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KR20010072540A - 헬리코박터 파일로리 （Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）제균성 식음료 제품 - Google Patents

헬리코박터 파일로리 （Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）제균성 식음료 제품 Download PDF

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KR20010072540A
KR20010072540A KR1020007007294A KR20007007294A KR20010072540A KR 20010072540 A KR20010072540 A KR 20010072540A KR 1020007007294 A KR1020007007294 A KR 1020007007294A KR 20007007294 A KR20007007294 A KR 20007007294A KR 20010072540 A KR20010072540 A KR 20010072540A
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히라따하루히사
고가야스히로
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마키타 키요아키
와카모토 세이야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 유효 성분으로서 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)에 대하여 고도의 살균력을 갖는 락토바실루스 가쎄리 (Lactobacillus gasseri) OLL 2716 (FERM BP-6999)을 포함하는, 에이치. 파일로리 제균성 및/또는 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호성을 갖는 식음료 제품에 관한 것이다. 본 락트산 박테리아를 사용하여 제조되는 식음료 제품, 예를 들어 산성 우유 등은 에이치. 파일로리 제균성 및/또는 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호성을 갖는 식음료 제품으로서 장기간 섭취하기에 적합하다.

Description

헬리코박터 파일로리 （Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）제균성 식음료 제품{FOOD OR DRINK PRODUCT WITH A DISINFECTION PROPERTY OF HELICOBACTER PYLORI}
에이치. 파일로리가 위에서 생육하는 박테리아로서 Warren 등에 의해 1983년에 발견되었는데 [Lancet, I. 1273 (1983)], 만성 위염, 위궤양 및 십이지장궤양과의 관계에 대해 초점이 맞추어졌다. 최근에, 발암물질의 투여 없이, 에이치. 파일로리에 의해 감염된 몽골 게르빌루스쥐에서 위장관 암이 발생한다는 것이 입증되었으며 (Watanabe 등의 문헌 [Gastroenterology, 115; 642 (1988)], 에이치. 파일로리가 위암에 있어서 그의 한 병인학적 박테리아로 관련성이 있음이 제안되었다.
한편, 소화성 궤양에 걸린 에이치. 파일로리 양성 환자에 있어서, 에이치. 파일로리를 살균하면, 소화성 궤양의 재발을 억제할 수 있음이 더욱 더 알려지고있으며, 따라서, 에이치. 파일로리의 능동 살균 요법이 유럽 국가 및 미국에서 실시되고 있다. 에이치. 파일로리의 살균 방법에 있어서, 항생제 (β-락탐, 아미노글리코사이드, 마크로라이드, 테트라사이클린 등) 및 항궤양제를 배합 사용하는 방법이 일반적인데; 예를 들어 3가지의 약물, 즉 두 유형의 항생제 (클라리쓰로마이신-메트로니다졸 또는 아목시실린) 및 위산 분비를 억제하는 양성자 펌프 억제제 (PPI)의 배합 요법이 임상적으로 실시된다. 그러나, 살균 요법을 목적으로 하는 항생제와 같은 약물의 투여에 있어서 가장 심각한 결점은, 고투여량의 약물의 다중 배합에 의해 내약성 에이치. 파일로리의 출현 빈도수가 증가하고, 설사 및 알러지 등과 같은 심각한 부작용이 나타난다는 것이다.
위의 에이치. 파일로리를 항생제 대신 살균할 목적으로, 락토페린을 투여하는 것을 포함하는 방법 (일본 특허 공개 공보 제130164/1998호), 항원으로서 에이치. 파일로리의 편모 및 우레아제를 사용하여 닭을 면역화함으로써 회수되는 특정 항원을 사용하는 방법 (일본 특허 공개 공보 제287585/1998호), 및 락트산 박테리아를 사용하는 방법으로서 특정의 개개의 생육가능한 락토바실루스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및/또는 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius, 일본 특허 공개 공보 제241173/1997호) 및 락토바실루스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus, 일본 특허 공개 공보 제98782/1994호) 박테리아 균주를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관하여 조사되어졌다.
반면, 락트산 박테리아는 바람직한 풍미성 물질을 생성하며, 락트산 및 박테리오신과 같은 항균성 물질을 생성하는 능력을 가지기 때문에, 락트산 박테리아는전세계적으로 발효유 등의 형태의 종래 식품에 있어서 극히 안전한 미생물이다. 따라서, 락트산 박테리아의 항균 작용을 이용한 에이치. 파일로리의 살균법은 부작용이 전혀 발생하지 않는 간단하고 효과적인 방법이라고 말할 수 있다.
