KR20070072510A

KR20070072510A - 항체 정제를 위한 친화도- 및 이온 교환- 크로마토그래피

Info

Publication number: KR20070072510A
Application number: KR1020077007353A
Authority: KR
Inventors: 줄리안 보너자; 로버트 피 브레이크; 마크 로버트 데이비스; 키스 켈러맨; 애너 프리네타
Original assignee: 론자 바이올로직스 피엘씨
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2005-08-30
Publication date: 2007-07-04
Also published as: WO2006024497A1; CA2581208A1; US20080312425A1; AU2005279347A1; EP1685161A1

Abstract

단일 생성물 단백질 종으로 이루어진 응집체의 제거를 수반하는, 항체 및 기타 생성물 단백질의 신규한 정제 방법이 고안된다.

Description

항체 정제를 위한 친화도- 및 이온 교환- 크로마토그래피{AFFINITY― PLUS ION EXCHANGE―CHROMATOGRAPHY FOR PURIFYING ANTIBODIES}

본 발명은 생물공학적 제조에 있어 단백질 분야, 특히 항체 정제에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 상기 단백질 또는 항체의 신규 정제 방법을 기술하는 것이다.

단백질 A 크로마토그래피는 단일 단계로 대개 IgG인 항체의 세포 배양 상층액으로부터의 거의 완전한 정제를 가능케 하므로 공업적 항체 제조에 널리 사용된다. 단백질 A 친화도 컬럼은 실시가 반복됨에 따라 컬럼으로부터 어느 정도 리간드가 누출되는 것이 불가피하다. 부분적으로, 이는 컬럼으로부터의 단백질 A의 단백질 가수분해성 절단에 기인한 것일 수도 있다; 의약용 항체의 공업적 제조에서는, 조절상의 이유로 프로테아제 저해제 혼합물이 첨가되지 않을 수도 있다. 불행하게도, 이러한 단백질 A 또는 단백질 A 절편 오염물은 IgG에 대한 친화도를 유지함에 따라 지속적으로 복합체를 형성하므로 정제된 항체로부터 제거하기가 어렵다. 박테리아성 단백질인 단백질 A는 원치 않는 면역 반응을 유도할 것이므로, 상기와 같은 두 상이한 고분자의 이종성 2량체형 복합체는 정제된 항체로부터 반드시 제거되어야 한다; 단량체 IgG에 단백질 A를 첨가하여 형성된 모델 복합체는 Fc 함유 백혈구 및 보체 시스템을 활성화시켜 생체 외에서 산화제 및 아나필라톡신 활성을 생성하는 것으로 보고된 바 있다 (Balint 등, Cancer Res. 44, 734, 1984). (상기) Balint 등 및 다른 이들 (Das 등, 1985, Analyt. Biochem. 145, 27-36)은 상기 IgG-단백질 복합체가 겔 여과에 의해 비복합체화된 IgG로부터 분리될 수 있음을 증명하였다. 상기 방법의 단점은 낮은 작업 처리량 및 항체 수율 손실이다.

단일 티오에스테르 결합에 의해 컬럼 매트릭스에 부착된 재조합 단백질 A종이 최근 상품화됨으로써 US 6,399,750에 기재되어 있는 고용량 단백질 A 컬럼이 가능하다. 이에 수반하여, 상기 재조합 단백질 A 매트릭스의 누출율은 CNBr 연결에 의해 수득된 기존의 다중점 부착 천연 단백질 A 매트릭스와 달리 현저히 높은 경우가 많다.

US 4,983,722는 혼합물을 음이온 교환 물질에 흡수시킨 후 두 성분을 분리하기 위해 이온 강도 증가의 조건 하에 항체 및 단백질 A를 연이어 용출시킴으로써 단백질 A 정제 항체 제제로부터 오염 단백질 A를 선택적으로 분리하는 것을 개시한다. 상기 분리 방법은 주어진 항체에 대해 특이적이고 매우 가변적인 값인 항체의 pI에 대한 의존도가 높다. 나아가, 작업 처리량은 우수한 분리를 수득하는 데 필요한 염 구배의 경사에 의해 제한된다.

단백질 A 복합체의 제거와는 별도로, 항체뿐만 아니라 임의의 다른 유형의 생물의약 단백질에 관한 추가적인 정제 문제는 동종성 2량체 및 고차 응집체의 형성이다. 주로 친화도에 기반을 두며 천연 단백질과의 사이에도 일어날 수 있는 단백질 A와의 복합체 형성과는 달리, 동종 화학 질량 법칙에 따른 항체 또는 유사 단백질의 응집체는 적어도 단백질 일부의 자발적인, 또는 염 또는 pH 유도적인 변성 이후에 형성되기 시작하여 용매 접근 가능 표면에 소수성 부분를 노출시키게 된다. 따라서 비특이적 응집은 친화도 기반의 복합체 형성과는 달리 주로 용매 배제 효과를 원동력으로 하며, 이러한 점에서 결정 성장 태양과 닮았다. 처음부터 지속적으로 가용성을 띄는 응집체는 시간에 따라 증가할 수 있으며, 용액으로부터 단백질의 침전을 발생시킬 수 있다. 의약 투여 시에는, 낮은 백분율의 오염성 응집체가 원치 않는 면역 반응을 추가로 유도한다. 응집체의 제거는 지금까지 거의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해서만 신뢰성 있게 수행되었다; 그러나 SEC는 막대한 처리 시간, 고가의 물질을 필요로 하는 정제이며 다른 크로마토그래피 기법에 비해 적은 용량만이 적재 가능하다는 점에서 제한적이다.

본 발명의 한 목적은 항체, 바람직하게는 IgG로부터 단백질 A 또는 단백질 A 절편을 분리하고/하거나 항체 응집체 또는 정제할 다른 생성물 단백질의 동종 응집체를 분리하기 위한 또 다른 방법으로서 선행 기술의 단점들을 배제한 방법을 고안하는 것이다.

본 발명에 따른 항체 정제 방법은 하기의 단계들을 포함하도록 고안된다:

첫째, 단백질 A가 천연 단백질 A 또는 이의 기능성 유도체인 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하고,

둘째, 오염 단백질 A 또는 이의 기능성 유도체가 이온 교환 물질에 결합하도록 하며 추가로 플로우-스루 (flow-through) 내에서 플로우-스루 의 분획에 의해 단백질 A 또는 단백질 A 유도체와 복합체를 형성하지 않는 항체 단량체로부터 항체 응집체의 분리를 가능케 하는 조건 하에, 이온 교환 물질 상에 항체 응집체 및 단백질 A 또는 단백질 A 유도체를 포함하는 상기 정제된 항체를 적재하고, 이어서 셋째, 넷째로, 플로우-스루를 분획한 다음, 상기와 같이 이온 교환 물질 상에 적재된 항체의 조성에 비해 단백질 A 또는 단백질 A 유도체의 함량과 항체 응집체의 함량이 모두 감소된 하나 이상의 항체 단량체 분획을 이온 교환체의 플로우-스루로부터 수획한다.

본 발명의 방법은 상기와 같이 정제된 항체 단량체의 응집체 함량을, 바람직하게는 상기 또는 제 1 이온 교환 단계로부터 플로우-스루 내에 최종 수합된 모든 항체의 1.0 % 미만, 더욱 바람직하게는 0.5 % 미만으로 감소시킨다. 따라서 본 발명의 방법에 따른 이온 교환 단계 이후 수득된 항체의 단량체성은 99% 이상, 더욱 바람직하게는 99.5% 이상으로서, 이는 당업자에게 널리 공지된 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

또한 바람직한 것은, 임의의 오염 단백질 A 또는 단백질 A 유도체는 이온 교환 물질에 결합되는 반면 상기와 같은 플로우-스루의 수획된 분획 내에서 이온 교환체의 플로우-스루 내의 이온 교환 물질 상에 적재된 항체 총량의 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상을 수합하는 것이다.

본 발명에 따른 응집체는 동일한 단백질체들의 비공유 회합, 바람직하게는 10^-7 M 이하 (보다 강한 결합의 의미에서는 그 미만)의 결합 평형 상수를 가지는 회합으로 간주되며, 이때 단백질은 단일 단백질 사슬 또는 공유 결합된, 예컨대 이황화 결합에 의해 결합된 동종 또는 이종 다중 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 의미하는 응집체는, 이들이 유래된 단량체와 마찬가지로 수용액 중에 용해될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 IgG 항체의 '단량체'는 동일한 글리코실화 중쇄 및 경쇄를 각 2개씩 포함하는 표준 4량체형 항체에 관련된다. 그리하여 예컨대 2량체형 응집체는 2개의 IgG 분자의 비특이적 회합이다. 응집체 형성은 천연 단백질 폴드 및 단백질 4차 구조에 대한 변성 영향에 밀접하게 연관된다; 응집은 예컨대 단백질 폴드의 열 및 pH 유도성 변성에 의해 유도될 수 있다. 따라서 응집 속도는 특이적 공격에 대한 개개의 단백질 폴드의 에너지적 안정성에 의존함으로써, 주어진 단백질에 매우 특이적이다 (Chiti 등, 2004, Rationalization of the effects of mutations on protein aggregation rates, Nature 424: 805-808).

단백질 A는 포도상구균 (Staphylococcus aureus)에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 이는 포유류 항체, 특히 IgG형 항체의 Fc 영역에 결합한다는 특성을 가진다. 주어진 항체 종류 내에서, 친화도는 종 기원 및 항체의 아형 또는 알로타입에 따라 다소 가변적이다 (참조: Surolia, A. 등, 1982, Protein A: Nature's universal, antibody', TIBS 7, 74-76; Langone 등, 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32:157-252). 단백질 A는 단백질 A를 분비하는 S. aureus의 배양액으로부터 직접 분리될 수 있으며, 보다 간편하게는 E.coli 내에서 재조합 발현된다 (Lofdahl 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:697-701). 항체, 특히 단일클론 IgG의 정제를 위한 이의 사용은, 선행 기술에 상세히 기재되어 있다 (예컨대, 상기 Langone 등; Hjelm 등, 1972; FEBS Lett. 28: 73-76). 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 사용되는 경우, 단백질 A는 교차 결합된 비하전 아가로오스 (Sepharose, 천연의 비정제 아가로오스에 포함되어 있는 하전된 분획이 없음), 트리스아실, 교차 결합된 덱스트란 또는 실리카 기재 물질과 같은 고체 매트릭스에 연결된다. 이를 위한 방법은, 예컨대 단백질의 1차 아미노 작용기를 매개로 CNBr 활성화 매트릭스에 연결하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 단백질 A는 IgG의 Fc 부분, 즉 상기한 [Langone 등, 1982]에 기재된 IgG의 C?2-Cy3 접점 영역에 고친화 및 고특이적으로 결합한다. 이는 특히 인간 알로타입 또는 아형 IgG1, IgG2, IgG3 및 마우스 알로타입 또는 아형 IgG2a, IgG2b, IgG3에 강하게 결합한다. 단백질 A는 또한 V_H 유전자 패밀리인 V_H III에 의해 암호화되는 면역글로불린의 Fab 영역에 대하여 친화도를 나타낸다 (Sasso 등, 1991, J. Immunol, 61: 3026-3031; Hilson 등, J Exp. Med., 178: 331-336 (1993)). 단백질 A를 암호화하는 유전자 서열은 기능상 상이한 두 영역을 나타내는 것이었다 (Uhlen 등, J. Biol. Chem., 259: 1695-1702 (1984); Lofdahl 등, Proc. Nutl. Acad. Sci. (USA), 80: 697-701 (1983)). 아미노 말단 영역은 동종성이 큰 5개의 IgG 결합 도메인 (E, D, A, B 및 C로 불림)을 포함하고, 카르복시 말단 영역은 세포벽 및 세포막에 단백질을 고정시킨다. 단백질 A의 IgG 결합 도메인은 5개 모두, 예컨대 인간 IgG-Fc 잔기 252-254, 433-435 및 311에 관여함으로써 Fc 영역을 매개로 IgG에 결합하며, 이는 단백질 A의 B 도메인의 경우 Deisenhofer 등 (1981, Biochemistry 20: 2361-2370) 및 Sauer-Eriksson 등 (1995, Structure 3: 265-278)의 결정 구조에 제시된 바와 같다. Fc 부분의 본질적으로 연속적인 두 주요 결합 부위에 대한 발견은 [Gouda 등, 1998, Biochemistry 37: 129-136]에 의한 NMR-용액 연구 내에서 확인되었다. 원칙적으로, 단백질 A의 IgG 결합 도메인 A 내지 E는 각각 IgG의 Fc 부분 에 결합하기에 충분하다. 나아가, VH3 도메인 패밀리의 일정한 인간 대립 유전자들은 단백질 A에 의한 인간 Ig의 결합을 선택적으로 중재하는 것으로 밝혀졌다 (Ibrahim 등, 1993, J. Immunol. 151:3597-3603; V-region mediated binding of human Ig by protein A). 본원의 내용에서는, 본 발명의 또 다른 별도의 목적에 따라, 단백질 A에 대한 항체의 Fc 영역 결합에 상기와 같이 적용되고 있는 것들은 모두, 상기 항체의 Fc 영역이 그 자체로 고친화도 단백질 A 결합을 가능하게 하지 않은 경우 상기 VH3 패밀리 단백질 A 결합 대립 유전자를 매개로 하는 항체 결합에도 또한 적용된다. 이는 Fc를 기재로 하는, 본 발명의 원칙적인 방법의 동등한 구현예로 간주될 수 있다; 후자에 대하여는 이후 절에서 추가로 기재하도록 한다.

본 발명에 따른 IgG 항체는 고친화도 방식으로 단백질 A에 결합될 수 있는 알로타입의 항체로 간주되어야 한다. 나아가 단백질 A에의 결합에 관여하는 항체의 Fc 부분과는 관계없이, 상기 항체는 천연 발생 항체에 상응해서도 안 된다. 특히 그 가변 사슬 영역 부분에서, 이는 당업계에서 통상 고안되는 바와 같은 가공된 키메릭 (chimeric) 항체 또는 CDR 이식 항체일 수 있다. 요컨대, 본 발명에 따른 IgG 항체는 IgG형 항체로 간주되어야 한다.

