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KR102809728B1 - 글리코실화된 pd-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

글리코실화된 pd-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR102809728B1
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에즈라 엠. 청
용-수 김
승-오 임
치아-웨이 리
미엔-치에 헝
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Abstract

비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, 글리코실화된 아미노산 위치를 포함하는 PD-1 폴리펩티드가 또한 제공된다. 상기 항체 및 폴리펩티드를 제조 및 사용(예를 들어, 암의 치료를 위해)하기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

글리코실화된 PD-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 형태로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전체는 본원에 참고로 포함된다. 2016년 11월 30일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 24258_105005PCT_SL.txt이고, 19,819 바이트의 크기이다.
분야
본 발명은 일반적으로 의약, 분자 생물학 및 종양학에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암을 치료하기 위한 항체에 관한 것이다.
배경
T-세포 활성화를 보존하는 것은 광범위한 악성 암의 치료를 완전히 재형성하였다. 예를 들어, T-세포 반응을 표적화하는 최초로 FDA 승인된 체크포인트 차단제(checkpoint blockade)인 이필리무맙의 개발은 전이성 흑색종 치료를 가능하게 하였다(Hodi et al., The New England Journal of Medicine 363, 711-723 (2010)). 항-세포독성 T 림프구 항원-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4)(CTLA-4) 단클론성 항체는 흑색종 환자를 치료하는데 있어서 유망한 결과를 나타낸 한편, PD-1 및 PD-L1 둘 다를 표적화하는 2 세대 체크포인트 억제제는 III 상 임상 시험에서 우수한 임상 활성 및 안전성을 입증하였다(Topalian et al., The New England Journal of Medicine 366, 2443-2454 (2012); Brahmer et al., The New England Journal of Medicine 366, 2455-2465 (2012)). PD-L1은 또한 그것의 면역억제 활성 이외에 암 세포 진행을 유도하는 발암 가능성을 보유하기 때문에(Topalian et al., The New England Journal of Medicine 366, 2443-2454 (2012); Page et al., Annual Review of Medicine 65, 185-202 (2014)), PD-1/PD-L1을 표적화하는 것은 PD-1을 통한 면역억제를 차단하는 한편, PD-L1을 통한 세포 진행을 감소시킴으로써 이중 효능을 제공하며(Okazaki et al., Nature Immunology 14, 1212-1218 (2013)), 더욱 민감한 결과를 가질 것으로 예상된다(Topalian et al., The New England Journal of Medicine 366, 2443-2454 (2012); Brahmer et al., The New England Journal of Medicine 366, 2455-2465 (2012); Hamid et al., The New England Journal of Medicine, 369, 134-144 (2013)). 2014년에, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-1 항체의 효능을 단일 약제 또는 조합으로서 검사하기 위한 미국에서 진행중인 10 개 이상의 임상 시험이 있었다(Page et al., Annual Review of Medicine 65, 185-202 (2014)). 유망한 결과를 갖는 몇몇의 성공적인 임상 시험이 있었던 반면, PD-L1 및 PD-1의 병리학적 기능 및 조절 메커니즘은 불완전하게 정의된 채로 남아있다.
침묵 면역 반응을 되살리는 것이 최근 수술적 제거, 화학요법, 방사선요법, 및 표적화된 요법 이후의 치료 옵션의 레퍼토리에 추가되었다. 항-CTLA-4 단클론성 항체의 사용(Dunn et al., Nature Immunology 3, 991-998( 2002); Leach et al., Science 271, 1734-1736 (1996))은 전이성 흑색종 치료에서 성공을 최초로 입증한 한편, 자가면역 반응을 또한 유도한다는 것을 밝혀내었다. 면역 세포에만 영향을 미치는 항-CTLA-4와 달리, 항-PD-L1 및 항-PD-1은 암 및 T-세포 둘 다로부터의 이중 영향을 생성하는 종양 부위에 주로 작용하므로, 역효과를 제한하고 우수한 치료 효능을 제공한다(Okazaki et al., Nature Immunology 14, 1212-1218 (2013)). 그러나, 암 세포에서 PD-1/PD-L1 경로의 성공적 표적화를 위한 새로운 치료법 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
요약
본원은 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체(본원에서 항-glycPD-1 항체)를 제공한다. 일부 양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 비해 위치 N49, N58, N74 및/또는 N116에서 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N58 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N74 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N74 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58, N74, 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58, N74, 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다.
일부 양태에서, 항체는 1 이상의 글리코실화 모티프(motif)에 선택적으로 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 글리코실화 모티프를 포함하는 글리코펩티드 및 인접 펩티드에 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 1 이상의 글리코실화 모티프에 인접하여 3차원으로 위치한 펩티드 서열에 결합한다. 특정 양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 추가 양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd 보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다.
특정 양태에서, 항-glycPD-1 항체는 PD-1에 결합하고 1 이상의 글리코실화 모티프를 마스킹하거나 은폐하여 분자와 상기 모티프의 결합 또는 다른 상호작용을 차단하고 상기 글리코실화 부위에서 PD-1의 글리코실화를 차단할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 N49, N58, N74 및 N116 중 1 이상에서 글리코실화 부위를 마스킹한다.
특별한 양태에서, 각각 서열번호 3 및 5의 아미노산 서열(임의의 시그널 서열이 없는 성숙 VH 및 VL 영역 아미노산 서열)을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항-glycPD-1 단클론성 항체 STM418 및 이의 항원 결합 부위, 및 이의 인간화 및 키메라화된 형태가 제공된다. 본원은 글리코실화된 PD-1에 대한 결합을 위해 STM418 MAb와 경쟁하고/하거나 STM418과 동일한 에피토프에 결합하는 항-glycPD-1 항체를 제공한다. STM418의 에피토프는 다음과 같이 밑줄로 표시된 PD-1 아미노산 서열 내의 접촉 잔기를 갖는다:
(서열번호 1의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124). 서열번호 1의 글리코실화된 PD-1 서열의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124로부터의 영역을 갖고, 특히 서열번호 1의 위치 T36, S38, T51, T53, S55, S109, R115, S118 및 Y121 중 1 이상에 접촉하는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 구체적 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하고 서열번호 1의 위치 36, 38, 51, 53, 55, 109, 115, 118, 및 121 모두와의 결합 접촉을 갖는 항체가 제공된다.
STM418 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 대응 아미노산 서열을 아래 표 3에 나타낸다. 서열번호 2 및 3은 STM418 VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이고, 서열번호 4 및 5는 STM418 카파 경쇄 가변 도메인의 성숙 형태의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이다. 표 4는 STM418의 Chothia, AbM, Kabat 및 Contact 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 제공한다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 5의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-1 항체는 키메라 항체일 수 있으며, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 이와 경쟁한다. 바람직하게는, VH 및 VL 도메인은 같은 클래스의 CDR을 가지며, 즉 둘 다 Chothia, AbM, Kabat 또는 Contact CDR을 갖는다.
다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 1, 2, 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는다. 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 1, 2, 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 다에 대한 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
바람직하게는, 상술한 항체는 인간 프레임워크 영역(human framework region)을 가지며, 즉 STM418의 인간화된 형태이고, 임의로는, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다.
당업자는 1 이상의 아미노산 치환이 인간화된 항체의 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서 이루어져 결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선할 수 있음을 인식할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd 보다 적어도 5 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1 단백질에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다.
실시양태에서, 실시예 2에 기재된 유세포분석 결합 에세이(assay)에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 대한 결합을 위한 MFI에 비해 3 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 또는 100 배 큰, 야생형 PD-1을 발현하는 세포에 대한 MFI로서 표현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능하다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커, 예컨대 FITC로 직접 표지되거나, 형광으로 표지된 2 차 항체에 의해 검출된다. 글리코실화된 PD-1에 대한 STM418 MAb, 또는 이의 키메라 또는 인간화된 형태의 결합 친화성은 하한값 및 상한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 특히 이펙터(effector) T-세포에 의해 발현된 글리코실화된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
다른 특별한 양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 결합하는, 각각 서열번호 23 및 25의 아미노산 서열(성숙한 VH 및 VL 영역 아미노산 서열)을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 및 이의 항원 결합 부위를 갖는 항-glycPD-1 단클론성 항체 STM432, 및 이의 인간화된 키메라 형태가 제공된다. 각각 STM432 MAb, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 22 및 24,를 아래 표 3에 나타내었다. 또한, 표 5에는 STM432의 Chothia, AbM, Kabat 및 Contact 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타내었다. STM432 MAb는 밑줄친 접촉 잔기 R95, R103, S127, 및 K131을 갖는 서열 (서열번호 1의 아미노산 D91 내지 M107 및 C123 내지 I134)를 갖는 글리코실화된 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 따라서, 상기 기재된 바와 같은 STM432에 결합하는 항-glycPD-1 항체가 제공된다. 또한, 글리코실화된 PD-1에 대한 결합을 위해 STM432 MAb와 경쟁하는 항-glycPD-1 항체가 제공된다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및/또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 23의 VH 도메인 및 서열번호 25의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-1 항체는 키메라 항체일 수 있으며, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 각각 서열번호 36, 서열번호 7, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 이와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는 항-glycPD-1 항체가 제공된다. 항-glycPD-1 항체는 또한 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38; 또는 각각 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 다의 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 바람직하게는, 이들 항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 즉 STM432의 인간화된 형태이고, 경우에 따라, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다. 당업자는 1 이상의 아미노산 치환이 인간화된 항체의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 이루어져 결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선할 수 있음을 인식할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 5 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1 단백질에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 5에 기재된 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 대한 결합을 위한 MFI에 비해 3 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 또는 50 배 큰, WT PD-1을 발현하는 세포에 대한 MFI로서 표현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능하다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커, 예컨대 FITC로 직접 표지된다. 글리코실화된 PD-1에 대한 STM432 MAb, 또는 이의 결합 도메인 또는 인간화 또는 키메라 형태의 결합 친화성은 하한값 및 상한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-1의 상호작용을 억제하고, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 글리코실화된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
일부 양태에서, 항체는 재조합체이다. 특정 양태에서, 항체는 IgG, IgM, IgA 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 양태에서, 항체는 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1 가 scFv, 2 가 scFv, 이중 특이적 항체, 이중 특이적 scFv, 또는 단일 도메인 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 추가 양태에서, 항체는 이미징제(imaging agent), 화학요법제, 독소 또는 방사성핵종에 콘쥬게이트된다.
추가 실시양태에서, 본원은 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 실시양태의 항체(예를 들어, 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항체)를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 추가적인 실시양태에서, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상)의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 제공된다. 추가 양태에서, 실시양태의 단리된 폴리펩티드는 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는, 인간 PD-1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상)의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화된다. 일부 양태에서, 실시양태의 폴리펩티드는 면역원성 폴리펩티드(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), KLH)에 융합되거나 콘쥬게이트된다. 특정 양태에서, 폴리펩티드는 C- 또는 N- 말단에 Cys 잔기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리펩티드는 Cys 잔기에서 디설파이드 결합에 의해 면역원성 폴리펩티드에 콘쥬게이트된다.
또 추가적인 실시양태에서, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상)의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공되고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되며, 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제형화된다.
또 추가적인 실시양태에서, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되며, 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제형화된다. 일부 양태에서, 면역원성 조성물은 백반(alum) 또는 프로인트 보강제(Freund's adjuvant)와 같은 보강제를 추가로 포함한다.
또 추가적인 실시양태에서, 본원은 실시양태의 항체 또는 단리된 폴리펩티드의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 암을 치료하는 방법은 폴리펩티드(예를 들어, 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가 양태에서, 실시양태의 항체(예를 들어, 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항체), 예컨대 비제한적으로 STM418 또는 STM432의 인간화 또는 키메라 형태, 또는 글리코실화된 PD-1에 대한 결합을 위해 STM418 또는 STM432와 경쟁하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 대장암, 직장암 또는 피부암이다. 특정 양태에서, 암은 부신암, 항문암, 담도암, 방광암, 골암, 성인에서의 뇌/CNS 종양, 소아에서의 뇌/CNS 종양, 유방암, 남성에서의 유방암, 청소년에서의 암, 소아에서의 암, 젊은 성인에서의 암, 원발부위 불명암, 캐슬맨병(Castleman disease), 자궁경부암, 대장/직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 패밀리 종양(Ewing family tumor), 안구암, 담낭암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor)(GIST), 임신 영양막 질환, 호지킨병(Hodgkin disease), 카포시육종, 신장암, 후두 또는 하인두암, 백혈병(예를 들어, 성인 급성 림프성(adult acute lymphocytic)(ALL), 급성 골수성(acute myeloid)(AML), 만성 림프성(chronic lymphocytic)(CLL), 만성 골수성(chronic myeloid)(CML), 만성 골수단핵구성(chronic myelomonocytic)(CMML), 소아 백혈병), 간암, 폐암(예를 들어, 비소세포, 소세포), 폐 카르시노이드 종양, 림프종, 피부의 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강암, 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 소아에서의 비-호지킨 림프종, 구강암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(예를 들어, 성인 연조직암), 피부암(예를 들어, 기저 및 편평 세포, 흑색종, 메르켈 세포(merkel cell)), 소장암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 빌름스 종양(Wilms tumor)이다. 특정 양태에서, 항체는 약학적으로 허용 가능한 조성물이다. 추가 양태에서, 항체는 전신적으로 투여된다. 특별한 양태에서, 항체는 정맥내로, 피부내로, 종양내로, 근육내로, 복강내로, 피하로 또는 국소로 투여된다.
일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 항암 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 항암 요법은 수술 요법, 화학요법, 방사선 요법, 냉동요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 사이토카인 요법이다.
또 추가적인 실시양태에서, 본원은 PD-1-함유 샘플을 실시양태의 항체(예를 들어, 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항체)와 접촉시키는 단계를 포함하는, PD-1 글리코실화, N-결합형 글리코실화 또는 N-글리코실화를 평가하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 시험관내(in vitro) 방법이다. 특정 양태에서, 샘플은 세포 샘플이다.
또 추가적인 실시양태에서, 실시양태에 따른 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 갖고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 및 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되는 폴리펩티드)를 동물에게 투여하는 단계 및 상기 동물로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 상기 동물은 마우스, 래트, 토끼 또는 인간일 수 있다. 특정 양태에서, 방법은 항체의 CDR을 확인하는 단계 및 CDR을 둘러싼 서열을 인간화시켜 인간화된 항체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 또 추가적인 양태에서, 방법은 인간화된 항체를 재조합적으로 발현시키는 단계를 포함한다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본원은 상술한 방법에 의해 생성된 단리된 항체를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원은 비글리코실화된 PD-1에 비해 실시양태의 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하고, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되는 폴리펩티드)에 선택적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
도면 설명
도 1a-1d. PD-1에 대한 PD-L1-결합은 글리코실화 특이적이다. (a 및 b) 최종 시점에서 PD-L1 및 야생형 PD-1 및 PD-1 4NQ 돌연변이체(즉, 비글리코실화된 PD-1)를 발현하는 293T 세포 사이의 동적 상호작용을 도시한 시간 경과(time lapse) 현미경 이미지(24 시간 시점). PD-1 WT(a) 또는 4NQ PD-1 돌연변이체(b)를 발현하는 세포의 녹색 형광(녹색 형광 표지된 PD-1/Fc 단백질) 병합 이미지(20x)를 도시하였다. (c) 그래프는 매시간 시점에서 PD-1 WT 또는 PD-1 4NQ를 발현하는 HEK293T 세포에 대한 PD-L1/Fc 단백질의 정량적 결합을 나타낸다. (d) 야생형 PD-1 또는 4NQ 돌연변이체 PD-1을 발현하는 293T 세포에 대한 PD-L1/Fc 융합물의 결합을 공동-면역침강 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 에세이하였다. WB:항-hIgG-HRP는 웨스턴 블롯 분석에서 항-hIgG-HRP 항체에 의해 인식된 바와 같은 결합된 PD-L1/Fc를 나타내고; WB:항-FLAG는 웨스턴 블롯 분석에 의한 PD-1의 검출을 나타내며; IP:FLAG에서의 항-FLAG는 면역침강에 의한 PD-L1/Fc 투입의 검출 및 항-FLAG 항체를 이용한 검출을 나타낸다.
도 2. PD-1-Fc 단백질에 결합하는 항-glycPD-1 항체의 웨스턴 블롯 분석. 야생형(WT), 돌연변이체(N49, N58 및 N74) 및 PNGase로 처리된 야생형에 대한 STM418 및 STM432 MAb의 결합을 웨스턴 블롯으로 도시하였다.
도 3a-3c. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 단백질인 PD-1(서열번호 1)의 위치 49에서 N에 대해 치환된 Q를 갖는 N49, 위치 58에서 N에 대해 치환된 Q를 갖는 N58, 위치 74에서 N에 대해 치환된 Q를 갖는 N74, 위치 116에서 N에 대해 치환된 Q를 갖는 N116, 및 각각의 위치 49, 58, 74, 및 116에서 N에 대해 치환된 Q를 갖는 4NQ를 발현하는 293T 세포, 또는 대조군 293T 세포에 대한 표지된 항-glycPD-1 및 대조군 항체의 결합을 유세포분석을 사용하여 측정한다. a. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 단백질을 발현하는 293T 세포 및 대조군 293T 세포에 대한 항-glycPD-1 항체 STM418의 결합. b. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 단백질을 발현하는 293T 세포 및 대조군 293T 세포에 대한 항-glycPD-1 항체 STM432의 결합. c. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 단백질을 발현하는 293T 세포 및 대조군 293T 세포에 대한 대조군 마우스 IgG의 결합.
도 4a 및 4b. 항-glycPD-1 항체 STM418의 중화 활성 및 EC50. a. 항체 농도에 따른, PD-1을 발현하는 세포에 대한 PD-L1-Fc 단백질의 결합을 차단하기 위한 STM418의 활성. b. STM418 농도에 따른 PD-1-PD-L1 결합의 억제. EC50은 0.132 ㎍/mL이다.
도 5a 및 5b. 항-glycPD-1 항체 STM432의 중화 활성 및 EC50. a. 항체 농도에 의해 PD-1을 발현하는 세포에 대한 PD-L1-Fc 단백질의 결합을 차단하기 위한 STM432의 활성. b. STM432 농도에 따른 PD-1-PD-L1 결합의 억제. EC50은 0.110 ㎍/mL이다.
도 6. 암 세포의 T 세포 사멸에 대한 STM418 및 STM432의 효과. 그래프는 STM418 및 STM432 항체 및 대조군 마우스 IgG의 존재하에 적색 이미지로 검출된 암 세포의 수준으로서 암 세포 증식을 나타낸다.
상세한 설명
N-글리코실화는 소포체(endoplasmic reticulum)(ER)에서 개시되고 이어서 골지체(Golgi)에서 가공되는 번역후 변형이다(Schwarz & Aebi, Current Opinion in Structural Biology 21, 576-582(2011)). 이 유형의 변형은 올리고사카라이드로 구성된 미리 형성된 글리칸을 NXT 모티프(-Asn-X-Ser/Thr-) 내에 위치한 아스파라긴(asparagine)(Asn) 측쇄 수용체로 이동시키는 막-연관된 올리고사카릴 트랜스퍼라아제(oligosaccharyl transferase)(OST) 복합체에 의해 1 차 촉매화된다(Cheung and Reithmeier, Methods 41(4): 451-59 (2007); Helenius and Aebi, Science 291 (5512): 2364-69 (2001)). 미리 형성된 글리칸으로부터의 사카라이드의 첨가 또는 제거는 각각 세포- 및 위치-의존 방식으로 N-글리코실화 캐스케이드를 긴밀하게 조절하는 글리코트랜스퍼라아제 및 글리코시다아제의 그룹에 의해 매개된다.
프로그램된 사멸 리간드(programmed death ligand)-1(PD-L1) 및 프로그램된 사멸(programmed death)(PD-1) 사이의 세포외 상호작용은 종양-연관된 면역 회피에 대한 영향을 표시하였다. 항-PD-1 또는 PD-L1 항체를 사용한 면역 체크포인트 차단제의 임상적 성공에도 불구하고, PD-L1 및 PD-1의 상호작용의 근본적인 조절 메커니즘은 많이 알려지지 않은 채로 남아있다. PD-1의 N-결합형 글리코실화는 PD-L1에 대한 그것의 결합을 향상시켜, T 세포-매개된 면역 반응의 억제를 야기할 수 있다. 따라서, 항-glycPD-1 항체는 보다 일반적인 PD-1 항체에 비해 향상된 억제 효과를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "프로그램된 사멸-1" 또는 "PD-1"은 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간, 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)(cyno)), 개, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 PD-1을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 경우, PD-1은 또한 이의 SNP 변이체뿐 아니라, 비제한적으로 인산화된 PD-1, 글리코실화된 PD-1, 및 유비퀴틴화된 PD-1을 포함한 PD-1의 상이한 변형된 형태를 포함하여 다양한 PD-1 이소형, 관련된 PD-1 폴리펩티드를 포함한다.
N-결합형 글리코실화를 위한 부위가 굵은 글씨 및 밑줄로 표시되어 있는 인간 PD-1의 예시적 아미노산 서열이 하기에 제공된다(N49, N58, N74 또는 N116):
하기 표 1에 나타낸 바에 있어서, 모든 4 개의 N-글리코실화 부위는 PD1의 세포외 도메인에 위치해 있다.
특정 PD-1 이소형 또는 변이체의 특정 글리코실화 부위는 상기 특정 PD-1 이소형 또는 변이체의 위치 49, 58, 74 또는 116의 아미노산으로부터 달라질 수 있다.
