KR20070041765A - Ｈｉｖ-감염의 예방 및 치료를 위한 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역원성 조성물 및 백신에 유용한 Gag, Pol 및 Nef의 신규한 HIV 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 융합체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Nef 또는 이의 면역원성 단편, 및 p17 Gag 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편을 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편이 존재하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 폴리펩티드는 Pol 또는 RT 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다.

Description

ＨＩＶ-감염의 예방 및 치료를 위한 백신 {VACCINE FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HIV-INFECTION}

본 발명은 신규한 HIV 폴리펩티드 작제물, 이의 의약에서의 용도, 이를 포함하는 약제 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HIV-1 Nef 및 HIV-1 Gag 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 HIV-1 Nef, HIV-1 Pol 및 HIV-1 Gag 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.

HIV-1은 전세계적으로 주요 건강 관련 문제 중 하나로서 간주되는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 주원인이다. HIV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 백신이 필요하다.

HIV-1은 레트로비리디아에(Retroviridiae) 류의 RNA 바이러스이다. HIV 게놈은 하기 세 부류로 나뉘는 9개 이상의 단백질을 엔코딩한다: 주 구조적 단백질인 Gag, Pol 및 Env, 조절성 단백질인 Tat 및 Rev, 및 보조 단백질인 Vpu, Vpr, Vif 및 Nef. HIV 게놈은 모든 레트로바이러스의 5'LTR-gag-pol-env-LTR3' 조직화 를 나타낸다.

HIV 엔벨로프(envelope) 글리코단백질(glycoprotein) gp 120은 숙주 세포에 부착하기 위해 사용되는 바이러스 단백질이다. 이러한 부착은 CD4 및 두개의 케모킨 수용체 CCR-5 또는 CXCR-4 중 어느 하나로서 공지된 헬퍼 T 세포 및 마크로파아지의 두개의 표면 분자에 결합하므로써 매개된다. gp120 단백질은 먼저 보다 큰 전구 분자(gp160)로서 발현되고, 이후, 후번역에 의해 분해되어 gp120 및 gp41을 생성한다. gp120 단백질은 gp41 분자로의 연결에 의해 비리온의 표면 상에 보유되고, 이것이 바이러스 멤브레인에 삽입된다.

gp120 단백질은 항체를 중화시키는 것을 주 목적으로 하지만, 불행하게도 단백질의 최고 면역원성 영역(V3 루프)은 또한 단백질의 최고 가변성 부분이다. 그러므로, 항체의 중화를 유도하기 위한 백신 항원으로서 gp120(또는 이의 전구 gp160)의 사용은 광범위한 보호 백신에 대해서는 사용이 제한된 것으로 여겨진다. 또한, gp120 단백질은 세포독성 T 림프구(CTL)에 의해 인지되는 에피토프를 함유한다. 이러한 이펙터(effector) 세포는 바이러스 감염된 세포를 제거할 수 있으며, 이에 따라 제 2의 주 항바이러스 면역 메카니즘을 구성한다. 항체를 중화시키는 표적 영역과 대조적으로, 일부 CTL 에피토프는 상이한 HIV 스트레인(strain) 중에서 상대적으로 보존되는 것으로 보인다. 이러한 이유로 gp120 및 gp160은 세포 매개된 면역 반응(특히 CTL)을 유도하는 것을 목표로 하는 백신에서 유용한 항원 성분이 될 수 있다.

HIV-1의 비엔벨로프(non-envelope) 단백질은 예를 들어 gag 및 pol 유전자의 생성물과 같은 내부 구조적 단백질 및 Rev, Nef, Vif 및 Tat와 같은 그 밖의 비구조적 단백질을 포함한다[참조: Green et al., New England J. Med, 324, 5, 308 et seq (1991) and Bryant et al. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq (1992)].

HIV NeF는 초기 단백질이다. 즉, 감염시에 초기에, 그리고 구조적 단백질의 부재시에 발현된다.

Nef 유전자는 몇몇 활성을 지니는 것으로 나타난 초기 보조 HIV 단백질을 엔코딩한다. 예를 들어, Nef 단백질은 그 기능의 생물학적 중요성이 검토되고 있지만, 세포 표면으로부터 CD4, HIV 수용체 및 MHC 클래스 I 분자의 하향 조절을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, Nef는 T 세포의 시그널 경로와 상호작용하여 활성 상태를 유도하고, 이에 따라 보다 효과적인 유전자 발현을 조장할 수 있다. 몇몇 HIV 분리물은 이러한 영역에서 변이가 있는데, 이러한 변이는 기능성 단백질을 엔코딩하지 못하도록 하여 생체내 복제 및 발병에 있어서 심각하게 불리하게 된다.

Gag 유전자는 전구 폴리단백질로서 번역되고 이것이 프로테아제로 분해되어 매트릭스 단백질(p17), 캡시드(p24), 누클레오캡시드(p9), p6 및 두개의 스페이스 펩티드인, p2 및 p1을 포함하는 생성물을 형성한다.

Gag 유전자는 비스플라이싱된(unspliced) 바이러스 mRNA로부터 발현되는 p55로 불리우는 55kD Gag 전구 단백질을 야기시킨다. 번역 동안에, p55의 N 말단은 미리스토일화되어(myristolyated), 세포 멤브레인의 세포질과의 결합을 유발시킨다. 멤브레인 결합된 Gag 폴리단백질은 감염된 세포의 표면으로부터 바이러스 입 자의 버딩(budding)을 유발시키는 그 밖의 바이러스 및 세포 단백질과 함께 바이러스 게놈 RNA의 두개의 복사체를 보충한다. 버딩후, p55는 바이러스 성숙의 과정 동안에 바이러스 엔코딩된 프로테아제(pol 유전자의 생성물)에 의해 MA(매트릭스 [p17]), CA(캡시드 [p24]), NC(누클레오티드캡시드[p9]) 및 p6으로 명명되는 4개의 보다 작은 단백질로 분해된다.

3개의 주요 Gag 단백질 이외에, 모든 Gag 전구체는 몇몇 그 밖의 영역을 함유하며, 이들은 분해되어 다양한 크기의 펩티드로서 비리온으로 잔류한다. 이러한 단백질은 상이한 역할을 하는데, 예를 들어, p2 단백질은 프로테아제의 활성을 조절하는 데 있어서 의도한 역할을 하고, 단백질 분해 과정의 올바른 타이밍에 기여한다.

p17(MA) 폴리펩티드는 p55의 N 말단의 미리스토일화된 말단으로부터 유래된다. 대부분의 MA 분자는 비리온 지질 이층의 내부 표면에 부착되어 잔류하여 입자를 안정화시킨다. MA의 서브셋은 비리온의 보다 심층 내측에서 보충되며, 여기에서 착물의 일부가 되어 바이러스 DNA를 핵까지 호위한다. 이러한 MA 분자는, MA에 대한 핵친화성 시그널이 세포 핵 수입기(cellular nuclear import machinery)에 의해 인지되기 때문에 바이러스 게놈의 핵 전달을 용이하게 한다. 이러한 현상은 HIV가 레트로바이러스에 대해 특이적인 특성인 비분할 세포를 감염되게 한다.

p24(CA) 단백질은 바이러스 입자의 원추형 코어를 형성한다. 시클로필린 A는 HIV 입자로의 혼입을 유도하는 p55의 p24 영역과 상호작용하는 것으로 입증되었다. Gag와 시클로필린 A간의 상호작용은 필수적인데, 그 이유는 시클로스포린 A에 의한 이러한 상호작용의 방해가 바이러스 복제를 억제하기 때문이다.

Gag의 NC 영역은 소위 HIV 패키징 시그널을 특이적으로 인식하는 것을 담당한다. 패키징 시그널은 바이러스 RNA의 5'말단 근처에 위치한 4개의 스템 루프(stem loop) 구조로 이루어지며, 이종 RNA의 HIV-1 비리온으로의 혼입을 매개하기에 충분하다. NC는 두개의 징크-핑거 모티프(zinc-finger motif)에 의해 매개되는 상호작용을 통해 패키징 시그널에 결합한다. 또한, NC는 역전사를 용이하게 한다.

p6 폴리펩티드 영역은 p55 Gag과 보조 단백질 Vpr 간의 상호작용을 매개하여 Vpr의 어셈블링 비리온으로의 혼입을 유도한다. 또한, p6 영역은 감염된 세포로부터 버딩 비리온의 효과적인 방출을 위해 요구되는 소위 레이트 도메인(late domain)을 함유한다.

Pol 유전자는 바이러스 DNA의 세포 DNA로의 인테그레이션(integration)에 요구되는 RT 및 인테그라제 단백질인, 초기 감염시에 바이러스에 의해 요구되는 두개의 활성을 함유하는 두개의 단백질을 엔코딩한다. Pol의 일차 생성물은 비리온 프로테아제에 의해 분해되어 DNA 합성에 필요한 활성(RNA 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성 뿐만 아니라 RN아제 H 기능)을 포함하는 아미노 말단 RT 펩티드 및 카르복시 말단 인테그라제 단백질을 생성한다. HIV RT는 카르복시 말단 RN아제 H 도메인이 결여된 분해 생성물(p51) 및 전장 RT(p66)의 헤테로이량체이다.

RT는 레트로바이러스 게놈에 의해 엔코딩된 가장 잘 보존된 단백질 중 하나이다. RT의 두가지 주요 활성은 DNA Pol 및 리보누클레아제 H이다. RT의 DNA Pol 활성은 템플레이트로서 상호교체가능하게 RNA 및 DNA를 사용하고, 유사한 모든 공 지된 DNA 폴리머라제는 다시 DNA 합성을 개시할 수 없지만 프라이머(RAN)로서 작용하는 예비 존재 분자를 필요로 한다.

모든 RT 단백질내 고유의 RN아제 H 활성은 DNA 합성이 진행함에 따라 RNA 게놈 분리를 복제함에 있어서 초기에 중요한 역할을 한다. 모든 RNA-DNA 하이브리드 분자로부터 RNA가 선택적으로 열화된다. 구조적으로, 폴리머라제 및 리보 H는 상기 Pol의 아미노산 2/3을 커버하는 Pol을 지닌 분리된 비중첩 도메인을 점유한다.

p66 촉매적 서브유닛은 5개의 별개의 서브유닛으로 폴딩된다(folded). 이러한 아미노산 말단 23은 RT 활성을 갖는 부분을 지닌다. 이에 대한 카르복시 말단이 RN아제 H 도메인이다.

WO 03/025003은 HIV-1 p17/24 Gag, Nef 및 RT를 엔코딩하는 DNA 작제물을 기술하고 있으며, 여기에서 DNA 서열은 고도로 발현된 사람 유전자를 닮도록 코돈 최적화될 수 있다. 이러한 작제물은 DNA 백신에 유용하다.

다중 HIV 항원을 함유하는 융합 단백질, 예컨대 WO 99/16884에 기술된 바와 같은 Nef-Tat 융합체는 HIV에 대한 백신 후보물질로서 제안되었다. 그러나, 융합 단백질은 직접적으로 생성되는 것이 아니며, 따라서 원시 단백질에 상응하지 않기 때문에 이들을 발현시키는 데 어려움이 있을 수 있다. 전사 수준, 또는 추가의 다운스트림(downstream)에서도 어려움이 있을 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 조성물로 직접 포뮬레이션(formulation)하지 못할 수 있다. 특히, 함께 융합된 다중 항원을 포함하는 HIV 백신에 대한 주 접근방법은 폴리펩티드 융합 단백질보다는 DNA 또는 생벡터(live vector)이다.

본 발명은 HIV 감염 및 AIDS의 예방 및 치료를 위한 백신에 사용하기 위한 신규한 작제물을 제공한다.

일면에서, 본 발명은 Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 Gag 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하며, p17 및 p24 Gag가 존재하는 경우, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 및 면역원성 단편이 존재하는 폴리펩티드를 제공한다.

본원에서 기술된 바와 같은 작제물 및 조성물에 있어서, Nef는 바람직하게는 전장(full-length) Nef이다.

본 발명에 따른 작제물에 있어서, p17 Gag 및 p24 Gag는 바람직하게는 각각 전장 p17 및 p24이다.

일 구체예에서, 폴리펩티드는 p17 및 p24 Gag 둘 모두 또는 이들의 면역원성 단편을 포함한다. 이러한 작제물에 있어서, p24 Gag 성분 및 p17 Gag 성분은 Nef 및/또는 RT 또는 이들의 면역원성 단편 또는 유도체와 같은 하나 이상의 추가의 HIV 항원 또는 면역원성 단편에 의해 분리된다.

다르게는, p17 또는 p24 Gag가 독립적으로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 (i) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드 및 (ii) p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하거나, (i) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드, 및 (ii) p17 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 작제물은 Pol 또는 Pol의 유도체, 예컨대 RT 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 추가로 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 RT의 특정 단편은 RT가 C 말단에서 절두된 단편, 바람직하게는 카르복시 말단 RN아제 H 도메인이 결여되어 있는 말단이다. 카르복시 말단 RN아제 H 도메인이 결여되어 있는 이러한 단편 중 하나는 본원에 기술된 p51 단편이다.

바람직하게는, 본원에 기술된 융합 단백질에서 RT 또는 면역원성 단편은 p66RT 또는 p51 RT이다.

본 발명에 따른 융합 단백질 또는 조성물의 RT 성분은 592 위치에서의 변이, 또는 HXB2 이외의 스트레인에서의 동등한 변이를 포함하거나 포함하지 않아, 메티오닌이 또 다른 잔기, 예컨대 리신으로 변이되므로써 제거된다. 이러한 변이의 목적은 원핵 발현 시스템에서 내부 개시 자리로서 작용하는 자리를 제거하는 것이다.

RT 성분 또한, 또는 다르게는, 효소 활성(역전사효소)을 제거하기 위한 변이를 포함한다. 따라서, K231이 W 대신에 존재할 수 있다.

p24 및 RT를 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, p24가 작제물에서 RT에 선행하는 것이 바람직할 수 있는 데, 그 이유는 항원이 E.coli 에서 단독으로 발현되는 경우에, RT에 비해 p24의 발현이 보다 양호하게 관찰되기 때문이다.

본 발명에 따른 바람직한 작제물은 하기를 포함한다:

1. P24-RT-Nef-pl7

2. p24-RT*-Nef-pl7

3. p24-p51RT-Nef-pl7

4. p24-p51RT*-Nef-pl7

5. pl7-p51RT-Nef

6. pl7-p51RT*-Nef

7. Nef-pl7

8. 링커를 지닌 Nef-pl7

9. pl7-Nef

10. 링커를 지닌 pl7-Nef

*는 리신으로의 RT 메티오닌₅₉₂ 변이를 나타낸다.

상기 기재된 작제물에 포함되는 링커는 함께 연결되는 두개의 융합 파트너 간의 잠재적 상호작용을 감소시키기 위한 임의의 짧은 아미노산 서열일 수 있다. 링커는 예를 들어 4 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 본원의 실시예에서 기술된 GSGGGP 서열과 같은 6개의 아미노산 서열일 수 있다.

