KR20050094806A

KR20050094806A - 티오유레아를 함유하는 탈색소침착제 또는 항돌연변이 및항암제용 의약품

Info

Publication number: KR20050094806A
Application number: KR1020057006214A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 쟝; 세리프 라비; 베로니끄 슈와브
Original assignee: 엘엠디
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2005-09-28
Also published as: US20060135618A1; FR2845599A1; WO2004032912A1; AU2003286213A1; NO20052176L; EP1553933B1; CA2501742A1; ATE367807T1; JP2006509733A; FR2845599B1; EP1553933A1; DE60315176D1; MXPA05003891A

Abstract

본 발명은 일반식 I의 티오유레아, 일반식 IIa, IIb 및 III을 갖는 상기 티오유레아의 모노 또는 디옥사이드 유도체, 또는 이들의 혼합물을 적어도 한 종 이상 함유하는 의약품 또는 화장 조성물에 관한 것이다. 상기 의약품은 항돌연변이제 및 항암제로서 뿐만 아니라, 티로시나제 저해용, 멜라닌 합성 저해용, 피부 미백 또는 탈색소침착용, 또는 피부 흠집 제거용으로 적절하게 사용된다.

Description

티오유레아를 함유하는 탈색소침착제 또는 항돌연변이 및 항암제용 의약품{MEDICINE COMPRISING A THIOUREA FOR USE AS DEPIGMENTING AGENT OR ANTI-MUTAGENIC AND ANTI-CARCINOGENIC AGENT}

본 발명은, 항돌연변이 작용 및/또는 항암 작용 뿐만 아니라 탈색소침착 작용(depigmenting action)을 갖는, 티오유레아 또는 이들의 모노 또는 디옥사이드 유도체를 함유하는 의약품에 관한 것이다.

사람의 피부 색소침착(skin pigmentation)은 멜라노사이트(melanocyte)라고 알려진 독특한 세포 개체군에서 발생하는 세포의 복잡한 연속 작용에 기인한다. 멜라노사이트는 표피의 하부에 위치하고, 이들은 자외선 조사에 기인한 손상 작용로부터 신체를 보호하는 갈색 색소인 멜라닌을 합성하는 기능을 한다. 이러한 멜라닌은 멜라노사이트 내부에 존재하는 소포인 멜라노좀에 침적된다. 멜라노좀은 멜라노사이트로부터 방출되어, 멜라노좀에 존재하는 멜라닌을 동화하는 케라티노사이트(keratinocyte)에 의해, 피부 표면으로 운반된다. 피부의 어두운 혈색은 멜라노사이트에 의해 합성되어 케라티노사이트에 전달되는 멜라닌의 양에 비례한다.

몇몇 경우에, 예를 들어 피부를 밝게 하거나, 노화에 기인한 흠(blemish)을 제거하기 위해 또는 멜라노사이트의 과활성을 감소시키기 위해, 멜라닌합성을 감소시키거나 억제하는 것이 바람직하다.

과산화수소 또는 과산화아연과 같은 과산화물을 포함하는 화장료 조성물(cosmetic composition)을 피부상에 나타나는 주근깨와 같은 흠을 제거하려는 목적으로 장기간 사용하여왔다. 그러나, 과산화물은 매우 불안정하여 저장에 문제가 있다. 또한, 이러한 과산화물을 미용 기초재료에 안정적으로 혼입시키는 것은 어렵고, 과산화물 자체는 충분한 미백효과를 가지고 있지 않다.

한편, 비타민 C, 시스테인 또는 콜로이드성 황을 함유하는 화장료 조성물을 피부미백의 목적으로 사용하기 시작하였다. 그러나, 이러한 물질들의 효과는 만족스럽지 못하였다.

오랜기간 동안, 히드로퀴논(Hydroquinone)은 다양한 피부미용 조제에 사용되어 온 참고 탈색소침착 분자이다. 그러나, 이 제품도 위험을 가지고 있고, 멜라노사이트에 대한 심각한 세포독성을 가지고 있어 회복할 수 없는 탈색소침착화를 야기시킬 위험이 있다.

