JP2000125848A

JP2000125848A - 細胞培養用具及び前記細胞培養用具を用いる簡易細胞培養方法

Info

Publication number: JP2000125848A
Application number: JP29668598A
Authority: JP
Inventors: Toyoko Fuda; 豊子附田; Yoko Fukuhara; 葉子福原
Original assignee: Japan Agriculture Forestry and Fisheries Ministry of
Current assignee: Japan Agriculture Forestry and Fisheries Ministry of
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2000-05-09

Abstract

(57)【要約】【課題】雑菌による汚染の心配がなく、しかも単純な
用具で労力とコストを節減して効率よく細胞を培養する
ことを目的とする。【解決手段】酸素及び二酸化炭素に対して透過性を有
し、かつ少なくともウイルス及び微生物に対しては透過
性を示さないポリオレフィンを融着接合してなる容器本
体に少なくとも二つの開口部（９）を設けた細胞培養バ
ッグ（１）と、該培養バッグ中の培養液の流通を阻止す
るための阻止部材（６，８）とからなる細胞培養用具。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、培養開始時の細胞
密度を適正に維持し、細胞を安定かつ効率的に増殖させ
るための細胞培養用具及び前記培養用具を用いる簡易細
胞培養方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞を培地中で培養する場合、細胞が増
殖するのに酸素が必要である。また、pHを約7.4にコン
トロールするために二酸化炭素が必要である。従って、
細胞培養を行なう場合、ディッシュまたはフラスコに細
胞と培地とを入れ、これを滅菌された空気／二酸化炭素
の混合ガス（一般には、二酸化炭素濃度５容量％）を導
入する炭酸ガス培養器内に置き、前記混合ガス雰囲気下
で培養するといった開放系による培養が一般的である。

【０００３】この開放系による培養では、ディッシュま
たはフラスコに気体が通過できるようなわずかな隙間を
つくり、その隙間から炭酸ガス培養器内の混合ガスをデ
ィッシュまたはフラスコ内に導き、培養液と接触させる
ことによって細胞培養に必要なガスの供給を行なってい
る。炭酸ガス培養器内の混合ガスは予め滅菌されている
ため、これを培養液と接触させても培養液を雑菌で汚染
することはない。しかしながら、炭酸ガス培養器の扉を
開けた時などに空気中の雑菌が培養器内に取り込まれ、
それが培養液と接触し、該培養液を汚染する危険性があ
る。

【０００４】この培養液の雑菌汚染を回避するため、塩
化ビニル樹脂または塩化ビニル共重合体とエチレン・n-
ブチルアクリレート・一酸化炭素共重合体とからなる通
気性を有するフィルムを融着接合して得られる培養バッ
グを用いる閉鎖系の培養が提案されている（特公平7-42
25）。該バッグは、酸素や二酸化炭素等のガスが流通可
能でかつ単位内容量当たりのガス透過面積を自在にコン
トロールできるため、バッグ内に培地と培養すべき細胞
とを導入して密閉した後、培養に必要なガス雰囲気下に
静置するだけで、培養途中に雑菌で汚染されることなく
細胞の培養が行なえるという利点を有する。

【０００５】一方、細胞培養においては、培養開始時の
細胞密度が低いと細胞の増殖が抑制されるため、細胞を
ある程度の規模で培養する場合、細胞密度が適正に維持
されるよう植え継ぎを繰り返しながら培養を行うのが一
般的である。研究レベルで必要となる細胞の量は、通
常、１〜10リットル培養程度である。ディッシュやフラ
スコ等を用いる開放系の培養で研究レベルに必要な細胞
を調製する場合には、植え継ぎのたびに新たなディッシ
ュやフラスコに培養細胞の一部を移さなければならず、
ピペッティング等の無菌操作も多数回必要であり、操作
が煩雑になるだけでなく雑菌汚染の可能性も高くなる。
また、形質転換細胞を培養する場合には、せっかく導入
した外来遺伝子がピペッティング等の細胞に対する負荷
によって漏出してしまうことがある。

