KR20080003306A

KR20080003306A - 신생물성 질환을 치료하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20080003306A
Application number: KR1020077015299A
Authority: KR
Inventors: 케네스 씨. 앤더슨; 다마인더 차우한
Original assignee: 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Priority date: 2004-12-03
Filing date: 2005-12-02
Publication date: 2008-01-07
Anticipated expiration: 2025-12-02
Also published as: BRPI0517135A; KR101282191B1; NZ555439A; US20140349965A1; JP5676071B2; CN103230394A; HK1113462A1; IL236426A0; CA2588923C; ZA200704402B; JP2012236862A; CN101155582B; US20230210817A1; DK1830838T3; MX2007006526A; JP2015028089A; US20070225350A1; SG157365A1; JP5837469B2; CN101155582A

Abstract

본 발명에는 신생물성 질환을 치료하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 또, 통상의 보르테조미브 치료에 대해 내성이 있는 다발성 골수종 세포에 대항해서 효과적인 조성물 및 방법이 포함된다. 또한, 상이한 2종의 프로테오좀 억제제에 의한 병용 치료는 다발성 골수종을 치료하는 데 상승작용을 보인다.

신생물성 질환, 프로테오좀 억제제, 보르테조미브

Description

신생물성 질환을 치료하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEOPLASTIC DISEASES}

본 발명은 화학 및 의약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암과 같은 신생물성 질환의 치료에 관한 것이다.

암은 미국에서의 사망의 주된 원인이다. 암을 치료하기 위한 새로운 접근법을 발견하기 위한 상당한 노력에도 불구하고, 1차 치료 선택권은 여전히 수술, 화학요법 및 방사선 요법의 단독 혹은 병용 요법이다. 그러나, 수술 및 방사선 요법은 일반적으로 상당히 규정된 유형의 암에 대해서만 유용하고, 전신적인 질환(disseminated disease)을 가진 환자를 치료하기 위한 용도에 제한되어 있다. 화학요법은 백혈병 등의 미만성 암(diffuse cancer) 혹은 전이암을 가진 환자를 치료하는 데 일반적으로 유용한 방법이다. 화학요법은 치료상 유익을 제공할 수 있지만, 화학요법제에 대한 내성이 있는 환자의 암 세포로 인한 질환을 치유하는 데 실패할 경우가 있다.

따라서, 암을 치료하기 위한 부가적인 화학요법제에 대한 필요도 존재한다. 신규의 잠재적으로 유용한 화학요법제 및 항균제를 확인하기 위해 개별의 연구자, 학계 및 회사에서 계속적인 노력이 행해지고 있다.

재발/난치성의 다발성 골수종(MM: multiple myeloma)의 치료를 위한 보르테조미브(Bortezomib)/PS-341 요법의 성공적인 개발은 유효한 치료 전략으로서 프로테아좀 억제를 확립시켰다. 다이펩타이드 보론산 유사물인 보르테조미브는 26S 프로테아좀 복합체를 표적으로 해서 그의 작용을 억제하는 잠재적이고 고도의 선택성이며 또한 가역성인 프로테아좀 억제제이다. 26S 프로테아좀은 세포내 단백질 분해를 매개하는 아데노신 트라이포스페이트(ATP)-의존성 멀티촉매 프로테아제이다. 잘못 꺾이거나 손상된 단백질의 프로테아좀 분해는 26S 프로테아제의 19S 조절 아단위(subunit)에 의해 폴리유비퀴틴작용된 단백질의 인식에 의해 진행되고, 이어서 작은 폴리펩타이드로 가수분해된다. 보르테조미브는 트립신 분해 혹은 카스파제-유사 프로테아좀 활성을 변화시키는 일없이 키모트립신 분해를 주로 억제한다. NF-kB를 억제하는 외에, 보르테조미브는 이하의 1) 내지 5)를 표적으로 해서 MM 생물학에 대한 다양성 발현 효과를 가진다: 1) 세포주기 조절 단백질; 2) 형질세포 분화유발 인자인 XBP-1(X-box binding protein-1)의 전사 활성의 매개를 통한 UPR 경로; 3) p53-매개 세포자멸사/MDM2; 4) DNA 복구 기전; 5) 내인성(카스파제-9 매개) 및 외인성(카스파제-8 매개) 세포 사멸 연쇄반응의 양쪽 모두를 통한 전통적인 스트레스 반응 경로. 구체적으로는, 보르테조미브는 JNK를 활성화시켜, 미토콘드리아 세포자멸사 신호, 즉, 사이토크롬-c(사이토-c) 및 카스파제의 제2 미토콘드리아 활성제(Smac)의 미토콘드리아로부터 사이토졸까지의 방출에 이어 카스파제-9 및 카스파제-3의 활성을 유발시킨다. 그러나, 내인성 저항(혹은 내성) 및 획득 저항의 양쪽 모두는 이미 관측되어 있고, 현재 보르테조미브 내성을 극복하기 위한 요 법은 없다.

발명의 개요

본 발명의 일 측면은 신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 이하의 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물을 투여하는 것을 포함하되, 상기 신생물성 질환은 적어도 하나의 다른 화학요법제에 대한 내성에 민감한 것인 방법이다:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물을 적어도 하나의 부가적인 화학 요법제와 병용해서 투여하는 것을 포함하는 방법이며, 여기서, 화학식 (I) 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물; 및 적어도 하나의 부가적인 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물이며, 여기서, 화학식 (I) 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 측면은 적어도 2종의 프로테오좀 억제제의 상승작용적 병용물(synergistic combination)을 신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 신생물성 질환의 치료 방법이다.

바람직한 실시형태의 상세한 설명

일 실시형태에 있어서, 화학식 (I)에 의한 화합물은 여기에 기재된 것과 같은 용도를 위해 제공된다:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, X는 염소이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)에 따른 입체 화학을 가진다:

상기 화학식 (II)의 화합물(식 중, X=Cl)은 본 명세서에서 NPI-0052로도 칭한다. 상기 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 해양 그램 양성 방선균인 살리노스포라의 발효로부터 유도될 수 있다.

일부의 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 화합물의 전구 약물, 대사 산물, 입체이성질체 및 약제학적 허용염은 본 명세서에 기재된 바와 같은 용도를 위해 제공된다.

"전구 약물"이란 생체내에서 모(parent) 약물로 전환되는 약제를 의미한다. 전구 약물은, 어떤 상황에 있어서는 이들이 모 약물보다 더욱 용이하게 투여될 수 있기 때문에 종종 유용하다. 이들은 예를 들어 상기 모 약물이 아닌 데 반해 경구 투여에 의해 생체이용가능하게 될 수도 있다. 상기 전구 약물은 또한 모 약물보다 약제학적 조성물에 있어서 향상된 용해성을 지닐 수도 있다. 전구 약물의 예는, 제한되지는 않지만, 수 용해성이 이동에 유해한 세포막을 통해 전달을 용이하게 하는 에스터("전구 약물")로서 투여되지만 이어서 일단 수 용해성의 혜택을 볼 수 있는 세포 내부에서 활성 전량을 카복실산으로 대사적으로 가수분해시키는 화합물이다. 전구 약물의 또 다른 예는 펩타이드가 신진대사되어 활성 부분을 드러내는 산기에 결합된 짧은 펩타이드(폴리아미노산)일 수도 있다. 적절한 전구 약물 유도체의 선택 및 제조를 위한 종래의 절차는 예를 들어 문헌[Design of Prodrugs(ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985)]에 기재되어 있고, 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다.

용어 "전구 약물 에스터"란 생리적 조건하에 가수분해된 수개의 에스터-형성기의 어느 것의 첨가에 의해 형성된 본 명세서에 개시된 화합물의 유도체를 의미한다. 전구 약물 에스터기의 예로는 폴리보일옥시메틸, 아세톡시메틸, 프탈리딜, 인다닐 및 메톡시메틸뿐만 아니라, 당업계에 공지된 기타 기, 예를 들어 (5-R-2-옥소-1,3-다이옥솔렌-4-일)메틸기를 들 수 있다. 전구 약물 에스터기의 다른 예는 예를 들어 문헌 [T. Higuchi and V. Stella, in "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975); 및 "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", edited by E. B. Roche, Pergamon Press: New York, 14-21 (1987)]에서 발견할 수 있다(카복실기를 함유하는 화합물에 대한 전구 약물로서 유용한 에스터의 예를 제공함). 상기 문헌은 각각 그들의 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다.

본 명세서에 개시된 화합물의 대사 산물은 상기 화합물을 생물학적 환경 내로 도입할 때 생성된 활성종을 포함한다.

본 명세서에 개시된 화합물이 적어도 1개의 카이럴 중심을 가질 경우, 이들은 라세미체로서 혹은 거울상 이성질체로서 존재할 수 있다. 단, 이러한 이성질체 및 그의 혼합물도 모두 본 발명의 범위내에 포함된다. 또한, 본 명세서에 개시된 화합물의 결정 형태의 일부는 다형체로서 존재할 수 있다. 이러한 다형체는 본 발명의 일부의 실시형태에 포함된다. 또한, 본 발명의 화합물의 일부는 물(즉, 수화물) 또는 통상의 유기 용매와 용매화물을 형성할 수 있다. 이러한 용매화물은 본 발명의 일부의 실시형태에 포함된다.

용어 "약제학적 허용염"이란 투여된 경우 유기체에 유의한 자극을 일으키지 않고 생물학적 활성 및 화합물의 성질을 저지하지 않는 화합물의 염을 의미한다. 일부의 실시형태에 있어서, 상기 염은 상기 화합물의 부가염이다. 약제학적 염은 하이드로할로산(예를 들어, 염산 또는 브롬화 수소산), 황산, 질산, 인산 등의 무기산과 화합물을 반응시킴으로써 얻어질 수 있다. 약제학적 염은 예를 들어, 아세트산, 숙신산, 락트산, 말산, 주석산, 구연산, 아스코르브산, 니코틴산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 혹은 나프탈렌설폰산 등의 지방족 혹은 방향족 카복실산 또는 설폰산과 같은 유기산과 화합물을 반응시킴으로써 얻어질 수도 있다. 또, 약제학적 염은 화합물과 염기를 반응시켜, 암모늄염; 나트륨염이나 칼륨 등의 알칼리금속염; 칼슘염 혹은 마그네슘염 등의 알칼리토금속염; 다이사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, C₁-C₇ 알킬아민, 사이클로헥실아민, 트라이에탄아민, 에틸렌다이아민 등의 유기염기의 염; 및 아르긴, 라이신 등이 아미노산과의 염과 같은 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.

약제학적 제제의 제조가 약제학적 부형제와 염의 형태의 활성 성분을 친밀하게 혼합하는 것을 포함할 경우, 비염기성인 약제학적 부형제, 예를 들어 산성 혹은 중성 부형제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

다양한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 화합물은 단독으로, 본 명세서에 개시된 다른 화합물과 배합해서, 또는 본 명세서에 기재된 치료 분야에 있어서의 1종 이상의 다른 약제와 배합해서 사용할 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "할로겐 원자"란 예를 들어 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 등의 원소의 주기율표의 제 7족의 방사선에 안정한 원자들의 어느 것을 의미하며, 불소 또는 염소가 바람직하다.

용어 "에스터"란 화학식 -(R)_n-COOR'를 가진 화학적인 성분(chemical moiety)을 의미하며, 상기 식 중, R 및 R'는 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 및 헤테로지환식(고리 탄소를 통해 결합됨)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다.

"아마이드"는 화학식 -(R)_n-C(O)NHR' 또는 -(R)_n-NHC(O)R'를 가진 화학적인 성분이며, 상기 식 중, R 및 R'는 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨) 및 헤테로지환식(고리 탄소를 통해 결합됨)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다. 아마이드는 본 발명의 하나의 분자에 부착된 아미노산 혹은 펩타이드 분자일 수 있고, 이에 따라 전구 약물을 형성할 수 있다.

본 발명의 화합물 상의 임의의 아민, 하이드록시 혹은 카복실 곁사슬은 에스터화 혹은 아마이드화될 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해 사용되는 절차 및 특정 기는 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]과 같은 참고 문헌에서 용이하게 발견할 수 있고, 이 문헌은 전체로서 본 명세서에 병합된다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "정제된", "실질적으로 정제된" 및 "단리된"이란 본 발명의 화합물이 통상 그들의 자연적인 상태에서 연합되는 기타 다른 화합물이 없는 본 명세서에 기재된 화합물을 의미하므로, 본 발명의 화합물은 주어진 샘플의 질량의 적어도 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량% 또는 20 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 50 중량% 또는 75 중량%를 포함한다.

