KR20010104925A - 폴리하이드록시알칸산 생합성 효소와 세포내폴리하이드록시알칸산 분해효소를 발현시키는 재조합미생물 및 그를 이용한 (ｒ)-3-하이드록시카르복실산의제조방법 - Google Patents
폴리하이드록시알칸산 생합성 효소와 세포내폴리하이드록시알칸산 분해효소를 발현시키는 재조합미생물 및 그를 이용한 (ｒ)-3-하이드록시카르복실산의제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성 관여 효소의 유전자와 PHA 세포내 분해효소의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 (R)-하이드록시카르복실산((R)-hydroxycarboxylic acid)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 세포내 PHA 분해효소(depolymerase) 및 랄스토니아 유트로파 또는 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)의 PHA 합성 관여 효소(biosynthesis enzyme)를 함께 발현시키는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하여 이로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, PHA 합성과 분해가 동시에 일어나기 때문에 연속공정에의 응용이 가능하고, 균체 회수 및 세포물질의 폐기처분 공정이 단순화되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다. 또한, 상기 재조합 대장균 시스템에 다른 다양한 단량체 단위를 가지는 PHA를 합성할 수 있는 미생물로부터 다양한 종류의 PHA 생합성 효소계와 세포내 PHA 분해효소를 적용함으로써, 다양한 3-하이드록시카르복실산의 생산에 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성 관여효소의 유전자와 PHA 세포내 분해효소의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 (R)-하이드록시카르복실산((R)-hydroxycarboxylic acid)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 PHA 분해효소(PHA depolymerase)를 발현시키는 유전자와 PHA 합성 관여 효소(PHA biosynthesis enzyme)를 발현시키는 유전자를 함께 도입한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드를 대장균에 도입하고 배양하여 균체 내에서 PHA 합성과 분해가 동시에 이루어지게 함으로써, 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(R)-하이드록시카르복실산은 두개의 기능기 즉, 하이드록실기(-OH)와 카르복실기(-COOH)를 동시에 가지고 있어, 유용물질의 유기합성이 용이하고 합성물에 키랄 중심(chiral center)을 손쉽게 제공할 수 있으며, 또한 이 두 기능기는 전환이 용이하기 때문에 정밀화학분야에서 키랄성 전구체로서 다양하게 이용될 수 있다. 항생제, 비타민, 향료, 페로몬(pheromone) 등의 합성을 위한 전구체와 의약품 디자인에 사용되는 비펩타이드 리간드(nonpeptide ligand) 개발을 위한 응용 및 신규 의약품 개발을 위한 전구체 등의 폭넓은 응용이 기대되고 있으며, 특히 페니실린을 대체할 항생물질로 주목을 받고 있는 카바페넴계 항생물질(carbapenem)의 전구체로서 사용될 수 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 한 예로서, (R)-3-하이드록시부탄산-메틸에스터(methyl-(R)-3-hydroxybutyrate)로부터 티에나마이신((+)-thiennamycin)을 합성하는 방법이 개발되어 보고된 바 있다(참조: Chiba and Nakai, Chem. Lett., 651-654, 1985).
폴리하이드록시알칸산(PHA)은 미생물에 의해 세포내에서 합성 및 축적되는에너지 및 탄소원 저장물질군으로서, 하이드록시카르복실산들이 에스터(ester) 결합으로 연결된 폴리에스터이다. 생합성 효소의 광학특이성으로 인해 PHA를 구성하는 단량체인 하이드록시카르복실산은 4-하이드록시부탄산(4-hydroxybutyric acid)와 같은 몇몇 광학이성질체가 존재하지 않는 경우를 제외하고, 모두 R-형의 광학활성을 가지므로, 생합성된 PHA를 분해함으로써 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 생산할 수 있다. PHA의 일종인 폴리하이드록시부탄산(poly-(3-hydroxybutyrate), PHB) 또는 폴리하이드록시부탄산/하이드록시발레르산 공중합체(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHB/V)를 화학적 방법으로 분해하여 (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드록시부탄산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxybutyrate), 또는 (R)-3-하이드록시발레르산-알킬에스터(alkyl-(R)-3-hydroxyvalerate)를 생산하는 방법이 연구되어 보고된 바 있다(참조: Seebach et al., Org. Synth., 71:39-47, 1992; Seebach and Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65:495-503, 1982). 그러나, 전술한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 화학적 방법에 의한 제조는 미생물 배양, 균체회수, 고분자 분리, 분해반응 및, 분리·정제로 이어지는 복잡한 공정으로 인한 수율의 감소와 다량의 유기용매 사용의 필요성 등의 문제점을 지니고 있다. 또한, 미생물 세포물질이 부산물로 다량 발생하게 되며, 현재까지 생산이 시도된 물질도 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산에 국한되어 있다.
