KR20010100207A

KR20010100207A - 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신의제조방법

Info

Publication number: KR20010100207A
Application number: KR1020000013301A
Authority: KR
Inventors: 강성구; 정성오; 김현수; 이진호; 김정환; 황수연; 이재철; 이병춘; 이재흥
Original assignee: 손 경 식; 제일제당주식회사
Priority date: 2000-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2001-11-14
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: KR100330705B1

Abstract

본 발명은 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) CJMPA122(KFCC-11136) 및 그를 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이노신을 고농도·고수율로 제조할 수 있다.

Description

이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신의 제조방법{Inosine-producing microorganism and method for preparing inosine using the same}

본 발명은 이노신(inosine)을 생산하는 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 배양액중에 이노신을 고농도로 축적시키는, 코리네박테리움(종전에는, 브레비박테리움(Brevibacterium)) 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872의 변이주 CS1019753(KFCC 10814; 대한민국특허 제 127853 호)로부터 유래된 변이주 CJMPA122(KFCC-11136)에 관한 것이다.

이노신은 정미성 조미료로 각광받고 있는 이노신산(5'-inosinic acid)의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이다. 또한, 이노신은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로서 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 지닐 뿐 아니라, 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에서 사용되고 있다. 이러한 이노신을 미생물을 이용한 직접 발효법(direct fermentation)에 의해 고농도·고수율로 생산하기 위해서는, 배양액중에 이노신을 고농도로 축적시킬수 있는 균주의 개발이 매우 중요한 과제이다.

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용한 직접 발효법에 의해 이노신을 고농도·고수율로 생산해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과, 본 발명에 따른 균주가 상기 목적에 부합함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배양액중에 이노신을 고농도로 축적시키는 신규한 변이주 및 상기 변이주를 배양하여 이노신을 고농도·고수율로 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJMPA122(KFCC-11136)를 제공한다. 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJMPA122는 아데닌(adenine) 및 바이오틴(biotin) 요구성, 및 구아닌(guanine) 또는 크산틴(xanthine) 누출형 변이주(leaky mutant)이고, 150㎍/㎖의 아자세린(azaserine)에 대해 내성을 갖는다. 또한, 라이소자임(lysozyme)에 의한 최저 생육억제농도가 8㎍/㎖이고, 3500㎍/㎖의 디하이드로프롤린(3,4-dehydro-DL-proline)에서 생육가능하다. 또한, 600㎍/㎖ 이상의 머캅토구아닌(6-mercaptopurine)에서 생육가능하고, 1200㎍/㎖ 이상의 머캅토퓨린(6-mercaptopurine)에서 생육가능하며, 300㎍/㎖ 이상의 아자아데닌(8-azaadenine)에서 생육가능한 특성을 갖는다.

둘째, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 제조하는방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

대한민국 특허 제 127853 호의 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스CS1019753(KFCC 10814)는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 변이주로서, ⅰ) 종래의 이노신산을 생산하는 아데닌 누출형 변이주[Agr. Bio. Chem., Vol; 47(5), p1035-1041, 1983, (KY13102, KY13171, KY13184 등)] 또는 아데닌 및 크산틴 또는 구아닌 동시요구성 균주와 달리, 아데닌을 요구하는 반면, 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 이들을 첨가함으로써 생육이 촉진되고, ⅱ) 우레아(urea)를 자화할 수 있는 우레아제(urease)가 결손되어 있으며, ⅲ) 세포내에 생성된 대량의 이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성능력이 부분적으로 결손된 것으로 여겨지는, 세포벽 분해효소인 라이소자임에 대해 높은 감수성을 갖고, ⅳ) 배양과정에서 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원에 의해, 또는 배양 후반에 배양액내에 축적되는 이노신산에 의해, 균체 외부의 삼투압이 증가하여 이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성이 저해됨으로 인해 균체 성장이 둔화되고 이노신산 생성이 저하되는 것을 방지할 수 있는, 삼투압 내성 형질이 부여된 균주이다.