사용방법

본 명세서에 존재하는 실시예에서 입증되는 바와 같이, 상기 화학식 (I)의 화합물은 키모트립신-유사, 트립신-유사 및 카스파제-유사 프로테아좀 활성을 억제한다. 이에 대해서, 보르테조미브는 키모트립신-유사 프로테아좀 활성만을 억제하는 것으로 나타나있다. 이것은 예를 들어, 문헌[Goldberg, A. L. & Rock, K. (2002) Nat Med 8, 338-40 및 Adams, J. (2004) Nat Rev Cancer 4, 349-60]을 참조할 수 있고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 또한, 상기 화학식 (I)의 화합물은 보르테조미브와는 다른 작용 기전을 가지는 것으로 입증되어 있다. 게다가, 상기 화학식 (I)의 화합물은 덱사메타손-감수성 MM.1S, 덱사메타손-내성 MM.1R, RPMI-8226, OPM2, U266 및 독소루비신-내성 Dox-40을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 다양한 다발성 골수종 세포주에 있어서 세포자멸사를 유발한다. 상기 화학식 (I)의 화합물은 또한 덱사메타손, 보르테조미브 및 탈리도마이드에 의한 다수의 이전의 요법 후에 재발된 인간의 다발성 골수종 환자로부터 획득한 세포주에 있어서 세포자멸사를 유발한다. 이와 같이 해서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 덱사메타손, 독소루비신, 보르테조미브/PS-341 및 탈리도마이드를 포함하는 다른 화학 요법제에 대해 내성이 있는 MM 세포에 대항해서 효과적이다.

따라서, 일 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물 에스터를 인간 등의 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 적어도 1종의 화학요법제에 대한 내성에 민감한 신생물성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. "적어도 1종의 화학요법제에 대한 내성"에 의해서란, 환자에 대한 화학요법제의 투여가 상기 신생물성 질환의 증상의 유의한 개선을 초래하지 못하는 것을 의미한다. 상기 신생물성 질환이 종양을 특징으로 하는 일부의 실시형태에 있어서, "적어도 1종의 화학요법제에 대한 내성"이란 종양의 성장의 상당한 억제 혹은 종양 크기의 감소를 가져오지 못하는 것을 의미한다. "적어도 1종의 화학요법제에 대한 내성"은 또한 상기 약제가 내성이 있는 종양 세포에 폭로될 경우, 상당한 세포자멸사를 유발하지 못하는 것을 의미할 수도 있다. 적어도 1종의 화학요법제에 대한 내성에 "민감한"에 의해서란, 신생물성 질환이 현재 적어도 1종의 화학요법제에 내성이 있거나 상기 화학요법제의 반복 투여시 내성을 발전시키는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서의 실시예는 보르테조미브와 병용되는 경우 화학식 (I)의 화합물이 MM 세포에 있어서 상승작용적인 세포자멸사를 유발시키는 것도 입증한다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물은 보르테조미브/PS-341과 병용해서 투여되어, 상기 약제가 개별적으로 투여된 경우보다 각 약제의 용량을 낮추어 사용해서 세포자멸사를 달성하므로, 약제의 독성을 저감시킬 수 있다. 경이롭게도, 이들 결과는 상이한 2종의 프로테아좀 억제제를 투여함으로써 상승작용적인 결과가 얻어질 수 있는 것을 입증한다. "상승작용적"이란, 2종 이상의 약제의 병용이 조합지수(combination index)(CI) < 1.0을 가져오는 것을 의미한다. 또한, 상기 화학식 (I)의 화합물과 비-프로테아좀 억제제와의 병용은 부가적인 효과를 제공하는 것도 입증되어 있다. "부가적인"이란, 2종 이상의 약제의 병용이 대략 1과 동일한 CI를 가져오는 것을 의미한다. CI는 예를 들어 이하의 방정식에 따른 추오-탈라레이법(Chou-Talalay method)에 의해 결정될 수 있다: "CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2"(식 중, (D)1 및 (D)2는 병용해서 사용할 경우 x 효과를 가지는 약물 1 및 약물 2의 용량이며; (Dx)1 및 (Dx)2는 단독으로 사용할 경우 동일한 x 효과를 가지는 약물 1 및 약물 2의 용량이다.

따라서, 일 실시형태에 있어서, 2종 이상의 프로테아좀 억제제를 상승작용적으로 병용해서 투여하는 것을 포함하여 신생물성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 병용될 수 있는 프로테아좀 억제제의 부류의 비제한적인 예로는 펩타이드 보로네이트 프로테아좀 억제제, 펩타이드 알데하이드 프로테아좀 억제제 또는 비-펩타이드 프로테아좀 억제제를 들 수 있다. 펩타이드 보로네이트 프로테아좀 억제제의 비제한적인 예는 보르테조미브이다. 펩타이드 알데하이드 프로테아좀 억제제의 비제한적인 예는 MG-132이다. 비-펩타이드 프로테아좀 억제제의 비제한적인 예로는 오무랄라이드(omuralide) 및 상기 화학식 (I)의 화합물을 들 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 적어도 1종의 프로테아좀 억제제는 화학식 (I)의 화합물 또는 보르테조미브이다. "병용"해서 투여하는 것이란, 2종 이상의 약제가 실제로 이들을 언제 혹은 어떻게 투여하는지에 관계없이 동일한 시간에 환자의 혈류에서 발견될 수 있는 것을 의미한다. 일 실시형태에 있어서, 약제는 동시에 투여된다. 이러한 일 실시형태에 있어서, 병용 투여는 단일 제형의 약제를 병용함으로써 달성된다. 다른 실시형태에 있어서, 약제는 순차 투여된다. 일 실시형태에 있어서, 약제는 경구 방식 등과 같이 동일한 경로를 통해 투여된다. 다른 실시형태에 있어서, 약제들은 하나는 경구 투여하고 다른 쪽은 정맥내 투여하는 것과 같이 상이한 경로를 통해 투여된다. 하나의 유리한 실시형태에 있어서, 2종 이상의 약제의 약동학은 실질적으로 동일하다.

일 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 화합물을 다른 화학요법제와 병용해서 투여하는 것을 포함하는 신생물성 질환의 치료 방법이 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 덱사메타손, 독소루비신 또는 탈리도마이드이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 보르테조미브 등의 다른 프로테아좀 억제제이다. 일 실시형태에 있어서, 화학식 (I)의 화합물을 부가적인 화학요법제와 배합한 약제학적 조성물이 제공된다.

일부의 실시형태에 있어서, 상기 방법 중 어느 방법에 의해 치료되는 신생물성 질환은 유방암, 육종, 백혈병, 난소암, 요관암, 방광암, 전립선암, 결장암, 직장암, 위암, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 췌장암, 간암, 신장암, 내분비암, 피부암, 흑색종, 혈관종, 및 뇌 또는 중추신경계(CNS: central nervous system) 암으로부터 선택된 암일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 신생물성 질환은 다발성 골수종이다.

약제학적 조성물

다른 측면에 있어서, 본 발명은 생리학적 허용 계면활성제, 담체, 희석제, 부형제, 평활제, 현탁제, 막형성물질 또는 코팅 조제를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이들의 배합물; 및 본 명세서에 개시된 화합물 또는 배합물에 관한 것이다. 치료상 용도를 위한 허용가능한 담체 또는 희석제는 제약 업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)]에 기재되어 있고, 이 문헌은 전체로서 참고로 본 명세서에 병합된다. 약제학적 조성물에는 방부제, 안정제, 염료, 감미료, 방향제, 향미료 등이 제공될 수 있다. 예를 들어, 방부제로서 벤조산 나트륨, 아스코르브산 또는 p-하이드록시벤조산의 에스터가 첨가될 수 있다. 또한, 산화방지제 또는 현탁제가 이용될 수도 있다. 각종 실시형태에 있어서, 계면활성제로서 알코올류, 에스터류, 황산염 지방족 알코올류 등을 이용할 수 있고; 부형제로서 슈크로스, 글루코스, 락토스, 전분, 결정화 셀룰로스, 만니톨, 경질 무수규산, 알루민산 마그네슘, 메타규산 알루민산 마그네슘, 합성 규산 알루미늄, 탄산 칼슘, 소듐 애시트 카보네이트, 인산수소나트륨, 카복시메틸 셀룰로스 등을 이용할 수 있으며; 평활제로서 스테아르산 마그네슘, 탤크, 경화유 등을 이용할 수 있고; 현탁제 또는 윤활제로서는 야자유, 올리브유, 참기름, 땅콩유, 대두유 등을 이용할 수 있으며; 현탁제로서 셀룰로스 혹은 슈거 등의 탄수화물의 유도체로서의 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 또는 폴리비닐의 유도체로서의 메틸아세테이트-메타크릴레이트 공중합체 등을 이용할 수 있고; 현탁제로서 에스터 프탈레이트류 등의 가소제 등을 이용할 수 있다.

용어 "약제학적 조성물"이란 희석제 또는 담체 등과 같이 기타 화학적 성분과 본 명세서에 개시된 화합물의 배합물 혹은 화합물의 혼합물을 의미한다. 약제학적 조성물은 유기체에 상기 화합물의 투여를 용이하게 한다. 경구, 주사, 분무, 비경구 및 국소 투여 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 화합물을 투여하는 다수의 수법이 당업계에 존재한다. 약제학적 조성물은 화합물을, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등의 무기산 혹은 유기산과 반응시킴으로써 얻을 수도 있다.

용어 "담체"란 세포나 조직에 화합물의 편입을 용이하게 하는 화학적인 화합물을 규정한다. 예를 들어, 다이메틸설폭사이드(DMSO)는 유기체의 세포나 조직에 많은 유기 화합물의 섭취를 용이하게 하는 통상 이용되는 담체이다.

용어 "희석제"는 상기 화합물의 생물학적 활성제를 안정화하는 동시에 관심대상 화합물을 용해시키는 물에 희석된 화학적인 화합물을 규정한다. 완충용액에 용해된 염은 당업계에 있어서 희석제로서 이용된다. 통상적으로 이용되는 하나의 완충용액은 인산염 완충식염수이고, 그 이유는 이것이 인간의 혈액의 염 조건과 흡사하기 때문이다. 완충염은 용액의 pH를 낮은 농도로 제어할 수 있으므로, 완충 희석제는 화합물의 생물학적 활성을 좀체로 변화시키기 않는다.

용어 "생리학적 허용"이란 상기 화합물의 생물학적 활성과 특성을 저해하지 않는 담체 혹은 희석제를 규정한다.

본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 그 자체로 인간 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 적절한 담체 혹은 부형제(들)와 혼합될 경우 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 즉각적인 용도의 이 화합물 및 제제를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990]에서 발견될 수 있다.

적절한 투여 경로로는 예를 들어 경구, 직장, 경점막, 국소 혹은 장내 투여; 근육내, 피하, 정맥내, 골수내 주입뿐만 아니라, 경막내, 직접 심실내, 복막내, 비강내 또는 안구내 주입 등의 비경구 전달을 들 수 있다. 상기 화합물은 또한 소정 속도로 연장된 및/또는 정해진 시간의 펄스방식 투여를 위해 점적 주입, 삼투 펌프, 환제, 경피(전기수송을 포함함) 첩포제 등을 포함하는 서방성 혹은 방출제어된 제형으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 제립화, 당의정 제조, 가루화, 유화, 캡슐화, 포획화 혹은 정제화 과정의 수법에 의해 자체로 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

이와 같이 해서 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 화합물을 약제학적으로 사용할 수 있는 제제로 가공하기 용이하게 하는 부형제 및 조제를 포함하는 1종 이상의 생리학적 허용 담체를 이용하는 종래의 방법으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여경로에 따라 좌우된다. 잘 알려진 기술, 담체 및 부형제의 어느 것이라도 예를 들어 전술한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재된 바와 같이 당업계에서 이해할 수 있고 또한 적합하다면 이용될 수 있다.

주사제는 통상의 형태, 예를 들어 주사 전에 액체 중에서 용액 혹은 현탁제를 위해 적합한 고체 형태, 액체 용액 혹은 현탁제로서 혹은 유제로서 조제될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 글루탐산 나트륨, 시스테인 염산염 등이다. 또한, 필요한 경우, 주사용 약제학적 조성물은 습윤제, pH 완충제 등과 같은 비독성의 조제 물질을 소량 함유할 수 있다. 생리학적 상용성 완충제로는 예를 들어 행크 용액(Hanks's solution), 링거 용액 혹은 생리적 식염수 완충액을 들 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 필요한 경우, 흡수증강조제(예를 들어, 리포솜)를 이용할 수도 있다.

