KR20010106025A - 당류의 부가적 공급을 이용한 고농도 폴리글루탐산의생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호기성 미생물인 바실러스속 미생물을 이용하고 당류를 부가적으로 공급하는 단계를 포함하는 폴리글루탐산의 고농도 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리글루탐산의 고농도 생산방법은 바실러스속 미생물을 배양하는 배지에 당류를 부가적으로 공급하고, 유가식 또는 회분식으로 바실러스속 미생물을 배양하여, 부산물의 생산없이 고농도의 폴리글루탐산을 높은 수율로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리글루탐산의 고농도 생산방법은 대규모로 적용할 수 있으므로, 폴리글루탐산을 경제적으로 대량생산할 수 있다.
Description
본 발명은 당류의 부가적 공급에 의한 고농도 폴리글루탐산의 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명의 폴리글루탐산의 고농도 생산방법은 바실러스속 미생물을 배양하는 배지에 당류를 부가적으로 공급하고, 유가식 또는 회분식으로 바실러스속 미생물을 배양하여, 부산물의 생산없이 고농도의 폴리글루탐산을 높은 수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물에 의해 생산되어지는 폴리글루탐산은 완전 생분해성으로 식품, 화장품뿐만 아니라, 최근에는 의료재료(참조: Kishida, A. and Murakami, K. et al, Polymer drug and polymeric drugs X: Slow release of 5-fluorouracil from biodegradable poly(γ-glutamic acid) and its benzylester matrices,J. of Bioactive and Compatible Polymers, 13:271-278, 1998), 기능성 담체, 막 전기재료로서 연구가 진행 중이다(참조: 미국특허 제 5,693751호). 폴리글루탐산 고농도 생산을 위한 플라스크 및 회분식 발효에서의 배지 최적화(참조: Ko, Y.K., Gross, R.A., Effect of glucose and glycerol on γ-poly(glutamic acid) formation byBacillus licheniformisATCC 9945a,Biotechnol. & Bioeng.,57(4):430-437, 1998)와 시트르산을 효율적으로 공급한 유가식 배양에 관한 연구는 보고된 바 있지만(참조: 이상엽, 윤성호, 바실러스 리케니포미스에 의한 폴리글루타믹산(γ-PGA)의 고효율 생산방법, 대한민국 특허 제 250627호), 배지에 함유된 글리세롤과 시트르산은 미생물이 쉽게 에너지원으로 사용할 수 없는 단점이 있었다. 그러나, 미생물이 쉽게 에너지원으로 이용할 수 있는 포도당이나 과당 등을 비롯한 당류의 효율적인 공급을 이용한 유가식 배양에 관해서는 보고된 바가 없다. 당류는 미생물의 대사경로를 통하여 많은 ATP를 얻을 수 있는 물질이기 때문에, 폴리글루탐산을 합성하는 과정과 같이 많은 ATP 소모하는 경우에 좋은 에너지원(ATP)으로 사용될 수 있을 것이다(참조: Troy FA, Chemistry and biosynthesis of the poly(γ-glutamic acid) capsule inBacillus licheniformis, J. Biol. Chem., 248(1):305-315, 1973).
따라서, 미생물이 손쉽게 이용가능한 당류를 효율적으로 공급하여 폴리글루탐산의 생산성을 높일 수 있는 발효기술을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 폴리글루탐산의 고농도 및 생산성 향상에 관한 발효기술을 확립하고자 예의 연구 노력한 결과, 바실러스속 미생물을 배양하기 위한 글리세롤, 시트르산 및 글루탐산을 함유하는 배지에 당류를 부가적으로 공급하고, 유가식 또는 회분식으로 바실러스속 미생물을 배양함으로써, 부산물없이 고농도의 폴리글루탐산의 높은 생산성으로 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 당류의 부가적인 공급을 통하여 고농도의 폴리글루탐산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 당류를 공급한 회분식 배양에 있어서, 배양시간에 따른 폴리글루탐산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 2는 당류를 공급한 유가식 배양에 있어서, 배양시간에 따른 폴리글루탐산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 회분식 배양에 있어서, 배양시간에 따른 폴리글루탐산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 각 배양방법에 의해 생산되는 폴리글루탐산의 생산농도를 비교한 그래프이다.
