KR20130041764A

KR20130041764A - 1,5-펜탄디아민의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130041764A
Application number: KR1020127022477A
Authority: KR
Inventors: 겐지 사와이; 시오미 와타나베; 다카시 미미쓰카; 히데키 사와이
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2013-04-25
Also published as: CN102844440A; PH12012502047A1; JPWO2011129293A1; CA2796363A1; WO2011129293A1; US20130071888A1; EP2559769A1; BR112012025490A2

Abstract

염색체에 LDC 유전자를 포함하며 L-라이신의 부산물로 생산이 억제되는 미생물을 이용한 발효에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법을 개시한다. 상기 1,5-펜탄디아민의 제조 방법은 염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형 세균에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법으로서, 상기 코리네형 세균은 배양하는 동안에 50 mU/(단백질)mg 이상의 라이신 탈탄산효소 활성을 계속 유지한다.

Description

1,5-펜탄디아민의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING 1,5-PENTANEDIAMINE}

본 발명은 발효법에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법에 관한 것이다.

폴리아미드(PA)는 자동차 산업, 스포츠 산업, 라이프스타일 산업에 사용되는 일련의 특수 플라스틱의 원료가 되는 중요한 폴리머군이며, 디아민은 이 폴리아미드의 주요 원료인 모노머 성분이다. 디아민은 디카르복시산과 축합되어 각종 폴리머를 형성하지만, 이때, 디아민과 디카르복시산의 체인 길이에 따라 폴리머의 특성이 결정된다.

종래, 디아민은 화학적으로는 디카르복시산의 중간 단계를 경유하여 석유 유래의 소재로부터 제조되거나, 또는 아미노산의 화학적 탈카르복시 반응에 의해 제조된다(비특허문헌 1). 석유 가격의 상승을 고려하면, 발효 등의 바이오 테크놀러지 방법에 의해 재생가능한 자원으로부터 디아민을 합성하는 방법으로의 신속한 전환이 요구된다.

그래서, 탄소수 5의 디아민인 1,5-펜탄디아민의 발효에 의한 제조 방법이 주목받고 있다. 1,5-펜탄디아민은 별칭으로 카다베린으로 불리우며, 폴리아미드의 원료 모노머인 화합물이다. 또한, 1,5-펜탄디아민은 생체내에 보편적으로 존재하는 폴리아민으로서, 이의 생합성 경로는 해명되고 있으며(비특허문헌 2 참조), 생합성 경로의 일부로서, L-라이신의 탈탄산 반응을 촉매하는 L-라이신 탈탄산효소(이하, LDC로 약칭됨)가 알려져 있다.

종래의 1,5-펜탄디아민의 발효에 의한 제조 방법에서는, 미생물에 LDC 유전자를 도입하는 것을 기본으로 하며, 재조합 대장균에서의 발효에 의한 제조 방법(특허문헌 1 참조), 라이신 생산 미생물의 코리네형 세균에서의 라이신 생산 능력을 더욱 강화하는 방법(특허문헌 2 참조), 1,5-펜탄디아민 분해 경로를 차단하는 방법(특허문헌 3 참조), 라이신 탈탄산효소를 자립 복제형 벡터로 공급하는 방법(비특허문헌 3 참조)이 알려져 있다.

그러나, 1,5-펜탄디아민의 발효에 의한 제조 방법에는 해결해야 할 과제들이 많으며, 예를 들면, L-라이신 생산 미생물의 코리네형 세균에 LDC 유전자를 도입한 미생물을 발효하는 경우, 라이신이 부산물로 생산되는 문제가 있었다(비특허문헌 4 참조). 즉, 라이신은 1,5-펜탄디아민 생합성의 바로 직전 단계 전구체이지만, 반응하지 않은 라이신이 배양상청에 다량 존재하게 되는 문제가 있었다. 이와 같이 라이신이 부산물로 생산되면, 전구체까지가 제조되어 있음에도 불구하고, 1,5-펜탄디아민의 발효 수율은 향상되지 않고, 경제적으로 문제가 되고 있었다. 또한, 특허문헌 3, 비특허문헌 3에서는 LDC 유전자를 자율 복제형 벡터로 공급하고 있지만, 배양 중에 고가의 항생 물질 등을 첨가할 필요가 있을 뿐만 아니라, 산업 스케일로 1,5-펜탄디아민을 염가로 발효 생산하기 위해서, LDC 유전자를 염색체에 포함하는 미생물의 사용이 요구된다.

일본 특허출원 공개번호 2002-223770호 공보 일본 특허출원 공개번호 2004-222569호 공보 일본 특허출원 공표번호 2009-531042호 공보

스야마, 가네오, 「약학 잡지」, 1965년, 제85권, p.513-533 셀리아 화이트 테이버(Celia white tabor) 외 1명, 「마이크로바이올로지컬 리뷰즈(Microbiological Reviews」, 1985년, 제49권, p.81-99 타테노 외, 어플라이드 마이크로 생물학 앤드 바이오 테크놀러지(2009), 81(1), 115-21(Tateno Appl Microbiol Biotechnol(2009), 81(1), 115-21) 미미즈카 외, 생명과학 바이오 테크놀러지 바이오케미컬(2007), 71(9), 2130-5(Mimitsuka Biosci Biotechnol Biochem (2007), 71(9), 2130-5)

본 발명은 염색체에 LDC 유전자를 포함하며 L-라이신의 부산물로서의 생산이 억제되는 미생물을 이용한 발효에 의한, 1,5-펜탄디아민의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, 1,5-펜탄디아민의 발효법에 의한 제조 방법에 있어서, L-라이신의 부산물로서의 생산 억제를 목적으로 하여 연구를 거듭한 결과, 염색체에 LDC 유전자를 포함하며, 또한 배양 중에 50 mU/mg(단백질) 이상의 라이신 탈탄산효소 비활성(specific activity)을 계속 유지하는 코리네형 세균을 1,5-펜탄디아민의 발효에 사용함으로써, L-라이신의 부생산의 억제가 가능하다는 것을 발견하였고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 하기 (1) - (12)로 구성된다.

(1) 염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형 세균에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법으로서, 상기 코리네형 세균은 배양 중에 50 mU/(단백질)mg 이상의 라이신 탈탄산효소 활성을 계속 유지하는 것을 특징으로 하는, 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.

(2) 염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형 세균에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법으로서, 상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자는 대수 증식기(exponential phase)에 기능하는 프로모터의 하류에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.

(3) 상기 프로모터가 divIVA 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는, (2)에 기재된 방법.

(4) 상기 프로모터가 하기 (A) - (D) 중 어느 하나로부터 선택되는 프로모터인 것을 특징으로 하는, (2) 또는 (3)에 기재된 방법.

(A) 서열번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어진 프로모터;

(B) 서열번호 2에 기재된 염기 서열에서, 1개 또는 수개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어진 프로모터;

(C) 서열번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어진 프로모터 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건하에 혼성화하는 프로모터;

(D) 서열번호 2에 기재된 염기 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 염기 서열로 이루어진 프로모터.