본 발명에 따른 단백질 A 또는 단백질 A 절편의 기능적 유도체는 마우스 IgG2a 또는 인간 IgG1의 Fc 부분에 대한 K=1O^-8 M 이상, 바람직하게는 K=1O^-9 M 이상인 결합 상수에 의해 특성화된다. 결합 상수에 대한 상기 수치에 부합하는 상호작용은 본원에서 '고친화도 결합'으로 칭해진다. 바람직하게는, 상기한 단백질 A의 기능성 유도체는 야생형 단백질 A의 기능성 IgG 결합 도메인을 적어도 일부 포함하며, 상기 도메인은 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 IgG 결합 기능을 보유하는 이들의 가공된 뮤테인으로부터 선택된다. 그 예로는 단백질 A의 도메인 B의 기능성 59 아미노산 'Z' 절편이 있으며, 상기 도메인은 US 6013763에 기재된 바와 같이 항체 정제에 사용될 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 항체 결합 절편은, 바람직하게는 본 단락에서 정의된 바와 같은 완전한 Fc 결합 도메인을 2개 이상 포함한다. 그 예로는, 예컨대 EP-282 308 및 EP-284 368 (둘 모두 Repligen Corporation 출원)에 개시되어 있는 재조합 단백질 A 서열이 있다 .

단독으로 또는 단백질 A 또는 상기 단락에서 정의된 바와 같은 기능성 단백질 A 유도체와 조합하여, 또한 바람직한 것은 단일점 부착이 가능하도록 가공된 단백질 A 유도체이다. 단일점 부착은 단일 공유 결합에 의해 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지 물질에 단백질 잔기가 부착되는 것을 의미한다. 적절한 반응성 잔기에 의한 상기 단일점 부착은 노출된 아미노산 위치, 즉 루프 내에서 N 또는 C 말단 또는 그밖에 단백질 폴드의 외부 경계상의 영역 근처에 이상적으로 배치된다. 적절한 반응기는, 예컨대 설프히드릴기 또는 아미노기이다. 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 단백질 A 또는 이의 기능성 절편은 그 아미노산 서열 내에 시스테인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 시스테인은 재조합 단백질 A 또는 이의 기능성 절편의 아미노산 서열 C 말단의 마지막 30개 아미노산으로 이루어진 분절 내에 포함된다. 상기 유형의 추가적인 바람직한 구현예에서, 재조합 단백질 A 또는 이의 기능성 절편은 티오에테르 황 결합에 의해 단백질 A 친화도 크로마토그래피 매질의 크로마토그래피 지지체 또는 매트릭스 물질에 50% 이상 부착된다. 상기 구현예의 예는, 예컨대 US 6399750 (Pharmacia 출원)에 기재되어 있으며 사용된 지지체 매트릭스의 성질에 따라 Amersham-Biosciences로부터 Streamline™ 또는 MabSelect™의 상표명으로 시판되고 있다. 본원에서 티오에테르는 좁게는 화학적 의미와는 관계없이 -S- 결합 체계로 간주되어야 하며, 이러한 점에서 일반적인 화학적 언어에서 벗어나는 것이다; 예를 들어, 본 발명에 따른 상기 -S- '티오에테르' 브릿지는 예컨대 티오에스테르 또는 혼합된 아세탈과 같이 보다 큰 작용기의 부분일 수 있으며, 이러한 면에서 본원의 내용상 반응성 기반의 일반적인 화학자 언어에서 벗어나는 것이다. 바람직하게는, 티오에테르 브릿지는 그것의 통상적인 좁은 화학적 의미에서의 티오에테르 브릿지이다. 상기와 같이 가교 역할을 하는 티오에테르기는, 예컨대 단백질 A의 시스테인 잔기의 설프히드릴기를 활성화된 크로마토그래피 지지체 물질 상에 포함된 에폭시드기와 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 말단의 시스테인 잔기에 있어서, 상기 반응은 단백질의 노출되어 있는 고유의 설프히드릴기의 결합만을 가능케 하여 그 단백질의 단일점 부착만이 결과로 나타나도록 적절한 조건 하에 수행될 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 A 또는 기능성 단백질 A 유도체는 US 6399750에 개시된 재조합 단백질 A로서 병렬 말단의 가공된 시스테인 잔기를 포함하며, 단일 부착점으로서 상기 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 크로마토그래피 지지체 물질에 대해 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상 연결된다. 또한 상기와 같은 연결은 바람직하게는 에폭시드 매개 활성화에 의해, 더욱 바람직하게는 예컨대 Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, UK, 에피클로로히드린과 교차 결합된 아가로오스 비드)와 같은 아가로오스 매트릭스의 1,4-비스-(2,3-에폭시프로폭시)부탄 활성화 또는 예컨대 Sepharose FF와 같은 아가로오스 매트릭스의 에피클로로히드린 활성화에 의해 달성되었다. 본 단락에 따른 상기 바람직한 구현예과 조합하여 또한 바람직하게는, 제 1 이온 교환체는 음이온 교환체, 특히 Sepharose Q ™ FF (Amersham-Biosciences/Pharmacia)와 같은 4차 아민 기재 음이온 교환체이고, 가장 바람직하게는 그룹 Q가 N,N,N-트리메틸아미노-메틸인 매트릭스 지지체에 연결된 기능성 교환체 그룹 Q를 가지는 음이온 교환체로서, 상기 음이온 교환체는 가장 바람직하게는 Pharmacia/Amersham Biosciences의 Sepharose Q ™ FF 이다. 4차 아미노기는 강한 교환체로서, 이는 또한 적재/세척 완충용액의 pH의 변화에 영향을 받지 않는다. 고속류 교환체 매트릭스는보다 큰 물리적 안정성을 위해 고도의 교차 결합을 가지는 45-165 μm 아가로오스 비드를 기재로 한다; 또한 세파로오스는 천연 아가로오스의 하전된, 설페이트화 분자 분획을 가지지 않으며 항체 적재량이 높은 조건 하에서도 항체의 비특이적 매트릭스 흡착을 허용하지 않는다. 상기와 같은 구현예의 예는 실험 관련 절에서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 오염 단백질 A는 단백질 A의 임의 유형의 기능성 IgG 결합 자손 또는 이의 상기한 바와 같은 기능성 유도체로서, 이는 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼으로부터 결합된 항체를 용출시키는 중에 수득된다. 상기 오염 단백질 A종은, 예컨대 특히 공업적 제조에서 효소 작용에 의해 생성될 가능성이 높은 펩티드 결합의 가수분해에서 기인할 수 있다. 단백질 A 크로마토그래피는 조정제된 신선한 생성물 용액이 여전히 프로테아제 활성을 상당히 보유한 경우 하류 처리에서 초기 단계로서 적용된다. 세포 배양액 내의 죽어가는 세포 또는 초기 원심 분리 또는 여과 단계에서 파괴된 세포들은 프로테아제를 방면시킬 가능성이 있다; 조절을 목적으로, 하류 처리 과정 또는 그 이전에 프로테아제 저해제로 세포 배양액를 보충하는 것은 생화학적 연구 실무와는 달리 대개 수행되지 않는다. 페닐-메틸-설포닐-클로라이드 (PMSF) 또는 e-카프로산이 그 예이다. 상기 화학시약은 생물의약품의 제조에 있어 첨가제로서 바람직하지 않다. 또한 단백질 A의 재조합 기능성 유도체 또는 절편은 단백질 폴드의 3차 구조에 따라, 야생형 단백질 A에 비해 프로테아제 저항성이 약화될 수 있다. 결합 도메인의 총수가 감소되면 개개의 IgG 결합 도메인을 연결하는 아미노산 분절이 노출될 수 있다. 도메인 간의 접촉은 도메인 폴딩의 안정도에 기여할 수 있다. 또한 단백질 A 또는 상기와 같은 이의 기능성 유도체에 의한 항체의 결합은 항체 결합 시에 유도되는 구조적인 변화로 인해 프로테아제 작용에 대한 감수성에 영향을 끼치거나 이를 촉진할 수 있다. 다시 말해, 야생형 또는 전장 단백질 A 또는 이의 기능성 가공 절편은 이와는 다른 행보를 보일 수도 있다. 본 발명에 따른 오염 단백질 A는 바람직하게는 여전히 기능성 IgG 결합 단백질이며, 따라서 이후 본 발명에 따른 이온 교환 분리 매질 상에 적재될 시에 단백질 A 정제 항체와 회합된다. 정제된 항체와 오염 단백질 A의 고친화도 기재 회합은 정제된 항체로부터 오염 단백질 A를 효율적으로 분리하기 어려운 이유가 된다.

본 발명에 따라 정제하고자 하는 항체는, 바람직하게는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체의 정제 이전의 세포 배양으로부터 수획된다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포 배양은 포유류 세포 배양이다. 포유류 세포는 리소좀이라 불리는, 분해 효소를 보유한 큰 구획을 가지며 이는 세포 사멸 또는 수획 시에 파괴된다. 특히 상기 세포 배양은, 예컨대 NSO 세포와 같은 골수종 세포 배양일 수 있다 (Galfre, G. 및 Milstein, C. Methods Enzymology , 1981, 73,3). 골수종 세포는 형질세포종 세포, 즉 림프계 세포 계통의 세포이다. NSO 세포주의 예는, 예컨대 세포주 ECACC No. 85110503으로 이는 [European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom]로부터 제한 없이 입수 가능하다. NSO는 특히 재조합 항체 생성을 위해 사용되는 경우 매우 높은 생산 수율을 올릴 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 NSO 세포는 적어도 재조합 단백질 A가 단일점 부착 단백질 A일 수 있는 야생형 단백질 A의 재조합 단축 절편을 사용하는 일정한 단백질 A 친화도 크로마토그래피 시스템을 이용한다면, 다른 숙주 세포 유형에 비해 오염 단백질 A를 훨씬 높은 수준으로 재생시키는 것으로 밝혀졌다. 그 예는 Streamline™ rProtein A 친화도 크로마토그래피 수지 (Amersham Biosciences; 본질적으로는 US 6,399,750에 기재된 것과 같은 티오에스테르 단일점 부착 재조합 단백질 A). 오염 단백질 A 약 1000 ng 이상/항체 mg의 수준은 Streamline™ rProtein A 친화도 컬럼을 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명의 방법은 단일의 신속한 정제 단계를 이용하여 오염 단백질 A를 상기의 상승 수준으로부터 < 1 ng/항체 mg로 효율적으로 감소시킨다는 점에서 선행 기술과 차이를 보이며, 이때 정제 계수는 약 1000x이다.

단독으로 또는 상기 단락과 조합하여 또한 바람직한 것은 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 항체는 수획시 또는 그 이후에 프로테아제가 불활성화되도록 처리되지 않는 것이고, 더욱 바람직하게는 수획 이후 하나 이상의 외인성 첨가 프로테아제 저해제와 혼합되지 않는 것이다. 본 내용상 프로테아제 저해제는, 예컨대 항체일 수 있는 생성물 단백질의 3차 및/또는 4차 구조를 화학적으로 개질시키거나 손상시키지 않으면서도 프로테아제를 선택적으로 저해하는 임의 종류의 화학 시약 (프로테아제는 아님)이다; 프로티나아제 저해제의 예는 금속프로티나아제 활성에 중요한 금속 이온을 킬레이트화하는 EDTA와 같은 킬레이터이고, 또한 금속프로티나아제에 대하여 동일한 활성을 갖는 N-[(2S,3R)-3-아미노-2-히드록시-4-페닐부티릴]-L-루신 히드로클로라이드 [Bestatin]와 같은 것을 고려할 수도 있다. 가장 바람직하게는, 상기 프로테아제 저해제는 PMSF 및 [Laskowski 등, 1980, Protein inhibitors of proteinases, Ann. Rev. Biochem. 49, 593-626]에 기재된 특이적인 프로티나아제 저해 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그 예는 루펩틴, 예컨대 아프로티닌이다.

단백질 A 친화도 크로마토그래피 작동에 대하여는, 기술 문헌에 널리 기재되어 왔으므로 추가적으로 기재될 필요가 없다. 상기 인용된 것 이외의 또 다른 예는, 예컨대 [Duhamel 등, J. Immunological Methods 31, (1979) 211-217, pH Gradient elution of human IgG1, IgG2 and IgG4 from protein A-Sepharose]이다.

용출시 약 pH 3-4.5의 산성 pH 조건에의 노출은, 약 pH 7.5로의 즉각적인 완충 용액 교환이 뒤따른다 하더라도 본질적으로 응집체 형성을 분명 야기할 것이다. 이러한 문제는 단백질 A 크로마토그래피가 널리 사용되기 시작하며 기존의 크로마토그래피군과 비교되었던 1980년대 초부터 인지되었다. 추가의 바람직한 구현예에서, 단백질 A 매트릭스로부터의 산 용출 이후에는 정제된 항체의 제 1 이온 교환체에의 적재 이전에 바이러스 불활성화 처리가 뒤따르며, 이때 바이러스 불활성화 처리는 더욱 바람직하게는, pH 3.5 내지 pH 4.5의 낮은 pH, 바람직하게는 30 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 45 ℃ 이상의 온도에서 약 50 내지 90분간의 인큐베이션, 또는 1μm 미만, 바람직하게는 0.25μm 미만의 공극 크기를 가지는 동물 바이러스 감소 필터를 통한 여과를 포함한다. 따라서 오염 단백질 A 또는 단백질 A 유도체를 제거하면서 동시에 응집체 함량을 감소시키기 이전에, 바람직하게는 추가로 응집체 형성을 도모하고 응집체 성장을 촉진하는 추가적인 중요한 처리 중재 단계를 수행한다; 상기 처리는, 예컨대 바이러스 단백질성 캡시드를 변성 또는 분해하고자 하는 산성 pH에서의 (열) 공격일 수도 있고, 또는 막 변성 효과가 또한 문제되는 한외여과 (ultrafiltration) 단계일 수도 있다. 바이러스 감소 처리는 바람직하게는, 저pH 인큐베이션 단계로서 약 6 내지 8의 바이러스 로그 감소 계수를 용이하게 허용한다.

