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KR19990063814A - 핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR19990063814A
KR19990063814A KR1019980702282A KR19980702282A KR19990063814A KR 19990063814 A KR19990063814 A KR 19990063814A KR 1019980702282 A KR1019980702282 A KR 1019980702282A KR 19980702282 A KR19980702282 A KR 19980702282A KR 19990063814 A KR19990063814 A KR 19990063814A
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KR
South Korea
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pharmaceutical composition
composition according
nucleic acid
formula
compound
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KR1019980702282A
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English (en)
Inventor
프란시스 블랑쉐
베아트리체 카메롱
조엘 쿠르제
빈센트 튈리에
Original Assignee
자끄 사비나
로오느-푸우랜크 로레르 소시에테 아노님
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 자끄 사비나, 로오느-푸우랜크 로레르 소시에테 아노님 filed Critical 자끄 사비나
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Abstract

핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물이 기재됨. 조성물은 핵산 및 적어도 하나의 형질감염제 외에, 핵 DNA 벡터화능과 DNA 결합성을 겸비하고, 바람직하게는 HMG("고 이동성 그룹") 단백질 계열에 속하는 적어도 하나의 화합물을 함유한다. 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 핵산 전달용 조성물의 용도 또한 기술됨.

Description

핵산 형질감염용으로 유용한 약학 조성물 및 이의 용도
염색체 결함 및/또는 이상(돌연변이, 이상발현 등)은 유전성 또는 비유전성의 다수 질환의 원인이다. 통상적인 의약은 이러한 관점에서 오랫동안 무력하였다. 오늘날, 유전자 요법의 개발로, 이러한 유형의 염색체 이상을 바로잡거나 예방할 수 있을 것으로 희망을 주고있다. 이러한 신약물처리법은 이러한 결함 또는 이상을 바로잡거나 치료목적의 단백질을 발현시키기 위해서, 유전정보를 병에 걸린 기관이나 세포 중으로 도입함에 있다.
핵산을 표적기관이나 세포 중으로 침투시키는 데 따른 주된 장해요인은 세포막을 가로지르는 통과를 방해하는 핵산의 크기 및 다-음이온성에 있다.
현재는, 특히 생체내 원형질막을 가로지르는 네이키드 DNA의 형질감염(WO90/11092) 및 형질감염 벡터를 통한 DNA의 형질감염을 포함하여, 상기 난점을 제거하기 위한 각종 기술이 제안되어 있다.
네이키드 DNA의 형질감염과 관련하여, 이의 효능은 여전히 극히 낮다. 네이키드 핵산은 효소에 의한 붕괴 및 뇨를 통한 제거로 해서 짧은 혈장 반감기를 갖는다.
제 2 기술에 있어서, 두가지 주요 전략이 제안된다:
첫 번째 전략은 천연 형질감염 벡터, 즉 바이러스를 사용한다. 따라서, 아데노바이러스, 허피스바이러스, 레트로바이러스 및 최근의 아데노-수반 바이러스의 사용이 제안된다. 이들 벡터는 고 형질감염능을 지닌 것으로 입증되었지만 유감스럽게도 이들이 관여하는 한 자체의 바이러스 성질 고유의 병원성, 복제 및/또는 면역원성의 특정 위험요소를 전적으로 배제하기란 가능하지가 않다.
두 번째 전략은 유리하게는 진핵세포내 DNA 전달 및 발현을 촉진할 수 있는 비-바이러스제의 사용에 있다.
본 발명의 요지는 특히 이러한 제 2 전략에 있다.
화학적 또는 생화학적 벡터는 특히 이러한 바이러스 재조합 및/또는 면역학적 반응의 부재를 이유로 천연 바이러스에 대한 유리한 대안을 나타내고 있다. 이들은 병원력을 보유하지 않고, 이들 벡터내에서의 DNA 증식 위험이 없으며 형질감염시키고자 하는 DNA 크기와 관련하여 이들과 결부된 이론적인 제한이 없다.
이들 합성 벡터에는 형질감염될 DNA를 응축하고 이의 세포 결합 및 원형질막, 경우에 따라 두 핵막을 가로지르는 통과를 촉진하는, 두 가지 주요 기능이 있다.
DNA는 다-음이온성으로 해서 역시 다-음이온성인 세포의 원형질막에 대해 자연히 친화성이 없다. 이러한 단점을 극복하기 위해서, 비-바이러스성 벡터는 모두 일반적으로 다-양이온 전하를 보유한다.
개발된 합성벡터 가운데, 폴리라이신 및 DEAE-덱스트란형의 양이온 중합체, 또는 양이온성 지질 또는 리포펙턴트가 가장 유리하다. 이들은 DNA 응축성 및 세포막과의 결합 촉진능을 보유하고 있다. 최근에 와서는, 수용체에 의하여 매개된 표적화 형질감염 개념이 개발되었다. 이러한 기술은 양이온 중합체를 이용하여 DNA를 응축시키면서, 동시에 이식하고자 하는 세포형의 표면에 존재하는 막 수용체에 대한 리간드와 양이온 중합체 간의 화학적 커플링을 이용하여 막과 복합체의 결합을 지시하는 원리를 이용하고 있다. 따라서, 트랜스페린 또는 인슐린 수용체 또는 간세포 아시알로글리코단백질 수용체의 표적화가 기술되어 왔다.
