KR100250830B1 - 자가분해에 의해 폴리하이드록시알킨산으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산의 제조방법 - Google Patents
자가분해에 의해 폴리하이드록시알킨산으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자가분해에 의해 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoates, PHAs)으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 다양한 미생물의 배양에 의해 PHAs를 생산ㆍ축적한 다음, 균체를 물이나 완충용액에 방치하여 PHAs를 자연분해시킴으로써, 광학활성을 갖는 그의 단량체 (D)-하이드록시카르복실산을 생산하고, 그를 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하는 공정과 그로부터 유기용매 추출로 불순물을 제거, 최종 정제하고 건조시켜 분말제재화하는 공정을 포함하는, (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 고효율이면서도 단순한 공정만으로도 광학활성이 있는 하이드록시카르복실산을 순수하게 생산할 수 있어 경제적이며, 종래 제조방법에서 필수적으로 다양 사용되던 유기용매가 적게 사용되어 환경 보호 차원에서도 일조하게 된다.
Description
본 발명은 자가분해애 의해 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoates, PHAs)으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 다양한 미생물의 배양에 의해 PHAs를 생산ㆍ축적한 다음, 균체를 물이나 완충용액에 방치하여 PHAs를 자연분해시킴으로써, 광학활성을 갖는 그의 단량체 (D)-하이드록시카르복실산을 생산하고, 그를 액체크로마토그래피(LC)로 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하는 공정과 그로부터 유기용매 추출로 불순물을 제거, 최종 정제하고 건조시켜 분말 제재화하는 공정을 포함하는, (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법에 관한 것이다.
(D)-하이드록시카르복실산은 하이드록실기와 카르복실기의 두가지 기능기를 동시에 가지고 있으며, 기능기 전환이 편리하고, 키랄 유도(chiral induction)에 의한 간편한 새로운 키랄 중심(chiral center)의 도입이 가능하다는 등의 장점을 가지고 있어, 키랄성 전구체로 널리 이용될 수 있다. 항생제, 비타민, 향료 및 페로몬(pheromone)등의 합성을 위한 전구체와 의약품 디자인에 사용되는 비펩타이트 리간드(ligand) 개발을 위한 응용, 신규 의약품 개발을 위한 전구체 등의 폭넓은 응용이 기대되고 있으며, 특히 페니실린을 대체할 락탐계 항생물질로 주목을 받고 있는 카바페넴계 항생물질(carbapenems)들의 전구체로서 사용될 수 있다. 또한, 메틸 (D)-3-하이드록시부탄산으로부터 (+)-티엔나마이신(thienamycin)을 합성하는 방법이 보고되었다[참조: Chiba and Nakai, Chem, Lett, 651-654, (1985); Seebach and Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65: 495-503, (1982)].
현재, (D)-3-하이드록시카르복실산은 발효공정에 의한 지방족 글리콜의 산화 반응[참조: Harada and Hirayashi, Agric. Biol. Chem., 32: 1175, (1968)], 미생물에 의한 카르복실산의 (D)-
-하이드록실화 반응[참조: Hasegawa et al., J. Ferment. Technol., 60: 501, (1982)],
-디케톤의 키랄촉매에 의한 수소화 반응[참조: Noyori et al., J. Am. Chem. Soc., 109: 5856, (1987); Brussel et al., WO9714500A1, (1997)] 등에 의해 주로 생산되고 있다.
한편, PHAs는 미생물의 세포 내에 합성ㆍ축적되는 에너지 및 탄소원의 저장물질로서, 사용되는 미생물, 공급하는 화학물질, 배양조건 등의 변화에 의해 100종류 이상의 단량체가 구성요소로서 가능한 것으로 알려져 있다[참조: Lee, Biotechno. Bioeng., 49: 1-14, (1996); Steinbuchel and Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-228 (1995)]. 생합성 효소의 광학특이성으로 인해 PHAs를 구성하는 모든 단량체 유니트들은 광학활성을 가진 형태 (Dconfiguration)로 존재하므로, 생합성된 PHAs를 분해함으로써 쉽게 광학적으로 순수한 하이드록시카르복실산을 생산하는 것이 가능하다.
PHB(poly-3-hydroxybutyrate)나 PHB/V(poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)를 화학적 방법으로 분해하여 (D)-3-하이드록시부탄산 및 (D)-3-하이드록시발레르산을 생산하는 방법이 연구되어 보고된 바 있다[참조: Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, (1992); Seebach and Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65: 495-503, (1982)].
그러나, 전술한 화학적 방법에 의한 하이드록시카르복실산의 제조는 유기용매를 사용한 복잡한 공정에 의해 저효율로 이루어지므로, 이러한 문제점을 해결할 수 있는, 광학활성을 지닌 하이드록시카르복실산의 제조방법이 당업계에서 절실하게 필요하였다.
PHA는 미생물이 탄소원은 풍부하나 다른 성장인자(질소, 인, 산소, 황 등)가 부족할 때 세포내에 합성하여 축적하는 에너지 저장물질이다. 따라서, 미생물은 성장환경이 바뀌어 제한되었던 성장인자가 다시 제공되면 축적해 놓은 PHA를 분해하여 에너지원으로 성장하게 된다.
PHAs를 생산하는 미생물은 모두 PHA 생합성 효소계와 함께 PHA 생분해 효소를 생산하며, PHA 생분해 효소는 세포 내에 가용성(soluble)형태 또는 PHA 입자에 부착된 형태의 2종류로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 합성된 PHAs는 환경인자의 조절에 의해 자가분해가 가능하며, 이를 통해 광학활성이 있는 하이드록시카르복실산을 경제적으로 생산할 수 있음에 착안하고 본 발명을 시작하게 되었다.
이에, 본 발명자는 미생물 내에 축적된 PHAs로부터 광학활성이 있는 단량체들을 제조하고자 예의 연구 노력한 결과, 미생물을 배양하여 고농도로 PHAs를 축적한 후, 균체를 수거하여 물이나 완충용액에 분산ㆍ방치함으로써, PHAs가 효율적으로 분해되어 하이드록시카르복실산 단량체들이 다량 방출되는 것을 확인하였고, 또한 전기 단량체들을 액체크로마토그래피(LC)나 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 순수하게 분리하여, 유기용매 추출과 건조 공정을 추가로 적용시킴으로써 정제 및 분말 제재화가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 PHA를 축적하는 재조합 균주를 포함한 각종 미생물의 배양에 의해 PHAs를 합성한 후, 이를 자가분해하여 광학활성이 있는 단량체 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 액체크로마토그래피(LC)나 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 전기 단량체의 분리공정을 추가로 포함하는, (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 순수분리된 (D)-하이드록시카르복실산에 유기용매 추출에 의한 불순물 제거공정과 건조공정을 추가로 적용시킴으로써, 최종 제품화 형태인 분말형 제재의 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법을 제공하는 것이다.
제1도는 알칼리게네스 레이터스에 축적된 PHB를 초기 pH 7.0으로 조정된 분해용액에서 자가분해시킬 때, 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량(-●-)과 분해용액의 pH 변화(-▲-)를 나타내는 그래프이다.
제2도는 알칼리게네스 레이터스에 축적된 PHB를 pH 7.0으로 유지되는 분해용액에서 자가분해시킬 때, 시간에 따른 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
제3도는 코리네박테리움에 축적된 PHB를 초기 pH 4.0, 7.0, 10의 분해용액에서 자가분해시킬 때, 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
제4도는 바실러스에 축적된 PHB를 초기 pH 4.0, 7.0, 10의 분해용액에서 자가분해시킬 때, 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
제5도는 3-하이드록시부탄산 표준물질(Sigma Chemical Co., USA)의 HPLC 피크를 나타낸다.
