KR20010071910A - Glucoamylase variants - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모 균류 글루코아밀라제의 변이체와 관련이 있는데, 그 변이체는 개선된 열 안정성 및/또는 당질 기질을 사용하는데에 증가된 특이활성을 나타낸다.The present invention relates to variants of fungal glucoamylases, wherein the variants exhibit increased specific activity in using improved thermostability and / or glyceral substrates.
Description
글루코아밀라제 (1,4-α디글루칸 글루코하이드로라제, EC 3.2.1.3)는 녹말이나 관련 올리고당과 다당류분자의 비환원 말단으로부터 D-포도당을 분해하는 반응을 촉매하는 효소이다. 글루코아밀라제는 상업적으로 가장 중요한 Aspergillus에서 유래된 것 함께 몇 가지의 사상균과 효모에 의하여 생산된다.Glucoamylase (1,4-alpha diglucan glucuronidase, EC 3.2.1.3) is an enzyme that catalyzes the decomposition of D-glucose from non-reducing ends of starch and related oligosaccharides and polysaccharide molecules. Glucoamylase is produced by several fungi and yeasts, together with those derived from the most commercially important Aspergillus.
상업적으로는 글루코아밀라제 효소는 이미 α-아밀라제에 의해 부분적으로 가수분해된 옥수수 녹말을 포도당으로 전환하는데 사용된다. 포도당은 그후 포도당 이성화효소에 의하여 거의 동량의 포도당과 과당으로 구성된 혼합물로 전환된다. 이 혼합물 또는 과당이 더욱 농축된 혼합물은 전세계적으로 상업화된 고과당 옥수수 시럽으로 보통 사용된다. 이 시럽은 세계에서 효소공정에 의해 생산되는 가장 큰 규모의 생산물이다. 녹말을 과당으로 전환시키는데 관여하는 세 가지 효소는 생산되는 산업 효소중 가장 중요한 효소의 하나이다.Commercially, the glucoamylase enzyme is used to convert corn starch, which has already been partially hydrolyzed by? -Amylase, to glucose. Glucose is then converted by the glucose isomerase into a mixture of approximately equal amounts of glucose and fructose. This mixture or a more concentrated mixture of fructose is commonly used as high fructose corn syrup commercialized worldwide. This syrup is the largest product produced by the enzyme process in the world. Three enzymes involved in the conversion of starch to fructose are one of the most important enzymes in industrial production.
고과당 옥수수 시럽 생산에서 그루코아밀라아베를 상업적으로 사용하는데 존재하는 주요 문제점 중의 하나는 글루코아밀라제의 상대적으로 낮은 열 안정성이다. 글루코아밀라제는 α- 아밀라제나 포도당 이성화효소처럼 열적으로 안정하지 않고 α-아밀라제 또는 포도당 이성화효소보다 낮은 pH에서 가장 활성이 높고 안정하다. 따라서, 글루코아밀라제는 별개의 용기에서 더 낮은 온도와 pH에서 사용하여야 한다.One of the major problems existing in commercial use of glucoamylase in the production of high fructose corn syrup is the relatively low thermal stability of glucoamylase. Glucoamylase is not thermally stable, like α-amylase or glucose isomerase, and is most active and stable at lower pH than α-amylase or glucose isomerase. Therefore, glucoamylase should be used at lower temperature and pH in separate containers.
Aspergillus niger의 글루코아밀라제는 길게 그리고 많이 O-그루코실화된 링커에 의하여 분리된 1개의 촉매활성도메인(aa 1-440)과 녹말부착도메인(aa 509-616)을 가진다(Svensson et al. (1983),Carlsberg Res. Commun. 48, 529-544, 1983 및 (1986), Eur.J.Bioche. 154, 497-502). Aspergillus awamori 변이체X100에서 유래한 글루코아밀라제의 촉매활성도메인는 6개의 보존된 α→α 고리 단편이 바깥쪽 및 안쪽 베럴을 연결하는 (α/α)6-폴드를 채택하고 있다.(Aleshin et al. (1992), J. biol.Chem. 267, 19291-19298). 1-디옥시노지리마이신(deoxyjirimycin)과 복합체를 이룬 글루코아밀라제의 결정구조 (Harris et al. (1993), Biochemistry, 32, 1618-1626)와 슈도테트라사카라이드 저해제인 아카아르보오즈(acarbose)와 D-글루코 D-하이드로아카르보즈(D-gluco- dihydroacarbose)와 복합체를 이룬 글루코아밀라제의 결정구조 (Aleshin et al. (1996), Biochemistry, 35, 8319-8328)는 , 더 나아가 일반산과 일반염기로 작용하는 글루탐산 179와 400과 각각 양립가능하다. 이 잔기의 촉매반응중의 중심적 역할은 단백질공학을 사용하여 연구된 바있다(Sterks et al.(1990), Protein Engng. 3, 193-198; Frandsen et al.(1994), Biochemistry, 33, 13808-13816). 4개의 글리코실 잔기 부착도메인인 -1, +1, +2, 및 +3에서의 글루코아밀라제-탄수화물 상호작용은 글루코아밀라제 복합체 구조에서 두드러지고(Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319-8328), 부착과 촉매반응에 중요한 잔기은 활성분석과 연계된 특정부위 돌연변이를 사용하여 광범위하게 연구되었다(Sierks et al. (1989), Protein Engng 2, 621-625; Sierks et al. (1990), Protein Engng.3, 193-198; Berland et al. (1995), Biochemistry, 34, 10153-10161; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10162-10169).Glucoamylase of Aspergillus niger has one catalytic activity domain (aa 1-440) and a starch attachment domain (aa 509-616) separated by a long and highly O-glucosylated linker (Svensson et al. (1983 , Carlsberg Res. Commun., 48, 529-544, 1983 and (1986), Eur. J. Bioche., 154, 497-502). The catalytic domain of glucoamylase derived from Aspergillus awamori mutant X100 adopts (α / α) 6 -folds in which six conserved α → α ring fragments connect the outer and inner barrels (Aleshin et al. 1992), J. Biol. Chem. 267, 19291-19298). The crystal structure of glucoamylase complexed with 1-deoxyjirimycin (Harris et al. (1993), Biochemistry, 32, 1618-1626) and acarbose, a pseudotetrasaccharide inhibitor, The crystal structure of glucoamylase complexed with D-gluco-dihydroacarbose (Aleshin et al. (1996), Biochemistry, 35, 8319-8328) Are compatible with glutamic acid 179 and 400, respectively. The central role of this residue in catalytic reactions has been studied using protein engineering (Sterks et al. (1990), Protein Engng., 193-198; Frandsen et al. (1994), Biochemistry, 33, 13808 -13816). Glucoamylase-carbohydrate interactions at the four glycosyl residue attachment domains -1, +1, +2, and +3 are prominent in the glucoamylase complex structure (Aleshin et al. (1996), Biochemistry 35, 8319- 8328), important residues in attachment and catalytic reactions have been extensively studied using specific site mutations associated with activity assays (Sierks et al. (1989), Protein Engng 2, 621-625; Sierks et al. (1995), Biochemistry, 34, 10153-10161; Frandsen et al. (1995), Biochemistry, 34, 10162-10169).
열안정성을 증가시키기 위한 Aspergillus niger 글루코아밀라제의 다양한 치환이 기술되었다:Various substitutions of Aspergillus niger glucoamylase to increase thermal stability have been described:
i) α-나선형 글리신의 치환: G137A와 G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); ii) 손상되기 쉬운 Asp-X 펩티드결합의 제거, D257E와 D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); iii) N182에서 탈아미노화의 방지(Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); iv) 추가적 이황화결합의 조작,A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); v) A435와 A436자리에 프롤린 잔기의 도입 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). 더 나아가 Clark Ford는 ENZIME ENGINEERING 14지(1997. 10. 17판) 및 Beijing/China지 (1997년 10월 12-17일판, 요약서 번호:Abstract book p.0-61)에 이를 발표하였다. 이 요약서는 열안정성을 개선하기 위한 Aspergillus awamori 글루코아밀라제의 G137A, N20C/A27C,및 S30P위치의 돌연변이을 제시하고 있다.i) Substitution of alpha-helical glycine: G137A and G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); ii) Elimination of impaired Asp-X peptide bonds, D257E and D293E / Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); iii) Prevention of deamidation in N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); iv) manipulation of additional disulfide bonds, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); v) introduction of proline residues at the A435 and A436 sites (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). Furthermore, Clark Ford has published in ENZIME ENGINEERING 14 (Oct. 17, 1997) and Beijing / China (Oct. 12-17, 1997, Abstract book p.0-61). This summary presents mutations in the G137A, N20C / A27C, and S30P positions of Aspergillus awamori glucoamylase to improve thermal stability.
글루코아밀라제에 관한 추가 정보는 인터넷 홈페이지 (http://www.public.iastate.edu/~pedro/glase/glase.html)에서 찾아볼 수 있다 . Pedro M. Coutinho에 의하여 작성된 "글루코아밀라제 www 페이지" (1997.10.8 마지막 수정)는 Aspergillus 주로부터 유래하는 글루코아미라제를 포함하는 글루코아밀라제에 관한 정보를 개시하고 있다. Aspergillus niger 글루코아밀라제의 화학적인 변이와 특정부위 변이가 열거되어 있다.Additional information on glucoamylase can be found on the Internet at http://www.public.iastate.edu/~pedro/glase/glase.html. The "Glucoamylase www page" (last revised Oct. 8, 1997) by Pedro M. Coutinho discloses information about glucoamylase including glucoamylase derived from Aspergillus. Aspergillus niger Chemical shifts and specific site mutations of glucoamylase are listed.
본 발명은 특히 개선된 열 안정성 및/또는 특이활성, 예를 들어 녹말전환, 예를 들면 녹말로부터 포도당의 생산에 적합한 증가된 특이활성을 지닌 모 AEG의 신규한 글루코아밀라제 변이체(돌연변이체)에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 글루코아밀라제 효소의 변이체와 이런 변이체 효소의 사용에 관련된다.The present invention relates in particular to novel glucoamylase variants (mutants) of parental AEG with improved thermal stability and / or specific activity, for example increased starch conversion, for example, suitable for the production of glucose from starch do. More specifically, the present invention relates to variants of glucoamylase enzymes and the use of such variant enzymes.
도 1은 Aspergillus niger G1의 글루코아밀라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pCAMG91을 도시한다.Figure 1 shows the plasmid pCAMG91 containing the glucoamylase gene of Aspergillus niger G1.
발명의 상세한 설명DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
본 발명의 기초가 되는 연구의 목표는 녹말 전환이나 알콜 발효에 적합한 특성에 기초하여 선택된 균류생체, 특히 Aspergillus 속 균주로부터 얻을 수 있는 특정 글루코아밀라제의 열안정성을 개선하고/또는 특이활성을 증가시키는 것이다.The goal of the underlying research of the present invention is to improve the thermal stability and / or increase the specific activity of certain glucoamylases obtainable from selected fungal organisms, in particular strains of the genus Aspergillus, based on properties suitable for starch conversion or alcohol fermentation .
개선된 열안정성 및/또는 증가된 특이활성을 얻기 위하여 돌연변이를 유발할 위치 및/또는 영역의 결정Determining the location and / or region that will cause the mutation to achieve improved thermal stability and / or increased specific activity
분자역학(MD) 가상실험은 단백질내 구조의 아미노산의 운동성을 나타낸다 (McCammon, JA 와 Harvey, SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). 이런 단백질역학은 종종 결정학 B-인자와 비교된다(Stout, GH 와 Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). 적정 기능잔기의 각기 다른 수소이온결합상태에서의 MD가상실험 운용을 통하여, 잔기의 pH에 따른 운동성이 가상 재현된다. 무작위 돌연변이유발을 위하여, 가장 높은 운동성 또는 유연성을 가지는 부위(여기서 동방성 연동)이 선택된다. 여기서는 단백질의 특정 부위에서 발견되는 높은 운동성은 이들 잔기를 다른 잔기로 치환하여 열적으로 개선될 수 있다고 이해된다. 치환은 잔기의 역학적 행동을 변화시킬 잔기 예를 들어 더 큰 곁사슬 및/또는 가까운 주위의 잔기와 개선된 접촉을 형성할 능력을 가진 잔기에 대하여 행하여진다. Aspergillus niger서 유래한 AMG는 MD가상실험에 사용 되었다(MD가상실험의 수행방법은 후술할 "재료 및 방법" 편에 기술된다.).Molecular Mechanics (MD) Virtual experiments indicate the amino acid mobility of structures in proteins (McCammon, JA and Harvey, SC, (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). Such protein dynamics are often compared with crystallographic B-factors (Stout, GH and Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). By virtue of the MD virtual experiment operation of different functional hydrogen residues at different hydrogen ion binding states, the mobility according to the pH of the residues is virtually reproduced. For random mutagenesis, the moiety with the highest motility or flexibility (where the orthotropic interlocking) is selected. It is understood here that the high motility found in a specific region of a protein can be thermally improved by replacing these residues with other residues. Substitutions are made for residues that will change the mechanical behavior of the residue, for example, a larger side chain and / or residues that are capable of forming improved contact with nearby surrounding residues. AMG derived from Aspergillus niger was used in the MD virtual experiment (the method of performing the MD virtual experiment is described in the Materials and Methods section below).
개선된 열안정성 및/또는 증가된 특이활성을 얻으려 할 때 돌연변이에 적합한, 분자역학(MD)가상실험에 의하여 발견된 영역은 다음과 같다:The areas found by molecular dynamics (MD) simulations, which are suitable for mutation when trying to obtain improved thermal stability and / or increased specific activity, are as follows:
영역:1-18,Area: 1-18,
영역:19-35,Area: 19-35,
영역:73-80,Area: 73-80,
영역:200-212,Area: 200-212,
영역:234-246,Area: 234-246,
영역:334-341,Area: 334-341,
영역:353-374,Area: 353-374,
영역:407-411,Area: 407-411,
영역:445-470,Area: 445-470,
특이활성 증가시키고 및/또는 열안정성을 개선시키기 위한 관심 있는 영역은 활성부위에 근접한 영역이다. α-나선구조의 각각 N-말단 및 C-말단에 위치한 것을 포함하는, 기질부착도메인에 있는 α-나선구조들 사이에 위치한 영역들은, 효소의 활성에 매우 중요하다. 이런 영역은 다음의 영역를 구성한다:A region of interest for increasing specific activity and / or improving thermal stability is the region close to the active site. Regions located between the a-helical structures in the substrate-attached domain, including those located at the N- and C-termini of the a-helical structure, are very important for the activity of the enzyme. These areas constitute the following areas:
영역:40-62,Area: 40-62,
영역:93-127,Area: 93-127,
영역:170-184,Area: 170-184,
영역:234-246,Area: 234-246,
영역:287-319,Area: 287-319,
영역:388-414.Area: 388-414.
Rhizopus, Talaromyces emerosonii (WO 99/28448에서 개시됨)같은 Talaromyces, 및 Thielavias는 말토스와 말토헵토스를 포함하는 말토덱스트린에 대하여 높은 특이활성을 갖는다. 그러므로, 특히 관심 있는 증가된 특이활성에 관련을 갖는(특이활성을 가져오는) 영역은 :Talaromyces such as Rhizopus, Talaromyces emerosonii (disclosed in WO 99/28448), and Thielavias have high specific activity against maltodextrins including maltose and maltothecose. Thus, the region (which brings about specific activity) that is particularly relevant to the increased specific activity is:
영역:200-212Area: 200-212
영역: 287-300Area: 287-300
영역: 305-319Area: 305-319
본 발명자는 모 글루코아밀라제의 아미노산 서열상의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 통하여 모 글루코아밀라제의 열안정성을 개선하고/또는 특이활성을 증가시키기는 것이 실제로 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이런 발견에 기초를 두고 있다.The inventors have found that it is indeed possible to improve the thermal stability and / or increase the specific activity of the moglucoamylase through modification of one or more amino acid residues on the amino acid sequence of the moglucoamylase. The present invention is based on this finding.
따라서, 첫 번째 견지에서 본 발명은 후술되는 부위이나 위치에서의 하나 이상의 변이를 포함하는 모 글루코아밀라제의 개선된 변이체와 관련된다.Thus, in a first aspect, the invention relates to improved variants of a moglucoamylase comprising at least one mutation at a site or position described below.
모 글루코아밀라제Moglucoamylase
본 발명에 따라 고려된 모 글루코아밀라제는 균류의 글루코아밀라제, 특히 Asperfillus niger나 Aspergillus awamori 글루코아밀라제와 같은 Aspergillus 종으로부터 얻을 수 있는 균류 글루코아밀라제, 또는 그것의 변이체, 상동성 글루코아밀라제, 및 구조적 및/또는 기능적으로 SEQ ID NO: 2와 유사한 그 외의 글루코아밀라제를 포함한다. "Aspergillus niger에서 유래한 글루코아밀라제 G1과 G2는 개별적이지만 밀접히 연관된 두 mRNA에 의하여 합성된다."(Boel et al. (1984) EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102)에 개시된 Aspergillus niger 유래 글루코아밀라제 G1과 G2이 구체적으로 고려되었다. G2 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 2에 개시된다. G1 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 13에 개시된다. 다른 하나의 고려된 AMG 뼈대는 Talaromyces emersonii,특히 WO 99/28448(Novo Nordisk)에 개시된 Talaromyces emersoonii DSM,이다.The moglucoamylases contemplated in accordance with the present invention are fungal glucoamylases, particularly fungal glucoamylases obtainable from Aspergillus species such as Asperfillus niger or Aspergillus awamori glucoamylase, or variants thereof, homologous glucoamylases, and structural and / And other glucoamylases functionally similar to SEQ ID NO: 2. "Glucoamylase G1 and G2 derived from Aspergillus niger are synthesized by two but closely related two mRNAs" (Boel et al. (1984) EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) Derived glucoamylase G1 and G2 were specifically considered. G2 glucoamylase is disclosed in SEQ ID NO: 2. G1 glucoamylase is disclosed in SEQ ID NO: 13. The other considered AMG framework is Talaromyces emersonii, in particular Talaromyces emersoonii DSM, as disclosed in WO 99/28448 (Novo Nordisk).
시종 구입 가능한 모 글루코아밀라제Moglucoamylase available at the time of purchase
시중 구입 가능한 모 글루코아밀라제는 Novo Nordisk로부터의 AMG, 또한 미국 Genecor Inc., 및 네덜란드의 Gist-Brocades, Delft사의 글루코아밀라제를 포함한다.Commercially available moglucoamylases include AMG from Novo Nordisk, Genecor Inc. of the United States, and Gist-Brocades of the Netherlands and Glucoamylase of Delft.
글루코아밀라제 변이체Glucoamylase variant
첫 번째 측면에서는 본 발명은 NO: 2에서 나타낸 아미노산 서열상의 이하의 위치 또는 부위에서의 하나 이상의 돌연변이로 구성된 모 글루코아밀라제의 변이체와 관련이 있다:In a first aspect the present invention relates to variants of a mogurocoamylase consisting of one or more mutations at the following positions or regions on the amino acid sequence shown in NO:
영역: 1-18Area: 1-18
영역: 19-35,Area: 19-35,
영역: 40-62,Area: 40-62,
영역: 73-80,Area: 73-80,
영역: 93-127,Area: 93-127,
영역: 170-184,Area: 170-184,
영역: 200-212Area: 200-212
영역: 234-246,Area: 234-246,
영역: 334-341,Area: 334-341,
영역: 353-374,Area: 353-374,
영역: 388-414,Area: 388-414,
영역: 445-470,Area: 445-470,
및/또는 SEQ ID NO: 2에서 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 영역, 여기에서 다음의 치환은 제외된다: N20C, A27C, S30P, Y48W, Y50F, W52F, R54K/L, D55G/V, G57A, K108R, D112Y, Y116A/W, S119C/W/E/G/Y/P, W120H/F/Y, G121T/A, R122Y, P123G, Q124H, R125K, W170F, N171S, Q172N, T173G, G174C, Y175F, D176N/E, L177H/D, W178R/D, W178R/D, E179Q/D, E180D/W, V181D/A/T, N182A/D/Q/Y/S, G183K, S184H, W212F, R241K, A246C, D293E/Q, A302V, R305K, Y306F, D309N/E, Y312W, W317F, E389D/Q, H391W, A392D, A393P, N395Q, G396S, E400Q/C, Q401E, G407D, E408P, L410F, S411A/G/C/H/D, S460PAnd / or a corresponding position or region in a homologous glucoamylase that exhibits at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the following substitutions are excluded: N20C, A27C, S30P, Y48W, Y50F, W52F, R54K / L, D55G / V, G57A, K108R, D112Y, Y116A / W, S119C / W / E / G / Y / P, W120H / F / Y, G121T / A, R122Y, P123G, Q124H, D / Q / Y / D / W / Y / W / Y / W / Y / Q, Q401E, Q401E, Q401E, Q401E, Q401E, Q401E, Q401E, Q401E, Q381D, G407D, E408P, L410F, S411A / G / C / H / D, S460P
한 구체예에서 변이된 부위는 영역:1-18이다. 고려된 구체적으로 바람직한 위치는 하나 이상의:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18를 포함한다.In one embodiment, the mutated site is in the region: 1-18. Specific specifically preferred locations contemplated include one or more of: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.
특정 돌연변이는 하나 이상의: A1V, T2P/Q/R/H/M/E/K, L3N, N9A, A11E/P, I18V를 포함한다.Specific mutations include one or more of: A1V, T2P / Q / R / H / M / E / K, L3N, N9A, A11E / P,
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G,A1V + L66R + Y402F + N427S + S486G,
T2K+S30P+N427M+S44G+V47M,T2K + S30P + N427M + S44G + V47M,
T2E+T379A+S386K+A393R,T2E + T379A + S386K + A393R,
T2Q+A11P+S394R,T2Q + A11P + S394R,
T2R+L66V+S394P+Y420F,T2R + L66V + S394P + Y420F,
T2M+N9A+T390R+D406N+L410R,T2M + N9A + T390R + D406N + L410R,
T2R+S386R+A393R,T2R + S386R + A393R,
A11P+T2Q+S394R,A11P + T2Q + S394R,
A11E+E408R'A11E + E408R '
I18V+T51S+S56A+V59T+L60A.I18V + T51S + S56A + V59T + L60A.
한 구체예에서 변이된 영역는 영역: 19-35이다.In one embodiment, the mutated region is in the region: 19-35.
바람직한 하위-영역는 하나 이상의: 21-26, 31-35를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35를 포함한다.Preferred sub-regions include one or more: 21-26, 31-35. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34,
특정 돌연변이는 하나 이상의: L19N, N20T, G23A, A24S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N을 포함한다.Specific mutations include one or more of: L19N, N20T, G23A, A24S / T / R, G26A, A27S / T, W28R / Y, S30T / N, G31A, A32V, D33R / K / H, S34N.
한 구체예에서 변이된 영역는 영역: 40-62 이다.In one embodiment, the mutated region is the region: 40-62.
