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KR20120133403A - 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체 - Google Patents

증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체 Download PDF

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KR20120133403A
KR20120133403A KR1020127027998A KR20127027998A KR20120133403A KR 20120133403 A KR20120133403 A KR 20120133403A KR 1020127027998 A KR1020127027998 A KR 1020127027998A KR 20127027998 A KR20127027998 A KR 20127027998A KR 20120133403 A KR20120133403 A KR 20120133403A
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KR
South Korea
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drug
ser
seq
gly
leu
Prior art date
Application number
KR1020127027998A
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English (en)
Inventor
루시 제이. 홀트
이안 엠. 톰린슨
Original Assignee
도만티스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도만티스 리미티드 filed Critical 도만티스 리미티드
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Abstract

약물 조합체, 융합체, 및 컨쥬게이트가 제공된다. 약물 융합체 및 컨쥬게이트는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 융합되거나 컨쥬게이션된 치료 또는 진단 제제를 함유한다. 약물 조성물, 융합체, 및 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않거나 융합되지 않은 치료 또는 진단 제제와 비교하여 보다 긴 생체내 반감기를 가진다.

Description

증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체 {BISPECIFIC FUSION ANTIBODIES WITH ENHANCED SERUM HALF-LIFE}
본 출원은 2004년 12월 2일에 출원된 미국 가특허출원 제60/632,361호 및 2004년 6월 1일에 출원된 미국 가특허출원 제60/576,271호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 본원에 참조로 통합된다.
치료 및/또는 진단 목적으로 유용할 수 있는 활성을 가지는 많은 약물들이 제한된 가치를 가지는데 이는 이들이 투여되었을 때에 신체로부터 빠르게 제거되기 때문이다. 예를 들어, 치료적으로 유용한 활성을 가지는 많은 폴리펩티드는 신장을 통한 순환으로부터 빠르게 제거된다. 이에 따라 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해서는 많은 용량이 투여되어야 한다. 개선된 약동학적 특성을 가지는 개선된 치료 및 진단 제제에 대한 필요가 존재한다. 혈청 알부민에 결합하는 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. (예를 들어 문헌[EP 0486525 B1 (Cemu Bioteknik AB); US 6,267,964 B1 (Nygren et al.); WO 04/001064 A2 (Dyax, Corp.); WO 02/076489 A1 (Dyax, Corp.); WO 01/45746 (Genentech, Inc.)] 참조).
발명의 요약
본 발명은 개선된 혈청 반감기를 가지는 약물(Drug) 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명은 하기의 화학식을 가지는 연속적인 폴리펩티드 사슬인 약물 융합체이다:
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d 또는 a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d,
상기 식에서,
X는 제 1 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 약물이고,
Y는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이며,
Z는 제 2 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 약물이고,
a, b, c, 및 d는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 1개 내지 약 100개 아미노산 잔기이고,
n1은 1 내지 약 10이며,
n2는 1 내지 약 10이고,
n3는 0 내지 약 10이며,
다만, n1 및 n2 둘 모두가 1이고 n3가 0인 경우에, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, Y는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, X는 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체이다.
다른 측면에서, 약물 융합체는 연속적인 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 연속적인 폴리펩티드 사슬은 잔기 X' 및 Y'를 포함하며,
여기서, X'는 폴리펩티드 약물이며 다만 이는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않고,
Y'는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이다. 일부 구체예에서, Y'는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, X'는 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 VH 및 VL에 공유결합에 의해 결합된 약물을 포함하는 약물 컨쥬게이트이다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 약물은 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 상기 VH 및 VL에 비공유결합에 의해 결합된 약물을 포함하는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트이다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 약물 융합체를 엔코딩하는 재조합 핵산 및 작제물, 및 재조합 핵산 및/또는 작제물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로 상기 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에 본원에 기술된 약물 융합체를 엔코딩하는 제조합 핵산 및/또는 작제물을 포함하는 숙주 세포를 유지하고, 이로써 약물 융합체를 생성하는 것을 포함하는 약물 융합체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약물 조합체(예, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 조성물(예, 약제 조성물)을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 것들과 같은 질병 또는 질환을 가지는 개체를 치료하기 위한, 치료적 유효량의 본 발명의 약물 조합체(예, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 질병 또는 질환은 관절염(예, 류마티즘성 관절염)과 같은 염증성 질환이다. 본 발명은 또한 약제 조성물(예, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 염증성 질병(예, 관절염(예, 류마티즘성 관절염))과 같은 질병 또는 질환의 치료를 위한 약제 제조용 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 치료, 진단 또는 예방을 위한 본원에 기술된 바와 같은 약물 조합체(예, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)에 관한 것이다.
도 1A는 마우스 혈청 알부민(MSA)에 결합함에 의해 선택된 3개의 Vκs의 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 아미노산 서열은, Vκs 지정된 MSA16(DOM7m-16(서열번호:1)로서도 언급), MSA12(DOM7m-12(서열번호:2)로도 언급), MSA26(DOM7m-26(서열번호:3)으로서도 언급)의 것이다.
도 1B는 래트 혈청 알부민(RSA)에 결합함에 의해 선택된 6개의 Vκ의 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 아미노산 서열은 Vκ 지정된 DOM7r-1(서열번호:4), DOM7r-3(서열번호:5), DOM7r-4(서열번호:6), DOM7r-5(서열번호:7), DOM7r-7(서열번호:8), 및 DOM7r-8(서열번호:9)의 것이다.
도 1C는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합함에 의해 선택된 6개의 Vκ의 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 아미노산 서열은 Vκ 지정된 DOM7h-2(서열번호:10), DOM7h-3(서열번호:11), DOM7h-4(서열번호:12), DOM7h-6(서열번호:13), DOM7h-1(서열번호:14), 및 DOM7h-7(서열번호:15)의 것이다.
도 1D는 인간 혈청 알부민 및 컨센서스(consensus) 서열(서열번호:23)에 결합함에 의해 선택된 7개의 VΗ의 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 서열은 VΗ 지정된 DOM7h-22(서열번호:16), DOM7h-23(서열번호:17), DOM7h-24(서열번호:18), DOM7h-25(서열번호:19), DOM7h-26(서열번호:20), DOM7h-21(서열번호:21), 및 DOM7h-27(서열번호:22)의 것이다.
도 1E는 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 결합함에 의해 선택된 3개의 Vκ의 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 아미노산 서열은 Vκ 지정된 DOM7h-8(서열번호:24), DOM7r-13(서열번호:25), 및 DOM7r-14(서열번호:26)의 것이다.
도 2A 및 2B는 각각 MSA16IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra로도 언급됨) 및 IL-1raMSA16(IL-1ra/DOM7m-16으로도 언급됨) 융합체를 발현하는데 사용되는 벡터의 개괄적인 지도이다.
도 2C 내지 2D는 IL-1raMSA16 융합체(IL-1ra/DOM7m-16으로도 언급됨)를 엔코딩하는 누클레오티드 서열(서열번호:27) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:28)을 도시한다.
도 2E 내지 2F는 MSA16IL-1ra 융합체(DOM7m-16/IL-1ra로도 언급됨)를 엔코딩하는 누클레오티드 서열(서열번호:29) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:30)을 도시한다.
도 2G 내지 2H는 혈청 알부민에 결합하지 않는 더미(Dummy)IL-1ra 융합체를 엔코딩하는 누클레오티드 서열(서열번호:31) 및 융합체의 아미노산 서열(서열번호:32)를 도시한다.
도 3A는 IL-1이 HeLa 세포에 의해 IL-8의 생성을 유도하는 것을 보여주고, IL-8이 ELISA 검정에서 검출되는 기전을 보여주는 도면이다.
도 3B는 IL-1ra(●, "R＆D"라고 표지됨), MSA16IL-1ra(■), 및 IL-1raMSA16(△) 각각이 배양된 MRC-5 세포에 의해 IL-8의 IL-1 유도된 분비를 억제하는 것을 도시하는 그래프이다. 관찰된 억제는 IL-1ra, MSA16IL-1ra, 및 IL-1raMSA16에 대해 용량-의존적이었다.
도 4A 내지 4C는 IL-1ra(◆) 및 MSA16IL-1ra(■) 둘 모두가 0% 마우스 혈청 알부민(4A), 5% 마우스 혈청 알부민(4B) 또는 10% 마우스 혈청 알부민(4C)를 포하하는 검정에서 배양된 MRC-5 세포에 의해 IL-8의 IL-1 유도된 분비를 억제하는 것을 도시하는 그래프이다. 관찰된 억제는 시험된 모든 조건에서 IL-1ra 및 MSA16IL-1ra에 대해 용량-의존적이었다.
도 5는 MSA16IL1-ra 융합체 및 IL-1raMSA16 융합체 둘 모두가 혈청 알부민에 결합하였으나 더미IL1-ra 융합체는 결합하지 않았다는 것을 증명하는 ELISA 결과에 대한 개략적인 도면이다.
도 6A 내지 6F는 인간 혈청 알부민(HSA)과의 클론 DOM7h-1 결합에 대한 바이어코어(BIACORE) 친화도(6A 및 6B), HSA과의 DOM7h-7 결합에 대한 바이어코어 친화도(6C 및 6D), 및 래트 혈청 알부민(RSA)과의 DOM7r-1 결합에 대한 바이어코어 친화도(6E 및 6F)를 도시하는 센소그램 및 표를 도시한다.
도 7은 DOM7h-1, DOM7r-1, DOM7h-2, DOM7r-3, DOM7h-7, DOM7h-8, DOM7r-8, DOM7r-13, DOM7r-14, DOM7m-16, DOM7h-22, DOM7h-23, DOM7h-26, DOM7r-16, DOM7m-26, DOM7r-27 및 DOM7R-31의 이들이 결합하는 혈청 알부민에 대한 친화도를 도시하는 표이다. DOM7h-8 또한 60nM의 친화도(KD)로 돼지 혈청 알부민에 결합한다.
도 8A는 수탁 번호 NM_173842로 진뱅크에 기탁된 인간 인터루킨 1 수용체 길항제(IL-1ra)를 엔코딩하는 핵산의 누클레오티드 서열(서열번호:33)을 도시한다.
도 8B는 도 8A에 도시된 핵산에 의해 엔코딩된 인간 IL-1ra(서열번호:34)의아미노산 서열을 도시한다. 성숙 단백질은 152개 아미노산 잔기로 구성된다(서열번호:34의 아미노산 잔기 26번 내지 177번).
도 9는 시간(일)에 따라 CD1 스트레인 수컷 동물에 1회 정맥내(i.v.) 주사(용량은 약 1㎎/㎏임) 후에 마우스 혈청에서 MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질의 농도(㎍/㎖)을 도시하는 그래프이다. 혈청 농도는 염소 항-HA(Abcam, UK) 캡쳐 및 단백질 L-HRP(인비트로겐, USA) 검출 시약을 사용하여 ELISA에 의해 측정한다. 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 시험 시료와 비교하기 위하여 1x 마우스 혈청의 존재하에 수립하였다. 1 컴파트먼트 모델를 이용한 모델링(WinNolin Software, Pharsight Corp., USA)은 MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질이 29.1 시간의 말기 상 t1/2 및 559 hr ㎍/㎖ 커브하의 면적을 가진다는 것을 도시한다.
도 10은 래트 혈청 알부민(RSA)에 결합함에 의해 선택된 Vκ의 아미노산 서열을 도시한다. 도시된 서열은 DOM7r-15(서열번호:37), DOM7r-16(서열번호:38), DOM7r-17(서열번호:39), DOM7r-18(서열번호:40), DOM7r-19(서열번호:41)로 지정된 Vκ의 것이다.
도 11A 내지 11D는 래트 혈청 알부민(RSA)에 결합하는 Vн의 아미노산 서열을 도시한다. 도시된 서열은 DOM7r-20(서열번호:42), DOM7r-21(서열번호:43), DOM7r-22(서열번호:44), DOM7r-23(서열번호:45), DOM7r-24(서열번호:46), DOM7r-25(서열번호:47), DOM7r-26(서열번호:48), DOM7r-27(서열번호:49), DOM7r-28(서열번호:50), DOM7r-29(서열번호:51), DOM7r-30(서열번호:52), DOM7r-31(서열번호:53), DOM7r-32(서열번호:54), 및 DOM7r-33(서열번호:55) 지정된 Vн의 것이다.
도 12는 시간에 따라 CD1 스트레인 수컷 동물에 1회 정맥내(i.v.) 주사(용량은 약 1.5㎎/kg임) 후에 마우스 혈청 중의, 각각이 HA 에피토프 태그를 함유하는 DOM7m-16, DOM7m-26 또는 MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb의 농도(% 초기 용량)을 도시하는 그래프이다. 혈청 농도는 염소 항-HA(Abcam, UK) 캡쳐 및 단백질 L-HRP(인비트로겐, USA) 검출 시약을 사용하여 ELISA에 의해 측정된다. 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 시험 시료와 비교를 위하여 1x 마우스 혈청의 존재하에 수립하였다. 1 컴파트먼트 모델을 사용한 모델링(WinNolin Software, Pharsight Corp., USA)은 대조군 dAb가 20분의 말기 상 t1/2β를 가지는 한편, DOM7m-16, DOM7m-26은 혈청에서 상당히 더 오랫동안 지속되었다.
도 13은 DOM7m-16/IL-1ra가 마우스 콜라겐-유도된 관절연(CIA) 모델에서 관절염을 치료하는데 IL-1ra 또는 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션)보다 더 효과적이었음을 보여주는 그래프이다. 관절염이 유도되고, 21일째에 시작하여, 마우스를 0.4㎎/㎏의 독사메타손(스테로이드), 1㎎/㎏(IL-1ra/항-SA 1㎎/㎏) 또는 10㎎/㎏(IL-1ra/항-SA 10㎎/㎏)의 DOM7m-16/IL-1ra, 1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏의 IL-1ra, 5㎎/㎏의 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션), 또는 염수로 처리하였다. 결과는 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra가 IL-1ra 또는 ENBREL®(엔타레셉트, 이뮤넥스 코포레이션) 보다 효과적이었음을 보여준다. IL-1ra에 대한 반응은 기대한 바와 같이 용량-의존적이고, DOM7m-16/IL-1ra에 대한 반응 또한 용량-의존적이었다. 1㎎/㎏의 DOM7m-16/IL-1ra 처리에 대한 평균 수치는 일관되게 10㎎/㎏의 IL-1ra 처리에 의해 얻어진 평균 수치보다 낮았다. 이 결과는 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra 처리가 IL-1ra 보다 10배 더 효과적이었다는 것을 나타낸다.
도 14A 내지 14G는 사포린 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다. 도 14A는 Swissprot 수탁 번호 P27559로서 기탁된 사포린-2 전구체의 아미노산 서열을 도시한다. 시그날 펩티드(서열번호:60)는 서열번호:60의 아미노산 1 내지 24번이다. 도 14B는 Swissprot 수탁 번호 P27560로서 기탁된 사포린-3의 아미노산 서열(서열번호:61)을 도시한다. 도 14C는 Swissprot 수탁 번호 P27561로서 기탁된 사포린-4 전구체의 아미노산 서열(서열번호:62)을 도시한다. 시그날 펩티드는 서열번호:62의 아미노산 1 내지 24번이다. 도 14D는 Swissprot 수탁 번호 Q41389로서 기탁된 사포린-5의 아미노산 서열(서열번호:63)를 도시한다. 도 14E는 Swissprot 수탁 번호 P20656으로 기탁된 사포린-6 전구체의 아미노산 서열(서열번호:64)를 도시한다. 시그날 펩티드는 서열번호:64의 아미노산 서열 1 내지 24번이고, 잠재적 프로펩티드는 서열번호:62의 아미노산 278 내지 299번이다. 도14F는 Swissprot 수탁 번호 Q41391로서 기탁된 사포린-7의 아미노산 서열(서열번호: 66)을 도시한다. 도 14G는 사포린-6의 여러 변이체 및 이소폼을 포함하는 컨센서스 아미노산 서열(서열번호:67)을 도시한다.
도 15는 WO 2004/041862에 개시된 마우스 혈청 알부민에 결합하는 수개의 카메리드(Camelid) Vнн의 아미노산 서열을 도시한다. 서열 A (서열번호:72), 서열 B (서열번호:73), 서열 C (서열번호:74), 서열 D (서열번호:75), 서열 E (서열번호:76), 서열 F (서열번호:77), 서열 G (서열번호:78), 서열 H (서열번호:79), 서열 I; (서열번호:80), 서열 J (서열번호:81), 서열 K (서열번호:82), 서열 L (서열번호:83), 서열 M (서열번호:84), 서열 N (서열번호:85), 서열 O (서열번호:86), 서열 P (서열번호:87), 서열 Q; (서열번호:88).
본 명세서에서, 구체예는 명료하고 간결한 명세서가 작성되는 방식으로 기재되었으나, 이는 구체예가 본 발명에서 이탈됨 없이 다양하게 조합되거나 분리될 수 있음을 의도한 것이고 이는 인정될 것이다.
본 발명의 구체예 중 임의의 하나와 동일한 구조식을 가지는 물질의 공지된 조성물은 그 자체로 명시적으로 권리가 부인된다. 대조적으로 신규한 물질을 위한 조성물, 공지된 조성물의 새로운 조합, 공지된 조성물의 신규한 용도 또는 공지된 조성물을 포함하는 신규한 방법은 권리가 부인되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물은 개체에 투여되어 개체에서 생물학적 표적 분자에 결합하고/거나 이의 기능을 변경시켜 유리한 치료 또는 진단 효과를 생성할 수 있는 임의의 화합물(예를 들어, 작은 유기분자, 핵산, 폴리펩티드)를 의미한다. 표적 분자는 개체의 게놈에 의해 엔코딩된 내인성 표적 분자(예를 들어 효소, 수용체, 증식 인자, 개체 게놈에 의해 엔코딩된 사이토카인) 또는 병원균(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류, 선충류 또는 다른 병원균)의 게놈에 의해 엔코딩된 외인성 표적 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 조합체"는 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합 또는 비공유 결합된 약물을 포함하는 조합체로서, 폴리펩티드 결합 잔기가 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어 항원 결합 위치)를 함유하는 조합체를 의미한다. 약물 조합체는 약물이 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합 또는 비공유결합된 컨쥬게이트일 수 있다. 약물은 폴리펩티드 결합 잔기에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어 적합한 링커 및/또는 상보적인 결합 파트너(예, 비오틴 및 아비딘)의 비공유결합) 공유결합 또는 비공유결합될 수 있다. 상보적인 결합 파트너가 사용되는 경우에, 겨합 파트너 중 하나는 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해 약물에 공유결합될 수 있고, 상보적인 결합 파트너는 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합될 수 있다. 약물이 폴리펩티드 또는 펩티드인 경우에, 약물 조합체은 폴리펩티드 또는 펩티드 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기가 연속적인 폴리펩티드 사슬의 분리된 일부(잔기)인 융합 단백질일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "컨쥬게이트"는 약물에 결합된 혈청 알부민에 결합된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 의미한다. 이러한 컨쥬게이트는 약물이 공유결합된 혈청 알부민에 결합된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "약물 컨쥬게이트", 및 약물이 비공유결합된 혈청 알부민에 결합된 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "비공유결합성 약물 컨쥬게이트"를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 컨쥬게이트"는 약물이 공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 의미한다. 약물은 항원 결합 단편에 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해 간접적으로 공유결합될 수 있다. 약물이 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 적합한 아미노산 사슬(예, 라이신의 ε아미노기)을 통해서와 같이 임의의 적합한 위치에서 항원 결합 단편에 결합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "비공유결합성 약물 컨쥬게이트"는 약물이 비공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 약물은 항원 결합 단편에 직접적으로(예, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용) 또는 간접적으로(예, 상보적 결합 파트너(예, 비오틴 및 아비딘)의 비공유 결합을 통해, 여기서 하나의 파트너는 약물에 공유결합되고 상보적인 결합 파트너는 항원 결합 단편에 공유결합된다) 결합될 수 있다. 상보적인 결합 파트너가 사용되는 경우에, 결합 파트너 중 하나는 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해 공유결합될 수 있고, 상보적인 결합 파트너는 혈청 알부민에 직접적으로 또는 적합한 링커 잔기를 통해 항체의 항원 결합 단편에 공유결합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물 융합체"는 혈청 알부민 및 폴리펩티드 약물에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 혈청 알부민 및 폴리펩티드 약물에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 하나의 연속적인 폴리펩티드 사슬의 분리된 부분(잔기)로서 존재한다.
본워에 사용된 바와 같이, "약물 기재"는 활성을 평가하거나 측정하거나 결정하는데 사용되는 약물(또는 약물 잔기)의 양에 기재하여 표준화된 약물 조합체 및 약물의 활성을 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 약물 조합체(예, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 이들이 함유하는 약물 보다 더 큰 분자량을 가진다. 이와 같이, 중량 기준으로 등가량의 약물 조합체 및 약물은 분자량 또는 몰 기재로 약물의 상이한 양을 함유할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 약물 조합체이 이것이 포함하는 약물의 분자량의 두배인 분자량을 가지는 경우에, 활성은 1㎍의 약물 조합체 및 1㎍의 약물을 사용하는 "약물 기재"에 의해 결정될 수 있는데, 이는 이러한 양이 동일한 양의 약물을 (유리 약물 또는 약물 조합체의 일부로서) 함유할 것이기 때문이다. 활성은 표준화될 수 있고 적절한 계산법, 예를 들어 표적 결합 영역 기재 당 또는 효소 약물에 대해서 활성 영역 기재 당에 대한 활성으로 표현함에 의해 "약물 기재"로 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "인터루킨 1 수용체 길항제"(IL-1ra)는 천연에 나타나거나 내인성인 포유동물 IL-1ra 단백질 및 천연에 나타나거나 내인성인 대응하는 IL-1ra 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질(예, 재조합 단백질, 합성 단백질(예, 합성 유기 화학 방법을 사용하여 생성)을 의미한다. 이에 따라, 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 IL-1ra의 성숙 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체, 및 다른 이소폼(예를 들어, 대안적인 스플라이싱 또는 다른 세포 가공에 의해 생성), 및 개질되거나 개질되지 않은 형태의 상기 것들(예를 들어 지질화, 당화, PEG화)을 포함한다. 천연에 나타나거나 내인성인 IL-1ra는 성숙 IL-1ra, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류)에서 천연에 나타나는 다른 이소폼과 같은 야생형 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 예를 들어 천연적으로 IL-1ra를 생성하는 원료로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이러한 단백질 및 천연에 나타나거나 내인성인 대응하는 IL-1ra와 동일한 아미노산 서열을 가지는 IL-1ra 단백질은 대응하는 포유동물의 이름에 의해 지칭된다. 예를 들어 대응하는 포유동물이 인간인 경우에 단백질은 인간 IL-1ra로서 지칭된다.
IL-1ra의 "작용성 변이체"는 적합한 방법(예, 돌연변이(예를 들어 화학적 돌연변이, 방사선 돌연변이), 재조합 DNA 기술)을 사용하여 생성될 수 있는 작용성 단편, 작용성 돌연변이 단백질, 및/또는 작용성 융합 단백질을 포함한다. "작용성 변이체"는 인터루킨-1 타입 1 수용체를 길항작용한다. 일반적으로, IL-1ra의 단편 또는 부분은 성숙한 IL-1ra(예를 들어 N-말단, C-말단, 또는 내부 결실)에 대하여 아미노산(예를 들어 하나 이상의 아미노산)의 결실 및/또는 첨가(예를 들어 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 첨가)를 가지는 것들을 포함한다. 인접된 아미노산만이 결실되거나 인접되지 않은 아미노산이 성숙 IL-1ra에 대하여 결실된 단편 또는 부분이 또한 고려된다.