상기 상황에서, 당업자는 서열 정렬 및 당업계의 다른 일반 지식을 기본으로 하여 상기 예시된 인간 PD-1의 N49, N58, N74 및 N116에 대응하는 임의의 특정 PD-1 이소형 또는 변이체의 글리코실화 부위를 결정할 수 있을 것이다. 이와 같이, 본원은 또한 비글리코실화된 PD-1 이소형 또는 변이체에 비해 PD-1 이소형 또는 변이체의 글리코실화된 형태에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. PD-1 이소형 또는 변이체의 글리코실화된 부위는 상기 제공된 인간 PD-1 서열의 N49, N58, N74 및 N116의 대응 부위일 수 있다. 본원은 또한 상기 제공된 예시적 인간 PD-1 서열의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 PD-1 이소형 또는 변이체의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상)의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 관사 "하나", "하나의", 및 "상기"는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상을 지칭한다. 예로서, 항체는 하나의 항체 또는 하나 이상의 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "또는"은 대체물만을 지칭하거나 대체물이 상호 배타적인 것으로 명확하게 나타내지 않는 경우, "및/또는"과 교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, "다른"은 적어도 2 이상을 지칭한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "약"은 어떤 값이 그 값을 결정하기 위해 이용되는 장치에 대한 오차의 고유한 변화, 또는 연구 대상체에 존재하는 변화를 포함하는 값을 나타낸다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE와 같은 면역글로불린(또는 "Ig") 클래스의 폴리펩티드 내의 B 세포의 폴리펩티드 생성물뿐 아니라 이의 항원 결합 단편을 갖는 다른 분자를 지칭한다. 항체는 폴리펩티드 사슬의 2 개의 동일한 쌍으로 구성될 수 있고, 각각의 쌍은 1 개의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 1 개의 경쇄(약 25 kDa)를 가지며, 각각의 사슬의 각각의 아미노-말단부는 약 100 내지 약 130 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각각의 사슬의 각각의 카복시-말단부는 불변 영역을 포함한다(Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Edition, W.H. Freeman and Company, New Yor). 여기서, 특정 분자 항원은 글리코실화된 인간 PD-1을 포함한다. 본원에서 제공된 항체는, 비제한적으로 다클론성 항체, 단클론성 항체, 합성 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 이중-특이적 항체, 다중 특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타화된(camelized) 항체, 키메라 항체, 세포내항체(intrabody), 항이디오타입(idiotypic)(항-Id) 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "단리된"은 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 참조로 사용될 때, 참조된 분자가 천연에서 발견되는 적어도 1 종의 성분이 없음을 의미한다. 상기 용어는 천연 환경에서 발견되는 일부 또는 모든 다른 성분이 제거된 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 항체의 천연 환경의 성분은, 예를 들어 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈장, 단백질, 핵산, 염 및 영양소를 포함한다. 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드의 천연 환경의 성분은, 예를 들어 지질막, 세포 소기관, 단백질, 핵산, 염 및 영양소를 포함한다. 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 성분 또는 그것이 단리되거나 재조합적으로 생성된 세포의 임의의 다른 성분이 모두 없거나 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "단클론성 항체"는 단일 세포 클론 또는 하이브리도마의 생성물 또는 단일 세포로부터 유래된 세포의 집단인 항체를 지칭한다. 단클론성 항체는 또한 면역글로불린 유전자를 코딩하는 중쇄 및 경쇄로부터 재조합적 방법에 의해 생성되어 단일 분자 면역글로불린 종을 생성하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 단클론성 항체 제제 내의 항체에 대한 아미노산 서열은 실질적으로 균질성이며, 상기 제제 내의 항체의 결합 활성은 실질적으로 동일한 항원 결합 활성을 나타낸다. 반대로, 다클론성 항체는 특정 항원에 결합하는 면역글로불린 분자의 조합인 집단 내의 상이한 B 세포로부터 얻어진다. 다클론성 항체의 각각의 면역글로불린은 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 단클론성 항체 및 다클론성 항체 둘 다를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Harlow and Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 및 Borrebaeck (ed.), Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp. 103-120 (1991)).
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 대응하는 인간 가변 영역 및/또는 인간 불변 영역 또는 그의 일부를 갖는 항체를 지칭한다. 상기 인간 생식세포 면역글로불린 서열이 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있다. 여기서, 인간 항체는 글리코실화된 인간 PD-1에 결합하는 항체를 포함하고, 인간 생식세포 면역글로불린 핵산 서열의 천연적으로 발생하는 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 대응 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지가 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 대응 서열과 동일하거나 상동성인 항체뿐 아니라 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 지칭한다(미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984) 참고).
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "인간화된 항체"는 천연 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region)("CDR") 잔기가 소망하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 대응 CDR(예를 들어, 도너 항체)로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린을 포함하는 키메라 항체(예를 들어, 수용자 항체)를 지칭한다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 1 이상의 FR 영역 잔기는 대응 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 가질 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어진다. 인간화된 항체 중쇄 또는 경쇄는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간 면역글로불린의 것과 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 1 이상의 가변 영역 중 실질적으로 모두를 가질 수 있다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린의 적어도 일부, 전형적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부를 가질 수 있다. 더욱 상세하게는, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Carter et al., Proc . Natl . Acd . Sci . USA 89:4285-4289 (1992); 및 미국 특허 제6,800,738호, 제6,719,971호, 제6,639,055호, 제6,407,213호, 및 제6,054,297호를 참고한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "재조합 항체"는 재조합적 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 지칭한다. 재조합 항체는 숙주 세포 내로 형질이입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉(transgenic) 및/또는 염색체도입 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D. et al., Nucl . Acids Res. 20:6287-6295(1992) 참고) 또는 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 단계를 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 지칭한다. 이러한 재조합 항체는, 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 것을 포함하여, 가변 영역 및 불변 영역을 가질 수 있다(Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고). 재조합 항체는 또한 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용될 때, 생체내(in vivo) 체세포 돌연변이유발)되므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 한편, 생체내에서 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "항원 결합 단편" 및 유사 용어는 항원에 면역특이적으로 결합하고 항원에 대한 그것의 특이성 및 친화성을 항체에 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 단편은 항체의 기능적 단편으로 지칭될 수 있다. 항원 결합 단편은 1가, 2가, 또는 다가일 수 있다.
항원 결합 단편을 갖는 분자는, 예를 들어 Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, F(ab')3, 단일쇄 Fv(scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 또는 단일 도메인 항체를 포함한다. scFv는 1가 scFv 또는 2가 scFv일 수 있다. 항원 결합 단편을 갖는 다른 분자는, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드, 가변 영역 폴리펩티드 또는 CDR 폴리펩티드 또는 항원 결합 단편이 결합 활성을 함유하는 한 이의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 항원 결합 단편은, 예를 들어 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec . Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plㆌckthun and Skerra, Meth . Enzymol., 178:497-515 (1989) 및 Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)의 기재에서 찾아볼 수 있다. 항원 결합 단편은 적어도 5 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 10 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 15 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 20 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 25 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 40 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 50 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 60 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 70 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 80 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 90 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 100 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 125 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 150 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 175 개의 연속하는 아미노산 잔기, 적어도 200 개의 연속하는 아미노산 잔기, 또는 적어도 250 개의 연속하는 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
항체의 중쇄는 아미노-말단부가 약 120 내지 130 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고 카복시-말단부가 불변 영역을 포함하는, 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기본으로 하여 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5 종의 별개 유형 중 1 종일 수 있다. 별개의 중쇄는 크기에서 상이하다: α, δ 및 γ는 약 450 개의 아미노산을 함유하는 한편, μ 및 ε은 약 550 개의 아미노산을 함유한다. 경쇄와 조합될 때, 이들 별개 유형의 중쇄는 IgG의 4 종의 서브클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 각각 5 종의 잘 알려진 클래스의 항체인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 발생시킨다. 중쇄는 인간 중쇄일 수 있다.
항체의 경쇄는 아미노-말단부가 약 100 내지 110 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고 카복시-말단부가 불변 영역을 포함하는, 약 25 kDa의 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217 개 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열을 기본으로 하여 람다(λ)의 카파(κ)로 지칭되는 2 종의 상이한 유형이 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 경쇄는 인간 경쇄일 수 있다.
항체의 가변 도메인 또는 가변 영역은 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노-말단에 위치하고 중쇄에서 약 120 내지 130 개 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110 개 아미노산의 길이를 갖는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 부위를 지칭하고, 각각의 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다. 가변 도메인은 상이한 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다. 서열의 가변성은 CDR에 집중되는 한편, 가변 도메인에서 덜 가변적인 부위는 프레임워크 영역(FR)으로 지칭된다. 경쇄 및 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호작용에 주로 관여한다. 본원에 사용된 아미노산 위치의 넘버링은 Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest에서와 같이 유럽 색인(EU Index)에 따른다. (미국 보건복지부, 워싱턴, D.C.) 5판. 가변 영역은 인간 가변 영역일 수 있다.
CDR은 면역글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3 개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 1 개, 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비-프레임워크 영역 내의 3 개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 1 개를 지칭한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다. CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 가변 도메인 내의 최고 초가변성의 영역으로서 Kabat에 의해 정의되었다(Kabat et al., J. Biol . Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv . Prot . Chem. 32:1-75 (1978)). CDR 영역 서열은 또한 보존된 β-시트 프레임워크의 일부가 아니므로, 상이한 입체구조를 맞출 수 있는 잔기로서 Chothia에 의해 구조적으로 정의되었다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 양쪽 용어는 당업계에 잘 인식되어 있다. 표준 항체 가변 도메인 내의 CDR의 위치는 많은 구조의 비교에 의해 결정되어 있다(Al-Lazikani et al., J. Mol . Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). 초가변 영역 내의 잔기의 수는 상이한 항체에서 달라지기 때문에, 표준 위치에 대한 추가 잔기는 전통적으로 표준 가변 도메인 넘버링 계획에서 잔기 번호 다음에 a, b, c 등으로 넘버링된다(Al-Lazikani et al., supra (1997)). 이러한 명명법은 당업자에게 유사하게 잘 알려져 있다.
범용적인 넘버링 체계인 ImMunoGeneTics(IMGT) Information System® (Lafranc et al., 2003, Dev . Comp. Immunol., 27(1):55-77)이 개발되어 널리 체택되어 왔다. IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 면역글로불린(Ig), T 세포 수용체(TR) 및 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC)에 특화된 통합 정보 체계이다. 여기서, CDR은 중쇄 또는 경쇄 내의 아미노산 서열 및 위치 둘 다의 형태로 지칭된다. 면역글로불린 V 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"는 종들 사이에서 보존되고 루프(loop)로 지칭되는 구조 내에 존재하기 때문에, 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 체계를 사용함으로써 CDR 및 프레임워크 잔기가 용이하게 확인된다. 이 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를, 전형적으로 인간 항체로부터의 수용체 프레임워크에 그라프팅(grafting)하고 치환하는데 사용될 수 있다. 추가 넘버링 체계(AHon)가 Honegger et al., 2001, J. Mol . Biol., 309: 657-670에 의해 개발되었다. 예를 들어, Kabat 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 체계 사이의 관련성은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Kabat, Id; Chothia et al., Id.; Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag; and Lefranc et al., 1999, Nuc . Acids Res., 27:209-212 참고).
CDR 영역 서열은 또한 AbM 및 Contact 방법에 의해서도 정의되었다. AbM 초가변 영역은 Kabat CDR 및 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(예를 들어, Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag 참고). "contact" 초가변 영역은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석을 기본으로 한다. 이들 초가변 영역 또는 CDR 각각으로부터의 잔기를 하기에 기재하였다.
CDR 영역 서열의 예시적 개략설명은 하기 표 2에 나타내었다. 표준 항체 가변 영역 내의 CDR의 위치는 많은 구조의 비교에 의해 결정되었다(Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol . Biol., 273:927-948); Morea et al., 2000, Methods, 20:267-279). 초가변 영역 내의 잔기의 수는 상이한 항체에서 달라지기 때문에, 표준 위치에 대한 추가 잔기는 전통적으로 표준 가변 도메인 넘버링 계획에서 잔기 번호 다음에 a, b, c 등으로 넘버링된다(Al-Lazikani et al., Id). 이러한 명명법은 당업자에게 유사하게 잘 알려져 있다.
표 2. CDR 영역 서열의 예시적 개략설명
하나 이상의 CDR은 또한 공유결합으로 또는 비공유결합으로 분자 내로 통합되어 면역접합체(immunoadhesin)로 될 수 있다. 면역접합체는 큰 폴리펩티드 사슬의 일부로서 CDR(들)을 통합할 수 있거나, 다른 폴리펩티드 사슬에 CDR(들)을 공유결합으로 연결할 수 있거나, CDR(들)을 비공유결합으로 통합할 수 있다. CDR은 면역접합체가 특정 관심 항원에 결합하는 것을 허용한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "결합하다" 또는 "결합하는"은 분자 사이의 상호작용을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용, 및/또는 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용을 포함한 비-공유 상호작용일 수 있다. 항체와 글리코실화된 인간 PD-1과 같은 표적 분자의 단일 에피토프 사이의 총 비-공유 상호작용의 강도는 상기 에피토프에 대한 항체의 친화성이다. "결합 친화성"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체와 같은 결합 단백질)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너(예를 들어, 항체) 사이의 비공유 상호작용의 강도의 총 합의 강도를 지칭한다.
항체와 같은 결합 분자 X의 친화성은 항체의 동족 항원과 같은 그것의 결합 파트너에 대하여 일반적으로 해리 상수(Kd) 또는 평형 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항체에 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고-친화성 항체는 일반적으로 항체에 신속하게 결합하고 결합된 채로 오래 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. "Kd" 또는 "KD 값"은 당업계에 알려진 에세이에 의해, 예를 들어 결합 에세이에 의해 측정될 수 있다. KD는 방사성표지된 항원 결합 에세이(radiolabeled antigen binding assay)(RIA)에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들어, 관심 항체의 Fab 버전 및 그것의 항원을 이용하여 수행될 수 있다(Chen, et al., (1999) J. Mol . Biol. 293:865-881). 또한, KD 또는 KD 값은, 예를 들어 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000 BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 Biacore, 또는 예를 들어, OctetQK384 시스템(ForteBio, Menlo Park, CA)을 사용하는 바이오레이어 간섭계법(biolayer interferometry)에 의한 표면 플라즈몬 공명 에세이를 사용하여 측정될 수 있다. 본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 항체가 제2 분자 항원에 비해 더 높은 친화성으로 제1 분자 항원에 결합하는 경우, 항체는 제2 분자 항원에 비해 제1 분자 항원에 "선택적으로 결합"할 수 있는 것으로 지칭된다. 항체는 일반적으로 완전히 관련없는 항원에 결합하지 않는다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 2 내지 30 개 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 또는 30 개 아미노산)뿐 아니라 더 긴 아미노산 사슬, 예를 들어 30 개 이상의 아미노산, 50 개 이상의 아미노산, 100 개 이상의 아미노산, 150 개 이상의 아미노산, 200 개 이상의 아미노산, 300 개 이상의 아미노산, 400 개 이상의 아미노산, 500 개 이상의 아미노산, 또는 600 개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는, 예를 들어 재조합 발현, 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 번역 후 또는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 글리코실화, 카바밀화(carbamylation), 인산화, 비오티닐화, 형광 염료의 부착 등). 폴리펩티드는 특정 부위에서 글리코실화될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 메틸화된 백본 구조, 펩토이드(peptoid) 백본 구조(폴리-N-치환된 글리신), L-아미노산, R-아미노산 등을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 야생형 서열, 천연적으로 발생하는 변이체 서열, 돌연변이체 서열(예를 들어, 점 돌연변이체(point mutant), 결손 돌연변이체) 등을 가질 수 있다.
항- glycPD -1 항체
본원은 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 상기 PD-1은 인간 PD-1일 수 있다. 글리코실화된 PD-1은 PD-1의 특이적 N-글리칸 구조 또는 PD-1의 글리코펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항원 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 단리된 항체는 비글리코실화된 PD-1에 비해 위치 N49, N58, N74, N116, 또는 이의 임의의 조합에서 글리코실화된 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N58 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N74 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58 및 N74 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N74 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N58, N74, 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 N49, N58, N74, 및 N116 글리코실화를 갖는 인간 PD-1에 선택적으로 결합한다.
특정 양태에서, 항-glycPD-1 항체는 PD-1에 결합하고 1 이상의 글리코실화 모티프를 마스킹하거나 은폐하여 분자와 상기 모티프의 결합 또는 다른 상호작용을 차단하고 상기 글리코실화 부위에서 PD-1의 글리코실화를 차단할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 N49, N58, N74 및 N116 중 1 이상에서 글리코실화 부위를 마스킹한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 1 이상의 글리코실화 모티프에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 글리코실화 모티프를 갖는 글리코펩티드 및 인접 펩티드에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 적어도 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 또는 90 % 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단편은 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 50 % 미만의 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 K의 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 미만인 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 추가 양태에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다.
글리코실화된 PD-1, 특히 본원에 기재된 STM418 및 STM432에 우선적으로 결합하는 단클론성 항체가 제공된다. 또한, STM418 및 STM432의 인간화된 키메라 형태 및 STM418 및 STM432에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항체가 제공된다. STM418 및 STM432의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 하기 표 3에서 제공된다.
특별한 양태에서, 각각 서열번호 3 및 5의 아미노산 서열(임의의 시그널 서열이 없는 성숙 VH 및 VL 영역 아미노산 서열)을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항-glycPD-1 단클론성 항체 STM418 및 이의 항원 결합 부위, 및 이의 인간화된 키메라 형태가 제공된다. 본원은 PD-1에 대한 결합을 위해 STM418 MAb와 경쟁하고/하거나 STM418과 동일한 에피토프에 결합하는 항-glycPD-1 항체를 제공한다.
STM418 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 단클론성 핵산(DNA) 및 대응 아미노산 서열을 아래 표 3에 나타낸다. 서열번호 2 및 3은 STM418 VH 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이고, 서열번호 4 및 5는 STM418 카파 VL 도메인의 성숙 형태의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이다. 표 4는 STM418의 Chothia, AbM, Kabat 및 Contact 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 제공한다.
글리코실화된 PD-1 상의 STM418의 에피토프는 항원-항체 가교 결합 실험에 의해 결정된, 밑줄로 표시된 서열번호 1에서의 PD-1 위치 및 접촉 잔기와 함께 다음과 같이 결정되었다:
(서열번호 1의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124). 따라서, 서열번호 1의 글리코실화된 PD-1 서열의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124로부터의 영역을 갖고, 특히 서열번호 1의 위치 T36, S38, T51, T53, S55, S109, R115, S118 및 Y121 중 1 이상에 접촉하는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 구체적 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하고 서열번호 1의 위치 36, 38, 51, 53, 55, 109, 115, 118, 및 121 모두와의 결합 접촉을 갖는 항체가 제공된다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 3의 VH 도메인 및 서열번호 5의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-1 항체는 키메라 항체일 수 있으며, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 이와 경쟁한다. 바람직하게는, VH 및 VL 도메인은 같은 클래스의 CDR을 가지며, 즉 둘 다 Chothia, AbM, Kabat 또는 Contact CDR을 갖는다.
다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 1, 2, 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는다. 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR, 또는 각각 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR의 1, 2, 또는 3에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 다에 대한 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
바람직하게는, 상술한 항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 즉 STM418의 인간화된 형태이고, 경우에 따라, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다.
당업자는 결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선하기 위하여 1 이상의 아미노산 치환이 인간화된 항체의 CDR 및/또는 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd 보다 적어도 5 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1 단백질에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 2에 기재된 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 대한 결합을 위한 MFI에 비해 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 50 배, 70 배 or 100 배 큰, WT PD-1을 발현하는 세포에 대한 MFI로서 표현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능하다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커, 예컨대 FITC로 직접 표지된다. 글리코실화된 PD-1에 대한 STM418 MAb, 또는 이의 키메라 또는 인간화된 형태의 결합 친화성은 하한값 및 상한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하고, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 글리코실화된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
다른 특별한 양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 결합하는, 각각 서열번호 23 및 25의 아미노산 서열(성숙한 VH 및 VL 영역 아미노산 서열)을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 및 이의 항원 결합 부위를 갖는 항-glycPD-1 단클론성 항체 STM432, 및 이의 인간화된 키메라 형태가 제공된다. STM432 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 각각 서열번호 22 및 24를 아래 표 3에 나타낸다. 또한, 표 5에는 STM432의 Chothia, AbM, Kabat 및 Contact 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR을 나타낸다.
STM432는 서열 (서열번호 1의 PD-1 아미노산 서열의 아미노산 D91 내지 M107 및 C123 내지 I134)에 대응하는 글리코실화된 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 본원에 나타낸 바와 같이, MAb STM432에 의해 인식된 에피토프를 포함하는, 즉 PD-1에 결합된 mAb에 의해 접촉된 아미노산 잔기 R95, R103, S127, 및 K131에 밑줄을 표시하였다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같이 STM432 에피토프에 결합하는 항-glycPD-1 항체가 제공된다. 또한, 글리코실화된 PD-1에 대한 결합을 위해 STM432 MAb와 경쟁하고/하거나 STM432와 동일한 에피토프에 결합하는 항-glycPD-1 항체가 제공된다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및/또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 서열번호 23의 VH 도메인 및 서열번호 25의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VH 도메인 및/또는 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-1 항체는 키메라 항체일 수 있으며, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 및 Kabat CDR 1-3; 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3, 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3, 또는 이의 조합을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 글리코실화된 PD-1에 특이적으로 우선적으로 결합하는 항-glycPD-1 항체는 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Chothia CDR 1-3; 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 AbM CDR 1-3; 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 Kabat CDR 1-3; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하고, 각각 서열번호 36, 서열번호 7, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 1-3; 또는 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 Contact CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 이와 경쟁한다. 바람직하게는, VH 및 VL 도메인은 같은 클래스의 CDR을 가지며, 즉 둘 다 Chothia, AbM, Kabat 또는 Contact CDR을 갖는다.
특정 실시양태에서, 각각 서열번호 26, 서열번호 27, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 29, 서열번호 30, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 31, 서열번호 32, 및 서열번호 28; 또는 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는 항-glycPD-1 항체가 제공된다. 항-glycPD-1 항체는 또한 각각 서열번호 36, 서열번호 37, 및 서열번호 38; 또는 각각 서열번호 39, 서열번호 40, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 다의 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 글리코실화된 PD-1에 대한 특이적 결합을 위해 상기 기재된 VH 및 VL 도메인 및 이의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 바람직하게는, 이들 항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 즉 STM432의 인간화된 형태이고, 경우에 따라, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다. 당업자는 결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선하기 위하여 1 이상의 아미노산 치환이 인간화된 항체의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd의 절반보다 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 5 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-1 단백질에 대한 항체의 결합에 의해 나타난 Kd 보다 적어도 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 2에 기재된 유세포분석 결합 에세이에서, 항체는 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 대한 결합을 위한 MFI에 비해 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 또는 50 배 큰, WT PD-1을 발현하는 세포에 대한 MFI로서 표현된 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능하다. 실시양태에서, 항체는 형광 표지 또는 마커, 예컨대 FITC로 직접 표지된다. 글리코실화된 PD-1에 대한 STM432 MAb, 또는 이의 결합 도메인 또는 인간화 또는 키메라 형태의 결합 친화성은 하한값 및 상한값을 포함하는 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-1의 상호작용을 억제하고, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 PD-1과 PD-1, 특히 종양 세포에 의해 발현된 글리코실화된 PD-1의 상호작용을 억제한다.