한 바람직한 구현예에서, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 항체 용출은 단백질 A 컬럼으로부터 항체 생성물 단백질을 용출하는 데 사용하기 전에, 1x 완충 용액으로 제조되는 완충 용액으로서 5 mS/cm 미만, 바람직하게는 3 mS/cm 미만, 더욱 바람직하게는 2 mS/cm 미만, 가장 바람직하게는 1.2 mS/cm 이하의 저전도도 용출 완충 용액을 사용하여 수행된다. 편의상, 상기 완충 용액은 또한 0.1 mS/cm 이상, 바람직하게는 0.5 mS/cm 이상, 가장 바람직하게는 0.8 mS/cm 이상의 최저전도도를 가져야 한다. 놀랍게도, 본 발명의 이러한 면에서 상기 저전도도 완충 용액은 첨가된 완충염의 화학적 성질과 무관하게 i. 단백질 A 컬럼으로부터의 용출 즉시 최저 응집체 함량, ii. 이어지는 산 또는 낮은 pH 바이러스 불활성화 단계 (이어서 pH가 거의 중성인 pH, 즉 pH 6.5-7.5로 즉각 재조정됨) 중에 가장 완만한 응집체 함량 증가, 및 iii. 약 60 분간의 노출 이후 일반적으로 약 7의 로그 감소 계수를 제공하며 산성 pH 처리 중에 여전히 허용되는 상당한 바이러스 로그 감소를 일관되게 나타내는 것으로 입증되었다. 이러한 저전도도 완충 용액의 공통적인 장점은 아직까지 제대로 평가된 적이 없었다. - 특히, 고전도도 (약 5-20 mS/cm)에서 완충염의 성질은 응집체 함량의 증가에 큰 영향을 미친다. 특히, 5-10 mS/cm 이상의 전도도에서 산성 pH 바이러스 불활성화 단계 중의 응집체의 비율은 시트레이트에 의해 막대하게 증가하였다. 따라서 추가의 바람직한 구현예에서는, 단독으로 또는 더욱 바람직하게는 상기 저전도도 용출 완충 용액의 추가 구현예와 조합하여, 단백질 A 크로마토그래피 용출 완충 용액은 완충염으로 pH 3 내지 4의 pKa 값을 가지는 1가 카르복시산 및/또는 그에 상응하는 모노카르복실레이트, 예컨대 알칼리 또는 알칼리토카르복실레이트를 사용하며, 더욱 바람직하게는 포르메이트/포름산을 사용한다. 임의로는, 상기 모노 카르복실레이트 또는 카르복시산은 H₄N⁺-CHR-COO^- 헤드 그룹 (R은 측쇄 라디칼)을 제외하고는 pH 4에서 그 측쇄 내에 임의의 추가의 하전된 기가 없고 설프히드릴 작용기가 없으며 아미노산이 pH 4에서 바람직하게는 5 mM 이상, 더욱 바람직하게는 10 mM 이상의 농도로 수용성이고 추가로 바람직하게는 그 카르복시산 작용기가 pH 2 내지 3의 pKa 값 (pKa₁)을 가지는 1가 아미노산이다. 상기 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 천연 아미노산이다. 천연 아미노산의 카르복시 헤드 그룹의 pKa 값은 [Dawson 등, Data for Biochemical Research, 2^nd ed., pages 1-63, Oxford University Press (1969)]에서 확인할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 아미노산은 글리신, 알라닌, C1-C5 알킬 히드록시 아미노산, 예컨대 세린 또는 트레오닌 또는 C1-C5 알콕시알킬 또는 가능하게는 폴리옥시알킬, 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 단백질 A 크로마토그래피 단계를 위한 용출 완충 용액의 제조에서 완충 아미노산으로 사용되기에는 글리신이 매우 바람직하다.

제 1 이온 교환체의 플로우-스루 내에서 오염 단백질 A는 바람직하게는 < 10 ng/항체 mg, 더욱 바람직하게는 < 4 ng/항체 mg, 가장 바람직하게는 < 1 ng/항체 mg의 농도로 감소하며, 이때 항체는 바람직하게는 IgG를 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 상기 역치들을 확인하기 위한 ELISA 어세이법은 실험 절에 상세히 기재되어 있다; 바람직하게는 순한 세제의 존재 하에 수행되는 시료의 pH = 4로의 산성화가 단백질 A의 누출량의 정확한 측정에 필수적이라는 사실에 유의해야 한다. 단백질 A 결합용 제 1 이온 교환체의 적재 용량과 같은 역치는 절대 초과되지 않는 것으로 간주되어야 함은 자명하며, 이는 필연적으로 오염 단백질 A의 큰 증가로 이어진다. 단백질 A 또는 단백질 A 절편의 분석에 적합한 ELISA 기재 방법은 US 4,983,722에 기재되어 있다. 적절한 항 단백질 A 항체는, 예컨대 Sigma-Aldrich로부터 시판된다. 특히 추가의 설프히드릴기를 포함하도록 가공된 단백질 A 유도체를 사용하는 경우, 단백질 표준의 적절한 관리가 중요하다. 시험 시료의 정량화를 위한 표준으로 사용되는 상기와 같은 순수 단백질 A 유도체의 단량체적 특성을 검증하는 것이 중요할 수 있는데, 이는 -S-S-브릿지를 매개로 형성되는 공유성 2량체 또는 다량체가 잘못된 결과를 유발할 수 있기 때문이다. 검증은 당업계의 관례대로, 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE 분석에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 그리하여 DTT 또는 베타메르캅토에탄올에 의한 상기 단백질 A 유도체-표준 용액의 환원은, ELISA 기법에서 측정 오차를 방지해 준다.

추가로 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 있어 이온 교환체의 플로우-스루 내에서는 제 1 이온 교환체 상에 적재된 항체의 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이 회수될 수 있다. 동일한 항체의 단백당형 및 궁극적인 가공 변이체와는 관계없이 본 발명에 따른 단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 뒤이은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 개시 혼합물 내에 존재하는 종 수준에서의 항체 유형은, 바람직하게는 단 한 가지가 존재한다. 예컨대, 본 발명에 따라 인간 또는 인간-마우스 키메릭 또는 유인원 또는 유인원화된 IgG 항체를 정제하는 경우 혈청 보강된 세포 배양액 내에는 혈청으로부터 전달될 수도 있는 소 (bovine) IgG가 존재하지 않는다. 다르게 말하자면, 본 발명의 방법은 무혈청 세포 배양액으로부터 수획된 비정제 항체에 적용된다.

본 발명에 따른 제 1 이온 교환체는 음이온 교환 수지이다; 단백질 A는 [EP-289 129 B1]에 기재된 바와 같이 두 유형의 수지에 의해 결합될 수 있다 . 제 1 이온 교환체 또는 음이온 교환체는 온화하게 교반된 시료 용액에 이온 교환체 수지를 침지하고 이어서 여과에 의해 추가로 액체 매질을 교환함으로써 특정 유속에서의 컬럼 방식 또는 배치 (batch) 작업 방식으로 작동될 수 있다. 본 발명에 따라 주어진 항체의 pI를 고려하여, 단백질 A 오염물이 결합되어 항체로부터 제거되는 동시에 플로우-스루 내에 항체를 보유하도록 하는 조건으로서 제 1 이온 교환체를 적재하기 위한 pH 및 이온 강도의 적절한 조건을 규명할 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 오염 단백질 A로부터 항체의 보다 빠른 분리를 가능케 한다. 매트릭스 지지체에 부착된 상기 제 1 음이온 교환체의 작용기의 예는, 예컨대 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸, 트리메틸아미노메틸, 및 디에틸-(2-히드록시프로필)-아미노에틸과 같은 1차, 2차, 및 특히 3차 또는 4차 아미노기이다. 음이온 교환체에 적합한 크로마토그래피 지지체 매트릭스는 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 아가로오스 기재 수지 및 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌 비드 및 폴리스티렌/디비닐 벤젠 수지이다. 추가로 동일하게는, 이온 교환막 흡수제를 사용할 수 있다 (예컨대, Sartobind Q, Sartorius). 높은 유속 및 짧은 분리 시간을 가능케 하고자 하는 명백한 목적을 위해, 매트릭스 물질은 살포 물질일 수 있고 이는 추가의 바람직한 구현예이다. 이는 세라믹 매트릭스를 비롯하여 살포에 효과적인 비드화 매트릭스 물질 (cp. 예컨대 Afeyan 등, 1991, J. Chromatography, 544, 267-279)로 이루어질 수도 있고 또는 Sepragen Inc. (Hayward, California/U.S.A.)에 의해 판매되는 상표 SepraSorb®의 고속류 물질과 같은 모놀리식 살포 물질일 수도 있다. SepraSorb®는 특히 비드화 매트릭스의 대안으로 개발되었다. 이는 교차 결합된 스폰지성 재생 셀룰로오스 물질로서 연속의 상호 연결된 열린 공극 (50-300 마이크론) 구조를 가진다. 상기 모놀리식 매트릭스는 이온 교환 작용기 (DEAE, QM, CM 및 SE)가 쉽게 고정화되는, 접근이 용이한 표면을 가진다. 통상의 매질 내에서의 비드 주변과는 달리, 공급 스트림 액체는 실제로 연속 매트릭스의 상호 연결 공극을 통해 살포와 유사하게 흐른다. SepraSorba는 제조 규모 면에서 비드화 매질에 비해 많은 장점을 제공한다. 이는 1 bar (14.5 psi)를 좀처럼 넘지 않는 후방 압력 하에 100 ml/분의 유속을 용이하게 달성할 수 있다. 모놀리식 매트릭스는 다루기 용이하며 복잡하고 시간 소비적인 컬럼 충전을 피하도록 설정하기 쉽다. 매트릭스는 막힘과 채널링이 없고 크래킹에 대해 저항성을 가지며, 이에 따라 작동 시간 및 작동 주기 수를 늘릴 수 있게 된다.

이온 교환체는 가장 바람직하게는, 예컨대 Sepharose CL-6B 또는 Sepharose Fast Flow (FF) (Amersham-Biosciences/Pharmacia)와 같은 아가로오스 매트릭스 상에 장착된 4차 아민 기재 음이온 교환체이다. 그 예는 Amersham-Biosciences/Pharmacia의 Sepharose Q™이다. 제 1 음이온 교환체의 사용과 조합하여 추가로 바람직한 것은, 본 발명에 따른 항체가 단일클론 항체로서 상기 단백질 A 친화도 크로마토그래피 단계에서 사용된 단백질 A의 pI보다 pH 2 단위 이상 높은, 즉 보다 염기성인 등전점 (pI)을 가지는 것이다; 예컨대, 천연 단백질 A가 약 5.0의 pI를 가지는 반면, Streamline 재조합 단백질 A는 약 4.5의 pI를 가진다. 본 발명에 따른 항체는 등전점 (pI)이 바람직하게는 6.5 이상, 더욱 바람직하게는 7.0 이상, 가장 바람직하게는 약 7.5 이상인 단일클론 항체이다. 이는 실제로 수획 및 정제된 항체의 pI를 의미하는 것이며, 단순히 아미노산 서열만으로부터 예측될 수 있는 pI를 의미하는 것이 아님에 유의하여야 한다. 실제로 정제된 항체 분자는 글리코실화와 같은 폴리펩티드 골격의 추가적인 개질화를 겪었을 수도 있으며, 상기 개질화는 하전된 모이어티 (moiety)를 추가함으로써 분자의 pI를 변경했을 수도 있다. 등전 포커싱 (IEF)에 의해 생성물 항체의 pI를 측정함에 따라, 항체 단백질, 예컨대 단일클론 항체 단백질의 번역 후 가공의 미세불균일성은 생성물 항체의 개개의 단백당형에 대한 보다 넓은 pI 범위를 야기하며, 이는 전체적으로 단일 밴드, 그리고 이에 따라 적어도 생성물 대부분에 대한 특정 수치보다는 IEF 겔 내의 도말을 닮은 것이다. 본 발명에 따른 상기 바람직한 구현예에서, '항체의 pI'는 상기 특정된 바람직한 pI 범위 내의 pI를 가지는 항체 생성물 분자의 그 할당분을 의미하는 것이다. 본 상세한 설명의 모든 추가적인 정의, 예컨대 주어진 정제 단계 이후 회수된 항체의 백분율은, 그 pI에 부합하는 항체만의 할당분을 의미한다. 추가로 바람직하게는, 대략 실험으로 측정 가능한 '도말' 영역의 pI 평균 수치는 그것이 단백당형의 정량적 분포의 합리적으로 공정한 표시라는 가정 하에, 본 발명에 따른 pI 또는 평균 pI로 간주되어야 한다.

바람직하게는, 제 1 이온 교환체의 적재 및 헹굼에 사용되는 완충 용액의 pH는 응집체 및 오염 단백질 A 또는 단백질 A 유도체 둘 모두를 제거하고자 하는 공동의 목적 하에, 원칙적으로 완충 용액에 노출된 이온 교환 물질의 하전된 기들과 단백질 A 또는 단백질 A 오염물 및 정제될 항체 둘 모두 간의 직접적인 반발을 피하도록 설정된다. 적용된 완충 용액 조건 하에 이온 교환체에 대한 단백질 A 종의 정적 결합을 가능케 함과 동시에 또한 동일한 완충 용액 조건 하에 항체의 비결합을 가능케 하고자 하는 목적 하에, 제 1 이온 교환체는 항체 및 단백질 A 또는 단백질 A 유도체의 pI를 고려하여 정제하고자 하는 항체의 pI에 근접한 또는 그 이상의 pH에서 작동되어야 한다. 따라서 항체의 표면 전하는 0 또는 음인 반면, 확실한 양이어서 반발성을 가지지는 않는다. 그리하여 이온 강도의 적절한 조절은 단백질 A가 결합됨과 동시에 항체에 대한 비결합 조건을 달성하는 데 필수적이다. 그러나 이는 상기 정의된 평균 pI값의 의미하는 것은 아니다; 따라서 항체의 단백당형와 관련하여, 이는 작은 할당분의 단백당형일수록 pI에 근접하거나 일치하는 것은 아님을 의미하지는 않는다. 나아가, 응집체 제거의 관점에서 응집체로부터의 단량체의 분리는 플로우-스루 방식으로 진행되나 효과의 일부는 적어도 비결합 방식에서의 이온 교환을 이용한 일시적이며 약한 이온성 상호 작용에 의한 것으로 간주되어야 한다; 단량체 및 응집체는 표면 전하, 및 이에 따라 pI에서 미세한 차이를 나타낸다; 그러므로 음이온 교환체를 이용하여, 예컨대 항체의 pI 미만에서 0.5 pH 단위 이하의 완충 용액 pH 범위 내에서도 최소한 일부 항체에 대해서는 본 발명의 방법을 성공적으로 실시할 수 있는데 (그리고 반대로 응집체 제거만의 관점에서 양이온 교환체를 이용하여 실시하는 경우 항체의 pI 초과에서 0.5 pH 단위, 하기 참조), 이는 추후 생각해 본 결과 응집체가 아닌 단량체만이 상이한 접근 가능 표면을 가짐에 따라 결국 이온 교환체 물질에 의한 이온성 힘에 의해 중성 또는 음전하조차 적극적으로 반발되는 현상을 설명하는 것이다. 그러나 본 발명의 실시에 관한 상기 구현예는 결국 응집체 pI, 그리고 이에 따라 응집 특성에 대한 의존도가 높을 것이며, 이들은 예측 불가능하고 따라서 임의의 주어진 항체에 대해 예상할 수가 없다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 오염 단백질 A 및 응집체로부터의 최적 분리를 고려할 때, 정제할 항체의 평균 pI로 설정된 완충 용액 pH를 사용하는 것은 덜 바람직하다; 바람직하게는, 플로우-스루의 수합을 일으키는 제 1 음이온 교환체의 적재 및 헹굼에 적합하며 본 발명에 따른 비결합 크로마토그래피 조건 하에 항체 생성물 피크를 포함하는 완충 용액 pH는 항체 단량체의 pI 초과의 pH로, 더욱 바람직하게는 pI + 0.5 pH 단위의 pH로 설정된다.