【０００６】これに対し、培養バッグを用いる場合に
は、例えば、バッグ内で細胞がある程度増殖した時点で
スプリット操作によりバッグ内の細胞の半分を新たなバ
ッグへ移し換えることによって、培養開始時の細胞密度
を維持したり細胞密度の上昇による死細胞の増加を抑え
て培養の効率化を図ることができる（特開平7-4710
5）。このスプリット操作は、通常、接続チューブによ
って、細胞密度が所定値にまで達したバッグと培地が充
填された新たなバッグとを接続してなされている。これ
により、細胞密度が上昇したバッグからは細胞が新たな
バッグへ移動し、その逆に新たなバッグからは培地が旧
バッグへ移動して細胞密度の均等化が図られる。しか
も、均等化が終了した時点で接続チューブを適宜シール
して切断することにより、バッグ内部を再度密閉状態に
することが可能である。

【０００７】しかしながら、スプリット操作では細胞密
度が均等化するまでにある程度の時間がかかるものと予
想され、内容量の大きい培養バッグを用いるほどその時
間は長くなると考えられる。従って、内容量の比較的小
さいバッグを用いる方が効率的な培養を行うことができ
ると考えられる。そのため、培養の規模が大きくなるほ
ど一度に多数のバッグを扱わなければならず、それに伴
ってスプリット操作も多用され、開放系の培養ほどでは
ないとしても操作が煩雑になり、消費する培養器材の量
も増えるものと予想される。従って、バック培養の場合
には、バッグの内容量に依らずに培養を効率的に行え、
しかもスプリット操作が不要な方法がより望ましい。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、雑菌
による汚染の心配がなく、しかも単純な用具で細胞を効
率よく培養することを目的とするものである。即ち、本
発明は、バック培養において、細胞の増殖能に応じて培
養開始時の細胞密度を考慮した培養が行なえるよう、培
養液の流通を阻止してバッグを仕切るための阻止部材を
備えた培養用具を用いて細胞を培養するものである。

【０００９】本発明では、該阻止部材で培養バッグを仕
切ることにより培養バッグ内で実際に培養を行う領域を
段階的に拡張していくため、培養当初からその終了時ま
で同一の培養バッグ内で培養を続けて行うことが可能で
ある。そのため本発明では、培養途中に培養バッグを更
新する必要がなく、ピペッティングやスプリット等の操
作も不要である。また、培養操作が簡略化されるため、
従来の開放系の培養やスプリット操作を行うバック培養
に比べて培養に使用する消耗器材を大幅に減らすことが
でき、しかも研究レベルで必要となる細胞数や培養上清
液を容易に調製することが可能である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は以下の発
明を包含する。（１）酸素及び二酸化炭素に対して透過性を有し、かつ
少なくともウイルス及び微生物に対しては透過性を示さ
ないポリオレフィンを融着接合してなる容器本体に少な
くとも二つの開口部を設けた細胞培養バッグと、該培養
バッグ中の培養液の流通を阻止するための阻止部材とか
らなる細胞培養用具。（２）前記阻止部材を少なくとも２個有する（１）の細
胞培養用具。

【００１１】（３）前記阻止部材が脱着または開閉自在
である（１）または（２）の細胞培養用具。（４）前記阻止部材が、バッグをその両面より挟持しう
る部材である（１）〜（３）の細胞培養用具。（５）前記ポリオレフィンが、酸素及び二酸化炭素以外
のガスに対しては透過性を示さないものである（１）〜
（４）の細胞培養用具。

【００１２】（６）酸素及び二酸化炭素に対して透過性
を有し、かつ少なくともウイルス及び微生物に対しては
透過性を示さないポリオレフィンを融着接合してなる容
器本体に少なくとも二つの開口部を設けた細胞培養バッ
グ全体に培地を充填し、該培養バッグ中の培養液の流通
を阻止するための阻止部材を用いて培養領域を仕切り、
該阻止部材で仕切られた培養領域内で細胞を培養して増
殖させた後、該阻止部材を開放して培養領域を拡張し、
拡張した培養領域内でさらに細胞を増殖させることを含
む細胞培養方法。