도 5는 대규모의 유가식 배양에 있어서, 배양시간에 따른 폴리글루탐산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 당류의 부가적 공급에 의한 고농도 폴리글루탐산의 생산방법은 바실러스속 미생물을 글리세롤, 시트르산 및 글루탐산을 함유하는 배지에 배양할 때,당류를 2 내지 10g/L의 농도로 유지하도록 부가적으로 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 바실러스속 미생물은 이에 한정되는 것은 아니나, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)를 사용함이 특히 바람직하다. 또한, 배양방법은 회분식 배양방법과 유가식 배양방법을 사용할 수 있으나 유가식 방법을 사용함이 바람직하며, 회분식으로 배양할 경우에는 배지에 2 내지 10g/L의 당류를 첨가하고, 유가식으로 배양할 경우에는 배지에 당류를 2 내지 3g/L의 농도로 유지시키는 것이 바람직하다. 아울러, 부가적으로 공급되는 당류는 과당, 젖당, 포도당, 설탕, 맥아당 또는 갈락토스 등의 단당류 또는 이당류를 사용함이 바람직하고, 가장 바람직하게는 포도당을 사용한다.
본 발명자들은 미생물이 폴리글루탐산을 합성할 때 다량의 ATP가 소모된다는 것에 착안하여, 미생물에 의해 쉽게 에너지원으로 사용될 수 있는 당류를 공급하여 줌으로써, 폴리글루탐산의 생산수율 및 생산속도를 향상시키고자 하였다.
우선, 당류가 폴리글루탐산 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 배지에 당류를 종류별, 농도별로 투입하고 회분식으로 배양하며, 폴리글루탐산의 합성과 다당류와 같은 부산물 생성여부를 조사하였다. 그 결과, 당류를 첨가하면 폴리글루탐산의 생산률은 높일 수 있으나, 일정농도 이상의 당류를 공급하면 다당류 등의 부산물이 함께 생성됨을 알 수 있다. 부산물은 원하는 폴리글루탐산의 분리 및 정제공정에 많은 어려움을 주는데, 특히, 소규모의 실험시에는 아주 미량이 검출되더라도 규모가 커질 경우에는 심각한 문제가 될 수 있기 때문에, 가능한 당류의 농도는 다당류의 합성이 일어나지 않을 정도로 낮게 유지하는 것이 아주 중요함을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 당류를 부산물이 생성되지 않을 정도로 공급하더라도, 일정시간동안 배양하면 배지에 축적되는 아세트산 때문에 미생물의 생장이 둔화되어 폴리글루탐산의 생산률이 저하됨을 알 수 있어, 소량의 당류를 같은 농도로 계속적으로 유지시킬 수 있는 유가식 배양방법을 이용함이 바람직함을 알 수 있었다.
폴리글루탐산을 생산하기 위한 종래의 유가식 배양방법은 시트르산을 제외한 배지에서 미생물을 배양하기 시작하여 미생물의 농도가 증가한 후, 시트르산을 공급하거나 배지 중의 시트르산의 농도를 낮게 유지하면서 농축된 E-배지를 공급하는 방식이었다. 그러나, 미생물이 쉽게 이용할 수 있는 에너지원이 부족하다는 단점을 극복하기 위하여, 미생물을 일정농도의 당류를 유지하도록 부가적으로 공급하면서 유가식으로 배양하여 폴리글루탐산의 생산수율 및 생산속도를 향상시키고자 하였다. 이에, 당류로는 전기 회분식 배양에서 가장 좋은 결과를 나타낸 포도당을 사용하였는데, 회분식 배양결과에서 보듯이 포도당이 과량으로 공급될 경우 다당류와 같은 부산물 및 아세트산을 다량으로 생산하기 때문에 낮은 농도로 유지하면서 공급하였다. 그 결과, 폴리글루탐산의 제조수율이 종래의 회분식 배양방법에 의해 얻어진 폴리글루탐산의 수율보다 현저히 증가함을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지본 발명을 본다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 회분식 배양에서 당류의 효과
당류의 농도에 따른 폴리글루탐산의 농도 및 다당류의 생성여부를 알아보기 위하여, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)를 E-배지에서 배양할 때, 당류를 농도별 및 종류별로 투입하고, 배양 후 생성된 폴리글루탐산의 농도와 그외 다당류의 생산 여부를 확인하였다(참조: 표 1). E-배지의 성분은 다음과 같다: 80g/L 글리세롤, 20g/L L-글루탐산, 12g/L 시트르산, 7g/L NH4Cl, 0.5g/L K2HPO4, 0.5g/L MgSO47H2O, 0.04 g/L FeCl3·6H2O, 0.15g/L CaCl2·2H2O 및 0.104g/L MnSO4·H2O. 배양 조건은 250mL의 플라스크에 50mL의 배지를 넣고, 250rpm, 37℃에서 60시간 동안 배양하였다.
