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KR102769100B1 - B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자 - Google Patents

B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자 Download PDF

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KR102769100B1
KR102769100B1 KR1020237033451A KR20237033451A KR102769100B1 KR 102769100 B1 KR102769100 B1 KR 102769100B1 KR 1020237033451 A KR1020237033451 A KR 1020237033451A KR 20237033451 A KR20237033451 A KR 20237033451A KR 102769100 B1 KR102769100 B1 KR 102769100B1
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주잔네 카믈러
아나이스 로페즈
헨리크 뮐러
쇠렌 오토센
뤼케 페데르센
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 PAP-연관된 도메인-함유 5(PAPD5) 및 PAP-연관된 도메인-함유 7(PAPD7) 둘 다에 상보적이고, 단일 핵산 분자를 사용할 때, PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현의 억제를 야기하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HBV 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 특이적인 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자{NUCLEIC ACID MOLECULE FOR REDUCTION OF PAPD5 AND PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION}
본 발명은 PAP-연관된 도메인-함유 5(PAPD5) 및 PAP-연관된 도메인-함유 7(PAPD7) 둘 다에 상보적이고, 단일 핵산 분자를 사용할 때, PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현의 억제를 야기하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 B형 간염 바이러스(HBV) 감염, 특히 만성 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 특이적인 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 350 백만으로 추정된 만성 보균자에 관해 전세계적으로 주요한 건강 문제로 남아있다. 약 25%의 보균자는 만성 간염, 경변 또는 또는 간암으로 사망한다. B형 간염 바이러스는 담배에 이어서 두 번째로 가장 중요한 발암 물질이고, 모든 1차 간암의 60 내지 80%를 유발한다. HBV는 HIV보다 100배 더 전염성이다.
HBV는 감싸진, 부분적인 이중-가닥의 DNA 바이러스이다. 조밀한 3.2 kb HBV 게놈은 코어, 중합효소(Pol), 외피 및 X-단백질을 코딩하는 4개의 중첩된 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 이루어진다. Pol ORF는 가장 길고 외피 ORF는 Pol ORF 내에 위치되는 반면, X 및 코어 ORF는 Pol ORF와 중첩된다. HBV의 생명주기는 2개의 주요 사건을 갖는다: 1) 이완 환형 DNA(RC DNA)로부터 폐환형 DNA(cccDNA)의 생성, 및 2) RC DNA를 생성하기 위한 전게놈 RNA(pgRNA)의 역 전사. 숙주 세포의 감염 전에, HBV 게놈은 RC DNA로서 비리온 내에 존재한다. HBV 비리온은 인간 간세포의 표면에 존재하는 음전하 프로테오글리칸에 비특이적으로 결합하고(문헌[Schulze, Hepatology, 46, (2007), 1759-68]), 간세포 나트륨-타우로콜레이트 동반 수송 폴리펩티드(NTCP) 수용체에 대한 HBV 표면 항원(HBsAg)의 특이적 결합을 통해 숙주 세포 내로 들어갈 수 있는 것으로 입증되었다(문헌[Yan, J Virol, 87, (2013), 7977-91]). 모든 HBV 바이러스 mRNA는 캐핑(capping)되고, 폴리아데닐화되고, 이어서 번역을 위해 세포질로 수출된다. 세포질에서, 새로운 바이런의 어셈블리가 개시되고, 초기 pgRNA가 바이러스 Pol로 패키징(packaging)되어 단일 가닥의 DNA 중간체를 경유하여 RC DNA로의 pgRNA의 역전사가 개시될 수 있다.
간세포 및/또는 간내 면역 세포에 의한 HBV 감염에 대응하여 항바이러스 사이토카인의 분비는 감염된 간의 바이러스 제거에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 만성적으로 감염된 환자는 숙주 세포 인지 시스템 및 후속 항바이러스 반응에 대응하는 바이러스에 의해 채택된 다양한 탈출 전략으로 인해 약한 면역 반응만을 보인다.
많은 관찰은, 여러 HBV 바이러스 단백질이 바이러스 인지 신호 시스템을 방해하는 초기 숙주 세포 반응 및 후속 인터페론(IFN) 항바이러스 활성에 대응할 수 있음을 나타냈다. 특히, HBV 비어있는 서브바이러스 입자(SVP, HBsAg)의 과도한 분비는 만성적으로 감염된 환자(CHB)에서 관찰된 면역학적 내성 상태의 유지에 관여하는 것으로 생각된다. HBsAg 및 다른 바이러스 항원에 대한 지속적인 노출은 HBV-특이적 T 세포 결실 또는 점진적인 기능 장애를 야기할 수 있다(문헌[Kondo, Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671]; 문헌[Kondo, Journal of MediCal Virology (2004), 74, 425-433]; 문헌[Fisicaro, Gastroenterology, (2010), 138, 682-93]). 더욱이 HBsAg는 직접적인 상호작용에 의해 면역 세포, 예컨대 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 천연 살해(NK) 세포의 기능을 억제하는 것으로 보고되었다(문헌[Op den Brouw, Immunology, (2009b), 126, 280-9]; 문헌[Woltman, PLoS One, (2011), 6, e15324]; 문헌[Shi, J 바이러스 Hepat. (2012), 19, e26-33]; 문헌[Kondo, ISRN Gasteroenterology, (2013), Article ID 935295]).
HBsAg 정량화는 만성 B형 간염의 진단 및 치료 반응을 위한 유의미한 바이오마커이다. 그러나, HBsAg 손실 및 형질전환의 달성은 만성적으로 감염된 환자에서 드물게 관찰되지만 치료법의 궁극적인 목표 중 하나로 남아있다. 현재 치료법, 예컨대 뉴클레오시드(뉴클레오티드) 유사체는 HBV DNA 합성을 억제하는 분자이지만, HBsAg 수준을 감소시키는 데 관여하지 않는다. 뉴클레오시드(뉴클레오티드) 유사체는, 심지어 장기간의 치료법과 함께, 자연적으로 관찰된 것과 필적할 만한 약한 HBsAg 제거(-1% 내지 2%)만을 나타냈다(문헌[Janssen et al., Lancet, (2005), 365, 123-9]; 문헌[Marcellin et al., N. Engl. J. Med., (2004), 351, 1206-17]; 문헌[Buster et al., Hepatology, (2007), 46, 388-94]). 완전히 또는 부분적으로 통합된 B형 간염 바이러스 DNA가 만성적으로 감염된 개체에서 HBsAg 발현의 원인임이 최근 밝혀졌다(문헌[Wooddell et all 2017 Sci. Transl. Med. Vol 9, Issue 409, eaan0241] 참조).
B형 간염 e-항원(HBV 외피 항원 또는 HBeAg로도 지칭됨)은 B형 간염 감염된 세포에 의해 분비되는 바이러스성 단백질이다. HBeAg는 만성 B형 간염 감염과 연관되고, 활성 바이러스 질병의 마커 및 환자의 전염력의 정도로 사용된다.
B형 간염 바이러스 프리코어(precore) 또는 HBeAg의 기능은 완전히 알려지지 않았다. 그러나, HBeAg는 바이러스 내구력에서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 공지되어 있다. HBeAg는 면역조절 단백질로서 기능함으로써 HBV 만성을 촉진하는 것으로 여겨진다. 특히, HBeAg는 세포내 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키는 것으로 나타난 분비된 부속 단백질이다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). HBeAg는 HBV 내구력에 기여하는 면역 내성원으로서 작용하고, 가용성 HBeAg가 태반을 횡단함을 고려하면 아마도 자궁 내에서 기능할 것이다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 또한, HBeAg는 i) 세포내 신호전달을 제어하는 세포 유전자; 및 ii) 바이러스 감염에 대한 선천적인 면역 반응을 줄이는 Toll-유사 수용체 2(TLR-2)를 하향조절한다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). HBeAg의 부재 하에, HBV 복제는 TLR2 경로의 상향조절과 연관된다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 따라서, HBeAg는 숙주 면역 반응에 영향을 주는 바이러스/숙주 상호작용을 조절하는 데 중요한 역할을 갖는다(문헌[Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141]). 따라서, HBeAg 양성 환자 집단에서 HBeAg의 감소는 HBV 특이적 면역기능장애의 반전을 야기할 수 있다(문헌[Milich, 1997, J. 바이러스. Hep. 4: 48-59]; 문헌[Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021]). 또한, 분비된 HBeAg는 T 세포 내성의 유도에서 세포내 간염 코어 항원(HBcAg)보다 상당히 더 효율적이고, HBeAg와 HBcAg 사이의 분할 T 세포 내성 및 HBc/HBeAg-특이적 T 세포 내성의 클론 이질성은 천연 HBV 감염, 특히 프리코어-음성 만성 간염에 대해 상당한 관련성을 가질 수 있다(문헌[Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027]]).
따라서, HBsAg의 분비에 더해 HBeAg의 감소는 HBsAg 단독의 분비의 억제와 비교하여, 만성 HBV 감염의 발병의 개선된 억제를 야기할 수 있다. 또한, 만성으로의 급성 감염의 최고 전염 속도(80% 초과)가 HBeAg-양성 모체로부터의 모체-태아 및 신생아 HBV 전염의 경우에 보고되었다(문헌[Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592]; 문헌[Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734]; 및 문헌[Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191]). 따라서, 예측된 모체에서의 HBeAg의 감소는 환자의 전염력의 정도를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 자식의 만성 HBV 감염의 발병을 억제할 수 있다.
따라서, HBV의 치료법에서, 바이러스 발현을 억제하기 위한, 특히 HBsAg 및 HBeAg의 분비를 억제하기 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다(문헌[Wieland, S. F. & F. V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80]; 문헌[Kumar et al. J Virol, (2011), 85, 987-95]; 문헌[Woltman et al. PLoS One, (2011), 6, e15324]; 문헌[Op den Brouw et al. Immunology, (2009b), 126, 280-9]).
국제 공개공보 제WO 2017/066712호에서, 텔로미어의 치료 및 진단에 관한 PAPD5의 하향조절이 기술되었다. 이러한 목적을 위한 5개의 shRNA 구조가 기술되었다.
국제 출원 제PCT/EP2017/064980호는 핵산 분자에 의한 PAPD5 또는 PAPD7 표적화 및 HBV 감염의 치료를 위한 이러한 분자의 조합을 개시한다.
발명의 목적
본 발명은 PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 생체내 및 시험관내 발현을 억제할 수 있는 신규한 핵산 분자를 동정한다. 2개의 표적 핵산을 단일 분자로 억제하는 능력은 생산, 표적 세포로의 전달의 단순함, 표적 세포, 약물동태학/약력학(PK/PD)의 단순함, 및 치료적 이익을 달성하는 데 요구되는 농도에 관한 뚜렷한 이점을 갖는다. 또한, 본 발명은 PAPD5 및 PAPD7 녹-다운(knock down)과 HBV 항원 억제, 예컨대 HBsAg 억제 사이에 상관관계가 존재함을 나타낸다.
도 1은 올리고뉴클레오티드가 물결선(A 내지 D) 또는 "올리고뉴클레오티드"(E 내지 H) 또는 T2(I)로 표시되고 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 3가 N-아세틸갈락토사민 모이어티인, 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체를 도시한다. 화합물 A 내지 D는 다이-리신 분지(brancher) 분자 PEG3 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다. 화합물 A 및 B에서, 올리고뉴클레오티드는 연결기 없이 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티에 직접 부착된다. 화합물 C 및 D에서, 올리고뉴클레오티드는 C6 연결기를 통해 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티에 부착된다. 화합물 E 내지 I는 시판 중인 트레블러 분지 분자(trebler brancher molecule) 및 길이 및 구조가 변하는 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다.
도 2는 3가 GalNAc 클러스터(GN2)의 화학식을 도시한다. GN2는 본 발명에서 접합 모이어티로서 유용하다. 물결선은, 예컨대 C6 아미노 연결기로의 또는 직접적으로 올리고뉴클레오티드로의 클러스터의 접합 부위를 나타낸다.
도 3은 실시예 1로부터의 HeLa 세포에서의 PAPD5 및 PAPD7 녹-다운과 실시예 2로부터의 dHepRG 세포에서의 HBsAg 감소 사이의 상관관계를 도시한다.
도 4는 화합물 번호 20_12의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 5는 화합물 번호 20_13의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 6은 화합물 번호 20_14의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 7은 화합물 번호 20_15의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 8은 화합물 번호 20_18의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 9는 화합물 번호 20_36의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 10은 화합물 번호 20_30의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 11은 인간 HeLa 세포주(A) 및 1차 마우스 간세포(PMH, B) 내의 인간 및 마우스 전사체를 표적화하는 올리고뉴클레오티드(표 5)에 의해 달성된 시험관내 PAPD5 및 PAPD7 감소를 도시한다.
도 12는 화합물 번호 20_20의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 13은 화합물 번호 20_21의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 14는 화합물 번호 21_2의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 15는 화합물 번호 20_22의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 16은 화합물 번호 21_33의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 17은 화합물 번호 21_34의 화학식을 도시한다. 이의 약학적인 염은 상기 화합물과 연관된 1가 또는 2가 양이온, 예컨대 Na+, K+ 및 Ca2+, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
도 18은 10 mg/kg의 2개의 올리고뉴클레오티드(하나는 PAPD5를 표적화하고 하나는 PAPD7을 표적화함)에 의한 단일 치료 후 AAV/HBV 마우스 모델에서 시간에 걸친 HBsAg 및 HBeAg에 대한 생체내 효과를 도시한다.
발명의 요약
정의
핵산 분자
본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 또는 "치료용 핵산 분자"는 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 2개 이상의 공유 결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자(즉, 뉴클레오티드 서열)로서 정의된다. 본 발명의 방법에 지칭된 핵산 분자는 일반적으로 50개 미만의 뉴클레오티드 길이의 치료용 올리고뉴클레오티드이다. 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있거나 이를 포함할 수 있거나, 다른 올리고머성 핵산 분자, 예컨대 CRISPR RNA, siRNA, shRNA, 압타머 또는 리보자임일 수 있다. 핵산 분자는 고체-상 화학 합성 및 이어지는 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조되는 조성물이다. 핵산 분자의 서열을 지칭할 때, 공유 결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티의 서열 또는 순서, 또는 이의 변형을 지칭한다. 본 발명의 핵산 분자는 인조 합성되고, 화학적을 합성되고, 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 핵산 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 12 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 13 내지 40개, 예컨대 14 내지 35개, 예컨대 15 내지 30개, 예컨대 16 내지 22개, 예컨대 16 내지 18개 또는 15개 내지 17개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 핵산 분자 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 22개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 본원에 제공된 임의의 범위는 범위의 종료점을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 핵산 분자가 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 10개 및 30개 둘 다의 뉴클레오티드가 포함된다.
일부 양태에서, 연속적인 뉴클레오티드 서열은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
핵산 분자는 포유동물에서 표적 핵산의 발현을 조절하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자(예컨대, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한)는 전형적으로 표적 핵산의 발현의 억제를 위한 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 핵산 분자는 RNAi 제제, 예컨대 siRNA 또는 shRNA로부터 선택된다. 다른 양태에서, 핵산 분자는 단일 가닥의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 고 친화도 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 포스포로티오에이트 핵산 분자이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 비-뉴클레오시드성 모이어티(접합체 모이어티)에 접합될 수 있다.
핵산 분자의 라이브러리는 변이체 핵산 분자의 컬렉션으로 이해되어야 한다. 핵산 분자의 라이브러리의 목적은 변할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자의 라이브러리는 핵산 분자의 라이브러리 내의 가장 효능 있는 서열을 동정하기 위하여 PAPD5 표적 핵산과 PAPD7 표적 핵산 사이의 공통 영역을 표적화하는 중첩 핵염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일부 양태에서, 핵산 분자의 라이브러리는 모 또는 조상 핵산 분자의 핵산 분자 디자인 변이체(자 핵산 분자)의 라이브러리이고, 이때 상기 핵산 분자는 모 핵산 분자의 코어 핵염기 서열을 보유하는 변이체를 디자인한다.
올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유 결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유 결합된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로서 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 고체-상 화학 합성 및 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급하는 경우, 공유 결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서를 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고, 화학적으로 합성되고, 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접한 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 용어 "단일 가닥의"는 당업자에 의해 일반적으로 이해된다. 특히, 내부 또는 상호 자가 상보성의 정도가 올리고뉴클레오티드의 전장에 걸쳐 50% 미만인 경우, 본 발명의 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 또는 분자간 듀플렉스(duplex) 구조(동일한 올리고뉴클레오티드의 2개의 분자 사이의 듀플렉스)를 형성할 수 있음이 이해된다.
본 발명의 한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H 동원(recruiting) 올리고뉴클레오티드이다. RNAi 분자와 달리, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 세포의 핵에서 작용한다. 프리-mRNA 서열을 표적화하기 위하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포의 핵에서 작용하므로 바람직하다.
RNAi
본원에서, 용어 "RNA 간섭(RNAi) 분자"는 세포의 세포질에서 RNA-유도된 침묵(silencing) 복합체(RISC)를 통해 RNA-의존적 유전자 침묵을 유도할 수 있는 짧은 이중-가닥의 RNA 분자를 지칭하고, 이때 이들은 촉매적 RISC 성분 아르고노트(argonaute)와 상호작용한다. RNAi 분자의 하나의 유형은 소간섭 RNA(siRNA)이고, 이는, 전사 후에 상보성 mRNA를 결합함으로써 번역에서 이들의 저하 및 손실을 야기하는 이중가닥 RNA 분자이다. 작은 헤어핀 RNA(shRNA)는 헤어핀 구조를 갖는 인공 RNA 분자이고, 이는 발현 시에 DICER 및 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)를 통해 mRNA를 감소시킬 수 있다. RNAi 분자는 관심 유전자의 RNA 서열을 기반으로 디자인될 수 있다. 상응하는 RNAi는 화학적으로 또는 시험관내 전사에 의해 합성될 수 있거나 벡터 또는 PCR 생성물로부터 발현될 수 있다.
siRNA 및 shRNA 분자는 일반적으로 20 내지 50개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 25 내지 35개의 뉴클레오티드 길이이고, dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23개의 염기 쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공하고, 이어서 oRNA-유도된 침묵 복합체(RISC)에 혼입되는 다이서(Dicer)로 공지된 엔도뉴클레아제와 상호작용한다. 다이서 기질의 효과적으로 연장된 형태는 미국 특허공보 제US 8,349,809호 및 제US 8,513,207호(본원에 참고로 혼입됨)에 기술되어 있다. 적절한 표적 mRNA에 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵을 유도한다. RNAi 제제는 변형된 뉴클레오티드간 연결기 및 고 친화도 뉴클레오시드, 예컨대 2‘-4‘ 이환형 리보스 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 및 cET를 사용하여 화학적으로 변형될 수 있다.
연속적인 뉴클레오티드 서열
용어 "연속적인 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 이러한 용어는 본원에서 용어 "인접한 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어 작용기를 연속적인 뉴클레오티드 서열에 부착하는 데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"로 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형을 도입함으로써, 균등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 비변형된 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 지칭된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에 변형을 갖는 뉴클레오시드는 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기 짝짓기를 허용하는 경우, 여전히 일반적으로 DNA 또는 RNA로 지칭된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유 결합으로 커플링시키는, 포스포다이에스터(PO) 이외의 연결기로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로 지칭된다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기와 비교하여, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인근 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 결합을 생산하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드 및 siRNA를 안정화시키는 데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 중 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 변형된 뉴클레오시드의 영역뿐만 아니라 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 양태에서, 핵산 분자, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA 또는 siRNA는 천연 포스포다이에스터로부터, 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 내성인 연결기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드를 항온처리함으로써 또는 뉴클레아제 내성 검정(예컨대, 뱀 독액 포스포다이에스터라제(SVPD))(둘 다 당해 분야에 널리 공지됨)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 강화시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기로 지칭된다. 일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 변형되고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 80% 이상, 또는, 예컨대 90% 이상은 변형된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 변형된다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 비-뉴클레오티드 작용기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드가 포스포다이에스터일 수 있음이 인정될 것이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트의 RNase H 동원과 상용성이다.
일부 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 황(S)을 포함한다(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기).
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 이로운 약물동태학 및 제조 용이성에 기인하여 특히 유용하다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 포스포로티오에이트이고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상 또는 90% 이상은 포스포로티오에이트이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 입체정의(stereodefining)되고, 예컨대 올리고뉴클레오티드에서 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 예컨대 90% 이상의 뉴클레오시드간 연결기는 입체정의된다. 입체정의된 포스포로티에이트 연결기의 합성은, 예를 들어 국제 공개공보 제WO 2014/012081호 및 제WO 2016/079181호에 기술된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드간 연결기, 특히 포스포트라이에스터, 메틸포스폰에이트, MMI, 아미드-3, 폼아세탈 및 티오폼아세탈로부터 선택되는 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
추가의 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제WO 2009/124238호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다. 한 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제WO 2007/031091호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시된 연결기로부터 선택된다. 특히, 뉴클레오시드간 연결기는 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH3)-0-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-로부터 선택될 수 있고/거나 뉴클레오시드간 연결기는 O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-(이때, RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
뉴클레아제 내성 연결기, 예컨대 포스포티오에이트 연결기는 표적 핵산, 예컨대 갭머에 대한 영역 G, 또는 헤드머(headmer) 및 테일머(tailmer)의 비-변형된 뉴클레오시드 영역과 함께 듀플렉스를 형성할 때 뉴클레아제를 동원할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 영역에 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티에이트 연결기는 또한 비-뉴클레아제 동원 영역 및/또는 친화성 강화 영역, 예컨대 갭머에 대한 영역 F 및 F', 또는 헤드머 및 테일머의 변형된 뉴클레오시드 영역에 유용할 수 있다.
그러나, 각각의 디자인 영역은 특히 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA가 뉴클레아제 분해에 대해 연결기를 보호하는 영역에서 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포다이에스터 연결기를 포함할 수 있다. 특히 변형된 뉴클레오시드 단위(전형적으로 비-뉴클레아제 동원 영역에서) 사이 또는 이의 인근의 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 1 또는 2개의 연결기를 포함하는 것은 올리고뉴클레오티드의 생체이용 효능 및/또는 생체분포를 변형시킬 수 있다(본원에 참고로 혼입된 국제 공개공보 제WO 2008/113832호 참조).
한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
스테레오랜덤(stereorandom) 포스포로티오에이트 연결기
포스포로티오에이트 연결기는 비-가교 산소 중 하나가 황으로 치환된 뉴클레오시드간 포스페이트 연결기이다. 비-가교 산소 중 하나의 황에 의한 치환은 키랄 중심을 도입하고, 또한 단일 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 내에서, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 S(Sp) 또는 R(Rp) 입체이성질형일 것이다. 이러한 뉴클레오시드간 연결기는 "키랄 뉴클레오시드간 연결기"로 지칭된다. 대조적으로, 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기는, 이들이 2개의 비-말단 산소 원자를 가지므로, 비-키랄성이다.
입체 중심의 키랄성의 디자인은 문헌[Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966). "Specification of Molecular Chirality". Angewandte Chemie International Edition. 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851]에 최초 공개된 표준 칸-잉골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) 규칙(CIP 우선순위 규칙)에 의해 결정된다.
표준 올리고뉴클레오티드 합성 중에, 커플링 및 이어지는 황화의 입체선택성은 조절되지 않는다. 이러한 이유로, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기의 입체화학은 임의로 Sp 또는 Rp이고, 또한 전통적인 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 생성된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 2X 개만큼 많은 상이한 포스포로티오에이트 부분입체 이성질체(이때, X는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기의 수임)로 존재할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 본원에서 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 지칭되고, 어떠한 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기도 함유하지 않는다. 따라서, 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 비-입체정의된 합성으로부터 유래하는 개별적인 부분입체 이성질체의 혼합물이다. 이러한 맥락에서, 상기 혼합물은 2X 개 이하의 상이한 포스포로티오에이트 부분입체 이성질체로 정의된다.
입체정의된 뉴클레오시드간 연결기
입체정의된 뉴클레오시드간 연결기는 키랄 중심을 올리고뉴클레오티드에 유도하는 뉴클레오시드간 연결기이고, 개별적인 올리고뉴클레오티드 분자 집단 내에서 주로 하나의 입체 이성질체 형태 R 또는 S로 존재한다.
당업계에 사용되는 입체선택적인 올리고뉴클레오티드 합성 방법이 전형적으로 각각의 뉴클레오시드간 연결기 입체중심에서 약 90% 이상 또는 약 95% 이상의 입체선택성을 제공하고, 또한 약 10% 이하, 예컨대 약 5%의 올리고뉴클레오티드 분자가 대안적인 입체 이성질체 형태를 가질 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 양태에서, 각각의 입체정의된 포스포로티오에이트 입체중심의 입체선택성은 약 90% 이상이다. 일부 양태에서, 각각의 입체정의된 포스포로티오에이트 입체중심의 입체선택성은 약 95% 이상이다.
입체정의된 포스포로티오에이트 연결기
입체정의된 포스포로티오에이트 연결기는 개별적인 올리고뉴클레오티드 분자의 집단 내에서, 예컨대 각각의 입체중심(Rp 또는 Sp)에서 약 90% 이상 또는 약 95% 이상의 입체선택성으로 Rp 또는 Sp 배열로 화학적으로 합성되는 포스포로티오에이트 연결기이고, 또한 약 10% 이하, 예컨대 약 5%의 올리고뉴클레오티드 분자는 대안적인 입체 이성질체 형태를 가질 수 있다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기의 입체 배열은 하기 제공된다:
.