실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-1의 상호작용을 억제하고, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 글리코실화된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
또 다른 실시양태는 각각 서열번호 2 또는 22와 적어도 90-98 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-glycPD-1 VH 도메인을 코딩하고/하거나 서열번호 4 또는 24와 적어도 90-98 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-glycPD-1 항체 VL 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 2 또는 22, 또는 서열번호 4 또는 24와 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 그 이상 동일하다.
하기 표 3은 STM418 및 STM432의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
표 3. STM418 및 STM432의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
하기 표 4 및 5에서는 Chothia, AbM, Kabat, 및 Contact CDR에 따른 STM418 및 STM432 항체의 CDR 서열이 제공된다. 따라서, 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 우선적으로 결합하는, 인간 프레임워크 영역에 이식된 하기 표 4 및 5의 CDR을 포함하는 STM418 및 STM432의 인간화된 형태가 제공된다.
표 4. STM418의 CDR 서열
표 5. STM432의 CDR 서열
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-glycPD-1 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE일 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 또한 키메라 항체, 친화성 성숙된 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 항-glycPD-1 항체는 또한 낙타화된 항체, 세포내항체, 항이디오타입(항-Id) 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 비글리코실화된 PD-1에 비하여 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 항원 결합 단편이다. 상기 항원 결합 단편은 Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, F(ab')3, 단일쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 또는 단일 도메인 항체일 수 있다. scFv는 1가 scFv, 또는 2가 scFv일 수 있다.
항원 또는 에피토프가 천연 공급원으로부터 단리되든 천연 화합물의 합성 유도체 또는 변이체이든, 글리코실화된 PD-1, 1 이상의 그의 각각의 에피토프, 또는 상술한 것 중 임의의 것의 콘쥬게이트에 대해 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체, 항원 결합 단편, 및 결합 도메인 및 CDR(상술한 것 중 임의의 것의 조작된 형태를 포함함)이 본원에 기재된 바와 같은 공지된 수단에 의해 생성될 수 있다.
항체는 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 공급원으로부터 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 양, 마우스(예를 들어, 마우스 및 래트), 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말, 또는 닭이다. 또한, 더 새로운 기술은 인간 조합 항체 라이브러리로부터의 인간 항체 개발 및 인간 항체에 대한 스크리닝(screening)을 허용한다. 예를 들어, 박테리오파지 항체 발현 기술은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,946,546호에 기재된 바와 같이 동물 면역화 부재시 특이적 항체가 생성되도록 허용한다. 이들 기법은 Marks et al., Bio/ Technol., 10:779-783(1992); Stemmer, Nature, 370:389-391(1994); Gram et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 91:3809-3813(1994); 및 Schier et al., Gene, 169(2):147-155(1996)에 또한 기재되어 있으며; 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
다양한 동물 종에서 다클론성 항체를 생성하는 방법뿐 아니라, 인간화, 키메라, 및 완전 인간을 포함한 다양한 유형의 단클론성 항체를 생성하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 다음 미국 특허들은 상기 방법을 가능하게 하는 설명을 제공하며, 이들은 본원에 참고로 포함된다: 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,196,265호; 제4,275,149호; 제4,277,437호; 제4,366,241호; 제4,469,797호; 제4,472,509호; 제4,606,855호; 제4,703,003호; 제4,742,159호; 제4,767,720호; 제4,816,567호; 제4,867,973호; 제4,938,948호; 제4,946,778호; 제5,021,236호; 제5,164,296호; 제5,196,066호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,420,253호; 제5,565,332호; 제5,571,698호; 제5,627,052호; 제5,656,434호; 제5,770,376호; 제5,789,208호; 제5,821,337호; 제5,844,091호; 제5,858,657호; 제5,861,155호; 제5,871,907호; 제5,969,108호; 제6,054,297호; 제6,165,464호; 제6,365,157호; 제6,406,867호; 제6,709,659호; 제6,709,873호; 제6,753,407호; 제6,814,965호; 제6,849,259호; 제6,861,572호; 제6,875,434호; 제6,891,024호; 제7,407,659호; 및 제8,178,098호, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 단클론성 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-1은 다클론성 항체일 수 있다. 동물은 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생성하기 위해 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드와 같은 항원으로 접종될 수 있다. 항원은 흔히 다른 분자에 결합되거나 콘쥬게이트되어 면역 반응을 향상시킨다. 콘쥬게이트는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용되는 항원에 결합된 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 비-단백질 성분일 수 있다. 항원 접종에 반응하여 동물에서 생성된 항체는 B 림프구를 생성하는 다양한 개별 항체로부터 제조된 다양한 비-동일적 분자(다클론성 항체)를 갖는다. 동물에서 다클론성 항체 생성을 위한 올바른 조건이 주어지면, 동물의 혈청 중의 대부분의 항체는 동물이 면역화되었던 항원성 화합물 상의 공동의 에피토프를 인식한다.
이 특이성은 친화성 정제에 의해 추가로 향상되어, 관심 항원 또는 에피토프를 인식하는 항체만을 선택할 수 있다. 단클론성 항체(MAb)를 생성하는 방법은 다클론성 항체를 제조하는 것과 동일한 방식으로 개시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마우스 및 래트와 같은 설치류가 단클론성 항체를 생성하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 토끼, 양, 또는 개구리 세포가 단클론성 항체를 생성하는데 사용된다. 래트의 사용은 잘 알려져 있으며, 특정 이점을 제공할 수 있다. 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)가 일상적으로 사용되며, 일반적으로 높은 퍼센트(percentage)의 안정적인 융합을 제공한다.
하이브리도마 기술은 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드로 미리 면역화된 마우스로부터의 단일 B 림프구와 불멸의 골수종 세포(대개 마우스 골수종)의 융합을 포함한다. 이 기술은 무기한의 세대 수 동안 단일 항체-생성 세포를 번식시키기 위한 방법을 제공하여, 동일한 항원 또는 에피토프 특이성을 가진 구조적으로 동일한 항체(단클론성 항체)가 비제한적인 양으로 생성될 수 있다.
항-glycPD-1 항체는 폴리펩티드의 생성, 예를 들어 시험관내 합성, 재조합 DNA 생성 등에 유용한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 인간화된 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 또한 재조합 면역글로불린 발현 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 인간화된 항체를 포함한 면역글로불린 분자의 재조합 생성이 미국 특허 제4,816,397호(Boss et al.), 미국 특허 제6,331,415호 및 제4,816,567호(둘 다 Cabilly et al.), 영국 특허 GB 2,188,638(Winter et al.), 및 영국 특허 GB 2,209,757에 기재되어 있으며; 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 인간화된 면역글로불린을 포함한 면역글로불린의 재조합 발현을 위한 기법은 또한 Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991), 및 Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992)에서 찾아볼 수 있으며; 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 제조합 항체의 생성, 설계 및 발현에 관한 추가 정보는 Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993)에서 찾아볼 수 있다.
외래 항체의 가변 영역은 온전하게 남겨두고, 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 도메인을 인간 기원의 유사 도메인으로 치환하는 방법이 개발되었다. 대안적으로, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉한 마우스 또는 래트에서 완전 인간 단클론성 항체가 생성된다. 설치류 및 인간 아미노산 서열 둘 다를 갖는 항체 가변 도메인을 재조합적으로 구축함으로써 단클론성 항체의 가변 도메인을 보다 인간 형태로 전환하는 방법이 또한 개발되었다. 인간화된 단클론성 항체에서, 초가변 CDR만이 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트, 닭, 라마) 단클론성 항체로부터 유래되며, 프레임워크 영역은 인간 아미노산 서열로부터 유래된다. 설치류의 특징인 항체에서의 아미노산 서열을 인간 항체의 대응 위치에서 발견된 아미노산 서열로 치환하는 것은 치료적 사용 동안 면역 부작용의 가능성을 감소시킬 것으로 생각된다. 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 또한 유전적 돌연변이 또는 다른 변화를 겪을 수 있으며, 이는 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 결합 특이성을 변화시킬 수 있거나 변화시키지 않을 수 있다.
원래의 항체의 항원 또는 에피토프 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성하도록, 단클론성 또는 다른 항체 및 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 조작된 항체가 생성될 수 있고, 즉 상기 분자는 결합 도메인을 갖는다. 이러한 기법은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 다른 항체의 프레임워크 영역, 불변 영역, 또는 불변영역과 프레임워크 영역에 대한 유전 물질에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,091,513호 및 제6,881,557호를 참고한다.
특정 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 기재된 파지 디스플레이 방법을 포함하여 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 국제 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741 참고). 인간 항체는 기능적 내생 면역글로불린을 발현할 수 없으나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 비-기능적으로 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합(homozygous) 결실은 내생 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 증식 및 배반포 내로 미량주사되어 키메라 항체를 생성할 수 있다. 이어서, 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합 자손을 생성한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드 전부 또는 일부를 이용한 통상의 방법을 사용하여 면역화된다. 항원 지향성인 단클론성 항체는 통상의 하이브리도마 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,916,771호 참고)을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 보유된 인간 면역글로불린 도입유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 종류 변환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기법을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체가 생성될 수 있다. 인간 항체를 생성하기 위한 이 기술의 개요에 대해서는, Lonberg 및 Huszar(1995, Int . Rev. Immunol. 13:65-93, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다)를 참고한다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 상기 기술 및 상기 항체를 생성하기 위한 프로토콜의 상세한 논의에 대해서는, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 국제 공개 WO 98/24893, WO 96/34096, 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호, 및 제5,939,598호를 참고한다. 또한, Abgenix, Inc.(Freemont, Calif.) 및 Medarex(Princeton, N.J.)와 같은 회사가 상기 기재된 것과 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원 지향성을 갖는 인간 항체를 제공할 수 있다.
일 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어 이종 비-인간, 인간 또는 인간화된 서열(예를 들어, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)로 그라프팅된 비-인간 도너(donor)로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 일 실시양태에서, 비-인간 도너는 래트이다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 합성이고, 예를 들어 돌연변이유발(예를 들어, 인간 파지 라이브러리 등의 파지 디스플레이 스크리닝)에 의해 얻어진다. 일 실시양태에서, 본원에서 제공된 키메라 항체는 마우스 V 영역 및 인간 C 영역을 갖는다. 일 실시양태에서, 마우스 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄에 융합된다. 일 실시양태에서, 마우스 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
키메라 항체를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol . Methods 125:191-202(1989); 및 미국 특허 제6,311,415호, 제5,807,715호, 제4,816,567호, 및 제4,816,397호를 참고하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 비-인간 종으로부터의 1 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 포함한 키메라 항체는, 예를 들어 CDR-그라프팅(EP 239,400; 국제 공개 WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 비니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); 및 Roguska et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:969 (1994)) 및 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하여 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있으며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
재조합 키메라 항-glycPD-1 항체의 생성을 위한 예시적 과정은 다음을 포함할 수 있다: a) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 마우스 항-glycPD-1 단클론성 항체의 CDR 및 가변 영역이 인간 면역글로불린으로부터 유래된 Fc 영역에 융합된 항체 중쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 키메라 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생성하는 단계; b) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 마우스 항-glycPD-1 단클론성 항체의 항체 경쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 키메라 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생성하는 단계; c) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 발현 벡터를 숙주 세포로 형질이입하여, 키메라 항체의 발현을 위한 형질이입된 숙주 세포를 생성하는 단계; 및 d) 형질이입된 세포를 통상의 세포 배양 기법에 의해 배양하여, 키메라 항체를 생성하는 단계.
재조합 인간화된 항-glycPD-1 항체의 생성을 위한 예시적 과정은 다음을 포함할 수 있다: a) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 도너 항체 결합 특이성을 보유하기 위해 필요한 가변 영역 프레임워크의 CDR 및 최소 부분이 비-인간 면역글로불린, 예컨대 마우스 항-glycPD-1 단클론성 항체로부터 유래되고, 항체의 나머지가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 항체 중쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 인간화된 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생성하는 단계; b) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 도너 항체 결합 특이성을 보유하기 위해 필요한 가변 영역 프레임워크의 CDR 및 최소 부분이 비-인간 면역글로불린, 예컨대 마우스 항-glycPD-1 단클론성 항체로부터 유래되고, 항체의 나머지가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 항체 경쇄를 코딩하고 발현하는 발현 벡터를 구축하여, 인간화된 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생성하는 단계; c) 통상의 분자 생물학 방법에 의해, 발현 벡터를 숙주 세포로 형질이입하여, 인간화된 항체의 발현을 위한 형질이입된 숙주 세포를 생성하는 단계; 및 d) 형질이입된 세포를 통상의 세포 배양 기법에 의해 배양하여, 인간화된 항체를 생성하는 단계.
예시적 방법에 관하여, 숙주 세포는 상이한 선택 가능한 마커를 함유할 수 있지만, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열을 제외하고는 바람직하게는 동일한 상기 발현 벡터로 공동-형질이입될 수 있다. 이 절차는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 위해 제공된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄용 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 재조합 항체를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli)과 같은 세균 세포, 또는 더욱 바람직하게는 진핵 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary)(CHO) 세포 또는 HEK-293 세포)일 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 의존하며, 선택된 숙주 세포에서 소망하는 발현 및 조절 특징을 갖도록 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주는, 비제한적으로 CHO-K1, NSO, 및 PER.C6(Crucell, Leiden, Netherlands)을 포함한다. 또한, 코돈 사용은 종 특이적 코돈 사용 성향을 설명하는 숙주 세포가 선택되어 단백질 발현을 향상시킬 때 최적화될 수 있다. 예를 들어, CHO 세포 발현의 경우, 항체를 코딩하는 DNA는 중국 햄스터(Cricetulus griseus)(중국 햄스터 난소 세포가 유래되는)에 의해 우선적으로 사용되는 코돈을 포함할 수 있다. 코돈 최적화의 방법은 소망하는 숙주 세포에 의한 발현 개선을 가능하게 하기 위해 이용될 수 있다(예를 들어, Wohlgemuth et al., Philos . Trans. R. Soc . Lond . B Biol . Sci. 366(1580):2979-2986 (2011); Jestin et al., J. Mol . Evol. 69(5):452-457 (2009); Bollenbach et al., Genome Res. 17(4):401-404(2007); Kurland et al., Prog . Nucleic Acid Res. Mol . Biol. 31:191-219 (1984); Grosjean et al., Gene 18(3): 199-209(1982) 참고).
일 실시양태에서, 항체는 낙타과 항체로부터, 바람직하게는 VHH 도메인 서열 또는 NanobodiesTM으로 알려진, 경쇄가 전혀 없는 중쇄 낙타과 항체로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. NanobodiesTM(Nb)는 천연적으로 발생하는 단일 사슬 항체의 최소 기능적 단편 또는 단일 가변 도메인(VHH)이고, 당업자에게 알려져 있다. 그것들은 낙타과에서만 나타나는 중쇄 항체로부터 유래된다(Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Desmyter et al., Nat. Struct . Biol., 803-811 (1996)). "낙타과"의 패밀리에서는, 경쇄 폴리펩티드가 전혀 없는 면역글로불린이 발견된다. "낙타과"는 구세계(old world) 낙타과(쌍봉낙타(Camelus bactrianus) 및 단봉낙타(Camelus dromedarius)) 및 신세계(new world) 낙타과(예를 들어, 라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama), 라마 구아니코 에(Lama guanicoe) 및 라마 비쿠나(Lama vicugna))를 포함한다. 단일 가변 도메인 중쇄 항체는 본원에서 NanobodyTM 또는 VHH 항체로 지정된다. Nb의 작은 크기 및 고유한 생물물리학적 특성은 드물거나 숨겨진 에피토프의 인식 및 단백질 표적의 공동 또는 활성 부위 내로의 결합에 대해 통상의 항체 단편을 초과한다. 또한, Nb는 리포터(reporter) 분자에 부착되거나, 인간화된, 다중-특이적 및 다가 항체로 설계될 수 있다. Nb는 안정적이고, 위장관계에서 생존하며 용이하게 제조될 수 있다.
상이한 특이성의 2 개의 항원 결합 부위를 단일 구축물 내로 통합하는 경우, 이중 특이적 항체는 정교한 특이성을 갖는 2 개의 별개의 항원을 통합하는 능력을 가져 치료제로서 큰 가능성을 갖는다. 이중 특이적 항체는 원래 각각 상이한 면역글로불린을 생성할 수 있는 2 개의 하이브리도마를 융합함으로써 제조될 수 있다. 이중 특이적 항체는 또한 2 개의 scFv 항체 단편을 연결하는 한편 완전 면역글로불린 내에 존재하는 Fc 부위를 생략함으로써 생성될 수 있다. 상기 구축물에서 각각의 scFv 단위는 합성 폴리펩티드 링커(linker)를 통해 서로 연결된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 항체 각각으로부터의 하나의 가변 도메인으로 이루어질 수 있으며, 후자는 보통 유전적으로 조작되어 최소로 면역원성인 한편, 단백질 가수분해에 대해 최대로 내성을 유지한다. 각각의 scFv 단위는 2 개의 scFv 단위를 가교하는 짧은(보통 10 아미노산 미만) 폴리펩티드 스페이서의 결합을 포함한 다수의 기법에 의해 연결되어, 이중 특이적 단일 사슬 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 생성된 이중 특이적 단일 사슬 항체는 단일 폴리펩티드 사슬 상에 상이한 특이성의 2개의 VH/VL 쌍을 함유하는 종이며, 각각의 scFv 단위 내의 VH 및 VL 도메인은 이들 2 개 도메인 사이의 분자내 연합을 허용하기에 충분한 폴리펩티드 링커 길이만큼 분리되어 있고, 이에 따라 형성된 scFv 단위는, 예를 들어 하나의 scFv 단위의 VH 도메인과 나머지 scFv 단위의 VL 사이의 원치 않는 연합을 예방하도록 충분히 짧게 유지되는 폴리펩티드 스페이서를 통해 서로 연속하여 결속된다.
항원 결합 단편의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 "dAb" 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 단일 사슬 Fv 분자("scFv"), 이때 VH 도메인 및 VL 도메인은 2 개의 도메인이 연합하여 결합 도메인을 형성하도록 허용하는 펩티드 링커에 의해 연결됨; (viii) 이중-특이적 단일 사슬 Fv 2량체(미국 특허 제5,091,513호); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 디아바디, 다가, 또는 다중 특이적 단편(미국 특허 출원 공개 제20050214860호). Fv, scFv, 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지의 결합에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 갖는 미니바디가 또한 제조될 수 있다(Hu et al., Cancer Res., 56:3055-3061 (1996)).
항체-유사 결합 펩티도미메틱(peptidomimetic)이 또한 실시양태에서 고려된다. Liu et al., Cell Mol . Biol., 49:209-216(2003)은 단순화된(pared-down) 항체로 작용하고 긴 혈청 반감기뿐 아니라 덜 번거로운 합성 방법의 특정 이점을 갖는 펩티드인 "항체 유사 결합 펩티도미메틱"(ABiP)을 기재하고 있다.
글리코실화된 PD-1 폴리펩티드
또 추가적인 실시양태에서, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상)의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공되고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되며, 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제형화된다.
일부 실시양태에서, 본원은 또한 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 폴리펩티드를 제공하며, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개는 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화된 위치 N49에 대응하는 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화된 위치 N58에 대응하는 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화된 위치 N74에 대응하는 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화된 위치 N116에 대응하는 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산을 갖는다.
예를 들어, 상기 폴리펩티드는 N49가 글리코실화된 인간 PD-1의 아미노산 44-50의 단편일 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 N74가 글리코실화된 인간 PD-1의 아미노산 70-80의 단편일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 N58 및 N74가 글리코실화된 인간 PD-1의 아미노산 50-80의 단편일 수 있다. 당업자는 본원에서 고려되는 폴리펩티드가 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함한 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산을 갖고, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되는 임의의 모든 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PD-1의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PD-1의 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 또는 270, 280 개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에서 제공된 적어도 2 종의 폴리펩티드를 갖는 조성물을 제공한다. 상기 적어도 2 종의 폴리펩티드는 별개의 분자이거나 하나의 분자로서 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 3 종의 폴리펩티드, 적어도 4 종의 폴리펩티드, 또는 적어도 5 종의 폴리펩티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 2 종의 폴리펩티드, 3 종의 폴리펩티드, 4 종의 폴리펩티드, 또는 5 종의 폴리펩티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 비천연 아미노산은 α-아미노기에서 메틸화되어, 메틸화된 백본을 갖는 펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 상기 비천연 아미노산은 R-아미노산이다. 일부 실시양태에서, 상기 비천연 아미노산은 염료(예를 들어, 형광 염료) 또는 친화성 태그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 화학적 변형을 포함한다. 화학적 변형은, 예를 들어 비오틴, 형광 염료를 이용한 화학적 변형을 포함한다. 당업자는 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하고, 폴리펩티드를 화학적으로 변형하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있음을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 실시양태의 폴리펩티드는 면역원성 폴리펩티드(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, KLH)에 융합되거나 콘쥬게이트된다. 특정 양태에서, 폴리펩티드는 C- 또는 N- 말단에 Cys 잔기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리펩티드는 Cys 잔기에서 디설파이드 결합에 의해 면역원성 폴리펩티드에 콘쥬게이트된다.
또 추가적인 실시양태에서, 본원은 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 면역원성 조성물을 제공하고, 이때 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되며, 폴리펩티드는 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제형화된다. 일부 양태에서, 면역원성 조성물은 백반 또는 프로인트 보강제와 같은 보강제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 동물에게 투여하는 단계 및 상기 동물로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이때 폴리펩티드는 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 갖는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 가지며, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 및 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개는 글리코실화된다. 상기 동물은 마우스, 래트, 토끼 또는 인간일 수 있다. 특정 양태에서, 방법은 항체의 CDR을 확인하는 단계 및 CDR을 둘러싼 서열을 인간화시켜 인간화된 항체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 또 추가적인 양태에서, 방법은 인간화된 항체를 재조합적으로 발현하는 단계를 포함한다. 따라서, 추가 실시양태에서, 상술한 방법에 의해 생성된 단리된 항체가 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원은 비글리코실화된 PD-1에 비해 실시양태의 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 인간 PD-1의 적어도 7 개의 연속하는 아미노산의 단편을 포함하고, 인간 PD-1의 위치 N49, N58, N74 또는 N116에 대응하는 상기 아미노산 중 적어도 1 개가 글리코실화되는 폴리펩티드)에 선택적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
본원에서 제공된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 화학적 합성 또는 재조합 생성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 발현 및 정제하는 예시적 방법은, 예를 들어 Scopes R.K., Protein Purification - Principles and Practice, Springer Advanced Texts in Chemistry, 3rd Edition (1994); Simpson R.J. et al., Basic Methods in Protein Purification and Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1st Edition (2008); Green M.R. and Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4st Edition (2012); Jensen K.J. et al., Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2nd Edition (2013)에서 찾아볼 수 있다. 폴리펩티드의 화학적 합성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다(Kelley and Winkler, 1990, In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow J. K, ed., Plenum Press, N.Y., Vol. 12, pp 1-19; Stewart et al., 1984, J. M. Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill; Marglin and Merrifield, Ann. Rev. Biochem, 39:841-866, at 862 (1970). Merrifield, R.B., 1963, J. Am. Chern . Soc. 85:2149-2154; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., 1997, CRC Press, Boca Raton Fla.; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, England 참고; 또한, 미국 특허 제4,105,603호; 제3,972,859호; 제3,842,067호; 및 제3,862,925호 참고).