제6도는 4-하이드록시부탄산 표준물질(Sigma Chemical Co., USA)의 HPLC 피크를 나타낸다.
제7도는 알칼리게네스 레이터스에 축적된 폴리하이드록시부탄산(PHB)의 자가분해에 의해 생성된 단량체 (D)-3-하이드록시부탄산의 HPLC 피크를 나타낸다.
제8도는 알칼리게네스 레이터스에 축적된 공중합체의 자가분해에 의해 생성된 단량체 (D)-3-하이드록시부탄산과 4-하이드록시부탄산의 HPLC 피크를 나타낸다.
제9도는 정제된 (D)-3-하이드록시부탄산의 양성자 NMR 피크를 나타낸다.
이하, 본 발명의 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명은 다양한 미생물의 배양에 의해 PHAs를 생산ㆍ축적한 다음, 균체를 적절한 pH로 조정된 물이나 각종 염 수용액 또는 완충용액에 방치하여 PHAs를 자연분해시킴으로써, 광학활성을 갖는 그의 단량체 (D)-하이드록시카르복실산을 제조하고, 이를 특정 조건의 LC나 HPLC로 분리한다. LC나 HPLC는 유기산을 분리할 수 있는 다양한 종류의 컬럼을 채용할 수 있고, pH가 1~3인 산성 수용액을 유동상으로 사용하는 것이 바람직하다.
ramigera 등을 포함하는 Zoogloea 속 미생물들이다.
이들 미생물들로부터 생산된 PHAs의 자가분해에 의해 제조되는 단량체 (D)-하이드록시카르복실산은 배양시 사용한 탄소원이나 화합물에 따라 (D)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), (D)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvalerate), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate) 및 탄소수가 6~14개인 중간사슬길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylicacids), 그리고 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(hydroxyvalericacid), 4-하이드록시발헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-펜탄산(pentenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-trans-헥산산(hexenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-cis-헥산산(hexenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-6-메틸헵탄산(methylheptanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸 에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸 에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필 에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질 에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydrox)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromoundecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)- 2,6-디메틸-5-헵텐산(heptenoic acid) 등이다.
이때, 폴리하이드록시알칸산을 구성할 수 있는 단량체 중 3-하이드록시프로피온산, 4-하이드록부탄산, 5-하이드록시발레르산 등은 키랄센터가 없어 광학이성질체가 존재하지 않고, 이외 광학이성질체가 존재하는 대다수의 단량체는 모두 (D)-form으로 존재한다.
상술한 여러 종의 단량체 중 본 발명의 바람직한 일실시예로서, (D)-3-하이드록시부탄산, (D)-3-하이드록시부탄산/4-하이드록시부탄산, (D)-3-하이드록시부탄산/(D)-3-하이드록발레르산, 탄소수 6~14의 (D)-하이드록시카르복실산의 단량체를 자가분해에 의해 생산하였다. 즉, Alcaligenes latus, Alcaligenes eutrophus(최근 Ralstonia eutropha로 재명명됨), Corynebacterium sp., Bacillus sp., Methylosinus trichosporium, Rhodospirillum rubrum, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, PHA합성 관련 유전자가 증폭된 재조합Alcaligenes eutrophus등을 절절한 탄소원이 첨가된 배지에서 배양하여 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)나 다른 종류의 PHAs를 합성 및 축적시킨 다음, 원심분리하여 균체를 수득하고, 그를 자가분해 용액에 분산하여 다양한 조건하에 분해하여 생성된 단량체의 농도를 측정하였다.
그 결과, PHB를 포함한 PHAs를 자가분해에 의해 단량체 (D)-하이드록시카르복실산의 효율적 생산이 가능함을 확인하였고, 적합한 자가분해 조건을 결정하였다.
이렇게 결정된 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산을 위한 자가분해 조건은 Alcaligenes latus의 경우, 분해용액의 pH가 2~11, 바람직하게는 pH 2~5, 가장 바람직하게는 pH가 3~4, 반응온도 4~55℃, 바람직하게는 30~50℃,가장 바람직하게는 37℃, 반응시간 30분~10시간이고; Alcaligenes eutrophus의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 반응시간 20시간 이상이며; Corynebacterium sp.의 경우, 분해용액의 pH가 5~9, 반응온도 30~40℃, 반응시간 2~30시간이고; Bacillus sp.의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 분해시간 10시간이고; Methylosinus trichosporium의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 분해시간 20시간이며; Rhodospirillum rubrum의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 분해시간 20시간이고; Alcaligenes eutrophus H16의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 분해시간 20시간이며; PHA 합성 유전자를 갖는 재조합 Alcaligenes eutrophus의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 반응시간 20시간 이상이었다.
(D)-3-하이드록시부탄산/4-하이드록시부탄산의 생산을 위한 자가분해 조건은 Alcaligenes latus의 경우, 분해용액의 pH가 7이하, 바람직하게는 pH가 2~5, 반응온도 30~40℃, 가장 바람직하게는 37℃, 반응시간 30분~10시간이었다. 또한, (D)-3-하이드록시부탄산/(D)-3-하이드록시발레르산의 생산을 위한 자가분해 조건은 Alcaligenes eutrophus의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 반응시간 20시간 이상이었다.
탄소수 6~14의 (D)-하이드록시카르복실산의 생산을 위한 자가분해 조건은 Pseudomonas oleovorans 또는 Pseudomonas aeruginosa의 경우, 분해용액의 pH가 2~12, 반응온도 30~40℃, 반응시간 10시간 이상이었다.
이외에도, 상술한 각종 단량체들은 단순히 균주와 배양시의 탄소원 및 기질을 다양하게 사용함으로써 얻을 수 있다[참조: Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, (1996); Steinbuchel and Valenti, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-228, (1995)].
본 발명은 고농도의 PHA를 자가분해하여 그의 단량체를 고농도로 생산할 수 있으며, 고농도의 PHA를 자가분해시 부산물로 생성되는 이량체를 염기성 조건에서 가열 분해함으로써 단량체 생산 수율을 향상시킬 수 있다.
상기에서, 자가분해를 위한 분해용액으로는 물이나 완충용액이 사용될 수 있는데, 물을 사용한 경우와 완충용액을 사용한 경우의 차이는 없거나 무시할 수 있는 정도였으며, 추후의 분리 및 정제의 견지에서 물을 사용하는 것이 바람직하다.
전술한 조건에 따른 고분자 PHA의 자가분해에서, 그 고분자가 공중합체인 경우 단량체들이 혼합물로 존재하게 되며, 이는 액체크로마토그래피나 고속액체크로마토그래피로 쉽게 분리할 수 있다.
순수 분리된 (D)-하이드록시카르복실산은 유기용매 추출에 의한 불순물 제거와 단순 건조 공정만으로 간단하게 정제 및 분말 제재화한다. 즉, 자가분해에서 얻은 순수한 (D)-하이드록시카르복실산 함유 용액에 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등의 강염기를 첨가하여 pH 9 이상의 염기영역으로 조정한 다음, 유기용매를 첨가하여 유기상으로 추출된 불순물을 제거하고, 수용상을 건조시킴으로써 90% 이상의 순도를 갖는 분말제제를 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
알칼리게네스 레이터스 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄 생산
알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus) 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 적합한 자가분해 조건을 확립하기 위해, 하기 표 1의 단순배지에 설탕을 30g/L 첨가하여 질소제한조건 하에 회분식 배양으로 PHB를 축적시킨 후, 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이를 다양한 조건으로 자가분해햐여 생성된 (D)-3-하이드록시카르복실산과 그의 이량체(dimer)의 농도를 측정하였다.