이때, 3' R 기는 연속적인 뉴클레오시드(5' 뉴클레오시드)의 3' 위치를 나타내고, 5' R 기는 연속적인 뉴클레오시드(3' 뉴클레오시드)의 5' 위치를 나타낸다.
Rp 뉴클레오시드간 연결기는 또한 srP로 나타낼 수 있고, Sp 뉴클레오시드간 연결기는 본원에서 ssP로 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, 각각의 입체정의된 포스포로티오에이트 입체중심의 입체 선택성은 약 97% 이상이다. 일부 양태에서, 각각의 입체정의된 포스포로티오에이트 입체중심의 입체선택성은 약 98% 이상이다. 일부 양태에서, 각각의 입체정의된 포스포로티오에이트 입체중심의 입체선택성은 약 99% 이상이다.
일부 양태에서, 입체선택적인 뉴클레오시드간 연결기는 올리고뉴클레오티드 분자의 집단에 존재하는 올리고뉴클레오티드 분자의 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 또는 (본질적으로) 모두 동일한 입체 이성질체 형태이다.
입체선택성은 단지 비키랄 골격(즉, 포스포다이에스터)을 갖는 모델 시스템에서 측정될 수 있고, 예컨대, 입체정의된 단량체를 하기 모델-시스템 "5' t-po-t-po-t-po 3'"에 커플링시킴으로써, 각각의 단량체의 입체선택성을 측정하는 것이 가능하다. 이어서, 이의 결과는 HPLC를 사용하여 분리할 수 있는 5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3' 또는 5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'를 제공한다. 입체선택성은 2개의 가능한 화합물로부터의 UV 신호를 통합함으로써 결정되고, 예컨대, 98:2, 99:1 또는 >99:1의 비를 제공한다.
특이적인 단일 부분입체 이성질체(단일 입체정의된 올리고뉴클레오티드 분자)의 입체 % 순도는 각각의 뉴클레오시드간 위치에서 정의된 입체중심에 대한 커플링 선택성, 및 도입된 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기의 수의 함수일 것임이 이해될 것이다. 예를 들어, 각각의 위치에서의 커플링 선택성이 97%인 경우, 15개의 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 결과적인 순도는 0.97일 것이다15(즉, 37%의 다른 부분입체 이성질체와 비교되는 63%의 목적 부분입체 이성질체). 정의된 부분입체 이성질체의 순도는, 합성 후에, 정제, 예를 들어 HPLC, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피에 의해 개선될 수 있다.
일부 양태에서, 입체정의된 올리고뉴클레오티드는 집단 내의 약 40% 이상, 예컨대 약 50% 이상이 목적 부분입체 이성질체인 올리고뉴클레오티드의 집단을 지칭한다.
달리 언급하자면, 일부 양태에서, 입체정의된 올리고뉴클레오티드는 집단의 약 40% 이상, 예컨대 약 50% 이상이 목적(특정) 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기 모티프(입체정의된 모티프로도 지칭됨)로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 집단을 지칭한다.
스테레오랜덤 및 입체정의된 뉴클레오시드간 입체중심 둘 다를 포함하는 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 경우, 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 순도는 정의된 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기 모티프를 보유하고, 스테레오랜덤 연결기가 계산에서 제외된 올리고뉴클레오티드의 집단의 %를 참고하여 결정된다.
핵염기
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린(예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예컨대, 우라실, 티민 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "핵염기"는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 천연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 및 비-천연 발생 변이체를 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸-사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로핀일-사이토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모-우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 다이아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택되는 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 부호, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 이때 각각의 문자는 임의적으로 균등한 기능의 변형된 핵염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸-사이토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-사이토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드" 또는 "변형된 핵산 분자"는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변현된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 기술한다. 용어 "키메라"는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자, 특히 갭머 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위해 문헌에 사용된 용어이다.
입체정의된 올리고뉴클레오티드
입체정의된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기인 올리고뉴클레오티드이다.
입체정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인 올리고뉴클레오티드이다.
입체정의된 뉴클레오시드간 모티프
입체정의된 뉴클레오시드간 모티프(본원에서 입체정의된 모티프로도 정의됨)는 입체정의된 올리고뉴클레오티드 중애서 입체정의된 R 및 S 뉴클레오시드간 연결기의 패턴을 지칭하고, 5' - 3'로 기재된다. 예를 들어, 하기 입체정의된 올리고뉴클레오티드는 RSSRRSRRSRSRSSS의 입체정의된 뉴클레오시드간 모티프를 갖는다:
5'-TsrP CssP AssP asrP csrP tssP tsrP tsrP cssP asrP cssP tsrP tssP CssP AssP G-3‘ (서열번호 18).
입체정의된 올리고뉴클레오티드의 서브-라이브러리에 관하여, 이들은 다른 점에서는 스테레오랜덤인 배경(임의적으로 하나 이상의 비-키랄 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대, 포스포다이에스터 연결기를 가짐)에서 공통의 입체정의된 뉴클레오시드간 모티프를 함유할 것이다.
예를 들어, 하기 올리고뉴클레오티드는 XXXXRSSRXXXXXXX의 입체정의된 뉴클레오시드간 모티프를 갖고, 이때 X는 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기(화합물에서 아래첨자로 표시됨)이다:
5'-Ts Cs As as csrP tssP tssP tsrP cs as cs ts ts Cs As G-3 (서열번호 18).
이러한 예에서, 제1 5' 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기는 5' 단부로부터의 제5 뉴클레오시드간 연결기(위치 4 및 5에서의 뉴클레오시드 사이)이고, 또한, 상기 모티프는 (뉴클레오시드간 연결기) 위치 5에서의 "RSSR" 모티프로도 지칭된다.
입체정의된 뉴클레오시드간 모티프(입체정의된 모티프)가 일련의 인접한 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기 상에 구성될 때(즉, 연속적인 뉴클레오시드 사이에 위치됨), 연속적인 입체정의된 뉴클레오시드간 모티프(연속적인 입체정의된 모티프)로 지칭된다. 연속적인 입체정의된 모티프가 2개 이상의 인접한 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하여야 함이 이해될 것이다.
서브-라이브러리 혼합물에서, 입체정의된 뉴클레오시드간 모티프는 또한 불연속적일 수 있고, 즉, 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기는 하나 이상의 스테레오랜덤 뉴클레오시드간 연결기에 의해 분산된다.
예를 들어, 하기 화합물은 불연속 모티프 XSXXRSXXXXXXSRS를 갖는다:
5'-Ts CssP As as csrP tssP ts ts cs as cs ts tssP CsrP AssP G-3 (서열번호 18).
모 올리고뉴클레오티드
모 올리고뉴클레오티드는 정의된 핵염기 서열(모티프 서열)을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 방법에서, 모 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 하나 이상의 라이브러리를 생성함으로써 본 발명의 방법을 사용하여 개선될 올리고뉴클레오티드이다.
전형적으로, 라이브러리는 모 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열 및 입체화학(전형적으로 스테레오랜덤)을 유지하면서, 뉴클레오시드 변형(디자인 라이브러리)을 변화시킬 수 있다.
다르게는, 라이브러리는 핵염기 서열(모티프 서열) 및 뉴클레오시드 변형 패턴(디자인)을 유지하면서, 모 올리고뉴클레오티드의 입체화학을 변화시킬 수 있다. 이러한 라이브러리에서, 뉴클레오시드간 연결기 중 하나 또는 그 이상(2+)의 입체화학이 입체정의되고, 모 올리고뉴클레오티드의 입체화학과는 상이하다.
일부 양태에서, 모 올리고뉴클레오티드는 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 모 올리고뉴클레오티드는 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 갭머이다.
일부 양태에서, 모 올리고뉴클레오티드는 공통의 입체정의된 모티프를 포함하는 서브-라이브러리일 수 있다.
입체정의된 변이체(자 올리고뉴클레오티드)
올리고뉴클레오티드의 입체정의된 변이체는 모 올리고뉴클레오티드와 동일한 서열 및 뉴클레오시드 변형(즉, 동일한 서열 및 뉴클레오시드 변형 화학 및 디자인)을 보유하지만, 하나 이상의 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 하나 이상의 입체정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기(입체정의된 포스포로티오에이트 변이체)에 대해서는 상이한 올리고뉴클레오티드이다.
입체정의된 변이체는 서브-라이브러리일 수 있거나, 완전히 입체정의된 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
입체정의된 올리고뉴클레오티드의 서브-라이브러리
스테레오랜덤 및 입체정의된 올리고뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 본원에서 서브-라이브러리로 지칭된다. 서브-라이브러리는 모든 가능한 부분입체 이성질체의 부분 집합을 나타내는 완전한 스테레오랜덤 올리고뉴클레오티드의 부분입체 이성질체 혼합물이 덜 복잡한 혼합물이다. 예를 들어, 이론적으로, 완전한 포스포로티오에이트 스테레오랜덤 16량체는 215 개 부분입체 이성질체(32,768개)의 혼합물인 반면, 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된 서브-라이브러리는 절반의 라이브러리 복잡성을 가질 것이고(16,384개의 부분입체 이성질체)(2개의 입체정의된 연결기 = 8,192개의 부분입체 이성질체; 3개의 입체정의된 연결기 = 4,096개의 부분입체 이성질체; 4개의 입체정의된 연결기 = 2,048개의 부분입체 이성질체; 5개의 입체정의된 연결기 = 1,024개 부분입체 이성질체), 100% 입체선택적인 커플링 효능을 나타낸다.
완전히 입체정의된 올리고뉴클레오티드
완전히 입체정의된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 내에 존재하는 모든 키랄 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된 올리고뉴클레오티드이다. 완전히 입체정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 내에 존재하는 모든 키랄 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인 올리고뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 완전히 입체정의된 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 비-키랄 뉴클레오시드간, 예컨대, 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기를 포함할 수 있고, 예를 들어 포스포다이에스터 연결기가 갭머의 측면 영역 내에, 및/또는, 예컨대 갭머 서열 및 접합체 기를 연결하는 DNA 뉴클레오시드(생체절단성 연결기)의 짧은 영역 사이의 종결 뉴클레오시드를 연결할 때, 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
완전히 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 모든 뉴클레오시드간 연결기, 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 영역, 예컨대 F-G-F' 갭머는 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 입체정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-짝짓기를 위한 자격을 기술한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 사이토신이 종종 사이토신 대신에 사용되고, 상기 용어 "상보성"은 비-변형된 및 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기 짝짓기를 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참조).
본원에 사용된 용어 "% 상보성"은 소정 위치에서, 별개의 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치의 연속적인 뉴클레오티드 서열에 상보적인(즉, 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 2개의 서열 사이에 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 계수하고(표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'로 정렬될 때), 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬(염기 쌍을 형성)되지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치(mismatch)로 지칭된다. 바람직하게는, 삽입 및 결실은 연속적인 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허락되지 않는다.
용어 "완전히 상보성"은 100% 상보성을 지칭한다.
하기 서열은 표적 핵산의 영역에 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드(서열번호 12)의 예이다:
동일성
본원에 사용된 용어 "동일성"은 소정 위치에서, 별개 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치에서 연속적인 뉴클레오티드 서열과 동일한(즉, 상보성 뉴클레오시드와 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 이들의 능력의 면에서) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 2개의 서열 사이에 동일한 정렬된 염기의 수를 계수하고, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. % 동일성 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이. 바람직하게는, 삽입 및 결실은 연속적인 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허락되지 않는다.
혼성화
본원에 사용된 용어 "혼성화하는" 또는 "혼성화하다"는 대향하는 가닥 상의 염기 쌍 사이에 수소 결합을 형성하고 이에 의해 듀플렉스를 형성하는 2개의 핵산 가닥(예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉싱된 온도로서 정의되는 용융 온도(Tm)에 의하여 기술된다. 생리학적 조건 Tm은 친화도에 엄격히 비례하지는 않는다(문헌[Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537]). 표준 상태 깁스(Gibbs) 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화도의 더욱 정확한 표현이고, ΔG°= -RTln(Kd)(이때, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도임)에 의해 반응의 해리 상수(Kd)와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1 M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산으로의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고, 자발적인 반응의 경우, ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어, 문헌[Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38] 및 문헌[Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기술된 등온 적정 열량계(ITC) 방법을 사용함으로써, 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 중인 장비가 ΔG° 측정에 이용가능함을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌[Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216] 및 문헌[McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기술된 대략적으로 유도된 열역학 파라미터를 사용하는 문헌[SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기술된 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model)을 사용함으로써, 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만, 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 핵산
본 발명에 따라서, 동일한 올리고뉴클레오티드에 의해 조절되는 2개의 표적 핵산이 존재한다. 표적 핵산은 i) 포유동물 PAPD5를 코딩하는 핵산(표적 핵산 1), 및 ii) 포유동물 PAPD7을 코딩하는 핵산(표적 핵산 2)이다. 표적 핵산은, 예를 들어 유전자, RNA, mRNA, 프리-mRNA, 천연 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있다. 적합하게는, 표적 핵산은 PAPD5 또는 PAPD7 단백질, 특히 포유동물 PAPD5 또는 PAPD7, 예컨대 인간 PAPD5 또는 PAPD7을 코딩한다(예를 들어, 인간, 원숭이 및 마우스 PAPD5 및 PAPD7에 대한 프리-mRNA 서열을 제공하는 표 1 및 2 참고).
일부 양태에서, 표적 핵산은 서열번호 1, 3 및/또는 5, 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유동물 PAPD5를 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적 핵산은 서열번호 2, 4, 및/또는 6 또는 11, 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유동물 PAPD7을 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[표 1A]
종간 PAPD5에 대한 게놈 및 어셈블리 정보.
[표 1B]
종간 PAPD7에 대한 게놈 및 어셈블리 정보.
Fwd = 정방향 가닥. Rev = 역방향 가닥. 게놈 좌표는 프리-mRNA 서열(게놈 서열)을 제공한다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유도된 합성 핵산일 수 있다.
생체내 또는 시험관내 적용의 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산을 발현하는 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접한 서열은 전형적으로 1 또는 2개의 미스매치를 임의적으로 제외하고, 올리고뉴클레오티드를 임의적인 작용기, 예컨대 접합체, 또는 다른 비-상보성 종결 뉴클레오티드(예컨대, 영역 D' 또는 D")에 연결할 수 있는 뉴클레오티드 기반 연결기 영역을 임의적으로 제외하면서 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 측정된 바와 같이, PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산의 보존된 영역에 상보성이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 2에 제공된다.
[표 2]
종간 PAPD5 및 PAPD7 에 대한 서열 세부사항.
표적 서열
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자에 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 양태에서, 표적 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열(즉, 하위-서열)에 상보적인 표적 핵산 상의 영역으로 이루어진다.
본 발명에서, 표적 서열은 인간 PAPD5 및 인간 PAPD7 표적 핵산 둘 다에 존재한다. 따라서, 표적 서열은 PAPD5 및 PAPD7 표적 핵산 둘 다에 존재하는 이중특이적인 표적 서열로 지칭될 수 있다. 이로운 양태에서, 표적 서열은 또한 하나 이상의 추가적인 종, 예컨대 사이노몰거스 원숭이로부터의 PAPD5 및 PAPD7, 및/또는 마우스로부터의 PAPD5 및 PAPD7에 존재한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 표적 핵산 상의 영역, 예컨대 본원에 기술된 표적 서열에 상보적이거나 이로 혼성화되는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 상보적이거나 혼성화되는 표적 핵산 서열은 일반적으로 10개 이상의 뉴클레오티드의 연속 핵염기의 스트레치를 포함한다. 연속적인 뉴클레오티드 서열은 10 내지 50개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 30개, 예컨대 13 내지 25개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 15 내지 18개의 연속적인 뉴클레오티드이다.
천연 발생 변이체
용어 "천연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 자리로부터 유래하지만, 예를 들어, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 다양성을 야기하는 유전자 코드의 퇴화에 기인하여, 또는 미성숙 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing), 또는 다형태, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형태, 및 대립형질 변이체의 존재에 기인하여 상이할 수 있는 PAPD5 또는 PAPD7 유전자 또는 전사체의 변이체를 지칭한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 대한 충분한 상보성 서열의 존재에 근거하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 천연 발생 변이체를 표적화할 수 있다.
일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 포유동물 PAPD5 표적 핵산, 예컨대 서열번호 1, 3 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 서열번호 1의 인간 PAPD5 표적 핵산에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 표 3A에 열거된 다형성이다.
일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 포유동물 PAPD5 표적 핵산, 예컨대 서열번호 2, 4 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 서열번호 2의 인간 PAPD7 표적 핵산에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는다. 일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 표 3B에 열거된 다형성이다.
많은 단일 뉴클레오티드 다형성은 PAPD5 또는 PAPD7 유전자, 예를 들어 표 3A(인간 PAPD5 프리-mRNA 개시/기준 서열은 서열번호 1임) 및 표 3B(인간 PAPD7 프리-mRNA 개시/기준 서열은 서열번호 2임)에 개시된 것들에서 공지된다.
[표 3A]
PAPD5 다형성(천연 발생 변이체).
[표 3B]
PAPD7 다형성(천연 발생 변이체).
발현의 조절
본원에 사용된 용어 "발현의 조절"은 핵산 분자의 투여 전의 PAPD5 및 PAPD7의 양과 비교될 때 PAPD5 및 PAPD7의 양을 변화시키는 핵산 분자 능력에 대한 전반적인 용어로서 이해되어야 한다. 발현의 대안적인 조절은 대조군 실험을 참고하여 결정될 수 있다. 대조군이 염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포, 또는 비-표적화 핵산 분자(모의군)로 처리된 개체 또는 표적 세포임이 일반적으로 이해된다. 그러나, 이는 또한 관리 기준으로 처리된 개체일 수 있다.
조절의 하나의 유형은, 예컨대 mRNA의 분해 또는 전사의 봉쇄에 의해, PAPD5 및 PAPD7의 발현을 억제하거나, 하향조절하거나, 감소시키거나, 저해시키거나, 제거하거나, 중단시키거나, 차단시키거나, 예방하거나, 줄이거나, 저하시키거나, 회피하거나, 종결하는 핵산 분자, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력이다.
고 친화도 변형된 뉴클레오시드
고 친화도 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 용융 온도(Tm)에 의해 측정되는 바와 같이 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고 친화도 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 야기한다. 수많은 고 친화도 변형된 뉴클레오시드가 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 많은 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 Ome 및 MOE, 및 2' 내지 4' 가교된 핵산, 예컨대 잠금 핵산(LNA)을 포함한다(예컨대, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 참조).
당 변형
본 발명의 핵산 분자는 변형된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교되는 경우 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 핵산 분자의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선할 목적으로 제조되었다.
이러한 변형은, 예컨대, 헥소스 고리(HNA), 리보스 고리 상의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 전형적으로 갖는 이환형 고리(LNA), 또는 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결핍된 비연결된 리보스 고리(예컨대, UNA)에 의한 치환에 의해, 리보스 고리 구조가 변형된 것들을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산(국제 공개공보 제WO 2011/017521호) 또는 삼환형 핵산(국제 공개공보 WO 제2013/154798호)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 또는 모폴리노 핵산의 경우, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 RNA 또는 DNA 뉴클레오시드에서 천연 발견되는 -OH 기로 변경함으로써 제조된 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다.
2' 당 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나(2' 치환된 뉴클레오시드), 리보스 고리에서 2' 탄소와 제2 탄소 사이의 가교를 형성할 수 있는 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드, 예컨대 LNA (2' - 4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드이다.
실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는 데 많은 초점이 맞춰졌고, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때 이로운 특성을 갖는 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 발견되었다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 강화된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예의 경우, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443], 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 문헌[Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참고한다. 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 하기 제시된다:
본 발명에 관하여, "2'치환된"은 LNA와 같은 2' 가교된 분자를 포함하지 않는다.
잠금 핵산 뉴클레오시드(LNA)
"LNA 뉴클레오시드"는 상기 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결하는 바이라디칼("2'-4' 가교"로도 지칭됨)을 포함하는 2'-당 변형된 뉴클레오시드이고, 이것은 리보스 고리의 형태를 제한하거나 잠근다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 이환형 핵산(BNA)으로 지칭된다. 리보스의 형태의 잠금은 LNA가 상보적인 RNA 또는 DNA 분자를 위해 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 혼성화(듀플렉스 안정화)의 강화된 친화도와 연관된다. 이것은 올리고뉴클레오티드/보체 듀플렉스의 용융 온도를 측정함으로써 통상적으로 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고머의 2'-당 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 또는 II의 일반적인 구조를 갖는다:
[화학식 I]
[화학식 II]
상기 식에서,
W는 -O-, -S-, -N(Ra)- 및 -C(RaRb)-로부터 선택되고, 예컨대, 일부 양태에서 -O-이고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기 모이어티이고;
Z는 인근 뉴클레오시드, 또는 5'-말단 기로의 뉴클레오시드간 연결기이고;
Z*는 인근 뉴클레오시드 또는 3'-말단 기로의 뉴클레오시드간 연결기이고;
X는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이고(일부 양태에서, X는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)- 및 -C(=CRaRb)-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X는 -O-이다),
Y는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이거나(일부 양태에서, Y는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- 및 -C(Ra)=N-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Y는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3- 및 CRaRb-로 이루어진 군으로부터 선택된다),
-X-Y-는 함께 2가 연결기(또한 라디칼로 지칭됨)이거나, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 기/원자로 이루어진 2가 연결기이고(일부 양태에서, -X-Y-는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-, -O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이라디칼이다. 일부 양태에서, -X-Y-는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-이다. 이때, Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택된다);
Ra, 및 존재하는 경우 Rb는 각각 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, 임의적으로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은 자리 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은 자리 치환기는 함께 옥소, 티오옥소, 이미노 또는 임의적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸 및 수소로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다.
일부 양태에서 R1, R2 및 R3은 모두 수소이고, R5 또는 R5*는 또한 수소이고, R5 및 R5* 중 나머지 하나는 수소가 아니 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, Ra는 수소 또는 메틸이다. 일부 양태에서, 존재하는 경우, Rb는 수소 또는 메틸이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소가 아니다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 99/014226호, 제WO 00/66604호, 제WO 98/039352호 및 제WO 2004/046160호(모두 본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-1-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 99/014226호 및 제WO 2004/046160호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 99/014226호 및 제WO 2004/046160호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 00/047599호 및 문헌[Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76](본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산(ENA)으로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 2007/134181호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소가 아닌 것, 예컨대 메틸이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 2010/077578호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2OCH3)-(2' O-메톡시에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2CH3)-(2'O-에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 10/036698호 및 제WO 07/090071호(둘 다 본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH2OCH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 당해 분야에서 환형 MOE(cMOE)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제WO 07/090071호에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH3)-을 나타낸다(R- 또는 S-배열). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-CH2-O-CH2-를 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 당해 분야에서 cET 뉴클레오시드로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제WO 07/090071호(베타-D) 및 국제 공개공보 제WO 2010/036698호(알파-L)(둘 다 본원에 참고로 혼입됨)에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체 이성질체일 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb는 모두 수소가 아니고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다. 이러한 6' 다이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 2009/006478호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 11/156202호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 6' 치환된 티오 LNA 양태에서, Ra는 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2- 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 비닐 카보 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 08/154401호 및 국제 공개공보 제WO 09/067647호(둘 다 본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(-ORa)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 N 치환된 LNA로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제WO 2008/150729호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-NRa-CH3-을 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(Ra)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, R5 및 R5* 중 하나 또는 둘 다는 수소이고, 치환되는 경우, R5 및 R5* 중 다른 하나는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 양태에서, R1, R2 및 R3은 모두 수소일 수 있고, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2- 및 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)-으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 형태적으로 제한된 뉴클레오티드(CRN)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제WO 2013/036868호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 COC 뉴클레오티드로 공지되어 있고, 문헌[Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238](본원에 참고로 혼입됨)에 개시되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드가 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질형일 수 있음이 인정될 것이다.
비제한적으로, 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제WO 99/014226호, 제WO 00/66604호, 제WO 98/039352호, 제WO 2004/046160호, 제WO 00/047599호, 제WO 2007/134181호, 제WO 2010/077578호, 제WO 2010/036698호, 제WO 2007/090071호, 제WO 2009/006478호, 제WO 2011/156202호, 제WO 2008/154401호, 제WO 2009/067647호, 제WO 2008/150729호, 문헌[Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76], 문헌[Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81] 및 문헌[Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238]에 개시되어 있다.
LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 하기 도식 1에 지시된다.
[도식 1]
상기 예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는 상보성 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성할 때, 상보성 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 작용할 수 있고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예컨대 RNase H를 동원할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 기전을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 5 또는 6개 이상의 연속적인 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고 친화성 강화 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머에 의해 한 측면 또는 양 측면 상에 접하는 올리고뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 동원
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와의 듀플렉스에서 RNase H를 동원하는 이의 능력을 지칭한다. 국제 공개공보 제WO 01/23613호는 RNase H를 동원하는 능력을 측정하는 데 사용될 수 있는 RNase H 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 공개공보 제WO 01/23613호(본원에 참고로 혼입됨)의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 측정된 초기 속도의 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 20% 초과의 초기 속도(pmol/L/분으로 측정됨)를 갖는다면, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 동원할 수 있는 것으로 간주된다. RHase H 활성의 측정에 사용하기 위하여, 재조합 인간 RNase H1은 스위스 루체른 소재의 루바이오 사이언스 게엠베하(Lubio Science GmbH)에서 시판 중이다.