변형 및 유도체
글리코실화된 PD-1에 대한 항체는 동물 종, 단클론성 세포주 또는 항체의 다른 공급원에 관계 없이 글리코실화된 PD-1의 효과를 중화시키거나 대응하는 능력을 가질 수 있다. 특정 동물 종은 치료 항체를 생성하기에 덜 바람직할 수 있으며, 이는 그것들이 항체의 Fc 부위를 통한 보체계의 활성화로 인해 알레르기 반응을 더욱 야기할 수 있기 때문이다. 그러나, 모든 항체는 Fc(보체 결합) 단편으로, 및 결합 도메인 또는 CDR을 갖는 항체 단편으로 효소적으로 분해될 수 있다. Fc 부위의 제거는 항체 단편이 소망하지 않는 면역학적 반응을 유도할 가능성을 감소시킬 수 있으므로, Fc가 없는 항체는 예방 또는 치료법을 위해 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 항체는 또한 키메라, 부분적으로 또는 완전히 인간화 되도록 구축되어, 다른 종에서 생성되었거나, 다른 종으로부터의 서열을 갖는 항체를 동물에게 투여하는 단계로부터 야기되는 유해한 면역학적 결과를 감소시키거나 제거할 수 있다.
항-glycPD-1 항체의 결합 특성은 소망하는 특성을 나타내는 변이체에 대해 스크리닝함으로써 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 상기 개선은 당업계에 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은, 그것들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 표시된다. 특별한 실시양태에서, 상기 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 마우스)로부터 발현된 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 및 Fv 또는 디설파이드-결합 안정화된 Fv를 표시하기 위해 이용될 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 단편을 발현하는 파지는 항원을 이용해, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택되거나 확인될 수 있다. 이들 방법에서 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함한 필라멘트상 파지(filamentous phage)이다. 항원 결합 단편은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 단백질로서 발현된다. 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman et al., J Immunol Methods, 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur . J. Immunol., 24:952-958(1994); Persic et al., Gene, 187:9-18 (1997); Burton et al., Adv . Immunol. 57:191-280 (1994); PCT 공개 WO 92/001047; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 개시된 것들을 포함하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
상기 참고문헌에 기재된 바에 있어서, 파지 선택 이후, 파지로부터의 항체 코딩 영역은 단리되고, 인간화된 항체를 포함한 모든 항체, 또는 임의의 다른 소망하는 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 하기에 상세히 기재된 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 세균 포함한 임의의 소망하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 기법은 또한 PCT 공개 WO 92/22324; Mullinax, R. L. et al., BioTechniques, 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., Am. J. Reprod . Immunol. 34:26-34 (1995); 및 Better, M. et al. Science 240:1041-1043(1988)에 개시된 것들과 같이 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이용될 수 있으며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 단일-사슬 Fv 및 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 기법의 예는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston, J. S. et al., Methods in Enzymology 203:46-88(1991); Shu, L. et al., Proc . Natl. Acad . Sci . (USA) 90:7995-7999; 및 Skerra. A. et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기재된 것들을 포함하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 항-glycPD-1 항체의 친화성을 증가시키기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 이 기법은 본원에 기재된 조합적 방법에서 사용될 수 있는 높은 친화성 항체를 얻는 단계에서 사용될 수 있다. 친화성 성숙으로 지칭되는 이 기술은 돌연변이 유발 또는 CDR 워킹(walking) 및 상기 수용체 또는 리간드(또는 이의 세포외 도메인) 또는 이의 항원성 단편을 사용하는 재-선택(re-selection)을 이용하여, 초기 또는 부모 항체와 비교하였을 때 높은 친화성으로 항원에 결합하는 항체를 확인한다(예를 들어, Glaser, S. M. et al., J. Immunol. 149:3903-3913(1992) 참고). 단일 뉴클레오티드 보다는 전체 코돈을 돌연변이화하는 것이 아미노산 돌연변이체의 반-무작위화된 레퍼토리를 야기한다. 각각 단일 CDR에서의 아미노산 변경이 상이하고, 각각의 CDR 잔기에 대하여 각각 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체를 함유한 변이체 클론의 풀(pool)로 구성된 라이브러리가 구축될 수 있다. 항원에 대해 결합 친화성이 증가된 돌연변이체는 고정된 돌연변이체와 표지된 항원을 접촉시킴으로써 스크리닝 될 수 있다. 항원에 대해 결합활성이 증가된 돌연변이 항체를 확인하기 위해 당업계에 알려진 임의의 스크리닝 방법(예를 들어, ELISA)이 사용될 수 있다(예를 들어, Wu, H. et al., Proc . Natl . Acad. Sci. (USA) 95(11):6037-6042(1998); Yelton, D. E. et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995) 참고. 경쇄를 무작위화시키는 CDR 워킹이 또한 사용될 수 있다(Schier et al., J. Mol . Biol. 263:551-567(1996) 참고).
CDR 및/또는 가변 영역 개선을 확인하기 위해 무작위 돌연변이유발이 파지 디스플레이의 방법과 협력하여 사용될 수 있다. 특이적 돌연변이유발(예를 들어, 친화성 성숙 또는 "CDR-워킹")에 의해 CDR 친화성을 증가(또는 감소)시키기 위해 파지 디스플레이 기술이 대안적으로 사용될 수 있다. 이 기법은 표적 항원 또는 이의 항원성 단편을 사용하여, 초기 또는 부모 항체와 비교하였을 때 높은(또는 낮은) 친화성으로 항원에 결합하는 CDR을 갖는 항체를 확인한다(예를 들어, Glaser, S. M. et al., J. Immunol. 149:3903-3913(1992) 참고).
상기 친화성 성숙을 성취하기 위한 방법은, 예를 들어 Krause, J. C. et al., MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10(2011); Kuan, C. T. et al., Int . J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B. J. et al., J. Mol . Biol. 401(1):84-96(2010); Montgomery, D. L. et al., MAbs 1(5):462-474(2009); Gustchina, E. et al., Virology 393(1):112-119 (2009); Finlay, W. J. et al., J. Mol . Biol. 388(3):541-558 (2009); Bostrom, J. et al., Methods Mol. Biol. 525:353-376 (2009); Steidl, S. et al., Mol . Immunol. 46(1):135-144 (2008); 및 Barderas, R. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . (USA) 105(26):9029-9034 (2008)에 기재되어 있으며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원은 또한 "부모"(또는 야생형) 분자에 비해 1, 2, 3, 4, 5 이상의 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 변형을 갖는 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 유도체를 제공한다. 상기 아미노산 치환 또는 첨가는 천연 산출(즉, DNA-코딩된) 또는 비-천연 산출 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 상기 아미노산은 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결된, 알려진 보호기/차단기, 단백분해 절단(proteolytic cleavage)에 의해 글리코실화(예를 들어, 변경된 만노오스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토오스, 푸코오스, 글루코오스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등의 함량을 가짐), 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 유도체화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 다음 중 하나 이상을 조절한다: 항체의 가용화, 모세포 수송 및 항체 분비의 용이화, 항체 조립의 촉진, 입체구조 완전성(conformational integrity), 및 항체-매개된 이펙터 기능. 일부 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형이 결여된 항체에 비해 항체 매개된 이펙터 기능을 향상시킨다. 변경된 항체 매개된 이펙터 기능을 야기하는 탄수화물 변형은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Shields, R. L. et al., J. Biol . Chem. 277(30): 26733-26740 (2002); Davies J. et al. Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294(2001) 참고; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다). 탄수화물 함량을 변경하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Wallick, S. C. et al., J. Exp . Med. 168(3): 1099-1109(1988); Tao, M. H. et al., J. Immunol. 143(8): 2595-2601 (1989); Routledge, E. G. et al., Transplantation 60(8):847-53 (1995); Elliott, S. et al., Nature Biotechnol. 21:414-21(2003); Shields, R. L. et al., J. Biol . Chem. 277(30): 26733-26740 (2002)를 참고하고; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
치환형 변이체는 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드 내의 1 이상의 부위에서 1 개 아미노산의 다른 것으로의 치환을 함유할 수 있고, 다른 기능 또는 특성의 손실이 있거나 없이, 항체 또는 폴리펩티드의 1 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있으며, 즉 1 개의 아미노산이 유사한 형태 및 전하 중 하나로 치환된다. 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 알라닌을 세린으로; 아르기닌에서 라이신(lysine)으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다. 대안적으로, 치환은 비-보존적이어서, 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받을 수 있다. 비-보존적 변화는 전형적으로 잔기를 화학적으로 상이한 것으로, 예컨대 극성 또는 하전된 아미노산을 비극성 또는 비하전된 아미노산으로, 및 이와 반대로 치환하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화된 항체는 유도체 항체이다. 상기 인간화된 항체는 1 이상의 비-인간 CDR에서 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 인간화된 항체 유도체는 비-유도체 인간화된 항체와 비교하였을 때 실질적으로 동일한 결합, 우수한 결합, 열악한 결합을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, CDR의 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 치환, 결실 또는 첨가되는 바와 같이 돌연변이되었다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 유도체 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 야생형 인간 PD-1와 비교하여 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 유도체 폴리펩티드는 비-유도체 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 동일한 결합, 우수한 결합, 또는 열악한 결합을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 PD-1의 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 아미노산 잔기는 치환, 결실 또는 첨가되는 바와 같이 돌연변이되었다.
본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드는, 비제한적으로 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 튜니카마이신의 물질대사 합성 등을 포함하여, 당업자에게 알려진 기법을 사용한 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일 실시양태에서, 유도체 폴리펩티드 또는 유도체 항체는 부모 폴리펩티드 또는 항체와 유사하거나 동일한 기능을 보유한다. 다른 실시양태에서, 유도체 폴리펩티드 또는 유도체 항체는 부모 폴리펩티드 또는 부모 항체에 비해 변경된 활성을 나타낸다. 예를 들어, 유도체 항체(또는 이의 단편)는 자신의 에피토프에 더욱 강하게 결합될 수 있거나 부모 항체에 비해 단백질 가수분해에 대해 더욱 내성이 있을 수 있다.
유도체화된 항체에서의 치환, 첨가 또는 결실은 항체의 Fc 영역에 있을 수 있으므로, 1 이상의 FcγR에 대한 항체의 결합 친화성을 변형시키기 위해 제공될 수 있다. 1 이상의 FcγR에 대한 변형된 결합을 갖도록 항체를 변형하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 PCT 공개 WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089, 및 미국 특허 제5,843,597호 및 제5,642,821호를 참고하고; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 다른 분자는 활성화 FcγR, 예를 들어 FcγRIIIA에 대하여 친화성이 변경될 수 있다. 바람직하게는 상기 변형은 또한 변경된 Fc-매개된 이펙터 기능을 갖는다. Fc-매개된 이펙터 기능에 영향을 미치는 변형은 당업계에 잘 알려져 있다(미국 특허 제6,194,551호, 및 WO 00/42072 참고). 일부 실시양태에서, Fc 영역의 변형은 변경된 항체-매개 이펙터 기능, 다른 Fc 수용체(예를 들어, Fc 활성화 수용체)에 대한 결합 변경, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(ADCC) 활성 변경, C1q 결합 활성 변경, 변경된 보체-의존성 세포독성 활성(complement-dependent cytotoxicity activity)(CDC), 식세포 활성, 또는 이의 임의의 조합을 갖는 항체를 야기한다.
유도체 항체 또는 폴리펩티드는 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에서 부모 분자 또는 항체의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)가 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 변경은 15 일 초과, 바람직하게는 20 일 초과, 25 일 초과, 30 일 초과, 35 일 초과, 40 일 초과, 45 일 초과, 2 개월 초과, 3 개월 초과, 4 개월 초과, 또는 5 개월 초과의 반감기를 야기한다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 인간화된 항체 또는 폴리펩티드의 반감기 증가는 포유동물에서 상기 항체 또는 폴리펩티드의 더 높은 혈청 역가를 야기하여, 상기 항체 또는 폴리펩티드의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나 상기 투여될 항체 또는 폴리펩티드의 농도를 감소시킨다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 폴리펩티드는 Fc 도메인 및 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)함으로써 생성될 수 있다. 본원에 기재된 인간화된 항체는 생물학적 반감기를 증가시키도록 조작될 수 있다(미국 특허 제6,277,375호 참고). 예를 들어, 본원에 기재된 인간화된 항체는 Fc-힌지 도메인에서 생체내 또는 혈청 반감기가 증가하도록 조작될 수 있다.
생체내 반감기가 증가된 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드는 상기 항체 또는 폴리펩티드에 고분자량 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)(PEG)과 같은 중합체 분자를 부착함으로써 생성될 수 있다. PEG는 다기능적 링커를 이용하거나 이용하지 않고 상기 분자 또는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 콘쥬게이션을 통하거나 라이신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해 항체 또는 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 최소 손실을 야기하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 수 있다. 콘쥬게이션의 정도는 SDS-PAGE 및 질량분석법에 의해 면밀히 모니터링되어, 항체에 대한 PEG 분자의 적합한 콘쥬게이션을 보장할 수 있다. 미반응된 PEG는, 예를 들어 크기 배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드는 또한 실질적으로 면역원성 반응 없이 포유동물 순환계 내로 주사될 수 있는 조성물을 제공하기 위해, Davis et al.(미국 특허 제4,179,337호)에 기재된 방법 및 커플링제에 의해 변형될 수 있다. Fc 부위의 제거는 항체 단편이 소망하지 않는 면역학적 반응을 유도할 가능성을 감소시킬 수 있으므로, Fc가 없는 항체는 예방 또는 치료법을 위해 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 항체는 또한 키메라, 부분적으로 또는 완전히 인간이 되도록 구축되어, 다른 종에서 생성되었거나, 다른 종으로부터의 서열을 갖는 항체를 동물에게 투여하는 단계로부터 야기되는 유해한 면역학적 결과를 감소시키거나 제거할 수 있다.
융합 및 콘쥬게이트
본원에서 제공된 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 또한 다른 단백질을 갖거나 다른 모이어티(moiety)에 화학적으로 콘쥬게이트된 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 Fc 부위를 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 제공하며, 이때 Fc 부위는 아이소타입(isotype) 또는 서브클래스에 의해 달라질 수 있으며, 키메라 또는 하이브리드일 수 있고/있거나, 예를 들어 이펙터 기능, 반감기의 조절, 조직 접근성을 개선하며, 안정성과 같은 생물물리학적 특징을 증가시키고, 생산 효율성을 개선(저비용적으로)하기 위해 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질 및 이를 제조하기 위한 방법의 구축에 유용한 많은 변형이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Mueller, J. P. et al., Mol . Immun. 34(6):441-452 (1997), Swann, P. G., Curr . Opin . Immun. 20:493-499 (2008), 및 Presta, L. G., Curr . Opin. Immun. 20:460-470 (2008)을 참고한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하이브리드, 예를 들어 IgG2/IgG4 Fc 불변 영역을 갖는 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은, 비제한적으로 Fc 감마 수용체 및 보체에 대한 결합을 예방하기 위해 변형된 IgG4, 1 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 개선하기 위해 변형된 IgG1, 이펙터 기능을 최분해하기 위해 변형(아미노산 변화)된 IgG1, 변경된 글리칸을 갖는/글리칸이 없는(전형적으로 발현 숙주를 변화시킴으로써) IgG1, 및 FcRn에 대한 pH-의존성 결합을 갖는 IgG1을 포함한다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 힌지 영역 미만을 포함할 수 있다.
다른 실시양태는 반감기를 증가시키는 FcR에 대한 결합 감소를 갖는 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체를 포함한다. 대표적인 IG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이체는 Angal et al., Molec . Immunol. 30(1):105-108 (1993); Mueller et al., Mol. Immun. 34(6):441-452 (1997); 및 미국 특허 제6,982,323호에 기재되어 있으며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 결실되며, 예를 들어 Angal et al.은 세린 241이 프롤린으로 치환된 IgG1 및 IgG2를 기재하고 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 개의 아미노산을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 적어도 1 개의 모이어티를 갖는 복합체에 연결되거나, 이에 공유결합으로 결합되거나, 이를 형성하는 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드를 제공한다. 상기 모이어티는, 비제한적으로, 진단제 또는 치료제로서 분자의 효능을 증가시키는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 이미징제, 독소, 치료 효소, 항생제, 방사성-표지된 뉴클레오티드 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 모이어티는 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 독소(예컨대, 아브린, 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소(즉, PE-40), 디프테리아 독소, 리신, 젤로닌, 또는 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질), 단백질(예컨대, 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자, 혈소판 유래 증식 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 또는 세포사멸제(예를 들어, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β)), 생체 반응 조절인자(예컨대, 예를 들어 림포카인(예를 들어, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6")), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor)("GM-CSF"), 과립구 집락 자극 인자("G-CSF"), 또는 대식세포 집락 자극 인자("M-CSF")), 또는 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬("GH"))), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 예컨대 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론, 미스라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) F(MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE; 예를 들어, 베도틴) 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체), 대사길항제(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, BiCNU®(카무스틴; BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드(cyclothosphamide), 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 또는 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)일 수 있다.
상기 치료 모이어티를 항체에 콘쥬게이트시키는 기법은 잘 알려져 있다; 예를 들어 Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; Thorpe et al., Immunol . Rev. 62:119-158 (1982); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169 (2008); Alley et al., Curr . Opin . Chem . Biol. 14(4):529-537 (2010); Carter et al., Amer . Assoc . Cancer Res. Educ . Book. 2005(1):147-154 (2005); Carter et al., Cancer J. 14(3):154-169(2008); Chari, Acc . Chem Res. 41(1):98-107 (2008); Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21(7):778-784(2003); Ducry et al., Bioconjug Chem. 21(1):5-13(2010); Senter, Curr . Opin . Chem . Biol. 13(3):235-244 (2009); 및 Teicher, Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004 (2009). auristatin E) (MMAE), 예를 들어 베도틴; 또는 이의 조합 참고.
바람직한 실시양태에서, 항체는 에티오피아 관목 메이테누스 오바투스(Maytenus ovatus)의 수피로부터 첫번째로 단리되는 벤조안사마크롤라이드(benzoansamacrolide)인 메이탄신(maytansine)에 콘쥬게이트된다. 이 세포독성제 및 이의 유도체(예를 들어, 메이탄시노이드)는 빈카 알칼로이드 결합 부위에 인접한 튜불린에 결합한다. 그것들은 미세소관의 단부에 위치한 튜불린에 대해 강한 친화성을 갖고 미세소관에 걸쳐 분포된 부위에 대해 낮은 친화성을 갖는 것으로 여겨진다. 미세소관 동역학의 억제는 세포가 세포 주기의 G2/M 단계에서 정지되도록 야기하여, 궁극적으로 아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포 사멸을 야기한다. (Oroudjev et al., Mol . Cancer Ther., 10L2700-2713 (2010)). 2 종의 메이탄신 유도체(티올-함유 메이탄시노이드)는 비가역적 및 가역적 링커와 조합되어 광범위하게 사용되었던 DM1 및 DM4(ImmunoGen, Inc., Waltham, MA)를 포함한다. 특히, 티오에터 링커를 이용해 항체에 부착된 DM1을 "엠탄신(emtansine)"으로 지칭하고, SPP 링커를 이용해 항체에 부착된 DM1을 "메르탄신(mertansine)"으로 지칭한다. SPDB 링커를 이용해 부착된 DM4를 "라브탄신(ravtansine)"으로 지칭하고, sSPDB 링커를 이용해 부착된 DM4를 "소라브탄신(soravtansine)"으로 지칭한다. (ImmunoGen, Inc., Waltham, MA). 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체-ADC는 튜불린-작용 메이탄시노이드 페이로드(payload) DM1을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체-ADC는 튜불린-작용 메이탄시노이드 페이로드 DM4를 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체-ADC는 DNA-작용 페이로드, 예를 들어 DGN462(ImmunoGen, Inc., Waltham, MA)를 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체-ADC의 항-glycPD-1 항체 성분은 STM418, 또는 이의 결합 부위의 키메라 또는 인간화된 형태이다. 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체-ADC의 항-glycPD-1 항체 성분은 STM432, 또는 이의 결합 부위의 키메라 또는 인간화된 형태이다.
특별한 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체에 콘쥬게이트된 세포독성제는 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E(또는 데스메틸-아우리스타틴 E)), 항유사분열 활성이 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분역을 억제하는 것을 포함하는 높은 독성의 항신생물제이다. 국제 일반명 베도틴은 MMAE-항체 콘쥬게이트에서 MMAE와 항체에 대한 이의 연결 구조를 지칭한다. 더욱 특별한 실시양태에서, ADC는 STM418(키메라 또는 인간화된 형태)-MMAE 또는 STM432(키메라 또는 인간화된 형태)-MMAE이다.
