KR20120137386A - 위암 검출용 마커 및 위암 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 피검자에게 부여하는 침습성이 낮고, 검출 감도와 정확성이 높은 위암의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 피검자 유래의 체액 시료 중의 COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편을 시험관 내로 측정하고, 그 양에 기초하여 위암 이환의 유무를 검출하는 방법, 및 상기 단백질에 특이적으로 결합 가능한 항체를 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.

Description

위암 검출용 마커 및 위암 검출 방법{GASTRIC CANCER MARKER, AND METHOD FOR DETECTING GASTRIC CANCER}

본 발명은, COTL1 단백질을 위암 검출용 마커로 하여, 그의 체액 중의 농도를 측정하는 것에 의한 위암의 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 위암의 검출을 위해 사용되는 상기 단백질과 결합 가능한 물질을 포함하는 위암의 검출용 키트에 관한 것이다.

위는 음식물을 수시간 저장하며, 그 사이에 분비된 위산에 의해 음식물을 산성으로 하여 부패를 방지하고, 소화 효소에 의해 음식물을 소화하는 역할을 갖는다, 중요한 소화기계 기관이다.

위암의 발생 빈도는, 일본에서는 인구 10만명당 50 내지 60명 정도이고, 남녀비는 1 내지 2:1로 남성에게 많은 경향이 있다. 또한, 사망수는 연간 약 5만명으로 전체 암의 17 ％ 정도이며, 제2차 세계 대전 후, 1990년 초까지 부위별 암사망율 1위였다. 현재에는 환자수가 해마다 감소하고 있어 폐암에 이어 제2위가 되었지만, 여전히 환자수가 많은 질환인 것에는 변함이 없다. 또한, 위암은 세계적으로 본 경우 일본, 한국, 중국 등의 아시아 지역, 남미에서의 환자수가 많은 질환이다. 위암의 위험 인자로서는 일반적으로는 흡연, 고염분의 식습관, 헬리코박터ㆍ파일로리균의 감염 등을 들 수 있다.

위암의 치료에는 내시경 치료, 외과 수술, 화학 요법, 방사선 요법 등이 알려져 있으며, 병기, 종양의 크기ㆍ심달도, 전이의 정도 등을 감안하여 실시된다. 치료 방침에 있어서는, 2004년에 일본 위암 학회에 의해 작성된 「위암 치료 가이드 라인」에 기초하여 결정된다. 조기 위암의 경우에는, 내시경 절제 또는 외과 수술에 의해 완전히 절제하는 것이 가능하며, 재발률도 매우 낮다. 한편, 진행 위암인 경우에는 병변이 적출되어도, 수술시에는 발견할 수 없었던 미소한 전이 병소가 있어, 재발하는 경우가 적지 않다. 위암은, 조기에 발견된 경우의 예후는 비교적 양호하며, 통상 90 ％ 이상이 완전히 치유된다. 그러나, 큰 종양이나 전이 후의 치료 성적은 5년 생존율이 약 70 ％로 떨어진다. 그 때문에, 조기 발견이 중요하다.

그러나, 대부분의 위암은 조기 단계에서는 무증상이며, 암이 진행된 후가 아니면 명확한 자각 증상이 나타나지 않는 경우가 많다. 따라서, 자각 증상에 의해 위암을 조기 발견하는 것은 곤란하다. 자각 증상으로서는, 위암의 진행에 따라 연변화, 흑색변, 구역질, 위부 불쾌감 등이 보이며, 전신적 증상으로서 쉽게 피로함, 발열, 체중 감소, 빈혈 등이 보인다. 더욱 진행되면 종양의 증대에 따라, 복부에 응어리를 느끼게 된다. 이러한 자각 증상이 나타난 후에도 환자는 그것을 종종 방치하는 경향이 있으며, 검진시의 X선 촬영 등으로 이미 진행된 상태에 처음으로 발견되는 경우도 적지 않다. 그 때문에, 조기 단계에 위암을 고감도이면서도 정확하게 검출하는 검사 방법의 개발이 중요해지고 있다.

위암의 검사법으로서는, 초음파 검사, CT 검사, 혈관 조영 검사, X선 촬영 등에 의한 화상 진단법이 있다. 화상 진단법은, 조기의 작은 위암을 발견하는 데에는 유용한 방법이기는 하지만, 예를 들면 건강 진단 등 다수의 피검자를 대상으로 하는 경우에는 효율적인 방법이라고는 할 수 없으며, 진단에 필요한 비용도 비교적 높다는 문제가 있다.

최근의 게놈 해석 또는 프로테옴 해석의 기술 진보에 따라, 암 영역에서의 연구의 성과로서 다양한 신규 종양 마커 후보가 발견되고 있다(예를 들면, 특허문헌 1, 특허문헌 2). 특정한 암에 특이적이면서도 감수성이 높은 혈중 마커는, 비교적 저렴하고 높은 처리량의 검사ㆍ진단이 가능해진다고 생각되는 점에서, 그의 개발이 강하게 요망되고 있다. 마커 탐색의 방법으로서는, 암세포와 비암세포에서의 유전자 발현이나 단백질 또는 세포의 대사 산물 등의 양을 비교하는 방법이나, 암환자와 비암환자의 체액 중에 포함되는 mRNA, 단백질 또는 대사 산물 등의 양을 측정하는 방법을 들 수 있다. 현재, 임상 현장에서 이용되고 있는 위암 종양 마커로서는, CEA, BFP, NCC-ST-439, CA72-4, CA19-9 등이 알려져 있다. 또한, 조직에서는 펩시노겐 C(pepsinogen C)(비특허문헌 1), hnRNP A2/B1(비특허문헌 2), NSP3, 트랜스젤린(transgelin), 프로히비틴(prohibitin), HSP27, 프로테인 디술피드 이소메라아제 A3(protein disulfide isomerase A3), GRP58(비특허문헌 3) 등의 마커 후보가 발견되어 있다. 그러나, 이들 마커 및 마커 후보는, 특이성 및/또는 검출 감도가 부족하거나, 생체 시료로부터의 그의 효율적인 검출 방법이 확립되어 있지 않다. 따라서, 그의 이용은 치료 후의 경과 관찰이라는 제한된 목적으로 한정되어 있으며, 보다 특이성 및 검출 감도가 높은 위암의 마커가 요망되고 있다.

국제 공개 WO2005/001126 국제 공개 WO2003/060121

Melle, C. 외, Journal of proteome research, 2005, 제5권, p.1799-1804 Lee, C. 외, Proteomics, 2005, 제5권, p.1160-1166 Ryu, J. W. 외, Journal Korean Medical Science, 2003, 제18권, p.505-509

본 발명의 과제는, 위암의 검출에 유용한 종양 마커 및 상기 종양 마커를 이용한 위암의 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은, 위암 환자의 혈액과 건상체의 혈액에 존재하는 단백질군을 비교하여, 위암 환자의 혈액에 검출되는 신규 종양 마커로서 COTL1 단백질을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

「COTL1」(coactosin-like1) 단백질이란, 액틴 세포 골격 결합성 단백질이며, 세포 내에서 5-리폭시게나아제와 결합한다는 것이 보고되어 있고, 류코트리엔의 생합성에 관여한다고 생각되고 있다(문헌 [Provost P. 외, 2001년, Journal of Biological Chemistry, 제276권, p.16520-16527]). 또한, 이 단백질은, 류마티스의 발병에 따라 그의 혈중 농도가 높아진다는 것이 보고되어 있다(문헌 [Eun-Heui J. 외, 2009년, Experimental and Molecular Medicine, 제41권, p.354-361]). 또한, 췌장암 조직에서 발현이 높다는 것도 알려져 있다(문헌 [Nakatsura T. 외, 2001년, Biochemical and Biophysical Research Communication, 제256권, p.75-80). 그러나, COTL1 단백질과 위암과의 관련성에 관한 보고는, 현재까지 알려져 있지 않다.

따라서, 본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.