【００１３】（７）前記培養領域を、培養すべき細胞の
増殖能に応じて細胞密度が適正に維持されるように仕切
る（６）の方法。（８）前記阻止部材を少なくとも２個使用し、培養領域
を仕切る工程と拡張する工程を２回以上繰り返す（６）
または（７）の方法。（９）前記阻止部材が脱着または開閉自在である（６）
〜（８）の方法。（10）前記阻止部材が、バッグをその両面より挟持しう
る部材である（６）〜（９）の方法。（11）前記ポリオレフィンが、酸素及び二酸化炭素以外
のガスに対しては透過性を示さないものである（６）〜
（10）の方法。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の細胞培養用具を説
明する。本発明の細胞培養用具は、細胞培養バッグと該
培養バッグ中の培養液の流通を阻止するための阻止部材
とからなる。図１に本発明の細胞培養用具の構成例を示
す。（１）は細胞培養バッグの一態様であり、（６）及
び（８）は阻止部材の一態様であるが、本発明の細胞培
養用具はこれらに限定されるものではない。

【００１５】本発明に用いる細胞培養バッグ（１）は、
酸素及び二酸化炭素に対して透過性を有し、かつ少なく
ともウイルス及び微生物に対しては透過性を示さないポ
リオレフィンを素材とする。例えば、ニプロ社より市販
されているカルチャーバッグ（ガスパーミアブルバッ
グ）等を使用することができる。該ポリオレフィンは酸
素及び二酸化炭素の分子構造に対して特異的に親和性を
有するものである。細胞培養バッグの酸素及び二酸化炭
素に対する透過性はこの親和性によるものであって、ポ
アサイズによる機械的な透過性ではない。従って、該バ
ッグは、親和性を示さない他のガスに対しては透過性を
示さない。また、該バッグは、雑菌汚染の原因となる微
生物やウイルスに対しても透過性を示さない。

【００１６】該バッグは、通常、ポリオレフィンをシー
ト状に成形し、該シートを２枚重ねて高周波融着または
熱融着などの融着接合によって袋状に成形して作製する
ことが可能である。シートの厚みは、ガス透過性と、培
地を充填した際にバッグが破裂することのないようにバ
ッグの強度とを考慮した厚みとするのが好ましく、通常
は、バッグの内容量に依らずに約0.1mmの厚みで充分な
性能が得られる。該バッグは融着接合されるため、完全
な密閉性を保持することが可能である。また、該バッグ
は光透過性であり、内部の細胞の状態を確認することが
可能である。

【００１７】本発明に使用する細胞培養バッグ（１）
は、細胞及び培地を導入するための開口部（９）を少な
くとも一つ有する。該開口部は培養細胞の回収や培養途
中のサンプリング等にも使用することができる。これと
は別に、空気抜き用としてさらに少なくとも一つの開口
部を設けるのが望ましい。該開口部は、バッグ本体と同
一の素材またはバッグ本体と融着接合可能な素材で構成
されたチューブ等を取り付けることによって設けること
ができ、バッグ本体へ融着接合して密閉性を保持するの
が望ましい。細胞培養時には、該開口部をピンチコッ
ク、クリップ、滅菌済みのキャップ等の適切な手段によ
って封鎖し、バッグ内部を密閉状態とする。

【００１８】本発明に使用する細胞培養バッグ（１）の
内容量は、最終的に得ようとする培養細胞の量に依存す
るが、通常約２リットルが好ましい。また、該バックに
は、阻止部材で仕切る際の目安となるよう目盛り（４）
を付けておくとよい。本発明の細胞培養用具は、培養バ
ッグ中の培養液の流通を阻止してバッグを仕切るための
阻止部材（６，８）を少なくとも２個有する。本明細書
中でいう「培養領域」とは、培養バッグ内で実際に培養
を行なう領域のことをいう。該阻止部材は、細胞培養開
始時の細胞密度を適正に維持するためのものである。通
常、培養開始時の細胞密度が低いと細胞の増殖は抑制さ
れる。内容量が数リットルの規模の培養バッグを用いる
場合には、培養開始時に細胞密度が極端に低下するなど
変動が大きくなるため、細胞の増殖に影響をきたす虞が
ある。これを避けるためには、培養開始時に細胞の増殖
能に応じた細胞密度が維持されるよう、培養に使用する
培地を適切な量に調整する手段が必要である。本発明の
阻止部材はこの手段に相当する。