그러나, 현재 제안되어 있는 합성벡터도 여전히 수행 및 바이러스 벡터와는 거리가 멀다. 이러한 문제는 특히 형질감염시킬 DNA의 불충분한 응축 및/또는 엔도좀을 떠나 세포핵 중으로 침투함에 있어 형질감염된 DNA에 의하여 직면하는 난점으로 인할 수 있다. 이에 대한 이유는 DNA → 휴지기 진핵세포의 핵 중으로의 수송이, 핵공의 크기가 60,000 Da 이하 분자량의 단백질의 확산만을 허용하기 때문에 명백한 문제점을 제기한다는 점이다[참조문헌: I. Davis et al., Ann. Rev. Biochem. 1995; 64; 865-896]. 따라서, 분자량이 106이상인 플라스미드 DNA는 자연히 단순확산에 의해서는 세포핵 중으로 침투할 수 없다.
본 발명은 유전자요법 분야, 구체적으로 말해서 유전물질의 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 전달에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 세포의 효율적인 형질감염에 유용한 약학 조성물을 제안한다. 본 발명은 또한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1: 다양한 세포 유형에서 본 발명에 따라 수행된 형질감염의 효능을 광의 강도로 표현한 도.
도 2: HMG1의 존재 및 부재하에 수행된 형질감염 효능 평가도.
재료 및 방법:
본 발명 조성물의 활성을 입증하기 위해 사용된 작제물은 루시퍼라제(Luc)를 암호화하는 유전자를 함유한 플라스미드 pCMV-Luc이다.
플라스미드 pCMV-Luc는 제한 효소 MluI 및 HindIII에 의해 절단되어 벡터 플라스미드 pcDNA3(Invitrogen)로부터 추출되고, 루시퍼라제를 암호화하는 유전자의 상류에 위치하며, 벡터 pGL계 벡터(Promega)에서 MluI 및 HindIII 부위로 삽입된 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유한다.
본 발명의 요지는 전술한 문제점에 대한 유리한 해결책을 구체적으로 제시하는 것이다.
더욱 정확히 말해서, 본 발명은 핵산 및 적어도 하나의 형질감염제 외에, 핵으로의 DNA 전달능과 DNA 결합성을 겸비하는 적어도 하나의 화합물을 함유함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 핵산의 형질감염용으로 유용한 약학 조성물을 제안한다.
본 발명의 목적상, DNA 결합성을 보유하는 화합물은 전달하고자 하는 DNA와 적어도 부분적으로 결합할 수 있는 여타의 화합물을 포괄한다. 더욱 상세히 말해서, DNA 전달능과 관련하여, 이는 본 발명의 목적상 처리하고자 하는 세포의 핵 내부로 전달하기 위하여 이러한 DNA가 각종 세포 및/또는 핵막을 효율적으로 가로지르게 지시하는 효율로 반영된다. 본 발명에 따른 화합물은 또한 예를 들면, 핵이입을 허용하는 영역과 DNA-결합영역을 결합시키는 키메릭 분자 형태로 출현할 수도 있다. 이러한 특정의 경우에, DNA-고정영역 가운데서, 예를 들면 특이적 서열과 결합할 수 있는 조절 단백질 또는 이와 대조적으로 DNA에 대한 비-서열-의존 친화성을 보유하는 것으로 알려져 있는 단백질로부터 유도된 것이 선택될 수 있다. 더 구체적으로 말해서 핵이입에 관여된 영역과 관련하여, 이는 예를 들면, nls(핵 편재화 서열)로서 언급되는 서열에 의해 표현될 수 있다. 이러한 서열은 핵플라스민의 추론된 협동 컨센서스 서열과 유사하거나 이로부터 유도될 수 있거나 SV40의 T 항원의 컨센서스 서열과 유사하거나 이로부터 유도될 수 있다.
특정 양태에 따라, 본 발명은 핵산 및 적어도 하나의 형질감염제 외에, HMG 계열에 속하는 적어도 하나의 화합물 또는 이의 유도체 중 하나를 함유함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 핵산의 형질감염용으로 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.
"고 이동성 그룹"을 나타내는 HMG형 단백질은 하전된 아미노산이 풍부하고 30,000 Da 이하의 분자량을 보유한 단백질이다. 2 내지 5% 과염소산에 가용성이기 때문에 이들은 0.35 M NaCl을 사용하여 크로마틴으로부터 통상적으로 추출된다.
3 계열의 HMG 단백질이 통상적으로 구별되고 있다: 분자량이 25,000에 근접하는 HMG1/2형, 분자량이 10 내지 12,000에 근접하는 HMG14/17형, 및 HMG14/17형 단백질에 가까운 조성을 갖지만 개체발생 동안의 조직분포가 상이한 HMGI/Y형 단백질. 단백질의 1차 서열이 이들 3 계열 각각에서 진화 동안 보존되었음이 알려져 있다.
특히 HMG1/2 계열의 단백질과 관련하여, 이들은 DNA-결합영역을 구성하는, "HMG 박스"로 언급되는, 80 개 아미노산으로 된 우점 염기성 서열(순전하 +20)의 존재를 특징으로 한다. 이러한 계열에 있어서, 이본쇄 DNA의 특이적 서열과 결합할 수 있는 단백질과 결합 특이성이 DNA의 특정 3차원 구조에 있는 단백질 간이 구별될 수 있다. 제 1 카테고리에서는 특정 유전자의 전사를 자극하는 단백질 UBF, SRY, TCF1 및 ABF2이 발견된다[참조문헌: Greiss E.A., et al. J. Mol. Evol. (1993) 37: 204-210]. 이들 단백질 각각의 서열은 하나 이상의 "HMG 박스"를 함유하고 있다. 제 2 카테고리는 단백질 HMG1 및 HMG2로 대표된다. 이들의 1차 서열은 두 "HMG 박스" 및 C 말단 산성서열의 존재를 특징으로 한다[참조문헌: Bustin M. B.B.A. (1990) 1049: 231-243]. 이들 단백질은 십자형 구조로 밀려나온 회문식 DNA 서열(회문 수준에서의 본쇄내 쌍 형성) 또는 고도의 만곡을 갖는 DNA 서열과 특이적으로 결합한다. 이러한 두 유형의 구조는 DNA의 마이너 홈을 넓히는 공통특성을 지니고 있으며, 이어서 이는 HMG1/2형 단백질의 결합을 수용할 수 있게 된다. 단백질 HMG1 및 HMG2의 생리학적 역할은 현재까지는 불충분하게 규명되어 있다. 그러나, 송아지 HMG1 단백질이 포유동물 세포의 핵 중으로 능동수송되는 것으로 나타났다[참조문헌: L. Kuehl et al. ; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368].
