KR20140107672A

KR20140107672A - 세포 회수 방법

Info

Publication number: KR20140107672A
Application number: KR1020147021626A
Authority: KR
Inventors: 사토시 다나카; 료 스에나가; 마사히로 쿠니노리; 쿄헤이 오타
Original assignee: 도요세이칸 그룹 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-09-04
Also published as: WO2013114859A1; EP3056560A1; US9574168B2; EP2811014B1; US20140335600A1; CN104093828B; EP2811014A1; EP2811014A4; EP3056560B1; CN104093828A

Abstract

새로운 세척용의 배양액 및 세척액을 사용하지 않고 세포의 회수 효율을 향상시킬 수 있다. 적어도, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 후의 세포를 회수하는 세포 회수 용기와, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기가, 도관에 의해서 연결되어 이루어진 세포 배양용 키트를 사용하여 배양된 세포의 회수 방법이며, 배양이 끝난 배양 상등액을 배양 용기에서 폐액 용기로 이송하는 상등액 배출 공정, 농축된 세포 현탁액을 배양 용기에서 세포 회수 용기로 이송하는 세포 회수 공정, 폐액 용기에 배출된 배양 상등액의 일부를 배양 용기로 되돌려서, 배양 용기에 잔존하는 세포를 세포 현탁액에 분산시키는 상등액 되돌리기 공정 및 잔존 세포가 분산된 세포 현탁액을 배양 용기에서 세포 회수 용기에 재 이송하는 재 회수 공정을 포함한 세포 회수 방법으로 한다.

Description

세포 회수 방법{CELL COLLECTION METHOD}

본 발명은 배양 용기를 사용해서 배양한 세포의 회수 방법에 관한 것이다. 특히 세포의 회수 효율을 향상시키기 위한 세포 회수 방법에 관한 것이다.

최근 의약품 생산, 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.

이러한 세포의 대량 배양에서는 일반적으로 배양 용기를 사용해서 세포를 배양하고 있다. 이 배양 용기를 사용한 세포 배양에서는 배양 후에 배양 용기에서 세포를 회수할 필요가 있다.

배양 세포(특히 부유계 세포)를 회수하는 경우, 기존에는 배양 용기에서 세포 현탁액을 전량 회수하여 원심 분리에 의해서 세포를 분리하는 방법이 행해졌다. 그러나 이 방법으로는, 세포를 대량 배양해서 세포 현탁액이 다량 있는 경우, 몇 번으로 나누어 원심 분리할 필요가 있으며, 시간과 노력이 소요된다는 문제점이 있었다.

한편 세포 회수 방법과 관련된 기술로서 예를 들면 특허 문헌 1에 기재된 세포 배양 방법에서 사용되고 있는 회수 방법을 들 수 있다. 이러한 회수 방법에서는 먼저 사용이 끝난 배지의 상등액을 배양 용기에서 배출한 후에, 배양 세포를 포함한 세포 현탁액을 회수했으며 이에 따라 농축된 세포 현탁액을 얻을 수 있다.

(특허 문헌 1) 국제 공개 2007/052716호 팜플렛

그러나 이 방법에서는, 배양 용기 내에 잔류하여 회수할 수 없는 세포가 비교적 많이 생겨나고 회수 효율이 충분하다고는 할 수 없다는 문제가 있었다.

즉, 이 회수 방법에 따르면 농축된 세포 현탁액을 회수할 수 있지만 세포 현탁액을 회수해도, 배양 용기 내의 벽면 등에 부착된 상태로 남아 버리는 세포가 존재한다. 또한, 배양 용기가 가요성 재료로 될 경우에는 세포 현탁액이 소량이 되면 배양 용기 내가 폐색되기 쉽고 비교적 다량의 세포 현탁액이 배양 용기에 남는 결과, 세포가 배양용기 내에 잔존해 버린다는 문제도 있었다.

이런 문제를 해결하기 위해서 세포 현탁액을 회수한 후, 배양 용기에 새로운 세척액(생리 식염수나 인산 완충액)을 넣고 섞어서, 배양 용기 내에 남아있는 세포를 세척액에 현탁시켜서 다시 회수하는 방법도 고려된다. 그러나 이렇게 세척액을 사용해서 배양 용기 내에 남아있는 세포를 회수하는 방법으로는 새로운 세척액이나 이것을 보존하기 위한 세척액 보존 용기가 필요하며, 비용이 더 든다는 문제가 있다.