본 발명에 따른 제 1 음이온 교환체의 작동 방식에는 제 1 음이온 교환체의 평형 완충 용액을 이용한 단백질 A 친화도 크로마토그래피로부터의 산성 또는 중성화된 용출물의 완충 용액 교환이 필요하다. 본 발명의 방법에서는 평형 완충 용액과 적재 완충 용액이 동일하다. 상기 목적을 위해서는 편의상 Amicon 또는 Millipore에 의해 판매되는 것과 같이 통용되는 한외 여과 장치들이 사용될 수 있다; 이들은 Sephadex G-25과 같이 저분자량 다공성 여과 매트릭스를 사용하면서도 희석 효과를 방지한다. 본 발명에 따른 평형 완충 용액은 바람직하게는 1 내지 150 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 110 mM, 가장 바람직하게는 20 내지 100 mM 염의 범위 내에서, 예컨대 염화나트륨과 같은 대체염의 염 농도를 가진다. 평형 완충 용액의 pH는 바람직하게는 pH 6.5 내지 pH 9.0, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 내지 pH 8.5, 가장 바람직하게는 pH 7.9 내지 pH 8.4의 범위이다. 단백질의 N 말단 아미노 작용기는 pKs 값이 약 9.25이므로 음이온 교환체에 대한 오염 단백질 A 및 이미 음으로 하전된 임의의 다른 단백질의 결합은 보다 염기성인 pH에서 강해질 것임을 염두에 두어야 한다; 본원에 있어, 적재 완충 용액의 pH는 선택된 pH 범위 내에서 전하의 변화에 기여할 수 있는 시스테인 및 히스티딘 측쇄의 상이한 함량 및 상이한 pI 값을 가지는 주어진 한 쌍의 항체 및 오염 단백질 A에 대한 결합 및 비결합의 최적 구분을 위해 미세 조정될 필요성이 존재할 수 있다. 나아가, 이온 강도의 임의의 증가가 그러하듯이 보다 염기성인 pH는 단백질 A-항체 상호 작용을 방해한다; 이온 강도 역시 오염 단백질 A의 결합 파괴의 필요성과 항체의 결합 방지의 균형을 맞추기 위해 미세 조정될 필요가 있다. 완충 용액의 이온 강도가 보통 pH 값에 반비례한다는 것은 당업자에게 자명한 사실이다; pH에 따라 단백질 A가 음이온 교환체에 강하게 결합할수록, 항체 결합의 방지 및 잠재적인 단백질 A-항체 상호 작용의 방해에 보다 많은 염이 용인된다. 따라서 상기 주어진 pH 및 대체 염의 범위는 상호 연관되는 것으로 간주되어야 한다: pH가 낮을수록 본 발명을 실시하기 위한 상기 주어진 바람직한 범위 내에서 용인되는 염이 적은 것으로 확인된다. 또한 염 프레이트 (freight)는 pH 완충 물질에 의해 첨가되어 용액의 이온 강도를 추가로 증가시킨다. 이온 강도는 평형 완충 용액의 전도도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 용어 '전도도'는 두 전극 간에 전류를 전달하는 수용액의 능력을 의미하며, 추가로 전하 및 이온 이동도를 고려하여 이온의 총량으로 측정된다. 따라서 수용액 중에 존재하는 이온량이 증가할수록, 용액은 높은 전도도를 가지게 된다. 전도도의 측정 단위는 mS/cm (milliSiemens/cm)이며, 예컨대 Topac Inc. (Hingham, MA/U.S.A.) 또는 Honeywell에 의해 시판되는 전도도 측정계를 사용하여 측정될 수 있다. 본원의 내용상, 모든 수치는 25 ℃에서의 비전도도 (specifc conductivity)에 관련된다. 바람직하게는, 제 1 음이온 교환 단계용 적재 또는 평형 완충 용액은 0.5-5 mS/cm, 더욱 바람직하게는 1-3 mS/cm, 가장 바람직하게는 1.25-2.5 mS/cm의 전도도를 가진다. 이상적으로는, 이는 약 2 mS/cm의 전도도를 가진다.

적절한 완충염의 예는 Good, N. E. (1986, Biochemistry 5:467-476)에서 확인할 수 있다. 예컨대 통상 사용되는 트리스.HCl 완충용액 또는 인산수소나트륨 완충용액이 적절한 완충 물질이다. 완충 물질의 농도는 보통 예컨대 10-40 mM 완충염 범위 내이다. 완충 용액의 고안에 유용한 잠재적인 음이온 종 중에서 클로라이드에 비해 음이온 용출의 특이적인 강도가 낮은 것이 바람직한데, 이때 낮은 용출 강도의 특성은 이온 전하 밀도에 거의 반비례하고 이온 크기에 거의 비례한다. 음이온 용출 강도의 실험상 비교는 생화학 표준 교과서 내에 표로 제시되어 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 완충 물질은 인산 완충 용액이다. 인산수소는 특히 pH 8 이하에서 사용되는 경우 낮은 용출 강도를 가지며, 또한 낮은 카오트로픽 (chaotropic) 특성에 의해 특히 우수하다.

추가의 바람직한 구현예에서, 제 1 음이온 교환체는 Biosepra의 상표 HyperD®인 음이온 교환체와 같은 세라믹 매트릭스 음이온 교환체이고, 더욱 바람직하게는 4차 암모늄 (= 4차 아민 기재) 이온성의 매트릭스 결합 작용기를 가지는 세라믹 매트릭스 음이온 교환체이다. 이들은 치료 규모의 정제에 매우 유용하다. 가장 바람직하게는, 4차 세라믹 음이온 교환체는 Q-세라믹 매트릭스 음이온 교환체로, 특히 바람직한 것은 예컨대 Ciphergen Biosystems Ltd., Guildford/Surrey, UK에 의해 상표명 'Biosepra'로 시판되는 Q-HyperD® 음이온 교환체이다. 또한 항체의 pI, 단백질 적재 및 완충 용액 pH에 대한 상기 및 하기의 바람직한 구현예는 본 구현예와 조합하여 바람직하나, 다만 예외적으로 Q-HyperD® 물질을 사용할 경우 완충 용액의 바람직한 전도도는 좋게는 0.5-2 mS/cm, 더욱 바람직하게는 0.6-1.7 mS/cm 범위, 가장 바람직하게는 약 1 내지 1.5 mS/cm이며 특히 Q-Hyper D®- F 이온 교환체를 사용할 경우에 그러하다. 상기 전도도는 생성물 단백질로부터 오염 단백질 A 또는 이의 절편을 제거하는 관점에서 최상의 정제 결과를 가능케 한다. Ceramic HYPERD 흡착제는 경직성 다공 비드를 사용하여 제조되며, 이는 기능화된 히드로겔로 코팅 및 투과된 것이다. 이에 따라 비드는 우수한 경직성 및 흐름 수행능과 더불어 뛰어난 질량 전이 및 역동성을 갖게 된다. Ceramic HYPERD 흡착제는 사용이 매우 간편하다. 이들은 상대적으로 높은 밀도로 인해 매우 큰 컬럼 내에 충전하여 사용하기에 용이하다. 수축 또는 팽창이 전혀 없어 컬럼을 반복 충전/비충전할 필요가 없다. 최근 500리터 초과의 컬럼은 치료용 분자의 제조 크로마토그래피에 사용된다. Ceramic HYPERD 이온 교환체는 또한 제조 공정용 50 μm 등급 (F 등급)을 사용할 수 있는데, 이의 높은 용량 및 낮은 후방 압력으로 인해 50 등급은 포획 공정 및 일반 하류 가공에 완벽하다. 세라믹 성질은 비드를 화학적으로 매우 안정하게 하므로, 이는 0.5 M NaOH를 비롯한 가장 통상적으로 사용되는 세척제를 사용하여 세척될 수 있다.

상기 제시된 조건들은 플로우-스루 방식으로 오염물 A의 제거를 가능하게 하는 틀을 마련하는 것이다. 주어진 항체 단량체로부터 응집체를 추가로 동시에 제거하고자 주어진 항체에 대해 단백질 A 제거 및 응집체 분리를 동시에 가능하게 하는 허용 조건을 정하기 위해서는, 상기 제시된 일반 범위 내에서 전도도, pH 및 완충염 종류 등에 대하여 추가적인 면밀한 시험이 필요하다. 상기한 바와 같이, 이는 주어진 항체에 대해 매우 특이적일 것이므로 일반 용어 내에서 임의의 추가적인 정의를 내릴 필요가 없다. 실험 절에서 추가로 예시된 연구들에서는, 비결합 방식으로 음이온 교환 매트릭스를 작동하는 것이 응집체 및 단량체의 분획을 도모하여 주로 플로우-스루 내 항체의 결합되지 않은 단백질 피크 분획의 감소 경사 상에서 응집체가 분리됨을 확인할 수 있다. 이러한 놀라운 연구 결과는 단백질 A 요소를 고려하지 않고, 항체를 제외한 생성물 단백질 단량체의 정제에 적용된다. 응집체의 수준은 분획의 주의 깊은 선별 및 수합에 의해, 제 1 이온 교환체의 플로우 스루의 주요 용출 피크에서 감소할 수 있다. 상기 연구 결과에 대하여는 이전에 과학 문헌에 보고된 바 없으며, 이는 고체상인 이온 교환 물질과 플로우 스루 이동상 간의 강한 상호 작용은 예상되지 않는다는 사실로 인해 기대될 수도 없는 것이었다. 가장 놀라운 것은 플로우-스루 내에서, 생성물 단백질 또는 항체 단량체의 평균 pI에서 상당히 벗어나 있으며 하전 방식으로 정적 결합에 대해 허용 불가능한 이온 강도에서 이온성 인력이 인정되는 플로어-스루 완충 용액의 완충 용액 pH에서 응집체 테일링 효과 (tailing effect)가 발생한다는 것이다. 이러한 방식으로, 음이온 및 양이온 교환체 모두 플로우-스루 분획 내에서 응집체 분리 또는 테일링을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 상기 설명에 한정되지 않고 추론하여 뒤늦게 생각해 보건대, 앞서 말한 바와 같이 적어도 부분적으로는 일부 약하지만 역동적인 이온 교환체와의 이온성 인력이 상기 효과에 기여하는 것으로 보인다. 이에는 또한 매트릭스 지지체 물질이 기여할 수도 있다. 본 발명에 따른 이온 교환 수지 상에서 플로우-스루 방식으로 생성물 단백질 단량체 또는 항체 단량체로부터 응집체를 분리하는 것에 대한 주목할 만한 하나의 바람직한 구현예에서, 제 1 음이온 교환체의 매트릭스 물질은 중합체성 폴리올 또는 다당류이다. 동일 분자 상의 결합 부위의 반복에 의해 확대되는 이른바 분리 효과의 친화성 요소는 응집체가 클수록 이에 기여할 수 있다. 그리하여 2개의 IgG 항체로 이루어진 2량체성 응집체는 본 발명의 방법에 따라 단량체성 IgG 항체로부터 성공적으로 분리될 수 있다.

배치 방식 작동이 가능하나, 제 1 음이온 교환체 단계에 대해서는 컬럼 작동 방식이 바람직하다. 이 경우, 약 10 내지 60 ml/h의 유속이 유리하게 사용될 수 있다. 적재된 항체의 적재 농도는, 유리하게는 10 내지 30 항체 mg /교환 수지 ml의 범위 내일 수 있다. 극도로 희석된 시료를 사용하면 항체 수율이 감소될 것임은 자명하며, 당업자에게 공지된 바이다. 정제하고자 하는 항체는 동일 평형 완충 용액을 이용하는 약 1 컬럼 부피의 세척을 포함하는 적재 작동의 로우-스루에서 수합된다. 플로우-스루의 pH는 안정성 향상 및 새로운 응집체 및/또는 항체 단백질 침전의 억제를 위해 중성 pH로 조정될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 방법은 단백질 A 함유 에피토프에 대해 길러진 항체에는 사용될 수 없다. 상기 항체는 청구 범위에 포함되지 않으며, 이는 당업자에게 명백한 제한 사항이다. 또한 본 발명에 따른 '제 1' 이온 교환 크로마토그래피 단계의 의미는 공개된 정의로서 단지 본 발명에 따른 사건을 연대순으로 고려한 것임에 유의해야 한다; 이는 정제하고자 하는 단백질 또는 항체 단백질 각각에 대한 통상의 결합 및 용출 방식으로 수행되는 임의의 중재 이온 교환 크로마토그래피 단계를 배제하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

본 발명의 방법의 가장 큰 장점은 비결합 또는 플로우-스루 방식에서 음이온 교환체를 매개로 항체를 정제하여, 컬럼의 용량이 물질의 처리량을 모두 제한하지는 않는다는 것이다; 용량은 소량의 오염 단백질 A 보유에 대해서만 결정적이다. 이는 많은 처리 시간 및 물질 자원을 절약하게 하는 동시에 단백질 A 오염물의 매우 효율적인 제거를 가능하게 한다.

