JP2003532419A - 細胞骨格結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明はヒト細胞骨格結合タンパク質(CYSKP)およびCYSKPを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、CYSKPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。
Description
【０００１】
本発明は、細胞骨格結合蛋白の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明は
また、これらの配列を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸
送性、神経性、細胞運動性、生殖系疾患および筋疾患の診断・治療・予防に関す
る。 本発明はさらに、細胞骨格結合蛋白の核酸配列及びアミノ酸配列の発現に
おける外来性化合物の効果についての評価に関する。
また、これらの配列を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸
送性、神経性、細胞運動性、生殖系疾患および筋疾患の診断・治療・予防に関す
る。 本発明はさらに、細胞骨格結合蛋白の核酸配列及びアミノ酸配列の発現に
おける外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
細胞質系のタンパク繊維である細胞骨格は細胞の形、構造および運動に関与する
。細胞骨格は細胞膜を支え、トラックを形成し、細胞小器官や他の要素はそれら
のトラックに沿って細胞質ゾル内を動く。細胞骨格は動的な構造をしており、細
胞が種々の形状をとり、有向性移動が行えるようになっている。更に、分子は細
胞骨格結合タンパク質との相互作用によって特定の細胞の位置に隔離される。主
要細胞骨格線維はミクロフィラメント、微小管および中間径フィラメントである
。ミオシン、ダイニンおよびキネシンなどの運動タンパク質は線維の運動を駆動
したり、線維に沿って運動する。細胞骨格膜アンカーは細胞膜に線維を結合させ
るが、付属タンパク質または結合タンパク質は線維の構造または活性を修飾する
。細胞骨格に結合する他のタンパク質は分泌や細胞内シグナル伝達のような過程
において役割を果たしている。(細胞骨格についてはLodish, H. ら (1995) Mole cular Cell Biology Scientific American Books, New York NYを参照。)微小管および結合タンパク質 チューブリン 直径24nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で複数の役割を果たしている。束
になった微小管は繊毛や鞭毛を形成し、両者は細胞膜の鞭状の伸長であり、繊毛
は上皮上の物質を一掃するのに必要で、鞭毛は精子の遊泳に必要である。赤血球
や血小板の微小管の辺縁領域はこれらの細胞の柔軟性の維持に重要である。細胞
小器官、膜小胞やタンパク質は、細胞内で微小管のトラックに沿って輸送される
。例えば、微小管は神経細胞アクソンの中を通っており、細胞体と神経末端の間
で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。神経末端にこれらの小胞を供
給できないと、神経のシグナル伝達が妨げられる。紡錘体をした微小管はまた、
細胞分裂時の染色体運動に重要である。安定な微小管集団と短命な微小管集団の
両方が細胞内に存在する。 微小管はGTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる高分子である。
各々のサブユニットは、α-チューブリンおよびβ-チューブリンのヘテロ二量体
で、それぞれイソ型が存在する。α-チューブリンはアセチル化、ポリグルタミ
ル化、2つのアミノ酸の切断(Δ2 チューブリン形成)、チロシン化などの多くの
翻訳後修飾が行われる。場合によっては、これらの修飾は微小管の安定性に影響
する。GTPの加水分解によって、微小管の末端にチューブリンサブユニットが付
加して結合する。このサブユニットは頭と尾部が相互作用してプロトフィラメン
トを形成するが、このプロトフィラメントは側面どうしが相互作用して微小管を
形成している。微小管は極性があり、片方の末端はα-チューブリンに、他の末
端はβ-チューブリンに取り囲まれており、この2つの末端はアセンブリの割合が
異なっている。各々の微小管は通常13のプロトフィラメントで構成されているが
、11または15のプロトフィラメントの微小管の場合もある。繊毛と鞭毛は2つの
微小管を含んでいる。微小管は中心体または微小管形成中心(MTOC)として知られ
ている特殊構造体から成長する。微小管形成中心は一つまたは二つの中心小体を
含んでおり、三つ組の微小管の風車配列になっている。繊毛または鞭毛の底にあ
る形成中心である基底小体には一つの中心小体(中心粒)が含まれる。中心形成に
存在するγチューブリンは、αおよびβチューブリンヘテロ二量体の重合の核形
成に重要であるが、微小管には重合しない。タンパク質中心周囲はMTOC に見ら
れ、微小管のアセンブリに関与している。微小管結合タンパク質 微小管結合タンパク質(MAP)は微小管の構築と安定化に関与している。アセンブ
リMAPである、一つの主要ファミリーの微小管結合タンパク質は神経細胞および
非神経細胞性の細胞においても同定される。アセンブリMAPは細胞質ゾル内の微
小管の架橋をも担っている。これらのMAPは塩基性微小管結合ドメインと酸性プ
ロジェクションドメインの二つのドメインを形成している。プロジェクションド
メインは膜、中間径フィラメントまたは他の微小管の結合部位である。配列解析
に基づいて、アセンブリMAPをタイプI とタイプ IIの2つの種類に分けることが
出来る。 タイプIMAPにはMAP1A と MAP1Bがあり、微小管で同時精製される大型の糸状の分
子であり、脳や精巣に多く発現する。これらは陽性に帯電したアミノ酸配列モチ
ーフのいくつかの繰り返しを含み、陰性に帯電したチューブリンを中和して微小
管の安定化を招く。MAP1A および MAP1B の各々は一つの前駆体ポリペプチドか
ら由来しており、後にタンパク分解性に処理されて、一本の重鎖と一本の軽鎖を
形成する。 別の軽鎖であるLC3は16.4 kDa (キロダルトン)あり、MAP1A、 MAP1Bおよび微小
管と結合する。LC3 はMAP1A または MAP1B 転写物以外の源泉から合成され、LC3
の発現は細胞増殖時のMAP1A または MAP1B の微小管結合活性の調節に重要であ
ることが示唆されている(Mann, S. S. ら (1994) J. Biol. Chem. 269:11492-11
497)。 MAP2a、MAP2b、 MAP2c、 MAP4 および Tauを含むタイプIIMAPは、微小管結合ド
メインの18残基配列を3つないし4つのコピーを有することが特徴である。MAP2a
、MAP2bおよび MAP2c は樹状突起のみに見られ、MAP4は 非神経細胞性細胞にあ
り、Tauは神経細胞の軸索(アクソン)と樹状突起に見られる。別のTau mRNAのス
プライシングによってTauタンパク質の複数の形態が存在するようになる。アル
ツハイマー疾患、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症および家
族性前線側頭部痴呆症(frontotemporal dementia )および染色体17に関連するパ
ーキンソン病のような神経変性疾患ではTauのリン酸化が変更される。Tauリン酸
化が変更されることによって微小管網が破壊され、神経細胞内Tau凝集の形成が
生じる(Spillantini, M.G. および Goedert, M. (1998) Trends Neurosci. 21:4
28-433)。 微小管の安定性はまた、微小管の長さを切断することによって調節される。AAA
アデノシン三リン酸分解酵素(ATPase) スーパーファミリーに属するタンパク質
カタニンはATP加水分解エネルギーを用いて安定な微小管を切断し、分解する。
カタニンは中心体からの微小管の遊離、紡錘体アセンブリの調節、および細胞周
期が推移する間の微小管代謝回転の促進を担っている (Hartman, J.J. およびVa
le, R.D. (1999) Science 286:782-785)。 微小管凝集はいくつかの疾患に関連している。ヒトから得た骨格外粘液様軟骨肉
腫腫瘍には粗面小胞体内の微小管の平行配列が含まれていた(Suzuki, T. ら (19
88) J. Pathol. 156:51-57)。微小管凝集体はC型ウイルス肝炎に感染したチン
パンジーから採取した肝細胞にも見られた。これらの凝集体に作製されたモノク
ーロナル抗体によって、p44(または微小管凝集タンパク質)と呼ばれるタンパク
質が検出されている (Maeda, T. ら (1989) J. Gen. Virol. 70:1401-1407)。p
44のヒト相同体はインターフェロン-αおよびインターフェロン-βによって誘導
されるが、インターフェロン-γによっては誘導されない。P44はインターフェロ
ンの抗ウイルス性作用における媒介物であると思われる(Kitamura, A. ら (1994
) Eur. J. Biochem. 224:877-883)。 ダイニン関連モータータンパク質 ダイニンは微小管上で作用する(-)末端指向型運動タンパク質である。細胞質性
と軸糸性の2種のダイニンがある。細胞質ダイニンは細胞質微小管に沿って物質
の移行を担い、例えば、神経末端から細胞体への輸送やエンドサイトーシス小胞
のリソソームへの輸送などに関与する。細胞質内ダイニンはまた、有子分裂にも
関与していることが報告されている。軸糸のダイニンはまた鞭毛や繊毛を動きに
関与する。一つの微小管ダブレット(２配列)上のダイニンは隣接する微小管ダブ
レットにそって「歩く」ようにして動く。この滑りによって屈曲力が生じ、鞭毛
または繊毛を拍動させる。ダイニンは1000から2000キロダルトンの間の天然質量
を有し、力を生じる頭部が２個ないし３個あり、それらはATPの加水分解によっ
て駆動される。この頭部はストークを介して基部ドメインに連結しており、この
基部ドメインは極めて異なった数からなる付属の中間鎖や軽鎖から構成されてい
る。キネシン関連モータータンパク質 キネシンは微小管上で作用する(＋)末端指向型運動タンパク質である。プロトタ
イプのキネシン分子は膜結合小胞や細胞小器官の輸送に関与する。この機能は神
経細胞における軸糸輸送のために特に重要である。また、すべての細胞タイプに
おいてキネシンはゴルジ複合体から小胞体への小胞輸送に重要である。この役割
はこれらの分泌性細胞小器官の独自性や機能性を保持するために極めて大切であ
る。 キネシンは、50以上のタンパク質から成る偏在する保存されたタンパク質ファミ
リーであり、それらは、一次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度および細胞
機能に基づいて少なくとも8つのサブファミリに分類される。(Moore, J.D. およ
び S.A. Endow (1996) Bioessays 18:207-219、Hoyt, A.M. (1994) Curr. Opin.
Cell Biol. 6:63-68を参照。)プロトタイプのキネシン分子は2個のポリペプチ
ド重鎖(KHCs) と2個のポリペプチド軽鎖(KLC)からなるヘテロ四量体である。KHC
サブユニットは通常「キネシン」と呼ばれる。KHCは長さが約1000のアミノ酸で
あり、KLCは長さが約550のアミノ酸である。2個のKHCは二量体化されて、三つの
異なる部分の二次構造を有する桿状体分子を形成する。分子の一端には、ATP加
水分解と微小管結合において機能する球状運動ドメインがある。キネシン運動ド
メインは非常に保存されており、70%以上の同一性を有する。モータドメインの
先には二量体化を媒介するα螺旋状コイルドコイル領域がある。分子の他の端に
は分子カーゴと結合している扇状の尾がある。この尾はKHC C末端と2つのKLCの
相互作用によって形成される。 キネシンのさらに分岐したサブファミリに属するものはキネシン関連タンパク質
(KRPs)と呼ばれ、これらの多くは真核生物の有糸分裂の際に作用する(Hoyt、 前 出 )。KRPによって紡錘体の構築に必要とされるものもある。in vivo およびin v itro 分析ではこれらのKRPは紡錘体を構成する微小管上で力を発揮し、紡錘体極
の分離を生じることが示唆されている。この活性のために、KRPのリン酸化が必
要とされる。紡錘体が構築できないと、有糸分裂が不成功に終わったり、染色体
異数性が生じ、後者は癌細胞の特徴である。さらに、セントロメアタンパク質E
と呼ばれる固有のKRPはヒト有糸分裂染色体の動原体に局在化し、反対の紡錘体
極への分離に関与する。ミクロフィラメントおよび関連タンパク質 アクチン 直径7-9nmの細胞骨格フィラメントであるミクロフィラメントは細胞の移動運動
、細胞の形状、細胞接着、細胞分裂および筋肉収縮にとって重要である。ミクロ
フィラメントの構築および分解によって細胞はその形態を変えることができる。
ミクロフィラメントは真核生物細胞において最も豊富な細胞内タンパク質である
アクチンの重合したものである。ヒト細胞には6個のイソ型のアクチンが含まれ
ている。三つのαアクチンが異なった種類の筋肉にあり、非筋肉βアクチンおよ
び非筋肉γアクチンは非筋肉細胞にあり、また他のγアクチンは腸の平滑筋細胞
にある。アクチンの単量体であるGアクチンは、極性のある螺旋状Fアクチンフィ
ラメントに重合し、ATPのADPへの加水分解が同時に生じる。アクチンフィラメン
トは結合して束やネットワークを形成し、原形質膜を支持する枠組みを与え、細
胞を形作る。これらの束やネットワークは細胞膜に接続している。筋肉細胞では
、収縮時にアクチンを含む細いフィラメントは運動タンパク質のミオシンを含む
太いフィラメントを滑って通過する。他のアクチン関連フィラメントはアクチン
細胞骨格の一部ではなく、むしろ微小管やダイニンに結合する。アクチン結合タンパク質 アクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの架橋、切断および安定化、ま
たアクチン単量体の隔離に関与している。アクチン結合タンパク質のいくつかは
複数の機能を有している。アクチンフィラメントの束やネットワークは共にアク
チン架橋タンパク質によって保持されている。これらのタンパク質は各フィラメ
ントに一個づつの合計2つのアクチン結合部位を有する。短い架橋タンパク質は
束形成を促進し、他方、長くてより柔軟性のある架橋タンパク質はネットワーク
形成を促進する。アクチン架橋タンパク質のカルモジュリン様カルシウム結合ド
メインによって架橋のカルシウム調節が可能となる。I 群の架橋タンパク質は
独特のアクチン結合ドメインを持ち、30 Kd タンパク質、EF-1a、ファシン(fasc
in)やスクルイン(scruin)等が含まれる。II 群の架橋タンパク質は7,000-MW ア
クチン結合ドメインを有し、ビリン(villin)やデマチン(dematin)等が含まれる
。III群架橋タンパク質は対の26,000-MW アクチン結合ドメインを有し、アルフ
ァアクチニン、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィン、ABP120およびフ
ィラミン(filamin)が含まれる。 タンパク質を切断することによって、短い断片に切るか、またはその端をブロッ
クすることによってアクチンフィラメントの長さが調節される。タンパク質の切
断には、gCAP39、セベリン(フラグミン)、ゲルソリンおよびビリンが含まれる。
タンパク質のキャッピングはアクチンフィラメントの端にキャップを形成するが
、フィラメントを切ることはできない。タンパク質のキャッピングにはCapZ、ト
ロポモジュリンおよびテンシンが含まれる。 接着斑に見られるテンシンもまたアクチンフィラメントを架橋する。細胞外マト
リックスによるインテグリン活性によってチロシン、セリンおよびスレオニン残
基上のテンシンのリン酸化が生じるが、このリン酸化は発癌遺伝子で形質転換さ
れた細胞においても生じる。テンシンにはSH2ドメインがあり、他のチロシンリ
ン酸化タンパク質と結合する場合もある (Lo, S.H. ら (1997) J. Cell Biol. 1
36:1349-1361)。テンシンのN 末端には酵母(Saccharomyces cerevisiae)の推定
上のチロシンホスファターゼ(PTP)の触媒的ドメインに相同的な領域が含まれて
いる。テンシンのこのPTPドメインはリン酸化ポリペプチドとの結合作用を媒介
する(Haynie, D.T. および Ponting, C.P. (1996) Protein Sci. 5:2643-2646)
。テンシン遺伝子を持たないマウスは腎臓に異常があり、テンシンの喪失は腎臓
における接着斑を弱化することを示す(Lo、前出)。 タンパク質のチモシンとプロフィリンは細胞基質内でアクチン単量体を隔離し、
非重合アクチンの存在を可能にする。プロフィリンはまた、アクチン単量体の付
加に必要な臨界濃度を効果的に下げてFアクチンの形成を刺激する (Gertler, F.
B. ら(1996) Cell 87:227-239)。 アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニンおよびカルデスモンは筋
肉収縮をカルシウムに応答して調節する。このトロポミオシンタンパク質は筋肉
細胞および非筋肉細胞に見られ、α螺旋状であり、コイルドコイル二量体を形成
している。横紋筋のトロポミオシンはトロポニン複合体とアクチン間の相互作用
を媒介し、筋肉収縮を調節する(PROSITE PDOC00290トロポミオシン・シグネチャ
)。トロポミオシン複合体はトロポニン-T、トロポニン-I およびトロポニン-Cか
ら構成される。トロポニン-Tはトロポミオシン、結合トロポニン-I およびトロ
ポニン-C をトロポミオシンに結合する。 アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニンおよびカルデスモンは筋
肉収縮をカルシウムに応答して調節する。このトロポミオシンタンパク質は筋肉
細胞および非筋肉細胞に見られ、α螺旋状であり、コイルドコイル二量体を形成
している。横紋筋トロポミオシンはトロポニン複合体とアクチン間の相互作用を
媒介し、筋肉収縮を調節する(PROSITE PDOC00290トロポミオシン・シグネチャ)
。トロポミオシン複合体はトロポニン-T、トロポニン-I およびトロポニン-Cか
ら構成される。トロポニン-Tはトロポミオシン、結合トロポニン-I およびトロ
ポニン-C をトロポミオシンに結合する。 アクチンのアセンブリの調節に関与する多くのタンパク質は、例えば、αアクチ
ニン、スペクトリン(spectrin)およびフィンブリン(fimbrin)などのアクチン架
橋タンパク質に見られるカルポニン相同性(CH)ドメインのような、タンパク質間
相互作用ドメインの特徴を有する。細胞外マトリクス受容体および細胞骨格間の
接触を媒介する巨大分子複合体である接着斑に主に局在する他のタンパク質は、
LIM ドメインとして知られるタンパク質間相互作用モチーフを有する。例えば、
ジキシン(zyxin )はアクチンの構築の空間的調節に関与しており、三つの直列型
LIMドメインを含んでいる。ジキシンはまた、そのプロリン豊富N末端によってα
アクチニンと相互作用する(Beckerle, M. C. (1997) BioEssays 19:949-957)。
細胞骨格タンパク質はいくつかの疾患に関連している。筋ジストロフィー、ネフ
ローゼ症候群および拡張型心筋症などの病態はαアクチニン-3の差次的発現に関
連している(Vainzof, M. et al. (1997) Neuropediatrics 28:223-228; Smoyer,
W.E. および Mundel, P. (1998) J. Mol. Med. 76:172-183; Sussman, M.A. ら
(1998) J. Clin. Invest. 101:51-61)。αアクチニンおよびいくつかのMAPは平
野小体に存在し、アルツハイマー病のような神経変性疾患を持つ老人および患者
においてしばしば見られる(Maciver, S.K. および Harrington, C.R. (1995) Ne
uroreport. 6:1985-1988)。異常なアクチンバンドリング(束ねる)タンパク質で
あるアクチニン-４は転移性癌細胞の細胞運動に関連すると思われる。他の疾患
との関連性としては、腫瘍組織からの細胞の分裂時にしばしば見られる未熟染色
体の凝縮(Murnane, J.P. (1995) Cancer Metastasis Rev. 14:17-29) およびウ
イルス性病原における軸糸およびアセンブリMAPの重要な役割がある(Sodeik, B.
ら (1997) J. Cell Biol. 136:1007-1021)。中間径フィラメントおよび関連タンパク質 中間径フィラメント(IF)は直径10nmの細胞骨格線維であり、ミクロフィラメント
と微小管の直径の中間の大きさである。これらは細胞の構造的役割を果たしてお
り、細胞を強化し、組織化する。IFは特に上皮細胞および神経細胞に豊富である
。IFは極めて安定であり、ミクロフィラメントや微小管とは異なり、細胞運動に
は関与しない。IFタンパク質には酸性ケラチン、塩基性ケラチン、デスミン、GF
Aタンパク(glial fibrillary acidic protein)、ペリフェリン、神経細線維、ネ
スチンおよびラミンズ(lamins)が含まれている。 IFは短い非螺旋状リンカー区分が割り込んでいる中心α螺旋状桿状領域を有する
。この桿状領域はたいてい、非螺旋状頭尾(ヘッドアンドテイル)ドメインによっ
て区分されている。中間径フィラメントタンパク質の桿状領域は結合してコイル
ドコイル二量体を形成する。極めて順序よい構築過程を通じて二量体からIFを生
じる。ミクロフィラメントや微小管の構築とは異なり、IF構築にはATPまたはGTP
のどちらも必要でない。 IF関連タンパク質(IFAP)はIF間の相互作用および他の細胞構造との相互作用を媒
介する。IFAPは束状またはネットワークにIFを架橋するか、あるいは原形質膜に
架橋する。またIFをミクロフィラメントや微小管細胞骨格に架橋する場合がある
。微小管とIFは特に密接に関連している。IFAPにはBPAG1、プラコグロビン、デ
スモプラキンI、デスモプラキンII、プレクチン(plectin)、アンキリン( ankyri
n)、フィラグリン (filaggrin)およびラミンB受容体が含まれる。 アンキリンのN末端部分は、特異的タンパク質間相互作用に関与するアンキリン
反復である33アミノ酸モチーフの反復からなっている。異なったアンキリン反復
がチュブリン、アニオン交換タンパク質、電位依存性ナトリウムチャネル、Na+/
K+-ATPaseおよびニューロファシン（neurofascin）との結合に関与するように、
モチーフ内の可変領域は特異的タンパク質結合を担っている。アンキリンモチー
フはまた、NF-κ-Bまた酵母においては細胞周期タンパク質CDC10、SW14およびSW
16のような転写因子にある。Drosophila Notch やLIN-12 およびGLP-1のC. eleg ans のような組織分化に関連するタンパク質にもアンキリン様反復が含まれてい
る。Lux ら (1990; Nature 344:36-42) によって、アンキリン様反復は「組込み
」アンキリンとして働き、内在性膜タンパク質、チューブリンおよびその他のタ
ンパク質のための結合部位を形成することが示されている。 細胞骨格膜アンカー 細胞骨格線維は特異的タンパク質によって原形質膜に接着している。これらの接
着は細胞の形状維持や筋肉収縮にとって重要である。赤血球において、スペクト
リン-アクチン細胞骨格は三つのタンパク質、バンド4.1、アンキリンおよびアデ
ュシン(adducing)によって細胞膜に接着される。この接着に欠陥があると、異常
な形状の細胞になり、それらの細胞は脾臓によってより急速に分解され、貧血を
起こさせる。血小板においては、スペクトリン-アクチン細胞骨格はまた、アン
キリンによって膜に結合されており、二番目のアクチンネットワークがフィラミ
ンによって膜に固着されている。筋肉細胞において、タンパク質ジストロフィン
はアクチン微細線維(フィラメント)を原形質膜に結合しており、ジストロフィン
遺伝子の突然変異によってデュセンヌ型筋ジストロフィーが生じる。接着結合お
よび接触プラークにおいては、アクチン微細線維は周辺膜タンパク質であるαア
クチニンおよびビンキュリンによって細胞膜に結合される。 IFはまた細胞骨格膜アンカーによって膜に接着される。核ラミナはラミンB受容
体によって核膜の内部表面に接着されている。ビメンチンIFはアンキリンとプレ
クチンによって原形質膜に接着されている。デスモソームおよびヘミデスモソー
ム膜接合部で臓器と皮膚の上皮細胞は結合されている。これらの膜接合部によっ
て剪断変形力が上皮細胞層全体に分布され、したがって、上皮細胞に強度と硬性
が与えられる。上皮細胞のIFはプロコグロビンとデスモプラキンによってデスモ
ソーム(接着斑)に接着している。IFをヘミデスモソームに結合するタンパク質は
わかっていない。デスミンIFは筋肉において筋節を包囲しており、パラネミン、
シネミン(synemin)およびアンキリンによって原形質膜に結合している。赤血球膜骨格のタンパク質 脊椎動物の体内の酸素分布は赤血球によって影響される。酸素は周囲の水または
大気から、鰓上皮または肺上皮タイプ I 細胞を通して拡散される。次に、酸素
は血液毛細血管内皮を通って直接血液循環系に入り、赤血球の膜を通過し、細胞
質の可溶性オキシヘモグロビンに保存される。酸素はヘモグロビンから臓器内の
各部位に遊離され、赤血球から他の標的細胞に送られる。赤血球膜および他の赤
血球以外の細胞膜の構造は、細胞内部分への酸素を効率的に拡散できるように維
持される必要がある。 赤血球膜は、i) 多くの二重層貫通タンパク質が埋め込まれたコレステロール豊
富なリン脂質二重層、ii) 外部のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカ
ータンパク質(GPIタンパク)、および iii) バイレイヤーの内部表面を積層する
赤血球骨格または膜骨格から構成されている。バイレイヤー貫通タンパク質には
陰イオン交換体、グリコホリン、糖輸送体および種々の陽イオン輸送体およびポ
ンプが含まれる。赤血球GPI タンパク質にはアセチルコリンエステラーゼおよび
補体反応調節因子(CD55)が含まれる。骨格タンパク質は、原形質膜の裏打ち、ま
たは細胞質内側の表面に組織化される。これらのタンパク質にはタンパク質4.1
、タンパク質 p 55、αおよびβスペクトリン、アクチンおよびデマチン、トロ
ポミオシンおよびトロポモジュリンなどのアクチン結合タンパク質が含まれる。
αおよびβスペクトリンはin vivoで結合してヘテロ四量体を形成する。スペク
トリンへテロ四量体は六角形の網目を持つ、裏打ちの二次元構造のネットワーク
に組織化される。このネットワークはβスペクトリン、アンキリン、陰イオン交
換体およびタンパク質4.2を含むタンパク質複合体によって、またタンパク質4.1
、グリコホリンCおよびタンパク質p 55間の「三角関係の」相互作用によって、
バイレイヤー貫通タンパク質に結合している。赤血球膜タンパク質の構造的機能
的変異体は種々の組織において見られる。変異体は例えば、陰イオン交換体、ア
ンキリンまたはスペクトリンなどの多重遺伝子ファミリーから、あるいは、タン
パク質4.1またはタンパク質4.2一つのような単一遺伝子ファミリーから転写され
る。mRNA転写物は組織特異選択的スプライシングを受ける。多くの先天性溶血性
貧血は赤血球膜タンパク質をコードする上述の遺伝子における突然変異から生じ
る。例えば、遺伝性楕円赤血球症はスペクトリン四量体のヘッドツーヘッド自己
結合領域で、またはその近くでのスペクトリン遺伝子の配列の突然変異から生じ
るか、またはタンパク質4.1のレベルを減少するタンパク質4.1遺伝子における突
然変異から生じる。他の例では、遺伝性球状赤血球症はアンキリン遺伝子、陰イ
オン交換遺伝子、タンパク質4.2遺伝子あるいは、αおよびβスペクトリン遺伝
子における突然変異に関連する。 (Delaunay J. (1995) Transfus. Clin. Biol.