| 첨가된 당류의 농도(g/L) | 첨가된 당에 따른 생산된 폴리글루탐산의 농도(g/L) | |||||
| 과당 | 젖당 | 포도당 | 설탕 | 맥아당 | 갈락토스 | |
| 5 | 20(×)* | 13(×) | 21(×) | 17(×) | 5(×) | 21(×) |
| 10 | 17(×) | 14(×) | 24(×) | 20(×) | 7(×) | 19(×) |
| 20 | 19() | 6(×) | 22() | 23() | 14(×) | 17(×) |
| 40 | 15() | 8() | 29.2() | 26() | 20() | 15() |
*: ()는 다당류의 생성여부
(이때,는 다당류의 존재를 나타내고, ×는 다당류의 부재를 나타낸다)
상기 표 1에서 보듯이, 당류의 농도가 40g/L 이상일 때는, 당의 종류에 관계없이 모두 다당류 등의 부산물이 검출되었다. 포도당의 경우 농도가 10g/L 이하일 때, 다당류 등의 부산물없이 24g/L의 폴리글루탐산을 얻을 수 있었는데, 이는 E-배지의 15g/L 보다 1.6배가 높은 수치이다. 이로부터, 당류에 따라 차이는 있지만, 부산물의 생성을 막아서 폴리글루탐산의 생산을 향상 시키기 위하여, 당류의 농도를 10g/L 이하로 유지하면서 공급해 주어야 함을 알 수 있었으므로, 이에 따라 일반적인 당류를 탄소원으로 이용하여 폴리글루탐산의 생산성을 향상시킬 수 있고, 이때 당류의 최적 농도가 존재함을 알 수 있었다.
실시예 2: 포도당을 첨가한 회분식 배양
실시예 1로부터 당류를 10g/L이하로 유지할 경우 부산물의 생산이 급격히 감소하므로, 포도당을 10g/L로 첨가한 E-배지에서 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)를 회분식으로 배양하였다. 배양조건은 5L 발효조에3L의 E-배지를 주입하고 배지를 37℃, pH 6.5로 유지하였으며, 10이상의 공기포화도로 용존산소를 유지하기 위해 순수 산소와 공기를 함께 혼합하여 사용하였다(참조: 도 1). 도 1은 포도당을 첨가한 회분식 배양을 나타낸 그래프이고, ()는 포도당의 농도, (▲)는 아세트산의 농도 및 (■)는 폴리글루탐산의 농도를 각각 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 23시간 동안 배양할 경우 32g/L의 폴리글루탐산을 얻었고 부산물은 생산되지 않았으나, 배양시간에 따라 배양액에 포함된 아세트산의 농도가 증가하며, 이에 따라 세포의 성장률이 급격히 감소하여 폴리글루탐산의 생산률 역시 감소함을 알 수 있었다.
실시예 3: 유가식 배양
실시예 2에서 나타난 아세트산의 발생을 억제할 수 있다면, 폴리글루탐산의 생산률을 좀 더 향상시킬 수 있다는 가정아래, 일정농도의 당류를 지속적으로 유지시킬 수 있는 유가식 배양을 수행하였다. 폴리글루탐산의 생산에 있어서, 유가식 배양은 기질을 효과적으로 미생물에게 공급해 줌으로써, 생산성과 농도를 동시에 증가시킬 수 있는 고도의 발효방법이다. 이에, 대표적인 당인 포도당을 사용하여, 폴리글루탐산의 농도와 생산성을 향상시키는 유가식 배양을 수행하였다. 배양 조건은 포도당의 첨가를 제외하고는, 실시예 2의 배양조건과 동일하게 하였다(참조: 도 2). 포도당은 미생물의 지수성장기 초기단계에 공급하였으며, 발효액의 포도당 농도는 3g/L로 유지하면서 공급하였다. 그 결과, 실시예 2의 회분식 배양방법에서와는 달리, 20시간 이상 배양한 배지내에서 아세트산은 검출되지 않았다. 도 2는 포도당을 3g/L로 유지하며 유가식 배양한 그래프이며, ()는 글루탐산 농도, (▲)는 폴리글루탐산 농도, (◆)는 시트르산 농도 및 (■)는 글리세롤 농도를 각각 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 22시간 동안 발효시켜 57.5g/L 폴리글루탐산을 생산하여 시간당 2.6g/L의 생산성을 나타내었는 바, 종래의 생산성을 2배로 향상시켰음을 알 수 있고, 포도당의 첨가에 의하여 배지에 함유된 글리세롤, 시트르산 또는 글루탐산의 미생물로의 유입이 영향받지 않았다. 배지에 함유된 글리세롤, 시트르산 또는 글루탐산의 미생물로의 유입은 폴리글루탐산의 생산에 중요한 과정임이 밝혀져 있으므로(참조: 대한민국 특허 제 250627호), 에너지원으로서의 포도당의 첨가가 배지에 함유된 글리세롤, 시트르산 또는 글루탐산의 미생물로의 유입을 방해하여 폴리글루탐산의 생산을 저해하는 이화억제(catabolic repression) 현상이 나타나지 않음을 알 수 있었다.