다수의 화학적 링커가 알려져 있으며, 세포독성 또는 DNA-작용 약물 페이로드를 항체에 콘쥬게이트시켜 ADC를 생성하기 위해 사용된다. 항-glycPD-1 항체를 포함하는 ADC, 특히 본원에 기재된 그것들의 표적에 결합한 이후 내부화하는 것을 생성하기 위해, 단독으로 또는 조합적으로 사용하기 위해 수용되는 특정 링커는 SMCC(4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산카복시산 N-히드록시석신이미드 에스터); SPDB(N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)부티레이트); SPP(N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트); 설포-SPDB 또는 sSPDB(N-석신이미딜-4-(2-피리딜디티오)-2-설포부타노에이트); 티오에터 링커 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복시레이트(MCC); 및 vc(발린-시트룰린 디펩티드 링커)를 포함한다. 예로서, 조작된 링커(예를 들어, SMCC, SPDB, S-SPDB), (Immunogen, Inc.)는 종양에 대한 ADC의 결합 이전에 안정되고, 이어서 ACD가 암 세포 내부로 내부화되면 페이로드 효능을 최적화하도록 설계되었다. 다른 링커, 예컨대 카텝신-절단성 링커인 디펩티드 vc 링커는 세포독성제, 예컨대 돌라스타틴 10으로부터 유래된 유사분열 억제제인 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 예를 들어 베도틴에 항체를 콘쥬게이트시키기 위해 사용될 수 있다. 세포독소는 항체에 콘쥬게이트되어, 1 이상의 독소 분자가 각각의 항체 분자에 부착될 수 있으며, 예를 들어 항체 당 평균 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 독소 분자가 있을 수 있다.
특별한 실시양태에서, MMAE는 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐-MMAE(MC-vc-PAB-MMAE)에 결합된 말레이미도카프로일(MC) 부착기에 의해 항체 시스테인에 간접적으로 연결된다. "MC-vc-PAB-MMAE" 선형 구조에서, "MC"는 말레이미드 및 카프로산으로 구성되며, 전형적으로 H 사슬 상의 시스테인기를 통해 항체에 부착하는 모이어티이다. 결국, "MC"는 발린(Val) 및 시트룰린(Cit)으로 구성되고, 종양 또는 암 세포 내부의 카텝신에 의해 절단되는 카텝신-절단성 링커인 "vc" 링커에 부착된다. "vc"는 스페이서 "PAB", 즉 MMAE 세포독소가 연결되는 파라미도벤조산에 부착된다. MC-vc-PAB-MMAE ADC는 카텝신 B와 같은 프로테아제에 의해 절단될 때, 유리, 막-투과성 MMAE를 방출한다. 실시양태에서, 항체에 대한 링커는 세포외액에서 안정적이지만, ADC가 종양 또는 암 세포로 유입되면 카텝신에 의해 절단되어, MMAE 또는 다른 독소 약물의 항유사분열 메커니즘을 활성화한다. 다른 실시양태에서, 모노메틸아우리스타틴 F, (MMAF)는 말레이미도카프로일에 의해 항체 시스테인에 연결된다(MC-MMAF). MC-vc-PAB-MMAE ADC와 반대로, MC-MMAF ADC는 MCC-DM1 ADC와 같이 절단 불가능하며, 세포 내로 내부화 및 분해되어, 세포 내의 활성 약물로서 시스테인-MC-MMAF를 방출해야 한다.
실시양태에서, 세포독성 페이로드는 ADC를 세포 내로 내부화한 다음, 리소좀 내로 방출된다. 리소좀에서, 리소좀 효소는 ADC의 항체 성분을 분해시킨다. 리소좀 분해 이후, 약물(및 약물-링커) 페이로드가 세포질 내로 방출되며, 여기서 약물은 세포내 표적에 결합하여, 궁극적으로 세포 사멸을 야기한다. 최적으로는, 방출된 페이로드는 링커가 여전히 부착된 완전 활성이다. ADC에 결합된 표적이 리소좀으로의 열악한 수송을 야기하는 다른 실시양태에서, 표적 세포 외부에서 안정적이나, 세포 내에서는 항체 성분으로부터 페이로드를 절단하는 링커는 세포 내에서 페이로드 방출을 위한 대안적 방식을 제공하지만, 리소좀 외부에서는 그렇지 않다. 다른 실시양태에서, 링커는 세포외액에서 안정적이지만, ADC가 종양 또는 암 세포로 유입되면 카텝신에 의해 절단되어, 독소 약물의 항유사분열 또는 다른 세포독성 메커니즘을 활성화한다. 다른 실시양태에서, 절단성 링커의 작용에 의해 방출된 페이로드는 이웃한 암 세포에 유입되고, 방관자 효과를 통해 이들을 사멸해, ADC의 표적화 및 종양 사멸 활성을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 및 폴리펩티드는 마커, 예컨대 펩티드에 콘쥬게이트 되어, 정제를 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 마커는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 대응하는 헥사-히스티딘 펩티드(서열번호 42), 헤마글루티닌 "HA" 태그(Wilson, I. A. et al., Cell, 37:767-778 (1984)), 또는 "플래그(flag)" 태그이다(Knappik, A. et al., Biotechniques 17(4):754-761 (1994)).
일부 실시양태에서, 모이어티는 에세이에서 검출될 수 있는 이미징제일 수 있다. 상기 이미징제는 효소, 보결분자단, 방사성표지, 비방사성 상자성 금속 이온, 합텐, 형광 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 발광성 분자, 생물발광성 분자, 광친화성 분자, 유색 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴일수 있다.
일부 실시양태에서, 효소는, 비제한적으로 서양고추냉이과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 보결분자단 복합체는, 비제한적으로 스트렙타비틴/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 형광 물질은, 비제한적으로, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아진일아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질은, 예컨대 비제한적으로, 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질은, 비제한적으로, 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 방사성 물질은, 비제한적으로, 비스무트(213Bi), 탄소(14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 불소(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브덴(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테뮴(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 삼중수소(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn)을 포함하며; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다.
이미징제는 당업계에 알려진 기법을 사용하여 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간물(예컨대, 당업계에 알려진 링커)을 통해 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 진단제로서 사용하기 위해 본원에 기재된 다른 분자에 콘쥬게이트 될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참고한다. 일부 콘쥬게이션 방법은, 예를 들어 항체에 부착되는 유기 킬레이트제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아마이드; 및/또는 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3을 이용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함한다. 단클론성 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 과요오드산염과 같은 커플링제의 존재시 효소와 반응할 수 있다. 형광 마커와의 콘쥬게이트는 이들 커플링제의 존재시 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드는 2 차 항체에 콘쥬게이트되어 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 바와 같은 항체 이종 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 상기 이종 콘쥬게이트 항체는 합텐(예를 들어, 플루오레세인), 또는 세포 마커(예를 들어, 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47) 또는 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IFNγ, Flt3, BLys) 또는 케모카인(예를 들어, CCL21)에 추가로 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 또한 고형 지지체에 부착될 수 있으며, 이는 표적 항원, 또는 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 결합을 통해 지지체에 고정된 표적 항원에 결합할 수 있는 다른 분자의 면역 에세이 또는 정제에 유용할 수 있다. 상기 고형 지지체는, 비제한적으로, 유리, 셀루로오스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
단백질 정제
단백질 정제 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기법은, 제1 단계에서 세포, 조직, 또는 기관의 균질화 및 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 조제물 분별을 포함한다. 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 달리 명시되지 않는 경우, 크로마토그래피 및 전기영동 기법을 사용하여 추가로 정제되어, 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성으로 정제)를 달성할 수 있다. 순수 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석적 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 및 등전점 전기영동이다. 펩티드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 고속 액체 크로마토그래피(fast-performance liquid chromatography)(FPLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography)(HPLC)이다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경되거나, 특정 단계가 생략되어, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조에 적합한 방법을 야기할 수 있는 것으로 여겨진다.
정제된 폴리펩티드는 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 이때 상기 폴리펩티드는 그것의 천연적으로 얻을 수 있는 상태에 비교하여 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 단리되거나 정제된 폴리펩티드는 또한 천연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 유리된 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 분별을 거쳐 다양한 다른 성분이 제거된 조성물을 지칭할 것이며, 조성물은 그것의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 함유한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 폴리펩티드가 조성물 내의 단백질의 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 또는 그 이상을 구성하는 바와 같이, 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭할 것이다.
폴리펩티드의 정제의 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법이 본 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 이들은, 예를 들어 활성 분획의 특이적 활성을 결정하는 단계, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위해 바람직한 방법은 분획의 특이적 활성을 계산하고, 그것을 최초 추출물의 특이적 활성과 비교하여, "정제 배수"로 평가된 이의 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 물론 정제를 실시하기 위해 선택된 특별한 에세이 기법, 및 발현된 폴리펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드가 항상 그것의 가장 정제된 상태로 제공될 일반적 필요성은 없다. 실제로, 특정 실시양태에서는 실질적으로 덜 정제된 생성물이 유용성을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 부분적 정제는 조합적으로 더 적은 정제 단계를 사용하거나, 동일한 일반 정제 계획의 상이한 형태를 이용함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, HPLC 기구를 이용하여 수행된 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기법에 비해 더 큰 "배수" 정제를 야기할 것이다. 낮은 정도의 상대 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수에서, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는 단계에서 유리할 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 단리될 성분과 그것이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적 친화성에 의지하는 크로마토그래피 절차이다. 이것은 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 칼럼 물질은 결합 파트너 중 1 개가 불용성 매트릭스에 공유결합으로 결합함으로써 합성된다. 이어서, 칼럼 물질은 용액으로부터 상기 성분을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 발생하지 않는 조건으로 조건을 변화(pH, 이온 강도, 온도 등 변경)시킴으로써 발생한다. 매트릭스는 분자를 임의의 상당한 정도로 흡착하지 않고, 넓은 범위의 화학적, 물리적, 및 열적 안정성을 갖는 성분이어야 한다. 리간드는 그것의 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 결합되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 단단한 결합을 제공해야 한다. 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않으면서 성분을 용출시키는 것이 가능해야 한다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 내의 분자가 그것들의 크기, 또는 보다 기술적 관점에서 그것들의 유체역학적 부피를 기본으로 하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 그것은 보통 큰 분자 또는 거대분자 복합체, 예컨대 단백질 또는 산업 중합체에 적용된다. 전형적으로, 상기 기법은 유기 용매가 이동상으로서 사용될 때 사용되는 명칭인 겔 투과 크로마토그래피에 비해, 칼럼을 통해 샘플을 이동시키기 위해 수용액이 사용될 때, 겔 여과 크로마토그래피로 알려져 있다. SEC의 근본적인 원리는 상이한 크기의 입자가 고정상을 통해 상이한 비율로 용출(여과)되는 것이다. 이것은 크기를 기본으로 한 입자 용액의 분리를 야기한다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 로딩된다면, 동일한 크기의 입자는 함께 용출되어야 한다.
고성능 액체 크로마토그래피(또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 확인, 및 정량화하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 자주 사용되는 칼럼 크로마토그래피의 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 충전재(고정상)를 유지하는 칼럼, 칼럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프, 및 분자의 체류 시간(retention time)을 나타내는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자, 및 사용된 용매(들)에 따라 달라진다.
본원은 또한 PD-1-함유 샘플을 실시양태의 항체와 접촉시키는 단계(예를 들어, 항체는 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합함)를 포함하는, PD-1 글리코실화, N-결합형 글리코실화 또는 N-글리코실화를 평가하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 특정 양태에서, 상기 샘플은 세포 샘플이다.
핵산.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 고려한다. 본원은 또한 상기 핵산 분자를 전달하거나 복제할 수 있는 벡터 분자(예컨대, 플라스미드)를 제공한다. 상기 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있고, 단일-가닥 및 이중-가닥 부분 둘 다를 함유할 수 있다.
약학 제제
항체를 함유한 약학 조성물의 임상 적용이 착수되는 경우, 일반적으로 의도된 적용에 적합한 약학 또는 치료 조성물을 제조하는 것이 유익할 것이다. 일반적으로, 약학 조성물은 본원에 기재된 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 유효량을 갖거나, 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 용해되거나 분산된 추가 약제를 함께 가질 수 있다.
본원은 또한 본원에 기재된 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드를 갖는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 0.1 중량%의 항체 또는 폴리펩티드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 0.5 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량% 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 70 중량%, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 또는 그 이상의 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 항-glycPD-1 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 약 2 중량% 내지 약 75 중량%, 약 25 중량% 내지 약 60 중량%, 약 30 중량% 내지 약 50 중량%, 또는 이의 임의의 범위의 조성물을 구성할 수 있다. 각각의 치료적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 적합한 복용량이 화합물의 임의의 소정 단위 용량으로 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자뿐 아니라 다른 약학적 고려사항이 상기 약학 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
조성물은 활성 성분으로서 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드뿐 아니라 약학적으로 허용 가능한 담체를 갖는 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 1 이상의 추가 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전, 유럽 약전 또는 동물에서, 더욱 특별하게는 인간에서의 사용을 위한 일반적으로 인정된 다른 약전에 열거된 담체일 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보강제(예를 들어, 프로인트 보강제(완전 또는 불완전)), 부형제, 안정화제 또는 비히클을 지칭한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 사용된 투여량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 담체이고, 이는 멸균액, 예컨대 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일, 예컨대 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 분자 개체 또는 조성물은 동물, 예컨대 적절하게는 인간에게 투여되었을 때 부작용, 알레르기 반응, 또는 다른 부반응을 생성하지 않는다. 항체 또는 추가의 활성 성분을 갖는 약학 조성물의 제제는 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 또한, 동물(예를 들어, 인간) 투여를 위해, 제제는 FDA 생물 표준국에 의해 요구되는 멸균성, 발열성, 일반적 안전성, 및 순도 표준을 충족해야 하는 것으로 이해될 것이다.
조성물은 mL 당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 고려된다. 따라서, 조성물 내의 항체 또는 폴리펩티드의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 mg/mL 이상(또는 이로부터 유래될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이들 중, 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 %가 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드일 수 있다.
활성 성분으로서 본원에 기재된 항체 또는 다른 폴리펩티드를 갖는 약학 조성물의 제제는 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 또한, 동물(인간을 포함함) 투여를 위해, 제제는 FDA 생물 표준국에 의해 요구되는 멸균성, 발열성, 일반적 안전성, 및 순도 표준을 충족해야 하는 것으로 이해된다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 반고체, 즉 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 생리식염수, 지질, 리포좀, 수지, 바인더, 필러 등, 또는 이의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업자에게 알려진 바와 같은 수성 용매(예를 들어, 물, 알코올성/수성 용액, 에탄올, 생리식염수, 비경구적 비히클, 예컨대 염화나트륨, 링거스 덱스트로오스(Ringer's dextrose) 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸올리에이트), 분산매, 코팅제(예를 들어, 레시틴), 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제 또는 항진균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살), 등장제(예를 들어, 당류, 염화나트륨), 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정화제(예를 들어, 완충제, 아미노산, 예컨대 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예컨대 덱스트로오스, 만노오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 말토오스, 소르비톨, 만니톨 등), 겔, 바인더, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 유체 및 영양소 보충제, 이와 같은 물질 및 이의 조합을 포함한다. 임의의 통상적 매질, 약제, 희석제, 또는 담체가 수용자에게 또는 이들이 함유된 조성물의 치료 효능에 유해한 경우를 제외하고, 본 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여 가능한 조성물에서의 그것의 사용은 적절하다. 약학 조성물에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 조성물은 임의의 간편하고 타당한 방식으로, 즉 용액, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수, 분쇄 등에 의해 담체와 조합될 수 있다. 상기 절차는 당업자에게 일상적이다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충액일 수 있다. 예는 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량((예를 들어, 약 10 개 아미노산 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온 계면활성제, 예컨대 TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICSTM와 같은 완충제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균액, 예컨대 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일, 예컨대 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은, 특히 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 담체일 수 있다. 또한, 생리식염수 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이, 특히 주사 가능한 용액에 대한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올, 폴리소르베이트-80 등을 포함한다. 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태는 그것이 고체, 액체, 또는 에어로졸 형태로 투여되는지 여부, 및 그것이 주사와 같은 투여의 경로를 위해 살균될 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 가질 수 있다. 조성물은 정맥내로, 피부내로, 경피로, 척추강내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 구강으로, 국부로, 국소로, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입)에 의한, 주사에 의한, 수액(infusion)에 의한, 연속적인 수액에 의한, 표적 세포를 직접 배싱(bathing)하는 국소적 관류에 의한, 카테터를 통한, 세척을 통한, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)로, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법 또는 상기의 임의의 조합에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990을 참고). 전형적으로, 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있고; 주사 전에 액체 첨가시 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있으며; 상기 제제는 또한 유화될 수 있다.
항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 유리 염기, 중성, 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 첨가 염, 예를 들어 단백질 조성물의 유리 아미노기로 형성된 것, 또는 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타타르산, 또는 만델산으로 형성된 것을 포함한다. 유기 카복시기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원은 지질을 갖는 약학 조성물을 제공한다. 지질은 특징적으로 물에서 불용성이고 유기 용매로 추출 가능한 성분의 클래스를 광범위하게 포함할 수 있다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연적으로 발생하거나 합성(즉, 인간에 의해 설계 또는 생성)될 수 있다. 지질은 생물학적 성분일 수 있다. 생물학적 지질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고리피드, 당지질, 설파타이드, 에터- 및 에스터-결합형 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질, 및 이의 조합을 포함한다. 지질로서 당업자에게 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 것들 이외의 화합물이 또한 사용될 수 있다.
당업자는 지질 비히클에서 조성물을 분산시키기 위해 이용될 수 있는 기법의 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드는 지질을 함유한 용액에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유결합으로 결합되거나, 지질에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀(micelle) 또는 리포좀으로 함유되거나 복합화되거나, 그 외에 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조체와 연합될 수 있다. 상기 분산은 리포좀의 형성을 야기하거나 야기하지 않을 수 있다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 또는 단일 투여 형태, 예를 들어 활성 성분의 양을 표시한 앰플 또는 샤쉐(sachette)와 같은 밀폐된 용기 내의 동결건조 분말 또는 무수 농축액으로 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 수액에 의해 투여될 경우, 그것은 멸균 약학 등급 물 또는 염수를 함유한 수액 병으로 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공되어, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있다.
각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 성분의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 소정 단위 용량으로 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자뿐 아니라 다른 약학적 고려사항이 상기 약학 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
단위 용량 또는 투여량은 대상체에서의 사용에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 투여, 즉 적절한 경로 및 치료 요법과 연관되어 상기 논의된 소망하는 반응을 생성하도록 계산된 소정 양의 약학 조성물을 함유한다. 치료의 횟수 및 단위 용량 둘 다에 따른 투여될 양은 소망하는 효과에 의존한다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 실시양태의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 대상체의 체중, 연령, 건강, 및 성별, 치료되는 질환의 유형, 질환 침입의 정도, 이전 또는 공존하는 치료적 개입, 환자의 특발성 질환, 투여의 경로, 및 특정 치료 성분의 효능, 안정성, 및 독성에 의해 결정될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 용량은 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 이상, 및 이의 유래 가능한 임의의 범위를 가질 수 있다. 본원에 열거된 수로부터 유래 가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기 기재된 수를 기본으로 하여 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 투여에 책임 있는 의사는, 어떤 경우에도 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
당업자가 이해하는 바에 있어서, 본원에 기재된 조성물은 치료 제제의 특별한 특성에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 조성물은 생리학적으로 용인될 수 있는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제, 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이들 치료 제제는, 예컨대 가축을 이용한 수의과 사용, 및 인간에서의 임상 사용을 위해 다른 치료제와 유사한 방식으로 포유동물에 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능을 위해 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여의 방식뿐 아니라 개별 대상체의 특화된 요구에 따라 달라진다. 인간 환자를 포함하여, 동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 체중, 병태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 공존하는 치료적 개입, 환자의 특발성 질환, 및 투여의 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여의 경로에 따라서, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수가 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여에 책임 있는 의사는, 어떤 경우에도 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
질환의 치료
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "대상체"는 치료, 관찰 및/또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. "동물"은 척추동물 및 무척추동물, 예컨대 어류, 조개류, 파충류, 조류, 및, 특히 포유동물을 포함한다. "포유동물"은, 비제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 유인원, 및 인간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "암" 또는 "암성(cancerous)"은 전형적으로 비조절된 세포 성장이 특징인 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭한다. 암의 예는, 비제한적으로 혈액암 및 고형 종양을 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질환 또는 건강 관련 병태의 치료 이득을 얻을 목적으로 대상체에 대한 치료제의 투여 또는 적용 또는 대상체에 대한 절차 또는 양상의 수행을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 대상체에게 약학적 유효량의 항-glycPD-1 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 참고로 암 환자에 대해 사용될 때, 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 잠재적으로 암의 중증도를 감소시키거나, (a) 암 성장 억제, 암 성장률 감소, 발달 방지, 암 침입성 감소 또는 암의 전이 예방, 및 (b) 암의 퇴행 야기, 암의 존재와 연관된 1 이상의 증상 지연 또는 최분해, 또는 암 환자의 생존 연장을 포함한 암의 진행을 지연시키거나 늦추는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "약학적 유효량"은 주어진 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및/또는 기간, 및/또는 이와 관련된 증상을 감소시키기에 충분한 약제(예를 들어, 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 임의의 다른 약제)의 양을 지칭한다. 치료제를 포함한 약제의 약학적 유효량은 (i) 주어진 질환, 장애, 또는 병태의 발전 또는 진행의 감소 또는 개선, (ii) 주어진 질환, 장애, 또는 병태의 재발, 발달 또는 개시의 감소 또는 개선, 및/또는 (iii) 다른 요법(예를 들어, 본원에서 제공된 항체의 투여 이외의 요법)의 예방 또는 치료 효과 개선 또는 향상을 위해 필요한 양일 수 있다. 본 발명의 성분/분자/약제(예를 들어, 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드)의 약학적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개체에서 소망하는 반응을 유도하는 성분/분자/약제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 약학적 유효량은 성분/분자/약제의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과를 초과하는 양을 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "투여하다" 또는 "투여"는, 예컨대 점막, 피부내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해 신체 외부에 존재하는 성분을 환자 내부로 주사하거나 그 외에 물리적으로 전달하는 행위를 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 치료될 때, 성분의 투여는 전형적으로 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 증상의 개시 후에 일어난다. 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 예방될 때, 성분의 투여는 전형적으로 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 증상의 개시 전에 일어난다.
본원은 또한 항-glycPD-1 항체 및 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 치료적 사용을 제공한다. 이들 항체 또는 폴리펩티드는 PD-1/PD-L1 시그널링의 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체 또는 폴리펩티드는 또한 T 세포 활성화 또는 증식에서 PD-1의 억제적 활성을 억제함으로써 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원은 PD-1 시그널링을 억제하거나 차단함으로써 대상체의 면역계를 상향-조절하는데 있어서 상기 항체 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 PD-1이 PD-L1에 결합하는 것을 차단하기 위한 항체 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 또한 암을 치료하는데 있어서 항-glycPD-1 항체 및 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 치료적 용도를 제공한다. 면역계의 상향-조절은 암의 치료에서 특히 바람직하므로, 본원은 또한 암 치료 방법을 제공한다. 암은 세포의 비정상적인 조절되지 않은 성장으로부터 야기된 신생물 또는 종양을 지칭한다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 암 세포는 PD-L1에 대해 양성이다.