본 발명은 상기의 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 배양 용기를 사용해서 배양한 세포를 회수할 때, 배양 용기의 폐색을 억제하고 새로운 세척용 배양액이나 세척 용액을 사용하지 않고 세포의 회수 효율을 향상시키는 것이 가능한 세포 회수 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 세포 회수 방법은 적어도, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 후의 세포를 회수하는 세포 회수 용기와, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기가, 도관에 의해서 연결되는 세포 배양용 키트를 사용하여 배양된 세포의 회수 방법이며, 배양이 끝난 배양 상등액을 배양 용기에서 폐액 용기에 이송하는 상등액 배출 공정, 농축된 세포 현탁액을 배양 용기에서 세포 회수 용기에 이송하는 세포 회수 공정, 폐액 용기에 배출된 배양 상등액의 일부를 배양 용기로 되돌려서, 배양 용기에 남아있는 세포를 세포 현탁액에 현탁시키는 상등액 되돌리기 공정 및 남아있는 세포가 현탁된 세포 현탁액을 배양 용기에서 세포 회수 용기에 다시 이송하는 재 회수 공정을 포함한 방법으로 되어 있다.

또한 본 발명의 세포 회수 방법은 적어도, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 후의 세포를 회수하는 세포 회수 용기와, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기가, 도관에 의해서 연결된 세포 배양용 키트를 사용하여 배양된 세포의 회수 방법이며, 배양이 끝난 배양 상등액을 배양 용기에서 폐액 용기에 이송하는 상등액 배출 공정, 배양 용기의 바닥 면적을 축소시켜서 농축된 세포 현탁액을 배양 용기의 세포 회수 포트 측에 끌어 모으는 축소 공정 및 모아진 세포 현탁액을 배양 용기에서 세포 회수 용기에 옮기는 축소 회수 공정을 포함하는 방법으로 되어 있다.

본 발명에 의하면, 배양 용기를 사용해서 배양한 세포를 회수할 때, 배양 용기의 폐색을 억제하고 새로운 세척용의 배양액 및 세척액을 사용하지 않고 세포의 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시 형태의 세포 회수 방법에서 사용되는 세포 배양용 키트를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 제1실시 형태의 세포 회수 방법에서 세척 회수 순서를 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 제2실시 형태의 세포 회수 방법에서 정치(가만히 놓아둠) 순서를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 제3실시 형태의 세포 회수 방법에서 축소 회수 순서를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 실시 형태의 세포 회수 방법에 의해 실험 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 세포 회수 방법의 바람직한 실시 형태에 대해서 도면을 참조하면서 설명한다. 먼저 도 1을 참조하여 본 실시 형태의 세포 회수 방법에 있어서 적절하게 사용할 수 있는 세포 배양용 키트에 대해서 설명한다. 이 세포 배양용 키트에는 배양 용기 (10), 배지 저장 용기 (20), 세포 주입 용기 (30), 세포 회수 용기 (40), 샘플링 용기 (50) 및 튜브 (60)가 갖춰져 있다. 또한, 배지 저장 용기 (20)는 폐액 용기로도 사용된다.

본 실시 형태의 세포 회수 방법은 이런 세포 배양용 키트를 사용해서 세포 배양을 한 후에, 세포 배양용 키트에서 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 세포를 회수하는 경우에 사용되는 방법이다.

또한, 본 실시 형태의 세포 회수 방법에서 사용되는 세포 배양용 키트는 이런 구성에 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 샘플링 용기 (50)를 제외한 것이나, 폐액 용기를 배지 저장 용기와는 별개로 갖춘 것, 배지 저장 용기 (20)를 다수 갖춘 것 등 적절히 변경한 것을 사용하는 것도 가능하다.

배양 용기 (10)는 배양 대상 세포와 배양액을 넣고, 세포를 대량 배양하기 위한 용기이다. 배양 용기 (10)는 가요성 소재를 재료로서, 주머니 모양(백형)으로 형성되어 있다.

이 배양 용기 (10)는 배양액이나 세포의 주입, 회수 등을 하기 위한 포트를 갖추고 있다. 포트의 수는 특히 한정되지 않지만, 1~3포트의 것이 매우 적합하게 사용된다. 도 1에는 1포트의 세포 배양용 키트가 도시되어 있으며 이 포트를 통해서 기타의 용기와 폐쇄계를 유지하면서, 배양액이나 세포 현탁액 등의 이송을 할 수 있게 되어 있다.

또한, 배양 대상 세포로서는 부유계 세포를 적절하게 사용할 수 있다. 배양액으로서는 일반적인 각종 배지를 사용할 수 있다.

배지 저장 용기 (20)는 세포를 배양하기 위한 배양액(배지)을 배양 용기 (10)로 이송하기 위해서 저장하는 용기이다. 배지 저장 용기 (20)는 배양 종료 후, 폐액 용기로서 사용할 수 있다. 즉, 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 세포를 회수하기에 앞서 배양액의 상등액을 폐액 용기로서의 배지 저장 용기 (20)로 이송함으로써 그 후 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)로 보낼 수 있다.