상기에서, 자가분해 조건은 분해용액의 pH(참조 : 표 2), 분해용액 내 탄소원 존재 유무 및 분해시 교반 유무(참조 : 표 3 및 표4), 자가분해시의 반응 온도(참조 : 표 5 및 표6) 등이다. 그 결과, pH 4.0의 조건에서 교반없이(무 산소 조건으로) 37℃로 자가분해하는 경우, (D)-3-하이드록시부탄산을 가장 효율적으로 생산함을 확인하였다.
분해용액으로는 다양한 산(염산, 황산, 아세트산 사용) 또는 염기(수산화나트륨, 암모니아수 사용)로 pH를 조절한 물 또는 염 수용액(탄소원을 제외한 단순배지, 등장액)과 완충용액(40mM 인산 완충용액, 40mM 아세테이트(acetate) 완충용액, 40mM 시트레이트(citrate) 완충용액, Tris-Cl 완충용액, MOPS 완충용액)들을 비교하였으나, 동일한 pH에서는 분해용액의 종류에 따른 결과의 차이가 없거나 무시할만한 수준(수율을 기준으로 최대 차이 3% 미만)이어서, 이후 분리 및 정제에 미칠 영향을 고려하여, 이후 실시예의 모든 분해용액으로 pH를 조정한 물을 사용하였다.
[표 1]
단순배지의 조성
[표 2]
분해용액의 pH에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산(3HB) 및 그의 이량체(dimer) 생산 농도(초기 PHB 농도 : 1.07 g/L, 반응 온도 : 37℃, 반응시간 : 30 분)
[표 3]
탄소원 및 교반 유무에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산(3HB)와 그의 이량체 생산 농도, 최종 수율 및 최종 pH(초기 PHB 농도 : 10.1 g/L, 초기 pH : 7.0 반응 온도 : 37℃, 반응 시간 : 8시간)
[표 4]
탄소원 및 교반 유무에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산(3HB)및 그의 이량체 생산 농도, (초기 PHB 농도 : 1.07 g/L, 초기 pH : 4.0 반응 온도 : 37℃, 반응 시간 : 30 분)
[표 5]
반응온도에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산(3HB)의 생산 농도(초기 PHB 농도 : 10.9 g/L, 초기 pH : 7.0)
[표 6]
반응온도에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산(3HB) 및 그의 이량체 생산 농도(초기 PHB 농도 : 1.07 g/L, 초기 pH : 4.0)
아울러, 반응용액의 pH와 자가분해 반응간의 상관관계를 보다 구체적으로 알아보기 위하여, 초기 pH를 7.0으로 조정한 분해용액 내에서 반응시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 pH 변화와 함께 측정하였다(참조 : 제1도). 제1도에서 보듯이, PHB의 자가분해 반응은 pH에 매우 민감하며, 초기 pH를 7로 조정한 경우 초기에는 자가분해가 거의 일어나지 않으며, 이후 pH가 감소함에 따라 자가분해가 촉진(반응 6시간째에 pH의 급격한 감소가 나타남과 동시에 (D)-3-하이드록시부탄산의 급속한 생산이 이루어졌다)됨을 알 수 있었다.
이러한 pH의 영향은 또한 발효기를 이용하여 pH 7로 유지하며 자가분해 반응을 수행한 결과에서도 증명될 수 있었다(참조 : 제2도). 즉, 초기 PHB 농도가 10.1 g/L 인 균체분산액을 발효기에 넣고, 질소를 충전하여 무산소화하고 4N NaOH를 첨가함으로써 pH를 7.0으로 유지하며 분해반응을 수행하였다. 그 결과, 30시간 후에도 16%의 PHB만이 분해되어, 2 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산이 생산됨을 알 수 있었다.
따라서, 알칼리게네스 레이터스에서 합성된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산에는 반응용액의 pH가 가장 중요한 영향인자이며, 낮은 pH에서는 자가분해가 촉진됨을 알 수 있었다.
이상의 결과에서 보듯이, 상당히 다양한 조건에서 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 효율적인 생산이 가능함을 알 수 있으며, 특히 초기 pH를 4로 하고, 34℃~50℃에서 반응할 경우에는 불과 30분만에 90% 이상의 수율을 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 생성물이 (D)-3-하이드록시부탄산임을 확인하기 위하여 HPLC로 검출시간(retention time)을 미국 Sigma사에서 판매하고 있는 3-하이드록시부탄산 라세믹 혼합체(racemic mixture)와 비교하였다(참조 : 제5도 및 제7도). 두 경우 모두 12.9분대에서 피크가 검출되어, 생성물질이 3-하이드록시부탄산임을 확인하였다.
[실시예 2]
알칼리게네스 레이터스 내에 생산ㆍ축적된 고농도 PHB의 자가분해와 생산된 이량체의 분해를 통한 고순도 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
[실시예 2-1]
실시예 1에서 예시한 바와 같이 저농도(약 10 g/L 이하)의 PHB를 자가분해하여, 높은 수율과 짧은 반응시간의 효율적인 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산이 가능하나, 실제 공정상에서의 조업은 분리공정의 용이성, 사용 용매의 절약 및 반응기 부피 감소 등의 이유로 인해, 고농도의 PHA하에서 진행시켜야 경제적 측면에서 유리하다.
따라서, 본 실시예에서는 알칼리게네스 레이터스의 유가식 배양에 의해 고농도로 PHB를 생산한 후, PHB 초기 농도를 상당히 높은 농도인 115.3g/L로 조정하여 자가분해하였다. 이때, 자가분해 조건은 초기 pH 4, 온도 37℃, 반응시간 1시간이었다.
그 결과, 117.8 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산(약 84% 수율)과 15.2g/L의 그의 이량체(약 12% 수율)가 생산되었다. 따라서, 고농도의 PHB의 자가분해에 의한 효율적인 (D)-3-하이드록시부탄산 생산이 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 2-2]
실시예 2-1에서 고농도의 PHB의 자가분해시 분해가 완전히 이루어지지 않아 상당량의 이량체가 함께 부산물로서 생산되었는 바, 본 실시예에서는 함께 생성된 이량체의 완전한 분해를 통해 단량체의 수율을 향상시키고자 하였다. 즉, 실시예 2-1에 의해 제조된 117.8 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 15.2 g/L의 이량체 혼합용액에 5M의 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 11로 조정한 후, 이를 시험관에 넣어 밀봉하고 95℃에서 2시간 반응시켰다. 그 결과, (D)-3-하이드록시부탄산의 최종 농도는 131.9 g/L(약 95% 수율)이었고, 이량체는 모두 분해되어 검출되지 않았다.
따라서 실시예 2-1과 2-2에서 예시한 바와 같이 자가분해 후, 함께 생성된 이량체를 염기조건에서 분해함으로써 고농도의 PHB로부터 효율적으로 (D)-3-하이드록시부탄산을 생산할 수 있다.
[실시예 3]
알칼리게네스 레이터스 내에 생산ㆍ축적된 공중합체에 의한 자가분해에 의한 단량체 생산
알칼리게네스 레이터스 탄소원으로 10 g/L의 설탕과 3 g/L의 4-하이드록시부탄산을 함께 첨가한 단순배지에서 플라스크 배양하여, 공중합체 고분자인 폴리(3-하이드록시부탄산-co-4-하이드록시부탄산)[poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)]를 건조균체중량의 70%까지 함유하는 균체를 얻었으며, 이 고분자의 단량체 중 12%가 4-하이드록시부탄산이었다. 이를 원심분리한 후, 21 g/L의 고분자 농도가 되도록 분산하여 자가 분해시켰다. 37℃, 초기 pH 4의 조건으로 자가분해한 경우, 4시간만에 13.6 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산 2.4 g/L의 4-하이드록시부탄산을 생산하였고, 이때의 수율은 각각 68%와 79%였다.