경점막 투여를 위해서, 투여대상 장벽에 대해 적절한 침투제가 제제에 이용될 수도 있다.

예를 들어 한번에 주사하거나 연속적 주입에 의한 비경구 투여용의 약제학적 제제는 수가용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁제는 적절한 유성의 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적절한 친지성 용제 혹은 비히클로는 참기름 등의 지방유, 또는 대두유, 그레이프후르츠오일 혹은 아몬드유 등의 기타 유기 오일, 올레산 에틸 혹은 트리글리세라이드류 등의 합성 지방산 에스터류, 또는 리포솜 등을 들 수 있다. 주사용 수성 현탁제는 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 혹은 덱스트란 등의 현탁제의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁제는 또한 적절한 안정제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농도 용액의 제조를 허용하는 제제를 함유할 수도 있다. 주사용 제제는 첨가된 방부제와 함께 예를 들어 앰플 혹은 다회 용량 용기 속에 단위 제형으로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 혹은 수성 비히클 중에 유제, 용액 혹은 현탁제와 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제 등의 배합 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수와 함께 구성용의 분말 형태일 수 있다.

경구 투여를 위해서, 상기 화합물은 당업계에 충분히 공지된 약제학적 허용 담체와 활성 화합물을 배합함으로써 용이하게 조제될 수 있다. 이러한 담체에 의해 본 발명의 화합물은 치료대상 환자에 의해 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로서 조제될 수 있다. 경구 용도를 위한 약제학적 제제는 상기 활성 화합물을 고체 부형제와 배합하고, 얻어진 혼합물을 임의적으로 분쇄하고, 필요에 따라 적절한 조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 혹은 당의정 코어를 얻음으로써 얻어질 수 있다. 적절한 부형제는 특히 락토스, 슈크로스, 만니톨 혹은 소르비톨을 포함한 슈거; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 고무, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 등의 셀룰로스 제제 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등의 충전제이다. 필요한 경우, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 혹은 알긴산 나트륨 등의 그의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다. 당의정 코어에는 적절한 코팅이 실시된다. 이 목적을 위해서, 아라비아 고무, 탤크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보톨 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용제 또는 용제 혼합물을 임의적으로 함유할 수 있는 슈거 농축용액이 이용될 수 있다. 염료 또는 안료는 활성 화합물 용량의 상이한 배합을 특징화하기 위해 혹은 확인하기 위해 정제 혹은 당의정 코팅에 첨가될 수 있다. 이 목적을 위해서, 아라비아 고무, 탤크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보톨 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용제 또는 용제 혼합물을 임의적으로 함유할 수 있는 슈거 농축용액이 이용될 수 있다. 염료 또는 안료는 활성 화합물 용량의 상이한 배합을 특징화하기 위해 혹은 확인하기 위해 정제 혹은 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구방식으로 이용될 수 있는 약제학적 제제는 글리세롤 또는 소르비톨 등의 가소제 및 젤라틴으로 이루어진 연질의 봉합 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 이루어진 압입 캡슐(push-fit 캡슐)을 포함한다. 이 압입 캡슐은 락토스 등의 충전제, 전분 등의 결합제 및/또는 탤크 혹은 스테아르산 마그네슘 등의 윤활제, 그리고 임의적으로 안정제와 혼합해서 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에 있어서, 상기 활성 화합물은 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 등의 적절한 액체에 용해 혹은 현탁될 수 있다. 또한, 안정제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제제는 이러한 투여에 적합한 용량일 필요가 있다.

한꺼번에 투여하기 위해서, 상기 조성물은 통상의 방법으로 조제된 정제 또는 로렌지(lozenge) 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해서, 본 발명에 의한 용도를 위한 화합물은 예를 들어, 다이클로로다이플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체 등의 적절한 분사제를 이용해서 가압팩 혹은 분무기로부터 에어로졸 분무 제품의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 설치해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 혹은 취입기에 이용하기 위한 젤라틴의 캡슐 혹은 카트리지는 상기 화합물과 락토스 또는 전분 등의 적절한 분말 베이스의 분말 믹스를 함유해서 조제될 수 있다.

본 명세서에는 또한 안구내, 비강내 및 이강내 전달을 포함하는 용도를 위한 약제학적 분야에서 잘 알려진 다양한 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 이들 용도를 위한 적절한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 안구내 전달을 위한 약제학적 조성물로는 점적제 등의 수가용성 형태로, 또는 젤란 검(Shedden et al., Clin . Ther., 23(3):440-50 (2001)) 또는 하이드로겔(Mayer et al., Ophthalmologica, 210(2): 101-3 (1996))으로 활성 화합물의 수용성 안과용 액제; 안과용 연고; 미립자, 액체 담체 매질에 현탁된 약물 함유 중합성의 소립자 등의 안과용 현탁제(Joshi, A., J. Ocul . Pharmacol, 10(l):29-45 (1994)), 지질-가용성 제제(Alm et al., Prog . Clin . Biol . Res., 312:447-58 (1989)) 및 미소구(Mordenti, Toxicol . Sci, 52(1): 101-6 (1999)); 및 안구 삽입물을 들 수 있다. 상기 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 이러한 적합한 약제학적 제제는 가장 흔하게 그리고 바람직하게는 안전성 및 편안함을 위해 멸균, 등장성 및 완충되도록 조제된다. 비강내 전달을 위한 약제학적 조성물은 또한 통상의 섬모 작용의 유지를 확실하게 하기 위해서 많은 관점에서 비강 분비를 자극하기 위해 종종 조제된 점적약제 및 스프레이를 포함할 수도 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)]에 기재된 바와 같이, 적절한 제제는 가장 흔하게 그리고 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5를 유지하기 위해 등장성, 약간 완충되어 있고, 가장 흔하게 그리고 바람직하게는 항균 방부제 및 적절한 약물 안정제를 포함하며, 상기 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합되고, 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 이강내 전달을 위한 약제학적 제제는 귀의 국소 용도용의 현탁제 및 연고를 포함한다. 귀 제제용의 공통 용제로는 글리세린 및 물을 포함한다.

상기 화합물은 또한 예를 들어 카카오 기름 또는 기타 글리세라이드류 등의 통상의 좌약 기재를 함유하는 좌약 혹은 정체 관장제 등의 직장 조성물로 조제될 수도 있다.

또한, 이미 설명한 제제에 대해서, 상기 화합물은 데포 제제로서 조제될 수도 있다. 이러한 장기간 작용하는 제제는 삽입(예를 들어, 경피 또는 근육내)에 의해 혹은 근육내 주입에 의해 투여될 수 있다. 이와 같이 해서, 예를 들어, 상기 화합물은 적절한 중합체 혹은 소수성 재료(예를 들어 허용가능한 오일 중의 유제로서) 또는 이온교환수지와 배합되거나, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 배합될 수 있다.

소수성 화합물에 대해서는, 적절한 약제학적 담체는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수상을 포함하는 공용제계일 수 있다. 이용된 공통의 공용제계는 VPD 공용제계이며, 이것은 무수 에탄올 중의 체적을 이루는 3% w/v 벤질 알코올, 8% w/v 비극성 계면활성제인 폴리소르베이트 80(등록상표명; Polysorbate 80™) 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. 당연히, 공용제계의 비율은 그의 용해도 및 독성 특성을 파괴하는 일없이 상당히 변화될 수 있다. 또한, 공용제 성분의 동질성은 변화될 수 있으며; 예를 들어, 기타 저독성의 비극성 계면활성제가 폴리소르베이트 80(등록상표명) 대신에 이용될 수 있고; 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기가 변화될 수 있으며; 기타 생체적합성 중합체가 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈 등의 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고; 기타 당류 또는 다당류가 덱스트로스를 대신할 수 있다.

대안적으로, 소수성 약제학적 화합물에 대한 다른 전달 시스템이 이용될 수 있다. 리포솜 및 유제는 소수성 약물을 위한 전달 비히클 혹은 담체의 잘 알려진 예이다. 다이메틸설폭사이드 등의 임의의 유기 용제는 또한, 통상 보다 큰 독성을 해치더라도 이용될 수 있다. 부가적으로, 상기 화합물은 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질 등의 서방성 시스템을 이용해서 전달될 수 있다. 다양한 서방성 재료가 확립되어 있고, 당업자에 의해 잘 알려져 있다. 서방성 캡슐은 그들의 화학적 성질에 따라 수주일 내지 100일 이상까지 화합물을 방출할 수 있다. 치료 시약의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 부가적인 전략이 이용될 수 있다.

세포내 투여를 의도한 약제는 당업자에게 잘 알려진 수법을 이용해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 약제는 리포솜 속에 캡슐화될 수 있다. 리포솜 형성시 수용액 중에 존재하는 분자는 모두 수성 내부 속으로 편입된다. 리포솜 내용물은, 외부 마이크로 환경으로부터 보호되고, 또한, 리포솜이 세포막과 함께 융해되기 때문에, 세포질 내로 효과적으로 전달된다. 리포솜은 조직 특이적 항체로 코팅될 수 있다. 상기 리포솜은 소망의 기관에 의해 선택적으로 표적화되어 취해질 것이다. 대안적으로, 작은 소수성 유기분자는 직접 세포내 투여될 수 있다.

부가적인 치료제 혹은 진단제는 약제학적 조성물 속으로 편입될 수 있다. 대안적으로 혹은 부가적으로, 약제학적 조성물은 기타 치료제 혹은 진단제를 함유하는 기타 조성물과 배합될 수 있다.

투여 방법

상기 화합물 또는 약제학적 조성물은 임의의 적절한 수법에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 투여 방법의 비제한적인 예로는 특히 본 발명의 화합물을 살아있는 조직과 접촉시키기 위해 당업자에게 적절한 것으로 간주되고 있는 바와 같은, (a) 캡슐, 정제, 과립, 분무액, 시럽 또는 기타 형태로 투여되는 것을 포함하는 경구 경로를 통한 투여; (b) 수성 현탁제, 유성 제제 등으로서 혹은 점적제, 분무액, 좌제, 고약, 연고 등으로서의 투여를 포함하는 직장, 질, 요도내, 안구내, 비강내 또는 이강내 등의 비경구 경로를 통한 투여; (c) 주입 펌프 전달을 포함하는 주사, 피하, 복막내, 정맥내, 근육내, 진피내, 안와내, 낭내(intracapsularly), 척수강내, 흉골내 등을 통한 투여; (d) 신장 혹은 심장 부분에서 직접 주입에 의해, 예를 들어 데포 삽입에 의한 것과 같은 국부적 투여; 및 (e) 국소 투여를 들 수 있다.

투여에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 그의 의도된 목적을 달성하기 위해서 유효량으로 함유되어 있는 조성물을 포함한다. 단일 용량으로서 요구되는 본 명세서에 개시된 화합물의 치료상 유효량은 투여 경로, 치료 중인 인간을 포함하는 동물의 종류 및 고려 중인 특정 동물의 신체적 특성에 따라 좌우될 것이다. 상기 용량은 원하는 효과를 달성하기 위해 조절될 수 있지만, 체중, 식이, 동반 약물 및 의약 분야의 당업자가 인식하는 기타 인자 등의 이러한 인자에 의존할 것이다. 더욱 구체적으로는, 치료상 유효량이란 치료 대상의 생존을 연장시키거나 질환의 증상을 예방, 경감 혹은 개선하는 데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료상 유효량의 결정은 특히 본 명세서에서 제공된 상세한 설명을 감안해서 당업자의 능력의 범위 내이면 충분하다.

당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 생체내 유용한 투여 용량 및 투여의 특정 형태는 연령, 체중 및 치료되는 포유동물종, 특히 이용되는 화합물 및 이들 화합물이 이용되는 특정 용도에 따라 변할 것이다. 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 용량 레벨인 유효 용량 레벨의 결정은 통상의 약리적 방법을 이용하는 당업자에 의해 성취될 수 있다. 전형적으로, 제품의 인간 임상 적용은 원하는 효과가 달성될 때까지 용량 레벨을 증가시키면서, 더욱 낮은 용량 레벨에서 시작된다. 대안적으로, 허용가능한 시험관내 연구는 확립된 약리적 방법을 이용하는 본 발명에 의해 동정된 조성물의 투여 경로 및 유용한 용량을 확립하는 데 이용될 수 있다.