【００１９】本発明の阻止部材は、培養液の流通を阻止
できるもの、即ち、培養バッグを仕切れるものであれば
どのようなものでもよいが、好ましくは、培養バッグを
均等な力で確実に仕切ることができるものである。該阻
止部材は、好ましくは脱着または開閉自在であり、培養
バッグをその両面から挟んで挟持しうるものである。脱
着型の場合には上下に分離可能な２つの部材等によって
バッグを挟持し、開閉型の場合には支点を中心として開
閉自在な部材等によってバッグを挟持する。バッグを仕
切る方式としては、バッグを単に両面から挟んで仕切る
方式よりも、断面凹部状、例えばほぼＵ字状の部材にバ
ッグを押し込んでもう一方の部材で挟持する押し込み方
式の方が、より均等な力で確実にバッグを仕切れるため
好ましい。なお、バッグを単に両面から挟んで仕切る方
式の場合には、バッグを二つ折りにしてから挟めば培養
液の流通阻止が確実となる。阻止部材を構成する素材に
ついては特に限定されないが、プラスチック等であれば
強度や弾性があり、扱いが容易である。

【００２０】図２〜図５に本発明の阻止部材の具体例を
示すが、本発明の阻止部材は培養液の流通を阻止できる
ものであればどのようなものでもよく、これらに限定さ
れるものではない。本発明の阻止部材の一態様として
は、棒状または好ましくは相互にほぼ合致し合う相補的
な形状の上下に分離可能な２つの部材等の脱着型のもの
が挙げられる。好ましくは、該阻止部材は図２に示すよ
うな上下に分離可能な２つの部材（２，３）からなる。
上部部材（２）はほぼＵ字状をしており、そのＵ字内部
へ下部部材（３）によってバッグを押し込むことでバッ
グを均等な力で仕切ることが可能である。該下部部材
は、上部部材のＵ字にほぼ合致する形状であればよく、
棒状または平板状等である。図２の阻止部材を培養バッ
グへ装着する様子を図３に示す。具体的には、下部部材
（３）を培養バッグの一方の面へ設置し、上部部材
（２）をもう一方の面へ設置し、培養バッグを２つに折
り畳むようにしながら下部部材を上部部材へ押し込み、
固定する。好ましくは、下部部材が下になるよう阻止部
材を設置する。

【００２１】阻止部材をより確実に固定するために、該
上下部材を弾性リング等の固定手段によって固定しても
よい。この場合、該固定手段は阻止部材の上下部材の両
端付近に設置し、少なくとも２個所で固定することが好
ましい。別の態様としては、棒状または好ましくは相互
にほぼ合致し合う相補的な形状の２つの部材（12，13）
を支点（14）を介して連結し、該支点を中心として開閉
自在にした開閉型の阻止部材が挙げられる。図４にその
一例を示す。図５には図４の阻止部材を培養バッグへ装
着した状態を示す。具体的には、該阻止部材を開いてそ
の間に培養バッグを設置し、該阻止部材を閉じて固定す
る。該阻止部材を構成する２つの部材は、支点と反対側
の端部で弾性リング等の固定手段によって固定してもよ
いし、部材自体に相互に固定し得るような構成（例え
ば、一方の部材の端部に凹部を設け、もう一方の部材の
端部に該凹部に合致するような凸部を設けるといった構
成）を付与してもよい。同様に、前記脱着型の上下部材
の一端に支点を設け、開閉型とすることも可能である。

【００２２】本発明では、各種動物細胞、植物細胞を培
養することができる。また、これらの初代培養細胞、株
化細胞、形質転換細胞、ハイブリドーマ等のいずれも培
養可能である。本発明では、浮遊系及び付着系のいずれ
の細胞でも培養可能であるが、特に、浮遊系細胞及び接
着性の比較的弱い付着系細胞の培養に好適である。本明
細書中でいう「接着性の比較的弱い付着系細胞」とは、
トリプシン処理を行わなくても外部からの物理的な刺激
等で剥がせる細胞のことである（以下、「半付着系細
胞」という）。

【００２３】また、培養に用いる培地は、培養すべき細
胞に応じて選択すればよく、例えば、動物細胞用の培地
としては、BME培地、MEM培地、RPMI-1640培地等が挙げ
られ、植物細胞用の培地としては、Ｂ５培地等が、そし
て昆虫細胞用の培地としては、IPL-41培地等が挙げられ
る。前記培地は、必要に応じて血清、ビタミン類、抗生
物質、さらに別の成分等を添加することも可能である。

