KR101114918B1 - 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 - Google Patents
재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101114918B1 KR101114918B1 KR1020070080109A KR20070080109A KR101114918B1 KR 101114918 B1 KR101114918 B1 KR 101114918B1 KR 1020070080109 A KR1020070080109 A KR 1020070080109A KR 20070080109 A KR20070080109 A KR 20070080109A KR 101114918 B1 KR101114918 B1 KR 101114918B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene encoding
- hydroxybutanoic acid
- recombinant
- coa hydrolase
- hydroxybutyryl
- Prior art date
Links
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N (S)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 46
- -1 (S) -3-hydroxybutyrate ester Chemical class 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 98
- QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N (S)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-VKBDFPRVSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 44
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010035473 Palmitoyl-CoA Hydrolase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000008172 Palmitoyl-CoA Hydrolase Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 18
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- AFENDNXGAFYKQO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybutyric acid Chemical compound CCC(O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 5
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 4
- 229920001791 ((R)-3-Hydroxybutanoyl)(n-2) Polymers 0.000 abstract description 2
- 108010001058 Acyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000002735 Acyl-CoA Dehydrogenase Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108010077268 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase Proteins 0.000 description 5
- 102100034767 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- 101100180552 Arabidopsis thaliana KAN2 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N (R)-3-hydroxybutanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@H](O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QHHKKMYHDBRONY-WZZMXTMRSA-N 0.000 description 3
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 2
- OMSUIQOIVADKIM-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](C)O OMSUIQOIVADKIM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OHEFFKYYKJVVOX-QMMMGPOBSA-N (2s)-6-methylhept-5-en-2-ol Chemical compound C[C@H](O)CCC=C(C)C OHEFFKYYKJVVOX-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N (S)-butane-1,3-diol Chemical compound C[C@H](O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N Butylate Chemical group CCSC(=O)N(CC(C)C)CC(C)C BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700024126 Butyrate kinases Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000926206 Homo sapiens Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090001084 Propionate kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100034060 Putative glutathione hydrolase 3 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000769 gas chromatography-flame ionisation detection Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- LDLDJEAVRNAEBW-BYPYZUCNSA-N methyl (3s)-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)C[C@H](C)O LDLDJEAVRNAEBW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- BFJBMDGQVHIMIV-VKHMYHEASA-N phosphono (3S)-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@H](O)CC(=O)OP(O)(O)=O BFJBMDGQVHIMIV-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- OHEFFKYYKJVVOX-UHFFFAOYSA-N sulcatol Natural products CC(O)CCC=C(C)C OHEFFKYYKJVVOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 합성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법 및 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 를 생산할 수 있으며, 리파아제를 이용하여 본 발명에 따른 방법으로 생산된 (S)-3-하이드록시부탄산으로부터 간단하게 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 락톤(lactone)을 생산할 수 있다.
(S)-3-하이드록시부탄산, (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르, β-케토티올라아제, 3-하이드록시이소부틸 CoA 하이드로라아제, (S)-3-하이드록시부틸 CoA 디하이드로게나아제
Description
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 합성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법 및 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
(S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르는 플라스 틱 재료, 방향제, 의약품, 농약 등 활용범위가 매우 넓은 chiral intermediate로 그 효용성이 매우 크다 (Speciality Chemicals Magazine, April:39, 2004). 예를 들면, 에틸 (S)-3-하이드록시부티레이트를 환원하여 다양한 항생제와 페로몬(Pheromone) 등을 만드는 중간체 물질인 (S)-1,3-부탄다이올(Butanediol)을 합성할 수 있으며(T. Ferreira et al ., Tetrahedron, 46:6311, 1990), 제초제인 (S)-설카톨(Sulcatol)의 전구체로도 이용되며(K. mori et al., Tetrahedron, 37:1341, 1981), b-lactam 계열의 항생제인 카바페넴(Carbapeneme)의 전구체로도 이용되고 (T. Chiba et al., Chemistry letters, 16:2187, 1987), 유사 비타민(vitamin-like nutrient)인 L-카르니틴의 전구체로도 이용된다 (B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105:5925, 1983).
기존의 에스테르의 제조방법으로는 프로키랄 전구체(prochiral precursor)인 3-케토에스테르(3-ketoester)를 이용하여 촉매 diphosphine-ruthenium로 asymmetric reductive hydrogenation하는 방법이 있으나 (R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109:5856, 1987), 사용하는 금속 촉매가 매우 비싸고 순수한 기질이 필요하며, hydrogenation반응은 매우 고압의 반응기를 필요로 한다는 단점이 있다. 또한, 효모를 Whole-cell 촉매로 사용하여 b-케토에스테르를 biocatalytic reduction하여 수율 58%, 광학순도 94%ee의 에틸 (S)-3- 하이드록시부티레이트를 생산하는 방법은, 미생물 내에 존재하는 다양한 옥시도리덕타아제(oxidoreductase)에 의해 광학 활성이 낮아지는 단점이 있다 (Tetrahedron Letters, 34:3949, 1993).