이미 부분적으로는 언급되었던 상기한 본 발명의 추가적인 목적은 정제할 생성물 단백질의 단량체로부터 단백질 응집체를 제거하는 일반적 방법으로서, 첫째로 플로우-스루의 분획에 의해 플로우-스루 내에서 바람직하게는 제 2 단백질 리간드와 추가로 복합화되지 않는 생성물 단백질 단량체로부터 생성물 단백질 응집체를 분리되도록 하는 조건 하에, 이온 교환 물질 상에 생성물 단백질의 단량체 및 응집형을 포함하는 상기 생성물 단백질이 포함된 용액을 적재하는 단계, 및 둘째로 플로우-스루를 추가로 분획한 후 정제를 위해 이온 교환 물질 상에 적재된 생성물 단백질의 조성에 비해 생성물 단백질 응집체의 함량이 감소된 하나 이상의 생성물 단백질 단량체 분획을 이온 교환체의 플로우-스루로부터 수획하는 단계를 포함하는 방법이다.

상기 정의들은 이에도, 특히 플로우-스루 이온 교환 크로마토그래피의 실질적인 수행에 대한 정의에도 적용된다; 따라서 상기 응집체는 단일 또는 다중의 공유 결합 단백질 사슬을 포함할 수 있는 주어진 단백질의 비특이적 2량체 또는 고차의 가용성 응집체로 간주되어야 한다. 바람직하게는, 응집체는 항체의 구체적인 예시로 이미 상기 정의되고 IgG에 대해 예시된 바와 같이 동일 생성물 단백질의 2량체 및 고차 응집체 둘 모두를 포함하며, 정의된 상기 모든 유형의 응집체들은 본 발명에 따라 플로우-스루 방식으로 수행되는 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 제거되는 것으로 확인된다. 음이온 및 양이온 교환은 둘 모두 본 발명의 방법을 실시하는 것으로 확인된다; 더욱 놀라운 것은, 이온 교환체에 생성물 단백질이 결합되는 것을 허용하지 않는 완충 용액 전도도로 인해 생산적인 결합을 유도하지는 않더라도, 생성물 단백질 단량체와 대상 이온 교환 물질 간의 이온성 인력 (예컨대, 교환체 및 단백질 표면상의 양전하의 인력)을 유도하는 완충 용액의 pH 뿐만 아니라 정제될 생성물 단백질 단량체의 pI에서도 본 방법이 실시되는 것으로 확인된다. 요컨대, 응집체 제거를 달성하기 위해 정제할 생성물 단백질과 관련하여 비결합 방식으로 양이온 교환체를 사용하는 경우, 양이온 교환체는 pH가 생성물 단백질의 평균 pI 이하인 적재 및 (적재 후) 헹굼 완충 용액과 함께 적용되어야 하고, 반대로 음이온 교환체를 사용하는 경우, 음이온 교환체는 pH가 생성물 단백질의 평균 pI 이상인 하나 또는 수개의 적재 및 (적재 후) 헹굼 완충 용액과 함께인 채로만 적용되어야 한다. 바람직하게는, 완충 용액 pH는 상기 항체 정제 내용에서 일반 용어로 설명된 바와 같이, 생성물 단백질의 pI로 설정되지는 않는다. 당단백질 및 단백당형의 pI 분포에 대한 상기 설명 및 pI의 실험적 측정또한 본 목적에 적용된다. 상기 헹굼 및 적재 완충 용액이 주어진 생성물 단백질 단량체에 대한 비결합 작동 방식을 정립하는 데 부합해야 하며, 이와 같이 정해진 한계 내에서 상기 헹굼 완충 용액은 조성 면에서 적재 완충 용액과 동일하거나 상이할 수도 있고, 혹은 수개의 상이한 헹굼 완충 용액을 연이어 사용할 수도 있으나 그로 인한 뚜렷한 이점은 인지되지 않는다. 단순성을 위해서는 시료 제제의 적재 및 헹굼이, 예컨대 동일한 완충 용액을 사용하여 수행된다. 그러나 본 발명의 크로마토그래피 정제 방법을 수행함에 있어서는, 비결합 방식 작동에서 허용되는 완충 용액 내에 현탁된 액체 시료 제제를 단순히 쏟아붓기보다는 균질 이온 교환 컬럼 상에 시료를 적재하는 더욱 복잡한 방식이 인지될 수 있다.

바람직하게는, 분획은 플로우-스루의 항체 피크를 둘 이상의 분획으로 분획 하거나 쪼갠 다음 꼬리 (tail) 분획을 버림으로써 달성된다. 이러한 방식으로, 동일한 목적 하에 장시간의 겔 투과 또는 크기 배제 크로마토그래피 방법 또는 동일하게 낮은 처리량, 복잡한 기계에 기반을 둔 고가의 스플릿-플로우 (split-flow) 또는 침전 기법을 가장 널리 사용되는 고처리량 및 초고속 이온 교환 크로마토그래피로 대체하는 동시에, 수획된 항체의 단량체성은 총 생성물 단백질 함량을 기준으로 99% 이상의 단량체 순도에 이르게 될 수 있다. 임의의 추가적인 장시간의 세척, 용출 및 재생 단계를 수행하지 않고 이온 교환 컬럼의 플로우-스루를 직접 수합하는 것이 가장 빠른 처리 방법일 것이다.

실험

1. 단백질 A ELISA

단백질 A 또는 재조합 단백질 A를 시험하기 위한 많은 ELISA들이 기재된 바 있다 (US 4983722 및 그 안의 참고문헌 참조). 하기한 모든 실시에 있어서, 단순한 샌드위치 ELISA는 평평한 바닥의 96 웰 마이크로적정 플레이트 (Nunc™) 상에 코팅된 포획 항단백질 A 항체가 단백질 A를 보유하는지에 대해 사용되었다. 이어서 결합 단백질 A는 비오틴화 항단백질 A 검출 항체로 검출되며, 이는 스트렙타 비딘 복합 호스래디시 퍼옥시다아제의 추가 결합을 가능하게 한다 (Amersham #RPN 1231). 시판되는 포획용 항단백질 A 토끼 항체 (천연 S. aureus 단백질 A에 대해 길러진 것)는 Sigma-Aldrich (#P-3775)로부터 입수 가능하다. 본 연구에서는 계속 이 항체가 사용되었다. 검출 토끼 항체 역시 동일하게 Sigma-Aldrich (#P-3775)로부터 구매하였다. 비특이적 흡착 공정에 의해 단백질을 코팅한 후, 상기 코팅된 단백질을 사용하여 단백질 A-특이적인 단백질 A 포획 항체를 존속시키는데, 이때 포획 항체는 비오틴화 토끼 항단백질 A 및 스트렙타비딘-호스래디시 퍼옥시다아제를 이용하여 추가로 검출한다. 발색 기질로는 테트라메틸 벤지딘을 사용한다. 미지 농도의 시료는 그 부모-단백질 A 또는 -검출하고자 하는 오염 단백질 A의 단백질 A 유도체를 이용한 표준 곡선으로부터 알아낸다. 적절한 표준 제조 및 산성 pH에서의 코팅이 중요한 것으로 입증되었다. 예컨대 Streamline Protein A™ (Amersham Biosciences, 이전에는 Pharmacia)와 같이 추가의 시스테인 잔기를 가지도록 가공된 재조합 단백질 A의 경우 특히, 단백질 표준 용액의 단량체 상태를 보장하기 위해 환원성 설프히드릴 시약을 이용한 표준 용액의 선처리가 필요한 것으로 밝혀졌다.

반면 야생형 단백질 A는, 많은 회사들, 예컨대 Sigma-Aldrich/Switzerland (#P6031) 또는 Pharmacia (#17-0770-01)로부터 시판되며 상기와 같은 선처리를 필요로 하지 않는다. Streamline™ 매트릭스로부터 오염 단백질 A의 누출을 관찰하기 위한 하기 실험에서는, 제조자로부터 수득한 비복합 재조합 단백질 A의 시료를 표준으로 사용하였다.

1.1 Cys 강화 단백질 A-표준의 선처리

Streamline™ 단백질 A 친화도 크로마토그래피 (Amersham Biosciences) 컬럼 물질로 시판되는 순수 재조합 단백질 A-Cys를 Pharmacia/Amersham Biosciences로부터 동결건조 형태로 입수하였다. 20 mg/ml 이하의 단백질을 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 디티오에리트리톨을 포함하는 0.1 M 트리스 pH 8에 용해시키고 실온에서 15-30분간 인큐베이션한 다음 1회용 PD-10 겔 투과 컬럼 (Amersham Biosciences)으로 탈염하였다 . 코팅 이전에 표준 용액을 다루기 위해 사용한 모든 완충 용액은 티올기의 산화를 막기 위해 N₂ 처리되어야 한다. 단백질 표준의 제조는 마이크로적정 플레이트를 코팅하기 위한 표준에 사용하기 직전에 최적으로 수행하였다. 임의로는, 1 mg/ml 저장 용액을 제조하여 -65 ℃ 냉동고 내에 보관하였고; 해동후, 단백질 A의 단량체적 특성을 비환원 SDS-PAGE에 적재한 분취액으로부터 분석하였다. 단백질 표준의 농도는 Bradford 어세이 (Bradford 등, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254; Splittgerber 등, 1989, Anal. Biochem. 179:198-201) 및 자동화 아미노산 분석에 의해 측정하였다. 상기 선처리의 결과는 스타필로코커스 단백질 A 표준 (1 레인: 천연 단백질 A; 2 레인: 선처리 이후) 및 순수한 비연결형 Streamline™ 재조합 단백질 A (Pharmacia, 현재는 Amersham-Biosciences에서 공급, 4 레인: 천연 재조합 단백질 A; 5 레인: 선처리 이후)에 대한 비환원 10% SDS-PAGE에 의해 도 1에 제시되어 있다. 1 레인은 해당 분자량이 수직축에 기재된 분자량 마커이다. 추가의 Cys 잔기를 포함하는 Pharmacia의 재조합 단백질 A는 환원 이후 저분자량으로 이동한다; 약 34kD의 단량체성 밴드가 보존되며 이는 명백히 이황화물 브릿지 2량체의 분해로부터 유래한 것으로서 훨씬 더 강하다.

1.2 ELISA

1.2.1 시료 제조

2개의 희석 단계에 의해, 1 mg/ml 단백질 A 표준의 1: 200.000 희석 저장 용액을 제조하여 50 ng/ml에서 제 1 표준을 제공하였다. 그로부터 0.2 ng/ml로 감소시킨 희석물을 표준 곡선의 분석 용도로 제조하였다. 나아가, 표준의 희석물 ('스파이킹 용액')을 사용하여 시료 내에 존재하는 간섭 물질을 제거하고자 시험할 2중 생성물 시료를 스파이킹하였다.

최종 생성물 시료 시험을 위해, 모든 시료를 2개의 500 μl 동일 부피로 나눈다. 하나는 1000 ng/ml 스파이킹 용액으로, 또는 적절하게는 10 μg/ml 용액으로 스파이킹시켜 항체 mg 당 10 단백질 A ng의 단백질 A 함량으로 최종 단백질 A를 제공한다. 나머지 반은 동일 부피의 시료 완충 용액으로 스파이킹시킴으로써, 스파이킹에 따른 생성물 시료의 희석 계수를 고려한다. 두 유형의 제제는 아래에서 '스파이킹된 시료'로 언급될 것이다. 시료 완충 용액은 탈이온수 또는 2중 증류수를 이용하여 부피 1 L가 되게 한, 7.51 g 글리신 (염기), 5.84 g NaCl, 0.5 ml Triton X-100으로 이루어진 것이었다.

최적의 정확도 측정을 위해, 시료 내 항체 농도를 당업계에 공지된 통상의 ELISA로 선측정하였다. 추가의 표준 용액을, 단백질 A에 대해 유사한 불변 영 역 친화도를 갖는 공지의 표준 항체 동량으로 스파이킹하여, 산성화 단계의 효율을 측정하고 어세이 내에서 단백질 A에 결합하여 이를 포획물로부터 제거하는 항체에 의해 유도되는 임의의 잠재적인 계통 오차를 알아냈다.

산성화: 450 μl의 스파이킹된 시료 또는 표준을 200 μl의 0.2 M 시트레이트/0.05 % Triton X-100 완충 용액 (pH 3.0)에 첨가한다. 모든 시료에 대해 3중으로 수행하였다. 나아가, 시료 희석물을 제조하여 3중으로 시험하였는데 이는 항체 농도가 1 mg/ml 내지 0.2 mg/ml의 범위 내에서 어세이가 최적으로 수행되기 때문이다. 반면 본 어세이에서 시료 용액 중에 존재하는 과량의 항체에 결합하는 오염 단백질 A 또는 A 절편을 유리시키기 위해서는 산성화 단계가 필수적이다.

1.2.2 항체를 이용한 마이크로적정 플레이트의 코팅

코팅 완충 용액은 1.59 g/L Na₂CO₃, 2.93 g/L NaHCO₃ 및 0.20 g/L 아지드화나트륨으로 이루어진 것이었다. 완충 용액의 pH는 pH 9.6으로 조절되었다. 단백질 A 표준에 대하여 포화가 나타나지 않도록 하기에 충분한 양으로 항체를 포함하는 항체 용액을 웰당 100 μl씩 가한다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮고 습도 챔버에 둔다. 약 18시간 동안 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한다. 모든 웰을 300 μl 이상의 세척 완충 용액 [NaCl 5.8 g/L, Na₂HPO₄ 1.15 g/L, NaH₂PO.H₂O 0.26 g/L, EDTA 3.7 g/L, Tween-20 0.2 g/L, 부탄올 10 ml/L, pH 7.2]으로 3회 헹군 후 가볍게 털어 건조시킨다. 250 μl의 차단 완충 용액 [0.5 % 카 제인 함마르스텐 함유 코팅 완충 용액]을 각 웰에 가하고 벤치탑 오비탈 쉐이커 (속도 120 rpm) 상에서 주위 온도로 2시간 동안 인큐베이션한다. 모든 웰을 300 μl 이상의 세척 완충 용액으로 3회 헹군 후 가볍게 털어 건조시킨다.

1.2.3 시료 인큐베이션 및 검출

표준 및 임의의 스파이킹된 시료를 포함하는 시료를 100 μl/웰로 넣는다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮은 후 벤치탑 오비탈 쉐이커 상에서 주위 온도로 90분 동안 인큐베이션한다. 모든 웰을 300 μl 이상의 세척 완충 용액으로 3회 헹군 후 가볍게 털어 건조시킨다. 비오틴화 토끼 항단백질 A를 기측정된 최적 희석도로 희석한다. 100 μl/웰을 가하고 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮은 다음 오비탈 쉐이커 상에서 주위 온도로 90분 동안 인큐베이션한다. 반복하여 헹군다.