또다른 일면에서, 본 발명은 4개 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편을 포함하는 HIV 항원의 융합 단백질로서, 4개의 항원 또는 단편이 Nef, Pol 및 Gag이거나, 이로부터 유래되는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, Gag는 융합체중 하나 이상의 다른 항원에 의해 분리되는 두개의 별개 성분으로서 존재한다. 바람직하게는, Nef는 전장 Nef이다. 바람직하게는, Pol은 p66 또는 p51RT이다. 바람직하게는, Gag는 p17 및 p24 Gag이다. 본 발명의 일면에서 융합체의 항원 성분의 또 다른 바람직한 특징 및 특성은 본원에서 기술되는 바와 같다.

본 발명의 일면의 바람직한 구체예는 상기 이미 기재된 바와 같은 4성분 융합체이다:

1. P24 - RT - Nef-pl7

2. P24 - RT* - Nef- pl7

3. p24 - p51RT - Nef- pl7

4. p24 - p51RT* - Nef- pl7

본 발명에 포함되는 HIV 항원과 관련하여 용어 "~로부터 유래된" 또는 "유도체"는 항원이 이들 본래의 상대에 대해 제한된 방식으로 변형될 수 있다는 것을 의미한다. 이는 예를 들어 원핵 시스템에서 발현을 증진시키거나 바람직하지 않은 효소 활성을 포함하는 바람직하지 않은 활성을 제거하므로써 단백질의 특성을 변화시킬 수 있는 점 변이를 포함한다. RT에 대해 본원에서 기술된 점 변이는 이러한 것들을 달성하도록 설계된다. 그러나, 항원은 백신에서 바람직할 수 있는 항원성 특성을 보유하고, 이에 따라 원시 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 원시 항원과 충분히 유사하게 잔류해야 한다. 특정 유도체가 이러한 면역 반응을 일으키거나 일으키지 않건 간에, 면역반응은 ELISA(항체 반응에 대해)과 같은 적합한 면역학적 검정 또는 세포 마커 및 사이토킨에 대해 적합한 염색을 사용하는 유세포 분석법(세포 반응에 대해)에 의해 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 HIV 항원의 폴리펩티드 작제물은 E. coli와 같은 원핵 시스템을 포함하는 시험관내 시스템에서 발현될 수 있다. 유리하게는, 이들 작제물은 통상적인 정제 방법에 의해 정제될 수 있다.

본원에서 기술된 융합체는 바람직하게는 선택된 발현 시스템에서 발현되는 경우에 용해될 수 있다. 즉, 이들 융합체는 발현 시스템으로부터 미정제 추출물의 상청액 중에 상당량으로 존재한다. 미정제 추출물 중의 융합 단백질의 존재는 SDS 겔 상에서 수행되는 것, 쿠마시에 염색법 및 농도계측적 측정에 의해 적합한 밴드를 체크하는 것과 같은 통상적인 수단에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 본원의 실시예에 기술된 기법에 의해 측정되어 50% 이상 가용성, 보다 바람직하게는 70% 이상 가용성, 보다 바람직하게는 90% 가용성 이상이다. 재조합에 의해 발현되는 단백질의 용해도를 증진시키기 위한 기술이 공지되어 있으며, 예를 들어 유전자 발현이 유도되는 온도를 낮추므로써 원핵 발현 시스템에서의 용해도가 증진된다.

본원에 기술된 융합 단백질은 정제될 수 있다. 특히, 융합 단백질은 정제될 수 있으나 가용성 또는 상당히 가용성인 채로 잔류할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 면역원성 단편은 항원중 하나 이상의 에피토프를 함유할 것이며, HIV 항원성을 나타내고, 적합한 작제물에 제공되는 경우에, 예컨대 다른 HIV 항원에 융합되거나 담체 상에 제공되는 경우에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 이러한 면역 반응은 원시 항원에 대해 유도된다. 전형적으로, 면역원성 단편은 HIV 항원으로부터 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 보다 바람직하게는 100개 이상의 연속 아미노산을 함유한다.

본 발명은 추가의 일면에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드 백신으로서 사용될 수 있다. 폴리누클레오티드는 플라즈미드 DNA, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템과 같은 핵산 발현 시스템을 포함하여 당업자들에게 공지된 다양한 임의의 전달 시스템내에 존재할 수 있다. 수많은 유전자 전달 기술, 예컨대 문헌(Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998) 및 본원에서 인용되는 문헌에 기술된 기술이 당해 널리 공지되어 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현을 위해 필요한 DNA 서열(예컨대 적합한 프로모터 및 터미네이팅 시스널)을 함유한다. 발현 시스템은 바이러스 또는 박테리아와 같은 재조합 생미생물인 경우, 대상 유전자가 생재조합 바이러스 또는 박테리아의 게놈에 삽입될 수 있다. 이러한 생벡터와의 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응 유도를 이끌어낼 것이다. 이러한 목적으로 사용되는 바이러스 및 박테리아는 예를 들면, 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아(vaccinia), 포울폭스(fowlpox), 카나리폭스(canarypox), 변형된 폭스바이러스(예를 들어, 변형된 바이러스 안카라(Modified Virus Ankara:(MVA)), 알파바이러스(alphaviruses) (신드비스 바이러스(Sindbis virus), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest Virus), 베네주엘리안 에퀸 뇌염 바이러스(Venezuelian Equine Encephalitis Virus), 플라비바이러스(flaviviruses) (황색열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)), 아데노바이러스(adenoviruses), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 피코르나바이러스(picornaviruses) (폴리오바이러스(poliovirus), 리노바이러스(rhinovirus)), 헤르페스바이러스(herpesviruses) (바리셀라 조스터 바이러스(varicella zoster virus) 등), 모르빌리바이러스(예컨대, 홍역), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella) , 시겔라(Shigella), 네이세리아(Neisseria), BCG가 있다. 이들 바이러스 및 박테리아는 악성일 수 있으며, 즉 생 백신을 얻기 위해서는 다양한 방식으로 약화될 수 있다. 또한, 이러한 생 백신은 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명에 따른 생벡터로서 사용하기 위한 바람직한 홍역 벡터는 슈워츠 스트레인(Schwartz strain) 또는 이로부터 유래된 스트레인이다.

생벡터로서 사용하기 위한 바람직한 아데노바이러스는 저혈청우세(low sero-prevalent) 사람 아데노바이러스, 예컨대 Ad5 또는 Ad35 또는 비사람 기원 아데노바이러스, 예컨대 비사람 영장류 아데노바이러스, 예컨대 원숭이 아데노바이러스이다. 이러한 저혈청우세 사람 또는 유사 아데노바이러스는 모집단에서 60% 미만, 전형적으로는 50% 미만의 혈청우세일 것이다. 바람직하게는, 이러한 벡터는 복제 결여성이다. 일반적으로, 이러한 바이러스는 E1 결손을 함유하고, E1 유전자로 형질변환된 세포주 상에서 성장될 수 있다. 바람직한 원숭이 아데노바이러스는 침팬지로부터 분리된 바이러스이다. 특히, C68(또한, Pan9로서 공지됨)(미국 특허 6083 716 참조) 및 Pan 5, 6 및 Pan 7(WO 03/046124)가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 이러한 벡터가 조작되어 본 발명에 따른 이종 폴리누클레오티드에 삽입되므로써 본 발명에 따른 폴리펩티드가 발현될 것이다. 이러한 재조합 아데노바이러스의 용도, 포뮬레이션 및 제조는 WO 03/046142에 자세히 기술되어 있다.

따라서, 본 발명에 따른 바람직한 백신의 Nef, p17 및 p24, 및 RT는 바람직한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 선택된 발현 시스템에서 엔코딩된 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. HIV 항원 중 하나 이상이, 예를 들어 RT가 폴리누클레오티드에서 코돈 최적화된 서열에 의해, 즉 E.coli와 같은 선택된 재조합 발현 시스템에서 발현을 위해 최적화된 서열에 의해 엔코딩될 수 있다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 p51 RT 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 이를 엔코딩하는, 바람직하게는 적합한 발현 시스템, 특히 E.coli와 같은 원핵 시스템에서 발현을 위해 코돈 최적화된 폴리누클레오티드를 제공한다.

p51 RT 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드는 단독으로 사용되거나, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 작제물과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 일면에서, 본 발명은 (i) Nef 또는 Nef 에피토프를 함유하는 단편 및 p17 Gag 및/또는 p24 Gag를 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편이 존재하는 폴리펩티드 및 (ii) p51 RT 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 이들을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다.

이러한 구체예에 따르면, (i)은, 예를 들어

1. Nef-pl7

2. 링커를 지닌 Nef- p17

3. p17 - Nef

4. 링커를 지닌 p17 - Nef로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, Nef는 전장 Nef이다. 바람직하게는, pl7는 전장 pl7이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 다른 항원 또는 다른 항원을 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 결합될 수 있다. 특히, 이는 HIV env 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. env의 바람직한 형태는 gp120, gp140 및 gp160이다. env는 예를 들어 R2로서 공지된 HIV-1 클레드 B 엔벨로프 클론으로부터의 WO 00/07631에 기술된 엔벨로프 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 HIV env 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체와 함께 본 발명에 따른 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성을 포함하는 조성물을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드(들)을 엔코딩하는 폴리누클레오티드(들) 및 HIV env 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기술된 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 적합한 발현 시스템, 특히 E.coli와 같은 원핵 시스템에서 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 발현은 저온, 즉 37℃ 미만의 온도에서 유도되어 폴리펩티드의 용해도를 촉진시킨다.

본 발명은 추가로 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서,

i). 비정제된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고,

ii). 조성물을 2개 이상의 크로마토그래피 단계로 처리하고,

iii) 임의적으로 폴리펩티드를 카르복시아미드화시키고,

iv) 완충액 교체 단계를 수행하여 약제 포뮬레이션을 위한 적합한 완충액 중에 단백질을 제공하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

상기 카르복시아미드화는 두개의 크로마토그래피 단계 사이에서 수행될 수 있다. 카르복시아미드화 단계는 요오도아세트이미드를 사용하여 수행될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은 두개 이하의 크로마그래피 단계를 사용한다.

본 발명은 추가로 약제학적으로 허용되는 애주번트 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 포함하는 약제 조성물 및 면역원성 조성물 및 백신을 제공한다.

본 발명에 따른 백신은 HIV에 대한 예방적 또는 치료적 면역화에 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로 HIV에 대한 예방적 또는 치료적 면역화를 위한 백신의 제조시에 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물 및 폴리누클레오티드 및 폴리누클레오티드 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 백신은 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 항원의 면역보호적 또는 면역치료적 양을 함유할 것이며, 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.

백신 제조는 일반적으로 문헌(New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978)에 기술되어 있다. 리포좀내 캡슐화는 예를 들어, 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 기술되어 있다. 단백질의 마크로분자로의 컨쥬게이션은 예를 들어 리크하이트(Likhite)의 미국 특허 제 4,372,945호 및 아르모르(Armor) 등의 미국 특허 제 4,474,757호에 기술되어 있다.

백신 용량에 있어서 단백질의 양은 일반적인 백신에 명백한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 어떠한 특이적 면역원이 사용되는 지와 선택된 백신화 섭생법에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 각각의 용량은 1 내지 1000㎍의 각각의 단백질, 바람직하게는 2 내지 200㎍, 매우 바람직하게는 4 내지 40㎍의 폴리펩티드 융합체를 포함할 것으로 예상된다. 특정 백신에 대한 최적의 양은 항체 역가 및 피검체의 다른 면역 반응의 관찰을 포함하여 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신화 이후, 피검체는 약 4주후에 부스트(boost)를 수용하고 이후 2차 부스터 면역화될 수 있다.

본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명의 백신 포뮬레이션에서 애주번트첨가된다. 애주번트는 일반적으로 문헌(Vaccine Design - Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995)에 기술되어 있다.

적합한 애주번트로는 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄이 포함되나 또한 칼슘, 철 또는 아연의 염이거나, 아크릴화된 티로신, 또는 아크릴화된 당, 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.

본 발명의 포뮬레이션에 있어서, 애주번트 조성물은 우선적 Th1 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 그러나, 그 밖의 체액 반응을 포함하는 그 밖의 반응도 배제되지 않는 것으로 이해해야 할 것이다.

면역 반응은 항원과 면역 시스템의 세포와의 상호작용을 통해 항원에 대해 생성된다. 형성된 면역 반응은 광범위하게는 두개의 극명한 카테고리로서 체액 또는 세포 매개된 면역 반응(전통적으로 각각 항체 및 세포 이펙터 보호 메카니즘에 의해 특징됨)으로 구분될 수 있다. 이러한 반응 카테고리는 Th1 타입 반응(세포 매개된 반응) 및 Th2 타입 면역 반응(체액 반응)으로 명명되어 있다.

극명한 Th1 타입 면역 반응은 항원 특이적인 할로타입 제한된 세포독성 T 림프구의 생성 및 천연 치사 세포 반응에 의해 특징될 수 있다. 마우스에서 Th1 타입 반응은 IgG2a 서브타입의 항체의 생성에 의해 특징되지만, 이는 사람에서는 IgG1 타입 항체에 상응한다. Th2 타입 면역 반응은 마우스에서 IgG1, IgA 및 IgM을 포함하는 광범위한 범위의 면역글로불린 이소타입의 생성에 의해 특징된다.

이러한 두가지 타입의 면역 반응의 진행 배후의 구동력은 면역 시스템의 세포를 도와주고, 궁극적으로 면역 반응을 Th1 또는 Th2 반응 중 어느 하나에 대해 조정하는 역할을 하는 다수의 확인된 단백질 메신저인 시토킨인 것으로 간주될 수 있다. 따라서, Th1 타입 시토킨의 높은 수준은 설정된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 유리하게 하는 경향이 있지만, Th2 타입 시토킨의 높은 수준은 항원에 대한 체액 면역 반응의 유도를 유리하게 하는 경향이 있다.

Th1 및 Th2 타입 면역 반응의 구별이 절대적인 것은 아님을 기억하는 것이 중요하다. 사실상, 개체는 Th1이 우세한 것으로, 또는 Th2가 우세한 것으로 기술된 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Mosmann) 및 코프만(Coffman)에 의한 뮤린 CD4+ve T 세포 클론에서 기술된 것에 비추어 시토킨의 패밀리를 고려하는 것이 종종 편리하다[참조: Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) THl and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p 145-173]. 전통적으로, Th1 타입 반응은 T 림프구에 의한 IL-2 시토킨 및 INF-γ의 생성과 관련된다. Th1 타입 면역 반응의 유도와 흔히 직접적으로 관련된 다른 시토킨은 IL-12와 같은 T 세포에 의해서는 생성되지 않는다. 대조적으로, Th2 타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 종양 괴사 인자-β(TNF-β)의 분비와 관련된다.

특정 백신 애주번트는 Th1 또는 Th2 타입 시토킨 반응의 자극에 특히 적합한 것으로 공지되어 있다. 전통적으로, 백신화 또는 감염 후 면역 반응의 Th1:Th2 조화에 대한 최상의 인디케이터(indicator)로는, 항원에 의한 재자극 후 시험관내 T 림프구에 의한 Th1 또는 Th2 시토킨 생성의 직접적인 측정, 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2 비의 측정이 포함된다.

따라서, Th1 타입 애주번트는 분리된 T 세포 집단을 자극하여 시험관내 항원으로 재자극되는 경우 Th1 타입 시토킨의 높은 수준을 생성하고, Th1 타입 이소타입과 관련된 항원 특이적 면역글로불린 반응을 유도한다.