IL-1ra의 작용성 변이체는 인간 IL-1ra의 성숙한 152개 아미노산 형태와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가지고 인간 인터루킨-1 타입 1 수용체를 길항작용한다(참조: Eisenberg et al., Nature 343: 341-346 (1990)). 변이체는 하나 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다(예를 들어, 153 또는 154개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다). 예를 들어, 변이체 IL-1ra는 서열번호:33의 잔기 26번 내지 177번이 뒤따르는 아미노-말단 메티오닌 잔기로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다(KINERET®(아나킨라), 암젠 인크.).
본원에 사용된 바와 같이, "사포린"은 식물 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)에 의해 생성된 폴리펩티드를 단일-사슬 리보솜 불화성화 폴리펩티드의 패밀리를 의미한다(Stirpe, F., et al., Biochem. J. 216:617-625 (1983), Bagga, S. et al., J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 사포닌 폴리펩티드는 길이 및/또는 아미노산 서열이 상이한 수개의 형태로 존재한다(e.g. Id. and Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. [ 268:6541-6548 (1993)). 사포린-6는 사포린의 가장 활성 형태이다(Bagga, S. et al., J. Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 천연 폴리펩티드(서열번호:65)의 48번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Glu이고, 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 91번 위치의 아미노산이 Arg 또는 Lys인 4개 이상의 천연에 나타나는 사포린-6의 이소폼이 기술되어 있다(Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)). 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 99번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Leu, 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 134번 위치가 Gln 또는 Lys; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 147번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Leu; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 149번 위치의 아미노산이 Ser 또는 Phe; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 162번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Asn; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 177번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 188번 위치의 아미노산이 Ile 또는 Thr; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 196번 위치의 아미노산이 Asn 또는 Asp; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 198번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Asp; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 231번 위치의 아미노산이 Asn 또는 Ser; 성숙 폴리펩티드(서열번호:65)의 233번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg인 폴리펩티드를 포함한다. (Id.) 이러한 이소폼 및 변이체를 포함하는 컨센서스 서열은 도14G(서열번호:67)에 제시된다.
이에 따라, "사포린"은 전구체 단백질, 성숙 폴리펩티드, 천연 단백질, 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 다른 이소폼(예를 들어, 대안적인 스플라이싱 또는 다른 세포 가공에 의해 생성), 및 천연에 나타나는, 합성 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드를 포함하는 개질되거나 개질되지 않은 상기 기재된 것들(예를 들어 지질화, 당화, PEG화)을 포함한다. 천연에 나타나거나 내인성인 사포린은 성숙 사포린(예, 성숙 사포린-6), 다형성 또는 대립유전자 변이체 및 사포나리아 오피시날리스에서 천연적으로 나타나는 다른 이소폼과 같은 야생 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 임의의 적합한 방법을 사용하여 사포나리아 오피시날리스로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 사포린의 "작용성 변이체"는 작용성 단편, 작용성 돌연변이 단백질, 및/또는 적합한 방법(예를 들어, 돌연변이(예를 들어 화학적 돌연변이, 방사선 돌연변이), 재조합 DNA 기술)을 사용하여 생성될 수 있는 작용성 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 사포린(예를 들어, 사포린-6)의 단편 또는 부분은 성숙 사포린(N-말단, C-말단 또는 내부 결실)에 대하여 아미노산(예를 들어 하나 이상의 아미노산)의 첨가 및/또는 부가(예를 들어 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 첨가)를 가지는 것들을 포함한다. 성숙 사포린에 대해 인접한 아미노산만이 결실되거나 인접하지 않은 아미노산이 결실된 단편 또는 부분 또한 포함된다. 다양한 사포린의 작용성 변이체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단 신장부를 함유하는 사포린-6의 융합 단백질이 제조되고 토끼 망상 적혈구 용해물 검정에서 완전한 리보솜-억제 활성을 보유하는 것으로 증명되었다(Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541-6548 (1993)). 변이체 또는 사포린-6은 활성 부위 잔기, Tyr72, Tyrl20, Glu176, Arg179 또는 Trp208(서열번호:65의 아미노산 72, 120, 176, 179, 또는 208)이 시험관내 검정에서 세포독성 활성을 감소시키는 알라닌으로 치환되었다(Bagga, S. et al., J; Biol. Chem. 278:4813-4820 (2003)). 이에 따라, 사포린의 추가 작용성 변이체를 제조하는 것이 요망되는 경우에 활성 영역 잔기의 돌연변이, 치환, 교체, 결실 또는 개질은 회피되어야 한다. 바람직하게는 천연에 나타나는 성숙 폴리펩티드 보다 더 적은 아미노산을 함유하는 사포린의 작용성 변이체는 적어도 활성 영역을 포함한다. 예를 들어, 천연에 나타나는 성숙 사포린-6 보다 더 적은 아미노산을 함유하는 사포린-6의 변이체는 성숙 사포린-6(Tyr72, Tyrl20, Glu176, Arg 179 및 Trp208(서열번호:65의 아미노산 72, 120, 176, 179 및 208)의 활성 영역 잔기를 포함하고, 길이가 약 137개 이상 아미노산, 약 150개 이상 아미노산, 약 175개 이상 아미노산, 약 200개 이상 아미노산, 약 225개 이상 아미노산, 약 250개 이상 아미노산이다.
사포린의 "작용성 변이체"는 리보솜-불활성화 활성(예를 들어, rRNA N-글리코시다제 활성) 및/또는 세포독성 활성을 가진다. 이러한 활성은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 종양 세포주를 사용하는 널리 공지된 토끼 망상 적혈구 용해물 검정 또는 임의의 널리 공지된 세포독성 검정을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다(e.g. Bagga, S. et al., J Biol. ; Chem. 278:4813- 4820 (2003) and Barthelemy, I. et al., J. Biol. Chem. 268:6541 6548 (1993)).
일부 구체예에서, 사포린의 작용성 변이체는 성숙 사포린-6(서열번호:65)와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 91% 이상, 또는 약 92% 이상, 또는 약 93% 이상, 또는 약 94% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가진다.
본 발명은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 영역(예를 들어 항원 결합 영역)을 함유하는 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하는 약물 조합체에 관한 것이다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약물 조합체에 대하여 상세하게 본원에 기술된 바와 같이, 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기는 서로에게 공유결합 또는 비공유결합에 의해 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 조합체은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 구체예에서, 약물 조합체은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 영역을 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합 또는 비공유결합되는 약물을 포함한다.
전형적으로, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드는 유기체(예를 들어 인간)로부터 원하지 않는 물질을 제거하는 내인성 기전에 의해 분해 또는 제거를 방해하고 생체내에서 천연에 나타나는 폴리펩티드이다. 예를 들어 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드는 세포되 매트릭스의 단백질, 혈액에서 발견된 단백질, 혈액 뇌 경계 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈, 스트레스 단백질, 질병 특이적 단백질 또는 Fc 트랜스포트에 관여하는 단백질에 편재된 단백질로부터 선택될 수 있다.
생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 적합한 폴리펩티드는 예를 들어 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(미국 특허 5,977,307, 이의 교시 내용은 본원에 참조로 통합된다), 뇌 모세혈관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예를 들어 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린 유사 증식 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린 유사 증식 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-항트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 혈청 반감기를 증강시키는 적합한 폴리페비드는 알파-1 당단백질(오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 안티키모트립신(ACT), 알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III(AT III), 아포리포단백질 A-1(Apo A-1), 아포리포단백질 B(Apo B), 세룰로플라스민(Cp), 보체 성분 C3(C3), 보체 성분 C4(C4), C1 에스터라아제 억제제(C1 INH), C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER), 헤모펙신(HPX), 리포단백질(a)(Lp(a)), 만노오스-결합 단백질(MBP), 미오글로빈(Myo), 프리알부민(트란스티레틴; PAL), 레티놀-결합 단백질(RBP), 및 류머티즘성 인자(RF)를 또한 포함한다.
세포외 매트릭스로부터의 적합한 단백질은 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린, 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요 단백질이다. 약 15개 타입의 콜라겐 분자가 현재 공지되어 있고, 신체의 상이한 부분에서 발견된다, 예를 들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견되는 타입 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90%를 차지함), 또는 연골, 척추 원반, 척색, 및 눈의 유리액에서 발견되는 타입 II 콜라겐이 있다.
혈액으로부터의 적합한 단백질은 예를 들어 혈장 단백질(예를 들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐(예를 들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 햅토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린, 및 β-2-마이크로글로불린), 효소 및 효소 억제제(예를 들어 플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역 시스템의 단백질 예를 들어 면역글로불린 단백질(예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgD, IgM, 면역글로불린 경쇄(카파/람다)), 수송 단백질(예를 들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 에펜신(예를 들어, 베타-데펜신 1, 호중구 데펜신 1, 호중구 데펜신 2 및 호중구 데펜신 3) 등을 포함한다.
혈액 뇌 경계 또는 신경 조직에서 발견되는 적합한 단백질은 예를 들어 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 수송체 등을 포함한다.
생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 적합한 폴리펩티드는 또한 신장에 편재된 단백질(예를 들어, 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만 항원), 간에 편재된 단백질(예를 들어, 알코올 탈수소효소, G250), 폐에 편재된 단백질(예를 들어, Ig A에 결합하는 분비성 성분), 심장에 편재된 단백질(예를 들어, 투석된 심장근육병증과 관련된 HSP27), 피부에 편재된 단백질(예를 들어, 케라틴), 골형성 활성을 증명하는 단백질의 전환성 성장 인자 β 수퍼패밀리의 서브세트인 형태발생 단백질(BMP)과 같은 뼈 특이적 단백질(예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), 종양 특이적 단백질(예를 들어, 영양포 항원, 허셉틴 수용체, 오에스트로겐 수용체, 카텝신(예를 들어, 카텝신 B, 간 및 비장에서 발견될 수 있음)을 포함한다.
적합한 질병-특이적 단백질은 예를 들어 LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드(OPGL, Nature 402, 304-309 (1999)), OX40(활성화된 T 세포상에서 발현되고 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I(HTLV-1) 생성 세포에서 특이적으로 상향 조절되는 TNF 수용체 패밀리의 원, Immunol. 165 (1):263-70 (2000))을 포함하여, 활성화된 T-세포에서만 발현되는 항원을 포함한다. 적합한 질병-특이적 단백질은 또한 예를 들어, CG6512 초파리, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐과 ftsH을 포함하는 금속프로테아제(관절염/암과 관련), 및 산성 섬유아세포 증식 인자(FGF-1), 염기성 섬유아세포 증식 인자(FGF-2), 혈관 내피 증식 인자/ 혈관 투과성 인자(VEFG/VPF), 전환성 증식 인자-α(TGF-α), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 내피 증식 인자(PD-ECGF), 태반 증식 인자(PlGF), 미드킨 혈소판 유래 증식 인자-BB(PDGF), 및 프랙탈킨을 포함한다.
생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 적합한 폴리펩티드는 열 쇼크 단백질(HSP)와 같은 스트레스 단백질을 포함한다. HPS는 통상 세포질내에서 발견된다. 이들이 세포질외에서 발견되는 경우에, 세포가 사멸하거나 이의 함유물을 밖으로 내보내는 인디케이터이다. 이러한 프로그래밍되지 않은 세포 사멸(세포 괴사)는 외상, 질병 또는 상처의 결과로서 세포외 HSP가 면역계로부터 반응을 유발하는 경우에 일어난다. 세포외 HSP에 결합하는 것은 질병 위치에 본 발명의 조성물을 편재시킬 수 있다.
Fc 수소에 관여하는 적합한 단백질은 예를 들어 브램벨 수용체(FcRB)로도 공지됨)를 포함한다. 이러한 Fc 수용체는 두개의 작용기를 가지고, 이들 둘 모두는 잠재적으로 전달에 유용한다. 기능은 (1) 태반을 통해 모체로부터 아기에게 IgG의 수송 및 (2) IgG를 분해로부터 보호하고 이에 의해 혈청 반감기를 연장하는 것이다. 수용체는 엔도좀으로부터 IgG를 재순환시키는 것으로 생각된다(Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997).
본 발명의 약물 조합체은 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 영역(예를 들어 항원 결합 영역)을 함유하는 임의의 폴리펩티드 결합 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드 결합 잔기는 31개 이상, 약 40개 이상, 약 50개 이상, 약 60개 이상, 약 70개 이상, 약 80개 이상, 약 90개 이상, 약 100개 이상의 아미노산 또는 약 110개 이상의 아미노산을 별개의 분자 부분으로 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드 결합 잔기는 적어도 약 5mM KD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))의 KD로 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 표면 플라즈몬 공명기술에 의해 측정되었을 때 폴리펩티드 결합 잔기는 약 10 내지 약 100nM, 또는 약 100nM 내지 약 500nM, 또는 약 500nM 내지 약 5mM의 KD로 생체내에서 혈청 반감기를 증상시키는 폴리펩티드에 결합한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 약 50nM, 또는 약 70nM, 또는 약 100nM, 또는 약 150nM 또는 약 200nM의 KD로 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 결합한다.
바람직하게는, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 영역(예를 들어, 항원 결합 영역)을 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기는 원핵세포 또는 박테리아 폴리펩티드 또는 펩티드가 아니다. 바람직하게는, 폴리펩티드 결합 잔기는 진핵생물, 포유동물 또는 인간 폴리펩티드 또는 펩티드이다.
특정 구체예에서, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 영역(예를 들어 항원 결합 영역)을 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기는 폴딩(folding)된 단백질 도메인이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 약 4KDa 이상, 약 4.5KDa 이상, 약 5KDa 이상, 약 5.5KDa 이상, 약 6KDa 이상, 약 6.5KDa 이상, 약 7KDa 이상, 약 7.5KDa 이상, 또는 약 8KDa 이상을 별개의 분자 부분으로 가진다.
생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 결합 영역(예를 들어 항원 결합 영역)을 함유하는 적합한 폴리펩티드 결합 잔기는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 적합한 부착 검정에서 천연에 나타나거나 천연에 나타나지 않는 폴리펩티드를 스크리닝함에 의해 확인될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드를 위한 항원 결합 영역을 가지는 바람직한 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편이다. 그러나, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 다른 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편은 본 발명에서 사용될 수 있다.
요망되는 경우에, 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)은 항체 또는 항원 결합 단편의 항원 결합 특이성을 보유하는 비면역글로불린 구조물로 구성된다. 본 발명의 약물 조합체은 이러한 비면역글로불린 결합 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 비면역글로불린 결합 잔기는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 예를 들어 SpA와 같은 중성 박테리아 수용체는 에피토프에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 결합 잔기를 생성하는 CDR의 그래프팅을 위한 스캐폴드로서 사용되었다. 이러한 방법의 상세한 내용은 미국 특허 5,831,012에 기재되어 있고 이의 교시 내용은 본원에 참조로 통합된다. 다른 적합한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 항체에 기초한 것들이다. 적합한 방법의 상세한 내용은 WO 98/58965에 기재되어 있다. 다른 적합한 스캐폴드는 문헌(van den Beuken et al., J. Mol. Biol. 310:591-601 (2001))에 기술되어 있는 리포칼린 및 CTLA4, 및 예를 들어 박테리아 GroEL 또는 다른 샤페론 폴리펩티드의 고리 구조상에 기초한 WO 00/69907에 기술된 것들과 같은 스캐폴드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 약물 조합체은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 비면역글로불린 결합 잔기로서, 비면역글로불린 결합 잔기가 하나, 둘, 또는 셋의 본원에 기술된 Vн, Vκ, 또는 Vнн 및 적합한 스캐폴드를 포함하는 비면역글로불린 결합 잔기를 포함한다. 특정 구체예에서, 비면역글로불린 결합 잔기는 본원에 기술된 Vн, Vκ, 또는 Vнн 및 적합한 스캐폴드의 CDR3를 포함하지만 CDR1 또는 CDR2는 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 비면역글로불린 결합 잔기는 본원에 기술된 Vн, Vκ, 또는 Vнн 및 적합한 스캐폴드의 CDR1 및 CDR2는 포함하지만 CDR3는 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 Vн, Vκ, 또는 Vнн 및 적합한 스캐폴드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3는 포함한다. 다른 구체예에서, 약물 조합체은 본원에 기술된 Vн, Vκ, 또는 Vнн 및 적합한 스캐폴드의 CDR3만을 포함한다.
본 발명의 약물 조합체은 약물 융합체, 약물 컨쥬게이트, 및 비공유결합 약물 컨쥬개이트의 제조를 위해 본원에 기술된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가로, 본 발명의 약물 조합체은 약물 융합체, 약물 컨쥬게이트, 및 비공유결합성 약물 컨쥬게이트에 대하여 본원에서 상세하게 기술된 이점 및 유용성을 가진다.
본 발명은 약물 단독(컨쥬게이션되니 않은 약물, 융합되지 않은 약물)과 비교하여 개선된 약동학 및 다른 이점을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)을 제공한다. 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 및 약물 융합체는 혈청 알부민 및 하나 이상의 요망되는 약물에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체는 약물 단독과 비교하여 상당히 연장된 생체내 혈청 반감기 및/또는 증가된 AUC를 가질 수 있다. 또한, 약물의 활성은 일반적으로 약물 조합체(예를 들어 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)에서 그다지 변경되지 않는다. 그러나, 약물 단독과 비교하여 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 활성의 일부 변화는 허용되고 일반적으로 약물 조합체의 개선된 약동한 특성에 의해 보상된다. 예를 들어 약물 조합체 (예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)은 약물 단독 보다 낮은 친화도로 약물 표적에 결합할 수 있으나, 약물 조합체의 개선된 약동학 특성(예를 들어 연장된 생체내 혈청 반감기, 보다 큰 AUC)으로 인하여 약물 단독과 비교하여 거의 동등하거나 우수한 효능을 가진다. 또한, 보다 적은 양의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 요망되는 치료 또는 진단 효과를 달성하기 위하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약물 조합체의 활성(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)은 약 100 이하, 또는 약 50 이하, 또는 약 10 이하, 약 5 이하, 또는 약 4 이하, 또는 약 3 이하, 또는 약 2 이하의 비율로 약물 단독과 상이하다. 예를 들어, 약물은 1nM의 KD, Ki 또는 중화 용량 50(ND50)을 가질 수 있고, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)은 약 2nM, 또는 약 3nM, 또는 약 4nM, 또는 약 5nM, 또는 약 10nM의 KD, Ki 또는 ND50을 가질 수 있다.
바람직하게는, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 활성은 약물의 활성에 비하여 그다지 감소되지 않는다. 특정 구체예에서, 약물 조합체의 활성은 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하로 약물의 활성에 비해 감소되거나 실질적으로 변화되지 않는다. 대안적으로, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 약물 활성의 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 보유하거나 약물과 실질적으로 동일한 활성을 가진다. 바람직하게는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 활성 및 약물은 "약물 기재"로 측정되고/거나 비교된다.
본원에 기술되고 도시된 바와 같이, 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 약물 단독 보다 더 큰 활성(예를 들어 생체내 활성)을 가질 수 있다. 예를 들어, 실시예 6에 도시된 바와 같이, 동일한 중량 용량(10㎎/kg 도는 1㎎/kg)으로 투여되는 경우에, DOM7m-16/IL-1ra는 IL-1ra보다 마우스 모델에서 관절염을 치료하는데 보다 효과적이었다. DOM7m-16/IL-1ra는 이의 분자량이 IL-1ra의 분자량의 대략 두배이지만 보다 효과적이었다. 따라서, DOM7m-16/IL-1ra를 접종받은 마우스는 IL-1ra를 접종받은 마우스의 약 절반의 IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra에서 잔기로서)을 투여받는다.
특정 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 약물 보다 더 큰 활성(예를 들어 생체내 활성)을 가지고, 예를 들어 약물 조합체는 약물 활성의 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상, 약 250% 이상, 약 300% 이상, 약 350% 이상, 약 400% 이상, 약 450% 이상, 약 500% 이상을 가질 수 있다. 바람직하게는, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 및 약물의 활성은 "약물 기재"로 결정되고/거나 비교되며, 약물은 적합한 시험관내 또는 생체내 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)은 생체내에서 측정되었을 때 이것이 포함하는 약물 보다 더 큰 활성을 갖니다. 다른 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 시험관내에서 측정되었을 때 이것이 포함하는 약물보다 더 큰 활성을 가진다.
혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 도메인 항체(dAb)를 포함하는 약물 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 추가의 이점을 제공한다. 도메인 항체는 매우 안정하고 항체 및 항체의 다른 항원 결합 단편에 비해 작고 E. coli 또는 효모(예를 들어 피치아 파스토리스)에서 발현에 의해 고수율로 생성될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 기원의 라이브러리 또는 임의의 요망되는 종으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 이에 따라, 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 포유동물 세포에서 일반적으로 생성되는 치료제(예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체)보다 용이하게 생성될 수 있고, 면역원성이 아닌 dAb가 사용될 수 있다(예를 들어 인간 dAb가 인간에서 질병을 치료하거나 진단하기 위한 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트를 위해 사용될 수 있다.
약물의 면역원성은 해당 약물이 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드 결합 잔기(예를 들면, 혈청 알부민을 결합하는 항체의 항원 결합 단편)를 포함하는 약물 조합체(예를 들면, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 일부일 때에 감소될 수 있다. 따라서, 약물은 혈청 알부민을 결합하는 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하는 약물 조합체(예를 들면, 약물 컨쥬게이트, 비공유성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)에 있어서는 (약물 자체보다) 덜 면역 발생적이거나 실질적으로 전혀 면역 발생적이지 않게 될 수 있다. 따라서, 이러한 약물 조합체(예를 들면, 약물 컨쥬게이트, 비공유성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)은 환자의 면역 체계에 의해 항약물성 항체의 합성으로 인한 효율성의 손실을 최소화한 채로 일정 시간에 걸쳐 반복적으로 환자에게 투여될 수 있다.
게다가, 여기에서 기술된 약물 조합체(예를 들면, 약물 컨쥬게이트, 비공유성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 향상된 안전성 프로파일을 가지며 약물만의 경우보다 더 적은 부작용을 야기할 수 있다. 예를 들면, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 항원 결합 단편의 혈청 알부민 결합 작용의 결과로서, 약물 융합체 및 컨쥬게이트(약물 컨쥬게이트, 비공유성 약물 컨쥬게이트)는 혈관 순환에 있어 향상된 체류 시간을 갖게 된다. 게다가, 컨쥬게이트 및 약물 융합체은 실질적으로 혈액뇌장벽을 가로지를 수 없고 체 투여(예를 들면, 혈관 내 투여)에 따라 중앙 신경계에 축적될 수 없다. 따라서, 신경학적 독성 또는 바람직하지 않은 양정신성 효과를 가지는 약물을 함유하는 컨쥬게이트(약물 컨쥬게이트, 비공유성 약물 컨쥬게이트) 및 약물 융합체는 약물 단독에 비하여 보다 큰 안전성 및 감소된 부작용으로 투여될 수 있다. 유사하게, 컨쥬게이트(약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트) 및 약물 융합체는 단독 약물 보다 특정 기관(예를 들어, 신장 또는 간)에 대해 감소된 독성을 가질 수 있다. 본원에 기술된 컨쥬게이트 및 약물 융합체는 또한 약물 또는 약물에 결합하는 표적(예를 들어 독소)를 혈관 순환에서 격리시켜 조직에 대한 약물 또는 표적의 효과를 감소시키는 데(예를 들어 독소의 효과를 억제) 사용될 수 있다.
약동학적 분석 및 생체내 반감기의 결정을 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌(Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, and in Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A practical Approach (1996))에 기술되어 있다. 또한 t 알파 및 t 베타 반감기(t1/2 알파, t1/2 베타)와 같은 약동학 파라미터를 기술하는 문헌("Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982))을 참조할 수 있다.