특정 양태에서, 실시양태의 폴리펩티드 또는 항체(예를 들어, 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드 또는 글리코실화된 PD-1에 결합하는 항체)는 암을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 STM418 또는 STM432의 키메라 또는 인간화된 형태이다. 본 치료 방법이 유용한 암은 임의의 악성 세포 유형, 예컨대 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것을 포함한다. 예시적 고형 종양은, 비제한적으로 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있다. 예시적 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에서 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가적인 예는, 비제한적으로 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평세포암종, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평상피암을 포함함), 복막의 암, 간세포암, 위 또는 위선암(위장암 및 위장관기질암을 포함함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, 흑색종, 표재 확산 흑색종, 흑색점 악성 흑색종, 말단 흑색점 흑색종, 결절성 흑색종뿐 아니라, B-세포 림프종(저급/난포 비-호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중급/난포 NHL; 중급 미만성 NHL; 고급 면역모세포 NHL; 고급 림프모구 NHL; 고급 소형 비-절개 세포 NHL; 대량 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함함), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 모양 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수모구 백혈병을 포함한다.
상기 암은 구체적으로 다음 조직학적 유형일 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추형 세포 암종; 소세포 암종; 유두상암; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저세포암; 섬모기질암; 이행상피암; 유두상 이행상피암; 선암; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암; 섬유주 선암; 샘낭 암종; 샘종성 폴립에서의 선암; 가족성 대장 폴립증 선암; 고형 암종; 악성 유암종; 세기관지-폐포 선암; 유두상 선암종; 색소혐성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암; 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 여포 선암종; 유두상 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지선암; 귀지선암; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암; 반지 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질암종; 소엽암; 염증성 암종; 유방 파제트병(paget's disease); 선방세포 암종; 선편평세포 암종; 선암 w/편평상피화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포종; 악성 남성모세포종; 세르톨리세포 암종; 악성 간질세포종; 악성 지질세포종; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색세포종; 글로만지오사르코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반에서의 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 기질육종; 악성 혼합 종양; 뮐로(mullerian) 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 브레너 종양(brenner tumor); 악성 엽상종; 활막육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 태생기암; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 골막 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종(ewing's sarcoma); 악성 치성 종양; 사기질모세포 치육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 파라육아종; 소형 림프구성 악성 림프종; 광범위 큰 세포 악성 림프종; 난포 악성 림프종; 균상식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만세포성 백혈병; 거핵아구 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종; 및 모양 세포 백혈병.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드는 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암(tracheal cancer), 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 대장암, 직장암 또는 피부암인 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
상기 폴리펩티드 또는 항체는 본원에서 항암제로서 다양한 양상으로 사용될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 본원은 종양 세포 성장을 억제하기에 충분한 시간 동안 종양 세포 집단을 치료적 유효량의 폴리펩티드 또는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 또는 항체를 항암제로서 사용하는 방법을 제공한다.
리포좀 내에 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐 내로의 캡슐화, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 엔도사이토시스(예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol . Chem. 262:4429-4432 참고), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 제작 등과 같은 다양한 전달 시스템이 또한 알려져 있으며, 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 관련 분자, 또는 관련 약학 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 투여 방법은, 비제한적으로 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막(예를 들어, 비강내 및 구강 경로)에 의한 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 다른 분자, 또는 약학 조성물은 근육내로, 정맥내로, 피하로, 정맥내로, 복강내로, 구강으로, 근육내로, 피하로, 강내로(intracavity), 경피로, 또는 진피로 투여된다. 상기 조성물은 임의의 간편한 경로에 의해, 예를 들어 수액 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내막(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 창자 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저(nebulizer), 및 에어로졸화제를 갖는 제형의 사용에 의한 폐 투여가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,019,968호; 제5,985,20호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 제5,290,540호; 및 제4,880,078호; 및 PCT 공개 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참고하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 다른 분자, 또는 약학 조성물은 치료가 필요한 구역에 국소로 투여되고, 이는 예를 들어, 국소 수액에 의해, 주사에 의해, 또는 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴 물질의 이식의 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 다른 분자를 투여할 때, 항체 또는 다른 분자가 흡수하지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울인다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드는 표적화된 전달을 위하여 리포좀으로 제형화된다. 리포좀은 수성 상을 캡슐화하는 동심으로 정렬된 인지질 이중층으로 구성된 소포이다. 리포좀은 전형적으로 다양한 유형의 지질, 인지질, 및/또는 계면활성제를 갖는다. 리포좀의 성분은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 구성으로 배열된다. 리포좀은 부분적으로 자신의 생체적합성, 낮은 면역원성, 및 낮은 독성으로 인해 유용한 전달 비히클일 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 본원에서 제공되고, 예를 들어 Epstein et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82: 3688; Hwang et al., 1980 Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 77: 4030-4; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호를 참고하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원은 또한 미국 특허 제5,013,556호에 개시된 것과 같은 연장된 혈청 반감기, 즉 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용되는 리포좀은 순환으로부터 신속하게 제거되지 않으며, 즉 단핵식세포계(mononuclear phagocyte system)(MPS)로 흡수되지 않는다. 본원은 또한 당업자에게 알려진 일반적인 방법을 사용하여 제조되는 입체구조로 안정화된 리포좀을 제공한다. 입체구조로 안정화된 리포좀은 부피가 크고 매우 유연한 친수성 모이어티를 갖는 지질 성분을 함유할 수 있으며, 이는 리포좀과 혈청 단백질의 소망하지 않는 반응을 감소시키고, 혈청 성분과의 옵소닌화를 감소시키며, MPS에 의한 인지를 감소시킨다. 입체구조로 안정화된 리포좀은 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 제조될 수 있다. 리포좀 및 입체구조로 안정화된 리포좀의 제조에 대해서는, 예를 들어 Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224; Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6; Klibanov et al., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7; Blum et al., 1990, Biochim . Biophys . Acta., 1029: 91-7; Torchilin et al., 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116; Litzinger et al., 1994, Biochim . Biophys . Acta, 1190: 99-107; Maruyama et al., 1991, Chem . Pharm . Bull., 39: 1620-2; Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allen et al., 1994, Adv . Drug Deliv . Rev, 13: 285-309를 참고하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원은 또한 특정 기관 표적화(예를 들어 미국 특허 제4,544,545호 참고), 특정 세포 표적화(예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2005/0074403호)에 적합한 리포좀을 제공하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 제공된 조성물 및 방법에 사용하기 위해 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG 유래된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 소망하는 직경을 갖는 리피좀을 생성하도록 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편, 예를 들어 F(ab')를 갖는 분자는 이전에 기재된 방법을 사용하여 리포좀에 콘쥬게이트될 수 있으며, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288를 참고한다.
본원에 기재된 인간화 또는 키메라 항체는 또한 면역리포좀으로 제형화될 수 있다. 면역리포좀은 항체 또는 이의 단편이 리포좀 표면에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된 리포좀 조성물을 지칭한다. 리포좀 표면에의 항체의 연결 화학은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,787,153호; Allen et al., 1995, Stealth Liposomes , Boca Rotan: CRC Press, 233-44; Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys . Acta, 1239: 133-144를 참고하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 면역리포좀은 추가로 입체적으로 안정화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인간화된 항체는 리포좀의 지질 이중층에 안정적으로 고정되는 소수성 앵커(anchor)에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된다. 소수성 앵커의 예는, 비제한적으로, 인지질, 예를 들어 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI)을 포함한다. 항체와 소수성 앵커 사이의 공유 결합을 달성하기 위해, 당업계에 알려진 임의의 생화학적 전략이 이용될 수 있으며, 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 J. Thomas August ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, Calif., p. 399-435를 참고한다. 예를 들어, 항체 분자 상의 작용기는 리포좀 연합된 소수성 앵커 상의 활성기와 반응할 수 있으며, 예를 들어 항체 상의 라이신 측쇄의 아미노기는 수용성 카보디이미드로 활성화된, 리포좀 연합된 N-글루타릴-포스파티딜에탄올아민에 결합될 수 있거나; 환원된 항체의 티올기가 피리딜티오프로피오닐포스파티딜에탄올아민과 같은 티올 반응성 앵커를 통해 리포좀에 결합될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Dietrich et al., 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105; Loughrey et al., 1987, Biochim . Biophys . Acta, 901: 157-160; Martin et al., 1982, J. Biol . Chem. 257: 286-288; Martin et al., 1981, Biochemistry, 20: 4429-38을 참고한다. 항-글리코실화된 PD-1 항체를 갖는 면역리포좀 제형은 표적 세포, 즉 항체가 결합하는 수용체를 포함하는 세포의 세포질에 활성 성분을 전달하기 때문에, 치료제로서 특히 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역리포좀은 혈액, 구체적으로 표적 세포에서 반감기가 증가될 수 있고, 표적 세포의 세포질 내로 내부화되어, 치료제의 손실 또는 엔돌리소좀 경로(endolysosomal pathway)에 의한 분해를 회피할 수 있다.
본원에서 제공된 면역리포좀 조성물은 1 이상의 소포 형성 지질, 항체 또는 본 발명의 다른 분자 또는 이의 단편 또는 유도체, 및 선택적으로, 친수성 중합체를 가질 수 있다. 소포 형성 지질은 2 개의 탄화수소 사슬, 예컨대 아실 사슬 및 극성 헤드기를 갖는 지질일 수 있다. 소포 형성 지질의 예는 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 및 당지질, 예를 들어 세레브로시드, 강글리오시드를 포함한다. 본원에서 제공된 제형에 유용한 추가 지질은 당업자에게 알려져 있으며, 본 명세서에 포함된다. 일부 실시양태에서, 면역리포좀 조성물은 친수성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 및 강글리오시드 GM1을 추가로 포함하고, 이는 리포좀의 혈청 반감기를 증가시킨다. 친수성 중합체를 리포좀에 콘쥬게이트시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 포함된다. 추가의 예시적인 면역리포좀 및 이를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 출원 공게 제2003/0044407호; PCT 국제 공개 WO 97/38731, Vingerhoeads et al., 1994, Immunomethods, 4: 259-72; Maruyama, 2000, Biol . Pharm . Bull. 23(7): 791-799; Abra et al., 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2): 1-3; Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2): 267-281; Bendas et al., 2001 BioDrugs, 14(4): 215-224, J. Thomas August ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, Calif., p. 399-435에서 찾아볼 수 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원은 또한 항-glycPD-1 항체의 단위 용량을 환자에게 투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 또한 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드의 단위 용량을 환자에게 투여함으로써 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 단위 용량은 대상체에 대해, 단위 용량으로 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체, 또는 비히클과 연합되어 소망하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 소정의 양을 함유한다.
항체, 폴리펩티드, 또는 조성물은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로, 치료적 유효량으로 투여된다. 투여될 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체 시스템의 능력, 및 소망하는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여될 필요가 있는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의존하며, 각각의 개별 대상체에 대해 고유하다. 그러나, 전신 적용에 적합한 투여량 범위가 본원에 개시되며, 투여 경로에 의존한다. 초기 및 부스터(booster) 투여에 적합한 요법이 또한 고려되며, 전형적으로 초기 투여 이후에, 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 1 시간 이상의 간격의 반복 투여fmf 포함한다. 예시적 다중 투여가 본원에 기재되며, 폴리펩티드 또는 항체의 높은 혈청 및 조직 수준을 지속적으로 유지하기에 유용하다. 대안적으로, 혈액에서 생체내 요법에 특이적인 범위로 농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥내 주입이 고려된다.
치료적 유효량은 소망하는 효과를 달성하도록 계산된 소정의 양이다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 병태, 성별, 및 환자에서 질환의 정도에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증의 사례에서 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 앰플 또는 샤쉐와 같은 밀폐된 용기 내에 포장된다. 일 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 밀폐된 용기 내의 동결건조 분말 또는 무수 농축액으로서 공급되고, 예를 들어 대상체에 대한 투여를 위해 물 또는 염수를 이용해 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 적어도 5 mg, 또는 바람직하게는 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 또는 적어도 75 mg의 밀폐된 용기 내의 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 본원에서 제공된 동결건조 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 자신의 원래 용기에서 2 내지 8 ℃ 사이로 저장되어야 하고, 재구성된 후에 12 시간 이내, 바람직하게는 6 시간 이내, 5 시간 이내, 3 시간 이내, 또는 1 시간 이내에 투여되어야 한다. 대안적 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물의 양 및 농도를 표시한 밀폐된 용기 내에 액체 형태로 공급된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물의 액체 형태는 적어도 1 mg/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 2.5 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 8 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 100 mg/mL, 적어도 150 mg/mL, 적어도 200 mg/mL로 밀폐된 용기 내에 공급된다.
제형에서 사용될 정확한 용량은 또한 투여의 경로, 및 병태의 심각성에 의존할 것이고, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다. 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드에 대하여, 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 환자 체중이다. 일부 실시양태에서, 환자에게 투여되는 투여량은 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.01 내지 2 mg/kg, 0.01 내지 1 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.01 내지 0.15 mg/kg, 0.01 내지 0.10 mg/kg, 0.01 내지 0.05 mg/kg, 또는 0.01 내지 0.025 mg/kg이다. 특히, 환자에게 투여되는 투여량은 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg 또는 10 mg/kg 환자 체중일 수 있다. 0.01 mg/kg 만큼 낮은 투여량이 주목할 만한 약역학적 효과를 나타낼 것으로 예측된다. 0.10-1 mg/kg의 투여량 수준이 가장 적절할 것으로 예측된다. 더 높은 용량(예를 들어, 1-30 mg/kg)이 또한 활성일 것으로 예측될 수 있다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종으로부터의 항체에 비해 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 더 낮은 투여량의 인간 항체 및 더 적은 빈도의 투여가 실행될 수 있다. 또한, 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드 투여의 투여량 및 빈도는, 예를 들어 지질화(lipidation)와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 투과를 향상시킴으로써 감소될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 방출 제어 또는 서방성 시스템으로 전달될 수 있다. 본원에서 제공된 1 이상의 항체, 분자, 또는 약학 조성물을 갖는 서방성 제형을 생성하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189 (1996), Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397 (1995); Cleek et al., Pro. Int'l . Symp . Control. Rel . Bioact . Mater. 24:853-854 (1997); 및 Lam et al., Proc . Int'l . Symp . Control Rel . Bioact . Mater. 24:759-760(1997)을 참고하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일 실시양태에서, 방출 제어 시스템에서는 펌프가 사용될 수 있다(Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit . Ref Biomed . Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; 및 Saudek et al., 1989, N. Engl . J. Med. 321:574 참고). 다른 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드의 방출 제어를 달성하기 위해 중합 물질이 사용될 수 있다(예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol . Sci . Rev. Macromol. Chem. 23:61 참고; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105 참고); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; PCT 공개 WO 99/15154; 및 PCT 공개 WO 99/20253 참고); 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서방성 제형으로 사용될 수 있는 중합체의 예는, 비제한적으로, 폴리(-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리안하이드라이드, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아마이드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방출 제어 시스템은 치료 표적(예를 들어, 폐)에 인접하여 위치하므로, 전신 투여량의 일부만 필요할 수 있다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참고). 다른 실시양태에서, 방출 제어 이식물로서 유용한 중합 조성물은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Dunn et al.(미국 특허 제5,945,155호 참고)에 따라 사용된다. 중합 시스템으로부터의 생활성 물질의 제자리(in situ) 방출 제어의 치료 효과를 기본으로 하여, 이식은 일반적으로 치료법이 필요한 환자의 신체 내 어디에서든 발생할 수 있다.
다른 실시양태에서, 비-중합성 지속 전달 시스템이 사용되며, 이에 의해 대상체의 신체에서 비-중합성 이식이 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에서의 이식 시에, 이식물의 유기 용매는 조성물로부터 주위 조직 유체로 소멸, 분산, 또는 도달할 것이며, 비-중합성 물질은 점진적으로 응고되거나 침전되어 고체, 미세다공성 매트릭스를 형성할 것이다(미국 특허 제5,888,533호 참고). 방출 제어 시스템은 또한 Langer(1990, Science 249:1527-1533)에 의한 검토에서 논의된다. 본원에서 제공된 1 이상의 치료제를 포함한 서방성 제형을 생성하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호; 국제 공개 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l . Symp . Control. Rel . Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al., 1997, Proc . Int'l . Symp . Control Rel. Bioact . Mater. 24:759-760을 참고하며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원은 또한 조성물이 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 갖는 실시양태를 제공하며, 이때 상기 핵산은 적절한 핵산 발현 백터의 일부로서 핵산을 구축하고, 예를 들어 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해(미국 특허 제4,980,286호 참고), 또는 직접 주사에 의해, 또는 마이크로입자 충격의 사용에 의해(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질이입제로 코팅함으로써, 핵산이 세포내로 되도록 핵산을 투여함으로써, 또는 핵으로 도입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩티드에 결합하게 핵산을 투여함으로써(예를 들어, Joliot et al., 1991, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:1864-1868 참고), 그것의 코딩된 항체 또는 폴리펩티드의 발현을 촉진하도록 생 체내에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포내로 도입되고 상동 재조합에 의해 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 포함될 수 있다.
본원에서 제공된 치료적 유효량의 항체, 폴리펩티드 또는 약학 조성물을 이용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물은 질환을 치료하기 위해, 예컨대 국소으로 진행된 암 또는 전이성 암을 갖는 암 환자에서 종양 세포 성장을 억제하거나 암 세포를 사멸하기 위해 전신적으로 또는 국소로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 그것들은 정맥내로, 척추강내로, 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 그것들은 단독으로 또는 항-증식성 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 그것들은 수술 또는 다른 절차 전에 환자에서의 암 부담을 감소시키기 위해 투여된다. 대안적으로, 그것들은 임의의 잔류 암(예를 들어, 수술이 제거에 실패한 암)이 생존하지 않도록 보장하기 위해 수술 이후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그것들은 전이를 예방하기 위해 원발성 암의 퇴행 이후에 투여될 수 있다.
병용 요법
특정 실시양태에서, 실시양태의 조성물 및 방법은 제2 또는 추가 요법과 조합된, 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드 또는 항체의 투여를 포함한다. 상기 요법은 PD-1 또는 글리코실화된 PD-1과 연관된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 암일 수 있으며, 제2 요법은 항암 요법 또는 항-과증식성 요법일 수 있다.
병용 요법을 포함한 방법 및 조성물은 치료 또는 보호 효과를 향상시키고/시키거나 다른 항암 요법 또는 항-과증식성 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료 및 예방 방법 및 조성물은 소망하는 효과, 예컨대 암 세포의 사멸 및/또는 세포 과증식의 억제를 달성하기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 절차는 폴리펩티드 또는 항체 및 제2 요법을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 제2 요법은 직접적인 세포독성 효과를 갖지 않으면서 면역계를 상향조절하는 약제일 수 있다. 조직, 종양, 또는 세포는 1 이상의 약제(예를 들어, 항체 또는 항암제)를 포함하는 1 이상의 조성물 또는 약학 제형(들)에 노출될 수 있거나, 2 이상의 별개의 조성물 또는 제형으로 조직, 종양, 및/또는 세포를 노출시킴으로써 노출될 수 있으며, 이때 1 개의 조성물은 1) 폴리펩티드 또는 항체, 2) 항암제, 또는 3) 폴리펩티드 또는 항체 및 항암제 둘 다를 제공한다. 또한, 상기 병용 요법은 화학요법, 방사선요법, 수술요법, 또는 면역요법과 콘쥬게이트되어 사용될 수 있다.
용어 "접촉된" 및 "노출된"은, 세포에 적용될 때, 본원에서 치료 폴리펩티드 또는 항체 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되어 위치되는 과정을 기재하기 위해 사용된다. 세포 사멸을 달성하기 위해, 예를 들어 양쪽 약제는 세포를 사멸하거나 분화를 예방하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.
항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 제2 또는 추가 항암 치료에 비해 그 이전에, 그 동안에, 그 이후에, 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시발생 내지 분, 일, 주의 범위의 간격을 둘 수 있다. 항체 또는 폴리펩티드가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 실시양태에서, 당업자는 각각의 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않아, 2 종의 화합물이 환자에 대해 유리하게 병용 효과를 여전히 나타낼 수 있도록 일반적으로 보장할 것이다. 상기 사례에서, 당업자는 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드와 제2 요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에, 더욱 상세하게는, 서로 약 6-12 시간 이내에 환자에게 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 치료를 위한 기간은 상당히 연장될 수 있으며, 이때 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7) 또는 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 경과한다.
구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 암의 치료를 위해 환자에게 펨브롤리주맙, 니볼루맙 또는 피딜리주맙과 조합된 투여를 포함하여, 1 이상의 다른 항-PD-L1 항체와 조합되어 투여된다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 암의 치료를 위해 환자에게 1 이상의 항-PD-1 항체와 조합되어 투여된다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 아테졸리주맙, 더발루맙 또는 아벨루맙과 조합되어 투여된다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 1 이상의 항-CTLA-4 항체와 조합되어 투여되고, 구체적 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙이다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4의 활성을 억제하는 약제, 예를 들어 Fc 도메인에 융합되는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4 단백질의 세포외-수용체 또는 리간드 결합 부위를 갖는 면역아데노신과 함께 투여된다.
구체적 실시양태에서, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항체와 조합되어 투여된다. 특히, 항-glycPD-1 항체는 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하며, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(및 코딩 뉴클레오티드 서열)이 2016년 10월 6일에 공개되고, 명칭이 "Antibodies Specific To Glycosylated PD-L1 And Methods Of Use Thereof"이며, 본원에 참고로 포함되는 PCT 공개 WO2016/160792에 개시되어 있는 항-PD-L1 항체 STM004 또는 STM115의 키메라 또는 인간화된 형태와 조합되어 투여될 수 있다. 항-glyc-PD-1 항체는 또한 비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(및 코딩 뉴클레오티드 서열)이 2016년 3월 29일에 출원되고, 명칭이 "Dual Function Antibodies Specific To Glycosylated PD-L1 And Methods Of Use Thereof"이며, 본원에 참고로 포함되는 미국 가출원 제62/314,652호에 개시되어 있는 항-PD-L1 항체 STM073 및 SMT108의 키메라 또는 인간화된 형태와 조합되어 투여된다.