(5) 상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자가 대장균 유래의 유전자인 것을 특징으로 하는, (1) - (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(6) 상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자가 하기 (A) - (D) 중 어느 하나로부터 선택되는 유전자로서, 라이신 탈탄산효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 것인 것을 특징으로 하는, (1) - (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(A) 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어진 유전자;

(B) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에서, 1개 또는 수개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어진 유전자;

(C) 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어진 유전자 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건하에 혼성화하는 유전자;

(D) 서열번호 1에 기재된 염기 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 염기 서열로 이루어진 유전자.

(7) 상기 코리네형 세균이 L-라이신 생산성이 향상된 코리네형 세균인 것을 특징으로 하는, (1) - (6) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(8) 상기 코리네형 세균이, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 311번째의 아미노산 잔기가 트레오닌 이외의 아미노산으로 치환된 변이형 아스파라긴산 키나제를 포함하는 것을 특징으로 하는, (1) - (7) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(9) 상기 코리네형 세균의 호모세린 탈수소효소 활성이 저하 또는 결손된 것을 특징으로 하는, (1) - (8) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(10) 상기 코리네형 세균이 유전자 삽입 변이에 의해 호모세린 탈수소효소 활성이 결손된 것을 특징으로 하는, (9)에 기재된 방법.

(11) 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움 속(Genus Corynebacterium)에 속하는 세균인 것을 특징으로 하는, (1) - (10) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(12) 상기 코리네박테리움 속(Genus Corynebacterium)에 속하는 세균이 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는, (11)에 기재된 방법.

[도 1] 본 발명의 실시예에서 제작한 코리네형 세균 CG4541 주를 배양하였을 때의 배양상청내 글루코스 농도, 라이신 농도 및 1,5-펜탄디아민(1,5-PD) 농도의 경시적인 변화를 나타낸 도면이다.
[도 2] 본 발명의 비교예에서 제작한 코리네형 세균 TM4552 주를 배양하였을 때의 배양상청내 글루코스 농도, 라이신 농도 및 1,5-펜탄디아민(1,5-PD) 농도의 경시적인 변화를 나타낸 도면이다.
[도 3] 본 발명의 실시예에서 제작한 코리네형 세균 CG4541 주의 배양시 라이신 탈탄산효소 비활성의 경시적인 변화를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에서, 라이신 탈탄산효소(LDC)는, L-라이신을 기질로 하여 탈탄산 반응에 의해 1,5-펜탄디아민으로 변환시킬 수 있는 효소를 의미하며, 다른 효소 작용을 병행하여 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 LDC는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli； 대장균), 셀레노모나스 루미남튬(Selenomonas ruminamtium), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 필로수스(Streptomyces pilosus), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 유박테리움 액시다미노필룸(Eubacterium acidaminophilum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 하프니아 알베이(Hafnia alvei), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 써모플라스마 액시도필룸(Thermoplasma acidophilum), 또는 피로코커스 아비시(Pyrococcus abyssi) 유래의 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 대장균 유래의 것이다.

본 발명에서 사용되는 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자는, 전술한 생물 유래의 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 구체예로서 들 수 있으며, 이때 사용되는 미생물의 코돈 사용 빈도에 따라 염기 서열을 재설계할 수도 있다. 아울러, 전술한 생물 유래의 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 염기 서열은, 데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있다. 이 중 바람직하게는, 대장균 유래의 유전자이며, 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어진 유전자이다.

다음으로, LDC의 비활성에 대해 설명한다. 1분간 1μM의 1,5-펜탄디아민을 생성하는 LDC 양을 1 유닛(U)으로 정의하면, LDC 활성은 하기 식 1로 나타낼 수 있다.

(계산식 1)

이에 따라, LDC의 단백질 함량 당 활성, 즉 비활성은 하기 식 2으로 산출할 수 있다.

(계산식 2)

또한, 본 발명에서 LDC 비활성은, 코리네형 세균이 가진 총 단백질 당 비활성을 의미하며, 코리네형 세균으로부터 추출된 총 단백질을 이용한 비활성 측정에 의해 산출할 수 있다. 그리고, 측정 방법은 하기 실시예에 구체적으로 기재되어 있다.

코리네형 세균으로부터 단백질을 추출하는 방법으로 한정되지 않으며, 초음파에 의해 균 파쇄법, 유리 비드를 이용한 볼텍스 등의 교반에 의한 균 파쇄법, 고압을 가한 균 파쇄법, 또는 이를 조합시켜 행하는 방법을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 유리 비드를 사용한 방법이다.

본 발명에서 염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형 세균은, 50 mU/(단백질) mg 이상의 LDC 비활성을 가지고 있는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 80 mU/(단백질) mg 이상의 LDC 비활성을 가지며, 보다 바람직하게는 180 mU/(단백질) mg 이상의 LDC 비활성을 가진다. 또한, 실시예에서 후술하지만, 배양 중에 어떤 시점에서 50 mU/(단백질)mg 이상의 LDC 비활성을 가지더라도, 이후 비활성이 저하된다면, 전구체 L-라이신의 축적이 이루어지므로, 본 발명에서 사용하는 코리네형 세균은 배양하는 동안 상기의 LDC 비활성을 계속 유지하여야 한다. 배양하는 동안이란 코리네형 세균을 발효 배지에 접종한 다음 기질당을 소비하는 기간 동안을 의미하며, 그 기간 중의 임의의 시점에서 비활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는, 상기 LDC 비활성을 유지하는 배양 시간은, 배양 개시 후 5시간 이상이며, 보다 바람직하게는 10시간 이상이며, 보다 바람직하게는 20시간 이상이다. 상기 비활성을 유지할 수 있는 배양 시간의 상한은 특별히 없다.

상기와 같은 LDC 비활성을 코리네형 세균에 부여하는 방법에는 제한이 없지만, 코리네형 세균의 염색체에 도입하는 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자의 카피수를 증가시키는 방법, 염색체에 도입하는 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자의 프로모터로서 강력한 프로모터를 사용하는 방법, 또는 효소 활성을 향상시킨 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 사용하는 방법 등이 있으며, 모두 바람직하게 사용할 수 있지만, 염색체에 도입하는 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자의 프로모터로서 강력한 프로모터를 사용하는 방법이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 프로모터는 특별히 한정되지 않으며, 코리네형 세균내에서 기능할 수 있는 프로모터이면 일반적으로 사용할 수 있으며, 또한 이종 유래의 프로모터일 수도 있으며, 바람직한 프로모터의 예로, 각종 아미노산 생합성계, 예컨대, 글루타민산 생합성계의 글루타민산 탈수소효소 유전자, 글루타민 합성계의 글루타민 합성효소 유전자, 라이신 생합성계의 아스파르트 키나제 유전자, 트레오닌 생합성계의 호모세린 탈수소효소 유전자, 이소루신 및 발린 생합성계의 아세트하이드록시산 합성효소 유전자, 루신 생합성계의 2-이소프로필말산 합성효소 유전자, 프롤린 및 알기닌 생합성계의 글루타민산 키나제 유전자, 히스티딘 생합성계의 포스포리보실 ATP 피로포스포릴라제 유전자, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산 생합성계의 데옥시아라비노헵툴론산인산(DAHP) 합성효소 유전자, 이노신산 및 구아닐산과 같은 핵산 생합성계, 예를 들면, 포스포리보실피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자, 이노신산 탈수소효소 유전자 및 구아닐산 합성효소 유전자의 각 프로모터, 또는 세포 분열에 관계하는 divIVA 유전자 등의 프로모터 및 tac 프로모터, trc 프로모터 또는 HCE 프로모터 등의 강력한 프로모터나, 대수 증식기(exponential phase)에 기능하는 프로모터를 들 수 있지만, 보다 바람직하게는 대수 증식기에 기능하는 프로모터이다. 대수 증식기에 기능하는 프로모터의 구체예로서는, divIVA, gap, ldhA, fda, glyA, cysK, aroF, gpmA, eno, fumC, pfk, sdhA, mdh, argF, proA, proC, aceE, serA, metE, nifS1, tpi, aceD, cysD, sdhB 또는 pck 유전자의 프로모터를 들 수 있지만, 그 중에서도 divIA 유전자 프로모터가 바람직하며, 구체적으로는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 프로모터가 특히 바람직하다.