본 출원인은 예상치 않게도, 처리하고자 하는 세포의 핵에서 적어도 하나의 형질감염제와 결부되어 있는 이종 핵산서열의 형질감염을 효과적으로 촉진하기 위하여, HMG 단백질의 이러한 기능, 즉 DNA 결합능 및 핵 중으로의 능동 수송능을 이용할 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 목적상, 유도체란 용어는 유전학적 및/또는 화학적 성질을 하나 이상 변형시켜 수득된, 전술한 화합물과는 상이한 여타 펩티드, 슈도펩티드(비-생화학적 성분을 이입하는 단백질) 또는 단백질을 말한다. 유전학적 및/또는 화학적 성질의 변형은 예를 들면, 해당 단백질의 하나 이상의 잔기의 여타 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 더욱 정확하게 말해서, 화학적 변형은 화학반응 또는 생물학적 또는 비-생물학적 분자(들)을 단백질내 소정수의 잔기 상에 화학적으로 그래프팅함으로써 생성된 펩티드 또는 단백질의 여타 변형을 의미하는 것으로 이해된다. 유전적 변형은 DNA가 이들 서열 또는 이들의 단편과 하이브리드화하고 산물이 지시된 활성을 보유하는 여타 펩티드 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 유도체는 다양한 목적, 예를 들면, 특히 DNA 리간드에 대한 상응하는 폴리펩티드의 친화성 증가, 생성수준의 향상, 프로테아제 내성 증가, 자체 활성 중 하나를 증가시키고/시키거나 변성시킴, 또는 신규 약력학 및/또는 생물학적 성질 부여를 위해 생성시킬 수 있다. 첨가에 의해 생성되는 유도체로는, 예를 들면, 추가의 이종 부분이 일단에 부착된 키메릭 펩티드 서열을 들 수 있다. 유도체라는 용어는 또한, 다른 세포원으로부터, 특히 인간기원의 세포로부터, 또는 다른 유기체로부터 유도된, 해당 서열과 상동성이고 동형의 활성을 보유하는 단백질 서열을 포함한다. 이러한 상동서열은 상응하는 DNA에 대한 하이브리드화 실험에 의하여 수득될 수 있다. 하이브리드화는 통상의 엄격한 조건하에서(Maniatis et al.), (참조: general techniques of molecular biology) 또는 바람직하게는 매우 엄격한 조건하에서 천연서열 또는 이의 단편을 탐침으로서 이용하여, 핵산 라이브러리를 출발물질로 하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 맥락에서, 이본쇄 DNA에 존재하는 2차 구조의 경우, HMG 계열의 단백질, 또는 이의 유도체 중 일부의 강 친화성을 이용하는 것도 고려해 볼 수 있다. 이들은 특히 래트 HMG1이 매우 강한 친화성을 보유하는 것으로 나타난 사본쇄 구조일 수도 있다[참조문헌: Bianchi et al. Sciences, 1989, 243, 1056-1059]. 이러한 구조는 아데노바이러스와 결부된 바이러스 ITR과 같은 천연서열로부터 수득될 수 있거나, 이들은 완전히 합성될 수 있거나 인공 회문체로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 사용 화합물은 HMG 1, 2, I, Y, 14 및 17형 단백질 및 이들의 유도체 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 이러한 화합물은 인간 HMG1 단백질 또는 이의 유도체 중 하나의 전부 또는 일부 또는 전술한 상동체로 표시된다.
특히 유리한 양태로서, 본 발명의 조성물은 또한 핵산 전달의 인도를 허용하는 표적화 요소도 포함한다. 이러한 표적화 요소는 핵산의 전달을 소정의 목적하는 조직 또는 세포형(종양세포, 간세포, 조혈세포 등) 쪽으로 인도되도록 하는 외세포 표적화 요소일 수 있다. 이러한 요소는 또한 핵산전달을 소정의 바람직한 세포구획(미토콘드리아, 핵 등) 쪽으로 인도되도록 하는 내세포 표적화 요소일 수도 있다.
더욱 바람직하게는, 표적화 요소는 본 발명에 따른 화합물과 결합, 공유결합 또는 비공유결합된다. 표적화 요소는 또한 핵산에 결합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양식에 따라, 화합물은 자신의 말단 중 하나에 결합된 추가의 이종 부분을 통해서 세포형 표면에 존재하는 세포 수용체 리간드, 예를 들면 당, 트랜스페린, 인슐린 또는 단백질 아시알로소뮤코이드와 결합된다. 이는 또한, 핵내 형질감염된 DNA의 축적을 촉진하는, 핵 위치선정 시그널 서열 nls와 같은 내세포형 리간드일 수도 있다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 표적화 요소로는, 당, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 지질을 들 수 있다. 이러한 요소는 바람직하게는 당 및/또는 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체 리간드 또는 이의 단편, 수용체 또는 수용체 단편 등과 같은 펩티드이다. 특히, 이들은 생장인자 수용체, 사이토카인 수용체, 세포 렉틴 수용체 또는 접착 단백질 수용체에 대한 리간드일 수 있다. 또한 트랜스페린, HDL 및 LDL에 대한 수용체를 언급할 수 있다. 표적화 요소는 또한 아시알로글리코단백질 수용체와 같은 렉틴을 표적화함을 가능하게 하는 당, 또는 이와는 달리 임뮤노글로불린의 Fc 단편에 대한 수용체를 표적화함을 가능하게 하는 항체 Fab 단편일 수 있다.