2:207-216.) タンパク質4.1は四つの機能的ドメインを有する80キロダルトンの赤血球膜タン
パク質である。これらのドメインには、i) アクチン結合タンパク質および膜貫
通タンパク質結合のERM(Ezrin/ラディキシン/モエシン) ファミリーに相同性の
ある30kDaの塩基性N末端ドメイン(Tsukita, S. et al.(1997) Trends Biochem.
Sci. 22:53-58)、ii) プロテインキナーゼCリン酸化部位を含む、16 kDa の親水
性ドメイン、iii) スペクトリンおよびアクチンとの相互作用に重要なcAMP依存
性プロテインキナーゼリン酸化部位を含む10 kDa の高荷電ドメイン、およびiv)
22/24 kDa の酸性ドメインがある。タンパク質 4.1 は構造的、機能的に関連す
るタンパク質4.1ファミリのメンバーである。タンパク質4.1ファミリは多くのチ
ロシンホスファターゼを含む進化的に関連するタンパク質スーパーファミリの一
部である(Baklouti, F. ら (1997) Genomics 39:289-302.)。 成熟型除核赤血球におけるタンパク質4.1の正確な裏打ちの局在化とは逆に、タ
ンパク質4.1エピトープ(抗原決定基)は有核細胞の細胞質部分や核骨格のいたる
ところに見られる。 特に、タンパク質4.1は中間期の間は核骨格に、有糸分
裂時には紡錘体に、分裂終止期には染色体周囲に、細胞質分裂時にはmidbody に
存在する。 (Krauss, S.W. ら. (1997) J. Cell Biol. 137:275-289.) 多数のmRNAスプライス変異体になるタンパク質4.1遺伝子の示差発現は種々のヒ
トおよびげっ歯類の組織に観察されている。遺伝子構造とmRNAスプライス変異体
の比較によって、異種間のタンパク質4.1の極端なゲノム配列の保存が明らかに
なった。ヒトおよびげっ歯類のmRNA種属の5' UTR の同定および配列決定は成功
していないが、これはおそらく、ヌクレオチドシークエンシング反応時に技術的
複雑な事態を起こさせるGCが豊富な領域に起因すると思われる。(Baklouti、前
出; Conboy, J.G. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9062-9065) ERMファミリのタンパク質に含まれるタンパク質の分析は、N 末端ドメインがCD4
4のような細胞内ドメインの膜貫通タンパク質と相互作用し、C末端ドメインがア
クチンと結合することを示した。両方の相互作用は、Rho-GTP タンパク質複合体
であるポリホスホイノシチドとセリン/チロシンキナーゼとの相互作用に関連し
、またチロシンキナーゼの活性に関連する。ERMタンパク質の多くのリン酸化部
位は保存されている。in vivo のERMタンパク質の発現は内皮のような組織に限
定されているが、ERMタンパク質遺伝発現の阻止は細胞培養の状態の下で解除さ
れる。 (Tsukita、 前出.) 裏打ちのアクチンの細胞骨格は種々の膜に基づく過程に関与するが、この過程で
は、関連する分子成分の機能的可塑性を大量に必要とする。バンド4.1に相同性
のあるタンパク質のファミリは、種々の刺激に応答したアクチン細胞骨格の再組
織化に関与しており、おそらく、膜貫通シグナル伝達に関与すると思われる。こ
のファミリには、チロシンホスファターゼ、チロシンキナーゼの基質および腫瘍
抑制遺伝子の候補が含まれる(Arpin M, et al. (1994) Curr. Opin. Cell Biol.
6:136-141)。 多くの病態や疾患において細胞骨格タンパク質相互作用における破壊が同定され
ている。神経線維腫症タイプ2は神経系の常染色体優勢疾患である。神経線維腫
症タイプ2患者から単離されたシュワン細胞は、対照のシュワン細胞と異なる、
特徴的形態および増殖パラメータを有する。神経線維腫症タイプ2に関連する遺
伝子は同定されており、NF2と呼ばれている。schwannomin あるいは マーリンと
して知られているNF2 遺伝子産生物はタンパク質4.1スーパーファミリのメンバ
ーであり、NF2遺伝子の突然変異がこの疾患に関連することが示されている。(Ro
senbaum, C. ら (1998) Neurobiol. Dis. 5:55-64.)さらに、乾癬の形成は赤血
球タンパク質4.1の類似体の表皮性上皮における変異発現または分布によるもの
である。(Shimizu, T. (1996) Histol. Histopathol. 11:495-501.)スペクトリ
ンやタンパク質4.1における突然変異体を持つ赤血球は、熱帯熱マラリア原虫(Pl asmodium falciparum) による侵入に対する感受性が異なることを示した。 (Face
r, C.A. (1995) Parasitol Res. 81:52-57.)さらに、赤血球タンパク質4.1に対
して産生された抗体によって、アルツハイマー病患者脳組織の前頭前野の皮質お
よび海馬における神経原線維濃縮体の大部分が染色された。68kDaのタンパク質
は、たぶん赤血球タンパク質4.1の脳類似体であろうと確認された。(Sihag, R.K
. ら (1994) Brain Res. 656:14-26.) 新規の細胞骨格結合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発
見により、新規の組成物を提供することで当分野の需要に応えることができる。 この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送障害
、神経疾患、細胞運動、生殖疾患おｙび筋肉疾患の診断・予防・治療において有
用であり、また、細胞骨格結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現に
おける外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
。細胞骨格は細胞膜を支え、トラックを形成し、細胞小器官や他の要素はそれら
のトラックに沿って細胞質ゾル内を動く。細胞骨格は動的な構造をしており、細
胞が種々の形状をとり、有向性移動が行えるようになっている。更に、分子は細
胞骨格結合タンパク質との相互作用によって特定の細胞の位置に隔離される。主
要細胞骨格線維はミクロフィラメント、微小管および中間径フィラメントである
。ミオシン、ダイニンおよびキネシンなどの運動タンパク質は線維の運動を駆動
したり、線維に沿って運動する。細胞骨格膜アンカーは細胞膜に線維を結合させ
るが、付属タンパク質または結合タンパク質は線維の構造または活性を修飾する
。細胞骨格に結合する他のタンパク質は分泌や細胞内シグナル伝達のような過程
において役割を果たしている。(細胞骨格についてはLodish, H. ら (1995) Mole cular Cell Biology Scientific American Books, New York NYを参照。)微小管および結合タンパク質 チューブリン 直径24nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で複数の役割を果たしている。束
になった微小管は繊毛や鞭毛を形成し、両者は細胞膜の鞭状の伸長であり、繊毛
は上皮上の物質を一掃するのに必要で、鞭毛は精子の遊泳に必要である。赤血球
や血小板の微小管の辺縁領域はこれらの細胞の柔軟性の維持に重要である。細胞
小器官、膜小胞やタンパク質は、細胞内で微小管のトラックに沿って輸送される
。例えば、微小管は神経細胞アクソンの中を通っており、細胞体と神経末端の間
で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。神経末端にこれらの小胞を供
給できないと、神経のシグナル伝達が妨げられる。紡錘体をした微小管はまた、
細胞分裂時の染色体運動に重要である。安定な微小管集団と短命な微小管集団の
両方が細胞内に存在する。 微小管はGTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる高分子である。
各々のサブユニットは、α-チューブリンおよびβ-チューブリンのヘテロ二量体
で、それぞれイソ型が存在する。α-チューブリンはアセチル化、ポリグルタミ
ル化、2つのアミノ酸の切断(Δ2 チューブリン形成)、チロシン化などの多くの
翻訳後修飾が行われる。場合によっては、これらの修飾は微小管の安定性に影響
する。GTPの加水分解によって、微小管の末端にチューブリンサブユニットが付
加して結合する。このサブユニットは頭と尾部が相互作用してプロトフィラメン
トを形成するが、このプロトフィラメントは側面どうしが相互作用して微小管を
形成している。微小管は極性があり、片方の末端はα-チューブリンに、他の末
端はβ-チューブリンに取り囲まれており、この2つの末端はアセンブリの割合が
異なっている。各々の微小管は通常13のプロトフィラメントで構成されているが
、11または15のプロトフィラメントの微小管の場合もある。繊毛と鞭毛は2つの
微小管を含んでいる。微小管は中心体または微小管形成中心(MTOC)として知られ
ている特殊構造体から成長する。微小管形成中心は一つまたは二つの中心小体を
含んでおり、三つ組の微小管の風車配列になっている。繊毛または鞭毛の底にあ
る形成中心である基底小体には一つの中心小体(中心粒)が含まれる。中心形成に
存在するγチューブリンは、αおよびβチューブリンヘテロ二量体の重合の核形
成に重要であるが、微小管には重合しない。タンパク質中心周囲はMTOC に見ら
れ、微小管のアセンブリに関与している。微小管結合タンパク質 微小管結合タンパク質(MAP)は微小管の構築と安定化に関与している。アセンブ
リMAPである、一つの主要ファミリーの微小管結合タンパク質は神経細胞および
非神経細胞性の細胞においても同定される。アセンブリMAPは細胞質ゾル内の微
小管の架橋をも担っている。これらのMAPは塩基性微小管結合ドメインと酸性プ
ロジェクションドメインの二つのドメインを形成している。プロジェクションド
メインは膜、中間径フィラメントまたは他の微小管の結合部位である。配列解析
に基づいて、アセンブリMAPをタイプI とタイプ IIの2つの種類に分けることが
出来る。 タイプIMAPにはMAP1A と MAP1Bがあり、微小管で同時精製される大型の糸状の分
子であり、脳や精巣に多く発現する。これらは陽性に帯電したアミノ酸配列モチ
ーフのいくつかの繰り返しを含み、陰性に帯電したチューブリンを中和して微小
管の安定化を招く。MAP1A および MAP1B の各々は一つの前駆体ポリペプチドか
ら由来しており、後にタンパク分解性に処理されて、一本の重鎖と一本の軽鎖を
形成する。 別の軽鎖であるLC3は16.4 kDa (キロダルトン)あり、MAP1A、 MAP1Bおよび微小
管と結合する。LC3 はMAP1A または MAP1B 転写物以外の源泉から合成され、LC3
の発現は細胞増殖時のMAP1A または MAP1B の微小管結合活性の調節に重要であ
ることが示唆されている(Mann, S. S. ら (1994) J. Biol. Chem. 269:11492-11
497)。 MAP2a、MAP2b、 MAP2c、 MAP4 および Tauを含むタイプIIMAPは、微小管結合ド
メインの18残基配列を3つないし4つのコピーを有することが特徴である。MAP2a
、MAP2bおよび MAP2c は樹状突起のみに見られ、MAP4は 非神経細胞性細胞にあ
り、Tauは神経細胞の軸索(アクソン)と樹状突起に見られる。別のTau mRNAのス
プライシングによってTauタンパク質の複数の形態が存在するようになる。アル
ツハイマー疾患、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症および家
族性前線側頭部痴呆症(frontotemporal dementia )および染色体17に関連するパ
ーキンソン病のような神経変性疾患ではTauのリン酸化が変更される。Tauリン酸
化が変更されることによって微小管網が破壊され、神経細胞内Tau凝集の形成が
生じる(Spillantini, M.G. および Goedert, M. (1998) Trends Neurosci. 21:4
28-433)。 微小管の安定性はまた、微小管の長さを切断することによって調節される。AAA
アデノシン三リン酸分解酵素(ATPase) スーパーファミリーに属するタンパク質
カタニンはATP加水分解エネルギーを用いて安定な微小管を切断し、分解する。
カタニンは中心体からの微小管の遊離、紡錘体アセンブリの調節、および細胞周
期が推移する間の微小管代謝回転の促進を担っている (Hartman, J.J. およびVa
le, R.D. (1999) Science 286:782-785)。 微小管凝集はいくつかの疾患に関連している。ヒトから得た骨格外粘液様軟骨肉
腫腫瘍には粗面小胞体内の微小管の平行配列が含まれていた(Suzuki, T. ら (19
88) J. Pathol. 156:51-57)。微小管凝集体はC型ウイルス肝炎に感染したチン
パンジーから採取した肝細胞にも見られた。これらの凝集体に作製されたモノク
ーロナル抗体によって、p44(または微小管凝集タンパク質)と呼ばれるタンパク
質が検出されている (Maeda, T. ら (1989) J. Gen. Virol. 70:1401-1407)。p
44のヒト相同体はインターフェロン-αおよびインターフェロン-βによって誘導
されるが、インターフェロン-γによっては誘導されない。P44はインターフェロ
ンの抗ウイルス性作用における媒介物であると思われる(Kitamura, A. ら (1994
) Eur. J. Biochem. 224:877-883)。 ダイニン関連モータータンパク質 ダイニンは微小管上で作用する(-)末端指向型運動タンパク質である。細胞質性
と軸糸性の2種のダイニンがある。細胞質ダイニンは細胞質微小管に沿って物質
の移行を担い、例えば、神経末端から細胞体への輸送やエンドサイトーシス小胞
のリソソームへの輸送などに関与する。細胞質内ダイニンはまた、有子分裂にも
関与していることが報告されている。軸糸のダイニンはまた鞭毛や繊毛を動きに
関与する。一つの微小管ダブレット(２配列)上のダイニンは隣接する微小管ダブ
レットにそって「歩く」ようにして動く。この滑りによって屈曲力が生じ、鞭毛
または繊毛を拍動させる。ダイニンは1000から2000キロダルトンの間の天然質量
を有し、力を生じる頭部が２個ないし３個あり、それらはATPの加水分解によっ
て駆動される。この頭部はストークを介して基部ドメインに連結しており、この
基部ドメインは極めて異なった数からなる付属の中間鎖や軽鎖から構成されてい
る。キネシン関連モータータンパク質 キネシンは微小管上で作用する(＋)末端指向型運動タンパク質である。プロトタ
イプのキネシン分子は膜結合小胞や細胞小器官の輸送に関与する。この機能は神
経細胞における軸糸輸送のために特に重要である。また、すべての細胞タイプに
おいてキネシンはゴルジ複合体から小胞体への小胞輸送に重要である。この役割
はこれらの分泌性細胞小器官の独自性や機能性を保持するために極めて大切であ
る。 キネシンは、50以上のタンパク質から成る偏在する保存されたタンパク質ファミ
リーであり、それらは、一次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度および細胞
機能に基づいて少なくとも8つのサブファミリに分類される。(Moore, J.D. およ
び S.A. Endow (1996) Bioessays 18:207-219、Hoyt, A.M. (1994) Curr. Opin.
Cell Biol. 6:63-68を参照。)プロトタイプのキネシン分子は2個のポリペプチ
ド重鎖(KHCs) と2個のポリペプチド軽鎖(KLC)からなるヘテロ四量体である。KHC
サブユニットは通常「キネシン」と呼ばれる。KHCは長さが約1000のアミノ酸で
あり、KLCは長さが約550のアミノ酸である。2個のKHCは二量体化されて、三つの
異なる部分の二次構造を有する桿状体分子を形成する。分子の一端には、ATP加
水分解と微小管結合において機能する球状運動ドメインがある。キネシン運動ド
メインは非常に保存されており、70%以上の同一性を有する。モータドメインの
先には二量体化を媒介するα螺旋状コイルドコイル領域がある。分子の他の端に
は分子カーゴと結合している扇状の尾がある。この尾はKHC C末端と2つのKLCの
相互作用によって形成される。 キネシンのさらに分岐したサブファミリに属するものはキネシン関連タンパク質
(KRPs)と呼ばれ、これらの多くは真核生物の有糸分裂の際に作用する(Hoyt、 前 出 )。KRPによって紡錘体の構築に必要とされるものもある。in vivo およびin v itro 分析ではこれらのKRPは紡錘体を構成する微小管上で力を発揮し、紡錘体極
の分離を生じることが示唆されている。この活性のために、KRPのリン酸化が必
要とされる。紡錘体が構築できないと、有糸分裂が不成功に終わったり、染色体
異数性が生じ、後者は癌細胞の特徴である。さらに、セントロメアタンパク質E
と呼ばれる固有のKRPはヒト有糸分裂染色体の動原体に局在化し、反対の紡錘体
極への分離に関与する。ミクロフィラメントおよび関連タンパク質 アクチン 直径7-9nmの細胞骨格フィラメントであるミクロフィラメントは細胞の移動運動
、細胞の形状、細胞接着、細胞分裂および筋肉収縮にとって重要である。ミクロ
フィラメントの構築および分解によって細胞はその形態を変えることができる。
ミクロフィラメントは真核生物細胞において最も豊富な細胞内タンパク質である
アクチンの重合したものである。ヒト細胞には6個のイソ型のアクチンが含まれ
ている。三つのαアクチンが異なった種類の筋肉にあり、非筋肉βアクチンおよ
び非筋肉γアクチンは非筋肉細胞にあり、また他のγアクチンは腸の平滑筋細胞
にある。アクチンの単量体であるGアクチンは、極性のある螺旋状Fアクチンフィ
ラメントに重合し、ATPのADPへの加水分解が同時に生じる。アクチンフィラメン
トは結合して束やネットワークを形成し、原形質膜を支持する枠組みを与え、細
胞を形作る。これらの束やネットワークは細胞膜に接続している。筋肉細胞では
、収縮時にアクチンを含む細いフィラメントは運動タンパク質のミオシンを含む
太いフィラメントを滑って通過する。他のアクチン関連フィラメントはアクチン
細胞骨格の一部ではなく、むしろ微小管やダイニンに結合する。アクチン結合タンパク質 アクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの架橋、切断および安定化、ま
たアクチン単量体の隔離に関与している。アクチン結合タンパク質のいくつかは
複数の機能を有している。アクチンフィラメントの束やネットワークは共にアク
チン架橋タンパク質によって保持されている。これらのタンパク質は各フィラメ
ントに一個づつの合計2つのアクチン結合部位を有する。短い架橋タンパク質は
束形成を促進し、他方、長くてより柔軟性のある架橋タンパク質はネットワーク
形成を促進する。アクチン架橋タンパク質のカルモジュリン様カルシウム結合ド
メインによって架橋のカルシウム調節が可能となる。I 群の架橋タンパク質は
独特のアクチン結合ドメインを持ち、30 Kd タンパク質、EF-1a、ファシン(fasc
in)やスクルイン(scruin)等が含まれる。II 群の架橋タンパク質は7,000-MW ア
クチン結合ドメインを有し、ビリン(villin)やデマチン(dematin)等が含まれる
。III群架橋タンパク質は対の26,000-MW アクチン結合ドメインを有し、アルフ
ァアクチニン、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィン、ABP120およびフ
ィラミン(filamin)が含まれる。 タンパク質を切断することによって、短い断片に切るか、またはその端をブロッ
クすることによってアクチンフィラメントの長さが調節される。タンパク質の切
断には、gCAP39、セベリン(フラグミン)、ゲルソリンおよびビリンが含まれる。
タンパク質のキャッピングはアクチンフィラメントの端にキャップを形成するが
、フィラメントを切ることはできない。タンパク質のキャッピングにはCapZ、ト
ロポモジュリンおよびテンシンが含まれる。 接着斑に見られるテンシンもまたアクチンフィラメントを架橋する。細胞外マト
リックスによるインテグリン活性によってチロシン、セリンおよびスレオニン残
基上のテンシンのリン酸化が生じるが、このリン酸化は発癌遺伝子で形質転換さ
れた細胞においても生じる。テンシンにはSH2ドメインがあり、他のチロシンリ
ン酸化タンパク質と結合する場合もある (Lo, S.H. ら (1997) J. Cell Biol. 1
36:1349-1361)。テンシンのN 末端には酵母(Saccharomyces cerevisiae)の推定
上のチロシンホスファターゼ(PTP)の触媒的ドメインに相同的な領域が含まれて
いる。テンシンのこのPTPドメインはリン酸化ポリペプチドとの結合作用を媒介
する(Haynie, D.T. および Ponting, C.P. (1996) Protein Sci. 5:2643-2646)
。テンシン遺伝子を持たないマウスは腎臓に異常があり、テンシンの喪失は腎臓
における接着斑を弱化することを示す(Lo、前出)。 タンパク質のチモシンとプロフィリンは細胞基質内でアクチン単量体を隔離し、
非重合アクチンの存在を可能にする。プロフィリンはまた、アクチン単量体の付
加に必要な臨界濃度を効果的に下げてFアクチンの形成を刺激する (Gertler, F.
B. ら(1996) Cell 87:227-239)。 アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニンおよびカルデスモンは筋
肉収縮をカルシウムに応答して調節する。このトロポミオシンタンパク質は筋肉
細胞および非筋肉細胞に見られ、α螺旋状であり、コイルドコイル二量体を形成
している。横紋筋のトロポミオシンはトロポニン複合体とアクチン間の相互作用
を媒介し、筋肉収縮を調節する(PROSITE PDOC00290トロポミオシン・シグネチャ
)。トロポミオシン複合体はトロポニン-T、トロポニン-I およびトロポニン-Cか
ら構成される。トロポニン-Tはトロポミオシン、結合トロポニン-I およびトロ
ポニン-C をトロポミオシンに結合する。 アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニンおよびカルデスモンは筋
肉収縮をカルシウムに応答して調節する。このトロポミオシンタンパク質は筋肉
細胞および非筋肉細胞に見られ、α螺旋状であり、コイルドコイル二量体を形成
している。横紋筋トロポミオシンはトロポニン複合体とアクチン間の相互作用を
媒介し、筋肉収縮を調節する(PROSITE PDOC00290トロポミオシン・シグネチャ)
。トロポミオシン複合体はトロポニン-T、トロポニン-I およびトロポニン-Cか
ら構成される。トロポニン-Tはトロポミオシン、結合トロポニン-I およびトロ
ポニン-C をトロポミオシンに結合する。 アクチンのアセンブリの調節に関与する多くのタンパク質は、例えば、αアクチ
ニン、スペクトリン(spectrin)およびフィンブリン(fimbrin)などのアクチン架
橋タンパク質に見られるカルポニン相同性(CH)ドメインのような、タンパク質間
相互作用ドメインの特徴を有する。細胞外マトリクス受容体および細胞骨格間の
接触を媒介する巨大分子複合体である接着斑に主に局在する他のタンパク質は、
LIM ドメインとして知られるタンパク質間相互作用モチーフを有する。例えば、
ジキシン(zyxin )はアクチンの構築の空間的調節に関与しており、三つの直列型
LIMドメインを含んでいる。ジキシンはまた、そのプロリン豊富N末端によってα
アクチニンと相互作用する(Beckerle, M. C. (1997) BioEssays 19:949-957)。
細胞骨格タンパク質はいくつかの疾患に関連している。筋ジストロフィー、ネフ
ローゼ症候群および拡張型心筋症などの病態はαアクチニン-3の差次的発現に関
連している(Vainzof, M. et al. (1997) Neuropediatrics 28:223-228; Smoyer,
W.E. および Mundel, P. (1998) J. Mol. Med. 76:172-183; Sussman, M.A. ら
(1998) J. Clin. Invest. 101:51-61)。αアクチニンおよびいくつかのMAPは平
野小体に存在し、アルツハイマー病のような神経変性疾患を持つ老人および患者
においてしばしば見られる(Maciver, S.K. および Harrington, C.R. (1995) Ne
uroreport. 6:1985-1988)。異常なアクチンバンドリング(束ねる)タンパク質で
あるアクチニン-４は転移性癌細胞の細胞運動に関連すると思われる。他の疾患
との関連性としては、腫瘍組織からの細胞の分裂時にしばしば見られる未熟染色
体の凝縮(Murnane, J.P. (1995) Cancer Metastasis Rev. 14:17-29) およびウ
イルス性病原における軸糸およびアセンブリMAPの重要な役割がある(Sodeik, B.
