KR20140034224A

KR20140034224A - 면역 유도제

Info

Publication number: KR20140034224A
Application number: KR1020137033212A
Authority: KR
Inventors: 아키라 쿠리하라; 후미요시 오카노
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: US20160030540A1; CN103547284A; ES2595161T3; DK2711017T3; CA2836568C; WO2012157737A1; BR112013029704A2; US20140120059A1; AU2012256757B2; JP5954174B2; PL2711017T3; EP2711017B1; EP2711017A1; JPWO2012157737A1; AU2012256757A1; KR101949186B1; CA2836568A1; RU2013156368A; US10463725B2; EP2711017A4

Abstract

암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규의 면역 유도제를 제공한다. 이하의 (a), (b) 및 (c), 즉 (a) 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, (b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 85% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드류로부터 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 그 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 함유하는 면역 유도제.

Description

면역 유도제{IMMUNITY INDUCING AGENT}

본 발명은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규한 면역 유도제에 관한 것이다.

암은 전체 사망 원인의 제1위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합시킨 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되어 있지 않은 것이 현재의 상태이다. 최근, 분자생물학이나 암 면역학의 진보로 암에 반응하는 세포장해성 T세포에 의해 인식되는 암 항원이나 암 항원을 코드하는 유전자가 동정되고 있고, 항원 특이성 면역요법으로의 기대가 높아지고 있다.

면역요법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서, 그 항원으로서 인식되는 펩티드 또는 단백질은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암 세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 필요로 된다. 1991년, 벨기에 Ludwig 연구소의 Boon 등은 자기 암 세포주와 암 반응성 T세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 멜라노머 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 1). 그 후에 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 도입하여 동정하는, SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되고(특허문헌 1, 비특허문헌 2), 이 방법에 의해 몇개의 암 항원이 단리되어 있다. 또한, 그 일부를 타깃으로 해서 암 면역요법의 임상시험이 개시되어 있다.

한편, 인간과 마찬가지로 개나 고양이에도 유선종양, 편평 상피암 등 다수의 종양이 알려져 있고, 개나 고양이의 질병 통계에서도 상위에 랭크되어 있다. 그러나, 개나 고양이의 암에 대한 유효한 치료약, 예방약 및 진단약은 현재 시점에서 존재하지 않는다. 대부분의 개나 고양이의 종양은 진행되어 종류(腫瘤)가 커지고나서 기르는 주인이 알아차리는 케이스가 대부분이며, 내원하여 외과적 수술에 의해 절제하거나, 인체약(항암제 등)을 투여해도 이미 때를 놓쳐서 처치 후 얼마안돼 사망하는 경우가 많다. 이러한 현재의 상태 중에서, 개나 고양이에 유효한 암의 치료약 및 예방약이 입수 가능하게 되면 개의 암에 대한 용도가 열린다고 기대된다.

katanin p60 subunit A-like 1(KATNAL1)은 미소관 결합 도메인을 갖는 단백질로서 동정되었다(특허문헌 2, 비특허문헌 3). 그러나, KATNAL1 단백질이 암 세포에 대한 면역 유도 활성을 갖고, 그것에 의해서 그 단백질이 암의 치료나 예방에 유용하다고 하는 보고는 없다.

미국 특허 제5698396호 일본 특허 공개 2004-8216호 공보

Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813(1995) Rigden DJ. et al. FEBS Lett. Mar 4; 583(5): 872-8(2009)

본 발명의 목적은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규한 폴리펩티드를 찾아내고, 그 폴리펩티드의 면역 유도제로의 사용을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구한 결과, 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 암을 가지고 있는 개의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해, 암을 가지고 있는 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코드하는 cDNA를 취득하고, 그 cDNA를 기초로 하여 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 개 katanin p60 subunit A-like 1(이하, KATNAL1이라 기재한다)의 폴리펩티드를 제작했다. 또한, 취득한 유전자의 인간 및 마우스 상동성 유전자를 기초로 해서 서열번호 4 및 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 인간 및 마우스 KATNAL1을 제작했다. 그리고 이들 KATNAL1 폴리펩티드가 유방암, 뇌종양, 항문 주위 선암, 신경아종, 비만세포종, 간암, 전립선암, 폐암, 갑상선암 또는 백혈병의 조직 또는 세포에 특이적으로 발현되고 있는 것을 찾아냈다. 또한, 이들 KATNAL1을 생체에 투여함으로써 생체 내에 KATNAL1에 대한 면역세포를 유도할 수 있는 것, 및 KATNAL1을 발현하는 생체 내의 종양을 퇴축(退縮)시킬 수 있는 것을 찾아냈다. 또한, KATNAL1의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 재조합 벡터가, KATNAL1을 발현하는 암에 대하여 생체 내에서 항종양 효과를 유도하는 것을 찾아냈다.

또한, KATNAL1의 폴리펩티드가 항원 제시 세포에 의해 제시되어서 그 펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력(면역 유도 활성)을 갖는 것, 이 때문에, 그 폴리펩티드가 암의 치료 및/또는 예방에 유용하고, 또한 그 폴리펩티드와 접촉한 항원 제시 세포나 그 항원 제시 세포와 접촉한 T세포가 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 것을 찾아내고 본 발명을 완성했다.

따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.

(1) 이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드류로부터 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 그 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제.

(a) 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12에 기재된 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드.

(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 85% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드.

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.

(2) 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 (1)에 기재된 면역 유도제.

(3) 항원 제시 세포의 처리제인 (1) 또는 (2)에 기재된 면역 유도제.

(4) 암의 치료 및/또는 예방제인 (1) 또는 (2)에 기재된 면역 유도제.

(5) 상기 암이 KATNAL1을 발현하는 암인 (4)에 기재된 면역 유도제.

(6) 상기 암이 유방암, 뇌종양, 항문 주위 선암, 신경아종, 비만세포종, 간암, 전립선암, 폐암, 갑상선암 또는 백혈병인 (4) 또는 (5)에 기재된 면역 유도제.

(7) 면역 증강제를 더 포함하는 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.

(8) 상기 면역 증강제가 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타니드, 폴리IC 및 그 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, 인터류킨12, 인터류킨18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 (7)에 기재된 면역 유도제.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 암의 치료 및/또는 예방 등에 유용한 신규한 면역 유도제가 제공된다. 후술의 실시예에 있어서 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 생체에 투여하면 생체 내에 있어서 면역세포를 유도할 수 있고, 또한 이미 발생되어 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 그 폴리펩티드는 암의 치료나 예방에 유용하다.

도 1은 동정한 KATNAL1 유전자의 개 정상 조직 및 종양 조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 도시한 도면이다. 참조번호 1; 개 KATNAL1 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조번호 2; 개 GAPDH 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴.
도 2는 동정한 KATNAL1 유전자의 인간 정상 조직 및 종양 조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 도시한 도면이다. 참조번호 3; 인간 KATNAL1 유전자의 인간의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조번호 4; 인간 GAPDH 유전자의 인간의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴.
도 3은 동정한 KATNAL1 유전자의 마우스 정상 조직 및 종양 조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 도시한 도면이다. 참조번호 5; 마우스 KATNAL1 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조번호 6; 마우스 GAPDH 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.

본 발명의 면역 유도제에 유효 성분으로서 포함되는 폴리펩티드로서는 이하의 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말하고, 구성하는 아미노산 수가 많은 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라 아미노산 수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)나 전장 단백질도 포함되고, 본 발명에서는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 KATNAL1의 전장 단백질도 포함된다.

(a) 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지고, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드

(b) (a)의 폴리펩티드와 85% 이상의 서열 동일성을 갖고, 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드

(c) (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명에 있어서 「아미노산 서열을 갖는다」라고 하는 것은, 아미노산 잔기가 그러한 순서로 배열되어 있다고 하는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란 서열번호 2로 나타내어지는 Met Asn Leu Ala··(중략) ··Glu Phe Gly Ser Ala의 아미노산 서열을 갖는, 490 아미노산 잔기 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 예를 들면 「서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」를 「서열번호 2의 폴리펩티드」라고 약기할 경우가 있다. 「염기서열을 갖는다」라고 하는 표현에 대해서도 마찬가지이다. 이 경우, 「갖는다」라고 하는 용어는 「로 이루어진다」라고 하는 표현으로 치환하여도 좋다.

여기에서, 「면역 유도 활성」이란 생체 내에서 인터페론 등의 사이토카인을 분비하는 면역세포를 유도하는 능력을 의미한다.

상기 폴리펩티드가 면역 유도 활성을 갖는지의 여부는, 예를 들면 공지의 엘리스팟 에세이(ELISPOT assay) 등을 이용하여 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, 면역 유도 활성을 평가해야 할 폴리펩티드를 투여한 생체로부터 말초혈 단핵구 등의 세포를 얻어 그 세포를 그 폴리펩티드와 공존 배양하고, 그 세포로부터의 사이토카인 산생량을 특이항체를 이용하여 측정함으로써 그 세포 중의 면역세포수를 측정할 수 있으므로, 이것에 의해 면역 유도 활성을 평가할 수 있다.

또한, 후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, 상기 (a)∼(c)의 재조합 폴리펩티드를 암을 가지고 있는 생체에 투여하면, 그 면역 유도 활성에 의해 종양을 퇴축시킬 수도 있다. 따라서, 상기 면역 유도 활성은 암 세포의 증식을 억제하거나 또는 암 조직(종양)을 축소 또는 소멸시키는 능력(이하, 「항종양 활성」이라고 한다)으로서 평가할 수도 있다. 폴리펩티드의 항종양 활성은, 예를 들면 후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 실제로 그 폴리펩티드를 암을 가지고 있는 생체에 투여해서 종양이 축소되거나 하는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다.

또는, 그 폴리펩티드로 자극된 T세포(즉, 그 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포와 접촉시킨 T세포)가 생체 밖에서 종양세포에 대하여 세포장해활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 폴리펩티드의 항종양 활성을 평가할 수도 있다. T세포와 항원 제시 세포의 접촉은, 후술하는 바와 같이 양자를 액체 배양지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 Int. J. Cancer, 58: p317, 1994에 기재된 ⁵¹Cr 릴리스 에세이(release assay)라고 불리는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 암의 치료 및/또는 예방 용도로 사용할 경우에는, 특별하게 한정되지 않지만 항종양 활성을 지표로 해서 면역 유도 활성을 평가하는 것이 바람직하다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 2, 4, 8, 10, 12에 각각 나타내어지는 아미노산 서열은, 개 정소 유래 cDNA 라이브러리와 암을 가지고 있는 개의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해, 암을 가지고 있는 개 유래의 혈청 내에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드 및 그 인간, 소, 말, 닭 상동인자로서 단리 된 KATNAL1 단백질의 아미노산 서열이다(실시예 1 참조). 개 KATNAL1의 인간 상동인자인 인간 KATNAL1에서는, 서열 동일성이 염기서열 95%, 아미노산 서열 98%이며, 소 상동인자인 소 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 91%, 아미노산 서열 97%, 말 상동인자인 말 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 87%, 아미노산 서열 88%, 닭 상동인자인 닭 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 81%, 아미노산 서열 90%이다.

상기 (a)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상, 바람직하게는 연속하는 8, 9또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 면역 유도 활성을 갖는 것이다. 보다 바람직하게는 그 폴리펩티드는 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열과 서열 동일성이 85% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이며, 특히 바람직하게는 그 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 이 분야에서 공지된 바와 같이, 약 7아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 항원성 및 면역원성을 발휘할 수 있다. 따라서, 서열번호 2, 4의 아미노산 서열 중의 연속하는 7아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 면역 유도 활성을 가질 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.

또한, 암 항원 폴리펩티드를 투여하는 것에 의한 면역 유도의 원리로서 폴리펩티드가 항원 제시 세포에 도입되고, 그 후 그 세포 내에서 펩티다아제에 의한 분해를 받아서 보다 작은 단편으로 되어 그 세포의 표면 상에 제시되고, 그것을 세포장해성 T세포 등이 인식하여 그 항원을 제시하고 있는 세포를 선택적으로 죽여 간다고 하는 것이 알려져 있다. 항원 제시 세포의 표면 상에 제시되는 폴리펩티드의 사이즈는 비교적 작고, 아미노산 수로 7∼30 정도이다. 따라서, 항원 제시 세포 상에 제시시킨다고 하는 관점으로부터는, 상기 (a)의 폴리펩티드로서는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7∼30 정도인 것이 바람직한 형태의 하나이며, 보다 바람직하게는 8∼30 또는 9∼30 정도의 아미노산으로 이루어지는 것이면 충분하다. 이들 비교적 작은 사이즈의 폴리펩티드는 항원 제시 세포 내에 도입되지 않고 직접 항원 제시 세포 상의 세포 표면에 제시될 경우도 있다.

또한, 항원 제시 세포에 도입된 폴리펩티드는 그 세포 내의 펩티다아제에 의해 임의적인 위치에서 절단을 받아서 여러가지 폴리펩티드 단편이 만들어지고, 이들 폴리펩티드 단편이 항원 제시 세포 표면 상에 제시되므로, 서열번호 2, 4, 8, 10, 12의 전체 길이 영역과 같이 큰 사이즈의 폴리펩티드를 투여하면 항원 제시 세포 내에서의 분해에 의해 항원 제시 세포를 개재하는 면역 유도에 유효한 폴리펩티드 단편이 필연적으로 생긴다. 따라서, 항원 제시 세포를 개재하는 면역 유도에 있어서도 사이즈가 큰 폴리펩티드를 바람직하게 사용할 수 있고, 아미노산 수를 30 이상, 더욱 바람직하게는 100 이상, 더욱 바람직하게는 200 이상, 더욱 바람직하게는 250 이상, 더욱 바람직하게는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12의 전체 길이 영역의 폴리펩티드로 해도 좋다.