인간 이외의 동물 연구에서, 잠재적인 제품의 적용은 원하는 효과가 더 이상 얻어지지 않거나 부작용이 없어질 때까지 용량을 감소시키면서, 더욱 높은 용량 레벨에서 시작된다. 용량은 원하는 영향 및 치료상 징후에 따라 광범위한 범위일 수 있다. 전형적으로, 용량은 약 10 ㎎/㎏(체중) 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 약 100 ㎎/㎏(체중) 내지 10 ㎎/㎏(체중)일 수 있다. 대안적으로 용량은 당업자가 이해하고 있는 바와 같이 환자의 표면 영역을 기준으로 해서 산출될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 대한 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 감안해서 개별의 환자에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fingl et al. 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics"], 특히 제 1페이지 제 1장 참조; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다). 전형적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 용량 범위는 약 0.5 내지 1000 ㎎/㎏(환자의 체중)일 수 있다. 이 용량은 환자의 필요에 따라 1일 이상의 과정에서 단 1회 혹은 일련의 2회 이상으로 부여될 수 있다. 화합물에 대한 인간의 용량이 적어도 소정의 조건에 대해서 확립되어 있는 경우, 본 발명은 확립된 인간 용량과 동일한 용량, 또는 그 확립된 용량의 약 0.1% 내지 500%, 더욱 바람직하게는 약 25% 내지 250%인 용량을 사용할 것이다. 새롭게 발견된 약제학적 화합물의 경우에서처럼 인간 용량이 확립되어 있지 않을 경우, 적절한 인간 용량은 ED₅₀ 또는 ID₅₀ 값으로 추정될 수 있거나, 또는 동물에서의 독성 연구 및 효능 연구에 의해 정량된 바와 같이 시험관내 또는 생체내로부터 유래된 기타 적절한 값으로 추정될 수 있다.

단, 담당의사는 독성 또는 기관 이상으로 인해 투여를 어떻게 그리고 언제 종료하거나 중지하거나 또는 조절할지 알 수 있을 것이다. 역으로, 담당 의사는 임상 반응이 (독성을 차단하는 데) 적절하지 않다면 높은 레벨까지 치료를 조정하는 것도 알 수 있을 것이다. 관심 대상 질환의 관리에 있어서 투여 용량의 규모는 치료할 건강 상태의 중증도 및 투여 경로에 따라 변할 것이다. 건강상태의 중증도는 예를 들어 표준 예후 평가 방법에 의해 부분적으로 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 투약 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 상기 개시된 것에 견줄만한 프로그램은 수의학에서 이용될 수 있다.

정확한 용량은 대부분의 경우 약마다 결정될 것이지만, 용량에 관한 일부의 일반론이 작성될 수 있다. 성인 인간 환자에 대한 일일 용량 요법은 예를 들어 각 활성 성분의 0.1 ㎎ 내지 2000 ㎎, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 예를 들어 5 ㎎ 내지 200 ㎎의 경구 용량일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 각 활성 성분의 정맥내, 피하 혹은 근육내 용량은 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 60 ㎎, 예를 들어 1 내지 40 ㎎ 사용된다. 약제학적 허용염의 투여의 경우, 용량은 유리염으로서 산출될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 1일당 1 내지 4회 투여된다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 연속적인 정맥내 주입에 의해, 바람직하게는 각 활성 성분의 용량으로 1000 ㎎/day까지 투여될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 어떤 상황에서는, 본 명세서에 개시된 화합물을, 특히 공격적인 질환 또는 감염증을 효과적이고 공격적으로 치료하기 위해 전술한 바람직한 용량 범위를 초과하거나, 또는 훨씬 초과하는 양으로 투여할 필요가 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 화합물은 연속 치료 기간, 예를 들어 1주 이상 혹은 수개월 내지 수년 동안 투여될 것이다.

투약량 및 간격은 조절 효과를 유지하는 데 충분한 활성 성분의 혈장 레벨 또는 MEC(minimal effective concentration; 최소 유효 농도)를 제공하도록 개별적으로 조절될 수 있다. MEC는 각 화합물에 대해서 다양할 것이지만, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 얻는 데 필요한 용량은 개별의 특징 및 투여 경로에 의존할 것이다. 그러나, HPLC 에세이나 바이오에세이는 혈장 농도를 결정하는 데 이용될 수 있다.

투약 간격은 또한 MEC 값을 이용해서 결정될 수 있다. 상기 조성물은 시간의 10 내지 90%, 바람직하게는 30 내지 90%, 가장 바람직하게는 50 내지 90%에 대해 혈장 레벨을 MEC 이상으로 유지하는 요법을 이용해서 투여될 필요가 있다.

국소 투여나 선택적 섭취의 경우, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있다.

투여된 조성물의 양은 물론 치료 대상, 대상의 체중, 병의 중증도, 투여 방법 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다.

본 명세서에 개시된 화합물은 공지된 방법을 이용해서 효능 및 독성이 평가될 수 있다. 예를 들어, 소정의 화학적 성분을 공유하는 특정 화합물 혹은 그 화합물의 하위세트(subset)의 독성학은 포유 동물과 같은 세포주, 바람직하게는 인간 세포주를 향한 시험관내 독성을 결정함으로써 확립될 수 있다. 이러한 연구 결과는 종종 포유 동물, 특히 인간에서의 독성의 전조가 된다. 대안적으로, 마우스, 래트, 토끼 혹은 원숭이 등의 동물 모델에서의 특정 화합물의 독성은 공지된 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 특정 화합물의 효능은 시험관내 방법, 동물 모델 혹은 인간 임상시험 등의 수개의 인정된 방법을 이용해서 확립될 수 있다. 암, 심혈관계 질환 또는 각종 면역기능이상을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 질환 상태의 거의 모든 등급마다 시험관내 모델에서 인정된 것이 존재한다. 마찬가지로, 허용가능한 동물 모델은 이러한 질환 상태를 치료하기 위한 약품의 효능을 확립하는 데 이용될 수 있다. 효능을 결정하기 위한 모델을 선택할 경우, 당업자는 적절한 모델, 용량, 투여 경로 및 요법을 선정하는 당업계의 조건에 의해 안내받을 수 있다. 물론, 인간 임상 시험도 인간에서의 화합물의 효능을 결정하는 데 이용될 수 있다.

상기 조성물은 필요한 경우 상기 활성 성분을 함유하는 1개 이상의 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 혹은 디스펜서(dispenser) 기구 속에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 블리스터 팩(blister pack)과 같이 금속 혹은 플라스틱 호일로 이루어질 수 있다. 상기 팩 혹은 디스펜서 기구는 투약 설명서를 수반할 수 있다. 상기 팩 혹은 디스펜서 기구는 또한 제조사, 용도 또는 약제학적 판매를 규정한 정부 기관에 의해 규정된 형식으로 용기와 관련된 지침서를 수반할 수도 있고, 이러한 지침은 인간 또는 가축 투여용 약물 형태를 상기 기관에서 승인받은 것을 반영하고 있다. 이러한 지침서는 예를 들어 처방 약물 혹은 승인된 약물 삽입물에 대해서 미국 식약청에서 승인된 라벨일 수 있다. 상용성 약제학적 담체에 배합된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 제조되어 적절한 용기 속에 놓이고, 표시된 조건의 처치를 위한 라벨이 부착될 수 있다.

도 1은 인간의 적혈구-유래 2OS 프로테아좀에 있어서의 NPI-0052에 의한 키모트립신-유사, 카스파제-유사 및 트립신-유사 프로테아좀 활성의 억제를 나타낸 도면;

도 2는 마우스들에 있어서의 NPI-0052의 생체내 키모트립신-유사 활성을 나타낸 도면;

도 3은 MM.1S 다발성 골수종(MM) 세포를 NPI-0052(7 nM)로 처리한 후, 단백질 추출물을 AdaY(¹²⁵I)Ahx₃L₃VS와 함께 37℃에서 배양한 후에 얻어진 방사선 사진을 나타낸 도면;

도 4는 MM.1S 세포를 NPI-0052로 처리한 후 단실-Ahx₃L₃VS에서 배양한 후에 얻어진 면역블롯(immunoblot)을 나타낸 도면;

도 5a는 표시된 용량의 NPI-0052로 24시간 처리한 후의 다양한 다발성 골수종 세포주의 세포 생존율을 나타낸 도면;

도 5b는 환자들로부터 획득한 MM 세포를 NPI-0052로 처리한 후의 세포자멸사의 DNA 분절 에세이를 나타낸 도면;

도 6은 환자들로부터 획득한 골수 간질 세포를 NPI-0052로 처리한 후의 세포 자멸사의 DNA 분절 에세이를 나타낸 도면;

도 7은 IL-6 또는 IGF-I의 존재 유무에 있어서 NPI-0052 또는 Dex로 처리한 후의 MM.1S 세포 생존성의 MTT 에세이를 나타낸 도면;

도 8은 MM.1S 세포의 VEGF-유발 이동에 대한 NPI-0052의 효과를 나타낸 도면;

도 9는 Bcl2-과발현 MM.1S 세포 생존성에 대한 NPI-0052의 효과를 나타낸 도면;

도 10a 및 도 10b는 마우스들에게 경구 투여한 경우 종양 성장에 대한 NPI-0052의 효과를 나타낸 도면;

도 10c는 마우스들에게 경구 투여한 경우 NPI-0052의 생존 효과를 나타낸 도면;

도 10d는 마우스들에게 경구 투여한 경우 NPI-0052의 체중 효과를 나타낸 도면;

도 10e는 NPI-0052-처리된 마우스들 및 대조군-처리된 마우스들로부터의 접종 부위의 조직 단면을 나타낸 도면;

도 10f는 마우스들에게 정맥내 투여한 경우 NPI-0052 및 보르테조미브의 종양 성장 효과를 비교한 도면;

도 10g는 마우스들에게 경구 투여한 경우 NPI-0052 및 보르테조미브의 생존 효과를 비교한 도면;

도 11a는 CMXRos로 배양한 MM.1S 세포에서의 NPI-0052의 미토콘드리아 막전 위 효과를 나타낸 도면;

도 11b는 막침투성 염료 다이하이드로에티듐(HE)으로 염색한 MM.1S 세포에서의 NPI-0052의 과산화물 생성 효과를 나타낸 도면;

도 11c는 NPI-0052로 처리한 MM.1S 세포로부터 획득한 미토콘드리아 및 세포질 단백질 단편의 면역블롯을 나타낸 도면;

도 11d는 NPI-0052로 처리하고 항-카스파제-9 Abs로 분석한 MM.1S 세포로부터 획득한 세포질 단백질의 면역블롯을 나타낸 도면;

도 11e는 NPI-0052로 처리하고 항-카스파제-8 Abs로 분석한 MM.1S 세포로부터 획득한 세포질 단백질의 면역블롯을 나타낸 도면;

도11f는 NPI-0052로 처리하고 PARP 및 카스파제-3 분할(cleavage) 에세이 양쪽 모두에 의한 세포자멸사를 평가한 MM.1S 또는 MM.1R MM 세포의 면역블롯을 나타낸 도면;

도 12a는 카스파제-3, 카스파제-8 또는 카스파제-9 억제제의 존재 유무에 있어서 NPI-0052 또는 보르테조미브에 의한 처리 후의 MM.1S 세포 생존성을 나타낸 도면;

도 12b는 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리한 후 벡터 단독, DN-카스파제-8 및 DN-카스파제-9로 핵산전달감염된(transfected) 세포의 MM.1S 세포 생존성을 나타낸 도면;

도 12c는 덱사메타손 또는 항-Fas MoAb로 처리한 DN-카스파제-8 및 DN-카스파제-9 핵산전달감염된 MM.1S 세포로부터의 세포질 추출물의 면역블롯을 나타낸 도 면;

도 12d는 NPI-0052 또는 보르테조미브에 의한 처리 후의 벡터 또는 DN-FADD 핵산전달감염된 세포에 대한 MM.1S 세포 생존성을 나타낸 도면;

도 12e는 표시된 농도의 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리하고 항-Bax 또는 항-Hsp60 Abs로 분석한 MM.1S MM 세포로부터의 미토콘드리아 단백질 추출물의 면역블롯을 나타낸 도면;

도 12f는 표시된 농도의 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리된 야생형 또는 누락된 Bax(녹-다운)에 의한 MEF(mouse embryonic fibroblast; 마우스 배아 섬유모세포)의 세포 생존성을 나타낸 도면;

도 13은 표시된 농도의 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리된 5개의 건강한 도너로부터의 정상 림프구의 생존성을 나타낸 도면;

도 14a는 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리된 후 벡터 단독 혹은 Bcl-2에 의해 핵산전달감염된 세포의 MM.1S 세포 생존성을 나타낸 도면;

도 14b는 NPI-0052 또는 보르테조미브로 처리된 벡터- 또는 Bcl-2-핵산전달감염된 MM.1S 세포로부터의 세포질 추출물의 면역블롯을 나타낸 도면;

도 15는 표시된 농도의 NPI-0052, 보르테조미브 또는 NPI-0052 + 보르테조미브로 처리된 MM.1S 및 MM.1R MM 세포의 세포 생존성을 나타낸 도면.