【００２４】次に、本発明の細胞培養用具を用いた細胞
培養方法について説明する。図６に、図１の細胞培養用
具を用いた細胞培養の手順を示す。まず、滅菌処理（例
えば、γ線滅菌やエチレンオキサイドガス滅菌）した上
記細胞培養バッグ（１）へ、培養すべき細胞に応じて調
製した培地（10）を開口部（９）より充填し、該開口部
をピンチコック等で一旦封鎖する。該培地は、常法に従
って調製することができ、濾過滅菌、オートクレーブ滅
菌などで予め滅菌しておく。また、滅菌済みの培地が予
め充填されているカルチュアーバック充填液体培地（ニ
プロ社より市販）を使用してもよい。どの程度の内容量
のバッグを使用するかは、最終的に得ようとする培養細
胞の量に基づいて選択する。当然のことであるが、培養
バッグは、その中に導入する培地の量よりもある程度大
きい内容量のものを使用し、該バッグを仕切れるだけの
余裕を持たせるのが望ましい。

【００２５】次いで、培地を内包する該バッグを第一の
阻止部材（６）で仕切る。その際、培養すべき細胞の増
殖能や導入量に応じて、培養開始時の細胞密度が適正に
維持されるよう培地の量を決定する。次いで、阻止部材
で仕切った培養領域（５）へ開口部（９）より細胞を導
入し、該開口部をピンチコック、クリップ、滅菌済みの
キャップ等の適切な手段によって封鎖し、バッグ内部を
密閉状態にする。上述の操作は、いずれもクリーンベン
チ等の無菌環境下で無菌的に行なう。

【００２６】次いで、該バッグを炭酸ガス培養器内へ入
れ、培養に必要なガス雰囲気下で静置培養する（第一の
培養）。培養温度、培養時間、pH、二酸化炭素濃度等の
条件は、使用する細胞に応じて設定する。第一の阻止部
材で仕切った培養領域（５）内で細胞が所望の程度まで
増殖したら、第二の阻止部材（８）でバッグを仕切る。
その際、培養細胞の増殖能に応じて、培養領域拡張時の
細胞密度が適正な範囲内に維持されるよう培地の量を決
定する。必要に応じて、細胞の増殖具合を目視等で確認
したり、開口部（９）よりサンプリングを行なって細胞
数等を確認することも可能である。次いで、第一の阻止
部材（６）を開放して培養領域を拡張し、第一の培養と
同様に炭酸ガス培養器内で静置培養する（第二の培
養）。

【００２７】該拡張した培養領域（７）内で細胞が所望
の程度まで増殖したら、第二の培養と同様の操作を繰り
返し、培養バッグ全体に細胞が増殖する（11）まで培養
を続ける。浮遊系及び半付着系のいずれの細胞の場合に
も、一般的には、培養開始時または培養領域拡張時の細
胞密度が1×10⁵個/ml程度となるように培地の量を決定
するのが望ましい。しかしながら、培養開始時または培
養領域拡張時の細胞密度は、使用する細胞の種類や増殖
特性または培養の目的に応じて適宜設定すればよい。

【００２８】浮遊系培養の場合には、培養すべき細胞の
増殖能に合わせて培養領域を拡張していく。即ち、例え
ば５倍に増殖する能力を有する細胞であれば、培養領域
が細胞の量の５倍になるように培地の量を決定し、該培
養領域内で細胞を増殖させ、次いで培養領域をさらに５
倍に拡張して細胞を増殖させればよい。半付着系培養の
場合には、細胞がコンフルエントになる前、即ち、対数
増殖期の後半に培養領域を拡張することが望ましい。こ
れは、細胞相互の接触凝集を避けるためである。この場
合には、培養領域を拡張する前に、細胞が付着した培養
バッグの表面を外側から軽く触れるなど外部から物理的
刺激を与えることによって細胞を剥がし、浮遊させてお
くのが望ましい。次いで、浮遊系細胞と同様に、細胞の
増殖能に合わせて培養領域を拡張していく。培養領域の
拡張は、細胞の増殖速度にもよるが、通常７日ごとに行
う。