미생물의 대사경로를 조작하여 포도당으로부터 생합성된 광학활성 (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 보고는 알려져 있다 (Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65:363, 1999; Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69:1295, 2003; Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002). (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 경로는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫째, 생분해성 고분자인 폴리하이드록시알칸산의 자가분해를 이용한 것 (Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65:363, 1999; Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69:1295, 2003), 둘째, 생분해성 고분자의 자가분해가 아닌 포도당으로부터 우선 (R)-3-하이드록시알카노일 CoA를 생산하고 생산된 (R)-3-하이드록시알카노일 CoA로부터 CoA를 제거한 후 (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 것이다 (Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002). 두 번째 방법의 경우, 포도당으로부터 β-케토티올라아제(PhaA)와, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 리덕테이즈(PhaB)를 이용하여 우선 (R)-3-하이드록시부티릴 CoA를 생산하며, 생산된 (R)-3-하이드록시부티릴 CoA로부터 CoA를 제거하는 것은 포스포트랜스부틸라아제(ptb)와 부티릴 카이네이즈 (BuK)를 이용한다 (Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002).
광학 활성 (S)-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 화학적 경로(chemical route), 생촉매 경로(biocatalytic route)들이 알려져 있지만, 미생물의 대사 경로를 조작하여 포도당(glucose)으로부터 생합성된 광학 활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생산하는 보고는 아직까지 없었다.
이에, 본 발명자들은 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생합성하기 위하여 예의 노력한 결과, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르가 생합성되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조용 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터와 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자가 크로모좀에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 포스포트랜스부틸라아제를 코딩하는 유전자(ptb) 및 부티레이트카이네이즈를 코딩하는 유전자(Buk)로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물의 배양액 또는 균주추출액을 아세틸-CoA, 아세토아세틸 CoA 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 구성된 군에서 선택되는 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 에스테르 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 ((S)-3-하이드록시부탄산 에스테르의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 생합성 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 (S)-3-하이드록시부탄산은 화학식 1에 나타난 바와 같이, (R) -3-하이드록시부탄산과는 다른 키랄도를 가지는 광학활성 화합물이다.
본 발명에 따른 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물은 도 1에 나타낸 생합성 경로를 거쳐 (S)-3-하이드록시부탄산을 생산한다.
먼저, 포도당으로부터 해당과정을 통해 아세틸 CoA가 생성되면, β-케토티올라아제에 의해 아세토아세틸 CoA로 전환되고, 상기 아세토아세틸 CoA는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제에 의해, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 전환되며, 최종적으로, 아실 CoA 하이드로라아제에 의하여 (S)-3-하이드록시부탄산으로 전환되게된다.
본 발명에 따른, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부 티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물은 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 도 1의 (S)-3-하이드록시부탄산 생합성경로를 거쳐 생산된 (S)-3-하이드록시부탄산이 리파아제에 의해 에스테르화 되면서, (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생성하게된다.
또, 다른 (S)-3-하이드록시부탄산의 생합성 경로로, 포도당으로부터 해당과정을 통해 아세틸 CoA가 생성되면, β-케토티올라아제에 의해 아세토아세틸 CoA로 전환되고, 상기 아세토아세틸 CoA는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제에 의해, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 전환되며, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA는 포스포트랜스부틸레이즈(Ptb) 또는 포스포트랜스아세틸레이즈(Pta)에 의하여, (S)-3-하이드록시부티릴 포스페이트로 전환되고, 상기 S)-3-하이드록시부티릴 포스페이트는 부틸레이트 카이네이즈(Buk) 또는 프로피오네이트 카이네이즈(Puk)에 의하여 최종적으로 (S)-3-하이드록시부탄산으로 전환되게 된다 (도 3).
본 발명에 따른 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 포스포트랜스부틸라아제를 코딩하는 유전자(ptb) 및 부티레이트카이네이즈를 코딩하는 유전자(Buk)로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물은 상기 도 3에 나타낸 경로를 통하여 (S)-3-하이드록시부탄산을 생산하게 된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: β-
케토티올라아제
및 (S)-3-
하이드록시부티릴
CoA
디하이드로게나아제를
코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터(
pTacReA
-
HBD
)의 제작
먼저 Ralstonia eutropha H16균주(ATCC 17699)를 LB 액체배지 3ml에 18시간 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 수득하고, 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사, USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.
상기 분리된 염색체를 다음으로 ReAf-EcoRI 프라이머(서열번호 5) 및 ReAb1259 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 상기 분리된 염색체를 주형으로 하여 Ralstonia eutropha균주의 β-ketothiolase 유전자(서열번호 1)를 증폭하였다. PCR반응 혼합물 100μl는 dNTP 250μM, primer각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형 100ng, pfu polymeras 5 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 중합과정을 25회 반복하였다.
ReAf-EcoRI :5'-ggaattc ATGACTGACGTTGTCATCGTATCC-3'(서열번호 5)
ReAb1259: 5'-gtc cac tcc ttg att ggc ttc g-3'(서열번호 6)
또 동일한 조건으로 Cahbdf 프라이머 (서열번호 7), Cahbdb-XbaI 프라이머 (서열번호 8)를 이용하여 Clostridium acetobutylicum 균주(ATCC 824)의 (S)-3-hydroxybutyrate dehydrogenase 유전자(서열번호 2)를 증폭하였다.