상기 프로모터 서열 및 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열은, 그러한 기능을 가지는 한, 각 염기 서열에, 1개 또는 수개의 염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 염기 서열도 포함한다. 여기서, 「수개」란, 통상 1 - 40개, 바람직하게는 1 - 30개, 보다 바람직하게는 1 - 20개, 보다 바람직하게는 1 - 9개, 보다 바람직하게는 1 - 5개 정도이다. 또한, 상기 프로모터 서열, 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 염기 서열은, 그러한 기능을 가지는 한, 상기 염기 서열 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건하에 혼성화하는 염기 서열을 들 수 있다. 여기서, 「엄격한 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드」란, 예를 들면, 본래의 염기 서열들 중 임의의 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 연속된 서열을 1개 또는 복수개 선택한 염기 서열을 프로브로서, 공지의 혼성화 기술(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publish. John Wily [Sons Section 6.3 - 6.4) 등을 이용하여, 혼성화하는 염기 서열이다. 여기서, 엄격한 조건은, 예를 들면, 50% 포름아미드의 존재 하에 혼성화 온도 37℃, 보다 엄격한 조건에서는 42℃, 보다 더 엄격한 조건에서는 65℃에서, 0.1 - 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성: 150 mM 염화 나트륨, 15 mM 구연산 나트륨)을 사용하여 세정하는 것에 의해 달성할 수 있다. 또한, 상기 프로모터 및 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 염기 서열로서는, 그러한 기능을 가지는 한, 서열 동일성이 통상 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상인 염기 서열일 수도 있다. 여기서, 서열 동일성은, 일치하는 염기의 수가 최대가 되도록(필요에 따라 갭을 삽입함), 2개의 염기 서열을 정렬하여 일치되는 염기의 수를 완전한 길이의 서열의 염기 수(2개의 서열 간에 전체 염기의 수가 상이한 경우, 긴 쪽의 서열의 염기 수)로 나누어 구한 값을 의미한다. 이러한 상동성 계산은 BLAST와 같은 주지의 소프트웨어로 용이하게 수행할 수 있다.

이러한 프로모터 및 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 염기 서열은 코리네형 세균 이외의 다른 세균으로부터 취득할 수도 있으며, 코리네형 세균으로부터 수득되는 염기 서열을 당업자에게 공지된 시험관내 돌연변이 유발 또는 부위 특이적인 돌연변이 유발함으로써 취득할 수도 있다.

상기 프로모터 및 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 염기 서열을 코리네형 세균에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 전기천공법(Bio/Technology, (1989), 7, 1067-1070)으로 도입할 수 있다.

또한, 코리네형 세균은 호기성의 그램 양성 간균이며, 종래 브레비박테리움 속으로 분류되었지만, 현재에는 코리네박테리움 속으로 통합된 세균도 포함된다(Int. J. Syst. Bacteriol., (1981) 41, p.225). 또한, 코리네박테리움 속과 매우 근친인 브레비박테리움 속 세균도 포함한다. 이와 같은 코리네형 세균의 예로서는, 코리네박테리움 아세토액시도필룸(Corynebacterium acetoacidophylum), 코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium mellassecola), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에픽시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis), 브레비박테리움 디베리카툼(Brevibacterium divaricatum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 로제움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum), 브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album), 브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum), 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)을 들 수 있다.

또한, 각 코리네형 세균의 구체적인 균주로서 코리네박테리움 아세토액시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC 15806, 코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC21511, 코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13020, ATCC 13020, ATCC 13060, 코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 에픽시엔스 AJ12340(수탁 번호: FERMBP-1539), 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868, 브레비박테리움 디베리카툼 ATCC 14020, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(수탁 번호: FERMBP-2205), 브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869, 브레비박테리움 로제움 ATCC 13825, 브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC 14066, 브레비박테리움 티어게니탈리스 ATCC 19240, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872, 브레비박테리움 알붐 ATCC 15111, 브레비박테리움 세리눔 ATCC 15112, 마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC 15354를 들 수 있다.

전술한 코리네형 세균은, 예를 들면, 미국 생물자원센터(ACTC)로부터 분양받을 수 있다. 즉, 균주마다 대응하는 등록 번호가 부여되어 있으며, 이 등록 번호는 미국 생물자원센터의 카탈로그에 기재되어 있어, 이 번호를 참조하여 각 균주를 분양받을 수 있다.

본 발명의 1,5-펜탄디아민의 제조 방법에 사용되는, 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 염색체에 포함하는 코리네형 세균은, 1,5-펜탄디아민의 전구체인 L-라이신의 생산성이 향상된 코리네형 세균인 것이 바람직하다. 코리네형 세균의 L-라이신 생산성을 향상시키는 방법은 제한되지 않으며, 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허출원 공개번호 2004-222569호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, S-아미노에틸시스테인(AEC)에 대한 내성주를 취득하는 방법이나, Journal of industrial Microbiol Biotechnol(2006, 33(7) 610-5) 또는 일본 특허출원 공표번호 2009-531042호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 게놈 육종법에 의한 L-라이신의 생산성을 향상시키는 방법이 있으며, 이들 모두 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 L-라이신의 생산성이 향상된 코리네형 세균의 바람직한 태양에 있어서, L-라이신에 의한 피드백 저해가 해제되고 아스파라긴산 키나제를 가지는 것이 바람직하며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 311번째의 아미노산 잔기가 트레오닌 이외의 아미노산으로 치환된 변이형 아스파라긴산 키나제를 포함하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 L-라이신의 생산성이 향상된 코리네형 세균의 다른 바람직한 태양에 있어서, 호모세린 탈수소효소 활성이 저하 또는 결손된 것이 바람직하며, 유전자 삽입 변이에 의해 호모세린 탈수소효소 유전자가 파괴 또는 분단되어 호모세린 탈수소효소 활성이 결손된 것이 보다 바람직하다.