최근에, 본 발명자들은 PHA를 생산하는 미생물들이 PHA 생합성 효소계와 함께 자체적으로 가지고 있는 PHA 분해효소를 이용하여 자가분해함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산을 포함하는 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산들을 생산하는 방법을 연구하여 발표한 바 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 전기 자가분해법은 종래의 화학적 방법에 비하여 훨씬 효율적인 바, 한 예로서 알칼리게네스 레이터스를 사용하는 경우 배양에 의해 PHB를 과량 축적시킨 후, pH를 적절히 맞추어 37℃로 30분간 방치함으로써 축적된 PHB의 95이상을 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시부탄산으로 분해·방출한다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 이러한 자가분해법은 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산 생성에 응용될 수 있으나, 근본적으로 PHA 축적 후 분해라는 회분식 공정을 따르고 있다. 만약, 연속적으로 PHA 축적과 동시에 분해가 일어날 수 있다면 부산물인 미생물 세포물질들을 많이 줄일 수 있으며, 이로부터 기질로부터의 하이드록시카르복실산 수율의 증가를 기대할 수 있을 것이다. 따라서, 효율적이고 보다 경제적으로 (R)-3-하이드록시카르복실산을 생산하기 위한, 좀 더 간단하고, 연속공정을 적용할 수 있는 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 요구되어 왔다.
미생물내에서 PHA의 일반적인 합성 및 분해 기작은 다음과 같다. 미생물이 탄소원은 충분하나 질소, 인산염 또는 마그네슘 등의 성장에 필수적인 요소가 제한된 불균형적인 성장 환경에 처하게 되면, PHA 생합성 효소계가 발현하여 여분의 탄소원으로부터 PHA를 합성, 세포내에 축적한다(참조: Lee, Biotechnol. Bioeng., 49:1-14, 1996). 이 후, 환경여건이 변화하여 제한되었던 성장요소가 다시 공급되면, PHA 분해효소와 올리고머 가수분해효소 등의 작용으로 PHA가 그 단량체인 (R)-3-하이드록시카르복실산으로 분해된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993).
이들의 미생물내 대사회로에서의 재사용을 위한 기작은 (R)-3-하이드록시부탄산의 경우만이 자세하게 연구되어 다음과 같이 밝혀졌다. 생성된 (R)-3-하이드록시부탄산은 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 작용에 의해 아세토아세테이트(acetoacetate)로 변환되고, 이는 미생물 대사회로에 재사용된다(참조: Muller and Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32:477-502, 1993; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999). 따라서, 미생물에 의한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 생산을 위하여는 PHA 합성 효소계와 PHA 분해효소가 필요하며, (R)-3-하이드록시부탄산 생산의 경우, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소의 활성이 억제되거나 제거된 상황이 바람직하다.
본 발명자들을 비롯한 많은 연구진들에 의해 재조합 대장균을 이용하여 PHA를 효율적으로 생산하는 방법에 대한 연구가 진행되어 왔으며, PHB나 PHB/V의 경우 건조 균체 질량의 80이상까지도 축적할 수 있는 기술 수준에까지 이르렀다(참조: Slater et al., J. Bacteriol., 170:4431-4436, 1988; Schubert et al., 170, 5837-5847, 1988; Kim et al., Biotechnol. Lett., 14:811-816, 1992; Fidler and Dennis, FEMS Microbiol. Rev., 103:231-236, 1992; Lee et al., J. Biotechnol., 32:203-211, 1994; Lee et al., Ann. NY Acad. Sci., 721:43-53, 1994; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1347, 1994; Lee and Chang, J. Environ. Polymer Degrad., 2:169-176, 1994; Lee and Chang, Can. J. Microbiol., 41:207-215, 1995; Yim et al., Biotechnol. Bioeng., 49:495-503, 1996; Lee and Lee, J. Environ. Polymer Degrad., 4:131-134, 1996; Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769, 1997; Wang and Lee, Biotechnol. Bioeng., 58:325-328, 1998; Lee, Bioprocess Eng., 18:397-399, 1998; Choi et al., Appl. Environ. Microbiol, 64:4897-4903, 1998; Wong and Lee, Appl. Microbial. Biotechnol., 50:30-33, 1998; 및, Lee et al., Int. J. Biol. Macromol., 25:31-36, 1999).
