CN117586999A

CN117586999A - 一种半连续发酵高产酶新工艺

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Publication number: CN117586999A
Application number: CN202210970410.3A
Authority: CN
Inventors: 李必金; 于宏艳; 胡丹; 赵津津; 李岩
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2024-02-23

Abstract

本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及一种半连续发酵高产酶的新工艺。本发明中以流加葡萄糖和乳糖的混糖作为诱导剂，诱导重组菌中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的表达，所述重组菌中含有优化后的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明通过采用葡萄糖和乳糖混糖流加工艺，可同时控制菌体生长和蛋白表达；并且，本发明在发酵过程中放出部分发酵液同时补充部分新鲜的发酵培养基，能够降低乙酸产生对菌体生长和蛋白表达的抑制作用，延长菌体活力维持时间，增加总菌体量和蛋白表达量。

Description

一种半连续发酵高产酶新工艺

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种半连续发酵高产酶新工艺。

背景技术

海藻糖是一种由两个吡喃环葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键缩合而成的非还原性双糖，按照有无结晶水分为结晶海藻糖和无水海藻糖。目前商品海藻糖主要为结晶海藻糖，含有两个结晶水，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，分子量为378.33。由于海藻糖具有在极端条件下保护生物活性特征，在科学界素有“生命之糖”的美誉。除了对生物体具有保护作用外，海藻糖还具有防止淀粉老化、防止蛋白质变性、抑制脂质氧化变质、抑制鱼腥味的生成、利于果蔬的保鲜等功能，因此被广泛应用于食品、医药及化妆品行业中。

目前海藻糖的生产方法主要包括微生物抽提法、发酵法、酶转化法以及基因重组法。其中酶法合成海藻糖的途径主要有四种，包括海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸酯酶转化法、海藻糖磷酸化酶转化法、海藻糖合酶转化法(单酶法)及麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)转化法(双酶法)，前两种方法由于需要高能化合物为原料，成本较高且磷酸化酶不稳定，不适合工业化生产；后两种方法转化工艺操作简单，转化率效率高，成本低，是目前工业化生产海藻糖的主要途径。

海藻糖合酶、MTSase和MTHase等主要来源于野生脂肪杆菌、恶臭假单胞杆菌、水生嗜热菌、谷氨酸棒杆菌、玫瑰微球菌和硫矿硫化叶菌中，但由于野生菌产酶量低、杂蛋白含量高导致获得的酶液酶活低、分离困难和转化效率低。随着现代基因工程技术的发展，为了能够提升淀粉对海藻糖转化效率和降低生产成本，利用基因工程菌进行异源高效表达目的蛋白已经成为当今的一个研究热点。目前常用的异源蛋白表达系统包括原核蛋白表达系统(大肠杆菌蛋白表达系统和枯草芽孢杆菌蛋白表达系统)及真核蛋白表达系统(哺乳动物蛋白表达系统和酵母蛋白表达系统)。

江南大学在专利CN106190880A中公开了一种高产MTSase的基因工程菌，以pPIC3.5k为载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，表达嗜酸热硫化叶菌来源的MTSase，发酵产MTSase酶活可达3128.7U/mL。同时在专利CN105969713A中公开了一种高产MTHase的基因工程菌及其应用，以pET-32a(+)为载体，以E.coli Origami(DE3)为表达宿主，构建了高产MTHase的基因工程菌，以该菌株进行发酵产MTHase酶活可达到204U/mL。专利CN109337851B中公开了一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，通过基因工程手段将海藻糖合酶TreS基因分别与5种芽孢衣壳蛋白编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在芽孢表面高效展示海藻糖合酶的基因工程菌。

其中大肠杆菌蛋白表达系统因为其细胞繁殖速度快、产量高、价格便宜、表达量高、抗污染能力强、遗传背景明确等优点而被广泛应用，但该系统在实际应用时仍然会受到各种因素的影响，其中包涵体的形成是困扰大家的一个主要问题。包涵体形成的主要原因是由于外源目的蛋白在表达过程中蛋白合成速率超过蛋白折叠速率导致错误折叠而形成无活性的不溶物。想要获得可溶性蛋白，就需要进行蛋白复性或者在设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般可以通过密码子优化提高mRNA二级结构的稳定性，从而有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。或者通过融合表达分子伴侣等融合蛋白，提高外源蛋白表达量和可溶性。或者通过诱导表达条件的优化，包括降低诱导温度降低蛋白合成速率和优化诱导剂浓度、诱导时间等诱导培养条件，从而提高重组蛋白的可溶性表达。