상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드 중 소수의(바람직하게는 1개 또는 수개의) 아미노산 잔기가 치환되어 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드이며, 원래의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 단백질 항원에 있어서 그 단백질의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환되어 결실되거나 또는 삽입되었을 경우라도, 원래의 단백질과 거의 같은 항원성을 갖고 있을 경우가 있는 것은 당업자에 있어서 널리 알려져 있다. 따라서, 상기 (b)의 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 발휘할 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다. 또한, 상기 (b)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열 중 1개내지 수개의 아미노산 잔기가 치환하여 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드인 것도 바람직하다. 본 명세서 중의 「수개」라는 것은 2∼10의 정수, 바람직하게는 2∼6의 정수, 더욱 바람직하게는 2∼4의 정수를 나타낸다.

여기에서, 아미노산 서열 또는 염기서열의 「서열 동일성」이란, 비교해야 할 2개의 아미노산 서열(또는 염기서열)의 아미노산 잔기(또는 염기)가 가능한 한 많이 일치하도록 양쪽 아미노산 서열(또는 염기서열)을 정렬시키고, 일치한 아미노산 잔기 수(또는 일치한 염기 수)를 전체 아미노산 잔기 수(또는 전체 염기 수)로 나눈 것을 백분률로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는 필요에 따라 비교하는 2개의 서열 중 한쪽 또는 양쪽에 적당하게 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는, 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTALW 등의 주지의 프로그램을 이용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입될 경우, 상기 전체 아미노산 잔기 수는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기로서 카운트한 잔기 수가 된다. 이와 같이 하여 카운트한 전체 아미노산 잔기 수가 비교하는 2개의 서열 사이에서 다른 경우에는, 서열 동일성(%)은 긴 쪽의 서열의 전체 아미노산 잔기 수로, 일치한 아미노산 잔기 수를 나누어서 산출된다.

또한, 천연의 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사의 성질을 갖는 것으로 그룹 나눌 수 있고, 이들 사이에서의 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 경우가 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 (a)의 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는 이들 각 그룹의 사이에서 치환함으로써 면역 유도 활성을 유지할 수 있는 가능성이 높아지기 때문에 바람직하다.

상기 (c)의 폴리펩티드는 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 일단 또는 양단에 다른 아미노산 또는 폴리펩티드가 부가된 것이며, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드도 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.

상기한 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법)등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법을 이용하여 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 그 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 장착하여 숙주세포에 도입하고, 그 숙주세포 내에서 폴리펩티드를 산생시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA는 개 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열번호 1에 기재한 염기서열을 증폭할 수 있게 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA이면, 상기 주형으로서 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 마찬가지로 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1, 3에 나타내어지는 염기서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 개나 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 원하는 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열번호 2, 4의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 분자클로닝 제2판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 DNA로부터 상기 (a)의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 각 아미노산을 코드하는 코돈(codon)은 공지이기 때문에 특정의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 용이하게 특정할 수 있다. 따라서, 상기한 (b) 또는 (c)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열도 용이하게 특정할 수 있으므로, 그러한 폴리뉴클레오티드도 시판의 핵산 합성기를 이용하여 상법에 의해 용이하게 합성할 수 있다.

상기 숙주세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이라도 좋고, 원핵세포의 예로서는 대장균 등, 진핵세포의 예로서는 원숭이 신장세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 출아효모, 분열효모, 누에세포, 아프리카 발톱개구리 난세포 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

숙주세포로서 원핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합부위, DNA 클로닝 부위, 터미네이터 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 그 벡터로 원핵 숙주세포를 형질전환한 뒤 얻어진 형질전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 그 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주세포로서 진핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가부위 등을 갖는 진핵세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pMSG and pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 그 벡터로 진핵 숙주세포를 형질전환한 뒤 얻어진 형질전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전점전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는, 상술한 바와 같이 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태에 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-전이효소(GST)나 His 태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 형태의 폴리펩티드도 상기한 (c)의 폴리펩티드로서 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 형질전환 세포에서 발현된 폴리펩티드는, 번역된 후 세포 내에서 각종 수식을 받을 경우가 있다. 이러한 번역 후 수식된 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 갖는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 번역 수식으로서는 N말단 메티오닌의 탈리, N말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포 내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스토일화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.

후술의 실시예에 구체적으로 기재되는 바와 같이, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드를 암을 가지고 있는 생체에 투여하면, 이미 발생되어 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 또한, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 면역 유도에 의한 암의 치료 및/또는 예방방법에 사용할 수 있다.

여기에서, 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

이 경우, 대상이 되는 암으로서는 서열번호 KATNAL1의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 발현하고 있는 암이면 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 유방암, 뇌종양, 항문 주위 선암, 신경아종, 비만세포종, 간암, 전립선암, 폐암, 갑상선암 또는 백혈병이다.

또한, 대상이 되는 동물은 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 영장류, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 특히 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이이다.

본 발명의 면역 유도제의 생체로의 투여 경로는 경구 투여라도 비경구 투여라도 좋지만, 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하다. 암의 치료 목적으로 그 면역 유도제를 사용할 경우에는, 항암 작용을 높이기 위해서 후술의 실시예에 기재하는 바와 같이, 치료 대상이 되는 종양 근방의 소속 림프절에 투여할 수도 있다. 투여량은 면역 유도하는데 유효한 양이면 되고, 예를 들면 암의 치료 및/또는 예방에 사용하는 것이라면 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양이면 된다. 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양은 종양의 크기나 증상 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 대상 동물에 대하여 1일당의 유효량으로서 0.0001∼1000㎍, 바람직하게는 0.001∼1000㎍이며, 1회 또는 수회로 나누어서 투여할 수 있다. 바람직하게는 수회로 나누고, 수일 내지 수개월 간격으로 투여한다. 후술의 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 본 발명의 면역 유도제는 이미 형성되어 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 발생 초기의 소수의 암 세포에도 항암 작용을 발휘할 수 있으므로 암의 발병 전이나 암의 치료 후에 사용하면 암의 발병이나 재발을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료와 예방의 쌍방에 유용하다.

본 발명의 면역 유도제는 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 각 투여 형태에 적합한, 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 등의 첨가제를 적당하게 혼합시켜서 제제할 수도 있다. 제제 방법 및 사용 가능한 첨가제는 의약 제제의 분야에 있어서 주지이며, 어느 방법 및 첨가제나 사용할 수 있다. 첨가제의 구체예로서는, 생리완충액과 같은 희석제; 설탕, 유당, 옥수수 전분, 인산 칼슘, 소르비톨, 글리신 등과 같은 부형제; 시럽, 젤라틴, 아라비아 고무, 소르비톨, 폴리비닐클로리드, 트래거캔스 등과 같은 결합제; 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 탤크, 실리카 등의 활택제 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 제제 형태로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제(散劑), 시럽제 등의 경구제, 흡입제, 주사제, 좌제, 액제(液劑) 등의 비경구제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 일반적으로 알려져 있는 제법에 의해 만들 수 있다.

본 발명의 면역 유도제는 생체 내에서의 면역학적 응답을 강화할 수 있는 면역 증강제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 면역 증강제는 본 발명의 면역 유도제에 포함되어 있어도 좋고, 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여해도 좋다.

상기 면역 증강제로서는 예를 들면 아쥬반트를 들 수 있다. 아쥬반트는 항원의 저장소(세포 밖 또는 대식세포 내)를 제공하고, 대식세포를 활성화하고 또한 특정 세트의 림프구를 자극함으로써 면역학적 응답을 강화할 수 있으므로, 항암 작용을 높일 수 있다. 따라서, 특히 본 발명의 면역 유도제를 암의 치료 및/또는 예방에 사용할 경우, 면역 유도제는 유효 성분인 상기 폴리펩티드에 추가해서 아쥬반트를 더 포함하는 것이 바람직하다. 다수 종류의 아쥬반트가 당업계에서 주지이며, 어느 아쥬반트라도 사용할 수 있다. 아쥬반트의 구체예로서는, MPL(SmithKline Beecham), 살모네라속의 Salmonella minnesota Re 595 리포 다당류의 정제 및 산 가수분해 후에 얻어지는 동류물; QS21(SmithKline Beecham), Quillja saponaria 추출물로부터 정제되는 순 QA-21 사포닌; PCT 출원 WO96/33739(SmithKline Beecham)에 기재된 DQS21; QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1[소(So) 외 10명, 분자와 세포(Molecules and cells)」, 1997년, 제7권, p.178-186]; 프로인트의 불완전 아쥬반트; 프로인트의 완전 아쥬반트; 비타민E; 몬타니드; 명반; CpG 올리고뉴클레오티드[예를 들면, 크레이그(Kreig) 외 7명, 「네이처(Nature)」, 제374권, p.546-549를 참조]; 폴리IC 및 그 유도체(폴리ICLC 등) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 기름으로 조제되는 여러가지의 유중수 에멀젼을 들 수 있다. 그 중에서도, 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타니드, 폴리IC 및 그 유도체, 및 CpG 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 아쥬반트와 폴리펩티드의 혼합비는 전형적으로는 약 1:10∼10:1, 바람직하게는 약 1:5∼5:1, 보다 바람직하게는 약 1:1이다. 단, 아쥬반트는 상기 예시에 한정되지 않고, 당업계에서 공지인 상기 이외의 아쥬반트도 본 발명의 면역 유도제를 투여할 때에 사용될 수 있다[예를 들면, 고딩(Goding) 저, 「모노클론항체: 원리와 실제(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)」, 제2판, 1986년을 참조]. 폴리펩티드 및 아쥬반트의 혼합물 또는 에멀젼의 조제 방법은 예방접종의 당업자에게는 주지이다.

또한, 상기 면역 증강제로서는 상기 아쥬반트 이외에도 대상의 면역응답을 자극하는 인자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 림프구나 항원 제시 세포를 자극하는 특성을 갖는 각종 사이토카인을 면역 증강제로서 본 발명의 면역 유도제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 그러한 면역학적 응답을 증강 가능한 다수의 사이토카인이 당업자에게 공지이며, 그 예로서는 백신의 방어 작용을 강화하는 것이 나타내어져 있는 인터류킨-12(IL-12), GM-CSF, IL-18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 이러한 인자도 상기 면역 증강제로서 사용할 수 있고, 본 발명의 면역 유도제에 포함시켜서 또는 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여할 수 있다.

또한, 상기 폴리펩티드와 항원 제시 세포를 인비트로에서 접촉시킴으로써 그 폴리펩티드를 항원 제시 세포에 제시시킬 수 있다. 즉, 상기한 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드는 항원 제시 세포의 처리제로서 이용할 수 있다. 여기에서, 항원 제시 세포로서는 MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 여러가지 MHC클래스 I분자가 동정되어 있고, 주지이다. 인간에 있어서의 MHC분자는 HLA라고 부른다. HLA클래스 I분자로서는, HLA-A, HLA-B, HLA-C를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 들 수 있다.

MHC클래스 I분자를 보유하는 수상세포 또는 B세포는 주지의 방법에 의해 말초혈로부터 조제할 수 있다. 예를 들면, 골수, 탯줄혈 또는 환자 말초혈로부터 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)와 IL-3(또는 IL-4)을 사용해서 수상세포를 유도하고, 그 배양계에 종양 관련 펩티드를 첨가함으로써 종양 특이적인 수상세포를 유도할 수 있다.

이 수상세포를 유효량 투여함으로써 암의 치료에 바람직한 응답을 유도할 수 있다. 사용하는 세포는 건강인으로부터 제공된 골수나 탯줄혈, 환자 본인의 골수나 말초혈 등을 사용할 수 있지만, 환자 본래의 자가세포를 사용하는 경우에는 안전성이 높고, 중독한 부작용을 회피하는 것도 기대할 수 있다. 말초혈 또는 골수는 신선 시료, 저온보존 시료 및 동결보존 시료의 어느 것이라도 좋다. 말초혈은 전체 혈을 배양해도 좋고, 백혈구 성분만을 분리해서 배양해도 좋지만, 후자 쪽이 효율적여서 바람직하다. 또한 백혈구 성분 중에서도 단핵구를 분리해도 좋다. 또한, 골수나 탯줄혈을 기원으로 할 경우에는 골수를 구성하는 세포 전체를 배양해도 좋고, 이것으로부터 단핵구를 분리해서 배양해도 좋다. 말초혈이나 그 백혈구 성분, 골수세포에는 수상세포의 기원이 되는 단핵구, 조혈간세포 또는 미성숙 수상세포나 CD4 양성 세포 등이 포함되어 있다. 사용되는 사이토카인은 안전성과 생리활성이 확인된 특성의 것이라면 천연형, 또는 유전자 재조합형 등, 그 산생 방법에 대해서는 묻지 않지만, 바람직하게는 의료용으로 사용되는 품질이 확보된 표품이 필요 최저량으로 사용된다. 첨가하는 사이토카인의 농도는 수상세포가 유도되는 농도이면 특별하게 한정되지 않고, 통상 사이토카인의 합계 농도로 10∼1000ng/mL 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼500ng/mL 정도이다. 배양은 백혈구의 배양에 통상 사용되고 있는 주지의 배지를 이용하여 행할 수 있다. 배양 온도는 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 인간의 체온인 37℃ 정도가 가장 바람직하다. 또한, 배양 중의 기체 환경은 백혈구의 증식이 가능하면 특별하게 한정되지 않지만, 5% CO₂를 통기시키는 것이 바람직하다. 또한 배양 기간은 필요수의 세포가 유도되는 기간이면 특별하게 한정되지 않지만, 통상 3일∼2주간 사이에서 행하여진다. 세포의 분리나 배양에 제공되는 기기는 적절히 적당한 것을 사용할 수 있지만, 의료용으로 안전성이 확인되고, 또한 조작이 안정되고 간편한 것이 바람직하다. 특히 세포배양장치에 대해서는 샤알레, 플라스크, 병 등의 일반적 용기에 관계없이, 적층형 용기나 다단식 용기, 롤러 병, 스피너식 병, 백식 배양기, 중공사 컬럼 등도 사용할 수 있다.