복합 완충 용액 [Na₂HPO₄ 1.15 g/L, NaCl 5.84 g/L, NaH₂PO₄.H₂0 0.26 g/L, EDTA 3.73 g/L, Triton X-100 0.05 % (v/v), pH 7.2]을 사용하여 스트렙타비딘-호스래디시 퍼옥시다아제를 기측정된 최적 희석도로 희석한다. 100 μl/웰을 가하고 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮은 다음 오비탈 쉐이커 상에서 주위 온도로 45분 동안 인큐베이션한다. 반복하여 헹군다. 갓 제조한 테트라메틸 벤지딘 (TMB, ICN product number #980502) 기질 용액을 100 μl 가한다. 상기 기질 용액은 다음과 같이 제조한다: DMSO 1 ml에 TMB 10 mg을 용해하여 저장 용액을 제조한다. 0.5 M 시트르산을 이용하여 pH 6.0으로 조절된 2.05 % (w/w) 아세트 산나트륨 수용액에 상기 저장 용액 10 μl, 추가로 H₂O₂ 10 μl를 첨가한다. 어세이의 임의의 시약 제조에 사용된 모든 물은 최고 품질로서, 탈이온화한 초순수 또는 2회 이상 증류된 물임은 자명하다.

기질 용액은 주위 온도에서 쉐이커 상에서 8-11분간 인큐베이션한다. 이어서 정지 용액 [13 % H₂SO₄]을 웰당 50 μl 가함으로써 반응을 중지시킨다. 정지 용액 첨가 이후 10분 이내에 플레이트 판독 분광계로 450nm 파장에서의 웰의 흡광도를 측정한다.

상기와 같은 ELISA의 검출 한계는 단백질 A 0.2 ng/ml으로, 조작 범위는 0.2 내지 50 ng/ml이다. 어세이간 변화 가능성은 10 % 미만이다.

도 2는 티오에테르 연결 내 단일점 부착 단백질 A를 이용하는 Streamline™ 재조합 단백질 A 크로마토그래피로부터 항체 용출물 중 재조합 단백질 A의 누출 수준을 나타낸 것이다. 주기 수는 1 M 염화나트륨을 이용한 용출 및 재평형 이후의 반복 사용을 의미한다. 하이브리도마 세포 배양의 세포 배양액로부터의 누출이 보통 500 ppm 수준인 반면, 다른 세포 유형들은 1000 ppm 정도의 수준을 나타냈다. 표 1에는 출처가 상이한 매트릭스로부터의 누출률에 대한 개요가 제시되어 있다; 크로마토그래피는 제조자의 지시에 따라 수행하였다.

[표 1]

도 3은 동일한 친화도 매트릭스 물질로 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 반복하여 실시하는 동안 오염 단백질 A의 불충분한 누출 감소에 관한 데이터를 제공한다; 야생형 단백질 A 다중점 부착 Sepharose 4 FF (Amersham-Biosciences)는 하기 2.1절에 기재된 바와 같이 반복적으로 사용되었고, 임의의 추가 용출물 처리 이전에, 용출물 내 오염 단백질 A의 수준을 상기한 바와 같이 ELISA로 측정하였다.

2. 단백질 A 및 Sepharose Q 크로마토그래피/응집체 제거에 대한 분획 비수반

2.1 Streamline ™을 이용한 단백질 A 친화도 크로마토그래피

NS0 골수종 세포 배양액의 세포 배양 상층액을 원심분리 및 심층 여과에 의해 조정제한 후 한외여과에 의해 농축하였다; 또한 한외여과는 배양액을 pH 7.5 PBS로 교환하는 데 사용하였다. 세포에 의해 생산된 항체 #5의 역가는 0.2 mg/ml였고, 총 1 L 완충 용액 교환 상층액을 적재하였다. 단일클론 항체 #5의 pI는 8.5였다. 단백질 A Streamline™ 컬럼 (부피 5.0 ml)를 10 컬럼 부피의 50 mM 글리신/글리시네이트 (pH 8.8, 4.3 M NaCl)로 미리 평형화시켰다; 유속은 200 cm/h이었다. 적재를 위해, 컬럼은 유속 50 cmh^-1로 작동되었다; 적재 용량은 매트릭스 물질 약 20 mg/ml이었다. 용출 이전에, 상기 컬럼을 추가의 200 mM NaCl 및 0.1 % Tween-20이 보강된 글리신 평형 완충 용액 10 컬럼 부피 이상으로 세척하였다. 0.1 M 글리신/HCl pH 4.0 완충 용액으로 이루어진 용출 완충 용액으로 용출을 수행하였다. 용출 직후, 항체 피크를 포함하는 용출물 분획을 충분한 분량의 0.5 M 트리스HCl (pH 7.5)으로 중성화한 다음, 산성 pH에의 장기 노출을 방지하기 위한 후속 음이온 교환 단계를 위해 본 발명의 적재/평형 완충 용액 (1O mM 트리스/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl)과 함께 Amicon 투석 여과 장치를 이용하여 완충 용액을 교환하였다.

항체 농도 및 오염 단백질 A 농도는 상기한 바와 같이 측정하였다. 용출물 중 오염 단백질 A의 수준은 투석 여과 이전에는 1434 ng/항체 mg, 이후에는 1650 ng/항체 mg이었다. 적재 이전에 완충 용액 교환된 상층 용액의 역가를 기준으로 항체 회수율은 81 %이었다; 투석 여과 용액 중 항체의 농도는 3.6 mg/ml이었다.

2.2 비결합 방식에서의 Q- Sepharose FF 음이온 교환 단계

2.1절에서 정제된 항체를 하기와 같이 추가 처리하였다: 5.0 ml Q-Sepharose FF 컬럼 (Amersham-Biosciences)을 10 ml의 0.1 M NaOH로 충전한 이후, 2 컬럼 부피의 0.1 M 트리스 pH 8로 충전하고 75 cm/h의 유속으로 10 mM 트리스 pH 8/50 mM NaCl 10 컬럼 부피로 평형화하였다. 평형 이후, 유속을 50 cm/h로 감소시켰다. 투석 여과 항체 용액 6 ml를 컬럼 상에 적재하고 플로우-스루를 추가의 처리를 위해 수합하였다; 우선 6 ml로, 이어서 계속 순수한 적재 완충 용액 또는 10 mM 트리스 pH 8, 50 mM NaCl 평형 완충 용액으로 적재한 다음, 280nm에서 모니터링된 플로우-스루의 흡수가 기저선으로 복귀할 때까지 플로우-스루를 계속 수합하였다. 플로우-스루 내 항체의 총 회수량은 23 항체 mg이었다 (87 %). 오염 단백질 A의 수준 측정 결과는 < 3 ng/항체 mg이었다. 이와 같이 Q-Sepharose 정제된 항체 배치의 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피, SEC; 10 mM 인산 pH 7.0, 140 mM NaCl 완충 용액 내, 유속 10 cm/h, 겔 ml 당 15 항체 mg의 적재 비율로 Sephacryl S-300 이용)에 의한 추가 처리는 미량의 오염 단백질 A 수준을 더 이상 실질적으로 변화시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 경험에 따르면, SEC를 사용하여 약 30-100 ng/mg인 오염 단백질 A의 수준을 약 1-5 ng/mg로 추가로 감소시킬 수 있다. 따라서 SEC는 미량의 단백질 A에 대해 매우 낮은 정제 계수를 가지며, 이는 항체와 오염물 A 간의 친화 상호 작용을 설명하는 것일 수 있다. 그러나 불가피한 시료 희석 및 느린 처리로 인해 발생하는 항체 단백질의 동일한 분해 때문에, SEC는 적재한 항체 양의 70% 회수만을 허용할 것이다. 이는 SEC가 시간은 많이 요구하면서도 물질 손실을 피하지 못함을 의미한다.

Q-Sepharose 컬럼은 상기한 바와 같이 2 M NaCl 내의 별도 용출 및 추가의 평형에 의한 추가 사용을 위해 재사용하였다.

2.3 주문제작 다중점 부착 단백질 A를 이용한 Streamline ™ 단백질 A 친화도 크로마토그래피

상기 다중점 부착 Streamline™ 단백질 A-친화도 매트릭스는 주문제작한 것으로 Pharmacia Biotech (현 Amersham-Pharmacia)에 의해 공급된 것이었다. 이는 제조자가 말단 Cys 잔기를 가지는 동일한 34 kD Streamline™형 재조합 단백질 A를 동일한 Sepharose 매트릭스 물질에 연결시켜 제조한 것이나, 다만 에폭시드 매개 활성화 및 -SH 기만의 연결을 위한 선택적 반응 조건 대신 활성화 및 연결을 위한 통상의 CNBr 화학을 사용하였다 (제조자의 제품 정보 참조). 실험 2.1의 방법을 반복하여 오염 단백질 A의 수준이 353 ng/항체 mg으로 측정되었다. 따라서 매트릭스 물질에 대한 단백질 A의 연결 방식은 부분적으로는 고용량의 단일점 부착 재조합 단백질 A 친화도 매트릭스로부터의 단백질 누출 증가의 원인이 되고; 전장 야생형 단백질 A에 비해 상기 재조합 단백질 A로 도입된 아미노산 서열의 개질화 또한 단백질 누출 증가에 상당히 기여하는 것으로 추론될 수 있다.

3. 병렬 시험: Miles 방법과의 비교( US 4,983,722)

Miles 특허 (No: 4,983,722)는 용출을 위한 염 구배 (0.025 M 내지 0.25 M NaCl)를 이용한 결합 방식에서 제 2 크로마토그래피 단계로 사용되는 DEAE Sepharose가 용출물 내의 걸러진 단백질 A 함량을 15 ng/항체 mg 미만으로 감소시킬 수 있음 (단백질 A 범위는 0.9 내지 14 ng/항체 mg이었음)을 청구한다.

[표 2]

단일 및 다중점 부착 단백질 A 친화도 매트릭스 상에 정제된 6A1 항체의

용출물 시료 중 단백질 A 잔류물의 비교

이들 실험의 목적은 낮은 pI 항체 (pI 6.5-7.5)와 MabSelect (단일점 부착 rProtein A 매트릭스)를 사용한 이들 결과를 확인하고, Miles 특허 방법과 비결합 Q-Sepharose 방법 (상이한 평형/적재 완충 용액 사용)을 직접 비교하는 것이었다. NSO 세포로부터 수획한 6A1 항체 및 항체의 발현 및 수획을 위한 각각의 세포 배양 방법을 기재하며, 하기 실험 7절에서 보다 자세히 언급한다.

적용 방법:

6A1 항체 (pI 6.5-7.5)의 정제에는 MabSelect 단백질 A 단계 및 이어지는 Q-Sepharose 음이온 교환 크로마토그래피 (비결합), 또는 DEAE Sepharose 크로마토그래피 (결합) 단계로 이루어진 2개의 크로마토그래피 단계가 포함되었다.

MabSelect 단백질 A 크로마토그래피:

컬럼 매트릭스: Mab Select 재조합 단백질 A (단일점 부착 rPA)

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 15 cm 베드 높이

컬럼 부피: 30 mL

작동 유속: 500 cm/hr (16.80 mL/min)

세척: 6 M 구아니딘 HCL (2 컬럼 부피)

적재 용량: 35 mg/매트릭스 ml

평형: 5O mM 글리신/글리시네이트 pH 8.0/25O mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 5O mM 글리신/글리시네이트 pH 8.0/25O mM NaCl (8 컬럼 부피)

용출 완충 용액: 10O mM 글리신 pH 3.50 (6 컬럼 부피)

세척: 10O mM 시트르산 pH 2.1 (2 컬럼 부피)

6A1 항체 함유 배양 상층액을 AKTA FPLC 시스템이 연결된 MabSelect 컬럼 (30 ml) 상에서 정제하였다. 사용 조건은 상기 표에 기재된 바와 같았다. 항체는 0.1 M 글리신 pH 3.5를 사용하여 용출하였다. 용출 이후 용출물 pH를 7.0으로 조절하고, 이후 용출 시료를 5개의 분취액으로 나누었다; 각 분취액을 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 상이한 완충 용액으로 투석 여과하였다.

Q-Sepharose 크로마토그래피 제 1 실시를 위해 50 mM 트리스HCl pH 8/75 mM NaCl로 제 1 분취액을 투석 여과하였다. Q-Sepharose 크로마토그래피 제 2 실시를 위해 50 mM 트리스HCl pH 8/100 mM NaCl로 제 2 분취액을 투석 여과하였다. Q-Sepharose 크로마토그래피 제 3 실시를 위해 2O mM 인산나트륨 pH 6.5/80 mM NaCl로 제 3 분취액을 투석 여과하였다. 제 4 및 제 5 분취액은 Miles 특허에 기재된 DEAE Sepharose 방법의 결합 평가를 위해 25 mM 트리스HCl pH 8.0/25 mM NaCl로 완충 용액 교환시켰다. 제 4 및 제 5 실시 간의 차이는, 제 4 실시에서는 주요 피크가 하나의 분획으로 수획되어 분석 이전에 표준 인산 완충 식염수로 투석 여과한 반면, 제 5 실시에서는 용출 피크가 분획되어 Miles 특허에 기재된 바에 따라 제조된 인산 완충 용액으로 투석하였다는 점이다.