Cahbdf: 5'- GAA GCC AAT CAA GGA GTG GAC ATGAAAAAGGTATGTGTTATAGG-3' (서열번호 7)
Cahbdb-XbaI: 5'- gc tctaga tta ttt tga ata atc gta gaa acc -3' (서열번호 8)
증폭된 유전자를 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 이들 두 유전자를 PCR 반응을 이용하여 퓨전시켰다. 먼저, 각각 1pmol 농도로 두 유전자를 혼합하여 PCR을 위한 주형으로 이용하였으며, 다른 조건은 상기와 모두 동일하고 중합과정을 2.5분으로 하여 증폭을 수행하였다. 증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 EcoRI, XbaI 제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pTac99A 벡터(Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003)에 라이게이션 하여 pTacReA-HBD를 제작하였다 (도 4).
실시예
2: (S)-3-
하이드록시부티릴
CoA
하이드로라아제를
코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터(
pET21aBCH
,
pET28bBCH
및
pK28BCH
)의 제작
먼저 Bacillus cereus(ATCC 14579)균주를 LB액체배지에서 18시간 배양 후 실시예 1과 동일한 방법으로 염색체를 분리하였다. 분리한 염색체를 주형으로 하고 ACH_NdeI 프라이머(서열번호 9) 및 ACH_BamHI 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 역시 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 이용하여 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase(BCH) 유전자(서열번호 4)를 증폭하였다.
ACH_NdeI 5'- CGC CAT ATG ACT GAA CAA GTT TTA TTT -3'(서열번호 9)
ACH_BamHI 5'- ATA GGA TCC TTA TGC ATT AAG TAA GTT AAA G -3'(서열번호 10)
증폭한 유전자를 실시예 2와 동일한 조건으로 정체하고 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 절단 후, 동일한 제한효소로 절단한 pET21a(Novagen, USA), peET28B(Novagen, USA) 및 pK28에 각각 라이게이션하여 pET21aBCH, pET28bBCH 및 pK28BCH를 제작하였다 (도 5).
상기 pK21 벡터는 PET21a 벡터를 제한효소 BglII 및 XbaI 제한효소로 절단한 후 EZ::TN<KAN2> 트랜스포존(Epicenter, USA; Cat#: MOD 1503)의 프로모터 의심부위를 KAN2 P-bgl I I 프라이머(서열번호 11) 및 KAN2-P-XbaI 프라이머(서열번호 12)를 이용하여 PCR로 증폭한 후, 동일한 제한효소로 절단 후 라이게이션하여 자체 제작하였다. 증폭한 DNA 서열은 서열번호 13에 나타내었다.
KAN2 P-bgl I I: TATA AGA TCT CAA CCA TCA TCG ATG AAT TGT (서열번호 11)
KAN2-P-XbaI: TAT TCT AGA AAC ACC CCT TGT ATT ACT GTT(서열번호 12)
EZ::TN<KAN2> 트랜스포존: 5'-TACACATCTCAACCATCATCGATGAATTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTT-3'(서열번호 13)
실시예
3: (S)-3-
하이드록시부티릴
CoA
디하이드로게나아제를
코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터(
pET21aHBD
및
pK21HBD
)의 제작
먼저 실시예 1에서 분리한 Clostridium acetobutylicum(ATCC 824) 염색체를 주형으로 hbd_NdeI 프라이머(서열번호 14) 및 hbd_BamHI 프라이머(서열번호 15)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 (S)-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase 유전자(서열번호 2)를 증폭하였다.
hbd_NdeI: 5'- ATA CAT ATG AAA AAG GTA TGT GTT ATA GGT GCA GGT-3'서열번호 14)
hbd_BamHI 5'- ATA GGA TTC TTA TTT TGA ATA ATC GTA GAA ACC TTT-3'서열번호 15)
증폭된 유전자는 NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단 후 동일한 제한효소로 절단한 pET21a 벡터와 pK21 벡터와 라이게이션하여 pET21aHBD 및 pK21HBD를 제작하였다 (도 6).
실시예 4: (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 (HBD ) 유전자의 활성확 인
실시예 3에서 제작한 pET21aHBD를 electroporation을 이용해 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환하고 LB ampicillin 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니를 ampicillin 100μg/ml을 함유하는 LB 액체배지 3ml에 접종하고 진탕 배양기(제이오텍, 한국)에서 200rpm, 37℃, OD600 값이 0.5가 될 때가지 배양한 다음, IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도시킨 후, 밤새 배양하였다. 그 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 후 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 다음, 원심분리 하여 cell free extract를 확보하였다. 이렇게 확보한 cell free extract를 효소 활성 확인 시료로 이용하였다.
시료의 (S)-3-hydroxybytyryl CoA dehydrogenase 활성은 1mM acetoacetyl CoA, 3mM NADH 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응 액을 5분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 생성된 (S)-3-hydroxybutyryl CoA를 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다.