대장균은 원래 균체 내에 에너지 저장물질로서 PHA를 합성할 수 없고, 이를 분해하는 효소 또한 가지고 있지 않다. 아울러, (R)-3-하이드록시부탄산을 아세토아세테이트로 변환시키는 (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소도 가지고 있지 않을 것으로 여겨진다. 다른 미생물의 PHA 합성 관여 유전자를 도입하여 제작한 PHA 합성 재조합 대장균의 경우에도, PHA 생합성 효소계만을 도입하였기 때문에 균체 내에 합성, 축적된 PHA는 분해되지 않는다(참조: Lee, Trends Biotechnol., 14:98-105, 1996; Lee, Nature Biotechnol., 15:17-18, 1997). 따라서, 본 발명자들은 이러한 효율적인 PHA 합성 재조합 대장균에 세포내 PHA 분해효소를 함께 도입, 발현시킴으로써 (R)-3-하이드록시카르복실산, 특히 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있으며, (R)-3-하이드록시부탄산 탈수소효소가 존재하지 않거나 활성이 없으면 (R)-3-하이드록시부탄산이 아세토아세테이트로 변환되지 않기 때문에 더 이상 대사에 사용되지 않을 것이라는 점에 착안하였다.
이에, 본 발명자는 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 PHA 분해효소를 발현시키는 유전자를 대장균에 도입, 발현시킴으로써, 재조합 대장균으로부터 광학활성을 갖는 (R)-3-하이드록시카르복실산들을 제조하고자 예의 연구노력한 결과, 랄스토니아 유트로파의 세포내 PHA 분해 효소를 발현하는 유전자를 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소의 발현 유전자와 함께 가지는 플라스미드를 작제하고, 전기 플라스미드로 대장균을 형질전환하여 배양함으로써 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산을 포함하는 하이드록시카르복실산들이 생성되어, 배양액으로 방출되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 폴리하이드록시알칸산 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 PHA 세포내 분해효소를 발현시키는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 재조합플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 형질전환체를 배양하는 공정을 포함하는 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 재조합 플라스미드 pJC4Red의 유전자 지도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pSYL105Red의 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 플라스미드 pSYL107Red의 유전자 지도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 플라스미드 pJC4Red-trc의 유전자 지도이다.
도 5는 본 발명의 재조합 플라스미드 pSYL105Red-trc의 유전자 지도이다.
도 6은 본 발명의 재조합 플라스미드 pSYl107Red-trc의 유전자 지도이다.
본 발명의 (R)-하이드록시카르복실산의 제조방법은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 세포내 PHA 분해효소(depolymerase) 및 랄스토니아 유트로파 또는 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)의 PHA 합성 관여 효소(biosynthesis enzyme)를 함께 발현시키는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하여 이로부터 (R)-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 PHA 분해효소를 발현시키는 유전자를 도입한 재조합 대장균을 배양하여, 상기 효소들의 발현에 의해 (R)-3-하이드록시부탄산과 그의 이량체를 생성하여 배양액 중으로 분비하게 한다. 분비된 (R)-3-하이드록시부탄산과 그의 이량체는 특정조건의 LC 또는 HPLC로 분리할 수 있다. 필요한 경우 이량체를 염기조건에서 가열함으로써, (R)-3-하이드록시부탄산으로 분해할 수도 있다(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999).
랄스토니아 유트로파 염색체 DNA로부터 GenBank에 등록된 염기서열을 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 고유의 항시적(constitutive) 발현 프로모터(promoter)를 갖고 있는 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 유전자를 얻어, 이를 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 포함하는 플라스미드 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337-1347, 1994), 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 세포분열 관여유전자인ftsZ를 함께 가지고 있는 pSYL107(참조: Lee, Biotechnol. Lett., 16:1247-1252, 1994; 대한민국 특허 제164282호), 그리고 알칼리게네스 레이터스 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 갖고 있는 pJC4(KCTC 0481BP) (참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998)에 클로닝하여 3종의 플라스미드, pSYL105Red, pSYL107Red 및 pJC4Red를 작제하였다. 또한, 전기 클로닝한 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 유전자 고유의 항시적 발현 프로모터를 유도발현 가능한 trc 프로모터로 치환하여, 또 다른 3종의 플라스미드인 pSYL105Red-trc, pSYL107Red-trc 및 pJC4Red-trc를 작제하였다.
전기 작제한 6종의 플라스미드 각각을 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 대장균 XL1-Blue(Stratagene Cloning System, U.S.A.)를 형질전환하여 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 PHA 분해효소를 가지는 6종의 재조합 대장균을 제작하여, 적절한 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 생성된 (R)-3-하이드록시카르복실산의 농도를 측정하였다.
그 결과, 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 효소를 발현시키는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 도입된 재조합 대장균의 배양으로 (R)-3-하이드록시카르복실산을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하였고, 적합한 배양조건을 확립하였다.
이렇게 결정된 (R)-3-하이드록시부탄산을 생산하기 위한 배양 조건은, 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 효소를 발현시키는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 도입된 재조합 대장균의 경우, 배양시간이 30 내지 70시간이고; trc 프로모터로 유도발현 가능한 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 효소를 발현시키는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 도입된 재조합 대장균의 경우, 유도발현 전 배양시간은 24 내지 72시간이며, 유도발현 후 연장배양시간이 2 내지 8시간이 바람직함이 밝혀졌다.