또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 배지 저장 용기 (20)를 2개 이상 갖출 수 있다. 이에 따라 동일한 배양액을 2배량 이상 저장 가능하며, 각각 다른 배양액을 저장함으로써, 배양 용기 (10)에 다양한 변화로 배양액을 공급할 수도 있다.

세포 주입 용기 (30)는 배양 개시시에 필요한 세포와 배양액이 들어있는 용기이다. 이 세포 주입 용기 (30)에서의 세포와 배양액을 배양 용기 (10)로 이송함으로써 세포 배양이 시작된다. 세포 주입 용기 (30)에는 최소한 1개의 포트가 갖추어져 있고 포트를 통해서 세포와 배양액이 이송된다.

세포 회수 용기 (40)는 배양 종료 후에 배양액의 일부와 배양된 세포가 포함되는 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 회수하기 위한 용기이다. 세포 회수 용기 (40)에는 최소한 1개의 포트가 갖추어 지고, 이 포트를 통해서 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 배양액의 일부와 배양된 세포가 포함되는 세포 현탁액이 이송된다.

샘플링 용기 (50)는 세포 배양 중이거나 배양 종료 후에, 배양 용기 (10)에서의 세포 현탁액의 일부를 이송해서 샘플링을 하기 위한 용기이다. 이 샘플링 용기 (50)로 이송하는 샘플로서의 세포 현탁액에는, 배양된 세포와 배양액이 포함된다. 샘플링 용기 (50)에는 배양 용기 (10)와 연결하는 도관(튜브)이 접속된 적어도 1개의 포트가 갖추어 지고 배양 용기 (10)에서 세포 현탁액이 샘플링 용기 (50)로 보내진다.

튜브 (60)는 세포 배양용 키트에서의 각 용기를 연결하는 도관이다.

다음에, 본 실시 형태의 세포 회수 방법이 이루어지는 세포 배양 장치의 구성에 대해서 도 2를 참조해서 설명한다. 이 도에는 세포 배양 장치가 모식적으로 도시되어 있다. 이 세포 배양 장치에 상기 세포 배양용 키트에서의 배양 용기 (10)가 배치되어 세포 배양이 진행된다. 세포 배양 장치는 도 2에 도시하는 바와 같이 배양 용기 (10), 적재대 (11), 고정 부재 (12), 교반 부재 (13), 칸막이 부재 (14) 및 튜브 (60)를 갖추고 있다.

적재대 (11)는 그 윗면에 배양 용기 (10)를 올려놓고 또한 그 배양 용기 (10)의 윗면에 교반 부재 (13)나 칸막이 부재 (14)가 배치된 평면의 베드(대)이다.

고정 부재 (12)는 배양 용기 (10)를 적재대 (11)에 고정하기 위한 부재이다. 도 2에서 고정 부재 (12)는 클램프로 도시하고 있지만, 배양 용기 (10)의 네 귀퉁이에 구멍을 형성하여 이를 통해서 고정하기 위한 핀 등의 고정 부재로서 구성할 수도 있다.

교반 부재 (13)는 배양 용기 (10)에 외력을 가함으로써, 배양 용기 (10)내의 세포 현탁액을 교반한다. 이에 따라 배양 용기 (10)의 세포를 세포 현탁액 내에 분산시켜서 세포 회수 용기 (40)로 이송되기 쉽게 할 수 있다. 또한, 배양 용기 (10)의 내면에 부착된 세포를 세포 현탁액에 분산시켜서 세포 회수 용기 (40)로 이송되기 쉽게 할 수 있다. 이 교반 부재 (13)에 의한 배양 용기 (10)내의 세포 현탁액의 교반은 세포 현탁액의 이송전 등 적절한 타이밍으로 하도록 할 수 있다.

이 교반 부재 (13)로는 예를 들면 롤러를 사용할 수 있다. 그리고 배양 용기 (10)의 상면을 교반 부재 (13)에 의해서 소정의 깊이까지 누르고, 또한 교반 부재 (13)를 적재대 (11)와 평행으로 이동시킴으로써 세포 현탁액을 교반할 수 있다.

또한, 도시하고 있지 않지만 교반 부재 (13)는 지지대 등에 의해서 배양 용기 (10) 위에 배치시킬 수 있다. 그리고 이 지지대를 구동 장치에 의해서 상하 방향과 수평 방향으로 이동시켜서 교반 부재 (13)에 의한 교반을 하는 것이 가능하다.

칸막이 부재 (14)는 배양 용기 (10)의 윗면과 아랫면이 밀착할 때까지 배양 용기 (10)의 끝에서 배양 용기 (10)를 누르고, 적재대 (11)에 대해서 수평 방향으로 이동함으로써, 배양 용기 (10)의 밑면적을 증감시킬 수 있는 부재이다.