그러나, 종래 발명에 있어서, 락트산 박테리아 균주, 특히 락토바실루스 브레비스 및/또는 락토바실루스 살리바리우스 (일본 특허 공개 공보 제241173/1997호)는, 에이치. 파일로리의 표적 부위로서의 위 환경의 특징적인 특성 (저 pH의 환경에 대한 내성)에 대한 고려 없이, 그리고 특성들 (락트산 박테리아 균주의 생존성, 풍미성, 물성)에 대한 주의 없이 상기 락트산 박테리아 균주를 사용함으로써 제조되는 식품, 예를 들어 발효유로서 선택되었다. 또한, 보고서에 의하면, 임상 시험에서 사용된 락토바실루스 아시도필루스는 결과적으로 효과가 없었다 (Bazzoli 등의 문헌 [Gastroenterology, 102, 제4권, A38, (1992)]. 이와는 달리, 일본 특허 공개 공보 제98782/1994호에 개시되어 있는 엘. 아시도필루스 La1 박테리아 균주의 배양 상청액을 사용한 임상 시험 결과는 에이치. 파일로리 살균 가능성은 나타내지만, 상기 효과가 지속될 수 있음을 증명하지는 못하였다 (Michetti 등의 문헌 [Gastroenterology, 108, 제4권, A166, (1995)]. 상기한 바와 같이, 종래의 락트산 박테리아는 현재 에이치. 파일로리 살균을 위한 목적 조성물의 제조를 위하여 더 변형시켜야 할 여지가 있다.
발명이 해결하고자 하는 문제점
항위염 및 항위궤양과 관련하여 에이치. 파일로리의 살균/에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호를 위한 시스템의 확립에 대한 이러한 현재의 산업적 요구 상태에 있어서, 본 발명자들은 안전성 프로파일 및 경구 흡수 관점에서 락트산 박테리아에 대한 주의를 다시한번 환기시키고, 락트산 박테리아를 사용함에 의한 에이치. 파일로리의 살균/에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호를 위한 시스템을 개발하려고 하였다.
더 구체적으로는, 본 발명에 의해 해결하고자 한 문제점은, 에이치. 파일로리의 살균, 및 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호를 목적으로, 위에서 고도의 생존 특성 및 우수한 콜로니화 특성을 가지며, 동물 모델 실험에서 명백한 항-에이치. 파일로리 활성을 가지고, 발효유와 같은 식품에서 사용하기 위한 현저한 특성 (락트산 박테리아 균주의 생존성, 풍미성 및 물성)을 갖는 락트산 박테리아 균주를 선발하고, 락트산 박테리아 균주를 사용하여 매일 섭취가능한 저가의 새로운 식음료 제품을 제공하는 것이다.
본 발명은 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori, 하기에서 때로 에이치. 파일로리로 칭함) 제균성(除菌性), 및/또는 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호에 효과를 갖는 락토바실루스 가쎄리 (Lactobacillus gasseri, 하기에서 때로 엘. 가쎄리로 칭함), 및 상기 락트산 박테리아를 포함하는 식음료 (food or drink) 제품에 관한 것이다.
도 1은 락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 게놈 DNA의 ApaI 절단 패턴 (펄스 필드 전기영동)을 예시한다.
문제를 해결하기 위한 수단
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것이다. 목적하는 락트산 박테리아를 스크리닝하기 위하여, 본 발명자들은 하기 표준을 확립하고, 스크리닝을 위하여 노력하였다. 더 구체적으로는, 본 발명자들은 사람 장으로부터 유래된 다수의 락토바실루스 박테리아 중에서 하기 특성을 갖는 박테리아 균주를 스크리닝하기 위하여 예의연구를 거듭하였다:
1. 위산에 대한 고도의 내성; 2. 저 pH의 조건 하에서의 우수한 생장력; 3. 사람 위암 세포 MKN45 상의 에이치. 파일로리의 고착을 억제하는 고도의 능력; 4. 에이치. 파일로리와의 혼합 배양 동안 에이치. 파일로리의 생장을 억제하는 고도의 능력; 5. 에이치. 파일로리 감염 모델 생쥐에 투여할 경우 에이치. 파일로리를 살균하는 고도의 능력; 및 6. 식품에 이용될 경우의 고도의 생존성, 및 우수한 풍미성 및 탁월한 물성. 본 발명자들은 상기 조건들을 만족시키는 박테리아 균주로서 락토바실루스 가쎄리 균주 OLL 2716을 찾아내었다 (이 박테리아 균주는 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소 (the Agency of Industrial Science and Technology의 the Life Engineering and Industrial Technology Research Institute)에 FERM BP-6999로 수탁됨).
본 박테리아 균주의 세균학적 특헝은 하기와 같다:
A. 형태학적 특성
세포 형태: 간균 (bacillus)
이동성: 무
포자의 존재 유무: 무
그램 염색성: 양성
B. 생리학적 특성 (양성: +; 음성: -; 약간 양성: W)
카탈라제 -
기체 생성 -
15℃에서의 생장 -
글루콘산 동화작용 -
락트산의 광학 회전 DL
호기성 생장 +
C. 탄수화물의 발효 특성 (양성: +; 음성: -; 약간 양성: W)
아라비노스 -
자일로스 -
람노스 -
리보스 -
글루코스 +
만노스 +
프룩토스 +
갈락토스 +
수크로스 +
셀로바이오스 +
락토스 +
트레할로스 +
멜리바이오스 -
라피노스 -
멜레지토스 -
스타치 W
만니톨 -
소르비톨 -
덱스트린 W
D. 유전 특성
DNA에 있어서, 구아닌 (G) + 시토신 (C)의 함량은 36.4%이다. 또한, Tannock 등의 방법 [Microbial. Ecol. Health Dis., 8: 79-84, 1995; Appl. Environ. Microbiol., 62: 4608-4613, (1996)]에 따라, 엘. 가쎄리 OLL 2716을 배양하고, 이 박테리아를 아가로스 플러그에 고정시키고 이어서 용해시키고, 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 (ApaI)으로 절단하고, 펄스-필드 겔 전기영동을 수행하여 (CHEF-DR II BIO-RAD), 도 1에 나타낸 밴드 패턴을 회복하였다. 상기 도면에 있어서, A는 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 나타내고, B는 크기 마커를 나타낸다.