유리하게는 본 발명에 따른 화합물은 또한 예를 들면, 다탄소쇄 또는 콜레스테롤 유도체와 같은 복합당 또는 친유성 화합물로 폴리글리코실화되고, 설폰화되고/되거나 포스포릴화되고/되거나 그래프팅될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 물론 다른 성질의 본 발명에 따른 여러 화합물을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명에 따른 화합물을 상술된 핵 표적화 화합물 외에, NDA 응축능을 특징으로 하는 제 2 화합물과 결합시키는 것이 가능함을 입증할 수 있다. 이러한 화합물이 특히 출원 FR 95/01865에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 화합물은 본 발명에 따른 핵산과 작용하기에 충분한 양으로 존재한다. 따라서, 화합물/핵산 비(중량 기준으로 표현됨)는 0.01 내지 5, 바람직하게는 0.25 내지 0.5일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 존재하는 형질감염제에 관하여, 이것은 바람직하게는 양이온 중합체 및 리포펙턴트로부터 선택된다.
본 발명에 따라서, 양이온 중합체는 바람직하게는 화학식 1의 화합물이다.
상기식에서,
- R은 수소 원자 또는 화학식의 그룹일 수 있고,
- n은 2 내지 10 의 정수이며,
- p와 q는 정수이며,
p와 q의 합은 중합체의 평균 분자량이 100 내지 107Da이 되도록 하는 값으로 이해된다.
화학식 1에서, n의 값은 상이한 단위 p 사이에서 변할 수 있다.
따라서, 화학식 1은 단독중합체와 헤테로중합체 모두를 포함한다.
좀더 바람직하게는, 화학식 1에서, n은 2 내지 5이다. 특히, 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리프로필렌이민(PPI) 중합체는 전적으로 유리한 성질을 갖는다. 본 발명을 실행하기 위한 바람직한 중합체는 분자량이 103내지 5 x 106인 것들이다. 예로서, 평균 분자량 50,000인 폴리에틸렌이민 Da (PEI50K) 또는 평균 분자량 800,000 Da인 폴리에틸렌이민 (PEI800K)을 언급할 수 있다.
PEI50K 및 PEI800K은 시판되고 있다. 화학식 1에 의해 나타내는 다른 중합체에 관하여, 이것은 특허원 FR 94/08735에 기재된 과정에 따라서 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물에 대한 최적 효과를 수득하기 위해서, 중합체와 핵산의 개별적인 비율은 바람직하게는 몰 비 R = 중합체내 아민/핵산내 포스페이트가 0.5 내지 50, 좀더 바람직하게는 5 내지 30이도록 측정된다. 매우 특히 유리한 결과는 핵산 전하 당 중합체 아민 5 내지 15 당량을 사용하여 수득된다.
리포펙턴트에 관하여 좀더 상세하게 말해서, 이들은 적어도 하나의 양이온성 친수성 영역, 예를 들면, 폴리아민 및 하나의 친유성 영역을 포함하는 친양쪽성 분자이다. 양이온으로 하전된, 바람직하게는 폴리아민, 양이온성 영역은 음으로 하전된 핵산과 가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 상호작용은 핵산을 매우 응축한다. 친유성 영역은 형성된 핵지질 입자를 지질막으로 코팅함으로써 이러한 이온 상호작용이 외부 수성 매질에 도달하기 어렵도록 한다.
유리하게는, 이러한 리포펙턴트를 또한 폴리아민 영역이 화학식 2에 상응하는 리포폴리아민으로부터 선택할 수 있다.
상기식에서,
m은 2 이상의 정수이고 n은 1 이상의 정수이며, m은 두 아민 사이에 존재하는 상이한 탄소그룹 간에서 다양할 수 있다. 바람직하게는, m은 2 내지 6이고 n은 1 내지 5이다. 좀더 바람직하게는, 폴리아민 영역은 DNA 결합성을 보유하는 스퍼민, 터민 또는 이들의 동족체 중의 하나로 나타낸다. 친유성 영역에 관하여, 이는 친수성 영역에 공유결합되는 라멜라 상 또는 육변형 상을 형성할 수 있는 적어도 하나의 포화 또는 불포화 탄화수소쇄, 콜레스테롤, 천연지질 또는 합성지질에 의해 나타낸다.
특허원 EP 394,111은 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 화학식 3의 기타 리포폴리아민을 기재한다.
화학식 2
상기식에서,
R은 특히 화학식 (R1R2)N-CO-CH2-NH-CO-의 라디칼을 나타낸다.
좀더 상세하게 언급할 수 있는 이러한 리포폴리아민의 대표적인 예는 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS) 및 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드 (DPPES)이다.
특허원 FR 94/14596에 기재되어 있는 리포폴리아민은 또한 유리하게는 본 발명에 따른 형질감염제로서 사용할 수 있다. 이는 R이 화학식 4를 나타내는 상기의 화학식 3에 의해서 나타낸다.
상기식에서,
- X 및 X'는 각각 독립적으로 산소 원자, q가 0, 1, 2, 또는 3인 메틸렌 그룹 -(CH2)q- 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 R'가 C1내지 C4알킬 그룹을 나타내는 -NR'-를 나타내고,
- Y 및 Y'는 각각 독립적으로 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 C=S 그룹을 나타내며,
- R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 치환 또는 비치환 C1내지 C4알킬 라디칼을 나타내며 p는 0 내지 5의 범위일 수 있으며,
- R6는 콜레스테롤 유도체 또는 R1및 R2가 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 측쇄 C12내지 C22지방족 라디칼을 나타내는 알킬아미노 그룹 -NR1R2을 나타낸다.