바람직한 하위-영역는 하나 이상의:40-47, 58-62를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62를 포함한다.Preferred sub-regions include one or more: 40-47, 58-62. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60,
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
S40C/A/G,S40C / A / G,
T43R,T43R,
T51S/D,T51S / D,
T56A/C,T56A / C,
V59T/A,V59T / A,
L60A를 포함한다.L60A.
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
T51S+S56A+V59T+L60A+I18V,T51S + S56A + V59T + L60A + I18V,
V59A+A393R+T490A+PLASD(N-말단 연장)를 포함한다.V59A + A393R + T490A + PLASD (N-terminal extension).
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 73-80이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의:73,74,75,76,77,78,79,80을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is in the region: 73-80. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
S73P/D/T/N/Q/E,S73P / D / T / N / Q / E,
L74I/D,L74I / D,
L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V(I/N/D가 바람직함),(I / N / D is preferable), and L75A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / K / M / P / S / T /
S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V(T/A가 바람직함),(T / A is preferable), and S76A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / T / W / Y /
T77V/T,T77V / T,
I78V,I78V,
E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V(Q/R/K가 바람직함),(Preferably Q / R / K), and E79A / R / N / D / C / Q / G / H / I / L / K / F / M / P / S / T / Y /
N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V(H/D/E/R/K/T/S/Y가 바람직함),E / R / K / T / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / S / Y is preferred),
을 포함한다..
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-127 이다. 또 다른 구체예에서 하위-영역은: 영역:93-124이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is in the region: 93-127. In yet another embodiment, the sub-region is: region: 93-124. Preferred sub-regions include one or more of: 93-107, 109-111, 113-115.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다.Specific preferred positions contemplated include one or more of: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117 , 118, 126, 127, respectively.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
N93T,N93T,
P94V,P94V,
S95N,S95N,
D97S,D97S,
L98S/P,L98S / P,
S100T/D,S100T / D,
A102S/*,A102S / *,
P107M/L/A/G/S/T/V/I,P107M / L / A / G / S / T / V / I,
N110T,N110T,
V111P,V111P,
D112N,D112N,
E113M/A,E113M / A,
T114S,T114S,
A115Q/A,A115Q / A,
Y116F,Y116F,
S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, A가 바람직함,A / R / N / D / Q / H / I / L / K / F / M / T /
R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,R122A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F /
G127A. 을 포함한다.G127A. .
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S119P+G447S,S119P + G447S,
S119P+Y402F,S119P + Y402F,
S119P+A393R,S119P + A393R,
S119P+I189T+223F+F227Y+Y402F,S119P + I189T + 223F + F227Y + Y402F,
S119P+T416H+Y402F+Y312Q를 포함한다.S119P + T416H + Y402F + Y312Q.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역:170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the shifted regions are regions 170-184. Certain mutations may include one or more:
N171R/K//Q/E/W/F/Y,N171R / K // Q / E / W / F / Y,
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,Q / Q / W / Y / V / Q / R / N / D / C / E / G / H / I /
T173K/R/S/N/Q,T173K / R / S / N / Q,
G174A, S,G174A, S,
Y175N/Q/D/E,Y175N / Q / D / E,
D176LD176L
L177IL177I
E180N/ME180N / M
V181I/TV181I / T
N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V.N182R / C / E / G / H / I / L / K / M / P / T / W / Y / V.
G183AG183A
S183AS183A
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K 를 포함한다.S184D / N / E / Q / L / I / T / R / K.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 200-212이다. 바람직한 하위-영역은 영역: 200-211을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is a region: 200-212. Preferred sub-regions include regions 200-211.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211을 포함한다.Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210,
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
A201D, F202L, A203L, T203K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T를 포함한다.A201D, F202L, A203L, T203K, A205R / S, V206L / N, G207N, S208H / T / D, S209T, S211P, W212N / A / T.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246 이다.In one embodiment, the mutated regions are regions: 234-246.
바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의:234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.Preferred sub-regions include one or more: 234-240, 242-245. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
L243A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.L243A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / K / M / F / P / S / T / W / Y / V.
A235SA235S
F237Y/H/N/D.F237Y / H / N / D.
D238T/S.D238T / S.
S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.S239A / R / N / D / C / G / H / I / L / F / P / S / T / Y / V.
S240GS240G
S242S/P/T/A/Y/H/N/D.S242S / P / T / A / Y / H / N / D.
G243S/P/T/A/Y/H/N/D.G243S / P / T / A / Y / H / N / D.
K244R,K244R,
A246T를 포함한다.A246T.
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의: A246T+T72I를 포함한다.A preferred combination of mutations comprises one or more: A246T + T72I.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역:287-319 이다.In one embodiment, the mutated region is the region: 287-319.
바람직한 하위-영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316를 포함한다.Preferred sub-regions include one or more of: 287-292, 294-301, 313-316.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다.Specific preferred positions contemplated include one or more of: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314 , 315, 316, 318, and 319, respectively.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,S287A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
I288L/N/Q,I288L / N / Q,
Y289F,Y289F,
T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,I / L / K / M / P / S / V, T290A / R / N / D / C /
L291I/D/N,L291I / D / N,
N292D,N292D,
D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,I / L / K / M / S / T / V, D293A / R / N / C /
G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,G / E / H / I / L / K / M / P / S / T / V,
L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,L295A / R / N / D / C / Q / E / G / H / K / M / S /
S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,S296A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,L / K / M / P / S / T / V, D297A / R / N / C /
S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,S298A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.E299A / R / N / D / C / Q / G / H / I / L / K / M / S / T / V.
V301T/I,V301T / I,
A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, S가 바람직함S / T / W / Y / V, S is desirable. A302R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P /
V303T/I,V303T / I,
G304A,G304A,
R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,R305A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / F / M / P / S /
Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.Y306A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / P / S / T / W / V.
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, Q가 바람직함,Q is preferable, and it is preferable that E / R / N / D / C / Q / G / H / I / L / K / M / P / S /
D309L,D309L,
T310V/S,T310V / S,
Y311N,Y311N,
Y312Q/N,Y312Q / N,
N313T/S/G,N313T / S / G,
N315Q/E/R,N315Q / E / R,
F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, Y가 바람직함, 를 포함한다.F / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / P / S / T / W.
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
Y312Q+S119P+T416H+Y402F,Y312Q + S119P + T416H + Y402F,
Y312Q+S119P+Y402F+T416H+S411V,Y312Q + S119P + Y402F + T416H + S411V,
Y312Q+T416HY312Q + T416H
N313G+F318Y 를 포함한다.N313G + F318Y.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 334-341이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 334-341. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.D336A / R / N / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / S / T / W / Y / V.
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.P / S / T / W / Y / V / K / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L /
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.Q338A / R / N / D / C / G / H / I / L / F / P / S / T / Y / V.
G339S/P/T/A.G339S / P / T / A.
S340I/T/N/V/A/D/G.S340I / T / N / V / A / D / G.
L341F/L/I/V 를 포함한다.L341F / L / I / V.
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S340G+D357S+T360V+S386P를 포함한다.S340G + D357S + T360V + S386P.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 353-374이다.In one embodiment, the mutated region is the region: 353-374.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374를 포함한다.Specific preferred positions contemplated include one or more of: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373 , ≪ / RTI >
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
A353D/S,A353D / S,
S356P/N/D,S356P / N / D,
D357S,D357S,
A359S,A359S,
T360V,T360V,
G361S/P/T/A,G361S / P / T / A,
T362R,T362R,
S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S364A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M /
S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / T / W /
S366T,S366T,
S368P/T/A,S368P / T / A,
T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,T / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F /
S371Y/H/N/D,S371Y / H / N / D,
S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G 를 포함한다.S / T / N / S / V / A / D / G.
돌연변이의 바람직한 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S356P+S366T,S356P + S366T,
D357S+T360V+S371H,D357S + T360V + S371H,
D357S+T360V+S386P+S340G 를 포함한다.D357S + T360V + S386P + S340G.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다.In one embodiment, the mutated region is the region: 388-414.
바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 397-399, 402-406, 412-414를 포함한다.Preferred sub-regions include one or more of: 397-399, 402-406, 412-414.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다.Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413,
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
T390R,T390R,
A393R,A393R,
S394P/R,S394P / R,
M398L,M398L,
S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, T/Q/C가 바람직함,It is preferable that the ratio of the number of pixels to the total number of pixels of the image sensor is S399A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / T /
Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, F가 바람직함,It is preferable that Y / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S /
D403S,D403S,
S405T,S405T,
D406N,D406N,
E408C/R,E408C / R,
A409R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, P가 바람직함,P / S / T / W / Y / V, P is preferable, and A /
L410R/I,L410R / I,
S411R/N/Q/E/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, V가 바람직함,/ RTI > / V / V, < / RTI >
A412C,A412C,
R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V.R413A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / T / W / Y / V.
D414A를 포함한다.D414A.
돌연변이의 바람직한 조합는 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more:
A393R+T490+V59A+PLASD(N-말단 연장),A393R + T490 + V59A + PLASD (N-terminal extension),
S394R+T2Q+A11P,S394R + T2Q + A11P,
Y402F+S411V,Y402F + S411V,
Y402F+S411V+S119P,Y402F + S411V + S119P,
Y402F+S411V+S119P+A393R,Y402F + S411V + S119P + A393R,
Y402F+S411V+S119P+T416A,Y402F + S411V + S119P + T416A,
E408R+S386N,E408R + S386N,
E408R+A425T+S465P+T494A,E408R + A425T + S465P + T494A,
L410R+A393R,L410R + A393R,
Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R를 포함한다.Y402F + Y312Q + S119P + T416H + S411V + A393R.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 445-470이다.In one embodiment, the mutated region is the region: 445-470.
바람직한 하위-영역은 하나 이상의:445-459, 461-470을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 162, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:Preferred sub-regions include one or more: 445-459, 461-470. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 162, 463, 464, 465, 466 , 467, 468, 469, 470. Certain mutations may include one or more:
G447S, G456C/P, S465P를 포함한다.G447S, G456C / P, S465P.
특정 변이체는 하나 이상의 다음의 치환을 포함한다: A1V, T2E/P/Q/R/H/M, L3P/N, N9A, A11P/E, I18V, L19N, N20T, G23A, A2S/T, D25S/T/R, G26A, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N, S40C, T43R, T51D/S, T53D, S56A/C, V59T/A, L60A, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P/S, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, F202L, A203L, T204K, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, S211P, W212N/A/T, A246T, Y312Q, N313T/S/G, A353D/S, S356P/N/D, D357S, A359S, T360V, G361S/P/T/A, T362R, S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S366T, S368P/T/A, T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V, S371Y/H/N/D, S372F/Y/C/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G, T390R, A393R, S394R/P, M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, D406N, E408C/R, L410I/R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465PSpecific variants include one or more of the following substitutions: A1V, T2E / P / Q / R / H / M, L3P / N, N9A, A11P / E, I18V, L19N, N20T, G23A, A2S / C, V59T / A, L60A, V59T / A, T / R, G26A, A27S / T, W28R / Y, S30T / N, G31A, A32V, D33R / K / H, S34N, S40C, T43R, T51D / S, T53D, N93T, P94V, S95N, D97S, L98P / S, S100T / D, A102S / *, N110T, V111P, D112N, E113M / A, F202L, A203L, T204K, A115Q / G, Y116F, S119A, G127A, N182E, A201D, A353D / S, S356P / N / A, A203L, A203L, T204K, A205R / S, V206L / N, G207N, S208H / T / D, S209T, S211P, W212N / A / T, A246T, Y312Q, D, D357S, A359S, T360V, G361S / P / T / A, T362R, S364A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / W / Y / V, S365A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / T / A, T369A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / T / W / Y / V, S371Y / Y, C, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D, G, T390R, A393R, S394R / P, M398L, S399C / Q / T, Y402F, D403S, S405T, E408C / R, L410I / R, S411V, A412C, D414A, G447S, S465P
개선된 열안정성Improved thermal stability
두 번째 측면에서는 본 발명은 특히 40℃ 내지 80℃온도 범위, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃온도 범위, 및 바람직하게는 pH4 내지 5에서의 개선된 열 안정성을 가진 모 글루코아밀라제의 변이체와 관계되고, NO: 2에 나타낸 아미노산 서열내 하기 위치 또는 영역In a second aspect, the present invention relates to mutants of a moglucoamylase having an improved thermal stability, in particular in the temperature range of 40 ° C to 80 ° C, preferably in the range of 60 ° C to 80 ° C, and preferably at pH 4 to 5 , The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
영역: 1-18,Area: 1-18,
영역: 19-35,Area: 19-35,
영역: 73-80,Area: 73-80,
영역: 93-127,Area: 93-127,
영역: 170-184,Area: 170-184,
영역: 200-212,Area: 200-212,
영역: 234-246,Area: 234-246,
영역: 287-319,Area: 287-319,
영역: 334-341,Area: 334-341,
영역: 388-414,Area: 388-414,
영역: 445-470,Area: 445-470,
및/또는 다음 치환 N20C, A27C, S30P, A246C 제외한, SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 보이는 상동성 글루코아밀라제내의 대응하는 위치 또는 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체인 모 글루코아밀라제의 변이체와 관계된다:And / or at least one mutation at a corresponding position or region in a homologous glucoamylase that is at least 60% homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, except for the following substitutions N20C, A27C, S30P, Lt; RTI ID = 0.0 > of amoglucoamylase: < / RTI >
기질의 부착이 안정성을 개선할 수도 있으므로, 영역: 93-127, 영역: 170-184, 부위: 305-319 역시 본 발명에 따라 열 안정화를 위하여 고려되었다.Areas: 93-127, regions: 170-184, sites: 305-319 were also considered for thermal stabilization in accordance with the present invention, as attachment of the substrate may improve stability.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 1-18이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: A1V, T2P/Q/R/H/M/E, N9A, A11E/P를 포함한다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:In one embodiment, the mutated region is region: 1-18. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, Specific mutations include one or more of: A1V, T2P / Q / R / H / M / E, N9A, A11E / P. A preferred combination of mutations is one or more of:
A1V+L66R+Y042F+N427S+S486G,A1V + L66R + Y042F + N427S + S486G,
T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,T2K + S30P + N427M + S44G + V470M,
T2E+T379A+S386K+A393R,T2E + T379A + S386K + A393R,
T2R+S386R+A393R,T2R + S386R + A393R,
A11P+T2Q+S394R,A11P + T2Q + S394R,
T2Q+A11P+S394R,T2Q + A11P + S394R,
T2R+L66V+S394P+Y402F,T2R + L66V + S394P + Y402F,
T2M+N9A+T390R+S406N+L410R,T2M + N9A + T390R + S406N + L410R,
T2R+S386R+A393R,T2R + S386R + A393R,
A11E+E408R을 포함한다.A11E + E408R.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 19-35이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의: 21-26, 31-35를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 : 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is in the region: 19-35. Preferred sub-regions include one or more: 21-26, 31-35. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34,
특정 돌연변이는 하나 이상의: L19N, N20T, G23A, A24S/T, D25S/T/R, A27S/T, W28R/Y, S30T/N, G31A, A32V, D33R/K/H, S34N을 포함한다.Specific mutations include one or more of: L19N, N20T, G23A, A24S / T, D25S / T / R, A27S / T, W28R / Y, S30T / N, G31A, A32V, D33R / K / H, S34N.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 73-80이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the mutated region is in the region: 73-80. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80. Certain mutations may include one or more:
S73P/D/T/N/Q/E,S73P / D / T / N / Q / E,
L74I/D,L74I / D,
L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V, I/N/D가 바람직함,L / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / K / M / P / S / T /
S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, T/A가 바람직함,S / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S /
T77V/T,T77V / T,
I78V,I78V,
E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V, Q/R/K가 바람직함,It is preferable that E / A / R / N / D / C / Q / G / H / I / L / K / F /
N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, H/D/E/R/K/T/S/Y가 바람직함, 을 포함한다.E / R / K / T / H / D / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / S / Y is preferable.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-127이다. 부가된 구체예에서 변이된 영역은 영역: 93-124이다. 바람직한 하위-영역들은 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is in the region: 93-127. In additional embodiments, the mutated regions are regions 93-124. Preferred sub-regions include one or more of: 93-107, 109-111, 113-115.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다.Specific preferred positions contemplated include one or more of: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117 , 118, 126, 127, respectively.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
P107M/L/A/G/S/T/V/I,P107M / L / A / G / S / T / V / I,
S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V, A가 바람직함,A / R / N / D / Q / H / I / L / K / F / M / T /
R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V를 포함한다.R122A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / T / W /
바람직한 돌연변이의 조합는 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S119P+G447S S119P+A393R을 포함한다.S119P + G447S S119P + A393R.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the shifted regions are regions 170-184. Certain mutations may include one or more:
N171R/K/Q/E/W/F/Y,N171R / K / Q / E / W / F / Y,
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,Q / Q / W / Y / V / Q / R / N / D / C / E / G / H / I /
T173K/R/S/N/Q,T173K / R / S / N / Q,
G174A,S,G174A, S,
Y175N/Q/D/E,Y175N / Q / D / E,
D176L,D176L,
L177I,L177I,
E180N/M,E180N / M,
V182R/C/E/G/H/I/L/K/P/T/W/Y/V,V182R / C / E / G / H / I / L / K / P / T / W /
G183A,G183A,
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K를 포함한다.S184D / N / E / Q / L / I / T / R / K.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 200-212이다. 바람직한 하위-영역은: 200-211을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: A203L, S211P를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is a region: 200-212. Preferred sub-regions include: 200-211. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, Specific mutations include one or more: A203L, S211P.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246이다. 바람직한 하위-영역은 하나 이상의:234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 : 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.In one embodiment, the mutated regions are regions: 234-246. Preferred sub-regions include one or more: 234-240, 242-245. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,L234A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / K / M / F / P / S /
A234S,A234S,
F237Y/H/N/D,F237Y / H / N / D,
D238T/S,D238T / S,
S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,S239A / R / N / D / C / G / H / I / L /
S240G,S240G,
S242S/P/T/A/Y/H/N/D,S242S / P / T / A / Y / H / N / D,
G243S/P/T/A/Y/H/N/D,G243S / P / T / A / Y / H / N / D,
K244R,K244R,
A246T를 포함한다.A246T.
바람직한 돌연변이의 조합는 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
A246T+T72I를 포함한다.A246T + T72I.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 287-319이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 287-319. Preferred sub-regions include one or more of: 287-292, 294-301, 313-316.
부가된 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:305-319이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 :287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다.In a further embodiment, the mutated sub-regions are regions: 305-319. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313 , 314, 315, 316, 318, and 319, respectively.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
Y312QY312Q
F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V, Y가 바람직함,를 포함한다.F / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / P / S / T / W.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
N313G+F318Y,N313G + F318Y,
Y302Q+S119P+T416H+Y402F를 포함한다.Y302Q + S119P + T416H + Y402F.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 334-341이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 : 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 334-341. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,D / R / N / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / S /
K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T//W/Y/V,W / Y / V, K / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L /
Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,I / L / F / P / S / T / Y / V,
G339S/P/T/A,G339S / P / T / A,
S340I/T/N/V/A/D/G,S340I / T / N / V / A / D / G,
L341F/L/I/V를 포함한다.L341F / L / I / V.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:S304G+D357S+T360V+S386PA preferred combination of mutations is one or more of: S304G + D357S + T360V + S386P
를 포함한다..
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 353-374이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 353-374. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373 , ≪ / RTI >
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
A353D/S,A353D / S,
S356P/N/D,S356P / N / D,
D357S,D357S,
A359S,A359S,
T360V,T360V,
G361S/P/T/A,G361S / P / T / A,
T362R,T362R,
S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S364A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M /
S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F / P / T / W /
S366T,S366T,
S368P/T/A,S368P / T / A,
T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,T / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / M / F /
S371Y/H/N/D,S371Y / H / N / D,
S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G를 포함한다.S / T / N / S / V / A / D / G.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S356+S366T,S356 + S366T,
D357S+T360V+S371H,D357S + T360V + S371H,
D357S+T360V+S386P+S340G를 포함한다.D357S + T360V + S386P + S340G.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:397-399, 402-406, 412-414를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 388-414. Preferred sub-regions include one or more of: 397-399, 402-406, 412-414.
부가된 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:407-411이다. 고려된 구체적인바람직한 위치는 하나 이상의 :388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In a further embodiment, the shifted sub-regions are regions: 407-411. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, Certain mutations may include one or more:
A393R,A393R,
S393P/R,S393P / R,
S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V, T/Q/C가 바람직함,It is preferable that the ratio of the number of pixels to the total number of pixels of the image sensor is S399A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / T /
Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V, F가 바람직함,It is preferable that Y / A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S /
D403S,D403S,
S405T,S405T,
D406N,D406N,
E408C/R,E408C / R,
Q409A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, P가 바람직함,P / S / T / W / Y / V, P is preferable,
L410I/R,L410I / R,
S411V,S411V,
A412C,A412C,
R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,R413A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S /
D414A를 포함한다.D414A.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
A393R+T2R+S386R,A393R + T2R + S386R,
A393R+T490A+V59A+PLASD(N-말단 연장),A393R + T490A + V59A + PLASD (N-terminal extension),
S394R+T2Q+A11P,S394R + T2Q + A11P,
Y402F+T2R+L66V+S394P,Y402F + T2R + L66V + S394P,
Y402F+S411V+S119P,Y402F + S411V + S119P,
Y402F+S411V,Y402F + S411V,
Y402F+Y312Q+S119P+T416H,Y402F + Y312Q + S119P + T416H,
S411V+A393R,S411V + A393R,
E408R+S386N,E408R + S386N,
E408R+A425T+S465P+T494A,E408R + A425T + S465P + T494A,
L410R+A393R,L410R + A393R,
S411V+S119P+Y402F+A393R,S411V + S119P + Y402F + A393R,
S411V+S119P+Y402F+A393R+T416H를 포함한다.S411V + S119P + Y402F + A393R + T416H.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 445-470이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:445-459, 461-470을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 445-470. Preferred sub-regions include one or more: 445-459, 461-470. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 461, 462, 463, 464, 465, 466 , 467, 468, 469, 470.
특정 돌연변이는 하나 이상의:Certain mutations may include one or more:
G447S, G456C/P, S465P를 포함한다.G447S, G456C / P, S465P.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
G447S+S119P,G447S + S119P,
S465P+ES08R+A425T+T494A를 포함한다.S465P + ES08R + A425T + T494A.