其次为了能够获得大量目的蛋白，通常采用补料分批发酵工艺实现高密度培养，但由于大肠杆菌发酵培养过程对氧气需求量较大，高密度培养过程中随着体积增大会导致溶氧不足产生大量乙酸而抑制菌体生长和外源蛋白的表达。

微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期较长，生产效率较低；补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏；连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备投资较大，且发酵产物浓度较低；半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可以补充养分和前体，而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。

发明内容

本发明的目的是提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的产量和酶活。

通过密码子优化等分子生物学手段对外源蛋白的可溶性表达有一定改善作用，但不能完全解决实际诱导表达过程中蛋白合成速率快而导致错误折叠形成包涵体的问题；通过共表达分子伴侣等融合蛋白可提高外源蛋白的可溶性，但是需要增加后续处理步骤，通过酶反应去除融合蛋白以获得目标蛋白。通过降低温度诱导的方法能够防止过快的折叠速率产生错误的蛋白中间体形成不可溶的包涵体，但是过低的温度会导致营养物质摄取速率和生长速率的降低，目的蛋白的产量会较低；采用补料分批发酵工艺，能够增加菌体量和总酶量，但随着发酵体积增加，供养不足会导致乙酸不断积累，最终抑制菌体生长和蛋白表达。

为了实现本发明的目的，在发酵液中菌体酶活高的同时，维持菌体量大。第一方面，本发明提供一种半连续发酵方法，在所述半连续发酵方法中，流加葡萄糖和乳糖的混糖作为诱导剂，诱导重组菌中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的表达。

在本发明所提供的半连续发酵方法中，混糖的总糖浓度为40-80％；流加混糖控制发酵体系中，溶氧值为30-40％；优选地，所述混糖的流加速度为2-5g/L/h。

总糖浓度是指葡萄糖和乳糖的浓度，例如葡萄糖浓度40％，乳糖浓度20％，总糖浓度为60％；在本发明所提供的半连续发酵方法中，葡萄糖与乳糖的质量比为：1:1-3:1。

在本发明所提供的半连续发酵方法中，所述重组菌中含有优化后的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明所提供的半连续发酵方法中，所述重组菌中含有优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更具体地，在本发明所提供的半连续发酵方法中，通过边放料边补料的方式进行半连续发酵，包括：

(1)将含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任一项所示的编码基因的大肠杆菌作为工程菌，将活化后的大肠杆菌种子液接种到发酵培养基中；

(2)诱导培养至发酵液体积占发酵容器40-50％时开始放料，每次放料同时补加占放料量40-60％的流加培养基，继续流加糖诱导产酶；

所述流加培养基，含有葡萄糖，水解液，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。

(3)当发酵液体积再次达到40-50％时，重复步骤(2)。

在本发明所提供的半连续发酵方法中，步骤(2)所述诱导培养包括：将活化后的大肠杆菌种子液接种到发酵培养基中，诱导前，发酵体系的溶氧控制20％-30％，当底糖消耗完全，溶氧回升后开始流加糖，通过流加糖控制发酵体系溶氧为30-40％；

优选地，在诱导培养过程中，发酵液中葡萄糖含量为零，降低发酵温度为30-33℃。

更具体地，在本发明所提供的半连续发酵方法中，在半连续发酵的培养体系中，控制pH6.9～7.1，风量控制10-30L/min，转速控制200～700rpm，罐压控制0.05～0.1Mpa。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任一项所示的编码基因或上述的半连续发酵方法在提高重组菌产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的产量或酶活力中的应用。

以及，上述的半连续发酵方法在双酶法合成海藻糖中的应用。

酶活力水平取决于可溶性活性蛋白水平，提高可溶性表达减少包涵体形成能够提高酶活力水平。根据蛋白质动力学模型研究表明，活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达，降低培养温度可以降低重组蛋白合成的速率，但同时菌体生长速率降低。

外源蛋白在大肠杆菌表达系统中表达水平高低主要取决于酶表达量和酶活力水平。经实验验证，采用本申请提供的半连续发酵方法(工艺)，可以实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活提高1.76-2.4倍，并且，菌体量提升1.42-1.5625倍；菌体麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活提高1.2-1.525倍，菌体量提升1.75-1.94倍。

本发明的有益效果在于：

(1)本申请通过在菌株构建阶段采用较强的启动子，选择合适的载体与宿主菌，能够提高目标蛋白的表达量；即本发明所采用的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任一项所示的编码基因，在大肠杆菌表达系统中，具备良好的表达能力。