배양 용기 (10)가 가요성 소재로 되었으므로 칸막이 부재 (14)에 의해서 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시키면 배양 용기 (10)내에서는 세포 현탁액이 위로 밀어올려져서, 배양 용기 (10)의 두께가 약간 증가한 상태가 된다.

후술하는 축소 공정에 있어서는 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시켜서 배양 용기 (10)내의 세포 현탁액의 액체 두께를 증가시킴으로써, 배양 용기 (10)에 폐색이 생기는 것을 방지할 수 있다. 이에 따라 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 회수되는 세포 현탁액이 증가하고 그 결과, 세포의 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

또한, 후술 하는 정치 공정에서는 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시켜서 배양 용기 (10)내의 세포 현탁액의 액체 두께를 증가시킨 상태로 해서 정치한 후에, 배양 용기 (10)내의 세포 현탁액의 배양 상등액을 폐액 용기에 이송할 수 있다.

이렇게 해서 배양 상등액을 폐액 용기로 이송을 하면 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시키지 않고 배양 상등액을 폐액 용기에 이송하는 경우에 비해서 상등액 배출 후의 배양 용기 (10)에 남는 세포 현탁액의 세포 농도를 높일 수 있다.

이는 배양 용기 (10)의 바닥 면적에 대한 상등액의 양을 늘릴 수 있고 배양 상등액의 배출량을 늘릴 수 있기 때문이다. 그 결과 세포 회수 용기 (40)에 회수되는 세포 현탁액의 세포 농도가 높아져서 회수하는 세포 현탁액량을 소량으로 할 수 있다.

이 칸막이 부재 (14)는, 교반 부재 (13)와 같이 롤러 등에 의해서 구성할 수 있다. 도 2에는 배양 용기 (10)를 2개의 롤러에 의해서 상하에서 끼워 넣는 칸막이 부재 (14)가 도시되어 있지만 이에 한정되는 것은 아니고, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소 가능한 것이면 된다. 또한, 칸막이 부재 (14)의 구동도, 교반 부재 (13)와 동일하게 실시할 수 있다.

튜브 (60)는 도 2에서 배양 용기 (10)와 세포 회수 용기 및 폐액 용기 등을 연결하고 있다. 이 도면의 예에서는 튜브 (60)는 A, B, C로 나눠져서 A는 세포 회수 용기에 연결되고 C는 폐액 용기에 연결되어 있다. 또한, B는 예를 들면 샘플링 용기에 연결하는 것으로서 이용할 수 있다.

<제1실시 형태>

다음에, 본 발명의 세포 회수 방법의 제1실시 형태에 대해서 도 2를 참조해서 설명한다. 본 명세서에서, 이하의 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 포함한 세포 회수 방법을 세척 회수라고 칭하는 경우가 있다.

(1) 상등액 배출 공정

우선, 배양 용기 (10)를 정지시키고 세포를 하부로 침강시킨 뒤, 세포 현탁액의 상등액을 배양 용기 (10)에서 폐액 용기로 이송시킨다.

이로써 배양 용기 (10)의 세포 현탁액을 농축할 수 있고, 세포의 농도를 높일 수 있다. 이 배양 상등액의 배출은 튜브 (60)에서의 튜브 펌프를 작동시켜서 실시할 수 있다. 또한, 아래에 설명하는 세포 현탁액의 이송이나 배양 상등액 되돌리기에 대해서도, 튜브 (60)에서의 튜브 펌프를 작동시킴으로써 할 수 있다.

(2) 세포 회수 공정

다음에, 배양 용기 (10)에서 세포 현탁액을 세포 회수 용기에 이송한다. 이 이송이 끝난 상태에서 배양 용기 (10)내에는 배양 세포가 포함되는 세포 현탁액이 일부 남아 있다.

(3) 상등액 되돌리기 공정

다음에, 폐액 용기에서 배양 용기 (10)에 배양 상등액을 일부 되돌려서, 배양 용기 (10)를 교반 부재 (13)에 의해서 교반한다. 이에 따라 배양 용기 (10)내의 벽면에 부착된 세포 등, 배양 용기 (10)내에 잔존한 세포를 세포 현탁액 내에 현탁시킬 수 있다. 교반은 필요에 따라 하면 된다.