HPLC 조건은 이동상으로 물과 아세토니트릴을 97:3 비율로 5분 흘리다가 아세토니트릴 비율을 15% 까지 25분 동안 증가시키면서 분석하였다. 용매의 유속은 1ml/min이었고 C18 Capcel PAK 칼럼(Shisheido, Japan)을 이용하였으며, 생성되는 (S)-3-hydroxybutyryl CoA 는 210nm에서 검출하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 (S)-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
| HBD | Control | |
| 전환율 | 75% | 0% |
실시예
5: (S)-3-
하이드록시부티릴
CoA
하이드로라아제
(
BCH
) 유전자의 활성확인
실시예 2에서 제작한 pET21aBCH를 실시예 4와 동일한 방법으로 대장균에 형질전환시킨 후 배양하여, cell free extract를 확보하고, 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 활성 확인에 이용하였다.
3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 활성은 1mM (S)-3-hydroxybutyryl CoA 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응액을 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 생성된 3-하이드록시부탄산을 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다. HPLC는 실시예 4와 동일한 조건에서 수행하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
| BCH | Control | |
| 전환율 | 73.5% | 28% |
실시예
6:
β-
ketothiolase
,
HBD
및
BCH
유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 미생물의 cell
extract
를 이용한 (S)-3-
하이드록시부탄산의
제조
실시예 1 내지 실시예 3에서 제작한 pTacReA-HBD, pET21aBCH 및 pK28BCH를 electroporation을 이용해 동시에 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시키고 실시예 4와 동일한 방법으로 cell free extract를 수득하여, 효소 활성 확인에 이용하였다.
(S)-3-하이드록시부탄산의 생성은 1mM acetyl CoA, 3mM NADH, 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응액을 30분 동안 37℃ 에서 반응시킨 용액을 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다.
분석은 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하여 가수분해 되어 생성된 CoA를 검출하여 측정하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, pTacReA-HBD, pET21aBCH 및 pK28BCH로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 β-ketothiolase, 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 및 (S)-3-hydroxybytyryl CoA dehydrogenase 를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
| 재조합 대장균 | Control | |
| 전환율 | 7.84% | 0.01% |
실시예
7:
β-
ketothiolase
,
HBD
,
BCH
유전자를 함유하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 (S)-3-
하이드록시부탄산의
제조(
In
-
vivo
)
실시예 1 및 실시예 2에서 제작한 pTacReA-HBD 및 pET28bBCH를 electroporation을 이용해 대장균 BL21(DE3)에 동시에 형질전환시키고, ampicillin 100μg/ml 과 kanamycin 50μg/ml을 함유하는 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니 2개를 100μg/ml을 함유하는 LB액체 배지 3ml이 포함된 15ml 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서, 200rpm으로 밤새 진탕배양하여 종균을 배양하였다. 이렇게 배양된 종균을 다시 50ml 2% glucose및 ampicillin 100μg/ml를 포함하는 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서, 200rpm으로 진탕배양하여, OD600이 0.5가 되었을 때, IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후, 밤새 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 수득하고, HPLC 분석을 통해 생성된 3-하이드록시부탄산을 정량분석하였다. HPLC 조건은 이동상으로 0.01N 황산을 함유한 물을 이용하였으며 유속은 0.6ml/min이었다. 칼럼은 Aminex87H(Bio-rad,USA)을 이용하였으며, 생성되는 3-하이드록시부탄산은 RI(Reflactive Index) detector를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
| (S)-3-HB (g/L) After induction |
Acetate (g/L) final |
Glucose consumed(g/L) | ||||
| DCW | 0h | 5h | 24hr | |||
| 시료1 | 0.74g/L | 0 | 0.190 | 0.348 | 2.12 | 8.36 |
| 시료2 | 1.6g/L | 0 | 0.193 | 0.370 | 2.01 | 9.10 |
또한 보다 정확한 정성분석 및 정량분석을 위하여, 생성된 3-하이드록시부탄산을 함유한 배양액을 동결건조한 후, 생성물을 메틸화시키고, methyl (S)-3-hydroxybutyrate의 GC-MSD(질량분석) 및 키랄도(Chirality) 분석을 수행하였다. 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며, 분석 조건은 표 4에 나타내었다. 질량분석도 수행하였으며, 그 결과에서도 생성된 산물이 3-하이드록시부탄산임을 확인할 수 있었으며, 상기 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다. 키랄도 분석결과, 광학순도 99.9%ee 이상의 (S)-3-하이드록시부탄산이 생산되었음을 확인하였고, Enantiomeric excess(ee)값은 아래의 수식 (1)로부터 결정하였다.