반감기(t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 대한 컨쥬게이트 또는 융합체의 혈청 농도 커브로부터 결정될 수 있다. 예를 들어 WinNonlin 분석 팩키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USA)가 커브를 모델링하기 위해 사용될 수 있다. 제 1 상(알파 상)에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 약간이 배출되고 환자에 분배된다. 제 2 상(베타 상)은 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)가 분배되고 혈청 농도가 약물 조합체가 환자로부터 제거됨에 따라 감소하는 종말 상이다. t 알파 반감기는 제 1 상의 반감기이고 t 베타 반감기는 제 2 상의 반감기이다. 따라서, 본 발명은 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 또는 15분 이상의 범위에서 tα 반감기를 가지는 본 발명에 따른 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 또한 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 또는 조성물은 12시간을 포함하여 12 이하의 범위에서 tα 반감기를 가질 것이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6 시간, 2 내지 5 시간, 또는 3 내지 4 시간이다.
유익하게는, 본 발명은 2.5 시간 이상의 범위에서 tβ 반감기를 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 3 시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 일부 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 21일을 포함하는 21일 이하의 범위에서 tβ 반감기를 가진다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 또는 20일이다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 12 내지 60 시간의 범위에서 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가의 구체예에서, 12 내지 48 시간의 범위내일 것이다. 추가의 구체예에서, 12 내지 26 시간의 범위내일 것이다.
상기 범주에 대해 추가로 또는 대안적으로, 본 발명은 0.01mg.min/㎖ 이상, 또는 1mg.min/㎖ 이상의 범위에서 AUC 값(커브 아래 면적)을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 0.01, 0.1, 1.5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300mg.min/㎖이다. 특정 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 600mg.min/㎖의 범위에서 AUC를 가진다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50mg.min/㎖이다. 다른 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 범위에서 AUC를 가진다: 15 내지 150mg.min/㎖, 15 내지 100mg.min/㎖, 15 내지 75mg.min/㎖, 15 내지 50mg.min/㎖, 0.01 내지 50mg.min/㎖, 0.1 내지 50mg.min/㎖, 1 내지 50mg.min/㎖, 5 내지 50mg.min/㎖, 및 10 내지 50mg.min/㎖.
본 발명은 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어 항원 결합 위치)를 함유하는 약물 및 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)에 관한 것이다. 약물 조합체의 바람직한 구체예에서, 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어, 항원 결합 위치)를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가진다.
일부 구체예에서, 약물 조합체는 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어, 항원 결합 위치)를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기에 비공유결합되는 약물을 포함한다. 이러한 구체예에서, 약물은 아미노산 말단, 카르복시 말단 또는 적합한 아미노산 측쇄(예를 들어 라이신의 ε 아미노기)를 통해 적합한 위치에서 폴리펩티드 결합 도메인에 공유결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 약물 조합체는 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어, 항원 결합 위치)를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기에 비공유결합된 약물을 포함한다. 이러한 구체예에서, 약물은 항원 결합 단편에 직접적으로(예를 들어 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용을 통해) 또는 간접적으로(예를 들어 상보적 결합 파트너(예를 들어 비오틴 또는 아비딘)의 비공유결합을 통해, 여기서, 하나의 파트너는 약물에 공유결합되고 상보적 결합 파트너는 항원 결합 단편에 공유결합된다) 비공유결합된다. 상보적 결합 파트너가 사용되는 경우에, 결합 파트너의 하나는 약물에 직접 또는 적합한 링커 잔기를 통해 공유결합되고, 상보적 결합 파트너는 폴리펩티드 결합 도메인에 직접 또는 적합한 링커 잔기를 통해 공유결합될 수 있다.
다른 구체예에서, 약물 조합체는 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어 항원 결합 위치)를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기 및 폴리펩티드 약물을 포함하는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 연속적인 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 사슬은 제 1 잔기로서 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어, 항원 결합 위치)를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하고, 제 2 잔기로서 폴리펩티드 약물을 포함하며, 이들은 폴리펩티드 사슬의 별개 부분(잔지)로서 존재한다. 제 1 및 제 2 잔기는 펩티드 결합을 통해 서로에게 직접 결하되거나, 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결된다. 추가의 잔기(예를 들어 제 3, 제 4) 및/또는 링커 서열은 적절하게 존재할 수 있다. 제 1 잔기는 N-말단 위치, C-말단 위치, 또는 제 2 잔기(예를 들어, 폴리펩티드 약물)에 대해 내부에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 생체내애서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 함유하는 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기 및 하나 이상의 폴리펩티드 약물 잔기를 포함한다. 이러한 구체예에서, 융합 단백질은 1 내지 약 10개(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 함유하는 폴리펩티드 약물 잔기, 및 1 내지 약 20개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 동일하거나 상이할 수 있는 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기를 포함한다.
생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기 및 폴리펩티드 약물 잔기는 임의의 요망되는 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 진행하여, 잔기는 하기 순서로 존재할 수 있다: 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기. 다른 예에서, 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 진행하여, 잔기는 하기 순서로 존재할 수 있다: 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 약물 잔기, 하나 이상의 폴리펩티드 결합 잔기. 본원에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 결합 잔기 및 폴리펩티드 약물 잔기는 펩티드 결합을 통해 서로에 직접 결합되거나 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다.
특정 구체예에서, 융합 단백질은 하기 화학식(아미노 말단에서 카르복시 말단)을 가지는 연속된 폴리펩티트 사슬이다:
a-(P)n2-b-(X)n1-c-(Q)n3-d 또는 a-(Q)n3-b-(X)n1-c-(P)n2-d
상기 식에서, X는 폴리펩티드 약물이고;
P 및 Q는 각각 독립적으로 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기이고,
a, b, c, 및 d는 각각 독립적으로 부재하거나 1 내지 약 100개 아미노산 잔기이고,
n1, n2, 및 n3는 각각 존재하는 X, P 또는 Q 잔기의 수를 나타내고,
n1은 1 내지 약 10이고,
n2는 0 내지 약 10이고,
n3는 0 내지 약 10이고,
다만 n2와 n3 둘 모두가 0이 아니며,
다만 n1 및 n2 둘 모두가 0이고 n3가 0인 경우에 X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, n2는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고, n3는 0이다. 다른 구체예에서, n3는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고, n2는 0이다. 다른 구체예에서, n1, n2, 및 n3는 각각 1이다.
특정 구체예에서, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
바람직한 구체예에서, P 및 Q는 각각 독립적으로 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 결합 잔기이다.
특히 바람직한 구체예에서, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치(예를 들어, 항원 결합 위치)를 함유하는 폴리펩티드 결합 잔기를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 결합 도메인은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편이다.
본 발명은 또한 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하는, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 방법은 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고, 상기 약물의 약 90% 이상의 활성을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하여, 약물의 활성을 실질적으로 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 방법은 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물 보다 덜 면역원성인 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하여, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 방법은 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 상기 약물 보다 덜 면역원성이고 상기 약물의 약 90% 이상의 활성을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하여, 약물의 활성의 실질적인 감소 없이 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 것이다.
다른 구체예에서, 방법은 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 상기 약물에 비해 더 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물에 비해 덜 면역원성이고, 상기 약물의 약 90% 이상의 활성을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하여, 약물의 활성의 실질적인 감소 없이, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 것이다.
약물 및 생체내 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기는, 본원에 기술된 바와 같이, 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 공유 결합(예를 들어 펩티드 결합) 또는 비공유결합을 통해 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기는 공유결합을 통해 결합된다. 예를 들어, 생성된 약물 조합체는 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체이다. 다른 구체예에서, 약물 및 생체내 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기는 비공유결합을 통해 결합되고, 약물 조합체는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트이다.
상기 방법을 사용하여 생성된 약물 조합체는 약물 보다 더 큰 활성(예를 들어, 생체내 활성)을 가질 수 있다. 일부 구체에에서, 방법은 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합시키고, 이에 의해 약물에 비해 보다 큰 활성을 가지는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 생성하는 것을 포함하여, 약물 단독 보다 더 큰 활성(예를 들어 생체내 활성)을 가지는 약물 조합체를 생성하기 위한 것이다. 이러한 구체에에서, 바람직하게는, 약물 조합체의 활성은 본원에 기술된 약물의 활성 보다 더 크다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가진다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편이다.
특정 구체예에서, 방법은 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편)으로부터 상기 폴리펩티트 결합 잔기를 선택하는 것을 포함하고, 여기서 선택된 폴리펩티드 결합 잔기는 약 5mM 이상의 KD로 생체내에서 혈청 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 결합한다.
본 발명은 또한 생체내 혈청 알부민 반감기를 상승시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기의 약제 제조용 용도에 관한 것이고, 여기서 약제는 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위해 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함한다.
일부 구체예에서, 용도는 약 10% 초과로 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 약물이 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 약제 제조용이다.
다른 구체예에서, 용도는 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 약제 제조용이다.
다른 구체예에서, 용도는 약 10%를 초과하여 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 약제 제조용이다.
다른 구체예에서, 용도는 약 10%를 초과하여 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 약제 제조용이다.
약물 조합체는 본원에 기술된 바와 같이 링커를 사용하거나 사용하지 않고 공유결합(예를 들어 펩티드 결합) 또는 비공유 결합을 통해 결합된, 약물 및 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 약물 및 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기는 공유결합을 통해 결합된다. 예를 들어, 약물 조합체는 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체일 수 있다. 다른 구체에에서, 약물 및 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기는 비공유결합을 통해 결합되고, 약물 조합체는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트이다.
특정 구체예에서, 용도는 약물 보다 활성(예를 들어, 생체내 활성)을 증가시키기 위하여, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 약제 제조용이다. 이러한 구체예에서, 바람직하게는 약물 조합체의 활성은 본원에 기술된 약물의 활성 보다 더 크다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가진다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 결합 잔기는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편이다.
혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편
본 발명의 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트 및 약물 융합체는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 (예를 들어 하나 이상의) 항원 결합 단편을 포함한다. 항원 결합 단편은 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체가 투여될 동물의 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 단편은 인간 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가진다. 그러나, 척추동물 사용이 고려되고, 항원 결합 단편은 요망되는 동물로부터의 혈청 알부민, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양, 돼지, 염소, 사슴, 밍크 등으로부터의 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 하나 이상의 종으로부터의 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가진다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 래트 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 인간 dAb 및 래트, 마우스, 및 인간 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 dAb가 생성되었다(표 1 및 도 7). 이러한 dAb는 동일한 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체를 사용하여 전임상 및 임상 연구를 가능하게 하는 이점을 제공하고, 적합한 대용 약물 융합체 또는 약물 커쥬게이트를 이용한 전임상 연구를 수행할 필요를 회피하게 한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 항원 결합 단편은 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, Fv 단편(단일 쇄 Fv(scFv) 및 이황화 결합된 Fv), 단일 가변 도메인 및 dAb(VH, VL)을 포함한다. 이러한 항원 결합 단편은 펩신 또는 필요한 절단 특이성을 가지는 다른 프로테아제를 이용한 항체의 단백질분해와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Fv 단편은 적합한 프로테아제 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 항체를 소화함에 의해 제조될 수 잇다. 예를 들어, 핵산은 2 내지 약 20개의 글리신 잔기의 사슬과 같은 적합한 펩티드 링커에 의해 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 것이 제조될 수 있다. 핵산은 임의의 적합한 기술(예를 들어, 트랜스펙션, 형질전환, 감염)을 사용하여 적합한 숙주(예를 들어, E.coli)로 도입되어 숙주가 단일 쇄 Fv 단편의 발현에 적합한 조건하에 유지될 수 있다. 다양한 항체의 항원 결합 단편이 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 코돈의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 F(ab')2 부분을 엔코딩하는 발현 구조물이 중쇄의 힌지 영역을 엔코딩하는 서열의 3' 말단에서 변역 종결 코돈을 도입함에 의해 설계될 수 있다. 본 발명의 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬겡티, 및 약물 융합체는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 개개 중쇄 및 경쇄 또는 혈청 알부민에 결합하는 개개 사슬(예를 들어, 단일 Vн, Vκ, Vλ)의 부분을 포함할 수 있다.
요망되는 혈청 알부민(예를 들어 인간 혈청 알부민)에 결합하는 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 천연 또는 인공 항체의 적합한 수집물로부터 선택되거나 적절한 숙주에서 적합한 면역원에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 혈청 알부민(예를 들어 단리되거나 정제된 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 알부민의 펩티드(예를 들어 적어도 약 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 37, 또는 40개 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드)로 적합한 숙주(예를 들어, 마우스, 인간 항체-형질전환 마우스, 래트, 토끼, 닭, 염소, 비인간 영장류(예를 들어 원숭이))를 면역화시킴에 의해 생성될 수 있다. 혈청 알부민에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편은 또한 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 재조합 항체 또는 항원 결합 단편의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이러한 라이브러리는 천연 또는 인공 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 함유할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 인공 CDR(예를 들어 무작위 아미노산 서열) 및 인간 프레임워크 영역을 함유하는 Fab 단편을 함유할 수 있다(미국 특허 제6,300,064호(Knappik, et al) 참조). 다른 실시예에서, 라이브러리는 하나 이상의 CDR에서 서열 다양성을 가지는 scFv 단편 또는 dAb(단일 Vн, 단일 Vκ, 또는 단일 Vλ)를 함유한다(참조: WO 99/20749(Tomlinson and Winter), WO 03/002609(Winter et al.), WO 2004/003019A2(Winter et al.)).
혈청 알부민에 결합하는 적합한 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 예를 들어 인간 항체 및 이들의 항원 결합 단편, 인간화된 항체 및 이들의 항원 결합 단편, 키메라 항체 및 이들의 항원 결합 단편, 및 카멜리드(Camelid) 항체 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 및 약물 융합체는 혈청 알부민에 결합하는 카멜리드 Vнн를 포함한다. 카멜리드 Vнн는 천연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 항체는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타, 및 과나코를 포함하는 카멜리드 종에서 나타난다. Vнн 분자는 IgG 분자 보다 약 10배 적고, 단일 폴리펩티드로서 매우 안정하며 극한의 pH 및 온도 조건에 저항성을 가진다. 혈청 알부민에 결합하는 적합한 카멜리드 Vнн는 WO 2004/041862(Ablynx N.V.) 및 본원(도 15 및 서열번호:77-88)에 개시된 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 카멜리드 Vнн는 인간 혈청 알부민에 결합하고 서열번호:72, 서열번호:73, 서열번호:74, 서열번호:75, 서열번호:76, 서열번호:77, 서열번호:78, 서열번호:79, 서열번호:80, 서열번호:81, 서열번호:82, 서열번호:83, 서열번호:84, 서열번호:85, 서열번호:86, 서열번호:87, 또는 서열번호:88과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열 동일성은 바람직하게는 BLAST P적합한 서열 정렬 알고리즘 및 디폴트 파라미터를 사용하여 결정한다(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-2268 (1990)).
면역화 항원의 제조, 및 다클론 및 단클론 항체 생성은 임의의 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 방법이 기술되어 있다. (예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) and Eur. J. Immunol. 6: 511- 519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent No. 4,172,124; Harlow, E. and D. Lane, 1988, I A-ntibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991) 참조). 일반적으로, 단클론 항체가 요망되는 경우에, 하이브리도마는 항체 생성 세포와 불멸화 세포주(예를 들어, SP2/0, P3X63Ag8.653과 같은 골수종 세포주 또는 헤테로골수종)로부터의 적합한 세포를 융합시킴에 의해 생성된다. 항체 생성 세포는 인간 인간-항체 형질전환 동물 또는다른 적합한 관심 항원으로 면역화된 동물의 형질말초 혈액 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 수득될 수 있다. 인간 기원이 항체(예를 들어, 인간 항체)를 생성하는 세포는 적합한 방법, 예를 들어 인간 항체 생성 세포와 헤테로골수종 또는 트리오마의 융합, 또는 엡스타인 바르 바이러스 감염을 통한 활성화된 인간 B 세포의 불멸화를 사용하여 생성될 수 있다(참조: 예를 들어, U.S. Patent No. 6,197,582 (Trakht); Niedbala et al. , Hybridoma, 17:299- 304 (1998); Zanella et al., J ImmunolMethods. 156:205-215 (1992); Gustatsson et a7., FI!um A77tihrliev 1 Hybridomas, 2:26-32 (1991)). 융합되거나 불멸화된 항체 생성 세포(하이브리도마)는 선택적 배양 조건을 사용하여 단리되거나 제한 희석에 의해 클로닝될 수 있다. 요망되는 특이성을 가진 항체는 생성하는 세포는 적합한 검정(예를 들어, ELISA)를 사용하여 확인될 수 있다.
항체는 또한 인간, 인간-항체 형질전환 동물 또는 관심 항원으로 면역화된 다른 적합한 동물의, 단리된 항원 특이적 항체 생성 세포(예를 들어 말초 혈액으로부터의 세포, 또는 바람직하게는 요망되는 특이성을 가진 항체를 생성하도록 결정된 비장 또는 림프절)로부터 직접 제조될 수 있다(예를 들어 합성되거나 클로닝될 수 있다)(참조: U.S. Patent No. 5,627,052 (Schrader)).
약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 또는 약물 융합체가 인간으로의 투여를 위한 경우에, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체 또는 이러한 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 이러한 타입의 항체 및 항원 결합 단편은 인간에서 덜 면역원성이거나 비면역원성이고 공지된 이점을 제공한다. 예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체의 항원 결합 단편을 함유하는 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 또는 약물 융합체는 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체에 결합하는 인간 항체의 생성으로 인한 효능이 다소 손실되거나 손실 없이(다른 완전히 면역원성이 항체와 비교하여) 인간에 반복하여 투여될 수 있다. 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체가 척추동물 투여를 위하여 의도된 경우에, 유사 항체 또는 항원 결합 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어 쥐과 또는 인간 항체로부터의 CDR은 말 또는 소와 같이 요망되는 동물로부터의 프레임워크상에 이식될 수 있다.
동일한 것을 엔코딩하는 인간 항체 및 핵산이 예를 들어 인간 또는 인간-항체 형질전화 동물로부터 수득될 수 있다. 인간-항체 형질전환 동물(예를 들어 마우스)는 XENOMOUSE (Abgenix, Fremont, CA), HUMAB-MOUSE, KIRIN TC MOUSE 또는 KM-MOUSE (MEDAREX, Princeton, NJ)와 같은 인간 항체의 레파토리를 생성할 수 있는 동물이다. 일반적으로 인간-항체 형질전환 동물의 게놈은 작용성 재배열을 거칠 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 트랜스유전자를 포함하도록 변경되었다. 인간-항체 형질전화 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어 내인성 유전자에 의해 엔코딩되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거한다. 인간-항체 형질전화 동물을 생성하는 적합한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. (참조: 예를 들어 U.S. Pat. Nos. 5,939,598 and 6,075, 181 (Kucherlapati et al.), U.S. Pat. Nos. 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, and 5,789,650 (Lonberg et al.), Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 2555 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Lonberg et al. EP 0 814 259 A2, I Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), Lonberg et al., At Rev Ir'munol 13(1):65-93 (1995), Kucherlapati et al. WO i 96/34096, Kucherlapati et al. EP 0 463 151 B1, Kucherlapati et al. EP 0 710 719 Al, Surani et al. US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et aL EP 0 438 474 B1, Taylor et al., Int. Immuzol. 6(4)579-591 (1994), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287- 6295 (1992), Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 1 (1997), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8):3720-3724 (1993) 및 Fishwild et al., Nat Biotechrzol 14(7) :845-851 (1996), 상기 각각의 교시내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다).
인간 항체 형질전환 동물은 적합한 항원(예를 들어 인간 혈청 알부민)으로 면역화될 수 있고, 항체 생성 세포는 통상적인 방법으로 단리되고 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 요망되는 특성을 가지는 인간 항체를 생성하는 하이브리도마는 임의의 적합한 검정(예를 들어, ELISA)를 사용하여 확인될 수 있고, 요망되는 경우에 적합한 배양 기술을 사용하여 선별되고 서브클로닝될 수 있다.
인간화된 항체 및 다른 CDR-이식된 항체는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. CDR-이식된 항체의 CDR은 혈청 알부민에 결합하는 적합한 항체(공여자 항체로서 언급)로부터 유래될 수 있다. 적합한 CDR의 다른 공급원은 쥐과(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼), 닭, 돼지, 염소, 비인간영장류(예를 들어, 원숭이)와 같은 인간 또는 비인간 공급원 또는 라이브러리로부터 천연 및 인공 혈청 알부민-특이적 항체를 포함한다.
인간화된 항체의 프레임워크 영역은 바람직하게는 인간 기원이고, 공여자 항체의 항원 결합 영역의 유사체 또는 등가 영역(예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역)에 서열 유사성을 가지는 인간 항체 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. 인간 유래의 프레임워크 영역의 다른 공급원은 인간 가변 영역 컨센서스 서열을 포함한다(참조: 예를 들어, Kettleborough, C.A. et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et ah, WO 94/04679; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). CDR 이식된 항체의 다른 타입은 말, 소, 개, 고양이 등으로부터의 생식 계열 항체예 의해 엔코딩된 프레임워크 영역과 같은 적합한 기원의 프레임워크 영역을 함유할 수 있다.
인간 유래의 프레임워크 영역은 인간 또는 동물 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 잔기를 공여자 항체의 대응하는 위치로부터의 잔기와 치환하는 "복귀 돌연변이"와 같은 아미노산 치환 또는 교환을 포함할 수 있다. 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이가 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 및 치환을 포함하여 행해질 수 있다. 변이체는 비인간 공여체 또는 수용체 인간 사슬의 돌연변이를 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, U.S. Patent Nos. 5, 693,762 (Queen et al.) and 5,859,205 (Adair et al.), 이들의 전체 교시 내용은 본원에 참조로 통합된다).
항체의 불변 영역, 항체 사슬(예를 들어 중쇄, 경쇄) 또는 이들의 단편 또는 일부는 존재하는 경우에 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체 및 특정 키메라 항체의 불변 영역, 항체 사슬(예를 들어 중쇄, 경쇄) 또는 이들의 단편 또는 일부는 존재하는 경우에 임의의 적합한 인간 항체 또는 항체 사슬로부터 유래된다. 예를 들어 인간 유래의 불변 영역 또는 이들의 일부는 대립유저자 변이체를 포함하여 인간 κ 또는 λ 경쇄 및/또는 인간 γ(예를 들어, γ1, γ2, γ3, γ4), μ, α(예를 들어, α1, α2), δ 또는 ε 중쇄로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 도는 항원 결합 단편(예를 들어 인간 유래의 항체, 인간 항체)는 기능(예를 들어 작용기 기능)을 변경하거나 재단하는 아미노산 치환 또는 교체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 유래의 불면 영역(예를 들어, γ1 불변 영역, γ2 불변 영역)은 보체 활성화 및/또는 Fc 수용체 결합을 감소시키도록 설계될 수 있다. (예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,648,260 (Winter et al.), 5,624,821 (Winter et al.) and 5, 834,597 (Tso et al.) 참조, 상기의 전체 내용은 참조로 본원에 통합된다.) 바람직하게는, 이러한 아미노산 치환 또는 교체를 함유하는 인간 유래의 불변 영역의 아미노산 서열은 인간 유래의 변경되지 않은 불변 영역의 아미노산 서열에 대해 전체 길이에 걸쳐 약 95% 이상의 동일성을 가지고, 바람직하게는 인간 유래의 변경되지 않은 불변 영역의 아미노산 서열에 대해 전체 길에 걸쳐 약 99% 이상의 동일성을 가진다.