배양 방법으로는 회분배양(batch culture), 유가배양(feeding culture) 또는 연속 배양을 이용할 수 있다. 연속 배양의 경우, 예를 들면, 일본 특허출원 공개번호 2008-104453호 공보에 기재된 바와 같은 연속 배양을 행하는 것이 바람직하다.

배양 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기염 타입 등을 포함하는 통상의 영양 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 글루코스, 과당, 슈크로스, 말토오스, 전분 가수분해물 등의 당류, 에탄올 등의 알코올류, 아세트산, 젖산 또는 락트산, 숙신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄 염류, 요소, 그 외에 질소 함유 화합물, 및 육류 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 대두 가수분해물 등의 질소 함유 유기물을 사용할 수 있다. 무기염으로서는 인산 제1 수소 칼륨, 인산 제2 수소 칼륨, 황산 암모늄, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 탄산 칼슘 등을 사용할 수 있다. 그 외에, 필요에 따라, 바이오틴, 티아민, 비타민 B6 등의 미량 영양원을 첨가할 수 있다. 이들 미량 영양원은 육류 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카자미노산 등의 배지 첨가물로 대용할 수도 있다.

배양 조건은 특별히 한정되지 않으며, 진탕 배양, 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 수행한다. 배양 온도는 일반적으로 25℃ - 42℃, 바람직하게는 28℃ - 38℃이다. 배양 시간은 통상 1일 내지 10일간이다.

배양 pH 조정에는 암모니아, 염산 또는 디카르복시산을 사용하는 것이 바람직하고, 디카르복시산을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 이들 중화제를 사용하여 배양 pH를 5 - 8로, 바람직하게는 pH 6.5 - 7.5로 제어하는 것이 바람직하다. 그리고, 중화제의 상태에는 제한이 없으며, 기체, 액체, 고체 또는 수용액으로 사용된다. 특히 바람직하게는 수용액이다.

중화제로서 바람직하게 사용되는 디카르복시산에는 특별한 제한은 없지만, 바람직하게는, 상기 2개의 카르복실기 외에는 실질적으로 관능기가 존재하지 않는 디카르복시산이다. 여기서 말하는 관능기란, 폴리아미드 중합 반응(반응 조건으로는, 예컨대, 반응 온도 250 - 270℃, 압력 10 - 20 kg/cm²에서, 반응 시간 1 - 5시간임)시, 아미노기나 카르복실기 등과 반응하여, 폴리머의 분기(分岐)를 일으키거나 폴리머의 결정화도를 저하(결정화도 80% 이하)시키는 것 등의 반응기이며, 예를 들면, 아미노기나 카르복실기가 이에 해당되지만, 그 이외에도, 산성 기(술폰산기, 인산기, 페놀성 수산기 등)나 알칼리성 기(하이드라지노기 등), 프로톤성 극성 기(수산기 등)나 절단가능한(開裂性) 기(에폭시기, 과산화기 등), 또는 그 외에 반응성이 높은 기(이소시아나이트기 등)가 해당된다. 한편, 할로겐 치환기나 방향족성 치환기, 에테르기, 에스테르기, 아미드기 등은 반응성이 낮아, 여기서 말하는 관능기에 해당되지 않는다.

디카르복시산으로는, 보다 바람직하게는, 하기 일반식 (1), (2) 또는 (3)으로 표시되는 디카르복시산이다.

HOOC-(CH₂)_m-COOH (1)

(단, 일반식 (1)에서, m = 0 - 16).

(화학식 1)

(단, 일반식 (2)에서, n, o = 0 - 16).

(화학식 2)

(단, 일반식 (3)에서, p, q = 0 - 16).

또한, 디카르복시산은, 더욱 바람직하게는, 아디핀산, 세바신산, 1,12-도데칸 디카르복시산, 숙신산, 이소프탈산, 테레프탈산이다.

배양액내 1,5-펜탄디아민은 1,5-펜탄디아민의 유리형(free form) 또는 1,5-펜탄디아민염으로서 존재한다. 배양액내 1,5-펜탄디아민을 회수하는 방법은, 먼저 배양액에서 미생물을 제거한다. 이 때, 미생물이 증식되고, 발효가 충분히 진행되어, 1,5-펜탄디아민이 생성된 후, 균체와 배양상청을 분리(분리 방법으로는 균체를 침전 제거, 원심분리, 막 여과 분리)하거나, 또는 처음부터 균체를 유지재(保持材) 등으로 분리·유지 또는 고정화할 수도 있다. 이렇게 균체가 제거된 1,5-펜탄디아민을 포함하는 배양액으로부터 1,5-펜탄디아민을 회수하는 방법으로는, 일본 특허출원 공개번호 2009-207495호 공보에 기재된 바와 같이, 1,5-펜탄디아민 디카르복시산 염으로서 결정화하여 회수할 수도 있다. 또한, 일본 특허출원 공개번호 2009-29872호 공보에 기재된 바와 같이, NF 막을 이용하여 1,5-펜탄디아민을 정제하여 채취할 수도 있다. 또한, 일본 특허출원 공개번호 2009-28045호 공보에 기재된 바와 같이, 극성 유기용매로 추출 및 증류함으로써, 1,5-펜탄디아민을 채취할 수도 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명의 실시 태양을 설명하지만, 이는 본 발명의 예시로서 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

1,5-펜탄디아민 및 L-라이신 농도의 HPLC에 의한 분석 방법

사용 컬럼: CAPCELL PAK C18(시세이도)

이동상: 0.1%(w/w) 인산 수용액 : 아세토니트릴 = 4.5 : 5.5

검출: UV 360 nm

샘플의 사전 처리: 분석 샘플 25 ㎕에 내부 표준 물질(內標)로서 1,4-디아미노부탄(0.03 M)를 25 ㎕, 탄산수소나트륨(0.075 M)를 150 ㎕ 및 2,4-디니트로플루오로벤젠(0.2 M)의 에탄올 용액을 첨가 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 보온한다. 상기 반응 용액 50 ㎕를 1 ml 아세토니트릴에 용해한 후, 10,000 rpm로 5분간 원심분리한 후 상청액 10 ㎕를 HPLC 분석하였다.

실시예 1, 비교예 1

(1) L-라이신을 발효 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미컴의 제작

1,5-펜탄디아민의 전구체인 L-라이신을 합성할 수 있는 코리네박테리움 글루타미컴을 제작하기 위해, 아스파르트 키나제(AK)에 유효 변이를 도입하여 L-라이신 발효균을 제작하였다. Apppl. Microbiol. Biotechnol., (2002), 58, p.217-223에 기재된 방법을 참고하여, 코리네박테리움 글루타미컴 AK-1(이하 AK-1주로 약칭) 주를 제작하였다. 즉, 이 조작은 구체적으로 다음과 같이 하여 행하였다.