포뮬레이션되어 본 발명에 사용하기 적합한 애주번트를 생성할 수 있는 바람직한 Th1 타입 면역자극물질은 하기를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 모노포스포릴 지질 A, 특히, 3-데-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이 본 발명에 사용하기에 바람직한 Th1 타입 면역자극물질이다. 3D-MPL은 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem, Montana)사에 의해 제조된 널리 공지된 애주번트이다. 화학적으로는, 흔히 4,5 또는 6 아실화된 사슬과의 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물로서 공급된다. GB 2122204B에 교시된 방법에 의해 정제되고 제조될 수 있으며, 또한 이 문헌은 디포스포릴 지질 A, 및 이의 3-O-탈아실화된 변이형을 개시하고 있다. 그 밖의 정제된 합성 리포폴리사카라이드가 개시되어 있다[참조: US 6,005,099 및 EP 0 729 473 Bl ; Hilgers et al, 1986, Int. Arch. Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al, 1987, Immunology, 60(l):141-6; and EP 0 549 074 Bl]. 3D-MPL의 바람직한 형태는 직경이 0.2㎛ 미만의 작은 입자 크기를 갖는 미립 포뮬레이션의 형태로 존재하며, 이의 제조 방법은 EP 0 689 454에 기술되어 있다.

또한, 사포닌은 본 발명에 따른 바람직한 Th1 면역자극물질이다. 사포닌은 널리 공지된 애주번트이며 문헌(Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)에 교시되어 있다. 예를 들어, 쿠일(Quil) A (남아메리카목 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 목피로부터 유래됨), 및 이의 분획은 US 5,057,540 및 문헌("Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55); 및 EP 0 362 279 Bl에 개시되어 있다. 용혈성 사포닌 QS21 및 QS17(쿠일 A의 HPLC 정제된 단편)이 효능있는 전신 애주번트로서 개시되어 있으며, 이들의 제조 방법은 US 미국 제 5,057,540호 및 EP 0 362 279 Bl에 개시되어 있다. 또한, 전신 백신을 위한 효능있는 애주번트로서 작용하는 QS7(쿠일-A의 비용혈성 단편)의 용도가 상기 문헌에 개시되어 있다. QS21의 용도는 추가로 문헌(Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437))에 개시되어 있다. QS21와 폴리소르베이트 또는 시클로덱스트린의 조합은 또한 공지되어 있다(WO 99/10008). QS21 및 QS7와 같은 쿠일 A의 분획을 포함하는 미립 애주번트 시스템이 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 개시되어 있다. 이러한 시스템은 이스콘(Iscorn)으로서 공지되어 있으며, 하나 이상의 사포닌을 함유할 수 있다.

또 다른 바람직한 면역자극물질은 비메틸화된 CpG 디누클레오티드("CpG")를 함유하는 면역자극성 올리고누클레오티드이다. CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아노신 디누클레오티드 모티프의 약어이다. CpG는 전신 경로 및 점막 경로 둘 모두에 의해 투여되는 경우에 애주번트인 것으로 당해 공지되어 있다[참조: WO 96/02555, EP 468520, Davis et al, J.Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6]. 전통적으로, BCG의 DNA 분획은 항종양 효과를 발휘할 수 있는 것으로 관찰되었다. 추가의 연구에서, BCG 유전자 서열로부터 유래된 합성 올리고누클레오티드는 면역자극 효과를 유발시킬 수 있는 것으로 나타났다(시험관내 및 생체내 둘 모두에서). 이러한 연구의 연구자들은 중심 CG 모티프를 포함하는 특정 회문식 서열이 이러한 활성을 지니는 것으로 결론내렸다. 면역자극화에서 CG 모티브의 중심적인 역할은 문헌(Krieg, Nature 374, p546 1995)에 의해 후에 규명되었다. 자세한 분석에서, CG 모티프가 특정 서열 컨택스트(context)로 존재하고, 이러한 서열은 박테리아 DNA에서 통상적이나 척추동물 DNA에서는 드문 것으로 나타났다. 면역자극성 서열은 흔히 푸린, 푸린, C, G, 피리미딘이며, 여기에서 CG 모티프는 메틸화되지 않으나, 그 밖의 메틸화되지 않은 CpG 서열이 면역자극성인 것으로 공지되어 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다.

6개의 누클레오티드의 특정 조합에서, 회문식 서열이 존재한다. 이러한 모티프중 몇몇은 하나의 모티프의 반복이거나 상이한 모티프의 조합으로서 동일한 올리고누클레오티드에 존재할 수 있다. 하나 이상의 이러한 면역조절 서열을 함유하는 올리고누클레오티드의 존재는 천연 치사 세포(인터페론 γ를 생성하고 세포분해 활성을 지니는)를 포함하는 다양한 면역 서스셋 및 마크로파지(Wooldrige et al Vol 89(no. 8), 1977)를 활성화시킨다. 그 밖의 이러한 컨센서스 서열을 지니지 않는 그 밖의 비메틸화 CpG 함유 서열이 또한 면역조절성인 것으로 나타났다.

백신으로 포뮬레이션되는 경우 CpG는 일반적으로 유리 항원과 함께 유리 용액으로 투여되거나(WO 96/02555; 상기 McCluskie and Davis), 항원에 공유적으로 컨쥬게이트되거나(WO 98/16247), 수산화알루미늄(간염 표면 항원)과 같은 담체와 함께 포뮬레이션된다[참조: 상기 Davis et al.; Brazolot-Millan et al, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8].

상기 기술된 바와 같은 이러한 면역자극물질은 예를 들어, 리포좀 수중유 에멀젼 및/또는 알루미늄 염(예컨대 수산화알루미늄)을 포함하는 금속 염과 같은 담체와 함께 포뮬레이션될 수 있다. 예를 들어, 3D-MPL은 수산화알루미늄(EP 0 689 454) 또는 수중유 에멀젼 (WO 95/17210)과 함께 포뮬레이션될 수 있으며; QS21 는 유리하게는 콜레스테롤 함유 리포좀(WO 96/33739), 수중유 에멀젼(WO 95/17210) 또는 알룸(alum) (WO 98/15287)과 함께 포뮬레이션될 수 있으며; CpG는 알룸(상기 Davis 등; 상기 Brazolot-Millan)과 함께 또는 그 밖의 양이온성 담체와 함께 포뮬레이션될 수 있다.

또한, 면역자극물질의 조합이 바람직한데, 특히 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합(WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), 보다 특히 WO 94/00153에 개시된 바와 같은 QS21와 3D-MPL의 조합이 바람직하다. 다르게는, CpG와 QS21과 같은 사포닌의 조합은 또한 본 발명에 사용하기 위한 효능있는 애주번트를 형성한다. 다르게는, 사포닌은 리포좀으로 또는 이스콘(Iscorn)으로 포뮬레이션될 수 있으며, 면역조절성 올리고누클레오티드와 조합될 수 있다.

따라서, 적합한 애주번트 시스템은 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3D-MPL과 알루미늄 염과의 조합을 포함한다. 개선된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합, 특히 WO 94/00153에 기술된 바와 같이 QS21과 3D-MPL의 조합을 포함하거나, QS21이 WO 96/33739에서 기술된 바와 같이 콜레스테롤 함유 리포좀(DQ)에 켄칭되는 덜 반응생성적인 조성물을 포함한다. 이러한 조합은 추가로 면역조절성 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다.

수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL과 토코페놀을 포함하는 특히 효능있는 애주번트 포뮬레이션이 WO 95/17210에 개시되어 있으며, 이것은 본 발명에 사용하기에 바람직한 또 다른 포뮬레이션이다.

또 다른 바람직한 포뮬레이션은 CpG 올리고누클레오티드를 단독으로, 또는 알루미늄 염과 함께 포함한다.

본 발명의 추가의 일면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 백신의 제조 방법으로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 적합한 애주번트와 혼합하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 포뮬레이션에 사용하기 위한 특히 바람직한 애주번트 조합은 하기와 같다:

i) 3D-MPL + 리포좀 중의 QS21

ii) 알룸 + 3D-MPL

iii) 알룸 + 리포좀 중의 QS21 + 3D-MPL

iv) 알룸 + CpG

v) 3D-MPL + QS21 + 수중유 에멀젼

vi) CpG

약제 조성물의 투여는 하나의 개별적인 용량보다는 하나 이상의 형태, 예를 들어 동일한 폴리펩티드 함유 조성물의 반복 용량을 취하거나 이종 "프라임-부스트(prime-boost)" 백신 섭생법으로 이루어질 수 있다. 이종 프라임 -부스트 섭생법은 각각이 그 자체로 두개 이상의 투여법을 포함할 수 있는 프라임 및 부스트로 상이한 형태의 백신을 투여하는 것을 사용한다. 동일한 형태의 항원이 필수적인 것은 아니지만, 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물은 보통 하나 이상의 항원을 가질 것이며, 동일한 항원의 상이한 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 프라임 부스트 면역화는 단백질과 DNA 기재 포뮬레이션의 조합물에 의해 수행될 수 있다. 이러한 전략은 광범위한 면역 반응을 유발시키는 데 효과적인 것으로 간주된다. 애주번트 첨가된 단백질 백신은 주로 항체 및 T 헬퍼 면역 반응을 유발하는 반면, 플라즈미드 또는 생벡터로서 DNA의 전달은 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유발한다. 따라서, 단백질과 DNA 백신화의 조합은 광범위하게 다양한 면역 반응에 대비할 것이다. 이는 특히 HIV의 컨텍스트와 관련되는 데, 그 이유는 항체 및 CTL 둘 모두를 중화하는 것이 HIV에 대해 면역 방어에 대해 중요한 것으로 간주되기 때문이다.

본 발명에 따르면, 백신화에 대한 스케쥴은 폴리펩티드 항원 및 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 연속적인 ("프라임-부스트") 또는 동시 투여를 포함할 수 있다. 상기 DNA는 플라즈미드 DNA와 같은 네이키드(naked) DNA로서, 또는 예컨대 폭스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터 또는 임의의 다른 적합한 생 벡터와 같은 재조합 생 벡터의 형태로 전달될 수 있다. 단백질 항원이 1회 또는 수회 주입된 후에, 1회 이상의 DNA 투여가 수행되거나, DNA가 먼저 1회 이상의 투여로 사용된 후 1회 이상의 단백질 면역화가 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 프라임-부스트 면역화의 특정예는 변형된 폭스바이러스 벡터, 예를 들어, 변형된 바이러스 앙카라(MVA) 또는 알파바이러스, 예를 들어 베네주엘리안 에퀸 뇌염 바이러스, 또는 아데노바이러스 벡터, 또는 홍역 바이러스 벡터와 같은 재조합 생 벡터의 형태로 DNA로 프라이밍시키고, 단백질, 바람직하게는 애주번트 첨가된 단백질로 부스팅시키는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명은

a) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 이의 유도체를 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편 또는 유도체가 존재하는 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물; 및

b) 하나 이상의 Nef 및 Gag, 또는 a)의 폴리펩티드에 존재하는 Nef 또는 Gag 에피토프를 함유하는 Nef 또는 Gag의 면역원성 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.

바람직하게는, a)의 폴리펩티드는 RT 또는 p51RT와 같은 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함한다.

다른 구체예에서, 약제학적 키트는

a) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 이의 유도체를 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편 또는 유도체가 존재하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물; 및

b) 하나 이상의 Nef 및 Gag, 또는 a)의 폴리펩티드에 존재하는 Nef 또는 Gag 에피토프를 함유하는 Nef 또는 Gag의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.

바람직하게는, a)의 폴리누클레오티드는, 추가로 RT 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체, 예컨대 p51RT를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다.

본 발명에 따른 프라임/부스트 키트에 사용하기에 바람직한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드이다. 따라서, 단백질/DNA 타입 프라임 부스트 방법의 단백질 성분은 본원에 기술된 임의의 바람직한 융합 단백질일 수 있다. 유사하게, DNA 성분은 임의의 바람직한 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드일 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같은 p24 - RT - Nef- p17, p24 - RT* - Nef- p17, p24 - p51RT - Nef - p17, p24 - p51RT* - Nef- p17, p17 - p51RT - Nef 또는 p17 - p51RT* - Nef 융합체 또는 임의의 p17-Nef 융합체가 프라임 부스트 키트에 제공될 수 있으며, 여기에서, 프라이밍 조성물은 융합 단백질을 포함하고, 부스팅 조성물은 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나, 프라이밍 조성물은 폴리누클레오티드를 포함하고, 부스팅 조성물은 융합 단백질을 포함한다.

프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물 둘 모두는 하나 이상의 용량으로 전달될 수 있다. 추가로, 초기 프라이밍 및 부스팅 용량은 추가의 용량이 후속될 수 있으며, 후속 용량은 예를 들어 DNA 플라즈미드 프라임/단백질 부스트/추가의 DNA 플라즈미드 용량/추가의 단백질 용량을 초래하도록 교대로 사용될 수 있다.

코돈 최적화는, 폴리누클레오티드 서열이 예를 들어 E.coli와 같은 원핵 시스템과 같은 목적하는 발현 시스템에서 유전자의 코돈 사용과 유사하도록 최적화되는 것을 의미한다. 특히, 서열에서 코돈 사용은 고도로 발현된 E.coli 유전자의 것과 유사하게 최적화된다.

본 발명에 따른 재조합 시스템에서 발현을 위한 코돈 최적화의 목적은 두가지로, 재조합 생성물의 발현 수준을 개선시키는 것과 보다 균질한 발현 생성물이 부여하는 것이다(보다 동종의 발현을 얻음). 개선된 균질성은 절두체(truncate)와 같은 불규칙 발현 생성물이 보다 적게 존재함을 의미한다. E.coli 발현에 적합한 코돈 사용은 또한 추정되는 "프레임-시프트(frame-shift)" 서열 뿐만 아니라 조기 말단화 및/또는 내부 개시 자리를 제거할 수 있다.

DNA 코드는 4개의 문자(A, T, C 및 G)를 가지며, 세개 문자의 "코돈"이 되도록 사용하여 유기체의 유전자에서 엔코딩된 단백질의 아미노산을 나타낸다. DNA 분자를 따른 코돈의 선형 서열은 그러한 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질(들)은 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 고도로 변질되어, 61개의 코돈이 20개의 천연 아미노산에 대해 코딩하고, 3개의 코돈이 "정지" 시그널을 나타낸다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 코딩되는 데, 실제로 몇몇은 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 코딩된다.

하나 초과의 코돈이 소정의 아미노산을 코딩하는데 이용될 수 있는 경우, 유기체의 코돈 사용 패턴은 매우 비랜덤인 것으로 관찰되었다. 상이한 종은 그들의 코돈 선택에 있어서 상이한 성향을 나타내며, 추가로, 코돈의 이용성은, 높고, 낮은 수준으로 발현되는 유전자들 간의 단일 종에 있어서 현저하게 상이할 수 있다. 이러한 성향은 바이러스, 식물, 박테리아 및 포유동물 세포에서 상이하며, 일부 종은 다른 것보다 랜덤 코돈 선택으로부터 차별되는 강한 성향을 보여준다. 예를 들어, 사람 및 그 밖의 포유동물은 특정 박테리아 또는 바이러스 보다 덜 강한 성향을 갖는다. 이러한 이유로, E.coli에서 발현된 포유동물 바이러스로부터의 바이러스 유전자, 또는 포유 동물 세포에서 발현된 외래 또는 재조합 유전자가 효율적인 발현을 위해 코돈의 부적합한 분포를 가질 가능성이 크다. 발현이 일어나야 하는 숙주에서 드물게 관찰되는 풍부한 코돈 또는 코돈 클러스터의 이종 DNA 서열에서의 존재는 이러한 숙주에서 낮은 이종 발현 수준의 징표인 것으로 여겨진다.