실시예 1 - 일반적 절차

세포 배양 및 시약. Dex-감수성 MM.1S 및 Dex-내성 MM.1R 인간 MM 세포주는 닥터 스티븐 로젠(Dr. Steven Rosen)(미국 일리노이주의 시카고시에 소재한 노쓰웨스턴 유니버시티)으로부터 얻었다. 이것은 문헌[Moalli, P. A., Pillay, S., Weiner, D., Leikin, R. & Rosen, S. T. (1992) Blood 79, 213-22 및 Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94]을 참조하고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. RPMI-8226 및 독소루비신(Dox)-내성(Dox-40) 세포는 닥터 윌리암 달톤(Dr. William Dalton)(미국 플로리다주의 탬파시에 소재한 모피트 암센터)으로부터 얻었다. U266 및 OPM2 MM 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)(미국 매릴랜드주의 록빌시에 소재)로부터 얻었다. 인간 종양 세포주인 DU 145, HT-29, Jurkat, LoVo, MDA-MB-231, MIA PaCa-2, NCI-H292, OVCAR-3, PANC-1 및 PC-3은 ATCC(미국 버지니아주의 머내서스시에 소재)로부터 구입하였다. MM 세포주는 10% 가열불활성화된 FBS(fetal-bovine serum; 소태아혈청), 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 보충한 RPMI-1640 배지에서 증식시켰다. MM 세포는 덱사메타손(Dex), 멜팔란, 탈리도마이드 또는 보르테조미브를 포함하는 이전의 다수 요법 시행 후 재발한 환자로부터 새롭게 단리하였다. MM 세포는 CD 138(Syndecan-1) 마이크로비드 및 오토 MACS 마그네틱 셀 소터(magnetic cell sorter)(미국 캘리포니아주의 어번시에 소재한 밀테니이 바이오테크사 제품)를 이용해서 CD 138 양성 선택법에 의해 환자의 골수 샘플로부터 정제하였다. 이것에 대해서는 문헌[Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94]을 참조할 수 있고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 정상의 인간 피부 섬유모세포인 CCD-27sk는 ATCC로부터 얻어, 10% 가열불활성화된 FBS, 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 4 mM L-글루타민 및 1 mM 피루브산 나트륨을 보충한 DMEM에서 증식시켰다. 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(미국 캘리포니아주의 샌 디에이고시에 소재한 네레우스 제약사 제품), 보르테조미브 또는 Dex(미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재한 시그마화학사 제품)의 다양한 농도로 처리하였다.

세포 생존율 및 세포자멸사 에세이. 세포 생존율은 문헌[Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94]에 기재된 바와 같이, 그리고 제조사의 지시(미국 인디애나주의 인디아나폴리스에 소재한 로체 어플라이드 사이언스사)에 따라 3-(4,5-다이메틸티오졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; 미국 캘리포니아주의 테메쿨라시에 소재한 케미콘 인터내셔널사 제품) 에세이에 의해 평가하였고; 상기 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. ELISA법(Cell Death Detection ELISAplus)을 이용해서 제조사의 지시(미국 인디애나주의 인디아나폴리스에 소재한 로체 어플라이드 사이언스사)에 따라 세포 사멸을 정량화하였다.

실시예 2 - 시험관내 2 OS 프로테아좀 활성 에세이

2OS 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성은 문헌[Stein, R. L., Melandri, F. & Dick, L. (1996) Biochemistry 35, 3899-908 및 Lightcap, E. S., McCormack, T. A., Pien, C. S., Chau, V., Adams, J. & Elliott, P. J. (2000) Clin Chem 46, 673-83]에 기재된 바와 같이 측정하였고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 정제된 인간 적혈구-유래 2OS 프로테아좀은 미국 필라델피아주의 플라이마우스 미팅시에 소재한 바이오몰사로부터 얻었다. 2OS 프로테아좀의 키모트립신-유사, 카스파제-유사 활성 및 트립신-유사 활성은 각각 펩타이드 기질로서 Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC(미국 매사추세츠주의 캠브리지시에 소재한 보스톤 바이오켐사 제품) 및 Boc-LRR-AMC(미국 필라델피아시의 킹 오브 프러시아시에 소재한 바켐 바이오사이언스사(Bachem Bioscience) 제품)를 이용해서 결정하였다. 분할된 펩타이드 기질의 형광발광은 플루오로스칸 어센트 96-웰 마이크로플레이트 리더(Fluoroskan Ascent 96-well microplate reader)(미국 매사추세츠주의 월섬에 소재한 써모 일렉트론사 제품)를 이용해서 측정하였다. EC₅₀ 값은 S자형 용량-반응(sigmoidal dose-response), 가변성 슬로프 모델을 이용해서 프리즘(그래프패드 소프트웨어사(GraphPad Software) 제품)에 의해 산출되었다. EC₅₀ 값은 최대 상대 형광의 50%가 억제된 약물 농도로서 규정된다. 도 1에 표시된 결과는 화학식 (II)(X=Cl)의 화합물이 상이한 농도임에도 불구하고 3개의 프로테아좀 활성을 모두 억제하는 것을 나타내었다.

실시예 3 - 마우스들에서의 전체 혈구 내의 생체외 2 OS 프로테아좀 활성의 분석(단일 정맥내 투여 또는 경구 투여)

상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 생체내 프로테아좀 활성을 억제하는 지의 여부를 직접 결정하기 위해서, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 100% DMSO에 용해되고, 연속적으로 5% 솔루톨(Solutol® HS 15; 폴리에틸렌 글리콜 660 12-하이드록시스테아레이트; 미국 루이지애나주의 시리브포트시에 소재한 바스프사 제품)로 희석해서 2% DMSO의 최종 농도를 수득하였다. 비히클 대조군은 2% DMSO 및 98% 솔루톨(5% Solutol® HS 15)로 구성되었다. 수컷 스위스-웹스터 마우스들(1군당 5마리, 체중 20 내지 25 그램)은 볼더 바이오패스(주)(미국 콜로라도주의 볼더시에 소재)에서 각종 농도의 상기 화합물을 10 ㎖/㎏의 체적으로 정맥내 혹은 경구 방식으로 처리하였다. 1군의 동물들은 처리하지 않고 프로테아좀 활성의 기준선을 확립하였다. 상기 화합물의 투여 후 90분째에, 상기 동물들을 마취시켜, 심장천공에 의해 혈액을 회수하였다. 굳은 전체 혈구를 원심분리에 의해 모아서, PBS로 세척하고, 생체외 프로테아좀 활성을 결정하기 위해 드라이아이스 상에서 동결시켰다. 백혈구(WBC) 용해물 중의 2OS 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성은 펩타이드 기질인 suc-LLVY-AMC를 이용해서 결정하였다. RFU(Relative Fluoresence Units)는 상기 세포 용해물의 단백질 농도를 이용해서 정규화하였다. 개별의 마우스들의 2OS 프로테아좀 활성은 평균 활성을 나타내는 수평 바(bar)로 도 2에 표시되어 있다. 기준선은 미처리 마우스들로부터 제조된 WBC 용해물에서 관찰된 2OS 프로테아좀 활성을 나타낸다. 도 2에 표시된 결과는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 백혈구 중의 2OS 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성을 용량 의존적 방법으로 억제하는 것을 나타낸다. 중요하게는, 이들 실험 결과는 상기 화합물이 경구 활성적이고 생체내 프로테아좀 활성을 억제하는 것을 입증하고 있다.

실시예 4 - MM 세포( 생체내 )에서의 프로테아좀 활성의 유발된 변화의 판정

화학식 (II)(X=Cl)의 화합물이 다발성 골수종 세포의 시험관내 프로테아좀 활성에 영향을 미치는지의 여부의 판정은 AdaY¹²⁵Iahx₃L₃VS에 의한 경쟁 실험을 이용해서 행하였다. 이 에세이에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의해 표적화되지 않은 부위는 AdaY(¹²⁵I)Ahx₃L₃VS에 의해 표지화되고, 자동방사선 사진에 의해 가시화되는 한편, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의해 표적화되지 않은 부위는 자동방사선 사진에서 볼 수 없었다. MM.1S MM 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)로 30분, 1시간, 3시간 또는 6시간 배양하고, 세포 용해는 유리 비드에 의해 수행되었다. 단백질 추출물 60 ㎍을 요드화 프로테아좀 억제제 AdaY¹²⁵Iahx₃L₃VS로 37℃에서 2시간 배양하였다. 다음에, 단백질은 샘플 완충제의 저감시 비등에 의해 변성되어, 12.5% SDS-PAGE 겔 상에 분리되고, 자동방사선 사진 촬영을 실시하였다. 도 3에 있어서 알 수 있는 바와 같이, 프로테아좀의 베타-5(β-5) 아단위는 대조군 세포보다 처리된 세포에 있어서 AdaY(¹²⁵I)Ahx₃L₃VS에 의한 표지화가 훨씬 적었다. 상기 β-5 아단위가 키모트립신-유사 활성을 매개하는 것 으로 부여되면, 이들 결과는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 상기 β-5 아단위에 결합됨으로써, MM.1S 세포 내의 키모트립신-유사 활성을 억제시키는 것을 시사한다. 게다가, MM.1S 세포를 상기 화합물(7 nM)로 6시간 처리하면, β-2 아단위(트립신 분해-활성) 및 β-1 아단위(카스파제-유사 활성)(데이터는 표시 생략)의 표지화가 저감되었다.

실시예 5 - MM 세포( 생체내 ) 내의 프로테아좀 활성의 유발된 변화의 판정

프로테아좀 활성의 생체내 판정은 활성 프로테아좀 아단위를 모두 공유결합적으로 개질시키는 단실(Dansyl)-AhX₃L₃VS에 의한 경쟁 실험을 이용해서 수행하였다. 이 억제제는 상기 단실 부분에 대해서 항체를 이용하여 면역블로팅함으로써 가시화될 수 있는 단실 설폰아마이드 헥사노일헵텐을 함유한다. MM.1S 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)로 30분, 1시간 또는 3시간 처리하고 나서, 5 μM 단실-Ahx₃L₃VS로 37℃에서 1시간 배양하였다. NP-40 용해 완충제(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40) 중에서 30분간 배양해서 세포를 용해시키고, 5분간 원심분리해서 막 분획, 핵 및 세포 지스러기를 제거하였다. 단백질 추출물 60 ㎍을 12.5% SDS-PAGE 겔에 의해 분리하고 나서, 다클론성 항-단실 다클론성 Ab(1:7500, 토끼, 몰리큘러 프로브스사 제품) 및 서양고추냉이 과산화효소 결합된 양 항-토끼(goat anti-rabbit) 이차 항체(써던 바이오테크사 제품)를 이용해서 면역블롯 분석을 행하였다. 블롯은 증강된 화학발광(웨스턴 라이트닝, 퍼킨 엘머사)에 의해 전개되었다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, MM.1S 세포를 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)로 처리하면, β-5 아단위의 단실Ahx₃L₃VS-표지화를 감소시킨다. 또한, 상기 화합물은 고농도, 즉 각각 1 nM 및 20 nM임에도 불구하고 β-1 및 β-2 아단위의 단실Ahx₃L₃VS-표지화도 감소시켰다. 이에 대해서, MM.1S 세포를 보르테조미브의 훨씬 고농도로 처리한 바 β-2 아단위를 억제하지 못했다(데이터는 표시 생략). 이들을 요약하면, 이들 실험결과는 MM 세포 중의 3개의 프로테아좀 활성 모드를 억제하는 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 능력을 입증하였다.