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 주로부터 통상적인 방법에 따라 조정(調整)한 게놈 DNA의 용액을 증폭 주형으로 사용하고, 데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 AK 유전자(Accession No. BA000036)의 염기 서열을 참고하여 설계한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 4, 5)를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행하고, 얻어진 산물을 1% 아가로스 겔에 전기 영동한 다음, AK 유전자를 포함하는 약 1.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라, 유전자 클린 키트로 정제하였다. 이 단편을 BamHI 및 SphI으로 절단하고, 얻어진 1.3 kb의 BamHI-SphI 단편을, 미리 BamHI 및 SphI로 절단시킨 pUC19의 BamHI/SphI 사이에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드를 pTM47로 칭한다. 그리고, 얻어진 AK 유전자가 데이터베이스에 등록되어 있는 유전자 서열과 같은 지를 서열로 확인하였다.

다음으로, 클로닝한 AK 유전자의 931번째부터 933번째의 acc(Thr)를 atg(Ile)로 변이시키기 위해, Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진 사 제품)를 사용하였다. 상세 실험 방법은 본 제품의 매뉴얼에 따라 실시하였다. pAK1을 증폭 주형으로 사용하고, 서열번호 6, 7에 나타낸 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여, pAK1의 전체 길이를 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 DpnI로 처리한 후, 대장균 JM109 주로 형질 전환하였다. 플라스미드를 추출하고, AK 유전자 서열을 확인한 바, 목적한 변이가 도입된 플라스미드를 취득하고, 이를 pTM49-1으로 칭하였다. 이 pTM49-1을 SphI 및 BamHI로 절단한 후, AK 유전자 부분(약 1.3 kb)을 겔 추출하여, 변이가 도입된 AK 유전자를 정제하였다.

다음으로, 바실러스 서브틸러스 IFO13719 주의 균체를 주형으로 하여, 서열번호 8, 9에 나타낸 염기 서열을 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행함으로써, sacB 유전자를 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 SacI으로 절단한 후, 동일하게 SacI로 미리 절단시킨 pHSG298(선택 마커로서 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 pUC 타입의 시판 중인 플라스미드, 다카라바이오 사 제품)에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드를 pTM38로 칭한다. 다음으로, SphI 및 BamHI으로 절단한 pTM38와 상기 AK 유전자를 포함하는 단편을 라이게이션하였다. 이렇게 제작한 sacB 유전자와 변이형 AK 유전자를 포함하는 플라스미드를 pTM52로 지칭한다.

ATCC 13032 주에 상기와 같이 하여 제작한 pTM52를 전기 천공법[FEMS Microbiology Letters, 65, p.299(1989]으로 도입하고, 카나마이신(25 ㎍/ml)이 첨가된 LB(트립톤(10 g/l)(Bacto 사 제품), 효모 엑기스(5 g/l)(Bacto 사 제품), 염화 나트륨(10 g/l)) 한천 배지 상에서 형질전환체를 선택하였다. 이어서, 선택한 카나마이신 내성 코리네균을 슈크로스 첨가 배지 상에서 배양하고, 이중 교차에 의해 슈크로스 내성 코리네균을 선택하였다. 이렇게 선택된 형질전환체들 중에서, S-아미노에틸시스테인(AEC)을 20 mM로 함유하는 최소 배지에서 생육가능한 균주로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 준비하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여 올리고뉴클레오티드(서열번호 4, 5)를 프라이머 세트로 사용하여 사용한 PCR 법을 수행함으로써 AK 유전자의 서열을 확인한 바, 931번째에서 933번째까지의 서열이 atg로 치환되어 있음을 확인할 수 있었다. 이렇게 제작한 AK-1주의 아스파르트 키나제는 라이신 및 트레오닌에 의한 피드백 저해가 해제되었다. 따라서, L-라이신을 배양에 의해 합성가능하게 되어 있다.

다음으로, 얻어진 AK-1주를, 또한, 유전자 재조합에 의해, 대장균 유래의 LDC 유전자를 염색체에 1 카피로 포함하는 코리네형 세균, 2 카피로 포함하는 코리네형 세균을 하기 기재된 방법에 따라 제작하였다.

(2) LDC 유전자 1 카피가 염색체에 도입된 코리네균의 제작(비교예 1)

AK-1주를 1,5-펜탄디아민 발효균으로 개량하기 위해, 대장균 유래의 LDC 유전자를 호모세린 탈수소효소 유전자 좌에 도입하기 위한 플라스미드 pTM45를 제작하였다. 즉, 이 조작은 구체적으로 다음과 같이 하여 행하였다.

pHSG298을 주형으로 하여, 서열번호 10, 11에 나타낸 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행함으로써, 카나마이신 내성 유전자의 프로모터를 증폭시켰다. 다음으로, 이 PCR 산물을 제한효소 BamHI 및 KpnI로 절단한 후, 겔 추출하여 카나마이신 내성 유전자의 프로모터(Kmp)를 정제하였다. 한편, 벡터 pUC19를 BamHI 및 KpnI로 절단한 후, 겔 추출에 의해 pUC19를 정제하였다. 이들 BamHI 및 KpnI로 절단시킨 pUC19와 카나마이신 내성 유전자의 프로모터를 라이게이션하였다. 이렇게 제작한 플라스미드를 pKmp으로 하였다.

다음으로, 대장균 JM109 주의 균체를 주형으로 하여, 서열번호 12, 13에 나타낸 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행하여 LDC 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 LDC 유전자를 제한효소 NcoI 및 SacI로 절단한 후, 겔 추출에 의해 LDC 유전자를 정제하였다. 한편, 플라스미드 pKmp를 NcoI 및 SacI로 절단한 후, 겔 추출에 의해 pKmp를 정제하였다. 이들 NcoI 및 SacI로 절단시킨 pKmp와 LDC 유전자를 라이게이션하였다. 이렇게 제작한 플라스미드를 pTM24로 지칭하였다.

다음으로, ATCC 13032 주의 균체를 주형으로 하여, 서열번호 14, 15에 나타낸 염기 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행하여 hom 유전자를 증폭시켰다. 이 증폭된 hom 유전자를 제한효소 SphI 및 BamHI로 절단한 후, 겔 추출하여 hom 유전자를 정제하였다. 한편, 전술한 pTM38를 SphI 및 BamHI로 절단한 후, 겔 추출에 의해 pTM38를 정제하였다. 이들 SphI 및 BamHI로 절단된 pTM38과 hom 유전자를 라이게이션하였다. 이렇게 제작한 플라스미드를 pTM44로 지칭하였다.

다음으로, 플라스미드 pTM24를 주형으로 하고, 서열번호 16, 17에 나타낸 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행하여, Kmp-LDC 유전자 단편을 증폭시켰다. 증폭된 Kmp-LDC 유전자 단편을 제한효소 Aor51HI로 절단한 후, 겔 추출을 행하여 Kmp-LDC 유전자 단편을 정제하였다. 상기와 같이 제작한 pTM44를 Aor51HI로 절단한 후, 겔 추출에 의해 pTM44를 정제하였다. 이들 Aor51HI로 절단시킨 pTM44와 Kmp-LDC 유전자 단편을 라이게이션하였다. 이렇게 제작한 플라스미드를 pTM45로 지칭하였다.