갭머
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 갭머일 수 있다. 안티센스 갭머는 RNase H 매개된 분해를 통해 표적 핵산을 억제하기 위해 통상적으로 사용된다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 별개의 구조 영역 5'-플랭크(flank), 갭 및 3'-플랭크를 포함한다(5' -> 3' 방향으로 F-G-F). "갭" 영역(G)은 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 동원할 수 있도록 하는 연속 DNA 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 갭 영역은 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게는 고 친화도 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 5' 플랭킹(flanking) 영역(F)에 의해, 및 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게는 고 친화도 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 3' 플랭킹 영역(F')에 의해 플랭킹된다. 영역 F 및 F'의 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 향상시킨다(즉, 친화도 향상 당 변형된 뉴클레오시드임). 일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고 친화도 2' 당 변형이고, 예컨대 독립적으로 LNA 및 2'-MOE로부터 선택된다.
갭머 디자인에서, 갭 영역의 5' 및 3' 최대 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 각각 5'(F) 또는 3'(F') 영역의 당 변형된 뉴클레오시드에 인접하게 위치한다. 플랭크는 갭 영역으로부터의 최대 거리의 단부, 즉, 5' 플랭크의 5' 단부 및 3' 플랭크의 3' 단부에 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 가짐으로써 추가로 한정될 수 있다.
영역 F-G-F'는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 형성한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 구조식 F-G-F'의 갭머 영역을 포함할 수 있다.
갭머 디자인 F-G-F'의 전체 길이는, 예를 들어 12 내지 32개의 뉴클레오시드, 예컨대 13 내지 24개, 예컨대 14 내지 22개의 뉴클레오시드, 예컨대 14 내지 17개, 예컨대 16 내지 18개의 뉴클레오시드일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 표시될 수 있되, 갭머 영역 F-G-F'의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다:
F1-8-G5-16-F'1-8, 예컨대 F1-8-G7-16-F'2-8
영역 F, G 및 F'는 이하에서 더욱 정의되고 F-G-F' 구조식에 혼입될 수 있다.
갭머 - 갭, 영역 G
갭머의 영역 G(갭 영역)는 올리고뉴클레오티드가 RNase H, 예컨대 인간 RNase H1, 전형적으로 DNA 뉴클레오시드를 동원할 수 있도록 하는 뉴클레오시드의 영역이다. RNase H는 DNA와 RNA 사이의 듀플렉스를 인식하고, RNA 분자를 효소적으로 절단하는 세포 효소이다. 적합하게는, 갭머는 5 또는 6개 이상의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5 내지 16개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6 내지 15개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 7 내지 14개의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 8 내지 12개의 연속 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 8 내지 12개의 연속 DNA 뉴클레오티드 길이의 갭 영역(G)을 가질 수 있다. 갭 영역 G는, 일부 양태에서, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 갭 영역의 사이토신(C) DNA는, 일부 경우에, 메틸화될 수 있고, 이러한 잔사는 5-메틸-사이토신(meC 또는 c 대신에 e를 가짐)으로 주석된다. 갭의 사이토신 DNA의 메틸화는, cg 다이뉴클레오티드가 갭에 존재하여 잠재적인 독성을 감소시키는 경우에 유리하고, 변형은 올리고뉴클레오티드의 효능에 대한 유의한 영향을 갖는 것으로 기대되지 않는다.
일부 양태에서, 갭 영역 G는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속 포스포로티오에이트 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 갭의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
전통적인 갭머는 DNA 갭 영역을 갖지만, 갭 영역 내에 사용될 때, RNase H 동원을 가능하게 하는 변형된 뉴클레오시드의 수많은 예가 존재한다. 갭 영역 내에 포함될 때, RNase H를 동원할 수 있는 것으로 보고되는 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 알파-L-LNA, C4' 알킬화된 DNA(국제 출원 제PCT/EP2009/050349호 및 문헌[Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300]에 기술됨, 둘 다 본원에 참고로 혼입됨), 아라비노스 유도된 뉴클레오시드, 예컨대 ANA 및 2'F-ANA(문헌[Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661]), UNA(비잠금 핵산)(본원에 참고로 혼입된 문헌[Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]에 기술됨)를 포함한다. UNA는 비잠금 핵산이고, 전형적으로 리보스의 C2와 C3 사이의 결합은 제거되어 비잠금 "당" 잔사를 형성한다. 이러한 갭머에 사용된 변형된 뉴클레오시드는, 갭 영역에 도입될 때, 2' 엔도(DNA 유사) 구조(즉, RNase H 동원을 가능하게 하는 변형)를 채용하는 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 DNA 갭 영역(G)은 임의적으로 갭 영역에 도입될 때, 2' 엔도(DNA 유사) 구조를 채택하는 1 내지 3개의 당 변형된 뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
영역 G - "갭-브레이커(gap-breaker)"
다르게는, 일부 RNase H 활성을 보유하면서, 갭머의 갭 영역에 3' 엔도 형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드의 삽입의 수많은 보고서가 존재한다. 하나 이상의 3' 엔도 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 갭 영역을 갖는 이러한 갭머는 "갭-브레이커" 또는 "갭-분열된(gap-disrupted)" 갭머로 지칭된다(예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2013/022984호 참조). 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드는 RNase H 동원을 가능하게 하는 갭 영역 내에 DNA 뉴클레오시드의 충분한 영역을 보유한다. RNase H를 동원하는 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 능력은 전형적으로 서열 특이적이거나 심지어 화합물 특이적이다(일부 경우에, 표적 RNA의 더욱 특이적인 절단을 제공하는 RNase H를 동원하는 "갭-브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시하는 문헌[Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487] 참조). 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에 사용된 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 3' 엔도 형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-메틸(OMe) 또는 2'-O-MOE(MOE) 뉴클레오시드, 또는 베타-D LNA 뉴클레오시드(뉴클레오시드의 리보스 당의 C2'와 C4' 사이의 가교는 베타 형태임), 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드일 수 있다.
전술된 영역 G를 함유하는 갭머와 같이, 갭-브레이커 또는 갭-분열된 갭머의 갭 영역은, 갭의 5' 단부에서의 DNA 뉴클레오시드(영역 F의 3' 뉴클레오시드에 인접함), 및 갭의 3' 단부에서의 DNA 뉴클레오시드(영역 F'의 5' 뉴클레오시드에 인접함)를 갖는다. 분열된 갭을 포함하는 갭머는 전형적으로 갭 영역의 5' 단부 또는 3' 단부에 3 또는 4개 이상의 연속 DNA 뉴클레오시드의 영역을 보유한다.
갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 예시적인 디자인은 다음을 포함한다:
F1-8-[D3-4-E1-D 3-4]-F'1-8
F1-8-[D 1-4-E1-D 3-4]-F'1-8
F1-8-[D 3-4-E1-D 1-4]-F'1-8
이때, 영역 G는 대괄호 [Dn-Er-Dm]에 존재하고, D는 DNA 뉴클레오시드의 연속 서열이고, E는 변형된 뉴클레오시드(갭-브레이커 또는 갭-분열된 뉴클레오시드)이고, F 및 F'는 본원에 정의된 플랭킹 영역이되, 갭머 영역 F-G-F'의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 양태에서, 갭-분열된 갭머의 영역 G는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 전술된 바와 같이, DNA 뉴클레오시드는 연속적일 수 있거나, 임의적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드에 의해 산재될 수 있되, 갭 영역 G는 RNase H 동원을 매개할 수 있다.
갭머 - 플랭킹 영역, F 및 F'
영역 F는 영역 G의 5' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하게 위치한다. 영역 F의 3' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고 친화도 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F'는 영역 G의 3' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하게 위치한다. 영역 F'의 5' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고 친화도 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F는 1 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드 길이, 예컨대 1 내지 6개, 예컨대 2 내지 6개, 예컨대 3 또는 4개의 연속적인 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는, 영역 F의 5' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F의 2개의 5' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F의 5' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F의 2개의 5' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F의 2개의 5' 최대 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F의 5' 최대 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F'는 2 내지 8개의 연속적인 뉴클레오티드 길이, 예컨대 3 내지 6개, 예컨대 4 또는 5개의 연속적인 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는, 일부 양태에서, 영역 F'의 3' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F'의 2개의 3' 최대 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F'의 2개의 3' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F'의 3' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F'의 2개의 3' 최대 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F'의 3' 최대 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F 또는 F'의 길이가 1개일 때, 유리하게는 LNA 뉴클레오시드임에 유의하여야 한다.
일부 양태에서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 당 변형된 뉴클레오시드의 연속 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 양태에서, 영역 F의 당 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 영역 F 및 F'는 독립적으로 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드 둘 다를 포함한다(혼합된 날개 디자인).
일부 양태에서, 영역 F 및 F'는 단지 하나의 유형의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 만으로 또는 베타-D-옥시 LNA 만으로 또는 ScET 만으로 이루어진다. 이러한 디자인은 또한 동형 플랭크 또는 동형 갭머 디자인으로 지칭된다.
일부 양태에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는, 예컨대 베타-D-옥시 LNA, ENA 및 ScET 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F는 1 내지 5개, 예컨대 2 내지 4개, 예컨대 3 또는 4개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 연속 LNA 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 양태에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드이다. 일부 양태에서, 영역 F는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 연속 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 양태에서, 단지 하나의 플랭킹 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 이것은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 5' (F) 플랭킹 영역인 반면, 3' (F') 플랭킹 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 이것은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 3' (F') 플랭킹 영역인 반면, 5' (F) 플랭킹 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는, 예컨대 베타-D-옥시 LNA, ENA 및 ScET 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는 LNA 뉴클레오시드이고, 이때 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 임의적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(교호하는 플랭크, 더욱 상세한 사항은 이의 정의 참고). 일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 이때 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'는 임의적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(교호하는 플랭크, 더욱 상세한 사항은 이의 정의 참고).
일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 5' 최대 및 3' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 ScET 뉴클레오시드이다.
일부 양태에서, 영역 F와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 양태에서, 영역 F'와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 양태에서, 영역 F 또는 F', F 및 F'의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
추가의 갭머 디자인은 국제 공개공보 제WO 2004/046160호, 제WO 2007/146511호 및 제WO 2008/113832호(본원에 참고로 혼입됨)에 개시된다.
LNA 갭머
LNA 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 다가 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진 갭머이다. 베타-D-옥시 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 다가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진 갭머이다.
일부 양태에서, LNA 갭머는 하기 화학식을 갖는다: [LNA]1-5-[영역 G]-[LNA]1-5, 이때 영역 G는 갭머 영역 G의 정의에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, LNA는 베타-D-옥시-LNA이고, 갭머는 하기 구조식을 갖는다;
F2-5 LNA, 0-2 DNA-G7-11 DNA-F'3-5 LNA, 0-2 DNA
MOE 갭머
MOE 갭머는 영역 F 및 F'가 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 갭머이다. 일부 양태에서, MOE 갭머는 디자인 [MOE]1-8-[영역 G]-[MOE]1-8, 예컨대 [MOE]2-7-[영역 G]5-16-[MOE]2-7, 예컨대 [MOE]3-6-[영역 G]-[MOE]3-6을 갖고, 이때 영역 G는 갭머의 정의에 정의된 바와 같다. 5-10-5 디자인을 갖는 MOE 갭머(MOE-DNA-MOE)는 당업계에 광범위하게 사용된다.
혼합된 날개 갭머
혼합된 날개 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 다가 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드인 LNA 갭머이다. 하나 이상의 영역 F 및 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 다가 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 하나 이상의 영역 F 및 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 다가 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 양태에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 혼합된 날개 양태에서, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 추가로 포함할 수 있다.
혼합된 날개 갭머 디자인는 국제 공개공보 제WO 2008/049085호 및 제WO 2012/109395호(이들 둘 다는 본원에 참고로 혼입됨)에 개시된다.
교호하는 플랭크 갭머
교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 플랭크(F 또는 F')가 LNA 뉴클레오시드 이외에 DNA를 포함하는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 영역 F 또는 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 다는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이러한 양태에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 다는 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함하고, 이때 F 및/또는 F' 영역의 5' 및 3' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 양태에서, 하나 이상의 영역 F 또는 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 다는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이러한 양태에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 다는 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함하고, 이때 F 또는 F' 영역의 5' 및 3' 최대 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. LNA 및 DNA 뉴클레오시드를 둘 다 포함하는 플랭킹 영역은, 이들이 LNA-DNA-LNA 뉴클레오시드의 교호하는 모티프를 포함하므로, 교호하는 플랭크로 지칭된다. 교호하는 플랭크 LNA 갭머는 국제 공객공보 제WO 2016/127002호에 개시된다.
교호하는 플랭크 영역은 3개 이하의 연속 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 또는 2개, 또는 1, 2 또는 3개의 연속 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
교호하는 플랭크는 LNA 뉴클레오시드(L)의 수 및 이어지는 DNA 뉴클레오시드(D)의 수를 나타내는 일련의 정수로서 주석될 수 있고, 예를 들어 하기 구조식과 같다:
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
올리고뉴클레오티드 디자인에서, 이들은 2-2-1가 5' [L]2-[D]2-[L] 3'를 나타내고, 1-1-1-1-1이 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'를 나타내는 수로 종종 표시될 것이다. 교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드에서 플랭크(영역 F 및 F')의 길이는 독립적으로 3 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8개, 예컨대 5 또는 6개 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 양태에서, 갭머 올리고뉴클레오티드 내의 단지 하나의 플랭크는 교호하지만, 다른 것은 LNA 뉴클레오티드로 구성된다. 추가적인 엑소뉴클레아제 내성을 부여하도록 3' 플랭크(F')의 3' 단부에 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 갖는 것이 이로울 수 있다. 교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 일부 예는 다음과 같다:
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
단, 갭머의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D"
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 일부 양태에서, 표적 핵산에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머 F-G-F', 및 추가로 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 그렇지 않을 수 있다. 이러한 추가의 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 본원에서 영역 D' 및 D"로 지칭될 수 있다.
영역 D' 또는 D"의 추가는 연속적인 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머를 접합체 모이어티 또는 다른 작용기에 접합시키기 위하여 사용될 수 있다. 연속적인 뉴클레오티드 서열을 접합시키는 데 사용될 때, 접합체 모이어티는 생체절단성 연결기로서 역할을 한다. 다르게는, 엑소뉴클레아제 보호를 제공하기 위해 또는 합성 또는 제조의 용이함을 위해 사용될 수 있다.
영역 D' 및 D"는 각각 영역 F의 5' 단부 또는 영역 F'의 3' 단부에 부착되어 구조식 D'-F-G-F', F-G-F'-D" 또는 D'-F-G-F'-D"의 디자인을 생성할 수 있다. 이러한 경우에, F-G-F'는 올리고뉴클레오티드의 갭머 부분이고, 영역 D' 또는 D"는 올리고뉴클레오티드의 별개 부분을 구성한다.
영역 D' 또는 D"는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드(표적 핵산에 상보적이거나 비-상보적일 수 있음)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. F 또는 F' 영역에 인접합 뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 염기 변형된 버전이 아니다. D' 또 D" 영역은 뉴클레아제 민감성 생체절단성 연결기로서 역할을 할 수 있다(연결기의 정의 참고). 일부 양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 단부 뉴클레오티드는 포스포다이에스터 연결기와 연결되고, DNA 또는 RNA이다. 영역 D' 또는 D"로 사용하기에 적합한 뉴클레오티드-기반 생체절단성 연결기는 국제 공개공보 제WO 2014/076195호에 개시되고, 이것은, 예를 들어 포스포다이에스터-연결된 DNA 다이뉴클레오티드를 포함한다. 폴리-올리고머뉴클레오티드 구축물에서 생체절단성 연결기의 사용은 국제 공개공보 제WO 2015/113922호에 개시되고, 이것은 단일 올리고뉴클레오티드 내에서 다수의 안티센스 구축물(예컨대, 갭머 영역)을 연결하는 데 사용된다.
한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머를 구성하는 연속적인 뉴클레오티드 서열 이외에 영역 D' 및/또는 D"를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 나타낼 수 있다:
F-G-F', 특히 F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D", 특히 F1-8-G5-16-F'2-8-D"1-3
D'-F-G-F'-D", 특히 D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8-D"1-3
일부 양태에서, 영역 D'와 영역 F 사이에 위치하는 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다. 일부 양태에서, 영역 F'와 영역 D" 사이에 위치하는 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다.
접합체
본원에 사용된 용어 "접합체"는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유 결합으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티로의 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 접합은, 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 줌으로써, 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 접합체 모이어티는 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배설, 투과성, 및/또는 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 개선함으로써, 약물동태학 특성을 변형시키거나 강화시킨다. 특히, 접합체는 특이적인 기관, 조직 또는 세포 유형에 대해 올리고뉴클레오티드를 표적으로 할 수 있고, 이에 의해 상기 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효능을 강화시킨다. 동시에, 접합체는 비-표적-세포 유형, 조직 또는 기관의 올리고뉴클레오티드의 활성, 예컨대 비-표적-세포 유형, 조직 또는 기관의 오프-타겟(off-target) 활성 또는 활성을 감소시키는 역할을 할 수 있다.
국제 공개공보 제WO 93/07883호 및 제WO 2013/033230호(본원에 참고로 혼입됨)는 적합한 접합체 모이어티를 제공한다. 더욱 적합한 접합체 모이어티는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)로 결합할 수 있는 것이다. 특히, 3가 N-아세틸갈락토사민 접합체 모이어티는 ASGPR로의 결합에 적합하다(예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2014/076196호, 제WO 2014/207232호 및 제WO 2014/179620호(본원에 참고로 혼입됨) 참고). 이러한 접합체는, 신장에서 이의 존재를 감소시키면서, 간으로의 올리고뉴클레오티드의 흡수를 강화시키는 역할을 하고, 이에 의해 동일한 올리고뉴클레오티드의 비접합된 버전과 비교하여 접합된 올리고뉴클레오티드의 간/신장 비를 증가시킨다.
한 양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소(예컨대, 세균성 독소), 비타민, 바이러스성 단백질(예컨대, 캡시드) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
접합체 연결기
연결기 또는 연결자는 하나의 해당 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유 결합을 통해 다른 해당 화학적 기 또는 분절로 연결하는 2개의 원자 사이의 결합이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티(예컨대, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 하나의 영역, 예컨대 접합체 모이어티를 다른 영역, 예컨대 올리고뉴클레오티드(영역 A 또는 C의 말단)에 공유 결합으로 결합시키는 역할을 한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치하는 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 접합체와 올리고뉴클레오티드 사이의 연결기는 생체절단성이다. 연결기 및 올리고뉴클레오티드는 종종 포스포다이에스터 연결기를 통해 부착된다.
생체절단성 연결기(영역 B)는 포유동물 신체 내에서 통상적으로 만나거나 통상적으로 만나는 것과 유사한 조건 하에 절단성 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진 생체절단성 연결기를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형(예컨대, 절단)을 겪는 조건은 포유동물 세포에서 발견되거나 포유동물 세포에서 만나는 바와 유사한 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 약품, 및 염 농도와 같은 화학적 조건을 포함한다. 포유동물 세포내 조건은 또한 포유동물 세포에 통상적으로 존재하는 효소적 활성, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터의 효소적 활성의 존재를 포함한다. 한 양태에서, 생체절단성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 양태에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 3개 이상 또는 4 또는 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 생체절단성 연결기를 함유하는 포스포다이에스터는 국제 공개공보 제WO 2014/076195호(본원에 참고로 혼입됨)에 더욱 상세히 기술되어 있다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이의 연결기는 안티센스 화합물의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단에서의 2 내지 5개의 연속적인 포스포다이에스터-연결된 뉴클레오시드로 구성되는 생리학적으로 불안정한 연결기이다. 일부 양태에서, 연속적인 포스포다이에스터 연결기는 AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC 및 GG로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 다이뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 연속적인 포스포다이에스터 연결기는 서열 AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC 또는 GGG의 트라이뉴클레오티드이다. 특정 예에서, 3개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 갖는 포스포다이에스터-연결된 CA 다이뉴클레오티드는 연속적인 뉴클레오티드 서열과 접합체 모이어티 사이의 생체절단성 연결기로서 사용되었다. 생체절단성 연결기를 함유하는 포스포다이에스터는 국제 공개공보 제WO 2014/076195호(본원에 참고로 혼입됨)에 더욱 상세히 기술된다. 생체절단성 연결기를 갖는 접합체 화합물에서, 약 50% 이상의 접합체 모이어티가 올리고뉴클레오티드로부터 절단되고, 예컨대 약 60% 이상이 절단되고, 예컨대 약 70% 이상이 절단되고, 예컨대 약 80% 이상이 절단되고, 예컨대 약 85% 이상이 절단되고, 예컨대 약 90% 이상이 절단되고, 예컨대 약 95% 이상의 접합체 모이어티가, 표준과 비교될 때, 절단된 올리고뉴클레오티드로부터 절단된다.
접합체는 또한 비-생체절단성 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있거나, 일부 양태에서, 접합체는 생체절단성 연결기에 공유 결합으로 부착된 비-절단성 연결기를 포함할 수 있다. 필수적으로 생체절단성이 아닌 연결기는 주로 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드 또는 생체절단성 연결기에 공유 결합으로 연결하는 역할을 하고, 잠재적으로 접합체 모이어티와 올리고뉴클레오티드 사이에 일부 거리를 생성한다. 일부 예시적인 연결기(영역 Y)는 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산(ADO), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 6-아미노헥산산(AHEX 또는 AHA), 6-아미노헥실옥시, 4-아미노부티르산, 4-아미노사이클로헥실카복실산, 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도-카프로에이트)(LCSMCC), 석신이미딜 m-말레이미도-벤조일레이트(MBS), 석신이미딜 N-e-말레이미도-카프로일레이트(EMCS), 석신이미딜 6-(베타-말레이미도-프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), 석신이미딜 N-(a-말레이미도 아세테이트)(AMAS), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 베타-알라닌(베타-ALA), 페닐글리신(PHG), 4-아미노사이클로헥산산(ACHC), 베타-(사이클로프로필) 알라닌(베타-CYPR), 아미노 도데칸산(ADC), 알릴렌 다이올, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 등을 포함한다. 비-절단성 연결기는 또한 반복 단위, 예컨대 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기의 쇄 구조 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2-C36 아미노 알킬 기, 예를 들어 C6-C12 아미노 알킬 기이다. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기(C6 연결기로도 지칭됨)이다. 접합체 연결기는 통상적으로 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드, 및 접합체 기 상의 활성화된 에스터 기의 사용을 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 아미노 알킬과 올리고뉴클레오티드 사이의 연결기는, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 포스포다이에스터, 또는 본원에 언급된 다른 뉴클레오시드 연결기 중 하나일 수 있다. 본 발명의 접합체 화합물은 하기 영역 C-B-A(접합체 모이어티-생체절단성 연결기-올리고머뉴클레오티드/연속적인 뉴클레오티드 서열) 또는 C-Y-B-A(접합체 모이어티-비-절단성 연결기-생체절단성 연결기-올리고머뉴클레오티드/연속적인 뉴클레오티드 서열)로 구성될 수 있다.
치료
용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병에 기인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치료한다는 관점에서 치료 효과가 있다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 대상에서 질병의 임의의 치료를 포괄하고 하기를 포함한다: (a) 질병의 억제, 즉, 이의 발생의 저지, 예컨대 HBsAg 및/또는 HBeAg의 증가의 억제; 또는 (b) 질병의 개선(즉, 완화), 즉, 질병의 퇴행, 예컨대 HBsAg 및/또는 HBeAg 생산의 퇴행의 유발. 따라서, HBV 감염을 개선하고/거나 억제하는 화합물은 HBV 감염을 치료하는 화합물이다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "치료"는 이미 나타난 장애, 예컨대 이미 규정되고 나타난 HBV 감염의 의료적 개입에 관한 것이다.
예방
본원에서, 용어 "예방하는", "예방" 또는 "예방하다"는 예방적 치료, 즉, 질병을 치료하기보다는 예방하기 위한 목적의 조치 또는 절차에 관한 것이다. 예방은, 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다. 따라서, 본원에서 "HBV 감염을 예방하는"은 대상에서 발생하는 HBV 감염을 예방하는 것 및 HBV 감염의 증상의 발생을 예방하는 것을 포함한다. 본 발명에서, 특히, HBV 감염된 엄마로부터의 아이의 HBV 감염의 예방이 고려된다.
환자
본 발명의 목적을 위해, "대상"(또는 "환자")은 척추동물일 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "대상"은 인간 및 다른 동물, 특히 포유동물, 및 다른 유기체를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 수단 및 방법은 인간 치료 및 수의학적 적용 모두에 적용가능하다. 따라서, 본원에서 대상은 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 기니피그, 흰족제비, 고양이, 개, 닭, 양, 소 종, 말, 낙타 또는 영장류일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유동물이다. 더욱 바람직하게는, 대상은 인간이다.