인간화된 항체, CDR 이식된 항체, 또는 인간화되거나 CDR 이식된 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 수개의 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, U.S. Patent No. 5,225,539 (Winter), U.S. Patent No. 5,530,101 (Queen et al.) 참조.) 인간화되거나 CDR 이식된 항체의 부분(예를 들어 CDR, 프레임워크, 불변 영역)은 적합한 항체(예를 들어, 부분의 드 노보 합성)로부터 수득되거나 직접 유래될 수 있거나, 요망되는 특성(예를 들어, 혈청 알부민에 결합하는 특성)을 가지는 항체 또는 이들의 사슬을 엔코딩하는 핵산이 생성되거나 발현될 수 있다. 사슬의 일부를 제조하기 위하여, 하나 이상의 정지 코돈이 요망되는 위치에 도입될 수 있다. 예를 들어, 인간화되거나 CDR 이식된 가변 영역을 코딩하는 핵산(예를 들어 DNA) 서열은 PCR 돌연변이 방법을 사용하여 존재하는 DNA 서열을 변경하여 제작될 수 있다(예를 들어, Kamman, M. , et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989) 참조). 새로운 CDR을 엔코딩하는 PCR 프라이머는 동일하거나 매우 유사한 인간 가변 영역에 기초하는 이전에 인간화된 가변 영역의 DNA 주형에 하이브리드화될 수 있다(예를 들어, Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993) 참조). 유사한 DNA 서열이 주형으로서 사용될 수 없는 경우에, 가변 영역 서열을 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 합성 올리고누클레오티로부터 제작될 수 있다(예를 들어, Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). 시그날 펩티드를 엔코딩하는 서열 또한 핵산에 도입될 수 있다(예를 들어, 합성시 벡터로 삽입시). 수용체 항체로부터의 천연 시그날 펩티드 서열, 다른 항체 또는 다른 적합한 서열로부터 시그날 펩티드 서열이 사용될 수 있다(예를 들어, Kettleborough, C.A., Protein E'zgineering 4:773 783 (1991) 참조). 이러한 방법 또는 다른 적합한 방법을 사용하여 변이체는 용이하게 생성될 수 있다. 일 구체예에서, 클로닝된 가변 영역이 돌연변이될 수 있고, 요망되는 특이성을 가지는 변이체를 엔코딩하는 서열이 선택될 수 있다(예를 들어 파지 라이브러리로부터, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,514,548 (Krebber et al.) 및 WO93/06213(Hoogenboom et al.)).
혈청 알부민에 결합하는 항체 또는 항원 걸합 단편이 키메라 항체 또는 키메라 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 하나의 종(예를 들어 마우스) 및 다른 종(예를 들어 인간)으로부터의 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 키메라 항체 및 키메라 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 수개의 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, U.S. Patent No. 4,816,567 (Cabilly et al.), U.S. Patent No. 5,116,946 (Capon et al.).) 참조).
혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 수득하기 위한 바람직한 방법은 항원 결합 단편의 레파토리로부터 요망되는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항원 결합 단편(예를 들어, scFV, dAb)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 적합한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 많은 적합한 박테리오파지 디스플레이 라이브러리 및 선택 방법(예를 들어 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기술되었다(예를 들어, e.g. Griffiths et al., U.S. Patent No. 6,555,313 B1 (본원에 참조로 통합됨); Johnson et a/., U.S. Patent No. 5,733, 743 (본원에 참조로 통합됨); McCafferty et al., U.S. Patent No. 5,969,108 (본원에 참조로 통합됨); Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892 (본원에 참조로 통합됨); Winter, G. et al. , Hindu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screens, 4(2):121-133 (2001); WO 99/20749 (Tomlinson and Winter); WO 03/002609 A2 (Winter et al.); WO 2004/003019A2 (Winter et al.)). 박테리오파지 라이브러리에 디스플레이된 폴리펩티드는 필라멘트형 파지(예를 들어, fd, M13, F1), 용혈성 파지(예를 들어, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파지(예를 들어 MS2)와 같은 임의의 적합한 박테리오파지상에 디스플레이될 수 있고, 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합을 위해 선택될 수 있다.
일반적으로, 적합한 파지 코우트 단백질과 융합 단백질로서 폴리펩티드 레파토리를 디스플레이하는 파지 라이브러리가 사용된다. 이러한 라이브러리는 적합한 숙주 박테리아로 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 도입하고, 생성된 박테리아를 배양하여 파지를 생성하는 것(예를 들어, 적합한 헬퍼 파지 또는 요망되는 경우 보조(complementing) 플라스미드과 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 파지 라이브러리는 침전 및 원심분리와 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 이러한 배양물로부터 회수될 수 있다.
라이브러리는 임의의 요망되는 양의 아미노산 서열 다양성을 함유하는 항체 또는 항원 결합 단편의 레파토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레파토리는 요망되는 유기체로부터의 천연에 나타나는 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유할 수 있고/거나 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 하나 이상의 영역(예를 들어, CDR 서열)을 함유할 수 있다. 이러한 레파토리 또는 라이브러리에서 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이 공통 아미노산 서열의 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 규정된 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레파토리에서 모든 또는 실질적으로 모든 폴리페비드는 요망도는 타입의 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)이다. 예를 들어, 레파토리에서 각 폴리펩티드는 VH, VL, 또는 Fv(예를 들어, 단일 쇄 Fv)를 함유할 수 있다.
아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 임의의 요망되는 영역의 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은, 임의의 적합한 돌연변이 방법(예를 들어 낮은 충실도의 PCR, 올리고누클레오티드-매개되거나 위치 지정 돌연변이, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 다양화된 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역과 같은 표적 영역으로 도입될 수 있다. 요망되는 경우에, 다양화될 항체 또는 항원 결합 단편의 영역은 무작위화될 수 있다.
다양한 파지 디스플레이는 혈청 알부민에 결합하고 다른 유익한 특성을 가지는 선택된 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴딩되지 않은 경우에 응집을 저지하는 항체 또는 항원 결합 단편이 선택될 수 있다. 응집은 폴리펩티드 농도에 의해 영향을 받고 부분적으로 폴딩되거나 폴딩되지 않은 중간체로부터 많은 경우에 일어나는 것으로 생각된다. 상승된 온도 및 높은 폴리펩티드 농도와 같은 부분적으로 폴딩된 중간체를 선호하는 인자 및 조건은 비가역적 응집을 촉진시킨다(Fink, A.L., Folding & Design 3:R1-R23 (1998)). 예를 들어, 동결건조된 제조물과 같은 농축된 형태로 정제된 폴리펩티드를 저장하는 것은 종종 적어도 폴리펩티드의 일부의 비가역적 응집을 초래한다. 또한, E. coli와 같은 생물학적 시스템에서의 발현에 의한 폴리펩티드의 생성은 종종 응집된 폴리펩티드를 함유하는 봉입체(inclusion body)의 형성을 초래한다. 봉입체로부터 활성 폴리펩티드를 회수하는 것은 매우 어렵고 재폴딩 단계와 같은 추가의 단계를 생물학적 생성 시스템에 첨가할 것을 필요로 한다.
가열되었을 때 응집 및 재폴딩을 가역적으로 저지하는 항체 및 항원 결합 단편은 적합한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 디스플레이된 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리는 적어도 일부의 디스플레이된 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이 재폴딩되고 일부의 폴리펩티드가 응집되는, Ts>Tc인 온도 (Tc)로 냉각된다. 다음, 비가역적으로 폴딩되지 않고 혈청 알부민에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편은 온도(Tr)에서 회수된다. 가역적으로 폴딩되지 않는 회수된 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 용융 온도(Tm)을 가지고, 바람직하게는 레파토리가 Ts로 가열되고, Tc로 냉각되고, 가역적으로 폴딩되지 않는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이 Ts>Tm>Tc, 및 Ts>Tm>Tr과 같은 Tr에서 분리되었다. 일반적으로 파지 디스플레이 라이브러리는 약 80℃로 가열되고 약 실온 또는 약 4℃로 선택전에 냉각된다. 가역적으로 폴딩하지 않는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 가역적으로 폴딩되지 않은 능력을 제공하는 잔기로 특정 아미노산 잔기를 치환함에 의해 설계되거나 가공될 수 있다(예를 들어, 가역적으로 폴디오디지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 선택하고, 설계 또는 가공하는 방법에 대한 상세한 논의는 문헌(WO 2004/101790 (Jespers et al.), 및 U.S. Provisional Patent Application Nos: 60/470,340 (2003년 5월 14일에 출원) 및 60/554,021 (2004년 3월 17일에 출원))을 참조할 수 있다. WO 2004/101790 및 상기 두개의 미국 가특허출원의 교시내용은 본원에 참조로 통합된다).
가역적으로 폴딩되지 않고 응집을 저지하는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 수개의 이점을 제공한다. 예를 들어, 응집에 대한 이들의 저지능으로 인하여, 가역적으로 폴딩하지 않는 항체 또는 항원 결합 단편은 E. coli와 같은 적합한 생물학적 생성 시스템을 사용하여 발현에 의해 가용성 단백질로서 고수율로 용이하게 생성될 수 있다. 또한, 가역적으로 폴딩하지 않는 항체 또는 항원 결합 단편은 통상적인 폴리펩티드 보다 더 높은 농도로 제형화되고/거나 보관될 수 있다. DOM7h-26(서열번호: 20)은 가역적으로 폴딩되지 않는 인간 VH이다.
바람직하게는, 혈청 알부민에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 프레임워크 영역(FR)이 (a) 인간 프레임 워크 영역의 아미노산 서열, (b) 인간 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 8개 이상의 아미노산, 또는 (c) 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하고 카바트(Kabat)에 의해 규정된 바와 같은 가변 도메인(Vн, Vκ, Vλ)를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, 상기 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 서열이 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크의 아미노산 서열에 비하여 5개 아미노산 이하의 차이를 포함한다.
다른 구체예에서, FR1, FR2, FR3, 및 FR4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나, FR1, FR2, FR3, 및 FR4의 아미노산 서열은 상기 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 비하여 10개 이하의 아미노산 서열 차이를 집합적으로 함유한다. 다른 구체예에서, FR1, FR2, FR3, 및 FR4의 아미노산 서열은 상기 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 상응하는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다.
특정 구체예에서, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 생식계열 서열에 기초한 면역글로불린 가변 도메인(예를 들어, VH, VL)을 포함하고, 요망되는 경우 상보성 결정 영역과 같은 하나 이상의 다양화된 영역을 가질 수 있다. VH를 위한 적합한 인간 생식계열 서열은 예를 들어 VH 유전자 세그먼트 DP4, DP7, DP8, DP9, DP10, DP31, DP33, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 및 DP69, 및 JH 세그먼트 JH1, JH2, JH3, JH4, Jκ4b, JH5 및 JH6에 의해 엔코딩되는 서열을 포함한다. VL을 위해 적합한 인간 생식계열 세그먼트는 예를 들어, Vκ유전자 세그먼트 DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPKl9, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 및 DPK28, 및 Jκ 세그먼트 Jκ 1, Jκ 2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5에 의해 엔코딩되는 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 또는 약물 융합체는 혈청 알부민에 결합하는 마우스, 래트 및/또는 토끼 항원 또는 이러한 항체의 항원 결합 단편을 함유하지 않는다.
항원 결합 단편은 온 속도(on rate) 및 오프 속도(off rate)로 요망되는 친화도로 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 친화도(KD), 온 속도(Kon 또는 ka) 및 오프 속도(Koff, 또는 kd)는 특정 약물에 대한 요망되는 혈청 반감기를 수득하기 위하여 선택될 수 있다. 예를 들어 만성 염증성 질환의 염증성 매개체를 중화하는 약물(예를 들어, 염증성 시토카인에 결합하여 중화하는 dAb)에 대해 요망되는 혈청 반감기를 수득하는 것이 바람직하고, 보다 짧은 반감기는 약간의 독성을 가지는 약물(예를 들어, 화학치료제)를 위해 바람직할 수 있다. 일반적으로 혈청 알부민에 결합하기 위한 빠른 온 속도 및 빠르거나 중간인 오프 속도가 바람직하다. 이러한 특성을 가지는 항원 결합 단편을 포함하는 약물 컨쥬게이트 및 약물 융합체는 투여된 후에 혈청 알부민에 빠르게 결합하고 해리되어 따르게 혈청 알부민에 재결합한다. 이러한 특성을 약물의 빠른 청소율(clearance)을 감소시키지만 약물 표적으로 효율적으로 전달하고 접근할 수 있게 할 것이다.
혈청 알부민(예를 들어 dAb)에 결합하는 항원 결합 단편은 일반적으로 약 1nM 내지 약 500μM의 KD로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 단편은 표면 플라즈몬 공명기술(예를 들어 BIACORE 장치를 사용하였을 때)에 의해 측정되었을 때 약 10 내지 약 100nM 또는 약 100nM 내지 약 500nM, 또는 약 500nM 내지 약 5mM의 KD (KD=Koff(kd)/Kon (ka))로 혈청 알부민에 결합한다. 특정 구체예에서, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체는 약 50nM, 또는 약 70nM, 또는 약 100nM, 또는 약 150nM, 또는 약 200nM의 KD로 혈청 알부민(예를 들어 인간 혈청 알부민)에 결합하는 항체(예를 들어, dAb)의 항원 결합 단편을 포함한다. 본원에 기술된 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트 및 약물 융합체의 개선된 약동학적 특성(예를 들어, 연장된 t1/2β, 증가된 AUC)는 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편의 친화도와 상관관계를 가질 수 있다. 이에 따라, 개선된 약동학적 특성을 가지는 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트 및 약물 융합체는 일반적으로 높은 친화도(예를 들어, 약 500nM 이하, 약 250nM 이하, 약 100nM 이하, 약 50nM 이하, 약 10nM 이하, 또는 약 1nM 이하, 또는 약 100pM 이하의 KD)로 혈청 알부민(예를 들어 인간 혈청 알부민)에 결합하는 항원 결합 단편을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편에 컨쥬게이트되거나 융합되는 약물은 표면 플라즈몬 공명기술(예를 들어 BIACORE 장치를 사용하였을 때)에 의해 측정되었을 때 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편의 친화도 보다 더 강한 친화도(KD) 및/또는 혈청 알부민을 위한 항원 결합 단편의 Koff 보다 빠른 Koff(kd)로 이의 표적(약물 표적)에 결합한다. 예를 들어, 약물은 SA에 대한 SA와 결합하는 항원 결합 단편의 친화도 보다 약 1 내지 약 100000, 또는 약 100 내지 약 100000, 또는 약 1000 내지 약 100000, 또는 약 10000 내지 약 100000 배 강한 친화도로 이의 표적에 결합할 수 있다. 예를 들어, SA에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 약 10μM의 친화도로 결합할 수 있고, 약물을 약 100pM의 친화도로 이의 표적에 결합한다.
특정 구체예에서, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb이다. 예를 들어, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 Vκ dAb, 또는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22, 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 VH dAb. 다른 구체예에서, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 혈청 알부민에 결합하고 상기 아미노산 서열의 임의의 것의 CDR을 포함하는 dAb이다. 다른 구체예에서, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb이고, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 서열번호:26, 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22, 또는 서열번호:23과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 약 97% 이상 또는 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열 동일성은 바람직하게는 BLAST P와 같은 적합한 서열 정렬 알고리즘 및 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264- 2268(1990)).
약물
본 발명의 특정 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트)는, 예를 들어 개체에서 생물학적 표적 분자에 결합하고/거나 이의 기능을 변경시킴에 의해, 유익한 치료 또는 진단 효과를 생성하기 위하여 개체에 투여될 수 있는 임의의 약물(예를 들어 작은 유기 분자, 핵산, 폴리펩티드)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 약물 조합체(예를 들어 약물 융합체)는 폴리펩티드 또는 펩티드 약물을 포함할 수 있다. 약물 융합체의 바람직한 구체예에서, 약물은 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편(예를 들어 Vн, Vκ, Vλ)을 포함하지 않는다. 본 발명에서 사용되는 적합한 약물은 예를 들어, 면역억제제(예를 들어, 시클로스포린 A, 라파마이신, FK506, 프리드니손), 항바이러스제(아시클로버, 간시클로버, 이디나버), 항생제(페니실린, 미노실린, 테트라사이클린), 항염증제(아스피린, 이부프로펜, 프레드니손), 사이토톡신 또는 세포독성제(예를 들어, 파크리탁셀, 사이토찰라신 B, 그라미시딘 D, 에트듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신 C, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미토산트론, 미트라마이신, 안티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신, 및 이들 약물의 임의의 것의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 적합한 약물은 또한 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캡토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라신, 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파클로람부실, CC-1065, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 로부스틴 C 및 시스-디클로로디아민 플래티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노로비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라미이신(AMC)), 방사선핵종(예를 들어, 요오드-125, -126) 이트륨(예를 들어 이트륨-90, -91) 및 프라세오디미움(예를 들어, 프라세오디미운-144, -145) 및 프로테아제 억제제(예를 들어 기질 금속프로테나아제의 억제제)를 포함한다. 다른 적합한 약물은 안티센스 핵산 및 RNAi와 같은 핵산이다. 칼리케마이신 또한 본발명에 사용하기에 적합하다.
적합한 약물은 또한 나르코틱(예를 들어 코데인, 날메펜, 날로손, 펜타닐, 메페리딘, 모르핀, 트라마돌, 프로폭시펜, 옥시코돈, 메타돈, 날부핀)을 포함하는 진통제, 비스테로이드계 항염증제(예를 들어 인도메타신, 케토롤락, 아르토로텍, 이부프로펜, 나프록센, 살리실레이트, 셀레콕시브, 로페콕시브), 아세타미노펜, 캅사이신, 지코노티드 등을 포함한다.
특정 구체예에서, 약물은 폴리펩티드 독소, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프로테리아 독소이다. 다른 적합한 폴리펩티드 약물은 항체 또는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb), 폴리펩티드 작용제, 활성화제, 분비촉진제, 길항제 또는 억제제를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드 약물은 CD 항원과 같은 세포 표면 단백질, 사이토카인 수용체(예를 들어 인터루킨 수용체, 케모카인 수용체), 어드히젼(adhesion) 분자 또는 보조자극성(costimulatory) 분자에 결합하여 작용하거나 길항작용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 약물은 시토카인, 성장 인자, 시토카인 수용체, 성장 인자 수영체 및 다른 표적 리간드에 결합할 수 있고, 이들은 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 칼디오트로핀-l, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, FAPoc, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈카인 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-01, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-y, IGF-I, IGF-II, IL-lα, IL-1β, IL-1 수용체, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL 6,IL-7,IL-8(72a.a.),IL-8(77a.a.),IL-9, IL-10, IL-ll, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈α, 인히빈β, IP-10, 케라티노사이트 성장 인자-2 (KGF 2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮐러(Mullerian) 억제 성분, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), t MIG, MIP-lc, MIP-1p, MIP-3a, MIP-3p, MIP-4, 골수계 전구세포 억제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴투린(Neurturin), 신경 성장 인자, ,8-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴(Oncostatin) M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFla, SDF1p, SCF, SCGF, 줄기세포인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-2, TGF-03, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B. VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4를 비제한적으로 포함한다. 이렇게 나열된 것들은 결코 철저한 것이 아님을 인식할 것이다.
적합한 약물은 또한 뇌하수체 호르몬(PTH), 부신피질자극성 호르몬(ACTH), 레닌, 루테인 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 성선자극 방출 호르몬(GnRH), 루테인 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH), 알도스테론 등을 포함하는 호르몬을 포함한다. 적합한 약물은 또한 케라티노사이트 성장 인자, 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 에리트로포이에틴(EPO), 프로테아제, 엘라스타아제, LHRH 유사체, 작용제 및 길항제, 카파 오피오이드 수용체 길항제(예를 들어, 다이노르핀 A)와 같은 오피오이드 수용체 작용제, 칼시토닌 및 칼시토닌, 항이뇨호르몬(바소프레신), 옥시토신 길항제, 혈관성 장 펩티드, 트롬빈 억제제, 폰 빌레브란트 인자, 계면활성제, 및 달팽이 독액(예를 들어, 지코노티드)를 포함한다.
적합한 약물은 또한 항암 활성(예를 들어 증식 억제, 성장 억제, 애팝토시스 유도, 전이 억제, 부착 억제, 신혈관형성 억제)을 가지는 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다. 수개의 이러한 펩티드 및 폴리펩티드는 당분야에 공지되어 있다(예를 들어 Janin Y.L., Amino Acids, 25:1 -40 (2003)). 참조 문헌의 전체 교시 내용, 특히 본원에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 참조로 통합된다. 수개의 이러한 펩티드의 아미노산 서열은 표 8에 제시된다.
다른 적합한 약물은 항바이러스 활성을 가지는 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다. 수개의 이러한 펩티드 및 폴리펩티드는 예를 들어 문헌(Giannecchini, et al., J Biro., 77(6):3724 33 (2003); Wang, J., et al., Clin Chem (2003) ; Hilleman, M.R., Vaccine, 21(32):4626-49 (2003); Tziveleka, L.A., et al., Curr Top Med Chem, 3(13):1512-35 (2003); Poritz, M.A., et al., Virology, 313(1):170-83 (2003); Oevermann, A., et al., I Antiviral Res, 59(1):23-33 (2003); Cole, A.M. et al., Curr Pharm Des, 9(18):1463- t 73 (2003); Pinon, J.D., et al., Virol, 77(5):3281-90 (2003); Sia, S.K., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99(23):14664-9 (2002); Bahbouhi, B., et al., Biochem J. 66(Pt It 3):863-72 (2002); de Soultrait, V.R., et al, JMol Biol, 18(1):45- 58 (2002); Witherell, G., Curr Opin Investig Drugs, 2(3):340-7 (2001); Ruff, M.R., et al., Antiviral Res, 52(1):63-75 (2001); Bultmann, H., et al., J. Virol, 75(6):2634-45 (2001); Egal, M., et al., Int JAntimicrob AGents, 13(1):57-60 (1999); and Robinson, W.E., Jr., JLeuLoc Biol, 63(1) :94-100(1998))에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하여 당분야에 공지되어 있다. 이들 참조분헌의 전체 교시 내용, 특히 본원에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드는 참조로 본원에 통합된다. 이들 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 조합체, 약물 융합체, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트에 사용될 수 있는 약물의 예이다.
폴리펩티드 약물은 또한 시토카인 또는 증식 인자, 또난 수영체의 가용성 부분(예를 들어 시토카인 수용체, 증식 인자 수용체, 호르몬 수용체) 또는 상기 나열된 폴리펩티드와 같은 다른 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 적합한 폴리펩티드 약물은 또한 인터루킨 1 수용체 길항제((Eisenberg et al.. Nature 343:341-346 (1990)), 트롬보포이에틴 수용체 길항제(예를 들어, (de Serres et al., Stem Cells 17:316-326 (1999)), 멜라노코르틴 수용체 길항제((e.g. MCR-4 antagonists (Cepoi et al., Brain Res. 1000:64-71 (2004)), 안지넥스, 6DBF7(Mayo et al., J. Biol. Chem. 278:45746-45752 (2003)), 케모카인 미메틱 (예를 들어, RANTES 미메틱 (Nardese et al., Nat. Struct. 　Biol. 8:611-615 (2001)), 성장 호르몬(예를 들어, 인간 성장 호르몬), 성장 호르몬 유사체 및 성장 호르몬 분비촉진제 (예를 들어, CP-424,391 (MacAndrew et al., Eur. J. Pharmacol. 432:195-202 (2001)), 성장 호르몬 방출 호르몬 미메틱(예를 들어, MK-677 (Chapman et al., J. Clin. Endocrirol. Metab. 82:3455-3463 (1997)), 세포 부착 분자 상호작용 억제제(예를 들어, LFA-l/ICAM-l, VLA-l/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al., Med. Res. Rev. 22. 146-167 (2002)), 인터페론 미메틱(예를 들어, SYR6 (Sato et al., Biochem. J. 371(Pt.2):603-608 (2003), 헤르셉틴 미메틱(Nature Biotechnol. 18:137 (2000)), 항원 제시 억제제(Bolin et al., J. Med. Chem. 43:2135-2148 (2000)), GPIIB/IIIA 길항제(예를 들어, FK633 (Aoki et al., Thromb. Res. 81:439-450 1 (1996)), 알파브베타3 길항제(예를 들어, SC56631 (Engleman et al., J. Clin. Invest. t 99:2284- 2292 (1997)), 에리트로포이에틴 미메틱 (e.g. EMP1 (Johnson et al., Biochemistry 37:3699-3710 (1998)), 오피오이드 수용체 길항제(예를 들어, [(2S, 3R)-TMT]DPDPE(Liao et al., J. Med. Chen. 41:4767-4776 (1998)), 조혈성 인자(예를 들어, 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구 콜로니 자극 인자 (GM CSF))수용체(예를 들어, 증식 인자 수용체, 시토카인 수용체, 호르몬 수용체)와 같은 작용제 및 길항제를 포함한다.