상기 폴리펩티드와 항원 제시 세포를 인비트로에서 접촉시키는 방법 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 행할 수 있다. 배지 중의 펩티드 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 1∼100㎍/ml 정도, 바람직하게는 5∼20㎍/ml 정도이다. 배양시의 세포 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 10³∼10⁷세포/ml 정도, 바람직하게는 5×10⁴∼5×10⁶세포/ml 정도이다. 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 항원 제시 세포가 표면 상에 제시할 수 있는 펩티드의 길이는, 통상 최대로 30아미노산 잔기 정도이다. 따라서, 특별하게 한정되지 않지만, 항원 제시 세포와 폴리펩티드를 인비트로에서 접촉시킬 경우 그 폴리펩티드를 약 30아미노산 잔기 이하의 길이로 조제해도 좋다.

상기한 폴리펩티드의 공존 하에 있어서 항원 제시 세포를 배양함으로써 펩티드가 항원 제시 세포의 MHC 분자에 도입되고, 항원 제시 세포의 표면에 제시된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 그 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함한 단리 항원 제시 세포를 조제할 수 있다. 이러한 항원 제시 세포는 생체 내 또는 인비트로에 있어서 T세포에 대하여 그 폴리펩티드를 제시하고, 그 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하여 증식시킬 수 있다.

상기와 같이 해서 조제되는 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원 제시 세포를 T세포와 인비트로에서 접촉시킴으로써 그 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있다. 이것은 상기 항원 제시 세포와 T세포를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포를 액체 배지에 현탁하여 마이크로 플레이트의 웰 등의 용기에 넣고, 이것에 T세포를 첨가해서 배양함으로써 행할 수 있다. 공존 배양시의 항원 제시 세포와 T세포의 혼합 비율은 특별하게 한정되지 않지만, 통상 세포수의 비율로 1:1∼1:100 정도, 바람직하게는 1:5∼1:20 정도이다. 또한, 액체 배지 중에 현탁하는 항원 제시 세포의 밀도는 특별하게 한정되지 않지만, 통상 100∼1000만세포/ml 정도, 바람직하게는 10000∼100만세포/ml 정도이다. 공존 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 특별하게 한정되지 않지만, 통상 2일∼3주간, 바람직하게는 4일∼2주간 정도이다. 또한, 공존 배양은 IL-2, IL-6, IL-7 및 IL-12과 같은 인터류킨의 1종 또는 복수의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, IL-2 및 IL-7의 농도는 통상 5∼20U/ml 정도, IL-6의 농도는 통상 500∼2000U/ml 정도, IL-12의 농도는 통상 5∼20ng/ml 정도이지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 상기의 공존 배양은 신선한 항원 제시 세포를 추가해서 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 예를 들면, 공존 배양 후의 배양 상청을 버리고 신선한 항원 제시 세포의 현탁액을 첨가해서 공존 배양을 더 행한다고 하는 조작을, 1회 내지 수회 반복해도 좋다. 각 공존 배양의 조건은 상기와 같아도 좋다.

상기 공존 배양에 의해 그 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포가 유도되어 증식된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 이용하여 그 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합하는, 단리 T세포를 조제할 수 있다.

후술의 실시예에 기재되는 바와 같이, KATNAL1 유전자는 유방암 세포, 유방암 조직, 뇌종양 세포, 뇌종양 조직, 항문 주위 선암 조직, 항문 주위 선암 세포, 비만세포종 조직, 비만세포종 세포, 신경아종 세포, 간암 세포, 간암 조직, 전립선암 세포, 전립선암 조직, 폐암 세포, 폐암 조직, 갑상선암 세포, 갑상선암 조직 및 백혈병 세포에 특이적으로 발현되고 있다. 따라서, 이들 암종에 있어서는 KATNAL1 유전자가 정상 세포보다 유의하게 많이 존재하고 있다고 생각된다. 따라서 암 세포 내에 존재하는 KATNAL1의 폴리펩티드의 일부가 암 세포 표면 상의 MHC 분자에 제시되고, 상기와 같이 해서 조제한 세포장해성 T세포가 생체 내에 투여되면, 이것을 마커로 해서 세포장해성 T세포가 암 세포를 장해할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포는 생체 내에 있어서도 그 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있으므로, 그 항원 제시 세포를 생체 내에 투여함으로써도 암 세포를 장해할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 이용하여 조제된 상기 세포장해성 T세포나 상기 항원 제시 세포도 또한 본 발명의 면역 유도제 와 마찬가지로, 암의 치료 및/또는 예방제로서 유용하다.

상기한 단리 항원 제시 세포나 단리 T세포를 생체에 투여할 경우에는 이들 세포를 이물로서 공격하는 생체 내에서의 면역응답을 회피하기 위해서, 치료를 받는 환자로부터 채취한 항원 제시 세포 또는 T세포를 상기와 같이 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 이용하여 조제한 것이 바람직하다.

항원 제시 세포 또는 단리 T세포를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방제의 투여 경로는 정맥내 투여나 동맥내 투여와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 또한, 투여량은 증상이나 투여 목적 등에 따라 적당하게 선택되지만, 통상 1개∼10조개, 바람직하게는 100만개∼10억개이며, 이것을 수일 내지 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 제제는, 예를 들면 세포를 생리완충 식염수에 현탁한 것 등이면 좋고, 다른 항암제나 사이토카인 등과 병용할 수도 있다. 또한, 제제 분야에 있어서 주지의 1 또는 2 이상의 첨가제를 첨가할 수도 있다.

또한, 상기 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 대상 동물의 체내에서 발현시킴으로써도 그 생체 내에서 항체 산생이나 세포장해성 T세포를 유도할 수 있고, 폴리펩티드를 투여하는 것과 동등한 효과를 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 상기한 (a) 내지 (c)의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 그 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 포함하는 것이라도 좋다. 후술의 실시예에 나타내는 바와 같이, 이러한 항원 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터는 유전자 백신이라고도 불린다.

유전자 백신을 제조하기 위해서 사용하는 벡터는 대상동물 세포 내(바람직하게는 포유동물 세포 내)에서 발현 가능한 벡터이면 특별하게 한정되지 않고, 플러스미드 벡터라도 바이러스 벡터라도 좋고, 유전자 백신의 분야에서 공지의 어떠한 벡터를 사용해도 좋다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA나 RNA 등의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 또한, 벡터에의 그 폴리뉴클레오티드의 장착은 당업자에게 주지의 방법을 이용하여 행할 수 있다.

유전자 백신의 투여 경로는 바람직하게는 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여 경로이며, 투여량은 항원의 종류 등에 따라 적당하게 선택할 수 있지만, 통상 체중 1kg당 유전자 백신의 중량으로 0.1㎍∼100mg 정도, 바람직하게는 1㎍∼10mg 정도이다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스에, 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 장착하고, 이것을 대상 동물에 감염시키는 방법을 들 수 있다. 이 중에서 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.

기타의 방법으로서는, 발현 플러스미드를 직접 근육내에 투여하는 방법(DNA백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는, 유전자를 직접 체내에 도입하는 in vivo 방법, 및 대상동물로부터 소정 종류의 세포를 채취해 체외에서 유전자를 그 세포에 도입하고 그 세포를 체내에 되돌리는 ex vivo 방법이 있지만(닛케이 사이언스, 1994년 4월, p20-45, 월간 약사, 1994년, 제36권, 제1호, p.23-48, 실험의학증간, 1994년, 제12권, 제15호, 및 이것들의 인용문헌 등), in vivo 방법이 보다 바람직하다.

in vivo 방법에 의해 투여하는 경우에는 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여할 수 있다. in vivo 방법에 의해 투여하는 경우에는, 예를 들면 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효성분인 본 발명의 상기 펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 주사제 등으로 되고, 필요에 따라서 관용의 담체를 첨가해도 좋다. 또한, 그 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜(센다이바이러스(HVJ)-리포솜 등)에 있어서는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 「서열번호 1로 나타내어지는 염기서열」이라고 했을 경우에는 서열번호 1로 실제로 나타내어져 있는 염기서열 이외에, 이것과 상보적인 서열도 포함한다. 따라서, 「서열번호 1로 나타내어지는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 했을 경우에는, 서열번호 1로 실제로 나타내어져 있는 염기서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 및 이것들로 이루어지는 이중쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는 적당하게 어느 하나의 염기서열을 선택하게 되지만, 당업자라면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.

실시예 1: SEREX법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득

(1) cDNA 라이브러리의 제작

개의 정소로부터 산-구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid-guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, Zap-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(STRATAGENE사 제품)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1×10⁶pfu/ml이었다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 제작한 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여 면역스크리닝을 행하였다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트에 2340 클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 만들게 하여 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science사 제품)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 담그어 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청으로서는 항문근위 종양의 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행하였다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고 있지 않은 λZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가해 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthcare Bio-Science사 제품)에 통액하여 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜 대장균 및 파지에 흡착되는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 통과한 혈청 획분은 0.5% 탈지분유를 포함하는 TSB로 500배 희석하고, 이것을 면역스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 플롯한 멤브레인을 TSB-T(0.05% Tween20/TSB)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TSB로 5000배 희석을 행한 염소 항견 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제품)를 실온 1시간 반응시켜, NBT/BCIP 반응액(Roche사 제품)을 사용한 효소 발색반응에 의해 검출하고, 발색반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색반응 양성 콜로니가 단일화할 때까지 상기와 같은 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 9110개의 파지 클론을 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 서열 동일성 검색

상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기서열 해석에 제공하기 위해서 파지 벡터로부터 플러스미드 벡터로 전환하는 조작을 행하였다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제품) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3ml 첨가해 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하여 상청을 파지미드(phagemid) 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml) 함유 LB 한천배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(최종 농도 50㎍/ml) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(퀴아젠사 제품)를 사용하여 목적의 인서트를 가지는 플러스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플러스미드는 서열번호 13에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 14에 기재된 T7 프라이머를 이용하여 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전장 서열(full-length sequence)의 해석을 행하였다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열번호 1에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여 서열 동일성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 서열 동일성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 KATNAL1 유전자인 것이 밝혀졌다. 개 KATNAL1의 인간 상동인자인 인간 KATNAL1에서는 서열 동일성이 염기서열 95%, 아미노산 서열 98%이며, 마우스 상동인자인 마우스 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 85%, 아미노산 서열 94%, 소 상동인자인 소 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 91%, 아미노산 서열 97%, 말 상동인자인 말 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 87%, 아미노산 서열 88%, 닭 상동인자인 닭 KATNAL1에서는 서열 동일성은 염기서열 81%, 아미노산 서열 90%이었다. 인간 KATNAL1의 염기서열을 서열번호 3, 아미노산 서열을 서열번호 4로, 마우스 KATNAL1의 염기서열을 서열번호 5, 아미노산 서열을 서열번호 6으로, 소 KATNAL1의 염기서열을 서열번호 7, 아미노산 서열을 서열번호 8로, 말 KATNAL1의 염기서열을 서열번호 9, 아미노산 서열을 서열번호 10으로, 닭 KATNAL1의 염기서열을 서열번호 11, 아미노산 서열을 서열번호 12로 나타낸다.

(4) 각 조직에서의 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개, 인간 및 마우스의 정상조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50∼100mg 및 각 세포주 5∼10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제품)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제품)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 유전자 풀 cDNA(invitrogen사 제품), QUICK-Clone cDNA(클론테크사 제품) 및 Large-Insert cDNA Library(클론테크사 제품)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(개 프라이머는 서열번호 15 및 16, 인간 프라이머는 서열번호 17 및 18, 마우스 프라이머는 서열번호 19 및 20에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)를 이용하여 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행하였다. 비교 대조를 위해 GAPDH 특이적인 프라이머(개 및 인간GAPDH 프라이머는 서열번호 21 및 22, 마우스 GAPDH 프라이머는 서열번호 23 및 24에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 개 KATNAL1 유전자는 건강한 개 조직에서는 대부분의 조직에서 발현이 보이지 않고, 한편 개 종양 조직에서는 강한 발현이 보여졌다. 인간 및 마우스 KATNAL1 유전자의 발현도 개 KATNAL1 유전자와 마찬가지로, 인간 및 마우스 정상조직에서는 거의 발현을 확인할 수 없고, 암 세포에서는 대부분의 세포주에서 발현이 검출되었다(도 2, 도 3).

(5) 각 조직에서의 정량적 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 인간의 정상조직에 있어서의 발현을 정량적 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 인간 정상조직 및 암 조직의 cDNA는 Tissue scan Real Time cancer survey Panel I(ORIGENE사 제품)을 사용했다. 또한 정량 RT-PCR은 BIO RAD사 제품의 CFX96 Real Time Cystem-C1000 Thermal Cycler를 이용하여 실시했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열번호 17 및 18에 기재)를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 즉, cDNA 샘플 5㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 2×SYBR Premix Ex TaqII 폴리메라아제(다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)의 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 20㎕로 하고, 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행하였다. 그 결과, KATNAL1 유전자는 유방암, 대장암, 갑상선암, 간암, 전립선암, 폐암에 있어서 각각의 정상조직과 비교해서 전부 5배 이상 발현이 높았다. 본 결과는 인간 KATNAL1을 표적으로 한 항종양제가 정상조직에서의 부작용을 전혀 걱정할 일 없고, 약제의 약효와 부작용의 큰 괴리를 기대시킨다.