E. 위산 내성
위산 내성 시험을 하기와 같이 수행하였다. 즉, 활성화 하에서 (37℃, 18시간), MRS 브로쓰 (DIFCO)에서 2회 배양하고, 생리 식염수로 2회 헹군 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아 현탁물 1 ml을, 여과살균한 pH 2.0의 인공 위액 [0.2% NaCl, 증류수에 용해시킨 0.35% 펩신 (1:5000)] 9 ml에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 호기적으로 접촉시키고; 그 후 1 ml을 pH 6.5의 인산염 완충액 (67 mM) 9 ml에 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 초기 박테리아의 수와, 인공 위액에 접촉시킨 후의 박테리아의 수를 MRS 아가를 사용하여 세어 생존율을 계산하였다. 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 위산 내성이 사람 장에서 유래한 락토바실루스 박테리아 (150개의 균주) 중에서 가장 높았으며, 다른 박테리아 균주의 위산 내성과 비교했을 때, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 위액 내성이 가장 높았다 (표 1).
여러 락토바실루스 박테리아의 인공 위액에 대한 내성
박테리아 균주 2시간 처리 후의 생존율 (%)
락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 0.53
락토바실루스 아시도필루스 JCM 1132T 0.48
락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 0.018
락토바실루스 살리바리우스 WB 1004 (FERM P-15360) 0.004
락토바실루스 브레비스 WB 1005 (FERM P-15361) 0.18
E. 저pH 조건 하에서의 생장
활성화 하에 MRS 브로쓰에서 2회 배양 (37℃, 18시간)한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 10 ㎕를 변형 MRS 브로쓰 [0.2% NaCl, MRS 브로쓰에 용해시키고, pH를 4.0으로 조절한 0.35% 펩신 (1:5000)] 상에 접종하고, 여기에서 37℃에서 호기적으로 배양하였다. 배양을 시작한지 9시간 후에, 배양 배지의 현탁도 (OD650)을 생장률로서 측정하였다. 그 결과, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716이 저 pH 조건 하에서 가장 큰 생장률을 나타내었다 (표 2).
박테리아 균주 배양 9시간 후의 OD650
락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 0.255
락토바실루스 아시도필루스 JCM 1132T 0.030
락토바실루스 람노수스 GG (ATCC 53103) 0.222
락토바실루스 살리바리우스 JCM 1231 0.116
G. 사람 위암 세포 (MKN45)에 대한 점착력
사람 위암 세포 MKN45에 대한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 및 엘. 아시도필루스 CNCM I-1225의 점착력을, 사람 대장암 세포에 대한 락트산 박테리아의 점착력을조사한 Granato 등의 방법 [Appl. Environ. Microbiol., 65(3), 1071-1077, (1999)]에 따라 조사하였다. MKN45를, 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배양 배지 (RPMI, Nissui Pharmaceuticals 제품) 10 ml을 사용하여 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 긁어 내어 RPMI로 헹구고, 이어서 ml 당 5 x 104개의 세포의 최종 세포 농도로 RPMI로 현탁시키고, 이어서 96웰 마이크로플레이트에 웰 당 0.1 ml로 나누었다. 37℃에서 3일 동안 추가로 배양한 후, 마이크로플레이트에 점착된 MKN45를 pH 6의 0.1 M 인산염 완충액으로 헹구어 MKN45의 단일층을 제조하였다. MRS 브로쓰 (DIFCO 제품)에서 배양한 후 pH 6의 0.1 M 인산염 완충액에 최종 109CFU/ml로 현탁시킨 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 아시도필루스 CNCM I-1225의 현탁물 0.1 ml을 단일층에 첨가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. MKN45의 단일층을 pH 6의 0.1 M 인산염 완충액으로 3회 헹구고; 이어서, 결코 점착되지 않는 락트산 박테리아를 제거하였다. MKN45 상에 점착되는 락트산 박테리아는 그램 염색시키며, 그의 수는 현미경을 사용하여 세었다. 그 결과, MKN45 상에 점착된 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아 수가 엘. 아시도필루스 CNCM I-1225의 수보다 큼을 관찰하였다. 즉, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716은 사람 위암 세포에 대하여 큰 점착력을 가짐이 확인되었다 (표 3).