추가의 적합한 펩티드 및 폴리펩티드 약물은 인간 타입 1 IL-1 수용체에 결합하는 펩티드 길항제(예를 들어, AF 11377 (FEWTPGYWQPYALPL, 서열번호:56), AF11869 (FEWTPGYWQJYALPL, 서열번호:57 (J = 1-아제티딘-2-카르복실산), FEWTPGYWQJY (서열번호:58), FEWTPGWYQJY (서열번호:59), FEWTPGWYQJYALPL (서열번호:60), 또는 아실화된 아미노 말단 및/또는 아민화된 카르복실 말단을 임의로 함유하는 상기 서열 중 임의 것(Akeson et al., J Biol. Chem. 271:30517-305123 (1996)), TNF-알파-매개 독성의 펩티드 길항제(예를 들어, 문헌(Chirinos-Rojas et al, J. Immurol. 161:5621-5626 (1998)), 에리트로포이에틴 수용체의 펩티드 작용제(예를 들어, 문헌(McConnel et al., Biol. Chem. 379: 1279-1286 (1998) 또는 Wrighton et al., Scierce 273:458-464 (1996))에 공지된 것들; 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1, 예를 들어, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)아미드 및 이들의 유사체(참조: 예를 들어, Ritzel U. et al., J. E:ndocrinology 159:93-102 (1998)), 및 인터페론(예를 들어, INFα, INFβ,INFγ)을 포함한다. 추가의 적합한 폴리펩티드 및 펩티드 약물은 인테그린 억제제(예를 들어, RGD 펩티드, 예를 들어 H-Glu[시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)]2(Janssen, M.L., et al., Cancer Research 62:6146- 6151 (2002)), 시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(Kantlehner M., et al., Agnew. Chem. Int. Ed. 38.560 (1999)), 시클로(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)(Haubner, R., et al., J. Nucl. Med. 42:326-336 (2001)), 리보좀-불활성화 단백질 (RlPs) 예를 들어 사포닌(예를 들어, 서열번호:67), 기질 금속프로테아제 억제제(예를 들어, U.S. Patent No. 5,616,605), 및 항바이러스 펩티드 및 폴리펩티드, 예를 들어 HIV 융합체 억제제(예를 들어, T-1249 및 T-20 (FUZEON ®(엔푸버타이드), Trimeris Inc.), 및 가용성 수용체 길항제 예를 들어 면역어드히젼(예를 들어, LFA3-Ig, CTLA4-Ig)을 포함한다.
항미생물성 폴리펩티드 및 펩티드 약물은 또한 본 발명에 사용하기에 적합한다. 적합한 항미생물성 폴리펩티드 및 펩티드 약물의 예는 아데노레귤린, 덤시딘-1L, 카텔리시딘(cathelicidin)(예를 들어, 카텔리시딘 유사 펩티드, 인간 LL- 37/hCAP-18), α-데펜신(예를 들어, 인간 호중구 펩티드 1 (HNP-1), HNP-2, HNP-3, HNP-4, 인간 데펜신 5, 인간 데펜신 6), β-데펜신 (e.g., 인간 β-데펜신-l, 인간 -데펜신-2), 및 θ-데펜신 (예를 들어, θ-데펜신-l)을 포함하는 데펜신(defensin), 히스타틴(예를 들어, 히스타틴 1, 히스타틴 3, 히스타틴 5), 락토페리신-유래 펩티드 및 관련 펩티드(참조, Tomita M., et al., Acta Paediatr. Jpn. 36:585-591 (1994) 및 Strom, M.B., et al. Biochem Cell Biol. 80:65-74 (2002))를 포함한다.
약물 융합체
본 발명의 약물 융합체는 연속적인 폴리펩티드 사슬을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 사슬은 폴리펩티드 약물인 제 2 잔기에 연결된 제 1 잔기로서 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 제 1 및 제 2 잔기는 펩티드 결합을 통해 서로에게 직접 결합될 수 있거나, 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결된다. 추가 잔기(예를 들어 제 3, 제 4) 및/또는 링커 서열은 적절하게 제시될 수 있다. 제 1 잔기는 N-말단 위치, C-말단 위치, 또는 제 2 잔기(예를 들어, 폴리펩티드 약물)에 대해 내부에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, 각 잔기는 1 카피 이상으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 약물 융합체는 각각이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 2개 이상의 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 VH 및 인간 혈청 알부민에 결합하는 VL, 또는 인간 혈청 알부민에 결합하는 둘 이상의 VH 또는 VL).
일부 구체예에서, 약물 융합체는 하기 화학식을 가지는 연속된 폴리펩티드이다:
a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d 또는 a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d,
상기 식에서, X는 제 1 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 약물이고,
Y는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 단일 사슬 항원-결합 단편이고,
Z는 제 2 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드이고,
a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 부재하거나 1 내지 약 100개 아미노산 잔기이고,
n1은 1 내지 약 10이고,
n2는 1 내지 약 10이고,
c3는 0 내지 약 10이며,
단, n1 및 n2가 둘 모두 1이고 n3가 0인 경우에 X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
일 구체예에서, X와 Z 모두는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다. 일 구체예에서, n1은 1이고, n3는 1이고, n2는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 바람직하게는, Y는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이다. 보다 바람직하게는, Y는 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb(예를 들어, Vн, Vκ, 또는 Vλ)이다. 특정 구체예에서, X 또는 Z는 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 작용성 변이체이다.
특정 구체예에서, Y는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Y는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 약물 융합체는 잔기 X' 및 Y'를 포함하고, X'는 폴리펩티드 약물이고, 다만 X'가 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않으며, Y'는 혈청 알부민에 결합 특이성을 가지는 항체의 단일 사슬 항원 결합 단편이다. 바람직하게는, Y'는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 가변 도메인(Vн), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이다. 보다 바람직하게는, Y'는 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb(예를 들어, Vн, Vκ, 또는 Vλ)이다. X'는 Y'에 대해 아미노 말단에 위치할 수 있거나, Y'는 X'에 대해 아미노 말단에 위치할 수 있다. 일부 구체예에서, X' 및 Y'는 아미노산 또는 2 내지 약 10개 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 분리된다. 특정 구체예에서, X'는 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 작용성 변이체이다.
특정 구체예에서, Y'는 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Y'는 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 약물 융합체는 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 인간 IL-1ra(서열번호:28)를 포함한다. 바람직하게는 dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고 인간 프레임워크 영역을 포함한다.
다른 구체예에서, 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트는 인간 IL-1ra의 성숙한 152개 아미노산 형태와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 가지고 인간 인터루킨-1 타입 1 수용체를 길항작용하는 인간 IL-1ra의 작용성 변이체를 포함한다(참조: Eisenberg et al., Nature 343: 341-346, (1990)). 변이체는 하나 이상의추가의아미노산을 포함한다(예를 들어 153 또는 154개 아미노산을 포함한다). 본 발명의 약물 융합체는 임의의 적합한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 적합한 발현 벡터로 약물 융합체를 엔코딩하는 핵산을 삽임합에 의해 생성될 수 있다. 생성된 작제물은 발현을 위해 적합한 숙주 세포로 도입된다. 발현시에, 융합 단백질은 임의의 적합한 방법을 사용하여 세포 용해물 또는 바람직하게는 배양 배지 또는 원형질막공간(periplasm)으로부터 분리되거나 정제될 수 있다(참조: 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)).
적합한 발현 벡터는 많은 성분 예를 들어, 복제 오리진, 선택 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트, 예를 들어 전사 조절 엘리먼트(예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결자) 및/또는 하나 이상의 번역 시그날, 시그날 서열 또는 리더 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 제어 엘리먼트 및 시그날 서열이 존재하는 경우 이들은 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산 서열의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 발현을 지시하기 위해 사용될 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성성(constitutive) 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 바람직하게는 항체, 항체 사슬 또는 이들의 부분을 엔코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 핵산의 전사를 지시할 수 있다. 원핵(예를 들어, E. coli에 대한 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵(예를 들어, 유인원 바이러스 40 초기 및 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터) 숙주를 위한 다양한 적합한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 통상 벡터를 지니는 숙주 세포의 선택을 위한 선택 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터의 경우에 오리진 또는 레플리케이션을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 제공하는 생성물을 엔코딩하는 유전자는 공통의선택 마커이고 원핵 세포(예를 들어, 락타마아제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로사이신 내성 유전자)에 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원제 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트로의 선별을 가능하게 한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2 , URA3 , HIS3)는 종종 효모에서 선택 마커로서 사용된다. 바이러스(예를 들어 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 게놈으로 인테그레이션할 수 있는 벡터 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 또한 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵세포(E. coli), 곤충 세포(초파리 슈니에더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모(P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae)에서 발현을 위한 적합한 발현 벡터가 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 기술된 바와 같이 약물 융합체를 발현하는 재조합 숙주 세포 및 약물 융합체 제조 방법이 제공된다. 재조합 숙주 세포는 약물 융합체를 엔코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 약물 융합체는 적합한 숙주 세포에서 단백질을 엔코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의하거나 다른 적합한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 발현 작제물은 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있고, 생성된 세포는 작제물의 발현에 적합한 조건하에서 유지될 수 있다(예를 들어, 배양물에서, 동물에서). 적합한 숙주 세포는 E.coli, B. Subtilis와 같은 박테리아 세포를 포함하는 원핵세포, 또는 다른 적합한 박테리아, 진핵세포 예를 들어 균류 또는 효모 세포(예를 들어, Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharonyces pombe, Neurospora crassa) 또는 다른 저급 진핵세포, 및 고급 진핵세포, 예를 들어 곤충 유래의 것들(예를 들어, Sf9 곤충 세포 (WO 94/26087 (O'Connor)) 또는 포유동물 유래의 것(예를 들어, COS 세포, 예를 들어 COS-1 (ATCC L 수탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7 (ATCC 수탁 번호 CRL-1651), CHO (예를 들어, ATCC 수탁 번호 CRL-9096), 293 (ATCC 수탁 번호 CRL-1573), HeLa (ATCC 수탁 번호 CCL-2), CV1 (ATCC 수탁 번호 CCL-70), WOP I (Dailey et al., J. Virol. 54:739-749 (1985)), 3T3, 293T (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), NSO 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등 (참조: 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., eds. Currert Protocols ir' Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993))일 수 있다.
본 발명은 또한 약물 융합체의 발현을 위해 적합한 조건하에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 유지시키는 것을 포함하여 약물 융합체를 생성하는 방법을 포함한다. 방법은 추가로 요망되는 경우에 약물 융합체를 분리하거나 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 약물 융합체의 성분(예를 들어 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 IL-1ra)이 화학적으로 조립되어 연속적인 폴리펩티드 사슬을 생성한다.
컨쥬게이트
다른 측면에서, 본 발명은 약물에 결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다.
이러한 컨쥬게이트는, 약물이 공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "약물 컨쥬게이트", 및 약물이 비공유결합된 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 "비공유결합성 약물 컨쥬게이트"를 포함한다. 바람직하게는, 컨쥬게이트는 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편 및 약물이 생체내 환경(예를 들어 인간에게 투여되는 경우) 서로에게 실질적으로 결합된(공유결합적으로 또는 비공유결합적으로) 체로 유지되기에 충분히 안정하다. 바람직하게는, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하로 또는 실질적으로 0%로 해리되거나 분해되어 "생체내" 조건하에서 약물 및 항원 결합 단편을 방출한다. 예를 들어, "생체내" 조건하에서의 안정성은 37℃에서 혈청(예를 들어 인간 혈청)에서 24 시간 동안 약물 컨쥬게이트 또는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트를 인큐베이션함에 의해 편리하게 평가될 수 있다. 이러한 방법의 일 실시예에서, 동일한 양의 약물 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트되지 않은 약물은 2개의 상이한 혈청 바이얼로 희석된다. 각 바이얼의 함량의 반은 즉시 -20℃로 냉동되고, 다른 반은 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 모든 4개의 시료는 다음에 임의의 적합한 방법, 예를 들어 SDS-PAGE 및/또는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 분석될 수 있다. 웨스턴 블롯팅은 약물에 결합하는 항체를 사용하여 프로빙될 수 있다. 약물 컨쥬게이트 레인에서 모든 약물은 해리가 없다면 약물 컨쥬게이트의 크기로 실시될 것이다. 많은 다른 적합한 방법은 상기 기술된 바와 같이 제조된 시료를 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과, 이온 교환, 역상), ELISA, 질량 분광기 등과 같은 적합한 분석 방법을 사용하여 분석함에 의해 "생체내" 조건하에서 안정성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
약물 컨쥬게이트
다른 측면에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 하원 결합 단편을 포함하는 약물 컨쥬게이트, 및 상기 항원 결합 단편에 공유결합된 약물을 포함하고, 다만, 단일의 연속 폴리펩티드 사슬이 아닌 약물 컨쥬게이트를 제공한다.
일부 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알무빈에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로부털린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 상기 VH 또는 VL에 공유결합된 약물을 포함하고, 다만 약물 컨쥬게이트는 단일의 연속 폴리펩티드 사슬이 아니다. 바람직하게는, 약물 컨쥬게이트는 혈청 알부민에 결합하는 단일 VH 또는 혈청 알부민에 결합하는 VL을 포함한다. 특정 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 약물 컨쥬게이트는 인간 혈청 알부민에 결합하는 Vκ dAb를 포함하고, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 인간 혈청 알부민에 결합하는 VH dAb를 포함하고 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
약물 컨쥬게이트는 임의의 요망되는 약물을 포함할 수 있고 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 약물은 하나 이상의 위치, 예를 들어 아미노 말단, 카르복실 말단과 같은 적합한 링커, 또는 아미노산 잔기를 통해 직접 또는 간접적으로 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 폴리펩티드 약물(예를 들어, 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 작용성 변이체)에 결합하는 dAb를 포함하고, 폴리펩티드 약물의 아미노 말단(예를 들어, 인간 IL-1ra 또는 인간 IL-1ra의 작용성 변이체)은 직접 또는 적합한 링커 잔기를 통해 dAb의 카르복실 말단에 결합된다. 다른 구체예에서, 약물 컨쥬게이트는 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 dAb에 공유결합된 둘 이상의 상이한 약물을 포함한다. 예를 들어, 제 1 약물은 dAb의 카르복실 말단에 (직접 또는 간접적으로) 공유결합될 수 있고, 제 2 약물은 아미노 말단에 (직접 또는 간접적으로) 또는 측쇄 아미노기(예를 들어, 라이신의 ε 아미노기)를 통해 공유결합될 수 있다. 이러한 약물 컨쥬게이트는 선택적 커플링의 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조: Hermanson, G. T., Biocojugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편에 약물을 컨쥬게이션하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 선택된 특정 방법은 컨쥬게이션될 약물에 따라 다르다. 요망되는 경우, 말단 작용기를 함유하는 링커는 항원 결합 단편 및 약물을 연결하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이션은 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편과 직접 또는 링커와 반응성 작용기를 함유하는 약물을 반응시킴에 의해 달성된다(또는 반응성 작용기를 함유하도록 개질된다). 공유결합은 적절한 조건하에서 제 2 화학기와 반응할 수 있는 화학적 잔기 또는 작용기를 함유하는(또는 함유하도록 개질된) 약물을 반응시킴에 의해 공유 결합을 형성함에 의해 형성된다. 요망되는 경우에, 적합한 반응성 화학기는 임의의 적합한 방법을 사용하여 항원 결합 단편 또는 링커에 첨가될 수 있다(참조: 예를 들어, Hermanson, G. T., Biocorjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). 많은 적합한 반응성 화학기 조합은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 아민기는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-디하이드록시숙시닐이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 기와 반응할 수 있다. 티올은 요오도아세틸, 아클리로일, 피리딜, 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등과 반응할 수 있다. 알데하이드 작용기는 아민 또는 히드라지드 함유 분자와 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포르이미드 연결을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자에 도입하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Hermanson, G. T., Bioco'jugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
일부 구체예에서, 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편은 두개의 티올의 작용에 의해 약물에 결합되어 디설파이드 결합을 형성한다. 다른 구체예에서, 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편은 이소티오시아네이트기와 제 1 아민의 반응에 의해 약물에 결합되어 이소티오유레아 결합을 생성한다.
적합한 링커 잔기는 선형이거나 분지형일 수 있고, 예를 들어 테트라에틸렌 글리콜, C2-C12 알킬렌, -NH-(CH2)p-NH- 또는 -(CH2)p-NH(여기서, p는 1 내지 12), -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-, 1 내지 약 100개(바람직하게는 1 내지 약 12개) 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 사슬일 수 있다.
비공유결합성 약물 컨쥬게이트
일부 비공유결합(예를 들어, 수소결합, 반데르발스 상호작용)은 안정하고, 고도록 특이적인 분자간 연결을 생성할 수 있다. 예를 들어, 상보성 결합 파트너 사이의 여러 비공유결합을 통하여 달성되는 분자 인식 상호작용은 효소와 다른 기질의 결합, 항체에 의한 항원의 인지, 리간드와 이들의 수용체의 결합, 및 단백질 및 펩티드의 3차원 구조의 안정화와 같은 많은 중요한 생물학적 상호작용을 나타낸다. 이에 따라, 이러한 약한 비공유결합 상호작용(예를 들어, 수소결합, 반데르발스 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용 등)이 사용되어 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편에 약물을 결합시킬 수 있다.
바람직하게는, 항원 결합 단편 및 약물을 연결하는 비공유결합은 항원 결합 단편 및 약물이 생체내 환경(예를 들어, 인간에 투여된 경우)에서 서로에게 실질적으로 결합된 채로 유지되기에 충분한 강도를 가진다. 일반적으로, 항원 결합 단편 및 약물을 연결하는 비공유 결합은 약 1010M-1 이상의 강도를 가진다. 바람직한 구체예에서, 비공유결합의 강도는 약 1011M-1 이상, 약 1012M-1 이상, 약 1013M-1 이상, 1014M-1 이상, 또는 1015M-1 이상이다. 비오틴 및 아비딘, 비오틴 및 스트렙타비딘 사이의 상호작용은 매우 효과적이고 여러 조건하에서 아정한것으로 공지되어 있고, 본원에 기술된 바와 같이 비오틴 및 아비딘 또는 비오틴 및 스트렙타비딘 상이의 비공유결합은 본 발명의 비공유결합성 약물 컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다.
비공유결합은 혈청 알부민에 대해 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편 및 약물간에 직접 형성될 수 있거나, 적합한 상보적 결합 파트너(예를 들어, 비오틴과 아비딘 또는 스트렙타비딘) 사이에 형성될 수 있고, 여기서 한 파트너는 약물에 공유결합되고 상보적 결합 파트너는 항원 결합 단편에 공유결합된다. 상보적 결합 파트너가 사용되는 경우에, 결합 파트너의 하나는 직접 또는 적합한 링커 잔기를 통해 약물에 공유결합될 수 있고, 상보적 결합 파트너는 혈청 알부민에 직접 또는 적합한 링커 잔기를 통해 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 공유결합될 수 있다.
상보적 결합 파트너는 서로에게 선택적으로 결합하는 분자쌍이다. 많은 상보적 결합 파트너, 예를 들어, 항체(또는 이들의 항원 결합 단편) 및 이의 동족 항원 또는 에피토프, 효소 및 이들의 기질, 및 수용체 및 이들의 리간드가 공지되어 있다. 바람직한 상보적 결합 파트너는 비오틴과 아비딘, 및 비오틴과 스트렙타비딘이다.
혈청 알부민에 결합 특이성을 가지는 항원 결합 단편 또는 약물에 많은 상보적 결합쌍을 직접 또는 간접적으로 공유결합시키는 것은 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어 반응성 작용기를 함유하는 상보적 결합 파트너를 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 링커를 사용하거나 하지 않고 반응시킴에 의해 수행될 수 있다. 선택된 특정 방법은 컨쥬게이션되는 화합물(예를 들어, 약물, 상보적 결합 파트너, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편)에 따라 다를것이다 요망되는 경우에, 말단 반응성 작용기를 함유하는 링커(예를 들어, 호모이작용성 링커, 헤테로이작용성 링커)가 항원 결합 단편 및/또는 약물을 상보적 결합 파트너에 연결하는데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 두개의 구별된 반응성 잔기를 함유하는 헤테로이작용성 링커가 사용될 수 있다. 헤테로이작용성 링커는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편 또는 약물과 반응할 것이고, 다른 반응성 잔기는 상보적 결합 파트너와 반응할 것이다. 임의의 적합한 링커(예를 들어, 헤테로이작용성 링커)가 상요될 수 있고 많은 이러한 링커가 당업계에 공지되어 있고, 판매 공급원(예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크., IL)으로부터 입수가능하다.
조성물 및 치료 및 진단 방법
약제학적 또는 생리학적 조성물(예를 들어 인간 및/또는 척추동물 투여용)을 포함하는 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 조성물이 제공된다. 약제학적 또는 생리학적 조성물은 하나 이상의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 및 약제학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 통상, 이러한 담체는 염수 및/또는 완충 배지를 포함하여 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거 용액을 포함한다. 필요하다면 현탁액에 폴리펩티드 복합체를 유지하기 위하여 적합한 생리학적으로 허용되는 애쥬번트는 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알지네이트와 같은 증점제로부터 선택될 수 있다. 정맥내 비히클은 약체, 영양 보충제, 및 전해질 보충제 예를 들어 링거의 덱스트로오스에 기초한 것들을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체가 또한 존재할 수 있다(참조: Mack (1982) Remirgton's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
조성물은 요망되는 양의 약물 조합체(예를 들어 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 5중량% 내지 약 99중량% 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 컨쥬게이트 또는 약물 융합체를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물을 약 10% 내지 약 99%, 또는 약 20% 내지 약 99%, 또는 약 30% 내지 약 99%, 또는 약 40% 내지 약 99%, 또는 약 50% 내지 약 99%, 또는 약 60% 내지 약 99%, 또는 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 90% 내지 약 99%, 또는 약 95% 내지 약 99% 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 중량 기준으로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 조성물은 동결건조된다(동결건조(lyophilization)).
본원에 기술된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 통상 만성 폐쇄성 폐 질환(예를 들어, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 폐기종), 알레르기성 과민반응, 암, 박테리아 도는 바이러스 감염증, 폐렴 예를 들어 세균성 폐렴(예를 들어 스태필로코커스 뉴모니애), 자가면역 질환(타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 관절염(예를 들어, 골관절염, 류마티즘성 관절염, 청소년 류마티즘성 관절염, 건선 관절염, 루프스 관절염, 척추관절병변(예를 들어, 강직성 척추염), 전신 홍반성 루프스, 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 베체트 증후군, 및 중증근무력증), 자궁내막증, 건선, 복강 유착증(예를 들어, 복강 외과술 후), 천식 및 패혈성 쇼크와 같은 염증 상태(예를 들어, 급성 및/또는 만성 염증 질환)를 예방, 억제 또는 치료하기 위한 용도를 가질 것이다. 본원에 기술된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 만성 또는 급성 외상성 통증, 만성 또는 급성 신경병증성 통증, 급성 또는 만성 근골격 통증, 만성 또는 급성 암 통증 등과 같은 통증을 예방, 억제 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 본원에 기술된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 또한 진단 목적으로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 사용하여 예방, 억제, 또는 치료될 수 있는 암은 림프종(예를 들어 B 세포 림프종, 급성 골수 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 폐암(예를 들어 소세포폐암종, 비소세포폐암종), 결장암, 두경부암, 췌장암, 간암, 위암, 유방암, 남소암, 방광암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병), 아데노암종, 신장암, 조혈암(예를 들어, 골수이형성증후군, 골수증식성 질환(예를 들어, 적혈구과다증, 본태성(또는 일차) 혈소판증가증, 특발성 골수섬유증) 등을 포함한다.