(1) 피검체 유래의 체액 중에 존재하는 COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편으로 이루어지는 위암 검출용 마커의 양을 시험관 내에서 측정하고, 그 양에 기초하여 위암의 이환을 결정하는 위암 검출 방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 상기 COTL1 단백질이 서열 번호 1로 표시되는 폴리펩티드인 방법.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 피검체의 상기 위암 검출용 마커의 양이 건상체의 그것과 비교하여 통계학적으로 유의하게 많을 때에 위암에 이환되어 있는 것으로 결정하는, 방법.

(4) 상기 (3)에 있어서, 상기 통계학적으로 유의하게 많은 양이 건상체의 2배 이상인 방법.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 측정이 상기 위암 검출용 마커와 특이적으로 결합 가능한 물질을 사용하는, 방법.

(6) 상기 (5)에 있어서, 상기 결합 가능한 물질이 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체 및/또는 이들의 단편인 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 위암이 조기 위암인 기재한 방법.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 체액 시료가 혈액 또는 뇨인 방법.

(9) 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체, 이들의 단편 및/또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 위암 검출용 키트.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2010-046613호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

본 발명에 의해, 위암을 용이하면서도 높은 신뢰도로 검출하는 것이 가능해졌다. 예를 들면, 위암 환자의 혈액 등의 체액 시료 중에 포함되는 COTL1 단백질의 농도를 측정하는 것만으로도 위암인지 아닌지를 용이하게 판정할 수 있다. 본 발명의 위암 검출 방법에 따르면, 조기 암이어도 검출이 가능하다는 점에서 유효하다.

[도 1] 위암 환자 및 건상자의 혈장 중의 COTL1 단백질을 웨스턴 블롯법에 의해 검출한 그래프.
[도 2] 위암 환자 및 건상자의 혈장 중의 CEA(도 2A) 및 CA19-9(도 2B)를 샌드위치 엘리사(ELISA)법에 의해 검출한 그래프.

1. 위암 검출용 마커

(개요)

본 발명의 제1 양태는, 위암을 검출하기 위한 위암 검출용 마커에 관한 것이다. 본 발명은, COTL1 단백질이 건상자보다도 위암 환자의 혈액 중에 많이 존재한다는 지견에 기초한 것이다. 후술하는 본 발명의 제2 양태에서 설명하는 바와 같이, 피검체의 혈액 중에 존재하는 당해 단백질의 양의 다소에 따라 그 피검체의 위암의 이환을 검출할 수 있다.

(발명의 구성)

본 발명에서 「위암 검출용 마커」란, 위암을 검출하기 위한 생물학적 마커이며, 피검체가 위암에 이환되어 있는 것을 나타내는 지표가 되는 물질을 말한다. 본 발명의 위암 검출용 마커는, COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편(이후, 본 명세서에서 이들을 합하여 종종 「COTL1 단백질 등」이라 함)으로 구성된다.

본 발명의 「COTL1 단백질」은, 상술한 바와 같이 액틴 세포 골격 결합성 단백질을 말한다. 본 발명에서는, 142 아미노산으로 이루어지는 약 17 kDa의 각 생물종 COTL1 단백질이 해당하지만, 바람직하게는 인간 유래의 COTL1 단백질(GenBank 액세션 No.NP_066972.1), 구체적으로는 서열 번호 1로 표시되는 폴리펩티드이다. 또한, COTL1 단백질은, COTL1 단백질, 특히 인간 유래의 COTL1 단백질의 변이체 또는 야생형 및/또는 변이형의 COTL1 단백질의 단편일 수도 있다. COTL1 단백질 등은 본 발명자들에 의해, 위암 세포에 의해 생산되고, 위암 환자에게서는 건상체에 비교하여 많은 양이 체액 중에 누출된다는 것이 분명해졌다.

본 명세서에 있어서 상기 COTL1 단백질 「변이체」란, COTL1 단백질의 바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 인간 유래의 야생형 COTL1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 또는 그의 부분 서열에 있어서, 1 이상, 바람직하게는 1 내지 수개의 아미노산의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 상기 아미노산 서열 또는 그의 부분 서열과 약 80 ％ 이상, 약 85 ％ 이상, 바람직하게는 약 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 95 ％ 이상, 약 97 ％ 이상, 약 98 ％ 이상, 약 99 ％ 이상의 ％ 동일성을 나타내는 변이체를 의미한다. 여기서, 「수개」란, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 정수를 가리킨다. 또한, 「％ 동일성」이란, BLAST나 FASTA에 의한 단백질의 검색 시스템을 이용하여, 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고 결정할 수 있다(문헌 [Karlin, S. 외, 1993년, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A., 제90권, p.5873-5877; Altschul, S. F. 외, 1990년, Journal of Molecular Biology, 제215권, p.403-410; Pearson, W. R. 외, 1988년, Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.,제85권, p.2444-2448]). COTL1 단백질의 변이체의 구체예로서, 피검체의 종류(예를 들면, 피검자의 경우에는 인종)나 개체에 기초한 다형(SNIPs를 포함함), 스플라이스 변이 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 「단편」이란, 야생형 COTL1 단백질, 바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 인간 유래의 야생형 COTL1 단백질 또는 그의 변이체를 구성하는 아미노산 중 적어도 7개 이상 전체수 미만, 적어도 10개 이상 전체수 미만, 적어도 15개 이상 전체수 미만, 바람직하게는 적어도 20개 이상 전체수 미만, 적어도 25개 이상 전체수 미만, 보다 바람직하게는 적어도 35개 이상 전체수 미만, 적어도 40개 이상 전체수 미만, 적어도 50개 이상 전체수 미만의 연속된 아미노산 잔기로 이루어지고, 1개 또는 복수의 에피토프를 유지하는 폴리펩티드 단편을 말한다. 이러한 단편은, 후술하는 본 발명에 관한 항체 또는 그의 단편과 면역 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 펩티드 단편을 COTL1 단백질에 포함하는 이유는, 비록 단편화되어 있어도 혈액 중의 COTL1 단백질을 정량할 수 있으면 본 발명의 목적을 달성할 수 있고, 혈액 중의 상기 야생형 COTL1 단백질(바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 인간 유래의 야생형 COTL1 단백질) 또는 그의 변이체의 전장 폴리펩티드가, 예를 들면 혈액 중에 존재하는 프로테아제나 펩티다아제 등에 의해 단편화되어 존재할 가능성이 있기 때문이다.

2. 위암 검출 방법

(개요)

본 발명의 제2 양태는, 위암을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, COTL1 단백질이 건상자보다도 위암 환자의 혈액 중에 많이 존재한다는 지견에 기초하여, 피검체 유래의 체액 중 존재하는 본 발명의 위암 검출용 마커의 양을 측정하고, 그 결과로부터 위암을 검출하는 방법이다.

(발명의 구성)

본 발명의 방법은, (1) 위암 검출용 마커 측정 공정, 및 (2) 이환 결정 공정을 포함한다. 이하, 각각의 공정에 대하여 상세히 설명을 한다.

2-1. 위암 검출용 마커 측정 공정

「위암 검출용 마커 측정 공정」이란, 피검체 유래의 체액 중에 존재하는 본 발명의 위암 검출용 마커, 즉 COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편의 양을 시험관 내에서 측정하는 공정이다.

본 명세서에서 「피검체」란, 위암 이환의 검출 대상이 되는 검체이며, 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물, 특히 바람직하게는 인간이 해당한다. 본 명세서에서 피검체가 인간인 경우에는, 이후 특별히 「피검자」라 한다.