(4) 재 회수 공정

다음에 잔존 세포가 현탁한 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기에 재차 이송한다. 이로써 본 실시 형태의 세포 회수 방법에 따르면 새로운 배양액이나 세척액을 사용하지 않고 세포 회수 공정에서 배양 용기 (10)에 잔존한 세포를 회수할 수 있으며 세포의 회수 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

또한, 상기 세포 회수 방법에 있어서, 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 2회 이상 반복하는 것이 바람직하다. 이와 같이 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 2회 이상 반복하면 그때마다 배양 용기 (10)에 잔존하고 있는 세포를 다시 회수할 수 있기 때문에 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

또한, 상기 세포 회수 방법에 있어서 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 동시에 실시하는 것도 바람직하다. 이와 같이 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 동시에 하면 배양 상등액을 흐르게 하면서 세포를 재 회수할 수 있고 배양 용기 (10)내에 잔존하고 있는 세포를 세포 회수 용기 (40)로 이송하기가 쉬울 수 있다. 이때, 배양 용기 (10)는 2포트 이상의 것을 적절히 사용할 수 있고, 튜브 (60)를 통해서 1개의 포트는 세포 회수 용기 (40)에 연결되어 다른 1개의 포트는 폐액 용기에 연결된다.

<제2실시 형태>

다음에, 본 발명의 세포 회수 방법의 제2실시 형태에 대해서 도 3을 참조하여 설명한다.

본 실시 형태의 세포 회수 방법은 다음과 같이 상등액 배출 공정을 실시하기 전에 정치 공정을 가지고 있다는 점에서 제1실시 형태와 다르다. 기타의 점에 대해서는 제1실시 형태와 같다.

(1) 정치 공정

제1실시 형태의 세포 회수 방법에서의 상등액 배출 공정을 실시하기 전에, 칸막이 부재 (14)를 사용해서, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킨다. 구체적으로는 칸막이 부재 (14)에 의해 배양 용기 (10)의 끝에서 앞면과 뒷면을 밀착시키면서 칸막이 부재 (14)를 배양 용기 (10)상에서 이동시킴으로써, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킬 수 있다. 그리고, 배양 용기 (10)를 정치시켜서 세포를 하부로 침강시킨다.

그 후 제1실시 형태에서 설명한 상등액 배출 공정, 세포 회수 공정, 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 실시한다. 또한 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 되풀이하는 것도 바람직하다.

이와 같이 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소하고 세척 회수를 실시함으로써 바닥 면적에 대한 상등액의 양을 늘릴 수 있고 배양 상등액의 배출량을 늘릴 수 있다. 그래서 세포 회수 공정에서 회수되는 세포 현탁액의 세포 농도를 높일 수 있고, 세포의 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

<제3실시 형태>

다음에, 본 발명의 세포 회수 방법의 제3실시 형태에 대해서 도 4를 참조해서 설명한다. 본 명세서에서, 이하의 축소 공정 및 축소 회수 공정을 포함한 세포 회수 방법을 축소 회수라고 칭하는 경우가 있다.

(1) 상등액 배출 공정

먼저 제1실시 형태와 같이 배양 용기 (10)를 정지시켜서 세포를 하부로 침강시킨 뒤, 세포 현탁액의 상등액을 배양 용기 (10)에서 폐액 용기에 이송시킨다.

(2) 축소 공정

다음에, 칸막이 부재 (14)를 이용해서, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킨다. 구체적으로는 칸막이 부재 (14)에 의해서 배양 용기 (10)의 끝에서 앞면과 뒷면을 밀착시키면서 칸막이 부재 (14)를 배양 용기 (10)상에서 이동시킴으로써, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킬 수 있다. 이로써 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서의 세포 회수 포트 근처 또는 세포 회수 포트 측으로 모을 수 있다.

(3) 축소 회수 공정

또한, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킨 상태에서 배양 용기 (10)에서 세포 현탁액을 세포 회수 용기 (40)로 이송한다. 이와 같이 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시킨 상태에서 세포 현탁액의 이송을 실시함으로써 세포 현탁액의 액량(액체 두께)의 저하로 인한 배양 용기 (10)의 폐색을 억제할 수 있다. 그래서 배양 용기 (10)내에 잔존하는 세포 현탁액을 줄일 수 있고, 세포의 회수 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

또한, 축소 공정 및 축소 회수 공정을 동시에 실시하는 것도 바람직하다. 즉, 칸막이 부재 (14)를 사용해서, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소시키면서, 배양 용기 (10)에서 세포 현탁액을 세포 회수 용기 (40)로 이송하는 것도 바람직하다. 이와 같이 축소 공정 및 축소 회수 공정을 동시에 실시함으로써, 배양 용기 (10)의 폐색을 억제할 수 있다.

또한, 상등액 배출 공정 후에 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)로 이송하는 세포 회수 공정을 실시하고, 이어서 축소 공정 및 축소 회수 공정을 실시하는 것도 바람직하다. 이로써 배양 용기 (10)의 폐색을 억제하여 세포를 회수할 수도 있다.

