KR100250627B1

KR100250627B1 - 바실러스 리케니포미스의 유가식 배양에 의한 폴리글루탐산의 고농도 생산방법

Info

Publication number: KR100250627B1
Application number: KR1019970067605A
Authority: KR
Inventors: 윤성호; 이상엽
Original assignee: 윤덕용; 한국과학기술원
Priority date: 1997-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2000-04-01
Anticipated expiration: 2017-12-10
Also published as: KR19990048816A

Abstract

본 발명은 시트르산의 기질 조절을 통산 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 유가식 배양으로 폴리글루탐산(polyglutamic acid, γ-PGA)을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 시트르산이 없는 초기배지에서 바실러스 리케니포미스 균주를 고농도로 성장시킨 다음, 시트르산이 함유된 영양배지를 공급하는 유가식 배양에 의해, 고농도의 γ-PGA를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 고부가 제품으로 인식되고 있는 γ-PGA의 생산성을 획기적으로 향상시켰을 뿐만 아니라, 본 발명의 방법으로 γ-PGA를 생산하는 경우, γ-PGA의 초기 생성이 억제되어 일정 균체 성장 전까지 낮은 점도를 유지하여, 공정 초기의 교반속도와 통기량을 낮출 수 있어 생산 비용이 크게 절감되므로 경제적이다.

Description

바실러스 리케니포미스의 유가식 배양에 의한 폴리글루탐산의 고농도 생산방법

본 발명은 시트르산의 기질 조절을 통한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 유가식 배양으로 폴리글루탐산(polyglutamic acid, γ-PGA)을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 시트르산이 없는 초기배지에서 바실러스 리케니포미스 균주를 고농도로 성장시킨 다음, 시트르산이 함유된 영양배지를 공급하는 유가식 배양에 의해, 고농도의 γ-PGA를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

폴리글루탐산은 D와 L형태의 글루탐산 단량체로 이루어진 수용성 고분자이다. 미생물에 의해 폴리글루탐산이 합성될 경우, γ 위치의 카르복실기가 아미노 결합을 한 γ-폴리글루탐산(γ-PGA)을 생산하는 것으로 밝혀졌다(참조: Thorne et al, J. Bacteriol. 68, 307-315(1954)). γ-PGA는 비생분해성 수용성 고분자의 대체물로서, 식품, 화장품, 도료, 기름제거제, 합성세제, 계면활성제 등의 용도로 이용될 수 있으며, 또한 생체재료, 기능성 담체, 막재료, 전기재료 등의 기능성 고분자로의 이용에 관한 연구도 진행되고 있다.

γ-PGA에 대한 연구는 1950년대 초기에서 1970년대 초기까지 활발히 이루어졌으나, 잠시 주춤하다가 80년대 후반부터 다시 주목받기 시작하였다. γ-PGA가 처음으로 알려진지 75년이 지났음에도 합성경로와 고분자 합성에서의 기본 기질 등은 명확히 밝혀지지 않고 있다. γ-PGA는 α-아미노기와 γ-카르복실산의 작용기 간의 결합으로 중합되는데, 중합 방식이 일반 단백질 합성방법과 다르게 진행되며, 그 결과 γ-PGA는 구조적으로도 일반 단백질과는 상이하다(참조: Thorne et al, J. Bacteriol. 68, 307-315(1954)).

지금까지 γ-PGA 합성에 대한 연구는 주로 바실러스속 균주인, B. anthracis, B. licheniformis, B. megaterium, B. subtilis(natto)에 의해 이루어져 왔다. 이들 생산균주에 따라 γ-PGA 생산에 필요한 영양분도 달라진다. 이중 Bacillus subtilis var. polyglutamicum만이 포도당 등의 탄소원과 무기염류만으로 된 배지중에서 성장하면서 γ-PGA를 생산하고, 그 외의 균은 γ-PGA 생산에 L-글루탐산을 필요로 하는 것으로 보고되었다(참조: Thorne et al, J. Bacteriol. 68, 307-315(1954)). 이는 γ-PGA가 주로 L-글루탐산에 의해 γ-D-PGA로 합성되기 때문이다. 또한, γ-PGA에 포함되는 L-글루탐산의 비율은 배양배지의 Mn(II) 농도에 영향을 받는 것으로 보고되었다(참조: Leonard, C.G. et al, J. Bacteriol., 76, 499(1958)).

그 이후 γ-PGA의 생산성을 높이기 위해, 필요한 영양분에 대한 연구와 L-글루탐산을 필요로 하지 않는 미생물을 분리하기 위한 연구가 시도되기도 하였다(참조: Moraine, R. A. and Fogovin, P., Biotechnol. Bioeng., 13, 381(1971)). 또한, B. subtilis IFO3335를 이용한 연구에서, L-글루탐산, 시트르산 및 황산암모늄이 포함된 배지에서 많은 많은 양의 γ-PGA가 합성되는 보고도 있었다(참조: Goto, A. and Kunioka, Biosci. Biotech. Biochem., 56(7), 1031-1035(1992)).