ら (1997) J. Cell Biol. 136:1007-1021)。中間径フィラメントおよび関連タンパク質 中間径フィラメント(IF)は直径10nmの細胞骨格線維であり、ミクロフィラメント
と微小管の直径の中間の大きさである。これらは細胞の構造的役割を果たしてお
り、細胞を強化し、組織化する。IFは特に上皮細胞および神経細胞に豊富である
。IFは極めて安定であり、ミクロフィラメントや微小管とは異なり、細胞運動に
は関与しない。IFタンパク質には酸性ケラチン、塩基性ケラチン、デスミン、GF
Aタンパク(glial fibrillary acidic protein)、ペリフェリン、神経細線維、ネ
スチンおよびラミンズ(lamins)が含まれている。 IFは短い非螺旋状リンカー区分が割り込んでいる中心α螺旋状桿状領域を有する
。この桿状領域はたいてい、非螺旋状頭尾(ヘッドアンドテイル)ドメインによっ
て区分されている。中間径フィラメントタンパク質の桿状領域は結合してコイル
ドコイル二量体を形成する。極めて順序よい構築過程を通じて二量体からIFを生
じる。ミクロフィラメントや微小管の構築とは異なり、IF構築にはATPまたはGTP
のどちらも必要でない。 IF関連タンパク質(IFAP)はIF間の相互作用および他の細胞構造との相互作用を媒
介する。IFAPは束状またはネットワークにIFを架橋するか、あるいは原形質膜に
架橋する。またIFをミクロフィラメントや微小管細胞骨格に架橋する場合がある
。微小管とIFは特に密接に関連している。IFAPにはBPAG1、プラコグロビン、デ
スモプラキンI、デスモプラキンII、プレクチン(plectin)、アンキリン( ankyri
n)、フィラグリン (filaggrin)およびラミンB受容体が含まれる。 アンキリンのN末端部分は、特異的タンパク質間相互作用に関与するアンキリン
反復である33アミノ酸モチーフの反復からなっている。異なったアンキリン反復
がチュブリン、アニオン交換タンパク質、電位依存性ナトリウムチャネル、Na+/
K+-ATPaseおよびニューロファシン（neurofascin）との結合に関与するように、
モチーフ内の可変領域は特異的タンパク質結合を担っている。アンキリンモチー
フはまた、NF-κ-Bまた酵母においては細胞周期タンパク質CDC10、SW14およびSW
16のような転写因子にある。Drosophila Notch やLIN-12 およびGLP-1のC. eleg ans のような組織分化に関連するタンパク質にもアンキリン様反復が含まれてい
る。Lux ら (1990; Nature 344:36-42) によって、アンキリン様反復は「組込み
」アンキリンとして働き、内在性膜タンパク質、チューブリンおよびその他のタ
ンパク質のための結合部位を形成することが示されている。 細胞骨格膜アンカー 細胞骨格線維は特異的タンパク質によって原形質膜に接着している。これらの接
着は細胞の形状維持や筋肉収縮にとって重要である。赤血球において、スペクト
リン-アクチン細胞骨格は三つのタンパク質、バンド4.1、アンキリンおよびアデ
ュシン(adducing)によって細胞膜に接着される。この接着に欠陥があると、異常
な形状の細胞になり、それらの細胞は脾臓によってより急速に分解され、貧血を
起こさせる。血小板においては、スペクトリン-アクチン細胞骨格はまた、アン
キリンによって膜に結合されており、二番目のアクチンネットワークがフィラミ
ンによって膜に固着されている。筋肉細胞において、タンパク質ジストロフィン
はアクチン微細線維(フィラメント)を原形質膜に結合しており、ジストロフィン
遺伝子の突然変異によってデュセンヌ型筋ジストロフィーが生じる。接着結合お
よび接触プラークにおいては、アクチン微細線維は周辺膜タンパク質であるαア
クチニンおよびビンキュリンによって細胞膜に結合される。 IFはまた細胞骨格膜アンカーによって膜に接着される。核ラミナはラミンB受容
体によって核膜の内部表面に接着されている。ビメンチンIFはアンキリンとプレ
クチンによって原形質膜に接着されている。デスモソームおよびヘミデスモソー
ム膜接合部で臓器と皮膚の上皮細胞は結合されている。これらの膜接合部によっ
て剪断変形力が上皮細胞層全体に分布され、したがって、上皮細胞に強度と硬性
が与えられる。上皮細胞のIFはプロコグロビンとデスモプラキンによってデスモ
ソーム(接着斑)に接着している。IFをヘミデスモソームに結合するタンパク質は
わかっていない。デスミンIFは筋肉において筋節を包囲しており、パラネミン、
シネミン(synemin)およびアンキリンによって原形質膜に結合している。赤血球膜骨格のタンパク質 脊椎動物の体内の酸素分布は赤血球によって影響される。酸素は周囲の水または
大気から、鰓上皮または肺上皮タイプ I 細胞を通して拡散される。次に、酸素
は血液毛細血管内皮を通って直接血液循環系に入り、赤血球の膜を通過し、細胞
質の可溶性オキシヘモグロビンに保存される。酸素はヘモグロビンから臓器内の
各部位に遊離され、赤血球から他の標的細胞に送られる。赤血球膜および他の赤
血球以外の細胞膜の構造は、細胞内部分への酸素を効率的に拡散できるように維
持される必要がある。 赤血球膜は、i) 多くの二重層貫通タンパク質が埋め込まれたコレステロール豊
富なリン脂質二重層、ii) 外部のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカ
ータンパク質(GPIタンパク)、および iii) バイレイヤーの内部表面を積層する
赤血球骨格または膜骨格から構成されている。バイレイヤー貫通タンパク質には
陰イオン交換体、グリコホリン、糖輸送体および種々の陽イオン輸送体およびポ
ンプが含まれる。赤血球GPI タンパク質にはアセチルコリンエステラーゼおよび
補体反応調節因子(CD55)が含まれる。骨格タンパク質は、原形質膜の裏打ち、ま
たは細胞質内側の表面に組織化される。これらのタンパク質にはタンパク質4.1
、タンパク質 p 55、αおよびβスペクトリン、アクチンおよびデマチン、トロ
ポミオシンおよびトロポモジュリンなどのアクチン結合タンパク質が含まれる。
αおよびβスペクトリンはin vivoで結合してヘテロ四量体を形成する。スペク
トリンへテロ四量体は六角形の網目を持つ、裏打ちの二次元構造のネットワーク
に組織化される。このネットワークはβスペクトリン、アンキリン、陰イオン交
換体およびタンパク質4.2を含むタンパク質複合体によって、またタンパク質4.1
、グリコホリンCおよびタンパク質p 55間の「三角関係の」相互作用によって、
バイレイヤー貫通タンパク質に結合している。赤血球膜タンパク質の構造的機能
的変異体は種々の組織において見られる。変異体は例えば、陰イオン交換体、ア
ンキリンまたはスペクトリンなどの多重遺伝子ファミリーから、あるいは、タン
パク質4.1またはタンパク質4.2一つのような単一遺伝子ファミリーから転写され
る。mRNA転写物は組織特異選択的スプライシングを受ける。多くの先天性溶血性
貧血は赤血球膜タンパク質をコードする上述の遺伝子における突然変異から生じ
る。例えば、遺伝性楕円赤血球症はスペクトリン四量体のヘッドツーヘッド自己
結合領域で、またはその近くでのスペクトリン遺伝子の配列の突然変異から生じ
るか、またはタンパク質4.1のレベルを減少するタンパク質4.1遺伝子における突
然変異から生じる。他の例では、遺伝性球状赤血球症はアンキリン遺伝子、陰イ
オン交換遺伝子、タンパク質4.2遺伝子あるいは、αおよびβスペクトリン遺伝
子における突然変異に関連する。 (Delaunay J. (1995) Transfus. Clin. Biol.
2:207-216.) タンパク質4.1は四つの機能的ドメインを有する80キロダルトンの赤血球膜タン
パク質である。これらのドメインには、i) アクチン結合タンパク質および膜貫
通タンパク質結合のERM(Ezrin/ラディキシン/モエシン) ファミリーに相同性の
ある30kDaの塩基性N末端ドメイン(Tsukita, S. et al.(1997) Trends Biochem.
Sci. 22:53-58)、ii) プロテインキナーゼCリン酸化部位を含む、16 kDa の親水
性ドメイン、iii) スペクトリンおよびアクチンとの相互作用に重要なcAMP依存
性プロテインキナーゼリン酸化部位を含む10 kDa の高荷電ドメイン、およびiv)
22/24 kDa の酸性ドメインがある。タンパク質 4.1 は構造的、機能的に関連す
るタンパク質4.1ファミリのメンバーである。タンパク質4.1ファミリは多くのチ
ロシンホスファターゼを含む進化的に関連するタンパク質スーパーファミリの一
部である(Baklouti, F. ら (1997) Genomics 39:289-302.)。 成熟型除核赤血球におけるタンパク質4.1の正確な裏打ちの局在化とは逆に、タ
ンパク質4.1エピトープ(抗原決定基)は有核細胞の細胞質部分や核骨格のいたる
ところに見られる。 特に、タンパク質4.1は中間期の間は核骨格に、有糸分
裂時には紡錘体に、分裂終止期には染色体周囲に、細胞質分裂時にはmidbody に
存在する。 (Krauss, S.W. ら. (1997) J. Cell Biol. 137:275-289.) 多数のmRNAスプライス変異体になるタンパク質4.1遺伝子の示差発現は種々のヒ
トおよびげっ歯類の組織に観察されている。遺伝子構造とmRNAスプライス変異体
の比較によって、異種間のタンパク質4.1の極端なゲノム配列の保存が明らかに
なった。ヒトおよびげっ歯類のmRNA種属の5' UTR の同定および配列決定は成功
していないが、これはおそらく、ヌクレオチドシークエンシング反応時に技術的
複雑な事態を起こさせるGCが豊富な領域に起因すると思われる。(Baklouti、前
出; Conboy, J.G. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9062-9065) ERMファミリのタンパク質に含まれるタンパク質の分析は、N 末端ドメインがCD4
4のような細胞内ドメインの膜貫通タンパク質と相互作用し、C末端ドメインがア
クチンと結合することを示した。両方の相互作用は、Rho-GTP タンパク質複合体
であるポリホスホイノシチドとセリン/チロシンキナーゼとの相互作用に関連し
、またチロシンキナーゼの活性に関連する。ERMタンパク質の多くのリン酸化部
位は保存されている。in vivo のERMタンパク質の発現は内皮のような組織に限
定されているが、ERMタンパク質遺伝発現の阻止は細胞培養の状態の下で解除さ
れる。 (Tsukita、 前出.) 裏打ちのアクチンの細胞骨格は種々の膜に基づく過程に関与するが、この過程で
は、関連する分子成分の機能的可塑性を大量に必要とする。バンド4.1に相同性
のあるタンパク質のファミリは、種々の刺激に応答したアクチン細胞骨格の再組
織化に関与しており、おそらく、膜貫通シグナル伝達に関与すると思われる。こ
のファミリには、チロシンホスファターゼ、チロシンキナーゼの基質および腫瘍
抑制遺伝子の候補が含まれる(Arpin M, et al. (1994) Curr. Opin. Cell Biol.
6:136-141)。 多くの病態や疾患において細胞骨格タンパク質相互作用における破壊が同定され
ている。神経線維腫症タイプ2は神経系の常染色体優勢疾患である。神経線維腫
症タイプ2患者から単離されたシュワン細胞は、対照のシュワン細胞と異なる、
特徴的形態および増殖パラメータを有する。神経線維腫症タイプ2に関連する遺
伝子は同定されており、NF2と呼ばれている。schwannomin あるいは マーリンと
して知られているNF2 遺伝子産生物はタンパク質4.1スーパーファミリのメンバ
ーであり、NF2遺伝子の突然変異がこの疾患に関連することが示されている。(Ro
senbaum, C. ら (1998) Neurobiol. Dis. 5:55-64.)さらに、乾癬の形成は赤血
球タンパク質4.1の類似体の表皮性上皮における変異発現または分布によるもの
である。(Shimizu, T. (1996) Histol. Histopathol. 11:495-501.)スペクトリ
ンやタンパク質4.1における突然変異体を持つ赤血球は、熱帯熱マラリア原虫(Pl asmodium falciparum) による侵入に対する感受性が異なることを示した。 (Face
r, C.A. (1995) Parasitol Res. 81:52-57.)さらに、赤血球タンパク質4.1に対
して産生された抗体によって、アルツハイマー病患者脳組織の前頭前野の皮質お
よび海馬における神経原線維濃縮体の大部分が染色された。68kDaのタンパク質
は、たぶん赤血球タンパク質4.1の脳類似体であろうと確認された。(Sihag, R.K
. ら (1994) Brain Res. 656:14-26.) 新規の細胞骨格結合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発
見により、新規の組成物を提供することで当分野の需要に応えることができる。 この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送障害
、神経疾患、細胞運動、生殖疾患おｙび筋肉疾患の診断・予防・治療において有
用であり、また、細胞骨格結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現に
おける外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【０００３】
本発明は、総称して「CYSKP」、個別にはそれぞれ「CYSKP-1」、「CYSKP-2」、
「CYSKP-3」、「CYSKP-4」、「CYSKP-5」、「CYSKP-6」、「CYSKP-7」、「CYSKP
-8」、「CYSKP-9」、「CYSKP-10」、「CYSKP-11」、「CYSKP-12」、「CYSKP-13
」、「CYSKP-14」、「CYSKP-15」、「CYSKP-16」、「CYSKP-17」、「CYSKP-18」
、「CYSKP-19」、「CYSKP-20」、「CYSKP-21」、「CYSKP-22」、「CYSKP-23」、
「CYSKP-24」、「CYSKP-25」、「CYSKP-26」、「CYSKP-27」、「CYSKP-28」、「
CYSKP-29」、「CYSKP-30」、「CYSKP-31」、「CYSKP-32」、「CYSKP-33」、「CY
SKP-34」と呼ぶ細胞骨格結合タンパク質である精製されたポリペプチドを提供す
る。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択
したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から
選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然
のポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する
群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群か
ら選択した実質上単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ I
D NO:1-34のアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。 また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、（c
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードする
ような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリ
ヌクレオチドはSEQ ID NO:1-34を有する群から選択したポリペプチドをコードす
る。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:35-68を有する群から選
択される。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（ｃ
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードする
ようなポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポ
リヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチ
ドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポ
リヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ
酸配列と９０％以上が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチドと、
（ｃ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペ
プチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択され
たアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択
したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌ
クレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に好適な条件下で培
養する過程と、（ｂ）このように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し
、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能
的に結合したプロモーター配列を有する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配
列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチドと
、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプ
チドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片とで構成される群から選択した
ポリペプチドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選
択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるポリヌクレオチド
配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチドと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とで構成される群から選択し
た実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレ
オチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。 本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
ここで標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68
を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である
ポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドと、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とを
含む群から選択したポリヌクレオチド配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプ
ル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続した
ヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在す
る場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌ
クレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、
プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様で
は、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。 本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68
を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である
ポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とを含む群
から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程
と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標
的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検
出する過程を含む。 本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成
分を提供し、有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選
択したアミノ酸配列を有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群
から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有す
る天然のポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-34有する群から選択したアミノ酸
配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34
を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を
含む群から選択する。一実施例では、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したア
ミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、患者にこの組成物を投
与することを含む、機能的CYSKPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療
方法を提供する。 本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、（ｃ
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアゴニスト
としての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す
過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では
、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形
剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者へ
の投与を含む、機能的CYSKPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法
を提供する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（
ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド
の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアンタゴ
ニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供
する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に
曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実
施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤とし
て許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。別の実施態様では、機能的CYSKP
の過剰発現に関連する疾患や病状を治療する方法であって、そのような治療を必
要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−34を有するから選択したアミノ酸配
列と９０％以上が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（ｃ）
SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節
する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、
（ａ）このポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの化合物と結合させる
ステップと、（ｂ）このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、そ
れによって、このポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップと
を含む。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
を有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチ
ドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択した
アミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片とを含む群から選択したポ
リペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 ス
クリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペ
プチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチド
の活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下での
ポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する
過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプ
チドの活性を調節する化合物であることを意味する。 更に本発明は、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合
物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:
35-68を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は（ａ）この標
的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）標的
ポリヌクレオチドの変異発現を検出するステップとを含む。 本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程
と、（ｂ）（i）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるポリヌクレオチド配列を含む
天然のポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチ
ド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v
）（i）〜（iv）のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくと
も２０の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物
学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定
方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル
中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成さ
れるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:35-
68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii
）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも
９０％が同一であるポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、（ii
i）（i）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）
（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）の
RNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）
〜（v）を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリ
ダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプル
のハイブリダイゼーション複合体の量を、未処理の生物学的サンプルのハイブリ
ダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルの
ハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
「CYSKP-3」、「CYSKP-4」、「CYSKP-5」、「CYSKP-6」、「CYSKP-7」、「CYSKP
-8」、「CYSKP-9」、「CYSKP-10」、「CYSKP-11」、「CYSKP-12」、「CYSKP-13
」、「CYSKP-14」、「CYSKP-15」、「CYSKP-16」、「CYSKP-17」、「CYSKP-18」
、「CYSKP-19」、「CYSKP-20」、「CYSKP-21」、「CYSKP-22」、「CYSKP-23」、
「CYSKP-24」、「CYSKP-25」、「CYSKP-26」、「CYSKP-27」、「CYSKP-28」、「
CYSKP-29」、「CYSKP-30」、「CYSKP-31」、「CYSKP-32」、「CYSKP-33」、「CY
SKP-34」と呼ぶ細胞骨格結合タンパク質である精製されたポリペプチドを提供す
る。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択
したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から
選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然
のポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する
群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群か
ら選択した実質上単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ I
D NO:1-34のアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。 また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、（c
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードする
ような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリ
ヌクレオチドはSEQ ID NO:1-34を有する群から選択したポリペプチドをコードす
る。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:35-68を有する群から選
択される。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（ｃ
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードする
ようなポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポ
リヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチ
ドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポ
リヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ
酸配列と９０％以上が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチドと、
（ｃ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペ
プチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択され
たアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択
したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌ
クレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に好適な条件下で培
養する過程と、（ｂ）このように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し
、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能
的に結合したプロモーター配列を有する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配
列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチドと
、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプ
チドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片とで構成される群から選択した
ポリペプチドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選
択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるポリヌクレオチド
配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌ
クレオチドと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とで構成される群から選択し
た実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレ
オチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。 本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
ここで標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68
を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である
ポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドと、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とを
含む群から選択したポリヌクレオチド配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプ
ル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続した
ヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在す
る場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌ
クレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、
プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様で
は、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。 本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択し
たポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、（ｂ）SEQ ID NO:35-68
を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である
ポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレオチドと、（ｃ）（ａ）のポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドと、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物とを含む群
から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程
と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標
的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検
出する過程を含む。 本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成
分を提供し、有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選
択したアミノ酸配列を有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群
から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有す
る天然のポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-34有する群から選択したアミノ酸
配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34
を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を
含む群から選択する。一実施例では、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したア
ミノ酸配列を含む組成物を提供する。 更に、本発明は、患者にこの組成物を投
与することを含む、機能的CYSKPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療
方法を提供する。 本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を含む天然のポリペプチド、（ｃ
）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアゴニスト
としての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す
過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では
、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形
剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者へ
の投与を含む、機能的CYSKPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法
を提供する。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（
ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド
の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアンタゴ
ニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供
する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に
曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実
施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤とし
て許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。別の実施態様では、機能的CYSKP
の過剰発現に関連する疾患や病状を治療する方法であって、そのような治療を必
要とする患者に対して成分を投与する過程を含む方法を提供する。 更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を
有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−34を有するから選択したアミノ酸配
列と９０％以上が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、（ｃ）
SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの
生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1−34を有する群から選択したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節
する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、
（ａ）このポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの化合物と結合させる
ステップと、（ｂ）このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、そ
れによって、このポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップと
を含む。 本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列
を有するポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ
酸配列と少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチ
ドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択した
アミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片とを含む群から選択したポ
リペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 ス
クリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペ
プチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチド
の活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下での
ポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する
過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプ
チドの活性を調節する化合物であることを意味する。 更に本発明は、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合
物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:
35-68を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は（ａ）この標
的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）標的
ポリヌクレオチドの変異発現を検出するステップとを含む。 本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程
と、（ｂ）（i）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるポリヌクレオチド配列を含む
天然のポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチ
ド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v
）（i）〜（iv）のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくと
も２０の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物
学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定
方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル
中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成さ
れるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:35-
68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii
）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも
９０％が同一であるポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、（ii
i）（i）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）
（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）の
RNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）
〜（v）を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリ
ダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプル
のハイブリダイゼーション複合体の量を、未処理の生物学的サンプルのハイブリ
ダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルの
ハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に
、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変
し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説
明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範
囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等）」は
、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、
例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が
含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を
除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明
するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施
または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説
明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発
明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び
開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発
明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられて
いないことを認めるものではない。 (定義） 用語「CYSKP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたCYSKPのアミノ酸配列を指す。 用語「アゴニスト」は、CYSKPの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す
。このアゴニストは、CYSKP に直接相互作用するか、或いはPKINが関与する生物
学的経路の成分と作用して、CYSKP の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、
小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。 用語「対立遺伝子変異配列」は、CYSKPをコードする遺伝子の別の形を指す。対
立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。 また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。 ポリペプチドの構造ま
たは機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変
異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る
。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチド
の自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは
他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。 CYSKP をコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、CYSKP と同じポリペプチド或いはCYSKP の機能特性の少
なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、CYSKPをコードする
ポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配
列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCYSKPをコード
するポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出
可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も「改変」され
得り、サイレント変化を生じCYSKPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、
挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学
的にCYSKP の活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親
水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、
負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電し
たアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極
性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン
がある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンと
イソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがあ
る。 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合
成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関
連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当
業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。 用語「アンタゴニスト」は、CYSKPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、CYSKP に直接相互作用するか、或いはPKINが関与する
生物学的経路の成分と作用して、CYSKP の活性を調節する抗体、核酸、糖質、小
分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片、
Fv断片などの無傷の分子を指す。CYSKP ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。
動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまた
はオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好み
に応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であ
り、ペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及
びキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物
を免疫化するために用いる。 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を
指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タ
ンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構
造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するた
めの無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得
る。 本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング
）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAや
、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベ
ンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチド
や、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有
するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまた
は7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオ
チドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造
することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、
細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二
重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり
、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。 用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能
を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性
」は、天然或いは組換え体のCYSKP、合成のCYSKPまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力を指す。 用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関
係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」に結合する。 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含
む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を
含む任意の組成物を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。
CYSKP 若しくはCYSKP の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は
、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結
乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である
。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えば
ドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成エレメント（例えばデンハー
ト液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させる
ことができる。 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返
し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／ま
たは３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washin
gton, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或い
はそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列
を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を
指す。 即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元
のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸
を示している。
、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変
し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説
明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範
囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等）」は
、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、
例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が
含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。 本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を
除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明
するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施
または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説
明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発
明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び
開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発
明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられて
いないことを認めるものではない。 (定義） 用語「CYSKP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたCYSKPのアミノ酸配列を指す。 用語「アゴニスト」は、CYSKPの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す
。このアゴニストは、CYSKP に直接相互作用するか、或いはPKINが関与する生物
学的経路の成分と作用して、CYSKP の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、
小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。 用語「対立遺伝子変異配列」は、CYSKPをコードする遺伝子の別の形を指す。対
立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１の突然変異から作製し得る。 また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。 ポリペプチドの構造ま
たは機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変
異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る
。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチド
の自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは
他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。 CYSKP をコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、CYSKP と同じポリペプチド或いはCYSKP の機能特性の少
なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、CYSKPをコードする
ポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配
列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCYSKPをコード
するポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出
可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も「改変」され
得り、サイレント変化を生じCYSKPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、
挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学
的にCYSKP の活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親
水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、
負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電し
たアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極
性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニン
がある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンと
イソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがあ
る。 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合
成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関
連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当
業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。 用語「アンタゴニスト」は、CYSKPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、CYSKP に直接相互作用するか、或いはPKINが関与する
生物学的経路の成分と作用して、CYSKP の活性を調節する抗体、核酸、糖質、小
分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片、
Fv断片などの無傷の分子を指す。CYSKP ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。
動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまた
はオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好み
に応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であ
り、ペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及
びキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物
を免疫化するために用いる。 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を
指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タ
ンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構
造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するた
めの無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得
る。 本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング
）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAや
、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベ
ンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチド
や、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有
するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまた
は7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオ
チドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造
することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、
細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二
重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり
、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。 用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能
を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性
」は、天然或いは組換え体のCYSKP、合成のCYSKPまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力を指す。 用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関
係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」に結合する。 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含
む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を
含む任意の組成物を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。
CYSKP 若しくはCYSKP の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は
、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結
乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である
。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えば
ドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成エレメント（例えばデンハー
ト液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させる
ことができる。 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返
し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／ま
たは３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVI
EW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washin
gton, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或い
はそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列
を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を
指す。 即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元
のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸
を示している。
【０００４】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボー
ン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷また
は疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或い
は１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す
。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の
置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導
体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持している
ポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源
のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持して
いるプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリ
ペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。 「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決め
られる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子また
はタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサ
ンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。 用語「断片」は、CYSKP またはCYSKP をコードするポリヌクレオチドの固有の部
分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さ
が短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ
酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１
０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プラ
イマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片
は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、
１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸
残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば
、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミ
ノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長
さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げている
ものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けさ
れた任意の長さであってよい。 SEQ ID NO:35-68 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異
なる、SEQ ID NO:35-68 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を
含む。SEQ ID NO:35−68のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅
技術、またはSEQ ID NO:35−68を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の
方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:35−68の正確な断片の長さや
領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定
できる。 SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SEQ ID NO: 35−68のある断片によってコード
される。SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SEQ ID NO: 1−34を特異的に同定する
固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SE
Q ID NO: 1−34を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして
有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−34の断片の正確な長さや領域は
、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる
。 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例え
ばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配
列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列を
コードする。 「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ
以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列にお
いて、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列を
より有意に比較できる。 ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメン
トプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッ
ケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部であ
る。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-1
53、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレ
オチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktuple=2、ga
p penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた
」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、ア
ラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてCL
USTAL Vによって報告される。 或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、
国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search T
ool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol. 2
15:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能であ
る。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデ
ータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blas
tn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と
呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較する
ために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/g
orf/b12.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences
」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。
BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他
のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、
ある者は、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVer
sion 2.0.12 (April-21-2000)でblastnを使用するであろう。デフォルトパラメ
ータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さと
比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が
原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配
列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードす
るような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一性
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント
方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び
疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。 ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプ
ログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメ
ータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL V
を用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパ
ラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設
定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリ
ヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列
の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによっ
て報告される。 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプ
チド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された
「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用す
るであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチ
ド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一
致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配
列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを
含む直鎖状の小染色体である。 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、あ
る一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリン
グのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。アニーリングが許容される条件下で、
特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダ
イズしたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのスト
リンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件で
は、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核
酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的
に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗
浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーショ
ン特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容され
る条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに
約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステッ
プを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、
所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くな
るように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致する
プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式
及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (198
9) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Har
bor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２x SSC及び約0.１％のSDSの存在下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSC濃度
は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、
遮断剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬
には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子DNA
が含まれる。特定条件下、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションにおいて有
機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる
。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダ
イゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的
な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドに
コードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって
、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は
、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。 或いは、一方の核酸配列が
溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ
、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若し
くはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配列間に形
成され得る。 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが
それぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連
する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。 用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている生物体に導入すると
、免疫応答を引き起こすCYSKP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を
指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知の
あらゆる抗体生産方法に有用なCYSKP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド
断片を含む。 用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドま
たはその他の化合物の構成を指す。 用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の
指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合
物を指す。 用語「調節」は、CYSKPの活性の変化を指す。例えば、調節によって、CYSKPのタ
ンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或い
は免疫学的特性の変化が起こる。 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌ
クレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノ
ム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或い
はセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核
酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。 「機能的にリンクした」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的にリンクしている
。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要
がある場合、一般に、機能的にリンクしたDNA配列は非常に近接するか、或いは
連続し得る。 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドの
バックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、成分
に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写
の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNA
の寿命を延長し得る。 CYSKP の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 こ
れらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CYSKPの
酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。 「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検
出に用いる、CYSKPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸
配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである
。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素が
ある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチド
にアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。
プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延長し得る。プラ
イマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び
同定）に用い得る。 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも
１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロー
ブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４
０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチ
ドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長
いプローブ及びプライマーもある。 表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、例えば、Sambrook, J.
ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Sp
ring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protoc ols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New
York NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applicati ons Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、そ
の目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, W
hitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどし
て既知の配列から得ることができる。 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために
本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソ
フトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であ
り、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドで
あって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分
析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のた
めの追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テ
キサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一
般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが
可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。
Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Geno
me Research, Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー
結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispri
ming libaray）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリ
ゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソ
ースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更
してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマ
ッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の
配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメ
ントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイ
ズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有
であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有
用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポ
リヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRま
たはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或
いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定す
る特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方
法に限定されるものではない。 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れ
たセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば
化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操
作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子
工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換
または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に
機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不
可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるよう
なものであり得る。 或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであっ
て例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは
組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御
免疫応答を誘導する。 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、
エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）
を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主または
ウイルスタンパク質と相互作用する。 「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的ま
たは生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、
化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野
で既知の成分がある。 本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と
同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換さ
れ、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CYSKP、CYSKPをコー
ドする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞から
の抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に
存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリン
ト等を含み得る。 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは
合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定
の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが
存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ
「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含
む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「
Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が
少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最
も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸
またはヌクレオチドに置き換えることである。 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィル
ター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル
、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基質は、壁、
溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面には
ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。 「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または
組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。 「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形
質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条
件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入
する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞
の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、ウイル
ス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクショ
ン及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入された
DNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可
能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一
時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではな
いが動植物を含み、有機体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸
を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導
入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって
或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育
種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すもので
ある。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバ
クテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知
られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって
宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術
はよく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられてい
る。 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAST 2 Se
quences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、ある核
酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決
定された核酸配列のことである。このような核酸対は、所定の長さに対して、例
えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以
上の相同性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上
述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表す
ことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mR
NAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは
僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追
加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落しているこ
とがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に
生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多形性変
異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる
。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「
１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状ま
たは病状性向を示し得る。 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAS
T 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによって、
ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なく
とも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチ
ド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。 (発明) 本発明は、新規のヒト細胞骨格結合タンパク質（CYSKP）及びCYSKPをコードする
ポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した細胞増殖異常、自
己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送、神経疾患、および細胞運動、生殖障害ならび
に筋肉の疾患の診断、治療、及び予防に関する。 表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概
略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyte
プロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配
列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプ
チド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド
配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyt
eポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によっ
て表示した。 表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によっ
て同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示してい
る。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド
配列識別番号（Polypeptide SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペ
プチド配列番号（Incyte Polypeptide ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い
相同体のGenBankの識別番号（Genbank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチ
ドとそのGenBank相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、GwnBank
相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これ
らを引用することを以って本明細書の一部とする。 表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそ
れぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）
およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte Polypeptide ID）
を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそ
れぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Co
mputer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化
の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ（signature）配列、ドメイン
、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能
の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可
能なデータベースを示す。 表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それ
らの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞骨格結合タンパク質であ
ることを確立している。例えば、SEQ ID NO:31 は、Basic Local Alignment Sea
rch Tool (BLAST)によって決定されるようにマウスアンキリン(GenBank ID g387
9121) に類似の線虫タンパク質に34%の同一性がある(表2参照)。BLAST確率スコ
アは1.1e-146であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然
に得られる確率を示している。SEQ ID NO:31はまた、Ank リピートを有するが、
これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリ
ードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定さ
れた。別の例において、SEQ ID NO:34 はBasic Local Alignment Search Tool (
BLAST)によって決定されたヒト中間径フィラメント結合タンパク質(GenBank ID
1333846) に97アミノ酸にわたって96%の同一性がある。(表2参照)BLAST確率スコ
アは8.2e-45であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然
に得られる確率を示している。PRODOM データベースを用いたBLASTからのデータ
分析によって、さらにSEQ ID NO:34 が細胞骨格タンパク質であることの補強証
拠が得られる。SEQ ID NO:1-30 および SEQ ID NO:32-33は同じような方法で解
析し、注釈を付けた。 The algorithms and parameters for the analysis of
SEQ ID NO:1-34 are described in Table 7. 表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲ
ノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を
任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌク
レオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Polynucleotide SEQ ID NO :）およ
びそれに対応するIncyte ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte Poly
nucleotide ID）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長
さを示す。列４は、例えば、SEQ ID NO:35−68を同定するため、或いはSEQ ID N
O:35−68と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼー
ションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はcDNA
配列、ゲノムDNAから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはcDNA及び
ゲノムDNAを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配
列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６
および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始
ヌクレオチド（５'）位置および停止ヌクレオチド（３'）位置を示す。 表４の列５の識別番号は、特に例えばIncyte cDNAとそれに対応するcDNAライブ
ラリに照会し得る。例えば、3824958H1はIncytecDNA配列の識別番号であり、BRA
XNOT01はそれが由来するcDNAライブラリの識別番号である。cDNAライブラリが示
されていないIncyte cDNAは、プールされているcDNAライブラリ（例えば、71263
527V1）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み
立てに用いたGenBankのcDNAすなわちEST（例えば、g2276318）の識別番号の場合
もある。或いは列５の識別番号は、ゲノムDNAのGenscan分析により予測されるコ
ード領域と言える。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集
する場合がある。（例IVを参照）。または列５の識別番号は、「エキソンスティ
ッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGensca
n予想エキソンの両方の集合に照会し得る。（例Vを参照）。または列５の識別番
号は、「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結
び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合に照会し得る。 (See Exa
mple V.) 場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認する
ための列５に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得
られたが、関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。 表５は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のた
めの代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記の
ポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列に
よって最も頻繁に表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作
製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。 本発明はまた、CYSKP の変異体も含む。好適なCYSKP の変異体は、CYSKP の機能
的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつCYSKP アミノ酸配列
に対して少なくとも約8０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％
のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有す
る。 本発明はまた、CYSKPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、CYSKPをコードするSEQ ID NO:35−68からなる一群から選
択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID N
O:35−68のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され
、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配
列を含む。 本発明はまた、CYSKPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CYSKPをコードするポ
リヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは
少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％もの
ポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:
35−68からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオ
チド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更に
は少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:35−68
からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供
する。上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、CYSKPの機能的或いは構造的
特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードすることができる。 遺伝暗号の縮重により作り出され得るCYSKPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るよう
なありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これ
らの組み合わせは、天然のCYSKPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的な
トリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されて
いるとみなす。 CYSKP をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、適切に選択さ
れたストリンジェントな条件下で、天然のCYSKP のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった
使い方のコドンを有するCYSKP 或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列
を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、
特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選
択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えずに、CYSKP 及びそ
の誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転
写物を作ることにある。 本発明はまた、CYSKP 及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、CYSKP またはその任意の
断片をコードする配列の中に突然変異体を導入することも可能である。 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリ
ヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:35−68及びそれらの断片とハイブリダイズ
可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (
1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol.
152:507-511を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーショ
ンの条件は、「定義」に記載されている。 DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例
もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法
には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUEN
ASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems
）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）
を用いることができる。 或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technolo
gies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソ
ヌクレアーゼを併用することができる。好しくは、MICROLAB2200液体転移システ
ム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waterto
wn MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の
装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエ
ンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシン
グシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られて
いる他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当
分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ausubel, F.
M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Y
ork NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnolog y , Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列
を利用して、CYSKP をコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメ
ントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制
限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてク
ローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarka
r, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）。別の方法に逆PCR法が
あり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未
知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の
配列からなる制限酵素断片から得る（Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res
16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及
び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関
与している（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照
）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて
未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知
の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Pa
rker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR
、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Pa
lo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は
、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を
見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソ
フトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Bioscie
nces, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３
０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対し
てアニーリングするようにプライマーを設計し得る。 完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択
されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラ
リは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが
完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'
非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産
物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具
体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動
性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性
化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る
。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER
、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロード
からコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御
可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない
ようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCYSKP 、その断
片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重によ
り、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列
を作ることができ、これらの配列をCYSKPの発現に利用可能である。 種々の目的でCYSKPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 こ
れらの目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の
調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリ
ゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるD
NAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例
えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限
部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異
体の生成等を行う突然変異を導入し得る。 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA;
米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-7
97; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A.
他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いて
シャフリングして、CYSKPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのCYSKPの生物学的特性を改変或いは改良することがで
きる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変
異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子
変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次に
これらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／
スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化に
よって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単
一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化
されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種また
は異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それ
によって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方
法で最大化させることができる。 別の実施例によれば、CYSKP をコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてCYSKP 自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相
技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Protein s, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York NY, 55-60
ページ、Roberge, J.Y. ら (1995) Science 269:202-204等を参照）。自動合成
はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にCY
SKPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／
または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との
組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体
ポリペプチドを作製することが可能である。 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である
（Chiez, R.M.および F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を
参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって
確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。 生物学的に活性なCYSKPを発現させるために、CYSKPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、
好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメ
ントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びCYSKPをコードするポリヌ
クレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、
５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及
び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、CYSKPをコードする配列
のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、AT
G開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。CYSKP をコードす
る配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された
場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。
しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、イン
フレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含
まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物
及び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適
なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Scharf, D. ら (1
994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。 当業者に周知の方法を用いて、CYSKP をコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。この方法には、 in vitro 組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある（Sambro
ok, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NYの9, 13,
16章等を参照）。 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CYSKPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には
、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形
質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス
発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発
現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウ
イルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形
質転換させた植物細胞系、あるいは動物細胞系などの微生物等がある（前出のSa
mbrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol
. Chem. 264:5503-5509、Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Taka
matsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、Coruzzi, G. ら (1984) EMBOJ. 3:1671-1
680、Broglie, R. ら (1984) Science 224:838-843、Winter, J. ら (1991) Res
ults Probl. Cell Differ. 17:85-105、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McG
raw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York
NY, 191-196ページ、Logan, J. およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345-355等
を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニ
アウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクタ
ーを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達する
ことができる（Di Nicola, M. ら (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu
, M. ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M.
ら (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. ら (1994) Mol. Immun
ol. 31(3):219-226、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242
等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CYSKPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CYSKP
をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング
、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド
(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの
多数のクローニング部位にCYSKP をコードする配列をライゲーションするとlac
Ｚ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色
スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた
配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G
. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照）。
例えば、抗体の産生のためなどに多量のCYSKP が必要な場合は、CYSKP の発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリオ
ファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベク
ターが使用できる。 CYSKPの作製に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダ
ーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベ
クターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可
能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞
内への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへ
の組込みを可能にする（前出のAusubel (1995)、Bitter, G.A. ら (1987) Metho
ds Enzymol. 153:516544; およびScorer, C.A.ら(1994) Bio/Technology 12:181
-184を参照）。 植物系もCYSKPの発現に使用可能である。CYSKP をコードする配列の転写は、ウ
イルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:3
07-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の
35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニッ
ト等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（前出の
Coruzzi、前出のBroglie、前出のWinter等を参照）。これらの構成物は、直接DN
A形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能
である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Scien ce and Technology ) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ等を参照
。） 哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノ
ウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リー
ダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCYSKP をコードする配列
を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により
、感染した宿主細胞にCYSKP を発現する生ウイルスを得ることが可能である（Lo
gan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）
。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用い
て、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースに
したベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現
するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約６kb〜
１０MbのHACsを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリ
マー、またはベシクル）で送達する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Na
t Genet.15:345-355.を参照)。 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけ
るCYSKP の安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、PPをコー
ドする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。 このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す
前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカー
の目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在する
ことにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能
となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組
織培養技術を用いて増殖可能である。 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。選択系には、以下の
ものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデ
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれtk−またはap
r−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232
; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代
謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfr
はメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシ
ン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulf
uron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin ac
etyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigler, M. 他. (1980) Proc
. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Bi
ol. 150:1-14を参照)。( Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
7:35673570; ColbereGarapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照
。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるt
rpB及びhisDは、文献に記載されている（Hartman, S.C.および R.C. Mulligan (
1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照）。可視マーカー、
例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニ
ダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフ
ェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだ
けでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を
定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-
131等を参照）。 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CYSKP をコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CYSKP をコードする配
列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能であ
る。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCYSKP をコードす
る配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー
遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。 一般に、CYSKP をコードする核酸配列を含み、CYSKP を発現する宿主細胞は、当
業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法に
は、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタ
ンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベ
ースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれる
が、これらに限定されるものではない。 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるCYSK
P の発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 こ
のような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノ
アッセイ（RIA）、フローサイトメーター（FACS）などがある。PKIN上の２つの
非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクロー
ナルベース イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好
ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこ
れ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. ら (1990) Serologica l Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coliga
n, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associat
es and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemica l Protocols , Humans Press, Totowa NJ等を参照）。 多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッ
セイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CYSKP をコードするポ
リヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼー
ションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニック
トランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR
増幅が含まれる。別法として、CYSKPをコードする配列、またはその任意の断片
をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である
。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7
、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて
、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例
えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical
等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易
にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、
インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色
剤等がある。 CYSKP をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞か
ら製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、
ベクター、或いはその両者に依存する。CYSKP をコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCYSKP の分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現した
タンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではない
がこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシ
ル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または
「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折り
たたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固
有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、M
DCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Bethesd
a, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にす
るように選択し得る。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCY
SKP タンパク質が、CYSKP 活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのス
クリーニングを容易にする。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も
、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を容易にする。限定されるも
のではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）
、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン
結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは
固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシ
ド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族
の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は
、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能に
する。また、CYSKP をコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパ
ク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、CYSKP が精
製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前
出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用
いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出
系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCYSKP の合成が可能である。こ
れらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質コー
ド配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのよう
な放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。 本発明のCYSKP またはその断片を用いて、CYSKP に特異結合する化合物をスクリ
ーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、
CYSKPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の
例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子
が挙げられる。 一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片など
のCYSKPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性ま
たは自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Curr ent Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、CYSKP
が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容
体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合
物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対する
スクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方
としてCYSKPを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動
物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。CYSKP を発現する細胞またはCYSKP を
含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、CYSKP または化合物の何れかの
結合、刺激または活性の阻害を分析する。 あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、
蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出
することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、
溶液中の或いは固体支持物に固定されたCYSKP と結合させるステップと、CYSKP
とこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競
合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこ
のアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を
用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に
固定させる。 本発明のCYSKP またはその断片を用いて、CYSKP の活性を調整する化合物をスク
リーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタ
ゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、CY
SKP が少なくとも１つの試験化合物と結合する、CYSKP の活性が許容される条件
下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのCYSKP の活性が試験化合物不在
下でのCYSKP の活性と比較する。試験化合物の存在下でのCYSKP の活性の変化は
、CYSKP の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をCY
SKP の活性に適した条件下でCYSKP を含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合
させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、CYSKP の活性を
調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接
触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングする
ことができる。 別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル
系内で、CYSKP またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノ
ックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患
動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を
参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培
地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマー
カー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクタ
ーは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、
Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的
遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002;
Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-43 30）。形質転換した
ES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微
量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝
形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。
このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で
検査することができる。 CYSKP をコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞にお
いて操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細
胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。こ
れらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomso
n, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。 CYSKP をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノッ
クイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を
作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、CYSKP をコードするポリ
ヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノム
に組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。
遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処
理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばCYSKPを乳汁内
に分泌するなどCYSKPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源
となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
ン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷また
は疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或い
は１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す
。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の
置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導
体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持している
ポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源
のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持して
いるプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリ
ペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。 「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決め
られる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子また
はタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサ
ンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。 用語「断片」は、CYSKP またはCYSKP をコードするポリヌクレオチドの固有の部
分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さ
が短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ
酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１
０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プラ
イマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片
は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、
１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸
残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば
、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミ
ノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長
さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げている
ものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けさ
れた任意の長さであってよい。 SEQ ID NO:35-68 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異
なる、SEQ ID NO:35-68 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を
含む。SEQ ID NO:35−68のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅
技術、またはSEQ ID NO:35−68を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の
方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:35−68の正確な断片の長さや
領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定
できる。 SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SEQ ID NO: 35−68のある断片によってコード
される。SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SEQ ID NO: 1−34を特異的に同定する
固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO: 1−34のある断片は、SE
Q ID NO: 1−34を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして
有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−34の断片の正確な長さや領域は
、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる
。 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例え
ばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配
列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列を
コードする。 「相同性」の語は、配列類似性即ち２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ
以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列にお
いて、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列を
より有意に比較できる。 ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメン
トプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッ
ケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部であ
る。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-1
53、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレ
オチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktuple=2、ga
p penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた
」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、ア
ラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてCL
USTAL Vによって報告される。 或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、
国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search T
ool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol. 2
15:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能であ
る。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデ
ータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blas
tn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と
呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較する
ために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/g
orf/b12.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences
」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。
BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他
のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、
ある者は、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVer
sion 2.0.12 (April-21-2000)でblastnを使用するであろう。デフォルトパラメ
ータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）配列長さと
比較して測定し得る。 或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００
または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。 高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が
原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配
列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードす
るような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一性
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント
方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び
疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。 ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプ
ログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメ
ータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL V
を用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパ
ラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設
定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリ
ヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列
の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによっ
て報告される。 或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプ
チド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された
「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用す
るであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチ
ド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なく
とも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）
の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一
致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配
列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを
含む直鎖状の小染色体である。 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、あ
る一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリン
グのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。アニーリングが許容される条件下で、
特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダ
イズしたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのスト
リンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件で
は、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核
酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的
に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗
浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーショ
ン特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容され
る条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに
約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステッ
プを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、
所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くな
るように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致する
プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式
及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら (198
9) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Har
bor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ンでは、約０．２x SSC及び約0.１％のSDSの存在下、約６８℃で１時間の洗浄過
程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSC濃度
は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、
遮断剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬
には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子DNA
が含まれる。特定条件下、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションにおいて有
機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる
。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダ
イゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的
な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドに
コードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって
、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は
、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。 或いは、一方の核酸配列が
溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ
、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若し
くはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配列間に形
成され得る。 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが
それぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連
する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。 用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている生物体に導入すると
、免疫応答を引き起こすCYSKP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を
指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知の
あらゆる抗体生産方法に有用なCYSKP のポリペプチド断片またはオリゴペプチド
断片を含む。 用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドま
たはその他の化合物の構成を指す。 用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の
指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合
物を指す。 用語「調節」は、CYSKPの活性の変化を指す。例えば、調節によって、CYSKPのタ
ンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或い
は免疫学的特性の変化が起こる。 「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌ
クレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノ
ム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或い
はセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核
酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。 「機能的にリンクした」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的にリンクしている
。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要
がある場合、一般に、機能的にリンクしたDNA配列は非常に近接するか、或いは
連続し得る。 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドの
バックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、成分
に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写
の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNA
の寿命を延長し得る。 CYSKP の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 こ
れらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CYSKPの
酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。 「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検
出に用いる、CYSKPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸
配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである
。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素が
ある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチド
にアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。
プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延長し得る。プラ
イマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び
同定）に用い得る。 本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも
１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロー
ブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４
０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチ
ドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長
いプローブ及びプライマーもある。 表、図面及び配列リストを含む本明細書に
裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解された
い。 プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、例えば、Sambrook, J.
ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Sp
ring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protoc ols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New
York NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applicati ons Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、そ
の目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, W
hitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどし
て既知の配列から得ることができる。 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために
本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソ
フトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であ
り、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドで
あって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分
析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のた
めの追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テ
キサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一
般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが
可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。
Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Geno
me Research, Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー
結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispri
ming libaray）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリ
ゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソ
ースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更
してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマ
ッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の
配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメ
ントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイ
ズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有
であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有
用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポ
リヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRま
たはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或
いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定す
る特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方
法に限定されるものではない。 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れ
たセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば
化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操
作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子
工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換
または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に
機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不
可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるよう
なものであり得る。 或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであっ
て例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。 ワクシニアウイルスは
組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御
免疫応答を誘導する。 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、
エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）
を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主または
ウイルスタンパク質と相互作用する。 「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的ま
たは生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、
化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野
で既知の成分がある。 本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と
同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換さ
れ、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CYSKP、CYSKPをコー
ドする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞から
の抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に
存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリン
ト等を含み得る。 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは
合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定
の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが
存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ
「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含
む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「
Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が
少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最
も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸
またはヌクレオチドに置き換えることである。 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィル
ター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル
、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基質は、壁、
溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面には
ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。 「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または
組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。 「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形
質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条
件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入
する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞
の種類によって選択する。 限定するものではないが形質転換方法には、ウイル
ス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクショ
ン及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入された
DNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可
能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一
時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。 ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではな
いが動植物を含み、有機体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、
例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸
を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導
入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって
或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育
種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すもので
ある。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバ
クテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知
られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって
宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術
はよく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられてい
る。 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAST 2 Se
quences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、ある核
酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決
定された核酸配列のことである。このような核酸対は、所定の長さに対して、例
えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以
上の相同性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上
述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表す
ことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mR
NAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは
僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追
加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落しているこ
とがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に
生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多形性変
異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる
。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「
１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状ま
たは病状性向を示し得る。 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAS
T 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによって、
ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なく
とも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチ
ド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。 (発明) 本発明は、新規のヒト細胞骨格結合タンパク質（CYSKP）及びCYSKPをコードする
ポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した細胞増殖異常、自
己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送、神経疾患、および細胞運動、生殖障害ならび
に筋肉の疾患の診断、治療、及び予防に関する。 表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概
略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyte
プロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配
列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプ
チド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド
配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyt
eポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によっ
て表示した。 表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によっ
て同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示してい
る。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド
配列識別番号（Polypeptide SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペ
プチド配列番号（Incyte Polypeptide ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い
相同体のGenBankの識別番号（Genbank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチ
ドとそのGenBank相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、GwnBank
相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これ
らを引用することを以って本明細書の一部とする。 表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそ
れぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）
およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte Polypeptide ID）
を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそ
れぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Co
mputer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化
の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ（signature）配列、ドメイン
、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能
の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可
能なデータベースを示す。 表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それ
らの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞骨格結合タンパク質であ
ることを確立している。例えば、SEQ ID NO:31 は、Basic Local Alignment Sea
rch Tool (BLAST)によって決定されるようにマウスアンキリン(GenBank ID g387
9121) に類似の線虫タンパク質に34%の同一性がある(表2参照)。BLAST確率スコ
アは1.1e-146であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然
に得られる確率を示している。SEQ ID NO:31はまた、Ank リピートを有するが、
これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリ
ードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定さ
れた。別の例において、SEQ ID NO:34 はBasic Local Alignment Search Tool (
BLAST)によって決定されたヒト中間径フィラメント結合タンパク質(GenBank ID
1333846) に97アミノ酸にわたって96%の同一性がある。(表2参照)BLAST確率スコ
アは8.2e-45であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然
に得られる確率を示している。PRODOM データベースを用いたBLASTからのデータ
分析によって、さらにSEQ ID NO:34 が細胞骨格タンパク質であることの補強証
拠が得られる。SEQ ID NO:1-30 および SEQ ID NO:32-33は同じような方法で解
析し、注釈を付けた。 The algorithms and parameters for the analysis of
SEQ ID NO:1-34 are described in Table 7. 表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲ
ノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を
任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌク
レオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Polynucleotide SEQ ID NO :）およ
びそれに対応するIncyte ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte Poly
nucleotide ID）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長
さを示す。列４は、例えば、SEQ ID NO:35−68を同定するため、或いはSEQ ID N
O:35−68と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼー
ションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はcDNA
配列、ゲノムDNAから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはcDNA及び
ゲノムDNAを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配
列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６
および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始
ヌクレオチド（５'）位置および停止ヌクレオチド（３'）位置を示す。 表４の列５の識別番号は、特に例えばIncyte cDNAとそれに対応するcDNAライブ
ラリに照会し得る。例えば、3824958H1はIncytecDNA配列の識別番号であり、BRA
XNOT01はそれが由来するcDNAライブラリの識別番号である。cDNAライブラリが示
されていないIncyte cDNAは、プールされているcDNAライブラリ（例えば、71263
527V1）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み
立てに用いたGenBankのcDNAすなわちEST（例えば、g2276318）の識別番号の場合
もある。或いは列５の識別番号は、ゲノムDNAのGenscan分析により予測されるコ
ード領域と言える。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集
する場合がある。（例IVを参照）。または列５の識別番号は、「エキソンスティ
ッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGensca
n予想エキソンの両方の集合に照会し得る。（例Vを参照）。または列５の識別番
号は、「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結
び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合に照会し得る。 (See Exa
mple V.) 場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認する
ための列５に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得
られたが、関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。 表５は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のた
めの代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記の
ポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列に
よって最も頻繁に表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作
製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。 本発明はまた、CYSKP の変異体も含む。好適なCYSKP の変異体は、CYSKP の機能
的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつCYSKP アミノ酸配列
に対して少なくとも約8０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％
のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有す
る。 本発明はまた、CYSKPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、CYSKPをコードするSEQ ID NO:35−68からなる一群から選
択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID N
O:35−68のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され
、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配
列を含む。 本発明はまた、CYSKPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CYSKPをコードするポ
リヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは
少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％もの
ポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:
35−68からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオ
チド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更に
は少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:35−68
からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供
する。上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、CYSKPの機能的或いは構造的
特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードすることができる。 遺伝暗号の縮重により作り出され得るCYSKPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るよう
なありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これ
らの組み合わせは、天然のCYSKPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的な
トリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されて
いるとみなす。 CYSKP をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、適切に選択さ
れたストリンジェントな条件下で、天然のCYSKP のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった
使い方のコドンを有するCYSKP 或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列
を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、
特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選
択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えずに、CYSKP 及びそ
の誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転
写物を作ることにある。 本発明はまた、CYSKP 及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、CYSKP またはその任意の
断片をコードする配列の中に突然変異体を導入することも可能である。 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリ
ヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:35−68及びそれらの断片とハイブリダイズ
可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (
1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol.
152:507-511を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーショ
ンの条件は、「定義」に記載されている。 DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例
もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法
には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUEN
ASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems
）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）
を用いることができる。 或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technolo
gies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソ
ヌクレアーゼを併用することができる。好しくは、MICROLAB2200液体転移システ
ム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Waterto
wn MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の
装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエ
ンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシン
グシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られて
いる他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当
分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ausubel, F.
M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Y
ork NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnolog y , Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列
を利用して、CYSKP をコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメ
ントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制
限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてク
ローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarka
r, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）。別の方法に逆PCR法が
あり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未
知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の
配列からなる制限酵素断片から得る（Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res
16:8186等を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及
び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関
与している（Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照
）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて
未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知
の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Pa
rker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR
、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Pa
lo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は
、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を
見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソ
フトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Bioscie
nces, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３
０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対し
てアニーリングするようにプライマーを設計し得る。 完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択
されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラ
リは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが
完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'
非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産
物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具
体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動
性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性
化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る
。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER
、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。 サンプルのロード
からコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御
可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない
ようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCYSKP 、その断
片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重によ
り、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列
を作ることができ、これらの配列をCYSKPの発現に利用可能である。 種々の目的でCYSKPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 こ
れらの目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の
調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリ
ゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるD
NAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例
えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限
部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異
体の生成等を行う突然変異を導入し得る。 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA;
米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-7
97; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A.
他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いて
シャフリングして、CYSKPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのCYSKPの生物学的特性を改変或いは改良することがで
きる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変
異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子
変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次に
これらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／
スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化に
よって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単
一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化
されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種また
は異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それ
によって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方
法で最大化させることができる。 別の実施例によれば、CYSKP をコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてCYSKP 自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相
技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Protein s, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York NY, 55-60
ページ、Roberge, J.Y. ら (1995) Science 269:202-204等を参照）。自動合成
はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にCY
SKPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／
または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との
組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体
ポリペプチドを作製することが可能である。 ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である
（Chiez, R.M.および F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を
参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって
確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。 生物学的に活性なCYSKPを発現させるために、CYSKPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、
好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメ
ントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びCYSKPをコードするポリヌ
クレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、
５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及
び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、CYSKPをコードする配列
のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、AT
G開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。CYSKP をコードす
る配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された
場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。
しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、イン
フレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含
まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物
及び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適
なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Scharf, D. ら (1
994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照）。 当業者に周知の方法を用いて、CYSKP をコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。この方法には、 in vitro 組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある（Sambro
ok, J. ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Press, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NYの9, 13,
16章等を参照）。 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CYSKPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には
、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形
質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス
発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発
現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウ
イルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形
質転換させた植物細胞系、あるいは動物細胞系などの微生物等がある（前出のSa
mbrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol
. Chem. 264:5503-5509、Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Taka
matsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、Coruzzi, G. ら (1984) EMBOJ. 3:1671-1
680、Broglie, R. ら (1984) Science 224:838-843、Winter, J. ら (1991) Res
ults Probl. Cell Differ. 17:85-105、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McG
raw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York
NY, 191-196ページ、Logan, J. およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:345-355等
を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニ
アウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクタ
ーを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達する
ことができる（Di Nicola, M. ら (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu
, M. ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M.
ら (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. ら (1994) Mol. Immun
ol. 31(3):219-226、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242
等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CYSKPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CYSKP
をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング
、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド
(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの
多数のクローニング部位にCYSKP をコードする配列をライゲーションするとlac
Ｚ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色
スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた
配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G
. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照）。
例えば、抗体の産生のためなどに多量のCYSKP が必要な場合は、CYSKP の発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリオ
ファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベク
ターが使用できる。 CYSKPの作製に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダ
ーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベ
クターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可
能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞
内への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへ
の組込みを可能にする（前出のAusubel (1995)、Bitter, G.A. ら (1987) Metho
ds Enzymol. 153:516544; およびScorer, C.A.ら(1994) Bio/Technology 12:181
-184を参照）。 植物系もCYSKPの発現に使用可能である。CYSKP をコードする配列の転写は、ウ
イルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:3
07-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の
35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニッ
ト等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（前出の
Coruzzi、前出のBroglie、前出のWinter等を参照）。これらの構成物は、直接DN
A形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能
である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Scien ce and Technology ) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ等を参照
。） 哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノ
ウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リー
ダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCYSKP をコードする配列
を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により
、感染した宿主細胞にCYSKP を発現する生ウイルスを得ることが可能である（Lo
gan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）
。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用い
て、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースに
したベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現
するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約６kb〜
１０MbのHACsを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリ
マー、またはベシクル）で送達する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Na
t Genet.15:345-355.を参照)。 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけ
るCYSKP の安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、PPをコー
ドする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。 このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す
前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカー
の目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在する
ことにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能
となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組
織培養技術を用いて増殖可能である。 任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。選択系には、以下の
ものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデ
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれtk−またはap
r−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232
; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代
謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfr
はメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシ
ン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulf
uron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin ac
etyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigler, M. 他. (1980) Proc
. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Bi
ol. 150:1-14を参照)。( Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
7:35673570; ColbereGarapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照
。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるt
rpB及びhisDは、文献に記載されている（Hartman, S.C.および R.C. Mulligan (
1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照）。可視マーカー、
例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニ
ダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフ
ェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだ
けでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を
定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-
131等を参照）。 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CYSKP をコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CYSKP をコードする配
列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能であ
る。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCYSKP をコードす
る配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー
遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。 一般に、CYSKP をコードする核酸配列を含み、CYSKP を発現する宿主細胞は、当
業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法に
は、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタ
ンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベ
ースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれる
が、これらに限定されるものではない。 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるCYSK
P の発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 こ
のような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノ
アッセイ（RIA）、フローサイトメーター（FACS）などがある。PKIN上の２つの
非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクロー
ナルベース イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好
ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこ
れ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. ら (1990) Serologica l Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coliga
n, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associat
es and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemica l Protocols , Humans Press, Totowa NJ等を参照）。 多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッ
セイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CYSKP をコードするポ
リヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼー
ションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニック
トランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR
増幅が含まれる。別法として、CYSKPをコードする配列、またはその任意の断片
をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である
。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7
、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて
、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例
えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemical
等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易
にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、
インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色
剤等がある。 CYSKP をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞か
ら製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、
ベクター、或いはその両者に依存する。CYSKP をコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCYSKP の分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。 更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現した
タンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではない
がこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシ
ル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または
「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折り
たたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固
有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、M
DCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Bethesd
a, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にす
るように選択し得る。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCY
SKP タンパク質が、CYSKP 活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのス
クリーニングを容易にする。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も
、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を容易にする。限定されるも
のではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）
、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン
結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは
固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシ
ド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族
の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は
、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能に
する。また、CYSKP をコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパ
ク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、CYSKP が精
製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前
出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用
いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出
系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCYSKP の合成が可能である。こ
れらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質コー
ド配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのよう
な放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。 本発明のCYSKP またはその断片を用いて、CYSKP に特異結合する化合物をスクリ
ーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、
CYSKPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の
例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子
が挙げられる。 一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片など
のCYSKPの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性ま
たは自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Curr ent Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、CYSKP
が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容
体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合
物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対する
スクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方
としてCYSKPを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動
物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。CYSKP を発現する細胞またはCYSKP を
含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、CYSKP または化合物の何れかの
結合、刺激または活性の阻害を分析する。 あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、
蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出
することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、
溶液中の或いは固体支持物に固定されたCYSKP と結合させるステップと、CYSKP
とこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競
合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこ
のアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を
用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に
固定させる。 本発明のCYSKP またはその断片を用いて、CYSKP の活性を調整する化合物をスク
リーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタ
ゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、CY
SKP が少なくとも１つの試験化合物と結合する、CYSKP の活性が許容される条件
下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのCYSKP の活性が試験化合物不在
下でのCYSKP の活性と比較する。試験化合物の存在下でのCYSKP の活性の変化は
、CYSKP の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をCY
SKP の活性に適した条件下でCYSKP を含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合
させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、CYSKP の活性を
調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接
触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングする
ことができる。 別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル
系内で、CYSKP またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノ
ックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患
動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を
参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培
地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマー
カー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクタ
ーは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、
Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的
遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002;
Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-43 30）。形質転換した
ES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微
量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝
形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。
このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で
検査することができる。 CYSKP をコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞にお
いて操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細
胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。こ
れらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomso
n, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。 CYSKP をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノッ
クイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を
作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、CYSKP をコードするポリ
ヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノム
に組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。
遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処
理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばCYSKPを乳汁内
に分泌するなどCYSKPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源
となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
CYSKP の領域と細胞骨格結合タンパク質の領域との間に、例えば配列及びモチー
フの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、CYSKP の発現は
肺、生殖(胎盤を含む)、神経(脳を含む)、副腎、内皮、腎臓および脾臓組織なら
びに卵巣、乳房および精巣の腫瘍組織に密接に関連する。従って、CYSKP は、細
胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送、神経疾患、細胞運動、生殖お
よび筋肉疾患においてある役割を果たすと考えられる。CYSKP の発現若しくは活
性の増加に関連する疾患の治療においては、CYSKPの発現または活性を低下させ
ることが望ましい。また、CYSKP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療
においては、CYSKP の発現または活性を増大させることが望ましい。 従って、一実施例において、CYSKP の発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にCYSKP またはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないが、このような疾患には免疫系の疾患、神経
の疾患、発生または発達障害、および癌を含む細胞増殖異常が含まれ、細胞増殖
異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝
炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真
性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、
頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が、
自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼
吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテ
ローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性
多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触
皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球
体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸
球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎
症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性
関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身
性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー
症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感
染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、小胞輸送障害に
は、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール
血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、ク
ッシング病、およびアジソン病、潰瘍性大腸炎、胃十二指腸潰瘍などを含む胃腸
管障害、小胞輸送異常に合併する他の病態には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、
花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)、自己免疫性溶血性貧血、増殖糸球体腎炎、炎
症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマトイド、骨関節炎、強皮症
、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、
トキシックショック症候群、外傷性組織障害、およびウイルス感染症、細菌感染
症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、神経の疾患の中には、癲癇、虚血
性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチント
ン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びそ
の他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動
失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、
硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、
ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ
病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症
、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（
cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症
候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常
症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神
経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性
、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安
性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、
糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精
神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質
基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、細胞運動障害には
、強直性脊椎炎、チェディアック東症候群、デュシェンヌ型およびベッカー型筋
ジストロフィー、肝内胆汁鬱滞、心筋過形成(肥厚)、心筋症、早発性歯根膜炎が
含まれ、 腺癌、卵巣癌および慢性骨髄性白血病などの癌、および細菌感染症や
寄生虫感染、生殖障害には、プロラクチン産生障害、不妊症、卵管疾患、排卵欠
損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺
激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形
、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌
、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、
女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下
症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延
、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeo-chro
mocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍、また筋肉疾
患には、心筋炎、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフ
ィー、筋緊張性ジストロフィー、中核疾患、ネマリンミオパシー、橋中心髄鞘崩
壊症、脂質筋疾患、ミトコンドリアミオパシー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚
性筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒筋炎およびエタノールミオパシー、狭心症、ア
ナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管性ショック、クッシング症
候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、およびクロム親和細胞腫(褐色細
胞腫)、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイヤー症候群、乳酸アシド
ーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺が含まれる。 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP またはその
断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたCYSKP を含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能
である。 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP の活性
を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。 更なる実施例では、CYSKP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にCYSKP のアンタゴニストを投与することが可能である。限
定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己
免疫／炎症性疾患、小胞輸送、神経疾患、細胞運動疾患、生殖疾患および筋疾患
が含まれる。一実施態様では、CYSKP と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニ
ストとして、或いはCYSKP を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティ
ング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP をコードす
るポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能
である。 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニス
ト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与するこ
ともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従っ
てを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療
または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬
剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し
得る。 CYSKP のアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。 詳しくは、精製されたPPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてCYSKP と特異的に結合するものの同定が可能である。CY
SKPの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 この
ような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが
含まれる。 但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の
形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のもの
を含む種々の宿主が、CYSKP または任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないが
このようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム
等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリ
アニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロ
フェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、
BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ま
しい。 CYSKP に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分
子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。CYSKP アミノ酸の短いストレッチは
、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生さ
れ得る。 CYSKPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するもので
はないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:4
95-497、Kozbor, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J.
ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984)
Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。 更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子
をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備え
る分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Nat
l. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-6
08; Takeda, S.ら. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野で
周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、CY
SKP特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が
異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェー
ンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫
グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特
異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. ら (19
89) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) Natur
e 349:293-299等を参照）。 CYSKP に対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定
するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作
製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによ
って作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することに
よって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定すること
が可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照）。 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を
同定することができる。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のため
の数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセ
イには、CYSKP とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの
非干渉性CYSKP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部
位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合ア
ッセイも利用することができる(Pound、前出)。 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、CYS
KPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、
平衡状態の下でCYSKP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で
除して得られる値である。多数のCYSKPエピトープに対して親和性が不均一なポ
リクローナル抗体医薬のＫａは、CYSKPに対する抗体の平均親和性または結合活
性を表す。特定のCYSKP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫ
ａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和
性抗体医薬は、CYSKP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノア
ッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体
医薬は、CYSKPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（i
mmunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988
) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC;
Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies , John Wiley & Sons, New York NY)。 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの
特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CYSKP抗体複合体を沈殿
させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様
々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能
である。（前出のCattyの文献、同Coligan らの文献等を参照）。 本発明の別の実施例では、CYSKPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、
CYSKPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアン
チセンス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更す
ることができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチ
センスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CYSKPをコードする配列の制御
領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である( Agra
wal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ
等を参照)。 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任
意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タ
ンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現
プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Slater, J.E. ら (1998)
J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)9(
13):1288-1296.等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスや
アデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入するこ
ともできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.
および W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その
他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分
野で公知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):
217-225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M
.C. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことに
より、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (20
00) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症(SCID
)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の
複合型免疫欠損症（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon,
C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Ce
ll 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crys
tal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassam
ia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因す
る血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. およ
び Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝
子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）
細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988)
Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93
:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans 及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原
虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタン
パク質を発現させることができる。CYSKP の発現若しくは調節に必要な遺伝子の
欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCYSKP を発現させ
て、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。 本発明の更なる実施例では、CYSKP の欠損による疾患や異常症は、CYSKP をコー
ドする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によっ
てCYSKP 欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの
細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射
法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介
した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A. および W.
F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell
91:501-510; Boulay, J-L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechno
l. 9:445-450）がある。 CYSKP の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、
PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF
、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる
。CYSKPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイ
トメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジ
ンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター
（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テ
トラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 26
8:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechno
l. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミド
PVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プ
ロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.