코직산(Kojic acid)은 최근 사람의 피부에서 멜라닌의 형성을 억제하는 물질로서 효과적으로 사용되고 있다. 결과적으로, 코직산을 함유하거나(일본 특허공보 No. 56-18569), 또는 계피산 또는 벤조산과 같은 방향족 카르복시산과의 코직산 에스테르를 함유하거나(일본 특허공보 No. 60/100005), 또는 코직산의 디에스테르를 함유하는(일본 특허공보 Nos. 61-60801 및 60-17961) 피부 탈색소침착 목적의 다양한 화장료 조성물이 개시되어 있다. 따라서, 이러한 코직산 및 코직산 에스테르는 멜라닌합성을 억제할 수 있는 물질로 알려져 있다. 그러나, 코직산의 효율은 개인에 따라 편차를 나타내며, 평균적으로는 불충분하다.

이소티오시아네이트 및 티오시아네이트들이 탈색소침착제로서 개시되어 있다(WO 02/058664).

결과적으로, 다른 탈색소침착 물질을 탐색하는 것은 여전히 주요한 관심사이다.

현재까지, 단지 페닐티오유레아가 탈색소침작 활성을 갖는 것으로 개시되어 있다(미국 특허공보 2002/0044914).

티오유레아, 페닐티오유레아 및 디메틸티오유레아과 같은 몇몇 다른 티오유레아는 감작을 유발하는 것으로 알려져 있다(티오유레아 및 이의 유도체와 관련된 접촉 및 광접촉문제: 문헌 리뷰 및 케이스 보고. 에이. 둠즈-구센즈 등, 영국 저널 더마톨로지, 116, 4, 573-579). 더 나아가, 이들 중 몇몇은 갑상선 저해제로서 알려져 있다.

놀랍게도, 본 출원인은 티오유레아 계열에 속하는 특정 분자들이 생체 외에서 멜라닌 합성에 대한 현저한 저해효과를 갖고 있음을 발견하였다.

명백히, 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)티오유레아는 설포라판(탈색소침착 활성을 갖는 이소시아네이트; WO 02/058664)의 분해산물의 하나로 알려져 있으며, 상기 설포라판은 피부와의 연장된 접촉에 의해, 특히 아래의 과정에 의해 뜨거운 물과 반응하여 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)티오유레아로 분해된다.

(수용액에서의 설포라판의 열분해, 이 진, 밍푸 왕, 로버트 티. 로젠 및 치탕호, J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 3121-3123).

그러나, 이것의 약학적 또는 화장료 활성, 특히 탈색소침작제로서는 종래기술의 문헌에서 개시되어 있지 아니하며, 제안되지도 아니하였고, 탈색소침착제의 분해산물이 상기 탈색소침착제 보다 더 큰 활성을 갖는다는 것은 자명하지도 아니하다.

돌연변이는, DNA에서 그리고 세포의 발현과정에서 자발적으로 그리고 자연히, 또는 화학약품, 고에너지 조사, 스트레스 등에 기인한 이차적 효과로서, 발생한다.

돌연변이유발원은 돌연변이를 유발하는 물질이다. 종종, 이들은 발암물질(암을 유발하는)이다. 현대 사회는 주위 환경에서 돌연변이유발원이 존재하는 것에 대해서 염려하고 근심한다. 돌연변이유발원은 모든 곳에서 발생하고, 몇몇은 식물에서 자연적으로 생성되고, 대부분은 유기물질을 태우는 과정(특히, 조리 과정)에서 발생하고, 산업현장에서 발생하기도 한다. 최근에, 사람들은 많은 건강문제에 직면하고 있다. 이들 건강 문제의 대부분은, 세포와 DNA의 손상을 증가시키는데 기여하는 돌연변이유발원 및 돌연변이 유발요인에 의해 초래되는, 인간 세포 및 DNA 손상에 기인한다. 이들 돌연변이유발원 및 돌연변이 유발요인으로는, 오염, 스트레스, 노화, 흡연, 자외선광, 과도한 운동, 조직 손상 등을 언급할 수 있다. 세포와 DNA의 손상에 의해 발생하는 질병들의 예로는, 노화, 노화에 기인한 흠, 암, 백내장, 건조한 피부, 피로, 피부암, 스트레스성 장애 및 주름을 언급할 수 있다.

약학적 조성물들이 항돌연변이 활성을 생체 내부에서 갖는 것이 유용할 수 있으나, 이들은 때때로 심각한 부작용을 갖는다.