ee
S
=(
C
S
-
C
R
)/(
C
S
+
C
R
) x 100 (1)
| GC-MSD 정성분석 | Oven temperature : 50℃/5min - 10℃/min - 320℃/10min |
| Injector temperature : 320℃ | |
| Detector temperature : 320℃ | |
| Injector Split ratio : 20/1 | |
| GC-FID 정량분석(chriality) | Injector 160oC, 3mL/min He, 20:1 s/s ratio |
| Oven 80℃/15min | |
| Detector make up flow : 30mL/min Air flow : 300mL/min H2 flow : 30mL/min Temperature : 160 ℃ |
|
| Column G-TA (30m x 0.25mm) |
실시예
8:
pET21aBCH
-
ReA
-
HBD
,
pET21aBCH
-
ReA
-
ReHBD
벡터의 제작
실시예 1과 동일한 방법으로 R. eutropha 유래의 HBD(ReHBD) 유전자(서열번호 3)를 ReHBD-RBS-UP 프라이머 및 ReHBD-DN-XhoI 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
ReHBD-RBS-UP: 5'-GAAGCCAATCAAGGAGTGGACATGAGCATCAGGACAGTGGG-3' (서열번호 16)
ReHBD-DN-XhoI: 5'-ATACTCGAGTTACTTGCTATAGACGTACACGC CGCGGCC-3' (서열번호 17)
실시예 1과 동일한 조건으로 ReAf-EcoRI 프라이머(서열번호 5)와 ReHBD-DN-XhoI 프라이머(서열번호 17)를 이용하여 ReA 유전자와 ReHBD유전자를 fusion 하여 ReAReHBD 유전자를 완성하였다. 또 실시예 1에서 제작한 pTacReA-HBD 벡터를 주형으로 상기 ReAf-EcoRI 프라이머와 상기 ReHBD-DN-XhoI 프라이머를 이용하여 ReA-HBD유전자를 증폭하였다. 상기 fusion하여 증폭된 두 유전자를 EcoRI 과 XhoI 제한효소 처리하고 실시예 2에서 제작한 pET21aBCH 또한 동일한 제한효소로 절단한 후 정제하여 라이게이션하여 pET21aBCH-ReA-HBD 및 pET21aBCH-ReA-ReHBD를 완성하였다.
HBD-DN-XhoI: 5'-ATACTCGAGTTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTCCTG-3'(서열번호 18)
실시예
9 :
pET21aBCH
-
ReA
-
HBD
,
pET21aBCH
-
ReA
-
ReHBD
벡터로 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-3-
하이드록시부탄산의
제조
실시예 8에서 제작한 pET21aBCH-ReA-HBD 및 pET21a-BCH-ReA-ReHBD를 electroporation을 이용해 대장균 Codon Plus(DE3)에 각각 형질전환시키고, LB/ ampicillin 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니 2개를 LB/ampicillin 배지 3ml이 포함된 15ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서, 200rpm으로 진탕배양하여 밤샘 배양하였다. 배양된 종균을 다시 100ml 2% glucose를 포함하는 MR 액체배지에 접종하고 37℃에서, 200rpm으로 10시간 진탕 배양하여 1.5L 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. 배양 시작후 OD가 120이 되었을 때 IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후 2 시간 마다 생성되는 (S)-3-Hydroxybutyric acid를 실시예 7과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 약 10g/L의 (S)-3-HB가 생성되었다 (도 10 및 표 6).
| 반응시간(h) | HBD (g/L) | ReHBD (g/L) | |||||||
| 배양 | 발현유도 | DCW | Glu | S3HB | AA | DCW | Glu | S3HB | AA |
| 0.0 | -0.7 | 20.1 | 0.2 | -0.3 | 21.1 | 0.2 | |||
| 8.0 | 4.5 | 17.0 | 0.0 | 3.6 | 18.9 | 0.0 | |||
| 10.0 | 6.0 | 10.5 | 0.1 | 5.1 | 14.1 | 0.1 | |||
| 12.0 | 16.7 | 5.6 | 0.2 | 12.8 | 11.9 | 0.2 | |||
| 15.0 | 31.2 | 9.1 | 0.3 | 34.7 | 7.9 | 0.3 | |||
| 16.0 | 0.0 | 44.2 | 5.0 | 0.2 | 46.2 | 5.7 | 0.3 | ||
| 18.0 | 2.0 | 51.1 | 6.2 | 0.8 | 0.6 | 53.5 | 7.3 | 1.2 | 0.6 |
| 20.0 | 4.0 | 59.7 | 2.5 | 2.4 | 0.8 | 62.2 | 5.6 | 2.8 | 0.7 |
| 22.0 | 6.0 | 64.8 | 5.3 | 4.0 | 0.8 | 64.7 | 2.0 | 4.1 | 0.7 |
| 24.0 | 8.0 | 66.3 | 5.0 | 5.6 | 1.0 | 62.3 | 7.3 | 4.2 | 2.0 |
| 26.0 | 10.0 | 68.5 | 3.6 | 6.7 | 1.4 | 68.3 | 7.8 | 6.2 | 2.4 |
| 28.0 | 12.0 | 67.5 | 7.0 | 7.5 | 1.2 | 66.9 | 4.0 | 8.0 | 2.2 |
| 30.0 | 14.0 | 71.3 | 5.6 | 8.1 | 1.2 | 65.4 | 3.3 | 9.5 | 1.9 |
| 32.0 | 16.0 | 71.6 | 3.6 | 8.9 | 1.5 | 68.1 | 2.8 | 10.6 | 1.4 |
| 34.0 | 18.0 | 72.5 | 3.6 | 9.3 | 2.0 | 64.7 | 4.3 | 10.6 | 1.3 |
| 36.0 | 20.0 | 68.4 | 2.7 | 9.7 | 2.7 | 70.6 | 4.8 | 10.3 | 1.1 |
| 38.0 | 22.0 | 68.2 | 2.3 | 10.3 | 3.4 | 65.8 | 4.6 | 10.4 | 1.4 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
도 1은 (S)-3-HB 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 (S)-3-HB esters를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 (S)-3-HB 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 pTacReA-hbd 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pET21aBCH 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pK28BCH, pET28bBCH 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 pET21aHBD, pK21HBD 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 생산된 ((S)-3-HB를 메틸화시켜 분석한 GC-MSD분석 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 생산된 (S)-3-HB를 메틸화시켜 키랄도(Chriality)를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 유가식 배양을 통한 (S)-3-HB 를 생산할 때의 시간 profile을 결과를 나타낸 것이다.