증가된 특이활성Increased specific activity
세번째 측면에서는 본발명은 NO: 2에 나타난 다음의 위치 또는 영역:In a third aspect, the present invention relates to the following position or region represented by NO: 2:
영역: 1-18,Area: 1-18,
영역: 40-62,Area: 40-62,
영역: 93-127,Area: 93-127,
영역: 170-184,Area: 170-184,
영역: 200-212,Area: 200-212,
영역: 234-246,Area: 234-246,
영역: 287-319,Area: 287-319,
영역: 388-414,Area: 388-414,
및/또는 다음 치환: S411G를 제외한 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 부위에서의 하나 이상의 변이로 구성된 증가된 특이활성을 갖는 모 글루코아밀라제의 변이체와 관련된다.And / or at least one mutation at the corresponding position or site in a homologous glucoamylase that exhibits at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except for the following substitution: S411G. Lt; RTI ID = 0.0 > glucoamylase. ≪ / RTI >
한 구체예에서 변이된 부위는 부위: 1-18이다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19를 포함한다. 특정 돌연변이는: L3N, I18V이다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:In one embodiment, the mutated site is a site 1-18. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, Certain mutations are: L3N, I18V. A preferred combination of mutations is one or more of:
I18V+T51S+S56A+V59T+L60A를 포함한다.I18V + T51S + S56A + V59T + L60A.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 40-62이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:40-47, 58-62를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의:40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 61, 62를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the mutated region is in the region: 40-62. Preferred sub-regions include one or more: 40-47, 58-62. Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 56, 58, 59, 60, Certain mutations may include one or more:
S40C, T43R, T51S/D, T53D, S56A/C, V59T, L60A를 포함한다. 바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의: T51S+S56A+V59T+L60A+I18V를 포함한다.S40C, T43R, T51S / D, T53D, S56A / C, V59T, and L60A. A preferred combination of mutations includes one or more of: T51S + S56A + V59T + L60A + I18V.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역:93-127이다. 추가적 구체예에서 변이된 하위-영역은 영역:93-124이다. 바람직한 하위-부위는 하나 이상의: 93-107, 109-111, 113-115를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 126, 127을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the mutated region is in the region: 93-127. In a further embodiment, the mutated sub-regions are regions 93-124. Preferred sub-sites include one or more of: 93-107, 109-111, 113-115. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117 , 118, 126, 127, respectively. Certain mutations may include one or more:
N93T, P94V, S95N, D97S, L98S/P, S100T/D, A102S/*, N110T, V111P, D112N, E113M/A, T114S, A115Q/G, Y116F, S119A, G127A를 포함한다.N93T, P94V, S95N, D97S, L98S / P, S100T / D, A102S / *, N110T, V111P, D112N, E113M / A, T114S, A115Q / G, Y116F, S119A and G127A.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
S119P+Y402F,S119P + Y402F,
S119P+Y402F+I189T+Y223F+F227Y를 포함한다.S119P + Y402F + I189T + Y223F + F227Y.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 170-184이다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:In one embodiment, the shifted regions are regions 170-184. Certain mutations may include one or more:
N171R/K/Q/E/W/F/Y,N171R / K / Q / E / W / F / Y,
Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,Q / Q / W / Y / V / Q / R / N / D / C / E / G / H / I /
T173K/R/S/N/Q,T173K / R / S / N / Q,
G174A/S,G174A / S,
Y175N/Q/D/E,Y175N / Q / D / E,
D176L,D176L,
L177I,L177I,
E180N/M,E180N / M,
V181I/T,V181I / T,
N182R/C/E/G/H/I/L/K/M/P/T/W/Y/V, E가 바람직함,E / G / H / I / L / K / M / P / T / W /
G183A,G183A,
S184D/N/E/Q/L/I/T/R/K를 포함한다.S184D / N / E / Q / L / I / T / R / K.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역:200-212이다. 바람직한 하위- 영역은: 200-211을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is a region: 200-212. Preferred sub-regions include: 200-211.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210을 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:A201D, F202L, A203L, T204K, A205R/S, V206L/N, G207N, S208H/T/D, S209T, W212N/A/T를 포함한다.Specific contemplated locations contemplated include one or more of: 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, Specific mutations include one or more of: A201D, F202L, A203L, T204K, A205R / S, V206L / N, G207N, S208H / T / D, S209T, W212N / A / T.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 234-246이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:234-240, 242-245를 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245를 포함한다.In one embodiment, the mutated regions are regions: 234-246. Preferred sub-regions include one or more: 234-240, 242-245. Specific preferred positions contemplated include one or more of: 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 245.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 287-319이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:287-292, 294-301, 313-316을 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 287-319. Preferred sub-regions include one or more of: 287-292, 294-301, 313-316.
고려된 구체적인 바람직한 위치는 하나 이상의 :287, 288, 289, 290, 291,292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 315, 316, 318, 319를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의:Specific preferred positions contemplated include one or more of: 287, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 307, 308, 310, 311, 313, 314 , 315, 316, 318, and 319, respectively. Certain mutations may include one or more:
S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,S287A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
I288L/N/Q,I288L / N / Q,
T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/P/S/V,T290A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
L291I/D/N,L291I / D / N,
N292D,N292D,
D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,I / L / K / M / S / T / V, D293A / R / N / C /
G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/L/K/M/P/S/T/V,G / E / H / I / L / K / M / P / S / T / V,
L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,L295A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
S295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/T/V,S295A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
D297A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,I / L / K / M / S / T / V,
S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,S298A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I /
E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V,E / A / R / N / D / C / Q / G / H / I /
V301T/I,V301T / I,
A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V, S가 바람직함,A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K / F / M / P / S / T /
V303T/I,V303T / I,
G304A,G304A,
R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,R305A / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / F / M / P / S /
Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V,Y306A / R / N / D / C / Q / E / G / H / I / L / K /
E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V, Q가 바람직함,Q is preferable, and it is preferable that E / R / N / D / C / Q / G / H / I / L / K / M / P / S /
D309L,D309L,
T310V/S,T310V / S,
Y311N,Y311N,
Y312Q/N, Q가 바람직함,Y312Q / N, Q is preferred,
Y313T/S/G, S가 바람직함,Y313T / S / G, S is preferable,
N315Q/E/R을 포함한다.Includes N315Q / E / R.
한 구체예에서 변이된 영역은 영역: 388-414이다. 바람직한 하위- 영역은 하나 이상의:397-399, 402-406, 412-414을 포함한다. 고려된 구체적인 바람직한 위치들은 하나 이상의 :388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414를 포함한다. 특정 돌연변이는 하나 이상의: M398L, S399C/Q/T, Y402F, D403S, S405T, E408C/R, S411V, A412C, D414A를 포함한다.In one embodiment, the mutated region is the region: 388-414. Preferred sub-regions include one or more of: 397-399, 402-406, 412-414. Specific preferred locations contemplated include one or more of: 388, 389, 390, 394, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 412, 413, 414. Specific mutations include one or more of: M398L, S399C / Q / T, Y402F, D403S, S405T, E408C / R, S411V, A412C, D414A.
바람직한 돌연변이의 조합은 하나 이상의:A preferred combination of mutations is one or more of:
Y402F+S119P,Y402F + S119P,
Y402F+S119P+I189T+Y223F+F227Y를 포함한다.Y402F + S119P + I189T + Y223F + F227Y.
한 바람직한 구체예에서 변이된 영역은:In one preferred embodiment, the mutated regions comprise:
부위: 287-300,Site: 287-300,
부위: 305-319,Site: 305-319,
및/또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60% 상동성을 나타내는 상동성 글루코아밀라제 내의 대응하는 위치 또는 영역이다.And / or a corresponding position or region within the homologous glucoamylase that exhibits at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
상동성 (동일성)Homology (identity)
상기 모 글루코아밀라제에 대해 언급한 상동성은 첫번째 서열이 두번째 서열로부터 유도됨을 나타내는 두 단백질 서열간의 일치성의 정도로서 결정된다. 상동성은 GCG 프로그램 패키지(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. 및 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p>443-453)에서 제공되는 GAP같이. 분야에서 알려진 컴퓨터 프로그램의 수단을 통해 적절히 결정된다. 폴리펩티드 서열을 비교하기 위해 다음과 같은 지정: GAP 생성 페널티(creation penalty) 3.0, GAP 연장 페널티(extension penalty) 0.1으로 GAP를 사용하여, 본 발명의 유사 DNA 서열에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 성숙한 부분은 적어도 70%와 같이 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 적어도 99% SEQID NO:2에 나타낸 아미노산 서열의 성숙한 부분과 동일성을 나타낸다.The homology referred to above for the mammogian amylase is determined as the degree of correspondence between the two protein sequences indicating that the first sequence is derived from the second sequence. Homology was determined using the GCG program package (Programmer for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, SB and Wunsch, CD, (1970) Biology, 48, p > 443-453). Is determined appropriately by means of a computer program known in the art. Using GAP with the following designation: GAP creation penalty 3.0, GAP extension penalty 0.1 to compare polypeptide sequences, the mature portion of the polypeptide encoded by the pseudo-DNA sequence of the invention is at least At least 80%, at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, most preferably at least 99% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, such as 70% It indicates identity.
바람직하게는, 모 글루코아밀라제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열; 또는 그것의 대립유전자 변이체; 또는 글루코아밀라제 활성이 있는 그것의 단편으로 포함한다.Preferably, the moglucoamylase comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; Or an allelic variant thereof; Or fragments thereof having glucoamylase activity.
SEQ ID NO: 2의 단편은 이 아미노산 서열의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단으로부터 하나 이상의 결실된 아미노산을 가진 폴리펩티드이다. 예를 들어, AMG G2(SEQ ID NO: 2)는 글루코아밀라제 활성이 있는 Aspergillus niger G1 글루코아밀라제의 한 단편이다(Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5), p. 1097-1102). 대립유전자 변이체란 같은 염색체 상 자리를 차지하는 유전자의 둘 이상의 택일적 형태중 어느 하나를 의미한다. 대립유전자 변이체는 돌연변이에 의해 자연적으로 생겨나고 집단 내의 다양성의 결과를 낳을 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할(코드화되는 폴리펩티드상에 변화가 없음)수도 있거나 또는 바뀐 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드화 할 수도 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코드화되는 폴리펩티드이다.The fragment of SEQ ID NO: 2 is a polypeptide having at least one deleted amino acid from the amino terminal and / or carboxyl terminal of the amino acid sequence. For example, AMG G2 (SEQ ID NO: 2) is a fragment of Aspergillus niger G1 glucoamylase with glucoamylase activity (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102 ). An allelic variant refers to any one of two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic variants are naturally occurring by mutation and can result in diversity within the population. The gene mutation may be silent (no change on the encoded polypeptide) or may encode a polypeptide having the altered amino acid sequence. An allelic variant of a polypeptide is a polypeptide that is encoded by an allelic variant of the gene.
상동성 모 글루코아밀라제의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 및/또는 다른 아미노산 잔기에 의한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 다를 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 변화는 부차적인 종류의, 즉 단백질의 접힘 및/또는 활성에 중대한 영향이 없는 보전적 아미노산의 치환; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 30 아미노산; 아미노-말단의 메티오닌 잔기와 같은 작은 아미노-말단 또는 카르복실 말단의 연장, 대략 20 내지 25 잔기 까지의 작은 연결 펩티드; 또는 폴리-히스티딘 반복서열, 항체의 에피톱, 또는 부착 도메인과 같은 전체 전하 또는 그외 다른 기능을 바꾸어 정제를 용이하게하기 위한 작은 연장이다.The amino acid sequence of a homologous moglucoamylase may differ from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by insertion or deletion of one or more amino acid residues and / or substitution of one or more amino acid residues by another amino acid residue. Preferably, the change in amino acid is a substitution of a conservative amino acid that does not have a significant effect on the secondary type, i.e., the folding and / or activity of the protein; Small deletions, typically 1 to 30 amino acids; A small amino-terminal or terminal extension of the carboxyl, such as an amino-terminal methionine residue, a small connecting peptide of up to about 20 to 25 residues; Or a small extension to facilitate purification by altering the overall charge or other function, such as a poly-histidine repeat sequence, an epitope of an antibody, or an attachment domain.
또 다른 구체예에서, 분리된 모 글루코아밀라제는 매우 낮은 스트린전시(stringency)조건, 바람직하게는 낮은 스트린전시 조건, 더욱 바람직하게는 중간 스트린전시 조건, 더욱 바람직하게는 중간-높은 스트린전시 조건, 더욱 더 바람직하게는 높은 스트린전시 조건, 가장 바람직하게는 매우 높은 스트린전시 조건하에서, i)SEQ ID NO:1의 cDNA 핵산 서열, ii)SEQ ID NO: 1의 cDNA 서열, iii)i) 또는 ii)의 하위-서열, 또는 iv) i),ii) 또는 iii)의 상보적 가닥과 동일 조건하에서 혼성화하는 핵산 프로브와 혼성화하는 핵산 서열에 의하여 코드화된다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, 및 T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO:1의 하위-서열은 적어도 100 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 적어도 200 뉴클레오티드이다. 또한, 그 하위-서열은 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 코드화 한다. 모 폴리펩티드는 또한 대립유전자 변이체 또는 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편이다.In yet another embodiment, the isolated mugurosamylase is used at very low stringency conditions, preferably at low string conditions, more preferably at medium string conditions, more preferably at medium to high string I) the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, ii) the cDNA sequence of SEQ ID NO: 1, iii) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, ) or a sub-sequence of i) or ii), or iv) a nucleic acid sequence which hybridizes under the same conditions as the complementary strand of i), ii) or iii) (J. Sambrook, EF Fritsch , And T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York). The sub-sequence of SEQ ID NO: 1 is at least 100 nucleotides, or preferably at least 200 nucleotides. In addition, the sub-sequences encode polypeptide fragments having glucoamylase activity. A polypeptide is also a polypeptide fragment having an allelic variant or glucoamylase activity.
SEQ ID NO: 1의 핵산 서열 또는 그것의 하위서열뿐만 아니라 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은 서로 다른 속 또는 종의 균주로부터 당업계 주지의 방법에 따라 글루코아밀라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 밝히고 글로닝하기 위하여 핵산 프로브를 제작하는데 사용될 수 있다. 특히, 이런 프로브는 그 안의 대응하는 유전자를 밝히고 분리하기 위하여 표준적인 서던블롯 방법에 따라 그 관심있는 속 또는 종의 게놈 DNA 또는 cDNA와 혼성화에 사용될 수 있다. 이런 프로브는 전체 서열에 비하여 상당히 짧을 수 있지만 적어도, 바람직하게는 적어도 25, 더 바람직하게는 적어도 35 뉴클레오티드 길이는 되어야 한다. 더 긴 프로브도 또한 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 대응하는 유전자를 탐지하기 위하여(예를 들어32P,3H,35S,비오틴(biotin), 또는 아비딘(avidin)으로)표지된다.The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof, as well as the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or its subsequence, as well as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof may be obtained from a strain of a different genus or species by using a polypeptide having glucoamylase activity Can be used to construct nucleic acid probes to identify and code for encoding DNA. In particular, such probes can be used to hybridize genomic DNA or cDNA of the genus or species of interest according to standard Southern blotting methods to identify and isolate corresponding genes therein. Such probes may be considerably shorter than the entire sequence, but at least, preferably at least 25, more preferably at least 35 nucleotides in length. Longer probes can also be used. Probes are typically labeled to detect corresponding genes (e.g., 32 P, 3 H, 35 S, biotin, or avidin).
그러므로, 이런 다른 생물체로부터 마련된 게놈 DNA 또는 cDNA라이브러리는 상기한 프로브에 혼성화되고 글루코아밀라제를 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 찾기 위하여 검색될 수 있다. 이런 다른 생물체으로부터 유래한 게놈 DNA나 다른 DNA는 한천 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이나 다른 분리기술을 이용하여 분리될 수 있다. 라이브러리에서 유래한 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀루로즈 또는 다른 적합한 운반체 물질에 옮겨져서 고정될 수 있다. 클론이나 SEQ ID NO: 1 또는 그것의 하위-서열과 상동성 있는 DNA를 동정하기 위하여 운반체 물질이 서던블롯에 사용된다. 본 발명의 목적을 위하여, 혼성화는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1에 나타낸 핵산서열, 그것의 상보적 가닥, 또는 그것의 하위-서열 각각에 매우 낮은 스트린전시 조건 내지 매우 높은 스트린 전시 조건하에서 대응하는 핵산 프로브에 혼성화된다는 것을 가리킨다. 이런 조건 하에서 핵산 프로브가 혼성화된 분자는 X-선 필름을 사용하여 탐지된다.Thus, a genomic DNA or cDNA library prepared from such other organisms can be searched to find DNA that hybridizes to the above-mentioned probe and encodes a polypeptide having a glucoamylase. Genomic DNA or other DNA from these other organisms can be isolated using agar or polyacrylamide gel electrophoresis or other separation techniques. DNA derived from the library or isolated DNA can be immobilized by transfer to nitrocellulose or other suitable carrier material. A carrier material is used in the Southern blot to identify DNA that is homologous to the clone or SEQ ID NO: 1 or its sub-sequence. For purposes of the present invention, the hybridization is carried out by hybridizing the nucleic acid sequence to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, its complementary strand, or each of its sub-sequences under very low or very high string expression conditions Lt; RTI ID = 0.0 > nucleic acid probe. ≪ / RTI > Under these conditions, molecules hybridized with nucleic acid probes are detected using X-ray films.
적어도 100 뉴클레오티드 긴 길이의 프로브를 위하여는 운반체 물질은 최종적으로 적어도 45℃(매우 낮은 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 50℃(낮은 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 55℃(중간 스트린전시), 더 바람직하게는 적어도 60℃(중간-높은 스트린전시),좀더 바람직하게는 적어도 65℃(높은 스트린전시), 및 가장 바람직하게는 적어도 70℃(매우 높은 스트린전시) 각각의 온도에서 2x SSC, 0.2% SDS로 각각 15분씩 세번씩 세척되어야 한다.For probes of at least 100 nucleotides in length, the carrier material will eventually be at least 45 캜 (very low string representation), more preferably at least 50 캜 (low string representation), more preferably at least 55 캜 More preferably at least 60 캜 (medium to high string display), more preferably at least 65 캜 (high string display), and most preferably at least 70 캜 (very high string display) Should be washed with 2x SSC, 0.2% SDS three times for 15 minutes each.
약 15뉴클레오티드 내지 70뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브를 위하여, 스트린전시 조건은 표준 서던블롯 과정에 따라 Bolton과 Mccarthy에 따른 계산 방법(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390)을 사용하여 계산된 Tm의 5℃ 내지 10℃이하에서 0.9M NaCl, 0.09M Tris-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1x Denhardt's 용액, 0.1mM ATP, 및 ml당 0.2mg의 효모 RNA의 조성 안에서의 전 혼성화, 혼성화, 및 세척 후-혼성화로서 정의된다.For short probes from about 15 nucleotides to 70 nucleotides in length, the string representation conditions were calculated using Bolton and McCarthy's calculation method (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) according to standard Southern blotting procedures the composition of below 5 ℃ to 10 ℃ of T m 0.9M NaCl, 0.09M Tris- HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1x Denhardt's solution, 0.1mM ATP, and 0.2mg yeast RNA per ml of Hybridization, post-hybridization, and post-hybridization.
약 15뉴클레오티드 내지 70뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브를 위하여는 운반체 물질은 6x SCC + 0.1% SDS에서 15분간 한번 세척되고 계산된 Tm보다 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서 6x SCC를 사용하여 각각 15분씩 두번 세척되어야 한다.For short probes of about 15 nucleotides to about 70 nucleotides in length the carrier material using a 6x SCC at 5 ℃ to 10 ℃ lower temperature than the washing once for 15 min in 6x SCC + 0.1% SDS and calculating T m 15 minutes twice each It should be cleaned.
본 발명은 또한 (a) 매우 낮은, 낮은, 중간, 중간-높은, 높은, 매우 높은 스트린전시 조건에서 SEQ ID NO:1의 핵산 서열, 또는 그것의 상보 가닥, 또는 그것의 하위-서열과의 혼성화; 및 (b) 그 핵산 서열의 분리에 의하여 만들어진, 분리된 핵산 서열과 관련된다. 그 하위-서열은 바람직하게는 글루코아밀라제 활성이 있는 폴리펩티드 단편을 코드화하는 서열 같은, 적어도 100 뉴클레오티드의 서열이다.The invention also relates to a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a complementary strand thereof, or a nucleic acid sequence thereof, or a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, Hybridization; And (b) the separation of the nucleic acid sequence. The sub-sequence is preferably a sequence of at least 100 nucleotides, such as a sequence encoding a polypeptide fragment having glucoamylase activity.
고려된 모 글루코아밀라제은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 100% SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩티드 글루코아밀라제 활성의 가지고 있다.The considered moglucoamylase is at least 20%, preferably at least 40%, more preferably at least 60%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 100% SEQ Has the mature polypeptide glucoamylase activity of ID NO: 2.
한 바람직한 구체예에서는 이 발명의 변이체는 대략 60 내지 80℃, 바람직 하게는 63 내지 75℃ 온도 간격 내에서, 바람직하게는 pH 4 내지 5, 특히 4.2 내지 4.7에서 말토덱스트린을 기질로 사용하여 개선된 열 안정성 및/또는 증가된 특이활성을 가진다.In one preferred embodiment variants of this invention are modified using maltodextrin as a substrate at a temperature interval of about 60 to 80 DEG C, preferably 63 to 75 DEG C, preferably at a pH of 4 to 5, especially 4.2 to 4.7 Thermal stability and / or increased specific activity.
다른 한 바람직한 구체예에서는 이 발명의 변이체는 예를 들어 알콜 발효를 위하여 사용된다.In another preferred embodiment, variants of this invention are used, for example, for alcohol fermentation.
한 바람직한 구체예에서는 모 글루코아밀라제는 Aspergillus niger G1의 글루코아밀라제(Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5), p. 1097-1102)이다. 모 글루코아밀라제는 절단형의 글루코아밀라제, 예를 들면 AMG G2 글루코아밀라제, 일 수도 있다.In one preferred embodiment, the moglucoamylase is a glucoamylase of Aspergillus niger G1 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p 1097-1102). The moglucoamylase may be a truncated form of glucoamylase, for example AMG G2 glucoamylase.
모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA서열의 클로닝Cloning of DNA Sequences Encoding Moglucoamylase
모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA서열은 당업계 주지의 다양한 방법을 사용하여 문제의 글루코아밀라제를 생산하는 어떤 세포나 미생물로부터 분리될 수 있다. 첫째로, 연구될 글루코아밀라제를 생산하는 생물체에서 유래한 염색체 DNA 또는 전령 RNA 를 사용하여 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리가 제작되어야 한다. 그 후, 만약 글루코아밀라제의 아미노산 서열이 알려진 경우는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성될 수 있고 문제의 생물체로 부터 마련된 게놈 라이브러리에서 유래한 글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 대안으로, 다른 공지의 글루코아밀라제 유전자에 상동성 있는 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 매우 낮은 스트린전시 부터 매우 높은 스트린전시 까지의 혼성화 및 세척조건을 사용하여 글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이것은 위에 기술되어 있다.DNA sequences encoding the moglucoamylase can be isolated from any cell or microorganism that produces the glucoamylase in question using a variety of methods known in the art. First, genomic DNA and / or cDNA libraries must be constructed using chromosomal or messenger RNA derived from an organism that produces the glucoamylase to be studied. Thereafter, if the amino acid sequence of the glucoamylase is known, the labeled oligonucleotide probe can be synthesized and used to identify a clone encoding a glucoamylase derived from a genomic library prepared from the organism in question. Alternatively, labeled oligonucleotide probes containing sequences that are homologous to other known glucoamylase genes can be cloned using the hybridization and washing conditions from very low string representation to very high string representation and encoding clones encoding glucoamylase It can be used as a probe for identification. This is described above.