(2)采用葡萄糖和乳糖混糖流加工艺，可同时控制菌体生长和蛋白表达；本发明通过控制补糖速率即可实现外源蛋白的可溶性表达，操作简单；本发明采用半连续发酵工艺，溶氧充足避免了乙酸的积累，改善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定。

(3)本发明采用半连续发酵工艺，不需要反复装料、灭菌、接种、放料等操作，节省非发酵时间，设备利用率高，总产酶量高。本发明采用的培养基氮源水解液来源广泛，成本低廉，利于工业化应用。

(4)本发明在发酵培养过程中通过培养条件的优化提高菌体数量也能够增加目标蛋白的总表达量。本发明采用半连续发酵工艺，发酵过程中每隔一段时间放出部分发酵液同时补充部分新鲜的发酵培养基，能够降低乙酸产生对菌体生长和蛋白表达的抑制作用，延长菌体活力维持时间，增加总菌体量和蛋白表达量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明所用到的技术，例如载体构建技术、工程菌构建技术、电泳技术等均为基因工程中比较成熟的技术，本领域人员可以根据现有技术实现。在操作过程中所用的设备或者试剂、载体、酶等，如无特别说明，均能在市场中得到。

本发明中，TB培养基(W/V)的配方为：1.2％蛋白胨，2.4％酵母粉，0.213％磷酸二氢钾，1.643％磷酸氢二钾，0.5％甘油，pH7.0。

PBS缓冲液制备方法为：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液pH至6.0，最后加蒸馏水定容至1L即得。

菌体破碎的方法为：10000rpm离心15min收集发酵液中的菌体，精确称量1g菌体至烧杯中，用PBS缓冲液(pH＝6.0)溶解定容至50mL，菌悬液采用超声波细胞破碎仪进行破碎，破碎总时间40min，每10min间隔一次，超声工作时间1s，超声间隙时间2s，超声功率为70％。

产MTSase菌体酶活测定方法为：先吸取25uL 1％的麦芽六糖溶液，再吸取375uL的PBS缓冲液(pH＝6.0)，加入100uL的产MTSase菌体破碎液，在50℃的水浴锅中反应30min，然后放入沸水浴中灭活10min后至完全冷却，采用高效液相色谱仪测定反应后麦芽六糖含量。

MTSase酶活力定义为：每1min转化1umol麦芽六糖所需的MTSase酶量为1U。

产MTHase菌体酶活测定方法为：吸取200uL 9％的麦芽糊精溶液，再吸取500uL的PBS缓冲液(pH＝6.0)，加入100uL的产MTSase菌体破碎液，在55℃的水浴锅中反应60min后放入沸水浴中灭活10min，将其冷却后加入100uL的产MTHase菌体破碎液后再在55℃水浴锅中反应20min后，在沸水浴灭活10min终止反应，采用高效液相色谱仪测定反应液中海藻糖含量。

MTHase酶活力定义为：每1min转化麦芽糊精生成1umol海藻糖所需的MTHase酶量为1U。

发酵液葡萄糖测定采用生物传感仪(SBA)测定；

海藻糖测定参照GB/T23529-2009中高效液相色谱法测定海藻糖含量。

实施例1产MTSase和MTHase重组表达菌株的构建

本实施例提供MTSase和MTHase重组表达菌株的构建，步骤如下：

按照NCBI上报道的节杆菌来源的(麦芽寡糖基海藻糖合成酶)MTSase基因序列人工合成基因treY，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，采用限制性内切酶双酶切之后将表达载体pET-28a和treY基因连接获得重组表达质粒pET-28a-treY，将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，37℃培养1h后，涂布于固体TB培养基，挑取单菌落在含有卡那霉素抗性的TB液体培养基中37℃培养12h后进行PCR验证。将验证正确的菌株进行甘油管保藏，得到重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-treY。

按照NCBI上报道的节杆菌来源的(麦芽寡糖基海藻糖水解酶)MTHase基因序列人工合成基因treZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，采用限制性内切酶双酶切之后将表达载体pET-24a和treZ基因连接获得重组表达质粒pET-24a-treZ，将其转化至E.coli BL21(DE3)LysS感受态细胞中，37℃培养1h后，涂布于固体TB平板，挑取单菌落在含有卡那霉素抗性TB液体培养基中37℃培养12h后进行PCR验证。将验证正确的菌株进行甘油管保藏，得到重组表达菌株E.coli BL21(DE3)LysS/pET-24a-treZ。