다음으로, AK-1주에 플라스미드 pTM45를 전기 천공법[FEMS Microbiology Letters, 65, p.299(1989]에 의해 도입하여 카나마이신 내성주를 선발한 후, 카나마이신 내성주를 슈크로스 첨가 배지 상에서 배양하고, Biosci. Biotechnol. Biochem(2007), 71(9), 2130-5의 TM45 주 제작 방법으로 기재되어 있는 이중 교차법에 의해, sacB 유전자가 탈락된 슈크로스 내성 코리네균을 선택하였다. 이렇게 선택한 형질전환체로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 준비하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 올리고뉴클레오티드(서열번호 18, 19)를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 방법으로 행하고, 얻어진 산물을 1.0% 아가로스 겔에 전기영동하였으며, 이때 3.5 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 이로부터, 선택된 형질전환체가, hom 유전자좌에 LDC 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 형질전환체를 코리네박테리움 글루타미컴 TM4552 주(TM4552 주로 약칭됨)로 명명하였다.

(3) LDC 유전자 2 카피를 포함하는 코리네균의 제작(실시예 1)

다음으로, LDC 유전자를 젖산 또는 락트산 탈수소효소 유전자(LDH 유전자)좌에 도입하기 위한 플라스미드를 제작하였다.

(i) LDC 유전자 발현 카세트의 제작

LDC 유전자의 발현 프로모터로서 ATCC 13032 주의 divIVA 유전자(서열번호 20)의 프로모터(서열번호 2, Pdiv와 약칭)를 사용하였다.

먼저, 통상적인 방법에 따라 준비한 ATCC 13032 주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21, 22에 나타낸 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 사용하여 PCR을 행하고, Pdiv의 클로닝을 행하였다. PCR 증폭 반응에는 KOD-plus polymerase(TOYOBO)를 사용하고, 반응 버퍼, dNTPmix 등은 부속된 것을 사용하였다. 프라이머를 20 pmol/샘플로, KOD-Plus polymerase를 1유닛/샘플이 되도록 50 ㎕의 반응 조성물을 준비하였다. 반응 용액을 PCR 증폭 장치 iCycler(BIO-RAD)에서 94℃의 온도에서 5분간 열 변성시킨 후, 94℃(열 변성)에서 30초, 60℃(프라이머의 어닐링)에서 30초, 68℃(상보쇄의 신장)에서 30초를 1 사이클로 하여 30회 사이클을 행하고, 그 후 4℃의 온도에서 냉각하였다. 그리고, 유전자 증폭용 프라이머(서열번호 21, 22)에는, 5 말단 측에는 BamHI 인지 서열, 3 말단 측에는 NcoI 인지 서열이 각각 부가되도록 제작하였다.

PCR 증폭 단편을 정제하고, 말단을 T4 polynucleotide Kinase(다카라바이오)로 인산화한 후, pUC118 벡터(제한효소 HincII로 절단하고, 절단면을 탈인산화처리한 것임)에 라이게이션하였다. 라이게이션은 DNA Ligation Kit Ver.2(다카라바이오)를 사용하여 행하였다. 라이게이션 용액을 대장균 DH5α의 컴피턴트 세포(다카라바이오)에 형질전환하고, 항생 물질 암피실린이 50 ㎍/mL로 포함된 LB 플레이트에 접종하여 하룻밤 배양하였다. 생육된 콜로니에 대하여, 미니프렙으로 플라스미드 DNA를 회수한 다음, 제한효소 BamHI, NcoI로 절단하여, Pdiv 단편이 삽입되어 있는 플라스미드를 선발하였다. 이들 일련의 조작은 모두 부속된 프로토콜에 따라 행하였다. 이렇게 제작한 플라스미드를 pCG5로 지칭한다.

다음으로, 대장균 JM109 주의 균체를 주형으로 한 PCR 법에 의해 LDC 유전자를 클로닝하였다. PCR 증폭 반응은 상기와 유사한 방법으로 행하고, 유전자 증폭용 프라이머(서열번호 23, 24)에 5 말단 측에는 NcoI 인지 서열, 3 말단 측에는 SacI 인지 서열이 각각 부가되도록 제작하였다. 수득한 LDC 유전자를 포함하는 PCR 증폭 단편을 정제하고, 상기와 유사한 방법으로 pUC118에 클로닝하였다. 제작한 플라스미드를 pCG11로 지칭한다.

다음으로, pCG11을 제한효소 NcoI, XbaI로 절단하고, LDC 유전자를 포함하는 약 2.1 kb의 단편을 잘라 정제한 후, 미리 제한효소 NcoI, XbaI로 절단시킨 pCG5에 라이게이션하였다. 수득되는 Pdiv 하류에 LDC 유전자가 연결된 단편을 포함하는 플라스미드를 pCG13로 지칭한다.

(ii) LDH 유전자좌 도입용 플라스미드의 제작

LDH 유전자좌에 도입하기 위한 상동 영역으로서, 각각 500 bp의 LDH 유전자 5' 말단 및 3' 말단 영역의 클로닝을 행하였다. 각각, ATCC 13032 주의 게놈을 주형으로 서열번호 25, 26(5 말단 영역) 및 서열번호 27, 28(3 말단 영역)을 프라이머 세트로 사용하여, 상기와 유사한 방법으로 PCR을 행하였다. 그리고, 5' 말단 영역 증폭용 프라이머(서열번호 25, 26)에는 5 말단측과 3 말단 측에 BglII 인지 서열이 각각 부가되도록 제작하고, 3' 말단 영역 증폭용 프라이머(서열번호 27, 28)에는 5 말단측에는 SalI 인지 서열, 3 말단 측에는 SphI 인지 서열이 부가되도록 제작하였다. 얻어진 LDH 유전자의 5 말단 및 3 말단 영역을 포함하는 약 500 bp의 PCR 증폭 단편을 각각 정제하고, 상기와 유사한 방법으로 pUC118에 각각 클로닝하였다. 제작한 플라스미드를 pCG28(5 말단 영역) 및 pCG29(3 말단 영역)로 지칭한다.

다음으로, pCG13을 제한효소 BamHI 및 XbaI로 절단하고, Pdiv-LDC 유전자를 포함하는 약 2.4 kb의 단편을 잘라 정제한 후, 전술한 pTM38를 미리 제한효소 BamHI 및 XbaI로 절단하여 둔 것에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드를 pCG33으로 지칭한다.

다음으로, pCG29를 제한효소 SalI 및 SphI로 절단하고, LDH 유전자의 3 말단 영역을 포함하는 단편을 잘라 정제한 후, 미리 제한효소 SalI, SphI로 절단하여 둔 pCG33에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드를 pCG37로 지칭한다.

마지막으로, pCG28를 제한효소 BglII, BamHI로 절단하고, LDH 유전자의 5 말단 영역을 포함하는 단편을 잘라 정제한 후, 미리 제한효소 BglII, BamHI로 절단하여 둔 pCG37에 라이게이션하였다. 얻어진 플라스미드를 pCG41로 지칭한다.