이와 같이, 본 실시 형태의 세포 회수 방법에 의하면, 배양 용기의 폐색을 억제하여 배양 용기 (10)에 잔존하는 세포 현탁액을 감소시킬 수 있어서 새로운 세척용의 배양액 및 세척 용액을 사용하지 않고 세포의 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

<제4실시 형태>

다음에, 본 발명의 세포 회수 방법의 제4실시 형태에 대해서 설명한다. 본 실시 형태의 세포 회수 방법은 다음과 같이 제3실시 형태에 제1실시 형태를 조합하여 축소 회수를 실시한 후, 세척 회수를 실시하는 점에서 제3실시 형태와 다르다. 기타의 점에 대해서는 제3실시 형태와 마찬가지이다.

즉, 본 실시 형태의 세포 회수 방법은 먼저 제3실시 형태의 상등액 배출 공정, 축소 공정 및 축소 회수 공정을 실시한 후, 이어서 제1실시 형태의 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 실시한다.

이로써 배양 용기의 폐색이 억제되어 배양 용기 (10)에 잔존하는 세포 현탁액을 감소시켜서 세포 회수 효율을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 배양 용기 (10)내를 세척하여 벽면에 부착된 세포를 세포 현탁액에 현탁시킴으로써 세포 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

따라서 본 실시 형태의 세포 회수 방법에 의하면 새로운 세척용 배양액 또는 세척 용액을 사용하지 않고 더욱 세포 회수 효율을 향상시킬 수 있게 된다.

또한, 본 실시 형태의 세포 회수 방법에 제2실시 형태를 조합하여, 정치 공정을 끝낸 후에 축소 회수를 실시하고, 이어서 세척 회수를 실시하는 구성으로 하면, 더욱 세포 회수 효율을 향상시킬 수 있다.

실시예

상기 실시 형태의 세포 회수 방법으로 세척 회수 및/또는 축소 회수하고 배양 용기에서 세포를 회수하는 경우와, 세척 회수 및/또는 축소 회수를 하지 않고 배양 용기에서 세포를 회수하는 경우를 비교해서 이들의 효과를 검증하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 이 실험은 22×66cm의 배양 용기를 사용하고 이에 2000mL의 배양액과 8.00E+09(8.00×10⁹)개의 세포를 봉입하여 실시하였다.

(비교예 1)

제1실시 형태의 세포 회수 방법에서의 상등액 배출 공정과 세포 회수 공정만을 하고 축소 회수 및 세척 회수를 하지 않고 배양 용기에서 세포를 회수하였다.

그 결과, 폐액 용기에 배출된 배양 상등액은 1600mL이며 이에 2.00E+08(2.00×10⁸)의 세포가 포함되어 있고 세포 수의 백분율은 2.5%였다. 세포 회수 용기에 회수된 세포 현탁액은 350mL이며 이에 6.83E+09(6.83×10⁹)의 세포가 포함되어 있고 그 세포 수의 백분율은 85.31%였다. 또한, 배양 용기에 잔존한 세포 현탁액은 50mL이며 이에 9.75E+08(9.75×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며 그 세포 수의 백분율은 12.19%였다.

(실시예 1)

제1실시 형태의 세포 회수 방법에서 상등액 배출 공정, 세포 회수 공정, 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 각각 1회 실시함으로써, 세척 회수를 1회 실시하고 배양 용기에서 세포를 회수하였다.

폐액 용기에 배출된 배양 상등액은 1550mL이며 이에 1.94E+08(1.94×10⁸)의 세포가 포함되어 있고, 그 세포 수의 백분율은 2.42%였다. 세포 회수 용기에 회수된 세포 현탁액은 400mL이며 이에 7.32E+09(7.32×10⁹)의 세포가 포함되어 있고, 그 세포 수의 백분율은 91.45%였다. 또한, 배양 용기에 잔존한 세포 현탁액은 50mL이며 이에 4.91E+08(4.91×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 6.13%였다.

(실시예 2)

제1실시 형태의 세포 회수 방법에서 상등액 배출 공정, 세포 회수 공정, 상등액 되돌리기 공정 및 재 회수 공정을 각각 1회 실시한 후에, 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 다시 한번 반복함으로써, 세척 회수를 2번 하여, 배양 용기에서 세포를 회수하였다.

폐액 용기에 배출된 배양 상등액은 1500mL이며 이에 1.88E+08(1.88×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 2.34%였다. 세포 회수 용기에 회수된 세포 현탁액은 450mL이며 이에 7.56E+09(7.56×10⁹)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 94.55%였다. 또한, 배양 용기에 잔존한 세포 현탁액은 50mL이며 이에 2.48E+08(2.48×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 3.11%였다.