따라서, 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-co-4-하이드록시부탄산)로부터 자가분해에 의해 (D)-3-하이드록시부탄산과 4-하이드록시부탄산을 효율적으로 생산할 수 있었으며, 이들은 LC나 HPLC에 의해 순수분리할 수 있었다(참조: 후술하는 실시예 15).
[실시예 4]
알칼리게네스 유트로퍼스 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
종래의 방법[참조: Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 43: 892-898, (1994)]에 따라, 질소 제한 조건 하에서 알칼리게네스 유트로퍼스를 배양하여 72%의 PHB를 함유하는 균제를 얻었다. 이를 초기 PHB 농도가 34 g/L가 되도록 조정하고, 초기 pH 4.0, 7.0의 두 경우로 나누어 30℃에서 34시간 자가분해하였다. 그 결과, 초기 pH 4.0인 경우에는 5.2 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 0.4 g/L의 이량체가 생성되었고, 초기 pH7.0인 경우에서는 9.3 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 0.9 g/L의 이량체가 생산되었다. 총수율은 각각 14%와 25%였으며, 알칼리게네스 레이터스의 경우와는 달리 알칼리게네스 유트로퍼스에서는 PHB의 완전분해가 일어나지 않았다. 따라서, 알칼리게네스 레이터스보다는 효율적이지 못하지만, 알칼리게네스 유트로퍼스에 PHB를 축적시키고 이를 자가분해함으로써, (D)-3-하이드록시부탄산을 생산할 수 있었다.
[실시예 5]
알칼리게네스 유트로퍼스 내에 생산ㆍ축적된 공중합체의 자가분해에 의한 단량체 생산
종래의 방법[참조: Kim et al., Enzyme Microbial Techno.., 16: 556-561, (1994)]에 따라, 알칼리게네스 유트로퍼스를 탄소원으로 10 g/L의 포도당과 함께 1 g/L의 프로피온산을 첨가한 배지에서 배양한 결과, 건조균체농도의 63%에 달하는 PHB/V(poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 공중합체 (D)-3-하이드록시발레르산 8%)를 생산ㆍ축적 하였으며, 이를 자가분해하여 단량체 (D)-3-하이드록시부탄산과 (D)-3-하이드록시발레르산을 생산하였다. 27.4 g/L의 공중합체 농도가 되도록 시료를 준비하여 pH 7, 30℃에서 35시간 자가분해하였으며, 이때 5.8 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 0.6 g/l의 (D)-3-하이드록시발레르산을 생산할 수 있었다. 따라서, PHB/V 공중합체의 축적 후 자가분해에 의해서 (D)-3-하이드록시부탄산과 (D)-3-하이드록시발레르산의 혼합물을 얻을 수 있으며, 이 둘은 LC나 HPLC로 분리할 수 있었다.
[실시예 6]
코리네박테리움 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산과 생산
토양으로부터 순수 분리한 코리네박테리움(Corynebacterium sp. SS-15)[참조: 허 성숙 등, 한국생물공학회지, 제 12권 : 451-458, (1997)]을 탄소원으로 20 g/L의 크실로스가 첨가된 단순배지에서 3일간 플라스크 배양하여, 33%의 PHB를 함유한 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 이를 pH 4.0, 7.0, 10.0으로 조정된 물에 초기 PHB 농도가 3.4 g/L가 되도록 분산하여 30℃에서 방치하고 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 측정하였다(참조 : 제3도). 그 결과, 초기 pH 7.0인 경우에서는 41시간 반응 후 최대 4.23 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산이 생산되었는 바, 이는 83%의 수율을 나타낸다.
[실시예 7]
바실러스 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
토양으로부터 순수 분리한 바실러스(Bacillus sp. SS-19)[참조: 허 성숙 등, 한국생물공학회지, 제 12권 : 451-458, (1997)]을 탄소원으로 20 g/L의 크실로스가 첨가된 단순배지에서 3일간 플라스크 배양하여, 15%의 PHB를 함유한 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 이를 pH 4.0, 7.0, 10.0으로 조정된 물에 초기 PHB 농도가 1.4 g/L가 되도록 분산하여 30℃에서 방치하고 시간에 따른 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산량을 측정하였다(참조 : 제4도). 그 결과, 초기 pH 7.0일 때 20시간 반응 후 최대 0.96 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산이 생산되었는 바, 이는 57%의 수율을 나타낸다.
[실시예 8]
메탄 자화균 메틸로시너스 트리코스포리움 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
상기 실시예에서는 모두 호기성이거나 통성 호기성 미생물을 사용하였다. 본 실시예에서는 혐기성 균주이며 메탄 자화균일 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium)(KCTC 2591)를 배양하여 PHB를 축적시킨 후, 자가분해에 의한 3HB((D)-3-하이드록시부탄산)의 생산을 시도하였다. PHB의 축적은 황재웅과 박성훈[참조: 한국생물공학회지, 11: 246-253, (1996)]의 방법을 이용하여 균체농도 1.1g/L, PHB 함량 10%의 결과를 얻었다. 이를 PHB 농도가 10.5 g/L 되도록 농축하여, pH 4의 수용액에서 37℃의 온도로 전기 실시예들(실시예 1~7)과 같이 자가분해를 수행하였다. 그 결과, 24시간 후 1.15 g/L의 3HB를 얻을 수 있었으며, 이는 수율로 9%에 해당한다. 따라서, 메탄 자화균의 배양에 의해 PHB를 축적한 다음, 자가분해에 의해 3HB를 얻을 수 있음을 알았다.
[실시예 9]
광합성 세균 로도스피리움 루부럼 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
또 다른 혐기성 균주이며 광합성 세균인 로도스피리움 루부럼(Rhodospirillum rubrum)(KCTC 1372)를 하시모토 등[Hashimoto et al., J. Chem. Eng. Japan, 26: 56-58, (1993)]의 방법으로 배양하여, 140시간 후 1.5 g/L의 균체를 얻었고, 이때 PHB 함량은 16%이었다. 이를 PHB 농도가 12 g/L 되도록 농축하여, pH 4의 수용액에서 37℃의 온도로 전기 실시예들(실시예 1~8)과 같이 자가분해를 수행하였다. 그 결과, 24시간 후 1.61 g/L의 3HB를 얻을 수 있었으며, 는 수율로 11%에 해당한다. 따라서, 광합성 세균의 배양에 의해 PHB를 축적한 다음, 자가분해에 의해 3HB를 얻을 수 있음을 알았다.
[실시예 10]
과당(fructose)를 탄소원으로 사용하는 알칼리게네스 유트로퍼스 H16(ATTCC17699) 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
과당을 탄소원으로 사용하는 균주 알칼리게네스 유트로퍼스 H16(ATCC17699)를 휴게스(Hughes) 등의 방법[참조: Hughes et al., USPatent4,433,053, (1984)]으로 유가식 배양하여, 70시간 후 42 g/L의 균체를 얻었고, 이때 PHB 함량은 65%이었다. 이를 PHB 농도가 42 g/L 되도록 농축하여, pH 7의 수용액에서 30℃의 온도로 자가분해를 수행하였다. 그 결과, 36시간 후 11.7 g/L의 3HB를 얻을 수 있었으며, 이는 수율로 23%에 해당한다. 따라서, 알칼리게네스 유트로퍼스 H16을 과당을 탄소원으로 배양하여 PHB를 축적한 다음, 자가분해에 의해 3HB를 얻을 수 있음을 알았다.