본 명세서에서 「체액」이란, 위암 검출을 위해 제공되는 시료이며, 생물학적 유동체를 의미한다. 체액은, 본 발명의 위암 검출용 마커가 포함될 가능성이 있는 생물학적 유동체일 수 있으며, 특별히 한정은 되지 않는다. 예를 들면, 혈액, 뇨, 림프구 배양 상청, 수액, 소화액(위액, 타액을 포함함), 땀, 복수, 콧물, 눈물, 질액, 정액 등이 포함된다. 바람직하게는, 혈액 또는 뇨이다. 여기서 말하는 「혈액」이란, 전혈, 혈장 및 혈청을 포함한다. 전혈은, 정맥혈, 동맥혈 또는 제대혈을 불문한다. 체액은, 동일 개체로부터 얻어지는 상이한 2 이상의 조합일 수도 있다. 본 발명의 위암의 검출 방법은, 침습성이 낮은 혈액이나 뇨로부터도 검출 가능하다는 점에서 간편한 검출법으로서 매우 유용하다.

「피검체 유래의 체액」이란, 피검체로부터 이미 채취된 체액을 말하며, 체액을 채취하는 행위 자체는 본 발명의 양태에는 포함되지 않는다. 피검체 유래의 체액은, 피검체로부터 채취된 것을 즉시 본 발명의 방법에 사용할 수도 있고, 채취 후 직접, 또는 적당한 처리를 실시한 후에 냉장 또는 동결한 것을 본 발명의 방법에 사용하기 전에 실온으로 되돌려 사용할 수도 있다. 냉장 또는 동결 전의 적당한 처리로서는, 예를 들면 전혈에 헤파린 등을 첨가하여 항응고 처리를 실시한 후, 또는 혈장 또는 혈청으로서 분리하는 것 등이 포함된다. 이들 처리는, 당해 분야에서 공지된 기술에 기초하여 행할 수 있다.

본 명세서에서 「본 발명의 위암 검출용 마커의 양」이란, 피검체 유래의 체액 중에 존재하는 COTL1 단백질 등의 분량을 말한다. 이 분량은, 절대량 또는 상대량의 어느 하나일 수도 있다. 절대량의 경우, 소정의 체액량 중에 포함되는 위암 검출용 마커의 질량 또는 용량이 해당한다. 상대량의 경우, 특정한 측정값에 대한 피검체 유래의 위암 검출용 마커의 측정값에 의해 표시되는 상대적인 값을 말한다. 예를 들면, 농도, 형광 강도, 흡광도 등을 들 수 있다.

위암 검출용 마커의 양은, 시험관 내에서 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 등과 특이적으로 결합 가능한 물질을 이용하여 측정하는 방법을 들 수 있다.

본 명세서에서 「특이적으로 결합 가능하다」란, 어떤 물질이 본 발명의 표적인 위암 검출용 마커, 즉 COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편이랑만 실질적으로 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 여기서, 「실질적으로」란, 비특이적인 결합 이외의 결합을 의미한다.

「특이적으로 결합 가능한 물질」로서는, 예를 들면 COTL1 결합 단백질을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 COTL1 단백질을 항원으로 하고, 그것을 인식하여 결합하는 「항COTL1 항체」, 바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 항체, 또는 COTL1 단백질의 변이체를 항원으로 하고, 그것을 인식하여 결합하는 「항COTL1 변이체 항체」, 바람직하게는 서열 번호 1의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인식하여 결합하는 항체, 및/또는 이들의 항체 단편이다. 또는, 이들의 화학 수식 유도체일 수도 있다. 여기서, 「화학 수식 유도체」란, 상기 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체 및/또는 이들의 단편의 COTL1 단백질 등과의 특이적인 결합 활성을 획득 또는 유지하는 데에 있어서 필요한 기능상의 수식, 또는 상기 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체 및/또는 이들의 단편을 검출하는 데에 있어서 필요한 표지를 위한 수식을 모두 포함한다.

기능상의 수식에는, 예를 들면 글리코실화, 탈글리코실화, PEG화를 들 수 있다.

표지상의 수식에는, 예를 들면 형광 색소(FITC, 로다민, 텍사스 레드, Cy3, Cy5), 형광 단백질(예를 들면, PE, APC, GFP), 효소(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스 옥시다아제), 또는 비오틴 또는(스트렙토) 아비딘에 의한 표지를 들 수 있다.

항체는, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 중 어느 하나일 수도 있다. 특이적 검출을 가능하게 하기 위해, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. COTL1 단백질 등과 특이적으로 결합하는 항COTL1 폴리클로날 항체 등(항COTL1 폴리클로날 항체, 항COTL1 변이체 폴리클로날 항체 및/또는 이들의 항체의 단편에 대한 폴리클로날 항체를 포함함) 또는 모노클로날 항체 등(항COTL1 모노클로날 항체, 항COTL1 변이체 모노클로날 항체 및/또는 이들의 항체의 단편에 대한 모노클로날 항체를 포함함)은, 후술하는 방법에 의해 제작할 수 있다. 그 이외에, 항인간 COTL1 폴리클로날 항체는, 프로테인 그룹사 등으로부터 시판되고 있으며, 그것을 이용할 수도 있다. 본 발명의 항체의 글로불린 타입은, 상기 특징을 갖는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니며, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나일 수도 있지만, IgG 및 IgM이 바람직하다. 항체 단편은, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, ScFv 등이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 유전자 공학 기술에 의해 생산 가능한 항체 단편 및 유도체도 포함된다. 이러한 항체에는, 예를 들면 합성 항체, 재조합 항체, 다중 특이성 항체(이중 특이성 항체를 포함함), 단쇄 항체 등이 포함된다. 본 발명의 항COTL1 단백질 항체 등은, 상기 단백질 중 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산으로 이루어지는 1 또는 수개의 에피토프에 대한 항체이다. 특이적인 폴리클로날 항체는, 예를 들면 아가로스 등의 담체에 COTL1 단백질 등을 결합한 칼럼에, 상기 단백질을 면역한 토끼 등의 항혈청을 통과시키고, 칼럼 담체에 결합한 IgG 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 제작할 수 있다.

(1) 항COTL1 항체의 제작

이하, 본 발명에서 사용하는 항COTL1 폴리클로날 항체 등 및 모노클로날 항체 등의 제작 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

(1-1) 면역원의 제조

본 발명에서 항체를 제작할 때, 면역원(항원)으로서의 COTL1 단백질 등을 제조한다. 본 발명에서 면역원으로서 사용 가능한 COTL1 단백질은, 예를 들면 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 COTL1 단백질 또는 그의 변이체 또는 그의 폴리펩티드 단편, 또는 이들과 다른 펩티드(예를 들면, 시그널 펩티드, 표지 펩티드 등)와의 융합 폴리펩티드이다. 면역원으로서의 COTL1 단백질은, 예를 들면 서열 번호 1의 아미노산 서열 정보를 이용하여, 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 고상 펩티드 합성법 등에 의해 면역원으로서 사용하기 위한 COTL1 단백질 단편을 합성할 수 있다. 면역원으로서 COTL1 단백질 단편을 사용하는 경우에는, KLH, BSA 등의 캐리어-단백질에 연결시켜 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 면역원으로서의 COTL1 단백질 등은, 공지된 DNA 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. COTL1 단백질 등을 코드하는 cDNA는, cDNA 클로닝법에 의해 제작할 수 있다. 면역원 COTL1 유전자 등을 발현하는 위 상피 세포 등의 생체 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, 이것을 올리고 dT 셀룰로오스 칼럼으로 처리하여 얻어지는 폴리 A(+) RNA로부터 RT-PCR법에 의해 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이 라이브러리로부터 혼성화 스크리닝, 발현 스크리닝, 항체 스크리닝 등의 스크리닝에 의해 목적으로 하는 cDNA 클론을 얻을 수 있다. 필요에 따라, cDNA 클론을 PCR법에 의해 증폭할 수도 있다. 이에 따라 목적으로 하는 유전자에 대응하는 cDNA를 얻을 수 있다. cDNA 클로닝 기술은, 예를 들면 문헌 [Sambrook, J. 및 Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17]에 기재되어 있다.

이어서, 상기한 방법 등으로 얻어진 cDNA 클론을 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터에 의해 형질 전환 또는 트랜스펙션된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양함으로써, 목적으로 하는 COTL1 단백질 등을 상기 세포로부터 얻을 수 있다. 이 때, 목적으로 하는 단백질 등을 배양 상청 중에서 얻는 경우에는, 그의 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 5' 말단에 분비 시그널 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹함으로써 세포 외에 성숙 폴리펩티드를 분비시킬 수 있다.