실시예 2: KATNAL1의 생체 내에서의 암 항원성의 해석

(1) 생체 내에서 KATNAL1을 발현하는 재조합 벡터의 제작

서열번호 5의 염기서열을 기초로, 이하의 방법으로 생체 내에서 KATNAL1을 발현하는 재조합 벡터를 제작했다. PCR은 실시예 1에 있어서 발현이 보여진 마우스 암 세포주 N2a(ATCC로부터 구입)로 조제했다. cDNA를 1㎕, HindIII 및 XbaI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 25 및 26에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)를 이용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 5의 아미노산 서열 전장(full-length)을 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 이용하여 약 1500bp의 DNA 단편을 정제했다.

정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질전환 후 플러스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플러스미드를 HindIII 및 XbaI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 HindIII, XbaI 제한효소로 처리한 포유류 발현 벡터 pcDNA 3.1(invitrogen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 포유류의 세포 내에서 KATNAL1 단백질이 산생된다.

상기에서 제작한 플러스미드 DNA 100㎍에 50㎍의 금 입자(Bio Rad사 제품), 스페르미딘 100㎕(SIGMA사 제품), 1M CaCl₂ 100㎕(SIGMA사 제품)를 첨가하고, 와류에 의해 교반하여 10분 실온에서 정치했다(이후, 금-DNA 입자라 기재한다). 3000rpm으로 1분 원심한 후, 상청을 버리고 100% 에탄올(WAKO사 제품)에 의해 3회 세정했다. 금-DNA 입자에 100% 에탄올 6ml를 첨가하여 와류에 의해 충분하게 교반한 후, 금-DNA 입자를 Tefzel Tubing(Bio Rad사 제품)에 흘려 넣고, 벽면에 침전시켰다. 금-DNA 입자가 부착된 Tefzel Tubing의 에탄올을 바람으로 건조하고, 유전자총에 적합한 길이로 잘랐다.

(2) DNA 백신법에 의한 KATNAL1의 항종양 효과

10마리의 A/J 마우스(7주령, 수컷, 일본 SLC사에서 구입) 및 Balb/c 마우스(7주령, 수컷, 일본 SLC사에서 구입)에 대하여 상기에서 제작한 튜브를 유전자총에 고정하고, 순 헬륨가스를 이용하여 400psi의 압력으로, 체모(剃毛)한 마우스의 복강에 DNA 백신을 7일마다 합계 3회 경피 투여한 후에(플러스미드 DNA 접종량은 2㎍/마리로 된다) 마우스 신경아종 세포주 N2a 세포, 대장암 세포주 CT26을 각각 1×10⁶개를 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 컨트롤로서 KATNAL1 유전자가 삽입되어 있지 않은 플러스미드 DNA를 각 모델에서 10마리씩 투여했다.

항종양 효과는 종양의 크기(장경×단경²/2) 및 생존 마우스의 비율로 평가했다. 본 검토의 결과, 신경아종 세포주를 사용한 예방 모델에 있어서 43일 후에는, 컨트롤군 및 KATNAL1 플러스미드 투여군에서 각각, 2886mm³, 659mm³로 되고, KATNAL1 플러스미드 투여군에서는 종양의 현저한 퇴축이 관찰되었다. 또한, 생존의 경과를 관찰한 결과, 신경아종 세포주를 사용한 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여 후 76일에서 전례 사망한 것에 대해, KATNAL1 플러스미드 투여군에서는 60%의 마우스가 생존하고 있었다. 이상의 결과로부터 KATNAL1 플러스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되었다. 마찬가지로, 대장암 세포주를 사용한 예방 모델에 있어서도 35일 후에는 컨트롤군 및 KATNAL1 플러스미드 투여군에서 각각, 2598mm³, 763mm³로 되고, KATNAL1 플러스미드 투여군에서는 종양의 현저한 퇴축이 관찰되었다. 또한, 생존의 경과를 관찰한 결과, 컨트롤군에서는 투여 후 50일에서 전례 사망한 것에 대해, KATNAL1 플러스미드 투여군에서는 50%의 마우스가 생존하고 있었다. 이상의 결과로부터, KATNAL1 플러스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되었다.

실시예 3: 인간 재조합 KATNAL1 단백질의 제작 및 면역 유도능의 평가

(1) 인간 재조합 KATNAL1 단백질의 제작

서열번호 3의 유전자를 기초로, 이하의 방법으로 인간 KATNAL1의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, EcoRI 및 XhoI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 27 및 28에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(다카라 슈조사 제품)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)를 이용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 4의 아미노산 서열 전장을 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 이용하여 약 1500bp의 DNA 단편을 정제했다.

정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(invitrogen사 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질전환 후 플러스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플러스미드를 EcoRI 및 XhoI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후, 목적 유전자 서열을 EcoRI, XhoI 제한효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30a(Novagen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플러스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)로 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.

(2) 재조합 KATNAL1 단백질의 정제

상기에서 얻어진 서열번호 4를 발현하는 재조합 대장균을 100㎍/ml 암피실린 함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7 부근이 될 때까지 37℃로 배양 후, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 더 배양했다. 그 후 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 펠릿을 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행하였다.

이 균체를 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고, 빙상에서 초음파파쇄를 행하였다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm으로 20분간 원심분리하여, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.

불용성 획분을 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)으로 현탁해 6000rpm으로 15분간 원심했다. 본 조작을 2회 반복하고, 탈(脫)프로테아제 조작을 행하였다.

이 잔사를 6M 구아니딘 염산염, 0.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)에 현탁하고, 4℃에서 20시간 정치해 단백질을 변성시켰다. 이 변성 조작 후 6000rpm으로 30분간 원심하여 얻어진 가용성 획분을 정법에 따라서 조제한 니켈 킬레이트 컬럼[담체: Chelateing Sepharose(상표) Fast Floｗ(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액: 6M 구아니딘 염산염, 0.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)]에 첨가하고, 또한 4℃에서 밤새 정치하여 니켈 킬레이트화한 담체에의 흡착을 행하였다. 이 컬럼 담체를 1500rpm으로 5분간 원심하여 상청을 회수하고, 컬럼 담체에 대해서는 인산 완충화 생리식염수로 현탁 후, 컬럼에 재충전했다.

컬럼 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH4.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH3.0)으로 용출을 행해 정제 획분으로 하고, 이후 이 정제 획분을 투여 시험용의 재료로 했다. 또한, 각 용출 획분 중의 목적 단백질은 정법에 따라 행한 쿠마씨 염색에 의해 확인했다.

상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품을 반응용 완충액[50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 5mM CaCl₂(pH8.0)]으로 치환한 후, FactorXa Cleavage Capture Kit(Novagen사 제품)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라서 FactorXa 프로테아제에 의한 His 태그의 절단 및 목적 단백질의 정제를 행하였다. 이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품 12ml를 한외여과 NANOSEP 10K OMEGA(PALL사 제품)를 이용하여 생리용 인산 완충액(닛스이 세이야쿠사 제품)으로 치환한 후, HT 터프린 아크로디스크 0.22㎛ (PALL사 제품)로 무균 여과를 행하고, 이것을 실험에 사용했다.

(3) 인간 재조합 KATNAL1 단백질 반응성의 CD8 양성 세포장해성 T세포의 유도

건강한 사람으로부터 말초혈를 분리하고, Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika, Durham, NC)에 중층해서 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심분리했다. 말초혈 단핵구(PBMC)를 함유하는 획분을 회수하고, 냉인산염 완충액 중에서 3회(또는 그 이상) 세정하여 PBMC를 얻었다. 얻어진 PBMC를 AIM-V 배지(Life Technololgies, Inc., 미국 뉴욕주 Grand Island) 20ml에 현탁하고, 배양 플라스크(Falcon) 중에 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 2시간 부착시켰다. 비부착 세포는 T세포 조제에 사용하고, 부착 세포는 수상세포를 조제하기 위해서 사용했다.

한편, 부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/ml) 및 GM-CSF(1000U/ml)의 존재 하에서 배양했다. 6일 후에 얻어진 비부착 세포집단을 회수하고, 인간 재조합 KATNAL1 단백질을 10㎍/ml의 농도로 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, IL-4(1000U/ml), GM-CSF(1000U/ml), IL-6(1000U/ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1β(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA) 및 TNF-α (10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 첨가한 AIM-V 배지로 교환해서 2일간 더 배양한 후 얻어진 비부착 세포집단을 수상세포로서 사용했다.

조제한 수상세포를 AIM-V 배지 중에 1×10⁶세포/ml의 세포 밀도로 현탁하고, 인간 재조합 KATNAL1 단백질을 다시 10㎍/ml의 농도로 첨가하여 96구멍 플레이트를 이용하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, X선 조사(3000rad)하고, AIM-V 배지에서 세정하고, 10% 인간 AB혈청(Nabi, Miami, FL), IL-6(1000U/ml ) 및 IL-12(10ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지에서 현탁하여 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가했다. 또한, 조제한 T세포 집단을 1구멍당 각각 1×10⁶세포 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양했다. 7일 후, 각각의 상청을 버리고 상기와 마찬가지로 인간 재조합 단백질로 처리 후 X선 조사한 수상세포를 10% 인간 AB혈청(Nabi, Miami, FL), IL-7(10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) 및 IL-2(10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지에서 현탁해(세포밀도: 1×10⁵세포/ml ) 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가하고, 또한 배양했다. 같은 조작을 7일 간격으로 4∼6회 반복한 후에 자극된 T세포를 회수하고, 플로우 사이토메트리에 의해 CD8 양성 T세포의 유도를 확인했다.

또한, 음성 컨트롤로서 본 발명의 범위 밖의 서열인 단백질(서열번호 29)을 사용했다.

이어서, 본 폴리펩티드에서 자극된 CD8 양성 T세포를 발현하는 종양세포를 장해할 수 있을지를 검토했다.

발현이 확인된 악성 뇌종양 세포주, T98G[Stein GH et al., J. Cell Physiol., 99: 43-54(1979), ATCC로부터 구입]를 10⁵개를 50ml 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 인간 AB혈청을 포함하는 AIM-V 배지에서 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가하고, 또한 이것에 뒤에 10% 인간 AB혈청을 포함하는 AIM-V 배지에서 현탁된 10⁵, 5×10⁴, 2.5×10⁴ 및 1.25×10⁴개의 인간 재조합 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포를 각각 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 감마 카운터를 이용하여 측정함으로써 인간 재조합 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 산출했다.

그 결과, 인간 재조합 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포가 T98G에 대한 세포장해활성을 갖는 것이 밝혀졌다. 한편, 음성 컨트롤 단백질(서열번호 29)을 사용해서 유도한 CD8 양성 T세포는 세포장해활성을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 인간 재조합 단백질은 종양세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포장해성 T세포를 유도하는 능력이 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 세포장해활성은 상기한 바와 같이 자극 유도된 CD8 양성 T세포 10⁵개와 크롬 51을 도입시킨 10³개의 악성 뇌종양 세포주 T98G를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬 51의 양을 측정하여 식 1에 의해 산출한 CD8 양성 T세포의 T98G에 대한 세포장해활성을 나타낸다.