특정 실시양태에서, 치료의 과정은 1-90 일 이상 지속될 수 있다(이러한 범위는 그 사이에 있는 일수를 포함한다). 1 개의 약제는 1 일차 내지 90 일차(이러한 범위는 그 사이에 있는 일수를 포함한다) 중 임의의 일자 또는 이의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 다른 약제는 1 일차 내지 90 일차(이러한 범위는 그 사이에 있는 일수를 포함한다) 중 임의의 일자 또는 이의 임의의 조합에 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 1 일(24 시간) 이내에, 환자는 약제(들)의 1 회 또는 다중 투여를 제공받을 수 있다. 또한, 치료의 과정 이후에, 아무 항암 치료도 투여되지 않은 기간이 있는 것으로 고려된다. 이 기간은 환자의 병태, 예컨대 그들의 예후, 힘, 건강 등에 따라, 1-7 일, 및/또는 1-5 주, 및/또는 1-12 개월 이상(이러한 범위는 그 사이에 있는 일수를 포함한다) 지속될 수 있다. 상기 치료 사이클은 필요에 따라 반복될 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드를 이용한 치료를 "A"로서, 제2 항암 요법을 "B"로서 갖는 일부 실시예가 하기에 열거된다:
환자에 대하여 제2 요법과 조합된, 본원에서 제공된 임의의 항체, 폴리펩티드, 또는 약학 조성물의 투여는, 만일 존재하는 경우, 제2 요법의 독성을 고려하여 상기 제2 요법의 투여에 대한 일반적 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서는, 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
화학요법
매우 다양한 화학요법제가 본 실시양태에 따라 제2 요법으로서 사용될 수 있다. 화학요법제는 암의 치료시 투여되는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 이들 약제 또는 약물은 세포 내에서 그것들의 활성화 방식에 의해, 예를 들어 어떠한 단계에서 그것들이 세포 사이클에 영향을 미치는지 여부에 의해 분류될 수 있다. 대안적으로, 약제는 DNA를 직접 가교하거나, DNA 내로 삽입되거나, 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 그것의 능력을 기본으로 하여 특성화될 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드(cyclosphosphamide); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아마이드, 트리에틸렌티오포스포아마이드, 및 트리메틸올로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(자신의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 나이트로젠 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제, 예컨대 에네다인 항생제(예를 들어, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마lI 및 칼리키아미신 오메가I1); 다이네미신 A를 포함한 다이네미신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라나이신(authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르치노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라나이신(nogalarnycin), 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모퍼, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 미토테인 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피탄몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속잔트론(losoxantrone); 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴(difluorometlhylornithine)(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 젬시타빈, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스백금, 및 상기 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
방사선요법
본원에 기재된 방법 및 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 다른 통상의 항암 요법은 방사선요법, 또는 방사선 요법이다. 방사선요법은 종양 세포에 대한 γ-선, X-선 사용, 및/또는 방사성 동위원소의 직접 전달을 포함한다. 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 및 UV-조사와 같은 DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려된다. 이들 모든 인자가 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 회복, 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 일으킬 가능성이 크다.
종양 미세환경은 종양에 침윤하고 면역 반응을 억제하도록 작용하는 골수-유래된 서프레서(suppressor) 세포 및 조절 T 세포의 존재로 인해 본질적으로 억제성이다. 또한, T 세포 및 항원 제시 세포(antigen presenting cell)(APC)에 대한 특정 억제성 분자의 발현은 효과적인 면역 반응을 제한할 수 있다. 방사선은 종양 세포 아폽토시스, 노쇠, 오토파지(autophagy)의 도입을 통해 항-종양 효과를 매개하고, 일부 상황에서 더욱 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있다.
앱스코팔 효과(abscopal effect)는 원발성 종양의 표적화된 방사선이 방사선장(field of radiation)이 아닌 이격된 부위에서 항-종양 반응을 유도하는 생리학적 과정이다. 앱스코팔 효과에 원인이 되는 메커니즘은 면역 매개된 것이며, T 세포에 대한 종양 항원의 제시 향상뿐 아니라 국소 및 전신 면역 반응을 자극하는 사이토카인 및 다른 전염증성 인자의 방출을 포함하는 것으로 생각된다. 앱스코팔 효과는 방사선 치료를 받는 원발성 종양으로부터 멀리 위치한 종양에 영향을 미치기 때문에, 앱스코팔 효과를 촉발시킬 수 있는 항원은 신체 내의 제2 부위에 확산되면 보통 치료하기 더욱 어려운 전이성 종양을 치료하는데 있어서 특히 유리할 것이다.
본원에 기재된 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드는 국소 또는 전신 면역 반응을 자극할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료적 유효량의 항체, 폴리펩티드 또는 약학 조성물은 상승작용적인 앱스코팔 효과를 달성하기 위해 방사선요법 이전에, 방사선요법과 동시에, 또는 방사선요법 이후에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료적 유효량의 항체, 폴리펩티드 또는 약학 조성물은 숙주 내의 종양을 방사선에 대해 효과적으로 감작시키도록 투여된다. 조사는 이온화 방사선, 특히 감마 방사선일 수 있다. 일부 실시양태에서, 감마 방사선은 선형 가속기에 의해, 또는 방사성핵종에 의해 방출된다. 방사성핵종에 의한 종양의 조사는 외부 또는 내부일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 약학 조성물의 투여는 종양의 조사의 최대 1 개월, 특히 최대 10 일 또는 1 주일 이전에 개시된다. 또한, 종양의 조사는 본원에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 약학 조성물의 투여가 제1 및 최종 조사 세션 사이의 간격에서 유지되도록 분획화된다.
조사는 또한 X-선 방사선일 수 있다. X-선에 대한 투여량(선량) 범위는 연장된 기간(3 내지 4 주) 동안 50 내지 200 뢴트겐(roentgen)의 일일 선량에서 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량까지의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 달라지며, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 의존한다.
면역요법
당업자는 면역요법이 실시양태의 방법과 조합되거나 콘쥬게이트되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역요법은 암세포를 표적화하여 파괴하기 위하여 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 일반적으로 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)이 이러한 예이다. 예를 들어, 이필루미맙, 펨브롤리주만, 니볼루맙, 및 아테졸리주맙과 같은 체크포인트 억제제는 다른 예이다. 면역 이펙터는, 예를 들어 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 항체 특이적일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 이펙터로서의 역할을 할 수 있거나 세포 사멸에 실제로 영향을 미치기 위해 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(예를 들어, 화학요법제, 방사성핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소)에 콘쥬게이트될 수 있으며, 단지 표적화제로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
면역요법의 일 양태에서, 종양 세포는 표적화가 용이한, 즉 대부분의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 보유한다. 많은 종양 마커가 존재하며, 이들 중 임의의 것이 본 실시양태의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커는 CD20, 암태아성 항원, 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 양태는 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합하는 것이다. 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예컨대 FLT3 리간드를 포함한 면역 자극 분자가 또한 존재한다.
현재 조사 중에 있거나 사용 중에 있는 면역요법의 예는 면역 보충제, 예를 들어 소결핵균(Mycobacterium bovis), 열대말라리아원충(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, Infect Immun., 66(11):5329-36(1998); Christodoulides et al., Microbiology, 66(11):5329-36(1998)); 사이토카인 요법, 예를 들어 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF(Bukowski et al., Clin Cancer Res., 4(10):2337-47 (1998); Davidson et al., J Immunother.,21(5):389-98(1998); Hellstrand et al., Acta Oncol. 37(4):347-53(1998)); 유전자 요법, 예를 들어 TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(Qin et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95(24):14411-6(1998); Austin-Ward and Villaseca, Rev Med Chil, 126(7):838-45 (1998); 미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 단클론성 항체, 예를 들어 항-PD1, 항-PDL1, 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185(Topalian et al., The New England journal of medicine, 366:2443-2454 (2012); Brahmer et al., The New England journal of medicine 366:2455-2465 (2012); Hollander, Front Immunol (2012): 3:3. doi: 10.3389/fimmu.2012.00003; Hanibuchi et al., Int J Cancer, 78(4):480-5(1998); 미국 특허 제5,824,311호)이며; 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 항-glycPD-1 항체 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드 사용을 포함하는 본원에 개재된 요법과 함께 하나 이상의 항암 요법이 이용될 수 있다.
수술
암에 걸린 사람 중 약 60 %가 예방, 진단 또는 스테이징(staging), 치유, 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 겪을 것이다. 치유 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제, 및/또는 파괴되는 절제술을 포함하고, 다른 요법, 예컨대 본 실시양태의 치료, 면역요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법, 및/또는 대안적 요법과 콘쥬게이트되어 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경-제어 수술(모즈 수술(Mohs' surgery))을 포함한다.
암성 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 신체 내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 추가 항암 요법을 이용한 상기 구역의 관류, 직접 주사, 또는 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5 주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 투여량을 이용한 치료일 수 있다.
다른 약제
치료의 치료 효능을 개선하기 위해 본 실시양태의 특정 양태와 조합되어 다른 약제가 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 이들 추가 약제는 세포 표면 수용체와 갭 연결부(GAP junction)의 상향조절에 영향을 미치는 약제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 세포사멸 유도물질에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 약제, 또는 다른 생물학적 약제를 포함한다. 갭 연결부의 수의 증가에 의한 세포내 시그널링의 증가는 인접한 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료의 항-과증식성 효능을 개선하기 위해 본 실시양태의 특정 측면과 조합되어 세포증식억제제 또는 분화제가 사용될 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 실시양태의 효능을 개선하는 것으로 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 초점 접착 키나아제(focal adhesion kinase)(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 다른 약제, 예컨대 항체 c225가 치료 효능을 개선하기 위해 본 실시양태의 특정 양태와 조합되어 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
키트 및 진단법
다양한 양태에서, 본원은 치료제 및/또는 다른 치료제 및 전달제를 함유한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에서 제공된 요법을 제조 및/또는 투여하기 위해 고려된다. 키트는 본원에서 제공된 임의의 약학 조성물을 함유한 1 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 키트는, 예를 들어 적어도 항-glycPD-1 항체, 또는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드뿐 아니라, 본원에서 제공된 성분을 제조, 제형화, 및/또는 투여하거나 본원에서 제공된 방법의 1 이상의 단계를 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 항-glycPD-1 항체 및 적어도 1 개의 보조 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 글리코실화된 PD-1 폴리펩티드 및 적어도 1 개의 보조 시약을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 제2 항암제를 추가로 포함한다. 상기 제2 항암제는 화학요법제, 면역요법제, 호르몬 요법제, 또는 사이토카인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 에펜도르프 튜브(eppendorf tube), 에세이 플레이트, 시린지, 병, 또는 튜브와 같이, 키트의 성분과 반응하지 않는 용기인 적합한 용기 수단을 포함할 수 있다. 용기는 살균 가능한 물질, 예컨대 플라스틱 또는 유리로 이루어질 수 있다.
키트는 본원에 기재된 방법의 절차적 단계의 개요를 설명하고, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 바와 실질적으로 동일한 절차를 따를 지시 시트를 추가로 포함할 수 있다. 지시 정보는 컴퓨터를 사용해 실행될 때, 본원에서 제공된 항체 또는 폴리펩티드의 약학적 유효량을 전달하는 실제 또는 가상 절차의 디스플레이를 야기하는, 기계-판독 가능한 지시를 함유한 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에 있을 수 있다. 키트는 또한 약제 또는 생물학 제품의 제조, 사용 및 판매를 관리하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지를 포함할 수 있으며, 상기 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
실시예
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 및 정신을 실질적으로 변화시키지 않는 변형이 또한 고려되는 것으로 이해된다. 따라서, 다음 실시예는 예시하기 위한 것이지만, 어떤 방식으로든 제한하지 않는 것으로 의도된다.
재료 및 방법
세포 배양, 안정된 형질감염체, 및 형질감염. 모든 세포를 아메라칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 얻었다. 이들 세포를 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)이 보충된 DMEM/F I 2 또는 RPMI I 640 배지에서 성장시켰다. 퓨로마이신(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 사용하여 HEK293T 세포 내의 PD-I 안정된 형질감염체를 선택하였다. 일시적 형질감염을 위해, SN 리포좀(Hu, M. C. et al., 2004, Cell, 117:225-237) 리포펙타민TM 2000 및 리포펙타민 LTX(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 DNA, 예컨대 PD-I을 코딩하는 DNA로 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
렌티바이러스 감염을 사용한 안정된 세포의 생성. PD-1 유전자를 Origene(rockville, MD, USA)에서 구매하고, 알려진 분자 생물학 기법을 사용하여 pCDH 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝시켜, PD-1-Flag 발현 세포주를 수립하였다. pCDHI PD-1-Flag 발현 벡터를 주형으로 사용하여, 부위 특이적 돌연변이유발을 수행함으로써 PD-1-Flag NQ 돌연변이체 N49Q, N58Q, N74Q, N116Q, 및 4NQ(N49Q/N58Q/N79Q/N116Q)를 생성하였다. 모든 구축물을 효소 분해 및 DNA 서열결정을 사용하여 확인하였다. 안정된 세포를 발현하는 PD-1을 생성하기 위해, 리포펙타민 LTX 형질이입 시약을 이용하여 혈장을 293T 세포 내로 형질이입시켰다. 형질이입한지 24 시간 이후에, 배지를 교환하고, 이어서 상기 배지를 24 시간 간격으로 수집하였다. 렌티바이러스를 함유하는 수집된 배지를 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고, 0.45-μm 필터를 통해 여과하였다. 세포를 감염 12 시간 전에 50 % 콘플루언스(confluence)로 시딩하고, 배지를 렌티바이러스를 함유한 배지로 교체하였다. 24 시간 동안의 감염 후, 배지를 신선한 배지로 교체하였으며, 감염된 세포를 1 ㎍/mL 퓨로마이신(InvivoGen)을 사용하여 선택하였다.
면역블롯 분석, 면역세포화학 및 면역침강. 면역블롯 분석을 이전에 기재된 바(Lim et al., 2008, Gastroenterology, 135:2I 28-40; and Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455)와 같이 수행하였다. Bio-Rad ChemiDoc 영상화 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA. USA)을 사용하여 이미지 획득 및 밴드 강도의 정량화를 수행하였다. 면역세포화학을 위해, 세포를 실온에서 15 분 동안 4 % 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 5 % Triton X- 100에서 5 분 동안 투과시켰으며, 이어서 1 차 항체를 사용하여 염색하였다. 사용된 2 차 항체는 항-마우스 AlexaFluor 488 또는 594 염료 콘쥬게이트 및/또는 항-토끼 Alexa Fluor 488 또는 594 염료 콘쥬게이트(Life Technologies)였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI 블루)(Life Technologies)을 사용하여 핵을 염색하였다. 장착 후에, 다광자 공초점 레이저-주사 현미경(Nikon A1+, Melville, NY, USA)을 사용하여 세포를 시각화하였다.
유세포분석. PD-1 야생형 및 돌연변이체 단백질 또는 대조군 벡터를 과잉발현하는 세포를 트립신처리에 의해 단리시키고, 세포 염색 완충제(Cell Staining Buffer)(CSB)(BioLegend, San Diego, CA, US)에서 2x106 세포/mL로 수집하였다. 50 μL의 세포를 96 웰 둥근-바닥 플레이트에 소분하고, 여기에 50 μL의 20 ㎍/mL 1 차 항체를 첨가하였으며, 이어서 부드럽게 혼합하고, 어둠 속 4 ℃에서 1 시간 인큐베이션하였다. 세포를 CSB로 세척하고, 어둠 속 21 ℃에서 30 분 동안 DAPI(1:100)를 이용하여 항-마우스 IgG-PE 콘쥬게이트(10 ㎍/mL)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, Guava EasyCyte HT(Millipore Darmstadt, DE) 또는 FACS Celesta(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US) 유세포분석기를 사용하여 데이터를 획득하였다.
PD-L1 및 PD-1(PD-L1/PD-1) 상호작용 에세이. PD-1 단백질과 PD-L1 단백질의 상호작용을 측정하기 위해, PD-1 발현 세포를 실온에서 15 분 동안 4 % 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 이어서 재조합 인간 PD-L1-Fc 키메라 단백질(R&D Systems)과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 사용된 2 차 항체는 항-인간 Alexa Fluor 488 염료 콘쥬게이트(Life Technologies)였다. 이어서, 실시간 현미경 IncuCyte(Essen BioScience, Ann Arbor, Michigan, USA)를 사용하여 Alexa Fluor 488 염료의 형광 강도를 모니터링하였다.
옥텟(Octet)에 의한 KD 결정 및 비닝(binning). 고-처리량 KD 스크리닝을 위하여, 20 nM 용액을 통해 항체 리간드를 센서에 로딩시켰다. 1 mg/mL 소태아혈청 알부민(에세이 완충액)을 함유한 PBS에서 베이스라인을 수립하고, 센서를 에세이 완충액 내의 단일 농도의 피분석물 내로 침지시킴으로써 연합 단계를 수행하였다. 해리를 수행하고 신선한 에세이 완충액에서 모니터링하였다. 모든 실험을 1,000 rpm의 센서 쉐이킹과 함께 수행하였다. 데이터를 1:1 결합 모델에 맞추어 연합 비율 및 해리 비율을 추출하기 위해 ForteBio의 데이터 분석 소프트웨어를 사용하였다. 비 kd/ka를 사용하여 KD를 계산하였다. 전형적인 에피토프 비닝 에세이에서, 항원 PD-1-His(10 nM)를 2 차 항체(10 nM)와 함께 1 시간 동안 실온에서 예비 인큐베이션하였다. 대조군 항체(20 nM)를 AMC 센서(ForteBio) 상에 로딩하였으며 센서 상의 나머지 Fc-결합 부위는 전체 마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch)로 차단하였다. 상기 센서를 예비 인큐베이션된 항원-2 차 항체 혼합물에 노출시켰다. ForteBio의 데이터 분석 소프트웨어 7.0을 사용하여 원 데이터를 가공하고, 경쟁적 결합에 대해 항체 쌍을 평가하였다. 2 차 항체에 의한 추가 결합은 비어있는 에피토프(비-경쟁자)를 나타내는 한편, 무결합은 에피토프 차단(경쟁자)을 나타낸다.
PD-1의 글리코실화 분석. PD-1 단백질의 글리코실화를 확인하기 위해, 제조사에 의해 기재된 바와 같이 NGase F, Endo H, 0-글리코시다아제(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) 효소를 이용하여 세포 용해물을 처리하였다.
통계 분석. 막대 그래프에서의 데이터는 3 개의 독립 실험의 표준 편차를 이용하여 미치료 그룹 또는 대조군 그룹에 비교한 평균 배수 변화를 나타낸다. SPSS(Ver. 20, SPSS, Chicago, IL)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 스피어만 상관관계(Spearman's correlation) 및 만-위트니 검정(Mann­Whitney test)을 사용하여 단백질 발현과 BLBC 서브세트(subset) 사이의 상관관계를 분석하였다. 실험 데이터에 대하여 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 수행하였다. AP 값 < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
실시예 1: PD-L1에 대한 글리코실화된 PD-1의 결합.
N49, N58, N79 및 N116에서 글리코실화를 갖는, 야생형 PD-1을 발현하는 293T 세포 및 글리코실화를 차단하기 위해 이들 위치 모두에서 아스파라긴이 글루타민으로 치환된 돌연변이체 PD-1을 발현하는 293T 세포를 이용한 PD-1/PD-L1 결합 에세이를 이용하여 PD-L1에 대한 결합에서 PD-1의 글리코실화의 역할을 시험하였다. 따라서, 돌연변이체 4NQ는 N49Q/N58Q/N79Q/N116Q이다. 세포를 형광-표지된 PD-L1-Fc 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 제조사의 지시에 따라, 매시간 마다 IncuCyteTMZoom에 의해 리간드 및 수용체 결합을 정량화하였다. 도 1a는 야생형, 즉 글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포가 PD-L1-Fc 융합 단백질에 의해 녹색으로 염색된다는 것을 나타낸다. 반면에, 도 1b는 표지된 PD-L1-Fc 융합 단백질이 글리코실화되지 않은 4NQ 돌연변이체 PD-1을 발현하는 세포에 결합하지 않음을 나타낸다. 도 1c는 24 시간에 걸친 야생형, 글리코실화된 PD-1-발현 세포 및 4NQ 돌연변이체, 비글리코실화된 PD-1-발현 세포에 대한 녹색 염색의 수준을 그래프화한다. 야생형, 글리코실화된 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1-Fc의 결합은 24 시간에 걸쳐 증가하는 한편, 4NQ, 비글리코실화된 돌연변이체 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1-Fc 결합은 무시할 수 있다. 상기 실험은 PD-L1이 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 더 큰 친화성으로 결합한다는 것을 나타낸다.
글리코실화가 PD-1-PD-L1 결합을 위해 필요한지 여부를 결정하기 위해, 공동-면역침강 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여, PD-1 WT 또는 4NQ 발현 293T 세포에서 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 평가하였다. PD-1 WT 및 4NQ 발현 293T 세포의 용해물을 PD-L1/Fc 융합 단백질과 함께 또는 PD-L1/Fc 융합 단백질 없이 인큐베이션하고, 이어서 항-Flag 수지로 PD-1 단백질을 면역침강시켰으며, 항-인간 IgG-HRP를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하여, PD-1 단백질을 검출하기 위한 PD-L1/Fc 및 항-Flag 항체를 검출하였다. 도 1d에 도시된 바에 있어서, PD-1에 대한 PD-L1의 결합(항-hIgG-HRP 항체에 의해 상부 행에서 검출됨)은 PD-L1/Fc를 야생형, 글리코실화된 PD-1과 함께 인큐베이션하였을 때 관찰되지만, PD-L1/Fc를 비글리코실화된 4NQ PD-1 돌연변이체와 함께 인큐베이션하였을 때에는 그렇지 않다. 항-FLAG 항체는 야생형 및 4NQ PD-1 단백질 둘 다 및 대조군으로서 PD-L1/Fc를 검출하였다. 상기 결과는 글리코실화가 PD-L1 및 PD-1 연합을 위해 필요하다는 것을 지지한다.
실시예 2: 항-PD-1 항체의 생성
표준화된 프로토콜에 따라, SP2/0 마우스 골수종 세포와 인간 PD-1-면역화된 BALB/c 마우스(n=6)(Antibody Solutions, Inc., Sunnyvale, CA, USA)로부터 단리된 비장 세포의 융합에 의해, 글리코실화된 인간 PD-1에 대해 생성된 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻었다. 융합 전에, 면역화된 마우스로부터의 혈청은 FACS 분석을 이용하여 PD-1 면역원에 대한 결합에 대하여 확인되었다. 단클론성 항체(MAb)-생성 하이브리도마를 생성하였다. 항체를 생성했던 하이브리도마를 특이성에 대해 다시 시험하였다.