따라서, 본 발명의 폴리누클레오티드에 있어서, 코돈 사용 패턴은 전형적인 사람 면역결핍 바이러스로부터 변경되어 예컨대 E.coli와 같은 표적 유기체의 코돈 성향을 보다 근접하게 나타낼 수 있다.

코돈 최적화에 유용한 공개적으로 이용할 수 있는 다양한 프로그램, 예컨대 "CalcGene"(Hale and Thompson, Protein Expression and Purification 12: 185- 189 (1998)이 존재한다.

실시예

실시예 1: HIV-1 p24 - RT - Nef- pl7 융합 F4 및 코돈 최적화된 F4 (co)의 작제 및 발현

1. 비-코돈 최적화된 F4

HIV-1 gag p24(캡시드 단백질) 및 p17(매트릭스 단백질), 역전사 효소 및 Nef 단백질을 박테리오파지 T7 프로모터(pET 발현 시스템)의 제어하에 E.coli B834 스트레인(B834(DE3)는 BL21(DE3)의 메티오닌 옥소트로프 패런트(methionine auxotroph parent)이다)에서 발현시켰다.

상기 단백질을 4개의 단백질의 완전 서열을 함유하는 단일 융합 단백질로서 발현시켰다. 성숙한 p24 코딩 서열을 HIV-1 BH10 분자 클론으로부터 유도하고, 성숙한 p17 서열 및 RT 유전자를 HXB2로부터 유도하고, Nef 유전자를 BRU 분리물로부터 유도하였다.

유도 후, 재조합 세포를 전체 단백질의 10%에 이르는 p24-RT-Nef-p17 융합체의 상당한 수준으로 발현시켰다.

세포가 22℃에서 성장하고, 유도되면, p24-RT-Nef 융합 단백질을 주로 박테리아 융해물의 가용성 분획으로 제한시켰다(냉동/해동 이후에도). 30℃에서 성장되면, 약 30%의 재조합 단백질이 불용성 분획과 결합하였다.

융합 단백질 p24-RT-Nef-p17을 분자량이 약 129kDa인 1136개의 아미노산으로 구성하였다. 전장 단백질을 SDS 겔 상에서 약 130kDa로 이동시켰다. 이 단백질은 2D 겔 전기영도에 의해 확인된 바와 같이, 그 아미노산 서열에 기초하여 이론적 등전점(pI)가 7.96이었다.

재조합 플라즈미드에 대한 상세한 내용:

명칭: pRIT15436 (또는 랩명(lab name) pET28b/p24-RT-Nef-pl7)

숙주 벡터: pET28b

레플리콘: colEl

선택: 카나마이신

프로모터: T7

삽입: p24-RT-Nef-pl7 융합 유전자.

재조합 단백질에 대한 상세한 내용:

p24-RT-Nef-pl7 융합 단백질: 1136개의 아미노산.

N-말단- p24: 232a.a. -힌지(hinge):2a.a. - RT: 562a.a. -힌지:2a.a. -Nef: 206a.a. - - P17: 132a.a. -C-말단

누클레오티드 및 아미노산 서열:

누클레오티드 서열

p24 서열은 진하게 표시됨.

Nef 서열은 밑줄쳐 짐.

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 누클레오티드

아미노산 서열

P24 서열: 아미노산 1-232(진하게)

RT 서열: 아미노산 235-795

Nef 서열: 아미노산 798-1002

P17 서열: 아미노산 1005-1136

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

K (리신): 트립토판(w) 대신. 효소 활성을 제거하기 위해 도입된 변이.

재조합 단백질의 발현:

pET 플라즈미드에서, 표적 유전자(p24-RT-Nef-p17)를 강력한 박테리오파아지 T7 프로모터의 조절하에 두었다. 이 프로모터는 E.coli RNA 폴리머라제에 의해 인지되지 않으며, 숙주 세포에서 T7 RNA 폴리머라제의 공급원에 의존한다. B834(DE3) 숙주 세포는 lacUV5 조절 하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 염색체 복사체(copy)를 함유하며, 발현은 IPTG를 박테리아 배양물에 첨가하므로써 유지된다.

예비 배양물을 진탕 플라스크 중에서 37℃에서 미드-로그 페이스(mid-log phase)(A620:0.6)까지 배양한 후, 4℃에서 밤새 저장하였다(고정상 배양물을 피하기 위해). 배양물을 1% 글루코스 및 50㎍/ml 카나마이신이 보충된 LBT 배지에서 배양시켰다. 글루코스의 성장 배지로의 첨가는 기저 재조합 단백질 발현을 감소시키는 데 유리하다(lacUV5 프로모터의 cAMP 매개된 억제해제를 피함).

4℃에서 밤새 저장된 10ml의 배양물을, 카나마이신을 함유하는 LBT 배지(글루코스 비함유) 200ml를 접종하는 데 사용하였다. 배양물을 30℃ 및 22℃에서 배양하고, O.D.620이 0.6에 도달하면, IPTG를 첨가하였다(최종 1mM). 배양물을 추가로 3, 5 및 18시간(밤새) 동안 접종하였다. 샘플을 유도 전 및 유도 후 3, 5 및 18시간에 수거하였다.

추출물 제조는 하기와 같았다:

세포 펠릿을 파괴 완충액(이론상 10의 O.D.)에 현탁시키고, 프렌치 프레스에서 4개의 경로에 의해 분쇄하였다(20,000psi 또는 1250bar에서). 미정제 추출물(T)을 30분 동안 20,000g에서 원심분리하여 가용성(S) 및 불용성(P) 분획을 분리시켰다.

* 파괴 완충액: 5OmM 트리스-HCL pH 8.0, ImM EDTA, ImM DTT + 프로테아제 억제제 칵테일 (완전/뵈링거)

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석:

불용성 펠릿(P), 상청액(S) 및 미정제 추출물(T)에 상응하는 분획을 10% 환원성 SDS-PAGE에서 분석하였다. p24-RT-Nef-p17재조합체를 쿠마시에 블루 염색 및 웨스턴 블롯(WB)에 의해 검출하였다.

쿠마시에 염색: p24-RT-Nef-p17 단백질은 하기와 같이 나타났다:

±130kDa에서 하나의 밴드(계산된 MW로 맞춤)

MW 이론치: 128,970 달톤

MW 겉보기 수치: 130 kDa

웨스턴 블롯 분석:

시약 = - RT에 대한 모노클로날 항체 (p66/p51)

ABI(어드밴스드 바이오테크놀로지스(Advanced Biotechnologies)로부터 구입

희석비: 1/5000

- 알칼리 포스파타제-컨쥬게이트 항마우스 항체

희석비: 1/7500

발현 수준: 22℃에서 20시간 후 매우 강한 p24-RT-Nef-p17 특이적 밴드, 이는 10% 이하의 전체 단백질을 나타냄(표 1A 참조)

재조합 단백질의 "용해도":

"새로운" 세포 추출물(T,S,P 분획): 22℃/20시간의 배양으로, 거의 모든 p24-RT-Nef-p17 융합 단백질이 세포 추출물의 가용성 분획으로 회수되었다(도 1A 참조). 30℃/20시간의 성장/유도로, 약 30%의 p24-RT-Nef-p17 단백질이 불용성 분획과 결합하였다(도 1A).

"동결/해동"(S2, P2 분획):

가용성(S1) 분획(22℃에서 20시간 유도)을 -20℃에서 보존하였다. 해동하고 20,000g/30분에서 원심분리하였다: S2 및 P2(1/10부피로 재현탁시킴).

DTT 함유 파괴 완충액: 거의 모든 p24-RT-Nef-p17 융합 단백질이 여전히 가용성임(1 내지 5%만 침전됨)(도 1B 참조).

DTT 비함유 파괴 완충액: 85 내지 90%의 p24-RT-Nef-p17가 여전히 가용성임(도 1B).

도면:

도 1A - 쿠마시에 염색 및 웨스턴 블롯.

도 1B - p24-RT-Nef-p17 용해도 검정

F4 단백질을 실시예 7에서 정제 방법 I를 사용하여 정제하였다.

하기 실시예에 대한 세포 성장 및 유도 조건 및 세포 추출물 제조는 다른 조건이 명시되지 않는 한(예를 들어, 온도, 파괴 완충액의 조성), 실시예 1에서 기술된 바와 같다.

2. 코돈 최적화된 F4

하기 폴리누클레오티드 서열은 코돈 최적화되므로써 이러한 코돈 사용은 E.coli에서 고도로 발현된 유전자에서의 코돈 사용과 유사하게 된다. 아미노산 서열은 비-코돈 최적화된 F4에 대해 상기 기재된 것과 동일하다.

F4co에 대한 누클레오티드 서열:

p24 서열은 진하게 표시됨.

Nef은 밑줄쳐 짐.

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 누클레오티드

비-코돈 최적화된 F4와 관련하여 사용된 절차가 코돈 최적화된 서열에 대해 적용되었다.

재조합 플라즈미드에 대한 상세한 내용:

명칭: pRIT15513 (랩명: pET28b/p24-RT-Nef-pl7)

숙주 벡터: pET28b

레플리콘: colEl

선택: 카나마이신

프로모터: T7

삽입: p24-RT-Nef-pl7 융합 유전자, 코돈 최적화됨.

코돈 최적화된 F4 유전자를 B834(DE3) 스트레인의 recA^- 유도체인 E.coli BLR(DE3)에서 발현시켰다. RecA 변이는 추정되는 람다 파지의 생성을 억제한다.

예비 배양물을 진탕 플라스크 내에서 37℃에서 미드-로그 페이스(A₆₂₀:0.6)까지 배양한 후, 4℃에서 밤새 저장하였다(고정상 배양물을 피하기 위해).

배양물을 1% 글루코스 및 50㎍/ml 카나마이신이 보충된 LBT 배지에서 배양시켰다. 글루코스의 성장 배지로의 첨가는 기저 재조합 단백질 발현을 감소시키는 데 유리하다(lacUV5 프로모터의 cAMP 매개된 억제해제를 피함).

4℃에서 밤새 저장된 10ml의 배양물을, 카나마이신을 함유하는 LBT 배지(글루코스 비함유) 200ml를 접종하는 데 사용하였다. 배양물을 37℃에서 배양하고, O.D.₆₂₀이 0.6에 도달하면, IPTG를 첨가하였다(최종 1mM). 배양물을 22℃에서 추가 19시간(밤새) 동안 접종하였다. 샘플을 유도 전 및 19시간 유도시에 수거하였다.

추출물 제조는 하기와 같았다:

세포 펠릿을 샘플 완충액(이론상 10의 O.D.)에 재현탁시키고, 비등시키고, 직접 SDS-PAGE에 로딩하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석:

미정제 추출물 샘플을 10% 환원성 SDS-PAGE에서 수행하였다.

p24-RT-Nef-p17재조합 단백질을 쿠마시에 블루 염색(도 2) 및 웨스턴 블롯(WB)에 의해 검출하였다.

쿠마시에 염색: p24-RT-Nef-p17 단백질은 하기와 같이 나타났다:

±130kDa에서 하나의 밴드(계산된 MW로 맞춤)

MW 이론치: 128,967 달톤

MW 겉보기 수치: 130 kDa

웨스턴 블롯 분석:

시약 = - 래빗 폴리클로날 항 RT(래빗 PO3L16)

희석비: 1/10,000

- 래빗 폴리클로날 항 Nef-Tat(래빗 388)

희석비 1/10,000

- 알칼리 포스파타제-컨쥬게이트 항 래빗 항체

희석비: 1/7500

22℃에서 19시간 유도 후, 재조합 BLR(DE3) 세포는 10 내지 15%의 전체 단백질로부터 매우 높은 수준에 걸쳐 F4 융합체를 발현시켰다.

원시 유전자로부터 F4를 비교하면, 코돈 최적화 유전자로부터의 F4 재조합 생성물 프로파일은 상당히 단순화되었다. 60kDa에서의 F4 관련 주밴드 뿐만 아니라 그 아래에서 부밴드가 사라졌다(도 2 참조). F4를 발현하는 B834(DE3) 재조합 스트레인과 비교하면, F4co를 생성하는 BLR(DE3) 스트레인은 하기의 이점을 갖는다: 재조합 생성물의 덜 복잡한 밴드 패턴의 F4 전장 단백질의 높은 생성율.

실시예 2: P51RT(절두된, 코돈 최적화된 RT)의 작제 및 발현

아미노산 428-448 사이의 RT/p66 영역은 E.coli 프로테아제에 대해 민감하다. P51 작제물은 Leu 427에서 종료되어, RN아제H 도메인의 제거를 초래한다(도 3의 RT 서열 배열 참조).

RT 원시 유전자 서열에서 확인된 추정되는 E.coli "프레임쉬프트(frameshifte)" 서열이 또한 제거되었다(p51 유전자의 코돈 최적화에 의해).

p51 합성 유전자 설계/작제:

합성 p51 유전자의 서열을 E.coli 코돈 사용에 따라 설계하였다. 이에 따라, 코돈 사용이 E.coli에서 고도로 발현된 유전자에서의 코돈 사용과 유사하도록 코돈 최적화하였다. 합성 유전자는 하기와 같이 작제하였다: 32개의 올리고누클레오티드를 단일 단계 PCR로 어셈블링하였다. 2차 PCR에서, 전장 어셈블리를 말단 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 형성된 PCR 생성물을 pGEM-T 중간 플라즈미드로 클로닝하였다. 유전자 합성 동안에 도입된 포인트 에러를 수정한 후, p51 합성 유전자를 pET29a 발현 플라즈미드로 클로닝하였다. 이러한 재조합 플라즈미드를 B834(DE3) 세포로 형질변환하는 데 사용하였다.

재조합 단백질 특징:

p51 RT 누클레오티드 서열

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

아미노산 서열:

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

K (리신): 트립토판(w) 대신. 효소 활성을 제거하기 위해 도입된 변이.

길이, 분자량, 등전점(IP):

433 AA, MW : 50.3 kDa,, IP: 9.08

B834(DE3) 세포에서의 p51 발현:

P51 발현 수준 및 재조합 단백질 용해도를 RT/p66 생성 스트레인과 유사하게 평가하였다.

p51 발현 수준:

유도 조건 : 37℃에서 5시간 동안 세포 배양/유도(+1mM IPTG).

파괴 완충액 : 50 mM 트리스/HCl, pH:7.5, ImM EDTA, +/- ImM DTT.

웨스턴 블롯 분석:

시약 : - 래빗 클로날 항 RT(래빗 PO3L16)(희석비:1/10,000)

- 알칼리 포스페이트-컨쥬게이트 항 래빗 항체(희석비: 1/7500)

미정제 추출물(T), 불용성 펠릿(P) 및 상청액(S)에 상응하는 세포 분획을 10% 환원성 SDS-PAGE에서 분석하였다.

쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯(도 4)으로 도시된 바와 같이, P51의 매우 높은 발현(전체 단백질의 15 내지 20%)이 관찰되었으며, P66에 대해 관찰된 발현보다 높았다.

p51 및 p66 단백질(37℃에서 5시간 유도 후) 둘 모두에 대해, 80%의 재조합 생성물이 세포 추출물의 가용성 분획(S1)으로 회수되었다(도 4 참조). 30℃에서 발현된 경우, 99%의 재조합 단백질이 가용성 분획과 결합하였다(미도시됨).

p51 웨스턴 블롯 패턴은 다중밴드이나, P66에 대해 관찰된 것보다 덜 복잡하였다.