M.V. および H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するCYSKPを
コードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーター
を用いることが可能である。 市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transf
ection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチ
ドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウ
ム法（Graham. F.L. および A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電
気穿孔法（Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行
う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入
プロトコルの修飾が必要である。 本発明の別の実施例では、の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異
常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立し
たプロモーターのコントロール下でCYSKP をコードするポリヌクレオチドと、（
ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス
作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev
応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療す
ることができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagen
e社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用すること
をもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（VPCL
）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベ
ロープ遺伝子またはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Arment
ano, D. ら (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Viro
l. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-
3806、Dull, T. ら (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. ら (1998)
J. Virol. 72:9873-9880）。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Metho
d for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transduci
ng efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケー
ジング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細
書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細
胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野で
は当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. ら. (1
997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259-2267、Bon
yhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CYSKP の発現に関連
する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にCYSKP をコードするポリヌクレ
オチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについ
ては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節
タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性
であることが証明された（Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:263-26
8）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与され
た米国特許第5,707,618号（"Adenovirus vectors for gene therapy"）に記載さ
れており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクタ
ーについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び
Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい
。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CYSKP の発現に関連する１
つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にCYSKP をコードするポリヌクレオ
チドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神
経細胞にCYSKP を導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及び
パッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（H
SV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用い
られてきた（Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルス
ベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（"Herp
es simplex virus swains for gene transfer"）に開示されており、該特許の引
用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治
療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少
なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記
載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHS
V系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W
.F. ら (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:
152-161も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クロ
ーン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった
部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペ
スウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者
に公知の技術である。 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてCYSKP をコ
ードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスで
あるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が
広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分
かった（Garoff, H. および K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469
）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコ
ードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノム
RNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリ
メラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰
産生される。同様に、CYSKP をコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドを
コードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCYSK
P をコードするRNAが産生され、高いレベルでCYSKP が合成される。通常はαウ
イルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（
SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確
立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変
更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74-
83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にCY
SKP を導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入
は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローン
の処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方
法は、当業者に公知である。 転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可
能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の
間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三
重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために
十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有
用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載があ
る（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.および B.I. Carr, Molecular and I mmunologic Approaches , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ペー
ジ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに
結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することが
できる。 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイ
ムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断
に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーショ
ンに関与している。例えば、CYSKPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、
特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含ま
れる。 任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリ
ボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される
。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特
徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオ
チドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も
、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよ
く知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフ
ォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或
いは、CYSKPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を
産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモ
ーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的
RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞ま
たは組織内に導入することができる。 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができ
る。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるい
はその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホス
ホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼに
よって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリ
ジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型
塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）
等を加えることができる。 本発明の更なる実施例は、CYSKPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に
有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポ
リヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他
のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る
非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビ
ターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド
発現を変異し得る。従って、CYSKP の発現または活性の増加に関連する疾患の治
療においては、PPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合
物が治療上有用であり、PPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療におい
ては、CYSKP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が
治療上有用であり得る。 特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から
複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知ら
れている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチド
の発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の
化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／ま
たは構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまた
は無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知
られているような化合物の化学修飾がある。CYSKP をコードするポリヌクレオチ
ドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルに
は例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学
系があり得る。CYSKPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当
分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、CYSKPをコードする
ポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いた
ハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリ
ダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及
び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験
化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレ
オチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポ
リヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyce s pombe 遺伝子発現系（Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt,
G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（
Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて
スクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド
配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌク
レオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み
合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. ら
(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米国特許第6,022,691
号）。 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、i n vitro 及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、
ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者
に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入または
ポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用
いて実行することができる（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 15:46
2-466.等を参照）。 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、
サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。 本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分
を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース
、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemingto n's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載
されている。このような組成物は、CYSKP、CYSKPの抗体、擬態、アゴニスト、ア
ンタゴニスト、またはCYSKPのインヒビターなどからなる。 本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定
するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜
下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直
腸がある。 肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は
通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子
量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高
分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野におい
て肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬
剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. ら, 米国特
許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており
、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。 本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量
の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範
囲内で行う。 CYSKP またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に
組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソー
ム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、CYSKP ま
たはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる
。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全て
の組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. ら (1999) S
cience 285:1569-1572）。 任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッ
セイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等
において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、
好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用
いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばCYSKPまたはそ
の断片、CYSKPの抗体、CYSKPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビター
などの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動
物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の医薬的
有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定すること
ができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/E
D50比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細
胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量
の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性
を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好まし
い。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの
範囲内で様々に変わる。 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決
定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持
するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重
症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度
、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い
成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１
週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合
計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に
記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、
タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する
処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送
達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。 (診断) 別の実施例では、CYSKP に特異的に結合する抗体が、CYSKP の発現によって特徴
付けられる疾患の診断、またはCYSKP やCYSKP のアゴニストまたはアンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い
られる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法
で調合される。CYSKP の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或
いは細胞や組織から採取されたものからCYSKP を検出する方法が含まれる。抗体
は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非
共有結合性の接着によって標識化し得る。 多様なレポーター分子が本技術分野
で知られており、それらを用いることができる。 幾つかのレポーター分子につ
いては上記した。 CYSKPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCYSKPの発現を診断する元と
なるものを提供する。正常或いは標準的なCYSKP の発現の値は、複合体の形成に
適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液ま
たは細胞とCYSKP に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合
体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照及び疾患の
生検組織からのサンプルのCYSKP の発現の量が基準値と比較される。標準値と被
験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。 本発明の別の実施例によれば、CYSKP をコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリ
ゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリ
ヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るCYSKP を発現する生検組織における遺
伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、CYSKP の存在の有無
、更に過剰な発現を調べ、治療中のCYSKP 値の調節を監視する。 一実施形態では、CYSKP または近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌ
クレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによ
って、CYSKP をコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調
節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異
性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅のストリンジェントは、プローブがCYSKPをコードする自然界の配
列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列の
みを同定するかどうかによって決まるであろう。 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CYSKP をコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:35−68の配列
、或いはCYSKP 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム
配列に由来し得る。 CYSKP をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、CYSKP 及びCYSKP 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNA
プローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。mRNAプローブ
作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNA
ポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vit ro でRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプロ
ーブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例
としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介
してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられ
る。 CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CYSKP の発現に関連する疾
患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には
、細胞増殖異常である日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包
炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リン
パ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌があり、具体的には、副腎、膀胱、骨
、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉
、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲
状腺、子宮の癌があり、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS
)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド
症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫
性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、
気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性
糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性
紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病
、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無
力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬
、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性
アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰
瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染
症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が
含まれ、小胞輸送障害には、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症
候群、高コレステロール血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレ
ーブス病、甲状腺腫、クッシング病、およびアジソン病、潰瘍性大腸炎、胃十二
指腸潰瘍などを含む胃腸管障害、小胞輸送異常に合併する他の病態には、後天性
免疫不全症候群(AIDS)、花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)、自己免疫性溶血性貧
血、増殖糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマト
イド、骨関節炎、強皮症、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全
身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織障害、およびウ
イルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、神経の疾
患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病
、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、
筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色
素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイ
ルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎
、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、ク
ロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む
）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化
症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神
経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発達障害、
脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジスト
ロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺
伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺
、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座
不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、
ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進
行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含
まれ、細胞運動障害には、強直性脊椎炎、チェディアック東症候群、デュシェン
ヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、肝内胆汁鬱滞、心筋過形成(肥厚)、心
筋症、早発性歯根膜炎が含まれ、 腺癌、卵巣癌および慢性骨髄性白血病などの
癌、および細菌感染症や寄生虫感染、生殖障害には、プロラクチン産生障害、不
妊症、卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞
性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾
患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊
、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病
、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナ
ドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロ
シン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色
細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リ
ンパ嚢腫瘍、また筋肉疾患には、心筋炎、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、中核疾患、ネマリンミ
オパシー、橋中心髄鞘崩壊症 、脂質筋疾患、ミトコンドリアミオパシー、感染
性筋炎、多発性筋炎、皮膚性筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒筋炎およびエタノー
ルミオパシー、狭心症、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管
性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、および
クロム親和細胞腫(褐色細胞腫)、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイ
ヤー症候群、乳酸アシドーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺が含まれ
る。CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ド
ットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dip
stick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異CYSKP の発現を検出するた
めに患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用すること
が可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。 ある実施態様では、CYSKP をコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特
に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CYSKP をコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプル
を洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの
量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCYSKP を
コードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らか
になる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を
推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもでき
る。 CYSKPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の
正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から
抽出された体液或いは細胞と、CYSKPをコードする配列或いはその断片とを結合
させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量
用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標
準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値
は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる
。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。 疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正
常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブ
リダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得ら
れた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または
過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前
に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医
療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌
の発生または更なる進行を防止することが可能となる。 CYSKP をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成する
か、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ま
しくはCYSKPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCYSKPをコードするポ
リヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特
定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い
ストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその
両方のため用いることが可能である。 或る実施態様において、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多
くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び
欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、ＳＳＣＰ(single-str
anded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、C
YSKP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー
を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。DNAは例えば、病変組
織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一
本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲ
ル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオ
チドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってDNAシークエンシング機など
の高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリ
コSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的
なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較す
ることにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DN
Aの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用い
たシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去す
る。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Die
go CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。 CYSKP の発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.ら(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応
によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによ
って、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオ
リゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントと
して用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする
転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これにつ
いては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多
形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定
し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病
の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターす
ることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択す
るために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することがで
きる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有
効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。 別の実施例では、CYSKP、CYSKPの断片、CYSKPに特異的な抗体をマイクロアレイ
上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のよ
うなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロ
フィールをモニターまたは測定することが可能である。 或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発
明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細
胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターン
は、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量する
ことにより分析される（Seilliamer 他、米国特許第5,840,484号の"Comparative
Gene Transcript Analysis" を参照。この特許に言及することを以って本明細
書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全
体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより
、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまた
はその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処
理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転
写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。 転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離し
た転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプル
の場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映
する。 本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた
、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び
薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカ
ニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称
されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. ら. (19
99) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. および N.L. Anderson (2000)
Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書
の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一
のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィン
ガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発
現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲ
ノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。自己の発現が任意の
試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような
遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異
なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインの要素へ
の遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの阻止に役立つが、毒性の予測
につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされ
ない（例えば２０００年２月２９日にNational Institute of Environmental He
alth Sciencesより発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについ
てはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従っ
て、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺
伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。 或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理すること
により試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核
酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイ
ブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを
定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サン
プル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプ
ル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。 別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロ
テオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細
胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパ
ク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パタ
ーン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数
及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームの
プロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析す
ることにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプ
ルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動
により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成され
る（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルー
またはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、
分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポ
ットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサン
プル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的
サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連する
タンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば
化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部
分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配
列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチ
ド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質
同定のための更なる配列が得られる。 プロテオームのプロファイルは、CYSKP に特異的な抗体を用いてCYSKP 発現レベ
ルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ
上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ
要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定
量する（Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G
. ら. (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法
で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサ
ンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量
を検出し得る。 プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転
写レベルでの毒性サインと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク
質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ande
rson, N.L. および J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写
イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような
化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中で
の転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィー
ル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。 別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理す
ることにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発
現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパ
ク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。
両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を
示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシン
グし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理す
ることにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク
質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体
により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中の
タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両
サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示
す。 マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し
、そして分析する（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schen
a, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweile
r らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO9
5/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-215
5、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイ
プのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Pract ical Approach , M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに
記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす
。 本発明の別の実施例ではまた、CYSKP をコードする核酸配列を用いて、天然のゲ
ノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製す
ることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることが
でき、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺
伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中
に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列
は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産
物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（Harrington,
J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:12
7-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照）。一度マッピ
ングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域
やまたは制限酵素断片長多型（RFLP）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図
を作成可能である（Lander, E.S. およびD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相
関し得る（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965-968ページ.等を参
照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inher
itance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地
図上のCYSKP をコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の
疾患に対する素因が、このような疾患と関連するDNA領域の決定に役立つため、
更なる位置を決定するクローニングが行われる。 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体
標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例
えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な
染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る
。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を
探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q2
2-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなさ
れると、該領域に対する任意のマッピングにより更なる調査のための関連遺伝子
或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.ら (1988) Nature 336:577-
580等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間に
おける染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いても
よい。 本発明の別の実施例では、CYSKP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる
断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保
持されるか、細胞内に位置することになろう。CYSKP と検査する薬剤との結合に
よる複合体の形成を測定してもよい。 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を
有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Geysen,
らの (1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照）。この方法においては、多数の
異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、CYSKP、
或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたCYSKP が、当分
野で周知の方法で検出される。 精製されたCYSKP はまた、前記した薬剤をスク
リーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法
では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定する
こともできる。 別の実施例では、CYSKP と結合可能な中和抗体がCYSKP と結合するため試験用化
合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる
。この方法では、抗体が、CYSKPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプ
チドの存在も検出する。 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にCYSKP をコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限
に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的に
すぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限
に利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は、例
示目的であって本発明を限定するものではない。 前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願
第60/201.960号、同第60/202.729号、同第60/209.705号、同第60/210.149号、お
よび同第60/213.215号に言及することをもって本明細書の一部とする。 (実施例)１ cDNAライブラリの作製 Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）
に記載されたcDNAライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。
ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり
、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組
織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシ
アネートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として
得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出し
た。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或い
は別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り
返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、
オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Val
encia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNA
を単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStr
atagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステ
ム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）
を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAラ
イブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参照）。逆転写
は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレ
オチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化し
た。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、
SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフ
ィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法
を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応
させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例
えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technol
ogies）またはplNCY（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換
えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLif
e Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形
質転換した。２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは
細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収し
た。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Minipre
p精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Pla
smid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.
E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミド
を精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或
いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。 別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物
からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）
。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サン
プルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの
濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroskan II蛍光
スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した
。３ シークエンシング及び分析 実施例２ に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下
に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或
いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosy
stems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロデ
ィスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転
移システムと併用して処理した。 cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharma
cia Biotech社が提供する試薬またはABIシークエンシングキット、例えばABI PR
ISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosy
stems）に与えられた試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳
動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシーク
エンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対
呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステ
ム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配
列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法
（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を用いて決定した。cDNA配列の幾つ
かを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。 Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及び
ポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確
認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析
に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。IncyteのcDNA配列、またはその
翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、
脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）及びPF
AM等隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに
対して問い合わせた（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析
する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct
. Biol. 6:361-365を参照のこと。）問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMER
に基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレ
オチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、
ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実
施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phr
ed、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びF
ASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに
対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完
全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長
翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBank
タンパク質データベース（genpept）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PROD
OM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースの
タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド
配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウ
ェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASE
RGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペ
プチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算す
るMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込
まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメー
タを用いて生成する。 Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラ
ム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表
７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列１に、それら
の簡単な説明を列２に示す。 列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっ
くりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列４
は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパ
ラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。 完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用い
る上記のプログラムは、SEQ ID NO:35−68のポリヌクレオチド配列断片の同定に
も利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約
４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。４ ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集 推定上の細胞骨格結合タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、
gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定し
た。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログ
ラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94 及
びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参
照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構
築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペ
プチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範
囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が細胞
骨格結合タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチ
ドをPFAMモデルにおいて細胞骨格結合タンパク質について問合せて分析した。潜
在的な細胞骨格結合タンパク質が、細胞骨格結合タンパク質としてアノテーショ
ンが付けられたインサイトcDNA配列に対する相同性を基に同定された。こうして
選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgbpri及
びgbhtgと比較した。必要であれば、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比
較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソ
ンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、
任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられ
るので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、
この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオ
チド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及
び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た
。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コー
ド配列に完全に由来する。５ ゲノム配列データのcDNA配列データへのアセンブリ ステッチ配列（Stiched Sequence） 部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測さ
れたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分
cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノ
ム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲ
ノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズ
ムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配
列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラ
スタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間
隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列
に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは
、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る
。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現わ
れるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異
配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（cDNA−
cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム
配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共
データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測さ
れた不正確なエキソンは、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較すること
により修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査に
より配列を更に伸長させた。ストレッチ配列（Stretched Sequence） 部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。
先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎
動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記
載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタ
ンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenS
canエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリン
グセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGen
Bankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関
連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク
質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒト
ゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的な
DNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果とし
て得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した
。６ CYSKPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング SEQ ID NO:35−68を組み立てるために用いた配列を、BLAST及びSmith-Waterman
アルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータ
ベースの配列と比較した。SEQ ID NO:35−68と一致するこれらのデータベースの
配列を、Phrapなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配
列のクラスターに構築した（表７）。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SH
GC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から
入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された
配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラス
タに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上
の位置に割り当てられた。 地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン
間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。 （センチ
モルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平
均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 尤も、この
値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化す
る。cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカ
ーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカ
ーに基づく。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）など
の一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記
した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを
決定できる。 このようにして、SEQ ID NO:44 は62.90~64.20 センチモルガンの区間内で染色
体17に、SEQ ID NO:49は73.70から 76.40 センチモルガンの区間内で染色体14に
、SEQ ID NO:50は25.80から 40.30センチモルガンの区間内で染色体8に、SEQ ID
NO:54 は117.6から 132.4 センチモルガンの区間内で染色体1に、SEQ ID NO:64
は56.7から60.5センチモルガンの区間内で染色体4に、SEQ ID NO:65は141.40か
ら142.60センチモルガンの区間内で染色体5にそれぞれマッピングされた。７ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌ
クレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook,
7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。） BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte
Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子
を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。
フの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、CYSKP の発現は
肺、生殖(胎盤を含む)、神経(脳を含む)、副腎、内皮、腎臓および脾臓組織なら
びに卵巣、乳房および精巣の腫瘍組織に密接に関連する。従って、CYSKP は、細
胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、小胞輸送、神経疾患、細胞運動、生殖お
よび筋肉疾患においてある役割を果たすと考えられる。CYSKP の発現若しくは活
性の増加に関連する疾患の治療においては、CYSKPの発現または活性を低下させ
ることが望ましい。また、CYSKP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療
においては、CYSKP の発現または活性を増大させることが望ましい。 従って、一実施例において、CYSKP の発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にCYSKP またはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないが、このような疾患には免疫系の疾患、神経
の疾患、発生または発達障害、および癌を含む細胞増殖異常が含まれ、細胞増殖
異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝
炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真
性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、
頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が、
自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼
吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテ
ローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性
多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触
皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球
体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸
球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎
症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性
関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身
性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー
症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感
染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、小胞輸送障害に
は、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール
血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、ク
ッシング病、およびアジソン病、潰瘍性大腸炎、胃十二指腸潰瘍などを含む胃腸
管障害、小胞輸送異常に合併する他の病態には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、
花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)、自己免疫性溶血性貧血、増殖糸球体腎炎、炎
症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマトイド、骨関節炎、強皮症
、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、
トキシックショック症候群、外傷性組織障害、およびウイルス感染症、細菌感染
症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、神経の疾患の中には、癲癇、虚血
性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチント
ン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びそ
の他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動
失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、
硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、
ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ
病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症
、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（
cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症
候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常
症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神
経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性
、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安
性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、
糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精
神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質
基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、細胞運動障害には
、強直性脊椎炎、チェディアック東症候群、デュシェンヌ型およびベッカー型筋
ジストロフィー、肝内胆汁鬱滞、心筋過形成(肥厚)、心筋症、早発性歯根膜炎が
含まれ、 腺癌、卵巣癌および慢性骨髄性白血病などの癌、および細菌感染症や
寄生虫感染、生殖障害には、プロラクチン産生障害、不妊症、卵管疾患、排卵欠
損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺
激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形
、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌
、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、
女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下
症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延
、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeo-chro
mocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍、また筋肉疾
患には、心筋炎、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフ
ィー、筋緊張性ジストロフィー、中核疾患、ネマリンミオパシー、橋中心髄鞘崩
壊症、脂質筋疾患、ミトコンドリアミオパシー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚
性筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒筋炎およびエタノールミオパシー、狭心症、ア
ナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管性ショック、クッシング症
候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、およびクロム親和細胞腫(褐色細
胞腫)、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイヤー症候群、乳酸アシド
ーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺が含まれる。 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP またはその
断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたCYSKP を含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能
である。 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP の活性
を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。 更なる実施例では、CYSKP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にCYSKP のアンタゴニストを投与することが可能である。限
定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己
免疫／炎症性疾患、小胞輸送、神経疾患、細胞運動疾患、生殖疾患および筋疾患
が含まれる。一実施態様では、CYSKP と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニ
ストとして、或いはCYSKP を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティ
ング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCYSKP の発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CYSKP をコードす
るポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能
である。 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニス
ト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与するこ
ともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従っ
てを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療
または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬
剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し
得る。 CYSKP のアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。 詳しくは、精製されたPPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてCYSKP と特異的に結合するものの同定が可能である。CY
SKPの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 この
ような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが
含まれる。 但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の
形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のもの
を含む種々の宿主が、CYSKP または任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないが
このようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム
等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリ
アニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロ
フェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、
BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ま
しい。 CYSKP に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分
子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。CYSKP アミノ酸の短いストレッチは
、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生さ
れ得る。 CYSKPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するもので
はないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:4
95-497、Kozbor, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J.
ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984)
Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。 更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子
をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備え
る分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Nat
l. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-6
08; Takeda, S.ら. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野で
周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、CY
SKP特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が
異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェー
ンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。 抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫
グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特
異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. ら (19
89) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) Natur
e 349:293-299等を参照）。 CYSKP に対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定
するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作
製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによ
って作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することに
よって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定すること
が可能となる（Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照）。 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を
同定することができる。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のため
の数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセ
イには、CYSKP とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの
非干渉性CYSKP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部
位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合ア
ッセイも利用することができる(Pound、前出)。 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、CYS
KPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、
平衡状態の下でCYSKP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で
除して得られる値である。多数のCYSKPエピトープに対して親和性が不均一なポ
リクローナル抗体医薬のＫａは、CYSKPに対する抗体の平均親和性または結合活
性を表す。特定のCYSKP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫ
ａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和
性抗体医薬は、CYSKP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノア
ッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体
医薬は、CYSKPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（i
mmunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988
) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC;
Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies , John Wiley & Sons, New York NY)。 ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの
特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CYSKP抗体複合体を沈殿
させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様
々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能
である。（前出のCattyの文献、同Coligan らの文献等を参照）。 本発明の別の実施例では、CYSKPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、
CYSKPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアン
チセンス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更す
ることができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチ
センスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CYSKPをコードする配列の制御
領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である( Agra
wal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ
等を参照)。 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任
意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タ
ンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現
プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Slater, J.E. ら (1998)
J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. ら (1995)9(
13):1288-1296.等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスや
アデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入するこ
ともできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.
および W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その
他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分
野で公知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):
217-225; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M
.C. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。 本発明の別の実施例では、CYSKP をコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことに
より、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (20
00) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症(SCID
)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の
複合型免疫欠損症（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon,
C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Ce
ll 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crys
tal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassam
ia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因す
る血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. およ
び Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝
子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）
細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988)
Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93
:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans 及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原
虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタン
パク質を発現させることができる。CYSKP の発現若しくは調節に必要な遺伝子の
欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCYSKP を発現させ
て、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。 本発明の更なる実施例では、CYSKP の欠損による疾患や異常症は、CYSKP をコー
ドする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によっ
てCYSKP 欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの
細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射
法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介
した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A. および W.
F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell
91:501-510; Boulay, J-L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechno
l. 9:445-450）がある。 CYSKP の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、
PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF
、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる
。CYSKPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイ
トメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジ
ンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター
（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テ
トラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 26
8:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechno
l. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミド
PVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プ
ロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.