본 발명에 따른 균주는 코리네박테리움 암모니아게네스 CS1019753 균주에 대해 퓨린(purine)계 생합성 시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(L-glutamine)의 유사체(analogue)인 아자세린 내성을 부여하여 이노신을 대량 생성하도록, 이노신산 생산균주로부터 이노신 생산 균주로 대사 전이(metabolic flow change)를 일으켰다. 즉, 퓨린 생합성에 있어 글루타민의 적절한 공급이 속도 조절단계 역할을 하는 점에 착안하여, 상기 CS1019753 균주에 글루타민의 유사체인 아자세린 내성을 부여하여 대사 전이를 일으킨 것이다. 대사 전이가 이루어진 원인은 일반적으로 퓨린계 생합성에서 생성된 이노신은 하이포크산틴(hypoxanthine)으로 쉽게 분해되는데, 본 발명에 따른 균주에서는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase)의 효소 역가가 저하되어 생성된 이노신이 세포내에 대량으로 축적될 수 있기 때문이다. 본 발명의 배지(주 2)에서 아자세린에 대한 균주의 내성을 측정한 결과, 기존의 균주 CS1019753는 25㎍/㎖ 이하의 아자세린에서 내성을 갖고 그 이상의 농도에서는 성장이 일어나지 않은 반면, 본 발명의 균주 CJMPA122는 150㎍/㎖의 아자세린에서도 성장함을 알 수 있다.

본 발명에서는 이렇게 대사 전이가 일어난 미생물에 구아닌 유사체인 머캅토구아닌 내성을 부여한후, 퓨린 유사체인 머캅토퓨린 내성을 부여하고, 균주 생육을 위한 필수요소인 아데닌에 의해 이노신 생성이 저해되는 것을 방지하기 위하여, 아데닌 유사체인 아자아데닌 내성을 부여함으로써, 고농도의 이노신을 생산하는 균주를 개발한다.

본 발명에 따르면, 먼저 코리네박테리움 암모니아게네스 CS1019753를 친주로 하여 X선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanine), 디에틸설파이드(diethyl sulfide), 에틸아민(ethyl amine) 등의 화학적 돌연변이원으로 처리한후, 아자세린이 각각 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 및 200㎍/㎖으로 함유된 배지(주 5)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니(colony)를얻는다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후, 종배지(주 3)에서 24시간 배양한다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후, 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 CJAZ101 균주를 선별한다.

다음으로, 머캅토구아닌 내성을 갖는 균주를 얻기 위하여, CJAZ101 균주를 친주로 하여 화학적 돌연변이원을 사용하여 돌연변이를 일으킨후, 머캅토구아닌이 각각 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 600㎍/㎖, 800㎍/㎖ 및 1000㎍/㎖으로 함유된 배지(주 6)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻는다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양한다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후, 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 CJMG407 균주를 선별한다.

또 다음으로, 머캅토퓨린 내성을 갖는 균주를 얻기 위하여, CJMG407 균주를 친주로 하여 화학적 돌연변이원을 사용하여 돌연변이를 일으킨후, 머캅토퓨린이 각각 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1200㎍/㎖, 1400㎍/㎖ 및 1200㎍/㎖로 함유된 배지(주 7)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻는다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양한다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후, 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 CJMTP611 균주를 선별한다.

최종 단계로, 이노신 발효 배양중 필수요소인 아데닌에 의한 이노신 생성 저해를 감소시키기 위하여, 아데닌 유사체인 아자아데닌 내성을 갖는 균주를 얻고자, CJMTP611 균주를 친주로 하여 화학적 돌연변이원을 사용하여 돌연변이를 일으킨후,아자아데닌이 각각 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖로 함유된 배지(주 8)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻는다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양한다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후, 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 가장 우수한 균주를 선별, 순수 분리하고, 이 균주를 CJMPA122(KFCC-11136)라 명명하였다.

본 발명에 따른 균주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJMPA122는 부다페스트 조약에 의거하여 2000년 1월 29일자로 한국종균협회에 기탁하여, 수탁번호 KFCC-11136을 부여받았다.