HBV 감염
용어 "B형 간염 바이러스 감염" 또는 "HBV 감염"은 당업계에 통상적으로 공지되어 있고, B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 야기되고 간에 영향을 미치는 전염병을 지칭한다. HBV 감염은 급성 또는 만성 감염일 수 있다. 일부 감염된 인간은 초기 감염 동안 증상이 없고, 일부는 구토, 황달 피부, 피로, 어두운색 오줌 및 복통과 함께 질병이 급성 발병한다(문헌["Hepatitis B Fact sheet N°204". who.int. July 2014. Retrieved 4 November 2014]). 흔히, 이러한 증상은 몇 주 동안 지속되고 사망을 야기할 수도 있다. 증상이 시작되기까지 30 내지 180일이 걸릴 수 있다. 출생 즈음에 감염된 대상에서, 90%가 만성 B형 간염 감염으로 발달하는 반면에, 5세 이후에 감염된 대상의 10% 미만이 만성 B형 간염 감염으로 발달한다(문헌["Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission", U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), retrieved 2011-11-29]). 만성 질병을 앓는 대부분은 증상이 없지만; 간경변 및 간암이 궁극적으로 발생할 수 있다(문헌[Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167]). 이들 합병증은 만성 질병을 앓는 대상의 15 내지 25%의 사망을 야기한다(문헌["Hepatitis B Fact sheet N°204". who.int. July 2014, retrieved 4 November 2014]). 본원에서, 용어 "HBV 감염"은 급성 및 만성 B형 간염 감염을 포함한다. 또한, 용어 "HBV 감염"은 초기 감염의 증상이 없는 단계, 증상이 있는 단계, 및 HBV 감염의 증상이 없는 만성 단계를 포함한다.
화합물
본원에서, 용어 "화합물"은 임의의 핵산 분자, 예컨대 본 발명에 따른 RNAi 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 임의의 접합체를 의미한다. 예를 들어, 본원에서, 화합물은 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 핵산 분자, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
조성물
용어 "조성물"은 또한 핵산 분자 화합물을 기술하는 데 사용될 수 있다. 핵산 분자 조성물은 20% 미만의 불순물, 바람직하게는 15% 또는 10% 미만의 불순물, 더욱 바람직하게는 9, 8, 7 또는 6% 미만의 불순물, 가장 바람직하게는 5% 미만의 불순물을 갖는다. 불순물은 전형적으로 1차 핵산 분자 성분보다 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 짧은(n-1 또는 n-2) 핵산 분자이다.
본 발명은 비제한적인 도면 및 실시예를 참고하여 추가로 설명된다.
발명의 상세한 설명
PAPD5 및 PAPD7은 폴리머라제 β-유사 뉴클레오티딜 전달효소의 상과에 속하는 비-정규 폴리-A 폴리머라제이다. 국제 출원 제PCT/EP2017/064981호에서, PAPD5 및 PAPD7은, HBV 표면 항원(HBsAg)의 생산 및 2개의 소분자에 의한 HBV 감염 중의 HBV RNA의 발현, 및 이어지는 siRNA 화합물의 풀(pool)의 확인에 의해, HBV 감염의 억제를 위한 관련 표적으로서 동정되었다. 국제 출원 제PCT/EP2017/064980호에서, PAPD5 또는 PAPD7을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HBV 감염의 시험관내 억제를 달성하기 위해 기술되고 조합되었다.
본 발명은 단일 핵산 분자에 의해 표적 둘 다를 억제할 수 있도록 인간 PAPD5와 인간 PAPD7 mRNA 사이에 공유된 12 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 표적 서열을 동정하였다. 인간 PAPD5와 인간 PAPD7 프리-mRNA 사이에 약 4,500개의 공유된 표적 부위가 존재한다. 약학적으로 허용되는 분자의 생성에 관하여, 오프-타겟의 수, 및 개념의 생체내 증명을 가능하게 하는 다른 종에 대한 보전, 및 의미 있는 약물동태학/약력학(PK/PD) 모델화와 같은 다른 변수를 고려할 필요가 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드
본 발명은 시험관내 및 생체내에서 PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현을 억제할 수 있는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 동정하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 인간 PAPD5 및 인간 PAPD7 둘 다에 존재하는 16 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 3개의 표적 부위 중 하나에 상보적이다.
상기 억제는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 PAPD5를 코딩하는 표적 핵산 및 PAPD7을 코딩하는 표적 핵산에 혼성화시킴으로써 달성된다. 동일한 분자가 효과적이도록 2개의 표적에 동시에 혼성화될 필요가 없음이 이해된다.
표적 핵산 1은 포유동물 PAPD5 서열, 예컨대 서열번호 1, 3 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열일 수 있다.
표적 핵산 2는 포유동물 PAPD7 서열, 예컨대 서열번호 2, 4 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열일 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 1 및 표적 2를 억제하거나 하향-조절함으로써 이의 발현을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조절은 표적의 정상적인 발현 수준과 비교하여 50% 이상의 발현의 억제, 더욱 바람직하게는 표적의 정상적인 발현 수준과 비교하여 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 발현의 억제를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, HeLa 세포를 사용하여 시험관내 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 발현 수준을 적어도 65 내지 98%, 예컨대 70 내지 95%만큼 억제할 수 있고, 이러한 범위의 표적 감소는 HBV 항원 감소, 예컨대 HBsAg 및/또는 HBeAg 감소에 대한 양호한 상관관계를 갖는 올리고뉴클레오티드를 선택하는 데 있어서 유리하다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 HeLa 세포를 사용하여 시험관내 PAPD5 및 PAPD7 단백질의 발현 수준을 50%만큼 억제할 수 있다. 본원의 "재료 및 방법" 섹션 및 실시예는 HeLa 세포에서 표적 RNA 억제를 측정하는 데 사용될 수 있는 검정을 제공한다. 표적 조절은 올리고뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머 영역과 표적 핵산 사이의 혼성화에 의해 유발된다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열과 표적 핵산 중 하나 또는 둘 다 사이의 미스매치(mismatch)를 포함한다. 미스매치에도 불구하고, 표적 핵산에 대한 혼성화는 PAPD5 및 PAPD7 발현의 목적하는 조절을 나타내는 데 여전히 충분할 수 있다. 미스매치로부터 유발되는 감소된 결합 친화도는 유리하게는 올리고뉴클레오티드의 증가된 길이 및/또는 올리고뉴클레오티드 서열 내의 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드의 증가된 수에 의해 보충될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA를 함유한다.
본 발명의 양상은 PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현을 억제할 수 있는 12 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및 서열번호 2의 표적 핵산, 또는 이의 천연 변이체에 대해 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 또는 100% 상보적인 연속 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 대해 완전히 상보적(100% 상보적)이거나, 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및 서열번호 2에 존재하는 표적 핵산 영역에 대해 93% 이상 상보적인, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보적인 12 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 표적 핵산에 대해 93% 이상 상보적인, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보적이다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6의 표적 핵산에 대해 93% 이상 상보적인, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보적이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 상의 위치 64669 내지 69429 및 서열번호 2 상의 위치 29514 내지 29530에 대해 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 상의 위치 64670 내지 64685 및 서열번호 2 상의 위치 29515 내지 29530에 대해 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 상의 위치 69414 내지 69429 및 서열번호 2 상의 위치 30731 내지 30746에 대해 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 상의 위치 759 내지 781 및 서열번호 2 상의 위치 1032 내지 1054에 대해 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 14 내지 25개, 예컨대 15 내지 22개, 예컨대 16 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 표적 핵산에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 16 내지 20개, 예컨대 15 내지 18개, 예컨대 16 내지 18개, 예컨대 16 또는 17개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 22개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 20개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 17개 이하의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 본원에 제공된 임의의 범위가 범위 종료점을 포함함이 이해되어야 한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드가 12 내지 32개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 12개 및 32개의 뉴클레오티드 둘 다가 포함된다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17 또는 18의 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진다.
추가 양상에서, 본 발명은 안티센스 가닥이 서열번호 17 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 siRNA 분자에 관한 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 분자의 영역이 서열번호 17 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 93% 이상의 동일성, 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 shRNA 분자에 관한 것이다.
연속 핵염기 서열(모티프 서열)이, 예를 들어 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 변형될 수 있음이 이해된다.
고 친화도 변형된 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 서열에 혼입되는 패턴은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 디자인으로 지칭된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드에 의해 디자인된다. 유리하게는, 고 친화도 변형된 뉴클레오시드가 사용된다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 9개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 적합한 변형은 "정의" 섹션에서 "변형된 뉴클레오시드", "고 친화도 변형된 뉴클레오시드", "당 변형", "2' 당 변형" 및 "잠금 핵산(LNA)" 하에 기술된다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 잠금 핵산(LNA)인 경우가 유리하다. 종종 사용된 LNA 뉴클레오시드는 옥시-LNA 또는 cET이다.
추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 적합한 뉴클레오시드간 변형은 "정의" 섹션에서 "변형된 뉴클레오시드간 연결기" 하에 기술된다. 연속적인 뉴클레오티드 서열 내의 75% 이상, 예컨대 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기인 경우가 유리하다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 LNA 뉴클레오시드, 4 내지 8개의 LNA 뉴클레오시드, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 75% 이상의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이고, 예컨대 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 베타-D-옥시-LNA, 및 하기 LNA 뉴클레오시드 중 하나 이상을 모두 포함할 수 있다: 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, ScET 및/또는 베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합인 ENA. 추가 양태에서, 모든 LNA 사이토신 단위는 5-메틸-사이토신이다. 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열의 뉴클레아제 안정성이 뉴클레오티드 서열의 5' 말단의 1개 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 3' 말단의 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 갖는 것이 유리하다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 동원할 수 있다.
본 발명에서, 유리한 구조 디자인은 "정의" 섹션에서, 예를 들어 "갭머", "LNA 갭머", "MOE 갭머", "혼합된 날개 갭머" 및 "교호하는 플랭크 갭머" 하에 기술된 갭머 디자인이다. 갭머 디자인은 동형 플랭크, 혼합된 날개 플랭크, 교호하는 플랭크 및 갭-브레이커 디자인을 갖는 갭머를 포함한다. 본 발명에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 F-G-F' 디자인을 갖는 경우가 유리하다. "정의" 섹션에 기술된 F-G-F' 디자인 이외에, 하나의 디자인은 F 및 F' 날개 영역이 독립적으로 1 내지 8개의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, G가 동원 RNase H를 동원할 수 있는 5 내지 16개의 뉴클레오시드의 갭 영역인 것일 수 있다.
일부 양태에서, 갭머는 동형 플랭크 또는 교호하는 플랭크를 갖는 LNA 갭머이다.
본 발명의 일부 양태에서, LNA 갭머는 하기 디자인으로부터 선택된다: 동형 플랭크 디자인 2-11-3, 2-11-4, 2-12-2, 2-12-3, 2-13-2, 2-9-6, 3-10-3, 3-10-4, 3-11-2, 3-11-3, 3-12-2, 3-9-4, 4-10-2, 4-10-3, 4-11-2, 4-7-5, 4-8-4, 4-9-3, 5-10-2, 5-6-5, 5-7-4, 5-7-5, 5-8-3, 5-8-4, 5-9-2 또는 6-9-2.
본 발명의 일부 양태에서, LNA 갭머는 교호하는 플랭크 디자인 4-7-1-1-3, 4-9-1-1-2, 1-1-3-7-1-1-2, 1-1-3-9-2, 2-1-1-9-2, 2-1-1-9-3으로부터 선택된다.
표 5 및 7("재료 및 방법" 섹션)은 각각의 모티프 서열의 바람직한 디자인을 열거한다.
모든 경우에, F-G-F' 디자인은 "정의" 섹션에서, "올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D" 하에 기술된 영역 D' 및/또는 D"를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머 영역의 5' 또는 3' 단부에서 1, 2 또는 3개의 포스포다이에스터-연결된 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위를 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2개의 5' 포스포다이에스터-연결된 DNA 뉴클레오시드 및 이어지는 "정의" 섹션에 정의된 F-G-F' 갭머 영역으로 이루어진다. "정의" 섹션에 기술된 D'-F-G-F'-D" 디자인 이외에, 하나의 디자인은 a) F 영역이 1 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이고, 2 내지 5개의 동일한 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 cET, 및 0 내지 3개의 DNA 뉴클레오시드로 이루어지고; b) F' 영역이 2 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이고, 2 내지 5개의 동일한 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 cET, 및 0 내지 3개의 DNA 뉴클레오시드로 이루어지고; c) G 영역이 5 내지 11개, 예컨대 7 내지 10개의 DNA 뉴클레오티드로 이루어지고, d) 임의적으로 영역 D'가 1 내지 3개의 포스포다이에스터-연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 5' 또는 3' 단부에서 포스포다이에스터-연결된 DNA 단위를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 접합에 적합하고, 본원에 기술된 접합체 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 간으로의 전달을 위하여, ASGPR 표적화 모이어티는 접합체 모이어티로서 특히 이롭다(더욱 상세한 사항은 하기 "접합체" 섹션 참고).
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 7_1 내지 7_83(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 8_1 내지 8_81(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 9_1 내지 9_12(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)를 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 10_1 내지 10_18(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 11_1 내지 11_26(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 12_1 내지 12_15(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)를 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 13_1 또는 13_2(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)를 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 14_1 내지 14_13(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 15_1 내지 15_21(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 16_1 내지 16_5(표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)를 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 17_1 내지 17_183(표 7에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 18_1 내지 18_31 또는 18_250 내지 18_361(표 7에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 18_32 내지 18_249 또는 18_362 내지 18_610(표 7에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 19_1 내지 19_22(표 7에 열거된 올리고뉴클레오티드 참고)를 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 18_1, 18_5, 18_10, 18_15, 18_18, 18_19, 18_24, 18_27, 18_30, 18_346, 18_347, 18_357, 17_10, 17_137 또는 17_139를 갖는 화합물을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 18_1, 18_15, 18_30, 17_10, 17_137 또는 17_139를 갖는 화합물을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 입체정의된 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 입체정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함할 수 있다.
입체정의된 올리고뉴클레오티드 변이체를 생성하는 핵심 이점은 서열 모티프 전반에 걸친 다양성을 증가시키고, 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 서브-라이브러리를 비롯한 입체정의된 올리고뉴클레오티드(모 올리고뉴클레오티드와 비교하여 개선된 의학적 화학 특성을 가짐)를 선택하는 능력이다.
일부 양태에서, 개선된 의학적 화학 특성(또는 개선된 특성)은 하나 이상의 향상된 역가, 향상된 특이적인 활성, 향상된 조직 흡수, 향상된 세포 흡수, 향상된 효능, 변경된 생물분포, 감소된 오프-타겟 효과, 향상된 미스매치 식별, 감소된 독성, 감소된 면역원성, 변경된 혈청 단백질 결합, 개선된 작용 기간, 및 안정성으로부터 선택된다. 하나 이상의 특성에서의 개선은 모 올리고뉴클레오티드, 예컨대 스테레오랜덤 모 올리고뉴클레오티드와 비교하여 평가된다.
일부 양태에서, 개선된 특성은, 예컨대 표적 발현의 조절과 관련된 세포 기구와의 개선된 상호작용을 통해 표적 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드의 능력, 예를 들어, 향상된 RNase H 활성, 개선된 스플라이스 조절 활성 또는 개선된 마이크로RNA 억제일 수 있다.
일부 양태에서, 개선된 특성은 RNase H 특이성, RNase H 대립형질 식별(즉, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및/또는 RNase H 활성 사이의 식별)이다. 일부 양태에서, 개선된 특성은 RNase H 특이성, RNase H 대립형질 식별 및/또는 RNase H 활성이 아니다. 일부 양태에서, 개선된 특성은 개선된 세포내 흡수이다. 일부 양태에서, 개선된 특성은 감소된 톡성, 예컨대 세포독성 또는 간독성이다.
모 올리고뉴클레오티드 또는 다른 입체정의된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 하나 이상의 개선된 특성을 나타내는 입체정의된 올리고뉴클레오티드는 개선된 포스포로티오에이트 변이체로 지칭된다.
본 발명의 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 18_223, 18_36, 18_196, 18_188, 18_243을 갖는 화합물을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 핵산 분자, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아시알로당단백질 수용체(ASGPr), 예컨대 2가 또는 3가 GalNAc 클러스터에 결합할 수 있는 접합체 모이어티로 공유 결합으로 부착함으로써 간으로 직접 표적화된다.
접합체
HBV 감염이 주로 간의 간세포에 영향을 주므로, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접합체 모이어티에 접합시켜 간으로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 비접합된 올리고뉴클레오티드에 비해 증가시키는 것이 유리하다. 한 양태에서, 간 표적화 모이어티는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 콜레스테롤 또는 다른 지질 또는 접합체 모이어티를 포함하는 모이어티로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 발명은 접합체 모이어티에 공유 결합으로 부착되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체를 제공한다.
아시알로당단백질 수용체(ASGPR) 접합체 모이어티는 갈락토스의 친화도 이상의 친화도를 갖고 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 탄수화물 모이어티(ASPGR 표적화 모이어티)를 포함한다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 수많은 갈락토스 유도체의 친화도는 연구되어 있거나(예를 들어, 문헌[Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686] 참고), 당해 분야에 전형적인 방법을 사용하여 즉시 측정된다.
한 양태에서, 접합체 모이어티는 갈락토스, 갈락토사민, N-폼일-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티를 포함한다. 유리하게는, 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다.
ASGPR 접합체 모이어티를 생성하기 위하여, ASPGR 표적화 모이어티(바람직하게는 GalNAc)는 접합체 스캐폴드에 부착될 수 있다. 일반적으로, ASPGR 표적화 모이어티는 스캐폴드의 동일한 단부에 존재할 수 있다. 한 양태에서, 접합체 모이어티는 각각의 GalNAc 모이어티를 분지 분자(안티센스 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있음)에 연결하는 스페이서에 연결된 2 내지 4개의 말단 GalNAc 모이어티로 이루어진다.
추가 양태에서, 접합체 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티에 대하여 1가, 2가, 3가 또는 4가이다. 유리하게는, 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티를 포함한다.
접합체 모이어티를 구성하는 ASPGR 표적화 스캐폴드는, 예를 들어 GalNAc 모이어티를 이의 C-l 탄소를 통해 스페이서에 연결함으로써 생성될 수 있다. 바람직한 스페이서는 가요성 친수성 스페이서이다(미국 특허공보 제US 5,885,968호; 문헌[Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546]). 바람직한 가요성 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분지점은 2 또는 3개의 GalNAc 모이어티 또는 다른 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티의 부착을 허용하고 올리고뉴클레오티드로의 분지점의 부착을 추가로 허용하는 임의의 소분자일 수 있고, 이러한 구축물은 GalNAc 클러스터 또는 GalNAc 접합체 모이어티로 지칭된다. 예시적인 분지점 기는 다이-리신이다. 다이-리신 분자는 3개의 GalNAc 모이어티 또는 다른 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티가 부착될 수 있는 3개의 아민 기, 및 다이-리신이 올리고머에 부착될 수 있는 카복실 반응기를 함유한다. 문헌[Khorev, et al 2008 Bioorg. Med. Chem. Vol 16, pp. 5216]은 또한 적합한 3가 분지의 합성을 기술한다. 다른 시판 중인 분지는 1,3-비스-[5-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)] 포스포르아미다이트(글렌 리서치(Glen Research) 카탈로그 번호: 10-1920-xx); 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포르아미다이트(글렌 리서치 카탈로그 번호: 10-1922-xx); 및 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)프로필옥시메틸]메틸렌옥시프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포르아미다이트; 및 1-[5-(4,4'-다이메톡시-트라이틸옥시)펜틸아미도]-3-[5-플루오레노메톡시-카보닐-옥시-펜틸아미도]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포르아미다이트(글렌 리서치 카탈로그 번호: 10-1925-xx)를 포함한다.
다른 GalNAc 접합체 모이어티는, 예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2014/179620호 및 제WO 2016/055601호 및 국제 출원 제PCT/EP2017/059080호(본원에 참고로 혼입됨)에 기술된 것, 및 부착된 GalNAc 모이어티를 갖는 작은 펩티드, 예컨대 Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3; 간세포 상의 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 글리코트라이펩티드, 예컨대, 문헌[Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297] 참고); 리신-기반 갈락토스 클러스터(예컨대, L3G4; 문헌[Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214]); 및 콜란-기반 갈락토스 클러스터(예컨대, 아시알로당단백질 수용체에 대한 탄수화물 인식 모티프)를 포함할 수 있다.
ASGPR 접합체 모이어티, 특히 3가 GalNAc 접합체 모이어티는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'-단부에 부착될 수 있다. 한 양태에서, ASGPR 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 연결된다.
하나 이상의 연결기는 접합체 모이어티(예컨대, 분지 분자에서)와 올리고뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있다. 접합체 모이어티와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이에, 임의적으로 비-절단성 연결기, 예컨대 C6 연결기와 조합으로 생체절단성 연결기를 갖는 것이 유리하다. 연결기는 "정의" 섹션에서 "접합체 연결기" 하에 기술된 연결기로부터 선택될 수 있고, 특히 생체절단성 영역 D' 또는 D" 연결기가 유리하다.
한 양태에서, 접합체 모이어티는 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 예컨대 도 1에 도시된 것, 특히 도 1D에 도시된 것이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 "재료 및 방법" 섹션에서 표 9의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_12이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_13이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_14이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_15이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_16이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_18이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_20이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_21이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_22이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_30이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_35이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 20_36이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 21_2이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 21_33이다.
본 발명의 양태에서, 접합체 화합물은 화합물 번호 21_34이다.
제조 방법
추가 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 단위를 반응시키고, 이에 의해 올리고뉴클레오티드에 포함된 공유 결합으로 연결된 연속적인 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 포스포라미다이트 화학을 사용한다(예를 들어, 문헌[Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313]). 추가 양태에서, 상기 방법은 연속적인 뉴클레오티드 서열을 접합 모이어티(리간드)와 반응시켜 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합된 올리고뉴클레오티드와 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 조성물의 제조를 위해 제공된다.
약학 조성물
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 접합체 화합물, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 전형적인 약학 조성물은, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 접합체 화합물, 및 희석제, 담체 또는 부형제를 혼합함으로써, 제조된다.
약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충된 염수(PBS)를 포함한다. 일부 양태에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트 완충된 염수이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 허용되는 희석제에 50 내지 300 μM 용액의 농도로 사용된다.
핵산 분자의 경우, 이러한 적합한 제형을 구성하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 접합체 화합물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달을 위한 방법은 간단한 검토를 위해, 예컨대 문헌[Langer, Science 249:1527-1533, 1990]을 참고한다. 국제 공개공보 제WO 2007/031091호는 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 항원보강제의 더욱 적합하고 바람직한 예를 제공한다(본원에 참고로 혼입됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 국제 공개공보 제WO 2007/031091호에 제공된다.
본 발명에 따른 화합물은 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 통상적인 산-부가 염 또는 염기-부가 염을 지칭하고, 적합한 비독성 유기 또는 무기 산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성된다. 산-부가 염은, 예를 들어 무기 산(예컨대, 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 황산, 설팜산, 인산 및 질산)으로부터 유도된 것, 및 유기 산(예컨대, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 메탄설폰산, 옥살산, 석신산, 시트르산, 말산, 락트산, 퓨마르산 등)으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기-부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨 및 4차 암모늄 수산화물, 예컨대 테트라메틸 암모늄 수산화물로부터 유도된 것을 포함한다. 약학 화합물을 염으로 화학적으로 변형시키는 것은 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 가용성을 수득하기 위해 약제사에게 주지된 기술이다. 이는, 예를 들어 문헌[Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435] 또는 문헌[Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 and 1456-1457]에 기술되어 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염 또는 칼륨 염일 수 있다.
적용례
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
연구에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 세포(예컨대, 시험관내 세포 배양물) 및 실험 동물에서 PAPD5 및 PAPD7 단백질의 합성을 특이적으로 조절하는 데 사용될 수 있고, 이에 의해 표적의 기능적 분석 또는 치료 중재를 위한 표적으로서의 유용성의 사정을 용이하게 한다. 전형적으로, 표적 조절은 단백질을 생산하는 mRNA를 분해시키거나 억제하고, 이에 의해 단백질 형성을 방지함으로써, 또는 단백질을 생산하는 유전자 또는 mRNA의 조절자를 분해시키거나 억제함으로써 달성된다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래하는 합성 핵산일 수 있다.
PAPD5 및 PAPD7을 발현하는 표적 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법이 또한 본 발명에 의해 포괄되고, 상기 방법은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물을 효과량으로 상기 세포에 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포, 특히 인간 세포이다. 표적 세포는 포유동물 조직의 시험관내 세포 배양물 또는 생체내 세포 형성 부분일 수 있다. 바람직한 양태에서, 표적 세포는 간에 존재한다. 표적 세포는 간세포일 수 있다.
본 발명의 한 양상은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 양상에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 HBV의 증식을 억제할 수 있다. 특히, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 변수 중 하나 이상에 영향을 줄 수 있다: i) 바이러스 RNA의 발현의 감소; ii) 바이러스 RNA(HBV RNA)로부터 유래하는 바이러스 DNA(HBV DNA)의 생산, iii) 새로운 바이러스 입자(HBV 입자)의 생산의 감소; iv) HBV 항원, 특히 HBsAg 및/또는 HBeAg의 생산의 감소.