<110> LG Chem, LTD
<120> Preparing Method for (S)-3-hydroxybutyric acid and
(S)-3-hydroxybutyrate ester Using Recombinant Microorganism
<130> P06-B248
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> Ralstonia eutropha
<400> 1
atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60
ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120
gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180
tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240
gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300
gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360
gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420
gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480
gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540
ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600
ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660
cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720
acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780
tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840
aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900
ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt 960
gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg 1020
aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg 1080
acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc 1140
ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa 1182
<210> 2
<211> 849
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 2
atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt 60
gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga 120
ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct 180
actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240
tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct 300
gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca 360
ataacagaag tggcatcagc aactaaaact aatgataagg ttataggtat gcatttcttt 420
aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa 480
acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540
gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt 600
atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct 660
aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct 720
ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt 780
aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat 840
tcaaaataa 849
<210> 3
<211> 1095
<212> DNA
<213> Ralstonia eutropha
<400> 3
atgagcatca ggacagtggg catcgtcggt gccggcacca tgggcaatgg catcgcccag 60
gcctgcgcag tggtaggtct caacgtggtg atggtcgaca tcagcgatgc cgccgtgcag 120
aagggtgtcg ccaccgtggc aagcagcctg gaccgtctga tcaagaagga aaagctgacc 180
gaggccgaca aggccagcgc gctggcgcgc atcaagggca gcacctcgta tgacgatctc 240
aaggccaccg atatcgtgat cgaggccgcc accgagaact acgacctgaa ggtcaagatc 300
ctcaagcaga tcgacggcat cgtcggcgag aacgtgatca tcgcgtccaa cacctcgtcg 360
atctcgatca ccaagctggc tgccgtgacc tcgcgcgccg gcagccgctc ttgcactagt 420
agcgcaggtt gtggagcagc tagagctagt ggttcgaccg acggcactgg agcgcgcggc 480
accgctttat cggcatgcac ttcttcaacc cggtgccggt gatggcgctg gtggaactga 540
tccgcggcct gcagaccagc gacaccaccc acgccgccgt cgaggccctg tcgaagcagc 600
tcggcaaata cccgatcacg gtcaagaaca gcccgggctt ctgtggtggg tgcggcggca 660
gctccgggac agcttcgtcg agccgtttat gggctagtgc cagttcttgt cgggcccgaa 720
cgtcgtcaac cgcatcctgt gcccgatgat caacgaggcc ttctgcgtgc tgggcgaagg 780
cctggcctcg ccggaagaga gcagcagttg gcgtaggaca cgggctacta gttgctccgg 840
aagacgcacg acccgcttcc ggaccggagc ggccttctct tcgacgaagg catgaagctg 900
ggctgcaacc acccgatcgg gccgctggcg ctggctgaca tgatcggcct ggacaccatg 960
ctggccgtga tggaagtgct gtacacggag tttgccgatc cgaagtaccg cccggcgatg 1020
ctgatgcgcg agatggtcgc tgccggctac ctgggccgca agactggccg cggcgtgtac 1080
gtctatagca agtaa 1095
<210> 4
<211> 1056
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 4
atgactgaac aagttttatt ttctgttagt gaaaatggcg ttgcgacaat tactttaaac 60
cgtccaaaag cacttaattc tttatcttat gacatgttac aacctatcgg acaaaaactt 120
aaagagtggg aacacgatga gcgtattgca cttatcgtgt taaaaggagc tggcacaaaa 180
ggtttttgtg caggtggcga cattaaaact ctttatgaag cgcgttccaa tgaagtggca 240
ttgcaacatg cagaacgttt ttttgaagaa gagtatgaaa ttgatacata tatttatcaa 300
tatacaaaac cgattattgc ttgtttagat ggaattgtaa tgggcggtgg tgtcggtctt 360
acaaatggtg cgaagtatcg cattgtaact gagcgtacga aatgggcaat gccagagatg 420
aatatcggct tcttcccaga cgtcggagct gcatatttct taaataaagc gcctggatat 480
acaggacgat tcgttgcttt aacagcatct attttaaaag cttctgacgt attatttatt 540
aatgctgcag attactttat gacatctgat tcattaccag agtttcttac tgaacttgaa 600
agtgtaaatt ggcataaaga agatgatgta catactaatt taaaagaagt tattcgtaca 660
tttgcaactg ctccaaactt agaaagcgag ctcgctcctt cattagaagt aatcaattca 720
cattttgctt tcgatacaat tgaagaaatc atccattcat tggagaaaga tgaaagttcc 780
tttgctctaa aaacgaaaga aatactgtta tcaaaatccc ctatttcact aaaagtaaca 840
ttaaaacagt ttattgatgg acaagataaa tccgttgaag aatgtttcgc tacggacctt 900
atacttgcta aaaacttcat gagacatgaa gatttcttcg aaggagtacg ctccgttgtc 960
gttgataaag atcaaaatcc gaattataaa tataaacagt taagtgacgt ttcagaagaa 1020
gatgtgaatc gtttctttaa cttacttaat gcataa 1056
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ggaattcatg actgacgttg tcatcgtatc c 31
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gtccactcct tgattggctt cg 22
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gaagccaatc aaggagtgga catgaaaaag gtatgtgtta tagg 44
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gctctagatt attttgaata atcgtagaaa cc 32
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