실시예 6 - MM 세포 생존율에 대한 효과

세포 생존율은 문헌[Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94]에 기재된 바와 같이, 그리고 제조사의 지시(미국 인디애나주의 인디아나폴리스에 소재한 로체 몰리큘러 바이오케미컬사)에 따라 3-(4,5-다이메틸티오졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; 미국 캘리포니아주의 테메쿨라시에 소재한 케미콘 인터내셔널사 제품) 에세이에 의해 평가하였고; 상기 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. MM.1S(-■-), Dex-내성 MM.1R(-□-), RPMI-8226(-●-), 독소루비신-내성 Dox-40(-◆-), OPM2(-○-) 및 U266(-◇-) 세포를 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)로 24시간 처리한 후의 세포 생존율은 도 5a에 나타나 있다. 결과는 3개의 독립된 실험으로부터의 평균±표준편차이다(P < 0.005; 모든 세포주에 대해서 n = 3). 모든 세포주에서의 세포 생존율의 용량-의존성의 유의한 감소가 관찰되었다(IC₅₀ 범위 7 내지 24 nM).

세포 생존율은 정제된 환자 MM 세포에 대해서도 평가되었다. Dex, 보르테조미브 및 탈리도마이드를 포함하는 다수의 이전의 치료 후 재발한 9명의 MM 환자로부터 새로이 단리한 종양 세포를 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(10 nM)로 24시간 처리하고, 세포자멸사에 대해 분석하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, DNA 분절 에세이(P < 0.005; n=2)에 의해 측정된 바와 같이 이들 세포에 있어서 유의한 세포자멸사가 관찰되었다. 플롯한 값들은 3개의 샘플의 평균±표준편차이다. 중요하게는, 조사된 9명의 환자중 4명이 보르테조미브 요법에 대해 난치성이었고, 5명의 환자는 탈리도마이드 및 Dex 요법에 대해 내성이 있었다. 이들 데이터는 1) 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 종래 및 보르테조미브 요법에 대해 감수성이 있고 내성이 있는 MM 세포에 있어서의 세포자멸사를 유발시키고; 2) MM 세포에 대한 상기 화합물의 IC₅₀이 나노몰 농도 내인 것을 시사한다.

실시예 7 - 골수 간질 세포( BMSCs ) 생존율에 대한 효과

MM 세포는 골수 마이크로환경에서 주로 편재하고, BMSCs와의 그들의 상호작용은 MM 세포의 성장을 매개하고 또한 약물-유발 세포자멸사에 대항해서 보호하는 사이토카인의 생성을 유발시킨다. 이것에 대해서는 문헌[Anderson, K. C. (2003) Cancer 97, 796-801]을 참조할 수 있고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 따라서, 5명의 환자의 MM-유발 BMSCs에 대한 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 효과가 결정되었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, BMSCs(환자수 1 내지 5 명)를 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(20 nM)로 24시간 처리한 것은 DNA 분절 에세이에 의해 입증된 바와 같이 이들 세포에 있어서 세포자멸사를 초래하지 않았다. 제시된 양성 대조군은 에세이를 위한 내부 대조군이다. 5명의 MM 환자 중 2명으로부터의 정제된 MM 세포(CD 138+)도 동일한 실험으로 조사하였다. 결과는 3개의 샘플로부터의 평균±표준편차이다. 상기 화합물은 정제된 (CD138-양성) 환자 MM 세포의 세포자멸사의 유의한 증가(10 내지 12배)를 유발시켰다. 이들 결과는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 BMSCs가 아니라 MM 세포에 직접 작용하는 것을 시사한다.

실시예 8 - 재조합 인간 인터루킨-6( rhIL -6) 및 재조합 인간 인슐린-유사 성장인자-I( rhIGF -I) 항- 세포자멸사의 효과

MM 세포의 BMSCs에의 부착은 BMSCs로부터 IL-6 및 IGF-I 분비를 유발시켜, MM 세포의 성장을 조절할 뿐만 아니라, 화학요법에 대해 보호를 행한다. 이것은 문헌[Hardin, J., MacLeod, S., Grigorieva, I., Chang, R., Barlogie, B., Xiao, H. & Epstein, J. (1994) Blood 84, 3063-70 및 Chauhan, D., Kharbanda, S., Ogata, A., Urashima, M., Teoh, G., Robertson, M., Kufe, D. W. & Anderson, K. C. (1997) Blood 89, 227-234]을 참조할 수 있고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 따라서, rhIL-6 또는 rhIGF-I가 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의해 유발된 MM 세포의 세포자멸사를 억제하는지의 여부를 평가하였다. MM.1S 세포는 rhEL-6(10 ng/㎖) 또는 rhIGF(50 ng/㎖)의 존재 유무에 있어서 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM) 또는 Dex(0.5 μM)로 24시간 처리하 였다. 24시간 후에 세포를 수확하고, MTT 에세이에 의해 생존율을 분석하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 그 중간(median) 세포 생존율은 상기 화합물 단독으로 처리한 후 47 ± 2.3%였고; 상기 화합물 + rhIL-6(P = 0.26, 윌콕손 시험(Wilcoxon test))의 경우 51.2 ± 3.2%; 상기 화합물 + rhIGF-I(P = 0.28)의 경우 50.3% ± 2.0%였다. 중간 생존율은 Dex로 처리한 후 51 ± 2.1%였고, Dex + rhIL-6(P = 0.05, 편면 윌곡손 랭크-합 시험(one-sided Wilcoxon rank-sum test)에 의해 결정됨)에 대해서는 92 ± 5.5%였다. 결과는 3개의 독립된 실험의 평균±표준편차이다. 이들 시험 결과는 IL-6이나 IGF-I의 어느 것도 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 항-MM 활성을 차단하지 않는 것을 시사한다. 이에 대해서 그리고 다른 연구에서처럼, IL-6 및 IGF-I는 양쪽 모두 Dex-유발 MM.1S 세포 생존율의 감소를 차단한다. 이것은 문헌[Chauhan, D., Hideshima, T. & Anderson, K. C. (2003) Int J Hematol 78, 114-20 및 Mitsiades, C. S., Mitsiades, N., Poulaki, V., Schlossman, R., Akiyama, M., Chauhan, D., Hideshima, T., Treon, S. P., Munshi, N. C, Richardson, P. G. & Anderson, K. C. (2002) Oncogene 21, 5673-83]을 참조할 수 있고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 이와 같이 해서, 상기 데이터는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 MM 세포에 대한 IL-6 및 IGF-I의 성장 및 보호 효과를 극복하고, MM 세포에 대한 상기 화합물 및 Dex의 현저한 작용 기전을 나타내는 것을 시사한다. IL-6의 높은 혈청레벨이 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 능력과 결합해서 임상적 항암제 내성 및 치료 실패에 기여하여 IL-6 또는 IGF-I의 존재시에도 MM 세포의 세포자멸사를 초래 한다는 보고는, 상기 화합물이 MM이 진행된 환자에서의 약물 내성을 극복할 수 있는 것을 시사한다. 이것은 문헌[Kyrstsonis, M. C, Dedoussis, G., Baxevanis, C, Stamatelou, M. & Maniatis, A. (1996) Br J Haematol 92, 420-422]을 참조할 수 있고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다.

실시예 9 - MM 세포의 혈관내피성장인자( VEGF ) 유발 이동에 대한 효과

VEGF는 골수 마이크로환경에서 상승하여, MM 세포에서의 이동, 증식 및 혈관신생을 유발시킨다. 이것은 문헌[Podar, K., Tai, Y. T., Lin, B. K., Narsimhan, R. P., Sattler, M., Kijima, T., Salgia, R., Gupta, D., Chauhan, D. & Anderson, K. C. (2002) J Biol Chem 277, 7875-81]을 참조할 수 있고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 이와 같이 해서, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 MM 세포의 VEGF-유발 이동을 변경시키는지의 여부를 평가하였다. VEGF 유발 이동은 상기 화합물(7 또는 10 nM)의 존재유무로 조사하였다. 세포 이동은 문헌[Podar, K., Tai, Y. T., Davies, F. E., Lentzsch, S., Sattler, M., Hideshima, T., Lin, B. K., Gupta, D., Shima, Y., Chauhan, D., Mitsiades, C, Raje, N., Richardson, P. & Anderson, K. C. (2001) Blood 98, 428-35]에 이미 설명되어 있는 바와 같이 평가하였고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 MM.1S MM 세포의 VEGF-유발 이동을 유의하게 감소시킨다(P < 0.05). 이들 실험결과는 상기 화합물이 MM 세포의 골수로의 진입 및 주변 혈액 속으로의 그들의 배출의 양쪽 모두를 음성적으로 조율할 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 10 - Bcl2 -매개 보호 작용에 대한 효과

Bcl2는 MM을 포함하는 암 세포에서의 종래의 요법에 대한 내성을 부여한다. 이것은 문헌[Cory, S. & Adams, J. M. (2002) Nat Rev Cancer 2, 647-56 및 Gazitt, Y., Fey, V., Thomas, C. & Alvarez, R. (1998) Int J Oncol 13, 397-405]을 참조할 수 있고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. Bcl2는 보르테조미브-유발 세포자멸사를 적당히 약화시킬 수 있다. 따라서, MM.1S 세포에서의 Bcl2의 전위 발현(ectopic expression)이 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 대한 반응성에 영향을 미치는지의 여부를 평가하였다. MM.1S 세포는 Bcl2 구조체에 의해 안정적으로 핵산전달감염시키고, MTT 에세이를 이용해서 세포 생존성의 변화를 분석하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 용량-의존 방식으로 Bcl2-핵산전달감염된 MM.1S 세포(P < 0.005)의 세포생존성을 유의하게 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, 상기 화합물은 빈 벡터-핵산전달감염된 MM.1S 세포에 비해서 Bcl2-핵산전달감염된 세포에서의 세포 사멸을 15 + 1.1 % 적게 유발시켰다. 결과는 3개의 독립된 실험의 평균±표준편차이다. 이들 실험결과는 상기 화합물이 Bcl2-매개 보호를 극복할 수 있는 것을 시사한다.

실시예 11 - 쥣과 종양 모델에서의 생체내 평가

6주령의 3배 면역 결핍 BNX(beige-nude-xid) 마우스들은 프레더릭 암 연구개발센터(미국 매릴랜드주의 프레더릭시 소재)로부터 얻었다. 모든 동물 연구는 다나-파버 캔서 인스티튜트의 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 마우스들은 중독의 증후에 대해 매일 관찰되었다. 배뇨말기 채혈은 아이 소플루오란 흡입을 이용한 마취하에 수행하고, 동물들은 CO₂ 질식사에 의해 희생시켰다. 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 생체내 항-MM 활성을 결정하기 위해서, 21 BNX 마우스들의 옆구리에 RPMI-1640 배지 100 ㎕ 중에서 3×10⁷ RPMI 8226 MM 세포로 피하접종하였다. 종양이 측정가능하게 된 경우, 마우스들은 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 0.25 ㎎/㎏ (n = 7), 0.5 ㎎/㎏ (n = 7)을 공급한 처리군과, 비히클만 단독으로 공급한 대조군(n = 7)으로 나누었다. 약물 치료는 측정가능한 종양의 발달 후에 개시하였다. 약물(0.25 ㎎/㎏ 또는 0.5 ㎎/㎏)은 1주에 2회 경구 투여하였다. 수직 직경의 시리얼 캘리퍼 측정은 하루 걸러 수행하여, 이하의 식: 4/24 × (가장 짧은 직경)2 × (가장 긴 직경)을 이용해서 종양 체적을 산출하였다. 동물들은 종양이 2 ㎝ 이상이거나 또는 괴사한 경우 희생시켰다. 종양 성장 연구를 위해서, 각 군에 대해서 7마리의 마우스들을 사용하였다.

도 10a 내지 도 10c에 나타낸 바와 같이, 종양을 가진 마우스들을 비히클 단독이 아니라 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)로 처리한 것은 MM 종양성장을 유의하게 억제하고, 이들 마우스들의 생존율을 연장시켰다. 대조군에서의 마우스들은 모두 진행성 종양을 발달시키는 반면, 종양의 완전한 퇴화가 상기 처리된 마우스들의 70%에서 관찰되었다. 도 10b의 상부 구역상의 마우스는 비히클만을 단독으로 경구 용량 공급한 반면, 하부 구역 상의 마우스는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(0.25 ㎎/㎏)을 공급하였다. 도 10b에서의 왼쪽 구역은 마우스들의 오른쪽 옆구리 상에서 성장하는 피하 형질세포종의 확대를 나타낸다. 생존율은 사멸할 때까지 처리 첫째날부터 평가하고; 마우스들은 그들의 종양 직경이 2 ㎝에 도달하거나 빈사상태로 된 경우 희생시켰다(도 10c). 또한, 신경학적 해동 변화는 처리 12주 후에도 관찰되지 않았다. 상기 화합물의 투여농도는 체중 감소의 증거 없이 마우스들에 의해 잘 적합화되었다. 처리군 및 미처리군의 양쪽 모두의 마우스들은 매주 체중을 달았다. 마우스들의 체중의 평균 변화는 도 10d에 나타나 있다.