【００２９】培養バッグ全体に細胞が増殖したら、適宜
培養細胞または培養上清液を回収する。その際、半付着
系細胞の場合には、外側から触れるなど外部から物理的
刺激を与えて細胞を予めバッグ表面から剥がしておく。
このように、本発明の方法では、阻止部材で培養バッグ
を仕切ることにより同一の培養バッグ内で第一の培養、
第二の培養、第三の培養というように続けて培養を行う
ため、培養操作が簡略化されて容易かつ効率的に研究レ
ベルで必要となる細胞数や培養上清液を得ることができ
る。

【００３０】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例図６に示した手順に従い、図１に示した本発明の細胞培
養用具を使用してBmN₄-H細胞を培養した。細胞培養バッ
グには、培養領域を仕切る際の目安となるよう目盛りを
付けておいた。BmN₄-H細胞は、昆虫（カイコの胚子）由
来の半付着系の培養細胞で約５倍の増殖能を保持してい
る（もと予研より入手）。

【００３１】IPL-41培地（コージンバイオ製）にウシ胎
児血清(FBS)を５〜10％加えて無菌的に調製した培地（p
H7.2）2000mlを、細胞培養バッグ（２リットル用、γ線
滅菌済み）へ充填した。第一の阻止部材で培養領域を約
100mlに仕切り、BmN₄-H細胞を１×10⁷個（20ml）導入し
て培養開始時の細胞密度を約１×10⁵個/mlに調整した。
次いで、該バッグを炭酸ガス培養器内へ入れ、26℃、５
％二酸化炭素雰囲気下にて７日間静置培養した。BmN₄-H
細胞は、培養バッグへ導入する前に、同様の培養条件に
てフラスコ（５ml用）中で前培養し、バック培養に必要
な細胞数まで増殖させておいた。

【００３２】細胞の増殖程度を目視で確認した後、培養
領域が約500mlになるように（培地が約400ml追加される
ように）第二の阻止部材でバッグを仕切り、第一の阻止
部材を開放して培養領域を約５倍に拡張した。次いで、
同様に７日間静置培養した。同様に細胞の増殖程度を確
認した後、第二の阻止部材を開放して培養領域をバッグ
全域（約４倍）に拡張した。次いで、同様に６日間静置
培養した。

【００３３】最終的に、培養バッグ一つ（２リットル）
当たり約１×10⁹個の細胞と、必要に応じて約２リット
ルの培養上清を得ることができた。本実施例では、培養
領域の拡張操作をわずか２回行っただけで、約１×10⁹
個の細胞を効率よく調製することができた。また、本実
施例では、無菌操作が必要となるのは培地と細胞を培養
バッグへ導入する段階までであり、これ以降は無菌的に
行う必要がないため、操作が容易でかつ雑菌汚染の危険
も少ない。さらに、使用した消耗器材も、培養バッグ、
前培養に使用したフラスコとピペットなどごくわずかで
ある。

【００３４】比較例本比較例では、実施例と同様の細胞数（約１×10⁹個）
をフラスコ培養にて調製した。実施例と同一の細胞及び
培地を使用し、20ml培養用のフラスコ（ポリスチレン
製、γ線滅菌済み、ファルコンより入手）を用いて培養
を行った。培地及びBmN₄-H細胞を細胞密度が１×10⁵個/
mlとなるように培養フラスコへ導入し、全量を20mlとし
た。次いで、培養フラスコを炭酸ガス培養器内へ入れ、
実施例と同一の条件下にて７日間静置培養した。その
際、培養フラスコの蓋は、わずかに開けた状態にした。

【００３５】細胞の増殖程度を目視で確認した後、細胞
密度が１×10⁵個/mlとなるよう培地を加え新しい５本の
培養フラスコへ分注し、それぞれ全量を20mlとした（総
量100ml）。次いで、培養フラスコを炭酸ガス培養器内
へ入れ、同様に７日間静置培養した。同様に細胞の増殖
程度を確認した後、細胞密度が１×10⁵個/mlとなるよう
培地を加え新しい25本の培養フラスコへ分注し、それぞ
れ全量を20mlとした（総量500ml）。次いで、培養フラ
スコを炭酸ガス培養器内へ入れ、同様に７日間静置培養
した。