M.V. および H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するCYSKPを
コードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーター
を用いることが可能である。 市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transf
ection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチ
ドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウ
ム法（Graham. F.L. および A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電
気穿孔法（Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行
う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入
プロトコルの修飾が必要である。 本発明の別の実施例では、の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異
常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立し
たプロモーターのコントロール下でCYSKP をコードするポリヌクレオチドと、（
ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス
作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev
応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療す
ることができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagen
e社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用すること
をもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（VPCL
）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベ
ロープ遺伝子またはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Arment
ano, D. ら (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Viro
l. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-
3806、Dull, T. ら (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. ら (1998)
J. Virol. 72:9873-9880）。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Metho
d for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transduci
ng efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケー
ジング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細
書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細
胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野で
は当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. ら. (1
997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259-2267、Bon
yhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CYSKP の発現に関連
する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にCYSKP をコードするポリヌクレ
オチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについ
ては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節
タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性
であることが証明された（Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 27:263-26
8）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与され
た米国特許第5,707,618号（"Adenovirus vectors for gene therapy"）に記載さ
れており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクタ
ーについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び
Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい
。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CYSKP の発現に関連する１
つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にCYSKP をコードするポリヌクレオ
チドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神
経細胞にCYSKP を導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及び
パッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（H
SV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用い
られてきた（Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルス
ベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（"Herp
es simplex virus swains for gene transfer"）に開示されており、該特許の引
用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治
療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少
なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記
載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHS
V系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W
.F. ら (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:
152-161も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クロ
ーン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった
部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペ
スウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者
に公知の技術である。 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてCYSKP をコ
ードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスで
あるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が
広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分
かった（Garoff, H. および K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469
）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコ
ードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノム
RNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリ
メラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰
産生される。同様に、CYSKP をコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドを
コードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCYSK
P をコードするRNAが産生され、高いレベルでCYSKP が合成される。通常はαウ
イルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（
SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確
立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変
更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74-
83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にCY
SKP を導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入
は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローン
の処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方
法は、当業者に公知である。 転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可
能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の
間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三
重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために
十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有
用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載があ
る（Gee, J.E. ら (1994) in: Huber, B.E.および B.I. Carr, Molecular and I mmunologic Approaches , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ペー
ジ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに
結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することが
できる。 リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイ
ムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断
に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーショ
ンに関与している。例えば、CYSKPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、
特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含ま
れる。 任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリ
ボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される
。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特
徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオ
チドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も
、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。 本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよ
く知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフ
ォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或
いは、CYSKPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を
産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモ
ーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的
RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞ま
たは組織内に導入することができる。 細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができ
る。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるい
はその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホス
ホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用し
たりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら
全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼに
よって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリ
ジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型
塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）
等を加えることができる。 本発明の更なる実施例は、CYSKPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に
有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポ
リヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他
のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る
非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビ
ターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド
発現を変異し得る。従って、CYSKP の発現または活性の増加に関連する疾患の治
療においては、PPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合
物が治療上有用であり、PPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療におい
ては、CYSKP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が
治療上有用であり得る。 特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から
複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知ら
れている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチド
の発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の
化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／ま
たは構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまた
は無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知
られているような化合物の化学修飾がある。CYSKP をコードするポリヌクレオチ
ドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルに
は例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学
系があり得る。CYSKPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当
分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、CYSKPをコードする
ポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いた
ハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリ
ダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及
び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験
化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレ
オチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポ
リヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyce s pombe 遺伝子発現系（Atkins, D. ら (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt,
G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（
Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて
スクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド
配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌク
レオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み
合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. ら
(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000) 米国特許第6,022,691
号）。 ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、i n vitro 及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、
ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者
に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入または
ポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用
いて実行することができる（Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 15:46
2-466.等を参照）。 上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、
サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。 本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分
を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース
、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemingto n's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載
されている。このような組成物は、CYSKP、CYSKPの抗体、擬態、アゴニスト、ア
ンタゴニスト、またはCYSKPのインヒビターなどからなる。 本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定
するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜
下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直
腸がある。 肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は
通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子
量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高
分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野におい
て肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬
剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. ら, 米国特
許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており
、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。 本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量
の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範
囲内で行う。 CYSKP またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に
組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソー
ム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、CYSKP ま
たはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる
。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全て
の組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. ら (1999) S
cience 285:1569-1572）。 任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッ
セイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等
において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、
好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用
いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばCYSKPまたはそ
の断片、CYSKPの抗体、CYSKPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビター
などの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動
物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の医薬的
有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定すること
ができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/E
D50比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細
胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量
の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性
を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好まし
い。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの
範囲内で様々に変わる。 正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決
定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持
するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重
症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度
、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い
成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１
週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。 通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合
計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に
記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、
タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する
処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送
達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。 (診断) 別の実施例では、CYSKP に特異的に結合する抗体が、CYSKP の発現によって特徴
付けられる疾患の診断、またはCYSKP やCYSKP のアゴニストまたはアンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い
られる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法
で調合される。CYSKP の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或
いは細胞や組織から採取されたものからCYSKP を検出する方法が含まれる。抗体
は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非
共有結合性の接着によって標識化し得る。 多様なレポーター分子が本技術分野
で知られており、それらを用いることができる。 幾つかのレポーター分子につ
いては上記した。 CYSKPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCYSKPの発現を診断する元と
なるものを提供する。正常或いは標準的なCYSKP の発現の値は、複合体の形成に
適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液ま
たは細胞とCYSKP に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合
体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照及び疾患の
生検組織からのサンプルのCYSKP の発現の量が基準値と比較される。標準値と被
験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。 本発明の別の実施例によれば、CYSKP をコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリ
ゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリ
ヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るCYSKP を発現する生検組織における遺
伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、CYSKP の存在の有無
、更に過剰な発現を調べ、治療中のCYSKP 値の調節を監視する。 一実施形態では、CYSKP または近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌ
クレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによ
って、CYSKP をコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調
節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異
性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅のストリンジェントは、プローブがCYSKPをコードする自然界の配
列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列の
みを同定するかどうかによって決まるであろう。 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CYSKP をコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:35−68の配列
、或いはCYSKP 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム
配列に由来し得る。 CYSKP をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、CYSKP 及びCYSKP 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNA
プローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。mRNAプローブ
作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNA
ポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vit ro でRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプロ
ーブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例
としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介
してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられ
る。 CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CYSKP の発現に関連する疾
患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には
、細胞増殖異常である日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包
炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロ
ビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リン
パ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌があり、具体的には、副腎、膀胱、骨
、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉
、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲
状腺、子宮の癌があり、自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS
)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド
症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫
性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、
気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性
糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性
紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病
、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無
力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬
、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性
アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰
瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染
症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が
含まれ、小胞輸送障害には、嚢胞性線維症、グルコースガラクトース吸収不良症
候群、高コレステロール血症、真性糖尿病、尿崩症、高血糖症、低血糖症、グレ
ーブス病、甲状腺腫、クッシング病、およびアジソン病、潰瘍性大腸炎、胃十二
指腸潰瘍などを含む胃腸管障害、小胞輸送異常に合併する他の病態には、後天性
免疫不全症候群(AIDS)、花粉症、喘息および蕁麻疹(発疹)、自己免疫性溶血性貧
血、増殖糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リューマト
イド、骨関節炎、強皮症、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全
身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織障害、およびウ
イルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、神経の疾
患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病
、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、
筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色
素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイ
ルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎
、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、ク
ロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む
）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化
症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神
経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発達障害、
脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジスト
ロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺
伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺
、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座
不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、
ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進
行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含
まれ、細胞運動障害には、強直性脊椎炎、チェディアック東症候群、デュシェン
ヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、肝内胆汁鬱滞、心筋過形成(肥厚)、心
筋症、早発性歯根膜炎が含まれ、 腺癌、卵巣癌および慢性骨髄性白血病などの
癌、および細菌感染症や寄生虫感染、生殖障害には、プロラクチン産生障害、不
妊症、卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞
性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾
患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊
、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病
、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナ
ドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロ
シン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色
細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リ
ンパ嚢腫瘍、また筋肉疾患には、心筋炎、 デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、中核疾患、ネマリンミ
オパシー、橋中心髄鞘崩壊症 、脂質筋疾患、ミトコンドリアミオパシー、感染
性筋炎、多発性筋炎、皮膚性筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒筋炎およびエタノー
ルミオパシー、狭心症、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管
性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、および
クロム親和細胞腫(褐色細胞腫)、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイ
ヤー症候群、乳酸アシドーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺が含まれ
る。CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ド
ットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dip
stick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異CYSKP の発現を検出するた
めに患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用すること
が可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。 ある実施態様では、CYSKP をコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特
に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CYSKP をコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプル
を洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの
量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCYSKP を
コードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らか
になる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を
推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもでき
る。 CYSKPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の
正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から
抽出された体液或いは細胞と、CYSKPをコードする配列或いはその断片とを結合
させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量
用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標
準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値
は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる
。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。 疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正
常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブ
リダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得ら
れた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。 癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または
過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前
に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医
療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌
の発生または更なる進行を防止することが可能となる。 CYSKP をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成する
か、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ま
しくはCYSKPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCYSKPをコードするポ
リヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特
定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い
ストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその
両方のため用いることが可能である。 或る実施態様において、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多
くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び
欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、ＳＳＣＰ(single-str
anded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、C
YSKP をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー
を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。DNAは例えば、病変組
織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一
本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲ
ル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオ
チドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってDNAシークエンシング機など
の高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリ
コSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的
なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較す
ることにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DN
Aの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用い
たシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去す
る。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Die
go CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。 CYSKP の発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.ら(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応
によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによ
って、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオ
リゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントと
して用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする
転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これにつ
いては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多
形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定
し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病
の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターす
ることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択す
るために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することがで
きる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有
効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。 別の実施例では、CYSKP、CYSKPの断片、CYSKPに特異的な抗体をマイクロアレイ
上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のよ
うなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロ
フィールをモニターまたは測定することが可能である。 或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発
明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細
胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターン
は、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量する
ことにより分析される（Seilliamer 他、米国特許第5,840,484号の"Comparative
Gene Transcript Analysis" を参照。この特許に言及することを以って本明細
書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全
体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより
、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまた
はその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処
理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転
写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。 転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離し
た転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプル
の場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映
する。 本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた
、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び
薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカ
ニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称
されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. ら. (19
99) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. および N.L. Anderson (2000)
Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書
の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一
のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィン
ガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発
現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲ
ノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。自己の発現が任意の
試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような
遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異
なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインの要素へ
の遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの阻止に役立つが、毒性の予測
につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされ
ない（例えば２０００年２月２９日にNational Institute of Environmental He
alth Sciencesより発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについ
てはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従っ
て、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺
伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。 或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理すること
により試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核
酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイ
ブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを
定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サン
プル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプ
ル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。 別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロ
テオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細
胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパ
ク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パタ
ーン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数
及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームの
プロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析す
ることにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプ
ルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動
により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成され
る（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルー
またはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、
分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポ
ットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサン
プル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的
サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連する
タンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば
化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部
分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配
列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチ
ド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質
同定のための更なる配列が得られる。 プロテオームのプロファイルは、CYSKP に特異的な抗体を用いてCYSKP 発現レベ
ルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ
上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ
要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定
量する（Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G
. ら. (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法
で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサ
ンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量
を検出し得る。 プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転
写レベルでの毒性サインと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク
質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ande
rson, N.L. および J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写
イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような
化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中で
の転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィー
ル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。 別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理す
ることにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発
現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパ
ク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。
両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を
示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシン
グし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理す
ることにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク
質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体
により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中の
タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両
サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示
す。 マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し
、そして分析する（Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schen
a, M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweile
r らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO9
5/35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-215
5、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイ
プのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Pract ical Approach , M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに
記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす
。 本発明の別の実施例ではまた、CYSKP をコードする核酸配列を用いて、天然のゲ
ノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製す
ることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることが
でき、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺
伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中
に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列
は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産
物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（Harrington,
J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:12
7-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照）。一度マッピ
ングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域
やまたは制限酵素断片長多型（RFLP）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図
を作成可能である（Lander, E.S. およびD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。 蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相
関し得る（前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, 965-968ページ.等を参
照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inher
itance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地
図上のCYSKP をコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の
疾患に対する素因が、このような疾患と関連するDNA領域の決定に役立つため、
更なる位置を決定するクローニングが行われる。 確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体
標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例
えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な
染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る
。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を
探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q2
2-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなさ
れると、該領域に対する任意のマッピングにより更なる調査のための関連遺伝子
或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.ら (1988) Nature 336:577-
580等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間に
おける染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いても
よい。 本発明の別の実施例では、CYSKP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる
断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保
持されるか、細胞内に位置することになろう。CYSKP と検査する薬剤との結合に
よる複合体の形成を測定してもよい。 別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を
有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Geysen,
らの (1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照）。この方法においては、多数の
異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、CYSKP、
或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたCYSKP が、当分
野で周知の方法で検出される。 精製されたCYSKP はまた、前記した薬剤をスク
リーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法
では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定する
こともできる。 別の実施例では、CYSKP と結合可能な中和抗体がCYSKP と結合するため試験用化
合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる
。この方法では、抗体が、CYSKPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプ
チドの存在も検出する。 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にCYSKP をコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限
に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的に
すぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。 更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限
に利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は、例
示目的であって本発明を限定するものではない。 前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願
第60/201.960号、同第60/202.729号、同第60/209.705号、同第60/210.149号、お
よび同第60/213.215号に言及することをもって本明細書の一部とする。 (実施例)１ cDNAライブラリの作製 Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）
に記載されたcDNAライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。
ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり
、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組
織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシ
アネートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として
得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出し
た。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或い
は別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。 RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り
返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、
オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Val
encia CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNA
を単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キッ
ト（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。 場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStr
atagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステ
ム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）
を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAラ
イブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参照）。逆転写
は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレ
オチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化し
た。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、
SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフ
ィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法
を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応
させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例
えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、pSPORT1プラスミド（Life Technol
ogies）またはplNCY（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）等である。組換
えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLif
e Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形
質転換した。２ cDNAクローンの単離 UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは
細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収し
た。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Minipre
p精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Pla
smid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.
E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミド
を精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或
いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。 別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物
からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）
。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サン
プルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの
濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroskan II蛍光
スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した
。３ シークエンシング及び分析 実施例２ に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下
に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或
いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosy
stems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロデ
ィスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転
移システムと併用して処理した。 cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharma
cia Biotech社が提供する試薬またはABIシークエンシングキット、例えばABI PR
ISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosy
stems）に与えられた試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳
動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシーク
エンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対
呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステ
ム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配
列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法
（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を用いて決定した。cDNA配列の幾つ
かを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。 Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及び
ポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確
認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析
に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。IncyteのcDNA配列、またはその
翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、
脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）及びPF
AM等隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに
対して問い合わせた（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析
する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct
. Biol. 6:361-365を参照のこと。）問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMER
に基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレ
オチド配列を産出するように構築した。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、
ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実
施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phr
ed、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びF
ASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに
対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完
全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長
翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBank
タンパク質データベース（genpept）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PROD
OM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースの
タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド
配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウ
ェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASE
RGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペ
プチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算す
るMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込
まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメー
タを用いて生成する。 Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラ
ム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表
７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列１に、それら
の簡単な説明を列２に示す。 列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっ
くりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列４
は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパ
ラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。 完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用い
る上記のプログラムは、SEQ ID NO:35−68のポリヌクレオチド配列断片の同定に
も利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約
４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。４ ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集 推定上の細胞骨格結合タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、
gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定し
た。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログ
ラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94 及
びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参
照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構
築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペ
プチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範
囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が細胞
骨格結合タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチ
ドをPFAMモデルにおいて細胞骨格結合タンパク質について問合せて分析した。潜
在的な細胞骨格結合タンパク質が、細胞骨格結合タンパク質としてアノテーショ
ンが付けられたインサイトcDNA配列に対する相同性を基に同定された。こうして
選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgbpri及
びgbhtgと比較した。必要であれば、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比
較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソ
ンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、
任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられ
るので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、
この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオ
チド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及
び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た
。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コー
ド配列に完全に由来する。５ ゲノム配列データのcDNA配列データへのアセンブリ ステッチ配列（Stiched Sequence） 部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測さ
れたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分
cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノ
ム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲ
ノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズ
ムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配
列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラ
スタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間
隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列
に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは
、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る
。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現わ
れるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異
配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（cDNA−
cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム
配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共
データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測さ
れた不正確なエキソンは、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較すること
により修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査に
より配列を更に伸長させた。ストレッチ配列（Stretched Sequence） 部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。
先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎
動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記
載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタ
ンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenS
canエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリン
グセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGen
Bankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関
連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク
質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒト
ゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的な
DNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果とし
て得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した
。６ CYSKPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング SEQ ID NO:35−68を組み立てるために用いた配列を、BLAST及びSmith-Waterman
アルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータ
ベースの配列と比較した。SEQ ID NO:35−68と一致するこれらのデータベースの
配列を、Phrapなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配
列のクラスターに構築した（表７）。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SH
GC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から
入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された
配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラス
タに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上
の位置に割り当てられた。 地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン
間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。 （センチ
モルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平
均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 尤も、この
値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化す
る。cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカ
ーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカ
ーに基づく。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）など
の一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記
した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを
決定できる。 このようにして、SEQ ID NO:44 は62.90~64.20 センチモルガンの区間内で染色
体17に、SEQ ID NO:49は73.70から 76.40 センチモルガンの区間内で染色体14に
、SEQ ID NO:50は25.80から 40.30センチモルガンの区間内で染色体8に、SEQ ID
NO:54 は117.6から 132.4 センチモルガンの区間内で染色体1に、SEQ ID NO:64
は56.7から60.5センチモルガンの区間内で染色体4に、SEQ ID NO:65は141.40か
ら142.60センチモルガンの区間内で染色体5にそれぞれマッピングされた。７ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌ
クレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のSambrook,
7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。） BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte
Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子
を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。
【数１】
プロダクトスコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考
慮している。プロダクトスコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のよ
うにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２
つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）
に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当て
ることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得
る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTス
コアの塩基対を用いてプロダクトスコアを計算する。プロダクトスコアは、断片
的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えばプロダクトスコ
ア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致す
る場合のみ得られる。プロダクトスコア７０は、一端が１００％一致し、７０％
重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場
合に得られる。プロダクトスコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳し
ているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得
られる。 或いは、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分
析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少な
くとも一部は重畳するように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製され
たcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚
構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免
疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分
類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。
各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する
。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、
炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。 各カテゴリ
ーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られる
パーセンテージは、CYSKPをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cD
NA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Inc
yte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。８ CYSKP をコードするポリヌクレオチドの伸長 完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプラ
イマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知
の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜
３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標
的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Bioscie
nces）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構
造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て
回避した。 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上の
伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネス
テッドセットを設計した。 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得
られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマ
ー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNA
ポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies
)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI B
に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ
2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステッ
プ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステ
ップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパ
ラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、
ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、
3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存
する。 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した10
0μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR
)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し
てDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの
濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Fin
land）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μlを１％アガロース
ミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを
決定した。 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJI
コレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI
）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結
反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために
、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離
し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクロー
ンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター
（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagen
e）で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、大腸菌細胞に形質移入
した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロ
ニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一
晩培養した。 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu D
NAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ
1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ
4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステ
ップ6: 72℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記したようにPICOGREEN試
薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記
と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：
２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプ
ライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI
PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Termina
tor cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いて
シークエンシングした。 同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような
伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用い
て５'調節配列を得る。９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:35−68由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA
、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレ
オチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても
事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェ
ア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし
、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ32P] アデノシン三リン酸（Amersham
Pharmacia Biotech), ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、B
oston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレ
オチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Am
ersham Pharmacia Biotech）を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI
、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアー
ゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解
析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用い
る。 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション
は、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×
クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件
下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代
わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比
較する。１０ マイクロアレイ マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグ
ラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機
械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成する
ことが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とする
べきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、ス
ライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロッ
ト法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化
学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させ
てもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作
製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. ら (1995) Science
270:467-470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.
および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。 完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイ
クロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片また
はオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知の
ソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学
的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サン
プル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の
分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイ
ブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイ
エレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及
び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイ
クロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の
度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整
及び使用について、以下に詳述する。組織または細胞サンプルの準備 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリ
ゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは
、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第１
鎖緩衝液、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害因子、５００μMのdATP、５００μM
のdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdC
TP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GE
MBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的
対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。
各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化
ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させて
RNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピン
カラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精
製する。 結合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用
いて析出させたエタノール、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エ
タノールである。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbr
ook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁す
る。マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、
クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増
幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用
いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量
までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-
400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。 精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定す
る。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及
びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグ
ラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), Wes
t Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％
エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティング
する。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。 米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラ
ス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明
細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速
機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary
printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイ
エレメントサンプルを加える。 マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架
橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３
度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０
.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートし
た後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結
合部位をブロックする。ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応は、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩
衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各０.２μg含む９μlのサンプル
混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ
表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライド
より僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに
１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する
。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 ア
レイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗
浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄
して乾燥させる。検出 レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８８n
m、Cy3の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガ
ス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。
２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励
起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御
のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例
で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。 ２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を
連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に
対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems
, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフ
ィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波
長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からの
スペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて
、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種によ
り生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的
DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の
重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照
細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なっ
て発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には
、その較正を、２つの蛍光色素で較正するcDNAのサンプルを標識し、ハイブリダ
イゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた
１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices,
Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータ
は、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニ
ア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表
示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励
起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず
蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正
する。 グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからの
シグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナ
ルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用
いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。１１ 相補的ポリヌクレオチド CYSKPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のC
YSKPの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）及びCYSKPのコーディング配列を用いて、
適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５
' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCYSKPをコードする転写物に結合す
るのを阻害する。１２ CYSKPの発現 CYSKP の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でCYSKP が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニ
ングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関
連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッ
ドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクター
を、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCYSKP を
発現する。真核細胞でのCYSKP の発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一
般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体
病ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝
子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転
移のどちらかによって、CYSKP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力
は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Enge
lhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V
. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。 殆どの発現系では、CYSKP が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素
であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上
で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の
後、GST部分を特定の操作部位でCYSKP からタンパク分解的に切断できる。FLAG
は８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクロー
ナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒ
スチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での
精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995
）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したCYSKP を直接用いて以
下の実施例１６、及び１７のアッセイを行うことができる。１３ 機能的アッセイ CYSKP 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのCY
SKP をコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強
いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選
り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3
.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモー
ターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換
えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形
質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラス
ミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形
質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によっ
て、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、
例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパ
ク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサ
イトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細
胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、
細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出
して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物に
よるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散
乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの
取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によ
って計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍
光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜
組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (19
94) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。 遺伝子発現におけるCYSKP の影響は、CYSKP をコードする配列とCD64またはCD64
-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価するこ
とができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野
で周知の方法で細胞から精製することができる。CYSKP 及び目的の他の遺伝子を
コードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することが
できる。１４ CYSKP に特異的な抗体の作製 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) M
ethods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質上精製され
たCYSKP を用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
別法では、CYSKP アミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。 Ｃ末端付近の、或いは隣接する
親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で
周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。 通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A
ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミド
ベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によって
KLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫抗原性を高める（前出
のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプ
チド-KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性
及び抗PP活性を検査するには、ペプチドまたはCYSKP を基板に結合し、１％BSA
を用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性
ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。１５ 特異的抗体を用いる天然CYSKP の精製 天然PP或いは組換えCYSKP を、CYSKP に特異的な抗体を用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマ
トグラフィー用レジンと抗CYSKP 抗体とを共有結合させることにより形成する。
結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。 CYSKP を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CYSKP を優先的に吸
着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファ
ーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCYSKP との結合を切るよう
な条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、CYSKP を回収する
。１６ CYSKPと相互作用する分子の同定 CYSKPまたは生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例
えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標
識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCY
SKPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したCYSKP複合体を有する全てのウ
ェルをアッセイする。様々なCYSKP 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と
結合したCYSKP の数量及び親和性、会合についての値を計算する。 別法では、CYSKP と相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature
340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid syst
em）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づい
た市販のキットを用いて分析する。 CYSKP はまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPA
THCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの
大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定す
ることができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。１７ CYSKP 活性の実証 CYSKPの微小管運動性アッセイによって運動タンパク質活性を測定できる。この
アッセイにおいて、組換えCYSKP をガラスのスライドまたは同様の基板に固定す
る。ATPおよび細胞基質抽出物を含む溶液に入れたタキソールで安定化されたウ
シ脳の微小管(市販されている)をスライド一面に注ぐ。CYSKP 運動活性によって
駆動される微小管の運動はビデオ光学顕微鏡および画像解析技術を用いて視覚化
でき、定量化できる。CYSKPの活性は微小管運動の頻度や速度に直接比例する。
あるいは、CYSKP のアッセイでin vitroでタンパク質フィラメントの形成を測定
できる。高分子を作成するために、「限界濃度」より高い濃度のCYSKP溶液を炭
素を被覆したグリッドに使用する。適切な核形成部位を溶液に入れる。グリッド
は0.7%(W/v)水溶性酢酸ウラニルでネガティブ染色し、電子顕微鏡で調べる。約2
5nm(微小管)、8nm(アクチン)または10nm(中間径フィラメント)のフィラメントの
外観によって、タンパク活性があることが証明される。 または、Hammell, R.L. および Hitchcock-DeGregori, S.E. (1997, J. Biol. C
hem. 272:22409-22416)が述べているようにアクチンに対するCYSKPの結合親和性
はCYSKP のアッセイによって測定できる。CYSKP とアクチンはin vitro の組換
えcDNA発現系から作成し、CYSKP のN末端は当分野で周知の方法でアセチル化す
る。N 末端アセチル-CYSKP のアクチンへの結合は、記載のBeckman 社のTL-100
型遠心分離機で25℃で共沈降させて測定する。結合および遊離CYSKPはクーマシ
ーブルーで染色したSDSポリアクリルアミドゲルの定量的デンシトメトリによっ
て測定する。Hammell およびHitchcock-DeGregori (1997、前出)が記載している
式にデータを適用する、当分野に周知の方法を用いて明らかな結合定数(Kapp)
とヒル係数(H)を決定する。デンシトメトリを用いて測定されたCYSKPとアクチン
の割合を標準化する。Hammell およびHitchcock-DeGregori (1997、前出) は結
合の飽和はCYSKPとアクチンのモル比が0.14、すなわち、CYSKPが1に対してアク
チンが 7の化学量論に相当することを示した。アクチンへのCYSKPの結合は、CYS
KPの活性に比例する。 あるいは、CYSKPの活性は微小管に結合する能力として測定される。可逆的なア
センブリ(Vallee, R. B. (1982) Methods Enzymol. 134:89-104)、または PEM
バッファー(100 mM PIPES、 pH 6.6、 1mM EGTA、1mM MgSO4)を用いたタキソー
ル法(Vallee, R. B. (1982) J. Cell Biol. 92:435-442) によって成人ラット脳
から微小管を精製する。チューブリンからMAPを分離するために、2サイクルを行
った微小管のペレットをPEM バッファで再懸濁し、Sloboda, R. D. および Rose
nbaum, J. L. ((1982) Methods Enzymol.85:409-416)によって記載されているよ
うに0.1 M 硫酸マグネシウム飽和ホスホセルロースカラムに通す。タンパク質を
含む分画は二番目のホスホセルフォースカラムに通す。20 ml のCYSKP (250 mg/
ml) を80mlの微小管 (450 mg/ml) またはチューブリン (300 mg/ml) に加えて合
計量、100 mlとし、1 mM GTP および 50 mM タキソールの存在下、37℃で10分間
インキュベートする。懸濁液を遠心分離にかけ、上澄み液を除き、微小管のペレ
ットをPEMバッファで再懸濁してもとの反応液量にする。上澄み液とペレットの
分画との間のCYSKPの分配を算定するために、上澄み液と再懸濁したペレットの
同量をSDSサンプルバッファに入れて、クーマシーブリリアントブルーで染色し
た5-20% 勾配のSDSポリアクリルアミドゲルで定量する。ペレット分画中のCYSKP
の量はCYSKPの微小管への結合に比例する。 あるいは、CYSKP活性はタンパク質とタンパク質で複合体を形成する能力と関連
しており、NIH3T3マウス線維芽細胞の成長特性を調節する能力によって測定され
る。CYSKP をコードするcDNAは好適な真核生物発現ベクターにサブクローンされ
る。このベクターは当分野で周知の方法を用いてNIH3T3 細胞に形質移入する。
形質移入された細胞は次の定量化可能な性質について、非形質移入細胞と比較す
る。すなわち、培養液内での高密度への増殖、細胞の基質への接着性の減少、細
胞形態変化および免疫欠乏マウスに注射すると腫瘍を誘発する能力などの性質を
比較する。CYSKP の活性は、CYSKPで形質移入されたNIH3T3 細胞における細胞形
態変化の頻度とその増殖増加の程度に比例する。 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及
びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好
適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例
に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学また
は関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法
の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。 （表の簡単な説明） 表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の
概略を示す。 表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の
注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せ
て示す。 表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列
の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検
索可能なデータベースと共に示す。 表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA及びゲノム
DNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。 表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。 表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明す
る付表である。 表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プロ
グラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に
示す。
慮している。プロダクトスコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のよ
うにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２
つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）
に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当て
ることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得
る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTス
コアの塩基対を用いてプロダクトスコアを計算する。プロダクトスコアは、断片
的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えばプロダクトスコ
ア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致す
る場合のみ得られる。プロダクトスコア７０は、一端が１００％一致し、７０％
重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場
合に得られる。プロダクトスコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳し
ているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得
られる。 或いは、CYSKP をコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分
析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少な
くとも一部は重畳するように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製され
たcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚
構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免
疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分
類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。
各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する
。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、
炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。 各カテゴリ
ーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られる
パーセンテージは、CYSKPをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cD
NA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Inc
yte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。８ CYSKP をコードするポリヌクレオチドの伸長 完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプラ
イマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知
の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜
３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標
的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Bioscie
nces）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構
造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て
回避した。 配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。２段階以上の
伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネス
テッドセットを設計した。 高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得
られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて
９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマ
ー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNA
ポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies
)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI B
に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ
2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステッ
プ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステ
ップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパ
ラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、
ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、
3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存
する。 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した10
0μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR
)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し
てDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの
濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Fin
land）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μlを１％アガロース
ミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを
決定した。 伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJI
コレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI
）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結
反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために
、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離
し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクロー
ンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター
（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagen
e）で処理して制限部位の張出部（overhang）を満たし、大腸菌細胞に形質移入
した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロ
ニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一
晩培養した。 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu D
NAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ
1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ
4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステ
ップ6: 72℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記したようにPICOGREEN試
薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記
と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：
２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプ
ライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI
PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Termina
tor cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いて
シークエンシングした。 同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような
伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用い
て５'調節配列を得る。９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:35−68由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA
、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレ
オチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても
事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェ
ア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし
、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ32P] アデノシン三リン酸（Amersham
Pharmacia Biotech), ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、B
oston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレ
オチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Am
ersham Pharmacia Biotech）を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI
、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアー
ゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解
析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用い
る。 各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション
は、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×
クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件
下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代
わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比
較する。１０ マイクロアレイ マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグ
ラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機
械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成する
ことが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とする
べきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、ス
ライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロッ
ト法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化
学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させ
てもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作
製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. ら (1995) Science
270:467-470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.