(R)-3-하이드록시부탄산/(R)-3-하이드록시발레르산을 생산하기 위한 배양 조건은, 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 효소를 발현시키는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 도입된 도입된 재조합 대장균의 경우, 배양시간이 15 내지 70시간이고; trc 프로모터로 유도발현 가능한 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 효소를 발현시키는 유전자가 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자와 함께 도입된 재조합 대장균의 경우, 유도발현 전 배양시간은 10 내지 72시간이고, 유도발현 후 연장배양시간이 2 내지 8시간이 바람직함이 밝혀졌다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 생분해 유전자의 클로닝
랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소를 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 마머(Marmur)의 방법(참조: Marmur, J. Mol. Biol., 3:208-218, 1961)으로 분리한 랄스토니아 유트로파 염색체 유전자를 주형 DNA로 하여, 랄스토니아 유트로파의 세포내 PHA 분해효소 유전자 서열(참조: Saito and Saegusa, GenBank Sequence Database, AB017612, 1999)로부터 제작한 프라이머 1, 5'-GCTCTAGAGGATCCTTGTTTTCCGCAGCAACAGAT-3'(서열번호 1) 및 프라이머 2, 5'-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3'(서열번호 2)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 전기 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성은 95℃에서 50초간, 교잡(annealing)은 55℃에서 1분 10초간, 연장(extention)은 72℃에서 3분간 수행하였으며, 이를 30회 반복하고, 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 DNA를 제한효소BamHI으로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동하여 약 1.4kbp 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pUC19(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pUC19Red를 작제하였다. 아울러, pUC19Red를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 50㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 XL1-Blue/pUC19Red를 제조하였다. 클로닝된 DNA 절편의 유전자 염기서열을 분석하여, GenBank™에 등록된 염기서열과 비교해 본 결과, 고유의 항시적(constitutive) 발현 프로모터 영역을 포함하는 랄스토니아 유트로파 PHA 분해효소의 유전자임을 확인할 수 있었다. 전기 플라스미드 pUC19Red를 다시 제한효소HindⅢ로 절단한 후, 아가로즈 겔 전기영동을 수행하여 약 1.4kbp 크기의 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 유전자가 포함된 DNA 절편을 분리하였다. 전기 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단한 알칼리게네스 레이터스 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 가진 플라스미드 pJC4(참조: Choi et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:4897-4903, 1998)와 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 가진 두 종의 플라스미드 pSYL105와 pSYL107(참조: Lee, Biotechnol. Lett., 15:1247-1252, 1994; Wang and Lee, Appl. Environ. Microbiol., 63:4765-4769, 1997)에 각각 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJC4Red, pSYL105Red 및 pSYL107Red를 제조하였다. 도 1, 도 2 및, 도 3은 전기 제작한 플라스미드 pJC4Red, pSYL105Red 및 pSYL107Red의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 전기 제조한 플라스미드 pJC4Red, pSYL105Red 및 pSYL107Red에 삽입한 DNA 절편은 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 고유의 항시적 발현 프로모터 영역을 포함하고 있다.
전기 3종의 재조합 대장균 중 이들을 대표할 수 있는 재조합 플라스미드 pJC4Red와 pSYL105Red 각각으로 형질전환된 대장균 XL1-Blue를 대장균 XL1-Blue/pJC4Red(Escherichia coliXL1-Blue/pJC4Red)와 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red)라 명명하고, 1999년 10월 22일 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 0677BP와 KCTC 0676BP로 기탁하였다.
실시예 2: (R)-3-하이드록시부탄산의 생산
전기 실시예 1에서 작제한 플라스미드 pJC4Red, pSYL105Red 및 pSYL107Red을 일렉트로포레이션 방법에 의해 대장균 XL1-Blue에 각각 도입하여, 세 종의 재조합 대장균 XL1-Blue/pJC4Red, XL1-Blue/pSYL105Red 및 XL1-Blue/pSYL107Red를 구축하였다. 전기 구축한 재조합 대장균들을 100㎎/L 엠피실린을 첨가한 LB 배지에서 12시간 배양한 후, 1㎖을 취해 20g/L 포도당과 20㎎/L 티아민(thiamine)을 첨가한 100㎖의 R배지(참조: Lee and Chang, Biotechnol. Lett., 15:971-974, 1993)를 넣은 250㎖ 플라스크에 접종하여 배양하였다. 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL107Red는 30℃, XL1-Blue/pSYL105Red와 XL1-Blue/pJC4Red는 37℃에서 250rpm의 속도로 교반하며 배양하였다. 그런 다음, 수득한 건조균체의 농도, PHB 농도, PHB 함유량, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도 및 이량체의 농도를 측정하여, 표 1에 나타내었다. 이때, 이량체가 생성되는 이유는 랄스토니아 유트로파 PHA 생분해 효소가 대장균 세포 내에 축적된 PHB의 에스터 결합(ester bond)에 작용하여 이 결합을 끊음과 동시에, 이량체 이하의 크기가 되면 쉽게 균체 밖으로 배출됨으로 인한 것이다.