实施例2种子培养

本实施例提供将实施例1所得到的重组菌作为种子，进行培养的步骤，如下：

将甘油管保存的实施例1得到的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-treY和E.coli BL21(DE3)LysS/pET-24a-treZ分别涂布带有卡那霉素抗性的TB平板于37℃进行活化过夜培养，挑取3环接种于已灭菌的种子培养基中，500mL三角瓶装液量为50mL，将已接种的三角瓶放入37℃摇床振荡培养，转速220rpm，培养至OD₆₀₀达到8～10停止培养。

种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，水解液20g/L，磷酸氢二钾5.5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L。

实施例3半连续发酵产酶工艺

本实施例提供半连续发酵工艺，步骤如下：

(1)物料准备：

发酵培养基：葡萄糖25g/L，水解液45g/L，磷酸氢二钾8g/L，磷酸二氢钾2g/L；

流加培养基：水解液90g/L，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾4g/L；

流加糖：总糖浓度60％(W/V)，总糖浓度是指葡萄糖和乳糖的浓度，例如葡萄糖浓度40％，乳糖浓度20％，总糖浓度为60％；本实施例中葡萄糖和乳糖比例为1:1；

pH调节碱溶液：25％氨水，市售产品；

pH调节酸溶液：采用自制水解液，按照质量比1:1加水稀释制备；

水解液制备：以玉米浆、豆粕或棉粕为原料，加水至干物含量40～50％，之后加入98％浓硫酸，料酸比1:2～3，搅拌均匀后在反应釜中110～120℃反应12～15h，之后降温至50～55℃过滤，收集滤清液即得水解液。

(2)半连续发酵产酶

将实施例2得到的种子液按照0.25％的接种比接入装有40％发酵培养基的发酵罐中，发酵初始温度37℃，流加pH调节酸碱溶液控制pH6.9～7.1，风量控制10-30L/min，转速控制200～700rpm，罐压控制0.05～0.1MPa，诱导前溶氧(DO)控制20％～30％，当底糖消耗完全，溶氧(DO)回升后开始流加糖，通过控制流加糖速率控制DO在30～40％之间波动，(流加糖的补糖速率为5g/L/h)过程控制发酵液中葡萄糖含量为零，同时降低发酵温度至33℃，诱导培养至发酵液体积达到50％发酵罐体积时开始放料，每次放料20％同时补加10％流加培养基，继续流加糖诱导产酶，当发酵液体积再次达到50％时重复上述步骤。

(3)菌体量和酶活检测

取100mL发酵液10000rpm离心15min收集发酵液中的菌体，测定菌体量和菌体酶活。检测结果如表1：

表1菌体量和菌体酶活检测

实施例4：半连续发酵产酶工艺

本实施例提供一种半连续发酵产酶工艺，与实施例3的区别在于：调整流加糖中葡萄糖和乳糖比例为2:1，(流加糖的补糖速率为3g/L/h)其余同实施例3。

实施例5：半连续发酵产酶工艺

本实施例提供一种半连续发酵产酶工艺，与实施例3的区别在于：调整流加糖中葡萄糖和乳糖比例为3:1，(流加糖的补糖速率为2g/L/h)其余同实施例3

对比例1：分批发酵产酶

本对比例提供一种常规分批发酵产酶的方法，本对比例中重组菌为重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-treY及重组表达菌株E.coli BL21(DE3)LysS/pET-24a-treZ，步骤如下：

(1)物料准备：

诱导剂：浓度40％乳糖(W/V)；

pH调节碱溶液：25％氨水，市售产品；

(2)分批发酵产酶

将种子液按照0.25％的接种比接入装有40％发酵培养基的发酵罐中，发酵初始温度37℃，流加pH调节酸碱溶液控制pH6.9～7.1，风量控制10-30L/min，转速控制200～700rpm，罐压控制0.05～0.1MPa，诱导前DO控制20％～30％，当底糖消耗完全，DO回升后加入乳糖开始诱导，乳糖终浓度20g/L，调节风量、转速和罐压控制DO在30～40％之间波动，同时降低发酵温度至28℃，诱导培养至乳糖消耗完全停止发酵。

(3)菌体量和酶活检测

取100mL发酵液10000rpm离心15min收集发酵液中的菌体，测定菌体量和菌体酶活。

对比例2：补料分批发酵产酶(高密度发酵)

本对比例提供一种，补料分批发酵产酶的方法，本对比例中重组菌为重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-treY及重组表达菌株E.coli BL21(DE3)LysS/pET-24a-treZ，步骤如下：

(1)物料准备：

流加培养基：葡萄糖600g/L，水解液90g/L，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾4g/L；