식 1: 세포장해활성(%)=CD8 양성 T세포를 첨가했을 때의 T98G로부터의 크롬 51 유리량(cpm)÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량(cpm)×100.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명은 각종 암에 대하여 항종양 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 유도제를 제공하기 때문에 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Immunity-inducing Agent <130> 12068 <160> 29 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1760 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (97)..(1569) <223> <400> 1 gccgccccag ctgcagggcc tcgggcctgc ggcgcctctg accctcccag gttgctgctg 60 ccgctcggtg ccgaacctgt aggtctctgc aagaag atg aat ttg gct gag att 114 Met Asn Leu Ala Glu Ile 1 5 tgt gac aat gca aag aaa gga aga gaa tat gca ctt ctt ggg aac tat 162 Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly Arg Glu Tyr Ala Leu Leu Gly Asn Tyr 10 15 20 gac tca tca atg gta tat tac cag ggg gtg ata cag cag att cag aga 210 Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val Ile Gln Gln Ile Gln Arg 25 30 35 cat tgc cag tca gtc aga gac cca gct gtc aaa ggc aaa tgg caa cag 258 His Cys Gln Ser Val Arg Asp Pro Ala Val Lys Gly Lys Trp Gln Gln 40 45 50 gtt cgg cag gaa tta ttg gaa gaa tat gaa caa gtt aaa aac att gtc 306 Val Arg Gln Glu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu Gln Val Lys Asn Ile Val 55 60 65 70 agc act ttg gag agt ttt aaa atg gac aag ccc cca gat ttc cct gtg 354 Ser Thr Leu Glu Ser Phe Lys Met Asp Lys Pro Pro Asp Phe Pro Val 75 80 85 tcc tgt caa gat gaa cca ttt aga gat cct gct gtt tgg cca ccc cct 402 Ser Cys Gln Asp Glu Pro Phe Arg Asp Pro Ala Val Trp Pro Pro Pro 90 95 100 gta cct gca gaa cac aga gct cca cct cag ata agg cgt ccc aat cga 450 Val Pro Ala Glu His Arg Ala Pro Pro Gln Ile Arg Arg Pro Asn Arg 105 110 115 gaa gta aga cct ctg agg aaa gaa atg cca gga gta gga gcc cgg gga 498 Glu Val Arg Pro Leu Arg Lys Glu Met Pro Gly Val Gly Ala Arg Gly 120 125 130 cct gta ggc cga gca cat cct ata tca aag ggt gaa aaa ccc tct aca 546 Pro Val Gly Arg Ala His Pro Ile Ser Lys Gly Glu Lys Pro Ser Thr 135 140 145 150 agt aga gac aag gat tat aga gca aga gga aga gat gat aag gga agg 594 Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Arg Ala Arg Gly Arg Asp Asp Lys Gly Arg 155 160 165 aag aat atg cat gat ggt gcg agc gat ggt gaa att cct aaa ttt gat 642 Lys Asn Met His Asp Gly Ala Ser Asp Gly Glu Ile Pro Lys Phe Asp 170 175 180 ggt gct ggg tat gat aag gat ctg gtg gaa gcc ctg gag aga gac att 690 Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp Ile 185 190 195 gta tcc agg aat ccc agc att cat tgg gat gac ata gca gat ctg gaa 738 Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu Glu 200 205 210 gaa gct aag aag ttg cta agg gaa gct gtt gtt ctt cca atg tgg atg 786 Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp Met 215 220 225 230 cct gac ttt ttc aaa ggg att aga agg cca tgg aag ggt gta ctg atg 834 Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu Met 235 240 245 gtt gga ccc ccg ggc act ggt aag act atg cta gct aaa gct gtt gcc 882 Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met Leu Ala Lys Ala Val Ala 250 255 260 act gaa tgt ggc aca aca ttc ttc aat gtt tca tct tct aca ctg aca 930 Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr 265 270 275 tct aaa tat aga ggt gaa tct gag aag tta gtc cgt ctg ttg ttt gaa 978 Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu 280 285 290 atg gct aga ttt tat gcg ccc act acg atc ttc atc gat gaa ata gat 1026 Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Thr Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp 295 300 305 310 tct atc tgt agt cga aga gga acc tca gat gaa cat gag gca agt cgc 1074 Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp Glu His Glu Ala Ser Arg 315 320 325 aga gtc aag tct gaa cta ctc att cag atg gat gga gtt gga gga gct 1122 Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Ile Gln Met Asp Gly Val Gly Gly Ala 330 335 340 tta gag aat gat gat cct tcc aaa atg gtt atg gta ttg gcc gct act 1170 Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala Thr 345 350 355 aat ttc cca tgg gac att gat gaa gct ttg aga agg aga tta gaa aag 1218 Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys 360 365 370 agg ata tat ata cct ctc cca aca gca aaa gga aga act gag ctg ctg 1266 Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr Ala Lys Gly Arg Thr Glu Leu Leu 375 380 385 390 aag att aat ctt cgt gaa gtt gaa ctg gat cct gac att caa ctg gaa 1314 Lys Ile Asn Leu Arg Glu Val Glu Leu Asp Pro Asp Ile Gln Leu Glu 395 400 405 gat ata gca gag aag ata gag ggc tat tct ggt gct gat ata act aat 1362 Asp Ile Ala Glu Lys Ile Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn 410 415 420 gtt tgc agg gat gcc tct tta atg gca atg aga cgg cga atc aat ggc 1410 Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn Gly 425 430 435 tta ggt cca gaa gag atc cgt gca ctt tct aaa gag gaa ctt cag atg 1458 Leu Gly Pro Glu Glu Ile Arg Ala Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Met 440 445 450 cct gtt acc aaa gga gac ttt gaa ttg gct ctt aag aaa att gct aag 1506 Pro Val Thr Lys Gly Asp Phe Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ile Ala Lys 455 460 465 470 tct gtc tct gct gca gac ttg gag aag tat gaa aaa tgg atg gtc gaa 1554 Ser Val Ser Ala Ala Asp Leu Glu Lys Tyr Glu Lys Trp Met Val Glu 475 480 485 ttt gga tct gct tga atttctgtca gctctttcat ttctggtatt tttatttata 1609 Phe Gly Ser Ala 490 aaatgtgaag aaattccctg caattttttt aaaaaaacaa gtttagaact tttcattgga 1669 gagacttttc ccttaaagga aaaaacctaa aaccacaaag aatataaata tagctgggaa 1729 agaagaaaag cttacatagg gagcctgata g 1760 <210> 2 <211> 490 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Met Asn Leu Ala Glu Ile Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly Arg Glu Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val 20 25 30 Ile Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Val Arg Asp Pro Ala Val 35 40 45 Lys Gly Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu 50 55 60 Gln Val Lys Asn Ile Val Ser Thr Leu Glu Ser Phe Lys Met Asp Lys 65 70 75 80 Pro Pro Asp Phe Pro Val Ser Cys Gln Asp Glu Pro Phe Arg Asp Pro 85 90 95 Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg Ala Pro Pro Gln 100 105 110 Ile Arg Arg Pro Asn Arg Glu Val Arg Pro Leu Arg Lys Glu Met Pro 115 120 125 Gly Val Gly Ala Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala His Pro Ile Ser Lys 130 135 140 Gly Glu Lys Pro Ser Thr Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Arg Ala Arg Gly 145 150 155 160 Arg Asp Asp Lys Gly Arg Lys Asn Met His Asp Gly Ala Ser Asp Gly 165 170 175 Glu Ile Pro Lys Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu 180 185 190 Ala Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His Trp Asp 195 200 205 Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val 210 215 220 Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro 225 230 235 240 Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met 245 250 255 Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val 260 265 270 Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu 275 280 285 Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Thr Thr Ile 290 295 300 Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp 305 310 315 320 Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Ile Gln Met 325 330 335 Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val 340 345 350 Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr Ala Lys 370 375 380 Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu Val Glu Leu Asp 385 390 395 400 Pro Asp Ile Gln Leu Glu Asp Ile Ala Glu Lys Ile Glu Gly Tyr Ser 405 410 415 Gly Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met 420 425 430 Arg Arg Arg Ile Asn Gly Leu Gly Pro Glu Glu Ile Arg Ala Leu Ser 435 440 445 Lys Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Lys Gly Asp Phe Glu Leu Ala 450 455 460 Leu Lys Lys Ile Ala Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Leu Glu Lys Tyr 465 470 475 480 Glu Lys Trp Met Val Glu Phe Gly Ser Ala 485 490 <210> 3 <211> 7536 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (132)..(1604) <223> <400> 3 ccttttcacg cgcgtcgcga gctaacggac tcggcggcgg cggcggcggc ggcctgcgcc 60 ccacccgcac cccatctgga ccgcatcgct gaatgtgccc ggacctgcgc cttctgggtc 120 tctgaaagaa g atg aat ttg gct gag att tgt gat aat gca aag aaa gga 170 Met Asn Leu Ala Glu Ile Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly 1 5 10 aga gaa tat gcc ctt ctt gga aat tac gac tca tca atg gta tat tac 218 Arg Glu Tyr Ala Leu Leu Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr 15 20 25 cag ggg gtg atg cag cag att cag aga cat tgc cag tca gtc aga gat 266 Gln Gly Val Met Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Val Arg Asp 30 35 40 45 cca gct atc aaa ggc aaa tgg caa cag gtt cgg cag gaa tta ttg gag 314 Pro Ala Ile Lys Gly Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Leu Glu 50 55 60 gaa tat gaa caa gtt aaa agt att gtc agc act tta gaa agt ttt aaa 362 Glu Tyr Glu Gln Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Leu Glu Ser Phe Lys 65 70 75 att gac aag cct cca gat ttc cct gtg tcc tgt caa gat gaa cca ttt 410 Ile Asp Lys Pro Pro Asp Phe Pro Val Ser Cys Gln Asp Glu Pro Phe 80 85 90 aga gat cct gct gtt tgg cca ccc cct gtt cct gca gaa cac aga gct 458 Arg Asp Pro Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg Ala 95 100 105 cca cct cag atc agg cgt ccc aat cga gaa gta aga cct ctg agg aaa 506 Pro Pro Gln Ile Arg Arg Pro Asn Arg Glu Val Arg Pro Leu Arg Lys 110 115 120 125 gaa atg gca gga gta gga gcc cgg gga cct gta ggc cga gca cat cct 554 Glu Met Ala Gly Val Gly Ala Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala His Pro 130 135 140 ata tca aag agt gaa aag cct tct aca agt agg gac aag gac tat aga 602 Ile Ser Lys Ser Glu Lys Pro Ser Thr Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Arg 145 150 155 gca aga ggg aga gat gac aag gga agg aag aat atg caa gat ggt gca 650 Ala Arg Gly Arg Asp Asp Lys Gly Arg Lys Asn Met Gln Asp Gly Ala 160 165 170 agt gat ggt gaa atg cca aaa ttt gat ggt gct ggt tat gat aag gat 698 Ser Asp Gly Glu Met Pro Lys Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp 175 180 185 ctg gtg gaa gcc ctt gaa aga gac att gta tcc agg aat cct agc att 746 Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile 190 195 200 205 cat tgg gat gac ata gca gat ctg gaa gaa gct aag aag ttg cta agg 794 His Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg 210 215 220 gaa gct gtt gtt ctt cca atg tgg atg cct gac ttt ttc aaa ggg att 842 Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile 225 230 235 aga agg cca tgg aag ggt gta ctg atg gtt gga ccc cca ggc act ggt 890 Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly 240 245 250 aaa act atg cta gct aaa gct gtt gcc act gaa tgt ggt aca aca ttc 938 Lys Thr Met Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe 255 260 265 ttc aac gtt tcg tct tct aca ctg aca tct aaa tac aga ggt gaa tct 986 Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser 270 275 280 285 gag aag tta gtt cgt ctg ttg ttt gag atg gct aga ttt tat gcc cct 1034 Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro 290 295 300 acc acg atc ttc att gat gag ata gat tct atc tgc agt cga aga gga 1082 Thr Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly 305 310 315 acc tct gat gaa cat gag gca agt cgc agg gtc aag tct gaa ctg ctc 1130 Thr Ser Asp Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu 320 325 330 att cag atg gat gga gtt gga gga gct tta gaa aat gat gat cct tcc 1178 Ile Gln Met Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser 335 340 345 aaa atg gtt atg gta ttg gct gct act aat ttc ccg tgg gac att gat 1226 Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp 350 355 360 365 gaa gct ttg cga aga agg tta gaa aaa agg ata tat ata cct ctc cca 1274 Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro 370 375 380 aca gca aaa gga aga gct gag ctt ctg aag atc aac ctt cgt gag gtc 1322 Thr Ala Lys Gly Arg Ala Glu Leu Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu Val 385 390 395 gaa tta gat cct gat att caa ctg gaa gat ata gcc gag aag att gag 1370 Glu Leu Asp Pro Asp Ile Gln Leu Glu Asp Ile Ala Glu Lys Ile Glu 400 405 410 ggc tat tct ggt gct gac atc act aat gtt tgc agg gat gcc tct tta 1418 Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu 415 420 425 atg gca atg aga cgg cgt atc aat ggc tta agt cca gaa gaa atc