결과적으로, 생체에서 돌연변이를 방지하는 항돌연변이 활성을 갖는, 그리고 항암활성을 갖는 새로운 물질을 발견하기 위한 요구가 있다.

놀랍게도, 본 출원인은 티오유레아 계열에 속하는 특정 분자들이 돌연변이 유발물질과 UVB에 대해서 현저한 항돌연변이 작용 및 항암작용 양자 모두를 갖고 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 아래의 일반식 I을 갖는 티오유레아, 일반식 IIa, IIb 및 III을 갖는 상기 티오유레아의 모노 또는 디옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 한종 이상 함유하는 의약품에 관한 것이다.

여기서, n은 1 내지 12의 정수이고,

m은 1 내지 12의 정수이고,

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 수소원자, C₁-C₆ 알킬기, 또는 아릴기이고,

여기서, R₁, R₂, R₃, R₄, m 및 n은 상기 일반식 I에서 정의된 바와 같다.

본 명세서에서, "C₁-C₆ 알킬기"라 함은 1 내지 6의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분쇄 알킬기를 의미하고, 특히 CH₃기이다.

본 명세서에서, "아릴기"라 함은, 5 내지 8의 탄소원자를 가지는 하나 이상의 방향족 환을 의미하고, 이들은 컨쥬게이션되거나 융합될 수 있다. 특히, 상기 아릴기는 페닐 또는 나프틸기가 될 수 있고, 이들은 할로겐 원자, 상기에서 정의된 알킬기, OH기 또는 니트로기에 의해 치환될 수 있다.

바람직하게는, 상기 일반식 I, IIa, IIb 및 III을 갖는 티오유레아가 R₁ 및 R₂가 서로 같고, R₃ 및 R₄가 서로 같고, m=n인 경우이다.

보다 바람직하게는, R₁=R₂=CH₃인 경우이다.

바람직하게는, m=n=4인 경우이다.

바람직하게는, R₃=R₄=H인 경우이다.

더 더욱 바람직하게는, 상기 의약품이 아래의 식을 갖는 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)티오유레아, 1-(5-메탄설피닐부틸)-3-(5-메탄설포닐부틸)티오유레아, 또는 1,3-비스-(5-메탄설포닐부틸)티오유레아를 포함한다.

본 발명에 따른 티오유레아는 상업적으로 시판되거나, 또는 제조될 수 있다. 예를 들면, 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)티오유레아의 경우, 설포라판의 열분해로부터 제조될 수 있다. 특히, 모노 또는 디옥사이드 유도체들은 대응되는 미산화 티오유레아로부터 산화제, 예를 들면 과산화수소의 작용에 의해 제조할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 의약품은 티로시나제(tyrosinase) 저해용으로, 특히 티로시나제의 활성을 50% 억제시키는 용도로, 멜라닌 합성 저해용으로, 및 멜라노사이트의 과활성 억제용으로 사용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 의약품은 항돌연변이제, 특히 돌연변이 유발물질 및/또는 UVB에 대한 항돌연변이제, 및/또는 항암제의 용도로 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 의약품은 암 발생(특히 피부암의 발생), 노화 흠(특히 피부노화 흠) 및 주름 예방용으로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 아래의 일반식 I을 갖는 티오유레아, 일반식 IIa, IIb 및 III을 갖는 상기 티오유레아의 모노 또는 디옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 한종 이상 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

여기서, n은 1 내지 12의 정수이고,

m은 1 내지 12의 정수이고,

바람직하게는, 상기 화장료 조성물이 탈색소침착 조성물이다. 상기 조성물은 표피(epidermis)를 밝게하거나, 미백하거나, 탈색소침착하기 위해, 피부 흠(특히, 노화로부터 초래되는 피부 흠) 또는 주름을 제거하기 위해, 또는 표피의 색소침착을 예방하기 위해 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물이 국소투여용 제형인 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 의약품 또는 화장료 조성물은 경구투여용 또는 국소투여용, 더욱 바람직하게는 국소투여용이다.