【００３６】同様に細胞の増殖程度を確認した後、細胞
密度が１×10⁵個/mlとなるよう培地を加え新しい100本
の培養フラスコへ分注し、それぞれ全量を20mlとした
（総量2000ml）。次いで、培養フラスコを炭酸ガス培養
器内へ入れ、同様に６日間静置培養した。最終的に培養
系全体で約１×10⁹個の細胞が得られたが、本比較例で
は合計３回にわたる植え継ぎ操作が必要であったため、
一度に扱うフラスコの数が植え継ぎ操作ごとに５倍に増
え、培養操作が煩雑になり、雑菌で汚染されやすくなっ
ただけでなく、最終的に消費した培養フラスコやピペッ
ト等の培養器材の数も膨大になった。従って、本比較例
では、実施例におけるバッグ培養に比べてより多くの労
力とコストを要したことは明らかである。また、本比較
例では、ガス導入のため培養フラスコの蓋をわずかに開
けておかなければならないため、植え継ぎ操作以外のと
ころでも雑菌で汚染される可能性があり、実施例に比べ
て無菌培養の達成が格段に難しくなっていることは明ら
かである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞培養用具の構成例を示す図であ
る。

【図２】本発明の細胞培養用具における脱着型の阻止部
材の例を示す図である。

【図３】図２の阻止部材を細胞培養バッグへ装着する様
子を示す断面図である。

【図４】本発明の細胞培養用具における開閉型の阻止部
材の例を示す図である。

【図５】図４の阻止部材を細胞培養バッグへ装着した状
態を示す図である。

【図６】図１の細胞培養用具を用いた細胞培養の手順を
示す図である。

【符号の説明】

１細胞培養バッグ２脱着型阻止部材の上部部材３脱着型阻止部材の下部部材４目盛り５第一の培養を行なう培養領域６第一の阻止部材７第二の培養を行なう培養領域８第二の阻止部材９開口部 10 培地（細胞は含まない） 11 培養細胞 12 開閉型阻止部材の部材 13 開閉型阻止部材の部材 14 支点

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸素及び二酸化炭素に対して透過性を有
し、かつ少なくともウイルス及び微生物に対しては透過
性を示さないポリオレフィンを融着接合してなる容器本
体に少なくとも二つの開口部を設けた細胞培養バッグ
と、該培養バッグ中の培養液の流通を阻止するための阻
止部材とからなる細胞培養用具。
【請求項２】前記阻止部材を少なくとも２個有する請
求項１記載の細胞培養用具。
【請求項３】前記阻止部材が脱着または開閉自在であ
る請求項１または２記載の細胞培養用具。
【請求項４】前記阻止部材が、バッグをその両面より
挟持しうる部材である請求項１〜３のいずれか一項に記
載の細胞培養用具。
【請求項５】前記ポリオレフィンが、酸素及び二酸化
炭素以外のガスに対しては透過性を示さないものである
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養用具。
【請求項６】酸素及び二酸化炭素に対して透過性を有
し、かつ少なくともウイルス及び微生物に対しては透過
性を示さないポリオレフィンを融着接合してなる容器本
体に少なくとも二つの開口部を設けた細胞培養バッグ全
体に培地を充填し、該培養バッグ中の培養液の流通を阻
止するための阻止部材を用いて培養領域を仕切り、該阻
止部材で仕切られた培養領域内で細胞を培養して増殖さ
せた後、該阻止部材を開放して培養領域を拡張し、拡張
した培養領域内でさらに細胞を増殖させることを含む細
胞培養方法。
【請求項７】前記培養領域を、培養すべき細胞の増殖
能に応じて細胞密度が適正に維持されるように仕切る請
求項６記載の方法。
【請求項８】前記阻止部材を少なくとも２個使用し、
培養領域を仕切る工程と拡張する工程を２回以上繰り返
す請求項６または７記載の方法。
【請求項９】前記阻止部材が脱着または開閉自在であ
る請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】前記阻止部材が、バッグをその両面よ
り挟持しうる部材である請求項６〜９のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１１】前記ポリオレフィンが、酸素及び二酸
化炭素以外のガスに対しては透過性を示さないものであ
る請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。