[실시예 11]
수도모나스 올레오보란스 내에 생산ㆍ축적된 PHBs로부터 광학활성을 지닌 중간사슬길이의 하이드록시알칸산의 생산
수도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)를 다양한 유기산(alkanoates), 알코올(alcohols, alkanols), 탄화수소계(alkanes, alkenes)을 탄소원으로 하여 배양하는 경우, 탄소수가 6~14개인 중간사슬길이의 하이드록시알칸산(H4)을 단량체로 갖는 PHAs를 생성ㆍ축적하며, 또한 사용한 탄소원의 종류에 따라 생성된 고분자의 단량체의 종류 및 조성이 달라지는 것으로 보고되고 있다[참조: Brandl et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 1977-1982, (1988); Lee, Biotechno. Bioeng., 49: 1-14, (1996)].
예를 들면, 헥산산을 탄소원으로 할 경우 생성된 PHA는 탄소수가 6개인 3-하이드록시헥산산, 탄소수가 7개인 3-하이드록시헵탄산, 탄소수가 8개인 3-하이드록시옥탄산, 탄소수가 10개인 3-하이드록시데칸산을 단량체로 하여 구성된다. 이 중에서, 3-하이드록시헥산산이 주 단량체로서 약 82%의 몰분율을 차지하며, 3-하이드록시옥탄산이 약 17% 정도의 몰분율을 차지하고, 3-하이드록시헵탄산과 3-하이드록시데칸산이 합쳐서 약 1%의 몰분율에 불과한 소량으로 존재한다.
헵탄산을 탄소원으로 할 경우, 탄소원 6개에서 11개까지로 구성된 6종의 단량체 모두(3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시운데칸산)를 포함한 PHA가 생성되며, 이 중 3-하이드록시헵탄산이 주 단량체로서 약 94%의 몰분율로 존재한다.
옥탄산을 탄소원으로 할 경우, 탄소수가 짝수, 즉 6개, 8개, 10개인 단량체, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시부옥산, 3-하이드록시데칸산으로 구성된 PHA가 생성되는데, 주 단량체인 3-하이드록시옥탄산의 몰분율이 약 86%이며, 3-하이드록시헥산산이 약 10%, 3-하이드록시데칸산이 4% 정도를 차지한다. 특히, 이 경우에는 단량체의 대부분이 3-하이드록시옥탄산과 3-하이드록시헥산산임으로 인해, 폴리(3-하이드록시헥산산-co-3-하이드록시옥탄산[P(3HHx-co-3HO)]의 공중합 고분자로 일컬어지기도 한다.
노난산을 탄소원으로 할 경우, 헵탄산의 경우와 마찬가지로 5종의 단량체 모두를 단량체로 갖는 PHA가 생성ㆍ축적된다. 단량체 조성비는 주 단량체인 3-하이드록시노난산이 약 58% 정도이고, 3-하이드록시헵탄산이 31%, 3-하이드록시옥탄산이 6%, 3-하이드록시데칸산이 3%, 3-하이드록시헥산산이 1% 정도이며, 3-하이드록시운데칸산은 미량 존재한다.
데칸산을 탄소원으로 할 경우, 탄소수가 6, 8, 9, 10, 11개인 단량체로 구성된 PHA가 생성되며, 주 단량체인 3-하이드록시옥탄산이 약 63%이고, 3-하이드록시헥산산이 20%, 3-하이드록시데칸산이 11%, 3-하이드록시운데칸산이 3%, 3-하이드록시노난산이 1% 정도로 존재한다.
따라서, 탄소원인 헥산산으로부터 3-하이드록시헥산산을 생산하며, 헵탄산으로부터 3-하이드록시헵탄산, 옥탄산으로부터 3-하이드록시옥탄산, 노난산으로부터 3-하이드록시노난산, 데칸산으로부터 3-하이드록시데칸산과 3-하이드록시운데칸산을 생산하는 방안을 모색하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
이에, 본 실시예에서는 중간사슬길이의 하이드록시카르복실산을 자가분해에 의해 생산하고자, 옥탄산나트륨 또는 노난산을 탄소원으로 사용하였다. 수도모나스 올레오보란스(P. oleovorans ATCC29347)를 옥탄산나트륨 또는 노난산을 유일한 탄소원으로 첨가한 단순배지에서 배양하면, 건조균체 농도의 5~40%의 공중합체 고분자를 포함한 균체를 얻을 수 있는데, 본 실시예에서는 옥탄사나트륨을 사용한 경우 20%, 노난산을 사용한 경우 18%의 PHA 고분자를 포함한 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 이들을 pH 7.0으로 조정한 물에 균체농도를 기준으로 75g/L가 되도록 조정하여 분산하고, 30℃에서 4일간 자가분해반응을 수행하였다(참조: 표7 및 표8).
[표 7]
옥탄산나트륨을 탄소원으로 하여 배양한 수도모나스 올레오보란스의 자가분해에 의해 중간사슬길이의 (D)-3-하드록시카르복실산의 생산(초기 pH : 7.0, 반응온도 : 30℃, 반응시간 : 4일)
[표 8]
노난산을 탄소원으로 하여 배양한 수도모나스 올레오보란스의 자가분해에 의해 중간사슬길이의 (D)-3-하드록시카르복실산의 생산(초기 pH : 7.0, 반응온도 : 30℃, 반응시간 : 4일)
상기 표7 및 표8에서 보듯이, 자가분해에 의해서 주 단량체들은 약 8~9%의 수율로 생산할 수 있음이 확인되었다.
이러한 중간사슬길이의 (D)-3-하드록시알칸을 생산하는 방법이 아직까지 존재치 않는 것을 고려할 때, 본 발명의 방법은 비록 (D)-3-하드록시부탄산보다는 낮은 효율이지만, 어느 정도 생산이 가능함을 제시한다. 또한, 농도가 너무 낮아 생산할 수 없었던 단량체들의 경우도 탄소원의 변경으로 생산할 수 있음은 자명하다.
[실시예 12]
수도모나스 에루지노사 내에 생산ㆍ축적된 PHAs로부터 광학활성을 지닌 중간사슬길이의 하이드록시알칸산 생산
수도모나스 에루지노사(P. aeruginosa AO232)를 초산을 탄소원으로 하여 배양할 경우, 탄소수가 6개, 8개, 10개, 12개인 단량체(3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시 옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산)로 이루어진 PHA가 생산되고; 및, 프로피온산을 탄소원으로 하여 배양할 경우, 탄소수가 6개에서 12개 사이의 서로 다른 7종 단량체(3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시노난산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시운데칸산)로 구성된 PHA가 생성되는 것으로 보고된 바 있다[참조: Saito and Doi, Int. J. Biol. Macromol., 15: 287, (1993); Lee and Chang, Adv. Biochem. Eng., 52: 27-58, (1995)].
또한 수도모나스 에루지노사 균주인 P. aeruginosa PAO1의 PHA 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 수도모나스 푸티다(P.putida)를 형질 전환하였을 때, 탄소원으로 글루콘산(gluconate)을 사용함으로써 탄소수가 6개, 8개, 10개, 12개인 단량체(3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산)로 이루어진 PHA를 생산할 수 있음이 보고되었다[참조: Timm and Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209: 15-30, (1992)].