예를 들어, HBV의 증식을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 i) 바이러스 RNA(HBV RNA)의 발현을 대조군과 비교하여 40% 이상, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소시키거나; ii) 바이러스 DNA(HBV DNA)의 생산을 대조군과 비교하여 40% 이상, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소시키거나; iii) 새로운 바이러스 입자(HBV 입자)의 생산을 대조군과 비교하여 40% 이상, 예컨대 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소시키거나; iv) HBsAg 및/또는 HBeAg의 생산 및/또는 분비를 대조군과 비교하여 50% 이상, 예컨대 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 심지어 상기 항원 중 하나 또는 둘 다의 고갈을 완료할 때까지 감소시킬 수 있다. 대조군은 비처리된 세포 또는 동물, 또는 적절한 대조군으로 처리된 세포 또는 동물일 수 있다.
HBV의 증식의 억제는 HBV 감염된 dHepaRG 세포 또는 ASGPR-dHepaRG 세포를 사용하여 시험관내 측정될 수 있거나, 마우스 PAPD5 및 PAPD7에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드의 경우, "재료 및 방법" 섹션에 기술된 AAV/HBV 마우스 모델을 사용하여 생체내 측정될 수 있다. HBsAg 및/또는 HBeAg의 분비의 억제는 ELISA에 의해, 예컨대, 제조사의 지시에 따라 CLIA ELISA 키트(오토바이오 다이아그노스틱)에 의해 측정될 수 있다. 세포내 HBV mRNA의 생산의 억제는, 예컨대, "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이, 실시간 PCR에 의해 측정될 수 있다. 시험 화합물이 HBV의 생산을 억제하는지 여부를 평가하는 추가 방법은, 예컨대, 국제 공개공보 제WO 2015/173208호에 기술된 또는 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 RT-qPCR; 노턴 블롯(Northern Blot); 동일 반응계 혼성화, 또는 면역-형광법에 의해 HBV DNA의 분비를 측정하는 것이다.
HBsAg 분비의 감소에 기인하여, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 HBV 감염의 발병을 억제하거나 이의 치료에 사용될 수 있다. 특히, HBeAg 분비의 억제에 기인하여, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 단지 HBsAg의 분비를 감소시키는 화합물과 비교하여 만성 HBV 감염의 발병을 더욱 효율적으로 억제하거나 이를 치료한다. 또한, 기대 모체에서 HBeAg의 감소는 또한 이의 자손의 만성 HBV 감염의 발병을 억제할 수 있다. 따라서, HBeAg 분비의 감소에 기인하여, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 만성 HBV 감염의 발병(예컨대, HBV 감염된 모체의 자손에서의 만성 HBV 감염의 발병)을 억제하고, HBV 감염된 인간의 감염성을 감소시킨다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 HBV 감염된 개체에서 HBsAg 및 HBeAg의 분비를 감소시키기 위한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물이 숙주 게놈에 통합된 HBV DNA로부터 HBsAg 발현을 감소시킬 수 있는 경우가 유리하다.
본 발명의 추가 양상은 만성 HBV 감염의 발병을 억제하거나 치료하기 위한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양상은 HBV 감염된 인간의 감염성을 감소시키기 위한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 HBV 감염된 모체의 자손에서 만성 HBV 감염의 발병을 억제한다. 이러한 모체는 바람직하게는 HBeAg 양성이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물로 치료될 대상(또는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물을 예방적으로 수용할 대상)은 바람직하게는 인간, 더욱 바람직하게는 HBsAg 양성 및/또는 HBeAg 양성인 인간 환자, 더욱 더 바람직하게는 HBsAg 양성 및 HBeAg 양성인 인간 환자이다. 상기 인간 환자는 예측된 모체, 예컨대 HBeAg 양성 및/또는 HBsAg 양성인 예측된 모체, 더욱 바람직하게는 HBeAg 양성 및 HBsAg 양성인 예측된 모체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 효과량의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, HBV 감염의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약제, 특히 HBV 감염 또는 만성 HBV 감염의 치료 또는 예방, 또는 HBV 감염된 인간의 감염성의 감소에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명의 핵산 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 약제는 피하 투여를 위한 투여 형태로 제조된다.
본 발명은 또한 상기 약제가 정맥내 투여를 위한 투여 형태인 약제의 제조를 위한, 본 발명의 핵산 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 병용 요법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 다른 항-HBV 제제, 예컨대 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1(페길화되거나 페길화되지 않음), 리바피린, 라미부딘(3TC), 엔테카비르, 테노포비르, 텔비부딘(LdT), 아데포비르, 또는 최근에 생긴 다른 항-HBV 제제, 예컨대 HBV RNA 복제 억제제, HBsAg 분비 억제제, HBV 캡시드 억제제, 안티센스 올리고머(예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2012/145697호 및 제WO 2014/179629호에 기술됨), siRNA(예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2005/014806호, 제WO 2012/024170호, 제WO 2012/2055362호, 제WO 2013/003520호, 제WO 2013/159109호, 제WO 2017/027350호 및 제WO 2017/015175호에 기술됨), HBV 치료 백신, HBV 예방 백신, HBV 항체 요법(단클론성 또는 다클론성), 또는 HBV의 치료 및/또는 예방을 위한 TLR 2, 3, 7, 8 또는 9 작용제와 병용될 수 있다.
투여
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물은 올바른 의료 행위에 일치하는 방식으로 제형화되고 투여되고 투약된다. 이러한 맥락에서, 고려 인자는 치료받을 특정 포유동물, 개별적 환자의 임상적 상태, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 환자의 나이 및 성별, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 본원에서, "효과량"("(치료적) 효과 투여량"으로도 공지됨)은, 의학 박사 또는 다른 임상의에 의해 모색된, 대상의 생물학적 또는 의료적 반응을 유도하는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물 또는 약학 조성물의 "효과량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이며, HBsAg 및/또는 HBeAg를 억제하는 데 필요한 최소량이다. 예를 들어, 이러한 양은 수용자의 세포 또는 완전체로서 포유동물에 독성인 양보다 적을 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 0.1 내지 15 mg/kg, 예컨대 0.2 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.25 내지 5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 투여는 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회 또는 심지어 1개월 1회일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 약학 조성물은 국소(예컨대, 피부, 흡입, 안구 또는 귀) 또는 장(예컨대, 경구 또는 위장관) 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내 또는 척추강내) 투여될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산 분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 접합체 화합물, 또는 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 경로에 의해 투여된다. 한 양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내 투여된다. GalNAc 접합된 화합물을 사용하여, ASGP 수용체의 포화를 지연시키기 위해 피하 투여하는 것이 유리할 수 있다.
병용 요법
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 다른 치료제와의 병용 치료에 사용하기 위한 것이다. 치료제는, 예를 들어 상기 질병 또는 질환을 위한 치료 표준일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 올리고머 또는 올리고머 접합체는 안티센스(예컨대, 다른 LNA 올리고머), siRNA(예컨대, ARC520), 압타머, 모폴리노 또는 임의의 다른 항바이러스제, 뉴클레오티드 서열-의존적 작용 방식을 통해 작용하는 다른 작용제, 예컨대 올리고뉴클레오티드-기반 항바이러스제(예컨대, 서열 특이적인 올리고뉴클레오티드-기반 항바이러스제)와 병용으로 사용될 수 있다.
추가로, 예를 들어, 본 발명의 올리고머 또는 올리고머 접합체는 다른 작용제, 예컨대 면역 자극성 항바이러스제 화합물, 예컨대 인터페론(예컨대, 페길화된 인터페론 알파), TLR7 작용제(예컨대, GS-9620) 또는 치료 백신과 병용으로 사용될 수 있다.
추가로, 예를 들어, 본 발명의 올리고머 또는 올리고머 접합체는 항바이러스제 활성을 갖는 다른 작용제, 예컨대 소분자와 병용으로 사용될 수 있다. 이러한다른 작용제는, 예를 들어, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 억제제(예컨대, 엔테카비르 또는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트), 이입(encapsidation) 억제제, 도입 억제제(예컨대, 미르클루덱스(Myrcludex) B)일 수 있다.
특정 양태에서, 추가적인 치료제는 HBV 제제, 간염 C 바이러스(HCV) 제제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비-스테로이드성 항-염증(NSAID) 제제, 항진균제, 구충제, 구토방지제, 지사제 또는 면역억제제일 수 있다.
특정 관련 양태에서, 추가적인 HBV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1(페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제2 안티센스 올리고머; HBV 치료 백신; HBV 예방 백신; 라미부딘(3TC); 엔테카비르(ETV); 테노포비르 다이이소프록실 푸마레이트(TDF); 텔비부딘(LdT); 아데포비르; 또는 HBV 항체 요법(단클론성 또는 다클론성)일 수 있다.
다른 특정 관련 양태에서, 추가적인 HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1(페길화된 및 비페길화된); 리바비린; 페가시스; HCV RNA 복제 억제제(예컨대, 비로파마(ViroPharma)의 VP50406 시리즈); HCV 안티센스 제제; HCV 치료 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제 억제제; 또는 HCV 단클론성 또는 다클론성 항체 요법일 수 있다.
본 발명의 양태
본 발명의 하기 양태는 본원에 기술된 임의의 다른 양태와 조합될 수 있다.
1. 12 내지 32개의 뉴클레오티드 길이의 핵산 분자로서, PAPD5 및 PAPD7 둘 다의 발현을 억제할 수 있는 12 내지 22개의 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
2. 양태 1에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 및 서열번호 2의 표적 핵산에 대해 93% 이상 상보적인, 핵산 분자.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 및 서열번호 2의 표적 핵산에 대해 적어도 100% 상보적인, 핵산 분자.
4. 양태 1 또는 3에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 표적 핵산에 대해 상보적인, 핵산 분자.
5. 양태 1 또는 3에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6의 표적 핵산에 대해 상보적인, 핵산 분자.
6. 양태 1 내지 3 및 5 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자가 서열번호 1 상의 위치 759 내지 781 및 서열번호 2 상의 위치 1032 내지 1054에 상보적인, 핵산 분자.
7. 양태 1 내지 4 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자가 서열번호 1 상의 위치 64669 내지 69429 및 서열번호 2 상의 위치 29514 내지 29530에 상보적인, 핵산 분자.
8. 양태 1 내지 4 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자가 서열번호 1 상의 위치 69414 내지 69429 및 서열번호 2 상의 위치 30731 내지 30746에 상보적인, 핵산 분자.
9. 양태 1 내지 8 중 어느 한 양태에 있어서, -15 kcal 미만의 ΔG°에 의해 서열번호 1 및 서열번호 2의 표적 핵산을 혼성화시킬 수 있는 핵산 분자.
10. 양태 2 내지 9 중 어느 한 양태에 있어서, 표적 핵산이 RNA인, 핵산 분자.
11. 양태 10에 있어서, RNA가 프리-mRNA인, 핵산 분자.
12. 양태 1 내지 11 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자가 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로부터 선택되는, 핵산 분자.
13. 양태 1 내지 11 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자가 단일 가닥의 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 핵산 분자.
14. 연속적인 뉴클레오티드 서열이 14개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, 특히 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진, 양태 12 또는 13에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 연속적인 뉴클레오티드 서열이 14 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진, 양태 12 또는 13에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 양태 15에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 16 내지 18개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
17. 올리고뉴클레오티드가 14 내지 25개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진, 양태 1 내지 16 중 어느 한 양태에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 양태 17에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 15 내지 22개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 양태 17 또는 18에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 16 내지 20개의 뉴클레오티드 길이를 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
20. 양태 12 내지 19 중 어느 한 양태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 양태 12 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 양태 12 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 17 및 서열번호 18로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 양태 12 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 서열번호 19를 포함하거나 이로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
24. 양태 12 내지 23 중 어느 한 양태에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 상보적인 표적 핵산과 비교하여 0 내지 3개의 미스매치를 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
25. 양태 24에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 비교하여 1개의 미스매치를 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 양태 24에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 비교하여 2개의 미스매치를 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 양태 24에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산 서열 둘 다에 완전히 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. 양태 12 내지 27 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. 양태 28에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 고 친화도 변형된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 양태 28 또는 29에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 양태 30에 있어서, 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 독립적으로 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 양태 28 내지 31 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 양태 32에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드가 옥시-LNA, 아미노-LNA, 티오-LNA, cET 및 ENA로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 양태 32 또는 33에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드가 하기 2'-4' 가교 -O-CH2-를 갖는 옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 양태 34에 있어서, 옥시-LNA가 베타-D-옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 양태 32 또는 33에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드가 하기 2'-4' 가교 -O-CH(CH3)-을 갖는 cET인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 양태 36에 있어서, cET가 (S)cET, 즉, 6'(S)메틸-베타-D-옥시-LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 양태 32 또는 33에 있어서, LNA가 하기 2'-4' 가교 -O-CH2-CH2-를 갖는 ENA인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 양태 12 내지 33 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
40. 양태 39에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기가 뉴클레아제 내성인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 양태 39 또는 40에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열 내의 75% 이상의 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
42. 양태 39 또는 40에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
43. 양태 41 또는 42에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기가 입체정의된, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
44. 양태 12 내지 43 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 동원할 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
45. 양태 44에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열이 갭머인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
46. 양태 45에 있어서, 갭머가 구조식 5'-F-G-F'-3'를 갖고, 이때 F 및 F' 날개 영역이 독립적으로 양태 31 내지 38 중 어느 한 양태에 기재된 1 내지 7개의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지고, G가 RNase H를 동원할 수 있는 5 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
47. 양태 46에 있어서, 각각의 날개(F 및 F')가 상기 날개의 5' 말단 및 3' 말단에서 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 가짐을 특징으로 하고, G 영역이 상기 날개 영역(예컨대, G 영역의 5' 및 3' 말단)에 인정한 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
48. 양태 46 또는 47에 있어서, 영역 F 및 F'의 모든 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 동일한 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
49. 양태 46 내지 48 중 어느 한 양태에 있어서,
a) F 영역이 1 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이고, 1 내지 5개의 동일한 LNA 뉴클레오시드 및 0 내지 3개의 DNA 뉴클레오시드로 이루어지고;
b) F' 영역이 2 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이고, 2 내지 5개의 동일한 LNA 뉴클레오시드 및 0 내지 3개의 DNA 뉴클레오시드로 이루어지고;
c) G 영역이 RNase H를 동원할 수 있는 5 내지 11개의 뉴클레오티드이고;
d) 임의적으로 1 내지 3개의 포스포다이에스터-연결된 DNA 뉴클레오시드를 갖는 D' 영역이 상기 F 영역의 5' 단부에 위치되는,
올리고뉴클레오티드.
50. 양태 47에 있어서, 영역 F 및 F'가 동일한 LNA 뉴클레오시드로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
51. 양태 46 내지 48 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 F 및 F'의 모든 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 옥시-LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
52. 양태 46 또는 47에 있어서, 하나 이상의 영역 F 또는 F'가 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA 및 2'-플루오로-DNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
53. 양태 46 내지 52 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 G의 RNase H 동원 뉴클레오시드가 DNA, 알파-L-LNA, C4' 알킬화된 DNA, ANA 및 2' F-ANA 및 UNA로부터 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
54. 양태 53에 있어서, 영역 G의 뉴클레오시드가 DNA 및/또는 알파-L-LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
55. 양태 46, 53 및 54 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 G가 75% 이상의 DNA 뉴클레오시드로 이루어진, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
56. 양태 55에 있어서, 영역 G의 모든 뉴클레오시드가 DNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
57. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 7_1 내지 7_83 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
58. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 8_1 내지 8_81 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
59. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 9_1 내지 9_12 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
60. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 10_1 내지 10_18 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
61. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 11_1 내지 11_26 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
62. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 12_1 내지 12_15 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
63. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 13_1 및 13_2 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
64. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 14_1 내지 14_13 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
65. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 15_1 내지 15_21 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
66. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 16_1 내지 16_5 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
67. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 17_1 내지 17_183 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
68. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 18_1 내지 18_31 및 18_250 내지 18_361 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
69. 양태 68에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 18_1, 18_5, 18_10, 18_15, 18_18, 18_19, 18_24, 18_27, 18_30, 18_346, 18_347, 18_357, 17_10, 17_137 및 17_139 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
70. 양태 69에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 18_1, 18_15, 18_27, 18_30, 17_10, 17_137 및 17_139 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
71. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 18_32 내지 18_249 및 18_362 내지 18_610 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
72. 양태 71에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 18_223, 18_36, 18_196, 18_188 및 18_243 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
73. 양태 12 내지 55 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 19_1 내지 19_22 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
74. 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자 또는 양태 14 내지 57 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착되는 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체 화합물.
75. 양태 74에 있어서, 접합체 모이어티가 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친지성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소, 비타민, 바이러스 단백질 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 접합체 화합물.
76. 양태 74 또는 75에 있어서, 접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는, 접합체 화합물.
77. 양태 76에 있어서, 접합체 모이어티가 갈락토스, 갈락토사민, N-폼일-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티를 포함하는, 접합체 화합물.
78. 양태 77에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)인, 접합체 화합물.
79. 양태 77 또는 78에 있어서, 접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티에 대하여 1가, 2가, 3가 또는 4가인, 접합체 화합물.
80. 양태 79에 있어서, 접합체 모이어티가 2 내지 4개의 말단 GalNAc 모이어티, 및 각각의 GalNAc 모이어티를, 안티센스 화합물에 접합될 수 있는 분지 분자에 연결하는 스페이서로 이루어진, 접합체 화합물.
81. 양태 80에 있어서, 스페이서가 PEG 스페이서인, 접합체 화합물.
82. 양태 76 내지 81 중 어느 한 양태에 있어서, 접합체 모이어티가 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인, 접합체 화합물.
83. 양태 76 내지 82 중 어느 한 양태에 있어서, 접합체 모이어티가 도 1의 3가 GalNAc 모이어티 중 하나로부터 선택되는, 접합체 화합물.
84. 양태 83에 있어서, 접합체 모이어티가 도 10의 3가 GalNAc 모이어티인, 접합체 화합물.
85. 양태 74 내지 84 중 어느 한 양태에 있어서, 핵산 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치되는 연결기를 포함하는 접합체 화합물.
86. 양태 85에 있어서, 연결기가 생리학적으로 불안정한 연결기인, 접합체 화합물.
87. 양태 86에 있어서, 생리학적으로 불안정한 연결기가 뉴클레아제 민감성 연결기인, 접합체 화합물.
88. 양태 86 또는 87에 있어서, 생리학적으로 불안정한 연결기가 2 내지 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기로 구성되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
89. 양태 86 내지 88 중 어느 한 양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 구조식 D'-F-G-F' 또는 F-G-F'-D"를 갖고, 이때 F, F' 및 G가 양태 46 내지 56 중 어느 한 양태에 정의된 바와 같고, D' 또는 D"가 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 1, 2 또는 3개의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 접합체 화합물.
90. 양태 88 또는 89에 있어서, 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기가 CA 다이뉴클레오티드와 연관되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
91. 양태 76 내지 90 중 어느 한 양태에 있어서, 비접합된 핵산 분자 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교되는, 간과 신장 사이의 개선된 세포 분포, 또는 접합체 화합물의 간으로의 개선된 세포 흡수를 나타내는 접합체 화합물.
92. 양태 76 내지 91 중 어느 한 양태에 있어서, 접합체 화합물이 화합물 번호 20_12, 20_13, 20_14, 20_15, 20_16, 20_18, 20_20, 20_21, 20_22, 20_30, 20_35, 20_36, 21_2, 21_33 및 21_34로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체 화합물.
93. 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자, 양태 14 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 양태 74 내지 92 중 어느 한 양태에 따른 접합체 화합물 또는 이의 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 포함하는 약학 조성물.
94. 뉴클레오티드 단위를 반응시켜 안티센스 올리고뉴클레오티드에 포함되는 공유 결합으로 연결된 연속적인 뉴클레오티드 단위를 형성하는, 양태 14 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
95. 양태 94에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열을, 양태 76 내지 84 중 어느 한 양태에 기술된 비-뉴클레오티드 접합 모이어티와 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
96. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제와 혼합하는 단계를 포함하는, 양태 93에 따른 조성물의 제조 방법.
97. PAPD5 및 PAPD7을 발현하는 표적 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법으로서, 상기 방법이 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자, 양태 14 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 양태 74 내지 92 중 어느 한 양태에 따른 접합체 화합물 또는 양태 93에 따른 약학 조성물을 효과량으로 상기 세포에 투여함을 포함하는, 방법.
98. 양태 97에 있어서, PAPD5 및 PAPD7 발현이, 어떠한 처리도 없는 수준과 비교하여, 표적 세포에서 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70%% 이상, 80%% 이상, 90%% 이상, 또는 95%% 이상만큼 감소되는, 방법.
99. 치료 또는 예방 효과량의 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자, 양태 14 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 양태 74 내지 92 중 어느 한 양태에 따른 접합체 화합물 또는 양태 93에 따른 약학 조성물을 질병 또는 질병에 대한 민감성을 앓고 있는 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 질병의 치료 또는 예방 방법.
100. 대상에서 질병의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한, 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자, 양태 14 내지 57 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 양태 74 내지 92 중 어느 한 양태에 따른 접합체 화합물 또는 양태 93에 따른 약학 조성물.
101. 대상에서 질병의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 따른 핵산 분자, 양태 14 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 양태 74 내지 92 중 어느 한 양태에 따른 접합체 화합물의 용도.
102. 양태 99 내지 101 중 어느 한 양태에 있어서, 질병이 HBV 감염 또는 만성 HBV 감염인, 방법, 핵산 분자 또는 용도.
103. 양태 102에 있어서, HBsAg 및/또는 HBeAg 및/또는 세포내 HBV mRNA 및/또는 HBV DNA의 분비가 감소되는, 방법, 핵산 분자 또는 용도.
104. 양태 102 또는 103에 있어서, HBsAg가, 어떠한 처리도 없는 수준과 비교하여, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상만큼 감소되는, 방법, 핵산 분자 또는 용도.
105. 양태 99 내지 104 중 어느 한 양태에 있어서, 대상이 포유동물인, 방법, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
106. 양태 105에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
실시예
실시예는 본 발명을 설명한다.
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물
[표 4]
올리고뉴클레오티드 모티프 서열 표적화 인간 및 마우스 전사체의 목록(서열은 서열번호, 모티프 서열, 및 인간 PAPD5 전사체(서열번호 1) 및 인간 PAPD7 전사체(서열번호 2) 상에서 표적화하는 위치로 표시됨).
모티프 서열은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 핵염기의 연속 서열을 나타낸다.
[표 5]
올리고뉴클레오티드 디자인 및 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물의 목록(화합물은 화합물 번호로 표시되고, 표 4의 모티프 서열을 기준으로 함).
디자인은 갭머 디자인(F-G-F')을 지칭한다. 전통적인 갭머 디자인에서, 예컨대, 플랭크(F 및 F')의 3-10-3 모든 뉴클레오티드는 동일한 2'-당 변형된 뉴클레오시드(예컨대, LNA, cET 또는 MOE), 및 갭(G)을 형성하는 중간의 DNA의 스트레치로 구성된다. 교호하는 플랭크 디자인을 갖는 갭머에서, 올리고뉴클레오티드의 플랭크는 2' 당 변형된 뉴클레오시드(M)의 수 및 이어서 DNA 뉴클레오시드(D)의 수를 나타내는 일련의 정수로서 주석된다. 예를 들어 2-2-1 모티프를 갖는 플랭크는 5' [M]2-[D]2-[M] 3'를 나타내고, 1-1-1-1-1 모티프는 5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'를 나타낸다. 플랭크는 둘 다 5' 및 3' 말단에서 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 갖는다. 다수의 DNA 뉴클레오시드(전형적으로, 5 내지 16개)로 구성되는 갭 영역(G)은 플랭크 사이에 위치한다.
표에서 제목 "올리고뉴클레오티드 화합물"은 모티프 서열의 특정 디자인을 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 5-메틸 사이토신 DNA는 "e"로 제시되고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
[표 6]
인간 및 사이노몰거스 원숭이를 표적화하는 올리고뉴클레오티드 모티프 서열의 목록(서열은 서열번호, 모티프 서열(핵염기 서열), 및 이들이 인간 PAPD5 전사체(서열번호 1) 및 인간 PAPD7 전사체(서열번호 2) 상에서 표적화하는 위치로 표시됨).
모티프 서열은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 핵염기의 연속 서열을 나타낸다.
[표 7]
올리고뉴클레오티드 디자인 및 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물의 목록(화합물은 화합물 번호로 표시되고, 표 6의 모티프 서열을 기준으로 함).
디자인은 갭머 디자인(F-G-F')을 지칭한다. 전통적인 갭머 디자인에서, 예컨대, 플랭크(F 및 F')의 3-10-3 모든 뉴클레오티드는 동일한 2'-당 변형된 뉴클레오시드(예컨대, LNA, cET 또는 MOE), 및 갭(G)을 형성하는 중간의 DNA의 스트레치로 구성된다. 교호하는 플랭크 디자인을 갖는 갭머에서, 올리고뉴클레오티드의 플랭크는 2' 당 변형된 뉴클레오시드(M)의 수 및 이어서 DNA 뉴클레오시드(D)의 수를 나타내는 일련의 정수로서 주석된다. 예를 들어, 2-2-1 모티프를 갖는 플랭크는 5' [M]2-[D]2-[M] 3'를 나타내고, 1-1-1-1-1 모티프는 5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'를 나타낸다. 플랭크 둘 다는 5' 및 3' 말단에서 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 갖는다. 다수의 DNA 뉴클레오시드(전형적으로, 5 내지 16개)로 구성되는 갭 영역(G)은 플랭크 사이에 위치한다.