글루코아밀라제를 코드화하는 클론을 동정하는 또 다른 방법은 게놈 DNA 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하고, 결과물인 게놈 DNA 라이브러리로 글루코아밀라제가 없는 세균에 형질전환 시키고, 그런 뒤에 형질 변환된 세균을 글루코아밀라제의 기질(즉, 말토스)을 포함하는 한천에 도말하고, 그것에 의하여 글루코아밀라제를 발현하는 클론을 동정되도록 두는 것을 포함한다.Another method for identifying a clone encoding glucoamylase is to insert a genomic DNA fragment into an expression vector such as a plasmid and transform the resulting bacterial without a glucoamylase into a genomic DNA library, To an agar containing an amylase substrate (i.e., maltose), thereby allowing a clone expressing glucoamylase to be identified.
대안으로, 그 효소를 코드화하는 DNA 서열은 확립된 표준적 방법, 예를 들어 S.L. Beaucage 및 M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, 에 서술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al.에 의하여 EMBO J. 3, p. 801-805에 서술된 동 방법에 의해 합성으로 준비될 수 있다. 포스포로아미디트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기에 의하여, 합성되고, 정제되고, 어닐(anneal)되고, 이어지고, 그리고 적합한 벡터에 클론되었다.Alternatively, the DNA sequence coding for the enzyme may be obtained using established standard methods, e. Beaucage and M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, or by the method of EMBO J. 3, p. 801-805. ≪ / RTI > In the phosphoramidite method, oligonucleotides are synthesized, purified, annealed, sequenced, and cloned into suitable vectors, for example, by an automated DNA synthesizer.
마지막으로, DNA서열은 표준적 기술에 따라 합성된, 게놈, 또는 cDNA 기원의 이어진 단편에 의하여 마련된 게놈 기원과 합성된 기원의 혼합, 합성된 기원과 cDNA 기원의 혼합, 또는 게놈 기원과 cDNA 기원의 혼합일 수 있다. DNA서열은 또한 특이적 프라이머,예를 들면 US 4,683,202 또는 R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491에 서술된, 를 사용한 다중효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 마련될 수 있다.Finally, the DNA sequence may be a mixture of genomic and synthetic origin, prepared by standard techniques, genomic or contiguous fragments of cDNA origin, a mixture of synthetic origin and cDNA origin, or a mixture of genomic and cDNA origin Can be mixed. The DNA sequence may also be a specific primer, e. G., US 4,683,202 or R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491. ≪ RTI ID = 0.0 > (PCR) < / RTI >
부위특이적 돌연변이 유발Site-specific mutagenesis
일단 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열이 분리되고, 그리고 돌연변이를 위하여 원하는 부위가 동정되면, 돌연변이를 합성된 올리고뉴클레오티드을 사용하여 도입될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 부위에 측면을 접한 핵산서열을 포함한다. 한 특정 방법에서는, DNA의 단일가닥으로된 갭(gap), 즉 글루코아밀라제를 코드화하는 서열,이 글루코아밀라제 유전자를 운반하는 벡터안에 만들어진다. 그 다음엔 원하는 돌연변이를 갖는 합성된 뉴클레오티드가 그 단일가닥 DNA의 상동성 부분에 어닐된다. 남은 갭은 그 다음에 DNA 중합효소I (클레노우 단편)으로 채워지고, 그리고 구조체가 T4 리가아제를 사용하여 연결된다. 이 방법의 특이적 예는 Morianga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639에 서술되어 있다. US4,760,025는 사소한 변화를 실행함으로써 다중변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, Morinaga 방법에 의하면 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드 다수가 도입 될 수 있으므로 어느 한번에도 더욱 많은 수의 다양한 돌연변이도 도입될 수 있다.Once the DNA sequence encoding the glucoamylase has been isolated and the desired site for the mutation has been identified, the mutation can be introduced using the synthesized oligonucleotide. Such oligonucleotides include nucleic acid sequences flanking the desired mutation site. In one particular method, a single-stranded gap of DNA, a sequence encoding a glucoamylase, is made into a vector carrying the glucoamylase gene. The synthesized nucleotide with the desired mutation is then annealed to the homologous portion of the single stranded DNA. The remaining gap is then filled with DNA polymerase I (Klenow fragment), and the construct is ligated using T4 ligase. Specific examples of this method are described in Morianga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. US 4,760,025 discloses the introduction of oligonucleotides that encode multiple mutations by performing minor changes. However, according to the Morinaga method, many oligonucleotides of various lengths can be introduced, so that a larger number of mutations can be introduced at any one time.
돌연변이를 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA서열에 도입하는 또 다른 방법은 Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151에 서술되어 있다. 그것은 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 PCR의 프라이머 중 하나로 사용하여 원하는 돌연변이를 포함하는 PCR단편의 3-단계 생성과 관련되어 있다. PCR로부터 생성된 단편으로 부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편이 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의하여 분리될 수 있고, 발현 벡터에 다시 삽입될 수 있다.Another method for introducing mutations into the DNA sequence encoding glucoamylase is described in Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. It involves the three-step generation of PCR fragments containing the desired mutations using chemically synthesized DNA strands as one of the primers of the PCR. From the fragment generated from the PCR, the DNA fragment carrying the mutation can be isolated by cleavage by a restriction endonuclease and inserted back into the expression vector.
더 나아가, Sierks. et al., (1989), Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), Protein Eng. vol. 3, 193-198; 또한 Aspergillus niger에서 부위특이적 돌연변이 유발에 대하여 서술한다.Further, Sierks. et al., (1989), Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), Protein Eng. vol. 3, 193-198; It also describes the induction of site-specific mutations in Aspergillus niger.
무작위 돌연변이 유발Random mutagenesis
무작위 돌연변이 유발은 문제를 나타낸 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 세 부분 또는 유전자 전체 내에 편재된 또는 영역-특이적 무작위 돌연변이로서 적합하게 수행된다.Random mutagenesis is preferably performed as a localized or region-specific random mutation in at least three portions of the gene or in the entire gene that is translated into the amino acid sequence representing the problem.
모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이 유발은 통상적으로 당업계에 알려진 어느 한 방법으로 수행된다.Random mutagenesis of the DNA sequence encoding the moglucoamylase is typically performed by any method known in the art.
위와 관련하여, 본 발명의 더 나아간 측면은 그 안에서 변이체가 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 증가된 열안정성을 나타내는 글루코아밀라제 변이체를 생성하는 방법과 관련이 있는 데, 그 방법은:In the above context, a further aspect of the invention relates to a method for producing a glucoamylase variant in which the mutant exhibits relatively increased thermal stability relative to the mogurocoamylase, comprising:
(a) 모 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA 서열을 무작위 돌여변이를 유발하는 단계,(a) randomly transcribing a DNA sequence encoding a moglucoamylase to cause a mutation,
(b) (a)단계에서 얻어진 돌연변이된 DNA 서열을 숙주세포내로 발현하는 단계, 및(b) expressing the mutated DNA sequence obtained in step (a) into a host cell, and
(c) 모 글루코아밀라제에 비하여 상대적으로 변화된 특성을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 발현하는 숙주세포를 선별하는 단계를 포함한다.(c) selecting a host cell expressing a glucoamylase variant having relatively changed characteristics as compared to the moglucoamylase.
본 발명의 상기 방법의 (a) 단계는 바람직하게는 이 안의 작업 실시예에서 기술된 바와 같이 혼입된 프라이머를 사용하여 수행된다(아래 참조).The step (a) of the method of the present invention is preferably carried out using an incorporated primer as described in the working examples herein (see below).
예를 들어, 무작위 돌연변이 유발은 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발물질을 사용하거나, 적합한 올리고뉴클레오티드을 사용하거나, 또는 DNA서열을 PCR에 의하여 생성되는 돌연변이 유발의 대상으로 함으로써 수행된다. 더 나아가,무작위 돌연변이 유발은 이런 돌연변이 유발물질의 어떤 조합을 사용하여 수행된다. 돌연변이 유발 물질은 예를들면 전이, 전환, 역위, 교차, 결실, 및/또는 삽입을 유발할 수 있는 물질이다.For example, random mutagenesis is carried out by using suitable physical or chemical mutagens, by using suitable oligonucleotides, or by subjecting DNA sequences to mutagenesis induced by PCR. Furthermore, random mutagenesis is carried out using any combination of these mutagenic agents. Mutagenic agents are substances that can induce, for example, metastasis, transformation, inversion, crossing, deletion, and / or insertion.
본 목적에 적합한 물리적 화학적 돌연변이 유발 물질의 예는 자외선(UV), 조사 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 질산, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 아황산 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이와 같은 물질이 사용될 때에는 돌연변이 유발은 전형적으로 돌연변이 유발하고자 하는, 선택한 돌연변이 유발 물질 존재 하에서 돌연변이 유발이 일어나기 적합한 조건에서 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 항온처리하고, 원하는 성질을 가진 돌연변이된 DNA를 선별함으로써 수행된다.Examples of suitable physico-chemical mutagens for this purpose include ultraviolet (UV), irradiated hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), O- methylhydroxylamine, nitric acid, ethyl Methane sulfonate (EMS), sodium sulfite, formic acid, and nucleotide analogs. When such a substance is used, mutagenesis is typically carried out by incubating a DNA sequence coding for the parent enzyme in a condition suitable for mutagenesis in the presence of the selected mutagen causing substance to be mutagenized, and screening the mutated DNA having desired properties .
올리고뉴클레오티드을 사용하여 돌연변이 유발이 수행될 때, 하나의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성하는 동안 바뀌어야 할 위치에서 세개의 비-모 뉴클레오티드로 혼입되거나 섞여진다. 혼입 또는 섞임은, 그것을 수행하여, 원하지 아니하는 아미노산에 대한 코돈은 회피되도록 수행된다. 혼입 되거나 섞인 올리고뉴클레오티드은 예를 들어 PCR, LCR, 또는 적합하다고 여겨지는 어떤 DNA 중합효소 및 리가아제를 사용하여, 어떠한 공지된 기술에 의하여도 글루코아밀라제 효소를 코드화하는 DNA 속으로 삽입될 수 있다.When mutagenesis is performed using oligonucleotides, one oligonucleotide is incorporated or mixed with three non-mononucleotides at positions that need to be changed during oligonucleotide synthesis. Incorporation or blending is carried out so as to avoid codons for unwanted amino acids. The incorporated or mixed oligonucleotides can be inserted into DNA encoding the glucoamylase enzyme by any known technique, for example, using PCR, LCR, or any DNA polymerase and ligase that are considered suitable.
바람직하게는, 혼입은 야생형과 돌연변이의 비율이 미리 정의된 "일정한 무작위 혼입"을 사용하여 수행된다. 더 나아가서, 혼입은 어떤 뉴클레오티드의 도입이 우위가 되는, 그리고 그것에 의하여 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입되는 것이 우위가 되는 방향으로 나아간다. 혼입은 예를 들어 각 위치에서 90%의 야생형과 10%의 돌연변이가 도입되도록 만들어진다. 혼입 계획의 선택에서 덧붙여 고려할 점은 단백질-구조적 뿐아니라 유전적 제약이다. 혼입 계획은 특히 종결 코돈의 삽입이 회피되는 것을 확실이 하는, DOPE 프로그램을 사용하여 만들어져야 한다.Preferably, the incorporation is carried out using a " constant random incorporation " in which the ratio of wild type and mutation is predefined. Furthermore, incorporation proceeds in the direction in which the introduction of certain nucleotides is predominant, thereby leading to the introduction of one or more specific amino acid residues. Incorporation is made, for example, to introduce 90% of wild type and 10% of mutations at each site. In addition to the choice of inclusion plan, it is a genetic constraint as well as protein-structural. Incorporation schemes should be made using the DOPE program, which ensures that insertion of the termination codon is avoided in particular.
PCR에 의하여 생성되는 돌연변이 유발이 사용될 때에는, 모 글루코아밀라제를 코드화하는 화학적으로 처리 또는 비처리 유전자가 뉴클레오티드의 잘못된 삽입을 증가시키는 조건 하에서 PCR이 수행된다 (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).When PCR-induced mutagenesis is used, PCR is performed under conditions that chemically treated or untreated genes encoding moglucoamylase increase false insertion of nucleotides (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol 1, 1989, pp. 11-15).
E.coli, S. cereviseae, 또는 어떤 다른 미생물의 돌연변이 균주도 모 글리코실라제를 내포하는 플라스미드를 돌연변이 균주내로 형질전환하고, 그 돌연변이 균주를 그 플라스미드와 함께 성장시켜, 그리고 그 변이된 플라스미드를 그 돌연변이 균주으로부터 분리함으로써 글루코아밀라제를 코드화하는 DNA의 무작위 돌연변이 유발에 사용될 수 있다. 변이된 플라스미드는 그 다음에 발현을 위한 생물체내로 형질전환된다.A mutant strain of E. coli, S. cereviseae, or any other microorganism transforms a plasmid containing a mogriscosylase into a mutant strain, grows the mutant strain with the plasmid, and transforms the mutated plasmid Can be used for random mutagenesis of DNA encoding glucoamylase by isolation from the mutant strain. The mutated plasmid is then transformed into an organism for expression.
돌연변이 유발될 DNA 서열은 편리하게도 모 글루코아밀라제를 발현하는 생물체로부터 마련된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리안에 존재한다. 대안으로는, 그 DNA 서열은 플라스미드나 박테리오파지와 같은 적합한 벡터상에 존재하는데, 이와같은 벡터는 그러지 아니하면 돌연변이 유발 물질에 노출되므로 함께 가온 방치된다. 돌연변이 유발될 DNA 서열은 또한 숙주세포의 유전체에 삽입되어 있거나 그 세포안에 정착된 벡터로 존재하면서 숙주세포 안에 존재한다. 마지막으로 돌연변이 유발될 DNA 서열은 유리된 형태로 존재한다. 무작위 돌연변이 유발의 대상이 될 DNA는 바람직하게는 cDNA 또는 게놈DNA라는 것이 이해될 것이다.The DNA sequence to be mutagenized is conveniently present in a genomic DNA or cDNA library prepared from an organism expressing the moglucoamylase. Alternatively, the DNA sequence is present on a suitable vector, such as a plasmid or bacteriophage, which if not otherwise exposed to the mutagenic agent, is allowed to warm together. The DNA sequence to be mutagenized is also present in the host cell, either as a vector inserted into the genome of the host cell or as a settled vector in the cell. Finally, the DNA sequence to be mutagenized is in a free form. It will be appreciated that the DNA to be subjected to random mutagenesis is preferably cDNA or genomic DNA.
어떤 경우에 있어서는 발현 단계 b) 또는 선별 단계 c)를 수행하기 전에 돌연변이된 DNA 서열을 증폭하는 것이 편리하다. 이와같은 증폭은 당업계에 알려진 방법, 현재에 바람직한 방법은 모 효소의 DNA 또는 아미노산 서열을 바탕으로 마련된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 생성된 증폭에 따라 수행된다.In some cases it is convenient to amplify the mutated DNA sequence before performing the expression step b) or the selection step c). Such amplification is carried out according to methods known in the art, and currently preferred methods are amplification by PCR using oligonucleotide primers based on the DNA or amino acid sequence of the parent enzyme.
함께 항온처리 또는 돌연변이 유발물질에의 노출에 이어서, 돌연변이된 DNA는 발현이 이루어지는 것을 허용하는 조건하에서, DNA서열을 운반하고 있는 적합한 숙주 세포를 배양하는 것에 의하여 발현된다. 이 목적에 사용되는 숙주세포는 선택적으로 벡터안에 존재하는, 돌연변이된 DNA 서열이 형질전환된, 또는 돌연변이유발 처리 과정동안 모효소를 코드화하는 DNA 서열을 운반한 숙주세포이다. 적합한 숙주 세포의 예는 다음과 같다: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans 또는 Strepetomyces murinus와 같은 그람 양성 세균; 및 E.coli같은 그람 음성 세균.Following co-incubation or exposure to a mutagen, the mutated DNA is expressed by culturing a suitable host cell carrying the DNA sequence, under conditions permitting expression to occur. The host cell used for this purpose is a host cell optionally carrying a DNA sequence which is present in the vector, in which the mutated DNA sequence has been transformed or which encodes the parent enzyme during the mutagenesis process. Examples of suitable host cells are: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus amaloliquefaciens, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans or Strepetomyces gram-positive bacteria such as murinus; And gram-negative bacteria such as E. coli.
돌연변이된 DNA서열은 더 나아가 변이된 DNA서열의 발현을 용인하는 기능을 코드화하는 DNA서열로 구성된다.The mutated DNA sequence further comprises a DNA sequence encoding a function that allows for the expression of the mutated DNA sequence.
편재된 무작위 돌연변이 유발Ubiquitous random mutagenesis
무작위 돌연변이 유발은 문제의 모 글루코아밀라제의 한 부분에 유리하게 편재된다. 이것은, 예를 들어, 그 효소의 어떤 영역이 그 효소의 주어진 특성에 특히 중요함이 동정된 때, 그리고 변형에 의해 개선된 특성을 갖는 변이의 결과가 예상될때에 유리하다. 이와 같은 영역은 정상적으로는 모 효소의 4차구조가 밝혀지고 그 효소의 기능과 관련이 된 때에 동정된다.Random mutagenesis is ubiquitous in favor of a portion of the moglucoamylase in question. This is advantageous when, for example, an area of the enzyme is identified as being of particular importance to a given property of the enzyme, and the result of a variation with improved properties is expected. These regions are normally identified when the quaternary structure of the parent enzyme is revealed and related to the function of the enzyme.
편재된, 또는 영역-특이적, 무작위 돌연변이유발은 위에 기술된 바와 같은 PCR에 의하여 생성된 돌연변이 유발 기술 또는 당업계에 알려진 적합한 다른 기술을 사용하여 편리하게 수행된다. 대안으로, 변형될 DNA서열의 부분을 코드화하는 DNA서열은 분리되고, 예를 들어, 적합한 벡터 안으로의 삽입에 의하여, 그리고 전기한 부분은 그다음에 위에 논의된 돌연변이 유발 방법 중 어느 하나를 사용하여 돌연변이 유발의 대상으로 한다.Ubiquitous, or region-specific, random mutagenesis is conveniently performed using mutagenesis techniques generated by PCR as described above or other suitable techniques known in the art. Alternatively, the DNA sequence encoding the portion of the DNA sequence to be modified may be separated and inserted, for example, by insertion into a suitable vector, and then the transferred portion may then be subjected to mutagenesis using any of the mutagenesis methods discussed above It is the object of induction.
이 발명의 변이체를 만들기 위한 대안적 방법은 WO 95/22625 (Affymax Technologies N.V.) 또는 WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S)에 서술된 바와 같은 유전자 혼합법(gene shuffling)을 포함한다.Alternative methods for making variants of this invention include gene shuffling as described in WO 95/22625 (Affymax Technologies NV) or WO 96/00343 (Novo Nordisk A / S).
글루코아밀라제 변이체의 발현Expression of glucoamylase variants
본 발명에 따르면, 전기한 방법, 또는 당업계에서 알려진 대안의 방법 중의 하나에 의하여 생산된 변이체을 코드화하는 DNA서열은, 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 부착 부위, 번역 개시 신호, 및 선택적으로, 억제 유전자나 다양한 활성인자 유전자를 코드화하는 조절 서열을 전형적으로 포함하는 발현벡터를 사용하여 효소의 형태로 발현될 수 있다.According to the present invention, the DNA sequence encoding the variant produced by one of the methods described herein, or alternatively known in the art, can be a promoter, an operator, a ribosome attachment site, a translation initiation signal, Can be expressed in the form of an enzyme using an expression vector typically comprising a regulatory sequence that encodes an activator gene.
발현벡터Expression vector
본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열을 운반하는 재조합 발현벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정의 대상이 되는 벡터 중 어느 하나이고, 벡터의 선택은 종종 그 벡터가 도입될 숙주세포에 의존된다. 벡터는 숙주세포에 도입될 때 숙주세포 유전체에 삽입되어 그 벡터가 삽입된 염색체와 함께 복제되는 벡터이다. 적합한 발현벡터의 예는 pMT838을 포함한다.The recombinant expression vector carrying the DNA sequence encoding the glucoamylase variant of the present invention is conveniently one of the vectors to be subjected to the recombinant DNA procedure, and the selection of the vector is often dependent on the host cell into which the vector is to be introduced. A vector is a vector that, when introduced into a host cell, is inserted into a host cell genome and replicated along with the inserted chromosome. An example of a suitable expression vector includes pMT838.
프로모터Promoter
벡터안에서, DNA서열은 적합한 프로모터 서열과, 작동가능하도록 연결되어야 한다. 프로모터는 선택적 숙주 내에서 번역 활성을 나타내는 DNA 서열중의 하나이고 숙주세포에 대하여 상동적인, 또는 상이적인 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유래한다.Within the vector, the DNA sequence should be operably linked to the appropriate promoter sequence. A promoter is one of DNA sequences that exhibits translation activity in an alternative host and is derived from a gene encoding a protein that is homologous or different to the host cell.
본 발명의 글루코아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열의 전사를 이끌어내기 위한 적합한 프로모터의 예, 특히 세균에서의 예는 E.coli의 lac 오페론의 프로모터, Streptomyces coelicolor 의 agarase 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformisa-amylase 유전자 (amyL) 의 프로모터, Bacillus strearothermophilus 의 말토스합성 아밀라제 유전자 (amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciensa-아밀라제 (amyQ)의 프로모터, Bacillus subtilis xylA와 xlyB 유전자의 프로모터 등이다. 균류 숙주에서의 전사를 위하여는, 유용한 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, S. cerevisiae 에서 유래한 TPI (트리오스 포스페이트 이성화효소)프로모터(Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p.419-434), Rhizomucor miehei 아스파르트 프로티나제, A. niger의 중성a-아밀라제, A. niger의 산에 안정한a-아밀라제, A. niger의 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae의 알칼리 프로테아제, A. oryzae 의 트리오스 포스페이트 이성화효소, 또는 A. nidulans 아세트아미다제 등을 코드화하는 유전자에서 유래한 프로모터이다.Examples of suitable promoters for deriving the transcription of a DNA sequence encoding the glucoamylase variants of the present invention, in particular in bacteria, include the promoter of the lac operon of E. coli, the dagA promoter of the agarase gene of Streptomyces coelicolor, the promoter of the bacillus licheniformis a- amylase The promoter of the gene (amyL), the promoter of the maltose synthase amylase gene (amyM) of Bacillus strearothermophilus, the promoter of Bacillus amyloliquefaciens a- amylase (amyQ), and the promoter of Bacillus subtilis xylA and xlyB gene. For transfection in fungal hosts, useful examples are A. oryzae TAKA amylase, TPI (triose phosphate isomerase) promoter from S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1 , p.419-434), Rhizomucor miehei aspartate protease, neutral a- amylase of A. niger, stable a- amylase in the acid of A. niger, A. niger glucoamylase, Rhizomucor miehei lipase, A. oryzae An alkaline protease, a triose phosphate isomerase of A. oryzae, or A. nidulans acetamidase, and the like.