발현 벡터로서는, 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면 pET21a, pGEX4T, pC118, pC119, pC18, pC19 등), 고초균 유래의 플라스미드(예를 들면, pUB110, pTP5 등), 효모 유래의 플라스미드(예를 들면, YEp13, YEp24, YCp50 등) 등을 들 수 있으며, 파지 DNA로서는 λ 파지(λgt11,λ ZAP 등)를 들 수 있다. 또한, 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 바큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스 벡터를 사용할 수도 있다. 벡터 및 발현계는, 노바젠(Novagen)사, 다까라 슈조, 다이이찌 가가꾸 야꾸힌, 퀴아젠(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene)사, 프로메가(Promega)사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics)사, 인비트로젠사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사, GE 헬스 케어사 등으로부터 입수 가능하다.

발현 벡터에 COTL1 단백질 등의 cDNA를 삽입하기 위해서는, 우선 정제된 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하고, 적당한 제한 효소 부위 또는 멀티 클로닝 사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법 등이 채용된다. 벡터에는, 상기 단백질을 코드하는 DNA 이외에, 조절 엘리먼트, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커 등을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해 표지 펩티드를 폴리펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 부착한 융합 폴리펩티드로 할 수도 있다. 대표적인 표지 펩티드에는, 6 내지 10 잔기의 히스티딘 리피트, FLAG, myc 펩티드, GFP 단백질 등을 들 수 있지만, 표지 펩티드는 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, DNA 재조합 기술에 대해서는, 문헌 [Sambrook, J.& Russel, D.(상기])에 기재되어 있다. DNA 단편과 벡터 단편을 연결시키기 위해서는, 공지된 DNA 리가아제를 사용한다.

숙주 세포로서는, 세균 등의 원핵 세포(예를 들면, 에쉐리키아ㆍ콜라이: Escherichia coli 등의 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 고초균), 효모(예를 들면, 사카로마이세스ㆍ세레비시아에), 곤충 세포(예를 들면, Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면, COS, CHO, BHK) 등을 사용할 수 있다. 숙주 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법은, 각각의 숙주에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 세균에 상기 벡터를 도입하는 방법이면, 예를 들면 히트 쇼크법, 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기 천공법 등을 들 수 있다. 이들 기술은 모두 당해 분야에서 공지되어 있으며, 다양한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]을 참조하기 바란다. 또한, 동물 세포에 상기 벡터를 도입하는 방법이면, 예를 들면 리포펙틴법(문헌 [PNAS(1989) Vol.86, 6077), (PNAS (1987) Vol.84, 7413]), 전기 천공법, 인산칼슘법(문헌 [Virology(1973) Vol.52, 456-467]), 리포솜을 이용하는 방법, DEAE-덱스트란법 등이 바람직하게 이용된다.

대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 미생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 하나를 이용할 수도 있다. 배양은, 통상 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에 37 ℃에서 6 내지 24시간 동안 행한다. 배양 기간 중, pH는 중성 부근에 유지한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 이용하여 행한다. 배양 중에는 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 포유류 세포 등의 형질 전환체를 배양하는 경우에도, 각각의 세포에 적합한 배지 중에서 배양 후, 배양 상청 또는 세포 내에 생산된 단백질을 회수한다. 이 때 배지에는 혈청을 포함시킬 수도, 포함시키지 않을 수도 있지만, 무혈청 배지에서의 배양이 보다 바람직하다. COTL1 단백질 등이 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 단백질을 추출한다. 또한, COTL1 단백질 등이 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다.

표지 펩티드를 부착하지 않고 본 발명에 관한 단백질을 생산한 경우에는, 그의 정제법으로서 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피에 의한 방법을 들 수 있다. 또한, 그 이외에 겔 여과나 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등을 조합하는 방법일 수도 있다. 한편, 당해 단백질에 히스티딘 리피트, FLAG, myc, GFP와 같은 표지 펩티드를 부착하고 있는 경우에는, 일반적으로 이용되는 각각의 표지 펩티드에 적합한 어피니티-크로마토그래피에 의한 방법을 들 수 있다. 단리ㆍ정제가 용이한 발현 벡터를 구축하는 것이 바람직하다. 특히 폴리펩티드와 표지 펩티드와의 융합 단백질의 형태로 발현하도록 발현 벡터를 구축하고, 유전자 공학적으로 당해 단백질을 제조하면 단리ㆍ정제도 용이하다. COTL1 단백질 등이 얻어졌는지 아닌지는, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동 등에 의해 확인할 수 있다.

(1-2) 항체의 제작

이와 같이 하여 얻어진 COTL1 단백질 등을 항원으로서 COTL1 단백질 등을 특이적으로 인식하는 항체를 얻을 수 있다.

보다 구체적으로는, 단백질, 단백질 단편, 단백질 변이체, 융합 단백질 등은, 항체 형성을 인출하는 항원 결정기 또는 에피토프를 포함하지만, 이들 항원 결정기 또는 에피토프는 직쇄일 수도 있고, 보다 고차 구조(단속적)일 수도 있다. 또한, 상기 항원 결정기 또는 에피토프는, 당해 기술 분야에 알려진 모든 방법에 의해 동정할 수 있다.

본 발명의 단백질에 의해 모든 양태의 항체가 유도된다. 상기 단백질의 전부 또는 일부 또는 에피토프가 단리되어 있으면, 관용적 기술을 이용하여 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두 제조 가능하다. 방법에는, 예를 들면 문헌 [Kennet 등(감수), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Ple num Press, New York, 1980]에 예시된 방법이 있다.

(1-2-1) 폴리클로날 항체의 제작

폴리클로날 항체를 제작하기 위해, 우선 얻어진 COTL1 단백질 등을 완충액에 용해하여 면역원을 제조한다. 또한, 필요하면, 면역을 효과적으로 행하기 위해 아쥬반트를 첨가할 수도 있다. 아쥬반트의 예로서는, 시판된 완전 프로인트 아쥬반트(FCA), 불완전 프로인트 아쥬반트(FIA) 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

이어서, 상기 제조한 면역원을 포유 동물, 예를 들면 래트, 마우스(예를 들면 근교계 마우스의 Balb/c), 토끼 등에 투여하여, 면역한다. 면역원의 1회의 투여량은 면역 동물의 종류, 투여 경로 등에 따라 적절하게 결정되는 것이지만, 동물 1마리당 약 50 내지 200 μg으로 한다. 면역원의 투여 방법으로서는, 예를 들면 FIA 또는 FCA를 이용한 피하 주사, FIA를 이용한 복강 내 주사, 또는 0.15 mol/L 염화나트륨을 이용한 정맥 주사를 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 면역의 간격은 특별히 한정되지 않으며, 첫회 면역 후 수일 내지 수주 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회 추가 면역을 행한다. 첫회 면역 후, 면역 동물의 혈청 중의 항체가의 측정을 엘리사(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)법 등에 의해 반복하여 행하고, 항체가가플래토에 달했을 때에는, 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 주사하여, 최종 면역으로 한다. 면역 후에는, 혈액으로부터 COTL1 단백질 등에 대한 폴리클로날 항체를 회수할 수 있다. 모노클로날 항체가 필요한 경우에는, 후술의 항COTL1 항체 생산하이브리도마를 제작할 수 있다.