표에서 제목 "올리고뉴클레오티드 화합물"은 모티프 서열의 특정 디자인을 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 5-메틸 사이토신 DNA는 "e"로 제시되고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
표 8에서, 모 올리고뉴클레오티드 화합물은 이의 서열 모티프 및 디자인으로 표시된다. 상기 모 화합물의 뉴클레오시드간 연결기의 입체정의 모티프 상기 서열 및 디자인 아래에 표시되고, 완전한 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 갭머를 나타낸다. 상기 모체의 입체정의된 변이체는 모 화합물 아래의 화합물 번호 및 입체정의된 모티프에 의해 열거된다. 표는 3개의 모 화합물 화합물 번호 18_1, 18_347 및 18_12를 함유한다.
[표 8]
입체정의된 변이체의 목록.
모 올리고뉴클레오티드 화합물에 관하여, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
입체정의/입체정의된 모티프에 관하여, X는 스테레오랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, 명세에 정의된 바와 같이, R은 하나의 입체 이성질체 형태를 나타내고, S는 다른 입체 이성질체 형태를 나타내고, H는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서의 수소 원자를 나타낸다. 입체정의된 모티프의 첫 번째 문자(X, R 또는 S)는 올리고뉴클레오티드의 5' 단부로부터의 뉴클레오시드 1과 2 사이의 뉴클레오시드간 연결기에 상응한다.
[표 9]
올리고뉴클레오티드 모티프 서열, 및 5' ca 생체절단성 연결기를 갖는 안티센스 화합물.
C6은 6개의 탄소를 갖는 아미노 알킬 기를 나타내고, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 아래첨자 o는 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, 달리 지시되지 않는 한, 다른 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
[표 10]
GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물.
GN2는 도 3에 제시된 3가 GalNAc 클러스터를 나타내고, C6은 6개의 탄소를 갖는 아미노 알킬 기를 나타내고, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 아래첨자 o는 포스포다이에스터 뉴클레오시드 연결기를 나타내고, 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 분자를 나타내는 화학 도면은 도 4 내지 8에 제시된다.
AAV/HBV 마우스 모델
AAV/HBV 마우스 모델에서, IHBV 게놈(AAV/HBV)을 갖는 재조합 아데노-연관된 바이러스(AAV)에 감염된 마우스는 30주 초과 동안 안정한 바이러스혈증 및 항원혈증을 유지한다(문헌[Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78]).
수컷 C57BL/6 마우스(4 내지 6주령)(특정 병원균 부재)를 SLAC(Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences; 중국 과학원의 상하이 실험 동물 센터)로부터 구입하였고, 동물 관리 시설에서 개별적으로 환기되는 우리에서 사육하였다. 우시(WuXi) IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee; 협회 동물 관리 및 사용 위원회, 우시 IACUC 프로토콜 번호 R20131126-마우스)에 의해 지시된 바와 같은 동물의 관리 및 사용을 위한 지침을 따랐다. 3일 동안 마우스가 새로운 환경에 익숙하게 하고, 실험 디자인에 따라 분류하였다.
재조합 AAV-HBV를 PBS(주사 당 200 μL)에서 희석하였다. 이러한 재조합 바이러스는 1.3 카피의 HBV 게놈(유전자형 D, 혈청형 ayw)을 갖는다.
0일에, 모든 마우스에 꼬리 정맥을 통해 200 μL AAV-HBV(1 x 1011 벡터 게놈)를 주입하였다. 사전-투여 23일(AAV-HBV 주입 후 23일)에, HBV 마커의 혈청 수준 및 체중을 기준으로 동물을 군으로 분배하였다. 각각의 군을 옥수수 속대 깔집이 있는 폴리카보네이트 우리에 수용하였다(5 마리 이하/우리). 저, 중간 및 고 HBV 역가를 분산시켜 군 평균이 군 전반에 걸쳐 유사하도록 하였다. 동물 군을 비접합되거나 GalNAc 접합될 수 있는 올리고뉴클레오티드로 처리할 수 있다. 모든 혈청 수집(0.1 mL 혈액/마우스)을, 동물을 이소플루란 흡입에 의해 마취시킨 후, 레트로-오비탈(retro-orbital) 출혈에 의해 수행하였다.
HeLa 세포주
HeLa 세포주를 인증된 세포 배양물의 유럽 컬렉션(European Collection of Authenticated Cell Cultures)(ECACC, #93021013)에서 구입하고, 37℃ 및 5% CO2의 습한 인큐베이터에서 공급자에 의해 추천된 바와 같이 유지하였다. 검정을 위하여, 2,500 세포/웰을 96 멀티 웰 플레이트 중에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM 글루타민 AQ, 1% NEAA, 25 μg/mL 겐타미신을 갖는 이글의 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(시그마(Sigma), M2279)에 시딩하였다.
분화된 HepaRG 세포 배양물(HBV 감염 없음)
HepaRG 세포(바이오프레딕스 인터내셔날, 프랑스 렌 소재, Cat# HPR101)를 윌리암의 E 배지(William's E Medium)(시그마 W4128), 성장 배지 보충액(바이오프레딕스(Biopredics), Cat# ADD710) 및 1% (v/v) 글루타맥스(GlutaMAX)-I(깁코 #32551)으로 이루어진 완전 HepaRG 성장 배지에서 2주 동안 37℃에서 5% CO2를 갖는 습한 대기 중에서 배양하였다.
분화를 개시하기 위하여, 이들이 완전히 합류될 때까지, 세포를 완전 HepaRG 성장 배지에서 2주 동안 성장시켰다. 상기 배지의 절반을 윌리암의 E 배지(시그마 W4128), 성장 배지 보충액(바이오프레딕스, Cat# ADD720) 및 1% (v/v) 글루타맥스-I(깁코 #32551)로 이루어진 HepaRG 분화 배지로 교환하였고, DMSO의 최종 농도는 0.9% (v/v)였다. 3일 후, 배지를, 7일마다 분화 배지 재생되는 약 2주 동안 세포가 유지되는 완전한 분화 배지(DMSO 1.8% (v/v)의 최종 농도)로 완전히 대체하였다. 분화된 HepaRG 세포(dHepaRG)는, 담즙-유사 세포의 단일 층에 의해 둘러싸인 간세포-유사 세포 섬을 나타냈다. 화합물 처리 전에, dHepaRG 세포를 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트(코닝 바이오코트(Corning BioCoat) REF354407) 내에 100 μL의 완전 분화 배지 중 웰 당 80,000 세포로 시딩하였다. 세포는 올리고뉴클레오티드 처리 전에 평판배양한 후 약 1주 동안 96-웰 플레이트에서 이의 분화된 표현형을 회복하게 되었다. RNA를 처리 후 6일에 단리하였다.
HBV 감염된 dHepaRG 세포
HepaRG 세포(바이오프레딕스 인터내셔널(프랑스 렌 소재), 카탈로그 번호 HPR101)를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 대기에서 윌리엄 E 배지(깁코), 성장 배지 보충물(바이오프레딕스, 카탈로그 번호 ADD711C), 1%(v/v) 글루타맥스-I(깁코 #32551) 및 1x 펜/스트렙(Pen/Strep)(깁코, #15140)으로 이루어진 완전 HepaRG 성장 배지에서 2주 동안 배양하였다.
분화를 개시하기 위해, 0.9%(v/v) DMSO(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), D2650)를 융합성 세포에 대한 성장 배지에 첨가하였다. 1주일 후에, 배지를 완전 분화 배지(1.8%(v/v) DMSO로 보충된 HepaRG 성장 배지)로 대체하였고, 여기서 세포를 7일마다 분화 배지 리뉴얼에 의해 약 4주 동안 유지하였다. 분화된 HepaRG 세포(dHepaRG)는 담관-유사 세포의 단일 층으로 둘러싸인 간세포-유사 세포 섬을 나타냈다.
HBV 감염 및 화합물 처리 전에, dHepaRG 세포를 100 μL의 완전 분화 배지에서 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트(깁코, 카탈로그 번호 A11428-03)에 60,000 세포/웰로 시딩하였다. 세포를, HBV 감염 전에 평판배양 후에 약 1주일 동안 96-웰 플레이트에서 이들의 분화된 표현형을 회수하도록 하였다.
dHepaRG 세포를, HBV 입자로 30의 MOI로 감염시켰다. HBV 입자를 HBV-생산 HepG2.2.15 세포로부터 생산하였다(문헌[Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1005-1009]). dHepaRG 배양 조건, 분화 및 HBV 감염은 이전에 기술되었다(문헌[Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135]). 간략히, 4% PEG-8000 및 바이러스 스톡(20 내지 30 GE/세포)을 함유하는 완전 분화 배지[윌리암의 E 배지(깁코), 성장 배지 보충액(바이오프레딕스, Cat# ADD711C) 및 1% (v/v) 글루타맥스-I(깁코 #32551) 및 1x 펜/스트렙(깁코, #15140)으로 이루어지고 1.8% (v/v) DMSO가 보충된 HepaRG 성장 배지]를 첨가하였다(120 μL/웰). 감염 1일 후, 세포를 포스페이트-완충된 염수로 4회 세척하고, 배지(완전 분화 배지)를 실험 동안 4일 및 7일에 교체하였다.
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG
HepaRG 세포주(바이오프레딕스 인터내셔날, 프랑스 렌 소재, Cat# HPR101)로부터, 인간 ASGPR1 및 ASGPR2를 안정적으로 과발현하는 HepaRG 세포주를, 렌티바이러스성 방법을 사용하여 생성하였다. 증식하는 HepaRG 세포를 CMV 프로모터 및 퓨로마이신 내성 유전자의 제어 하에 인간 ASGPR1 및 2를 코딩하는, 시리온 바이오텍(Sirion biotech)에 의해 주문 생산된 렌티바이러스(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)와 함께 MOI 300에서 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신과 함께 11일 동안 선택하였고, 이어서 이식유전자의 안정한 발현을 보장하기 위해 동일한 농도의 항생제에서 유지하였다. ASGPR1/2 과발현을 RT-qPCR에 의해 mRNA 수준에서(ASGPR1: 8,560배 대 비-형질도입된, ASGPR2: 2,389 배 대 비-형질도입된) 및 유동 세포 분석에 의해 단백질 수준에서 모두 확인하였다. 분화된 세포는 ASGPR-dHepaRG 세포로 지칭된다.
ASGPR-HepaRG 세포는 1.8% DMSO를 사용하여 감염 전에 2주 이상 동안 분화되었다. HBV 감염을 전술된 dHepaRG 세포에 대해 수행하였다.
1차 마우스 간세포(PMH)
1차 마우스 간세포를 문헌[Berry and Friend, 1969, J. Cell Biol]; 문헌[Paterna et al., 1998, Toxicol.Appl. Pharmacol.]에 따라 2 단계 관류 프로토콜 후에 펜토바비탈로 마취한 C57BL/6J 마우스의 간으로부터 단리하였다. 제1 단계는 HBSS + 15 mM HEPES + 0.4 mM EGTA를 사용하는 5분 및 이어지는 HBSS + 20 mM NaHCO3 + 0.04% BSA(시그마 #A7979) + 4 mM CaCL2(시그마 #21115) + 0.2 mg/mL 콜라게나제 유형 2(워팅톤(Worthington) #4176)를 사용하는 12분이었다. 간세포를 얼음 상에서 5 mL의 차가운 윌리암의 E 배지(WME)(시그마 #W1878, 1x 펜/스트렙/글루타민, 10% (v/v) FBS(ATCC #30-2030)가 보충됨) 중에 포획하였다.
조 세포 현탁액을 70 μm 및 이어서 40 μm 세포 스트레이너(strainer)(팔콘(Falcon) #352350 및 #352340)를 통해 여과하고, WME로 25 mL까지 충전하고, 실온에서 5분 동안 50x g로 원심분리하여 간세포를 펠렛화시켰다. 상청액을 제거하고, 간세포를 25 mL WME에 재현탁하였다. 25 mL 90% 퍼콜(Percoll) 용액(시그마 #P4937; pH=8.5-9.5)을 첨가하고, 25℃에서 10분 동안 50x g로 상청액을 원심분리한 후, 부유 세포를 제거하였다. 나머지 퍼콜을 제거하기 위하여, 펠렛을 다시 50 mL WME 배지에 재현탁하고, 25℃에서 3분 동안 50x g로 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 세포 펠렛을 20 mL WME에 재현탁하고, 세포 수 및 생존율을 측정하고[인비트로겐(Invitrogen), 셀카운트(Cellcount)], 250,000 세포/mL까지 희석하였다. 25,000 세포/웰을 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트(피비 바이오코트(PD Biocoat) 콜라겐 I #356407) 상에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 3 내지 4시간 후, 세포를 WME로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고, 배지를 대체하였다. 시딩 후 24시간에, 올리고뉴클레오티드를 목적하는 농도로 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 항온처리하였다. RNA 단리[키아겐(Qiagen), RNeasy 96]에 이어서, 제조사의 프로토콜에 따라 표적 유전자(PAPD5:Mm01244121_m1 FAM-MGB, PAPD7: Mm01349513_m1 FAM-MGB) 및 하우스 키핑 유전자(GusB Mm_01197698_m1, VIC-MGB)에 대한 태크맨(TaqMan)을 사용하는 1-단계 RT-QPCR[콴타 바이오사이언스(Quanta Bioscience), qScript XLT 1-단계 RT-qPCR 터프믹스(ToughMix)]을 수행하였다.
1차 인간 간세포(PHH) 천연 감염 검정
인간화된 간을 갖는 키메라 uPA/SCID 마우스로부터의 콜라게나제 관류 방법에 의해 단리된 1차 인간 간세포(PHH)는 피닉스 바이오(Phoenix Bio, 일본 히로시마 소재)로부터 수득되었다. 상기 세포를 유형 I 콜라겐 코팅된 96-웰 플레이트 상에서 피닉스 바이오에 의해 제공된 배양 배지 중에서 웰 당 7 x 104 세포의 농도로 평판배양하였다(더욱 세부적인 사항에 대해 문헌[Ishida et al 2015 Am J Pathol. Vol 185 page1275-1285] 참조). HBV 유전형 D를 HepG2.2.15 세포 배양물 상청액으로부터 유도하고, PEG 침전을 사용하여 농축하였다. PHH를 37℃에서 20시간 동안 MOI 10으로 4% PEG 8000을 함유하는 PHH에서 감염시킨 후, 세포를 PBS로 4회 세척하였다. 감염 후 1일에, 올리고뉴클레오티드를 125 μL의 PHH 배지의 최종 부피로 세포에 전달하였다. 세포를 감염 후 4일 및 7일에 재처리하였다. 감염 후 11일에, 상청액 및 세포를 수집하였다. 상청액 중 HBsAg 및 HBeAg 수준을 CLIA ELISA 검정에 의해 평가하였다("재료 및 방법" 섹션; HBV 항원 측정 참고). 제조사의 프로토콜에 따라 마그나 퓨어(MagNA Pure) 로봇 및 마그나 퓨어 96 세포 RNA 대부피 키트[로슈(Roche), #05467535001]를 사용하여 mRNA를 세포로부터 추출하였다. "재료 및 방법" 섹션에 기술된 실시간 PCR을 사용하여, 상대적인 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현 수준을 분석하였다.
HBV 항원 측정
HBV 항원 발현 및 분비에 대한 영향을 평가하기 위해, 상청액을 제11일에 수집하였다. HBV 증식 변수, HBsAg 및 HBeAg 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 CLIA ELISA 키트(오토바이오 다이아그노스틱 #CL0310-2, #CL0312-2)를 사용하여 측정하였다. 간략히, 웰 당 25 μL의 상청액을 각각의 항체 코팅된 마이크로역가 플레이트에 옮기고 25 μL의 효소 접합체 시약을 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 진탕기 상에서 실온에서 항온처리한 후에, 웰을 자동 세척기를 사용하여 세척 완충제에 의해 5회 세척하였다. 25 μL의 기질 A 및 B를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 10분 동안 실온에서 항온처리한 후에, 발광을 엔비전(Envision) 발광 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다.
HBV 감염된 세포로부터의 세포내 HBV mRNA에 대한 실시간 PCR
콴트스튜디오(QuantStudio) 12K 플렉스(Flex)[어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)], 태크맨 RNA-to-CT 1-단계 키트(어플라이드 바이오시스템즈, #4392938), 인간 ACTB 내인성 대조군(어플라이드 바이오시스템즈, #4310881E)을 사용하는 qPCR에 의해 HBV mRNA를 기술적 반복 중에서 정량화시켰다. 태크맨 시약을 하기 시판 중인 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Sceintific) 프라이머(HBV Pa03453406_s1, ACTB 4310881E)와 함께 사용하였다. 기준 유전자 ACTB 및 PBS 처리된 세포에 대해 정규화된 비교되는 사이클 역치 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 mRNA 발현을 분석하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현에 대한 실시간 PCR
QPCR을 처리된 세포 또는 균질화된 조직 샘플로부터 추출된 RNA 상에서 수행하였다. RNA/LNA 듀플렉스 변성(90℃, 40초) 후, 실시간 PCR를 하기 태크맨 프라이머 검정(써모피셔 사이언티픽)에 의해 설정된 듀플렉스 중에서 1-단계 프로토콜[qScript(상표) XLT 1-단계 RT-qPCR 터프믹스(등록상표), 콴타 바이오사이언스로부터의 로우 록스(Low ROX, 상표), #95134-500]에 의해 수행하였다:
PAPD5(Hs00223727_m1, FAM-MGB)
PAPD7(Hs00173159_m1, FAM-MGB),
하우스 키핑 유전자 GUSB(Hu_4326320E, VIC-MGB)(제공자의 추천에 따름).
HBV DNA 정량화 바이러스 입자 역가
하기 최적화 조건을 갖는 제조사의 프로토콜에 따라 키아앰프 울트라센스(QIAamp UltraSens) 바이러스 키트(키아겐, #53704)를 사용하여 HBV DNA 추출을 수행한다. 30 μL 및 3 μL의 바이러스 샘플을 1 mL의 PBS 내로 희석한 후, 완충액 AC를 첨가한다. 제1 원심분리 단계를 전속력으로 4℃에서 45분 동안 수행한다. 콴트스튜디오 12K 플렉스(어플라이드 바이오시스템즈), 태크맨 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈, #4369016), 및 상기 표 9에 표시된 프라이머 및 100 μM으로 재구성된 프로브의 프리믹스 1:1:0.5를 사용하여 HBV DNA를 qPCR에 의해 중복 정량화시킨다. 하기 설정을 사용하여 qPCR을 수행한다: UDG 항온처리(2분, 50℃), 효소 활성화(10분, 95℃) 및 qPCR(변성을 위해 15초, 95℃, 및 어닐링 및 연장을 위해 1분 및 60℃의 40 사이클). 게놈 당량 계산은 공지된 농도를 갖는 HBV 유전자형 D 플라스미드 희석액으로부터 생성된 표준 곡선을 기준으로 한다.
HBV 입자 역가는 처리된 세포로부터의 단리된 세포내 mRNA 상의 QPCR에서 HBV 코어-특이적인 프라이머[인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)](표 11)를 사용하여 측정될 수 있다.
[표 11]
HBV 코어 특이적인 태크맨 프로브
ZEN은 내부 켄쳐(quencher)이다.
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 적용될 수 있는 프로토콜이 후술된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용된 장치, 지지체 및 농도의 면에서 방법을 약간 바꿈으로써 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 올리고메이커(Oligomaker) 48에 대한 포스포라미다이트 접근법을 1 μmol 스케일로 사용하여 우리딘 유니버셜 지지체 상에서 합성된다. 합성의 종료시, 올리고뉴클레오티드는 60℃에서 5 내지 16시간 동안 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 절단된다. 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC(RP-HPLC) 또는 고체 상 추출에 의해 정제되고, UPLC에 의해 특징규명되고, 분자 질량은 또한 ESI-MS에 의해 확인된다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트(DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 커플링은 활성화제로서 아세토니트릴 중 DCI(4,5-다이시아노이미다졸)(0.25 M) 및 아세토니트릴 중 5'-O-DMT-보호된 아미다이트(0.1 M)의 용액을 사용하여 수행된다. 최종 사이클을 위하여, 목적 변형을 갖는 포스포라미다이트, 예컨대 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기 또는 접합체 기 자체가 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 연결기의 도입을 위한 티올화가 잔탄 하이드라이드(아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M)를 사용함으로써 수행된다. 포스포르다이에스터 연결기는 THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입될 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것들이다.
고체 상 합성 후 접합을 위하여, 시판 중인 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트가 고체 상 합성의 마지막 사이클에 사용될 수 있고, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 단리된다. 접합체는 표준 합성 방법을 사용하는 작용기의 활성화에 의해 도입된다.
RP-HPLC에 의한 정제:
조질 화합물을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 10 μ 150 x 10 mm 컬럼 상에서 제조용 RP-HPLC에 의해 정제한다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충액으로서 5 mL/분의 유량으로 사용한다. 수집된 분획을 동결건조하여 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 수득한다.
약어:
DCI: 4,5-다이시아노이미다졸
DCM: 다이클로로메탄
DMF: 다이메틸폼아미드
DMT: 4,4'-다이메톡시트라이틸
THF: 테트라하이드로퓨란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
T m 검정:
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적(포스페이트 연결된, PO) 듀플렉스를 500 mL RNase-부재 물 중에서 3 mM까지 희석하고, 500 mL 2x Tm-완충액(200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na 포스페이트, pH 7.0)과 혼합한다. 용액을 3분 동안 95℃까지 가열하고, 이어서 30분 동안 실온에서 어닐링하였다. 듀플렉스 용융 온도(Tm)를, 펠티어(Peltier) 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 람다(Lambda) 40 UV/VIS 분광광도계 상에서 PE 템프랩(Templab) 소프트웨어(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 온도는 20℃에서 95℃까지 상승하고, 이어서 25℃까지 하락한다(260 nm에서 흡광도를 기록한다). 용융 및 어닐링 둘 다의 제1 미분계수 및 국소 최대치를 사용하여 듀플렉스 Tm을 평가하였다.
실시예 1: HeLa 세포에서 PAPD5 및 PAPD7(이중특이적)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능에 대한 선별.
16 내지 18량체 갭머 표적화 서열번호 17, 18 및 19를 사용하여 올리고뉴클레오티드 스크린을 수행하였다. PAPD5 및 PAPD7 둘 다를 발현하는 HeLa 세포 중에서 시험관내 실험으로 효능 시험을 수행하였다.
HeLa 세포를 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 배양하였다. 세포를 PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드 접합체의 첨가 전에 24시간 동안 항온처리하였다. 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 5 및 25 μM이고, 최종 배양물 부피는 100 μL/웰이었다. 올리고뉴클레오티드 화합물의 첨가 후 3일에 세포를 수확하였고, 제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로(PureLink Pro) 96 RNA 정제 키트(암바이온(Ambion))를 사용하여 RNA를 추출하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준을 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 실시간 PCR로 분석하였다.
상대적인 PAPD5 mRNA 및 PAPD7 mRNA 발현 수준은 평균 대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 %로서 표 12에 제시된다(즉, 값이 더 작을수록, 억제는 더 큼).
[표 12]
항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능(듀플렉스 QPCR에 의한 단일 실험)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 HeLa 세포 내의 GUSB에 대해 정규화되고, 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
실시예 2: HBV 감염된 HepaRG 세포에서 시험관내 EC50 및 효능.
실시예 1로부터의 모든 올리고뉴클레오티드를 HBV 감염된 dHepaRG 세포에서 HBV 증식 변수에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다.
비교를 위하여, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적화 HBV mRNA와 직접 비교하였다. HBV 표적화 올리고뉴클레오티드는 표 13에 제시된다.
[표 13]
비교되는 HBV 표적화 올리고뉴클레오티드
HBV 감염된 dHepaRG 세포("재료 및 방법" 섹션, HBV 감염된 dHepaRG 세포에 기술됨)를 96-웰 플레이트에서 배양하였다. HBV 감염 후 1일에, 비조력 흡수[짐노시스(gymnosis)]를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 세포에 3-배 연속 희석(20.00, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08, 0.03, 0.01 μM 올리고뉴클레오티드)으로 첨가하였다. 총 49개의 올리고뉴클레오티드를 시험하였다. PBS 대조군을 사용하여 시험을 3회 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 처리를 4일 및 7일에 반복하였다.
감염 후 11일에, 상청액 및 세포를 수확하였다.
CLIA ELISA 검정을 사용하여 상청액 중 HBsAg 및 HBeAg 수준을 평가하였다(재료 및 방법, HBV 항원 측정 참고).
HBV 증식 변수 HBsAg 및 HBeAg의 EC 50, 최대 KD(효능)를, drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 14에 제시되고, 평균 대조군 샘플(PBS 대조군) 및 비-감염된(NIF)의 %이고, 다음과 같이 계단된다: [(시험 값 - meanPBS)/ (meanNIF - meanPBS)] x 100)).
[표 14]
HBV 감염된 dHepaRG 세포에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD(3개의 평균).