가장 특별히 언급할 수 있는 이러한 리포폴리아민의 대표적인 예는 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸 (디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 및 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필 (디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트이다.
특허원 EP 394,111 및 FR 94 또한 상응하는 리포폴리아민의 제조를 위해 사용할 수 있는 과정을 기재한다.
특히 유리한 방법에서, 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS), 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드 (DPPES), 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸 (디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 또는 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트를 본 발명의 맥락에서 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 최적 효과를 수득하기 위해서, 폴리아민 및 핵산의 각각의 비율은 바람직하게는 형질감염제의 양전하/핵산의 음전하인 비율 R이 0.1 내지 10, 좀더 바람직하게는 0.5 내지 2이도록 결정된다.
형질감염 조성물내의 본 발명에 따른 화합물의 존재는 여러 면에서 유리하다. 특히, 이러한 존재는 현저하게 감소된 독성을 유발하여, 뒤이어서 예를 들면, 조혈세포와 같이 원래 형질감염제에 민감한 세포의 리포폴리아민으로의 형질감염을 가능하게 한다.
본 발명의 조성물에서, 핵산은 디옥시리보핵산또는 리보핵산일 수 있다. 이러한 핵산은 천연 또는 인공 기원의 서열이고, 특히 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA 또는 rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열이다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등의 기원일 수 있다. 이들은 당분야 전문가들에게 공지된 기술에 의해서, 특히 화학합성에 의해서 또는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합방법에 의해서 수득될 수 있다. 더욱이, 이들은 플라스미드 벡터와 같은 벡터 중으로 이입될 수 있다.
디옥시리보핵산에 관하여 좀더 상세하게 말해서, 이들은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 이러한 디옥시리보핵산은 치료 유전자, 전사 또는 복제 조절 서열, 안티센스 서열, 다른 세포 성분에의 결합을 위한 영역 등을 암호화할 수 있다.
본 발명의 목적상, 치료 유전자라는 용어는 특히 치료효과를 갖는 단백질 산물을 암호화하는 유전자를 언급하는 것으로 이해된다. 이렇게하여 암호화된 단백질 산물은 단백질, 펩티드 등일 수 있다. 이러한 단백질 산물은 표적 세포에 관하여 동종일 수 있다 (즉, 표적 세포가 병리상태를 보이지 않는 경우 통상적으로 표적 세포에서 발현되는 산물). 이러한 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포내 불충분한 발현 또는 변형으로 인하여 불활성 또는 약활성인 단백질의 발현을 극복하거나 단백질을 과발현하는 것을 가능하게 한다. 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 관하여 이종일 수 있다. 이러한 경우에, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포내에서 불충분한 활성을 보충하거나 제공하여 세포가 병리상태에 대항하거나 면역 반응을 자극하게 한다.
본 발명의 목적상 치료적인 산물 중에서, 좀더 상세하게는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인(인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120)), 생장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등), 아포리포단백질(ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93/05125)), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 낭포성 섬유증과 관련된 CFTR 단백질, 종양-억제 유전자(p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745)), 응고 관여 인자를 암호화하는 유전자(인자 VII, VIII, IX), DNA 복구에 관여되는 유전자, 자기불활화 유전자(티미딘 키나제, 시토신 디아미나제) 등을 언급할 수 있다.
치료 유전자는 또한 표적 세포내 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절함을 가능하게 하는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 특허 EP 140,308에 기재된 기술에 따라서, 이러한 서열을 예를 들면, 표적세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사시키고 이렇게하여 단백질로의 해독을 차단할 수 있다. 안티센스 서열은 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴시킬 수 있는 리보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(EP 321,201).
상술된 바와 같이, 핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역반응을 일으킬 수 있는 항원 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 따라서 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대해서 인간 또는 동물에 적용되는 백신 또는 면역요법의 제시를 가능하게 한다. 펩티드는 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185,573), 또는 의-광견병 바이러스에 대해 특이적인 항원 펩티드 또는 종양-특이적 항원 펩티드(EP 259,212)일 수 있다.
핵산은 바람직하게는 또한 치료 유전자 및/또는 목적 세포 또는 기관내의 항원 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 이러한 서열이 감염된 세포에서 기능을 발휘할 수 있을 때 해당 유전자의 발현을 자연히 책임지는 서열일 수 있다. 이들은 또한 상이한 기원의 서열(다른 단백질의 발현을 책임짐) 또는 합성서열일 수 있다. 특히, 이들은 진핵세포 또는 바이러스 유전자를 위한 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키기를 원하는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이와 유사하게, 이들은 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 견지에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV, RSV 등의 유전자의 프로모터를 언급할 수 있다. 추가로, 이러한 발현 서열은 활성화 서열, 조절 서열 등의 첨가에 의해서 변형될 수 있다.
더욱이, 핵산은 특히 치료 유전자의 상류에, 합성된 치료산물이 표적 세포의 분비경로로 향하도록 지시하는 시그널 서열을 또한 함유할 수 있다. 이 시그널 서열은 치료산물의 천연 시그널 서열일 수도 있으나, 또한 임의의 다른 기능성 시그널 서열이거나, 또는 인공 시그널 서열일 수도 있다.
좀더 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 중성지질을 포함한다. 이러한 조성물은 특히 비율 R이 낮을 경우 특히 유리하다. 본 출원인은 중성지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 향상시킬 수 있고, 놀랍게도 막을 불안정화시켜 세포속으로의 입자 침투를 촉진시킬 수 있음을 효과적으로 보여주었다.