300일째의 분석 결과, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-처리된 마우스들의 57%에 있어서 종양의 재발은 보이지 않았다(도 10c). 또한, 접종 부위에 대해 행한 이력 분석은 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-처리 마우스들 대 비히클-처리 마우스들에서 혈장 세포의 소멸이 확인되었다(도 10e, 각각 왼쪽 구역 및 오른쪽 구역). 이들 데이터는 상기 화합물이 경구 활성이고; 생체내 MM 종양 성장을 억제하여; 생존율을 연장시키는 것을 나타낸다.

실시예 12 - 생체내 항종양 활성의 비교 분석

상기 화학식 (II)의 화합물 및 보르테조미브의 생체내 활성을 비교하기 위해서, 전술한 바와 같은 마우스 모델들은 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(0.15 ㎎/㎏ 정맥내 투여) 또는 보르테조미브(1.0 ㎎/㎏ 정맥내 투여)로 주당 2회씩 처리하였다. 두 약제 모두 종양 진행(p < 0.01)을 유의하게 감소시켰고, 생존율(p = 0.0137)을 연장시켰다(도 10f 및 도 10g).

실시예 13 - 항- MM 활성 매개 기전

미토콘드리아는 스트레스 동안 세포자멸사 유발에 중요한 역할을 한다. 이점은 문헌[Bossy-Wetzel, E. & Green, D. R. (1999) Mutat Res 434, 243-51 및 Chauhan, D. & Anderson, K. C. (2003) Atopopsis 8, 337-43]을 참조하면 되고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 혈청 고갈 MM.1S 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)로 12시간 처리하고, 나중 20분 동안 CMXRos로 배양하고; 인산염-완충 식염수(PBS) 중의 친지성 양이온 염료 CMXRos(미토트랙커 레드(Mitotracker Red))(미국 오리건주의 유진시에 소재한 몰리큘러 프로브사 제품)로 37℃에서 20분간 염색하고; 흐름세포측정에 의해 분석해서 ΔΨm(미토콘드리아 막전위)의 변화를 평가하였다. 과산화물(O₂) 생성은 막침투성 염료 다이하이드로에티듐(HE)으로 최후 15분간 세포를 염색함으로써 측정하였다. 과산화물 음이온은 HE를 형광 에티듐으로 산화시켜, 흐름세포측정에 의한 분석을 허용하였다.

도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 CMXRos 음성 세포(P < 0.005, n = 2)의 증가된 개수에 의해 입증되는 ΔΨm을 감소시켜, MM.1S 세포에서의 O₂ 생성을 유발시킨다. 결과는 두 독립된 실험의 평균±표준편차이다. ΔΨm의 변화는 미토콘드리아 단백질 사이토-c 및 Smac의 세포질로의 방출과 관련되고, 이에 따라, 카스파제 9 및 카스파제-3을 유발시켰다. 이것은 문헌[Du, C, Fang, M., Li, Y., Li, L. & Wang, X. (2000) Cell 102, 33-42 및 Liu, X., Naekyung Kim, C, Yang, J., Jemmerson, R. & Wang, X. (1996) Cell 86, 147-157]을 참조하면 되고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다.

도 11c에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의한 MM.1S 세포의 처리는 미토콘드리아 사이토-c(상부 왼쪽 구역) 및 smac(상부 오른쪽 구역)에서의 감소 및 세포질 분획(각각 중간의 좌우 구역)에서의 이들 단백질의 동시 증가를 유발시킨다. 항-Hsp60(하부 왼쪽 구역) 및 항-튜블린(하부 오른쪽 구역) Abs에 의한 면역블로팅을 재프로브함으로써, 미토콘드리아 추출물의 순도 및 동일한 단백질 장전을 확인한다. 미토콘드리아 세포자멸성 단백질인 사이토-c 및 Smac/DIABLO의 방출은 카스파제-9 및 카스파제-3의 활성화를 유발한다. MM.1S 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)을 24시간 처리해서 수확하였고; 미토콘드리아 분획과 세포질 단백질 분획은 12.5% SDS-PAGE에 의해 분리하고, 항-사이토-c(상부 구역) 또는 항-Smac(중간 구역) Abs에 의한 면역블로팅함으로써 분석하였다. 단백질의 동일 장전 및 미토콘드리아 분획의 순도의 대조군으로서, 충전제는 또한 항-튜블린(하부 오른쪽 구역) 및 항-Hsp60 Abs(하부 왼쪽 구역) 각각에 대해 재프로브되었다. 블롯은 3개의 독립된 실험을 나타낸다.

MM.1S 세포는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)로 24시간 처리하고 수확하였고; 세포질 단백질은 12.5% SDS-PAGE에 의해 분리하고, 항-카스파제-8 Abs 및 항-카스파제-9 Abs에 의해 면역불롯팅함으로써 분석하였다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)로 MM.1S 세포를 처리하면, 카스파제-9의 단백질분해로 인한 분할을 유발한다. 게다가, 상기 화합물은 또한 카스파제-8(도 11e)을 활성화시킨다. 카스파제-9(미토콘드리아-의존성) 및 카스파제-8(미토콘드리아-독립성)은 양쪽 모두 단백질분해로 분할되고 통상의 다운스트림 효과인자 인 카스파제-3을 활성화시켜, PARP 분할을 초래하는 것이 공지되어 있다. 이것은 문헌[Miller, L. K. (1999) Trends Cell Biol 9, 323-8]을 참조할 수 있고; 이 문헌은 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 이와 같이 해서, MM.1S 또는 MM.1R MM 세포는 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(7 nM)로 24시간 처리하고, PARP 및 카스파제-3 분할 에세이의 양쪽 모두에 의해 세포자멸사를 평가하였다. 총 단백질 용해물에 대해 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 이 용해물의 면역블롯 분석은 항-PARP(상부 구역) 또는 항-카스파제-3(lower panel) Abs에 의해 수행하였다. "FL"은 "전체 길이"를 나타내고, "CF"는 분할된 단편을 나타낸다. 이 데이터는 또한 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 카스파제-3 및 PARP 분할을 유발시키는 것을 나타낸다(도 11f).

면역블롯 분석은 사이토크롬-c, Smac, 카스파제-8, -9 또는 -3(미국 매사추세츠주의 비벌리시에 소재한 셀 시그널링사 제품), 튜블린(미국 미주리주의 세인트 루이스시에 소재한 시그마사 제품), PARP, Hsp60 또는 Bax(미국 캘리포니아주의 샌 디에이고시에 소재한 BD Bioscience Pharmingen)에 대해서 항체를 이용해서 수행하였다. 블롯은 증강된 화학 발광(ECL; 미국 일리노이주의 알링턴 하이츠시에 소재한 아머샴사 제품)에 의해 전개시켰다.

실시예 14 - 보르테조미브와 비교한 MM 세포 세포자멸사의 역학적 차이

MM.1S 세포는 카스파제-9 억제제(LEHD-FMK), 카스파제-8 억제제(IETD-fmk) 또는 카스파제-3 억제제(Z-Val-Ala-Asp-플루오로메틸케톤, z-VAD-fmk)의 존재 유무에 있어서 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브로 처리하였다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 카스파제-3 억제는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브-유발 세포자멸사의 양쪽 모두를 현저하게 저지하였다. 결과는 4개의 독립한 실험의 평균±표준편차이다(P < 0.004). 카스파제-8의 차단은 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(P < 0.005, n = 4)에 의해 유발된 세포 사멸의 유의한 감소를 초래하는 반면, 카스파제-9 단독의 저해는 상기 화합물에 의해 유발된 MM.1S 세포에서의 감소된 생존율을 적당하게 차단한다. 이에 대해서, MM.1S 세포에서의 생존율의 보르테조미브-유발 감소는 카스파제-8 또는 카스파제-9 억제제(P < 0.005)의 존재에서 동등하게 차단된다. 요약하면, 이들 데이터는 카스파제-8 활성 및 카스파제-9 활성이 보르테조미브-유발 세포 사멸 동안 동등하게 기여하는 한편, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의해 유발된 세포자멸사는 카스파제-8 신호 경로를 통해 주로 진행되는 것을 시사한다.

이들 생화학적 데이터는 DN(dominant-negative) 전략을 이용해서 유전자 연구에 의해 확인하였다. MM.1S 세포는 또한 제조사의 지시(독일 아막사 바이오시스템즈사)에 따라, 벡터 단독, DN-카스파제-8, DN-카스파제-9 또는 DN-FADD로 세포주 뉴클레오펙토 키트 V를 이용해서 일시적으로 핵산전달감염시키고, 또한 녹색 형광 단백질(GFP) 단독을 함유하는 벡터로 공핵산전달감염시켰다. 핵산전달감염 이후, GFP-양성 세포는 흐름세포측정에 의해 선택되어, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브에 의해 처리되고 나서, 생존율의 분석을 실시하였다. DN-카스파제-8-핵산전달감염 MM 세포의 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(IC₅₀, 7 nM)에 의 한 처리는 DN-카스파제-9에 의한 핵산전달감염된 세포에 비해서 이들 세포의 생존율을 현저하게 증가시켰다(도 12B). 이에 대해서, DN-카스파제-8 또는 DN-카스파제-9-핵산전달감염된 MM.1S 세포의 보르테조미브(IC₅₀, 5 nM)에 의한 처리는 유사한 정도로 생존율을 증가시켰다. DN카스파제-8 및 DN-카스파제-9의 작용 특이성은 이들 세포(항-Fas MoAb)에 있어서의 카스파제-9(Dex) 및 카스파제-8의 공지의 유발인자에 의한 MM.1S 세포의 처리에 의해 확인되었다(Chauhan et al., 1997)(도 12c). 이들 데이터는 (1) 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-유발 MM 세포 세포자멸사가 카스파제-8에 의해 주로 매개되고; (2) 보르테조미브-유발 세포자멸사는 카스파제-8 활성화 및 카스파제-9 활성화의 양쪽 모두를 필요로 하는 것을 시사한다.

다음에, 카스파제-8 활성화를 초래하는 상류 신호 경로의 억제가 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브에 대한 반응에 영향을 미치는지의 여부를 결정하였다. FADD(Fas-associated death domain) 단백질은 단백질분해 처리 및 프로-카스파제-8의 자동활성화를 초래하는 Fas 등의 TNF 수용자 패밀리 부재의 결합시 집합된 DISCs(death inducing signaling complexes)의 중요한 부분이다. 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브는 양쪽 모두 카스파제-8 활성화를 유발시키므로, MM 세포에서의 이 이 상황 동안 FADD의 역할은 DN-FADD를 이용해서 평가되었다. FADD의 DN-FADD에 의한 차단은 빈 벡터-핵산전달감염된 MM.1S 세포에 비해서 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-유발 세포독성을 유의하게 약화시켰다(벡터-핵산전달감염된 세포에서의 생존 세포 42% ± 2.0% 대 DN-FADD-핵산전달감염된 세포 에서의 생존 세포 76% ± 5.1%; p < 0.05)(도 12d). DN-FADD는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-유발 카스파제-8 활성화를 감소시켰고; 그러나, 최소 카스파제-8 활성화는 여전히 알려져 있고(데이터는 표시 생략), FADD 이외의 카스파제-8의 상류 활성자에 기인할 수 있다. 중요하게는, DN-FADD-핵산전달감염된 MM.1S 세포를 보르테조미브로 처리한 결과, 벡터-핵산전달감염된 세포에 비해 생존율이 단지 16% 증가되었다(벡터-핵산전달감염된 세포에서의 생존 세포 39% ± 2.4% 대 DN-FADD-핵산전달감염된 세포에서의 생존 세포 55% ± 4.1%; p < 0.05)(도 12d). 카스파제-8 또는 카스파제-9 억제 연구와 연결된 이들 데이터는 상기 화학식 (II)의 화합물이 보르테조미브보다 FADD-카스파제-8 신호 축 상에서 더욱 의존하고, 나아가서 MM 세포에서의 상기 화학식 (II)의 화합물 대 보르테조미브의 상이한 작용기전이 확인되는 것을 시사한다.