용해도 검정

용해도 검정: 환원(DTT 함유 파괴 완충액) 및 비환원 조건 하에서 동결/해동의 가용성(S1) 분획(37℃에서, 5시간 유도)을 제조하였다. 해동 후, S1 샘플을 20,000g/30분에서 원심분리하여 S2 및 P2를 생성하였다(p2는 1/10 부피로 재현탁되었다).

환원 조건 뿐만 아니라 비환원 조건 하에서 제조된 가용성 분획(S1)의 동결/해동 후, 99%의 p51 및 p66은 여전히 가용성 (S2) 분획으로 수거되었다. 단지 1%가 침전물(P2)에서 발견되었다. 이는 도 5에 도시된다.

실시예 3: 링커 함유 또는 비함유의 p17-Nef 및 Nef-p17의 작제 및 발현

이중 융합 단백질을 링커 함유 및 비함유로 작제하였다. 두개의 융합 파트너 간에 유효 상호작용을 감소시키는 것을 목적으로 하는 링커는 다음과 같다:

재조합 플라즈미드 작제:

● pET29a/Nef-p17 발현 벡터:

Nef-p17 융합 유전자를 F4 재조합 플라즈미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 중간 pGEM-T 클로닝 벡터로 클로닝하고 이어서 pET29a 발현 벡터로 클로닝하였다.

● pET28b/p17-Nef 발현 벡터:

Nef 유전자를 F4 재조합 플라즈미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 중간 pGEM-T 클로닝 벡터로 클로닝하고, 이어서 p17 유전자를 지닌 프레임 융합체의 C 말단으로서 pET28b/p17 발현 벡터로 클로닝하였다.

● pET29a/Nef-링커-p17 및 pET28b/p17-링커-Nef 발현 벡터:

헥사펩티드 링커를 코딩하는 18 bp DNA 단편(GSGGGP)을 부위 특이적 변이 유발법("Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System", Invitrogen)에 의해 Nef와 p17 융합 파트너 사이에 삽입시켰다.

재조합 단백질 특징:

● 길이, 분자량, 등전점(IP)

Nef-pl7 (NP로 명명됨): 340 AA, MW: 38.5 kDa, IP:7.48

Nef-

-P17 (NLP로 명명됨): 346 AA, MW:38.9 kDa, IP: 7.48

pl7-Nef (PN으로 명명됨): 342 AA, MW: 38.7 kDa, IP: 7.19

p17-

-Nef(PLN으로 명명됨): 348 AA, MW: 39.IkDa, IP: 7.19

● 아미노산 서열 및 폴리누클레오티드 서열:

Nef-p17 누클레오티드 서열

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

Nef 서열은 진하게 표시됨.

p17-Nef 누클레오티드 서열:

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

p17 서열은 진하게 표시됨.

Nef-링커-p17 누클레오티드 서열:

Nef-링커-p17(NLP)

헥사펩티드 링커

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

p17-링커-Nef 누클레오티드 서열:

P17-링커-Nef (PLN)

헥사펩티드 링커

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

링커 존재 또는 부재에서의 Nef-p17, p17-Nef 융합체의 발현 비교

네개의 재조합 스트레인을 F4 및 Nef 생성 스트레인과 유사하게 3시간 동안 30℃에서 유도하였다. 미정제 추출물을 제조하고, 쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.

웨스턴 블롯 분석:

시약 : - 래빗 클로날 항 RT(래빗 PO3L16)(희석비:1/10,000)

- 알칼리 포스페이트-컨쥬게이트 항 래빗 항체(희석비: 1/7500)

도 6에 도시된 바와 같이, 링커 존재 또는 부재 하에서 Nef-p17 및 p17-Nef 융합체는 높은 수준으로 발현되었다(10% 전체 단백질).

웨스턴 블롯에서, 4개의 이중 융합 작제물을 다중 밴드 패턴을 나타내지만, F4에 대해 관찰된 것보다 덜 복잡하였다. 단독으로 발현되는 경우, Nef 및 p17 단백질은 단일 밴드 패턴을 나타내었다.

링커 펩티드의 부재하에 Nef-p17(NP) 및 p17-Nef(PN) 융합체를 발현시키는 스트레인을 추가로 분석하였다(용해도 검정, 하기 참조).

Nef-p17 및 p17-Nef 용해도 검정:

Nef-p17 및 p17-Nef 단백질을 F4 및 Nef 생성 스트레인과 유사하게 유도하였다.

유도 조건 : 30℃에서 3시간 동안 세포 배양/유도(+1mM IPTG).

파괴 완충액 : 50 mM 트리스/HCl, pH:8, 50mM NaCl, 1mM DTT.

새로운 세포 추출물:

세포 추출물을 (비환원 조건 하에서) 준비하고, 미정제 추출물(T), 불용성 펠릿(P), 및 상청액(S1)에 상응하는 분획을 쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯에 대해 도 7에 도시된 바와 같이, 거의 모든 Nef-p17, p17-Nef 뿐만 아니라 Nef 단백질이 세포 추출물의 가용성 분획(S)으로 회수되었다. F4 작제물에 대해 5 내지 10%의 재조합 단백질이 이미 펠릿 분획에서 회수되었다.

결론:

시험된 모든 이중 작제물은 고도로 발현되었다(전체 단백질의 10% 초과). P17-Nef 및 Nef-p17 융합 단백질은 F4 보다 가용성이었다. 둘 모두 덜 복잡한 WB 패턴을 제공하였다.

실시예 4: p24-RT*-Nef-p17(F4*)의 작제물 및 발현

F4*는, 592 위치에서 메티오닌이 리신으로 치환된 F4(p24-RT/p66-Nef-p17)의 변이형이다. 이러한 메티오닌은 F4 정제 실험의 Q 세파로스 용리물 샘플에 대해 수행되는 N 말단 시퀀싱에 의해 지지되는 바와 같이 추정되는 내부 전사 "개시" 자리이다. 사실상, Q 용리물 샘플에 존재하는 62kDa에서의 주가되는 F4 관련된 작은 밴드는 메티오닌 592에서 시작된다.

메티오닌은 리신에 의해 치환된다: RMR → RKR. RKR 모티프는 본래 클레이드 A RT 서열에 존재한다.

CD4-CD8 에피토프에 대한 이러한 변이에 대한 영향을 평가하였다:

- 하나의 HLA-A3 CTL 에피토프(A* 3002)가 소실되었으나, 9개의 다른 HLA-A3 에피토프가 RT 서열에 존재한다.

- 헬퍼 에피토프가 이러한 영역에서 전혀 확인되지 않았다.

재조합 단백질 특징:

● 길이, 분자량, 등전점(IP):

1136 AA, 129 kDa, IP: 8.07

● 누클레오티드 서열:

p24 서열은 진하게 표시됨.

Nef 서열은 밑줄쳐짐.

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 누클레오티드

● 아미노산 서열

P24 서열: 아미노산 1-232 (진하게)

RT 서열: 아미노산 235-795

Nef 서열: 아민노산 798-1002

P17 서열: 아미노산 1005-1136

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

K(리신): 메티오닌 대신(내부 "개시" 코돈)

K(리신)K: 트립토판(w) 대신. 효소 활성을 제거하기 위해 도입된 변이.

B834(DE3) 세포에서의 F4* 발현:

F4* 재조합 스트레인을 F4 비변이된 작제물과 유사하게 18시간 동안 22℃에서 유도하였다. 미정제 추출물을 제조하고, 쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, F4*를 높은 수준(10% 전체 단백질)으로 발현되었고, 이는 F4와 비교하여 약간 더 높으며, 작은 62kDa 밴드는 사라졌다.

웨스턴 블롯 분석:

시약 : - 푸울 3 Mabs 항 p24 (JCl 3.1, JCl 6.1, IG8.1.1) (희석비 1/5000)

- 래빗 폴리클로날 항 RT (래빗 PO3L 16) (희석비: 1/10000)

- 래빗 폴리클로날 항 Nef-Tat (래빗 388) (희석비 1/10000)

- 알칼리 포스파타아제-컨쥬게이트 항 래빗 항체(희석비: 1/7500)

- 알칼리 포스파타아제-컨쥬게이트 항 마우스 항체(희석비: 1/7500)

실시예 5: F3 및 F3*(변이 F3)의 작제 및 발현

F3 (pl7-p51-Nef) 및 추정되는 내부 메티오닌 개시 자리가 리신으로 대체된 F3* (pl7-p51*-Nef).

F3 및 F3* 융합체는 p24와 함께 사용될 수 있다.

재조합 플라즈미드 작제:

F3: p51을 엔코딩하는 서열을 pET29a/p51 발현 플라즈미드로부터 절삭하고(ScaI 및 StuI DNA 단편으로서), p17 및 Nef 서열을 지닌 프레임 융합체에서와 같이 StuI 자리(p17과 Nef 유전자 사이에 위치함)에서, pET28b/p17-Nef 플라즈미드와 결찰시켰다. 형성된 융합 작제물 p17-p51-Nef를 F3로 명명하였다.

F3*: 추정되는 내부 메티오닌 개시화 자리의 변이를, 시스템("Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis system"(Invitrogen))을 사용하여 달성하므로써 F3* 작제물을 생성하였다.

F3 및 F3* 플라즈미드를 B834(DE3) 세포를 형질변환하는데 사용하였다.

재조합 단백질 특징:

● 길이, 분자량, 등전점 (IP)

770 AA, 88.5 kDa, IP:8.58

● 누클레오티드 서열(F3*에 대해)

P17: 진한 서열

P51: 대문자 서열

Nef: 소문자 서열

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 누클레오티드

● 아미노산 서열(F3에 대해)

P17 서열: 아미노산 1-134(진하게 표시됨)

P51 서열: 아미노산 137-562

Nef 서열: 아미노산 565-770

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 아미노산

메티오닌 494가 F3* 작제물에서 리신(K)에 의해 대체

K(리신)K: 트립토판(W) 대신. 효소 활성을 제거하기 위해 도입된 변이.

B834(DE3) 세포에서의 F3 발현:

F3 발현 수준 및 재조합 단백질 용해도를 F4(p24-p66-Nef-p17) 및 p17-Nef(F2) 생성 스트레인과 유사하게 평가하였다.

유도 조건 : 3시간 동안, 37℃에서 세포배양, 30℃에서 유도(+1mM IPTG).

파괴 완충액 : F4: 50 mM 트리스/HCl, pH:8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA, +/- 1mM DTT

F2: 50 mM 트리스/HCl, pH:8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA, DTT 비함유

F3: 50 mM 트리스/HCl, pH:7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, +/- 1mM DTT

웨스턴 블롯 분석:

시약 : - 래빗 폴리클로날 항 RT(래빗 PO3L16)(희석비:1/10,000)

- 래빗 폴리클로날 항 Nef-Tat(래빗 388)(희석비:1/10,000)

- 알칼리 포스파타제-컨쥬게이트 항 래빗 항체(희석비: 1/7500)

"새로운" 세포 추출물

미정제 추출물(T), 불용성 펠릿(P) 및 상청액(S)에 상응하는 세포 분획을 10% 환원성 SDS-PAGE에서 분석하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, F3 융합 단백질이 높은 수준으로 발현되었다(10% 전체 단백질). 5 내지 10%의 F4 생성물이 펠릿 분획과 이미 결합되어 있지만, 거의 모든 F3가 세포 추출물의 가용성 분획(S)으로 회수되었다. WB 패턴은 F4와 비교하여 단순화되었다.

B834(DE3) 세포에서의 F3* 발현:

F3* 재조합 스트레인을 F3 비변이 작제물과 유사하게 3시간 동안 37℃에서 유도하였다. 미정제 세포 추출물을 제조하고, 쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯팅에 의해 검색하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, F3* 융합 단백질이 매우 높은 수준으로 발현되었다(10 내지 20% 전체 단백질). F3와 비교하여 WB 패턴이 단순하였으며, +/- 32kDa에서 매우 희미한 밴드(WB에서만 검출됨)가 사라졌다.

실시예 6: F4(p51) 및 F4(p51)*의 작제 및 발현

RT/p51을 F4 융합 작제물(RT/p66 대신에)에 사용하였다.

F4(p51) = p24-p51-Nef-pl7

F4(p51)* = p24-p51*-Nef-pl7 - 변이 F4(p51): 추정되는 내부 메티오닌 개시 자리(RT 부분에 존재함)를 리신으로 치환시켜 항원 패턴을 더욱 단순화시켰다.

재조합 플라즈미드 작제:

F4(p51) : p51을 엔코딩하는 서열을 pET29a/p51 발현 플라즈미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 제한 자리를 PCR 프라이머로 혼입하였다(코딩 서열의 5'말단에 NdeI 및 StuI, 3' 말단에 AvrII). PCR 생성물을 pGEM-T 중간 플라즈미드로 클로닝하고, 시퀀싱하였다. pGem-T/p51 중간 플라즈미드를 NdeI 및 AvrII에 의해 제한시키고, p51 단편을 NdeI 및 NheI에 의해 제한된 pET28b/p24-RT/p66-Nef-p17 발현 플라즈미드로 결찰시켰다(RT/p66 서열을 절삭시킴). 결찰은 T4 DNA 리가아제의 존재 하에서 적합한 농도로 분해 반응을 결합하므로써 수행하였다. 결찰 생성물을 사용하여 DH5αE.coli 세포를 형질변환시켰다. 올바른 번역 판독 프레임으로의 p51의 삽입에 대한 검증(F4 융합체에서 RT/p66 대신에)을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 형성된 융합 작제물 p24-RT/p51-Nef-p17이 F4(p51)이다.

F4(p51)*: 추정되는 내부 메티오닌 개시 자리(RT/p51에 존재함)의 변이를 시스템("Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis system"(Invitrogen))을 사용하여 달성하므로써 F4(p51)*을 생성하였다.

F4(p51) 및 F4(p51)* 발현 플라즈미드를 사용하여 B834(DE3) 세포를 형질변환시켰다.

재조합 단백질 특징:

● 길이, 분자량, 등전점(IP)

1005 AA, 114.5 kDa, IP: 8.47

● 누클레오티드 서열(F4(p51)*에 대해)

P24: 진하게 표시된 서열

P51: 대문자 서열

Nef: 소문자 서열

P17: 밑줄쳐 진 서열

박스: 유전적 구성에 의해 도입된 누클레오티드

● 아미노산 서열(F4(p51)*에 대해)

P24: 아미노산 1-232

P51: 아미노산 237-662

Nef: 아미노산 666-871

P17: 아미노산 874-1005

K(리신): 메티오닌 대신(내부 "개시" 코돈)

K(리신)K: 트립토판(w) 대신. 효소 활성을 제거하기 위해 도입된 변이.

834(DE3) 세포에서의 F4(p51) 발현:

F4(p51) 발현 수준 및 재조합 단백질 용해도를 F4 발현 스트레인과 유사하게 평가하였다.

유도 조건 : 19시간 동안, 37℃에서 세포배양, 22℃에서 유도(+1mM IPTG).