| 플라스미드/배지 | 배양온도/배양시간 | 건조균체의농도(g/L) | PHB의농도(g/L) | PHB의함유량() | 단량체의농도(g/L) | 이량체의농도(g/L) | 최종수율() |
| pJC4Red/R+포도당+티아민 | 37℃/51시간 | 1.45 | 0.10 | 7 | 0.7 | 6.7 | 43 |
| pSYL105Red/R+포도당+티아민 | 37℃/51시간 | 1.50 | 0.47 | 31 | 1.6 | 6.1 | 44 |
| pSYL107Red/R+포도당+티아민 | 30℃/51시간 | 3.04 | 1.97 | 65 | 1.7 | 2.7 | 25 |
| pJC4Red/LB+포도당 | 37℃/51시간 | 2.72 | 1.20 | 44 | 0.2 | 2.6 | 16 |
| pSYL105Red/LB+포도당 | 37℃/51시간 | 2.75 | 1.32 | 48 | 0.2 | 4.0 | 25 |
| pSYL107Red/LB+포도당 | 30℃/51시간 | 3.84 | 2.81 | 73 | 0.9 | 0.3 | 6 |
표 1의 PHB 함유량은 단위 건조균체 무게 당 축적된 PHB의 무게로, 최종 수율은 단위 포도당 질량당 생산된 단량체 농도와 단량체 농도로 환산한 이량체 농도의 합으로 정의하였다. 비록, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산 농도는 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red의 경우 1.6g/L, 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL107Red의 경우 1.7g/L 및 재조합 대장균 XL1-Blue/pJC4Red의 경우 0.7g/L에 불과하나, 이량체 농도가 각각 6.1, 2.7 및 6.7g/L에 달하고, 이는 염기조건에서 가열함으로써 단량체로 쉽고 효율적으로 변환될 수 있으므로, 기질인 포도당에 대한 (R)-3-하이드록시부탄산의 최종 수율은 각각의 경우 44, 25 및 43이었다.
또한, 다른 종류의 대장균들에서도 상기 플라스미드가 발현된다는 것을 확인하기 위하여, 대장균 B(ATCC 11303), HB101(참조: Boyer and Roulland-Dussoix, J.Mol. Biol., 41:459-472, 1969) 및 JM101(참조: Messing et al. Nucleic Acids Res., 9:309-321, 1981), W3110(ATCC 27325) 각각을 일렉트로포레이션에 의해 전기 3종의 플라스미드들 각각으로 형질전환하여, 총 12종의 재조합 대장균을 제작하였다. 제작한 재조합 대장균들을 100㎎/L의 엠피실린을 첨가한 LB 배지에서 12시간 동안 배양한 후, 1㎖을 취해 20g/L의 포도당을 첨가한 100㎖의 LB배지를 가한 250㎖ 플라스크에 접종하여 플라스크 배양을 수행하였다. 51시간 배양하여 측정한 결과, 전기 대장균 XL1-Blue를 사용한 경우보다는 약간 적으나, 약 0.1 내지 0.3g/L의 (R)-3-하이드록시부탄산 단량체와 2g/L 내외의 이량체가 생성되어 배지 내로 방출되었다. 따라서, 전기 작제한 플라스미드 시스템은 다양한 대장균 균주에 사용할 수 있으며, 본 실시예에서 사용한 4종의 대장균 이외의 다른 다양한 대장균에서도 사용될 수 있음은 자명하다.
본 실시예에서 사용한 플라스미드에서 랄스토니아 유트로파 PHA 생분해 유전자는 랄스토니아 유트로파 고유의 항시적 발현 프로모터를 사용하여 발현되고 있으나, 전기 프로모터를 다른 대장균에서 작동하는 항시적 발현 프로모터로 치환하여 사용하여도 유사한 결과를 얻을 수 있음은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게는 자명할 것이다.