이러한 데이터로부터, 상당한 수의 화합물이 HBsAg 및 HBeAg에 대한 양호한 효과를 가짐을 확인할 수 있다. 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 모티프를 갖는 화합물은 서열번호 19의 모티프에 의해 제조된 화합물보다 더욱 효율적인 것으로 보인다
도 3에서, HeLa 세포 중에서 PAPD5 및 PAPD7을 70% 초과로 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 경우, HBV 감염된 dHepaRG 세포 중에서 HBsAg를 감소시키는 이러한 올리고뉴클레오티드 능력에 대하여 높은 상관관계가 존재함을 또한 확인할 수 있다.
실시예 3: HeLa 세포 중에서 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능에 대한 선별.
상이한 디자인을 사용하여 서열번호 17, 18 및 19의 올리고뉴클레오티드 모티프의 다양성을 확장하는 298개의 올리고뉴클레오티드의 추가 라이브러리가 생성되었다. 효능 시험을, 선별이 단지 5 μM에서 수행된 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 시험관내 실험으로 수행하였다.
상대적인 PAPD5 mRNA 및 PAPD7 mRNA 발현 수준은 평균 대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 %로서 표 15에 제시된다(즉, 값이 적을 수록, 억제가 더 큼).
[표 15]
항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능(듀플렉스 QPCR에 의한 단일 실험)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 HeLa 세포 중에서 GUSB에 대해 정규화되고, 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
이러한 데이터로부터, 서열번호 19를 갖는 모티프 서열을 기반으로 하는 LNA-갭머 디자인이 매우 낮은(0 내지 10%) PAPD5 및 PAPD7 녹-다운을 가짐을 확인할 수 있다.
실시예 4: HeLa 세포 중에서 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 EC50 및 효능.
실시예 1 및 3으로부터의 최고 성능 올리고뉴클레오티드의 EC50 및 효능(KD)을, 올리고뉴클레오티드 농도 50, 15.81, 5.00, 1.58, 0.50, 0.16, 0.05 및 0.016 μM에 의한 동일한 검정을 사용하여 측정하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 EC 50, 최대 KD(효능)를, drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 16에 제시된다.
[표 16]
HeLa 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD.
실시예 5: 표적화 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에 대한 시험관내 효과.
실시예 3에서 선별된 올리고뉴클레오티드의 선택을, 하기 변화를 갖는 실시예 2의 검정을 본질적으로 사용하여 ASGPR-dHepaRG에서 선별하였다. 선별을 20, 6.67 및 2.22 μM의 올리고뉴클레오티드의 농도에서 표 17의 비교용 분자를 사용하여 HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG에서 수행하였다.
비교를 위하여, 표 17의 단일 표적화 PAPD5 및 단일 표적화 PAPD7 올리고뉴클레오티드의 조합을 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 함께 시험하였다.
[표 17]
단일 표적화 PAPD5 및 PAPD7 올리고뉴클레오티드의 조합.
HBsAg 및 HBeAg 수준의 감소는 표 18 및 19에 제시된다(값이 클수록 억제가 큼).
[표 18]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 3개 농도의 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 HBsAg에 대한 시험관내 효능(3개의 평균).
[표 19]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 3개의 농도의 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 HBeAg에 대한 시험관내 효능(3개의 평균).
이러한 데이터로부터, 최고 성능 이중특이적 PAPD5/PAPD7 올리고뉴클레오티드가, 병용 요법(2 x 20 μM)과 비교될 때, 절반의 올리고뉴클레오티드 농도(20 μM)를 사용하는 HBsAg 및 HBeAg 감소에 관하여, 더욱 양호한 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
실시예 6: HeLa 세포에서 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 입체정의된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능의 선별.
서열번호 18의 모티프 서열 주위의 다양성을 더욱 더 확장하기 위하여, 입체정의된 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를, 화합물 번호 18_1을 갖는 스테레오랜덤 모 화합물을 기반으로 생성하였다.
선별이 1 μM으로 수행되고 일부 5 μM으로 수행된 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 시험관내 실험에서 효과 시험을 수행하였다.
상대적인 PAPD5 mRNA 및 PAPD7 mRNA 발현 수준은 모 올리고뉴클레오티드의 %로서 표 20에 제시된다(즉, 값이 클수록, 억제가 양호함).
[표 20]
입체정의된 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능(듀플렉스 QPCR에 의한 단일 실험)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 HeLa 세포에서 GUSB에 대해 정규화되고 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
실시예 7: HeLa 세포에서 선택된 입체정의된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 EC50 및 효능.
실시예 6으로부터의 최고 성능 올리고뉴클레오티드의 EC50 및 효능(KD)을, 올리고뉴클레오티드 농도 33, 10.44, 3.33, 1.044, 0.33, 0.104, 0.033 및 0.01 μM에 의한 동일한 검정을 사용하여 측정하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 EC 50, 최대 KD(효능)을, drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 21에 제시된다.
[표 21]
HeLa 세포 중 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD. 화합물 번호 18_1은 스테레오랜덤 모 화합물이다.
이러한 데이터로부터, PAPD5 및 PAPD7 녹-다운과 관련되는 EC50 및 효능의 개선은 입체정의된 서브-라이브러리 및 완전히 입체정의된 화합물 둘 다에 의해 달성될 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 8: 표적화 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 입체정의된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에 대한 시험관내 효과.
실시예 6으로부터의 가장 효능 있는 올리고뉴클레오티드의 선택을 HBV 감염된 dHepaRG-ASGPR 세포 중에서 HBV 증식 변수에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다.
실험을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다.
HBsAg 및 HBeAg 수준의 감소는 표 22 및 23에 제시된다(값이 클수록 억제가 큼).
[표 22]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 3개의 농도의 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 HBsAg에 대한 시험관내 효능(3개의 평균)(화합물 번호 18_1은 스테레오랜덤 모 화합물임).
[표 23]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 3개의 농도의 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 HBeAg에 대한 시험관내 효능(3개의 평균)(화합물 번호 18_1은 스테레오랜덤 모 화합물임).
실시예 9: PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에 대한 시험관내 효과.
실시예 1로부터의 가장 효능 있는 올리고뉴클레오티드의 선택은 GalNAc 접합체 모이어티로 접합되고, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBV 증식 변수에 대한 이의 효과에 대해 시험되었다.
GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드의 HBsAg 및 HBeAg에 대한 EC50 및 효능(KD)의 평가를, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포를 사용하여 비교용 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않으면서 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는 표 24에 제시된다.
실시예 2의 과정에 더하여, 수확된 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 마그마 퓨어 용해 완충액(로슈 #05467535001)에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. RNA를 마그마 퓨어 "96 세포 RNA 대부피 키트"(로슈 #05467535001)로 추출하고, PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현 수준을 "재료 및 방법" 섹션, PAPD5 및 PAPD7에 대한 실시간 PCR에 기술된 바와 같이 측정하였다. EC50 및 효능(KD)을 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 24A에 제시된다.
[표 24]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD(3개의 평균).
이러한 데이터로부터, GalNAc 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 접합시킴으로써, EC50 값이 40배 이상 개선됨을 확인할 수 있다(상기 표가 nM 단위인 반면, 표 14가 μM 단위임에 유의함). 예를 들어, 화합물 20_15(GalNAc 접합된)의 HBsAg 감소가 화합물 18_05(20_15의 네이키드 버전)에 비해 176배 개선된다.
[표 24A]
GalNAc 접합된 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능 및 역가(EC50)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 ASGPR-dHepaRG 세포에서 GUSB에 대해 정규화되고 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
이러한 데이터로부터, 표적화 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드가 mRNA 수준을 10% 미만으로 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 10: dHepaRG 세포에서 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능에 대한 선별.
HeLa 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 녹-다운에 대해 선별된 올리고뉴클레오티드(실시예 1 및 3)를 dHepaRG 세포에서 선별하여 간 세포주에서 효율적인 녹-다운을 증명하였다.
dHepaRG 세포를 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 배양하였다. 올리고뉴클레오티드 농도 50, 15.81, 5.00, 1.58, 0.50, 0.16, 0.05 및 0.016 μM을 100 μL/웰의 최종 배양물 부피로 사용하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드 화합물의 첨가 후 6일에 수확하고, RNA를 제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로 96 RNA 정제 키트(암비온)에 의해 추출하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준을 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 분석하였다. PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 EC 50, 최대 KD(효능)를 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함).
결과는 표 25에 제시된다.
[표 25]
dHepaRG 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD.
이러한 데이터로부터, 효과적인 표적 감소가 간세포-유래 세포주에서 기록될 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 11: dHepaRG 세포에서 PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 입체정의된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능에 대한 선별.
HeLa 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 녹-다운에 대해 선별된 입체정의된 올리고뉴클레오티드(실시예 7)를 dHepaRG 세포에서 선별하여 간 세포주에서 효율적인 녹-다운을 증명하였다.
올리고뉴클레오티드 농도 33, 10.44, 3.33, 1.044, 0.33, 0.104, 0.033 및 0.01 μM을 사용하여 선별을 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준을 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 분석하였다. PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 EC 50, 최대 KD(효능)를 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함).
결과는 표 26에 제시된다.
[표 26]
dHepaRG 세포에서, PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현에 대한 항-PAPD5/PAPD7 입체정의된 화합물의 EC50 및 최대 KD.
이러한 데이터로부터, 입체정의된 올리고뉴클레오티드가 또한 간세포-유래 세포주에서 표적 감소에 효과적임을 확인할 수 있다.
실시예 12: PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에 대한 시험관내 효과.
실시예 5로부터 가장 효능 있는 올리고뉴클레오티드의 선택은 GalNAc 접합체 모이어티에 따라 변하고, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBV 증식 변수에 대한 이의 효과에 대해 시험되었다.
비교를 위하여, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표 13에 제시된 HBV 표적화 올리고뉴클레오티드의 GalNAc 접합된 버전과 비교하고, GalNAc 접합된 버전은 표 13A에 제시된다.
[표 13A]
비교되는 HBV 표적화 올리고뉴클레오티드.
GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드의 HBsAg 및 HBeAg에 대한 EC50 및 효능(KD)의 평가를, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포를 사용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는 표 27에 제시된다.
실시예 2의 과정에 더하여, 수확된 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 마그마 퓨어 용해 완충액(로슈 #05467535001)에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. 마그마 퓨어 "96 세포 RNA 대부피 키트"(로슈 #05467535001)를 사용하여 RNA를 추출하고, PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현 수준을 "재료 및 방법" 섹션, PAPD5 및 PAPD7에 대한 실시간 PCR에 기술된 바와 같이 측정하였다. EC50 및 효능(KD)을 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 27A에 제시된다.
[표 27]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD(3개의 평균).
표에 지시된 화합물은 표 10에 지시된 바와 같이, C6 연결기에 이어서 ca 다이뉴클레오티드에 포스포다이에스터 연결기를 갖는다.
[표 27A]
GalNAc 접합된 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능 및 역가(EC50)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 ASGPR-dHepaRG 세포에서 GUSB에 대해 정규화되고 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
Inf = EC50은 투여 반응의 결핍에 기인하여 계산될 수 없다.
기대되는 바와 같이, 2개의 HBV 표적화 분자는 PAPD5 및 PAPD7에 대한 매우 무의미한 효과를 갖고, 이에 따라, 이들의 HBsAg 및 HBeAg 효과는 PAPD5 또는 PAPD7을 감소시키는 이들의 능력과 관련되지 않는다. 시험된 화합물의 나머지는 85% 미만의 표적 감소 및 0.09 μM 미만의 EC50 값을 나타내고, 이들은 표 27에서 HBsAg 및 HBeAg에 대해 확인된 효과와 잘 관련된다.
실시예 13: PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, HBV 감염된 PHH 세포에 대한 시험관내 효과.
GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드의 선택을 HBV 감염된 1차 인간 간세포에서 추가로 시험하여("재료 및 방법" 섹션; PHH 천연 감염 검정 참고) 천연 ASGPR 발현을 갖는 시험관내 시스템에서의 효능을 예시하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드 농도는 3배 연속 희석이었다(20.00, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08, 0.03, 0.01 μM 올리고뉴클레오티드).
HBV 증식 변수 HBsAg 및 HBeAg의 EC 50, 최대 KD(효능)를 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 28에 제시된다.
PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 EC 50, 최대 KD(효능)를 동일한 알고리즘에 의해 계산하였다. 결과는 표 28A에 제시된다.
[표 28]
HBV 감염된 PHH 세포에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD(3개의 평균).
표에 지시된 화합물은, 표 10에 지시된 바와 같이, C6 연결기에 이어서 ca 다이뉴클레오티드에서 포스포다이에스터 연결기를 갖는다.
이러한 데이터로부터, PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드가 감염된 1차 인간 간세포에서 HBV 항원 분비를 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
[표 28A]
GalNAc 접합된 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능 및 역가(EC50)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 PPH 세포에서 GUSB에 대해 정규화되고 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
NA = 기술적 오차에 기인하여 평가되지 않는다.
이러한 데이터로부터, PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드가 이들의 표적을 11% 이하까지 감소시키되, 화합물 20_17은 PAPD7 mRNA에 대한 효과를 유지하면서, PAPD5 mRNA에 대한 매우 적은 효과를 갖는 것으로 나타남을 확인할 수 있다.
실시예 14: HeLa 세포 및 PMH 세포에서 인간 및 마우스 PAPD5 및 PAPD7(이중특이적)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능에 대한 선별.
올리고뉴클레오티드 선별은 인간 HeLa 세포주 및 1차 마우스 간세포(PMH)에서 PAPD5 및 PAPD7의 인간 및 마우스 전사체를 표적화하는 갭머 올리고뉴클레오티드(표 5)를 사용하여 수행되었다.
HeLa 세포에서의 선별은 25 μM 농도를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다.
PMH 세포에서의 선별은 5 μM 올리고뉴클레오티드를 사용하여 "1차 마우스 간세포" 하에 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 수행되었다.
도 11은 선별 결과를 도시하고, 각각의 점은 표 5로부터의 화합물, 및 PAPD7 mRNA(Y 축) 및 PAPD5 mRNA(X 축)를 감소시키는 이의 능력을 나타낸다. HeLa 세포(인간)에서는, PAPD5와 PAPD7 mRNA 감소 사이의 양호한 상관관계가 존재하는 반면, PMH(마우스) 세포에서는, PAPD7 mRNA의 감소가 PAPD5 mRNA 감소에 비해 매우 효율적이지 않음을 나타낸다.
마우스 간세포에서 PAPD7 mRNA의 적당한 억제의 그럴 듯한 설명은 1차 마우스 간세포에서 발현된 PAPD7의 1차 스플라이싱된 mRNA 전사체가 올리고뉴클레오티드의 결합 부위의 전사 개시 부위 다운스트림을 갖는 것이다. 이것은, 전체 전사체 산탄 서열결정(RNAseq)이 1차 마우스 간세포에 대해 수행될 때까지, 확인되지 않았다.
실시예 15: PAPD5 및 PAPD7을 표적화하는 선택된 GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에 대한 시험관내 효과.
실시예 2 및 5로부터 올리고뉴클레오티드의 추가 선택은 GalNAc 접합체 모이어티에 따라 변하고, HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBV 증식 변수에 대한 이들의 효과에 대해 시험되었다.
GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드의 HBsAg 및 HBeAg에 대한 EC50 및 효능(KD)의 평가는 HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포를 사용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행되었다. 결과는 표 29에 제시된다.
실시예 2의 과정에 더하여, 수확된 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 마그마 퓨어 용해 완충액(로슈 #05467535001)에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. 마그마 퓨어 "96 세포 RNA 대부피 키트"(로슈 #05467535001)를 사용하여 RNA를 추출하고, PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현 수준을 "재료 및 방법" 섹션, PAPD5 및 PAPD7에 대한 실시간 PCR에 기술된 바와 같이 측정하였다. EC50 및 효능(KD)을 drc 패키지(v3.0-1)로부터의 R-함수 drm()을 사용하여 계산하였다(4-변수 log-논리 함수는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로서 해당 유전자의 발현에 대해 정합되어 EC50 및 최대 녹-다운에 대한 값을 수득함). 결과는 표 29A에 제시된다.
[표 29]
HBV 감염된 ASGPR-dHepaRG 세포에서 HBsAg 및 HBeAg에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD(3개의 평균).
[표 29A]
GalNAc 접합된 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 시험관내 효능 및 역가(EC50)(PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준은 ASGPR-dHepaRG 세포에서 GUSB에 대해 정규화되고 대조군(PBS 처리된 세포)의 %로서 제시됨).
실시예 16: 선택된 이중특이적 PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드를 사용하는, 염색체 통합된 HBV DNA로부터의 HBsAg 발현에 대한 효과.
본 실험에서, PAPD5 및 PAPD7에 대한 양호한 역가를 갖는 GalNAc 접합된 항-PAPD5/7 올리고뉴클레오티드의 선택이 염색체 통합된 HBV DNA로부터 HBs 항원을 분비하는 인간 간세포 암종 세포주 Hep3B로부터 HBs 항원 및 mRNA 발현을 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하였다.
Hep3B 세포(문헌[Knowles et al. 1980. Science 209 pp. 497-499])를 ATCC로부터 구입하고(ATCC HB-8064), 10% FBS가 보충된 이글의 최소 필수 배지(EMEM)에서 배양하였다. 세포를 콜라겐 코팅된 96-웰 플레이트 상에서 웰 당 1.5 x 105 세포의 농도로 평판배양하고, 5% CO2를 갖는 가습된 대기 하에 37℃에서 배양하였다. 시딩 후 1일에, 20 μM에서의 농도 개시 및 이의 3배 연속 희석(20.00, 6.67, 2.22, 0.74, 0.25, 0.08, 0.03, 0.01 μM 올리고뉴클레오티드)을 사용하여 세포 올리고뉴클레오티드를 상기 세포에 첨가하였다. 4일 및 7일에 배지를 바꾸면서 처리를 반복하였다. 11일에, 상청액을 HBsAg 측정("재료 및 방법" 섹션에 HBV 항원 측정 하에 기술된 바와 같이 수행됨)을 위해 수집하고, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 200 μL 마그마 퓨어 용해 완충액을 각각의 웰에 첨가하고, RNA 추출을 위해, 플레이트를 -80℃에서 저장하였다.
제조사의 프로토콜에 따라 마그마 퓨어 로봇 및 마그마 퓨어 96 세포 RNA 대부피 키트(로슈, #05467535001)를 사용하여 세포내 mRNA를 용해된 Hep3B 세포로부터 추출하였다. 콴타스튜디오 12K 플렉스(어플라이드 바이오시스템즈), 태크맨 RNA-to-CT 1-단계 키트(어플라이드 바이오시스템즈, #4392938), 인간 ACTB 내인성 대조군(어플라이드 바이오시스템즈, #4310881E), 및 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 태크맨 프라이머 및 시약[라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 검정 ID Hs00900790_m1(PAPD5) 및 Hs00173159_m1(PAPD7) 및 통상적인 검정 ID APMFW4G(소 HBs)]을 사용하는 별개의 RT-qPCR에 의한 기술적 반복으로 PAPD5 및 PAPD7 mRNA를 정량화시켰다. 하기 설정을 사용하여 qPCR을 수행하였다: UDG 항온처리(15분, 48℃), 효소 활성화(10분, 95℃) 및 qPCR(변성을 위해, 15초, 95℃, 및 어닐링 및 연장을 위해, 1분, 60℃로 40 사이클).
HBsAg, HBs mRNA, PAPD5 및 PAPD7 감소의 EC50 및 최대 KD(염수의 %인 최대 효능)는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7.02 비선형 정합을 사용하여 계산되었다. 결과는 표 30 및 31에 제시된다.
[표 30]
Hep3B 세포에서 염색체 구성성분으로부터 발현된 염색체 통합된 HBs mRNA 및 HBsAg(3회의 생물학적 복제 및 2회의 기술적 반복의 평균)에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD.
NA = 적용가능하지 않다.
[표 31]
Hep3B 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현(3회의 생물학적 복제 및 2회의 기술적 반복의 평균)에 대한 항-PAPD5/PAPD7 화합물의 EC50 및 최대 KD.
이러한 데이터로부터, 7개의 시험된 올리고뉴클레오티드 중 4개가 HBsAg 및 HBs mRNA 발현을 통합된 HBs 단편으로부터 염수 대조군의 55% 미만까지 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 17: 비-인간 영장류에서 선택된 이중특이적 PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드의 효과.
사이노몰거스 마카퀘스(cynomolgus macaques)의 간에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현의 억제는 RNA-서열분석에 의해 정량화될 수 있다. 상기 동물은 염수, 또는 1, 3 또는 10 mg/kg/주의 화합물 번호 20_12로 4주 동안 매주 1회 처리하고(군 당 6 마리의 동물, 1, 8, 15, 22 및 29일에 총 5회 투여), 29일에 희생시켰다(투여 후 4주). 동시에, 동물을 염수 또는 10 mg/kg/주의 화합물 번호 20_12로 다시 4주 동안 매주 1회(총 5회 투여) 처리하였지만, 4주 회복 기간을 두고, 56일에 희생시켰다(4주 투여 + 4주 회복).
간 샘플을 채혈 후 20분 내에 RNA-레이터(Later)(키아겐 카탈로그 76104)에서 수집하였다. 조직 용해기 II(키아겐)를 사용하여 약 10 mg의 조직을 800 μL의 마그나퓨어 용해 완충액(로슈)에 용해시켰다. 이어서, 용해물의 350 μL 분취액을 마그나퓨어 96 ◎ 웰 플레이트로 옮기고, 자동적으로 처리하였다. RNA를 흡수 분광법[나노드롭(Nanodrop), 써모피셔]에 의해 정량화시키고, RNA 무결성[RNA 무결성 수(RIN)에 따라]을 RNA 6000 나노칩스(Nanochips)를 갖는 아길런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) 2100(아길런트 카탈로그 5067-1511)을 사용하는 미세유체 모세관 배열 전기영동에 의해 조절하였다.
바코드가 붙은 cDNA 라이브러리의 구축을 위하여, 400 ng의 총 RNA 분취액을 트루섹(TruSeq, 상표) 스트랜티드 토탈(Stranded Total) RNA 키트[일루미나(Illumina) 카탈로그 20020598] 및 리보-제로(Ribo-Zero, 상표) 골드(Gold) rRNA 제거 키트(일루미나 카탈로그 MRZG12324)를 위한 입력물로서 사용하였다. 라이브러리의 크기 분포를, 아길런트 고 민감성 DNA 키트(카탈로그 5067-4627)를 사용하는 전기영동에 의해 평가하였다. 라이브러리는 카파(KAPA) 라이브러리 정량 qRT-PCR 키트[카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems) 카탈로그 KK4824]를 사용하여 정량화시켰다. 라이브러리를 등몰 농도로 풀링(pooling)하고, 11 pM으로 희석한 후, 일루미나 하이섹(HiSeq) 4000 서열분석기의 유동 상에 다음과 같이 로딩하였다. 라이브러리는 하이섹 PE 래피드 클러스터(Rapid Cluster) 키트 v2(일루미나 카탈로그 PE-402-4002)를 사용하여 연장되었다. 증폭된 클러스터를 갖는 유동 세포는 트루섹 래피드 SBS 키트 - HS(일루미나 카탈로그 FC-402-4001)에 의한 짝지어진 단부 판독치(50-염기 쌍)를 사용하여 서열분석되었다. 실시간 이미지 분석 및 염기 소환은 하이섹 서열분석 조절 소프트웨어(HCS)를 사용하여 수행되었다. 카사바(CASAVA) 소프트웨어 버전 1.8은 서열 판독치 쌍의 FASTQ 파일의 생성을 위해 사용되었다.
수득된 최저 라이브러리 크기는 17 백만의 판독치 쌍이었고, 최고는 114 백만 판독치 쌍이었다. 평균적으로, 샘플 당 50 백만 판독치 쌍이 존재하고, 중앙값은 샘플 당 47 백만 판독치 쌍에 존재하였다. 각각의 라이브러리의 판독치 쌍은 GSNAP 프로그램을 사용하여 RefSeq/NCBI 데이터로부터의 사이노몰거스 전사체로 정렬되어 유전자-수준의 원 카운트(raw count)를 생성하였다. 이들은 각각의 라이브러리 크기에 대해 정규화되고(샘플간 비교를 위하여), 각각의 전사체의 경우, 데이터는 각각의 전사체 길이에 대해 추가로 정규화되었다(전사체간 비교를 위해). 모든 샘플의 경우, 이것은 정규화된 단위 RPKM(백만 매핑된 판독치 당 전사체의 킬로베이스 당 판독치)으로 전사체-수준 발현을 생성하였다. 처리된 동물에서 PAPD5 및 PAPD7에 대한 값은 상응하는 시점에서의 염수-처리된 동물에 대해 정규화되었다. 결과는 표 32에 제시된다.
[표 32]
화합물 번호 20_12로 처리된 사이노몰거스 원숭이의 간에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 발현.
* 동일한 시점에 대해 대조군 동물에 대해 정규화된다.
각각의 비히클 대조군과 비교하여, 결과는 화합물 번호 20_12의 모든 시험된 투여 수준에서 주요 군 동물 및 회복 동물 둘 다에서 간에서의 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 하향-조절을 나타낸다. PAPD5 mRNA의 하향-조절은 3 및 10 mg/kg에서 약 80%로 간에서 포화됨을 나타냈다. PAPD7 mRNA의 하향-조절은 용량-관련되고, 10 mg/kg에서 mRNA의 66% 감소에 도달하였다. 10 mg/kg/주로 투여된 회복 동물에서, PAPD5 mRNA의 하향-조절은 78%였다. PAPD7 mRNA의 경우, 하향-조절은 55%에 도달하였다. 후자 데이터는 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 억제가 마지막 투여 후 적어도 4주 동안 간에서 지속됨을 나타낸다.