(실시예 3)

제3실시 형태의 세포 회수 방법에서의 상등액 배출 공정, 축소 공정 및 축소 회수 공정을 각각 1회 실시함으로써 축소 회수하고, 배양 용기에서 세포를 회수하였다.

폐액 용기에 배출된 배양 상등액은 1600mL이며 이에 2.00E+08(2.00×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 2.5%였다. 세포 회수 용기에 회수된 세포 현탁액은 390mL이며 이에 7.61E+09(7.61×10⁹)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 95.06%였다. 또한, 배양 용기에 잔존한 세포 현탁액은 10mL이며 이에 1.95E+08(1.95×10⁸)의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 2.44%였다.

(실시예 4)

제1및 3실시 형태의 세포 회수 방법을 조합하여 상등액 배출 공정, 축소 공정 및 축소 회수 공정을 각각 1회 실시한 후, 상등액 되돌리기 공정과 재 회수 공정을 각각 1회 실시함으로써, 세척 회수를 1회 실시하여 배양 용기에서 세포를 회수하였다.

폐액 용기에 배출된 배양 상등액은 1590mL이며 이에 1.99E+08(1.99×10⁸⁾의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 2.48%였다. 세포 회수 용기에 회수된 세포 현탁액은 400mL이며 이에 7.70E+09(7.70×10⁹⁾의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 96.29%였다. 또한, 배양 용기에 잔존한 세포 현탁액은 10mL이며 이에 9.81E+07(9.81×10⁷⁾의 세포가 포함되어 있으며, 그 세포 수의 백분율은 1.23%였다.

비교예 1에서는, 배양 용기에 세포 현탁액이 50ml잔존하고 있었다. 이것은 액량이 적어져서 배양 용기가 폐색하여, 세포 현탁액을 세포 회수 용기에 더 이상 이송할 수 없게 되었기 때문이다.

실시예 1에서는, 배양 용기에 세포 현탁액이 50ml잔존한 뒤 폐액 용기에서 배양 상등액 50ml을 배양 용기로 되돌려서, 배양 용기를 교반하여 세척하고 세포 회수 용기에 다시 세포 현탁액 50ml을 회수했다. 그 결과, 배양 용기에는 세포 현탁액이 50ml잔존하고 있었다. 실시예 2에서는 실시예 1의 상등액 되돌리기와 재 회수를 다시 1회 반복하고, 세척 회수를 2번 하였다.

실시예 3에서는, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소해서 세포 현탁액을 회수하는 것으로, 배양 용기의 폐색이 억제되어 배양 용기에서의 세포 현탁액의 잔존량은 10ml로 감소하였다.

실시예 4에서는, 배양 용기 (10)의 밑면적을 축소해서 세포 현탁액을 회수한 후, 폐액 용기에서 배양 상등액 10ml을 배양 용기로 되돌려서, 배양 용기를 교반하여 세척하고 세포 회수 용기에 다시 세포 현탁액 10ml을 회수하였다. 그 결과, 배양 용기에는 세포 현탁액이 10ml잔존하였다.

세포 회수 용기에 회수된 세포의 수의 백분율은 비교예 1, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4순으로 85.31%, 91.45%, 94.55%, 95.06%, 96.29%였다.

또한, 폐액 용기에 배출된 세포 수의 백분율은 비교예 1, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4순으로 2.5%, 2.42%, 2.34%, 2.5%, 2.48%였다.

또한, 배양 용기에 잔존한 세포의 수의 백분율은 비교예 1, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4순으로 12.19%, 6.13%, 3.11%, 2.44%, 1.23%였다.

상기와 같이, 세척 회수를 1회만 한 실시예 1의 세포 회수 효율은 비교예 1에 비해 6%이상 증가하였다. 또한, 세척 회수를 2회 실시한 실시예 2의 세포 회수 효율은 비교예 1에 비해 9%이상 증가하고 있다.

또한, 축소 회수를 실시한 실시예 3의 세포 회수 효율은 비교예 1에 비해 10%가까이 증가했다. 또한, 축소 회수와 세척 회수를 1회 실시한 실시예 4의 세포 회수 효율은 비교예 1에 비해 11%가까이 증가하였다.

이상의 결과로부터, 본 실시 형태의 세포 회수 방법에서의 세척 회수를 실시함으로써 새로운 세척용 배양액 및 세척 용액을 사용하지 않고 세포의 회수 효율이 향상되고 있는 것을 알 수 있다. 또한, 본 실시 형태의 세포 회수 방법에서의 축소 회수를 실시함으로써 세포 회수 효율은 현저히 증가하고 있다. 따라서 본 실시 형태의 세포 회수 방법에서의 축소 회수에 따르면 배양 용기의 폐색을 억제하고 배양 용기 내에 잔존하는 세포 현탁액을 저감시킬 수 있어서 세포 회수 효율을 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명은 이상의 실시 형태에 한정되는 것은 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다는 것은 말할 필요도 없다.