또한, 본 실시예에서는 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA분해효소 유전자와 알칼리게네스 레이터스 또는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자가 함께 클로닝된 플라스미드를 사용하였다. 그러나, 이들을 대장균 내에 같이 존재할 수 있는 서로 다른 복제 기원(origin of replication)을 가진 플라스미드들(예: ColE1 호환 그룹 복제기원을 가지는 pBR322 또는 pUC19 유래 플라스미드와 플라스미드 p15A 복제 오리진을 가지는 pACYC177 또는 pACYC184 유래 플라스미드)에 각각 클로닝하여 이들로 함께 대장균을 형질전환하여도, 유사한 결과를 얻을 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 3: 플라스미드 벡터 시스템의 작제
상기 실시예 1에서 작제한 플라스미드들에서는 랄스토니아 유트로파 고유의 항시적 발현 프로모터를 사용하여 랄스토니아 유트로파 PHA 생분해 유전자를 발현하고 있으므로, PHA의 합성과 동시에 분해가 이루어지게 된다. 그러므로, 항시적 발현을 가능하게 하는 프로모터 이외에도, 유도발현 가능한 프로모터의 사용 가능성을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. PHA 생분해 유전자의 발현시기를 조절하고 동시에 다량의 PHA 생분해 효소를 발현하기 위하여, 유도발현이 가능한 강력한 프로모터인 trc 프로모터(참조: Amann and Brosius, Gene, 40:183-190, 1985)를 하기와 같이 도입하여, 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 유전자를 유도발현할 수 있는 플라스미드를 작제하였다. 물론, trc 이외의 다른 유도발현 프로모터, 예를 들어 T7 프로모터(참조: Caton and Robertson, Nucleic Acids Res., 7:1445-1456, 1979), trp 프로모터(참조: Yanofsky e al., Nucleic Acids Res., 9:6647, 1981), tac 프로모터(참조: de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, 1983), bad 프로모터(참조: Smith and Schleif, J. Biol. Chem., 253:6931-6933, 1978) 등 대장균에서 단백질 발현을 가능하게 하는 모든 유도발현 프로모터들을 마찬가지로 사용할 수 있음은 자명하다.
먼저, 전기 실시예 1에서와 동일하게 분리한 랄스토니아 유트로파 유전자를 주형 DNA로, 프라이머 3, 5'-GCTACGTAGGTCTCGCATGCTCTACCAATTGCATG-3'(서열번호 3), 프라이머 4, 5'-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3'(서열번호 4) 및 DNA 중합효소를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시예 1의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다. 전기 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 약 1.4kbp의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소BsaI과HindⅢ로 절단하였다. 이와는 별도로, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann and Brosius, GenBank™ M22744)를 두 가지 제한효소NcoI과HindⅢ로 절단하였다. 전기에서 절단된 플라스미드 pTrc99A에 상기 DNA 절편을 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pTrc99ARed를 제조하였다. pTrc99ARed를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하고, 50㎎/L의 엠피실린이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하여 재조합 대장균 XL1-Blue/pTrc99ARed를 제조하였다. 전기 제조된 재조합 대장균을 100㎎/L의 엠피실린이 첨가된 LB 액체배지에서 배양한 후, 이로부터 재조합 플라스미드 pTrc99ARed DNA를 염기용해법에 의해 다량 분리하였다.
유도발현 가능한 프로모터인 trc 프로모터를 갖는 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 유전자 절편을 수득하기 위하여, 상기 제작한 재조합 플라스미드 pTrc99ARed를 주형 DNA로 하고, 프라이머 5, 5'-GCAAGCTTCGACTGCACGGTGCACC-3'(서열번호 5), 프라이머 6, 5'-CGGGATCCAAGCTTACCTGGTGGCCGAGGC-3'(서열번호 6) 및 DNA 중합효소를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시예 1의 경우와 동일하게 수행하였다. 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 trc 프로모터와 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해효소 유전자를 포함하는 1.6kbp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 제한효소HindⅢ로 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단한 알칼리게네스 레이터스 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 가진 플라스미드 pJC4와 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 관여 효소를 발현시키는 유전자를 가진 두종의 플라스미드, pSYL105와 pSYL107에 각각 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJC4Red-trc, pSYL105Red-trc 및 pSYL107Red-trc를 제조하였다. 도 4, 도 5 및 도 6에 전기 제조된 플라스미드 pJC4Red-trc, pSYL105Red-trc 및 pSYL107Red-trc의 유전자 지도를 각각 나타내었다. 전기 3종의 재조합 대장균 중 이들을 대표할 수 있는 재조합 플라스미드 pSYL105Red-trc로 형질전환된 대장균 XL1-Blue를 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red-trc(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red-trc)라 명명하고, 1999년 10월 22일 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 KCTC 0678BP로 기탁하였다.