cgt 1466 Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ile Arg 430 435 440 445 gca ctt tct aaa gag gaa ctt cag atg cct gtt acc aaa gga gac ttt 1514 Ala Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Lys Gly Asp Phe 450 455 460 gaa ttg gcc cta aag aaa att gct aag tct gtc tct gct gca gac ttg 1562 Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ile Ala Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Leu 465 470 475 gag aag tat gaa aaa tgg atg gtt gaa ttt gga tct gct tga 1604 Glu Lys Tyr Glu Lys Trp Met Val Glu Phe Gly Ser Ala 480 485 490 atttctgtca gctctttaat ttctggtatt tttgttgata aaatacgaag aaattcctgc 1664 aatttttaaa aaacaagttt ggaatttttt tcagtggagt ggttttcgct taaaggaaaa 1724 aaaaatctaa aactgcgaag aatactaaat gtagttgaga aataattgat ggcgagagtt 1784 tgctagtctc cctccccggc tttgtgctgg tattccacgt attcctgcat taatattgca 1844 cacccaaacc agtctatcag ggaggctgaa gcaagggcgc agtgtgatat tttaggaata 1904 cagaagattt agaaataccc ctatttctca tttgcagttt ttttttccaa ttctgtgctc 1964 tgtcaacatg agggacctat ctatgtatgt tgacttttaa catcaaaatt ggatttgtgt 2024 caaacattca ttgttaagag aagaatgaca gtatattttg gaggaaataa tgaatttact 2084 aattaaacct ttagaattta tgacttactg ttagagtctg tcatatggtt agaattttta 2144 cttccgctac ccctgccatt tcttctgcta gctacttcat aatatcttga gctttactga 2204 ggaatattct cacgctctgt ggtatttgaa tcattttgcc aggtcatttc tctgtcttta 2264 gtattttttg ctggtgcttc ttacatttaa tatggaaagg tgggaagaat attactgcat 2324 tagatgtaat tcttcattct agacttccaa gtttgttttc acttttttgt gtgtgcgtga 2384 aggagtctgt gtcacccagg ctgtgtagtg cagtggttga tcttggctca ctgcaacctc 2444 tgcctcctag attcaagcaa ttctcctgtc tcagcctccc aagtagctgg gattacaggt 2504 gcgcaccacc atgcctggct gtgttttcac ttttctttca acatgttcaa ccagatatat 2564 agccattatt tttctcagct ccagcattgt ttgatttttc ttgagtttga ttttagtatt 2624 tgagataaat acttttacat tctaaacaag tccactctct gtggctaacg caaaacaaat 2684 gaaatcttta ttgttttcca aacagctagt ttaacaaaac agcatcatac atagtgaatg 2744 atgttcattg gaaaattcta aaatttgtcc ttgtctaggt tgagaacttt tacacacact 2804 aagataaaga tagaaatctg acatgctcac tcaattcagc aggaattaca cattagaaag 2864 aagccagaaa aataaatggc atatatccaa tcacaagtaa atgatcctgg cgttagtttt 2924 tatgattaca tgtgtctcat taggcaattt atgctttaat ggtcaagctt ttaaaaattt 2984 gtatttgata acatcctgaa ttctcagttt cgaatagtgc ctactggttt aaaactaaaa 3044 ataatacagc tttttggaca tttaaccaag atactaagaa ggtttttttt aaaaaaagag 3104 atttgattat ttttccctgc taaaaactgt aaatgcctta tgttcttttc agataactta 3164 agtctgacct aaactccagt attcatctga tgctgtaaat tgcccttctt tctgagacac 3224 agattataag atgccagatc ataagacatc atgattttat tgtaattgaa ttcttcctaa 3284 aaattgagag gtttcctttt attaactttt aaaataaaga aataagtagt ttcattacga 3344 ttattttgca aactattgcc agtcagaaat gcactttttt tttccctgaa gttttaggag 3404 ccgtcactaa aacattagtc ttgtgattgt taaaacttgt ttgtaatggg ttggtgcaaa 3464 agtaattgtg gtttttccat tactttcaat ggcaaaaacc gcaattactt ttgcaccagc 3524 ctaacaatag ttgattagtt agaccttttc tgggttttgt attgattatc ttggtgtgca 3584 tttaattatt tttctgaatt cttcatggat aatgacatag taattgtgat tcttttaata 3644 ccagttaagc agtatttggc aacttaaact tcctgggagc ctaactttac tatgttaagt 3704 gagtcaggtg tgctttttat ttcccttgtt tctcattttg ccctgtcagt ggatggtaga 3764 tgctttgtat atcttaaatc ccttaaagga tcttaaagac atccctcagg tgttctattt 3824 aacttttatt ttattttatt ttatttattt atttattttg agactgagtc ttgctctgtc 3884 gcccaggctg gagtgcagtg gcatgatctc ggctcactgc aacttctgcc tcccaggttc 3944 aagccattct cctgcctcgg cctcctgagt agctgggatt acagttgccg ccacacccgg 4004 cttatttttt tgtattttta gtagaggcag agtttcacca tgttggccag gctagtctcg 4064 aactcctgac ctcagatgat ccgcccacat tggcctccca aagtgctggg attacaggtg 4124 tgatccaccg cacctggccc taacttttaa tatacaacac acacacacac acacacacac 4184 acacacacac acacacacac acacacacac acactatttc agaagacagt gtgttgcctt 4244 acccagaatg agtgctagga ttacaggcgt gagacagaca cacatacaca cacatacaca 4304 cacacagagt ctttattgca gaagacagtg tgttgcctta taggcgtgag acacacacac 4364 acacacacac acacacacac acacacacag tctttattgc agaagacagt gtgttgcctt 4424 accagaatga gtgcttggat tacaggcgtg agccactgtg cccagcccta acttttaatg 4484 tacatcacac acacactcac actcacatac acacacacac acacactctg actgtcttta 4544 ttgcagaaga cagtgtgttg ccttacccag aatgagattg aattgttttg cttcgttttg 4604 ttttgttatt cagtgttgcg gtagcagatg cattatcaaa ggaaaaatat ttggctcctt 4664 taattcctct gaaaacatga gtattttgag ttctgcagca caatgactgt aggactaagc 4724 taagtctgct ttgcagatat ctgatcagat agtcccttca ttctgtagac gtgtattggt 4784 tggtccaaga cacagtgagt aggagctctg tggaccaaga caaagctgga ctagagagta 4844 cagttcaaac ttggcagttt ctctaacgac tctgtatagc ttctggcttc tactactgaa 4904 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atttcatgtt gtgtgagtgg acttcggttc cttcagtatt gtctaggtta ttgagtcttt 5804 ctttgcctaa tagtggattc ccactcttaa gataactttt attagtgata aatcagttta 5864 gggtatattc tgtatgacag gcataaaatg ttaagggtga atgctggcct tttccaagaa 5924 aaggccacct taacttgtat gaggaaaaaa tcctaactat tctctttttt gtatcttttt 5984 ttccgtaact gttttgattg tatattttaa agaaaccact taatttgtga tgcacgtaat 6044 atttgtgtga acctgagaat atgtcacaat aggaaaaagc agaaattata cttaggggac 6104 atgttagggg ggtaaaaata tttaagcctc gaatgtttta ctgtcatctc cactaactat 6164 ttttacagaa aaagctaaaa actctgttgt aattattgta agtttactta tttatacttt 6224 taaattaggc ttttcatact taaatttttt tgacatttgc ttttaatatt tgtttcttaa 6284 tgtggaaatt gtgtatttta ataatcaaat tattaggata atagatatat ttttaaacat 6344 tcacctcatt aacaaataga tctttgaatt tttattaggt tttttggctc cagacaactg 6404 tttagcttta atgatatttc taaattccca gtgacttatt aataaaaaca ggaaaaatat 6464 ttaggtaatg tcataaaatt tattttacct ttctcatttt ctgagaaaat aaatgaaaaa 6524 aaccctagat attgctttat taccaacagt gtgtaggttt ttgtacatat ggaaatttga 6584 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tttgtgctgc tactttgcta atctcattag cttagctgtg tttgtgcata ggttatattt 7484 ggtaataaat ttatagagtg ttggttgtca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7536 <210> 4 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asn Leu Ala Glu Ile Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly Arg Glu Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val 20 25 30 Met Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Val Arg Asp Pro Ala Ile 35 40 45 Lys Gly Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu 50 55 60 Gln Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Leu Glu Ser Phe Lys Ile Asp Lys 65 70 75 80 Pro Pro Asp Phe Pro Val Ser Cys Gln Asp Glu Pro Phe Arg Asp Pro 85 90 95 Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg Ala Pro Pro Gln 100 105 110 Ile Arg Arg Pro Asn Arg Glu Val Arg Pro Leu Arg Lys Glu Met Ala 115 120 125 Gly Val Gly Ala Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala His Pro Ile Ser Lys 130 135 140 Ser Glu Lys Pro Ser Thr Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Arg Ala Arg Gly 145 150 155 160 Arg Asp Asp Lys Gly Arg Lys Asn Met Gln Asp Gly Ala Ser Asp Gly 165 170 175 Glu Met Pro Lys Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu 180 185 190 Ala Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His Trp Asp 195 200 205 Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val 210 215 220 Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro 225 230 235 240 Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met 245 250 255 Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val 260 265 270 Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu 275 280 285 Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Thr Thr Ile 290 295 300 Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp 305 310 315 320 Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Ile Gln Met 325 330 335 Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val 340 345 350 Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr Ala Lys 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Ser Ser Met Val Tyr 15 20 25 tac cag gga gtg ata cag cag atc cag aga cac tgc cag tca ctg aga 268 Tyr Gln Gly Val Ile Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Leu Arg 30 35 40 gac ccg gcc acc aaa gcc aag tgg cag cag gta cgg cag gaa ctc ttg 316 Asp Pro Ala Thr Lys Ala Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Leu 45 50 55 60 gaa gaa tat gaa cag gtt aag agt atc gtc agc act tta gaa agc ttt 364 Glu Glu Tyr Glu Gln Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Leu Glu Ser Phe 65 70 75 aag atg gac aag ccc cct gac ttc ccc gtg tct tgc cga gat gaa ccg 412 Lys Met Asp Lys Pro Pro Asp Phe Pro Val Ser Cys Arg Asp Glu Pro 80 85 90 ttt aga gac cct gca gta tgg cca ccc cct gtc cct gcg gaa cac aga 460 Phe Arg Asp Pro Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg 95 100 105 gca ccc cct caa atc agg cgt cca aat cgc gaa gtg agg cct ctg cgg 508 Ala Pro Pro Gln Ile Arg Arg Pro Asn Arg Glu Val Arg Pro Leu Arg 110 115 120 aaa gac gtg ggg gca gga gcc cgg gga ctc gtg ggc cga gca cac cag 556 Lys Asp Val Gly Ala Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly Arg Ala His Gln 125 130 135 140 ata tcg aag agt gac aaa cct gca agt cgg gac aag gac tat aga gca 604 Ile Ser Lys Ser Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Lys Asp Tyr Arg Ala 145 150 155 aga ggg aga gat gac aag gca agg aaa aat gtg caa gat ggt gca agt 652 Arg Gly Arg Asp Asp Lys Ala Arg Lys Asn Val Gln Asp Gly Ala Ser 160 165 170 gac agc gag att ccc aag ttt gat ggc gcc ggg tat gat aag gat ctg 700 Asp Ser Glu Ile Pro Lys Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu 175 180 185 gtg gaa gcc ctg gag agg gac att gtg tcc agg aac cct agc att cac 748 Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His 190 195 200 tgg gat gac ata gca gac ctg gag gag gct aag aag ttg ctc cgg gaa 796 Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu 205 210 215 220 gct gtt gtc ctg ccc atg tgg atg cct gac ttt ttc aaa ggg att aga 844 Ala Val Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg 225 230 235 agg cca tgg aag ggt gtg ctg atg gtt ggc ccc cca ggc act ggt aag 892 Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys 240 245 250 act atg ctg gct aaa gcg gtt gcc act gaa tgt ggg aca acc ttt ttc 940 Thr Met Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe 255 260 265 aac gtg tcc tct tct acc ctg aca tct aag tac aga ggc gaa tct gag 988 Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu 270 275 280 aag ttg gtc cga ctg ttg ttt gaa atg gct agg ttc tat gcc cct acc 1036 Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Thr 285 290 295 300 acg atc ttc atc gac gaa att gat tct atc tgc agt cga aga ggg acg 1084 Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr 305 310 315 tct gat gag cac gag gca agc cgc aga gtc aag tcg gag ctc ctc atc 1132 Ser Asp Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Ile 320 325 330 cag atg gat gga gtt gga gga gcc tta gaa aat gat gac cca tcc aaa 1180 Gln Met Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys 335 340 345 atg gtg atg gtc ctg gct gct acg aac ttt ccg tgg gac att gat gag 1228 Met Val Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu 350 355 360 gct ctg cgc agg aga cta gag aaa agg att tac att cct ctc ccg aca 1276 Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr 365 370 375 380 gca aaa gga aga gcg gag ctc ctg aag atc agc ctc cgg gag gta gag 1324 Ala Lys Gly Arg Ala Glu Leu Leu Lys Ile Ser Leu Arg Glu Val Glu 385 390 395 ctg gac ccc gat gtc cac ctg gag gac atc gcc gac aag acg gag ggc 1372 Leu Asp Pro Asp Val His Leu Glu Asp Ile Ala Asp Lys Thr Glu Gly 400 405 410 tac tcg ggt gcc gac atc act aac atc tgc agg gac gct tct ttg atg 1420 Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Ile Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met 415 420 425 gcg atg agg cgg cgc atc aat ggc ttg agt ccg gaa gag atc cgg gcc 1468 Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 430 435 440 ctg tcc aag gag gag ctg cag atg cct gtc acc aga ggg gac ttg gag 1516 Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Arg Gly Asp Leu Glu 445 450 455 460 ttg gct ctg aag aaa atc gcc aag tct gtc tca gcg gca gac ctg 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tgtgcttttg tagaatttaa cctgtttagg tcggtaatct gagttccaaa 2333 caagactagt ctcctaggcg aatgcaaaag aacctttccc ctcttctgca tgtgagcgag 2393 cattctgcca gcacgcatgt ctgtatacca catgcatgca gtgcccgagg aggccagaga 2453 ggacattggg tcccctggtt ctggaattac agggtgtgtg agccaccgtg tggatgctgg 2513 gaaccaaacc caggtctcta caagggcagc cagtgttctt aacggctgag ccatccctcc 2573 aaccccacaa acagaaccta tgaacttgtg catgcagtgg gactagagca gacagctgcc 2633 atgctcgtta gatgcggagt aaccaggaag gaggatctca