지금까지의 γ-PGA에 대한 연구는 주로 합성경로와 특성 등에 관한 것이었으며(참조: Goto, A. and Kunioka, Biosci. Biotech. Biochem., 56(7), 1031-1035 (1992); Kunioka and Goto, A., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 867-872(1994); Cromwick and Gross, Can. J. Microbiol., 41:902-909(1995); Yokoi et al, J. Fermen. Bioeng, 82(1), 84-87(1996)), γ-PGA의 생산방법에 관한 연구는 pH나 교반속도 등의 발효조건을 조절하여 생산성을 증진시키려는 시도로서, 이렇게 생산된 γ-PGA의 농도는 매우 저조하였다(참조: Cromwick et al, Biotech. Bioeng., 50, 222-227(1996); Giannos et al, E.A. Dawes(ed), Novel Biodegradable Microbial Polymers, 457-460(1990)).

따라서, 산업화에 직접 적용될 수 있는 γ-PGA의 대량생산 방법이 당업계에서 절실히 요구되었다.

이에, 본 발명자들은 고농도의 γ-PGA를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, γ-PGA 생산균주의 선정, 선정된 생산균주에 대한 성장특성, γ-PGA 합성 및 축적 특성 등에 대한 기초실험을 통하여, γ-PGA 고생산능을 가지는 바실러스 리케니포미스의 유가식 배양시, 초기 배지에 시트르산을 배제하고 균주를 성장시킨 후, 영양분 공급시에 시트르산를 공급하면, 고농도의 γ-PGA가 효율적으로 생산되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 이러한 방식으로 γ-PGA를 생산할 경우, γ-PGA의 초기 생성이 억제되어 일정 균체 성장 전까지 낮은 점도를 유지하여, 공정 초기의 교반속도와 통기량을 낮출 수 있어, 생산비용을 크게 절감할 수 있음을 확인하였다.

결국, 본 발명의 목적은 시트르산의 기질 조절을 통한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 유가식 배양으로, γ-PGA를 고농도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 플라스크 배양시의 배지 내 각 성분이 세포성장과 폴리글루탐산의 생산에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

제2도는 플라스크 배양시 배지 내의 최종 글리세롤(glycerol), 글루탐산(L-glutamic acid) 및 시트르산(citrate)의 농도를 나타내는 그래프이다.

제3도는 시트르산이 없는 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 건조균체농도와 폴리글루탐산의 농도를 나타내는 그래프이다.

제4도는 시트르산이 없는 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 배지 내의 최종 글리세롤, 글루탐산 및 시트르산의 농도를 나타내는 그래프이다.

제5도는 시트르산 12 g/L을 함유한 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 건조균체농도와 폴리글루탐산의 농도를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 기초실험으로 우선, γ-PGA를 효율적으로 생산하는 균주는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 선정하고, 선정된 생산균주에 대한 성장특성, γ-PGA 합성 및 축적 특성 등에 대한 실험을 수행하였다. 이에 대한 결과를 기초로, 본 발명에서는 γ-PGA의 합성경로를 고려하여 배양중의 기질 조건을 달리한 유가식 배양으로 γ-PGA의 생산성을 획기적으로 증진시키고자 하였다.

즉, 시트르산이 없는 초기배지(L-글루탐산 20.0 g/L, 글리세롤 40.0 g/L, NH₄Cl 7.0 g/L, K₂HPO₄0.5 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5 g/L, FeCl₃ㆍ6H₂O 0.04 g/L, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.15 g/L, MnSO₄ㆍH₂O 0.104 g/L로 구성된 조성물)에서 바실러스 리케니포미스 균주를 고농도로 성장시킨 다음, 시트르산이 함유된 영양 배지를 공급하는 유가식 배양으로 γ-PGA를 고농도로 생산한다.

상기에서, 시트르산이 함유된 영양배지는 L-글루탐산 125g/L, 시트르산 250 g/L, CaCl₂ㆍ2H₂O 3 g/L, MnSO₄ㆍ5H₂O 3 g/L, 글리세롤 500 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/L로 구성되며, 발효액의 pH가 7.0 이상이 될 때 발효조에 첨가한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[플라스크 배양을 통한 배지 각 성분이 균체성장과 γ-PGA 합성에 미치는 영향]

바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis ATCC 9945A) 균주는 MnSO₄와 CaCl₂가 제외된 E 배지(후술하는 내용 참조)에서 47시간 동안 배양하여 30 % 글리세롤 스탁(glycerol stock)으로 -70℃에 보관하였다. 이 보관 균주를 37 ℃ 수조에서 급속 해동한 후, 그 균주액 0.2 ㎖을, 50 ㎖의 배지를 담은 250 ㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 3일간 배양하였다. 이때, 배양은 37 ℃, 250 rpm, 초기 pH 6.5에서 행하였다.