따라서, 수도모나스 에루지노사를 이용함으로써 자가분해에 의해 다양한 중간사슬길이의 탄소수를 갖는 다양한 하이드록시카르복실산을 생산할 수 있으며, 특히 수도모나스 올레오보란스로는 생성할 수 없는 3-하이드록시도데칸산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이에, 본 실시에에서는 중간사슬길이의 하이드록시카르복실산을 자가분해에 의해 생산하고자, 글루콘산을 유일한 탄소원으로 첨가한 단순배지에서 수도모나스 에루지노사 PAO1을 배양한 후, 이를 회수하고 고분자 농도가 15 g/L가 되도록 조정하여 30℃에서 pH 7의 조건으로 4일간 자가분해반응을 수행하였다(참조 : 표 9).
[표 9]
글루콘산을 탄소원으로 하여 배양한 수도모나스 에루지노사의 자가분해에 의해 중간사슬길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산의 생산(초기 pH : 7.0, 반응온도 : 30℃, 반응시간 : 4일)
상기 표9에서 보듯이, (D)-3-하이드록시옥탄산, (D)-3-하이드록시데칸산, (D)-3-하이드록시도데칸산을 6~10%의 수율로 각각 얻을 수 있었고, 이들 3가지는 LC나 HPLC로 분리할 수 있었다.
이와 같이 본 발명의 방법은 비록 낮은 수율이지만 중간사슬길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산을 PHA의 자가분해에 의해 생산할 수 있으며, 이는 특히 수도모나스 올레오보란스로는 얻지 못했던 (D)-3-하이드록시데칸산과 (D)-3-하이드록시도데칸산의 생산법을 제시한다.
[실시예 13]
재조합 알칼리게네스 유트로퍼스 내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
전술한 실시예들(실시예1~12)에서는 자연상태에서 PHAs를 합성하는 균주를 이용하여 고분자를 생산ㆍ축적시킨 후, 이를 자가분해하여 단량체인 (D)-하이드록시카르복실산을 생산하는 방법을 제시하였다. 최근, 유전공학의 발전에 의해 PHA 생합성 관여 유전자들이 클로닝되었고, 이들로 다양한 균주를 형질전환시켜 고분자 합성능을 향상시킨 결과들이 많이 보고되고 있다[참조: Lee, Biotechno. Bioeng., 49: 1-14, (1996); Lee, Trends Biotechno., 14: 431~438, (1996); Steinbuchel et al., FEMS Microbiol. Rev., 103: 217-230, (1992)].
이에, 본 실시예에서는 고분자를 생산ㆍ축적하는 재조합 균주를 이용하여 자가분해에 의한 (D)-하이드록시카르복실산의 생산 가능성을 조사하고자 하였다.
즉, 알칼리게네스 유트로퍼스 PHA 생합성 유전자를 삽입한 플라스미드인 pVK101[참조: Knauf and Nester, Plasmid, 8: 45, (1982)]로 형질전환된 알칼리게네스 유트로퍼스 NCIMB 11599[참조: 최종일 및 이상엽, 화학공학, 35: 684-689, (1997)]를 종래의 방법[참조: Kim et al. Biotechnol. Bioeng., 43: 892-898, (1994)]에 따라 배양하여, 건조균체농도의 약 66%에 해당하는 농도로 PHB를 축적한 균체를 얻었으며, 이를 원심분리로 회수하였다. 그런 다음, 이를 초기 PHB 농도가 30 g/L가 되도록 조정하여, 초기 pH으로 4.0, 7.0의 두 경우로 나누어 30℃에서 35시간 자가분해하였다.
그 결과, 초기 pH 4.0으로 조정한 경우에는 5g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 0.3 g/L의 이량체가 생성되었고, 초기 pH 7.0으로 조정한 경우에는 8.7 g/L의 (D)-3-하이드록시부탄산과 0.6 g/L의 이량체가 생성되었으며, 이때의 총 수율은 각각 14.7%와 26.8%이었다. 따라서, 재조합 균주에서 PHA를 생산ㆍ축적한 후 자가분해에 의해 단량체의 생산이 가능함을 알수 있었다.
[실시예 14]
재조합 대장균내에 생산ㆍ축적된 PHB의 자기분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 생산
실시예 13의 재조합 알칼리게네스 유트로퍼스는 형질전환 이전에도 PHA 합성능을 가진 경우이므로, 이와의 비교를 위해 원래 PHA 합성능이 전혀 없는 대장균에 알칼리게네스 유트로퍼스 PHA 합성 유전자를 가진 플라스미드를 도입시켜 PHB를 생산ㆍ축적시킨 후 자가분해에 여부를 조사하였다.
본 실시예에서 사용한 균주는 알칼리게네스 유트로퍼스 PHA 합성 유전자를 삽입한 높은 복제수의 플라스미드 pSYL105로 형질전환한 재조합 대장균 B와 XL1-Blue이다[참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, (1994)]. 이들 재조합 균주를 20 g/L의 포도당을 탄소원으로 첨가한 LB 배지 (pH 7.0)에서 종래의 방법[참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, (1994)]에 따라 플라스크 배양하여, 각각 건조균체농도의 75%와 80%에 달하는 고분자 PHA을 축적시켜 원심분리로 균체를 회수하였다. 이들을 다양한 초기 pH(pH 4, 7, 10)와 다양한 온도(20, 30, 37, 45℃)에서 자가분해반응을 수행하였으나, 모든 경우에 4일간 반응한 경우까지 (D)-3-하이드록시부탄산이 전혀 생성되지 않았다.
전술한 두 실시예(실시예 13, 14)의 결과로부터, 비록 재조합 균주일지라도 숙주세포가 원래 PHAs를 축적하는 균주일 경우 세포내 PHA 분해효소(intracellular PHA depolymerase)도 가지고 있으므로 자가분해에 의한 단량체 (D)-하이드록시카르복실산의 생산이 가능하지만, 대장균과 같이 본래 PHA를 축적하지 않는 균주의 경우에는 세포내 PHA 분해효소가 없으므로 자가분해되지 않음을 알수 있었다. 그러나, 아직까지 보고된 바는 없지만 세포내 PHA 분해효소를 클로닝하여, 이를 PHA 분해를 시키지 못하는 균주에 도입하여 활성을 가지도록 발현시키면, 자가분해에 의한 단량체 생산이 가능함은 자명하다. 따라서, 재조합 균주에 의해 PHA를 생산한 후 이를 자가분해하여 (D)-하이드록시카르복실산 단량체를 효율적으로 생산할 수 있음이 확인되었다.
[실시예 15]
생성된 광학적으로 순수한 단량체 하이드록시카르복실산들의 HPLC를 이용한 분리
공중합체 PHAs의 자가분해에 의해 생성된 단량체의 혼합물은 LC나 HPLC로 쉽게 분리할 수 있다. 한 예로서 실시예 3에서 얻은 (D)-3-하이드록시부탄산 및 4-하이드록시부탄산을 HPLC를 이용하여 쉽게 분리하였다(참조: 제5도, 제6도 및 제8도)
즉, Hitachi L-6000 펌프와 L-3300 RI 검출기가 장착된 HPLC(Hitachi사, 일본)에 Aminex
HPX-87H 컬럼(Bio-Rad lab사, 미국) 또는 ORH-801 컬럼(Rainin사, 미국)의 유기산 분리 컬럼을 장착시킨 후, 0.01N H2SO4수용액을 유동상으로 사용하여 단량체 (D)-3-하이드록시부탄산만을 분리·정제할 수 있다. 사용된 Aminex
HPX-87H 컬럼은 당사 유기산 분리 및 분석에 범용으로 사용되는 컬럼임을 고려할 때, 자가분해에 의해 생산된 광학적으로 순수한 하이드록시카르복실산은 종래의 유기산 분리 컬럼을 장착한 LC나 HPLC로 손쉽게 분리할 수 있음이 자명하다.