(1-2-2) 모노클로날 항체의 제작

면역 동물로부터의 항체 생산 세포의 회수

본 발명에 따르면, COTL1 단백질 등을 특이적으로 인식하는 항COTL1 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제작할 수 있다. 이러한 하이브리도마는 관용적 기술에 의해 생산하고, 동정하는 것이 가능하다. 이러한 하이브리도마를 생산하기 위한 하나의 방법은, 동물을 본 발명의 단백질로 면역하고, 면역된 동물로부터 항체 생산 세포를 채취하고, 이 항체 생산 세포를 골수종(미엘로마) 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하여, COTL1 단백질 등에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정할 수 있다. 항체 생산 세포로서는, 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 국소 림프절 세포가 바람직하다. 이들 세포는, COTL1 단백질 등으로 면역한 동물로부터 적출 또는 채취한 것을 이용할 수 있다. 동물에게 면역하는 방법은, 상기 폴리클로날 항체의 제작의 항목에 준한다. 항체 생산 세포와 융합시키는 골수종 세포주로서는, 마우스 등의 동물의 일반적으로 입수 가능한 주화 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포주로서는, 약제 선택성을 갖고, 미융합된 상태에서는 HAT 선택 배지(히포크산틴, 아미노프테린, 티민을 포함함)에서 생존할 수 없으며, 항체 생산 세포와 융합된 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 주화 세포는, 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체예로서는, BALB/c 마우스 유래의 히포크산틴ㆍ구아닌ㆍ포스포리보실ㆍ트랜스페라아제(HGPRT) 결손 세포주인 P3X63-Ag.8주(ATCC TIB9), P3X63-Ag.8.U1주(JCRB9085), P3/NSI/1-Ag4-1주(JCRB0009), P3x63Ag8.653주(JCRB0028) 또는 Sp2/0-Ag14주(JCRB0029) 등을 들 수 있다.

세포 융합

세포 융합은, 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서, 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 약 1:1 내지 20:1의 비율로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에 융합 반응을 행한다. 세포 융합 촉진제로서, 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 ％의 농도로 사용할 수 있다. 또한, 경우에 따라서는, 융합 효율을 높이기 위해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한, 전기 자극(예를 들면 전기 천공)을 사용한 시판된 세포 융합 장치를 이용하여 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 융합시킬 수도 있다(문헌 [Nature, 1977, Vol.266, 550-552]).

하이브리도마의 선별 및 클로닝

세포 융합 처리 후의 세포로부터 목적으로 하는 항COTL1 항체 등을 생산하는 하이브리도마를 선별한다. 그 방법으로서, 세포 현탁액을 예를 들면 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 위에 200만개/웰 정도 뿌리고, 각 웰에 선택 배지를 가하고, 이후 적당히 선택 배지를 교환하여 배양을 행한다. 배양 온도는 20 내지 40 ℃ , 바람직하게는 약 37 ℃이다. 미엘로마 세포가 HGPRT 결손주 또는 티미딘 키나아제 결손주의 것인 경우에는, 히포크산틴ㆍ아미노프테린ㆍ티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 사용함으로써, 항체 생산능을 갖는 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고, 증식시킬 수 있다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시 후, 약 14일 전후부터 생육하는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다.

이어서, 증식된 하이브리도마의 배양 상청 중에 목적으로 하는 항체가 존재하는지 아닌지를 스크리닝한다. 하이브리도마의 스크리닝은 통상의 방법에 따를 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 하이브리도마로서 생육한 웰에 포함되는 배양 상청의 일부를 채취하고, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA: Radio Immuno Assay) 등에 의해 행할 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법 등에 의해 행하여, 최종적으로 모노클로날 항체 생산 세포인 하이브리도마를 수립한다. 본 발명의 하이브리도마는, 후술하는 바와 같이 RPMI-1640, DMEM 등의 기본 배지 중에서의 배양에 있어서 안정적이며, 위암에서 유래하는 COTL1 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 생산, 분비하는 것이다.

항체의 회수

모노클로날 항체는, 관용적 기술에 의해 회수 가능하다. 즉, 수립한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상의 세포 배양법 또는 복수 형성법 등을 채용할 수 있다. 세포 배양법에 있어서는, 하이브리도마를 10 ％ 소 태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, MEM 배지 또는 무혈청 배지 등의 동물 세포 배양 배지 중에서 통상의 배양 조건(예를 들면 37 ℃, 5 ％ CO₂ 농도)으로 2 내지 10일간 배양하고, 그의 배양 상청으로부터 항체를 취득한다. 복수 형성법의 경우에는, 미엘로마 세포 유래의 포유 동물과 동종계 동물의 복강 내에 하이브리도마를 약 1000만개 투여하여, 하이브리도마를 대량으로 증식시킨다. 또한, 1 내지 2주일 후에 복수 또는 혈청을 채취한다.

상기 항체의 채취 방법에 있어서 항체의 정제가 필요로 되는 경우에는, 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티-크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 적절히 선택하거나, 또는 이들을 조합함으로써, 정제된 본 발명의 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체에는 키메라 항체, 예를 들면, 쥐 모노클로날 항체의 인간화형이 포함된다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 항체의 항원 결합 단편도 제공된다. 관용적 기술에 의해 생산 가능한 항원 결합 단편의 예에는 Fab 및 F(ab')₂ 단편이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 유전자 공학 기술에 의해 생산 가능한 항체 단편 및 유도체도 제공된다. 본 발명의 항체는, 시험관 내 및 생체 내 중 어느 것에 있어서도, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 (폴리)펩티드 단편의 존재를 검출하기 위한 어세이에 사용 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는, 면역 어피니티-크로마토그래피에 의해 단백질 또는 단백질 단편을 정제하는 것에도 사용할 수 있다.

어세이에 있어서의 특이적 검출을 가능하게 하기 위해 모노클로날 항체의 사용이 바람직하지만, 폴리클로날 항체여도 정제 폴리펩티드를 결합한 어피니티-칼럼에 항체를 결합시키는 것을 포함하는, 소위 흡수법에 의해 특이 항체를 얻을 수 있다.

(2) 항COTL1 항체 등을 사용한 본 발명의 위암 검출용 마커의 시험관 내 측정

상기 (1)에서 제작한 항COTL1 항체 등을 이용한 피검자 유래의 체액 중에 존재하는 본 발명의 위암 검출용 마커, 즉 COTL1 단백질 등의 양을 시험관 내에서 측정하는 방법(면역학적 측정법)으로서는, 예를 들면 효소 면역 측정법(ELISA, EIA), 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역 비탁법, 라텍스 응집 반응, 라텍스 비탁법, 적혈구 응집 반응, 입자 응집 반응 또는 웨스턴 블롯법을 들 수 있다.

본 발명의 위암 검출용 마커 측정 방법을 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법 또는 발광 면역 측정법 등의 표지를 이용한 면역 측정법에 의해 실시하는 경우에는, 상기 항COTL1 항체 등을 고상화하거나, 또는 시료 중의 성분을 고상화하여 이들의 면역학적 반응을 행하는 것이 바람직하다. 고상 담체로서는, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 라텍스, 젤라틴, 아가로스, 셀룰로오스, 세파로스, 유리, 금속, 세라믹 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 비드, 마이크로 플레이트, 시험관, 스틱 또는 시험편 등의 형상의 불용성 담체를 사용할 수 있다. 고상화는, 고상 담체와 상기 항COTL1 항체 등 또는 시료 성분을 물리적 흡착법, 화학적 결합법 또는 이들의 병용 등의 공지된 방법에 따라 결합시킴으로써 행할 수 있다.

본 발명에서는, 상기 항COTL1 항체 등과 체액 중의 위암 세포에서 유래하는 본 발명의 위암 검출용 마커와의 반응을 용이하게 검출하기 위해, 상기 항COTL1 항체 등을 표지함으로써 상기 반응을 직접 검출하거나, 또는 표지 이차 항체를 사용함으로써 간접적으로 검출한다. 본 발명의 위암 검출 방법에 있어서는, 감도의 면에서 후자의 간접적 검출(예를 들면 샌드위치법 등)을 이용하는 것이 바람직하다.