파괴 완충액 : 50 mM 트리스/HCl, pH:7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT

웨스턴 블롯 분석:

시약 : - 래빗 폴리클로날 항 RT(래빗 PO3L16)(희석비:1/10,000)

- 래빗 폴리클로날 항 Nef-Tat(래빗 388)(희석비:1/10,000)

- 알칼리 포스파타제-컨쥬게이트 항 래빗 항체(희석비: 1/7500)

미정제 추출물(T), 불용성 펠릿(P) 및 상청액(S)에 상응하는 세포 분획을 10% 환원형 SDS-PAGE에서 분석하였다.

도 11에 도시된 바와 같이, F4(p51)은 F4와 유사하게 높은 수준(10%의 전체 단백질)으로 발현되었다. 거의 모든 F5(p51)가 세포 추출물의 불용성 분획(S)으로 회수되었다. 항-Nef-tat 시약으로 검출하여, F4(p51)의 WB 패턴은 단순화된 것으로 나타났다(+/- 60kDa 미만으로 절두된 생성물의 감소).

834(DE3) 세포에서의 F4(p51)* 발현:

F4(p51)* 재조합 스트레인을 F4(p51) 비돌연변히 작제물인, F4 및 F4*와 유사하게 18시간 동안 22℃에서 유도하였다. 미정제 세포 추출물을 제조하고, 쿠마시에 염색된 겔 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, F4(p51) 및 F4(p51)* 융합체의 높은 발현이 관찰되었고, 10% 이상의 전체 단백질을 나타내었다. WB 패턴: +/- 60kDa 미만의 절두된 생성물의 감소. 또한, F4(p51)* 작제물에 대해, 47kDa 밴드(내부 개시 자리로 인해)가 사라졌다.

실시예 7: F4, F4(p51)* 및 F4*의 정제 - 정제 방법 I

4개의 HIV 항원 p24-RT-Nef-p17을 포함하는 F4 융합 단백질을 하기 기본 단계를 포함하는 정제 방법 I에 따라 E.coli 균질화물(homogenate)로부터 정제하였다.

ㆍ F4의 황산암모늄 침전

ㆍSO3 프락토겔 양이온 교환 크로마토그래피(포지티브 모드)

ㆍ옥틸 세파로스 소수성 상호작용 크로마토그래피(포지티브 모드)

ㆍQ 세파로스 FF 음이온-교환 크로마토그래피(포지티브 모드)

ㆍ SDS의 존재 하에서의 슈퍼덱스 200 겔여과 크로마토그래피

ㆍ투석 및 농축

추가로, F4(p51)* 융합 단백질(추가의 변이 Met592Lys를 지닌 코돈 최적화된 p51에 의해 치환된 RT) 및 F4* 단백질(추가의 Met592Lys 변이를 지닌 F4)을 동일한 정제 방법 I을 사용하여 정제하였다.

단백질 정량화

ㆍ 전체 단백질을 로우리(Lowry) 검정을 사용하여 측정하였다. 단백질 농도를 측정하기 전에, 모든 샘플을 PBS, 0.1% SDS에 대해 밤새 투석하여 방해 물질(우레아, DTT)를 제거하였다. BSA(Pierce)를 표준물질로서 사용하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯

ㆍ 샘플을 환원성 또는 비환원성 SDS-PAGE 샘플 완충액(+/- β-메르캅토에탄올) 중에서 제조하고, 95℃에서 5분 동안 가열하였다.

ㆍ 단백질을, 1mm 두께의 프리-캐스트 노벡스 트리스-글리신 겔(pre-case Novex Tris-glycine gel) 또는 크리테리온 겔(Criterion gel)(Bio-Rad)을 사용하여 75분 동안 200V에서 4 내지 20% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다.

ㆍ 단백질을 쿠마시에-블루 R250으로 가시화시켰다.

ㆍ 웨스턴 블롯(WB)을 위해, 단백질을 1.5시간 동안 100V에서 또는 밤새 30V에서 1.5시간 동안 4℃에서 SDS 겔에서 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad)으로 이동시켰다.

ㆍ F4를 상이한 항원에 대한 모노클로날 항체, 항 p24, 항 Nef-Tat, 항 RT(때로는 항 p24와 항 Nef-Tat의 혼합물이 최대 단백질 밴드 수를 검출하기 위해 사용되었다)를 사용하여 검출하였다.

ㆍ 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트된 항 마우스 또는 항 래빗 항체를 일차 항체에 결합시키고, 단백질 밴드를 기질로서 BCIP 및 NBT를 사용하여 가시화하였다.

항 E.coli 웨스턴 블롯

ㆍ 5㎍ 단백질(Lowry)을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 상기와 같이 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다.

ㆍ 잔류하는 숙주 세포 단백질을 폴리클로날 항 E.coli 항체를 사용하여 검출하였다. 단백질 밴드를 상기와 같이 알칼리-포스파타제로 가시화하였다.

정제 방법 I

방법 I은 황산암모늄에 의한 침전 및 4개의 크로마토그래피 단계를 포함한다:

ㆍ E.coli를 10mM DTT, 1mM PMSF, 1mM EDTA의 존재 하에 OD50(~360mL)에서 pH 8.0에서 50mM 트리스 완충액 중에 균질화시켰다. 2개의 라니 경로(Rannie passage)를 1000bar에서 적용하였다.

ㆍ 세포 파편 및 불용성 물질을 20분 동안 14400 x g에서 원심분리하여 제거하였다.

ㆍ 황산암모늄(AS)을 3.8M 원액으로부터 최종 농도가 2.1M이 되도록 맑은 상청액에 첨가하였다. 단백질은 실온에서 약 2시간 동안 침전시킨 후, 원심 분리하여 펠릿화시켰다(14400 x g에서 10분). 펠릿을 pH 7.0에서 10mm 포스페이트 완충액에서 8M 우레아, 10mM DTT에서 재현탁시켰다.

ㆍ 항원을 8M 우레아 및 10mM DTT의 존재 하에서 pH 7.0에서 포스페이트 완충액 중에서 SO3 프락토겔 칼럼(Merck) 상에서 포획하였다. 칼럼을 세척하여 비결합 단백질을 용리시키고 이어서 170mM NaClf의 예비 용리 단계로 결합된 숙주 세포 단백질(HCP)를 제거하였다. 이후, F4를 포스페이트 완충액 중에서 pH 7.0에서 460mM NaCl, 8M 우레아, 10mM DTT로 용리시켰다.

ㆍ SO3 용리물을 pH 7에서 10mM 포스페이트 완충액으로 2회 희석하고 4M 우레아, 1mM DTT, 230mM NaCl의 존재 하에 pH 7.0에서 포스페이트 완충액 중에서 옥틸 세파로스 칼럼에 로딩시켰다. 세척 단계(평형화 완충액) 이후에, 결합된 F4를 25mM 트리스 완충액 중에서 pH 8.0에서 8M 우레아, 1mM DTT로 용리시켰다.

ㆍ 옥틸 용리물을 희석하고, pH 9.0으로 조절한 후, pH 9.0(25mM 트리스)에서 8M 우레아의 존재 하에 Q 세파로스 칼럼(Amersham Bioscience)에 결합시켰다. 비결합 단백질을 세척해내고(pH 9.0에서 8M 우레아, 25mM 트리스), 예비 용리 단계(8M 우레아 중의 90mM NaCl, 25mM 트리스, pH 9.0)에 의해 HCP 및 F4 분해 생성물을 제거하였다. F4를 pH 9.0에서 트리스 완충액 중에서 200mM NaCl, 8M 우레아를 사용하여 칼럼으로부터 탈착시켰다.

ㆍ Q 용리물의 분취액에 1% SDS를 첨가하고, 0.1% SDS 및 1mM DTT를 함유하는 PBS 완충액에 대해 투석하여 겔여과 칼럼(분석 등급 수퍼덱스 200, 일련의 두개의 16 x 60cm 칼럼)에 샘플을 주입하기 전에 우레아를 제거하였다. 관련 분획을 공정중 SDS-PAGE 분석 후에 푸울링시켰다.

ㆍ 샘플을 1ℓ의 0.5M 아르기닌, 10mM 트리스, 5mM 글루타티온, pH 8.5에 대해 밤새 투석 멤브레인(12-14 kDa 컷-오프)에서 실온에서 2회 투석하였다.

연속되는 정제 단계가 하기 플로우챠트로 표시된다.

정제 플로우시트

360ml 균질화물 OD50(라니)

50mM 트리스 pH 8.0, 1 mM PMSF, 1OmM DTT, 2 mM EDTA

↓

정화

14400 x g에서 20분 원심분리

↓

황산암모늄 침전

실온에서 2시간 1.2M AS, 14400 x g에서 원심분리 10분

↓

8M 우레아, 10mM PO₄, 1OmM DTT, pH 7.0에서 펠릿 재현탁됨

↓

(+) SO3 프락토겔 EMD 650 (M) 크로마토그래피

pH 7.0, 8M 우레아, 1OmM DTT, 170mM NaCl에서 예비 용리, 460 mM NaCl에서 용리

↓

pH 7.0으로 2배 희석, 4M 우레아, 5mM DTT, 230mM NaCl

↓

(+) 옥틸 세파로스 크로마토그래피

pH 7.0, 4M 우레아, 230 mM NaCl; 8M 우레아, 20mM 트리스, pH 8.0에서 용리

↓

약 2배 희석, pH 9.0으로 조절 (NaOH)

↓

(+) Q 세파로스 FF 크로마토그래피

트리스 pH 9.0, 8 M 우레아; 90 mM NaCl 예비 용리, 20OmM NaCl 용리

↓

1% SDS 첨가

↓

투석

→ TBS, 0.1% SDS, pH 8.5

↓

슈퍼덱스 200 겔여과 크로마토그래피 16 x 120 cm

TBS, 0.1% SDS, pH 8.5

↓

IPA SDS-PAGE

↓

푸울/농축/투석

→ 포뮬레이션 적합성 완충액

IPA -공정중 분석

모든 완충액은 다르게 명시하지 않는 한 1mM DTT를 함유한다.

F4의 정제 결과

정제 단계 이후의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯

도 13은 F4의 정제 동안에 수거된 F4 함유 분획의 SDS 겔 및 항-p24-Nef-Tat 웨스턴 블롯을 나타낸다.

E.coli 균질화물이 도13의 레인 2에 도시되어 있으며, F4는 약 10%의 전체 단백질을 나타내는 것으로 추정된다(쿠마시에 블루 염색된 SDS-겔의 밀도 스캔). 원심분리 후, F4의 가용성 분획을 정화된 상청액(레인 3)으로 회수하였다. 황산암모늄 침전 단계는 많는 불순물(레인 4)을 제거하였고, 후속되는 크로마토그래피 단계를 위해 단백 전하(proteic charge)를 감소시켰다. 추가로, 침전물을 재현탁시키는 데 사용된 8M 우레아는 F4와 HCP의 착물을 해리시켜 F4의 완전한 포획과 SO3 수지로부터의 정량적 용리를 허용하였다. 레인 5에 도시된 SO3 용리물은 F4가 상당히 풍부하나, 불균질 패턴은 기본적으로 변하지 않고 잔류하였다. 소수성 옥틸 세파로스 칼럼은 주로 저분자량(LMW) HCP 및 F4 분해 생성물(레인 6)을 제거하였으며, 이에 따라 F4 패턴을 단순화시켰다. Q 세파로스 크로마토그래피는 추가로 F4 패턴을 단순화시켰으며, 많은 불순물(레인 7)을 제거하였다. E.coli 불순물에 있어서 최종 순도는 이 단계 후에 얻어졌다. 사실상, 숙주 세포 단백질이도 항 -E.coli 웨스턴 블롯 분석에 의해 Q 용리물 중에서 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 생성된 정제된 F4는 F4Q로서 언급된다. 슈퍼덱스 200 칼럼은 전장 F4로부터 LMW F4 분해 생성물을 분리시켜 슈퍼덱스 200 용리물(레인 8) 중에서 F4 균질성을 향상시켰다. 용어 F4S는 방법 I의 전체 계획에 따라 정제된 F4를 나타내는 데 사용될 수 있다.

항 E. coli 웨스턴 블롯은 F4의 정제 동안에 수거된 동일한 분획에 대해 수행하였다. 항 E.coli 웨스턴 블롯에 대한 가시적인 밴드의 부재는 HCP 오염도가 Q 용리물 및 슈퍼덱스 용리물중에서 1% 미만임을 나타낸다.

F4 및 단백질 회수

정제 공정의 각 단계에서 F4 회수율을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 추정하였다. SDS-겔로부터 F4 회수율을 추정하기 위해 샘플 부피를 정제 동안에 수거된 상이한 분획의 부피에 상응하는 SDS-겔에 로딩하였다.

하기 표 1은 F4 오염 분획 중 단백질 회수율을 보여준다.

표 1: 정제 공정 동안에 수거된 F4 포지티브 분획(360ml 균질화물) 중에서의 단백질 회수율. 단백질 농도는 로우리 검정으로 측정되었다.

상기 표는 정화 단계 이후에 상청액에서 회수된 F4를 포함하는 균질화물 및 가용성 물질중 단백질의 양을 보여주는 것이다. AS 침전 단계에서는 HCP의 상당량을 제거하여, SDS 겔에 대해 F4가 단지 소량 손실된 것으로 관찰되었다. SO3 크로마토그래피는 추가로 많은 불순물을 제거하였으며, SDS-겔은 F4의 높은 회수율을 나타낸다. 대조적으로, 옥틸 세파로스 및 Q 세파로스 칼럼 둘 모두에 의한 측정된 약 50%의 단백질 회수율은 또한 F4의 손실이 동반되었다. 겔여과 크로마토그래피 후의 단백질 회수율은 약 50% 였다. SDS-겔은 많은 LMW 단백질 밴드(F4 분해 밴드)가 제거되고, 동시에 F4 회수율이 감소되었음을 보여준다.

F4 수율

상기 표 1은 약 36mg의 정제된 F4가 OD50에서 360ml 균질화물로부터 수득될 수 있음을 보여준다. 그러므로, OD50에서 1ℓ균질화물은 약 100mg의 정제된 F4를 수득해야 할 것이다. 70 내지 90의 OD가 발효 공정 동안에 달성되기 때문에, 발효기 리터당 수율은 이에 따라 140 내지 180mg 범위의 F4가 될 것이다.

F4(p51)*의 정제 결과

F4(p51)* 융합 작제물을 변경없이 상기 기술된 정제 방법 I을 사용하여 정제하였다.

정제 공정 이후의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯

F14는 F4(p51)*의 정제 동안에 수거된 F4(p51)* 함유 분획의 SDS 겔 및 항 p24/항 Nef-Tat 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.

SDS-겔 및 웨스턴 블롯은 F4(p51)* 융합 단백질이 전체적으로 황산암모늄 침전 단계 뿐만 아니라 크로마토그래피 단계 동안에 F4와 유사하게 거동함을 보여준다. 정제된 F4(p51)*는 정제된 F4와 유사한 불균질성 패턴을 가졌다.

항 E.coli 웨스턴 블롯은 HCP 오염율이 Q 용리물 및 슈퍼덱스 용리물 둘 모두에서 1% 미만임을 나타냈다.