(주 1) 영양배지: 펩톤 1, 육즙 1, 염화나트륨 0.25, 효모엑기스 1, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 한천 2, pH 7.2

(주 2) 최소배지: 포도당 2, 황산암모늄 0.3, 인산제1칼륨 0.1, 인산제2칼륨 0.3, 황산마그네슘 0.03, 염화칼슘 10mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 황산아연 1mg/ℓ, 황산망간 3mg/ℓ, L-시스테인 20mg/ℓ, 칼슘판토테네이트 10mg/ℓ, 티아민염산염 5mg/ℓ, 바이오틴 30㎍/㎖, 아데닌 20mg/ℓ, 구아닌 20mg/ℓ, 한천 2, pH 7.2

(주 3) 종배지: 포도당 2, 펩톤 1, 육즙 1, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.2

(주 4) 발효배지: 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘 1.2, 염화칼슘 0.01, 황산철 20mg/ℓ, 황산망간 20mg/ℓ, 황산아연 20mg/ℓ, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6되게 첨가함.

(주 5) 아자세린 첨가배지: (주 2)배지에 아자세린을 25, 50, 100, 150, 200mg/ℓ로 첨가한 배지.

(주 6) 머캅토구아닌 첨가배지: (주 2)배지에 머캅토구아닌을 200, 400, 600, 800mg/ℓ로 첨가한 배지.

(주 7) 머캅토퓨린 첨가배지: (주 2)배지에 머캅토퓨린을 200, 400, 800, 1200, 1400mg/ℓ로 첨가한 배지.

(주 8) 아자아데닌 첨가배지: (주 2)배지에 아자아데닌을 100, 200, 300, 400, 500mg/ℓ로 첨가한 배지.

본 발명의 변이주 코리네박테리움 암모니아게네스 CJMPA122의 생화학적 특성은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

CJMPA122 균주의 특성

특 성	CS1019753	CJMPA122
아데닌	요구성	요구성
구아닌(크산틴)	누출형	누출형
바이오틴	요구성	요구성
라이소자임 감수성(최저생육 억제농도)	8㎍/㎖	8㎍/㎖
3,4-디하이드로프롤린 내성	3500㎍/㎖	3500㎍/㎖
아자세린 내성	25㎍/㎖	150㎍/㎖
머캅토구아닌 내성	50㎍/㎖	600㎍/㎖
머캅토퓨린 내성	200㎍/㎖	1200㎍/㎖
아자아데닌 내성	50㎍/㎖	300㎍/㎖

본 발명에서 사용되는 이노신을 생산하기 위한 배양방법은 하기와 같다.

코리네박테리움속에 속하며 이노신을 생산할 수 있는 미생물들을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지중에서 호기성 조건하에 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다. 탄소원으로서는 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용되고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤(peptone), NZ-아민, 육류추출물, 효모추출물, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등의 유기질소원이 사용된다. 무기 화합물로는 인산제1수소칼륨, 인산제2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 염화칼슘 등이 사용된다. 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가된다. 배양은 호기적 조건하에 진탕 배양 또는 통기교반 배양에 의해 25∼35℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양 동안 중성 부근에서 유지되는 것이 바람직하며, 배양기간은 3∼4일간으로 한다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 아자세린 내성주 CJAZ101의 분리

본 발명의 변이주를 개발하기 위한 첫 단계로서, 코리네박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC-10814)을 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(citrate bufer, pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시켰다. N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도 20∼50㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30∼32℃에서 20∼40분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨후, 3회에 걸쳐 0.85식염수로 세척하였다. 아자세린을 각각 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 및 200㎍/㎖로함유한 아자세린 첨가배지(주 5)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 균주를 내성 농도 150㎍/㎖에서 얻었으며, 이 균주를 CJAZ101이라 명명하였다. 하기 표 2에 아자세린 내성 농도별 균주의 성장정도를 나타내었다.

아자세린 내성 농도별 균주의 성장도

아자세린 농도(㎍/㎖)	0	25	50	100	150	200
CS1019753	+++	+	-	-	-	-
CJAZ101	+++	+++	+++	++	+	-

-; 성장안함

+; 10∼100 콜로니/플레이트, ++; 100~500 콜로니/플레이트, +++; 500 이상 콜로니/플레이트

실시예 2: 머캅토구아닌 내성주 CJMG407의 분리

실시예 1에서 선별한 균주 CJAZ101를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시켰다. 디에틸설파이드를 최종농도 50∼100㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30∼32℃에서 30∼40분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨후, 3회에 걸쳐 0.85식염수로 세척하였다. 머캅토구아닌을 각각 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 600㎍/㎖, 800㎍/㎖ 및 1000㎍/㎖로 함유한 머캅토구아닌 첨가 배지(주 6)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻었다. 머캅토구아닌 내성 농도별 균주 성장정도는 하기 표 3과 같다.