좀더 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용된 중성지질은 2개의 지방쇄를 함유한 지질이다.
특히 유리한 방법에서는, 천연지질 또는 합성지질을 사용하는데, 이 지질은 생리적인 조건하에 쯔비터이온성이거나 이온전하가 결여될 수도 있다. 이들은 좀더 구체적으로는 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일, -팔미토일 및 -미리스토일포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(특히, 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(특히, 스핑고마이엘린) 또는 아시알로강글리오시드(특히, 아시알로GM1 및 GM2)로부터 선택될 수 있다.
당해분야의 숙련인에게 익히 공지된 표준 기술을 이용해, 합성하거나 기관(예를 들면: 뇌) 또는 난(卵)으로부터 추출하여 이런 다양한 지질을 수득할 수 있다. 특히, 천연지질의 추출은 유기용매(또한 Lehninger, "Biochemistry" 참조)를 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 리포펙턴트를 형질감염제로 사용하여, 리포폴리아민 1 당량 당 중성지질 0.1 내지 20 당량, 좀더 바람직하게는 1 내지 5 당량을 포함한다. 형질감염제가 양이온 중합체인 경우, 본 발명의 조성물은 앞서 언급된 비의 양이온 중합체뿐만 아니라, 핵산 포스페이트 1 몰당량 당 중성지질 0.1 내지 20 몰당량, 좀더 바람직하게는 1 내지 5 몰당량을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 투여 등을 위해 제형될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 주입가능한 제형, 특히 원하는 기관으로의 직접주입, 또는 국소투여(피부 및/또는 점막으로)를 위해 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 멸균액, 등장액 또는 경우에 따라서는 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사액이 제조되도록 하는 특히 동결건조 조성물과 같은 건조 조성물일 수 있다. 주입을 위해 사용된 핵산의 용량 및 투여 횟수는 다양한 파라미터, 특히 사용된 투여양식, 관련 병리, 발현시킬 유전자 또는 원하는 치료 지속기간에 따라 조절될 수 있다.
이러한 조성물은 예를 들면, 조혈세포, 림프구, 간세포, 내피세포, 흑색종 세포, 암종 및 육종, 평활근세포, 뉴런 및 성상세포와 같은 광범위하고 다양한 세포형을 형질감염시키는데 유리하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 리포펙턴트 또는 양이온 중합체형의 형질감염제 및 앞서 정의된 바와 같은 화합물을 화합시켜 질환을 고칠 수 있는 핵산의 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내 형질감염을 이용하여 질환을 치료하는데 있어 특히 유리한 방법을 제공한다. 좀더 구체적으로 말해서, 본 방법은 핵산 또는 단백질 산물의 결여로 인해 발생하는 질환에 적용가능한데, 투여된 핵산은 상기 단백질 산물을 암호화하거나 상기 핵산 산물에 상응하는 서열을 함유한다. 본 발명에 따른 조성물은 생물학적 이용 효능 및 형질감염의 수준으로 인해 특히 유리하다.
본 발명은 또한 상응하는 수용체 또는 항원을 발현시키는 세포로 핵산을 표적화하기 위한, 세포 수용체 리간드, 항체 또는 항체 유도체와 커플링된 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 관점에서, 잠정적인 리간드, 항체 또는 항체 유도체는 화합물과 커플링되고 이 키메릭 분자의 형질감염력은 화합물 단독의 것과 비교하여 평가된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 좀더 상세히 기술될 것이나, 이는 설명적이고 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1: 래트 HMG1 단백질의 제조
1.1. 이. 콜라이에서 HMG1 단백질의 발현
포유동물에서 기원한 이러한 재조합 단백질은 이. 콜라이에서 과발현시켜 제조된다.
래트 HMG1 단백질[참조 문헌; M. E. Bianchi, Gene, 104(1991) 271-275]을 암호화하는 플라스미드 T7-RNHMG1을 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)로 도입한다. 뒤 이어서, 균주를 37℃에서 LB 배지 + 앰피실린(25 mg/L)중에 배양한다. 분리된 콜로니로부터 예비배양액을 수득한다. 이렇게 하여 500 ml 배양액이 접종된다. 600 nm에서 배양액의 흡광도가 0.7 값에 이르렀을 때, 최종농도가 0.5 mM에 이르도록 IPTG를 첨가시켜 HMG1의 합성을 유도한다. IPTG 존재하에 2시간 30분 동안 HMG1-생성 균주를 또다시 배양한다. 그리고 나서 세포를 원심분리(5000 x g, 20분)로 수거하고, 200 ml의 증류수로 세정한 다음 재원심분리시킨다. 정제될 때까지 -80℃에서 세포 펠릿을 저장한다.
1.2: 재조합 HMG1 단백질의 정제
예를 들면 하기 절차를 사용하여, 실시예 1.1에서 기술된 이. 콜라이 균주의 배양액으로부터 크로마토그래피에 의해 HMG1 단백질을 정제할 수 있다.