수율

약 25%의 F4(p51)*이 균질화물의 불용성 분획에서 손실되었다. 추가로, 상기 정제 방법은 이러한 단백질에는 적합하지 않기 때문에, 크로마토그래피 단계에서 손실이 관찰된 것이다. 그러므로, F4(p51)*의 전체 회수율은 균질화물 리터당 약 25mg(OD50)으로 감소되었다. OD 177에서 1리터 배양물로 외삽하였으며, 이에 따라 85mg F4(p51)*의 범위로 수율이 얻어졌다.

F4*의 정제 결과

F4* 융합 작제물을 변경 없이 상기 기술된 정제 방법을 사용하여 정제하였다.

정제 공정 이후의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯

도 15는 F4*의 정제 동안에 회수된 F4* 함유 분획의 SDS 겔 및 항 p24-Nef-Tat 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.

F4(p51)*에 있어서, F4*는 전체적으로 정제 절차 동안에 F4와 상당히 유사하게 거동함을 알 수 있다. 이 단백질은 SDS-겔 및 웨스턴 블롯에 의해 도시된 바와 같이 예상된 분획으로 회수되었다. 또한, 항 E.coli 웨스턴 블롯은 또한 Q 세파로스 칼럼 이후 이미 대부분의 HCP가 제거되었음을 보여준다.

수율

전체적인 회수량은 465ml 균질화물 OD50로부터 수득된 약 17mg의 정제된 F4*이다. OD 140에서 1ℓ 배양물로 외삽하면, 이에 따른 수율은 100mg F4*의 범위에 있을 것이다.

요약하면, 3개의 융합 단백질 F4, F4(p51)* 및 F4*는 정제 방법 I을 사용하여 정제하였다. 도 16에서 SDS 겔은 Q 세파로스 단계 이후 및 슈퍼덱스 200 칼럼에 의한 LWM 밴드의 제거 이후 작제물의 불균질성이 상이한 수준을 나타내는 3개의 정제된 단백질을 비교한 것이다.

실시예 8: F4 및 F4co(코돈 최적화됨)의 정제 - 정제 방법 II

정제 방법 II

상기 방법 I과 비교하여 단순화된 정제 절차인 방법 II가 개발되었다. 방법 II는 단지 2개의 크로마토그래피 단계 및 완충액 교체를 위한 최종 투석/투석여과로 구성된다. 특히, CM 하이퍼Z(CM hyperZ) 크로마토그래피 칼럼(BioSepra)이 방법 I의 정화 단계, 황산암모늄 침전 및 SO3 크로마토그래피(실시예 7)를 대체하기 위해 도입된다. 방법 II는 F4 및 전체 코돈 최적화된 F4("Fco") 둘 모두를 정제하는 데 사용되었다. F4co에 있어서, 두개의 상이한 형태의 방법 II가 수행되었는 데, 한 방법은 카르복시아미드화를 포함하고, 다른 한 방법은 포함하지 않는다. 카르복시아미드화 단계의 목적은 단백질의 산화적 응집을 억제하는 것이다. 이러한 카르복시아미드화는 제 1 크로마토그래피 단계(CM 하이퍼Z) 이후에 수행된다.

ㆍ E. coli (F4 또는 F4co)를 발현하는 OD90에서 10mM DTT의 존재 하에서 pH 8.0에서 50mM 트리스 완충액에서 균질화하였다. 2개의 라니 경로를 1000bar에 적용하였다.

ㆍ8M 우레아를 균질화물에 첨가한 후에 pH 7에서 포스페이트 완충액 중에서 8M 우레아로 평형화된 CM 하이퍼Z 수지(BioSepra)에 가하였다. 배치식으로 항원을 포획하였다. 이후, 수지를 칼럼에 패킹하고, 비결합 단백질을 평형 완충액으로 세척해내고, 결합된 숙주 세포 단백질(HCP)을 120mM NaCl로 예비 용리 단계에 의해 제거하였다. 이후, F4co를 pH 7.0에서 포스페이트 완충액에서 360mM NaCl, 8M 우레아, 10mM DTT로 용리하였다.

ㆍ 상기 융합 단백질의 산화적 응집을 조절하기 위해, F4co의 시스테인기가 요오도아세트아미드에 의해 카르복시아미드화될 수 있다. 그러므로, 임의로 50mM 요오도아세트아미드를 CM 하이퍼Z 용리물에 첨가하고, 암실에서 30분 동안 실온에서 카르복시아미드화를 수행하였다.

ㆍ 이후, CM 하이퍼Z 용리물을 충분히 희석하고(약 5 내지 8배), pH 9.0으로 조절하였다. 이후, F4co 또는 F4coca를 pH 9.0에서 트리스 완충액 중에서 8M 우레아의 존재 하에 Q 세파로스 칼럼(Amersham Bioscience)에 결합시켰다. 비결합 단백질을 평형 완충액으로 세척해내고, 동일 완충액 중의 90mM NaCl에 의한 예비 용리 단계(단지 비카르복시아미드화된 단백질을 지닌)로 결합된 HCP를 제거하였다. F4co를 pH 9.0에서 트리스 완충액 중에서 200mM NaCl, 8M 우레아에 의해 칼럼으로부터 탈착시켰다.

ㆍ 샘플을 1ℓ의 0.5M 아르기닌, 10mM 트리스 완충액, 10mM 글루타티온(단지 비카르복시아미드화된 단백질에 첨가됨)에 대해 밤새 투석 멤브레인(12-14kDa 컷-오프(cut-off))으로 RT에서 2회 투석하였다. 다르게는, 완충액 교체는 30 또는 50kDa 컷-오프를 지닌 접선흐름방식(tangential-flow) 멤브레인을 사용하여 동일한 완충액의 10배 샘플 부피에 대해 투석여과에 의해 달성하였다.

ㆍ 끝으로, 투석된 생성물을 0.22㎛ 멤브레인을 통해 무균 여과하였다.

연속되는 정제 단계를 하기 플루오챠트로 표시하였다.

정제 플로우시트

균질화물 OD90(라니)

50mM 트리스 pH 8.0, 10mM DTT

↓

8M 우레아 첨가, pH 7.0으로 조절

↓

(+) CM 하이퍼Z 크로마토그래피

pH 7.0, 8M 우레아, 10mM DTT; 120mM NaCl에서 예비 용리, 360mM NaCl에서 용리

↓

선택적 카르복시아미드화: 50mM 요오도아세트아미드의 첨가, 실온에서 30분

↓

희석 및 pH 9.0으로 조절, 8M 우레아

↓

(+) Q 세파로스 FF 크로마토그래피

트리스 pH 9.0, 8M 우레아, 예비 용리, NaCl*로 용리

↓

투석/투석여과

→ 포스페이트 완충액, 0.5M 아르기닌, pH 8.5(10mM 글루타티온)

↓

살균 여과

F4co가 카르복시아미드화되지 않고, 글루타티온이 정제된 벌크에 존재한 경우, 모든 완충액은 DTT를 함유하였다. 환원제는 단백질이 카르복시아미드화되면 생략하였다. F4co에 대해 *NaCl은 200mM NaCl이고, F4coca에 대해, 용리는 NaCl의 구배에 의하여 이루어졌다. 이 단계는 60mM NaCl로 예비용리하고, 100mM NaCl로 용리하므로써 F4coca에 대해 추가로 최적화될 수 있고, F4co에 대해 100mM NaCl(예비 용리 단계가 요구되지 않음)에 의해 추가로 최적화될 수 있다.

결과: F4co의 정제

도 17은 F4co의 정제 및 카르복시아미드화된 F4co("F4coca")의 정제 동안에 수거된 F4 함유 분획의 SDS 겔을 도시한 것이다.

CM 하이퍼Z 수지는 8M 우레아의 존재 하에서 미정제 균질화물(레인 1)로부터 F4co를 완전히 포획하였으며, 360mM NaCl로 정량적 용리를 달성하였다. 도 2에 도시된 CM 하이퍼Z 용리물은 F4co에 상당히 풍부하였다. 샘플의 적합한 용리 및 pH로의 조절 후, F4co 또는 F4coca가 Q 세파로스 칼럼에 결합하였다. 이후, F4co 또는 F4coca를 레인 3에 도시된 바와 같이 200mM NaCl로 특이적으로 용리하였다. 이 크로마토그래피는 잔류하는 숙주 세포 단백질 뿐만 아니라 DNA 및 엔도톡신을 제거하였다. 포뮬레이션 적합성 완충액 중에서 정제된 물질을 얻기 위해, Q 세파로스 용리물을 10mM 트리스 완충액, 0.5M 아르기닌, 10mM 글루타디온에 대해 pH 8.5에서 12-14 kDa 컷-오프를 가진 투석 멤브리레인에서 투석하였다. 글루타디온은 카르복시아미드화된 단백질과 함께 생략되었다.

F4co 및 F4coca 둘 모두의 정제로 배양액 OD 130의 리터당 약 500mg의 정제된 물질을 수득하였다. 이는 비-코돈 최적화된 F4가 함께하기 이전에 관찰된 범위와 유사하였다.

상기 기술된 바와 같이, 두개의 상이한 정제 방법(I 및 II)은 상이한 F4 작제물을 정제하기 위해 개발되었다. 도 18은 수득된 상이한 정제된 벌크를 비교한 것이다.

도 18에서 SDS 겔은, 두개의 상이한 단백질, 즉, F4 및 F4co의 차별되는 패턴을 분명하게 도시하고 있다. F4는 몇몇 강한 저분자량(LMW) 밴드를 제공한 반면, 코돈 최적화된 F4co에서는 희미한 밴드만 볼 수 있다. 방법 I 및 방법 II는 매우 유사한 F4co 패턴을 제공한다. 항-E.coli 웨스턴 블롯 분석에서는, 정제된 단백질의 순도가 숙주 단백질 오염율이 모든 제제에서 1% 미만인 것으로 나타났음을 확인시켜 주었다.

실시예 9: 마우스에서의 F4의 면역원성

포뮬레이션:

애주번트 포뮬레이션(1B):

애주번트 포뮬레이션(1B)을 제조하기 위해 유기 용매 중의 지질(예컨대, 난황으로부터 또는 합성의 포스파티딜콜린)과 콜레스테롤 및 3D-MPL의 혼합물을 진공 하에(또는 다르게는, 불활성 기체의 스트림 하에) 건조시켰다. 이후, 수용액(예컨대 포스페이트 완충 염수)을 첨가하고, 모든 지질이 현탁액 상태가 될 때까지 용기를 교반하였다. 이후, 이 현탁액을 리포좀 크기가 약 100nm로 감소될 때까지 마이크로유체화시킨 후, 0.2㎛ 필터를 통해 살균 여과하였다. 압출 또는 초음파 처리가 이 단계를 대신할 수 있다.

일반적으로, 콜레스테롤: 포스파티딜콜린의 비는 1:4(w/w)이며, 수용액이 첨가되어 최종 콜레스테롤 농도가 5 내지 50mg/ml가 된다.

리포좀은 100nm의 정해진 크기를 가지며, SUV(small unilamelar vesicles)로서 언급된다. 이러한 용액이 반복적으로 동결 및 해동되면, SUV는 융합하여 크기가 500nm 내지 15㎛ 범위인 MLV(large multilamellar structures)를 형성한다. 리포좀은 그 자체로 시간의 경과에도 안정하며, 용해 능력을 전혀 갖지 않는다. 수용액 중의 QS21를 상기 리포좀에 첨가하여 최종 3D-MPL 및 QS21의 농도가 100㎍/ml에 이르도록 하였다.

포뮬레이션 2A: 수중유 에멀젼 중의 3 De 아실화된 모노포스포릴 지질 A 및 QS21;

수중유 에멀젼을 WO 95/17210에 언급된 바와 같은 프로토콜에 따라 제조하였다. 구체적으로, 상기 에멀젼은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페놀, 2.0% 트윈 80을 함유하고, 입자 크기는 180nm이다.

수중유 에멀젼의 제조(2배 농축)

트윈 80을 포스페이트 완충 염수(PBS)에 용해시켜 PBS 중의 2% 용액을 형성하였다. 100ml의 2배 농축 에멀젼을 제공하기 위해, 5g의 DL 알파 토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌을 와동시켜 철저히 혼합하였다. 90ml의 PBS/트윈 용액을 첨가하고, 철저히 혼합하였다. 이후, 형성된 에멀젼을 주사기를 통과시키고, 끝으로 M110S 마이크로유체화기를 사용하여 마이크로유체화시켰다. 형성된 오일 방울은 크기가 대략 180nm였다.

살균된 벌크 에멀젼을 PBS에 첨가하여 최종 농도가 500㎕/ml의 에멀젼(v/v)에 도달되도록 하였다. 이후, 3D-MPL을 첨가하여 최종 농도가 100㎍에 이르도록 하였다. 이후, QS21을 첨가하여 최종 농도가 100㎍/ml에 이르도록 하였다. 성분의 각각 첨가하는 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

정제 방법 I에 따라 정제된 코돈 최적화되지 않은 F4Q를 포스페이트/아르기닌 완충액 pH 6.8로 희석하였다. 희석물을 두개의 상이한 농축 애주번트(애주번트 2A 및 1B)와 혼합하여 290mM(애주번트 2A에 대해) - 300(애주번트 1B에 대해)mM 아르기닌, 50㎍ MPL 및 50㎍ QS21의 존재 하에 500㎕의 F4의 40㎍/용량의 최종 포뮬레이션을 얻었다. 100㎕의 각각의 포뮬레이션을 마우스에 주입하였다.

F4(p24, p17, RT 및 Nef)내에서 발견된 4개의 항원에 대한 세포 및 체액 면역 반응을 평가하기 위해 마우스 면역원성 연구를 수행하였다.

F4 항원의 복잡성으로 인해, 각각의 유전적 배경이 상이한 8개의 마우스 스트레인을 상기 기술된 바와 같이 제조된 8㎍의 애주번트 F4 단백질, 100㎕ 부피에서 0일째 및 21일째에 2회 면역화하였다. 혈청 및 비장 샘플을 F4의 네성분(p24, p17, RT 및 Nef) 및 F4 각각의 체액 및 세포 반응을 분석하기 위해 마지막 면역화(35일) 이후 14일째에 수거하였다.

전체 항체 반응을 p24, p17, RT, Nef 및 F4에 대해 특이적인 ELISA로 특징화하였다. 하기 표, 표2는 항원 특이적 체액 반응이 각 스트레인에서 관찰된 것을 요약한 것이다. 이 결과는 애주번트 단독으로 면역화된 동물을 제어하는 지에 대해 비교한 항체의 존재 또는 비존재를 나타낸다. 제시된 결과는 두개의 독립된, 그러나 동일한 실험으로부터 수집된 결과이다. 표에서, 2A는 수중유 에멀젼에서 3D-MPL 및 QS21로 포뮬레이션된 항원을 나타내고, 1B는 3D-MPL, QS21 및 콜레스테롤 함유 리포좀으로 포뮬레이션된 항원을 나타낸다.

표 2

OF1 마우스는 모든 4개의 F4 성분에 대해 항체 반응을 개시하였다. 관찰된 반응이 도 19에 도시된다. +/-는 관찰된 반응이 약하거나 두개의 애주번트 중 하나에서만 관찰되었음을 나타낸다. 예컨대, B6D2F1 마우스 p17반응: +2A 및 -1B와 함께 전체적으로 +/-라는 것은 2A(약하지 않음)과 반응이 있었고, 1B와는 반응이 없었음을 의미한다. Balb/c 마우스 p17 반응: +/- 2A 및 -1B와 함께 전체적으로 -라는 것에서, +/-는 애주번트 2A와의 반응이 약하다는 것을 의미한다.