이들은 부형제, 특히 활성 성분의 물성 및 접근성을 향상시키기 위한 피부침투용 부형제와 함께 공지된 투여 형태의 제형, 예를 들면, 로션, 무스, 젤, 분산액, 스프레이, 혈청, 마스크, 바디로션 또는 크림의 형태로 제제화할 수 있다. 이들 제제는, 활성성분과 부형제 외에도, 생리학적으로 허용되는 용제, 일반적으로 물, 또는 알코올, 에테르 또는 글리콜과 같은 용매를 추가로 함유한다. 이들은 계면활성제, 보존제, 안정화제, 에멀젼제, 농축제, 시너지 효과를 추가적으로 제공하는 다른 활성성분, 미립자(trace element), 에센셜 오일, 향수, 착색제, 콜라겐, 화학 또는 광물 필터, 습윤제 또는 핫 스프링 워터를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 화장료 조성물을 피부에 적용하는, 피부의 미용적 처리에 관한 것이다.

이하에서, 실시예를 들어 설명하나, 이것들은 제한적인 것이 아니다.

실시예 1: 설포라판으로부터 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)티오유레아의 합성

(D,L)-설포라판의 합성

4-클로로부티로니트릴 40 g(알드리치, 참조번호 3,000-0)을, 나트륨에서 미리 증류한 무수 에탄올 800 ml에 용해시켰다.

그 후, 메탄 티오에이트 27 g(플루카, 참조번호 71742)을 첨가하고, 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. 현탁액을 종이 상에서 여과하고, 감압 증발시켰다. 에틸 에테르 400 ml를 첨가하였다. 다시, 종이 상에서 여과하였다. 미정제된 4-메틸티오부티로니트릴 32 g을 함유하는 에테르 용액을 얻었다.

리튬 알루미늄 하이드라이드 20 g을 함유하는 에틸 에테르 현탁액 400 ml를 준비하였다. 상기 4-메틸티오부티로니트릴 용액을 상기 리튬 알루미늄 하이드라이드 현탁액에 천천히 첨가하고, 2시간 30분동안 환류하였다.

그 후, 환류를 계속 수행하면서, 증류수 80 ml를 천천히 첨가하여 현탁액을 중화시켰다. 끓음이 멈추었을 때, 증류수 120 ml를 첨가하여 잔존하는 모든 하이드라이드를 중화시켰다. 글라스 프릿 상에서 여과하였다. 필터 상에 존재하는 불용성 물질을 에틸 에테르 200 ml를 사용하여 세척하였다. 에테르 분획을 모아, 증발시켰다. 메틸티오부틸아민 26.9 g을 얻었다. 얻어진 생성물을 아세톤 80 ml에 용해시키고, 35% 과산화수소 23 ml를 조금씩 나누어 첨가하였다. 50℃의 물중탕에서 밤새 두었다. 그 후, 소량의 활성 차콜을 첨가한 후 여과하고, 티오포스겐 20 ml를 함유하는 클로로포름 200 ml를 천천히 첨가하고, 5% 수산화나트륨 수용액 300 ml를 첨가하였다. 반응이 일어나도록 30분 동안 두었다.

그 후, 상기 혼합물을 디클로로메탄 200 ml로 8회 추출하였다. 유기상을 취하고, 소듐 설페이트를 사용하여 건조시키고, 증발시켰다.

잔사를 135℃에서 7×10^-2 torr 하에서 증류하였다. D,L-설포라판 12.5 g을 수득하고, 이것의 식별은 질량분광분석기에 의해 증명하였다.

1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)-티오유레아의 합성

적외선 분광 스펙트럼을 퍼킨-엘머 1600 에프11알(니트) 상에서 얻었다.

수소 및 탄소-13 NMR 스펙트럼은, 수소의 경우 200 MHz에서, 탄소의 경우 50.3 MHz에서, 브루커 에이엠 200 에스와이 상에서 얻었다. 화학적 편이는 중수소화 CDCl₃의 신호에 상대적인 값으로, 중수소화 중심선에서 수소의 경우 7.25 ppm, 탄소의 경우 76.9 ppm에서 식별하였다.

질량분광스펙트럼은 화학적 이온화(NH₃) 또는 전자 충돌의 방법에 의해 노라막/시다르 브이 2.3 상에서 얻었다.