(iii) pCG41의 염색체로의 도입

먼저 제작한 상기 TM4552 주에 상기와 같이 제작한 pCG41를 도입하고, 카나마이신(25 ㎍/ml)이 첨가된 LB(트립톤(10 g/l)(Bacto 사 제품), 효모 엑기스(5 g/l)(Bacto 사 제품), 염화 나트륨(10 g/l)) 한천 배지 상에서 형질전환체를 선택하였다. 이어서, 선택한 카나마이신 내성 코리네균을 슈크로스 첨가 배지 상에서 배양하고, 실시예 1과 마찬가지로 이중 교차법으로 슈크로스 내성 코리네균을 선택하였다. 이렇게 선택한 형질전환체로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 준비하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 올리고뉴클레오티드(서열번호 25, 28)를 프라이머 세트로 사용하여 PCR 방법으로 수행하고, 얻어진 산물을 1.0% 아가로스 겔에 전기영동하였는데, 약 3.3 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 그리고, pCG41 미도입주에서는 약 2 kb의 단편을 얻을 수 있었다. 이로부터, 선택된 형질전환체에는 LDH 유전자좌에 Pdiv-LDC 유전자 단편이 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이 형질전환체를 코리네박테리움 글루타미컴 CG4541 주(CG4541 주로 약칭)로 명명하였다.

(4) 1,5-펜탄디아민의 발효 시험

상기와 같이 제작한 TM4552 주(비교예 1)와 CG4541 주(실시예 1)를 사용하여 1,5-펜탄디아민 발효 시험을 행하였다.

멸균한 표 1에 나타낸 배지 5 mL에 CG4541 주(실시예 3) 및 TM4552 주(비교예 1)를 각각 하나의 백금이로 접종하여, 30℃에서 24시간 진탕하며 전전 배양을 행하였다. 이 전전 배양액을 전전 배양과 동일한 배지 45 ml에 전량 접종하여, 30℃, 120 rpm의 조건하에 24시간 배양하여 전 배양을 행하였다. 다음으로, 표 1에 나타낸 배지의 글루코스 농도를 150 g/L로 변경한 배지 1000 ml에 전 배양액 전량을 접종하여, 멸균한 공기를 0.07 vvm로 통기하에, 30℃, 교반 날개 회전수 800 rpm, pH 6.7로 조정하면서 배양을 행하였다. 중화제로서 황산 수용액(3 M) 및 암모니아 수용액(3 M)을 사용하였다.

CG4541 주의 배양 결과를 도 1에, TM4552 주는 도 2에 나타낸다. 그 결과, TM4552 주(비교예 1)는 1,5-펜탄디아민 축적 농도가 도중에 한계점에 도달하였고 전구체인 L-라이신이 축적되었지만, CG4541 주(실시예 1)에서는 1,5-펜탄디아민의 축적 농도가 10 g/L 이상으로 향상되었고 전구체 L-라이신의 축적은 전혀 발생되지 않았다.

(5) 라이신 탈탄산효소의 비활성 측정

상기와 같이 배양한 CG4541 주(실시예 1)와 TM4552 주(비교예 1)의 LDC 비활성을 경시적으로 측정하였다.

상기한 바와 같이 배양한 각 주의 배양액을 경시적으로 10 ml 샘플링하고, 4000 rpm에서 5분간 원심분리하여 집균한 후, 2 ml의 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH8)에 현탁하였다. 2 ml의 스크류 캡형 튜브(WATSON)에 0.4 g/개의 유리 비드(0.1 mmφ, 아즈원)를 넣고, 여기에 1 ml의 균체 현탁액을 가하였다. 다음으로, 비드식 호모게나이저(TOMY정공사제)에 의해, 4000 rpm에서 1분간의 파쇄 조작을 5회 반복 행한 후, 12000 rpm으로 5분 원심분리하여 상청을 회수하고, 회수한 상청을 조산물 효소액으로 사용하여, 계속되는 라이신 탈탄산효소의 비활성 측정 시험에 사용하였다. 또한, 단백질 농도 측정에는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하였다(PIERCE). CG4541 주의 조산물 효소액의 단백질 농도는 표 2에, TM4552 주의 조산물 효소액의 단백질 농도는 표 3에 나타낸다.

배양 시간	0시간	23시간	45시간	65시간	96시간	118시간	141시간	159시간
단백질 농도 (g/L)	-	3.2	2.4	1.9	2.2	3.1	3.2	3.0

배양 시간	0시간	25시간	45시간	69시간	90시간	112시간	135시간	159시간
단백질 농도 (g/L)	-	9.3	11.2	11.0	10.2	9.4	8.4	6.0

상기와 같이 수득한 조산물 효소액을 사용하여, L-라이신을 기질로 한 라이신 탈탄산효소 활성을 측정하였다. 반응 용액의 조성을 표 4에 나타낸다. 반응은 37℃에서 30분간 행하고, 그 후 반응을 종료시키기 위해 10분간 가열하였다. 원심분리한 후 상청을 사용하여, L-라이신과 생성된 1,5-펜탄디아민의 농도를 상기와 같이 HPLC로 측정하고, 단백질 당 LDC 비활성을 식 1에 의해 산출하였다. LDC 비활성의 경시적 변화를 도 3에 나타낸다.

용액	용량 (㎕)
조산물 효소액	395
500 mM L-라이신	100
5 mM 피리독살-5-리소산 용액	5
총	500

도 3의 결과로부터, TM4552 주의 LDC 비활성은 배양 경과에 따라 저하되었고, 배양 개시 후 90시간째에는 거의 확인할 수 없었다. 그에 비해, CG4541 주의 LDC 비활성은 배양 경과에 따라 감소되는 감소 경향은 있었지만, 배양 중에 비활성은 180 mU/(단백질) mg 이상으로 유지되었다.

CG4541 주의 LDC 비활성 및 배양액내 1,5-펜탄디아민, L-라이신 농도를 표 5에, TM4552 주의 LDC 비활성 및 배양액내 1,5-펜탄디아민, L-라이신 농도를 표 6에 나타낸다.

배양 시간	0시간	23시간	45시간	65시간	96시간	118시간	141시간	159시간
배양액내 1,5-PD (g/L)	0	0.8	4.8	7.3	9.7	10.7	11	10.9
배양액내 L-라이신 (g/L)	0	0	0	0	0	0	0	0
LDC 비활성 (mU/mg 단백질)	-	466	430	249	258	254	200	181

배양 시간	0시간	25시간	45시간	69시간	90시간	112시간	135시간	159시간
배양액내 1,5-PD (g/L)	0	0.7	3.7	5	5.3	5	4.9	5
배양액내 L-라이신 (g/L)	0	0	0.7	1.3	1.7	1.8	1.6	1.1
LDC 비활성 (mU/mg 단백질)	-	83	39	11	4	5	3	3

표 6의 결과에서, TM4552 주는 배양 개시 후 25시간째 LDC 비활성이 83 mU/(단백질) mg이고, 배양액내 L-라이신의 축적은 없었지만, 개시 후 45시간째에는 LDC 비활성이 39 mU/(단백질)mg으로 저하되었고, 배양액내 L-라이신이 축적이 발생되었다. 그 후, LDC 비활성은 저하되고, L-라이신의 축적은 증가되었다. 한편, 표 5의 결과에서, CG4541 주에서는 배양 중 LDC 비활성이 180 mU/(단백질)mg으로 유지되었고, 배양하는 동안에 배양액내 L-라이신의 축적은 전혀 발생되지 않았다.