머캅토구아닌 내성 농도별 균주의 성장도

6-MG 농도(㎍/㎖)	0	200	400	600	800	1000
CJAZ101	+++	-	-	-	-	-
CJMG407	+++	+++	++	+	-	-

-; 성장안함

각각의 콜로니를 영양배지(주1)에서 배양한후 종배지(주3)에서 24시간 배양하였다. 발효배지(주4)에서 3∼4일간 배양한후 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 균주를 내성 농도 600㎍/㎖에서 선별하였으며, 이 균주를 CJMG407이라 명명하였다.

실시예 3: 머캅토퓨린 내성주 CJMTP611의 분리

실시예 2에서 선별한 균주 CJMG407를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시켰다. N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도 20∼50㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30∼32℃에서 20∼40분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨후, 3회에 걸쳐 0.85식염수로 세척하였다. 머캅토퓨린을 각각 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖, 1200㎍/㎖ 및 1400㎍/㎖로 함유한 배지(주 7)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻었다. 머캅토퓨린 내성 농도별 균주 성장정도는 하기 표 4와 같다.

머캅토퓨린 내성 농도별 균주의 성장도

6-MTP 농도(㎍/㎖)	0	200	400	800	1200	1400
CJMG407	+++	+	-	-	-	-
CJMTP611	+++	+++	+++	++	+	-

-; 성장안함

+; 10∼100 콜로니/플레이트, ++; 100∼500 콜로니/플레이트 +++; 500 이상 콜로니/플레이트

각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양하여 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 우수한 균주를 내성 농도 1200㎍/㎖에서 선별하였으며, 이 균주를 CJMTP611이라 명명하였다.

실시예 4: 아자아데닌 내성주 CJMPA122의 분리

실시예 3에서 선별한 균주 CJMTP611를 포스페이트 완충액(pH 7.0) 또는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷∼10⁸세포/㎖로 현탁시켰다. N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도 20∼50㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30∼32℃에서 20∼40분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨후, 3회에 걸쳐 0.85식염수로 세척하였다. 아자아데닌을 각각 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 300㎍/㎖, 400㎍/㎖, 500㎍/㎖로 함유한 아자아데닌 첨가배지(주 8)에 적절히 희석한후 도말하여 콜로니를 얻었다. 아자아데닌 내성 농도별 균주 성장정도는 하기 표 5와 같다.

아자아데닌 내성 농도별 균주의 성장도

아자아데닌 농도(㎍/㎖)	0	100	200	300	400	500
CJMTP611	+++	-	-	-	-	-
CJMPA122	+++	+++	++	++	+	-

-; 성장안함

+; 10∼100 콜로니/플레이트, ++; 100∼500 콜로니/플레이트, +++; 500 이상 콜로니/플레이트

각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양한후 종배지(주 3)에서 24시간 배양하였다. 발효배지(주 4)에서 3∼4일간 배양한후 발효 배양액에 축적되는 이노신 생성량이 가장 우수한 균주를 내성 농도 400㎍/㎖에서 선별하였으며, 이 균주를 CJMPA122라 명명하고, 2000년 1월 29일자로 한국종균협회에 기탁하여, 수탁번호 KFCC-11136를 부여받았다.

아자아데닌 내성을 갖는 균주의 배양시 필수요소인 아데닌 첨가에 따른 이노신 생성효과를 나타내면 하기 표 6과 같다.

아데닌 첨가에 따른 아자아데닌 내성 균주의 이노신 생산효과(삼각플라스크 발효)

아데닌 농도(㎎/ℓ)	0	100	200	300	400
CJMTP611(이노신 생성량, g/ℓ)	5.3	7.5	10.1	8.3	6.1
CJMPA122(이노신 생성량, g/ℓ)	5.8	7.6	10.6	11.7	12.4

실시예 5: 삼각플라스크 발효역가 실험

사용 균주: CS1019753, CJAZ101, CJMG407, CJMTP611, CJMPA122

종배지: 포도당 2, 펩톤 1, 육즙 1, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.2

발효배지: 효모엑기스 0.1, 인산제1칼륨 1.5, 인산제2칼륨 2.5, 염화암모늄 1, 황산마그네슘 1.2, 염화칼슘 0.01, 황산철 20mg/ℓ, 황산망간 20mg/ℓ, 황산아연 20mg/ℓ, 바이오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6되게 첨가하였다.