5개의 컬럼 실시 각각에 대한 조건은 하기하는 바와 같다:

Q- Sepharose 크로마토그래피: 제 1 실시

컬럼 매트릭스: Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 베드 높이

컬럼 부피: 16 mL

컬럼 제조: 0.1 M 수산화나트륨 내에 150 cm/hr로 충전됨

작동 유속: 100 cm/hr (3.35 mL/min)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 15 mg/매트릭스 ml

평형: 5O mM 트리스HCl pH 8.0/75 mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 5O mM 트리스HCl pH 8.0/75 mM NaCl (5 컬럼 부피)

스트립 완충 용액: 2 M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

Q- Sepharose 크로마토그래피: 제 2 실시

컬럼 매트릭스: Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 베드 높이

컬럼 부피: 16 mL

컬럼 제조: 0.1 M 수산화나트륨 내에 150 cm/hr로 충전됨

작동 유속: 100 cm/hr (3.35 mL/min)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 7.5 mg/매트릭스 ml

평형: 5O mM 트리스HCl pH 8.0/10O mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 5O mM 트리스HCl pH 8.0/10O mM NaCl (5 컬럼 부피)

스트립 완충 용액: 2 M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

Q- Sepharose 크로마토그래피: 제 3 실시

컬럼 매트릭스: Q-Sepharose Fast Flow

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 베드 높이

컬럼 부피: 16 mL

컬럼 제조: 0.1 M 수산화나트륨 내에 150 cm/hr로 충전됨

작동 유속: 100 cm/hr (3.35 mL/min)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 7.5 mg/매트릭스 ml

평형: 2O mM 인산 나트륨 pH 6.5/8O mM NaCl

적재 후 세척: 2O mM 인산 나트륨 pH 6.5/8O mM NaCl (5 컬럼 부피)

스트립 완충 용액: 2 M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

DEAE Sepharose : 제 4 실시

컬럼 매트릭스: DEAE Sepharose (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 베드 높이

컬럼 부피: 16 mL

컬럼 제조: 평형 완충 용액 내에 150 cm/hr로 충전됨

작동 유속: 100 cm/hr (3.35 mL/min)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 7.5 mg/매트릭스 ml

평형: 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (5 컬럼 부피)

용출 완충 용액: 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl에 대한 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25O mM NaCl (10 컬럼 부피)

세척: 2 M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)

DEAE Sepharose 결합 방법; 제 5 실시 ( Miles 방법)

컬럼 매트릭스: DEAE Sepharose

컬럼 크기: 1.6 cm 내부 직경 x 8 cm 베드 높이

컬럼 부피: 16 mL

컬럼 제조: 평형 완충 용액 내에 150 cm/hr로 충전됨

작동 유속: 100 cm/hr (3.35 mL/min)

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 7.5 mg/매트릭스 ml

평형: 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 25 mM 트리스HCl pH 8.6/25 mM NaCl (5 컬럼 부피)

세척: 2 M 염화 나트륨 (2 컬럼 부피)

본 연구에 사용한 상이한 완충 용액의 특성들은 표 3에 제시되어 있다.

5 개의 이온 교환 실시로부터 생성된 용출물 시료를, rPA ELISA에서 단백질 A 수준에 대해 분석하였다. 그 결과는 표 4에 제시되어 있다.

[표 3]

본 연구에 사용된 완충 용액

^*구배 용출 완충 용액

DEAE-Sepharose 제 5 실시 (Miles 방법)의 용출 계수에 해당하는 분획들을 수합하여 rProtein A ELISA로 분석하였다; 결과는 표 5에 제시되어 있다.

[표 4]

rProtein A ELISA 결과: ^* 표에서, CV's는 컬럼 부피를 의미함

[표 5]

결합 방식 DEAE - Sepharose 분리 ( Miles 방법) 시 수득된 용출 피크에 해당하는 용 출물 분획 중 rProtein A의 수준; 제 5 실시

Miles 방법, 표 5: 주요 단백질 및 이에 따라 항체 피크가 용출물의 분획 2-4 (번호의 개시는 임의적임; 상기 분획들은 *로 표시됨) 내에 존재하는 반면, 단백질 A는 급격히 증가하는 피크 내에서 지연되어 용출된다 (#로 표시된 분획); 가장 마지막으로 분획 4 이후 항체 회수를 중단하면 대부분의 응집체를 제거하는 것이나, 2 ng/항체 mg 이하의 단백질 A 오염물의 허용가능한 경계에 합치되는 관점에서 상기 용출물 중에 발견되는 항체는 약 35 %의 손실 비율로 회수되지 못한다.

반면, 제 1 내지 제 3 실시의 비결합 방법은 단백질 A 함량 기준 면에서 우수한 항체 회수를 가능하게 하였다. 비결합 방법은 항상, 피크 모양의 임의의 특징적인 변형 없이 기존의 결합 방법으로 수득 가능한 뚜렷한 항체 단백질 피크를 나타내었다. 물론 적재 부피는 훨씬 큰 공극 부피로 인해 항체 시료가 이동하여 교환체 컬럼으로부터 흘러내게 할 정도로 충분하지는 않음에 유의해야 한다. 따라서 적재의 뒤를 잇는 이동상 공급은 또한 상기 실험 계획에서 본 비결합 방법을 위한 '적재 후 세척'으로 표시된다. 상기 컬럼을 통해 앞서 이동하는 적재 완충 용액과 더불어, 이는 컬럼 공극 부피를 고려하여, 항체 생성물 피크가 포함되는 컬럼으로부터 수합되는 플로우-스루를 생성한다. 따라서 생성물 단백질 피크를 수합하기 이전에, 생성물 단백질을 절대 포함하지 않을 컬럼 1 부피 (평형 완충 용액)가 항상 내려오게 될 것이다. 본 발명의 방법은 용출 완충 용액을 필요로 하지 않으며, 용어의 유사성에도 불구하고 본 발명의 비결합 방법에 있어 및 제 1 내지 제 3 실시에 예시된 바와 같이, 상기 적재 후 세척은 항체 또는 생성물 단백질의 정적 결합을 여전히 허용하지 않음이 자명한데, 이는 Miles에 따른 적재 후 완충 용액 조건과 대조를 이룬다; 이론상으로는, 본 발명의 방법에서 적재 후 세척 완충 용액은 상기 비결합 조건 요건이 유지되는 한 적재 완충 용액과 다를 수도 있으나 그로 인한 이점이 추가되지 않음은 물론일 것이다. 여전히 상기 모든 완충 용액은 컬럼 통과 이후 플로우-스루의 수합을 발생시킬 것이다. 따라서 제 1 내지 제 3 실시에서, 단순성을 위해 적재 완충 용액 및 적재 후 세척 완충 용액은 동일하다. 제 1 내지 제 3 실시에서, 대개 항체 피크는 약 1 내지 2 컬럼 공극 부피, 보통은 약 1.5 컬럼 부피에서 플로우-스루 방법으로 내려왔다. 그러나 약 2 내지 3 컬럼 공극 부피에서 플로우-스루 중 생성물 피크의 '용출'을 생성하였던 비결합 조건 하에서도 (데이터는 제시하지 않음) 여전히 피크의 확대 또는 끌림은 관찰되지 않았으며, 이는 비결합 조건이 일정하게 작동되었음을 시사하는 것이다. 본 발명의 비결합 방법 및 본 단락의 실험 개시의 내용에서, '용출' 부피라고 표지된 용어는 이를 위해 사용되는 것으로서 Miles에 따른 실제 결합-및-용출 작동 방식에 대한 용어에는 반하는 것이다. 본 항체 (6A1; pI 6.5 -7.5)에 대한 최고의 항체 회수율 (85 %)은 20 mM 인산나트륨 pH 6.5 /80 mM NaCl 완충 용액을 사용한 Q-Sepharose 상의 비결합 조건 하에 수득하였다 (제 3 실시에 해당). 제 1 실시 또한 양호한 회수율 (82 %)을 나타내었으나, 본 실시에서의 '용출' 부피는 다소 높았던 반면 항체 단백질 피크의 실질적인 확대는 관찰되지 않았다; 단백당형 분포는 분석되지 않았다. NaCl 농도 증가 (제 2 실시 vs. 제 1 실시)로 인해 rProtein A 제거율은 감소하였고, 따라서 제 3 실시 및 제 1 실시에서 사용한 완충 용액 시스템이 본 항체에 보다 적합하였다. 본 발명자의 이전 관찰사항에 따르면, 제 1 실시에서 사용된 완충 용액 시스템은 높은 pI 항체에 더 적절하며, 제 3 실시에 사용된 것은 중성 또는 약산성 항체에 보다 유용하였다. 제 1 실시의 데이터에 따르면, 훨씬 더 높은 용량 (>30 mg/ml)에서도 본 비결합 방법을 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 비결합 공정은 높은 용량 등이 적용될 수 있음에 따라 Miles 방법의 한 가지 주요 문제, 즉 단백질 A 피크 분획만을 피하고자 하는 목적을 위해 용출물의 분획에 엄격한 주의를 기울여야 할 필요성에서 벗어나 Miles 방법에 비해 대규모 제조를 보다 용이하게 한다; 후자는 혹여 허용 가능하다 하여도 동시에 조합하여 다수의 인자들 (응집체 및 단백질 A 오염물의 역치)이 추가되어야 할 경우 훨씬 더 어려워질 것이다.

제 5 실시 (Miles 방법)의 경우, rProtein A의 분획은 표 5에 제시된 바와 같이 주요 용출 피크에 걸쳐 관찰되었다. 따라서 주의 깊은 분획 수합은 rProtein A의 양호한 제거를 확실하게 하기 위해 필요하다. 이는 회수율 (70 %)에 영향을 끼치며, 이 경우에도 비결합 방법으로 수득된 것과 같은 양호한 제거 는 제공되지 않았다. 따라서 Miles 방법에서는 (단일점 부착 매트릭스에서 통상 수득되는 것과 같이) 매우 높은 누출이 관찰되는 경우 양호한 제거 및 세포주/항체의 높은 회수율을 달성하기가 더 어렵다.

제 5 실시의 데이터는 Miles 특허에서 수득된 결과 및 그에 기재된 조건을 대표하는 것이다.

방법 비교 및 수득된 데이터에 대한 개요는 하기 표 6에 제시되어 있다.

[표 6.1]

항체 정제의 상이한 단계에서의 rProtein A 수준에 대한 요약 ^*

주: rProtein A 수준은 괄호 안에 기재되어 있음 [ ng / mg ]; NSO 클론 세포주의 상층액 모두가 단백질 A의 유사한 오염 수준을 제공하는 것이 아님에 유의.

^*모든 실시예는 음이온 교환체 7.5 mg/ml 적재 하에 실시되었음

표 6.1에서 가장 좌측에 위치한 제 2 실시와 유사하게, 제 1 실시는 적재 용량 15 mg/ml 하에 비결합 방식으로 수행하고 또한 이온 강도를 감소시킨 결과 (표 6.2), 오염 단백질 A이 상당히 제거되었다.

[표 6.2]

Anion Exchange Q-Sepharose를 이용한 상기 우수한 결과는 상이한, 예컨대 높은 pI 항체를 사용하여도 완전히 재현될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

6. 세라믹 Q- HyperD ® F를 음이온 교환체로 사용한 정제

본질적으로, Mab-Select 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출물을 이용한 비결합 음이온 교환 크로마토그래피는 상기 비교 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. Q-HyperD® F (Biosepra 상표의 크로마토그래피 지지체)를 Ciphergen Biosystems Ltd., Guildford, UK로부터 구입하였다. Mab-Select 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 NSO 세포로부터 발현된 pI 8-9 항체의 처리는 실시예 5에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행하였다. 또한 이어서 (제 1 실시 내지 제 3 실시에 대한) 실시예 5에 기재된 바와 같이 본질적으로, 플로우-스루 방식의 Q 음이온 크로마토그래피가 단백질 A 친화도 컬럼 용출물에 적용되었으며, 단 비교 실시를 제외하고는 완충염, 완충 용액 pH 및 전도도의 조건 변화 하에 Q-Sepharose는 Q-Hyper DF (Biosepra®)로 대체되었다. 각각의 조건들은 표 7에 따른 도식에 기재되어 있다; 2 mS/cm 미만, 즉 약 1.26 mS/cm의 매우 낮은 전도도를 적용하는 것은 Sepharose Q 물질로 수득 가능한 것과 동일한 결과를 달성하며 가능한 최대로 오염 단백질 A를 제거하는 면에 있어 탁월한 것으로 입증되었다. 플로우-스루 분획 내 응집체의 테일링 (데이터는 제시되지 않음)도 분석적으로 관찰되었고, 또한 그 정도는 적용된 완충 용액에 의존한다.

이온 교환물질의 기본적인 목적 및 유형에 따라, 완충 용액 정의에 대한 단일의 최선 또는 절충 조건은 주어진 분리 과제에 따라 정의해야 한다. 그러나 대규모 공업 제조에서 세라믹 HyperD 물질은 수명, 내구성 및 압축성 (처리 시간, 유속) 면에서 이점을 제공한다. 따라서 전도도는 상이한 컬럼 물질에 대해 시험 및 최적화되어야 할 매우 중요한 인자이다. 또한 다중 음이온인 DNA의 오염 수준에 전도도가 매우 큰 영향을 끼침에 유의해야 한다. 완충 조건을 적절히 미세 조절함으로써 오염 DNA 및 단백질 A 수준 모두를 동시 연대적으로 최대 정도로 감소시킬 수 있다.

[표 7]

비교: 동일한 항체를 사용하여, Q-Sepharose는 0.4 ng/항체mg을 수득하였고 오염 DNA 수준은 10.9 pg/항체 mg으로 측정되었다; 그러나 Q에 대한 이러한 결과는 매우 상이한 완충 용액으로 달성된 것이었다 (2O mM 트리스HCl/50 mM NaCl, pH 8.00, 측정 결과 6.1 mS/cm의 전도도를 나타냄).

7. 단백질 A 크로마토그래피 이후 응집체 및 단백질 A의 동시 감소를 위한 비결합 방식에서의 이온 교환 크로마토그래피 사용

본 실험의 목적은 비결합 방식에서 작동된 이온 교환 크로마토그래피에 걸친 응집체-단량체 분리를 평가하기 위한 것이었다 (pH 6.5-7.5의 pI를 가지며 클론 세포주 NS0-6A1-Neo로부터 수획된 cB72.3 IgG 항체를 사용하며, 세포주는 글루타민 합성 효소 (GS) 및 네오마이신 선별 마커 및 본성적으로 발현하는 항체를 포함함). 평가를 위해 선택한 매트릭스는 2개의 상이한 완충 조건 하에 실시된 Q-Sepharose 음이온 교환 (Amersham Biosciences)이었다 .

NSO-GS 세포를 배양하고 B72.3 항체를 수획하는 것은 다른 문헌에서 자세히 기재된 바 있다 (cp. WO 03/027300 및 WO 03/064630; 출원인 동일). 생산자 세포주 NS0-6A1은 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 02083031 하에 2002.8.30자로 [European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury/Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom]에 [Andy Racher, Lonza Biologicals, 224 Bath Road, Slough, Berkshire, SL1 4DY, United Kingdom]의 이름으로 코드 '6A1-Neo' 하에 기탁되었다; 상기 주어진 주소는 [Lonza Biologies plc., United Kingdom]의 회사 주소이며, Lonza Biologies plc.에 귀속하는 모든 권리의, 권리를 갖는 위원회에 대하여 위탁이 수행되었다. 이러한 면에서, 현재 개인 주소가 [5 Kingfisher Close, Aldermaston, Reading/Berkshire RG7 4UY, United Kingdom]인 Andy Racher 씨는 임시로 합법적인 기탁자로 간주될 수 있으며, 기탁 서류에 대한 이러한 법적 해석과 관련하여 Racher 씨는 본 출원인, Lonza Biologies plc.에 이의를 보류하지 않고 최종적으로 권한을 부여함으로써 출원 내에 기탁된 물질을 언급하고 이를 공중에게 이용 가능하게 하며 본 출원에 대해 기탁에 대한 일체의 지위를 양도하였다.