표지 물질로서는, 효소 면역 측정법의 경우에는 퍼옥시다아제(POD), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스옥시다아제, 락트산 탈수소 효소, 아미제 또는 비오틴-아비딘 복합체 등을, 형광 면역 측정법의 경우에는 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다민이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트, 알렉사 또는 알렉사 플루오로 등을, 방사 면역 측정법의 경우에는 트리튬, 요오드 125 또는 요오드 131 등을 사용할 수 있다. 또한, 발광 면역 측정법은, NADH-, FMNH2-, 루시페라아제계, 루미놀-과산화수소-POD계, 아크리디늄 에스테르계 또는 디옥세탄 화합물계 등을 사용할 수 있다.

표지 물질과 항체와의 결합법은, 효소 면역 측정법의 경우에는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법 또는 과요오드산법 등의 공지된 방법을, 방사 면역 측정법의 경우에는 클로라민 T법, 볼턴-헌터법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 측정의 조작법은, 공지된 방법(문헌 [Current protocols in Protein Sciences, 1995년, John Wiley & Sons Inc., Current protocols in Immunology, 2001년, John Wiley & Sons Inc.])에 의해 행할 수 있다.

예를 들면, 상기 항COTL1 항체 등을 직접 표지한 경우에는, 체액 중의 성분을 고상화하고, 표지한 상기 항COTL1 항체 등과 접촉시켜, 본 발명의 위암 검출용 마커(COTL1 단백질 등)-항COTL1 항체 등의 복합체를 형성시킨다. 또한, 미결합된 표지 항체를 세정 분리하여, 결합 표지 항체량 또는 미결합 표지 항체량으로부터 체액 중의 위암 검출용 마커(COTL1 단백질 등)의 양을 측정할 수 있다.

또한, 예를 들면, 표지 이차 항체를 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체와 시료를 반응시키고(일차 반응), 나아가 표지 이차 항체를 반응시킨다(이차 반응). 일차 반응과 이차 반응은 반대의 순서로 행할 수도 있고, 동시에 행할 수도 있고, 또는 시간을 어긋나게 하여 행할 수도 있다. 일차 반응 및 이차 반응에 의해, 고상화한 본 발명의 위암 검출용 마커-항COTL1 항체 등-표지 이차 항체의 복합체, 또는 고상화한 항COTL1 항체 등-본 발명의 위암 검출용 마커-표지 이차 항체의 복합체가 형성된다. 또한, 미결합된 표지 이차 항체를 세정 분리하여, 결합 표지 이차 항체량 또는 미결합 표지 이차 항체량으로부터 시료 중의 위암 검출용 마커의 질량을 측정할 수 있다.

구체적으로는, 효소 면역 측정법의 경우에는 표지 효소에 그의 최적 조건하에 기질을 반응시키고, 그 반응 생성물의 양을 광학적 방법 등에 의해 측정한다. 형광 면역 측정법의 경우에는 형광 물질 표지에 의한 형광 강도를, 방사 면역 측정법의 경우에는 방사성 물질 표지에 의한 방사능량을 측정한다. 발광 면역 측정법의 경우는 발광 반응계에 의한 발광량을 측정한다.

본 발명의 방법에서는, 면역 비탁법, 라텍스 응집 반응, 라텍스 비탁법, 적혈구 응집 반응 또는 입자 응집 반응 등의 면역 복합체 응집물의 생성을, 그의 투과광이나 산란광을 광학적 방법에 의해 측정하거나, 육안적으로 측정하는 측정법에 의해 실시하는 경우에는, 용매로서 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액 또는 굿 완충액 등을 사용할 수 있으며, 나아가 폴리에틸렌글리콜 등의 반응 촉진제나 비특이적 반응 억제제를 반응계에 포함시킬 수도 있다.

본 발명의 검출법의 바람직한 실시 형태의 일례를 나타낸다. 우선, 본 발명의 항체를 일차 항체로서 불용성 담체에 고정한다. 또한, 바람직하게는, 항원이 흡착되지 않은 고상 표면을, 항원과는 무관계한 단백질(송아지 혈청, 소 혈청 알부민, 젤라틴 등)에 의해 블록킹한다. 이어서, 고정화된 일차 항체와 피검 시료를 접촉시킨다. 이어서, 상기 일차 항체와 상이한 부위에서 본 발명의 위암 검출용 마커와 반응하는 표지 이차 항체를 접촉시키고, 상기 표지로부터의 신호를 검출한다. 여기서 이용하는 「일차 항체와 상이한 부위에서 위암 검출용 마커와 반응하는 이차 항체」는, 일차 항체와 위암 검출용 마커(COTL1 단백질 등)의 결합 부위 이외의 부위를 인식하는 항체이면 특별히 제한은 없으며, 면역원의 종류를 막론하고 폴리클로날 항체, 항혈청, 모노클로날 항체 중 어느 하나일 수도 있고, 이들 항체의 단편(Fab, F(ab')₂, Fab, Fv, ScFv 등)을 사용할 수도 있다. 또한, 이차 항체로서 복수종의 모노클로날 항체를 사용할 수도 있다.

또한, 이것과는 반대로, 본 발명의 항체에 표지를 부착하여 이차 항체로 하고, 본 발명의 항체와 상이한 부위에서, 위암 검출용 마커와 반응하는 항체를 일차항체로서 불용성 담체에 고정하고, 이 고정화된 일차 항체와 피검 시료를 접촉시키고, 이어서 이차 항체로서 표지를 부착한 본 발명의 항체를 접촉시켜, 상기 표지로부터의 신호를 검출할 수도 있다.

또한, 본 발명의 항체는 상술한 바와 같이, 위암 세포에서 유래하는 위암 검출용 마커와 특이적으로 반응하기 때문에, 암의 검출약으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 검출약은, 본 발명의 항체를 포함하는 것이며, 따라서 본 발명의 검출약을 사용하여, 위암으로의 이환이 의심되는 개체로부터 채취한 시료 중에 포함되는 위암 세포에서 유래하는 위암 검출용 마커를 검출함으로써, 상기 개체의 위암의 이환을 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 검출약은, 면역학적 측정을 행하기 위한 수단이면 어떠한 수단에서도 이용할 수 있지만, 당 기술 분야에서 공지된 면역 크로마토용 테스트 스트립 등의 간편한 수단과 조합하여 사용함으로써, 간편하면서도 신속히 암을 검출할 수 있다. 면역 크로마토용 테스트 스트립이란, 예를 들면 시료를 흡수하기 쉬운 재료로 이루어지는 시료 수용부, 본 발명의 검출약을 함유하는 시약부, 시료와 검출약과의 반응물이 이동하는 전개부, 전개된 반응물을 정색(呈色)하는 표지부, 정색된 반응물이 전개되는 제시부 등으로 구성되는 것이며, 임신 진단약과 동일한 형태로 할 수 있다. 우선, 시료 수용부에 시료를 부여하면, 시료 수용부는 시료를 흡수하여 시료를 시약부까지 도달시킨다. 이어서, 시약부에서 시료 중의 위암 세포 유래의 위암 검출용 마커와 항COTL1 항체 등과의 반응이 발생하고, 반응한 복합체가 전개부를 이동하여 표지부에 도달한다. 표지부에서는, 상기 반응 복합체와 표지 이차 항체와의 반응이 발생하고, 그의 표지 이차 항체와의 반응물이 제시부까지 전개되면 정색이 인정되게 된다. 상기 면역 크로마토용 테스트 스트립은, 사용자에 대하여 고통이나 시약 사용에 의한 위험성을 일체 주지 않는 것이기 때문에, 가정에서의 모니터에 사용할 수 있고, 그 결과를 각 의료 기관 레벨로 정밀히 조사ㆍ치료(외과적 절제 등)하여, 전이ㆍ재발 예방으로 연결시키는 것이 가능해진다. 또한, 현재 이 테스트 스트립은, 예를 들면 일본 특허 공개 (평)10-54830호 공보에 기재된 바와 같은 제조 방법에 의해 염가로 대량 생산할 수 있는 것이다. 또한, 본 발명의 검출약과 기지된 위암의 종양 마커에 대한 검출약을 조합하여 사용함으로써, 더욱 신뢰성이 높은 진단이 가능해진다.