이를 위하여, 100 개를 초과하는 후보 MAb-생성 하이브리도마를 선택하고, ADCF 배지에서 성장시켰으며, 그것들의 단클론성 항체-함유 상청액을 농축 및 정제하였다. 비글리코실화된 PD-1과 비교하여 글리코실화된 PD-1에 대한 우선적 결합에 대하여 후보 단클론성 항체를 스크리닝하였다. PD-1 WT(완전 글리코실화됨)을 과잉발현하는 T293 세포를 비오틴으로 태깅(tagged)하고, 이어서 완전히 비글리코실화된 PD-1을 과잉발현하는 T293 세포와 혼합하였다. 혼합된 세포를 PD-1에 대한 1 차 항체와 함께 인큐베이션하고, FITC와 콘쥬게이트된 2 차 항체로 추가로 세척하였다. 세척 이후에, 형광 강도(MFI)를 측정하여, 글리코실화되거나 비글리코실화된 PD-1에 결합된 막에 대한 항체의 상대적 결합을 평가하였다. 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 대하여 상당히 높은 MFI를 나타내는 항체는 항-glycPD-1 항체로 확인되었다.
정제된 MAb를 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용(PD-L1/PD-1 결합 상호작용)을 중화하거나 억제하는 그것의 능력에 대해 생존 세포 이미징 에세이, IncucyteTM(Essen Bioscience)를 사용하여 시험하였다. 이 에세이를 위해, PD-1을 발현하는 293T 세포를 항-인간 PD-1 항체 및 형광-표지된 PD-L1-Fc 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 제조사의 지시에 따라, 매시간 마다 IncuCyteTMZoom에 의해 리간드 및 수용체 결합을 정량화하였다.
2 개의 항-glycPD-1 항체가 비글리코실화된 PD-1, STM413 및 STM432에 비해 글리코실화된 PD-1에 우선적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열이 표 3에서 제공된다. BIACORE® 에세이를 사용하여 글리코실화된 PD-1에 대한 결합 동역학에 대하여 항체를 특징화하였다. 결과는 하기 표 6에서 제공된다.
표 6. PD-1에 결합하는 항-glyc-PD-1 항체의 BIACORE 에세이
글리코실화된 PD-1 펩티드 단편에 대한 고-질량 MALDI 분석을 사용하여 글리코실화된 PD-1 상의 STM418 에피토프를 항체-항원 가교 결합에 의해 결정하였다. 항체의 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124로부터의 글리코실화된 PD-1의 영역을 포함하는 것으로 결정되었다:
(서열번호 1의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124), 여기서 항체-항원 가교 결합 실험에 의해 확인된 결합 접촉은 서열번호 1의 위치 36, 38, 51, 53, 55, 109, 115, 118 및 121에 밑줄로 표시된다.
글리코실화된 PD-1 상의 STM432 에피토프는 고-질량 MALDI 분석을 사용하여 항체-항원 가교 결합에 의해 결정하였다. 에피토프는 인간 PD-1 서열에서 다음과 같이 확인되었다.
(서열번호 1의 아미노산 91 내지 107 및 123 내지 134). 에피토프는 서열번호 1에서 PD-1의 아미노산 서열의 위치 D91로부터 위치 M107까지 및 이어서 위치 C123로부터 위치 I134까지 걸쳐있다. 밑줄 친 위치, R95, R103, S127 및 K131은 PD-1 항원에 대한 가교 결합을 나타내는 위치이다.
단클론성 항체 STM418 및 STM432를 글리코실화된 야생형 및 돌연변이체 PD-1-Fc에 대한 결합에 대하여 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 시험하였으며, 이때 돌연변이체 PD-1 단백질은 아스파라긴(N)이 글루타민(Q)으로 돌연변이 되는 것에 의해 제거된 1 이상의 글리코실화 부위를 가졌고, 야생형 PD-1은 글리코실화를 효소적으로 제거하기 위해 PNGase F로 처리되었다. 0.5 ㎍의 각각의 PD-1-Fc 단백질(야생형 및 돌연변이체 N49Q, N58Q, 및 N74Q) 및 PNGase F 처리된 야생형 PD-1을 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였으며, 염소-항-마우스 2 차 항체로 검출되는, STM418 및 STM432로 탐지하였다. 도 2는 STM418이 글리코실화된 야생형 PD-1 및 위치 49 및 58의 글리코실화 부위에 대한 돌연변이체인 PD-1(즉, 위치 74 및 116에서 글리코실화됨)에 결합하지만, 위치 74에 돌연변이체 글리코실화 부위를 갖는 PD-1 또는 PNGase F를 이용한 처리에 의해 탈글리코실화되었던 야생형 PD-1에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. STM432는 야생형 글리코실화된 PD-1 및 위치 58에 돌연변이체 글리코실화 부위를 갖는 PD-1에는 결합하지만, 위치 49 또는 위치 74에 돌연변이체 글리코실화 부위를 갖는 PD-1 또는 PNGase F를 이용한 처리에 의해 탈글리코실화되었던 야생형 PD-1에는 결합하지 않는다.
야생형 PD-1, 돌연변이체 PD-1 단백질을 발현하는 293T 세포 또는 대조군 293T 세포에 대한 항-glycPD-1 항체의 결합을 유세포분석을 사용하여 평가하였다. 야생형 PD-1, N49Q PD-1, N58Q PD-1, N74Q PD-1, N116Q PD-1, 및 4NQ PD-1(위치 49, 58, 74, 및 116에서 N을 Q로 치환한 돌연변이체)을 발현하는 293T 세포, 및 PD-1을 발현하지 않는 293T 세포에 대한 STM418 및 STM432의 결합을 평가하였다. 도 3a 및 3b는 항-glycPD-1 항체 또는 대조군 및 형광 표지된 2 차 항체와의 인큐베이션 이후에, MFI로 측정되거나 형광 강도로 측정된 세포의 유세포분석 결과를 나타낸다. 도 3c는 대조군 마우스 IgG의 인큐베이션으로부터의 결과를 나타낸다. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 단백질을 발현하는 세포 및 대조군 세포에 대한 항-glycPD-1 항체 및 대조군 항체의 결합에 대한 MFI를 하기 표 7에 나타낸다. 데이터는 STM418이 비글리코실화된 4NQ 돌연변이체 PD-1에 대한 결합에 대한 MFI에 비해 약 128 배 큰 MFI로 야생형, 글리코실화된 PD-1에 결합하고, STM432가 비글리코실화된 4NQ 돌연변이체 PD-1에 대한 결합에 대한 MFI에 비해 약 43 배 큰 MFI로 야생형, 글리코실화된 PD-1에 결합함을 나타낸다.
표 7. PD-1 발현 세포에 결합하는 항-GlycPD-1 항체에 대한 MFI 값
실시예 3. 항-GlycPD-1 항체 중화 활성
항체에 의한 PD-1 및 PD-L1 단백질 상호작용의 억제를 측정하기 위해, PD-1을 과잉발현하는 293T 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, STM418 또는 STM432 항체, 재조합 인간 PD-L1-Fc 단백질 및 항-인간-Fc Alexa Fluor 488 염료 콘쥬게이트(Life Technologies, Carlsbad, CA, US)와 함께 인큐베이션하였다. 녹색 형광을 2 시간 마다 IncuCyteTM Zoom 장치에 의해 측정하였으며, IncuCyteTM Zoom 소프트웨어(Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA)에 의해 정량화하였다. 도 4a는 0.03 ㎍/mL 내지 4.0 ㎍/mL의 항-glycPD-1 항체 STM418 농도의 존재시 18 시간에 걸친 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1-Fc의 결합을 나타낸다. STM418은 농도 의존성 물질에서 PD-1 발현 세포에 대한 PD-L1-Fc 결합을 억제한다. 도 4b는 0.132 ㎍/mL의 EC50을 계산하기 위한 STM418의 농도 대 PD-1-PD-L1 결합의 퍼센트 활성을 표시한다. 도 5a는 0.03 ㎍/mL 내지 4.0 ㎍/mL의 항-glycPD-1 항체 STM432 농도의 존재시 18 시간에 걸친 PD-1-발현 세포에 대한 PD-L1-Fc의 결합을 나타낸다. STM432는 농도 의존성 방식으로 PD-1 발현 세포에 대한 PD-L1-Fc 결합을 억제한다. 도 5b는 0.110 ㎍/mL의 EC50을 계산하기 위한 STM432의 농도 대 PD-1-PD-L1 결합의 퍼센트 활성을 표시한다.
실시예 4. T 세포 사멸에 대한 항-GlycPD-1 항체의 효과
T 세포 존재 하에서의, 암 세포에 대한 항-glycPD-1 항체의 효과를 평가하기 위해, T 세포를 자성 αCD3-단리 항체 키트에 의해 인간 PBMC로부터 단리시키고, 이어서 αCD3 항체 100 ng/mL 및 IL-2 10 ng/mL와 함께 72 시간 동안 인큐베이션함으로써 활성화하였다. RPMI 1640과 함께 10 ㎍/mL STM418, STM432 항체 또는 대조군으로서 mIgG1 아이소타입이 있는 96-웰 플레이트에서 NucLight Red Lentivirus 시약(Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA)으로 표지된 예비 시딩된 BT549 암 세포에 활성화된 T 세포를 첨가하였다. 암 세포의 T 세포 사멸은 Incucyte Zoom(Essen Biosciences)을 사용하여 Incucyte Zoom 2016 소프트웨어에 의해 계산된 적색 핵 이미지 수(증식)에 의해 시간에 걸쳐 검출하였다. 도 6은 대조군 마우스 IgG 아이소타입과 함께 인큐베이션된 활성화된 T 세포 존재 하의 암 세포와 비교하여 활성화된 T 세포 및 STM418 또는 STM432 항체 존재 하의 90 시간에 걸친 암 세포 증식 감소를 나타낸다.
실시예 5: 항체 인간화
상기 기재된 바에 있어서, 예를 들어 인간 질환의 생체내 치료에서의 사용을 포함한 특정 목적을 위해, 마우스 단클론성 항체의 인간화된 유도체를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 인간화된 항체를 형성하기 위해, 마우스 단클론성 항체의 프레임워크 서열("부모" 서열)은 프레임워크 서열에서의 차이를 확인하기 위해 우선 "억셉터" 인간 항체 세트의 프레임워크 서열과 정렬된다. 인간화는 부모와 억셉터 사이의 비-매칭 프레임워크 잔기를 치환함으로써 성취된다. 버니어 영역(Vernier zone) 내의 위치, VH/VL 사슬간 인터페이스 또는 CDR 표준 클래스 결정 위치와 같은 잠재적으로 중요한 위치에서의 치환을 유망한 복귀 돌연변이에 대해 분석하였다(Foote, J. et al., J. Molec . Biol. 224:487-499 (1992) 참고).
각각의 아미노산 사슬의 도메인 함량 및 각각의 도메인의 대략적인 경계를 결정하기 위해 보존 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database)(COD)(Marchler-Bauer, et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:D225-D229)를 사용할 수 있다. 가변 도메인 경계는 몇몇의 일반적으로 사용되는 정의(Kabat, E. A. et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Honegger, A. et al., J. Molec . Biol. 309(3):657-670 (2001))에 따른 CDR의 경계를 따라 정확하게 결정될 수 있다.
마우스 및 인간 생식세포 서열에 대한 부모 서열의 다중 정렬을 MAFFT(Katoh, K. et al., Nucleic Acids Res. 30: 3059-3066 (2002))를 사용하여 생성하고, 각각의 정렬에서의 엔트리(entry)를 부모 서열에 대한 서열 동일성에 따라 정렬한다. 기준 세트는 100 % 서열 동일성으로 모으고 중복되는 엔트리를 배제함으로써 고유한 서열 세트로 된다.
최적의 억셉터 프레임워크 선택은 양측 사슬의 프레임워크에 걸친 억셉터에 대한 전체 부모 항체 서열 동일성을 기본으로 한다; 그러나, VH/VL 사슬간 인터페이스를 구성하는 위치가 특히 관심 대상이다. 또한, 어떤 생식세포 프레임워크가 동일한 양쪽 인터페이스 잔기를 가지며 유사한 CDR-루프 입체구조를 지지하는 것으로 알려져 있는지를 결정하기 위해, 5 개의 CDR에 대해 정의되었던 표준 구조의 개별 세트에 관여하는 CDR-루프 길이 및 CDR 위치(Chothia, C. et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987); Martin, A. C. et al., J. Molec . Biol 263:800-815 (1996); Al-Laziniki, B. et al., J. Molec . Biol. 273:927-948(1997))를 생식세포와 비교한다.
인간 생식세포에 대한 부모 항체의 서열 정렬을 기본으로 하여, 가장 인접한 매칭 엔트리를 확인한다. 바람직한 인간 생식세포의 선택은 다음에 정렬된 기준을 기본으로 한다: (1) 프레임워크에 걸친 서열 동일성; (2) 동일하거나 양립 가능한 사슬간 인터페이스 잔기; (3) 부모 CDR 표준 입체구조를 갖는 지지 루프; (4) 중쇄 생식세포 및 경쇄 생식세포의 조합은 발현된 항체에서 발견됨; 및 (5) 제거되어야 하는 N-글리코실화 부위의 존재.
인간화된 항체의 Fv-영역의 구조 모델을 생성한다. FR 및 CDR에 대한 후보 구조 주형 단편뿐 아니라 완전 Fv를, 표적에 대한 그것들의 서열 동일성뿐 아니라, 옹스트롬(Angstroms)(Å) 단위의 분해능(resolution)과 같은 주형 구조의 질적 결정학적 수단을 기본으로 하여 항체 데이터베이스로부터 스코어링하고, 등급화하며, 선택한다.
FR 주형에 대해 CDR을 구조적으로 정렬하기 위해, CDR의 측쇄 상의 5 개 잔기를 CDR 주형에 포함시킨다. 단편의 정렬은 중첩하는 절편 및 생성된 구조 서열 정렬을 기본으로 하여 생성된다. 정렬에 따른 주형 단편은 MODELLER(SalI, A. et al.; J. Molec . Biol. 234:779-815(1993))에 의해 가공하였다. 이 프로토콜은 정렬된 구조 주형의 세트로부터 유래된 입체구조 제약(conformational constraint)을 생성한다. 상기 제약을 충족하는 구조 앙상블은 공역 경사법(conjugate gradient) 및 모의 어닐링 최적화 절차에 의해 생성한다. 단백질 구조의 점수 및 입체구조 제약의 충족으로부터 유래된 에너지 점수를 기본으로 하여 이 앙상블로부터 모델 구조를 선택한다. 모델을 점검하고, 표적과 주형 사이에 상이한 위치의 측쇄가 측쇄 최적화 알고리즘 및 최분해된 에너지를 사용하여 최적화한다. CDR 입체구조 가변성, 국소 패킹 및 표면 분석을 평가하여, 1 이상의 바람직한 모델을 선택하기 위해 시각화 및 계산 도구 세트를 사용한다.
부모 항체의 구조 모델을 구축하고, 좋지 않은 원자 충전율; 결합 길이, 결합 각 또는 이면각에서의 변형과 같은 결합에 대해 점검한다. 이들 결함은 항체의 구조적 안정성에 관한 잠재적 문제점을 나타낼 수 있다. 모델링 프로토콜은 상기 결함의 최분해를 추구한다. 인간화된 Fv의 최초 구조 모델은 모든 안전한 치환(즉, 결합 친화성 또는 안정성에 영향을 미치지 않는 치환) 및 신중한 치환(즉, 위치 치환이 이루어지나, 그 위치가 결합 친화성에 대해 중요할 수 있음)을 함유한다. 결합 친화성 감소 또는 안정성 감소의 위험과 연관된 것으로 여겨지는 위치에서의 치환은 변경되지 않는다. 모 항체의 가깝게 매칭된 변이체 모델 보다는 우수한 독립형 모델을 생성하기 위해 모 주형 조사와 별도로 주형 검색 및 선택을 수행한다. 잠재적 치환의 평가가 수행됨에 따라, 상기 모델은 업데이트되어, 바람직한 치환 및 복귀 돌연변이의 효과를 반영한다.
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본 출원서를 통틀어, 다양한 간행물이 참조되었다. 이들 간행물의 개시 내용은 본 발명이 존재하는 업계의 상태를 더욱 완전하게 기재하기 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원은 특정 특별한 실시양태의 예를 제공하는 한편, 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 상기 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM STCUBE, INC. <120> ANTIBODIES SPECIFIC TO GLYCOSYLATED PD-1 AND METHODS OF USE THEREOF <130> 24258.105005PCT <140> <141> <150> 62/262,303 <151> 2015-12-02 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 2 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attattgtac aagctattac 300 tacgggattg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaattact gatttactgg gcatccaccc ggcaaactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagag tatactctca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa cattatagca ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Ser Gly Gly Gly Gly Asn 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Tyr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Thr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Lys Ala Ser Gln Asp Tyr Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Trp Ala Ser Thr Arg Gln Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Trp 1 5 <210> 22 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gaagtgatgc tggtggagcc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtgctaa cacctactat 180 ccagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagatatggt 300 tacgacacgg tctttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Glu Val Met Leu Val Glu Pro Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Asp Thr Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gaaggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat gattatggca ttggttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggtcagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggtgg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gcggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Met Val Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala Tyr 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ser Gly Gly Gly Ala Asn 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Tyr Gly Tyr Asp Thr Val Phe Ala Tyr 1 5 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ala Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Ala Arg Tyr Gly Tyr Asp Thr Val Phe Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly Ile Gly Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Thr Thr Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Asp Asp Tyr Gly Ile Gly Phe Met Asn Trp Phe 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Gln Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 42 His His His His His His 1 5

Claims (39)

  1. 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체로서,
    Chothia CDR 시스템에 따른 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    AbM CDR 시스템에 따른 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    Kabat CDR 시스템에 따른 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    Contact CDR 시스템에 따른 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3
    을 포함하는 VH 도메인을 포함하고,
    Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 시스템에 따른 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR L1, L2 및 L3; 또는
    Contact CDR 시스템에 따른 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR L1, L2 및 L3
    을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  2. 비글리코실화된 PD-1에 비해 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체로서,
    Chothia CDR 시스템에 따른 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    AbM CDR 시스템에 따른 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    Kabat CDR 시스템에 따른 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3; 또는
    Contact CDR 시스템에 따른 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR H1, H2 및 H3
    을 포함하는 VH 도메인을 포함하고,
    Chothia, AbM 또는 Kabat CDR 시스템에 따른 서열번호 36, 서열번호 37 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR L1, L2 및 L3; 또는
    Contact CDR 시스템에 따른 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR L1, L2 및 L3
    을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    항체가 비글리코실화된 PD-1에 비해 위치 N49, N58, N74, N116 또는 이의 조합에서 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  4. 제2항에 있어서,
    항체가 비글리코실화된 PD-1에 비해 위치 N49, N58, N74, N116 또는 이의 조합에서 글리코실화된 PD-1에 선택적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    항체가 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd보다 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  6. 제2항에 있어서,
    항체가 비글리코실화된 PD-1에 대해 나타낸 Kd보다 10 배 적은 Kd로 글리코실화된 PD-1에 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  7. 제1항에 있어서,
    형광 표지에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 항체가, 유세포분석 에세이에서 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 결합하는 항체가 나타낸 측정된 형광 강도(measured fluorescence intensity)(MFI)에 비해 10 배 내지 50 배 높은 MFI로 글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  8. 제2항에 있어서,
    형광 표지에 의해 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 항체가, 유세포분석 에세이에서 비글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 결합하는 항체가 나타낸 측정된 형광 강도(measured fluorescence intensity)(MFI)에 비해 10 배 내지 50 배 높은 MFI로 글리코실화된 PD-1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  9. 제1항에 있어서,
    항체가 N49, N58, N74 또는 N116 중 1 이상에서 PD-1의 글리코실화를 마스킹하는, 단리된 단클론성 항체.
  10. 제2항에 있어서,
    항체가 N49, N58, N74 또는 N116 중 1 이상에서 PD-1의 글리코실화를 마스킹하는, 단리된 단클론성 항체.
  11. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 34 내지 44, 49 내지 59 및 104 내지 124를 포함하고 서열번호 1의 위치 36, 38, 51, 53, 55, 109, 115, 118 및 121의 아미노산과 접촉하는 글리코실화된 PD-1의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  12. 제2항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 91 내지 107 및 123 내지 134를 포함하고 서열번호 1의 위치 95, 103, 127 및 131의 아미노산과 접촉하는 글리코실화된 PD-1의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 단클론성 항체.
  13. 제1항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  14. 제2항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인이 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  15. 제1항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  16. 제2항에 있어서,
    VH 도메인이 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  17. 제1항에 있어서,
    VL 도메인이 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  18. 제2항에 있어서,
    VL 도메인이 서열번호 25의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 프레임워크 영역(human framework region)을 갖는, 단리된 단클론성 항체.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 불변 도메인을 포함하는, 단리된 단클론성 항체.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 IgG, IgM, IgA 또는 이의 항원 결합 단편인, 단리된 단클론성 항체.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv 또는 단일 도메인 항체인, 단리된 단클론성 항체.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간 또는 인간화된 항체인, 단리된 단클론성 항체.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 이미징제(imaging agent), 화학요법제, 독소 또는 방사성핵종에 콘쥬게이트되는(conjugated), 단리된 단클론성 항체.
  25. 약학적으로 허용 가능한 담체 내에 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물.
  26. 약학적으로 허용 가능한 조성물 내 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 단클론성 항체의 유효량을 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    암이 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 대장암, 직장암 또는 피부암인 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    정맥내, 피부내, 종양내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여를 위한 것인 약학 조성물.
  29. 제26항에 있어서,
    항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  30. 제26항에 있어서,
    펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, 아벨루맙 또는 이필리무맙을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  31. 제26항에 있어서,
    비글리코실화된 PD-L1에 비해 글리코실화된 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항-PD-L1 항체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  32. 제26항에 있어서,
    항-글리코실화된 PD-L1 단클론성 항체의 인간화되거나 키메라화된 형태를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  33. PD-1-함유 샘플을 제1항 또는 제2항에 따른 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, PD-1 글리코실화를 평가하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    시험관내(in vitro) 방법으로서 추가로 정의된 방법.
  35. 제33항에 있어서,
    샘플이 세포 샘플인 방법.
  36. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
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