실시예 4: trc 프로모터를 이용한 (R)-3-하이드록시부탄산의 생산
실시예 3에서 구축한 세 종의 플라스미드 pJC4Red-trc, pSYL105Red-trc 및pSYL107Red-trc를 일렉트로포레이션에 의해 대장균 XL1-Blue에 도입하여, 세 종의 재조합 대장균 XL1-Blue/pJC4Red-trc, XL1-Blue/pSYL105Red-trc 및 XL1-Blue/pSYL107Red-trc를 제조하였다. 전기 제조된 재조합 대장균들을 20g/L의 포도당과 20mg/L의 티아민을 첨가한 R배지에서 배양하였다. 이때, 배양온도는 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red-trc와 XL1-Blue/pJC4Red-trc의 경우 37℃, 재조합 대장균 XL1-Blue/pSYL107Red-trc의 경우는 30℃였으며, 250rpm에서 2일간 배양한 후, 1mM의 IPTG를 첨가하여 세포내 PHA 분해효소를 발현시킨 후 시간에 따른 (R)-3-하이드록시부탄산의 생산을 측정하였다. 배양 후 수득한 건조균체의 농도, PHB 농도, PHB 함유량, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도 및 이량체 농도를 측정하여, 표 2에 나타내었다.
| 플라스미드/배양온도 | 유도발현 후배양시간 | 건조균체의농도(g/L) | PHB의농도(g/L) | PHB의함유량() | 단량체의농도(g/L) | 이량체의농도(g/L) | 최종수율() |
| pJC4Red-trc/37℃ | 2 시간 | 1.4 | 0.16 | 11 | 0.1 | 3.6 | 22 |
| 4 시간 | 1.2 | 0.09 | 8 | 0.5 | 4.3 | 28 | |
| 6 시간 | 1.1 | 0.09 | 8 | 0.5 | 5.0 | 32 | |
| pSYL105Red-trc/37℃ | 2 시간 | 1.2 | 0.04 | 3 | 0.7 | 6.0 | 39 |
| 4 시간 | 1.3 | 0.00 | 0 | 0.7 | 6.1 | 40 | |
| 6 시간 | 1.3 | 0.02 | 2 | 0.7 | 7.1 | 45 | |
| pSYL107Red-trc/30℃ | 2 시간 | 0.7 | 0.12 | 17 | 0.0 | 0.6 | 4 |
| 4 시간 | 0.8 | 0.15 | 19 | 0.1 | 1.2 | 8 | |
| 6 시간 | 0.8 | 0.15 | 19 | 0.3 | 1.5 | 10 |
상기 표 2의 PHB 함유량은 단위 건조균체 무게 당 축적된 PHB의 무게로 정의하고, 최종 수율은 단위 포도당 질량당 생산된 단량체 농도와 단량체 농도로 환산한 이량체 농도의 합으로 정의하였다.
이상에서와 같이 유도발현이 가능한 프로모터를 사용하여 세포내 PHA 분해효소를 발현함으로써, 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산하는 것이 가능하였다. 따라서, 알칼리게네스 레이터스 유래 세포내 PHA 분해효소계도 유도발현 가능한 프로모터로부터 발현하여도, 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시부탄산을 같은 방법으로 얻을 수 있을 것이다.
실시예 5: (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산의 동시 생산
재조합 대장균을 이용하여, (R)-3-하이드록시부탄산 외의 다른 하이드록시카르복실산도 생산할 수 있는지 여부를 확인하고자, 상기에서 작제한 랄스토니아 유트로파 세포내 PHA 분해 유전자를 갖는 4종의 플라스미드, pJC4Red, pSYL107Red, pJC4Red-trc 및 pSYL107Red-trc 각각으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환한 4종의 재조합 대장균들을 10g/L의 포도당, 1g/L의 프로피온산 및 20mg/L의 티아민을 첨가한 R배지에서 배양하였다. 배양온도는 랄스토니아 유트로파 PHA 생합성 유전자계를 가지고 있는 플라스미드 pSYL107Red 또는 pSYL107Red-trc로 형질전환한 재조합 대장균의 경우에는 30℃, 그리고 알칼리게네스 레이터스 PHA 생합성 유전자계를 가지고 있는 플라스미드 pJC4Red 또는 pJC4Red-trc로 형질전환한 재조합 대장균의 경우에는 37℃였으며, 250rpm에서 48시간 배양하였다. 이들 중 trc 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환한 재조합 대장균의 경우에는 48시간 배양하고, 1mM IPTG(β-isopropylthiogalactoside)로 유도발현한 다음, 4시간 동안 배양한 후, 수득한 건조균체의 농도, PHB 농도, PHB 함유량, 생성된 단량체 (R)-3-하이드록시부탄산의 농도 및 (R)-3-하이드록시발레르산의 농도를 측정하여 표 3에 나타내었다.