실시예 18: PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드의 투여 후 HBV 감염된 마우스에서의 HBsAg 및 HBeAg에 대한 효과
본 연구는 AAV/HBV 마우스 모델에서 PAPD5 및 PAPD7 전사체를 감소시킬 때, HBV 증식 변수에 대한 생체내 효과를 나타내도록 설정된다.
실시예 14 및 도 11B는 단일 올리고뉴클레오티드를 사용하여 마우스 세포주 중에서 PAPD5 및 PAPD7을 둘 다 표적화하도록 도전하고 있음을 나타냈다. 따라서, 본 연구에서, 표 33에 열거된 2개의 올리고뉴클레오티드의 조합[1개는 표적화 마우스 PAPD5를 표적화하는 하나(화합물 번호 22_1) 및 마우스 PAPD7을 표적화하는 하나(화합물 번호 22_1)]이 사용되었다.
[표 33]
마우스 PAPD5(서열번호 5) 또는 마우스 PAPD7(서열번호 6)을 표적화하는 올리고뉴클레오티드.
Figure 112023107438530-pat00081
GN2는 도 2에 도시된 3가 GalNAc 클러스터를 나타내고, C6은 6개의 탄소를 갖는 아미노 알킬 기를 나타내고, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 아래첨자 o는 포스포다이에스터 뉴클레오시드 연결기를 나타내고, 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
"재료 및 방법" 섹션에 기술된 AAV/HBV 마우스 모델이 사용되었다. 마우스(3 pr. 군)에 10 mg/kg의 각각의 화합물 22_1 및 23_1의 단일 용량(6시간 간격의 2회의 별도 주사) 또는 5 mL/kg 염수(대조군)를 0일에 피하 투여하였다. 혈청 중 HBsAg 및 HBeAg는 "재료 및 방법" 섹션에 기술된 방법을 사용하여 3일마다 측정하였다. 표적 녹-다운을 측정하기 위하여, 마우스의 2개의 중간 군을 3일 및 14일에 희생시키고, 나머지 마우스를 27일에 희생시켰다. 희생시킨 후, 이들의 간은 PBS 관류에 따라서 제거하였다. 관류된 간을 더 작은 조각으로 절단하고, 바로 동결시켰다.
동결된 간 조각을, 세라믹 비드 및 1 mL의 마그마 퓨어 용해 완충액(로슈 #05467535001)을 함유하는 2 mL의 관에 첨가함으로써, mRNA를 동결된 간 조각으로부터 추출하였다. 조직 용해기(키아겐)를 사용하여 간 조각을 균질화시켰다. 마그마 퓨어 "96 세포 RNA 대부피 키트"(로슈 #05467535001)를 사용하여 RNA를 조직 균질화물로부터 단리하였다. 용해물을 -80에서 저장하였다. 태크맨 프라이머 검정에서의 하기 변화를 가지면서, "재료 및 방법" 섹션에 기술된 바와 같이 qPCR을 본질적으로 사용하여 PAPD5 및 PAPD7 mRNA를 측정하였고, 이것은 하기 2개의 검정(써모피셔 사이언티픽)에 의해 수행되었다:
GUSB 및 TBP는 하우스키핑 유전자 아래에 표시된 프라이머 검정으로 축정된 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 정규화에 사용된 하우스키핑 유전자이다.
결과는 하기 표 34, 35 및 36에 제시된다. 표 34의 데이터는 도 18A 및 18B에 추가로 제시된다.
[표 34]
PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드로 처리된 AAV/HBV 마우스 중 HBsAg(Log10 IU/mL 혈청).
상기 데이터는 단일 처리를 받은 AAV/HBV 마우스 모델에서의 PAPD5 및 PAPD7의 표적화가 처리 후 27일까지 HBsAg에서 지속된 2 log 감소를 야기하였음을 나타낸다.
[표 35]
PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드로 처리된 AAV/HBV 마우스에서의 HBeAg(Log10 IU/mL 혈청).
HBsAg에 관하여, PAPD5 및 PAPD7의 표적화는 혈청에서 HBeAg 수준의 감소를 야기하였고, HBsAg에 관하여는 유의미하지 않았다.
[표 36]
PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드(각각 10 mg/kg)에 의한 단일 용량 처리 후 AAV/HBV 마우스(3일 및 14일에 3 마리 동물 및 27일에 5 마리 동물) 및 ALT 수준(0일에 11 마리 동물, 14일에 8 마리 동물, 및 27일에 5 마리 동물)에서 PAPD5 및 PAPD7 mRNA.
이러한 데이터로부터, PAPD5 및 PAPD7 표적화 올리고뉴클레오티드가 각각 PAPD5 및 PAPD7 mRNA 수준에서 감소를 야기하였고, AAV/HBV 마우스 모델에서 양호한 내성이 있음을 확인할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> NUCLEIC ACID MOLECULE FOR REDUCTION OF PAPD5 AND PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION <130> P34468-WO <140> PCT/EP2018/078136 <141> 2018-10-16 <150> EP 17196554.4 <151> 2017-10-16 <150> EP 17208056.6 <151> 2017-12-18 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 82393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acaacgcgct ccctgcgggg cgggcggcaa cctccatgcg gcctcgtcca cgctcagcac 60 cggggaagcc gaggcggaga agccgcgcgc gcctcagaag ctcccggacg cccaggtacg 120 tgggagcact ccacagatgg cgcaagtacg gttgggccag gcggttgcgg ccccgtcgcg 180 ccgcggcctc tgtgacgcac ggcgaggcct cccgggctgc tgcgcggcgc agcgggggcg 240 gggcgagcgc gtgagggcgg ggcggtgggg ggggggggcg gagcgagagg ggcggagccg 300 gcagaggccc cgccccgggg ccggaggagc gaggacgcta cggagcaggc gcgtctcgct 360 gccgccgctg ccgccgccgc cgctcgctct tctgtggagc cgccgccgcc gccgccgcca 420 tttgcacggg gaccccagtg acaggggctc ggcggagggg cggaggggcg gagggagggg 480 gggagggccc gcggagcccc cgagggcggg agcgacgccg ccggcgccgg ccgggctccc 540 tgcgcgaccg cgccgcccgc 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ggggaggtgg ggttttcgtg gaaacgtcct 29220 gacagtgtgt catctacttg agtgtcccat gtcttcaggt tctatttcag tgtgcctgca 29280 ttactcctgg actgtagctg tgtctaggaa gatgaaattc ccatatcctc cctaaaatcc 29340 catacttgag atgactgagc agtgaatcta tgtaggagtt acagttcctc ttgatgctag 29400 tggtagcttc atttgctttg ctctgtgagt ttgtaataca gcattcttcc cttaaagggc 29460 ttccttccag ttctgatact ctgttcagtg tgagcgaccc cgttacactg tgtgccactc 29520 agggcttatc atgacattga tcatgccaag tccacactgc tggttggtgt gttggatatt 29580 ctggatttcc ttgtggtgtg ggcttccctt tttttttctt tttccctttt ctgctacctg 29640 gggtcttagc agactctgtg aactgtcaga cacttgtggc tgcccccttt ccattgttag 29700 gaatagactg gtcacagagt ctgaagcact gaacctgtgt gcaattatat accatgcact 29760 tgcagcagct cgctcgggtc tgtgtttaca tgcctgttgc ttgagctgct gtagttggga 29820 ggcatttggt ggtgagcccc tattcacagt accttgtatg agagacaggt gcctttgtgt 29880 tgcaggaaat gatgttggac ggagttccta tggggccatg caggtgaagc aggtgtttga 29940 ctacgcttac attgtgctca gccacgctgt gtcaccgctc gccaggtctt accccaacag 30000 ggattctgaa aggtaatggg tcttgtgcct gggttctagg ctcctctttc ctgtagagta 30060 gcaggtgtac tttttcatgt gcttctgtgg catggatgga tacactgtca tacttgagtg 30120 gaccttgagg aaagcttttt tgggggcaac aagatggctt ttgggtagcc cgtggcctag 30180 gacagcattt cttagtgggg tggtattgta cttgggacat tctgtattag agcagattcc 30240 tgactttgaa aacctcggtt ggtgcctgtc cagcagctgt caggtgtgct tgcttaggtt 30300 gtgagtgggt tcagatctga acacactgct ctgcctctac agctgtttag ccgtccttca 30360 ctttacagtt gaggatagtc tacagtgtct cctttagtgg ttgtcaggca tatttatttc 30420 cagttcagct tagctgctat agtatgtgca catggggagc aggaggagac aagagtggaa 30480 ggggagaaat gggctgaaca gactgctgtc agcagtgtgt gaatgtctgt tccagagctg 30540 gctgcctcag gaaactgtta ggaatgggcc tggctttcca tgattgtcca cacacagtgt 30600 tgcaggccag cccctagcct gtaatgggcg cctgggtatc tctccacacc tgtgcagtgg 30660 aaacaaagtg tcaggacttc atggctaccg cttaaactgg attgaagcca tcatttgtag 30720 acagatcttg gttaaggact tctacatagt gaacctacct ttatctgtac cgtgatctca 30780 tggtactatg aatgtaaaca tgtcagacct catgctctct cctgtcttta atgagcctca 30840 catctgacac ctagtgctta tgtccaaccc tgttctctgc agtactttag gaagaatcat 30900 caaagtcacc caggaagtga tcgactaccg gaggtggatc aaagaaaagt ggggtagcag 30960 aatcctcccg tctccagacc ttggtgagag actgacagtg tgaggcgtgg cctctcacca 31020 tagcacagaa gcatctctgc cctcttgtag ggttggccaa gctgtgaaag tagttccttt 31080 tctacttttt ctgataggct atccgttctg taagctctgg accctataga aatacagtcg 31140 tagctgcagt aaacgaaggg aaggagcaga tggaagtggt tgctaatgtt gcatttgatt 31200 aaacgaaggt atactccaac acagtggcaa gaaatcactg agatgcagat aggttttgtt 31260 ccaaatctta gaaatccagt atgtatttgt ttcagaattc tacattctac attgacattg 31320 gacatatttg ttttatgttt atagtttatg acagctacag gttaagactt acacagcact 31380 ggacaaatta tagtgttttc tggtgactag tttgattcac atttaaaatt agattaactc 31440 agatacaagg tttggtttgt taacattcag agttcagcag ccttgtgctt cgagcacatt 31500 gtactaatca ctaacctgga ctttgctttc ctgccccaga caacaggatt aagataaagg 31560 agagaattac cacgtgcaat ggggagcaga tgcagagccg ggagcccagc tccccttaca 31620 cccagcgcct gactctgtcc ctgtccagtc cccagctgct gtcttcaggc tcttctgctt 31680 cttctgtgtc ctcactttct ggaagtgaca ttgtgagtgg gcttttgctc ttgactcgtc 31740 cttctcatgg ggtggggtgg ccactgtcct tgttatctgt agcagggagt tcaagaccta 31800 ttcctcctcc atctcagtcc cttgctgggg tgtgaggatg tgtgtgtgtg tgagagatgt 31860 atgtgtgtgt gtgagatgta tttgtgtgga tatctatgga gtatatgtga ggtacgtgtg 31920 ggtgggaggt tggggtgtgt gtgtgtggtg tcgtgtctgt ctttgttggg tgttctttga 31980 cataggcttt aagaacccct ggctgtgttg ctccgatgac ccatcaatag cactcagcca 32040 aactttggac tttgagtggt tttttttgag aaatggttta gagatttacc ggttaggtcc 32100 atgtgcctca tctgcatttt ctgcagccta gtctttctcg tgctgcagtg actgaggaag 32160 gataggtttg ctgtaatggc ctttcctagc ttcctcctta aaggcgcctg gctcacactt 32220 cagctgcgct gtgcttatga ctctccttgt ctctgtgctg cgctctagga ctccgacaca 32280 ccgccctgca ccacacccag tgtttatcag ttcagcctgc aagcacccac taccctgatg 32340 gccagcctgc ccacagcctt gccaatgccc agcagcaaac cccagcctgc tgcttccaga 32400 acgttgatca tgacaacaaa caaccaggta caggcttcct ccccggggac ggcatccggg 32460 ccaagcagga ccctagatca gcgttcttgt ggacgactgg gtctagtgct gtctcccggc 32520 agtcatcgtg ctttggtggc tgcagttgtt actcagcctg ttgtgtaacg cagtctctga 32580 cctggagtct gatgttgttc tggagcactg gatgcctctg acaggtgctc tctcagtgcc 32640 gctttgcatg cagtagtgtc cagggcacgc actgctggct gcgtagacac ttgctctctc 32700 tctccagaaa ctcagtgtca gcatgggctt agactctctg ttagtcagtc agtactcggg 32760 acttctcttt ttaaatttta tataaagtga atcaaaagaa aagtatagaa attcagtatt 32820 gtgttgggtt tgtacaaact cagtgcatta ttaactggga aggagaagca gcatttgacg 32880 tgggagttga gtgggaaaca gaacagaagc atgtagatgg ctttcctgga gtcctttggc 32940 cctgctgaga tccattccca cacagctgct ttgaagctga gctctacgaa agcatgtgac 33000 tctgatgttg gtgagcgttg gacacccttc ccccagtgta gcccagacta cagacctcaa 33060 cgagtgcacg cgaggaactt tccaaggcag ttgttgaagc tattaaattc taccccactt 33120 caacttgact gtcagcttcc ggaaaggaca ctgcccaccc ttccactctg gaggcctctt 33180 tgtcactcgc caggacagtg tcttggagag cccgatgcag ggccagcttc agtttcctgc 33240 cggaggtgtt ttggacctgt ggtgtctaag aaagtatagg tgtggatccc agttggttgt 33300 cacagttgta tgattatcct gtgtgagtgt gagtcaggct gagcttgaaa ccaaagtttg 33360 ctgtaatggc ctggagcaga gtgctggcat ccgattctcc accatgtgct ttctacagag 33420 gtagccaggc tgctgcctct cccagcagct gctatccccc tatggagctc tgctgtcaaa 33480 ggttagctcc tactgtagca agtctctctg caagtgctgg gtaaagcagc gatacctgca 33540 gtgtcaggct gagagtggca cttaccagct ttcttttgct ttgggtggga cagataatgc 33600 ggtggccaga aagagccgcc ctctttgact cttcttgtgt tcctctgttc ctctggggtc 33660 tgagggttgt tcactttggg gctcattcta gggactaaag tgacagttgc tgttttggtg 33720 gctctaattg ttttgaattt ggtttgatct ttggagaatg ttagatttta tgacctagtg 33780 actgttataa cttggtattg taattgctat ttgagaagat gagatgattg taattccaag 33840 gccacagtgt ccttaggtca caacagaagc tgtgctccgt gggcatgtgt gtgagtggat 33900 tcgcacagcc agccccacac tgctttcact tggtgtgaag tttcacttgt gggaagctca 33960 tgtttctctt ttccttctag accagggtta ctatccctcc accaaccctc ggagtcgccc 34020 ctgttccttg cagacaggct ggtgtcgacg gaaccacatc tttgaaggct gttcacagtg 34080 taacttcccc agccattccc tcggcatccc ccaacccact gtctagtcct catctgtatc 34140 acaaggtaag tgtcgtctgc tgctgggcta ctttactgca gccgcttgct cactcggggc 34200 cctgcacccc ttggaactga attcccctgc atgctctctg gttggtggtt cagtctctgt 34260 gagcccccat gggcccgggt ttgttgactc tgaccctgca gggaccttct cacacccatg 34320 aagaggcaga gcagattaaa agcctgtagg ctctgagtgg agccatagtc tgttcagagg 34380 gaagggttcc ctcagcttac tgcacgccgc agcagggatt atgtggctat gggttcctgt 34440 tgtacattgt gtcttttcac ctcatggtct gtgtgctgca ctccagccct gctttctctc 34500 tctccagcag cacaatggca tgaaactgtc catgaaaggc tcccacaacc acactcaggg 34560 tggcggctac agctctgtgg gcagtggagc tgtgaggcct cctgtaggca accgaggaca 34620 tcatcagtac aaccgcaccg gctggaggag aaaaaagcac gcacacacaa gggacagcct 34680 gcccgtgagt ctcagcagat aatggtcctg actgactgcc caaaggcctc gctcgggcac 34740 cacaggggag ccgagaccag catccagcac ctccaccgct gtctgccaag cgcagcccag 34800 cactggtcac tctgcatgtt tgtgtggtgg ccgcatccat cttacagaac agctccttgt 34860 gctcatctgt gaagccttac tacatgtgga tgtgcgtctg cctgcctaga agtcttcatc 34920 tgtgcccagc agggcggcct aggagtgtca gggactggat gtgcggctgt gcagccgggt 34980 cagctaggtg gccatttggg gttctcatcg tgtctgtcac aggcagagac gccaagccct 35040 gctccgtgtc ttctgacgga gtgggcaggc tgctgtttta ctgccctcat gtcttgtttg 35100 aaaatttggg actgtttttc tatgtaaata ttgaaaactt atgatttgtg caataactca 35160 gatatttttt atttaatttc atattttcac ataagttata tttaagggag gagggaattt 35220 tttttaaaac acgcttaaat cctttcccaa tttgcatttt ctaagttggg ttcctcgtgt 35280 tggctggtta tctgatagca tcctgacatg aacaccgtga ggagggaggg gcctgtgggc 35340 tttgttttta tgtcttttct tttggtcaga tgcagtgaag gagccaagtc aacttgatag 35400 ttctgtgagg ccagtgtgta cctggcagcc tggctgtcgg ccttgggcct ttgtcctctc 35460 tgaccacgag ttctgacatt ttggtttggg tttttaaaaa ctagacacca aatccagcat 35520 ttaaagtgcc agaagtaaga acctctaaga ggagaagagg ttgtcacgtc gtataaatcg 35580 taaagaatcg tgactctggg cgtgcttcgg tcattaagtg acgtggtcta gagtcacggg 35640 cctggtgagt atcgttacag acaatggcac ccagatttag gaatgtggag aaagggattt 35700 tgttgattcc attgaggaat ctgcataggt atgcactcgt tctgttaaga gcaaatatct 35760 gaaaaggacc tccgttgtcc aggcacatgg gggtatttta atgtatcaca ggagagcaca 35820 gccccagtgt gggcccagga gcggctggtg cctggcgtca gaagcataca ggtatactat 35880 gcaagtgtat tctgccacaa ccactgtctt tgttactttt tttgaacaag aatccatcca 35940 ttgcctgacc ctgattctca agcaccacgg ttgtcctgga gtgcttgcag ttgtaggccc 36000 tctgacttct gcttctaaaa cgggggtctg gacctgctgc acaccacagg caggttgctt 36060 cttgtccacc agtacagagt gtcaagccga gtgctgtgcc acctgattga catgcagcag 36120 tggaaattct gaatggatgt ctgagtgaca ttggacacct cgccaaggac aagctctgtg 36180 tgtctgggtc tgcctcctgc tgccgtggtg aggctgttga ctctgggagg cattccagag 36240 cagaggagca catgggtctg cagctcatga ggattggagt catccagaat atttaaaatt 36300 atttaaattg tgaagcctgt tgctaaagaa tatttatgaa cactggtcca tagcctgtac 36360 taatttacac attagcaata ttgactgtat ctgcattaag gagccaccgt ggggccgttc 36420 gagtgacccg cagatgtgcg ttttaaagtt ctgtcatcca caggcacagg tatgtgtccg 36480 tctccgtcat ggtgaaccag atgaattggc ctggcgacca ctgtggccat atgctacagt 36540 ttacaaaatg ataccatgtt taaattttct gtgcggacaa caatgtggac actaaaatta 36600 acatattttt atgtaaagtt tttctattct ttgatcttta ataaacttta gatgctaga 36659 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 7 agatctgcat ccacag 16 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 8 cagatctgca tccacag 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 9 ccagatctgc atccacag 18 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 10 ccagatctgc atccaca 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 11 cccagatctg catccac 17 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 12 cccagatctg catcca 16 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 13 tcccagatct gcatcca 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 14 gtctcccaga tctgcat 17 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 15 tctcccagat ctgcat 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 16 gtctcccaga tctgca 16 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 17 tcaactttca cttcagt 17 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 18 tcaactttca cttcag 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 19 tgtttcaata ctaaaa 16 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 20 catcaacttt cacttcag 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide motif <400> 21 catcaacttt cacttcagt 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 22 caacataagt ctacacatcc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 23 cagttttacc gattcatca 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 24 ctgtgccttg ggtggcttt 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 25 aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa 24 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Prope <220> <221> ZEN <222> (9)..(10) <223> internal quencher <400> 26 agctccaaat tctttataag ggtcgatgtc catg 34 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 27 agcgaagtgc acacgg 16 <210> 28 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 28 gcgtaaagag agg 13 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 29 caagcgaagt gcacacgg 18 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 30 cagcgtaaag agagg 15 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 31 caaaggttgt tgtactct 18 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 32 cagttttatg ctaatca 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 33 gtattcttat tcttgct 17 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide motif <400> 34 cattgctttt ataatccta 19

Claims (36)

  1. 서열 TcAACtttcacttcAG를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
    이때 대문자가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자가 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 사이토신 LNA 뉴클레오시드가 5-메틸 사이토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된 접합체 모이어티를 포함하는 접합체 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는, 접합체 화합물.
  4. 제3항에 있어서,
    접합체 모이어티가 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인, 접합체 화합물.
  5. 제2항에 있어서,
    접합체 모이어티가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착되는, 접합체 화합물.
  6. 제2항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 연결기가 위치되는, 접합체 화합물.
  7. 제6항에 있어서,
    연결기가 생리학적으로 불안정한 연결기인, 접합체 화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    생리학적으로 불안정한 연결기가 S1 뉴클레아제 민감성 연결기인, 접합체 화합물.
  9. 제7항에 있어서,
    생리학적으로 불안정한 연결기가 3개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 갖는 포스포다이에스터-연결된 사이티딘-아데노신 다이뉴클레오티드인, 접합체 화합물.
  10. 제7항에 있어서,
    C6 아미노 알킬 기가 접합체 모이어티와 생리학적으로 불안정한 연결기 사이에 위치되는, 접합체 화합물.
  11. 제10항에 있어서,
    접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있고, 상기 접합체 모이어티가 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티이고, 상기 접합체 모이어티가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착되고, 3개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 갖는 포스포다이에스터-연결된 사이티딘-아데노신 다이뉴클레오티드가 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드와 상기 접합체 모이어티 사이에 위치되고, C6 아미노 알킬 기가 상기 3개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 갖는 포스포다이에스터-연결된 사이티딘-아데노신 다이뉴클레오티드와 상기 접합체 모이어티 사이에 위치되는, 접합체 화합물.
  12. 제2항에 있어서,
    화학식 GN2-C6ocoaoTcAACtttcacttcAG를 갖되, 대문자가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 사이토신 LNA 뉴클레오시드가 5-메틸 사이토신이고, 소문자가 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 아래첨자 o가 포스포다이에스터 뉴클레오시드 연결기를 나타내고, 모든 다른 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이고, C6이 6개의 탄소를 갖는 아미노 알킬 기를 나타내고, GN2가 도 2에 도시된 3가 GalNAc 클러스터를 나타내고, 도 2의 물결선이 C6 아미노 알킬 기로의 3가 GalNAc 클러스터의 접합 부위를 나타내는, 접합체 화합물.
  13. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된 접합체 모이어티를 포함하는 접합체 화합물의 약학적으로 허용되는 염.
  14. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된 접합체 모이어티를 포함하는 접합체 화합물의 약학적으로 허용되는 나트륨 염.
  15. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는
    상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착된 접합체 모이어티를 포함하는 접합체 화합물의 약학적으로 허용되는 칼륨 염.
  16. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체 화합물 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염, 항원보강제 또는 이들의 혼합물을 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  17. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체 화합물 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염, 항원보강제 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 만성 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  18. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체 화합물 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염, 항원보강제 또는 이들의 혼합물을 포함하는, HBV-감염된 대상의 감염성의 감소에 사용하기 위한 약학 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 희석제가 멸균 포스페이트-완충된 염수인, 약학 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 희석제가 멸균 포스페이트-완충된 염수인, 약학 조성물.
  21. 제18항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 희석제가 멸균 포스페이트-완충된 염수인, 약학 조성물.
  22. 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 접합체 화합물 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염을, PAP-연관된 도메인-함유 5(PAPD5) 및 PAP-연관된 도메인-함유 7(PAPD7)을 발현하는 표적 세포에 효과량으로 투여함을 포함하는, 상기 표적 세포에서 PAPD5 및 PAPD7 발현을 조절하는 시험관내 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    대상에서 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  24. 제1항에 있어서,
    대상에서 만성 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  25. 제1항에 있어서,
    HBV-감염된 대상의 감염성의 감소에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  26. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 접합체 화합물.
  27. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 만성 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 접합체 화합물.
  28. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV-감염된 대상의 감염성의 감소에 사용하기 위한 접합체 화합물.
  29. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 염.
  30. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 만성 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 염.
  31. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV-감염된 대상의 감염성의 감소에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 염.
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