세포 반응은 CD4 및 CD8, IFNγ 및 IL-2 발현을 위한 유세포 분석 염색(IFNγ 및 IL-2 발현을 위한 세포내 시토킨 염색) 및 이후의 11량체 중첩을 지닌 15량체의 펩티드 라이브러리 푸울을 사용하는, p24, p17, RT 또는 Nef 특이적 펩티드를 지닌 비장 세포의 재자극에 의해 특징화된다. CD 반응이 관찰된 우세한 세포 반응이다. 하기 표 3은 항원 특이적 CD4+IL-2+반응이 각각의 마우스 스트레인에 대해 관찰된 경우를 요약한 것이다. 다시 말하면, 이는 반응의 존재 또는 부재를 나타낸다.

표 3

DBA 마우스는 모든 4개의 F4 성분에 대해 CD4 반응을 일으켰다. 마우스에 대해 관찰된 CD4+IL-2+ 및 CD4+IFNγ+ 반응이 도 20에 도시된다.

요약하면, 두개의 애주번트 포뮬레이션중 어느 하나로 포뮬레이션된 F4는 p24, p27, RT 및 Nef에 대한 체액 및 세포 반응을 촉진시킬 수 있다. 이는 F4의 각 영역이 생체내 위치에서 면역원성임을 나타내는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals SA Abrecht, Helge Delchambre, Martine Marchand, Martine Mathy, Nathalie, Louise Permanne, Philippe, Jean, Gervais, Ghislain Voss, Gerald, Hermann <120> Vaccine <130> VB60990 <140> PCT/EP2005/008434 <141> 2005-08-03 <160> 19 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p24-RT-Nef-p17 fusion <400> 1 atggttatcg tgcagaacat ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact 60 ttaaatgcat gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg 120 ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct aaacacagtg 180 gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa 240 tgggatagag tacatccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca 300 aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca 360 aataatccac ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat ggataatcct gggattaaat 420 aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggaca taagacaagg accaaaagaa 480 ccttttagag actatgtaga 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Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu His Met Gly Pro Ile Ser Pro Ile 225 230 235 240 Glu Thr Val Ser Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val 245 250 255 Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile 260 265 270 Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu 275 280 285 Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr 290 295 300 Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln 305 310 315 320 Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys 325 330 335 Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 340 345 350 Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro 355 360 365 Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu 370 375 380 Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr 385 390 395 400 Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr 405 410 415 Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln 420 425 430 His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His Leu Leu Arg Trp Gly 435 440 445 Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Lys 450 455 460 Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Val 465 470 475 480 Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val 485 490 495 Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg 500 505 510 Gln Leu 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aacatctgct tcgatggggc ctcactactc ccgacaagaa gcaccagaag 1080 gagccgccgt tcctaaagat gggctacgag cttcatccgg acaagtggac agtacagccg 1140 atagtgctgc ccgaaaagga ttcttggacc gtaaatgata ttcagaaact agtcggcaag 1200 cttaactggg cctctcagat ttacccaggc attaaggtcc gacagctttg caagctactg 1260 aggggaacta aggctctaac agaggtcatc ccattaacgg aggaagcaga gcttgagctg 1320 gcagagaatc gcgaaattct taaggagccg gtgcacaggg tatactacga cccctccaag 1380 gaccttatag ccgagatcca gaagcagggg cagggccaat ggacgtacca gatatatcaa 1440 gaaccgttta agaatctgaa gactgggaag tacgcgcgca aacgaggggc tcatactaat 1500 gatgtaaagc aacttacgga agcagtacaa aagattacta ctgagtctat tgtgatatgg 1560 ggcaagaccc caaagttcaa gctgcccata cagaaggaaa catgggaaac atggtggact 1620 gaatattggc aagctacctg gattccagaa tgggaatttg tcaacacgcc gccgctggta 1680 aaactgaggc ctatgggtgg caagtggtca aaaagtagtg tggttggatg gcctactgta 1740 agggaaagaa tgagacgagc tgagccagca gcagatgggg tgggagcagc atctcgagac 1800 ctggaaaaac atggagcaat cacaagtagc aatacagcag ctaccaatgc tgcttgtgcc 1860 tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag tcacacctca ggtaccttta 1920 agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 1980 ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 2040 acacaaggct acttccctga ttggcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca 2100 ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc 2160 aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc tgcatggaat ggatgaccct 2220 gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga 2280 gagctgcatc cggagtactt caagaactgc taa 2313 <210> 17 <211> 770 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p17-p51-Nef (F3) <400> 17 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp 85 90 95 Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 100 105 110 Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val 115 120 125 Ser Gln Asn Tyr Leu Asp Arg Thr Gly Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr 130 135 140 Val Ser Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln 145 150 155 160 Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr 165 170 175 Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro 180 185 190 Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp 195 200 205 Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe 210 215 220 Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys 225 230 235 240 Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro 245 250 255 Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile 260 265 270 Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln 275 280 285 Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile 290 295 300 Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr 305 310 315 320 Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg 325 330 335 Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr 340 345 350 Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Lys Met Gly 355 360 365 Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro 370 375 380 Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys 385 390 395 400 Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu 405 410 415 Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu 420 425 430 Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys 435 440 445 Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala 450 455 460 Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln 465 470 475 480 Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg Gly 485 490 495 Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile 500 505 510 Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe Lys Leu 515 520 525 Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Tyr Trp Gln 530 535 540 Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val 545 550 555 560 Lys Leu Arg Pro Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly 565 570 575 Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp 580 585 590 Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr 595 600 605 Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala 610 615 620 Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu 625 630 635 640 Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys 645 650 655 Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp 660 665 670 Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp 675 680 685 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly 690 695 700 Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala 705 710 715 720 Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly 725 730 735 Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg 740 745 750 Leu Ala Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys 755 760 765 Asn Cys 770 <210> 18 <211> 3000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4(p51)* <400> 18 atggttatcg tgcagaacat ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact 60 ttaaatgcat gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg 120 ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct aaacacagtg 180 gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa 240 tgggatagag tacatccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca 300 aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca 360 aataatccac ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat ggataatcct gggattaaat 420 aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggaca taagacaagg accaaaagaa 480 ccttttagag actatgtaga ccggttctat aaaactctaa gagccgagca agcttcacag 540 gaggtaaaaa attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag 600 actattttaa aagcattggg accagcggct acactagaag aaatgatgac agcatgtcag 660 ggagtaggag gacccggcca taaggcaaga gttttgcata tgaggcctgg tccgatctct 720 ccgatagaaa cagtttcggt caagcttaaa ccagggatgg atggtccaaa ggtcaagcag 780 tggccgctaa cggaagagaa gattaaggcg ctcgtagaga tttgtactga aatggagaag 840 gaaggcaaga taagcaagat cgggccagag aacccgtaca atacaccggt atttgcaata 900 aagaagaagg attcaacaaa atggcgaaag cttgtagatt ttagggaact aaacaagcga 960 acccaagact tttgggaagt ccaactaggt atcccacatc cagccggtct aaagaagaag 1020 aaatcggtca cagtcctgga tgtaggagac gcatatttta gtgtaccgct tgatgaggac 1080 ttccgaaagt atactgcgtt tactataccg agcataaaca atgaaacgcc aggcattcgc 1140 tatcagtaca acgtgctccc gcagggctgg aaggggtctc cggcgatatt tcagagctct 1200 atgacaaaaa tacttgaacc attccgaaag cagaatccgg atattgtaat ttaccaatac 1260 atggacgatc tctatgtggg ctcggatcta gaaattgggc agcatcgcac taagattgag 1320 gaactgaggc aacatctgct tcgatggggc ctcactactc ccgacaagaa gcaccagaag 1380 gagccgccgt tcctaaagat gggctacgag cttcatccgg acaagtggac agtacagccg 1440 atagtgctgc ccgaaaagga ttcttggacc gtaaatgata ttcagaaact agtcggcaag 1500 cttaactggg cctctcagat ttacccaggc attaaggtcc gacagctttg caagctactg 1560 aggggaacta aggctctaac agaggtcatc ccattaacgg aggaagcaga gcttgagctg 1620 gcagagaatc gcgaaattct taaggagccg gtgcacaggg tatactacga cccctccaag 1680 gaccttatag ccgagatcca gaagcagggg cagggccaat ggacgtacca gatatatcaa 1740 gaaccgttta agaatctgaa gactgggaag tacgcgcgca aacgaggggc tcatactaat 1800 gatgtaaagc aacttacgga agcagtacaa aagattacta ctgagtctat tgtgatatgg 1860 ggcaagaccc caaagttcaa gctgcccata cagaaggaaa catgggaaac atggtggact 1920 gaatattggc aagctacctg gattccagaa tgggaatttg tcaacacgcc gccgctggta 1980 aaactggccc tagctatggg tggcaagtgg tcaaaaagta gtgtggttgg atggcctact 2040 gtaagggaaa gaatgagacg agctgagcca gcagcagatg gggtgggagc agcatctcga 2100 gacctggaaa aacatggagc aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgcttgt 2160 gcctggctag aagcacaaga ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct 2220 ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg 2280 ggactggaag ggctaattca ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac 2340 cacacacaag gctacttccc tgattggcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat 2400 ccactgacct ttggatggtg ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag 2460 gccaataaag gagagaacac cagcttgtta caccctgtga gcctgcatgg aatggatgac 2520 cctgagagag aagtgttaga gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc 2580 cgagagctgc atccggagta cttcaagaac tgcaggccta tgggtgcgag agcgtcagta 2640 ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa 2700 aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat 2760 cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc 2820 cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt 2880 gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag 2940 caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag 3000 <210> 19 <211> 1005 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F4(p51)* <400> 19 Met Val Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala 20 25 30 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 50 55 60 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu 65 70 75 80 Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu His Met Arg Pro Gly Pro Ile Ser 225 230 235 240 Pro Ile Glu Thr Val Ser Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro 245 250 255 Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val 260 265 270 Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly 275 280 285 Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp 290 295 300 Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg 305 310 315 320 Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly 325 330 335 Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr 340 345 350 Phe Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr 355 360 365 Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn 370 375 380 Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser 385 390 395 400 Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val 405 410 415 Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile 420 425 430 Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His Leu Leu Arg 435 440 445 Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe 450 455 460 Leu Lys Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro 465 470 475 480 Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys 485 490 495 Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys 500 505 510 Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Glu 515 520 525 Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg 530 535 540 Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys 545 550 555 560 Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr 565 570 575 Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala 580 585 590 Arg Lys Arg Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala 595 600 605 Val Gln Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro 610 615 620 Lys Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr 625 630 635 640 Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr 645 650 655 Pro Pro Leu Val Lys Leu Ala Leu Ala Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys 660 665 670 Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala 675 680 685 Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys 690 695 700 His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys 705 710 715 720 Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr 725 730 735 Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu 740 745 750 Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser 755 760 765 Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly 770 775 780 Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr 785 790 795 800 Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp 805 810 815 Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro 820 825 830 Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp 835 840 845 Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His 850 855 860 Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Arg Pro Met Gly Ala Arg Ala Ser Val 865 870 875 880 Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro 885 890 895 Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg 900 905 910 Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu 915 920 925 Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly 930 935 940 Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys 945 950 955 960 Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys 965 970 975 Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala 980 985 990 Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val Ser Gln Asn Tyr 995 1000 1005

Claims (28)

1. Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체, 및 p17 Gag 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우에, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편이 존재하는 폴리펩티드.
2. 제 1항에 있어서, Pol 또는 RT 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, RT 또는 면역원성 단편이 RT가 C 말단에서 절두되어 카르복시 말단 RN아제 H 도메인이 결여된 단편인 폴리펩티드.
4. 제 3항에 있어서, RT 단편이 p51 단편인 폴리펩티드.
5. 제 2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RT가 메티오닌이 또 다른 잔기, 예를 들어 리신에 의해 치환되는 592 위치에서의 변이를 포함하는 폴리펩티드.
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, Nef가 전장 Nef인 폴리펩티드.
7. 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 폴리펩티드:

   1. p24-RT-Nef-p17

   2. p24-RT*-Nef-p17

   3. p24-p51RT-Nef-p17

   4. p24-p51RT*-Nef-p17

   5. p17-p51RT-Nef

   6. p17-p51RT*-Nef

   7. Nef-p17

   8. 링커를 지닌 Nef-p17

   9. p17-Nef

   10. 링커를 지닌 p17-Nef

   (상기에서, *는 RT 메티오닌₅₉₂의 리신으로의 변이를 나타낸다).
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 정제하는 방법으로서,

   i). 정제되지 않은 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고;

   ii). 조성물을 2개 이상의 크로마토그래피 단계로 처리하고;

   iii). 임의로 폴리펩티드를 카르복시아미드화시키고;

   iv). 완충액 교체 단계를 수행하여 약제 포뮬레이션을 위한 적합한 완충액 중에 단백질을 제공하는 것을 포함하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 두개 이하의 크로마토그래피 단계가 존재하는 방법.
10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 카르복시아미드화가 두개의 크로마토그래피 단계 사이에 수행되는 방법.
11. (i) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체, 및 (ii) p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드, 또는 (i) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체, 및 (ii) p17 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
12. 제 11항에 있어서, RT 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
13. (i) Nef 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체 및 p17 Gag 및/또는 p24 Gag 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하고, p17 및 p24 Gag 둘 모두가 존재하는 경우, 이들 사이에 하나 이상의 HIV 항원 또는 면역원성 단편이 존재하는 폴리펩티드 및 (ii) p51 RT 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, (i)이

    1. Nef-p17

    2. 링커를 지닌 Nef-p17

    3. p17-Nef

    4. 링커를 지닌 p17-Nef로부터 선택되는 조성물.
15. 제 12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RT 또는 이의 면역원성 단편이 RT가 C 말단에서 절두되어 카르복시 말단 RN아제 H 도메인이 결여된 단편인 조성물.
16. 제 15항에 있어서, RT 단편이 p51 단편인 조성물.
17. 제 11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, RT가 메티오닌이 또 다른 잔기, 예를 들어 리신에 의해 치환되는 592 위치에서의 변이를 포함하는 조성물.
18. 제 11항 내지 제 17항중 어느 한 항에 있어서, Nef가 전장 Nef인 조성물.
19. 4개 이상의 HIV 항원 또는 이의 면역원성 단편 또는 유도체를 포함하는 HIV 항원의 융합체인 폴리펩티드로서, 4개의 항원 또는 단편이 Nef, Pol 및 Gag이거나, 이로부터 유래되는 폴리펩티드.
20. 제 19항에 있어서, Gag가 융합체내 하나 이상의 다른 항원에 의해 분리되는 두개의 분리된 성분으로서 존재하는 폴리펩티드.
21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, Nef가 전장 Nef인 폴리펩티드.
22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, Pol이 p66 또는 p51RT인 폴리펩티드.
23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, Gag가 p17 및 p24 Gag인 폴리펩티드.
24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조성물 또는 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드(들).
25. p51 RT 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 이를 엔코딩하는, 바람직하게는 E.coli에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 폴리누클레오티드.
26. 제 25항에 따른 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드.
27. 제1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드, 또는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 조성물, 또는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 정제된 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 애주번트와 함께 포함하는 약제 조성물.
28. 제 27항에 있어서, 애주번트가 QS21 또는 3D-MPL과 같은 Th1 유도 애주번트 또는 QS21과 3D-MPL의 조합물인 약제 조성물.

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