[실시예 16]
(D)-하이드록시카르복실산의 정제
폴리하이드록시부탄산과 같은 동종 중합체(homopolymer)로부터 얻어진 단량체 혹은 공중합체의 자가분해 후 실시예 15에서 기술한 방법에 의해 순수 분리된 단량체 (D)-하이드록시카르복실산은 이후 그 용도에 따라 사용할 수 있도록 제품화하기 위하여, 최종적으로 정제하고자 하였다.
본 실시예에서는 최종 정제하여 분말형 제제를 조제하고자, 전기 실시예 1,2의 방법으로 생산한 (D)-3-하이드록시부탄산을 하기 두 가지 방법으로 정제하여 분말형 제제를 조제하였다.
첫 번째로 적용된 방법은 시바크(Seebach) 등의 방법을 변형한 방법이다[참조: Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, (1992)]: (D)-3-하이드록시부탄산-황산 수용액 10mL((D)-3-하이드록시부탄산 200 g/L)에 1mL의 0.1N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 중화시킨 후, 회전 증발 건조기(rotary evaporator)로 물을 증발시켰다. 이에 20mL의 에테르를 가하여 용해시키고 무수 황산마그네슘 염을 첨가하여 수분을 제거하고 여과하였다. 다시 회전 증발 건조기로 용매인 에테르를 제거ㆍ농축한 후, Kugelrohr 장치(Aldrich사, 미국)를 사용하여 100℃에서 감압 증류하였다. 그 결과 약 1.58g의 (D)-3-하이드록시부탄산(약 79%의 수율)을 90% 이상의 순도로 얻을 수 있었다.
전술한 방법은 감압 증류 등 분리정제에 사용되는 에너지가 과다하여 생산단가의 상승효과가 우려되므로, 다른 정제법을 고안하였다.
먼저 자가분해에서 얻어진 (D)-3-하이드록시부탄산 용액 10mL((D)-3-하이드록시부탄산 200g/L)에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 11로 조정한 후, 10mL의 클로로포름 또는 에테르를 첨가하여 유기상으로 추출된 불순물을 제거한 후, 수용상을 95℃ 건조기(drying oven)에서 건조하였다. 이를 에탄올에 용해시키고 건조하여, 약 1.97 g의 (D)-3-하이드록시부탄산 나트륨염((D)-3-hydroxybutyric acid, sodium salt)을 90% 이상의 순도의 분말제제(약 82% 수율)로 조제하였다. 이때, pH를 염기영역으로 조정하기 위해 첨가한 수산화나트륨 외에도 다른 강염기(예: 수산화 칼륨 등)를 사용하는 것도 가능하며, 다른 염기의 사용이 본 정제방법에 영향을 미치지 않음은 자명하다.
또한, 본 실시예에서는 불순문 제거를 위한 추출용매로 클로로로포름과 에테르만을 사용하였으나, 물과 섞이지 않는 다른 종류의 유기용매의 사용도 본 정제방법에 큰 영향을 미치지 않음은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
상기 두 방법으로 인한 수율이나 순도면에서는 큰 차이는 없으나, 시바크(Seebach) 등의 방법으로 사용된 감압 공정이 실제 공정상에 적용하기 어렵고 높은 정제비용을 요구하며, 생산 규모의 증대가 어렵고 공정이 복잡하다는 문제점 때문에, 본 발명에서 고안된 후자의 방법이 실제 공정에 적합하며, 이 방법을 통해 (D)-3-하이드록시부탄산의 효율적인 정제 및 분말제재화가 가능하다.
본 실시예에서는 (D)-3-하이드록시부탄산의 정제만을 예로 들었으나, 다른 종류의 (D)-하이드록시부탄산 단량체에도 적용 가능하고, 그 경우에도 효율적인 정제 및 분말제재화가 가능함을 공정의 특징상 자명하다.
[실시예 17]
정제한 (D)-3-하이드록시부탄산의 확인 및 광학순도 검사
전기 실시예 16에 의해 분말 정제한 생산물이 (D)-3-하이드록시부탄산임을 확인하기 위하여, 이를 CDCl3에 용해시켜 양성자(proton) NMR로 분석하였고(참조: 제9도), 이에 따라 (D)-3-하이드록시부탄산임을 확인할 수 있었다. 미생물에 의해 축적되는 폴리하이드록시알칸산은 이성질체가 존재하는 단량체의 경우, 생합성 효소의 광학특이성으로 인해 모두 D-형(Dconfiguration)으로 존재하며, 본 발명에서 사용되어진 자가분해의 경우 역시 D-형의 단량체만을 생산할 것임에는 틀림이 없으나, 이를 확인하기 위해 정제분말을 증류수에 용해시켜 광회전(optical rotation)을 측정하였다. 측정된 값은 -24.7°로 시바(Seebach) 등이 보고한[참조: Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, (1992)] 값과 일치하여, 생산된 (D)-3-하이드록시부탄산이 광학적으로 순수함을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 다양한 미생물을 이용하여 그 균체 내에 고농도로 생산ㆍ축적된 다양한 PHAs를 자가분해시킴으로써 각종 광학활성이 있는 (D)-하이드록시카르복실산을 용이하게 생산할 수 있으며, 생산된 단량체들은 LC나 HPLC를 이용하여 쉽게 분리ㆍ정제할 수 있다. 아울러, 순수분리된 (D)-하이드록시카르복실산은 용매추출에 의한 불순물 제거와 건조 단계를 추가로 거침으로써 정제 및 분말 제재화된다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 고효율이면서도 단순한 공정만으로 광학활성이 있는 (D)-하이드록시카르복실산을 순수하게 생산할 수 있어 경제적이며, 종래 제조방법에서 필수적으로 다량 사용되던 유기용매의 양을 크게 줄일 수 있어, 환경 보호 차원에서도 일조하게 된다.
Claims (24)
- 세포내 폴리하이드록시알칸산 분해효소(intracellular polyhydroxyalkanoate depolymerase)의 활성도가 있는 미생물의 비양에 의해 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoates)을 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충액의 분해용액에 방치하여 폴리하이드록시알칸산을 자가분해시킴으로써, 광학 활성을 갖는 그의 단량체 (D)-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids)의 제조방법.