gacaggggcc gcatgagtgt 2693 ggtcacacgc actgtgccct gatgtccgtt ctctgtgatt aattacacct gcccttctgg 2753 atcaccaggc aacctatgct tcaaaagttt gtctaataat atcctgattc tcgagcctat 2813 tttaagctat atactatata caccttagag gcacttttaa aaactcctag tatgttgctt 2873 aagatatttg accccttttt cttactaaaa cctataaatg catcacgctc ttttcaggag 2933 acataagccc gactctctaa actcttggat tcatctgatt actgtaaatt tccccctttc 2993 ttctgagagg gagtgaaggg ccccagcagg ctgaccattg cacacacagc ggagcatagc 3053 agacatggca ctgacaggtt ttgtcgttta cccctctccc ccactgagct gttagcttga 3113 tcctgaagct cactaccaag gtctggcccc ttattcagtc actgactcat tcctgagacc 3173 gagcaccaag gtctagctat cagaattcag tatttcgact aacctaacta acataaccaa 3233 ccagatctta ccagcacgtt ctcgctcact ctaagacaga gctccccctt tcctcttacg 3293 attaacacct gcaaagctat ttactgttgt ttctgtgtaa ttcagactca gccaccttgt 3353 ctcatctctc tgccttgctt aataaaggat ctctttgcat ttggcttgtg cttggacgga 3413 ggtgtttgga tgtggtctgt gcctaacccg gggtccagag gggagcatcc cacagtgcac 3473 aggtcccttc gtaaggatta taaaatttca aatcaaaaga catttgtaat gggactaatt 3533 ttaaaattag actgagagac tcttccttcc atgaacaaac ttgcttttat ttatttactt 3593 tgaggaagag tctgactctg ttgccaatgc tggtcttcag ctgtttcagc ctcccagtag 3653 ctgggactga ttattgataa atgcttaaaa taaacaacta atgtggaagg ctgatgcagg 3713 aggatccata ggaaacagaa acagcccaaa tgccccccag ctgctgaaag tatgatgaaa 3773 atatcacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacgaagagt ctgaagccag 3833 cttgtgtaga ctagcaaggc cctatctcaa aaatcaaaca gaaagaaccc cattcaatcc 3893 tcttgttgta tttcaaaaag aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg 3953 aaggaaggaa 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caaagcatac acgcaagtaa tgcgattact gtgaaagctt ccatagtttc 4853 ctttttaaag aaagtaagat aatattggtg agatgtccca gacaaatgga agctgtggcc 4913 tcctagttac gcaggttagg aacaggtgac atcacaggcc ttccacccat gagttccatc 4973 cttcagtaga gtgaccccag gcaacacatg gccatcagaa atgccagact gggacatcct 5033 gccggggcct tcacaggaga gcctgggtca cagttcagtc acacagctgt ctaactttca 5093 gggagttcac caagtggggt ggagtaggga aaccagcacc cacaagcagt caagcaggca 5153 cacggaggcc taaaacaagc agccgcccag gagtatgtgt gagcccagtt tacagtatta 5213 attgtcgctg gttatccctg tgtgtattgt gactctgtgg ggagtcattg cctccttagc 5273 tcttgggtat ctgagttcat gaggcttcct tccttagata cactacagga tcaggcagga 5333 gtctgcccag gtaacctcct ccttgcctca cttgagaggc aggcaaagaa ctgggcctgt 5393 catttgcata gtggtcttgg ctctggcctc cttagtgagg tcttttttgg tctcttcata 5453 cacacacaca cacacacgca cacaggcccc caataataat aatagtacat ttctactgtt 5513 ttcttattaa atatagatca caactagggt atgactcatg ctttgggata aaatgttagg 5573 tgggagtcga ccttttctaa gaaaagatct aactgtggcg aactggaaga atctggacta 5633 ttccagcttt ctagtgtctt tgttttgttg cttaatgttt gcatgtacaa tgttttaaat 5693 ttgtgacaca tatgatactt atgtcaatct aagagtccac cacaacagaa gaaaatagga 5753 ccaagttgaa ggatgcattg ggggcaaatt aaccctcacc gggaccgcac tgatattaaa 5813 gttgaaggat ggggggcggg ggaggggact aatcctcatg gggaccactc atccacaccg 5873 attatttctg cagtttattt acctcataat tattacatgt ttacttattt atgtgtttaa 5933 tttaggcttt ccttatttat ttaatttttg ggtcacttgc ttttgatatt atttcttaat 5993 gtggaaactg agtatttaaa atattagatc tgtatggtga tatgttttta cacatttact 6053 tagtagtaat ttgaattttt accagtttat ttttttttga aaaatgtagt tttgatgata 6113 attctcattt caggtgcctt attaataaaa gcttattaag aggaaaaaaa aaaaaaaaaa 6173 <210> 6 <211> 488 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Asn Leu Ala Glu Ile Cys Glu Asn Ala Lys Lys Gly Arg Glu Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val 20 25 30 Ile Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Leu Arg Asp Pro Ala Thr 35 40 45 Lys Ala Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu 50 55 60 Gln Val Lys Ser Ile Val 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ttg ctg aga gaa gct gtc 672 Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val 210 215 220 gtc ctt ccc atg tgg atg cct gac ttt ttc aaa ggg att aga agg cca 720 Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro 225 230 235 240 tgg aag gga gtg ctg atg gtt ggg ccc cca ggc act gga aag acc atg 768 Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met 245 250 255 ctg gct aaa gcc gtg gcc acc gag tgc ggc aca acc ttc ttt aat gtc 816 Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val 260 265 270 tcc tct tcc aca ctg acg tct aaa tat aga ggc gaa tct gag aag ttg 864 Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu 275 280 285 gtt cgt ctg ttg ttt gaa atg gct agg ttt tat gcc ccc acc acg atc 912 Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Thr Thr Ile 290 295 300 ttc atc gat gag ata gat tct atc tgc agt cga aga gga acc tct gat 960 Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp 305 310 315 320 gaa cat gag gca agt cgc 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att gta gtt cag cgg ctc cct cgg cct 336 Ala Ser Ala Gly Ile Met Gly Ile Val Val Gln Arg Leu Pro Arg Pro 100 105 110 cgc gcc ctt ggc ggg gtg cct gga cgg gcg aac tac aaa gcc cgg cgc 384 Arg Ala Leu Gly Gly Val Pro Gly Arg Ala Asn Tyr Lys Ala Arg Arg 115 120 125 ccc gac agc tgg gaa aga ccg ata act ttg agc cga cca gga gaa gag 432 Pro Asp Ser Trp Glu Arg Pro Ile Thr Leu Ser Arg Pro Gly Glu Glu 130 135 140 aaa tct ctc ttt gtg gtg agg ggc ctc atg ggt ggt cgc gat ttg ggc 480 Lys Ser Leu Phe Val Val Arg Gly Leu Met Gly Gly Arg Asp Leu Gly 145 150 155 160 tct gtg cgc tgg gaa ggg gaa gtg gag ttg aga cgt gtg ctt ccc gcc 528 Ser Val Arg Trp Glu Gly Glu Val Glu Leu Arg Arg Val Leu Pro Ala 165 170 175 ctg cca ttt ggc cgg ccg ggc tac agc gct cag ccc cac ccc ggc tgg 576 Leu Pro Phe Gly Arg Pro Gly Tyr Ser Ala Gln Pro His Pro Gly Trp 180 185 190 gcc gcc gcc cgc cta gtc tca ggg atg agc agc cgc cca ggc tgc agg 624 Ala Ala Ala Arg Leu Val Ser Gly Met Ser Ser Arg Pro Gly Cys Arg 195 200 205 gcc tcg ggc ctt 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Gly Thr 420 425 430 ggt aag act atg cta gct aaa gct gtc gcc acg gaa tgt ggc aca acg 1344 Gly Lys Thr Met Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr 435 440 445 ttc ttc aac gtt tcc tct tct aca ctg acg tct aaa tat aga ggt gaa 1392 Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu 450 455 460 tct gag aag tta gtc cgt ctg ttg ttt gaa atg gct aga ttt tat gcc 1440 Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala 465 470 475 480 ccc acc aca atc ttc att gat gag ata gat tct atc tgc agt cga aga 1488 Pro Thr Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg 485 490 495 gga acc tct gat gaa cat gag gcc agt cgc aga gtc aag tct gaa cta 1536 Gly Thr Ser Asp Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu 500 505 510 ctc att cag atg gat gga gtt gga gga gct tta gag aat gac gat cct 1584 Leu Ile Gln Met Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro 515 520 525 tcc aaa atg gtt atg gtg ttg gct gct act aat ttc cca tgg gac att 1632 Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile 530 535 540 gat gaa gct ttg cga agg aga tta gaa aaa agg ata tat ata cca ctc 1680 Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu 545 550 555 560 cca aca gca aaa gga aga act gag ctt ctg aag atc aat ctt cgt gag 1728 Pro Thr Ala Lys Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu 565 570 575 gtt gaa gtg gac cct gat att caa ctg gaa gat ata gca gag aag att 1776 Val Glu Val Asp Pro Asp Ile Gln Leu Glu Asp Ile Ala Glu Lys Ile 580 585 590 gag ggc tat tct ggt gct gat ata act aat gtt tgc agg gat gcc tct 1824 Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser 595 600 605 tta atg gca atg aga cgg cga atc aat ggc tta agt cca gaa gag atc 1872 Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ile 610 615 620 cgt gcg ctt tct aaa gag gag ctt cag atg cct gtg acc aga gga gac 1920 Arg Ala Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Arg Gly Asp 625 630 635 640 ttc gaa ttg gct ctt aag aaa att gct aag tct gtc tct gcc gca gac 1968 Phe Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ile Ala Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp 645 650 655 ttg gag aag tat gaa aaa tgg atg gtt gaa ttt gga tct gct tga 2013 Leu Glu Lys Tyr Glu Lys Trp Met Val Glu Phe Gly Ser Ala 660 665 670 atttctgaca ggtctttcat ttctggtatt tttgtttata aaatgtgaag aattcctgca 2073 attaaaaaaa aaaaataggt ttggaacttt tcgttggaga gattttcacg taaaggaaaa 2133 aaaaaacccc taaaaccaca aagaatataa atgtagttga gaaataagaa aagcttacgt 2193 agagagcctg atagtctccg tcccctggct ttgtgctggt attccacgtg ctcatgcatt 2253 ggtattgcac gcccagacca g 2274 <210> 10 <211> 670 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 10 Met Gly Ala Glu Glu Gly Trp Thr Arg Arg Ser Ser Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Arg Arg Arg Pro Ala Val Pro Ser Ser Asp Gln His Leu Glu Thr Ala 20 25 30 Gln Arg Gly Gln Gln Arg Ala Pro Arg Asp Arg His Ala Ser Cys His 35 40 45 Gly Asp Glu Ala Leu Pro Arg Gln Ala Glu Pro Ala Leu Asn His Tyr 50 55 60 Thr Leu Ser Pro Ala Ala Gly Asp Arg Arg Arg Phe His Lys Glu Ile 65 70 75 80 Leu Arg Arg Gly Pro Arg Cys Gly Arg Gly Arg Ala Glu Asp Ala Arg 85 90 95 Ala Ser Ala Gly Ile Met Gly Ile Val Val Gln Arg Leu Pro Arg Pro 100 105 110 Arg Ala Leu Gly Gly Val Pro Gly Arg Ala Asn Tyr Lys Ala Arg Arg 115 120 125 Pro Asp Ser Trp Glu Arg Pro Ile Thr Leu Ser Arg Pro Gly Glu Glu 130 135 140 Lys Ser Leu Phe Val Val Arg Gly Leu Met Gly Gly Arg Asp Leu Gly 145 150 155 160 Ser Val Arg Trp Glu Gly Glu Val Glu Leu Arg Arg Val Leu Pro Ala 165 170 175 Leu Pro Phe Gly Arg Pro Gly Tyr Ser Ala Gln Pro His Pro Gly Trp 180 185 190 Ala Ala Ala Arg Leu Val Ser Gly Met Ser Ser Arg Pro Gly Cys Arg 195 200 205 Ala Ser Gly Leu Arg Arg Leu Ser Pro Ser Gln Val Ala Ala Ala Arg 210 215 220 Cys Arg Thr His Lys Gly Tyr Phe Phe Lys Val Arg Gln Glu Leu Leu 225 230 235 240 Glu Glu Tyr Glu Gln Val Lys Ser Ile Val Ser Thr Leu Glu Ser Phe 245 250 255 Lys Ile Asp Lys Pro Pro Asp Phe Pro Val Ser Ser Gln Asp Glu Pro 260 265 270 Phe Arg Asp Pro Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg 275 280 285 Ala Pro Pro Gln Ile Arg Arg Pro Asn Arg Glu Val Arg Pro Leu Arg 290 295 300 Lys Glu Met Pro Gly Val Gly Ala Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala His 305 310 315 320 Pro Ile Ser Lys Ser Glu Lys Pro Ser Thr Ser Arg Asp Lys Asp Tyr 325 330 335 Arg Ala Lys Gly Arg Asp Asp Lys Gly Arg Lys His Met Gln Asp Gly 340 345 350 Ala Ser Asp Gly Glu Ile Pro Lys Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys 355 360 365 Asp Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser 370 375 380 Ile His Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu 385 390 395 400 Arg Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly 405 410 415 Ile Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr 420 425 430 Gly Lys Thr Met Leu Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr 435 440 445 Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu 450 455 460 Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala 465 470 475 480 Pro Thr Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg 485 490 495 Gly Thr Ser Asp Glu His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu 500 505 510 Leu Ile Gln Met Asp Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro 515 520 525 Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile 530 535 540 Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu 545 550 555 560 Pro Thr Ala Lys Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu 565 570 575 Val Glu Val Asp Pro Asp Ile Gln Leu Glu Asp Ile Ala Glu Lys Ile 580 585 590 Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser 595 600 605 Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ile 610 615 620 Arg Ala Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Arg Gly Asp 625 630 635 640 Phe Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ile Ala Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp 645 650 655 Leu Glu Lys Tyr Glu Lys Trp Met Val Glu Phe Gly Ser Ala 660 665 670 <210> 11 <211> 1784 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (106)..