이전의 연구는 Bax가 미토콘드리아 세포자멸사 경로를 유발하는 것을 입증하고 있다. 이것은 문헌[Wei, M. C, Zong, W. X., Cheng, E. H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A. J., Roth, K. A., MacGregor, G. R., Thompson, C. B. & Korsmeyer, S. J. (2001) Science 292, 727-30 및 Lei, K., Nimnual, A., Zong, W. X., Kennedy, N. J., Flavell, R. A., Thompson, C. B., Bar-Sagi, D. & Davis, R. J. (2002) Mol Cell Biol 22, 4929-42]을 참조할 수 있고; 이들 두 문헌은 모두 전체로서 참조로 본 명세서에 병합된다. 이와 같이 해서, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 의해 유발된 MM 세포 세포자멸사가 Bax의 변화에 따라 상관이 있는지의 여부를 평가하였다. MM.1S MM 세포는 상기 화학식 (II)의 화합 물(X=Cl) 또는 보르테조미브로 처리하고, 미토콘드리아 단백질 추출물은 항-Bax 또는 항-Hsp60 Abs로 면역블롯 분석을 실시하였다. 도 12e에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 만약에 있다면 미토콘드리아에 있어서 Bax 레벨의 증가를 약간 유발시킨다. 블롯은 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 중요하게는, 보르테조미브는 미토콘드리아에 있어서 Bax의 유의한 축적을 유발시킨다.

야생형 Bax 또는 녹아웃을 수반하는 MEF는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브로 48시간 처리하고 나서, MTT 에세이에 의해 세포 생존율을 분석하였다. 도 12f에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 Bax(야생형) 및 Bax(녹-아웃)의 양쪽 모두에 있어서 생존율을 감소시키는 한편, Bax의 결손은 보르테조미브에 대한 유의한 내성을 부여한다. 결과는 3개의 독립된 실험의 평균±표준편차이다(P < 0.05). 이들 데이터는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브에 의해 유발된 세포자멸사 동안 Bax의 차이 요건을 나타내고, 이들 약제의 명백한 작용 기전을 시사한다.

실시예 15 - 보르테조미브와 비교한 정상의 림프구에 대한 차이 효과

보르테조미브 요법은 환자의 독성과 관련이 있다. 따라서, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브의 정상 세포에 대한 효과를 비교하였다. 5개의 건강한 도너로부터의 림프구를 다양한 농도(0 내지 20 nM)의 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브(0-20 nM)로 72시간 처리하고, MTT 에세이에 의한 세포독성에 대해 분석을 실시하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)은 높은 용량(20 nM)에서도 정상의 림프구의 생존율을 유 의하게 감소시키지 않았다(J-T 경향 시험으로부터 P = 0.27). 결과는 3개의 독립된 실험의 평균±표준편차이다. 이에 대해서, 보르테조미브는 6 내지 10 nM의 저농도에서도 림프구의 생존성을 유의하게 감소시킨다. 단, 환자 MM 세포의 IC₅₀은 정상의 림프구에 대해 효과를 갖지 않는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 농도에 도달하는 반면, MM 세포에 대한 보르테조미브의 IC₅₀은 정상의 림프구의 생존율의 50% 저하를 유발시킨다. 요약하면, 이들 데이터는 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)이 선택적인 항-MM 활성을 가지며; 특히, 보르테조미브보다 정상 세포에 대한 독성이 낮은 것을 시사한다.

상기 화학식 (II)의 화합물 또는 보르테조미브가 정상의 림프구 및 피부 섬유모세포에 있어서 프로테아좀 활성을 변화시키는지의 여부도 조사하였다. 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브는 양쪽 모두 이들 세포에 있어서 프로테아좀 활성을 유의하게 억제시켰고; 20 nM의 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 또는 보르테조미브는 키모트립신-유사 프로테아좀 활성의 억제를 각각 99% 또는 59 ± 11% 유발시켰다(데이터는 표시 생략). 따라서, 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 20 nM이 정상의 림프구에 있어서 유의한 세포독성을 유발시키지 않았지만, 이들 세포에서 키모트립신-유사 프로테아좀 활성을 감소시켰다. 마찬가지로, 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(317 nM) 또는 보르테조미브(15 nM)에 대한 IC₅₀에서의 정상의 CCD-27sk 섬유모세포의 치료 역시 프로테아좀 활성(데이터는 표시 생략)을 억제시켰다.

실시예 16 - 보르테조미브에 비해서 Bcl -2-과발현 MM 세포에 대한 상이한 효 과

세포자멸사 동안, Bax는 Bcl-2의 항세포자멸 기능을 중화시키고, 이에 따라 사이토-c 방출 및 카스파제-9 활성화를 용이하게 하였다. Bcl-2도 MM을 포함한 암 세포에 약물 내성을 부여해서 보르테조미브-유발 사멸에 대한 부분적인 보호를 제공하였다. 따라서, MM.1S 세포 중의 Bcl-2의 전위 발현이 화학식 (II)의 화합물 또는 보르테조미브의 능력에 영향을 미쳐 MM 세포 중의 세포독성 및 후미토콘드리아 세포자멸사 신호를 유발시키는지의 여부를 평가하였다. Bcl-2의 과발현은 두 약제 모두에 의해 처리된 세포의 생존성을 증가시켰고, 즉, 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)에 대해서는, Bcl-2-핵산전달감염된 세포 중의 생존성 50% ± 2.6% 대 벡터-핵산전달감염된 세포 중의 생존성 39% ± 1.5%(p < 0.05); 보르테조미브에 대해서는 Bcl-2-핵산전달감염된 세포 중의 생존성 61% ± 2.9% 대 벡터-핵산전달감염된 세포 중의 생존성 40% ± 2.1%(p < 0.05)(도 14a)였다. 보르테조미브에 대한 반응에서 Bcl-2 핵산전달감염체의 증가된 생존성은 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)(11%)(p < 0.04; n = 3)(도 14a)에 대한 반응에서보다 컸다(21%). 또한, 보르테조미브는 대조군의 벡터-핵산전달감염된 세포에 있어서 유의한 카스파제-9 분할을 유발시켰고, 이것은 Bcl-2-핵산전달감염된 세포에 있어서 현저하게 줄어들고(밀도계에 의해 3배 감소); 이에 대해서, 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)-유발 카스파제-9 분할은 Bcl-2 과발현에 의해 최소로 영향을 받는다(도 14b). 생존성 결과와 함께 이들 실험결과는 Bcl-2가 상기 화학식 (II)의 화합물보다 보르테조미브에 대항해서 더욱 보호를 제공하는 것을 시사하고 있다.

실시예 17 - 병용치료

도 15에 나타낸 바와 같이, 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)과 보르테조미브의 병용에 의한 24시간 동안의 MM.1S 또는 MM.1R MM 세포의 치료는 상승작용적인 증식 억제를 유발하였다. 결과는 3개의 독립된 실험(P < 0.005)의 평균±표준편차였다. 항-MM 약제인 화학식 (II)(X=Cl)와 보르테조미브 간의 상호작용은 "CalcuSyn" 소프트웨어 프로그램(미국 미조리주의 퍼거슨 및 영국 캠브리지의 바이오소프트사 제품)에 의한 아이소볼로그램(isobologram) 분석을 이용해서 분석되었다. 세포 생존성 에세이(MTT)로부터의 데이터는 약물 치료된 세포 대 치료되지 않은 세포에서 영향받은 성장된 세포 분획(FA)으로서 표현되었다. 상기 CalcuSyn 프로그램은 이하의 방정식에 따른 추오-탈라레이법에 근거하고 있다: "CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 + (D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2"(식 중, (D)1 및 (D)2는 병용해서 사용할 경우 x 효과를 가지는 약물 1 및 약물 2의 용량이며; (Dx)1 및 (Dx)2는 단독으로 사용할 경우 동일한 x 효과를 가지는 약물 1 및 약물 2의 용량이다. CI = 1일 경우, 이 방정식은 보존 아이소볼로그램을 표시하며 추가적인 효과를 나타낸다. 1.0보다 작은 CI 값은 상승작용을 나타낸다. 1.0보다 작은 CI 값은 보르테조미브 + NPI-0052에 대해서 얻어졌고, 이것은 상승작용을 나타낸다. 또한, 최대 항-MM 활성은 기타 치료 스케쥴보다 오히려 부수적으로 주어진 경우 관찰되었다. 병용된 화학식 (II)의 화합물(X=Cl) 및 보르테조미브의 낮은 용량은 정상의 PBMNCs의 생존성에 유의하게 영향을 미치지 않았다(데이터는 표시 생략). 따라서, 보르테조미브와 상기 화학식 (II)의 화합물(X=Cl)의 병용은 1) 각 약제의 아독성(sub-toxic) 농도의 사용 을 허용할 수 있고; 2) 약물-내성의 지연 혹은 예방이 가능하며; 3) 이들 약제의 단계적으로 증대하는 상승작용적인 용량이 세포자멸사 역치를 증가시킬 수 있다.

Claims

신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물을 투여하는 것을 포함하되,

상기 신생물성 질환은 적어도 하나의 다른 화학요법제에 대한 내성에 민감한 것인 신생물성 질환의 치료 방법:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제 1항에 있어서, X는 염소인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)의 구조를 가지는 신생물성 질환의 치료 방법:

.
제 1항에 있어서, 상기 신생물성 질환은 암인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 4항에 있어서, 상기 암은 유방암, 육종, 백혈병, 난소암, 요관암, 방광암, 전립선암, 결장암, 직장암, 위암, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 췌장암, 간암, 신장암, 내분비암, 피부암, 흑색종, 혈관종 및 뇌 또는 중추신경계(CNS) 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 5항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 결장직장암종, 전립선 암종, 유방 샘암종, 비소세포 폐암종 및 난소암종 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 6항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 1항에 있어서, 상기 환자는 인간인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 덱사메타손, 독소루비신 및 탈리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 프로테오좀 억제제인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 10항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 보르테조미브인 신생물성 질환의 치료 방법.
신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물을 적어도 하나의 부가적인 화학 요법제와 병용해서 투여하는 것을 포함하는 신생물성 질환의 치료 방법:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제 12항에 있어서, X는 염소인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)의 구조를 가지는 신생물성 질환의 치료 방법:

.
제 12항에 있어서, 상기 신생물성 질환은 암인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 15항에 있어서, 상기 암은 유방암, 육종, 백혈병, 난소암, 요관암, 방광암, 전립선암, 결장암, 직장암, 위암, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 췌장암, 간암, 신장암, 내분비암, 피부암, 흑색종, 혈관종 및 뇌 또는 중추신경계(CNS) 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 16항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 결장직장암종, 전립선 암종, 유방 샘암종, 비소세포 폐암종 및 난소암종 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 17항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 환자는 인간인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 덱사메타손, 독소루비신 및 탈리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 프로테오좀 억제제인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 21항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 보르테조미브인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 병용은 상승작용적인 것인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 12항에 있어서, 상기 병용은 부가적인 것인 신생물성 질환의 치료 방법.
화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물; 및 적어도 하나의 부가적인 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제 25항에 있어서, X는 염소인 약제학적 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (II)의 구조를 가지는 약제학적 조성물:

.
제 25항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 덱사메타손, 독소루비신 및 탈리도마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적 조성물.
제 25항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 프로테오좀 억제제인 약제학적 조성물.
제 29항에 있어서, 상기 다른 화학요법제는 보르테조미브인 약제학적 조성물.
적어도 2종의 프로테오좀 억제제의 상승작용적 병용물을 신생물성 질환을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 신생물성 질환의 치료 방법.
제 31항에 있어서, 상기 신생물성 질환은 암인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 32항에 있어서, 상기 암은 유방암, 육종, 백혈병, 난소암, 요관암, 방광암, 전립선암, 결장암, 직장암, 위암, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 췌장암, 간암, 신장암, 내분비암, 피부암, 흑색종, 혈관종, 및 뇌 또는 중추신경계(CNS) 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 33항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 결장직장암종, 전립선 암종, 유방 샘암종, 비소세포 폐암종 및 난소암종 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법.
제 34항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 31항에 있어서, 상기 환자는 인간인 신생물성 질환의 치료 방법.
제 31항에 있어서, 상기 프로테오좀 억제제의 적어도 1종은 보르테조미브 및 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적 허용염 혹은 전구 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 신생물성 질환의 치료 방법:

식 중, X는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.