발현벡터Expression vector
본 발명의 발현벡터는 또한 적합한 전사 종결인자로 구성되어 있고, 진핵세포에서는 다중 아데닐화 서열이 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA서열과 조작가능하도록 연결되어 있다. 종결과 폴리아데닐화 서열은 적합하게 프로모터와 동일한 기원에서 유래한다.The expression vectors of the invention are also comprised of suitable transcription termination factors, and in eukaryotic cells, multiple adenylation sequences are operably linked to DNA sequences encoding the alpha -amylase variants of the invention. Termination and polyadenylation sequences suitably originate from the same origin as the promoter.
벡터는 더 나아가 벡터가 문제의 숙주 세포에서 복제하는 것을 가능하게 하는 DNA 서열로 구성되어 있다. 이와 같은 서열의 예는 플라스미드인 pUS19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 개시점이다.The vector further comprises a DNA sequence that enables the vector to replicate in the host cell in question. Examples of such sequences are the cloning start points of the plasmids pUS19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.
벡터는 또한 B. subtilis 또는 B. licheniformis의 dal 유전자, 또는 엠피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제내성을 지니는 유전자와 같은 선택마커, 즉 숙주세포의 결함을 보충하는 산물의 유전자, 로 구성되어 있다. 더 나아가, 벡터는 amdS, argB, niaD, 및 하이그로마이신(hygromycin) 내성을 일으키는 마커인 sC와 같은 Aspergillus 선택마커로 구성되어 있거나, 또는 WO 91/17243에 기술된 바와 같이, 공-형질전환에 의하여 선택성이 획득된다.The vector may also be a selection marker such as a B. subtilis or B. licheniformis dal gene or a gene having an antibiotic resistance such as ampicillin, kanamycin, chloramphenicol, or tetracycline resistance, i.e., a gene of a product complementary to a defect in a host cell, . Furthermore, the vector consists of Aspergillus selectable markers such as amdS, argB, niaD, and hygromycin resistant markers, such as sC, or as described in WO 91/17243, Selectivity is obtained.
본 발명의, 글루코아밀라제 변이체, 프로모터, 종결인자, 및 다른 인자들 각각을 코드화하는 DNA제작물을 연결하고, 이를 복제에 필수적인 정보를 포함하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용되는 방법은 당업계에서 숙련된 자에게 주지되어 있다 (참고., 예를 들어, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, 1989).Methods used to ligate a DNA construct encoding each of the glucoamylase variants, promoters, termination factors, and other factors of the present invention, and insert it into a suitable vector containing information essential for replication, include those skilled in the art (See, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989).
숙주세포Host cell
위에 정의한 바대로 DNA 구조체 또는 본 발명의 발현벡터로 이루어져 있는 본 발명의 세포는 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 재조합의 생산에, 숙주세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 DNA 구조체(하나 또는 그이상의 복제본)을 숙주세포 염새체 안으로 삽입함에 의하여, 변이체를 코드화하는 본발명의 DNA 구조체와 함께 형질전환된다. 이 삽입은 DNA서열이 세포내에서 안정하게 유지될 가능성이 높다는 잇점이 있는것으로 일반적으로 생각되고 있다. DNA 구조체들의 숙주 염색체 안으로의 삽입은 편리한 방법, 예를 들면 상동적 또는 상이적 재조합 방법, 에 따라 수행된다. 대안으로는, 세포는 다른 종류의 숙주세포와 관련하여 위에 기술된 바와 같이 발현벡터를 사용하여 형질전환된다.The cells of the present invention composed of a DNA construct or an expression vector of the present invention as defined above are advantageously used as a host cell in the production of recombinant glucoamylase variants of the present invention. The cell is transformed with the DNA construct of the invention encoding the variant, by inserting the DNA construct (one or more copies) into the host cell envelope. This insertion is generally considered to have the advantage that the DNA sequence is likely to remain stable in the cell. Insertion of the DNA constructs into the host chromosome is carried out according to a convenient method, for example a homologous or anisotropic recombination method. Alternatively, the cells are transformed using an expression vector as described above in connection with other types of host cells.
본 발명의 세포는 포유류나 곤충과 같은 고등 생물의 세포가 되기도 하지만, 바람직하게는 미생물 세포, 예를들면 세균 또는 곰팡이 (효모 포함) 세포이다.The cell of the present invention may be a cell of a higher organism such as a mammal or an insect, but is preferably a microbial cell, for example, a bacterium or a fungal (including yeast) cell.
적합한 세균의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus,Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans, 또는 Streptomyces murinus과 같은 그람 양성 세균, 또는 E. coli 같은 그람 음성 세균이다. 박테리아의 형질전환은 원형질체 형질전환에 의해, 또는 수용(competent) 세포를 사용함에 의하여 그 자체로 알려진 바대로 달성된다.Examples of suitable bacteria include bacteria such as Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus lentus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis or Streptomyces lividans, Gram-positive bacteria, or gram-negative bacteria such as E. coli. Transformation of the bacteria is accomplished by protoplast transformation, or by using competent cells, as is known per se.
효모 생물체는 예를 들어 Saccharomyces cerevisiae 같은 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces의 종으로 부터 호의적으로 선택된다.Yeast organisms are favorably selected from species of Saccharomyces or Schizosaccharomyces such as, for example, Saccharomyces cerevisiae.
숙주세포는 또한 사상균, 예를 들어 Aspergillus의 종, 가장 바람직하게는 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger에 속하는 균주, 또는 Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (완전한 상태에서는 Gribberella zeae라 명명하고, 이전에는 Gibberella roseum f. sp. cerealis), 또는 Fusarium sulphureum (완전한 상태에서는 Gibberella puricaris라고 명명하고, Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, 및 Fusarium roseum var. graminearum과 동의어), Fusarium cerealis (Fusarium cokkwellnse와 동의어), 또는 Fusarium venenatum의 균주와 같은 Fusarium의 균주이다.The host cell may also be a filamentous fungus, for example a species of Aspergillus, most preferably a strain belonging to Aspergillus oryzae or Aspergillus niger, or a strain belonging to the genus Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (designated as Gribberella zeae in the complete state and formerly Gibberella roseum f. Fusarium cerealis (synonymous with Fusarium cokkwellnse), or Fusarium venenatum (synonym of Fusarium spp.), or Fusarium sulphureum (termed Gibberella puricaris in its complete state, synonymous with Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, and Fusarium roseum var. graminearum) Like strain of Fusarium.
발명의 한 바람직한 구체예에서는 숙주세포는 프로테아제가 결핍되거나 또는 결손된 균주이다.In one preferred embodiment of the invention, the host cell is a strain deficient or deficient in protease.
이것은 예를 들어 "apl"라 명명되는 유전자가 결실된 염기성 프로테아제를 갖는, 프로테아제 결핍 균주인 Aspergillus oryzae Jal 125이 된다. 이 균주은 WO97/35956 (Novo Nordica)에 서술되어 있다.This results in a protease-deficient strain, Aspergillus oryzae Jal 125, which has a basic protease, for example a gene named " apl " This strain is described in WO 97/35956 (Novo Nordica).
사상균 세포는 원형질체 제작과그 자체로알려진 방법에 따라, 세포벽의 재생산이 후속되는 원형질체의 형질전환과 관련된 과정에 의하여 형질전환된다. Aspergillus를 숙주 미생물로 사용하는 것은 EP 238 023 (Novo Nordisk A/S)에 기술되어 있고, 그 내용은 참고문헌으로써 여기에 삽입되어 있다.The fungal cell is transformed by a process related to the transformation of the protoplast, which is followed by reproduction of the cell wall, according to the production of the protoplast and the method known per se . The use of Aspergillus as a host microorganism is described in EP 238 023 (Novo Nordisk A / S), the contents of which are incorporated herein by reference.
글루코아밀라제 변이체의 제작방법Production method of glucoamylase variant
좀더 나아간 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 글루코아밀라제의 변이체를 생산하는 방법과 관련이 있는데, 그 방법은 그 변이체를 생산하는데 도움이 되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것과 그 변이체를 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수하는 것으로 구성되어 있다.In a further aspect, the invention relates to a method of producing a variant of a glucoamylase of the invention, comprising culturing a host cell under conditions conducive to producing the variant, contacting the variant with a cell and / And is recovered from the culture medium.
숙주세포를 배양하는데 사용된 배지는 문제의 숙주세포를 성장시키고 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 발현을 얻는데 적합한 통상적 배지중의 하나이다. 적합한 배지는 상업적 공급자로부터 이용가능하거나 또는 공지된 방법에 따라서 마련될 수 있다(예를 들어 American Type Culture Collection 의 카탈로그에 기술되 바에 따라).The medium used for culturing the host cells is one of the usual medium suitable for growing the host cell of interest and obtaining the expression of the glucoamylase variants of the present invention. Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to known methods (for example as described in the catalog of the American Type Culture Collection).
숙주세포로부터 분비된 글루코아밀라제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과를 통하여 배지로부터 분리하는 것과, 그리고 배지에서 단백질을 포함하는 구성물을 황산 암모늄과 같은 염을 이용하여 침전시키는 것을 포함하는 주지된 과정에 따라 배지로부터 편리하게 회수되며, 이 과정은 이온교환수지, 친화성 크로마토그래피, 또는 이와 유사한 과정과 같은 크로마토그래피 과정의 사용으로 이행된다.Glucoamylase variants secreted from the host cells can be prepared by separating the cells from the culture medium by centrifugation or filtration and precipitating the protein-containing composition in a medium with a salt such as ammonium sulfate Conveniently recovered from the medium, and this process is carried out with the use of a chromatographic procedure such as ion exchange resin, affinity chromatography, or the like.
녹말 전환Starch conversion
본 발명은 포도당 생산과 그와 유사한 것을 녹말로부터 생산함에 본발명의 글루코아밀라제 변이체를 사용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은a-아밀라제의 존재하의 전구체 녹말의 부분적 가수분해와 그리고 그 다음으로 글루코아밀라제 존재하의a-(1→4) 및a-(1→6) 글루코시딕 결합의 절단을 통한 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원말단으로부터 D-포도당의 방출물의 더 나아간 가수분해 단계를 포함한다.The present invention provides a method of using the glucoamylase variant of the present invention to produce glucose production and the like from starch. Generally, the method involves the partial hydrolysis of the precursor starch in the presence of a- amylase and the subsequent hydrolysis of starch through the cleavage of a- (1 → 4) and a- (1 → 6) glucosidic bonds in the presence of glucoamylase Or a further hydrolysis step of the release of D-glucose from the non-reducing end of the associated oligosaccharide and polysaccharide molecule.
a-아밀라제를 이용한 전구체 녹말의 부분적 가수분해는 녹말 분자의 내부의a-(1→4)-결합의 가수분해를 통한 첫 분해를 제공한다. 상업적 응용에서는,a-아밀라제를 사용한 첫 가수분해는 약 105℃의 온도에서 수행된다. 통상적으로 30% 내지 40% 고체의 매우 높은 녹말 농도가 처리된다. 첫 가수분해는 통상적으로 이런 상승된 동도에서 5분간 수행된다. 부분적으로 가수분해된 녹말은 두번째 용기로 옮겨지고 10 내지 15의 덱스트로스 평형체(D.E.)를 만들기 위해 85℃내지 98℃의 온도에서 대략 1 내지 2시간동안 항온처리될 수 있다.Partial hydrolysis of the precursor starch with a - amylase provides the initial degradation through hydrolysis of the a- (1 → 4) -bonds inside the starch molecule. In commercial applications, the initial hydrolysis with a- amylase is carried out at a temperature of about 105 ° C. Very high starch concentrations of 30% to 40% solids are typically treated. Initial hydrolysis is typically carried out for 5 minutes in these elevated isotopes. The partially hydrolyzed starch is transferred to a second container and can be incubated at a temperature of 85 ° C to 98 ° C for about 1-2 hours to make a dextrose equilibrium (DE) of 10-15.
글루코아밀라제 존재 하에서의 녹말 또는 연관된 올리고당과 다당 분자의 비환원 말단으로부터의 D-포도당의 분출물의 더 나아간 가수분해의 단계는 보통 30℃와 62℃사이의 낮아진 온도하에서 분리된 용기에서 수행된다. 바람직하게는 기질 용액의 온도는 55℃와 60℃사이로 떨어진다. 용액의 pH는 약 5.5 내지 6.5으로부터 3과 5.5 사이 범위로 떨어진다. 바람직하게는, 용액의 pH는 4 내지 4.5이다. 글루코아밀라제가 용액에 첨가되고 24 내지 72 시간동안, 바람직하게는 36 내지 48 시간동안 반응이 수행된다.The step of further hydrolysis of the exudate of D-glucose from the non-reducing end of starch or related oligosaccharides and polysaccharide molecules in the presence of glucoamylase is usually carried out in separate vessels at lower temperatures between 30 ° C and 62 ° C. Preferably the temperature of the substrate solution falls between 55 [deg.] C and 60 [deg.] C. The pH of the solution falls from about 5.5 to 6.5 in the range between 3 and 5.5. Preferably, the pH of the solution is between 4 and 4.5. Glucoamylase is added to the solution and the reaction is carried out for 24 to 72 hours, preferably 36 to 48 hours.
본 발명의 내열성 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 회분식 당화공정보다 더 높은 온도에서 당화공정들이 수행된다. 본 발명에 따르면 당화과정은 60℃이상내지 80℃ 범위의 온도들, 바람직하게는 63℃ 내지 75℃ 수행될 수 있다. 이것은 전통적 회분식 과정 (상기한 바대로) 및 연속식 당화과정 양자 모두에 적용한다.The saccharification processes are carried out at a higher temperature than the batch saccharification process using the heat resistant glucoamylase variant of the present invention. According to the present invention, the saccharification process can be carried out at temperatures in the range of 60 ° C to 80 ° C, preferably 63 ° C to 75 ° C. This applies to both traditional batch processes (as described above) and continuous saccharification processes.
실제적으로, 하나 이상의 막에 의하여 분리된 과정들을 포함하는 연속 당화 과정들은 막을 통한 합당한 높은 유입을 유지할 수 있기 위하여 또는 세균의 오염을 최소화하기 위하여, 60℃이상의 온도에서 수행되어야 한다. 그러므로, 본 발명의 내열성 변이들은 공업적인 당화 공정에서 받아들일 수 있는 시간의 기간내에, 낮은 비용 및/또는 더 낮은 효소 단백질의 양으로도 대규모 연속 당화 공정들을 수행할 수 있는 가능성을 제공한다. 본 발명에 따르면, 당화시간은 더 단축될 수 있다.In practice, sequential saccharification processes involving processes separated by one or more membranes must be performed at a temperature of 60 ° C or higher, in order to maintain a reasonably high inflow through the membrane or to minimize bacterial contamination. Therefore, the heat-resistant variations of the present invention provide the possibility to perform large-scale continuous saccharification processes even at low cost and / or with a lower amount of enzyme protein within a period of time acceptable in an industrial saccharification process. According to the present invention, the saccharification time can be further shortened.
본 발명의 글루코아밀라제 변이체(예를 들어 AMG 변이체)의 활성은 전통적으로 사용되는 30℃ 내지 60℃사이의 온도에서보다 60℃ 내지 80℃ 사이의 범위에서 일반적으로 충분히 더 높다. 그러므로, 글루코아밀라제가 작동하는 온도를 높임으로써 당화 과정은 더 짧은 시간의 기간동안 수행된다.The activity of the glucoamylase variants of the present invention (for example AMG variants) is generally sufficiently high in the range between 60 ° C and 80 ° C than at temperatures between 30 ° C and 60 ° C, which is traditionally used. Therefore, by increasing the temperature at which glucoamylase works, the saccharification process is performed for a shorter period of time.
더 나아가, 열안정성을 개선함으로써 T1/2(반감기, 재료 및 방법 편에 정의된 대로)는 개선될 수 있다. 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 열 안정성이 개선되어서, 당화 과정동안 불활성화된 글루코아밀라제와 교체하기 위하여 소량의 글루코아밀라제가 첨가되면 된다. 본 발명에 따르면 당화과정동안 더 많은 글루코아밀라제가 활성이 유지된다. 더욱 더 나아가, 63℃이상의 온도에서 당화과정이 수행되는 동안 미생물에 의한 오염의 위험 또한 줄어든다.Furthermore, by improving thermal stability, T 1/2 (as defined in the Half-Life, Materials and Methods section) can be improved. The thermal stability of the glucoamylase variants of the invention is improved so that a small amount of glucoamylase may be added to replace the inactivated glucoamylase during the glycation process. According to the present invention, more glucoamylase activity is maintained during the glycation process. Furthermore, the risk of contamination by microorganisms during the glycation process at temperatures above 63 ° C is also reduced.
글루코밀라제, 아밀라제 및 풀루란나제를 이용한 전형적인 당화 시도로부터의 포도당 수율은 95.5% 내지 96.5% 이다. 나머지 탄수화물들은 1%의 말토스, 1.5 내지 2%의 이소말토스, 및 1 내지 1.5%의 가수가 더 높은 올리고당들로 구성되어 있다. 이당류들은, 포도당 농도가 높고 건조 고체의 수위가 높은 때의 글루코아밀라제는 역반응산물을 형성하는 경향이 있기 때문에, 생산된다.The glucose yield from a typical saccharification trial using glucoamylase, amylase and pullulanase is 95.5% to 96.5%. The remaining carbohydrates are composed of 1% maltose, 1.5-2% isomaltose, and 1 to 1.5% of the higher oligosaccharides. Disaccharides are produced because glucoamylase tends to form a reverse reaction product when the glucose concentration is high and the level of the dry solid is high.
액화된 후 용액내 존재하는 당류들 및 당화과정에서 생성된 당류들로의 증가된 특이활성을 갖는 글루코아밀라제는 사용될 수 있는 것보다 줄어든 효소 용량 또는 더 짧아진 과정 시간 때문에 잇점이 있다. 일반적으로, 글루코아밀라제는 더 짧은 사슬 당류에 비해 더 긴 당류로 구성된 기질들에 선호성을 가지고 예를 들어 말토헵토스에 대한 특이활성이 따라서 말토스에 대하여 보다 6배 더 높다. 말토스와 같은 짧은 사슬 당류에 대한 증가된 특이활성(올리고당에 대한 활성의 감소 없는)은 따라서 또한 더 낮은 효소 용량 및/또는 더 짧은 과정 시간의 사용을 가능하게 한다.Glucoamylases with increased specific activity to saccharides present in the solution after liquefaction and sugars produced in the saccharification process are advantageous due to reduced enzyme capacity or shorter process times than can be used. In general, glucoamylases have a preference for substrates composed of longer saccharides compared to shorter chain sugars and, for example, the specific activity for maltoheptose is therefore six times higher than for maltose. Increased specific activity (with no reduction in activity on oligosaccharides) for short chain sugars such as maltose thus also allows the use of lower enzyme capacity and / or shorter process times.
더 나아가, 더 높은 포도당 수율은, 감소된 분량의 효소 단백질이 사용되므로, 증가된 α-1,4 가수분해 활성(만약 α-1,6 활성이 변하지 아니하거나 또는 줄어든다면)을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 이용하여 얻어 질 수 있고 α-1,6 역반응 산물은 따라서 줄어든다(더 적은 양의 이소말토스).Furthermore, higher glucose yields are obtained when a reduced amount of enzyme protein is used, so that a glucoamylase variant having increased < RTI ID = 0.0 > a-1,4 < / RTI > hydrolysing activity (if the & And the α-1,6 back-reaction product is thus reduced (less isomaltose).
특이활성은 37℃ 또는 60℃에서, "재료 및 방법" 편에서 기술된 방법을 사용하여 측정된다.Specific activity is measured at 37 ° C or 60 ° C using the method described in the "Materials and Methods" section.
그 안에 본 발명의 글루코아밀라제 변이체들이 사용되는 당화과정의 실시예는 JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987; EP452,238, 와 WO 99/27124 (모든 참고문헌은 참고문헌으로서 여기 삽입되어 있다)에 기술된 과정들을 포함한다.Examples of the glycation process in which the glucoamylase variants of the present invention are used are described in JP 3-224493; JP 1-191693; JP 62-272987; EP452,238, and WO 99/27124 (all references incorporated herein by reference).
본 발명의 더 나아간 측면은 다음의 단계들로 구성된, 액화된 녹말용액의 당화하는 방법과 관련이 있다.A further aspect of the present invention relates to a method of saccharifying a liquefied starch solution comprising the following steps.
(i) 그 단계동안 하나 이상의 효소 당화기간들이 일어나는 당화 단계, 그리고 그 다음 단계로서(i) a saccharification step in which one or more enzyme saccharification periods occur during that step, and
(ii) 하나 이상의 높은 온도의 막분리 단계(ii) at least one high temperature membrane separation step
상기 효소 당화는 본 발명의 내열성 글루코아밀라제 변이체를 사용하여 수행된다.The enzyme saccharification is carried out using the heat resistant glucoamylase variant of the present invention.
본 발명의 글루코아밀라제 변이체(들)은 본 발명의 과정에서는 오직 4개이상의 포도당 잔기 분자내의α-(1→6)-글리코시딕 결합만 가수분해하는 효소와 조합하여 사용된다. 선호적으로는, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 풀루란나제 또는 이소아밀라제와 조합하여 사용될 수 있다. 탈분지를 위한 이소아밀라제와 풀루란나제의 사용, 그 효소들의 분자적 특성, 및 효소들의 글루코아밀라아재와의 잠재적 사용은 G.M.A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142에 설명되어 있다.The glucoamylase variant (s) of the present invention are used in combination with enzymes that hydrolyze only the ? - (1? 6) -glycosidic linkage in only four or more glucose residue molecules in the course of the present invention. Preferably, the glucoamylase variant of the present invention can be used in combination with pullulanase or isoamylase. The use of isoamylase and pullulanase for de-branching, the molecular properties of the enzymes, and the potential use of enzymes with Glucoamylase have been reviewed by GMA van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985 , 101-142.
더 나아간 측면에서는 본 발명은 녹말 전환 과정에서의 본 발명의 글루코아밀라제 변이체의 사용과 관련이 있다.In a further aspect, the invention relates to the use of the glucoamylase variants of the invention in the process of starch conversion.