사람 위암 세포에 대한 락토바실루스 가쎄리 균주 OLL2716의 점착력
MKN45 세포 100개 당 점착 박테리아의 수 (평균 ± 표준 편차)
락토바실루스 가쎄리 OLL2716 560 ± 55**
락토바실루스 아시도필루스 CNCM I-1225 234 ± 30
**: p<0.01 (스튜던트 (Student) t 검정, n=4)
사람 위 환경에서의 위산 내성이 크고, 저 pH 조건 하에서 우수하게 생장하며, 제약 제제 (항위염제, 항궤양제) 또는 식품 (발효유, 액체 형태, 페이스트 형태, 건조 제품)의 형태로 본 박테리아 균주의 생육가능한 박테리아를 투여함으로써 에이치. 파일로리를 살균하고 숙주를 에이치. 파일로리에 의한 감염으로부터 보호함으로써 위염, 또는 위궤양 또는 십이지장 궤양의 개시 또는 재발을 예방할 수 있는 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 선발하였다. 이와 같이, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 항-에이치. 파일로리 활성, 그의 요구르트 생성 특성 (저장 수명, 풍미, 물성), 및 에이치. 파일로리 감염 생쥐 모델에 투여할 경우 에이치. 파일로리 살균에 대한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 효과를 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 기술하지만, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
더 구체적으로는, 본 발명은 에이치. 파일로리 제균성 및/또는 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호성을 가지며, 헬리코박터 파일로리에 대한 고살균력을 갖는 락토바실루스 가쎄리에 속하는 하나 이상의 락트산 박테리아를 포함하는 식품, 락트산 박테리아를 포함하는 물질, 및 그의 가공 제품에 관한 것이다.
락트산 박테리아를 포함하는 물질은 락트산 박테리아의 현탁물; 락트산 박테리아의 배양물 (박테리아, 배양 상청액, 배양 배지 성분을 포함); 락트산 박테리아의 배양물로부터 고체를 버림으로써 제조되는 락트산 박테리아의 액체 배양물; 락트산 박테리아를 발효시킴으로써 제조되는 식음료 제품을 포함하는 락트산 박테리아 발효유, 예를 들어 락트산 박테리아 드링크, 산성 우유 및 요구르트 등을 포함한다.
가공 제품은 락트산 박테리아의 농축물, 락트산 박테리아를 포함하는 물질, 및 발효유; 그의 페이스트 제품; 그의 건조 제품 (분무 건조 제품, 동결 건조 제품, 진공 건조 제품, 드럼 건조 제품 등); 그의 액체 제품; 그의 희석 제품 등을 포함한다. 또한 락트산 박테리아로서, 생육가능한 박테리아, 습식 박테리아, 건조 박테리아 등이 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식음료 제품은 유효 성분으로서 하나 이상의 락트산 박테리아, 그를 포함하는 물질 및 그의 가공 제품을 함유하며, 또한 건강 식품으로서도 유용하다.
유효 성분의 블렌딩 양은 임의적이며, 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 0.0001 내지 10% 범위 이내의 양이 적당하다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나, 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는, 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며; 유효 성분은 안전성 프로필 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다. 생쥐에서 10일 동안 그의 급성 독성 시험을 행한 결과, 실제로 5,000 mg/kg/일의 경구 투여량에서는 어떠한 죽음도 관찰되지 않음이 증명되었다.
유효 성분은 식음료 제품의 형태로 사용될 수 있거나, 통상적인 방법에 의해 다른 식품 재료 및 식품 성분과 배합되어 사용될 수 있다. 유효 성분을 사용하는본 발명의 조성물은 페이스트, 액체 및 현탁물의 형태를 취할 수 있으나, 바람직하게는, 본 발명은 감미제, 사워링제 (sour agent), 비타민 및 기타 드링크제의 제조에 통상 사용되는 여러 성분을 사용함으로써 건강 드링크제로서 제조된다.
본 발명에 따르면, 생육가능한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아는, 예를 들어 주로 요구르트를 포함하여 가공유 (플레인 요구르트, 과일 요구르트, 디저트 요구르트, 드링크 요구르트, 및 빙결 요구르트), 락트산 박테리아 드링크, 분말화 식품, 과립 식품, 페이스트 식품 등의 형태로 섭취될 수 있다. 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716은 이 균주를 하기와 같이 발효유의 제조에 사용할 경우 생산성 (저장 수명, 풍미, 물성) 면에서 특히 탁월하다. 따라서, 발효유의 형태로 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 투여하는 방법이 가장 바람직하다. 발효유의 제조에 있어서, 출발체로서, 락토바실루스, 스트렙토코커스 (Streptococcus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 페디오코커스 (Pediococcus) 속 등의 락트산 박테리아, 비피도박테리움 론굼 (Bifidobacterium longum), 비. 브레베 (B. breve), 비. 인판티스 (B. infantis), 비. 비피덤 (B. bifidum) 등의 비피도박테리아, 및 효소 등을, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716과 함께 사용하는 방법이 효과적이다. 또한, 발효유의 제조를 위한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716은, 원 배양물, 모 (mother) 출발체 및 벌크 출발체를 이 순서대로 연속적으로 제조하는 것을 포함하는 방법에도 사용될 수 있으며, 모 출발체의 제조 공정 없이, 벌크 출발체 또는 제품 제조에 직접 접종되는 더 많은 박테리아 수의 농축 출발체 (빙결 제품 또는 동결건조 제품)로 사용될 수 있다.
시험예 1
사람 위암 세포 (MKN45)에 대한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 점착을 Kabir 등의 방법 [Gut, 41(1); 49-55, (1997)]에 따라 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716으로 억제시켰다.