상기 플라스크 배양을 통하여 배지 각 성분이 균체성장과 γ-PGA 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위하여 E 배지(L-글루탐산, 20.0(g/L); 시트르산, 12.0(g/L); 글리세롤, 80.0(g/L); NH₄Cl, 7.0(g/L); K₂HPO₄, 0.5(g/L); MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.5(g/L); FeCl₃ㆍ6H₂O 0.04(g/L); CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.15(g/L); MnSO₄ㆍH₂O, 0.104(g/L)와 Ca⁺⁺, Mn⁺⁺, L-글루탐산, 시트르산을 각각 제외한 E 배지, 그리고 E 배지에 시트르산을 첨가하여 시트르산의 농도가 3 또는 6 g/L되게 한 배지를 사용하였다.

각 성분의 세포 성장과 γ-PGA 생산에 미치는 영향은 제1도에, 배지내의 최종 글리세롤, L-글루탐산, 시트르산의 농도는 제2도에 각각 나타내었다.

제1도 및 제2도에서, E는 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; E w/o Ca는 칼슘이온을 제외한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; E w/o Mn은 망간이온을 제외한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; E w/o L-glu는 L-글루탐산을 제외한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; E w/o Citrate는 시트르산을 제외한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; E w/ Cit. 3g/L는 3g/L의 시트르산을 첨가한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우; 및, E w/ Cit. 6g/L는 6g/L의 시트르산을 첨가한 E 배지에서 균체를 성장시켰을 경우를 각각 나타낸다.

제1도 및 제2도에서 보듯이, γ-PGA 생산은 E 배지에서 3.01 g γ-PGA/L로 가장 높았으며, 최종 균체 농도는 시트르산이 없는 E 배지에서 2.67 g 건조균체/L로 가장 높았다. 또한, 배지 내 L-글루탐산과 시트르산을 각각 제외한 배지와 3 g/L의 시트르산을 포함한 배지에서는 미량의 γ-PGA만이 생산되었으나, 최종 균체 농도는 모든 성분이 다 포함된 E 배지에서 배양하였을 경우보다 높았다. 이는 L-글루탐산과 시트르산이 γ-PGA 합성에 필수적이긴 하지만, 세포성장에 커다란 영향을 미치지 않음을 나타낸다. γ-PGA 생산량과 최종 균체농도는 서로 반비례하였는데, 이는 배양조건에 따라 탄소원으로부터의 균체와 γ-PGA 수율의 변화와, γ-PGA가 생산됨에 따라 배지 내 점도가 증가함에 따라 산소전달이 어려워지기 때문이다.

[실시예 2]

[시트르산이 없는 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하는 유가식 배양에 의한 균체성장과 γ-PGA 합성]

유가식 배양에 의한 γ-PGA의 고효율 생산을 위하여, 종균배양과 발효조에서의 초기배지는 E 배지에서 시트르산을 제외하고 40g/L의 글리세롤을 첨가한 배지를 사용하였다. 이는 배양 초기에서의 γ-PGA 생성을 억제시켜 균체의 성장을 촉진시키고, 나중에 공급영양액에 시트르산을 첨가시켜 γ-PGA 생성 시기를 조절하기 위함이었다.

유가식 배양실험은 5 L 발효조(BioFlo 3000 fermentor, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA)를 이용하였으며, 배양조건은 37 ℃, 3 vvm, pH 6.5~6.7로 유지하였다. pH는 25% 암모니아수와 2M 염산용액으로 조절하였다. 용존산소량은 교반속도를 400에서 1000 rpm까지 변화시키고, 필요할 경우 순수 산소를 공급하여 포화용존산소량의 50%로 조절하였다. 접종균은 초기배지와 동일한 조성의 배지 200 ㎖를 담은 1000 ㎖ 플라스크에서 초기 지수증식기까지 배양 후(37 ℃, 250 rpm), 800 ㎖의 초기배지가 들어있는 발효조에 접종하였다. 이때, 세포의 성장은 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 660 ㎚ 파장에서의 흡광도로 측정하였다.