본원에 기술된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 또한 섬유증, 불임증, 조기 진통, 발기부전, 골다공증, 당뇨병(예를 들어, 타입 II 당뇨병), 성장 장애, HIV 감염증, 호흡곤란증후군, 종약 및 야뇨증의 예방, 억제 또는 치료에 사용하기에 적합하다.
본 출원에서, 용어 "예방"은 질환의 유도 전에 보호성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 유도 사건 이후지만 질병의 임상적 출현 이전에 조성물을 투여하는 것을 의미한다. "치료"는 질병 증상이 명확해진 후에 보호성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
질병에 대해 보호하거나 치료하는 데 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 유효성을 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하다. 감수성 마우스에서 전신성 홍반성 루프스(SLE)를 테스트하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng J. I Med., 299: 515). 중증근무력증(MG)은 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질로 질환을 유도함에 의해 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다(Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주사에 의해 감수성 스트레인의 마우스에서 유도된다(Stuart et al. (1984) Arums. Rev. Immunol., 42: 233). 관절염은 애쥬번트 관절염이 마이코박테리아 열 쇼크 단백질에 의해 감수성 래트에서 유도되는 모델이 기술되어 있다(Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). 골관절염을 치료하는 유효성은 관절염이 콜라게나아제의 관절내 주사에 의해 유도되는 쥐과 모델에서 평가될 수 있다(Blom, A.B. et al., Osteoarthritis Cartilage 12:627-635 (2004). 갑상선염은 기술된 바와 같이 사이로글로불린의 투여에 의해 마우스에서 유도된다(Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM)은 천연에서 나타나거나 문헌(Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113)에 기술된 바와 같은 특정 스트레인의 마우스에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트에서 EAE는 인간에서 MS에 대한 모델로서 역활한다. 이 모델에서, 탈수초성 질환이 미엘린 염기성 단백질의 투여에 의해 유도된다(참조: Paterson (1986) Textbook of Im''unopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Scierce, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J. Immcol., 138: 179).
본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 별개로 투여되는 조성물 또는 다른 제제와 함계 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물 예를 들어 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄, 면역독소 등을 포함한다. 약제 조성물은 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체), 또는 상이한 약물을 포함하는 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 배합물과 함께 다른 세포독성제 또는 다른 제제의 "칵테일"을 포함할 수 있다.
약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 임의의 적합한 기술에 따라 임의의 개체 또는 피검체에 투여될 수 있다. 다양한 경로의 투여가 예를 들어 경구, 식이요법, 국소, 경피, 직장, 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근내, 피하, 피내, 복강내, 경막내, 관절내 주사), 및 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내, 또는 구강 흡입, 비강내 소적) 경로의 투여를 포함하는 경로가 가능하다. 바람직한 형태의 투여는 선택된 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체), 및 치료되어야 하는 질환(예를 들어, 질병)에 따라 다양하다. 투여의 용량 및 빈도는 환자의 연령, 성, 상태, 다른 약물의 동시 투여, 임상의에 의해 고려되어야 하는 다른 파라미터에 따를 것이다. 치료적으로 유효한 양의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)가 투여된다. 치료적 유효량은 투여 조건하에서 요망되는 치료 효과를 달성하는데 충분한 양잉다.
용어 "피검체" 또는 "개체"는 영장류(예를 들어 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 토끼, 기니아 피그, 래트, 마우스, 또는 다른 소과, 양과, 말과, 개과, 고양이과, 설치류, 또는 쥐과 종을 비제한적으로 포함하는 포유동물과 같은 동물을 포함하는 것으로 본원에 정의된다.
약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 천연 화합물 또는 염으로서 투여될 수 있다. 아민 또는 다른 염기성 기를 함유하는 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 염은 예를 들어 염화수소, 브롬화수소, 아세트산, 과염소산 등과 같은 적합한 유기산 또는 무기산과 반응시킴에 의해 수득될 수 있다. 4차 암모늄 기를 구비한 화합물은 또한 염소, 브롬, 요오드, 아세테이트, 과염소산염 등과 같은 상대음이온을 함유한다. 카르복실산 또는 다른 산성 작용기를 함유하는 화합물의 염은 적합한 염기 예를 들어 수산화 염기와 반응시킴에 의해 제조될 수 있다. 산성 작용기의 염은 나트륨, 칼륨 등과 같은 상대양이온을 함유한다.
본 발명은 또한 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체), 약물 전달 장치 및 임의로 사용 지시서를 포함하는, 피검체(예를 들어 환자)에 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 투여하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 동결건조된 제형과 같은 제형으로서 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 약물 전달 장치는 시린지, 흡입기, 비강내 또는 안내 투여 장치(예를 들어, 분무기, 안구 또는 비강 점적기, 및 바늘 없는 주사 장치로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 보관을 위해 동결건조시키고 사용 전에 적합한 담체로 재구성될 수 있다. 임의의 적합한 동결건조 방법(예를 들어 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실이 있을 수 있고(예를 들어 통상적인 면역글로불린에 있어서, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 가지려는 경향이 있다), 사용 수준이 보상할 수 있도록 조절되어야 할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 동결건조(lyophilization)된(동결 건조) 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 동결건조된(동결 건조) 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 재수화되었을 때 이의 활성(혈청 알부민에 대한 결합 활성)의 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하를 손실한다. 활성은 이것이 동결건조되기 전에 약물 조합체의 효과를 생성하는데 필요한 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 양이다. 예를 들어, 요망되는 기간 동안 요망되는 혈청 농도를 달성하고 유지하는데 필요한 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체의 양이다. 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 활성은 동결건조 전에 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있고, 활성은 손실 활성의 양을 결정하기 위하여 재수화 후에 동일한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 또는 이들의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방 및/또는 치료적 처치를 위하여 투여될 수 있다. 특정 치료적 사용에서, 선택된 세포 집단의, 부분적 또는 전체적 억제, 억제, 조절, 살상, 또는 다른 측정가능한 파라미터와 같은 투여 조건 하에서 요망되는 치료 또는 예방 효과를 달성하는데 충분한 양이 "치료적 유효량 또는 용량"으로서 정의된다. 이러한 용량을 달성하는데 필요한 양은 질병의 경중 및 환자의 면역계의 전체적 상태 및 전반적 건강에 따를 것이고, 일반적으로 체중 킬로그램당 약 10㎍/㎏ 내지 약 80㎍/㎏, 또는 약 0.005 내지 5.0㎎의 약물 조합체 또는 약물 융합체의 범위를 가지며, 0.05 내지 2.0mg/kg/용량이 보다 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)는 매일(예를 들어, 1일당 4회 이하), 2일마다, 3일마다, 주 2회, 주 1회, 2주에 1회, 1달에 1회, 또는 2달에 1회 예를 들어 약 10㎍/㎏ 내지 약 80㎍/㎏, 약 100㎍/㎏ 내지 약 80mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 80mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 70mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 60mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 50mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 40mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 20mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg, 약 10㎍/㎏ 내지 약 10mg/kg, 약 10㎍/㎏ 내지 약 5mg/kg, 약 10㎍/㎏ 내지 약 2.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 7mg/kg, 약 8mg/kg, 약 9mg/kg 또는 약 10mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
예방적 사용을 위하여, 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체) 또는 이들의 칵테일은 또한 유사하거나 다소 적은 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약물 조합체(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 비공유결합성 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)를 함유하는 조성물은 포유동물의 선택된 표적 세포 집단의 변경, 불활성화, 살생 또는 제거를 돕기 위하여 예방적 또는 치료적 세팅으로 활용될 수 있다.
실시예
인터루킨 1 수용체 길항제(IL-1ra)는 인터루킨 타입 1 수용체(IL-1Ra1)에 대한 IL-1을 경쟁적으로 억제함에 의해 IL-1의 생물학적 활성을 차단하는 길항제이다. IL-1 생성은 염증성 자극에 대응하여 유도되고 염증 및 면역 반응을 포함하는 다양한 생리적 반응을 매개한다. IL-1은 연골 분해 및 뼈 재흡수의 자극을 포함하는 활성의 범위를 가진다. 류마티즘성 관절염 환자에서, 국소적으로 생성되는 IL-1의 양이 상승되고, 천연적으로 나타나는 IL-1ra의 수준이 이러한 비정상적으로 증가된 양과 경쟁하기에 부족하다. 메토트렉세이트와 같은 질환 개질 항류마티즘 약물(DMARDS) 및 KINERET®(아나킨라, 암젠 인크)와 같은 생물 제제를 포함하는 RA를 위해 이용가능한 수개의 치료법이 있다.
KINERET®(아나킨라, 암젠 인크)는 153개 아미노산으로 구성되고 17.3킬로달톤의 분자량을 가지는 인간 인터루킨-1 수용체 길항제의 재조합의 비당화 형태이다. (KINERET®(아나킨라, 암젠 인크)의 아미노산 서열은 천연적으로 나타나는 IL-1ra에서의 152개 아미노산 및 추가적인 N-말단 메티오닌에 해당한다.) KINERET®(아나킨라, 암젠 인크)은 하나 이상의 DMARD를 실패한 18세 이상의 환자에서 보통 내지 중증의 류마티즘성 관절염의 징조 및 증상의 감소에 대해 처방된다. 용량은 100mg의 약물의 1회용 1일 경피 주사제이다. Tβ1/2는 4 내지 6시간이고 환자의 71%가 14 내지 28일내에 주사 위치 반응을 시작한다.
여기서 본 발명자들은 혈청 알부민 결합 dAb에 치료 폴리펩티드를 연결하는 것은 (i) 치료 폴리펩티드 단독과 유사한 활성을 가지고 (ii) 또한 혈청 알부민에 결합하는 화합물을 생성한다는 것을 증명한다. 또한, 본 발명은 치료 폴리펩티드의 긴 혈청 반감기 버젼을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명자들은 IL-1ra 단독 보다 더 긴 혈청 반감기의 화합물을 생성하는 IL-1ra에 혈청 알부민 결합 dAb를 연결하였다.
마우스, 래트, 인간 혈청 알부민에 결합하는 도메인 항체의 선별
본 실시예는 혈청 알부민에 대해 생성된 단일 도메인 항체(dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 마우스 혈청 알부민(MSA), 인간 혈청 알부민(HSA), 및 래트 혈청 알부민(RSA)에 대한 dAb의 선별이 기술된다.
마우스 혈청 알부민에 대한 dAb는 WO 2004/003019 A2에 기술된 바와 같이 선별되었다. 3개의 인간 파지 디스플레이 항체 라이브러리가 사용되었다. 각 라이브러리는 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3)에 혼입된 NNK 코돈에 의해 엔코딩된 측쇄 다양성을 가지는 VΗ(V3-23/DP47 및 JΗ4b) 또는 Vκ(o12/o2/DPK9 및 Jκ1)에 기초하였다.
라이브러리 1(VΗ):
하기 위치에서 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98.
라이브러리 크기: 6.2x109.
라이브러리 2(VΗ):
하기 위치에서 다양성: H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100A, H100B.
라이브러리 크기: 4.3x109.
라이브러리 3(Vκ):
하기 위치에서 다양성: L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96
라이브러리 크기: 2x109.
VΗ 및 Vκ 라이브러리는 일반적인 리간드 단백질 A 및 단백질 L에 결합하는 것에 대해 미리 선별되어 선택된 라이브러리에서 클론의 대다수가 작용성이었다. 상기 도시된 라이브러리의 크기는 사전 선별 후의 크기에 대응한다.
2회의 선별은 라이브러리 각각을 개별로 사용하여 혈청 알부민에 대해 수행되었다. 각 선별에 대해, 항원을 100㎍/㎖의 농도에서 4㎖의 PBS 중의 면역튜브(nunc)상에 코팅하였다. 제 1회의 선별에서, 3개의 라이브러리 각각을 HSA(시그마) 또는 MSA(시그마)에 대해 별개로 패닝(panning)하였다. 제 2회의 선별에서, 6회의 제 1회 선별의 각각으로부터의 파지는 (i) 동일한 항원(예를 들어 1회 MSA, 2회 HSA)에 대해 다시 패닝하고, (ii) 상호적인 항원(예를 들어 1회 MSA, 2회 HSA)에 대해 패닝하여 총 12개의 2회 선별을 초래하였다. 각 경우에, 제 2회의 선별 후에, 48개 클론을 HSA 및 MSA에 결합하기 위하여 시험하였다. 가용성 dAb 단편을 문헌(Harrison et al, 2 Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109)에 의한 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생성하였고, 2% 트윈 PBS를 블록킹 완충액으로서 사용하고 결합된 dAb를 단백질L-HRP(시그마)(VκS에 대해) 및 단백질 A-HRP(애머샴 파마시아 바이오테크)(Vκs에 대해) 중 하나로 검출하는 것을 제외하고, 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133).
MSA, HSA 또는 둘 모두로의 결합을 지시하는 백그라운드 위의 시그날을 주는 dAb를 플라스틱 단독에 결합하기 위한 ELISA 가용성 형태에서 시험하였으나, 보두는 혈청 알부민에 대해 특이적이었다. 다음에 클론을 서열분석하여 21개의 독특한 dAb 서열이 동정되었음을 밝혔다. 선택된 Vκ dAb 클론 사이의 최소 유사성(아미노산 수준)은 94%였다(127/136)×100).
다음에, 혈청 알부민 결합 dAb는 용액으로부터 비오티닐화된 항원을 포획하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA 플레이트를 1㎍/㎖ 단백질 L(Vκ 클론에 대해) 및 1 ㎍/㎖ 단백질 A(VΗ 클론에 대해)로 코팅하는 것을 제외하고 ELISA 프로토콜(상기와 같이)에 따라 수행하였다. 가용성 dAb를 프로토콜에서와 같이 용액으로부터 포획하였고, 검출을 비오티닐화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙타비딘 HRP를 이용하였다. 비오티닐화된 MSA 및 HSA를 혈청 알부민 분자 당 평균 2개 비오틴을 달성할 목적으로 제조자의 지시에 따라 제조되었다. ELISA에서 용액으로부터 비오티닐화된 MSA를 포획한 24개 클론을 동정하였다. 이들 중 2개(하기 클론 2 및 38) 또한 비오티닐화된 HSA를 포획하였다. 다음, dAb를 CM5 바이어코어 칩상에 코팅된 MSA에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 8개의 클론을 바이어코어 상의 MSA에 결합하였음이 관찰되었다.
인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 대해 dAb를 프로토콜에 대한 하기 수정 사항을 제외하고 항-MSA dAb에 대해 앞서 기술한 바와 같이 선별하였다: 합성 VΗ 도메인의 파지 라이브러리는 라이브러리 4G였고, 이는 DP47 생식계열 유전자 및 JH4 세그먼트를 포함하는 인간 VH3에 기초한다. 하기 특이적인 위치에서의 다양성을 CDR1: 30, 31, 33, 35; CDR2: 50, 52, 52a, 53, 55, 56; 및 CDR3: 4-12 다양화된 잔기: 예를 들어 4G H11에서 H95, H96, H97, 및 H98 및 4G H19에서 H95, H96, H98, H99, H100, H100a, H100b, H100c, H100d, H100e, 및 H100f에서의 돌연변이(NNK 코돈; 카바트에 따른 넘버링)에 의해 유도하였다. 마지막 3개의 CDR3 잔기는 FDY이어서 CDR3 길이는 7 내지 15개 잔기로 다양하다. 라이브러리는 1x1010 초과의 개별 클론를 포함한다.
VΗ 및 Vκ 라이브러리의 서브세트를 각각 일반적인 리간드 단백질 A 및 단백질 L에 결합하기 위하여 사전선별되어 선별되지 않은 라이브러리에서 클론의 대다수가 작용성이었다. 상기 도시된 라이브러리의 크기는 사전선별 후의 크기에 대응한다.
2회의 선별을 VΗ 및 Vκ 라이브러리의 서브세트를 별개로 사용하여 래트 및 인간 혈청 알부민 상에 수행하였다. 각 선별에 대해, 항원을 (i) 100㎍/㎖의 농도로 4㎖의 PBS에서 면역튜브(nunc)상에 코팅하거나 (ii) 비오티닐화하고 스트렙타비딘 비드(1회에서) 및 뉴트라비딘 비드(2회에서)에서 포획이 후속하는 가용성 선별에 대해 사용하였다. (각 클론을 분리하기 위하여 사용된 선별 전략에 대한 상세한 내용에 대해 표 1을 참조하라) 각 경우에, 제 2회의 선별 후에 24개 파지 클론을 HSA 또는 RSA에 대한 결합에 대해 시험하였다.
선별 중 하나에서 클론의 상당한 비율이 파지 ELISA에서 양성인 경우에, 이러한 선별로부터의 DNA를 가용성 dAb의 생성에 대해 발현 백터로 클로닝하였고, 개개 클론을 수집하였다. 가용성 dAb 단편을 문헌(Harrison et al., Methods Enzymol. 1996;267:83-109)에 의한 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생성하였고, 2% TWEEN PBS를 블록킹 완충액으로 사용하고 결합된 dAb를 항-myc-HRP로 검출하는 것을 제외하고 표준 ELISA 프로토콜에 따랐다(Hoogenboom at al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4-133). 다음에, ELISA에서 양성인 클론을 BIACORE 표면 플라즈몬 공명 장치(Biacore AB)를 사용하여 MSA, RSA, 또는 HSA에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. MSA, RSA, 또는 HSA에 결합하는 dAb를 추가로 분석하였다. 다음에 클론을 서열분석하고 독특한 dAb 서열을 확인하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
BIACORE 칩(Biacore AB)상에서 혈청 알부민에 결합한 dAb를 다음에 추가로 뷴석하여 친화도에 대한 정보를 수득하였다. 분석을 혈청 알부민으로 코팅된 CM5 칩(카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스)를 사용하여 수행하였다. 흐름 세포 1은 코팅되지 않은 블록킹된 음성 대조군이고, 흐름 세포 2는 HSA로 코팅되었고, 흐름 세포 3은 RSA로 코팅되었고, 흐름 세포 4는 MSA로 코팅되었다. 혈청 알부민을 코팅된 물질의 500 공명 유닛(RU)를 목적으로 프로그래밍된 BIACORE 코팅 위자드를 사용하여 아세트산염 완충액 pH5.5에서 고정화하였다. 관심 대상의 각 dAb를 200㎖ 내지 500㎖ 스케일로 E.coli의 원형질막공간에서 발현시키고, VH에 대해서는 단백질 A-스트림라인 친화성 수지(애머샴, UK) 및 Vκ에 대해서 단백질 L-아가로스 친화성 수지(아피테크, 노르웨이)에 대한 배치 흡착 및 후속하여 pH 2.2의 글리신을 이용한 용출과 PBS로의 완충액 교환을 사용하여 상청액으로부터 정제하였다. dAb의 농도의 범위를 BIACORE HBS-EP 완충액으로 희석하여 제조하고(5nM 내지 5μM의 범위에서) BIACORE 칩으로 흘려주었다.
친화도(KD)를 KD의 영역에서 dAb의 농도에 의해 생성된 흔적으로 온 속도 및 오프 속도 커브를 맞춤에 의해 BIACORE 흔적으로부터 계산하였다. 혈청 알부민에 상이한 친화도의 범위를 가지는 dAb를 확인하였다. 10 내지 100nM의 범위에 HSA에 대한 DOM7h-8, HSA에 대한 DOM7h-2 및 RSA에 대한 DOM7r-1의 친화도가 포함되었다. 범위 100nM 내지 500nM의 범위에 HSA에 대한 DOM7h-7, RSA에 대한 DOM7h-8, 및 HSA에 대한 DOM7h-26의 친화도가 포함되었다. 범위 500nM 내지 5μM에 HSA에 대한 DOM7h-23 및 HSA에 대한 DOM7h-1의 친화도가 포함된다. 예 흔적이 도 6A 내지 6F에 포함된다.
항혈청 알부민 항체를 IL-1 수용체 길항제(IL-1ra)와의 융합체로서 포매팅
본 실시예는 혈청 알부민에 결합하는 IL-1ra 및 dAb를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 기술한다. 2개의 융합체, 하나는 IL-1ra의 dAb N-말단(MSA16IL1-ra) 및 하나는 IL-1ra의 dAb C-말단(IL1-raMSA 16)을 제조하였다. 융합체 및 벡터의 서열을 도 2C 및 2D에 도시하였다. MSA에 결합하지 않는 대조군 융합체를 또한 생성하였고, 이의 서열을 도 2E에 도시하였다.
KINERET(아나킨라, 암젠 인크)는 4 내지 6 시간의 짧은 반감기를 가지고, 제안된 투여 방법은 매일 투여였다. 이러한 방법은 증례의 71%에서 14 내지 28일 후에 주사 위치 반응을 유도하였다. 따라서, 더 긴 혈청 반감기를 가지는 인간 IL-1ra의 형태가 유리할 것이고, 효능을 증가시키고 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 이들은 둘 모두 약제로서 바람직한 특성이다.
클로닝
간략하게, 두개의 다중 클로닝 영역(MCS)를 하기 상세히 설명된 바와 같이 설계하고 T7 프로모터를 가지는 발현 벡터에 삽입하였다. 제한 위치를 IL-1ra, dAb, GAS 리더 및 링커의 삽입을 위해 설계하였다. 하나(MCS 1+3)은 IL-1ra의 dAb 말단을 가진 단백질을 엔코딩하고, 다른 하나(MCS 2+4)는 IL-1ra의 dAb C-말단을 가지는 단백질을 엔코딩한다.
dAbIL1-ra 융합체에 대한 클로닝 위치 1+3
NdeI, 스터퍼(stuffer), SalI, NotI, 스터퍼, XhoI, BamHI
Figure pat00003
(서열번호:35)
IL-1radAb 융합체에 대한 클로닝 위치 2+4
NdeI, 스터퍼, StUI, SacI, 스터퍼, SalI, NotI, TAA TAA BamHI
Figure pat00004
(서열번호:36)
다음에 GAS 리더를, 적절한 제한 효소를 사용하여 MCS를 소화하고 리더를 코딩하는 어닐링된 프라이머를 라이게이션하여 각 벡터로 삽입하였다. 다음에, 링커를 코딩하는 링커 DNA를 유사한 방법으로 삽입하였다. IL-1ra를 코딩하는 DNA를 cDNA 클론으로부터 (필요한 제한 위치를 첨가하도록 설계된 프라이머를 사용하여) PCR에 의해 수득하고 TOPO 클로닝 벡터에 삽입하였다. 핵산 서열분석에 의해 정확한 서열을 확인한 후에, IL-1ra를 코딩하는 DNA를 TOPO 벡터로부터 절제하여 리더 및 링커를 함유하는 벡터로 라이게이션하였다. 마지막으로, dAb를 코딩하는 DNA를 dAb 발현 백터로부터 절제하여 삽입물(겔 여과에 의해 여과) 및 벡터의 SalI/NotI 소화에 의해 벡터로 삽입하였다.