더 나아가, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 연속 당화 단계들을 포함하여 연속 녹말 전환 과정에 사용된다.Furthermore, the glucoamylase variants of the present invention are used in a continuous starch conversion process, including sequential saccharification steps.
본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 고정화된 형태로 사용될 수 있다. 이것은 말토스 시럽과 같은 특화된 시럽들을 생산 하는데, 및 더 나아가 과당 시럽의 생산과 관련된 올리고당의 추출 찌꺼기 흐름에 적합하고 자주 사용된다.The glucoamylase variant of the present invention can also be used in immobilized form. It is suitable for the production of specialized syrups such as maltose syrup and, moreover, suitable for the extraction residue stream of oligosaccharides associated with the production of fructose syrup.
본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 또한 연료 또는 음료로서의 에탄올을 생산하는 과정에 사용되거나 또는 시트르산, 아스코르브산, 라이신, 글루탐산과 같은 유기 화합물들을 생산하기 위한 발효공정에 사용된다.The glucoamylase variants of the present invention are also used in the process of producing ethanol as a fuel or beverage or in a fermentation process for producing organic compounds such as citric acid, ascorbic acid, lysine and glutamic acid.
재료 및 방법Materials and methods
재료:material:
효소들:Enzymes:
AMG G1: Boel etal. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, 및 SEQ ID NO: 13 에 개시된 Aspergillus niger 글루코아밀라제 G1, Novo Nordisk로부터 이용가능AMG G1: Boel etal. (1984), EMBO J. 3 (5), 1097-1102, and Aspergillus niger glucoamylase G1 disclosed in SEQ ID NO: 13, available from Novo Nordisk
AMG G2: SEQ ID NO: 2에 나타난 절단된 Aspergillus niger의 글루코아밀라제, G1 Novo Nordisk로부터 이용가능AMG G2: a truncated Aspergillus niger glucoamylase as shown in SEQ ID NO: 2, available from G1 Novo Nordisk
용액들:Solutions:
완충액: 0.05M 아세트산나트륨 ( 1L milli-Q 물에 6.8g ), pH 4.5Buffer: 0.05 M sodium acetate (6.8 g in 1 L milli-Q water), pH 4.5
정지용액: 0.4M NaOHStop solution: 0.4 M NaOH
GOD-perid, 124036, Boehringer MannheimGOD-perid, 124036, Boehringer Mannheim
기질들:Substrates:
말토스: 29mM ( 100ml 50mM 아세트산 나트륨에 1g의 말토스, pH4.5) (Sigma)Maltose: 29 mM (1 ml maltose in 100 ml 50 mM sodium acetate, pH 4.5) (Sigma)
말토헵토스: 10mM, 115mg/10ml (Sigma)Maltothecose: 10 mM, 115 mg / 10 ml (Sigma)
숙주 세포:Host cells:
A. oryzae JaL 125: Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-chome Yodogawa-ku, Osaka, Japan으로부터 이용가능하고, A. oryzae pyrG 유전자를 마커로 사용하여 1단계 유전자 교환방법(G. May에 의하여 "Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" (1992), p.1-25. Eds. J. R. Kinghorn 및 G. Turner; Blackie Academic and Professional에 서술됨)에 의하여 결실된 "alp"(Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem. 55, p. 2807-2811에 서술됨)라 칭하는 알칼리성 프로테아제 유전자를 가진 Aspergillus oryzae IFO 4177. JaL 125 균주은 더 나아가 WO 97/35956 (Novo Nordisk)에 개시되었다.A. oryzae JaL 125: Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-chome Available from Yodogawa-ku, Osaka, Japan, and using the A. oryzae pyrG gene as a marker, a first-step gene exchange method ("Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi" Alp "(Murakami K et al., (1991), Agric. Biol. Chem., 1992, p. 25, edited by JR Kinghorn and G. Turner, Blackie Academic and Professional) 55, p. 2807-2811). The JaL 125 strain was further described in WO 97/35956 (Novo Nordisk).
미생물들:Microorganisms:
균주: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATaleu2-△2 ura3-52 his4-539 pep4-△1[cir+]Strain: Saccharomyces cerevisiae YNG318: MAT a leu2-? 2 ura3-52 his4-539 pep4-? 1 [cir +
플라스미드들:Plasmids:
pCAMG91: 도1 참조. Aspergillus niger G1 글루코아밀라제 (AMG G1)을 포함하는 플라스미드. pCAMG91의 제조는 Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7) p.1581-1585에 개시되어 있다.pCAMG91: See Fig. Plasmids containing Aspergillus niger G1 glucoamylase (AMG G1). The preparation of pCAMG91 is described by Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (7) p.1581-1585.
pMT838: 절단된 Aspergillus niger 글루코아밀라제 G2(SEQ ID NO: 2)를 코드화하는 플라스미드pMT838: A plasmid encoding the truncated Aspergillus niger glucoamylase G2 (SEQ ID NO: 2)
pJSO026 (S. cerevisiae 발현 플라스미드) (J.S.Okkels, (1996) " pYES벡터내의 URA3-프로모터의 결실은 S. cerevisae에서 균류 리파제의 발현 수준을 증가시킨다." Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, Anuals of the New York Academy of Sciences의 vol. 782) 더 구체적으로, 발현 플라스미드 pJSO37는 pYES 2.0의 유도가능 GAL1프로모터를 Saccharomyces cerevisiae로부터 유래한 항시-발현성 TPI프로모터(트리오스 포스페이트 이성화효소)(Albert 및 Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl Genet., 1, 419-434)로 교체함과 URA3 프로모터의 일부분을 결실함에 의하여 pYES2.0로부터 유도되었다.Deletion of the URA3-promoter in the pYES vector increases the expression level of the fungal lipase in S. cerevisae. " Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering (JSOkkels, (1996) pJSO026 (S. cerevisiae expression plasmid) 782 of the New York Academy of Sciences. More specifically, the expression plasmid pJSO37 expresses the inducible GAL1 promoter of pYES 2.0 in a constant-expression TPI promoter (triose phosphate isomerase) derived from Saccharomyces cerevisiae Albert and Karwasaki, (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 419-434) and deletion of a portion of the URA3 promoter.
방법:Way:
Saccharomyces cerevisiae YNG318의 형질전환Transformation of Saccharomyces cerevisiae YNG318
DNA단편들 및 열린 벡터들은 혼합되어 표준 방법들에 의하여 효모인 Saccharomyces cerevisae YNG318로 형질전환된다.The DNA fragments and open vectors are mixed and transformed into Saccharomyces cerevisae YNG318, the yeast strain by standard methods.
특이활성을 kThe specific activity is k catcat (sec.(sec. -1-One )로서 결정함)
750 마이크로L 기질(1% 말토스, 50mM 아세트산나트륨, pH4.3)은 5분동안 37℃ 또는 60℃와 같은 선택된 온도에서 항온처리된다.750 microliter substrate (1% maltose, 50 mM sodium acetate, pH 4.3) is incubated for 5 minutes at 37 [deg.] C or 60 [deg.] C at a selected temperature.
아세트산나트륨에 희석된 50 마이크로L 효소가 첨가된다. 100 마이크로L의 분할량들이 0, 3, 6, 9 및 12분 후에 취하여져서 반응을 정지하기 위하여 100 마이크로L 0.4M 수산화나트륨에 옮겨진다. 빈칸도 포함된다.50 microL of enzyme diluted in sodium acetate is added. 100 microliter aliquots were taken at 0, 3, 6, 9 and 12 minutes and transferred to 100 microL 0.4 M sodium hydroxide to stop the reaction. It also includes blanks.
20 마이크로L은는 마이크로 적정 평판들로 옮겨지고 200 마이크로L의 GOD-Perid 용액이 첨가된다. 실온에서 30분 항온처리한 후 650nm에서의 흡광도가 측정된다.20 μL is transferred to microtiter plates and 200 μL of GOD-Perid solution is added. After incubation at room temperature for 30 minutes, the absorbance at 650 nm is measured.
포도당이 표준으로 사용되고 특이활성은 kcat(sec.-1)로서 계산된다.Glucose is used as standard and the specific activity is calculated as k cat (sec. -1 ).
AGU 활성의 결정 및 AGU/mg로 표현Determination of AGU activity and expressed as AGU / mg
1 노보 아밀로글루코시다제 유니트(Novo Amyloglucosiase Unit)(AGU)는 1분에 37℃ 및 pH 4.3에서 1 마이크로몰의 말토스를 가수분해하는 효소의 분량으로 정의된다. 분석 방법의 자세한 서술(AEL-SM-0131)은 Nove Nordisk로부터 요구하여 이용가능하다.1 Novo Amyloglucosiase Unit (AGU) is defined as the amount of enzyme hydrolyzing 1 micromole of maltose at 37 ° C per minute and pH 4.3. A detailed description of the analytical method (AEL-SM-0131) is available on request from Nove Nordisk.
활성은 Boehringer Mannheim에서 유래한 GOD-kit, 124036.를 사용한 후에 변형된 방법에 의하여 AGU/mg으로 결정된다. Standard: AMG-standard, batch 7-115, 195 AGU/mgThe activity is determined by the modified method AGU / mg after using the GOD-kit, 124036. derived from Boehringer Mannheim. Standard: AMG-standard, batch 7-115, 195 AGU / mg
375 마이크로L의 기질 (50mM아세트산나트륨 안의 1% 말토스, pH4.3)은 37℃에서 5분동안 항온처리된다. 아세트산나트륨에 희석된 25마이크로L의 효소가 첨가된다. 이 반응은 10분 경과후 100 마이크로L의 0.25M의 NaOH를 첨가함으로써 정지된다. 20마이크로L는 96정 마이크로적정평판으로 옮겨지고 200 마이크로L GOD-Perid 용액이 첨가된다. 실온에서 30분 경과 후, 650nm에서의 흡광도가 측정되고 특이활성이 AMG-표준에 따른 AGU/mg으로 계산된다.375 microL of the substrate (1% maltose in 50 mM sodium acetate, pH 4.3) is incubated for 5 minutes at 37 < 0 > C. 25 microliters of enzyme diluted in sodium acetate is added. The reaction is stopped by the addition of 100 microL of 0.25 M NaOH after 10 minutes. 20 μL is transferred to a 96-well microtiter plate and 200 μL GOD-Perid solution is added. After 30 minutes at room temperature, the absorbance at 650 nm is measured and the specific activity is calculated as AGU / mg according to the AMG-standard.
AMG로된 특이활성은 그다음엔 단백질 농도(mg/ml)로 유추한 활성(AGU/ml)으로 부터 계산된다.The specific activity in AMG is then calculated from the activity (AGU / ml) deduced to the protein concentration (mg / ml).
Aspergillus oryzae의 형질전환 (일반 과정)Transformation (general process) of Aspergillus oryzae
100ml의 YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)는 A. oryzae의 포자로 접종되고, 약 24시간 동안 진탕 배양된다. 균사는 미라글로스(miracloth)를 통하여 여과에 의하여 수집되고 200ml의 0.6M MgSO4로 세척한다. 균사는 15ml의 1.2M MgSO4,10mM NaH2PO4, pH 5.8안에서 현탁시킨다. 그 현탁액은 얼음위에서 냉각되고 1ml의 120mg의 NovozymeTM234을 포함하는 완충액이 첨가 된다. 5분 경과 후, 1ml의 12mg/ml의 BSA (Sigma H 형)가 첨가되고 현미경 아래에서 조사한 표본 안에 많은 수의 원형질체가 관찰될 때까지 1.5 내지 2.5시간동안 37℃에서 온화하게 교반하면서 항온처리가 이어진다.100 ml of YPD (Sherman et al., (1981), Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) are inoculated with A. oryzae spores and shake-cultured for about 24 hours. Mycelia are collected by filtration through a Mira Gloss (miracloth) and washed with 200ml of 0.6M MgSO 4. Mycelium is suspended in 1.2M MgSO 4, 10mM NaH 2 PO 4, pH 5.8 in 15ml. The suspension is cooled on ice and a buffer containing 1 ml of 120 mg of Novozyme TM 234 is added. After 5 minutes, 1 ml of 12 mg / ml BSA (Sigma H form) was added and incubated for 1.5 to 2.5 hours at 37 [deg.] C with gentle agitation until a large number of protoplasts were observed in the specimens examined under the microscope Lt; / RTI >
현탁액은 마이크로클로스(microcloth)를 통하여 여과되고, 여과물은 살균된 시험관안으로 옮겨지고, 그리고 5ml의 0.6M 솔비톨, 100mM Tris-HCl, pH7.0로 뒤덮여 진다. 원심분리가 1000g에서 15분간 수행되고 원형질체는 MgSO4완화액의 상층으로부터 수집된다. 2부피의 STC (1.2M 솔비톨, 10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM CaCl2)가 원형질체 현탁액에 첨가되고 혼합액은 1000g에서 5분간 원심분리된다. 원형질체 응집체(pellet)는 3ml의 STC로 다시 현탁되고 다시 응집된다. 이 과정은 반복된다. 마지막으로, 원형질체는 0.2-1ml의 STC안에 다시 현탁된다.The suspension is filtered through a microcloth, the filtrate is transferred into a sterile test tube, and covered with 5 ml of 0.6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 7.0. Centrifugation is performed 15 bungan eseo 1000g protoplasts are collected from the top layer of MgSO 4 mitigation solution. Two volumes of STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM CaCl 2 ) are added to the protoplast suspension and the mixture is centrifuged at 1000 g for 5 minutes. The protoplast aggregate (pellet) is suspended again in 3 ml of STC and re-agglutinated. This process is repeated. Finally, the protoplasts are suspended again in 0.2-1 ml of STC.
100㎕의 원형질체 현탁액은 10㎕의 STC에, 5-25㎍의 p3SR2 ( Hynes et al., Mol. and Cel. Biol. Vol. 3, No. 8, 1430-1439, Aug. 1983에 기술된 A. nidulansamdS 유전자를 포함하는 플라스미드)와 함께 혼합된다. 그 혼합액은 0.2ml의 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10mM CaCl2에 방치되고 그리고 10ml의 Tris-HCl, pH7.5가 첨가되고 주의깊게 혼합되고(두번) 그리고 마지막으로 0.85ml의 같은 용액이 첨가되고 주의깊게 혼합된다. 그 혼합액은 실온에서 25분동안 방치되고, 2,500g에서 15분간 돌리고, 그리고 응집체는 2ml의 1.2M 솔비톨에 재현탁된다. 한번 더 침전시킨후 원형질체들은 백그라운드 성장을 저해하기 위하여 1.0M 수크로스, pH 7.0, 질소원으로 10mM 아세트아미드, 및 20mM CsCl를 함유한 최소평판(Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56)에 도말한다. 4 내지 7일간 37℃에서 배양한 후 포자들은 선택되고, 멸균수에 현탁되고 하나의 콜로니로 퍼진다. 이 과정은 반복되며 두번째 재분리 후의 콜로니의 포자들은 정의된 형질전환체로서 보관된다.100 [mu] l of protoplast suspension was added to 10 [mu] l of STC, 5-25 [mu] g of p3SR2 (A (SEQ ID NO: 2) described in Hynes et al., Mol. And Cell Biol. . < / RTI > plasmid containing the nidulansamdS gene). The mixture was left in 0.2 ml of 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl 2 and 10 ml of Tris-HCl, pH 7.5 was added and carefully mixed (twice) and finally 0.85 ml of the same solution Added and carefully mixed. The mixture is left at room temperature for 25 minutes, at 2,500 g for 15 minutes, and the aggregate is resuspended in 2 ml of 1.2 M sorbitol. After one more settling, the protoplasts were plated on a minimal plate (Cove, (1966), Biochem. Biophys. Acta 113, 51) containing 1.0 M sucrose, pH 7.0, 10 mM acetamide in a nitrogen source, and 20 mM CsCl -56). After incubation at 37 ° C for 4 to 7 days, the spores are selected, suspended in sterile water and dispersed as a single colony. This process is repeated and the spores of the colonies after the second re-separation are retained as the defined transformants.
유가식 발효Fed-batch fermentation
유가식 발효가 말토덱스트로스를 탄소원으로하고, 요소를 질소원으로하고, 효모추출물을 포함하는 배지에서 수행된다. 유가식 발효는 A. oryzae의 문제되는 숙주세포의 진탕 플라스크 배양액을 3.5%의 탄소원과 0.5%의 질소원으로 구성된 배지에 접종함으로써 수행된다. pH5.0 및 34℃에서 24시간동안 배양한 후 부가적 탄소 및 질소원의 연속적 공급이 시작된다. 탄소원이 제한인자로 유지되고 산소공급이 충분함이 보장된다. 유가식 배양은 4일간 지속되며, 그 후에 효소들은 원심분리, 한외여과, 청정 여과 및 무균여과로 회수된다.Fed-batch fermentation is carried out in a medium containing maltodextrose as a carbon source, urea as a nitrogen source, and yeast extract. The fed-batch fermentation is carried out by inoculating a shake flask culture of the host cell of A. oryzae into a medium consisting of 3.5% carbon source and 0.5% nitrogen source. After 24 hours of incubation at pH 5.0 and 34 ° C, a continuous supply of additional carbon and nitrogen sources is initiated. It is ensured that the carbon source is maintained as a limiting factor and the oxygen supply is sufficient. Fed-batch cultures last for 4 days, after which the enzymes are recovered by centrifugation, ultrafiltration, clean filtration and sterile filtration.
정제refine
배양 육즙은 여과되고 1.7M AMS의 농도로 황산암모늄(AMS)가 첨가되고 pH는 pH5로 맞추어 진다. 침전된 물질은 원심분리로 제거되고 글루코아밀라제 활성을 포함하는 용액은 미리 1.7M AMS, 20mM 아세트산나트륨, pH5로 평형화된 Toyo Pearl Butyl 컬럼에 적용한다. 부착되지 않은 물질들은 평형완충액으로 세척된다. 부착된 단백질은 컬럼부피의 10배 이상의 1.7 내지 0M AMS 선형구배를 사용하여 10mM 아세트산나트륨, pH 4.5로 용출한다. 글루코아밀라제를 포함하는 분획들은 수집되고 20mM 아세트산 나트륨, pH4.5에 대하여 투석된다. 그 용액은 그 다음에는 미리 10mM Piperazin, Sigma, pH5.5로 평형화된 Q 세파로스 컬럼에 적용된다. 부착되지 않은 물질들은 평형완충액으로 세척된다. 부착된 단백질은 컬럼부피의 10배 이상의 0 내지 0.3M 염화나트륨 선형구배를 사용하여 10mM Piperazin, pH5.5로 용출한다. 글루코아밀라제를 포함하는 분획)들은 수집되고 그 순수도는 SDS-PAGE를 이용하여 확인된다.The culture broth is filtered and ammonium sulfate (AMS) is added at a concentration of 1.7 M AMS and the pH is adjusted to pH 5. The precipitated material is removed by centrifugation and the solution containing glucoamylase activity is applied to a Toyo Pearl Butyl column equilibrated to 1.7 M AMS, 20 mM sodium acetate, pH 5 in advance. Unattached materials are washed with equilibration buffer. The attached protein is eluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.5 using a 1.7 to 0 M AMS linear gradient of at least 10 times the column volume. Fractions containing glucoamylase were collected and dialyzed against 20 mM sodium acetate, pH 4.5. The solution is then applied to a Q Sepharose column equilibrated in advance with 10 mM Piperazin, Sigma, pH 5.5. Unattached materials are washed with equilibration buffer. The attached protein is eluted with 10 mM Piperazin, pH 5.5 using a linear gradient from 0 to 0.3 M sodium chloride at least 10 times the column volume. Fractions containing glucoamylase) are collected and their purity is confirmed using SDS-PAGE.
TT 1/21/2 (반감기) 방법 I(Half-life) Method I
변이체들의 열 안정성은 다음 방법을 사용하여 T1/2로서 결정된다: 950 마이크로리터의 50mM 아세트산나트륨 완충액(pH4.3) (NaOAc)가 5분간 68℃ 또는 70℃에서 5분간 항온처리된다. 50마이크로리터의 완충액(4AGU/ml) 안의 효소가 첨가된다. 2x40마이크로리터의 표본들이 0, 5, 10, 20, 30 및 40분 각각에 취하여지고 얼음위에서 냉각된다. 가온방치 이전(0분)에 측정된 활성(AGU/ml)은 대조군(100%)으로 사용된다. 안정성의 기울기(퍼세트로서)가 가온방치시간에 대한 함수로 측정된다. 남은 글루코아밀라제 활성의 %가 각기 다른 시간에서 결정된다. T1/2은 그 때까지의 남은 활성의 %가 50%로 줄어든 경우의 시간의 간격이다.The heat stability of the mutants is determined as T 1/2 using the following method: 950 microliters of 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.3) (NaOAc) is incubated for 5 minutes at 68 ° C or 70 ° C for 5 minutes. The enzyme in 50 microliters of buffer (4 AGU / ml) is added. 2x40 microliter specimens are taken at 0, 5, 10, 20, 30 and 40 minutes respectively and cooled on ice. The activity (AGU / ml) measured before the incubation (0 min) was used as a control (100%). The slope of the stability (as a set) is measured as a function of the warm-up time. The percent of remaining glucoamylase activity is determined at different times. T 1/2 is the time interval when the percentage of the remaining activity to that point has been reduced to 50%.
TT 1/21/2 (반감기) 방법 II(Half-life) Method II
T1/2는 문제의 효소를 pH4.5에서 문제의 온도(예를 들어 70℃)에서 30% 포도당, 50mM 아세트산나트륨에 항온처리함으로써 측정된다. 표본들은 주어진 시간 간격별에서 취하여지고 얼음위에서 냉각되고 잔류된 효소 활성은 pNPG 방법(아래 서술한 대로)에 의하여 측정된다.T 1/2 is measured by incubating the enzyme in question at 30 ° C, 50 mM sodium acetate at pH 4.5 at the temperature of interest (eg, 70 ° C). Samples are taken at a given time interval and cooled on ice and the residual enzyme activity is measured by the pNPG method (as described below).
%잔류 글루코아밀라제 활성은 다른 시간들에서 결정된다. T1/2은 그 때까지의 남은 활성의 %가 50%로 줄어든 경우의 시간의 간격이다.The% residual glucoamylase activity is determined at different times. T 1/2 is the time interval when the percentage of the remaining activity to that point has been reduced to 50%.
잔류된 효소 활성(pNPG 방법)Residual enzyme activity (pNPG method)
pNPG 시약:pNPG reagent:
0.2g의 pNPG (p-니트로페닐글루코피라노시드)는 0.1M 아세테이트 완충액(pH4.3)에 용해되어 100ml로 만들어진다.0.2 g of pNPG (p-nitrophenylglucopyranoside) is dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 4.3) and made into 100 ml.
보레이트 용액:Borate solution:
3.8g의 Na2B4O710H2O 는 Milli-Q 물에 용해되어 100ml로 만들어 진다.3.8 g of Na 2 B 4 O 7 10 H 2 O is dissolved in Milli-Q water and made into 100 ml.