2-2. 이환 결정 공정

「이환 결정 공정」이란, 상기 위암 검출용 마커 측정 공정에서 측정된 단백질량에 기초하여 위암의 이환을 결정하는 공정이다. 측정된 위암 검출용 마커, 즉, COTL1 단백질 등의 질량에 기초하여 위암의 이환을 결정한다. 결정 방법의 일례로서, 예를 들면 피검체의 위암 검출용 마커의 양이 건상체의 그것과 비교하여 통계학적으로 유의하게 많을 때에 위암에 이환되어 있는 것으로 결정하는 방법을 들 수 있다.

여기서, 「건상체」란, 적어도 위암에 이환하지 않은 개체, 바람직하게는 건강한 개체를 말한다. 또한, 건상체는, 피검체와 동일한 생물종인 것을 요한다. 예를 들면, 검사에 사용하는 피검체가 인간(피검자)인 경우에는, 건상체도 인간(본 명세서에서는, 이후 「건상자」라 함)이어야만 한다. 건상체의 신체적 조건은, 피검체와 동일하거나 또는 근사한 것이 바람직하다. 신체적 조건이란, 예를 들면 인간의 경우이면 인종, 성별, 연령, 신장, 체중 등이 해당한다.

「통계학적으로 유의하다」란, 예를 들면 얻어진 값의 위험률(유의 수준)이 5 ％, 1 ％ 또는 0.1 ％보다 작은 경우를 들 수 있다. 그 때문에, 「통계학적으로 유의하게 많다」란, 피검체와 건상체 각각으로부터 얻어진 위암 검출용 마커의 양적 차이를 통계학적으로 처리했을 때에 양자간에 유의차가 있고, 피검체의 상기 단백질량이 건상체의 그것과 비교하여 많은 것을 말한다. 통상, 체액 중의 위암 검출용 마커의 양에 대하여 피검체가 건상체의 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 가장 바람직하게는 5배 이상 많은 경우가 해당한다. 양적 차이가 3배 이상이면 신뢰도는 높고, 통계학적으로도 유의하게 많다고 할 수 있다. 통계학적 처리의 검정 방법은, 유의성의 유무를 판단 가능한 공지된 검정 방법을 적절하게 이용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 스튜던트 t 검정법, 다중 비교 검정법을 이용할 수 있다.

건상체의 체액 중에서의 위암 검출용 마커의 양은, 상기 공정에서 설명한 피검체의 체액 중에서의 위암 검출용 마커의 양의 측정 방법과 동일한 방법으로 측정하는 것이 바람직하다. 건상체의 체액 중에서의 위암 검출용 마커의 양은, 피검체의 체액 중에서의 위암 검출용 마커의 양을 측정할 때마다 측정할 수도 있지만, 미리 측정해둔 위암 검출용 마커의 양을 이용할 수도 있다. 특히, 건상체의 다양한 신체적 조건에 있어서의 위암 검출용 마커 질량을 미리 측정해두고, 그 값을 컴퓨터에 입력하여 데이터 베이스화해두면, 피검체의 신체적 조건을 해당 컴퓨터에 입력함으로써, 그의 피검체와의 비교에 최적인 신체적 조건을 갖는 건상체의 위암 검출용 마커의 양을 바로 이용할 수 있기 때문에 편리하다.

피검체의 체액 중의 위암 검출용 마커의 양이 건상체의 체액 중의 위암 검출용 마커의 양보다도 통계학적으로 유의하게 많은 경우, 그의 피검체는 위암에 이환되어 있는 것으로 판정한다. 본 발명에서 대상이 되는 위암의 병기는 특별히 한정은 없으며, 조기 위암부터 말기 위암에 이른다. 특히, 조기 위암이어도 그의 검출이 가능하다는 점에서, 본 발명의 실익이 있다. 「조기 위암」이란, 종양이 발생한 국소(점막 내)에 국한되어 있어, 주위 조직으로의 침윤이 없는 것, 또는 침윤이 있어도 그의 범위가 국소에 국한되어 있는 것을 말한다. 조기 위암은, 스테이지 분류의 스테이지 0과 스테이지 I을 포함한다. 위암의 조기 검출은, 5년 생존율을 현저히 향상시킨다.

이와 같이, 본 발명의 위암의 검출 방법에 따르면, 체액 시료 중의 위암 검출용 마커를 항체를 이용하여 면역학적으로 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 피검체가 위암에 이환되어 있는지 아닌지를 판정할 수 있을 뿐만 아니라, 위암 환자와 비위암 환자의 식별을 가능하게 한다.

3. 위암 검출용 키트

본 발명의 제3 양태는, 위암 검출 키트이다.

「위암 검출용 키트」란, 위암의 이환 유무, 이환의 정도 또는 개선의 유무나 개선의 정도를 검출하기 위해, 또한 위암의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 후보 물질을 스크리닝하기 위해 직접 또는 간접적으로 이용되는 것을 말한다.

본 양태의 키트는, 그의 구성물로서 위암의 이환에 관련하여 체액 시료 중 특히 혈액, 혈청, 혈장에 있어서 발현이 변동되는 COTL1 단백질, 바람직하게는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 그의 변이체 서열을 갖는 단백질을 특이적으로 인식하고, 결합 가능한 물질이 포함된다. 구체적으로는, 예를 들면 항COTL1 단백질 항체 등 또는 그의 단편 또는 이들의 화학 수식 유도체가 포함된다. 이들 항체는, 고상 담체에 결합되어 있을 수도 있다. 그 이외에, 예를 들면 표지 이차 항체, 나아가서는 표지의 검출에 필요한 기질, 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액, 정제된 표준 물질로서의 COTL1 단백질 등, 사용 설명서 등을 포함하고 있을 수도 있다.

[실시예]

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은, 이 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

<참고예>

(1) 중공사 필터의 제작

분획 분자량 약 5만의 공경을 막 표면에 갖는 폴리술폰 중공사를 100개를 묶고, 중공사 중공부를 폐색하지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관에 고정하여, 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈(모듈 A)은 혈청 또는 혈장 중의 고분자량 단백질의 제거에 사용되며, 그의 직경은 약 7 mm, 길이는 약 17 cm이다. 마찬가지로 저분자량 단백질의 농축에 사용되는 미니 모듈(모듈 B)을 분획 분자량 약 3000의 공경의 막을 사용하여 제조하였다. 미니 모듈은 한쪽 끝에 중공사 내강에 연결하는 입구가 있으며, 반대측의 끝은 출구가 된다. 중공사 입구와 출구는 실리콘 튜브에 의한 폐쇄 순환계 유로이며, 이 유로 내를 액체가 페리스타 펌프에 구동되어 순환한다. 또한, 중공사 외투의 유리관에는 중공사로부터 누출된 액체를 배출하는 포트를 구비하여, 1개 모듈 세트가 구성된다. 유로도 중에 T자의 커넥터에 의해 모듈을 연결하고, 모듈 A 3개와, 모듈 B 1개를 탠덤에 연결하여 하나의 중공사 필터로 하였다. 이 중공사 필터를 증류수로 세정하고, PBS(0.15 mM NaCl을 포함하는 인산 완충액, pH 7.4) 수용액을 충전하였다. 분획 원료의 혈청 또는 혈장은 상기 중공사 필터의 유로 입구로부터 주입되고, 분획ㆍ농축 후에 유로 출구로부터 배출된다. 상기 중공사 필터에 주입된 혈청 또는 혈장은, 모듈 A마다 분자량 약 5만에 분자체가 작용하고, 분자량 5만보다도 저분자인 성분은 모듈 B에서 농축되어, 제조되도록 되어 있다.