발현 및 정제
MSA16IL1-ra, IL-1raMSA16, 및 더미(Dummy)IL-1ra를 E.coli의 원형질막공간에서 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(아피테크, 노르웨이)에 대한 배치 흡착 및 후속하여 pH2.2에서 글리신을 이용한 용출을 이용하여 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 dAb를 다음에 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 후속하여 쿠마시 염색에 의해 분석하였다. 단백질 중 하나(IL-1raMSA16)에 대해, 90% 초과의 단백질은 기대된 크기였고, 따라서 추가의 정제 없이 활성에 대해 분석하였다. 다른 단백질(MSA16IL1-ra 및 더미IL-1ra)이 보다 더 적은 밴드에 의해 오염되었고 따라서 pH9에서 RESOURSEQ 이온 교환 칼럼상에서 FPLC 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 0 내지 500 mM NaCl의 선형 염 농도 구배 형태를 사용하여 용출하였다. SDS-PAGE 겔 전기영동에 의한 분석 후에, 기대된 크기의 단백질을 함유하는 분획을 배합하여 >90% 순도의 배합된 분획을 수득하였다. 이러한 단백질을 추가의 분석을 위해 사용하였다.
시험관내 MRC-5 IL-8 검정에 의한 dAb IL-1ra 융합체의 활성의 결정
MSA16IL-1ra 융합체를 MRC-5 세포(ATCC 수탁 번호 CCL-171; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉선 Manassas, VA)에서 IL-1에 의한 IL-8 분비의 유도를 중화할 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 방법을, HUVEC에서 IL-1에 의한 IL-8의 유도를 기술하는 문헌(Akeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523)으로부터 변형하여 HUVEC 세포주 대신에 MRC-5 세포를 사용하였다. 간단하게, 미세역가 플레이트에서 플레이팅된 MRC-5 세포를 dAbIL-1ra 융합 단백질 또는 IL-1ra 대조군, 및 IL-1(100pg/㎖)으로 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상청액으로부터 세포를 흡입하고 IL-8 농도를 샌드위치 ELISA(R&D 시스템)을 통해 측정하였다.
융합 단백질에서 IL-1ra의 활성은 IL-8 분비에서의 감소를 초래하였다. MSA16IL1-ra 융합체의 활성 및 IL-1raMSA16 융합체의 활성으로부터 생성된 IL-8의 감소를 Il-1ra 대조군(재조합 인간 IL-1ra, R&D 시스템)에서 보여진 감소와 비교하였다. 시험된 단백질 각각의 중화된 용량 50(ND50)을 측정하고 표 2에 제시하였다.
단백질 ND50
IL-1ra 0.5nM
MSA16IL-1ra 2nM
IL-1raMSA16 8nM
결과는 IL-1ra가 항혈청 알부민 dAb를 구비한 융합체 작제물의 부분으로서 활성을 유지한다는 것을 증명한다. MSA16IL-1ra 단백질을 추가로 이의 약동학(PK 연구)를 평가하기 위하여 연구되었다.
혈청 알부민, 항 IL-1ra 샌드위치 ELISA
3개의 dAb/IL-1ra 융합체를 혈청 알부민에 결합하는 능력에 대해 시험하고, 동시에 단클론 항-IL 1ra 항체에 의해 검출하였다. 시험된 융합체는 MSA16IL-1ra, IL-1raMSA16, 및 더미IL-1ra였다. 간략하게, ELISA 플레이트를 10㎍/㎖에서 마우스 혈청 알부민으로 밤새 코딩하고, 0.05% 트윈 PBS로 5X 세척하고, 그 후에 4% Marvel PBS로 1시간 동안 차단하였다. 블록킹 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 5X 세척하고, 다음에 각 dAb, 4% MPBS 중에 희석된 IL-1ra 융합체로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 융합체를 1μM 농도로 인큐베이션하고 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 5X 세척하고, 다음에 4% MPBS 중에 희석된 2차 항체(항-토끼 IgG-HRP)의 1/2000 희석율로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체와 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.05% 트윈 PBS로 3X 세척하고, PBS로 2X 세척하고, 다음에 TMB 마이크로웰 페록시다아제 기질(KPL, MA)의 50㎕로 전개하고, 반응을 웰 당 50㎕의 HCL로 중단시켰다. 흡광도를 450nM에서 판독하였다.
MSA16IL-1ra 및 IL-1raMSA16 단백질 둘 모두를 샌드위치 ELISA에서 1μM 농도에서 2X 초과의 백그라운드 수준으로 검출하였다. MSA16IL-1ra 단백질을 3.9nM 이하의 희석율에서 1X 백그라운드 이상으로 검출한 반면에, IL-1raMSA16 단백질을 500nM 아래로만 2X 백그라운드 이상으로 검출하였다. 혈청 알부민에 대한 MSA16IL-1ra의 결합은 대조군 작제물(더미IL-1ra)이 혈청 알부민에 결합하지 않는 때에 혈청 알부민에 대해 특이적으로 관찰되었다.
마우스 PK 연구에서의 약물 융합체 혈청 반감기의 측정
A. MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질의 마우스에서 혈청 반감기의 측정
MSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질을 E.coli 원형질 막공간에서 발현하고 단백질 L-아가로스 친화성 수지(아피테크, 노르웨이)에 대한 매치 흡착 및 후속하는 pH2.2에서의 글리신을 이용한 용출을 사용하여 정제하였다. 융합 단백질의 혈청 반감기를 CD1 스트레인 수컷 동물로 대략 1.5㎎/㎏에서 1회 정맥내(i.v.) 주사한 후에 마우스에서 측정하였다. 혈청 수준의 분석을 염소 항-HA(Abcam, UK) 포획 및 4% Marvel로 차단된 단백질 L-HRP(인비트로겐, USA)를 사용하여 ELISA에 의하였다. 세척을 0.05% 트윈 20, PBS로 하였다. 공지된 농도의 MSA 결합 dAb/HA 융합체의 표준 곡선을 시험 시료와의 비교를 위하여 1X 마우스 혈청의 존재하에 제작하였다. 1 컴파트먼트 모델을 이용한 모델링(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)은 29.1 시간의 t1/2 종말 상 및 559hr.㎍/㎖의 커브하의 면역을 가졌음을 보였다. 이는 단지 수분과 같이 짧을 수 있는 HA 에피토프 태그 펩티드 단독에 대한 예측된 반감기에 대해 큰 개선점을 증명한다.
HA 에피토프 태그를 약물 모델로서 사용한 본 연구의 결과는 약물의 생체내 혈청 반감기를 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, dAb)를 구비한 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트로서 제조되는 경우에 연장될 수 있다.
항-MSA dAb DOM7m-16 및 DOM7m-26, 및 MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb의 마우스에서의 생체내 반감기를 또한 평가하였다. 다시 DOM7m-16, DOM7m-26 및 HA 에피토프 태그를 함유한 대조군 dAb은 약물(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 약물)에 대한 모델로서 작용한다. 이러한 연구에서, MSA에 결합하지 않는 대조군 dAb는 20분의 생체내 반감기를 가진 반면에, DOM7m-16 및 DOM7m-26의 생체내 반감기는 상당히 연장되었다. (도 12) DOM7m-16은 추가 연구에서 29.5 시간의 마우스에서의 생체내 반감기를 가지는 것으로 밝혀졌다.
다른 연구에서, HA 에피토프 태그를 함유한 DOM7h-8의 생체내 반감기(t1/2β)를 마우스에서 평가하였다. 2 컴파트먼트 모델을 이용한 모델링(WinNonlin Software, Pharsight Corp., USA)은 DOM7h-8이 29.1시간의 t1/2β를 가진다는 것을 증명하였다.
약물(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 약물)에 대한 모델로서 HA 에피토㎎프 태그를 사용한 이들 연구 각각의 결과는, 약물의 생체내 혈청 반감기가 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체(예를 들어 dAb)의 항원 결합 단편을 구비한 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트로서 제조되는 경우에 상당히 연장될 수 있다는 것을 증명한다.
B. MSA 결합 dAb/IL-1ra 융합 단백질의 마우스에서의 혈청 반감기의 측정
MSA 결합 dAb/IL-1ra 융합 단백질(MSA16IL-1ra)를 E.coli의 원형질막공간에서 발현시키고 단백질 L-아가로스 친화성 수지(아피테크, 노르웨이)에 대한 배치 흡착 및 후속하는 pH2.2에서의 글리신을 이용한 용출을 이용하여 정제하였다. MSA16IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra), MSA에 결합하지 않는 dAb를 구비한 IL-1ra 융합체에 결합하지 않는 dAb를 구비한 IL-1ra 융합체(더미dAb/IL-1ra), 및 HA 에피토프 태그에 융합된 항-MSA dAb(DOM7m-16HA 태그)를 CD1 스트레인 수컷 동물에 대략 1.5㎎/㎏로 1회 i.v. 주사 후에 마우스에서 측정하였다.
혈청 수준의 분석을 IL-1ra 샌드위치 ELISA(R&D 시스템, USA)에 의하였다. 공지된 농도의 dAb/IL-1ra 융합체의 표준 곡선을 시험 시료와의 비교를 위해 1X 마우스 혈청의 존재하에 제작하였다. 모델링을 WinNonlin 약동학 소프트웨어(Pharsight Corp., USA)를 사용하여 수행하였다.
항-MSA dAb를 구비한 IL-1ra 융합체가 비-MSA dAb(DOM7m-16/IL-1ra)의 융합체인 대조군과 비교하여 상당히 혈청 반감기를 증가시킬 것으로 예상되었다. 대조군 비-MSA dAb(DOM7m-16/IL-1ra) 융합체가 짧은 혈청 반감기를 가지는 것으로 예상되었다.
연구 결과를 표 3에 제시하였고, 항-MSA dAb와의 IL-1ra 융합체(DOM7m-16/IL-1ra)가 MSA에 결합하지 않는 dAb(더미 dAb/IL-1ra)를 구비한 IL-1ra 융합체보다 약 10배 더 긴 혈청 반감기를 가졌다. 결과는 또한 더미/IL-1ra(AUC: 1.5hr.㎍/㎖)에 비교하여 DOM7m-16/IL-1ra(AUC: 267hr.㎍/㎖)에 대한 농도 시간 커브 하의 면역에서 >200배 개선(증가)가 있었다는 것을 밝혔다.
제제 혈청 반감기
DOM7m-16/IL-1ra 4.3 시간
더미/IL-1ra 0.4 시간
DOM7m-16HA 태그 29 시간
이들 연구의 결과는 생체내 혈청 반감기 및 약물의 AUC가 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체(예를 들어, dAb)의 항원 결합 단편을 구비한 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트로서 제조된 경우에 상당히 연장될 수 있다는 것을 증명한다.
RSA 결합 dAb/HA 에피토프 태그 융합 단백질의 래트에서의 혈청 반감기의 측정
항-래트 혈청 알부민 dAb를 E.coli의 원형질간막공간에서 C-말단 HA 태그와 함께 발현시키고 Vκ dAb에 대한 단백질 L-아가로스 친화성 수지(아피테크, 노르웨이)에 대한 배치 흡착 및 VH에 대한 단백질 A 친화성 수지에 대한 배치 흡착 및 후속하여 pH 2.2에서의 글리신을 구비한 용출을 이용하여 정제하였다. 혈청 반감기를 측정하기 위하여, 4마리 래트 군에 DOM7r-27, DOM7r-31, DOM7r-16, DOM7r-3, DOM7h-8, 또는 부적합한 항원에 결합하는 대조군 dAb(HEL4)의 1.5㎎/㎏로 1회 i.v. 주사를 투여하였다. 혈청 시료를 7일 기간에 걸쳐 꼬리 정맥으로부터 계열 방혈시켜 수득하고 ELISA 플레이트상에 코팅된 염소 항-HA(Abcam, cambridge UK)를 사용하여 샌드위치 ELISA 및 후속하여 단백질 A-HRP(VH에 대해) 또는 단백질 L-HRP(Vκ dAb에 대해)를 이용한 검출을 사용하여 분석하였다. 공지된 농도의 dAb의 표준 곡선을 시험 시료와의 비교를 위해 1x 래트 혈청의 존재하에 제작하였다. 2 컴파트먼트 모델을 이용한 모델링(WinNolin 약동학 소프트웨어(Pharsight Corp., USA)을 사용)을 사용하여 t1/2β 및 커브(AUC)하의 면역을 계산하는데 사용하였다(표 4). 래트에서 HEL4 대조군에 대한 t1/2β는 30분 이하였고, 데이터에 기초하여 DOM7h-8에 대한 AUC는 약 150hr.㎍/㎖ 내지 약 2500hr.㎍/㎖일 것으로 예상된다.
Figure pat00005
약물(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 약물)에 대한 모델로서 HA 에피토프를 사용하여 이러한 래트 연구의 결과는 약물의 생체내 혈청 반감기가 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체(예를 들어 dAb)의 항원 결합 단편과의 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트로서 제조된 경우에 상당히 연장될 수 있다는 것을 증명한다.
인간에서 반감기의 예측
인간에서 dAb, 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트의 생체내 반감기는 상대성장측정 스케일링을 사용하여 동물에서 수득된 반감기 데이터로부터 추정될 수 있다. 3 마리의 동물에서 측정된 생체내 반감기의 로그를 동물의 중량의 로그에 대해 플롯팅하였다. 플롯팅된 점을 통하여 선을 구리고 선의 기울기 및 절편을 사용하여 식 log Y=log(a) + b log(W)(여기서, Y는 인간에서 생체내 반감기이고, log(a)는 y 절편이고, b는 기울기이고, W는 인간의 중량이다)를 사용하여 인간에서 생체내 반감기를 계산하였다. 선을 약 35그램(예를 들어, 마우스), 약 260그램(예를 들어, 래트) 및 약 2,710그램의 중량을 가지는 동물에서 수득된 생체내 반감기 데이터를 사용하여 생성하였다. 마우스 및 래트에서 수득된 반감기 값에 기초하여, DOM7h-8과 같은 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 인간에서 약 5.5 시간 내지 약 40 시간의 t1/2β 및 약 150hr.㎍/㎖ 내지 약 2500hr.㎍/㎖의 AUC를 가지는 것으로 예상된다.
류마티즘성 관절염의 마우스 콜라겐 유도된 관절염 모델에서 항-SA dAb/IL-1ra 약물 융합체의 효능
인정된 류마티즘성 관절염의 마우스 모델(DBA/1 마우스에서 타입 II 콜라겐 유도된 관절염(CIA))에서 융합체 DOM7m-16/IL-1ra의 효능 및 IL-1ra의 효능을 평가하였다. 연구 전반에 걸쳐, 시험 용이성을 위해 마우스를 12시간 광, 12시간 암 사이클을 가지는 20 내지 24℃에서 HEPA-여과된 스캔테이너(scantainer)에 하우징된 표준 타입 2 케이지에 두었다. 음식(Harlan-Teklad unicersal diet 2016) 및 UC 멸균수를 임의로(ab libitum) 제공하였다. 마우스를 적합한 새환경순응을 보장하기 위하여 연구 시작 적어도 7일 전에 시험 용이성을 위해 수입하였다.
7 내지 8주령의 DBA/1 마우스(Taconic M and B. Domholtveg, Denmark로부터 수득)에 에멀젼이 안정화될 때까지 1:1 비율로 에멀젼화된 알트로겐-CIA 애쥬번트 및 알트로겐-CIA 콜라겐의 에멀젼(둘 모두 MD 바이오사이언스)으로 1회 주사하였다. 에멀젼이 물 비이커에 첨가된 에멀젼 소적이 고형 덩어리를 형성할 때 안정화된 것으로 고려하였다. 다음에, 마우스를 에멀젼으로 주사하였다.
에멀전이 주사된지 21일 후에, 가장 진행된 관절염 질환을 가진 20마리의 동물을 본 연구에서 제거하고, 남은 마우스를 10마리 동물 군으로 나누었다(각 그룹은 5마리 수컷 및 5마리 암컷을 포함한다). 마우스를 표 5에 도시된 바와 같이 처리하고 모든 처리는 10㎖/㎏이 투여되도록 계산된 농도로 전달하였다.
Figure pat00006
Figure pat00007
21일 내지 49일 주당 3회 관절염의 중증도를 임상 수치로 기록하였다. 마우스를 49일째에 안락사시켰다. 개개 마우스를 이들이 12 이상의 관절염 수치를 나타내거나 심각한 거동 문제를 가진다면 초기에 안락사하였다.
임상 수치화를 위하여, 각 팔다리를 하기 범주에 따라 수치화하고 모든 4개의 팔다리에 대한 수치를 마우스의 총 스코어를 생성하는데 첨가하였다. 생성된 이러한 방법은 각 마우스에 대해 0 내지 16 수치였다. 수치화 범주는 하기와 같았다: 0=정상, 1=경증이나 발목 또는 손목의 확실한 적색 상태 및 부음, 또는 질환 손발가락의 개수에 관계 없이 개개 손발가락에 제한된 명확한 적색 상태 및 부음; 2=손목 및 발목의 중간 정도의 적색 상태 및 부음; 3=손발가락을 포함하는 전체 손발의 심각한 적색 상태 및 부음; 4=여러 관절이 관여하는 최대로 염증이 나타난 사지.
그룹 평균 관절염 수치를 개개 마우스로부터 임상 수치를 사용하여 매일 처리 일에 각 처리 군에 대해 계산하였다. 윤리적 이유로 연구로부터 제거된 임의의 동물에 대해서 16의 최대 수치를 할당하였다. 그룹 평균 관절염 수치를 시간에 대해 플롯팅하였다(도 13).
49일째에 그룹 평균 관절염 수치의 통계학적 분석을 Wilconson 시험을 사용하여 수행하였다. 이러한 통계학적 분석은 DOM7m-16/IL-1ra(1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏(그룹 3 및 4))로 처리된 2개의 그룹이 염수 대조군 그룹(그룹 6)에 비교할 때 49일째에 상당히 개선된 관절염 수치(각각 P<1% 및 P<0.05% 유의수준으로)를 가졌다. 대조적으로, 1㎎/㎏의 IL-1ra를 이용한 처리(그룹 1)는 49일째에 관절염 수치에서 통계적으로 유의한 개선을 나타내지 않았으나, 10㎎/㎏의 IL-1ra를 이용한 처리(그룹 2)는 P<5% 유의 수준으로 상당한 개선을 나타내었다. ENBREL®(entracept; Immunex Corporation)를 이용한 처리(그룹 5)는 p<10% 유의 수준으로 40일째에 관절염 수치에서 상당한 개선을 초래하였다.
10㎎/㎏ 용량의 DOM7m-16/IL-1ra를 이용한 처리(그룹 4)은, 5㎎/㎏의 ENBREL®(entracept; Immunex Corporation)를 이용한 표준 처리에 비교하여, 49일째에 관절염 수치를 개선하는데 유효하였다. 또한, 보다 적은 1㎎/㎏ 용량의 DOM7m-16/IL-1ra를 이용한 처리(그룹 3)는 동일한 투여량으로만 IL-1ra를 이용한 처리(그룹 1) 보다 49일째에 관절염 수치를 개선하는데 보다 효과적이었다(P<10% 수준에서의 유의 수준).
본 연구의 결과는 특정 용량에서 DOM7m-16/IL-1ra가 IL-1ra 또는 ENBREL®(entracept; Immunex Corporation) 보다 더 효과적임을 증명한다. IL-1ra에 대한 반응은 예상대로 용량 의존적이고, DOM7m-16/IL-1ra에 대한 반응은 또한 용량 의존적이다. 1㎎/㎏의 DOM7m-16/IL-1ra를 이용한 처리에 대한 평균 수치는 지속적으로 10㎎/㎏의 IL-1ra를 이용한 처리에 의해 수득한 평균 수치보다 더 낮았다. 이러한 플롯팅된 결과(도 13)는 본 연구에서 DOM7m-16/IL-1ra를 이용한 처리가 IL-1ra 보다 약 10배 더 효과적이었음을 나타내었다.
DOM7m-16/IL-1ra의 이러한 우수한 효능은 DOM7m-16/IL-1ra 융합 단백질이 중량 기준으로 IL-1ra로서 IL-1 수용체 결합 에피토프의 수의 약 절반을 함유하는 경우에조차 관찰되었다(예를 들어 1㎎의 DOM7m-16/IL-1ra(MW ~31.2kD))은 1㎎의 IL-1ra로서의 IL-1 수용체 결합 에피토프 수의 약 절반(MW ~17.1kD)을 함유한다).
본 연구의 결과는 혈청 알부민에 결합하는 dAb가 IL-1ra에 연결될 수 있고(RA에 대해 임상적으로 증명된 치료법), 생성된 약물 융합체가 긴 혈청 반감기 특성(dAb에 의해 부여됨) 및 IL-1 수용체 결합 특성( IL-1ra에 의해 부여됨) 둘 모두를 가진다는 것을 증명하였다. 약물 융합체의 혈청 체류 시간으로 인하여, CIA를 치료하기에 유효한 DOM7-16/IL-1ra의 용량은 IL-1ra에 비하여 상당히 감소되었다.
본 연구의 결과는 연장된 반감기 및 증가된 AUC의 이익에 더해, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 (예를 들어 dAb의) 항원 결합 단편과의 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트로서 제조된 약물이 약물 단독에 비해 이점을 제공하는 매우 유효한 치료제라는 것을 증명한다. 예를 들어, 마우스 CIA 모델에서 증명된 바와 같이 보다 낮은 용량의 약물 융합체가 유효하고 IL-1ra 단독에 비해 더 긴 시간에 걸쳐 IL-1에 의해 유도된 관절 염증 및 관절 손상을 억제하였고, 질병 진행에 대해 보다 큰 보호를 제공하였다.
항-SA dAb/사포린 비공유결합성 약물 컨쥬게이트
리보솜 불활성화 단백질 사포린(항암 약물)은 변성제 및 프로테아제에 매우 안정하여 T 림프구에 표적화된 독소로서 사용되어 왔다. 비공유결합성 약물 컨쥬게이트를 비오틴-스트렙타비딘 링크를 통해 사포린을 DOM7h-8에 커플링함에 의해 제조하였다. 이러한 비공유결합성 약물 컨쥬게이트로 수득된 결과는 DOM7h-8이 약물에 커플링되었을 때 이의 혈청 알부민 결합 특성을 보유하는 것을 증명하였다.
DOM7h-8cys로서 언급되는, 108번 위치의 C-말단 아르기닌(서열번호: 24의 108번 아미노산)이 시스테인 잔기로 대체된 변이체 DOM7h-8을 HB2151 세포에서 재조합 핵산의 발현에 의해 제조하였다. 세포를 증식시키고 원심분리에 의해 상청액을 회수하기 전에 72 시간 동안 밤새 발현 자가유도 TB 레디믹스(readymix)(Merk Kga, Germany)에서 30℃에서 유도하였다. DOM7h-8cys를 단백질 L-아가로오스상의 친화성 포획을 사용하여 상청액으로부터 정제하였다. 다음에, 수지를 2X PBS의 10배 칼럼 부피로 세척하고 DOM7h-8cys를 0.1M 글리신 pH2로 용출하였다. 용출된 DOM7h-8cys를 0.2x 부피의 Tris pH8로 중화시키고 1㎎/㎖로 농축하였다(센트리콘 20㎖ 농축기(Millipore Corp., MA)를 사용).