비교실시예 1: 회분식 배양
본 발명의 고농도 폴리글루탐산의 생산방법이 종래의 방법보다 우수함을 증명하기 위하여, 당류를 첨가하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)를 E-배지에서 회분식으로 배양하였다.(참조: 도 3). 도 3은 회분식 배양을 나타낸 그래프이고, ()는 글루탐산 농도, (▲)는 폴리글루탐산 농도, (◆)는 시트르산 농도 및 (■)는 글리세롤 농도를 나타는데, 22시간 동안 배양할 경우 23.5g/L의 폴리글루탐산을 수득하였다.
상기한 실시예 2, 3 및 비교실시예 1의 결과를 비교하면, 종래의 방법처럼 당류의 첨가없이 회분식 배양만을 행하였을 경우 보다는 에너지원으로 당류를 첨가하여 회분식 배양만을 행하였을 경우가 폴리글루탐산의 생산률이 높고, 동일하게 당류를 첨가하였을 경우에는 회분식 배양을 행하였을 경우 보다는 유가식 배양을 행하였을 경우가 폴리글루탐산의 생산률이 높음을 알 수 있었다(참조: 도 4).
실시예 4: 대규모의 유가식 배양
실시예 3에서 제시된 방법이 대규모의 배양 시에도 잘 적용되는지를 알아보기 위하여, 30L와 300L 발효조에서 각각 포도당을 이용한 유가식 배양을 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 30L 발효조에는 20L의 E-배지를, 300L 발효조에는 200L의 E-배지를 주입하였으며, 300L 발효조에는 용존 산소량을 5 내지 10로 유지하기 위하여, 순수산소를 사용하는 대신에 0.1 내지 0.4기압의 압력을 걸어 주었다. 발효 22 시간 후, 30L와 300L 발효조 각각으로부터 55g/L 및 46g/L의 폴리글루탐산을 얻을 수 있었다(참조: 도 5). 도 5는 대규모의 배양시, 배양시간에 따른 폴리글루탐산의 생산량을 나타내는 그래프로서, ()는 30L 발효조를 나타내고, (■)는 300L 발효조를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 30L 발효조에서는 5L 발효조에서와 유사한 결과를 얻었지만, 300L 발효조에서는 다소 농도와 생산성이 낮아지는 것을 볼 수 있었는데, 이는 발효액의 고점성으로 인한 불균일한 혼합 및 낮은 물질전달계수 등에 기인한 것으로 추측되었다. 따라서, 발효조의 적절한 설계를 통하여, 이들 문제들이 해결된다면, 대용량의 반응기에서도 동일한 결과가 나타날 것으로 사료되었다. 55g/L와 46g/L의 폴리글루탐산 농도는 이제까지 얻을 수 없었던 매우 높은 농도이므로, 실시예 3에서 제시된 방법은 대규모의 배양시에도 잘 적용됨을 알 수 있었다. 특히, 폴리글루탐산을 생산하는 바실러스(Bacillus)속 미생물들이 상기 전략들이 적용될 수 있음은 당업계에서는 자명하다고 하겠다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 바실러스속 미생물을 배양하는 배지에 미생물이 쉽게 에너지원으로 사용할 수 있는 당류를 부가적으로 공급하고, 유가식 또는 회분식으로 바실러스속 미생물을 배양하여, 부산물의 생산없이 고농도의 폴리글루탐산을 높은 수율로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 고농도의 폴리글루탐산을 생산하는 방법은 대규모로 적용할 수 있으므로, 폴리글루탐산을 경제적으로 대량생산할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 기술은 단지 바람직한 실시예 뿐이며, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 바실러스속 미생물을 이용하여 폴리글루탐산을 생산하는 방법에 있어서, 글리세롤, 시트르산 및 글루탐산을 함유하는 배지에 당류를 첨가하여 2 내지 3g/L의 농도로 유지하도록 유가식으로 배양한 다음, 그로 부터 폴리글루탐산을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
- 제 1항에 있어서,바실러스속 미생물은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)인 것을 특징으로 하는고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
- 제 1항에 있어서,당류는 과당, 젖당, 포도당, 설탕, 맥아당 및 갈락토스로 구성된그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
- 바실러스속 미생물을 이용하여 폴리글루탐산을 생산하는 방법에 있어서, 글리세롤, 시트르산 및 글루탐산을 함유하는 배지에 2 내지 10g/L의 당류를 첨가하고 회분식으로 배양한 다음, 그로 부터 폴리글루탐산을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
- 제 4항에 있어서,바실러스속 미생물은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis,ATCC 9945A)인 것을 특징으로 하는고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
- 제 4항에 있어서,당류는 과당, 젖당, 포도당, 설탕, 맥아당 및 갈락토스로 구성된그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는고농도 폴리글루탐산의 생산방법.
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