크로마토그라피

반응을 실리카겔형 60 에프 254(머크, 참조번호 7735) 플레이트를 사용한 박막 크로마토그라피를 사용하여 모니터링하였다. 시약과 생성물은 포스포몰리브산의 10% 에탄올 용액으로 처리하고 가열한 후, UV 광을 통해 시각적으로 관찰하였다. 플래쉬 크로마토그라피는 실리카겔 아이씨엔 60, 230-400 메쉬 상에서 수행하였다.

용매 증류

에틸 에테르 및 THF를, 질소 분위기에서, 나트륨/벤조페논 하에서 증류시켰다. 크로마토그라피용 시클로헥산, 에틸 아세테이트 및 메탄올은 증류한 후 사용하였다.

방법

불활성 분위기에서, 상기에서 수득한 설포라판 2 g(11 mmol)을 물 15 ml에 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하고, 빛으로부터 보호하였다. 상온에서, 용액을 감압농축시키고, 잔사를 크로마토그라피용 디클로로메탄에 용해시킨 후, 실리카겔 컬럼(용출액: CH₂Cl₂/CH₃OH: 90/10)상에서 크로마토그라피를 수행하여, 무색 오일 형태의 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)-티오유레아(이하, "비스 MSiBT") 1.70 g(5 mmol)을 43%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz): 6.45(dl, 2H, NH), 3.53(t. H, J = 6,0 Hz), 2.87(m, 4H), 2.65(s, 6H), 1.78(m, 8H).

¹³C NMR(50.3 MHz): 24.0(CH₂), 32.1(CH₂), 41.2(CH₂-CH₂), 47.2(CH₃), 57.4(CH₂SO), C(IV) 관찰되지 않음.

IR(v, cm^-1) : 2176, 2096, 1140, 940 cm^-1.

IC.MS m/z: 312(MH⁺).

실시예 2: 1-(5-메탄설피닐부틸)-3-(5-메탄설포닐부틸)-티오유레아의 제조

상기 설포라판 분자에 존재하는 두개의 황원자 중 단지 하나에 대한 산화를, 불활성 분위기 대신에 개방된 공기 분위기에서, 실시예 1의 1,3-비스-(5-메탄설피닐부틸)-티오유레아의 합성 반응을 수행하여 성취하였다.

설포라판 1 g(5.5 mmol)을 물 10 ml에 용해하고, 용액을 24시간 동안 환류하고, 빛으로부터 보호하였다.

상온에서, 용액을 감압농축시키고, 잔사를 크로마토그라피용 디클로로메탄에 용해시킨 후, 실리카겔 컬럼(용출액: CH₂Cl₂/CH₃OH: 90/10)상에서 크로마토그라피를 수행하여, 무색 오일 형태의 1-(5-메탄설피닐부틸)-3-(5-메탄설포닐부틸)-티오유레아(이하, "MSBMSBT") 200 mg을 12%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz): 6.55(solid, 2H, NH), 3.55(t, 4H, CH₂), 3.15(t, 2H, SO₂CH₂), 2.80(t, 2H, SOCH₂), 2.60(s, 3H, SOCH₃), 2.90(s, 3H, S0₂CH₃), 1.80-1.87(m, 8H, CH₂).

¹³C NMR(50.3 MHz): 20.5(CH₂), 28.5(CH₂), 39.8(CH₃SO), 41.0(CH₃S0₂), 43.5(CH₂-NH), 54.1(CH₂SO), 44.8(CH₂SO₂), 183.35(C=S).

IR(v, cm^-1): 2176, 2096, 1140, 940 cm^-1.

IC.MS m/z: 328(MH⁺).

실시예 3: 1-이소티오시아네이토-4-메틸설포닐부탄으로부터 1,3-비스-(5-메탄설포닐부틸)-티오유레아의 제조

1-이소티오시아네이토-4-메틸설포닐부탄 1 g(5 mmol)을 물 15 ml에 용해시켜 얻어진 용액을 3시간 동안 환류시켰다. 상온에서, 용액을 감압농축시키고, 잔사를 메탄올을 사용하여 재결정하여, 베이지색 고체 형태의 1,3-비스-(5-메탄설포닐부틸)-티오유레아(이하, "비스 MSoBT") 535 mg을 40%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz): 6.50(sl, H, NH), 3.55(t, 4H, J = 6.0 Hz), 2.75(t, 4H, SO₂CH₂), 2.60(s, 6H, S0₂CH₃), 1.70-1.90(m, 8H, CH₂CH₂).