诱导剂：100mM IPTG；

pH调节碱溶液：25％氨水，市售产品；

(2)补料分批发酵产酶

将种子液按照0.25％的接种比接入装有40％发酵培养基的发酵罐中，发酵初始温度37℃，流加pH调节酸碱溶液控制pH6.9～7.1，风量控制10-30L/min，转速控制200～700rpm，罐压控制0.05～0.1MPa，诱导前DO控制20％～30％，当底糖消耗完全DO回升时加入IPTG诱导，IPTG终浓度0.2mM，同时流加培养基控制菌体比生长速率0.1h^-1，降低发酵温度至28℃，连续流加至发酵最高条件下DO降至零时停止流加，结束发酵，最终发酵液体积达到发酵罐体积的60％左右。

(3)菌体量和酶活检测

不同实施例发酵产酶条件下，发酵液中菌体量和菌体酶活如表2：

表2不同发酵方法的发酵液中菌体量和菌体酶活

从表2中，可以得知，采用本申请提供的半连续发酵方法(工艺)，可以实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活提高1.76-2.4倍，并且，菌体量提升1.42-1.5625倍；菌体麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活提高1.2-1.525倍，菌体量提升1.75-1.94倍。

对比例3混糖不同流加量

本对比例中对半连续发酵诱导过程中，混糖(葡萄糖+乳糖)不同的补糖速率对发酵液中菌体量和菌体酶活的影响。

本对比例与实施例3相同，区别在于，本对比例中，开始流加糖的过程中，流加糖的补糖速率为7g/L/h，大于实施例3的补糖速率；或者流加糖的不同速率为2g/L/h，小于实施例3的补糖速率。

其中当补糖速率较小或较大时，发酵液中菌体量和菌体酶活均呈现下降趋势，推测原因可能是：当补糖速率较小时，补加的葡萄糖不能满足菌体生长需求导致菌体生长缓慢，补加的诱导剂乳糖量少导致诱导强度低菌体酶活低；当补糖速率较大时，补加的葡萄糖过量导致菌体只利用葡萄糖生长，不利用乳糖进行诱导产酶，导致菌体酶活低。

对比例4不同优化序列

本发明在实施例1中，得到多条优化序列，在实际实验中，有2个序列不能成功表达出蛋白，或在半连续发酵中的蛋白表达量与现有技术中高密度发酵的酶活性及产量相近，甚至更差。

本次提供一个优化序列(序列如SEQ ID NO.3所示)在半连续发酵(方法与实施例3相同)及分批发酵(方法与对比例1相同)和高密度发酵(方法与对比例2相同)中得到菌体量和酶活力，见表3。

表3不同发酵方法的发酵液中菌体量和菌体酶活

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种半连续发酵方法，其特征在于，在所述半连续发酵方法中，流加葡萄糖和乳糖的混糖作为诱导剂，诱导重组菌中麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的表达。

2.根据权利要求1所述的半连续发酵方法，其特征在于，混糖的总糖浓度为40-80％；流加混糖控制发酵体系中，溶氧值为30-40％；优选地，所述混糖的流加速度为2-5g/L/h。

3.根据权利要求2所述的半连续发酵方法，其特征在于，葡萄糖与乳糖的质量比为：1:1-3:1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的半连续发酵方法，其特征在于，所述重组菌中含有优化后的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或所述重组菌中含有优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的半连续发酵方法，其特征在于，包括：

(2)诱导培养至发酵液体积占发酵容器40-50％时开始放料，每次放料同时补加占放料量40-60％的流加培养基，并流加糖诱导产酶；

(3)当发酵液体积再次达到占发酵容器40-50％时，重复步骤(2)。

6.根据权利要求5所述的半连续发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导培养包括：诱导前，发酵体系的溶氧为20％-30％，当发酵培养基的底糖消耗完全，溶氧回升后开始流加糖，通过流加糖控制发酵体系溶氧为30-40％；

7.根据权利要求6所述的半连续发酵方法，其特征在于，在半连续发酵的培养体系中，控制pH6.9～7.1，风量控制10-30L/min，转速控制200～700rpm，罐压控制0.05～0.1Mpa。

8.根据权利要求7所述的半连续发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖、水解液、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；所述水解液以玉米浆、豆粕或棉粕为原料，加水至干物含量的40～50％，之后加入硫酸，搅拌均匀后在反应釜中110～120℃反应12～15h，之后降温至50～55℃过滤即得水解液。

9.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任一项所示的编码基因或权利要求1-8任一项所述的半连续发酵方法在提高重组菌产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的产量或酶活力中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的半连续发酵方法在双酶法合成海藻糖中的应用。