25 마이크로L의 표본들은 50마이크로L의 기질이 첨가되고 2시간동안 50℃에서 항온처리된다. 광학밀도는 405nm에서 측정되고 잔류 활성은 계산된다.Samples of 25 microL were added with 50 microL of substrate and incubated at 50 DEG C for 2 hours. The optical density is measured at 405 nm and the residual activity is calculated.
pAMGY의 제조Preparation of pAMGY
pAMGY벡터는 이하와 같이 제조된다: pJSO026의 리파제 유전자는 AMG유전자로 교체되었는데, 그것은 순방향 프라이머인; FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3'과 역방향 프라이머인; RG2: 5'-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3'과 함께 주형 플라스미드로 AMG유전자를 포함하는 pLAC103를 사용한 PCR 증폭되었다. pJSO026은 XbaI과 SmaI에 의하여 37℃에서 2시간동안 절단되었고 PCR 증폭물은 클레노우 단편의 사용과 XbaI에 의한 절단에 의하여 평활말단화 되었다. 벡터 단편과 PCR 증폭물은 연결된 후 전기 형질전환에 의하여 E.coli 안으로 형질전환되었다.The pAMGY vector was prepared as follows: The lipase gene of pJSO026 was replaced with the AMG gene, which is a forward primer; FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT CCT TAC TCA GCA ATG-3 'and reverse primer; RG2: 5'-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3 'was PCR amplified using pLAC103 containing the AMG gene as a template plasmid. pJSO026 was cleaved by XbaI and SmaI at 37 ° C for 2 hours and the PCR amplification was terminated by the use of the Klenow fragment and cleavage by XbaI. The vector fragment and the PCR amplification were ligated and transformed into E. coli by electrotransformation.
pLaC103의 제작Production of pLaC103
A. niger의 AMGII cDNA 클론은 AMG의 GII형태의 S. cerevisiae에서의 발현을 목적으로 하는 pLaC103의 기원으로 사용된다. 제조는 아래 개략적으로 서술된 몇몇단계로 이루어진다.The AMGII cDNA clone of A. niger is used as the origin of pLaC103 for the expression of AMG in GII form S. cerevisiae. The manufacture consists of several steps outlined below.
pT7-212 (EP37856/ 미국 특허 번호. 5162498)은 XbaI으로 절단되고 클레노우 DNA 중합효소 및 dNTP로 평활말단화된다. EcoRI으로 절단된 후 결과물인 벡터 단편은 한천 전기영동겔로부터 정제되고 2.05kb 길이의 pBoel53의 EcoRI-EcoRV 단편과 연결되어 그것에 의하여 결과적 플라스미드인 pG2x안의 AMG를 코드화하는 단편의 EcoRI말단에 XbaI부위를 재생산한다.pT7-212 (EP37856 / U.S. Pat. No. 5,162,498) is cut with XbaI and blunt ended with Klenow DNA polymerase and dNTP. After digestion with EcoRI, the resulting vector fragment was purified from an agar electrophoresis gel and ligated with an EcoRI-EcoRV fragment of pBoel53 of 2.05 kb length, thereby regenerating the XbaI site at the EcoRI end of the fragment encoding AMG in the resulting plasmid pG2x do.
AMG csc의 상류 DNA를 제거하기 위하여, 및 적합한 제한효소 인식부위를 갖는 AMG를 코드화하는 DNA를 만들기 위하여 다음의 구조체가 만들어졌다:In order to remove the upstream DNA of AMG csc, and to make DNA encoding AMG with the appropriate restriction enzyme recognition site, the following construct was made:
p53의 930bp EcoRI-PstI 단편은 분리되었고 AluI 절단의 대상이되고, 결과적771bp Alu-PstI 단편은 평활말단 EcoRI 부위를 갖는(위 참조) pBR322에 연결되었고 PstI으로 절단되었다. 결과적 플라스미드 pBR-AMG'에서, EcoRI 부위는 AMG cds의 개시 코돈으로부터 단 34bp에서 재생산된다.The 930 bp EcoRI-PstI fragment of p53 was isolated and subject to AluI cleavage, and the resulting 771 bp Alu-PstI fragment was ligated to pBR322 with a smooth end EcoRI site (see above) and digested with PstI. In the resulting plasmid pBR-AMG ', the EcoRI site is reproduced at only 34 bp from the start codon of AMG cds.
pBR-AMG'로부터 775bp EcoRI-PstI 단편은 분리되고 pT7-212의 XbaI-EcoRI벡터 단편을 포함하는 연결반응에 의하여 pG2x에서 유래한 1151bp의 PstI-XbaI 단편과 연결된다.The 775 bp EcoRI-PstI fragment from pBR-AMG 'is isolated and ligated to the 1151 bp PstI-XbaI fragment derived from pG2x by a ligation reaction involving the XbaI-EcoRI vector fragment of pT7-212.
결과적인 플라스미드 pT7GII는 탈인산가수분해효소 존재하에서 BamHI절단을 받고 인산가수분해효소의 불활성화 후에 부분적 SphI절단이 수행된다. 이 반응으로부터 2489bp SphI-BamHI 단편은 AMGII cds에 연결된 S.c.TPI 프로모터를 애워싸게 된다.The resulting plasmid pT7GII undergoes BamHI cleavage in the presence of phosphatidic acid hydrolase and partial SphI cleavage is performed after inactivation of the phospholipase. From this reaction, the 2489 bp Sphl-BamHI fragment is abolished by the S. c.TPI promoter linked to AMGII cds.
위 단편은 pT7GII의 1052bp BamHI단편과 함께 탈인산가수분해효소 처리된 pMT743(EP37856/US 5162498)의 벡터단편 에 연결되는데 이 pMT743은 SphI-BamHI절단의 결과물이다. 결과적 플라스미드는 pLaC103이다.The above fragment is ligated to a vector fragment of pMT743 (EP37856 / US 5162498) treated with dephosphorylase, together with a 1052 bp BamHI fragment of pT7GII, which is the result of SphI-BamHI cleavage. The resulting plasmid is pLaC103.
열안정성 AMG 변이체의 선별Selection of thermostable AMG variants
라이브러리는 아래에 기술된 내열성 여과지 분석에의해 검색되었다.The library was searched by the heat-resistant filter paper analysis described below.
열안적성에 대한 여과지 분석법Filter paper analysis for heat aptitude
효모 라이브러리가 30℃에서 최소한 72시간동안 100 ㎍/ml암피실린을 포함하는 SCFura 한천평판 위의 아세트산셀룰로스(OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, 독일)- 니트로셀룰로스 여과지(Protran-Ba 85, Schleicher & Scchuell, Dassel, 독일)의 샌드위치 평판에 도말된다. 콜로니들은 메탄올로 1분간 활성화된 PVDF 여과지(Immobilon-P, Millipore, Bedford) 또는 Protran여과지(활성화 없이)로 레플리카(replica)되고, 그다음에 바로 0.1M NaAc에서 세척되고, 그다음엔 실온에서 2시간동안 가온방치된다. 콜로니들은 PVDF/Protran 여과지로부터 수도물로 세척된다. 각 여과샌드위치들과 PVDF/Protran 여과지들은 검색후에 여과지들 상의 양성 변이체를 위치짓기 위하여 가온방치 이전에 바늘을 이용하여 특정적으로 표지된다. 부착된 변이체와 함께있는 PVDF 여과지들은 0.1M NaAc, pH4.5가 담겨 있는 용기에 옮겨지고 47℃에서 또는 대안으로 Protran 여과지의 경우에는 67-69℃에서 항온처리된다. 아세트산셀룰로스 샌드위치와 SC ura-한천 평판위의 니트로셀룰로스 여과지는 사용시까지 실온에 보관된다. 항온처리후에, 잔류활성은 5%말토스, 1% 한천, 50mM NaAc, pH4.5를 포함하는 평판위에서 탐지된다. PVDF여과지와 함께 분석 평판은 여과지샌드위치와 같은 방법으로 표지되고, 2시간동안 50℃에서 방치된다. PVDF여과지를 제거한후 분석평판은 포도당 GOD-Perid( Boehringer Mannheim GmbH, 독일)로 염색된다. 잔류 활성이 있는 변이체들은 분석평판에서 하얀 배경에 짙은 녹색의 점으로 탐지된다. 개선된 변이체들은 보관 평판에 위치된다. 개선된 변이체는 처음 선별과 같은 조건하에서 두번 재선별된다.(OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) -nitrocellulose filter paper (Protran-Ba 85, Schleicher & Scchuell, Germany) on a SCFura agar plate containing 100 μg / ml ampicillin for at least 72 hours at 30 ° C. , Dassel, Germany). The colonies were replicated with PVDF filter paper (Immobilon-P, Millipore, Bedford) or Protran filter paper (without activation) activated with methanol for 1 min and then immediately washed with 0.1 M NaAc, Is left. Colonies are washed with tap water from PVDF / Protran filter paper. Each filter sandwich and PVDF / Protran filter paper is specifically labeled with a needle prior to warming to locate positive variants on the filter paper after the search. The PVDF filter paper with the attached variants is transferred to a container containing 0.1 M NaAc, pH 4.5 and incubated at 47 ° C or alternatively at 67-69 ° C for Protran filter paper. The cellulose cellulose sandwich and the nitrocellulose filter paper on the SC ura-agar plate are kept at room temperature until use. After incubation, the residual activity is detected on a plate containing 5% maltose, 1% agar, 50 mM NaAc, pH 4.5. Analytical plates with PVDF filter paper are labeled in the same manner as filter paper sandwiches and left at 50 ° C for 2 hours. After removing the PVDF filter paper, the assay plates are stained with glucose GOD-Perid (Boehringer Mannheim GmbH, Germany). Variants with residual activity are detected as dark green dots on a white background in the assay. The improved variants are located on a storage plate. Improved variants are re-selected twice under the same conditions as the first selection.
DOPE 프로그램을 사용한 무작위 돌연변이 유발을 위한 일반적 방법General method for random mutagenesis using DOPE program
무작위 돌연변이 유발은 하기의 단계에 의하여 수행된다:Random mutagenesis is carried out by the following steps:
1. 모 효소에서 관심있는 변형을 위한 영역을 선택한다,1. Select the region for the strain of interest in the parent enzyme,
2. 선택된 영역에서 돌연변이 부위와 변이되지 않는 부위를 결정한다,2. Determine mutation sites and non-mutation sites in the selected region,
3. 예를 들어, 원하는 안정성 및/또는 제작되어야하는 변이의 수행의 관점에서, 어떤 종류들의 돌연변이들이 수행되어야 하는지 결정한다,3. Determine what kind of mutations should be performed, for example, in terms of the desired stability and / or performance of the mutation to be made,
4. 구조적으로 합당한 변이체를 선택한다.4. Choose structurally appropriate variants.
5. 단계 3에서 선택된 잔기들을 단계 4를 고려하여 조정한다.5. Adjust the residuals selected in step 3 in consideration of step 4.
6. 뉴클레오티드 분포를 적합한 DOPE알고리즘을 사용하여 분석한다.6. Analyze the nucleotide distribution using a suitable DOPE algorithm.
7. 필요하다면, 원하는 잔기들을 유전자 코드 리얼리즘(realism)에 맞춘다, 예를 들어 정지 코드의 도입을 피하기 위하여; 예를 들어 유전코드로부터의 제약들을 계산한다, 숙련된 자들은 어떤 코돈 조합들은 실제로는 사용될 수 없고 적응시킬 필요가 있다는 것을 인지할 것이다.7. If necessary, tailor the desired residues to genetic code realism, eg to avoid the introduction of stop codes; For example, compute constraints from the genetic code, the skilled artisan will recognize that certain codon combinations are not actually available and need to be adapted.
8. 프라이머를 제작한다,8. Prepare the primer,
9. 무작위 돌연변이를 프라이머를 사용하여 수행한다.9. Random mutations are performed using primers.
10. 결과적 검색을 통하여 개선된 특성을 갖는 글루코아밀라제 변이체를 선택한다.10. Select glucoamylase variants with improved properties through an outcome search.
Dope 알고리즘Dope algorithm
단계 6에서 사용할 적합한 도프 알고리즘은 당업계에서 주지되어 있다. 이와 같은 알고리즘의 하나는 Tomandl, D. et al., 1997, J. of Computer-Aided Molecular Design 11:29-38에 서술되어있다. 또다른 알고리즘은 DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svecdsen, A, 및 Kretzschmar, T(1998) Nucleic Acids Research 26:697-702) 이다.Suitable dope algorithms for use in step 6 are well known in the art. One such algorithm is described in Tomandl, D. et al., 1997, J. of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38. Another algorithm is DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svecdsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26: 697-702).
분자 가상실험을 사용하여 온도활성에 중요한 영역을 추출하는 방법How to Extract Important Areas of Temperature Activity Using Molecular Virtual Experiments
관심있는 효소, 여기서는 AMG,의 X-선 구조 및/또는 모델-구성 구조는 분자역학 가상실험의 대상이 된다. 분자역학가상실험은 CHARMM(Molecular simulations(MSI)에서 유래) 또는 다른 적합한 프로그램, 예를 들어 DISCOVER (MSI로부터)을 사용하여 만들어진다. 역학은 진공상태, 또는 결정수를 포함하여, 또는 적합한 물에 넣어 문제되는 효소와 함께, 예를 들어 구형 또는 상자, 수행된다. 가상실험은 300 피코초 (ps) 이상, 예를들면 300 내지 1200ps 동안에 이루어진다. 등방성 진동은 구조들의 CA 탄소에 대하여 추출되고 구조들간의 비교가 수행된다. 등방성 진동을 얻는 방법의 더 자세한 것은 CHARMM manusl(MSI로부터 이용가능)에서 찾을 수 있다. 분자역학 가상실험은 전하를 띨 수 있는 아미노산위의 표준 전하들 사용하여 수행될 수 있다. 이런 조건은 약 7의 중간 pH와 유사하다. 더 낮은 pH를 분석하기 위하여, 보통의 적정가능한 아미노산 잔기들의 바뀐 pKa들을 얻기 위하여 pH2 내지 10 이내에서; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr 및 His 분자의 적정이 행하여질 수 있다. 또한 Ser, Thr, 및 Cys도 적정가능하지만 여기서는 고려하지 않는다. 여기에서는 pH 때문에 바뀐 전하들 높은 pH에서는 모든 Arg, Lys은 음전하로, 모든 Asp, Glu는 전하가 없는 걱으로 서술되었다.The X-ray structure and / or model-constitutional structure of the enzyme of interest, here AMG, is subject to molecular dynamics virtual experiments. Molecular dynamics Virtual experiments are made using CHARMM (derived from Molecular simulations (MSI)) or other suitable program, for example DISCOVER (from MSI). The mechanics are carried out in vacuum, or in the form of spheres or boxes, including crystals, or with the enzyme in question, which is placed in a suitable water. The virtual experiment is performed for 300 picoseconds (ps) or more, for example, 300 to 1200 ps. Isotropic vibrations are extracted for the CA carbon of structures and comparisons between structures are performed. Further details of how to obtain isotropic vibrations can be found in CHARMM manusl (available from MSI). Molecular dynamics Virtual experiments can be performed using standard charges above the chargeable amino acids. This condition is similar to an intermediate pH of about 7. To analyze the lower pH, within pH 2 to 10 to obtain altered pKa of normal titratable amino acid residues; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr, and His molecules. Ser, Thr, and Cys are also suitable, but are not considered here. Here, the charges changed due to the pH were described at high pH, with all Arg and Lys negative, and all Asp and Glu with no charge.
관심있는 효소의 모델을 만드는 것은 MSI프로그램 패키지의 HOMOLOGY모델을 사용하여 얻을 수 있다. Aspergillus awamori 의 변이체 X100의 결정구조는, 예를 들면 Brookhaven 데이타베이스의 3GLY 및 1DOG에서 찾을 수 있다.Modeling of the enzyme of interest can be achieved using the HOMOLOGY model of the MSI program package. The crystal structure of variant X100 of Aspergillus awamori can be found, for example, in 3GLY and 1DOG of the Brookhaven database.
본 발명의 목적은 개선된 열안정성 및 /또는, 예를 들어 녹말전환 공정에서의 당화 단계, 사용에 적합한 증가된 특이활성을 가진 개선된 글루코아밀라제 변이체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an improved glucoamylase variant having improved thermal stability and / or increased specific activity suitable for use, for example, a saccharification step in a starch conversion process.
본 발명의 본문에 사용된 "열안정성이 개선된 글루코아밀라제 변이체"는 본 발명에서는 대응하는 모 글루코아밀라제보다 높은 T1/2(반감기)를 가지는 글루코아밀라제 변이체를 의미한다.As used herein, the term "thermostable glucoamylase variant" means a glucoamylase variant having a T 1/2 (half life) higher than that of the corresponding moglucoamylase in the present invention.
T1/2의 결정(방법1과 방법2)은 하기의 "재료 및 방법"편에 기술되어 있다.The determination of T 1/2 (Method 1 and Method 2) is described in the "Materials and Methods" section below.
본 발명의 본문에 사용된 "특이활성이 증가된 글루코아밀라제 변이체"는 본 발명에서는 문제의 당류 내의 α-1,4결합에 대한 특이활성이 증가된 글루코아밀라제 변이체를 의미한다. 특이활성은 kcat또는 AGU/mg(하기의 "재료 및 방법"편에서 기술된 대로 측정한다)으로 결정된다. 증가된 특이활성은 kcat또는 AGU/mg값이 대응하는 모 글루코아밀라제의 kcat또는 AGU/mg값 보다 더 높다는 것을 의미한다.As used herein, the term " glucoamylase variant with increased specific activity " means a glucoamylase variant having an increased specific activity toward the [alpha] -1,4 linkage in the present invention. Specific activity is determined by k cat or AGU / mg (measured as described in the Materials and Methods section below). The increased specific activity means that the value of k cat or AGU / mg is higher than the k cat or AGU / mg value of the corresponding moglucoamylase.
본발명의 발명자는 모 글루코아밀라제와 비교하여 개선된 열안정성 및 또는 증가된 특이활성을 지닌 여러 모 글루코아밀라제 변이체를 제공하여왔다. 개선된 열안정성은 모 글루코아밀라제의 선택된 위치의 치환에 의하여 얻어진다. 이에 대하여는 후술한다.The inventors of the present invention have provided several moglucoamylase variants with improved thermal stability and / or increased specific activity as compared to moglucoamylase. Improved thermal stability is obtained by substitution of selected positions of the moglucoamylase. This will be described later.
명명법nomenclature
본 명세서와 청구범위에서는 관용적인 1문자 및 3문자 코드가 아미노산 잔기에 대하여 사용된다. 참조의 편의를 위하여, 본 발명의 글루코아밀라제 변이체는 이하의 명명법을 사용하여 기술한다:In the present specification and claims, idiomatic one-letter and three-letter codes are used for amino acid residues. For ease of reference, the glucoamylase variants of the present invention are described using the following nomenclature:
원래 아미노산: 위치: 치환된 아미노산Original amino acid: Position: Substituted amino acid
이 명명법에 의하면, 예를 들어 30번 위치의 알라닌을 아스파라긴으로 치환한 경우 다음과 같이 나타낸다:According to this nomenclature, for example, when alanine at position 30 is substituted with asparagine, it is represented as follows:
Ala30Asn 또는 A30NAla30Asn or A30N
같은 위치에서 알라닌을 결실한 경우 다음과 같이 나타낸다:When alanine is deleted at the same position:
Ala30* 또는 A30*Ala30 * or A30 *
같은 위치에서 라이신같은 다른 아미노산 잔기를 삽입한 경우 다음과 같이 나타낸다.When another amino acid residue such as lysine is inserted at the same position, it is expressed as follows.
Ala30AlaLys 또는 A30AKAla30AlaLys or A30AK
아미노산 잔기30 내지 33번과 같이 아미노산 잔기의 인접한 연결체의 결실은(30-33)* 또는 △(A30-N33)과 같이 나타낸다.Deletion of adjacent linkers of amino acid residues as in amino acid residues 30 to 33 is represented by (30-33) * or? (A30-N33).
다른 글루코아밀라제에 비교하여 특정 위치에 "결실"을 포함하고 그 위치에 삽입이 있는 경우는 다음과 같이 나타낸다:When compared to other glucoamylases, the term "deletion" is included at a particular position and the insertion at that position is as follows:
*36Asp 또는 *36D 라 표시하면, 36번 위치에 아스파르트산이 삽입된 경우이다.* 36Asp or * 36D indicates that aspartic acid is inserted at position 36.
다중돌연변이는 +기호로 분리된다. 예를 들어:Multiple mutations are separated by a + sign. E.g:
Ala30Asp + Glu34Ser 또는 A30N + E34S 와 같이 표시하면 각각 30번과 34번 위치에서 알라닌과 글루탐산이 아스파라긴과 세린으로 치환된 경우를 나타낸다. 다중돌연변이는 다음과 같이 또한 분리된다, 즉 더하기 부호와 같은 의미:Ala30Asp + Glu34Ser or A30N + E34S indicates that alanine and glutamic acid are substituted with asparagine and serine at positions 30 and 34, respectively. Multiple mutations are also separated as follows, meaning the same as a plus sign:
Ala30Asp/Glu34Ser 또는 A30N/E34S.Ala30Asp / Glu34Ser or A30N / E34S.
하나 이상의 아미노산 잔기가 주어진 위치에 무작위로 삽입된 경우에는 A30N,E 또는 A30N/E, 또는 A30N 또는 A30E 와 같이 표시된다.When one or more amino acid residues are randomly inserted at a given position, they are labeled A30N, E or A30N / E, or A30N or A30E.
더 나아가, 변형에 적합한 위치가 제시된 특정 변이가 없이 그 중에서 확인된 경우, 그 위치에서 존재하는 아미노산 잔기가 다른 어떤 아미노산 잔기로 치환된 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어 30번 위치의 알라닌의 변형이 언급되었으나 특정되지 아니한 경우에는 알라닌은 결실되거나 다른 어떤 아미노산 예를 들어:Furthermore, it is understood that when a position suitable for modification is identified therein without a specific variation presented, the amino acid residue present at that position is replaced by some other amino acid residue. Thus, for example, if a variant of alanine at position 30 is mentioned but is not specified, the alanine may be deleted or replaced with another amino acid such as:
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 중 어느 하나로 치환된 것으로 이해된다.Is understood to be substituted by any one of R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W,
실시예 1Example 1
AMG G2 변이체의 제조Preparation of AMG G2 variants
특정부위 돌연변이 유발:Specific site mutation induction:
AMG G2 (SEQ ID NO:2) 변이체의 제작을 위하여 제조자의 지시에 따라 상업적 키트인, Chameleon 이중가닥, 특정부위 돌연변이 유발 키트가 사용되었다.For the production of AMG G2 (SEQ ID NO: 2) variants, the commercial kit, Chameleon double stranded, specific site mutagenic kits were used according to the manufacturer's instructions.