¹³C NMR(50.3 MHz): 21.0(CH₂), 29.2(CH₂), 38.5(CH₃), 44.0(CH₂-NH), 53.9(CH₂SO), 182.6(C=S).

IR(v, cm^-1): 2168, 2096, 1144, 930 cm^-1.

IC.MS m/z: 344(MH⁺).

녹는점: 142℃.

실시예 4: 비스 MSiBT로부터 비스 MSoBT의 제조

비스 MSiBT(1 g, 3 mmol)의 아세톤 용액 10 ml에, 35% 과산화수소 0.70 ml(2.2 당량, 6.6 mmol)을 천천히 첨가하였다. 그 후, 반응이 일어나도록 상온에서 40시간 동안 두었다. 아세톤을 진공 증발로 제거하였다. 잔류 수용액에 클로로포름에 첨가하고, 황산나트륨으로 직접 트랩하였다. 유기상을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 메탄올을 사용하여 재결정하여, 베이지색 고체 형태의 비스 MSoBT를 30%의 수율로 수득하였다.

실시예 5: 코직산과 비교한 비스 MSoBT의 티로시나제 저해력 탐색

티로시나제의 저해력 측정:

다음의 반응을 이용하였다: 시그마 회사에서 시판되는 무색 L-도파(L-3,4-디히드록시페닐알라닌, 참조번호 D-9628)를 475 nm에서 흡광하는 유색 도파크롬으로의 산화. 본 반응은 진균류 티로시나제(EC 1.14.18.1, 시그마, 참조번호 T-7755)에 의해 촉매된다. 이러한 반응의 반응속도(Kinetics)는 30℃에서 시간에 대한 함수로서 광학밀도(optical density)를 측정함으로써 기록하였다.

사용한 다양한 용액의 조성은 다음과 같다:

완충용액 pH 6.8:

포스페이트 완충용액 0.1M, pH 6.8

기질 용액:

상기 pH 6.8 완충용액에서 L-도파 5 mM

저해제 용액:

저해 분자를, 이들의 용해도에 따라, pH 6.8 완충용액에, 50％ 메탄올(메탄올-증류수)에 또는 순수 메탄올에 직접 용해시켰다.

저해제 용액들의 다양한 농도(w/v)는 0.2％, 0.1％, 0.05％, 0.025％, 0.0125％, 0.00625％ 및 0.00312％이었다.

효소 용액:

pH 6.8 완충용액에서 티로시나제 250 유닛.

티로시나제의 활성은 광학밀도 기록에서 측정된 초기반응속도로부터 평가하였다.

무저해제(농도 0)에서의 초기반응속도 곡선과, 테스트하고자 하는 다른 농도에서의 초기반응속도 곡선을 플롯하였다.

분자의 저해력은 티로시나제의 활성을 50% 억제하는 농도로서 정의된다.

3분 동안 기록하고, 저해 퍼센트(저해 속도 및 포화 꼭지점)를 계산하였다. 상기에서 제조한 비스 MSoBT는 최종 농도 8.3 mM에서 티로시나제의 효소활성을 50% 억제하였다. 코직산(알드리치, 참조번호 22,046-9)는 같은 저해 퍼센트를 최종농도 0.670 mM에서 나타내었다.

비스 MSiBT와 MSBMSBT의 낮은 수용성은 이들 분자들에 대한 티로시나제 저해력에 대한 테스트가 가능하지 않음을 의미한다.

실시예 6: 코직산 및 디메틸티오유레아와 비교한 비스 MSiBT, MSBMSBT 및 비스 MSoBT의 탈색소침착력 평가

비스 MSiBT, MSBMSBT 및 비스 MSoBT 분자들을, 인간피부에서 존재하는 멜라닌 단위를 대표하는 살아있는 시스템에서 이들이 갖고 있는 탈색소침착 작용을 테스트하기 위해, 멜라민 생성 인간 멜라노사이트-케라티노사이트 상호-배양액에서 테스트하였다.

코직산과 디메틸티오유레아를 본 테스트의 양성 대조군으로서 사용하였다.