(1575) <223> <400> 11 cgcccccctt cctcgctctg cttgagcgca gaaggaccgc gtccccctcc ccgctccgcc 60 ggcgccggga cacgcacccc gctcctccca ggtttctgag agaag atg aat ttg gca 117 Met Asn Leu Ala 1 gag atc tgc gac aat gcc aaa aag gga aga gac tat gca ctc att ggg 165 Glu Ile Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly Arg Asp Tyr Ala Leu Ile Gly 5 10 15 20 aat tat gac tct tct atg gtg tat tac cag ggt gtc atc cag caa atc 213 Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val Ile Gln Gln Ile 25 30 35 cag aga cat tgc cag tcg atc aga gat cca gca att aag ggc aaa tgg 261 Gln Arg His Cys Gln Ser Ile Arg Asp Pro Ala Ile Lys Gly Lys Trp 40 45 50 caa cag gtt cgg caa gaa tta gtc gaa gaa tat gag caa gtt aag agc 309 Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Val Glu Glu Tyr Glu Gln Val Lys Ser 55 60 65 att gtc gac act tta gag agt ttt aaa atg gac aga cct gca gat atc 357 Ile Val Asp Thr Leu Glu Ser Phe Lys Met Asp Arg Pro Ala Asp Ile 70 75 80 cct gtg tcc tat caa gat gag cct ttt aga gac cct gct gtt tgg cca 405 Pro Val Ser Tyr Gln Asp Glu Pro Phe Arg Asp Pro Ala Val Trp Pro 85 90 95 100 cct cca gtt cca gct gaa cac agg gcc cca cct cag ata aag cgt ccc 453 Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg Ala Pro Pro Gln Ile Lys Arg Pro 105 110 115 aac cga gga gca aag ccc ttg agg aag gaa tcc ccg ggc ctg cag ccc 501 Asn Arg Gly Ala Lys Pro Leu Arg Lys Glu Ser Pro Gly Leu Gln Pro 120 125 130 cgt ggg ccc gtg ggc aga gca cag cca gca gtg agg agc gac aaa cct 549 Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala Gln Pro Ala Val Arg Ser Asp Lys Pro 135 140 145 gca ggc agc cgt gac agg gag ccg agg gcc aga ggg agg gat gac aag 597 Ala Gly Ser Arg Asp Arg Glu Pro Arg Ala Arg Gly Arg Asp Asp Lys 150 155 160 gga aag aaa ata ccc cag gaa ggt gtt gct gat gat gtt cta aga ttt 645 Gly Lys Lys Ile Pro Gln Glu Gly Val Ala Asp Asp Val Leu Arg Phe 165 170 175 180 gat gga gcg ggt tat gac aaa gac ttg gtc gaa gct ctt gaa agg gac 693 Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Asp 185 190 195 att gtg tca agg aat cca agc att cac tgg gat gac ata gca gat ttg 741 Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His Trp Asp Asp Ile Ala Asp Leu 200 205 210 gaa gaa gcc aag aaa tta tta aga gaa gct gtt gtt ctt cca atg tgg 789 Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val Val Leu Pro Met Trp 215 220 225 atg cct gat ttt ttc aaa ggg atc aga agg cct tgg aag ggc gtg ctg 837 Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro Trp Lys Gly Val Leu 230 235 240 atg gtt ggt cca cct ggt act ggc aaa aca atg cta gca aaa gct gtt 885 Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met Leu Ala Lys Ala Val 245 250 255 260 gct aca gaa tgt gga aca acg ttc ttc aac gtg tct tcc tct acg ctg 933 Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val Ser Ser Ser Thr Leu 265 270 275 aca tct aaa tac aga ggc gaa tct gaa aag ctt gtc cgc ctc ttg ttt 981 Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu Val Arg Leu Leu Phe 280 285 290 gaa atg gcg agg ttt tac gct cca gca aca atc ttc att gat gaa att 1029 Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Ala Thr Ile Phe Ile Asp Glu Ile 295 300 305 gat tca atc tgc agc cgc aga ggc aca tcc gat gag cac gaa gcg agt 1077 Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp Glu His Glu Ala Ser 310 315 320 cgc aga gtc aag tca gag ctg ctt gtg caa atg gat ggg gta ggt ggt 1125 Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Val Gln Met Asp Gly Val Gly Gly 325 330 335 340 gct ttg gag aat gat gac cct tcc aag atg gtt atg gta tta gct gct 1173 Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val Met Val Leu Ala Ala 345 350 355 aca aac ttt cct tgg gat att gat gaa gct ctc cga cgg aga ctg gaa 1221 Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu 360 365 370 aaa agg att tat ata cct ttg ccc aca gca aaa ggc aga gca gaa cta 1269 Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr Ala Lys Gly Arg Ala Glu Leu 375 380 385 ctt aag att aat ctt cgg gaa gta gaa ctg gat cct gac atc agc ctt 1317 Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu Val Glu Leu Asp Pro Asp Ile Ser Leu 390 395 400 gag gaa att gct gag aag att gaa ggc tat tct ggt gct gac atc act 1365 Glu Glu Ile Ala Glu Lys Ile Glu Gly Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Thr 405 410 415 420 aat gtc tgc agg gat gcc tct tta atg gca atg aga cgg cgt att aac 1413 Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met Arg Arg Arg Ile Asn 425 430 435 ggc tta act cca gaa gag att cgg gca ctt tct aaa gag gaa ctt cag 1461 Gly Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg Ala Leu Ser Lys Glu Glu Leu Gln 440 445 450 atg cca gtt acc aag ggg gac ttt gag ttg gct ctg aag aaa atc tcc 1509 Met Pro Val Thr Lys Gly Asp Phe Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ile Ser 455 460 465 aaa tct gtt tct gct gca gac ctg gag aag tac gag aaa tgg atg gcg 1557 Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Leu Glu Lys Tyr Glu Lys Trp Met Ala 470 475 480 gag ttt gga tct gct taa tctcaccgac agctttccat tgtaagagtt 1605 Glu Phe Gly Ser Ala 485 ttatggctct tgttgttttc acttgcaatg tgagttagaa atctttttaa aggtttaata 1665 aaaggtctgc cgttctccct gtcccacccc caccccttcc tggtgacaag atcttttaaa 1725 ctctatttgc ctttaaaggg actgaacata ataacaagct gaaacggtta aaataaaaa 1784 <210> 12 <211> 489 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 12 Met Asn Leu Ala Glu Ile Cys Asp Asn Ala Lys Lys Gly Arg Asp Tyr 1 5 10 15 Ala Leu Ile Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Met Val Tyr Tyr Gln Gly Val 20 25 30 Ile Gln Gln Ile Gln Arg His Cys Gln Ser Ile Arg Asp Pro Ala Ile 35 40 45 Lys Gly Lys Trp Gln Gln Val Arg Gln Glu Leu Val Glu Glu Tyr Glu 50 55 60 Gln Val Lys Ser Ile Val Asp Thr Leu Glu Ser Phe Lys Met Asp Arg 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Val Ser Tyr Gln Asp Glu Pro Phe Arg Asp Pro 85 90 95 Ala Val Trp Pro Pro Pro Val Pro Ala Glu His Arg Ala Pro Pro Gln 100 105 110 Ile Lys Arg Pro Asn Arg Gly Ala Lys Pro Leu Arg Lys Glu Ser Pro 115 120 125 Gly Leu Gln Pro Arg Gly Pro Val Gly Arg Ala Gln Pro Ala Val Arg 130 135 140 Ser Asp Lys Pro Ala Gly Ser Arg Asp Arg Glu Pro Arg Ala Arg Gly 145 150 155 160 Arg Asp Asp Lys Gly Lys Lys Ile Pro Gln Glu Gly Val Ala Asp Asp 165 170 175 Val Leu Arg Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Asp Leu Val Glu Ala 180 185 190 Leu Glu Arg Asp Ile Val Ser Arg Asn Pro Ser Ile His Trp Asp Asp 195 200 205 Ile Ala Asp Leu Glu Glu Ala Lys Lys Leu Leu Arg Glu Ala Val Val 210 215 220 Leu Pro Met Trp Met Pro Asp Phe Phe Lys Gly Ile Arg Arg Pro Trp 225 230 235 240 Lys Gly Val Leu Met Val Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Met Leu 245 250 255 Ala Lys Ala Val Ala Thr Glu Cys Gly Thr Thr Phe Phe Asn Val Ser 260 265 270 Ser Ser Thr Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Glu Ser Glu Lys Leu Val 275 280 285 Arg Leu Leu Phe Glu Met Ala Arg Phe Tyr Ala Pro Ala Thr Ile Phe 290 295 300 Ile Asp Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Arg Arg Gly Thr Ser Asp Glu 305 310 315 320 His Glu Ala Ser Arg Arg Val Lys Ser Glu Leu Leu Val Gln Met Asp 325 330 335 Gly Val Gly Gly Ala Leu Glu Asn Asp Asp Pro Ser Lys Met Val Met 340 345 350 Val Leu Ala Ala Thr Asn Phe Pro Trp Asp Ile Asp Glu Ala Leu Arg 355 360 365 Arg Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Pro Thr Ala Lys Gly 370 375 380 Arg Ala Glu Leu Leu Lys Ile Asn Leu Arg Glu Val Glu Leu Asp Pro 385 390 395 400 Asp Ile Ser Leu Glu Glu Ile Ala Glu Lys Ile Glu Gly Tyr Ser Gly 405 410 415 Ala Asp Ile Thr Asn Val Cys Arg Asp Ala Ser Leu Met Ala Met Arg 420 425 430 Arg Arg Ile Asn Gly Leu Thr Pro Glu Glu Ile Arg Ala Leu Ser Lys 435 440 445 Glu Glu Leu Gln Met Pro Val Thr Lys Gly Asp Phe Glu Leu Ala Leu 450 455 460 Lys Lys Ile Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala Asp Leu Glu Lys Tyr Glu 465 470 475 480 Lys Trp Met Ala Glu Phe Gly Ser Ala 485 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 13 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 14 taatacgact cactatagg 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 15 gatgaacatg aggcaagtcg 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 16 ggtaacaggc atctgaagtt cc 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 17 gttcttccaa tgtggatgcc 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 18 tcttcagaag ctcagctctt cc 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 19 aagatggtgc aagtgacagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 20 tcgatgaaga tcgtggtagg 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 21 gggctgcttt taactctg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 22 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gapdh primer <400> 23 cttcaccacc atggagaagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gapdh primer <400> 24 tgaagtcgca ggagacaacc 20 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 25 atgaatttgg cggagatttg tgagaatgc 29 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 26 tcatgcagac ccaaactcaa cc 22 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 27 cccggaattc atgaatttgg ctgagatttg tgataatgc 39 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 28 ccgccgctcg agtcaagcag atccaaattc aaccatcc 38 <210> 29 <211> 491 <212> PRT <213> Megathura crenulata <400> 29 Ile Leu Val Arg Lys Asn Ile His Ser Leu Ser His His Glu Ala Glu 1 5 10 15 Glu Leu Arg Asp Ala Leu Tyr Lys Leu Gln Asn Asp Glu Ser His Gly 20 25 30 Gly Tyr Glu His Ile Ala Gly Phe His Gly Tyr Pro Asn Leu Cys Pro 35 40 45 Glu Lys Gly Asp Glu Lys Tyr Pro Cys Cys Val His Gly Met Ser Ile 50 55 60 Phe Pro His Trp His Arg Leu His Thr Ile Gln Phe Glu Arg Ala Leu 65 70 75 80 Lys Lys His Gly Ser His Leu Gly Ile Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Gln 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Pro Thr Phe Phe Ala Asp Ser Gly Asn Asn Asn 100 105 110 Pro Phe Phe Lys Tyr His Ile Arg Ser Ile Asn Gln Asp Thr Val Arg 115 120 125 Asp Val Asn Glu Ala Ile Phe Gln Gln Thr Lys Phe Gly Glu Phe Ser 130 135 140 Ser Ile Phe Tyr Leu Ala Leu Gln Ala Leu Glu Glu Asp Asn Tyr Cys 145 150 155 160 Asp Phe Glu Val Gln Tyr Glu Ile Leu His Asn Glu Val His Ala Leu 165 170 175 Ile Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Ser Met Ser Thr Leu Glu Tyr Ser Ala 180 185 190 Phe Asp Pro Tyr Phe Met Ile His His Ala Ser Leu Asp Lys Ile Trp 195 200 205 Ile Ile Trp Gln Glu Leu Gln Lys Arg Arg Val Lys Pro Ala His Ala 210 215 220 Gly Ser Cys Ala Gly Asp Ile Met His Val Pro Leu His Pro Phe Asn 225 230 235 240 Tyr Glu Ser Val Asn Asn Asp Asp Phe Thr Arg Glu Asn Ser Leu Pro 245 250 255 Asn Ala Val Val Asp Ser His Arg Phe Asn Tyr Lys Tyr Asp Asn Leu 260 265 270 Asn Leu His Gly His Asn Ile Glu Glu Leu Glu Glu Val Leu Arg Ser 275 280 285 Leu Arg Leu Lys Ser Arg Val Phe Ala Gly Phe Val Leu Ser Gly Ile 290 295 300 Arg Thr Thr Ala Val Val Lys Val Tyr Ile Lys Ser Gly Thr Asp Ser 305 310 315 320 Asp Asp Glu Tyr Ala Gly Ser Phe Val Ile Leu Gly Gly Ala Lys Glu 325 330 335 Met Pro Trp Ala Tyr Glu Arg Leu Tyr Arg Phe Asp Ile Thr Glu Thr 340 345 350 Val His Asn Leu Asn Leu Thr Asp Asp His Val Lys Phe Arg Phe Asp 355 360 365 Leu Lys Lys Tyr Asp His Thr Glu Leu Asp Ala Ser Val Leu Pro Ala 370 375 380 Pro Ile Ile Val Arg Arg Pro Asn Asn Ala Val Phe Asp Ile Ile Glu 385 390 395 400 Ile Pro Ile Gly Lys Asp Val Asn Leu Pro Pro Lys Val Val Val Lys 405 410 415 Arg Gly Thr Lys Ile Met Phe Met Ser Val Asp Glu Ala Val Thr Thr 420 425 430 Pro Met Leu Asn Leu Gly Ser Tyr Thr Ala Met Phe Lys Cys Lys Val 435 440 445 Pro Pro Phe Ser Phe His Ala Phe Glu Leu Gly Lys Met Tyr Ser Val 450 455 460 Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Met Thr Ala Ser Thr Thr Glu Leu Cys Asn 465 470 475 480 Asp Asn Asn Leu Arg Ile His Val His Val Asp 485 490

Claims

이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드류로부터 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 그 폴리펩티드를 발현 가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
(a) 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12에 기재된 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드.
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 85% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분서열로서 포함하는 폴리펩티드.
제 1 항에 있어서,
상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 4, 2, 8, 10, 12 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
항원 제시 세포의 처리제인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
암의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 4 항에 있어서,
상기 암은 KATNAL1을 발현하는 암인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 암은 유방암, 뇌종양, 항문 주위 선암, 신경아종, 비만세포종, 간암, 전립선암, 폐암, 갑상선암 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 유도제.
제 7 항에 있어서,
상기 면역 증강제는 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타니드, 폴리IC 및 그 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, 인터류킨12, 인터류킨18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 면역 유도제.