에이치. 파일로리 균주 CNTC 11637의 형광 표지 박테리아 용액을 제조하기 위하여, 먼저, 약간 호기성의 조건 하에, 5% FCS (태아 송아지 혈청)을 함유하는 브루셀라 (Brucella) 브로쓰 (DIFCO 제품)에서 활성화 하에 (37℃, 72시간) 2회 배양한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637을 PBS로 헹구고, 그 후 세포 형광 표지 키트 PKH-2 (Dai-Nippon Pharmaceuticals, Co. 제품)의 희석제 (Diluent) A에 2.0의 최종 OD650으로 현탁시켰다. 헬리코박터의 배양을 위하여, 약간 호기성의 배양을, 기체 생성 백 Aneropack Helico (Mitsubishi Gas Chemicals, Co. 제품)을 사용하여 수행하였다. 현탁물 1 ml에, 형광 표지 염료 PKH-2 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 15분 동안 반응시키고; 그 후 박테리아를 원심분리 (3,000 rpm, 10분)로 회수하여 행크 (Hank) 균형 염 용액 (HGS)로 헹구고 HGS 1 ml에 현탁시키고; 생성된 용액을 형광 표지 박테리아 용액이라 명명하였다. 이어서, 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 형광 표지 박테리아 용액 (OD650=2.0) 0.1 ml 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아 용액 (OD650=4.0) 0.1 ml을, MKN45 세포 현탁물 (1 x 106개의 세포/ml) 0.8 ml에 동시에 첨가하고, 호기적으로 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 단독의 MKN45 세포 현탁물을 블랭크로서 사용하고 (MKN45 세포 현탁물 0.8 ml + 0.2 ml의 HGS); 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아 용액 대신 HGS를 첨가한 용액을 음성 대조군으로 사용하였다. 진탕 후, 15% 수크로스를 함유하는 둘베코 (Dulbecco) PBS 9 ml [Cell Culture Technique (제6판), Asakura Shoten, 20페이지 (1991)]을 첨가하고, 세포를 원심 분리로 수확하여 (1,000 rpm, 10분) HGS로 헹구고, 원심분리하고 (1,000 rpm, 10분); 그 후, 생성된 세포를 다시 HGS 1 ml에 현탁시키고; 생성된 현탁물 250 ㎕를 형광성 분석을 위한 96웰 마이크로플레이트의 웰에 첨가하고; 형광 강도 (여기 파장 길이: 490 nm, 측정 파장 길이: 530 nm)를 형광성 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
위암 세포에 대한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 단독의 점착률을 100%라고 가정하면, 결과적으로, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716이 첨가된 시스템에서의 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 점착률은 92.8%이며; 따라서, 본 박테리아 균주가 에이치. 파일로리의 위암 세포에 대한 점착을 억제하는 효과를 가짐을 확인하였다.
시험예 2
엘. 가쎄리 균주 OLL 2716에 의한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장 억제 시험에서, 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 활성화 하에 2회 배양하고, 각각 106콜로니 형성 단위 (CFU)/ml 및 105CFU/ml의 최종 농도로 5% FCS를 함유하는 브루셀라 브로쓰 (DIFCO 제품) 200 ml에 접종하여 약간 호기성의 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 생육가능한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 박테리아의 수를, 배양 시작 후 0,24, 및 48시간에 세었다. 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 검출을 위하여, 변형 스키로우 (Skirrow) 배양 배지 [말 혈액 (7%), BHI 아가 (52 g), 트리메토프림 (5 mg/ℓ), 폴리믹신 B (2,500 U/ml), 반코마이신 (10 mg/ℓ), 바시트라신 (5 mg/ℓ), 증류수 (1,000 ml)] (37℃, 7일, 약간 호기성 배양) 및 MRS 아가 (37℃, 48시간, 혐기성 배양)을 각각 사용하였다.
그 결과, 생육가능한 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 박테리아의 수는 단독 배양한지 48시간 후에 약 5배 증가하였으나, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716이 공존하는 경우에는 그의 생육가능한 박테리아의 수가 약 1/10으로 감소하였는데; 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716이 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장을 억제하는 능력을 가짐이 확인되었다 (표 4).
헬리코박터 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장 억제에 대한 락토바실루스 가쎄리 균주 OLL 2716의 효과
박테리아 균주 0 h 24 h 48 h
헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 1.5 x 106 3.3 x 106 7.9 x 106
헬리코박터 파일로리의 생장률 (%) 100 220.0 526.7
락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 2.2 x 105 7.4 x 107 4.5 x 107
헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 1.9 x 106 1.2 x 106 1.8 x 105
헬리코박터 파일로리의 생장률 (%) 100 63.2 9.5
시험예 3
에이치. 파일로리는, 우레아를 분해하여 암모니아를 생성하는 능력을 가지기 때문에, 강산 조건 하에서 생존할 수 있음이 증명되었다. 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716이 우레아의 존재 하에 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장을 억제하는능력을 조사하기 위하여, 저 pH 조건 하에서 본 박테리아 균주 및 락토바실루스 아시도필루스 CNCM I-1225가 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장을 억제하는 효과를 조사하였다. 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 아시도필루스 균주 CNCM I-1225를 활성화 하에 2회 배양하고, 이어서 5% FCS 및 5 mM 우레아를 함유하는 pH 4.0의 브루셀라 브로쓰 200 ml에 각각 최종 105CFU/ml 및 107CFU/ml로 접종하여 약간 호기성 조건 하에 37℃에서 배양하였다. 배양 시작 후 0, 6 및 12시간에 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 아시도필루스 균주 CNCM I-1225의 생육가능한 박테리아의 수를 세었다. 그 결과, 우레아의 존재 하에, 배양 시작 후 6 및 12 시간에서의 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637의 생장을 억제하는 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 능력이 엘. 아시도필루스 균주 CNCM I-1225의 능력보다 큰 것으로 관찰되었다. 즉, 본 박테리아 균주는 우레아의 존재 하에서도 에이치. 파일로리의 생장을 억제하는 능력이 크다는 것을 확인하였다 (표 5).