다른 지시가 있는 경우를 제외하고는, 하기 기술된 총 정제과정을 4℃에서 수행한다. 500 μM EDTA, 5 mM DTT, 200 μM Pefabloc SC [4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드] 및 10% (중량/용량) 글리세롤을 함유한 pH 7.7의 50 mM Tris/HCl 완충액 15 ml에서 500 ml의 배양액으로부터 수득된 세포를 재현탁시킨다. 15분간 음파파쇄에 의해 세포를 파괴시킨 후, 원심분리(50,000 x g; 1 시간)에 의해 세포 파편을 분리한다. 그리고 나서 완충액 A [400 mM 염화나트륨, 200 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μM Pefabloc SC, 0.2% Nonidet P40 및 10% 글리세롤을 함유한 pH 7.9의 20 mM Hepes]로 평형시키고 용리된 Sephadex G-25 컬럼(Pharmacia)을 통해 무세포 추출물을 크로마토그래피시킨다. 단백질을 함유한 분획을 수집하고 완충액 A에서 평형을 이룬 DEAE-Sephadex A-25 겔(Pharmacia)의 컬럼을 통해 크로마토그래피시킨다. 이 컬럼상에 보유되지 않은 단백질 분획을 최종농도가 2.8M이 되게끔 고체 황산암모늄과 점진적으로 혼합한다. 2 시간 후, 이 현탁액을 원심분리시킨다(30,000 x g; 15분). 200 mM EDTA, 500 μM DTT 및 2.8 M 황산암모늄을 함유한 pH 7.9의 20 mM Hepes 완충액에서 평형을 이룬 페닐-슈퍼로스 HR 5/5 컬럼(Pharmacia)을 통해 20℃에서 상등액을 크로마토그래피시킨다. 동일한 완충액에서 감소하는 직선구배의 황산암모늄(2.8M 에서 0M로)으로 컬럼으로부터 단백질을 용리시킨다. HMG1 단백질을 함유한 분획을 모아 1 mM EDTA 및 500 μM DTT를 함유한 pH 7.7의 50 mM Tris/HCl 완충액으로 광범위하게 투석시킨다. 그리고 나서 이 샘플을 pH 7.7의 50 mM Tris/HCl 완충액-500 μM DTT내 직선구배 0 에서 0.5 M의 염화나트륨으로 용리되게 될 MonoQ HR 5/5 컬럼 (Pharmacia)으로 주입한다. 280 nm에서 대칭형의 흡광 피크를 형성하는 단백질 HMG1을 이 완충액중에 수집한다. HMG1 단백질을 센트리콘 10에서 원심분리에 의해 농축시킨 후 pH 6.2의 10 mM Mes 완충액-140 mM NaCl-500 μM DTT 중에 취한다. 사용될 때까지 -80℃에서 HMG1 단백질을 저장한다. 이 제제는 변성조건하에(SDS) 전기영동에 의해 분석되고 쿠마시 염색에 의해 가시화될 경우 겉보기 분자량 31,000에서 이동하는 단일 단백질 밴드를 나타낸다. 정제에 대한 전체 수율은 초기 배양액 500 ml에 대해 순수한 HMG1 단백질 850 μg이다.
실시예 2: 시험관내에서 포유동물 세포로의 핵산 전달
본 실시예는 DNA와 결합하고 핵속으로 능동적으로 이입되는 HMG1형 단백질이 플라스미드 DNA의 형질감염을 촉진하는데 사용 가능한 방법을 보여준다.
본 발명의 조성물의 활성을 입증하기 위해 사용된 작제물은 앞서 기술된 루시퍼라제(Luc)를 암호화하는 유전자를 함유한 플라스미드이다.
본 절차는 형질감염(융합 세포) 2일 후 수거될 24-웰 플레이트(직경 16mm)에 대해 설정된다. 모든 파라미터는 비례적으로 변화될 수 있다.
D 일, NIH 3T3 세포(ATCC: CRL1658), 3LL[참조문헌; Isakov N. et al., JNCI 71(1983) 139-145] 및 H460[참조문헌; Maxwell et al., Oncogene 8 (1993) 3421-3429]을 105세포/웰로 접종한다.
D+2 일, 세포를 PBS로(미량의 혈청을 제거하기 위해) 세정하고 10% 태 송아지 혈청(FCS)으로 보충되거나 보충되지 않은 250 ml의 PRMI(3LL 및 H460) 또는 DMEM(NIH 3T3) 중에 취한다.
형질감염을 위해 사용된 조성: 하기의 것을 튜브(웰-당량 당)로 첨가하고:
- H2O qs 20 ml
- NaCl qs 140 mM 최종
- 0.5 mg 플라스미드 DNA
- 125 ng HMG1
혼합물을 적절하게 와동시킨 다음 DOGS 리포펙턴트 1.5 nmol을 첨가하기 전에 실온에서 15분간 배양한다. 다시 한번 혼합물을 적절하게 와동시키고 실온에서 15분간 배양한다.
배양배지로 DNA/HMG1/리포펙턴트 혼합물 20 ml를 첨가시켜 세포를 형질감염시키고, 37℃에서 2 내지 4 시간 동안 배양한다. 그리고 나서 이 배지를 완전 배지로 대체시킨다.
D+4 일, 세포를 실온에서 250 ml PBS로 세정하고 100 ml의 특정 목적의 완충액(Reporter(Promega) + TCK 및 Aprotinin)에서 용해시킨다. 합성된 루시퍼라제의 활성을 측정하기 위해 10 ml의 용해액 및 50 ml의 기질(Promega)을 사용한다.
도 1 및 2에 나타낸 결과는 독립적으로 두번 반복된 4가지 실험의 평균이다. 이를 행하기 위해, 형질감염된 세포에서 Luc 유전자의 발현에 의해 수득된 광 단위(LU)를 평가한다.
도 1은 가변량의 HMG1 단백질의 존재하에, 앞서 언급된 3가지 세포형에 대해 수득된 값들을 대조하고 있다.
도 2는 상이한 양의 HMG1 단백질을 첨가시켜 수득되는 형질감염의 촉진 인자를 요약식으로 대조하고 있다. HMG1 단백질에 의한 형질감염 효능의 증가는 세포형에 따라 다양할 수 있다.