および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。 完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイ
クロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片また
はオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知の
ソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学
的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サン
プル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の
分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイ
ブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイ
エレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及
び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイ
クロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の
度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整
及び使用について、以下に詳述する。組織または細胞サンプルの準備 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリ
ゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは
、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第１
鎖緩衝液、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害因子、５００μMのdATP、５００μM
のdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdC
TP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GE
MBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的
対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。
各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化
ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させて
RNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピン
カラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精
製する。 結合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用
いて析出させたエタノール、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エ
タノールである。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbr
ook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁す
る。マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、
クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増
幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用
いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量
までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-
400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。 精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定す
る。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及
びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグ
ラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), Wes
t Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％
エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティング
する。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。 米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラ
ス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明
細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速
機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary
printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイ
エレメントサンプルを加える。 マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架
橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３
度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０
.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートし
た後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結
合部位をブロックする。ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応は、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩
衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各０.２μg含む９μlのサンプル
混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ
表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライド
より僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに
１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100に保持する
。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 ア
レイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗
浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄
して乾燥させる。検出 レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８８n
m、Cy3の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガ
ス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。
２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励
起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御
のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例
で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキャンした。 ２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を
連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に
対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems
, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフ
ィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波
長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からの
スペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて
、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種によ
り生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的
DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の
重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照
細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なっ
て発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には
、その較正を、２つの蛍光色素で較正するcDNAのサンプルを標識し、ハイブリダ
イゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた
１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices,
Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータ
は、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニ
ア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表
示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励
起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず
蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正
する。 グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからの
シグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナ
ルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用
いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。１１ 相補的ポリヌクレオチド CYSKPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のC
YSKPの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）及びCYSKPのコーディング配列を用いて、
適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５
' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCYSKPをコードする転写物に結合す
るのを阻害する。１２ CYSKPの発現 CYSKP の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でCYSKP が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニ
ングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関
連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッ
ドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクター
を、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCYSKP を
発現する。真核細胞でのCYSKP の発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一
般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体
病ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝
子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転
移のどちらかによって、CYSKP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力
は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Enge
lhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V
. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。 殆どの発現系では、CYSKP が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素
であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上
で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の
後、GST部分を特定の操作部位でCYSKP からタンパク分解的に切断できる。FLAG
は８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクロー
ナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒ
スチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での
精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995
）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したCYSKP を直接用いて以
下の実施例１６、及び１７のアッセイを行うことができる。１３ 機能的アッセイ CYSKP 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのCY
SKP をコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強
いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選
り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3
.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモー
ターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換
えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形
質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラス
ミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形
質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によっ
て、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、
例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパ
ク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサ
イトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細
胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、
細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出
して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物に
よるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散
乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの
取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によ
って計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍
光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜
組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (19
94) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。 遺伝子発現におけるCYSKP の影響は、CYSKP をコードする配列とCD64またはCD64
-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価するこ
とができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野
で周知の方法で細胞から精製することができる。CYSKP 及び目的の他の遺伝子を
コードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することが
できる。１４ CYSKP に特異的な抗体の作製 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) M
ethods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質上精製され
たCYSKP を用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
別法では、CYSKP アミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。 Ｃ末端付近の、或いは隣接する
親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で
周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。 通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A
ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミド
ベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によって
KLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫抗原性を高める（前出
のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプ
チド-KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性
及び抗PP活性を検査するには、ペプチドまたはCYSKP を基板に結合し、１％BSA
を用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性
ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。１５ 特異的抗体を用いる天然CYSKP の精製 天然PP或いは組換えCYSKP を、CYSKP に特異的な抗体を用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマ
トグラフィー用レジンと抗CYSKP 抗体とを共有結合させることにより形成する。
結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。 CYSKP を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CYSKP を優先的に吸
着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファ
ーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCYSKP との結合を切るよう
な条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、CYSKP を回収する
。１６ CYSKPと相互作用する分子の同定 CYSKPまたは生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例
えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標
識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCY
SKPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したCYSKP複合体を有する全てのウ
ェルをアッセイする。様々なCYSKP 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と
結合したCYSKP の数量及び親和性、会合についての値を計算する。 別法では、CYSKP と相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature
340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid syst
em）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づい
た市販のキットを用いて分析する。 CYSKP はまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPA
THCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの
大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定す
ることができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。１７ CYSKP 活性の実証 CYSKPの微小管運動性アッセイによって運動タンパク質活性を測定できる。この
アッセイにおいて、組換えCYSKP をガラスのスライドまたは同様の基板に固定す
る。ATPおよび細胞基質抽出物を含む溶液に入れたタキソールで安定化されたウ
シ脳の微小管(市販されている)をスライド一面に注ぐ。CYSKP 運動活性によって
駆動される微小管の運動はビデオ光学顕微鏡および画像解析技術を用いて視覚化
でき、定量化できる。CYSKPの活性は微小管運動の頻度や速度に直接比例する。
あるいは、CYSKP のアッセイでin vitroでタンパク質フィラメントの形成を測定
できる。高分子を作成するために、「限界濃度」より高い濃度のCYSKP溶液を炭
素を被覆したグリッドに使用する。適切な核形成部位を溶液に入れる。グリッド
は0.7%(W/v)水溶性酢酸ウラニルでネガティブ染色し、電子顕微鏡で調べる。約2
5nm(微小管)、8nm(アクチン)または10nm(中間径フィラメント)のフィラメントの
外観によって、タンパク活性があることが証明される。 または、Hammell, R.L. および Hitchcock-DeGregori, S.E. (1997, J. Biol. C
hem. 272:22409-22416)が述べているようにアクチンに対するCYSKPの結合親和性
はCYSKP のアッセイによって測定できる。CYSKP とアクチンはin vitro の組換
えcDNA発現系から作成し、CYSKP のN末端は当分野で周知の方法でアセチル化す
る。N 末端アセチル-CYSKP のアクチンへの結合は、記載のBeckman 社のTL-100
型遠心分離機で25℃で共沈降させて測定する。結合および遊離CYSKPはクーマシ
ーブルーで染色したSDSポリアクリルアミドゲルの定量的デンシトメトリによっ
て測定する。Hammell およびHitchcock-DeGregori (1997、前出)が記載している
式にデータを適用する、当分野に周知の方法を用いて明らかな結合定数(Kapp)
とヒル係数(H)を決定する。デンシトメトリを用いて測定されたCYSKPとアクチン
の割合を標準化する。Hammell およびHitchcock-DeGregori (1997、前出) は結
合の飽和はCYSKPとアクチンのモル比が0.14、すなわち、CYSKPが1に対してアク
チンが 7の化学量論に相当することを示した。アクチンへのCYSKPの結合は、CYS
KPの活性に比例する。 あるいは、CYSKPの活性は微小管に結合する能力として測定される。可逆的なア
センブリ(Vallee, R. B. (1982) Methods Enzymol. 134:89-104)、または PEM
バッファー(100 mM PIPES、 pH 6.6、 1mM EGTA、1mM MgSO4)を用いたタキソー
ル法(Vallee, R. B. (1982) J. Cell Biol. 92:435-442) によって成人ラット脳
から微小管を精製する。チューブリンからMAPを分離するために、2サイクルを行
った微小管のペレットをPEM バッファで再懸濁し、Sloboda, R. D. および Rose
nbaum, J. L. ((1982) Methods Enzymol.85:409-416)によって記載されているよ
うに0.1 M 硫酸マグネシウム飽和ホスホセルロースカラムに通す。タンパク質を
含む分画は二番目のホスホセルフォースカラムに通す。20 ml のCYSKP (250 mg/
ml) を80mlの微小管 (450 mg/ml) またはチューブリン (300 mg/ml) に加えて合
計量、100 mlとし、1 mM GTP および 50 mM タキソールの存在下、37℃で10分間
インキュベートする。懸濁液を遠心分離にかけ、上澄み液を除き、微小管のペレ
ットをPEMバッファで再懸濁してもとの反応液量にする。上澄み液とペレットの
分画との間のCYSKPの分配を算定するために、上澄み液と再懸濁したペレットの
同量をSDSサンプルバッファに入れて、クーマシーブリリアントブルーで染色し
た5-20% 勾配のSDSポリアクリルアミドゲルで定量する。ペレット分画中のCYSKP
の量はCYSKPの微小管への結合に比例する。 あるいは、CYSKP活性はタンパク質とタンパク質で複合体を形成する能力と関連
しており、NIH3T3マウス線維芽細胞の成長特性を調節する能力によって測定され
る。CYSKP をコードするcDNAは好適な真核生物発現ベクターにサブクローンされ
る。このベクターは当分野で周知の方法を用いてNIH3T3 細胞に形質移入する。
形質移入された細胞は次の定量化可能な性質について、非形質移入細胞と比較す
る。すなわち、培養液内での高密度への増殖、細胞の基質への接着性の減少、細
胞形態変化および免疫欠乏マウスに注射すると腫瘍を誘発する能力などの性質を
比較する。CYSKP の活性は、CYSKPで形質移入されたNIH3T3 細胞における細胞形
態変化の頻度とその増殖増加の程度に比例する。 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及
びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好
適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例
に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学また
は関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法
の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。 （表の簡単な説明） 表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の
概略を示す。 表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の
注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せ
て示す。 表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列
の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検
索可能なデータベースと共に示す。 表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA及びゲノム
DNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。 表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。 表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明す
る付表である。 表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プロ
グラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に
示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 1/18 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８４
3/06 5/14 ４Ｈ０４５
3/10 7/00
5/14 7/04
7/00 7/06
7/04 9/00
7/06 9/10 １０１
9/00 9/12
9/10 １０１ 11/00
9/12 11/06
11/00 13/02
11/06 13/12
13/02 15/00
13/12 15/08
15/00 17/06
15/08 17/12
17/06 19/02
17/12 19/06
19/02 19/10
19/06 21/00
19/10 21/04
21/00 25/00
21/04 25/06
25/00 25/14
25/06 25/16
25/14 25/18
25/16 25/28
25/18 29/00
25/28 １０１
29/00 31/04
１０１ 31/10
31/04 31/12
31/10 33/00
31/12 35/00
33/00 35/02
35/00 37/02
35/02 37/08
37/02 43/00 １０５
37/08 １１１
43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/78
１１１ 16/18
Ｃ０７Ｋ 14/78 16/46
16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15
16/46 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
1/21 21/08
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ
21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ
1/68 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ
33/50 33/566
33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/00 Ａ
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02
(31)優先権主張番号 ６０／２０９，７０５
(32)優先日 平成12年６月５日(2000．6．5)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／２１０，１４９
(32)優先日 平成12年６月７日(2000．6．7)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／２１３，２１５
(32)優先日 平成12年６月21日(2000．6．21)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス
アメリカ合衆国カリフォルニア州94005・
ブリスベーン・ゴールデンイーグルレーン
233
(72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム
アメリカ合衆国カリフォルニア州95123・
サンノゼ・コイドライブ 233
(72)発明者 ボーグン、マライア・アール
アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・
サンレアンドロ・サンティアゴロード
14244
(72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル
アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・
マウンテンビュー・＃17・モンロードライ
ブ 230
(72)発明者 アジムザイ、ヤルダ
アメリカ合衆国カリフォルニア州94552・
カストロバレー・ボールダーキャニオンド
ライブ 5518
(72)発明者 ラル、プリーティ
アメリカ合衆国カリフォルニア州95056・
サンタクララ・ピーオーボックス 5142
(72)発明者 ヤオ、モニーク・ジー
アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・
マウンテンビュー・フレデリックコート
111
(72)発明者 バンドマン、オルガ
アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・
マウンテンビュー・アンナアベニュー
366
(72)発明者 バーフォード、ニール
アメリカ合衆国コネチカット州06422・ダ
ラム・ワイルドウッドサークル 105
(72)発明者 バトラ、サジィーブ
アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・
サニーベイル・＃709・エルカミーノリア
ル 555
(72)発明者 キーニー、ライアム
アメリカ合衆国カリフォルニア州94127・
サンフランシスコ・ウッドサイドアベニュ
ー 50
(72)発明者 ポリッキー、ジェニファー・エル
アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・
サンノゼ・ジャービスコート 1511
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36
FB02 FB03
4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 DA05
EA02 EA04 GA11 HA14 HA15
4B063 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QQ52
QQ79 QR56 QR59 QR80 QR82
QS05 QS24 QS25 QS28 QS34
QS38
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE12
DA01 DA13
4B065 AA01X AA90X AA93Y AB01
AC14 CA24 CA44 CA46
4C084 AA02 AA17 BA01 BA22 BA23
CA25 DC50 NA14 ZA022
ZA052 ZA152 ZA162 ZA182
ZA222 ZA452 ZA512 ZA532
ZA552 ZA592 ZA662 ZA682
ZA752 ZA812 ZA892 ZA942
ZA962 ZA972 ZB052 ZB072
ZB112 ZB132 ZB152 ZB212
ZB262 ZB272 ZB332 ZB352
ZB372 ZB382 ZC022 ZC062
ZC312 ZC332 ZC352
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
BA41 CA40 DA76 DA86 EA20
EA50 FA71 FA74 GA26
Claims (112)
- 【請求項１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択した実質上単離され
たポリペプチド。 （ａ）配列番号１乃至34(SEQ ID NO:1-34)を有する群から選択したアミノ酸配列
を有するポリペプチド。 （ｂ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が
同一であるようなアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド （ｃ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの生物学的活性断片 （ｄ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの免疫抗原性断片。 - 【請求項２】SEQ ID NO:1-34を有する群から選択した請求項１に記載の単離され
たポリペプチド。 - 【請求項３】 請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
。 - 【請求項４】請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
。 - 【請求項５】SEQ ID NO:35-68を有する群から選択した請求項４に記載の単離さ
れたポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモー
ター配列を含む組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項７】請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細
胞。 - 【請求項８】請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
- 【請求項９】請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、 （ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を前記ポリペプチドの
発現に適した条件下で培養する過程と、 （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記
組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有することを特徴とする
方法。 - 【請求項１０】請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された
抗体。 - 【請求項１１】 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択した実質上単離さ
れたポリヌクレオチド。 （ａ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチド （ｂ）SEQ ID NO:35-68を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なく
とも９０％が同一であるようなポリヌクレオチド配列を有する天然のポリヌクレ
オチド （c）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド （ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物 - 【請求項１２】請求項１１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続し
たヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項１３】請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌ
クレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少な
くとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイ
ブリダイズする過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が
存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブ
と前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が
形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的
にハイブリダイズすることを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１１に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリ
ヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその
断片を増幅する過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標
的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検
出する過程を含むことを特徴とする方法. - 【請求項１６】有効量の請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形
剤とを有することを特徴とする成分。 - 【請求項１７】前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したア
ミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６に記載の成分。 - 【請求項１８】機能的なCYSKPの発現低下に関連する疾患や病状を治療する方法
であって、そのような治療が必要な患者に請求項１６の成分を投与する過程を含
むことを特徴とする治療方法。 - 【請求項１９】 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確
認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と
、 （ｂ）前記サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とす
る方法。 - 【請求項２０】請求項１９に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、
薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。 - 【請求項２１】 機能的なCYSKPの発現の低下に関連する疾患や病状の治療方法で
あって、そのような治療が必要な患者に請求項２０の成分を投与することを含む
ことを特徴とする治療方法。 - 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性
を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と
、 （ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを
特徴とする方法。 - 【請求項２３】請求項２２に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物
と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。 - 【請求項２４】機能的なCYSKPの過剰発現に関連する疾患や病状の治療方法であ
って、そのような治療が必要な患者に請求項２３に記載の成分を投与する過程を
含むことを特徴とする治療方法。 - 【請求項２５】 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリ
ーニングする方法であって、 （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化
合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによ
って請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含
むことを特徴とする方法。 - 【請求項２６】請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリ
ーニングする方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１に
記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、 （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過
程と、 （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化
合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含
み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請
求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とす
る方法。 - 【請求項２７】請求項５に記載の配列を有する標的ポリヌクレオチドの変異発現
の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオ
チドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、 （ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌ
クレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２８】 試験化合物の毒性を算定する方法であって、 （ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、 （ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１１に記載のポリヌクレ
オチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイ
ズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プロー
ブと前記生物学的サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダ
イゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが
、請求項１１に記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片
を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、 （ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、 （ｄ）前記処理した生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の
量を、処理していない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体
の量と比較する過程とを含み、前記処理した生物学的サンプル中の前記ハイブリ
タイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴
とする方法。 - 【請求項２９】生物学的サンプル中のCYSKPの発現に関連する症状または疾患に
対する診断試験法であって、 （ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が
形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項１０に記載の抗
体と結合する過程と、 （ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的
サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。 - 【請求項３０】前記抗体が、 （ａ）キメラ抗体 （ｂ）単鎖抗体 （ｃ）Fab断片 （ｄ）F(ab')2 断片 （ｅ）ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の抗体
。 - 【請求項３１】請求項１０に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む化合物。
- 【請求項３２】被検者のCYSKP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であっ
て、請求項31に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを
特徴とする方法。 - 【請求項３３】前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３１に記載の化合
物。 - 【請求項３４】被検者のCYSKP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であっ
て、請求項33に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを
特徴とする方法。 - 【請求項３５】請求項１０に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を
調製する方法であって、 （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したア
ミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化す
る過程と、 （ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、 （ｃ）前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、
SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特
異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする
方法。 - 【請求項３６】 請求項３５に記載の方法で産出した抗体。
- 【請求項３７】 請求項36に記載の抗体及び適切なキャリアを含む化合物。
- 【請求項３８】 請求項１０に記載の抗体の特異性を有する抗体を用いてモノク
ローナル抗体を製造する方法であって、 （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したア
ミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化す
る過程と、 （ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、 （ｃ）不死化細胞を用いて前記抗体産出細胞を融合して、モノクローナル抗体を
産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、 （ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、 （ｅ）SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含む
ことを特徴とする方法。 - 【請求項３９】請求項３８に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
- 【請求項４０】 請求項３９に記載の抗体及び適切なキャリアを含む化合物。
- 【請求項４１】 Fab発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出する
ことを特徴とする請求項１０に記載の抗体。 - 【請求項４２】組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗
体を産出することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。 - 【請求項４３】SEQ ID NO:1-34 を有する群から選択したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを検出する方法であって、 （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを
用いて請求項１０に記載の抗体をインキュベートする過程と、 （ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、 該特異結合が、SEQ ID NO:1-34 を有
する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在する
ことを標示することを特徴とする方法。 - 【請求項４４】SEQ ID NO:1-34を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを精製する方法であって、 （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを
用いて請求項１０に記載の抗体をインキュベートする過程と、 （ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-34を有する群から選択
したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とす
る方法。 - 【請求項４５】 SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項４６】 SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項４７】 SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項４８】 SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項４９】 SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５０】 SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５１】 SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５２】 SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５３】 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５４】 SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項５５】 SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５６】 SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５７】 SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５８】 SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項５９】SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６０】SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６１】SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６２】SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６３】SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６４】SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６５】SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６６】SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
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チド。 - 【請求項７５】SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項７６】SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項７７】SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項７８】 SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項７９】 配列番号35のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項８０】 配列番号36のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項８１】 配列番号37のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項８２】配列番号38のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８３】 配列番号39のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項８４】配列番号40のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８５】配列番号41のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８６】配列番号42のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８７】配列番号43のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８８】配列番号44のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項８９】配列番号45のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９０】配列番号46のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９１】配列番号47のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９２】配列番号48のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９３】配列番号49のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９４】配列番号50のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９５】配列番号51のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９６】配列番号52のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９７】配列番号53のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９８】配列番号54のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項９９】配列番号55のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載の
ポリヌクレオチド。 - 【請求項１００】 配列番号56のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０１】配列番号57のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０２】配列番号58のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０３】 配列番号59のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記
載のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０４】配列番号60のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０５】配列番号61のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０６】配列番号62のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０７】配列番号63のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０８】配列番号64のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０９】配列番号65のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１１０】配列番号66のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１１１】配列番号67のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１１２】配列番号68のポリヌクレオチド配列を有する請求項１１に記載
のポリヌクレオチド。
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| JP2004500813A (ja) | 小胞輸送タンパク質 | |
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