<실시예 1>

(1) 건상자 및 위암 환자 혈액의 단백질 동정

50 내지 70세대의 위암 환자 6명으로부터 얻은 혈청의 혼합액, 및 동년대의 건상자 6명으로부터 얻은 혈청의 혼합액을 제조하였다. 각 혼합액을 기공 크기 0.22 ㎛의 필터로 여과하여 협잡 물질을 제거하고, 단백질 농도 50 mg/mL가 되도록 제조하였다. 이 혈장을 25 mM 중탄산암모늄 용액(pH 8.0) 12.5 mg/mL에 희석하고, 참고예 (1)에 나타낸 중공사 필터에 의해 분자량에 의한 분획을 행하였다. 분획 후의 혈청 샘플(전량 1.8 mL, 최대 250 μg의 단백질을 포함함)을 동결 건조한 후, 100 μL의 25 mM 중탄산암모늄 용액(pH 8.0)에 재용해하였다. 이 샘플에 대하여, 총 단백질의 50분의 1 양의 트립신으로 37 ℃에서 2 내지 3시간의 조건으로 펩티드소화를 행하고, 탈염 칼럼(워터스(Waters)사)에 의한 탈염 처리를 행한 후, 이온 교환 칼럼(KYA 테크놀로지스)에 의해 8 분획화하였다. 이 각각의 분획을 역상 칼럼(KYA 테크놀로지스)으로 더 분획하고, 용출된 펩티드에 대하여 온라인으로 연결된 질량 분석계 Q-TOF 울티마(Ultima)(마이크로매스(Micromass)사)를 사용하여 서베이 스캔 모드로 3회 측정하였다.

혈액 단백질을 동정하는 기준으로서, (i) 그의 단백질에 속하는 펩티드 중, 적어도 1개 이상이 P값 0.05 이하의 높은 신뢰성으로 검출되어 있는 것, (ii) 펩티드의 MS 데이터의 측정값 및 MS/MS 데이터의 측정값과, 펩티드의 이론값와의 오차가 0.3 달톤 이하인 것이라는 2개의 기준을 이용하여, 잘못된 단백질 동정을 최대한 배제할 수 있는 조건에서의 해석을 행하였다.

이 데이터를 건상자와 암 환자 사이에서 비교하여, 동정된 단백질 중 3회의 위암 환자의 샘플 측정의 마스코트(MASCOT) 스코어의 평균이 건상자 샘플의 평균과 비교하여 유의하게 높은 단백질로서 COTL1 단백질을 발견하였다(표 1).

(2) 웨스턴 블롯법에 의한 혈액 중의 COTL1 단백질의 검출

위암 환자 16명(스테이지 I: 7명, 스테이지 III: 5명, 스테이지 IV: 4명) 및 건상 대조 12명으로부터 혈장 샘플을 얻었다. 각 샘플 100 μL에 대하여 100 μL의 아피겔 블루(Bio-Rad)와 50 μL의 프로테인 A-세파로스(GE 헬스 케어)를 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 반응시켜, 샘플 중의 알부민 및 면역 글로불린을 제거하였다. 이와 같이 하여 얻어진 샘플을 SDS 샘플 버퍼(50 mM 트리스 염산, pH 6.8, 1 mM DTT, 5 ％ SDS, 10 ％ 글리세롤)로 가용화 및 비등 처리를 행하여, SDS-폴리아크릴아미드겔(16 ％) 전기 영동에 가한 후, 단백질을 PVDF막으로 옮겼다. 이것을 토끼 폴리클로날 항체(프로테인테크 그룹(Proteintech Group)사), 이어서 퍼옥시다아제 표지 2차 항체와 반응시켰다. 면역 반응하는 단백질을 Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(피어스(Pierce)사)를 사용하여 X선 필름에 감광시켜 가시화하고, COTL1에 상당하는 밴드의 시그널 강도를 사이언 이미지(Scion Image)(사이언 코포레이션(Scion Corporation))을 사용하여 화상 해석에 의해 수치화하였다. 그 결과, 조기 및 진행성 위암 환자에 있어서, 건상 대조자와 비교하여 높은 값의 혈장 중 COTL1 단백질 농도가 검출되었다(도 1).

<비교예 1>

(1) 위암 검출에서의 CEA 및 CA19-9와의 성능 비교

비교 대상의 종양 마커로서, CEA, 및 CE19-9를 선택하였다. CEA(암 태아성 항원)은, 임상적으로 가장 광범위하면서도 빈번히 이용되고 있는 종양 마커 중 1종이며, 위암 이외에도 폐암, 유방암, 담도암, 췌장암, 대장암 등의 검출에 사용되고 있다. 한편, CA19-9는, 주로 위암, 대장암 및 췌장암이나 담낭ㆍ담관암의 진행예에서 높은 양성율을 나타낸다는 것이 알려져 있다. 그러나, 양 마커 모두 감수성이 낮아 조기 암의 검출에는 적합하지 않다.

위암 환자 혈장 및 건상 대조 중의 CEA 레벨을 CagAg CEA EIA 키트(후지 레비오사)를 사용하여 측정하였다(도 2A). CEA는, 스테이지 IV에서만 높은 값을 나타내고 있어, 조기 위암은 검출할 수 없었다.

CA19-9 레벨(도 2B)은, CagAg CA19-9 EIA 키트(후지 레비오사)를 사용하여 측정하였다. CA19-9는, 스테이지 III 및 스테이지 VI에서 특히 높은 값을 나타내는 샘플이 존재하지만, 조기 위암은 검출할 수 없었다.

이상의 결과로부터, 본 발명은, 조기 위암을 검출하는 데에 있어서 매우 우수한 방법이라는 것이 입증되었다.

본 발명에 따르면, 간이하면서도 염가의 방법으로 위암을 효과적으로 검출할 수 있기 때문에, 위암의 조기 발견, 진단 및 치료가 가능해진다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 환자 혈액을 이용하여 위암을 비침습적으로 검출할 수 있기 때문에, 위암을 간편하면서도 신속히 검출하는 것이 가능해진다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입한 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. Kyoto University <120> detection marker for gastric cancer and method for detection of gastric cancer <130> PH-4711-PCT <150> JP 2010-046613 <151> 2010-03-03 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Lys Ile Asp Lys Glu Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Leu 1 5 10 15 Val Arg Asp Asp Gly Ser Ala Val Ile Trp Val Thr Phe Lys Tyr Asp 20 25 30 Gly Ser Thr Ile Val Pro Gly Glu Gln Gly Ala Glu Tyr Gln His Phe 35 40 45 Ile Gln Gln Cys Thr Asp Asp Val Arg Leu Phe Ala Phe Val Arg Phe 50 55 60 Thr Thr Gly Asp Ala Met Ser Lys Arg Ser Lys Phe Ala Leu Ile Thr 65 70 75 80 Trp Ile Gly Glu Asn Val Ser Gly Leu Gln Arg Ala Lys Thr Gly Thr 85 90 95 Asp Lys Thr Leu Val Lys Glu Val Val Gln Asn Phe Ala Lys Glu Phe 100 105 110 Val Ile Ser Asp Arg Lys Glu Leu Glu Glu Asp Phe Ile Lys Ser Glu 115 120 125 Leu Lys Lys Ala Gly Gly Ala Asn Tyr Asp Ala Gln Thr Glu 130 135 140

Claims (9)

1. 피검체 유래의 체액 중에 존재하는 COTL1 단백질, 그의 변이체 및/또는 이들의 단편으로 이루어지는 위암 검출용 마커의 양을 시험관 내에서 측정하고, 그 양에 기초하여 위암의 이환을 결정하는 위암 검출 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 COTL1 단백질이 서열 번호 1로 표시되는 폴리펩티드인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피검체의 상기 위암 검출용 마커의 양이 건상체의 그것과 비교하여 통계학적으로 유의하게 많을 때에 위암에 이환되어 있는 것으로 결정하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 통계학적으로 유의하게 많은 양이 건상체의 2배 이상인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 상기 위암 검출용 마커와 특이적으로 결합 가능한 물질을 사용하는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 결합 가능한 물질이 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체 및/또는 이들의 단편인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위암이 조기 위암인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액 시료가 혈액 또는 뇨인 방법.
9. 항COTL1 항체, 항COTL1 변이체 항체, 이들의 단편 및/또는 이들의 화학 수식 유도체를 포함하는 위암 검출용 키트.

Images