.
제13항 또는 14항에 있어서, 상기 변이성 B-사슬 폴리펩타이드는 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B29에서 비표준 아미노산 치환을 추가로 포함하고, 상기 치환은 노르루이신, 아미노부티르산, 아미노프로피온산, 오르니틴, 디아미노부티르산, 및 디아미노프로피온산으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
제13항 내지 15항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 변이성 B 사슬은 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B28에서 아스파트산, 프롤린 및 리신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 치환을 포함하는, 방법.
인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B10에서, 아스파트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 측쇄를 포함하는 아미노산의 치환 및 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B29에서, 오르니틴, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 노르루이신, 아미노부티르산, 및 아미노프로피온산으로 구성되는 군으로부터 선택된 비표준 아미노산의 치환과 조합하여, 인간 인슐린의 서열에 관하여, 위치 B24에서 오소-모노플루오로-페닐알라닌 치환을 함유하는 변이성 인슐린 B-사슬 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드.
제17항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 프로인슐린 유사체 또는 단일-사슬 인슐린 유사체인, 폴리펩타이드.
제17항 또는 18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B28에서, 아스파트산, 프롤린 및 리신으로 구성되는 군으로부터 선택된 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
제17항 내지 19항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 인간 인슐린의 서열에 대하여 위치 B3에서 리신 치환을 추가로 포함하는 폴리펩타이드.