cgccatatga ctgaacaagt tttattt 27
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ataggatcct tatgcattaa gtaagttaaa g 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
tataagatct caaccatcat cgatgaattg t 31
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
tattctagaa acaccccttg tattactgtt 30
<210> 13
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EZ::TN<KAN2>
<400> 13
tacacatctc aaccatcatc gatgaattgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca 60
agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag 120
gggtgtt 127
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
atacatatga aaaaggtatg tgttataggt gcaggt 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ataggattct tattttgaat aatcgtagaa accttt 36
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
gaagccaatc aaggagtgga catgagcatc aggacagtgg g 41
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
atactcgagt tacttgctat agacgtacac gccgcggcc 39
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
atactcgagt tattttgaat aatcgtagaa accttttcct g 41
Claims (23)
- β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제4항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제7항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것를 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제10항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제11항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자 및 (S)-3-하이드록 시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터와 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제13항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제14항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자가 크로모좀에 삽입되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제16항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 제17항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
- 삭제
- 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 미생물의 배양액 또는 균주추출액을 아세틸-CoA, 아세토아세틸 CoA 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 구성된 군에서 선택되는 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 에스테르 제조용 재조합 미생물.
- 제22항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 ((S)-3-하이드록시부탄산 에스테르의 제조방법.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070080109A KR101114918B1 (ko) | 2007-08-09 | 2007-08-09 | 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 |
| PCT/KR2008/003217 WO2009020279A1 (en) | 2007-08-09 | 2008-06-10 | Preparing method for (s)-3-hydroxybutyric acid and (s)-3-hydroxybutyrate ester using recombinant microorganism |
| EP08766179.9A EP2176415B1 (en) | 2007-08-09 | 2008-06-10 | Preparing method for (s)-3-hydroxybutyric acid and (s)-3-hydroxybutyrate ester using recombinant microorganism |
| US12/733,026 US8535918B2 (en) | 2007-08-09 | 2008-06-10 | Preparing method for (S)-3hydroxybutyric acid and (S)-3 hydroxybutyrate ester using recombinant microorganism |
| CN2008801020522A CN101802200B (zh) | 2007-08-09 | 2008-06-10 | 使用重组微生物制备(s)-3-羟丁酸和(s)-3-羟丁酸酯的方法 |
| JP2010519852A JP2010535497A (ja) | 2007-08-09 | 2008-06-10 | 組み換え微生物を利用した（ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070080109A KR101114918B1 (ko) | 2007-08-09 | 2007-08-09 | 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090015626A KR20090015626A (ko) | 2009-02-12 |
| KR101114918B1 true KR101114918B1 (ko) | 2012-02-15 |
Family
ID=40341482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020070080109A KR101114918B1 (ko) | 2007-08-09 | 2007-08-09 | 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8535918B2 (ko) |
| EP (1) | EP2176415B1 (ko) |
| JP (1) | JP2010535497A (ko) |
| KR (1) | KR101114918B1 (ko) |
| CN (1) | CN101802200B (ko) |
| WO (1) | WO2009020279A1 (ko) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101774400B1 (ko) | 2009-04-30 | 2017-09-04 | 게노마티카 인코포레이티드 | 1,3-부탄다이올 생산 유기체 |
| US8632664B2 (en) * | 2009-10-27 | 2014-01-21 | Lifescan Scotland Limited | Test meter for use with a dual chamber, multi-analyte test strip with opposing electrodes |
| WO2011071682A1 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for converting synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol to 1,3-butanediol |
| CN107709542B (zh) * | 2015-07-29 | 2021-08-17 | 赢创运营有限公司 | 3-羟基丁酸的生产 |
| CA3151146C (en) * | 2015-10-13 | 2024-03-19 | Lanzatech Nz, Inc. | Genetically engineered bacterium comprising energy-generating fermentation pathway |
| US20180303821A1 (en) * | 2017-04-24 | 2018-10-25 | BraneQuest, Inc. | Membrane active molecules |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010104925A (ko) * | 2000-05-16 | 2001-11-28 | 윤덕용 | 폴리하이드록시알칸산 생합성 효소와 세포내폴리하이드록시알칸산 분해효소를 발현시키는 재조합미생물 및 그를 이용한 (ｒ)-3-하이드록시카르복실산의제조방법 |
| US6692945B2 (en) | 2001-01-05 | 2004-02-17 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of polyhydroxyoctanoate by streptomyces lividans |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0417742A (pt) * | 2003-12-16 | 2007-04-10 | Pioneer Hi Bred Int | transgênies de supressão de gene dominante e métodos utilizando os mesmos |
| US9297028B2 (en) * | 2005-09-29 | 2016-03-29 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
| US7659104B2 (en) * | 2006-05-05 | 2010-02-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation |
| US7541173B2 (en) * | 2006-06-15 | 2009-06-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation |
| US8017364B2 (en) * | 2006-12-12 | 2011-09-13 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Solvent tolerant microorganisms |