우레아의 존재 하에 헬리코박터 파일로리의 생장을 억제하는 락토바실루스 가쎄리 OLL 2716의 효과
박테리아 균주 0 h 24 h 48 h
헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 2.0 x 105 2.0 x 105 1.8 x 105
헬리코박터 파일로리의 생장률 (%) 100 100 90.0
락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 1.5 x 107 4.0 x 107 1.2 x 108
헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 2.0 x 105 1.5 x 105 3.0 x 104
헬리코박터 파일로리의 생장률 (%) 100 75.0 15.0
락토바실루스 아시도필루스 CNCM I-1225 1.6 x 107 2.5 x 107 8.9 x 107
헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 2.0 x 105 1.9 x 105 1.0 x 105
헬리코박터 파일로리의 생장률 (%) 100 95.0 50.0
실시예 1
플레인 요구르트를 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 사용하여 제조하였다. 더 구체적으로는, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716, 엘. 불가리쿠스 (L. bulgaricus) JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 (S. thermophilus) ATCC 19258을, 개별적으로 10%의 탈지유 분말의 배양 배지 상에 1%로 접종하여 37℃에서 15시간 동안 배양함으로써 벌크 출발체를 제조하였다. 95℃에서 5분 동안 가열 처리한 요구르트 믹스 (SNF: 9.5%, FAT: 3.0%)에, 엘. 불가리쿠스 JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 ATCC 19258 출발체를 각각 1%, 그리고 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 5% 접종하고; 생성된 접종물을 43℃에서 4시간 동안 발효시켰다. 발효 및 냉각 직후, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716, 엘. 불가리쿠스 JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 ATCC 19258의 생육가능한 박테리아 수는 각각 9.0 x 107CFU/ml, 6.4 x 107CFU/ml, 및 11.0 x 108CFU/ml이었으며, 생성된 요구르트는 모두 풍미 및 물성이 우수하였다. 요구르트를 10℃에서 2주 동안 보관한 후, 엘. 가쎄리 OLL 2716, 엘. 불가리쿠스 JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 ATCC 19258의 생육가능한 박테리아 수는 각각 3.7 x 107CFU/ml, 2.7 x107CFU/ml, 및 10.8 x 108CFU/ml이었으며, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 생육가능한 박테리아의 수는 단지 약간 감소하였다. 보관 제품의 풍미 및 물성은 탁월하였다.
비교예 1
플레인 요구르트를 엘. 살리바리우스 균주 WB1004 (FERM P-15360)을 사용하여 제조하였다. 더 구체적으로는, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 대신 엘. 살리바리우스 균주 WB1004 (FERM P-15360)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 발효 및 냉각 직후, 엘. 살리바리우스 균주 WB1004, 엘. 불가리쿠스 JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 ATCC 19258의 생육가능한 박테리아 수는 각각 5.3 x 107CFU/ml, 6.0 x 107CFU/ml, 및 12.5 x 108CFU/ml이었으며, 생성된 요구르트는 모두 풍미 및 물성이 우수하였다. 요구르트를 10℃에서 2주 동안 보관한 후, 엘. 살리바리우스 균주 WB1004, 엘. 불가리쿠스 JCM 1002T 및 에스. 써모필루스 ATCC 19258의 생육가능한 박테리아 수는 각각 0.1 x 107CFU/ml, 4.5 x 107CFU/ml, 및 8.8 x 108CFU/ml이었으며, 엘. 살리바리우스 균주 WB1004 (FERM P-15360)의 생육가능한 박테리아의 수는 약 1/50으로 감소하였다.
실시예 1 및 비교예 1을 하기 표와 같이 요약할 수 있다.
보관 생육가능한 박테리아의 수 (x 107CFU/ml) 산성도 (%) pH 풍미
OLL2716 WB 1004
실시예 1 보관 전 9.0 0.90 4.42 탁월
2주 3.7 1.11 4.07 우수
비교예 1 보관 전 5.3 0.87 4.40 탁월
2주 0.1 1.20 3.99 강산 맛
시험예 4
에이치. 파일로리 살균에 대한 생육가능한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 살리바리우스 WB1004 (FERM P-15360) 박테리아의 투여 효과를 생체내에서 조사할 목적으로, 에이치. 파일로리 균주 NCTC 11637을 생쥐 1마리 당 1 x 109CFU로 무균 생쥐 (BALB/c)에 감염시키고; 이어서 4주 후에, 1주에는 3회, 그리고 2주 내지 7주에는 주 당 1회씩, 생쥐 1마리 당 1 x 109CFU의 에이치. 파일로리를 감염시킨 생쥐에 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 및 엘. 살리바리우스 균주 WB1004 (FERM P-15360)을 개별적으로 투여하였다. 생육가능한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 살리바리우스 WB1004 (FERM P-15360) 박테리아를 투여한 지 8주 후에, 생쥐 위에서의 에이치. 파일로리의 수, 및 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 또는 엘. 살리바리우스 WB 1004 (FERM P-15360)의 수를, 각각 변형 스키로우 배양 배지 및 MRS 아가에서 세고, 한편, 항-에이치. 파일로리 항체의 혈청 역가치 (492 nm에서의 흡수도)는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 분석하였다.