농축된 DOM7h-8cys를 NAP5 탈염 칼럼(GE 헬쓰케어/애머샴 바이오사이언스, NJ)를 사용하여 PBS로 완축액을 교환하고 농도를 측정하였다. dAb를 다음에 EZ-LINK 설포-NHS-LC-비오틴(피어스 바이오테크놀로지 인크., IL)을 사용하여 비오티닐화하였다(1차 아민을 통해). 비오티닐화된 dAb를 1:1 몰비로 스트렙타비딘-사포린(어드밴스드 타겟팅 시스템즈, 샌디에고)와 혼합하였다.
dAb/사포린 복합체가 형성되었음을 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA를 사용하여 온전한 복합체를 검출하였다. 인간 혈청 알부민(HSA)를 웰 당 100㎕의 부피로 10㎍/㎖로 밤새 ELISA 플레이트(Nunc, NY)의 웰의 반에 코팅하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 밤새 세척하고, 전체 플레이트를 2% PBS로 2시간 동안 블록킹하였다. 블록킹한 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고, 그 후에 2% 트윈 PBS중에서 0.5μM로 희석된 DOM7h-8/사포린 비공유결합성 컨쥬게이트로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 동일한 ELISA 플레이트 상에서 대조군으로서, 0.5μM의 커플링되지 않은 사포린 및 0.5μM의 커플링되지 않은 DOM7h-8을 1% 트윈 PBS에서 인큐베이션하였다. 추가의 대조군은 HAS로 코팅되지 않고 2% 트윈으로 블록킹된 ELISA의 웰상에서 인큐베이션된 동일한 3개의 희석된 단백질이었다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 그 후에 25 트윈 PBS에 희석된 염소 항 사포린 다클론성 항체(어드밴스드 테라퓨틱 시스템즈)의 1/2000 희석액으로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 PBS로 1회 희석하고, 종이상에서 가볍게 두드려 건조시켰다. ELISA를 100㎕ 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 기질로서 전개하고 반응을 50㎕ 1M 염산으로 중단시켰다. DOM7h-8 및 사포린의 비공유결합 컨쥬게이트의 존재를 컨쥬게이션되지 않은 부분의 임의의 것과 컨쥬게이트의 OD600을 비교함에 의해 확인하였다.
DOM7h-8/사포린 DOM7h-8 단독 사포린 단독
OD600
(HAS로 코팅된 플레이트)
0.311
0.060
0.079
OD600
(2% 트윈 PBS로 블록킹된 플레이트)
0.078
0.068
0.075
본 연구의 결과는 약물이 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편에 컨주ㅠ게이션될 수 있고, 컨쥬게이션된 항원 결합 단편이 혈청 알부민 결합 활성을 보유한다는 것을 증명하였다. 추가로, 비오틴-스트렙타비딘 상호작용의 안정성 및 강도로 인하여, 결과는 공유결합된 컨쥬게이트 및 비공유결합된 컨쥬게이트가 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 단편의 혈청 알부민 활성을 보유하도록 제조될 수 있다.
항-SA dAb/플루오레세인 컨쥬게이트
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 단백질 상의 아미노, 설프히드릴, 이미다졸릴, 티로실, 또는 카르보닐기와 가교연결될 수 있다. 이는 많은 작은 분자 약물과 크기면에서 비교되는 389Da의 분자량을 가진다. 이러한 컨쥬게이트로 수득된 결과는 작은 화학 잔기에 커플링되었을 때 항-SA dAb가 이의 혈청 알부민 결합 특성을 유지한다는 것을 증명하고, 작은 분자 약물이 항-SA dAb에 컨쥬게이션될 수 있다는 것을 가리킨다.
농축된 DOM7h-8cys를 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조하였다. 농축된 dAb를 NAP5 탈염 칼럼(GE 헬쓰케어/애머샴 바이오사이언스, NJ)을 사용하여 50mM 붕산염 pH8(커플링 완충액)으로 완충액 교환하였고, 다음에 2㎖ 센트리콘 농축기(밀리포어 코프., MA)를 사용하여 2.3㎎/㎖로 농축하였다. FITC(피어스 바이오테크놀로지 인크.)를 제조자의 지시에 따라 디메틸 포름아미드(DMF)에서 10㎎/㎖로 희석하였고 다음에 24:1의 FITC:dAb의 몰비로 커플링 완충액에 dAb와 혼합하였다. 반응을 30분 동안 진행되도록 하였다. 이 때, 과잉의 미반응 FITC를 PBS로 사전 평형화된 PD10 탈염 칼럼(GE 헬쓰케어/에머샴 바이오사이언스, NJ)을 사용하여 반응물로부터 제거하고 DOM7h-8cys/FITC 컨쥬게이트를 PBS로 용출하였다.
FITC/dAb 커플링 반응이 성공적임을 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA를 사용하여 커플링된 dAb를 검출하였다. 인간 혈청 알부민(HSA)를 웰당 100㎕의 부피로 10㎍/㎖로 밤새 ELISA 플레이트(Nunc, NY)의 웰의 반에 코팅하고 다음에 모든 웰을 2% 트윈 PBS로 2시간 동안 블록킹하였다. 블록킹 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 그 후에 2% 트윈 PBS 중에서 1μM로 희석된 DOM7h-8cys/FITC로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 동일한 ELISA 플레이트에서 대조군으로서, 1μM의 대조군 FITC 커플링된 항체 및 1μM의 커플링되지 않은 DOM7h-8을 2% 트윈 PBs에서 인큐베이션하였다. 추가 대조군은 HSA로 코팅되지 않은 ELISA 플레이트의 웰상에 인큐베이션되고 2% 트윈으로 블록킹된 동일한 2개의 희석 단백질이었다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고, 그 후에 2% 트윈 PBS로 희석된 토끼 항 FITC 항체(세로텍)의 1/500 희석액으로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05 트윈으로 3회 세척하고, 그 후에 2% 트윈 PBS에서 희석된 2차 검출 항체로(1/5000 항 래트 Ig HRP 컨쥬게이트)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고, PBS로 1회 세척하고 종이상에서 가볍게 두드려 건조시켰다. ELISA를 3,3',5,5'-테트라메틸벤즈이딘을 기질로서 사용하여 웰당 100㎕로 전개하고, 반응을 1M 염산 웰당 50㎕로 중단시켰다. DOM7h-8 및 FITC의 컨쥬게이트의 존재를 컨쥬게이트의 OD600을 컨쥬게이션되지 않은 부분 중 어느 하나의 것과 비교하여 확인하였다.
DOM7h-8/FITC DOM7h-8 단독 FITC 커플링된 항체(음성 대조군)
OD600
(HSA 코팅된 플레이트)
0.380
0.042
0.049
OD600
(2% 트윈 PBS로 블록킹된 플레이트)
0.041
0.041
0.045
항-SA dAb/펩티드 컨쥬게이트
많은 펩티드가 치료 효과를 가진다. N- 또는 C- 말단 시스테인을 가지는 모델 펩티드를 항 혈청 알부민 dAb에 커플링할 수 있다.
이러한 경우에, 4개의 상이한 펩티드를 사용할 것이다: 펩티드 1 YPYDVPDYAKKKKKKC (서열번호:68); 펩티드 2 CKKKKKKYPYDVPDYA (서열번호: 69); 펩티드 3 HHHHHHKKKKKKC (서열번호: 70) 및 펩티드 4: CKKKKKKHHHHHH (서열번호:71). 펩티드 1 및 2는 헤마글루티닌 태그(HA 태그) 서열을 포함하고, 펩티드 3 및 4는 His 태그의 서열을 포함한다. 농축된 DOM7h-8cys는 실시예 7에 기술된 바와 같이 제조될 것이다.
농축된 dAb는 5mM 디티오트레이톨로 환원되고 다음에 NAP5 탈염 칼럼(GE 헬쓰케어/애머샴 바이오사이언스, NJ)를 사용하여 완충액을 커플링 완충액(20mM BisTris pH 6.5, 5mM EDTA, 10% 글리세롤)으로 교환할 것이다. 시스테인은 5mM 디티오디피리딘의 최종 농도를 사용하여 차단하고(dAb가 자신과 이량체화되는 것을 막기 위하여), 이것은 DMSO 중의 100mM 디티오디피리딘의 스탁으로부터 dAb 용액에 첨가될 것이다. dAb 및 디티오디피리딘을 20 내지 30분 동안 커플링되도록 할 것이다. 비반은 디티오디피리딘을 다음에 PD10 탈염 칼럼을 사용하여 제거하고 dAb를 커플링 완충액(20mM BisTris pH6.5, 5mM EDTA, 10% 글리세롤) 중에 용출할 것이다. 다음에, 용출된 단백질을 필요할 때까지 냉동할 것이다.
펩티드 1-4는 200μM의 농도로 물 중에 개별적으로 용해되고 5mM DTT를 사용하여 환원되고, 그 후에 NAP5 탈염 칼럼(GE 헬쓰케어/애머샴 바이오사이언스, NJ)를 사용하여 탈염할 것이다. 각 펩티드를 다음에 일어날 펩티드-dAb 커플링을 위해, 20:1 비율로 환원되고 블록킹된 용액에 첨가될 것이다. 펩티드, dAb 커플링 반응의 성공을 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA를 사용하여 항-SA dAb/펩티드 컨쥬게이트를 검출하였다.
인간 혈청 알부민을 웰 당 100㎕의 부피로 10㎍/㎖로 밤새 ELISA(Nunc, NY)상에 코팅할 것이다. 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고, 그 후에 4% Mavel PBS로 2 시간 동안 블록킹할 것이다. 블록킹 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고, 그 후에 4% Marvel PBS중에서 1μM로 희석된 DOM7h-8/펩티드 컨쥬게이트로 1 시간 동안 인큐베이션할 것이다. 동일한 ELISA 플레이트상에서 대조군으로서, 20μM의 커플링되지 않은 펩티드 및 1μM의 커플링되지 않은 DOM7h-8을 4% MPBS에 인큐베이션할 것이다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 그 후에 펩티드 1 및 2에 대해 1/2000 희석율 및 4% Mavel PBS에 희석된 Ni NTA-HRP(펩티드 3 및 4에 대해)의 1/2000희석율의 염소 항-HA 항체(Abcam)으로 1시간 동안 인큐베이션할 것이다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 4% MPBS 중에 1/2000으로 희석된 2차 항-염소 HRP 항체로 1시간 동안 인큐베이션할 것이다(다른 웰을 1시간 동안 블록킹하였다). 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척하고 PBS로 1회 세척하고 종이상에서 가볍게 두드려 건조시킬 것이다. ELISA를 3,3',5,5'-테트라메틸벤즈이딘을 기질로서 사용하여 웰당 100㎕로 전개하고, 반응을 1M 염산 웰당 50㎕로 중단시킬 것이다. DOM7h-8/펩티드 컨쥬게이트의 존재를 컨쥬게이트의 OD600을 컨쥬게이션되지 않은 부분 중 어느 하나의 것과 비교하여 확인하였다.
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010

Figure pat00011

Figure pat00012
본 발명은 구체적으로 제시되었고 이의 바람직한 구체예를 참조하여 기술되었으나, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 이탈됨 없이 형태 및 세부 면에서 다양한 변경이 가능할 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> DOMANTIS LIMITED HOLT, LUCY J. TOMLINSON, IAN M. <120> DRUG COMPOSITIONS, FUSIONS AND CONJUGATES <130> 3440.1002-003 <140> PCT/GB2005/002163 <141> 2005-05-31 <150> 60/576,271 <151> 2004-06-01 <150> 60/632,361 <151> 2004-12-02 <160> 158 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His 20 25 30 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Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Met Gln Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 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Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ile Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Arg Gln 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Asp Thr Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Gly Ser Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Tyr Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ile Gly Asp Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Thr Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gln 100 105 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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr His Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asn Pro Ser Tyr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser 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(1)...(6) <223> Cyclic peptide <400> 108 Lys Gly Asp Gln Leu Ser 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <221> SITE <222> (1)...(8) <223> Cyclic peptide <221> SITE <222> 3 <223> Xaa = Cln <400> 109 Tyr Ser Xaa Val Leu Phe Lys Gly 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 110 Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 111 Ile Glu Leu Leu Gln Ala Arg 1 5 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 112 Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys 1 5 10 <210> 113 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <221> SITE <222> (2)...(3) <223> Xaa = any amino acid <400> 113 Phe Xaa Xaa Tyr Lys Trp 1 5 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <221> SITE <222> (3)...(4) <223> Xaa = any amino acid <221> SITE <222> (5)...(5) <223> Xaa = Ar <400> 114 Lys Trp Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 115 Leu Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Trp Tyr Thr 1 5 10 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 116 Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu 1 5 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 117 Met Pro Arg Phe Met Asp Tyr Trp Glu Gly Leu Asn 1 5 10 <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 118 Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly 1 5 10 15 Pro Pro Arg Val 20 <210> 119 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 119 Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Gly Gln Ser Thr 1 5 10 15 Ser Arg His Lys Lys Leu 20 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 120 Cys Ala Phe Tyr Ile 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 121 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 122 Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cys Lys 1 5 <210> 123 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 123 Tyr Ser Phe Val His Gly Phe Phe Asn Phe Arg Val Ser Trp Arg Glu 1 5 10 15 Met Leu Ala <210> 124 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 124 Lys Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Ala Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg 1 5 10 15 Leu Ile Phe Ser 20 <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 125 Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser Lys 1 5 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 126 Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg 1 5 10 <210> 127 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 127 Arg Cys Val Arg Cys Arg Phe Val Val Trp Ile Gly Leu Arg Val Arg 1 5 10 15 Cys Leu Val <210> 128 <211> 23 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 128 Leu Asn Trp Ala Trp Ala Ala Glu Val Leu Lys Val Gln Lys Arg Arg 1 5 10 15 Ile Tyr Asp Ile Thr Asn Val 20 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 129 Leu Glu Gly Ile Gln Leu Ile Ala 1 5 <210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 130 Phe Trp Leu Arg Phe Thr 1 5 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 131 Trp Val Arg Trp His Phe 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 132 Trp Val Arg Trp His 1 5 <210> 133 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 133 Trp His Phe Ile Phe Trp 1 5 <210> 134 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 134 Ile Trp Leu Ser Gly Leu Ser Arg Gly Val Trp Val Ser Phe Pro 1 5 10 15 <210> 135 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 135 Gly Ser Arg Ile Leu Thr Phe Arg Ser Gly Ser Trp Tyr Ala Ser 1 5 10 15 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 136 Asp Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ala Ala Leu Arg Asp Gln Ile 1 5 10 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 137 Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp 1 5 10 15 Ser <210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 138 Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg 1 5 10 15 <210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 139 Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg 1 5 10 15 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 140 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 141 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 142 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 143 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <221> SITE <222> 1 <223> Xaa = para-aminoPhe <400> 144 Xaa Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 145 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 146 <211> 13 <212> PRT <213> unknown <220> <223> Anticancer peptide <221> SITE <222> 7 <223> Xaa = C(O) <400> 146 Arg Ser Gly Ile Tyr Asp Xaa Asp Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 147 <211> 3 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 147 Arg Gly Asp 1 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 148 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 149 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 149 Ile Pro Cys Asn Asn Lys Gly Ala His Ser Val Gly Leu Met Trp Trp 1 5 10 15 Met Leu Ala Arg 20 <210> 150 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 150 Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala 1 5 10 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 151 Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser 1 5 10 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 152 Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 153 Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu 1 5 10 <210> 154 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 154 Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu 1 5 10 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 155 Cys His Ala Val Cys 1 5 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 156 Cys Glu Lys His Ile Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Asp Asp Asp 1 5 10 15 Asp <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Anticancer peptide <400> 157 Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys 1 5 10 <210> 158 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Binds human type 1 IL-1 receptor <221> SITE <222> 10 <223> Xaa = 1-azetidine-2-carboxylic acid <400> 158 Phe Glu Trp Thr Pro Gly Trp Tyr Gln Xaa Tyr Ala Leu Pro Leu 1 5 10 15

Claims (75)

  1. 하기 화학식을 가지는 약물 융합체:
    a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d 또는 a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n1-d,
    상기 식에서,
    X는 제 1 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 약물이고,
    Y는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이며,
    Z는 제 2 표적에 대해 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드 약물이고,
    a, b, c, 및 d는 독립적으로 1개 내지 약 100개 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이거나 존재하지 않고,
    n1은 1 내지 약 10이며,
    n2는 1 내지 약 10이고,
    n3는 0 내지 약 10이며,
    다만, n1 및 n2 둘 모두가 1이고 n3가 0인 경우에, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
  2. 제 1 항에 있어서, n1 및 n3가 둘 모두 1이고, n2가 2 내지 약 10임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  3. 제 1 항에 있어서, Y가 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  4. 제 1 항에 있어서, Y가 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22, 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  5. 제 1 항에 있어서, X가 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  6. 제 1 항에 있어서, X가 진통제, 항암제, 호르몬 또는 항균 폴리펩티드 또는 펩티드임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  7. 제 1 항에 있어서, X가 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 항염증제, 세포독소 또는 세포독성제임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  8. 제 1 항에 있어서, X가 프로테아제 억제제임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  9. X' 및 Y' 잔기를 포함하는 약물 융합체로서, X'가 폴리펩티드 약물이고(다만, X는 항체 사슬 또는 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다), Y'가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)인 약물 융합체.
  10. 제 9 항에 있어서, X'가 Y'에 대해 아미노 말단에 위치함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  11. 제 9 항에 있어서, Y'가 X'에 대해 아미노 말단에 위치함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 VH 및 VL이 인간 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 약물 융합체.
  13. 제 12 항에 있어서, Y'가 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25 및 서열번호:26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  14. 제 12 항에 있어서, Y'가 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22, 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 융합체.
  15. 제 9 항에 있어서, X'가 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체임을 특징으로 하는 약물 융합체.
  16. 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(Vl), 및 상기 VH 또는 VL에 공유결합된 약물을 포함하는 약물 컨쥬게이트.
  17. 제 16 항에 있어서, 약물 컨쥬게이트가 단일 VH를 포함함을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  18. 제 16 항에 있어서, 약물 컨쥬게이트가 단일 VL을 포함함을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 약물이 링커 잔기를 통해 상기 VH 또는 VL에 공유결합됨을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  20. 제 16 항에 있어서, 둘 이상의 상이한 약물이 상기 VH 또는 VL에 공유결합됨을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  21. 제 16 항에 있어서, 약물이 폴리펩티드임을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 IL-1ra 또는 IL-1ra의 작용성 변이체임을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  23. 제 16 항에 있어서, 약물이 진통제, 항암제, 호르몬 또는 항균 폴리펩티드 또는 펩티드임을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  24. 제 16 항에 있어서, 약물이 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 항염증제, 세포독소 또는 세포독성제, 항대사산물, 알킬화제, 안타사이클린 또는 방사선핵종임을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  25. 제 16 항에 있어서, 약물이 프로테아제 억제제임을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  26. 제 16 항에 있어서, 상기 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 서열번호:15, 서열번호:24, 서열번호:25, 서열번호:26, 서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:18, 서열번호:19, 서열번호:20, 서열번호:21, 서열번호:22 및 서열번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 약물 컨쥬게이트.
  27. 제 1 항 또는 제 9 항의 약물 융합체를 엔코딩하는 재조합 핵산.
  28. 제 27 항의 재조합 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
  29. 제 27 항의 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  30. 제 29 항의 숙주 세포를 상기 재조합 핵산의 발현을 위해 적합한 조건하에서 유지하고, 이에 의해 약물 융합체를 생성하는 것을 포함하는 약물 융합체 생성 방법.
  31. 제 1 항 또는 제 9 항의 약물 융합체 및 생리학적 허용 담체를 포함하는 약제 조성물.
  32. 제 16 항의 약물 컨쥬게이트 및 생리학적 허용 담체를 포함하는 약제 조성물.
  33. 제 5 항, 제 15 항, 및 제 22 항 중 어느 한 항의 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하여, 염증성 질환을 가지는 개체를 치료하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 염증성 질병이 관절염임을 특징으로 하는 방법.
  35. 치료, 진단 또는 예방용인 제 3 항, 제 4 항, 제 13 항, 제 14 항 및 제 26 항중 임의의 한 항의 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체.
  36. 치료, 진단 또는 예방용인 제 5 항, 제 15 항, 제 22 항중 임의의 한 항의 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체.
  37. 제 5 항, 제 15 항, 및 제 22 항 중 어느 한 항의 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체의 염증성 질병의 치료를 위한 약제 제조용 용도.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 염증성 질병이 관절염임을 특징으로 하는 용도.
  39. 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 또는 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL), 및 상기 VH 또는 VL에 비공유결합된 약물을 포함하는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 VH 또는 VL 및 상기 약물이 상보성 결합 파트너를 통해 비공유결합됨을 특징으로 하는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 상보성 결합 파트너가 비오틴과 아비딘 또는 비오틴과 스트렙타비딘임을 특징으로 하는 비공유결합성 약물 컨쥬게이트.
  42. 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기의, 약 10% 초과하여 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체를 포함하는 약제 제조를 위한 용도.
  43. 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기의, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체를 포함하는 약제 제조를 위한 용도.
  44. 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기의, 약 10% 초과하여 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체를 포함하는 약제 제조를 위한 용도.
  45. 생체내에서 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기의, 약 10% 초과하여 약물의 활성을 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위하여, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물 조합체를 포함하는 약제 제조를 위한 용도.
  46. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합된 약물 조합체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  47. 제 46 항에 있어서, 약물 조합체가 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 용도.
  48. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 비공유결합된 약물 조합체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  49. 제 48 항에 있어서, 약물 조합체가 비공유결합성 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 용도.
  50. 제 42 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 용도.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 용도.
  52. 제 42 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 상기 약물보다 더 큰 활성을 가지는 약물 조합체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
  53. 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합하여 약물 조합체를 생성하는 것을 포함하고, 상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는, 약물의 활성을 실질적으로 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키기 위한 방법.
  54. 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합하여 약물 조합체를 생성하는 것을 포함하고, 상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물 보다 덜 면역원성인, 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 방법.
  55. 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합하여 약물 조합체를 생성하는 것을 포함하고, 상기 약물 조합체가 상기 약물 보다 덜 면역원성이고 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는, 약물의 활성을 실질적으로 감소시킴 없이 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 방법.
  56. 약물을 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합하여 약물 조합체를 생성하는 것을 포함하고, 상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 더 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고, 상기 약물 보다 덜 면역원성이며, 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는, 약물의 활성을 실질적으로 감소시킴 없이 약물의 생체내 혈청 반감기를 증가시키고 약물의 면역원성을 감소시키기 위한 방법.
  57. 제 53 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물을 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 약물 조합체가 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 53 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물을 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 비공유결합시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 약물 조합체가 비공유결합성 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 53 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하나 이상의 폴리펩티드로부터 상기 폴리펩티드 결합 잔기를 선택하는 것을 추가로 포함하고, 선택된 폴리펩티드 결합 잔기가 약 5mM 이상의 KD로 생체내 혈청 반감기를 증강시키는 폴리펩티드에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 53 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 53 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 조합체가 상기 약물에 비해 보다 큰 활성을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  65. 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물을 포함하는 약물 조합체로서,
    상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는 약물 조합체.
  66. 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물을 포함하는 약물 조합체로서,
    상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 보다 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고 상기 약물 보다 덜 면역원성인 약물 조합체.
  67. 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물을 포함하는 약물 조합체로서,
    상기 약물 조합체가 상기 약물 보다 덜 면역원성이고 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는 약물 조합체.
  68. 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 가지는 결합 위치를 가지는 폴리펩티드 결합 잔기에 결합된 약물을 포함하는 약물 조합체로서,
    상기 약물 조합체가 상기 약물에 비해 더 긴 생체내 혈청 반감기를 가지고, 상기 약물 보다 덜 면역원성이며, 상기 약물의 활성의 약 90% 이상을 가지는 약물 조합체.
  69. 제 65 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 공유결합됨을 특징으로 하는 약물 조합체.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 약물 조합체가 약물 융합체 또는 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 약물 조합체.
  71. 제 65 항 내지 제 68 항에 있어서, 약물이 상기 폴리펩티드 결합 잔기에 비공유결합됨을 특징으로 하는 약물 조합체.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 약물 조합체가 비공유결합성 약물 컨쥬게이트임을 특징으로 하는 약물 조합체.
  73. 제 65 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가짐을 특징으로 하는 약물 조합체.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 결합 잔기가 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 가지는 항체의 항원 결한 단편임을 특징으로 하는 약물 조합체.
  75. 제 65 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 조합체가 상기 약물보다 더 큰 활성을 가짐을 특징으로 하는 약물 조합체.
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