| 재조합 대장균 | 배양온도/유도발현 후배양시간 | 건조균체의농도(g/L) | (R)-3-하이드록시부탄산의 농도(g/L) | (R)-3-하이드록시발레르산의농도(g/L) |
| XL1-Blue/pJC4Red | 37℃/0시간 | 2.15 | 0.12 | 0.01 |
| XL1-Blue/pSYL107Red | 30℃/0시간 | 1.10 | 0.10 | 0.00 |
| XL1-Blue/pJC4Red-trc | 37℃/4시간 | 0.80 | 1.51 | 0.28 |
| XL1-Blue/pSYL107Red-trc | 37℃/4시간 | 0.95 | 0.17 | 0.03 |
상기 표 3에서 보듯이, 재조합 대장균을 이용하여 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산을 함께 효율적으로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다. 마찬가지로, 재조합 대장균에 의해 합성될 수 있는 다른 종류의 PHA도 분해하게 되면, 다양한 (R)-3-하이드록시카르복실산을 동일한 방법으로 생산할 수 있음은 물론, 다양한 PHA의 단량체(참조: Steinbuchel and Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128:219-228, 1995; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 65:363-368, 1999)들을 배양조건, 균주, PHA 합성계/분해계 등의 조합에 의해 동일한 방법으로 생산할 수 있을 것이다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PHA 생합성 효소계와 세포내 PHA 분해효소를 발현시키는 재조합 플라스미드를 대장균에 도입함으로써 (R)-3-하이드록시부탄산을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, PHA 생합성 관여효소계와 세포내 PHA 분해 관련 효소계를 함께 도입한 재조합 대장균을 이용하여, 단순한 배양 또는 배양 후의 유도발현에 의해 (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산 등의 3-하이드록시카르복실산들이 바로 배지 내로 분비되며, 이에 따라 배양공정과 분리 및 정제공정만으로 전체공정을 크게 간소화할 수 있다. 아울러, 연속공정이 가능하며, 세포고정화 기술을 사용할 경우 폐기처분할 세포물질이 없거나 크게 감소되며 이를 통한 전체 수율의 증가도 기대할 수 있다. 또한, (R)-3-하이드록시부탄산과 (R)-3-하이드록시발레르산 이외의 다른 단량체 단위를 가지는 PHA를 합성할 수 있는 미생물의 PHA 생합성 효소계 유전자와 세포내 PHA 분해 관여 효소 유전자를 클로닝하여, 전기 재조합 대장균 시스템에 적용시킴으로써 다양한 3-하이드록시카르복실산의 생산에도 일반적으로 매우 폭넓게 응용할 수 있을 것이다.
Claims (12)
- 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoate, PHA) 생합성효소 유전자와 PHA 분해효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제 1항에 있어서,폴리하이드록시알칸산 생합성효소 유전자는 알칼리게네스레이터스(Alcaligenes latus) 또는 랄스토니아 유트로파(Ralstoniaeutropha)로부터 유래한 것을 특징으로 하는재조합 플라스미드.
- 제 1항에 있어서,폴리하이드록시알칸산 분해효소 유전자는 랄스토니아유트로파(Ralstonia eutropha)로부터 유래된 것을 특징으로 하는재조합 플라스미드.
- 제 1항에 있어서,폴리하이드록시알칸산 분해효소 유전자의 발현 프로모터는 랄스토니아유트로파(Ralstonia eutropha) 고유의 발현 프로모터, trc, T7, trp.tac 및 bad 유도발현 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는것을 특징으로 하는재조합 플라스미드.
- 제 1항에 있어서,pJC4Red, pSYL105Red, pSYL107Red, pJC4Red-trc, pSYL105Red-trc 및pSYL107Red-trc로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는재조합 플라스미드.
- 재조합 플라스미드 pJC4Red로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pJC4Red(Escherichia coliXL1-Blue/pJC4Red)(KCTC 0677BP).
- 재조합 플라스미드 pSYL105Red로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red)(KCTC 0676BP).
- 재조합 플라스미드 pSYL105Red-trc로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pSYL105Red-trc(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red-trc)(KCTC 0678BP).
- 제 1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하여 균체 내에서 폴리하이드록시알칸산의 합성과 분해가 동시에 이루어지게 하고, 이로부터 (R)-3-하이드록시카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는, 광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제 9항에 있어서,재조합 플라스미드는 pJC4Red, pSYL105Red, pSYL107Red, pJC4Red-trc,pSYL105Red-trc 및 pSYL107Red-trc로 구성된 그룹으로부터 선택되는것을 특징으로 하는광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제 9항에 있어서,형질전환된 대장균은 XL1-Blue/pJC4Red(Escherichia coliXL1-Blue/pJC4Red, KCTC 0677BP), XL1-Blue/pSYL105Red(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red, KCTC 0676BP) 또는 XL1-Blue/pSYL105Red-trc(Escherichia coliXL1-Blue/pSYL105Red-trc, KCTC 0678BP)인것을 특징으로 하는광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제 9항에 있어서,(R)-3-하이드록시카르복실산은 (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드록시발레르산, (R)-3-하이드록시부탄산의 이량체, (R)-3-하이드록시발레르산의 이량체, (R)-3-하이드록시부탄산, (R)-3-하이드록시발레르산의 에스터 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는광학적으로 순수한 (R)-3-하이드록시카르복실산의 제조방법.
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