유가식 배양에서의 초기배지는 시트르산이 포함되지 않은 E 배지에 40g/L의 글리세롤을 첨가하였고, 영양공급액의 조성은 L-글루탐산 125g/L, 시트르산 250 g/L, CaCl₂ㆍ2H₂O 3 g/L, MnSO₄ㆍ5H₂O 3 g/L, 글리세롤 500 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/L이었다. 건조균체농도는 4 ~ 8 ㎖ 시료를 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고 증류수로 세척한 후, 무게감소가 없을 때까지 95 ℃ 오븐에서 건조시켜, 균체의 중량을 저울로 측정하였다. γ-PGA의 정제는 종래의 방법에 따라 수행하였다(참조: Kunioka and Goto, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 867-872(1994)). 제3도는 시트르산이 없는 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 건조균체농도와 γ-PGA의 농도를 나타내는 그래프이다.

발효조에 균주를 접종하고 9시간 경과한 후(발효액의 pH 7.0, 건조균체 농도 4.23 g/L)에 영양액 150 ㎖를 공급하고 γ-PGA 생성과 균체농도를 관찰하였다(참조: 제4도). 또한, 배지 내의 글리세롤, 시트르산, L-글루탐산의 농도도 측정하였다(참조: 제5도). 제4도 및 제5도에서 보듯이, 급격한 γ-PGA 생성시점과 시트르산의 감소시점이 일치하는 것으로 보아, 생성된 γ-PGA는 대부분 시트르산의 대사에 의해 생성된 것을 알 수 있었다.

본 실험결과 영양분 공급 시점까지 γ-PGA 생성은 5 g/L 이하로 억제되었으며, 기질공급후 약 17시간 후(접종 후 26시간)에 34.9 g/L의 γ-PGA가 생성되었다. 이는 회분식 배양에서 얻어진 것보다 2.5배 높은 양이다(참조: Cromwick et al., Biotech. Bioeng., 50: 222(1996)). 또한, 생산성은 1.34 g γ-PGA/L/h로서, 종래에 보고된 유가식 배양에 의한 γ-PGA 생산방법보다 5배 가량 향상되었다(참조: Cromwick et al, E.A. Dawes(ed), Novel Biodegradable Microbial Polymers, 457-460(1990)).

[실시예 3]

[시트르산 12 g/L을 함유한 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 균체성장과 γ-PGA 합성]

실시예 2의 대조 실험으로서, 시트르산 12 g/L을 함유한 초기배지에서 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 함유된 영양액을 공급하였을 때의 균체성장과 γ-PGA 합성을 관찰하였다(참조: 제5도). 실시예 2와 같은 방법으로 영양액을 공급하였을 경우, 건조균체농도는 최대 7.20 g/L, γ-PGA는 5.30 g/L까지 생산되었다.

이는 실시예 2의 결과에 비해 현격히 적은 생산량이며, 이로 보아 초기 배지에서는 시트르산을 제외하고 균체를 성장시킨 후, 시트르산이 포함된 영양액을 공급하는 것이 γ-PGA의 생산에 적합하다고 결론지을 수 있다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 일단 γ-PGA 생산을 억제시킨 조건에서 원하는 농도까지 바실러스 리케니포미스 균체를 배양한 후, γ-PGA를 생성시키는 본 발명의 유가식 배양으로 고농도의 γ-PGA를 효율적으로 생산할 수 있었다. 또한, 이러한 방식으로 γ-PGA를 생산할 경우, γ-PGA의 초기 생성이 억제되어 일정 균체 성장 전까지 낮은 점도를 유지하여 공정 초기의 교반속도와 통기량을 낮출 수 있어 생산 비용이 절감된다.

Claims

시트르산이 없는 초기배지에서 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주를 고농도로 성장시킨 다음, 시트르산이 함유된 영양배지를 공급하는 유가식 배양에 의한, γ-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid)의 생산방법.
제1항에 있어서, 초기배지는 L-글루탐산 20.0 g/L, 글리세롤 40.0 g/L, NH₄Cl 7.0 g/L, K₂HPO₄0.5 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5 g/L, FeCl₃ㆍ6H₂O 0.04 g/L, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.15 g/L, MnSO₄ㆍH₂O 0.104 g/L로 구성된 조성물인 것을 특징으로 하는 γ-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid)의 생산방법.
제1항에 있어서, 시트르산이 함유된 영양배지는 L-글루탐산 125 g/L, 시트르산 250 g/L, CaCl₂ㆍ2H₂O 3 g/L, MnSO₄ㆍ5H₂O 3 g/L, 글리세롤 500 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 3 g/L로 구성된 조성물인 것을 특징으로 하는 γ-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid)의 생산방법.
제1항에 있어서, 시트르산이 함유된 영양배지는 발효액의 pH가 7.0 이상일 때 첨가되는 것을 특징으로 하는 γ-폴리글루탐산(γ-polyglutamic acid)의 생산방법.