예를 들면 도 2에서는 롤러형의 교반 부재를 사용하여 상등액 되돌리기 공정을 실시하고 있지만 적재대를 진탕하는 등 기타의 방법으로 배양 용기를 교반해도 되고, 또한 3회 이상 세척 회수하는 등 적절히 변경할 수 있다.

본 발명은 대량의 세포를 배양할 필요가 있는 바이오 의약이나 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 적절하게 이용할 수 있다.

Claims

적어도, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 후의 세포를 회수하는 세포 회수 용기와, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기가, 도관에 의해서 연결되어 이루어진 세포 배양용 키트를 사용하여 배양된 세포의 회수 방법이며,
배양이 종료된 배양 상등액을 상기 배양 용기에서 상기 폐액 용기로 이송하는 상등액 배출 공정,
농축된 세포 현탁액을 상기 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기로 이송하는 세포 회수 공정,
상기 폐액 용기에 배출된 배양 상등액의 일부를 상기 배양 용기로 되돌려서, 상기 배양 용기에 잔존하는 세포를 세포 현탁액에 현탁시키는 상등액 되돌리기 공정 및
잔존 세포가 현탁한 세포 현탁액을 상기 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기에 재 이송하는 재 회수 공정을 포함하는
것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제1항에 있어서, 상기 상등액 되돌리기 공정에서 소정의 현탁 부재를 사용하여, 상기 배양 용기의 표면이 소정의 깊이로 하강하는 위치까지 상기 배양 용기의 표면을 누르면서, 상기 현탁 부재를 상기 배양 용기상에서 수평 방향으로 왕복 이동시켜서 상기 배양 용기에 잔존하는 세포를 세포 현탁액에 분산시키는
것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상등액 되돌리기 공정에서의 상기 배양 용기에 잔존하는 세포의 세포 현탁액에서의 분산과 상기 재 회수 공정에서의 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기에 대한 세포 현탁액의 이송을 동시에 하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
적어도, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 후의 세포를 회수하는 세포 회수 용기와, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기가, 도관에 의해서 연결되어 이루어진 세포 배양용 키트를 사용하여 배양된 세포의 회수 방법이며,
배양이 끝난 배양상등액을 상기 배양 용기에서 상기 폐액 용기로 이송하는 상등액 배출 공정,
상기 배양 용기의 바닥 면적을 축소시키고 농축된 세포 현탁액을 상기 배양 용기의 세포 회수 포트 측에 모으는 축소 공정 및
모아진 세포 현탁액을 상기 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기에 이송하는 축소 회수 공정을 포함한
것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제4항에 있어서, 상기 축소 공정에서의 농축된 세포 현탁액의 모은 것과 상기 축소 회수 공정에서의 모아진 세포 현탁액의 상기 세포 회수 용기로의 이송을 동시에 하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 상등액 배출 공정 후에, 농축된 세포 현탁액을 상기 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기로 이송하는 세포 회수 공정을 하고 이어서 상기 축소 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 축소 회수 공정 후에,
상기 폐액 용기에 배출된 배양 상등액의 일부를 상기 배양 용기로 되돌려서, 상기 배양 용기에 잔존하는 세포를 세포 현탁액에 현탁시키는 상등액 되돌리기 공정 및
잔존 세포가 현탁한 세포 현탁액을 상기 배양 용기에서 상기 세포 회수 용기로 재 이송하는 재 회수 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 축소 공정에서 소정의 칸막이 부재를 사용하여, 상기 배양 용기를 배양 공간의 외부에서 앞면과 뒷면이 밀착하게 누르면서, 상기 칸막이 부재를 상기 배양 용기상에서 이동시켜서 상기 배양 용기의 바닥 면적을 축소시키는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제1항 내지 제3항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상등액 되돌리기 공정 및 상기 재 회수 공정을 2회 이상 반복하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기가 상기 폐액 용기로서 사용되는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상등액 배출 공정 전에, 상기 배양 용기의 바닥 면적을 축소시켜서 세포가 침강할 때까지 상기 배양 용기를 정치하는 정치 공정을 하는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제11항에 있어서, 상기 정치 공정에서 소정의 칸막이 부재를 사용하여, 상기 배양 용기를 끝부터 앞면과 뒷면이 밀착되게 누르면서, 상기 칸막이 부재를 상기 배양 용기 위에서 이동시키고 상기 배양 용기의 바닥 면적을 축소시키는 것을 특징으로 하는 세포 회수 방법.
제8항 또는 제12항에 있어서, 상기 소정의 칸막이 부재가 롤러임을 특징으로 하는 세포 회수 방법.