문제의 AMG G2효소를 코드화하는 유전자는 AMG G1형태가 포함되어 있는 pCAMG91(도1 참조) 플라스미드의 G2 nt.1362와 G2 nt.1530 사이의 DNA를 결실함에 의하여 마련된 pMT838 상에 위치시킨다.The gene encoding the AMG G2 enzyme in question is located on pMT838 prepared by deleting the DNA between G2 nt.1362 and G2 nt.1530 of the pCAMG91 plasmid (see FIG. 1) containing the AMG G1 form.
제조자의 지시에 따라 pMT838의 항암피실린 유전자의 ScaI 부위는 하기의 프라이머를 사용하여 MluI 부위로 전환되었다:Following the manufacturer's instructions, the ScaI site of the antipy- silicin gene of pMT838 was converted to the MluI site using the following primers:
7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3' (SEQ ID NO: 3).7258: 5'p gaa tga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac 3 '(SEQ ID NO: 3).
(따라서, 항암피실린 유전자에서 발견되고 절단에 사용된 ScaI 부위는 MluI 부위로 바뀜). 문제의 AMG 유전자를 포함하는 pMT838 벡터는 그 다음에 DNA 중합효소와 올리고 7258 (SEQ ID NO: 3)과 21401(SEQ ID NO: 4)의 주형으로 사용된다.(Thus, the ScaI site found in the antampicillin gene and used for cleavage is replaced by the MluI site). The pMT838 vector containing the AMG gene in question is then used as a template for the DNA polymerase and oligo 7258 (SEQ ID NO: 3) and 21401 (SEQ ID NO: 4).
프라이머 번호. 21401 (SEQ ID NO: 4)은 선별 프라이머로 사용되었다.Primer number. 21401 (SEQ ID NO: 4) was used as a screening primer.
21401: 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gta tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3'21401: 5'p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tga agg gta tat acc acg cct tgg acc tgc gtt ata gcc 3 '
(AMG 유전자에서 발견되는 ScaI부위를 아미노산 서열의 변화없이 전환함).(Which converts the ScaI site found in the AMG gene without changing the amino acid sequence).
원하는 돌연변이 (예를 들어, 시스틴 잔기의 도입)는 원하는 돌연변이를 포함하는 적합한 올리고들을 첨가로써 문제의 AMG 유전자에 도입된다.The desired mutation (e. G., Introduction of a cysteine residue) is introduced into the AMG gene in question by the addition of suitable oligos including the desired mutation.
프라이머 107581은 T12P의 도입을 위하여 사용되었다.Primer 107581 was used for the introduction of T12P.
107581: 5'pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3' (SEQ ID NO: 5)107581: 5'pgc aac gaa gcg ccc gtg gct cgt ac 3 '(SEQ ID NO: 5)
변이체들은 전체 유전자를 서열결정함으로써 입증된다. 플라스미드는 위의 "재료 및 방법" 편에 기술된 방법을 사용하여 A.oryzae내로 형질전환된다. 변이체는 위의 "재료 및 방법" 편에 서술된 것과 같이 발효되고 정제된다.Variants are verified by sequencing the entire gene. Plasmids are transformed into A. oryzae using the methods described in the " Materials and Methods " section above. Variants are fermented and purified as described in the " Materials and Methods " section above.
실시예2Example 2
편재된 무작위, 도프처리된 돌연변이 유발을 사용한, 모 효소에 비하여 개선된 열 안정성을 갖는 A.niger AMG 변이체의 제작Production of A. niger AMG variants with improved thermal stability compared to parent enzyme using ubiquitous, randomized, dope-induced mutagenesis
A. niger AMG의 열안정성을 개선시키기 위하여 선-선별된 영역안에 무작위 돌연변이 유발이 수행되었다.In order to improve the thermal stability of A. niger AMG, random mutagenesis was performed in pre-selected regions.
잔기:Residue:
영역: L19-G35Area: L19-G35
영역: A353-V374Area: A353-V374
DOPE 소프트웨어 (재료 및 방법 참조)는 정지 코돈의 양을 최소화 하는 위의 영역들 안의 각 시사된 변화들 혼입되는 코드를 결정하기 위하여 사용된다. 아미노산 변화의 시사된 집단을 유추하기 위하여, 뉴클레오티드의 정확한 분포는 코돈의 세 위치들에서 계산된다. 도프된 영역들은 원하는 잔기를 얻을 높은 기회를 갖기 위하여 지적된 위치들에서 특정적으로 도프되지만 아직 다른 가능성들도 허락된다.The DOPE software (see Materials and Methods) is used to determine the incorporated code for each of the suggested changes in the above areas that minimize the amount of stop codon. In order to deduce the suggested populations of amino acid changes, the exact distribution of nucleotides is calculated at three positions of the codon. Doped regions are specifically doped at indicated locations to have a high chance of obtaining the desired residues but still other possibilities are allowed.
첫째열은 돌연변이될 아미노산이고, 두째열은 야생형의 백분율이고, 그리고 세째열은 새로운 아미노산(들)을 정의했다.The first column is the amino acid to be mutated, the second column is the percentage of the wild type, and the third column defines the new amino acid (s).
프라이머 서열, 야생형 뉴클레오티드 서열, 모 아미노산 서열 및 각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드의 분포와 함께. 결과적인 도프된 올리고뉴클레오티드 가닥은 표2에 센스방향 가닥으로서 나타낸다.Together with primer sequences, wild type nucleotide sequences, parent amino acid sequences and distribution of nucleotides to each doped position. The resulting doped oligonucleotide strand is shown in Table 2 as the sense orientation strand.
각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드 분포.The nucleotide distribution for each doped position.
1: A10, C901: A10, C90
2: A6, T942: A6, T94
3: A95, C53: A95, C5
4: G95, C54: G95, C5
5: G95, A35: G95, A3
6: A3, C26: A3, C2
7: G3, A95, C27: G3, A95, C2
8: G92, A4, T48: G92, A4, T4
9: A3, T979: A3, T97
10: G95, T510: G95, T5
11: G3, A9711: G3, A97
12: G95, A2, C312: G95, A2, C3
13: T5, C9513: T5, C95
14: G88, A8, C414: G88, A8, C4
15: G7, A9315: G7, A93
16: G4, C9616: G4, C96
17: G4, C9617: G4, C96
18: G95, A2, C318: G95, A2, C3
순방향 프라이머 (SEQ ID NO: 6):Forward primer (SEQ ID NO: 6):
FAMGII 5'-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GTT ATC 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3'FAMGII 5'-C GAA GCG ACC GTG GCT CGT ACT GTT ATC 12T A3T AAC ATC G4G 5CG 67C G4T 8CT 91010 GTG 1112C G4C G13G 141516 1718T GGC ATT GTC GTT GCT AGT CCC AGC ACG GAT AAC-3 '
역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 7):Reverse primer (SEQ ID NO: 7):
RAMG1: 5'-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3'RAMG1: 5'-GAT GGC AGT ACG AGC CAC GGT CGC TTC G-3 '
결과적인 도프된 올리고뉴클레오티드 가닥은 센스방향 가닥으로서 표4에 나타난다: 프라이머 서열, 야생주 뉴클레오티드 서열, 모 아미노산 서열 및 각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드의 분포와 함께.The resulting doped oligonucleotide strand is shown in Table 4 as the sense orientation strand: along with the distribution of the primer sequence, the wild-type nucleotide sequence, the parent amino acid sequence, and the nucleotide at each doped position.
각 도프된 위치에 대한 뉴클레오티드 분포Distribution of nucleotides for each doped position
1:G91, A3, T3, G31: G91, A3, T3, G3
2:A13, C872: A13, C87
3:A40, T603: A40, T60
4:G3, A3, C944: G3, A3, C94
5:A6, T945: A6, T94
6:G4, A4, T926: G4, A4, T92
7:G2, A96, C27: G2, A96, C2
8:G93, A3.5, C3.58: G93, A3.5, C3.5
9:G87, A8, C59: G87, A8, C5
10:A84, C1610: A84, C16
11:G93, T711: G93, T7
12:G92, A5, T312: G92, A5, T3
13:A3, C9713: A3, C97
14:G3, A9714: G3, A97
15:G2, A2, T4, C9215: G2, A2, T4, C92
16:G93, A716: G93, A7
17:G93, C717: G93, C7
18:A90, T1018: A90, T10
19:G4, A9619: G4, A96
20:G95, A520: G95, A5
21:G96, A421: G96, A4
22:G3, C9722: G3, C97
23:G2, A1, T95, C223: G2, A1, T95, C2
24:A3, C9724: A3, C97
25:G97, A3, C225: G97, A3, C2
26:G2, A96, C226: G2, A96, C2
27:A5, C9527: A5, C95
28:A95, T528: A95, T5
29:G2, A9829: G2, A98
30:G94, A4, C230: G94, A4, C2
31:G94, A3, T1, C231: G94, A3, T1, C2
32:A4, T9632: A4, T96
33:A20, C8033: A20, C80
프라이머: FAMGIV (SEQ ID NO: 8)Primer: FAMGIV (SEQ ID NO: 8)
5'-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16T 2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3'5'-GTG TCG CTG GAC TTC TTC AAG 123 45A 6AC 78C 910T 11CT 1213T 1415A 1617C 18CC TAC 1920T A2122 2324C AGT 1425C 2627G T28T A16T 2930C ATT 313233 GAT GCC GTG AAG ACT TTC GCC GA-3 '
프라이머: RAMGVI (SEQ ID NO: 9)Primer: RAMGVI (SEQ ID NO: 9)
5'-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3'5'-ctt gaa gaa gtc cag cga cac-3 '
무작위 돌연변이 유발Random mutagenesis
표2와 표3으로부터 명백한 혼입된 올리고뉴클레오티드들(일반적 용어로 FAMG로 표시된) 및 L19-G35영역에 대한 역방향 프라이머 RAMG와 N-말단(FG2:5'-CAT CCC CAG GAT TAC TCA GCA ATG-3'(SEQ ID NO: 10)과 C-말단(RG2: 5'- CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT (SEQ ID NO: 11)을 커버하는 특정 SEQ ID NO: 2 프라이머가 21염기쌍이 겹치는 중복 연장 방법(Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68)에 의하여 PCR-라이브러리-단편들을 생성하기 위하여 사용되었다. 플라스미드 pAMGY는 중합효소연쇄반응의 주형이다. PCR 단편들은 E.coli/효모 셔틀벡터인 pAMGY에서 상동성 있는 재조합에 의하여 글로닝된다(재료 및 방법 참조).From the Tables 2 and 3, it can be seen that the oligonucleotides (designated FAMG in general terms) and the reverse primer RAMG and N-terminal (FG2: 5'-CAT CCC CAG GAT TAC TCA GCA ATG-3 (SEQ ID NO: 10) covering a specific SEQ ID NO: 2 primer covering the C-terminal (RG2: 5'-CTC AAA CGA CTC ACC AGC CTC TAG AGT The library was used to generate PCR-library-fragments by the extension procedure (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68.) The plasmid pAMGY is the template for the polymerase chain reaction. . < / RTI > coli / yeast shuttle vector pAMGY (see Materials and Methods).
검색Search
라이브러리는 위 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이 Protran 여과지를 사용하고 67 내지 69℃에서 항온처리함으로써 열안정성 여과지 분석법에서 검색되었다.The library was screened in a thermostable filter paper assay by using Protran filter paper as described in the "Materials and Methods" section above and incubating at 67-69 ° C.
실시예3Example 3
DNA올리고들로 혼입된 PCR 혼합에 의한, 모 효소보다 개선된 열안정성을 가진 A. niger AMG 변이체들의 제작Production of A. niger AMG variants with improved thermostability over parental enzymes by PCR mixing with DNA oligos
중합효소 연쇄반응(PCR)법은 AMG유전자와 양측인접영역을 포함하는 DNA단편을 마련하기 위하여 사용되었다. 대략 10 ug DNA가 DNA분해효소에 의하여 분해되고, 그리고 2% 아가로스겔이 수행된다. 50-150 bp의 단편들은 겔로부터 정제된다. 대략 1ug의 정제된 단편들은 원하는 돌연변이를 포함하는 5 내지 15몰(molar)배 많은 양의 올리고와 혼합된다. 각각, Hklib1, Hklib2, Hklib3 등의 제작을 위한 올리고들은 다음과 같은 종류이다:Polymerase chain reaction (PCR) was used to prepare DNA fragments containing the AMG gene and both adjacent regions. Approximately 10 μg of DNA is degraded by the DNAase, and 2% agarose gel is performed. Fragments of 50-150 bp are purified from the gel. Approximately 1 ug of purified fragments are mixed with 5-15 molar excess of oligo containing a desired mutation. Oligos for making Hklib1, Hklib2, Hklib3, etc., respectively, are of the following type:
DNA분해효소가 처리된 DNA와 올리고의 혼합에 뉴클레오티드, PCR 완충액 및 Taq/Pwo 중합효소가 첨가된다. PCR 조립반응이, 처음 2분간 94℃, 그다음엔35 내지 40순환의 다음의 항온처리 시간들: 94℃,30초; 45℃,30초; 72℃,60초; 그 다음 마지막으로 5분간의 72℃를 사용하여 수행되었다. PCR 증폭반응은 1uL의 조립반응물이 주형으로서, 그리고 AMG유전자 양측인접 영역에 어닐하는 프라이머들을 첨가함으로써 수행되었다. 변수들: 처음 2분간 94℃, 그다음엔 다음의 항온처리 시간들로된 35 내지 40 순환: 94℃, 30초;72℃, 90초; 마지막으로 10분간의 72℃.Nucleotides, PCR buffer, and Taq / Pwo polymerase are added to the mixture of DNA with the DNA-degraded enzyme and oligo. PCR assays were performed at 94 ° C for the first 2 minutes, then 35-40 cycles of the following incubation times: 94 ° C, 30 seconds; 45 캜, 30 seconds; 72 캜, 60 seconds; Lt; RTI ID = 0.0 > 72 C < / RTI > for 5 minutes. The PCR amplification reaction was carried out by adding 1 uL of the ligation reagent as a template and adding primers annealing to regions adjacent to the AMG gene. Variables: 94 ° C for the first 2 minutes, then 35-40 cycles with the following incubation times: 94 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 90 seconds; Finally, 72 ° C for 10 minutes.
결과적 PCR 산물은 1% 아가로스 겔로부터 정제되고, 선형화된 벡터와 혼합되고, 그리고 위에 서술된 대로 컴피턴트 세포에 형질전환된다.The resulting PCR product is purified from 1% agarose gel, mixed with a linearized vector, and transformed into competent cells as described above.
실시예4Example 4
특이활성Specific activity
AMG G2변이체는 위의 실시예1에 서술된 바와 같이 제작된다. kcat로 나타난 특이활성은 pH 4.3, 37℃에서, 위 "재료 및 방법" 편에 서술한 바와 같이 말토스와 말토헵토스를 기질로 사용한 표본들에 대하여 계산된다. AGU/mg 으로 표현된 특이활성 또한 위 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 말토스를 기질로 사용하여 pH 4.3, 37℃에서 측정된다.AMG G2 variants were prepared as described in Example 1 above. The specific activity expressed as k cat is calculated at pH 4.3 and 37 ° C for samples using maltose and maltoheptose as substrates as described above in "Materials and Methods". The specific activity expressed as AGU / mg is also measured at pH 4.3 and 37 ° C using maltose as the substrate as described above in "Materials and Methods".
실시예5Example 5
70℃에서 열안정성Thermal stability at 70 ° C
실시예1에서 기술된 접근방법을 사용하여 AMG G2 S119P의 변이체가 제조되었다.Mutants of AMG G2 S119P were prepared using the approach described in Example 1.
열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이, 방법I을 사용하여 T1/2로서, 50mM NaOAc, pH 4.5, 70℃, 0.2AGU/ml에서 30분간 항온처리후의 %잔류 활성으로서 결정되었다. 시험의 결과는 아래 표에 열거되어 있고, 야생형 AMG G2와 비교되어 있다.Thermal stability was determined as the% residual activity after incubation for 30 minutes at 50 mM NaOAc, pH 4.5, 70 ° C, 0.2 AGU / ml, as T 1/2 using Method I as described in "Materials and Methods" . The results of the test are listed in the table below and are compared with wild-type AMG G2.
실시예6Example 6
68℃에서 열안정성Thermal stability at 68 ° C
AMG G2 변이체는, 아래 표의 변이체 no. 1 및 no. 2를 제외하고는, 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작되는데, 그 변이체는 WO 95/22625(Affymax Technology N.V.)에 서술된 바와 같이 혼합함에 의하여 마련된다. 열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 68℃에서 방법 I을 사용하여 T1/2로서 결정되고 같은 조건하에서의 야생형 A.niger AMG G2와 비교된다. 변이주의 평가는 상층액의여과후 배양 육즙에 대하여 수행되었다.The AMG G2 variant is the variant no. 1 and no. 2, which variants are prepared by mixing as described in WO 95/22625 (Affymax Technology NV). Thermal stability was determined as T 1/2 using Method I at 68 ° C as described in the "Materials and Methods" section and compared to the wild type A. niger AMG G2 under the same conditions. The mutant strains were evaluated for culture broth after filtration of the supernatant.
실시예7Example 7
68℃에서 열안정성Thermal stability at 68 ° C
AMG G2 변이체는 실시예3에서 서술된 접근방법을 사용한 혼합함과 양성 변이주를 혼합함으로써 제작되었다. 열안정성은 "재료 및 방법" 편에서 서술된 바와 같이 68℃에서 방법I을 사용하여 T1/2로서 결정되고 같은 조건에서의 야생형 A.niger AMG G2에 비교된다. 평가는 상층액의 여과후에 배양 브로스에 대하여 수행된다.The AMG G2 variants were produced by mixing the positive mixture with the mixing vessel using the approach described in Example 3. [ Thermal stability was determined as T 1/2 using Method I at 68 ° C as described in the "Materials and Methods" section and compared to the wild type A. niger AMG G2 under the same conditions. The evaluation is performed on the culture broth after filtration of the supernatant.
실시예8Example 8
68℃에서의 열 안정성Thermal stability at 68 ° C
AMG G2 변이체는 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작된다. 열 안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술된 바와 같이 68℃에서 방법I을 사용하여 T1/2로서 결정되었고 같은 조건에서 야생형 A.niger AMG G2와 비교되었다. 변이체의 평가는 상층액의 여과후에 배양 육즙에 대하여 수행되었다.AMG G2 variants are constructed using the approach described in Example 3. [ Thermal stability was determined as T 1/2 using Method I at 68 캜 as described in the "Materials and Methods" section and compared with the wild type A. niger AMG G2 under the same conditions. The variants were evaluated for culture broth after filtration of the supernatant.
실시예9Example 9
70℃에서 열 안정성 7 Thermal stability at 0 ° C
AMG G2 변이체는 실시예1에 서술된 접근방법을 사용하여 제작되었고 반-정제된 표본에 대하여 평가되었다(G-25컬럼 상에서 탈염화로 이어지는 배양 브로스의여과). 열 안정성은 위의 "재료 및 방법" 편에 기술된 바와 같이, 50mM NaOAc, pH4.5, 70℃에서 방법I을 사용하여 % 잔류 활성으로서 결정된다. 시험의 결과는 아래 표에서 열거되고 야생주 A. niger AMG G2 비교된다.AMG G2 variants were constructed using the approach described in Example 1 and evaluated against semi-purified samples (filtration of the culture broth leading to desalting on a G-25 column). Thermal stability is determined as% residual activity using Method I at 50 mM NaOAc, pH 4.5, 70 캜, as described in the "Materials and Methods" section above. The results of the tests are listed in the table below and are compared to the wild A. niger AMG G2.
실시예10Example 10
30% 포도당의 존재하에서 70℃에서 열안정성Heat stability at 70 캜 in the presence of 30% glucose
AMG G2 글루코아밀라제는 실시예3에 서술된 접근방법을 사용하여 제작된다.AMG < / RTI > G2 glucoamylase is prepared using the approach described in Example 3.
열안정성은 "재료 및 방법" 편에 서술한 바와 같이 70℃에서 방법II을 사용하여 T1/2로서 결정되고 같은 조건에서 야생형 A.niger AMG G2와 비교된다.Thermal stability was determined as T 1/2 using Method II at 70 ° C as described in the "Materials and Methods" section and compared with the wild type A. niger AMG G2 under the same conditions.
실시예11Example 11
AMG 변이체 S119P+Y402F+S411V 및 PLASD(N-말단)+V59A+A393R+T490A,각각의 당화의 수행AMG variants S119P + Y402F + S411V and PLASD (N-terminal) + V59A + A393R + T490A, respectively.
양자 모두 개선된 열안정성을 가지는 AMG 변이체 S119P+Y402F+S411V 및PLASD(N-말단)+V59A+A393R+T490A, 각각의 당화의 수행은 아래에 서술된 바와 같이 70℃에서 시험된다.The performance of each saccharification of the AMG variants S119P + Y402F + S411V and PLASD (N-terminal) + V59A + A393R + T490A, both of which have improved thermal stability, is tested at 70 ° C as described below.
참조 효소는 야생형 A.niger AMG G2이다. 당화과정은 하기의 조건하에서 수행된다:The reference enzyme is the wild type A. niger AMG G2. The saccharification process is carried out under the following conditions:
기질 10 DE 말토덱스트로스, 대략 30% DS (w/w)Substrate 10 DE maltodextrose, approximately 30% DS (w / w)
온도 70℃Temperature 70 ° C
최초pH 4.3 (70℃에서)Initial pH 4.3 (at 70 < 0 > C)
사용효소량 0.24 AGU/g DSAmount of enzyme used 0.24 AGU / g DS
당화Glycation
당화를 위한 기질은 말토덱스트린(일반 옥수수로부터 준비됨)을 끓는 Milli-Q물에 용해하여 건조기질이 대략 30% (w/w)되도록 맞춤으로써 만들어 진다. pH는 4.3으로 맞추어진다. 15g건조 고체에 해당되는 기질의 분할량은 50ml 파란 뚜껑 유리 플라스크에 옮겨지고 교반을 수반하여 수욕에 담겨진다. 효소가 첨가되고, 필요한 경우에는 pH가 다시 맞추어진다. 이 실험은 똑같이 다시 반복 된다. 표본들은 일정시간 간격을 두고 취하여지고 탄수화물 조성을 결정하기 위하여 HPLC상에서 분석된다.The substrate for glycation is made by dissolving maltodextrin (prepared from common corn) in boiling Milli-Q water and adjusting the dry substrate to about 30% (w / w). The pH is adjusted to 4.3. The amount of the substrate corresponding to 15 g dry solid is transferred to a 50 ml blue lid glass flask, and is stirred into the water bath. The enzyme is added and, if necessary, the pH is adjusted again. This experiment is repeated again. Samples are taken at regular intervals and analyzed on HPLC to determine carbohydrate composition.
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