그 결과, 8주 후, 대조 생쥐 (에이치. 파일로리만을 단독으로 투여)의 위에서의 에이치. 파일로리 수는 105CFU/g으로 검출되었으며, 반면, 생육가능한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 및 엘. 살리바리우스 WB 1004 (FERM P-15360) 박테리아를 투여한 생쥐의 위에서의 에이치. 파일로리의 수는 검출가능한 한계치 이하로 감소하였다 (103CFU/g 이하). 그러나, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 투여한 생쥐의 항-에이치. 파일로리 항체의 역가치는, 대조 생쥐와 비교하여 1/5 이하로 감소하였으며, 또한 엘. 살리바리우스 균주 WB1004 (FERM P-15360)의 항-에이치. 파일로리 항체 역가치와 비교해서는 1/4 이하로 감소하였다 (표 6). 이와 같이, 에이치. 파일로리 살균에 대한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 효과는 엘. 살리바리우스 WB1004 (FERM P-15360)의 효과보다 더 큰 것으로 관찰되었다. 또한, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716은 위에서의 콜로니화 능력을 가지는 것으로 확인되었는데, 이는 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 투여 후 8주에 생쥐에서 투여 박테리아 균주가 106/g 이상으로 검출되었기 때문이다.
위에 콜로니화하는 락토바실루스 박테리아의 수 및 헬리코박터 파일로리 NCTC 11637 살균에 대한 효과
생쥐 위 내용물에서의 박테리아 수 (로그 CFU/g) 항-에이치. 파일로리 항체 역가치 A492
엘. 살리바리우스 엘. 가쎄리 에이치. 파일로리
대조 (N=5, 락트산 박테리아를 투여하지 않음) 검출되지 않음 검출되지 않음 5.2 ± 0.04 0.488 ± 0.284*
엘. 가쎄리 균주 OLL 2716 투여 (N=6) 검출되지 않음 6.1 ± 1.0 <3.0 0.086 ± 0.082*
락토바실루스 살리바리우스 WB 1004 (FERM P-15360) 투여 (N=5) 6.1 ± 0.8 검출되지 않음 <3.0 0.346 ± 0.276
*: P<0.05 (쉐프 (Sheffe) 검정)
시험예 5
사람에 있어서 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 효능을 입증할 목적으로, 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 포함하는 요구르트를 40 내지 60세의 에이치. 파일로리 양성인 대상자 30명에게 투여하였다. 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조한 요구르트 90 g을 8주 동안 일일 2회 제공하였다. 에이치. 파일로리 살균에 대한 효과를 우레아 호흡 (breath) 시험, 혈중 펩시노겐 (I), 펩시노겐 (II) 및 내시경 검사 (6명의 대상자)로 조사하였다.
그 결과, 에이치. 파일로리 살균의 마커로 사용되는 혈중 펩시노겐 (I/II) 비는 30명 중 26명에서 개선되었으며; 우레아 호흡 시험에서는, 28명 중 21명에서 개선되었음이 관찰되었다. 또한, 내시경 검사를 행한 6명의 대상자에서의 위세포에서 에이치. 파일로리 수를 세었는데; 그 결과, 6명의 대상자 모두에서 에이치. 파일로리 수가 투여전의 수의 1/10 내지 1/100으로 감소되었음이 나타났다.
참고예 1
엘. 가쎄리 균주 OLL 2716을 MRS 액체 배양 배지 (DIFCO 제품) 5 리터에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 정상 배양하였다. 배양 종료 후, 배양물을 7,000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켜, 액체 배양물의 1/50 부피의 박테리아 농축물을 회수하였다. 이어서, 박테리아 농축물을, 10 중량%의 탈지유 분말 및 1 중량%의 글루탐산나트륨을 함유하는 동일 부피의 현탁 배지로 혼합시키고, 이어서, pH를 7로 조절하고, 그 후 생성된 혼합물을 동결건조시켰다. 생성된 동결건조 제품을 60메쉬의 체로 미분화하여 동결건조 박테리아 분말을 회수하였다.
참고예 2
문헌 [General Pharmaceutical Preparation Regulation, Guidebook of the Japanese Pharmacopoeia, 제13 개정판]의 "분말" 규정에 따라, 락토스 400 g (JP.에 따라) 및 감자 스타치 600 g (JP.에 따라)을, 상기 실시예에서 회수한 엘. 가쎄리 균주 OLL 2716의 동결건조 박테리아 분말 1 g에 첨가하여 이들을 균질하게 혼합시켜 분말을 제조하였다.