색소침착된 표피 견본(공기/액체 계면에서 검정 표현형/정상 케라티노사이트 및 멜라노사이트의 상호-배양액)는 마텍코포레이션(미국)으로부터 구입하였고, 이들이 추천하는 방법으로 배양하였다. 배양배지도 상기 회사로부터 공급받았다. 테스트 물질들(35 mM 코직산, 2.8 mM 디메틸티오유레아(알드리치, 참조번호 18,870-0), 상기에서 제조한 2.8 mM 비스 MSiBT, 상기에서 제조한 2.8 mM MSBMSBT, 상기에서 제조한 2.8 mM 비스 MSoBT)을 배양배지에 21일 동안 적용시켰다.

각각의 테스트 물질들은 배양배지 용액을 갖는 4개의 배양웰에 적용하였다. 테스트 물질들의 탈색소침착력은, 대조군의 표피 견본은 천천히 탈색소침착화하는 반면 활성 물질로 처리한 표피 견본은 훨씬 빨리 밝아지기 때문에, 시각적으로 명백하게 관찰된다.

탈색소침착력은 배양웰로부터 멜라닌을 추출하여 평가하였다.

추출을 두개의 배양웰에서 수행하였고, 1% EDTA 0.05 mM 및 10% 트리스 HCl(아미노-2-(히드록시메틸)-2-프로판디올-1,3) 10 mM을 함유하는 pH 6.8의 소듐 도데실 설페이트(SDS) 0.35 ml에서 균질화하였다.

5 mg/ml의 프로티나제 케이 20 ㎕를 각각의 균질액에 첨가하였다. 45℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 프로티나제 케이 20 ㎕를 추가로 첨가하고, 배양을 4시간 동안 계속하였다. 그 후, 0.5M 탄산나트륨 용액 50 ㎕와 30% 과산화수소 용액 10 ㎕를 첨가하였다. 견본을 80℃에서 30분 동안 유지하고, 이들은 냉각시켰다. 견본을 클로로포름-메탄올 혼합액(2:1, v/v) 100 ㎕를 사용하여 추출하였다. 10,000 g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상청액의 광학밀도를 405 nm에서 측정하였다. 아래의 표 1에서 테스트 물질들을 비교하였다(결과들은 상호-배양액에서의 멜라닌 저해 퍼센트로 표현하였다).

테스트 물질	농도, mM	저해%
코직산	35	32
디메틸티오유레아	2.8	36
비스 MSiBT	2.8	7.5
MSBMSBT	2.8	18
비스 MSoBT	2.8	29.6

놀랍게도, 비스 MSiBT는 MSBMSBT 보다, 특히 비스 MSoBT 보다 약한 탈색소침착력을 나타내었으며, 약 30% 저해력을 나타내기 위한 필요농도가 피부 미백을 위해 상업적으로 광범위하게 시판되고 있는 비교물질인 코직산보다 25배 낮았다.

따라서, 본 발명에 따른 물질은 탈색소침착력을 갖고 있다.

실시예 7.1: MMS(메틸메탄설포네이트)에 대한 비스 MSoBT의 돌연변이 저해력의 평가

유전독성 분자에 대한 돌연변이 저해력을 테스트하기 위해, 유전독성 분자인 메틸메탄설포네이트(MMS)를 사용하였으며, 이것은 대표적 돌연변이 유발물질인 4-니트로퀴놀린 옥사이드 및 벤조(자)피렌의 혼합물의 유전독성에 대하여 비교하였다. MMS는 단독으로 또는 점차 증가하는 농도로 비스 MSoBT와 혼합하였고, 광방출을 비교하였다. 이것은 돌연변이 50 저해 농도를 확인하는 것을 가능케한다.

배양균 살모넬라 티피무리움 TA 104 recN2-4(유전독성 테스트용)와 배양균 살모넬라 티피무리움 TA 104 prl(세포독성 테스트용)을 37℃의 영양 배양액 8 g/L 교반 배지에서 밤새 배양하였다(유전독성 테스트용 박테리아의 광학밀도 0.2-0.5 및 세포독성 테스트용 박테리아의 광학밀도 0.4-0.6). 다음날, 상기 영양 배양액 배지를 사용하여, 유전독성 테스트용 박테리아를 1/10로 희석시키고, 세포독성 테스트용 박테리아를 1/2로 희석시켰다. 90 mM MMS 저장 수용액을 제조하고, 96-웰 플레이트에서 1/2로 연속적 희석을 수행하였다. 참조 유전독성물질(4-니트로퀴놀린 옥사이드(NQO)/벤조(자)피렌(BAP))을, NQO 0.4 ppm, BAP 800 ppm의 농도로, 사용하였다. 테스트 물질은, 물질대사 활성화를 수행한 후 또는 물질대사 활성화를 수행하지 않고(분획 S9: 사이토크롬 피450을 함유하는 마이크로좀 균질액: 최종 2.45 mL/mL), 테스트하였다.