형질감염을 위해 필요한 조성물을 함유한 배지를 10% FCS로 보충할 경우 증가에 있어 최대치가 관찰된다. 이는 FCS의 존재가 생체내에서 직면한 조건을 나타내기 때문에 유리하다. 또한, FCS의 존재는 특히 HMG1 단백질의 부재하에, 형질감염의 효능을 감소시키는데 있어 중요하다. 이는 배양 배지내 FCS의 존재가 세포에 의해 내부화 가능한 DNA의 양을 감소시킴을 암시한다. 이러한 맥락에서, HMG1은 DNA의 양을 제한하는 조건하에서의 형질감염에 특히 유리한 것으로 언급될 수 있다.
형질감염을 위한 최적 HMG1/DNA 비(질량기준)는 0.25 내지 0.5이다. 이러한 조건은 DNA를 응축할 수 있는 것으로 기술되지 않는다[참조문헌; Bttger M. et al., B. B. A. 950 (1988) 221-228; Stros M. et al., N. A. R. 22 (1994) 1044-1051]. 이에 대한 이유는 플라스미드가 HMG1으로 포화되지 않기 때문이다[참조문헌; Kohlstaedt L. A. et al., Biochemistry 33 (1994) 12702-12707]. 이리하여 HMG1 단백질의 효과는 DNA와의 결합능 및 세포핵으로의 수송능에 의해 설명된다.

Claims (25)

  1. 핵산 및 적어도 하나의 형질감염제 외에, 핵으로의 DNA 전달능과 DNA-결합성을 겸비하는 적어도 하나의 화합물을 함유함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 핵산의 형질감염용으로 유용한 약학 조성물.
  2. 핵산 및 적어도 하나의 형질감염제 외에, HMG 계열에 속하는 적어도 하나의 화합물 또는 이의 유도체 중 하나를 함유함을 특징으로 하는, 적어도 하나의 핵산의 형질감염용으로 유용한 약학 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화합물이 HMG 1, 2, I, Y, 14 및 17형 단백질 또는 이들의 유도체 중에서 선택됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 인간 HMG1 단백질, 이의 유도체 중 하나 또는 동족체의 전부 또는 일부로 표시됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 또한 폴리글리코실화, 설폰화, 포스포릴화 및/또는 복합당에 또는 친유제에 그래프팅됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 또한 핵- 또는 세포 수용체 리간드와 결합됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염제가 양이온 중합체 또는 리포펙턴트임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 양이온 중합체가 바람직하게는 화학식 1의 화합물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
    화학식 1
    상기식에서,
    R은 수소원자 또는 화학식의 그룹이고
    n은 2 내지 10의 정수이며,
    p 및 q는 정수이며, p와 q의 합은 중합체의 평균 분자량이 100 내지 107이 되도록 하는 값이다.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 양이온 중합체가 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리프로필렌이민(PPI) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 중합체가 평균분자량이 50,000인 폴리에틸렌이민(PEI50K) 및 평균분자량이 800,000인 폴리에틸렌이민(PEI800K) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 리포펙턴트가 화학식 2의 적어도 하나의 친수성 폴리아민 영역을 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
    화학식 2
    상기식에서,
    m은 2 이상의 정수이고,
    n은 1 이상의 정수이며,
    m은 포화 또는 불포화 탄화수소쇄, 콜레스테롤 또는 라멜라 상 또는 육변형 상을 형성할 수 있는 천연 또는 합성 지질을 포함하는 유형의 친유성 영역과 공유결합되어 있는 두 아민 사이에 놓인 상이한 탄소그룹 간에 다양할 수 있다.
  12. 제 11 항에 있어서, 폴리아민 영역이 스퍼민, 써민 또는 핵산결합성을 보유한 이들의 동족체 중 하나임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 친유성 영역이 화학식 4로 표현됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
    화학식 4
    상기식에서,
    X 및 X′는 상호 독립적으로 산소원자, 메틸렌 그룹 -(CH2)q-(여기에서, q는 0, 1, 2 또는 3이다), 또는 아미노 그룹 -NH- 또는 -NR′-(여기에서, R′은 C1-C4알킬 그룹이다)이고,
    Y 및 Y′는 상호 독립적으로 메틸렌 그룹, 카보닐 그룹 또는 C=S 그룹이며,
    R3, R4및 R5는 상호 독립적으로 수소원자 또는 치환되거나 비치환된 C1-C4알킬 라디칼이며, p는 0 내지 5 범위일 수 있으며,
    R6는 콜레스테롤 유도체 또는 알킬아미노 그룹 -NR1R2이며 R1및 R2는 상호 독립적으로 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 측쇄 C12-C22지방족 라디칼이다.
  14. 제 11 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS), 팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드 (DPPES), 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)펜틸(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 또는 1,3-비스(3-아미노프로필아미노)-2-프로필(디옥타데실카바모일메톡시)아세테이트 중에서 선택된 리포폴리아민임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제 1 항 내지 7 항, 11 항, 12 항 및 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염제가 디옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS)임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제 1 항 내지 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 디옥시리보핵산임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. 제 1 항 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  19. 제 16 항 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 안티센스 서열임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  20. 제 16 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 함유함을 특징으로 하는 약학 조성물.
  21. 제 1 항 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 중성지질을 또한 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 중성지질(들)이 합성지질 또는 천연지질 중에서 선택되고 생리학적 조건에서 쯔비터이온성이거나 이온 전하를 전혀 띠지 않을 수 있음을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 중성지질(들)이 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일, -팔미토일 및 -미리스토일-포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(특히, 예를 들면, 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(특히, 예를 들면, 스핑고마이엘린) 및 아시알로강글리오시드(특히, 예를 들면, 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 핵산의 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 전달을 위한 제 1 항 내지 23 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 용도.
  25. 세포 수용체 리간드, 항체 또는 항체 유도체와 커플링되어 있고, 상응하는 수용체 또는 항원을 발현하는 세포 쪽으로 핵산을 표적화하는 제 1 항 또는 제 2 항 에 따른 화합물의 용도.
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