실시예 2
탈지유를 80 내지 85℃에서 20 내지 30분 동안 살균하고, 이어서 균질화하고, 이어서 냉각시켰다. 생성된 균질물에 출발체로서 박테리아 균주 (FERM BP-6999)의 순수 배양물 2 내지 5%를 첨가하고, 이를 37 내지 40℃에서 16시간 동안 발효시켜, 락트산 함량이 2%인 산성 우유 (탈지유 분말의 배양 배지 중 배양물)을 회수하였다. 나타나는 응고유를 파쇄시키면서 산성 우유를 5℃에서 냉각시켜, 이를 산성 우유로 명명하였다.
한편, 적당량의 사워링제, 풍미제 및 염료와, 15% 수크로스를 함유하는 당 용액을 제조하여 균질화하고, 70 내지 80℃에서 20 내지 30분 동안 살균하고, 5℃로 냉각시켜 이를 당 용액으로 명명하였다.
이와 같이 회수한 당 용액 및 산성 우유를 65:35의 비로 함께 혼합시킴으로써 산성 우유 드링크를 회수하였다.
실시예 3
실시예 1에서 회수한 탈지유 분말의 배양 배지 중 본 박테리아 균주의 배양물의 동결건조 생성물 40 g을, 40 g의 비타민 C 또는 40 g의 동량의 비타민 C 및 시트르산의 혼합물, 100 g의 과립화 당, 및 60 g의 동량의 콘 스타치 및 락토스의 혼합물에 첨가하고, 이어서 충분히 블렌딩하였다. 이 혼합물을 패키지에 포장하여, 패키지 하나 당 1.5 g의 스틱형 영양성 건강 식품 패키지 150개를 제조하였다.
참고예 3
하기 조성에 기초하여, 항-궤양제를 제조하였다: (1) 탈지유 분말의 배양 배지 중 박테리아 균주의 배양물의 동결건조 생성물 50 g; (2) 락토스 90 g; (3) 콘 스타치 29 g; 및 (4) 스테아르산마그네슘 1 g.
먼저, (1), (2) 및 (3) (여기에서는 17 g)을 함께 혼합하여 과립화하고, 이와 동시에 (3) (여기에서는 7 g)으로부터 페이스트를 제조하였다. 생성된 과립에 (3) (여기에서는 5 g) 및 (4)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 함께 완전히 혼합하고; 이 혼합물을 가압 정제화 기계로 압축시켜 100개의 정제를 제조하였는데, 각각의 정제는 유효 성분 40 mg을 포함하였다.
본 발명의 잇점
본 발명에 따르면, 부작용 없이, 에이치. 파일로리의 살균 및/또는 에이치. 파일로리에 의한 감염에 대한 보호를 효율적으로 실시할 수 있다. 본 발명의 조성물은 안전성 프로필 면에서 완전히 문제가 없으며, 유제품 및 기타 다양한 식음료 제품의 형태로 자유롭게 제조될 수 있어, 본 조성물은 건강한 사람, 및 유아 및 소아, 노인, 병약자, 및 회복기 환자 등이 장시간 섭취할 수 있으며, 본 조성물은 위염, 위궤양 등에 대하여 특히 탁월한 예방 및/또는 치료 효과를 나타낸다.
법규 규정 제13-2에 따른 수탁 미생물에 대한 참고
1. 락토바실루스 가쎄리 OLL 2716
a. 미생물이 수탁된 수탁 기관의 명칭 및 주소
명칭: 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소
주소: 일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쵸메 1-3 (우편번호: 305-8566)
b. 수탁 기관에의 수탁일: 199년 5월 24일
c. 수탁시 수탁기관에 의해 허여된 접근 번호: FERM BP-6999

Claims (7)

  1. 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 제균성 (除菌性) 및/또는 헬리코박터 파일로리에 의한 감염에 대한 보호성을 가지며, 헬리코박터 파일로리에 대하여 고살균력을 갖는 락토바실루스 가쎄리 (Lactobacillus gasseri)에 속하는 하나 이상의 락트산 박테리아, 락트산 박테리아를 포함하는 물질 및 그의 가공 제품을 포함하는 식음료 (food or drink) 제품.
  2. 헬리코박터 파일로리 제균성 및/또는 헬리코박터 파일로리에 의한 감염에 대한 보호성을 가지며; 경구 투여 조성물로 제조될 경우 헬리코박터 파일로리에 대한 고살균력, 저 pH 환경에 대한 내성 및 고생존성을 갖는 락토바실루스 가쎄리에 속하는 하나 이상의 락트산 박테리아, 상기 락트산 박테리아를 포함하는 물질 및 그의 가공 제품을 포함하는 식음료 제품.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 락트산 박테리아가 락토바실루스 가쎄리 OLL 2716인 식음료 제품.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 락트산 박테리아가 락트산 박테리아의 현탁물, 락트산 박테리아의 배양물, 락트산 박테리아의 액체 배양물, 및 락트산 박테리아로부터의 발효유로부터 선택되는 하나 이상의 것인 식음료 제품.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가공 제품이 농축 제품; 페이스트 제품; 분무 건조 제품, 동결건조 제품, 진공 건조 제품, 및 드럼 건조 제품으로부터 선택된 하나 이상의 건조 제품; 액체 제품; 및 희석 제품으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 식음료 제품.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 건강 식품인 것을 특징으로 하는 식음료 제품.
  7. 락토바실루스 가쎄리 OLL 2716 (FERM BP-6999).
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