마우스-인간 키메릭 항체 cB72.3의 유전자 구조는 [Whittle 등, Protein Eng. 1987,6: 499-505] 및 [Colcher 등, Cancer Research 49, 1738-1745, (1989)]에 기재되어 있다. 또한 NS0-6A1-Neo 세포주로부터 항체가 발현된다. NSO 6A1 항체 (cB72.3)에 대한 정제 공정에는 rmp 단백질 A Sepharose 및 뒤이은 비결합 Q-Sepharose 음이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 2개의 크로마토그래피 단계가 포함된다.

rmp 단백질 A Sepharose 크로마토그래피

컬럼 매트릭스: rmp 단백질 A Sepharose (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.8 cm 내부 직경 x 15 cm 베드 높이

컬럼 부피: 30.1 ml

작동 유속: 150 cm/hr

세척: 6 M 구아니딘 HCl (2 컬럼 부피)

적재 용량: 35 mg/매트릭스 ml

평형: 5O mM 인산나트륨 pH 7.0/250 mM NaCl (8 컬럼 부피)

적재 후 세척: 5O mM 인산나트륨 pH 7.0/250 mM NaCl (8 컬럼 부피)

용출 완충 용액: 0.1 M 글리신/0.1 M NaCl pH 3.0 (6 컬럼 부피)

스트립: 0.1 M 시트르산 pH 2.1 (2 컬럼 부피)

6A1 항체를 포함하는 세포 배양 상층액을 ATKA FPLC 시스템에 연결된 rmp 단백질 A 컬럼 (30 ml) 상에서 정제하였다. 사용한 조건은 상기 표에 기재한 바와 같았다. 항체는 0.1 M 글리신/0.1 M NaCl pH 3.0을 사용하여 용출하였다. 용출에 이어 용출물 pH을 pH 3.7로 조절하고 60 분간 유지한 다음 pH 6.5로 중성화하였다. 2주기를 수행하는 것이 필요하였다. 제 1 주기의 용출물을 25 mg/ml로 농축하고, 완충 용액을 2O mM 인산나트륨/80 mM NaCl pH 6.5로 교환한 다음, 하기의 '제 1 실시'- 용출 조건 하에 Q-Sepharose 컬럼 상에 적재하였다. 제 2 주기의 용출물을 25 mg/ml로 농축하고, 완충 용액을 2O mM 트리스HCl/75 mM NaCl pH 8.0으로 교환한 다음, 하기의 제 2 실시에 기재된 바와 같은 Q-Sepharose 컬럼에 적용하였다.

결합하지 않은 분획 (플로우-스루)에 걸쳐 분획들을 수합하여 겔 투과-HPLC로 분석하였다. 회수 및 용출 부피는 표 1에 제시되어 있다. GP-HPLC 결과는 표2에 제시되어 있다. 응집체 추이는 도 4 및 도 5에 제시되어 있고, 용출 추이는 도 6 및 도 7에 제시되어 있다.

Q- Sepharose 크로마토그래피 제 1 실시:

컬럼 매트릭스: Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.0 cm 내부 직경 x 15 cm 베드 높이

컬럼 부피: 12 ml

작동 유속: 100 cm/hr

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 50 mg/매트릭스 ml

평형: 2O mM 인산나트륨/80 mM NaCl pH 6.5

적재 후 세척: 2O mM 인산 나트륨/80 mM NaCl pH 6.5

스트립: 2O mM 인산 나트륨/2 M NaCl pH 6.5 (2 컬럼 부피)

UV-모니터링된 크로마토그램은 도 6에 제시되어 있다.

Q- Sepharose 크로마토그래피 제 2 실시:

컬럼 매트릭스: Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences)

컬럼 크기: 1.0 cm 내부 직경 x 15 cm 베드 높이

컬럼 부피: 12 ml

작동 유속: 1OO cm/hr

세척: 0.1 M 수산화 나트륨 (2 컬럼 부피)

적재 용량: 50 mg/매트릭스 ml

평형: 2O mM 트리스HCl/75 mM NaCl pH 8.0

적재 후 세척: 2O mM 트리스HCl/75 mM NaCl pH 8.0

스트립: 2O mM 트리스HCl/2 M NaCl pH 8.0 (2 컬럼 부피)

UV-모니터링된 크로마토그램 (260nm 에서의 OD)은 도 7에 제시되어 있다.

겔 투과/크기 배제 크로마토그래피를 위해, 중복 3중 검출 (RALS, 점도계 및 굴절률)을 적용하여, 겔 컬럼으로부터 방출되는 단백질 분획을 검출하였다: 광 산란 검출기는 분자량의 직접적인 측정을 제공하여 컬럼 보정의 필요성을 제거한다. 점도계는 구조 내의 차이를 직접 확인할 수 있도록 해 준다. 또한 전체 분포에 걸쳐 분자량 크기를 측정할 수 있도록 해 준다. 3중 검출의 추가적인 한 가지 이점은 단일의 좁은 표준 및 단일의 넓은 표준을 사용하여 기기 변수를 측정할 수 있다는 것이다. 3중 검출은 '절대' 분자량, 고유의 점도 및 분자 크기를 단일 측정으로 측정한다. 이는 중합체 시료의 분지, 형태, 구조 및 응집에 대한 정보를 제공한다.

크로마토그래피 조건:

용매: 0.2 M 인산나트륨 완충 용액, pH=7.0

유속: 0.7 ml/min

주입 부피: 1OO μl

컬럼/측정기 온도: 29 °C

컬럼: Superdex 200HR

검출기:

시료의 3중 검출 크로마토그램은 검출기 상에서 우수한 신호대잡음비를 나타냈다. 단량체 피크의 재현성은 매우 양호하다. 모든 시료에서 Mw는 140 k-147 k 달톤 정도, 고유 점도 IV~는 0.065-0.079 dl/g, 유압 반경 Rh~는 5.3-5.5 nm, 및 중량 분획은 80-99 %이었다. 제 2 피크는 분자량이 300 k 정도, IV~는 0.08 dl/g, 및 Rh~는 7 nm이고, 이는 2량체의 결과와 일치한다.

도 8 내지 17은 표 2로부터 선택된 분획들의 3중 검출을 대한 2중 GP 크로마토그래피 실시를 나타낸다 (cp. 교차 참조를 위한 농도 데이터).

도 8/분획 1.2 Q-FT-01-F2 농도=3.58 mg/ml

도 9/F.1.5 Q-FT-01-F5 농도=15.5 mg/ml ^*7.75 mg/ml

도 10/F. 1.11 Q-FT-O1-F11 농도=7.41 mg/ml ^*3.71 mg/ml

도 11/F. 1.15 Q-FT-01-F15 농도=1.38 mg/ml

도 12/F. 1.19 Q-FT-01-F19 농도=0.334 mg/ml

도 13/F. 2.2 Q-FT-02-F2 농도=5.9 mg/ml ^*2.95 mg/ml

도 14/F. 2.5 Q-FT-02-F5 농도=15.5 mg/ml ^*7.75 mg/ml

도 15/F. 2.10 Q-FT-02-F10 농도=8.95 mg/ml ^*4.48 mg/ml

도 16/F. 2.20 Q-FT-02-F20 농도=1.57 mg/ml

도 17/F. 2.33 Q-FT-02-F33 농도=0.37 mg/ml

^* 인산 완충 용액으로 1/2 희석.

[표 2] GP - HPLC 분석 결과: 응집체 추이

2O mM 나트륨 인산/8O mM NaCl pH 6.5 및 2O mM 트리스HCl/75 mM NaCl pH 8.0로 완충한 두 Q-Sepharose 실시 모두에서, 응집체 대부분은 꼬리 분획 중에 용출되면서 상대적으로 높은 양의 단량체가 초기 분획 내에 존재하였다. (2O mM 인산나트륨/80 mM NaCl pH 6.5로 완충한) 제 1 실시는 2O mM 트리스HCl/75 mM NaCl pH 8.0로 완충한 제 2 실시에 비해 꼬리 분획 내에 높은 수준의 응집체를 포함하였다. 피크 분획을 피하여 단백질 피크의 적절한 무응집체 분획들은 수합하였다. 상기 무응집체 분획들로부터 수합한 항체는 크기 배제 HPLC에 의해 >99.1 %의 단량체성을 갖는 것으로 나타났다. 수합된 단량체 분획 중 오염 단백질 A의 수준은 선택 및 수합된 분획 중 오염 단백질 A의 수준이 << 1.5 ng/항체 mg으로 측정됨과 동시에 측정된다.

Claims

하기의 단계들을 포함하는 항체, 바람직하게는 IgG 항체의 정제 방법:

1) 단백질 A가 천연 단백질 A 또는 이의 기능성 유도체인 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하고,

2) 오염 단백질 A 또는 이의 기능성 유도체가 이온 교환 물질에 결합하도록 하며 추가로 플로우-스루 내에서 플로우-스루의 분획에 의해 단백질 A 또는 단백질 A 유도체와 복합체를 형성하지 않는 항체 단량체로부터 항체 응집체의 분리를 가능케 하는 조건 하에, 이온 교환 물질 상에 항체 응집체 및 단백질 A 또는 단백질 A 유도체를 포함하는 상기 정제된 항체를 적재하고, 및 추가로

3) 플로우-스루를 분획하고 상기와 같이 이온 교환 물질 상에 적재된 항체의 조성에 비해 단백질 A 또는 단백질 A 유도체의 함량과 항체 응집체의 함량이 모두 감소된 하나 이상의 항체 단량체 분획을 이온 교환체의 플로우-스루로부터 수획함.
제 2 항에 있어서, 단백질 A가 컬럼 물질에 대한 단일점 부착을 허용하도록 가공된 재조합 단백질 A임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 재조합 단백질 A가 이의 아미노산 서열 내에 시스테인을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 시스테인이 재조합 단백질 A의 아미노산 서열 C 말단의 마지막 30개 아미노산으로 이루어진 분절 내에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 재조합 단백질 A가 티오에테르 황 결합을 매개로 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지체 물질에 50% 이상 부착됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 또는 이의 기능성 유도체가 이온 교환체의 플로우-스루 중 < 1 ng/IgG mg의 농도로 감소됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 수획된 항체의 단량체성이 99% 이상으로서 플로우-스루의 항체 피크를 둘 이상의 분획으로 분획하고 꼬리 분획을 버림으로써 달성됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG 항체로서, 이때 IgG 항체가 키메릭 또는 CDR-이식 IgG 항체임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단백질 A 친화도 크 로마토그래피에 의한 항체 정제 이전에 세포 배양으로부터 수획됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 포유류 세포 배양으로부터 수획됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되어야 할 항체가 프로테아제를 불활성화하도록 처리되지 않으며, 바람직하게는 하나 이상의 프로테아제 저해제와 혼합되지 않음을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 저해제가 PMSF, 프로티나아제 저해 펩티드, e-카프로산 및 환원성 설프히드릴 화합물로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
하기의 단계들을 포함하는 생성물 단백질의 정제 방법:

1) 플로우-스루의 분획에 의해 플로우-스루 내에서 바람직하게는 제 2 단백질 리간드와 추가로 복합화되지 않는 생성물 단백질 단량체로부터 생성물 단백질 응집체를 분리 가능하게 하는 조건 하에, 이온 교환 물질 상에 생성물 단백질의 단량체 및 응집형을 포함하는 상기 생성물 단백질을 포함하는 용액을 적재하고, 및 추가로

2) 플로우-스루를 분획한 다음, 정제를 위해 이온 교환 물질 상에 적재한 생성물 단백질의 조성에 비해 생성물 단백질 응집체의 함량이 감소된 하나 이상의 생성물 단백질 단량체 분획을 이온 교환체의 플로우-스루로부터 수획함.
제 13 항에 있어서, 분획이 플로우-스루의 생성물 단백질 피크를 둘 이상의 분획으로 분획하거나 쪼갠 다음 꼬리 분획을 버림으로써 달성되며, 바람직하게는 수획한 항체의 단량체성이 99 % 이상임을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 제 1 분획보다 생성물 단백질의 단량체성의 정도가 낮은 하나 이상의 제 2 분획이 단량체성 평가를 기초로 하여 버려짐을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 이온 교환체의 적재 및 헹굼을 위해 하나 이상의 완충 용액을 사용하며, 이때 이온 교환체로부터 배출되는 하나 이상의 완충 용액이 생성물 단백질 피크를 포함하는 플로우-스루에 포함됨을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 완충 용액의 pH가 정제하고자 하는 생성물 단백질 단량체의 pI 또는 상기 pI±0.5 pH 단위 범위의 평균 pI인 pH로 설정됨을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 완충 용액의 pH가 정제하고자 하는 생성물 단백질 단량체의 pI 또는 평균 pI와 상이한 pH로 설정되며, 이때 pH가, 상기 완충 용액에 노출되거나 침지되는 경우 생성물 단백질 단량체와 이온 교환 물질의 하전된 기들 간의 이온성 인력을 유도하는 표면 전하를 생성물 단백질 단량체에 추가로 부여함을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 양이온 교환체의 경우, 완충 용액의 pH가 정제하고자 하는 생성물 단백질 단량체의 평균 pI 미만의 값으로 설정되며, 바람직하게는 상기 평균 pI의 0.5 내지 3 pH 단위 미만의 값으로 설정됨을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 음이온 교환체의 경우, 완충 용액의 pH가 정제하고자 하는 생성물 단백질 단량체의 평균 pI 초과의 값으로 설정되며, 바람직하게는 상기 평균 pI의 0.5 내지 3 pH 단위 초과의 값으로 설정됨을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 조건들이 이온 교환 물질에 대한 생성물 단백질 단량체의 결합에 관해 비결합 조건인 것으로, 그 결과 이온 교환 물질 상에 적재된 생성물 단백질의 70 % (w/w) 초과, 더욱 바람직하게는 80 % (w/w) 초과가 플로우-스루 내에서 이온 교환 물질로부터 회수될 수 있음을 특징으로 하는 방법.