발효방법: 상기 종배지 3㎖을 지름 18mm 시험관에 분주하고 121℃에서 15분간 가압살균하였다. 각각의 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양하였다. 발효배지 40㎖를 500㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 가압살균하였다. 종배양액 3㎖을 접종한후 교반속도 200rpm, 온도 32℃에서 4일간 배양하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같다.

삼각플라스크에서의 이노신 생성 균주 역가 비교

균주	이노신 농도(g/ℓ)
CS1019753	0
CJAZ101	4.3
CJMG407	6.9
CJMTP611	10.1
CJMPA122	10.6

실시예 6: 5ℓ 발효조에서의 발효 역가 실험

사용균주: CJAZ101, CJMG407, CJMTP611, CJMPA122

1단 종배지: 포도당 2, 펩톤 1, 육즙 1, 효모엑기스 1, 염화나트륨 0.25, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, pH 7.2

2단 종배지: 포도당 5, 펩톤 1, 효모엑기스 2, 인산제1칼륨 0.1, 인산제2칼륨 0.1, 황산마그네슘 0.1, 암모늄설페이트 0.5, 아데닌 0.03, 구아닌 0.03, pH 7.2

발효배지: 인산제1칼륨 1, 인산제2칼륨 1, 효모엑기스 0.1, 황산마그네슘 1, 염화칼슘 0.01, 황산철 15mg/㎖, 황산망간 6mg/㎖, 황산아연 1.5mg/㎖, 바이오틴 30㎍/㎖, 티아민염산염 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총 환원당으로 24되게 첨가하였다.

발효방법: 상기 1단 종배지 50㎖을 500㎖ 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 가압살균한후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 1단 종배양액으로 사용하였다.

2단 종배지를 1ℓ 조제하여 2.5ℓ 발효조에 가하고 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. 1단 종배양액을 50㎖ 접종한후 교반속도 800rpm, 온도 32℃, 통기량 0.5v/v/m, pH 7.2에서 24∼30시간 배양하여 2단 종배양으로 사용하였다. 발효배지 1800㎖를 5ℓ 발효조에 가하고 121℃에서 15분간 가압 살균하였다. 종배양액 200㎖를 접종한후 교반속도 700rpm, 온도 32℃, 통기량 1v/v/m, pH 7.2에서 3일간 배양하였다. 또한 발효시 당이 1가 될때 1, 2 및 3차 추가당으로 과당, 포도당을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8되도록 첨가하였다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.

5 ℓ 발효조에서의 이노신 생성 균주 역가 비교

균주	이노신 농도(g/ℓ)
CJAZ101	26.2
CJMG407	35.7
CJMTP611	47.2
CJMPA122	52.3

상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 균주 CJMPA122는 원료 의약품으로 유용한 이노신을 고농도·고수율로 제조할 수 있게 한다. 이렇게 생성된 이노신으로부터 효소 전이반응을 통하여 직접 발효법 보다 고농도·고수율로 이노신산을 경제적으로 제조할 수 있다.

Claims

이노신을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJMPA122(KFCC-11136).
제 1 항에 있어서, 아데닌 및 바이오틴 요구성, 및 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주인 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 150㎍/㎖의 아자세린에 대해 내성을 갖는 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 라이소자임에 의한 최저 생육억제농도가 8㎍/㎖인 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 3500㎍/㎖의 디하이드로프롤린에서 생육가능한 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 600㎍/㎖ 이상의 머캅토구아닌에서 생육가능한 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 1200㎍/㎖ 이상의 머캅토퓨린에서 생육가능한 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항에 있어서, 300㎍/㎖ 이상의 아자아데닌에서 생육가능한 코리네박테리움 CJMPA122.
제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 따른 균주를 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 제조하는 방법.