CG4541 주는 LDC 유전자의 발현 프로모터로서 카나마이신 내성 유전자와 divIVA 유전자의 프로모터를 사용하고 있지만, 카나마이신 내성 유전자의 프로모터만을 사용하고 있는 TM4552 주의 LDC 비활성은 가장 높은 시점에서도 80 mU/(단백질) mg 정도에 불과하여, CG4541 주의 LDC 비활성 지속성은 divIVA 유전자 프로모터의 효과인 것으로 생각된다.

본 발명은 폴리아미드의 원료가 될 수 있는 1,5-펜탄디아민을 제조하는 방법으로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Process of Producing 1,5-pentandiamine <130> PF000430-PCT <160> 28 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2148 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 2 <211> 195 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 ttgtggcctt gaaagtgtgc aggatttttg aattctcttt ggagttttcg gcgcgtatgt 60 cagataaaaa ataactgctg gctacaatgg cacgtgaaga acagtatgat aaatggaaat 120 tccagtcatg agagattctt gtggctgagt cccggccctg cctggggcca ccgttaaatc 180 gaagggaatc cgcaa 195 <210> 3 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 atagcatgcg tggccctggt cgtacagaa 29 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 ataggatcct tagcgtccgg tgcctgc 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 gcaccaccga catcatcttc acctgc 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 gagggcaggt gaagatgatg tcggt 25 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 gaagagctcg atccttttta acccatcac 29 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 gaagagctcc aagtcgataa acagcaatat t 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 attggatccc ctgaatcgcc ccatcatcc 29 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 ataggtaccc catggcaccc cttgtattac tgttt 35 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 ataccatgga cgttattgca atattgaat 29 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 atagagctct tattttttgc tttcttcttt caatacc 37 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 atagcatgca tgacctcagc atctgccc 28 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 ataggatcct tagtcccttt cgaggcg 27 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 gaaagcgctc ctgaatcgcc ccatcatcc 29 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 gaaagcgctt tattttttgc tttcttcttt 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 gaagaattct aaacctcagc atctgcccc 29 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 gaaccgcggt tattttttgc tttcttcttt 30 <210> 20 <211> 1098 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 20 atgccgttga ctccagctga tgtgcataac gtcgctttta ataagccgcc tatcggcaag 60 cgtggctaca acgaagacga ggttgatcag ttcctagatc tcgttgagga cgccctcgtt 120 cagttccaag aggaaaacga agacctaaag cagcaggtcg aagagctaga ggcgcaggtt 180 gccggtggta cttcttccgc tgctagttcc tcaactgcag gtgcagccac agctgcagct 240 tccaagtctg ttgacgaggc agcgctgcgc aaggaaatcg aagagaagct gcgctccgaa 300 tacgcatcca agctcgatga tgcctccaag gccgctcaga aggctcaaaa cgatgcgaag 360 tccgctcaag atcagctaca gcgtgcacaa gctgacgcaa aggcagctcg cgacgaagct 420 gaaaaggcca aggctgaagc taagtcagca gcatcctcca gcaccactaa ggcagcagcg 480 gttggcgctg tcggcgctgg caccggagca gcagttgcta caggtgctgc aaatgtggac 540 acccacatgc aggcagcgaa ggttctggga ctcgcacagg aaatggcaga ccgcctgacc 600 tcagaggctc gctccgaatc caagtccatg ctggacgagg ctcgcgaagc agcagagaag 660 cagatcgagg aagcaaacag cacctccaac cgcactctgg aagatgctcg cgcaaacgct 720 gagaagcaga tcgctgaagc gcagaaccgc gctgacactc tggtcaacga agctgacgct 780 aaggctaaga acctggtttc cgaagccgag aagaagtccg cagccaccct ggccgcatcc 840 acctctcgtg cagaagctca gatccgtcaa gccgaggaca aggcaaacgc cctccaggca 900 gacgcagagc gcaagcacac cgaaaccatg gctgcagtca aggaacagca gaatgctctg 960 gagacccgca tcgcggaact gcagaccttc gagcgtgagt accgcacccg tctgaagtcc 1020 ctcctcgagg gccagctgga agaactcaac gcacgtggct cctctgcacc aaccaacaac 1080 aagccatctg gtgagtaa 1098 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 atgcggatcc ttgtggcctt gaaagtgtgc 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 atgcccatgg ttgcggattc ccttcgattt 30 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 ataccatgga cgttattgca atattgaat 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 atagagctct tattttttgc tttcttctt 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 ataagatctt tctccgaccg cgtcaaccg 29 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 ataggatccg agttcgagta gttctgcgg 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 atatctagaa agtttctctc cttagctat 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 atagcatgcc aaaatacccg aagcaacac 29

Claims

염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형(coryneform) 세균에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법으로서,
상기 코리네형 세균은 배양하는 동안에 50 mU/(단백질)mg 이상의 라이신 탈탄산효소 활성을 계속 유지하는 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
염색체에 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네형 세균에 의한 1,5-펜탄디아민의 제조 방법으로서,
상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자는 대수 증식기(exponential phase)에 기능하는 프로모터 하류에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 프로모터는 divIVA 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로모터는 하기 (A) - (D) 중 어느 하나로부터 선택되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법:
(A) 서열번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어진 프로모터;
(B) 서열번호 2에 기재된 염기 서열에서, 1개 또는 수개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어진 프로모터;
(C) 서열번호 2에 기재된 염기 서열로 이루어진 프로모터 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건하에 혼성화하는 프로모터;
(D) 서열번호 2에 기재된 염기 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 염기 서열로 이루어진 프로모터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자는 대장균 유래의 유전자인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 라이신 탈탄산효소를 코딩하는 유전자는 하기 (A) - (D) 중 어느 하나로부터 선택되는 유전자로서 라이신 탈탄산효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 것인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법:
(A) 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어진 유전자;
(B) 서열번호 1에 기재된 염기 서열에서, 1개 또는 수개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 서열로 이루어진 유전자;
(C) 서열번호 1에 기재된 염기 서열로 이루어진 유전자 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건하에 혼성화하는 유전자;
(D) 서열번호 1에 기재된 염기 서열과의 서열 동일성이 적어도 80% 이상인 염기 서열로 이루어진 유전자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 코리네형 세균은 L-라이신 생산성이 향상된 코리네형 세균인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 코리네형 세균은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 311번째 아미노산 잔기가 트레오닌 이외의 아미노산으로 치환된 변이형 아스파라긴산 키나제를 포함하는 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 코리네형 세균은 호모세린 탈수소효소 활성이 저하 또는 결손된 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 코리네형 세균은 유전자 삽입 변이에 의해 호모세린 탈수소효소 활성이 결손된 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 코리네형 세균은 코리네박테리움 속(Genus Corynebacterium)에 속하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속에 속하는 세균은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는 1,5-펜탄디아민의 제조 방법.