| EP2706111A1 (en) * | 2008-03-03 | 2014-03-12 | Joule Unlimited Technologies, Inc. | Engineered CO2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest |
-
2007
- 2007-08-09 KR KR1020070080109A patent/KR101114918B1/ko active IP Right Grant
-
2008
- 2008-06-10 EP EP08766179.9A patent/EP2176415B1/en active Active
- 2008-06-10 WO PCT/KR2008/003217 patent/WO2009020279A1/en active Application Filing
- 2008-06-10 CN CN2008801020522A patent/CN101802200B/zh active Active
- 2008-06-10 JP JP2010519852A patent/JP2010535497A/ja active Pending
- 2008-06-10 US US12/733,026 patent/US8535918B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010104925A (ko) * | 2000-05-16 | 2001-11-28 | 윤덕용 | 폴리하이드록시알칸산 생합성 효소와 세포내폴리하이드록시알칸산 분해효소를 발현시키는 재조합미생물 및 그를 이용한 (ｒ)-3-하이드록시카르복실산의제조방법 |
| US6692945B2 (en) | 2001-01-05 | 2004-02-17 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of polyhydroxyoctanoate by streptomyces lividans |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Applied Microbiololgy and Biotechnology, 2008.05.07., 79(4):633-641 |
| Biotechnology Advances, 2007, 25:148-175 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2176415B1 (en) | 2014-05-07 |
| JP2010535497A (ja) | 2010-11-25 |
| KR20090015626A (ko) | 2009-02-12 |
| EP2176415A4 (en) | 2011-10-26 |
| CN101802200B (zh) | 2013-11-20 |
| WO2009020279A1 (en) | 2009-02-12 |
| EP2176415A1 (en) | 2010-04-21 |
| US8535918B2 (en) | 2013-09-17 |
| US20100209983A1 (en) | 2010-08-19 |
| CN101802200A (zh) | 2010-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110151530A1 (en) | Enzymatic production of 2-hydroxy-isobutyrate (2-hiba) | |
| CN104087546B (zh) | 一种工程菌及制备(3r，5s)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法 | |
| KR101114918B1 (ko) | 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 | |
| TW200526787A (en) | Biochemical synthesis of 6-amino caproic acid | |
| CN110396508B (zh) | 源自Nocardia cyriacigeorgica的L-泛解酸内酯脱氢酶及应用 | |
| CN107849522A (zh) | 用于产生1,3‑丁二醇的方法和微生物 | |
| JP2013538060A (ja) | レブリン酸、レブリン酸エステル、バレロラクトン、およびこれらの誘導体の産生のための発酵経路 | |
| KR20150022889A (ko) | 생합성 경로, 재조합 세포 및 방법 | |
| CN110396507B (zh) | 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶 | |
| CN104726507A (zh) | 一种醛酮还原酶在催化生成(r)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用 | |
| Kang et al. | Increased production of ω-hydroxynonanoic acid and α, ω-nonanedioic acid from olive oil by a constructed biocatalytic system | |
| CN111411128B (zh) | 一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用 | |
| Kim et al. | Construction of an engineered biocatalyst system for the production of medium‐chain α, ω‐dicarboxylic acids from medium‐chain ω‐hydroxycarboxylic acids | |
| Schweiger et al. | Characterization of two aldo–keto reductases from Gluconobacter oxydans 621H capable of regio-and stereoselective α-ketocarbonyl reduction | |
| JP2007124922A (ja) | ３−キヌクリジノン還元酵素およびこれを用いる（ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 | |
| Chen et al. | Metabolic engineering of high L-lysine-producing Escherichia coli for de novo production of L-lysine-derived compounds | |
| CN110527671B (zh) | 源自Nocardia farcinica的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用 | |
| CN110396506B (zh) | 源自Nocardia asteroides的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用 | |
| JP4648691B2 (ja) | 光学活性な化合物の製造方法 | |
| US9637761B2 (en) | Recombinant microorganism metabolizing 3,6-anhydride-L-galactose and a use thereof | |
| CN111334495B (zh) | 制备右旋酰胺酮洛芬的方法 | |
| WO2006013802A1 (ja) | エナンチオマー豊富化化合物の製造方法 | |
| CN110358804A (zh) | R-3-氨基正丁醇的酶法生产工艺 | |
| Latham et al. | Enzymatic Cascades | |
| Cao et al. | Production of Optically Pure (S)-3-Hydroxy-γ-butyrolactone from d-Xylose Using Engineered Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20070809 |
|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20080825 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20070809 Comment text: Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20101013 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20110623 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20120125 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20120203 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20120203 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150119 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20150119 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160128 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20160128 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170202 Year of fee payment: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20170202 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180116 Year of fee payment: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20180116 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190116 Year of fee payment: 8 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20190116 Start annual number: 8 End annual number: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200116 Year of fee payment: 9 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200116 Start annual number: 9 End annual number: 9 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210118 Start annual number: 10 End annual number: 10 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20221226 Start annual number: 12 End annual number: 12 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20231226 Start annual number: 13 End annual number: 13 |