- 제1항에서 광학활성을 갖는 단량체 (D)-하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acids)을 제조한 다음, 액체크로마토그래피(LC)나 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 전기 단량체의 분리공정을 추가로 포함하는, (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에서 순수분리된 광학활성을 갖는 단량체 (D)-하이드록시카르복실산을 용매추출에 의한 불순물 제거 및 건조시키는 정제 및 분말 제재화 공정을 추가로 포함하는, (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제2항에 있어서, LC나 HPLC는 유기산 분리 컬럼을 채용하고, pH 범위가 1~3인 산성 수용액을 유동상으로 사용하는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 정제 및 분말 제재화 공정은 순수분리된 (D)-하이드록시카르복실산 함유 용액에 강염기를 첨가하여 pH 9 이상의 염기영역으로 조정한 다음, 유기용매를 사용한 추출에 의해 불순물을 제거하고 건조시키는 공정만으로 구성되는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 강염기로 수산화나트륨을 사용하여 pH 11로 조정한 다음, 클로로포름을 첨가하여 유기상으로 추출된 불순물을 제거한 후, 수용상을 건조기(drying oven)에서 건조시키는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 고농도의 폴리하이드록시알칸산을 자가분해하여 그의 단량체를 고농도로 생산하는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 폴리하이드록시알칸산의 자가분해시 부산물로 생성되는 이량체를 염기성 조건에서 가열 분해함으로써 단량체 생산 수율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 미생물은 Achromobacter 속 미생물들, Acidovorax delafieldii, Acidovax facilis, Acinetobacter 속 미생물들, Actinomyces sp., Alcaligenes 속 미생물들, Alteromonas macleodii, Amoebobacter 속 미생물들, Aphanocapa sp., Aphanothece sp., Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Azospirillum 속 미생물들, Azotobacter 속 미생물들, Bacillus 속 미생물들, Beggiatoa 속 미생물들, Beijerinckia 속 미생물들, Beneckea 속 미생물들, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophamon latum, Caulobacter 속 미생물들, Chloroflexus aurantiacus, Chlorogloea 속 미생물들, Chromatium 속 미생물들, Chromobacterium 속 미생물들, Clostridium 속 미생물들, Comamonas 속 미생물들, Corynebacterium 속 미생물들, Derxia 속 미생물들, Desulfococcus multivorans, Desulfonema 속 미생물들, Desulfosacina variabilis, Desulfovibrio sapovorans, Ectothiorhodospira 속 미생물들, Ferrobacillus ferroxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Halobacterium 속 미생물들, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga 속 미생물들, Hyphomicrobium 속 미생물들, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus, Lamprocystis reseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Methylobacterium 속 미생물들, Methylococcus thermophilus, methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylosinus 속 미생물들, Methylovibrio soehngenii, Micrococcus 속 미생물들, Mycobacterium 속 미생물들, Nitrobacter 속 미생물들, Nocardia 속 미생물들, Paracoccus dentrificans, Oscillatoria limosa, Penicillium cyclopium, Photobacterium 속 미생물들, Physarum polycephalum, Pseudomonas 속 미생물들, Ralstonia 속 미생물들, Rhizobium 속 미생물들, Rhodobacillus 속 미생물들, Rhodobacter속 미생물들, Rhodococcus 속 미생물들, Rhodocyclus 속 미생물들, Rhodomicrobium vannielii, Rhodopseudomonas 속 미생물들, Rhodospirillum 속 미생물들, Sphingomonas paucimobilis, Spirillum 속 미생물들, Spirulina 속 미생물들, Staphylococcus 속 미생물들, Stella 속 미생물들, Streptomyces 속 미생물들, Syntrophomonas wolfei, Thiobacillus 속 미생물들, Thiocapsa 속 미생물들, Thiocystis violacea, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthomonas maltophilia 및 Zoogloea 속 미생물들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 단량체는 3-하이드록시프로피온산(hydroxypropionic acid), 3-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(hydroxvalerate), 3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(hydroxynonoic acid), 3-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시부탄산(hydroxybutyrate), 4-하이드록시발레르산(hydroxvaleric acid),4-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(hydroxvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-펜탄산(pentenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-trans-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-cis-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-헥센산(hexenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-trans-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-옥텐산(octenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-노넨산(nonenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-데센산(decenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-cis-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5,8-cis-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸발레르산(methylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸헥산산(methylhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸헵산산(methylheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸옥탄산(methyloctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-메틸노난산(methylnonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-메틸데칸산(methyldecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-메틸-6-옥텐산(octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산(hydroxysuccinic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시아디핀산(hydroxyadipinic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시아젤라인산(hydroxyazelaic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-메틸 에스테르, 3-하이드록시스베린산(hydroxysuberic acid)-에틸 에스테르, -하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-에틸 에스테르, 3-하이드록시피메린산(hydroxypimelic acid)-프로필 에스테르, 3-하이드록시세바신산(hydroxysebacic acid)-벤질 에스테르, 3-하이드록시(hydroxy)-8-아세톡시옥탄산(acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-아세톡시노난산(acetoxynonanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 페녹시(phenoxy)-3-하이드록시옥탄산(hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시부탄산(hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시발레르산(hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시(cyanophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시(nitrophenoxy)-3-하이드록시헥산산(hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-페닐발레르산(phenylvaleric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-5-시클로헥실부탄산(cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시(dihydroxy)5-cis-테트라데센산(tetradecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-4,5-에폭시데칸산(epoxydecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6,7-에폭시도데칸산(epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8,9-에폭시(epoxy)-5,6-cis-테트라데칸산(tetradecanoic acid), 7-시아노(cyano)-3-하이드록시헵탄산(hydroxyheptanoic acid), 9-시아노(cyano)-3-하이드록시노난산(hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-7-플루오로헵탄산(fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-9-플루오로노난산(fluorononanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-클로로헥산산(chlorohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-클로로옥탄산(chlorooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-6-브로모헥산산(bromohexanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-8-브로모옥탄산(bromooctanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-11-브로모운데칸산(bromodecanoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-부텐산(butenoic acid), 6-하이드록시(hydroxy)-3-도데센산(dodecenoic acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸부탄산(methylbutyric acid), 3-하이드록시(hydroxy)-2-메틸발레르산(methylvaleric acid) 및 3-하이드록시(hydroxy)-2,6-디메틸-5-헵탄산(heptenoic acid)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 미생물 Alcaligenes latus의 배양에 의해 PHB(Poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~11)에서 4~55℃ 온도로 30분~10시간 방치하는 자가분해에 의한 단량체 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 미생물 Alcaligenes latus를 pH 2~5의 분해용액에서 37℃ 온도로 반응시키는 것을 특징으로 하는 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 미생물 Alcaligenes latus의 배양에 의해 공중합체 폴리-3-하이드록시부탄산-co-4-하이드록시부탄산(poly-3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)을 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 7이하)에서 30~40℃ 온도로 30분~10시간 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산 및 4-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 제13항에 있어서, 미생물 Alcaligenes latus를 pH 2~5의 분해용액에서 37℃ 온도로 반응시키는 것을 특징으로 하는 (D)-3-하이드록시부탄산 및 4-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 미생물 Alcaligenes eutrophus의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 20시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 미생물 Alcaligenes eutrophus의 배양에 의해 공중합체 폴리-3-하이드록시부탄산-co-3-하이드록시발레르산(poly-3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxyvalerate)을 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 20시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산 및 (D)-3-하이드록시발레르산의 제조방법.
- 미생물 Corynebacterium sp.의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 5~9)에서 30~40℃ 온도로 2~30시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 미생물 Bacillus sp.의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 10시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 혐기성 메탄 자화균 Methylosinus trichosporium의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 10시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 혐기성 광합성 세균 Rhodospirillum rubrum의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 10시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 과당 이용 균주 Alcaligenes eutrophus H16의 배양에 의해 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 20시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
- 미생물 Pseudomonas oleovorans 또는 Pseudomonas aeruginosa의 배양에 의해 PHA(polyhydroxyalkanoates)를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 10시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 탄소수 6~14의 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- PHA(polyhydroxyalkanoates) 합성 유전자를 가진 재조합 균주의 배양에 의해 PHA를 생산ㆍ축적한 다음, 그 균체를 물, 염 수용액 또는 완충용액의 분해용액(pH 2~12)에서 30~40℃ 온도로 20시간 이상 방치하는 자가분해에 의한 (D)-하이드록시카르복실산의 제조방법.
- 제23항에 있어서, 재조합 균주는 Alcaligenes eutrophus의 PHA 합성 유전자를 가진 재조합 Alcaligenes eutrophus인 것을 특징으로 하는 (D)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
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