반응물의 유전독성 및 세포독성에 대한 함수로서의 광방출 반응속도는, 플루로스칸 애센트 에프엘(써모랩시스템)을 사용하여, 3시간 동안(각 5분 마다 측정) 측정하였다. 반응물들은 시그마-알드리치사로부터 공급받았다.

결과

비스 MSoBT의 MMS에 대한 돌연변이 50 저해 농도는, S9 없이 17 ppm, S9와 함께 20 ppm이었다.

실시예 7.2: UVB에 대한 비스 MSoBT의 돌연변이 저해력의 평가

UVB에 대한 돌연변이 저해력을 평가하기 위해, 박테리아 배양균들을 평균 20 유닛의 광방출(RLU)을 갖는 시간동안 조사하였다. 그리고 나서, 광을 조사하기 전에, 비스 MSoBT를 배양 배지에 점차 증가하는 농도로 첨가하고, 50% 저해력을 테스트하였다.

MMS가 없다는 것을 제외하고, 실시예 7.1에서의 절차를 수행하되, 박테리아 배양균을 UVB 254 nm를 사용하여 20초 동안 조사하였다.

이 조건에서, UVB에 의해 유발되는 돌연변이에 대한, 비스 MSoBT의 50% 저해 농도는 25 ppm이었다.

Claims

아래의 일반식 I을 갖는 티오유레아, 일반식 IIa, IIb 및 III을 갖는 상기 티오유레아의 모노 또는 디옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 한종 이상 함유하는 의약품:

여기서, n은 1 내지 12의 정수이고,

m은 1 내지 12의 정수이고,

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 수소원자, C₁-C₆ 알킬기, 또는 아릴기이고,

여기서, R₁, R₂, R₃, R₄, m 및 n은 상기 일반식 I에서 정의된 바와 같다.
제 1 항에 있어서, 상기 의약품이 티로시나제 억제용, 멜라닌 합성 억제용 또는 멜라노사이트 과활성 억제용인 것을 특징으로 하는 의약품.
제 1 항에 있어서, 상기 의약품이 항돌연변이제 및/또는 항암제인 것을 특징으로 하는 의약품.
제 3 항에 있어서, 상기 의약품이 암, 특히 피부암 예방용인 것을 특징으로 하는 의약품.
전항 중 어느 한 항에 있어서, R₁ 및 R₂가 서로 같고, R₃ 및 R₄가 서로 같고, m=n인 것을 특징으로 하는 의약품.
전항 중 어느 한 항에 있어서, R₁=R₂=CH₃인 것을 특징으로 하는 의약품.
전항 중 어느 한 항에 있어서, m=n=4인 것을 특징으로 하는 의약품.
전항 중 어느 한 항에 있어서, R₃=R₄=H인 것을 특징으로 하는 의약품.
전항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약품이 국소투여용 제제인 것을 특징으로 하는 의약품.
아래의 일반식 I을 갖는 티오유레아, 일반식 IIa, IIb 및 III을 갖는 상기 티오유레아의 모노 또는 디옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 한종 이상 함유하는 화장료 조성물:

여기서, n은 1 내지 12의 정수이고,

m은 1 내지 12의 정수이고,

R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 수소원자, C₁-C₆ 알킬기, 또는 아릴기이고,

여기서, R₁, R₂, R₃, R₄, m 및 n은 상기 일반식 I에서 정의된 바와 같다.
제 10 항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 표피를 밝게하거나, 미백하거나, 탈색소침착하기 위해, 피부 흠, 특히, 노화에 기인한 피부 흠 또는 주름을 제거하기 위해, 또는 표피의 색소침착을 예방하기 위해 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.