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KR102720422B1 - Ttk 억제제 화학요법을 위한 예후 바이오마커 - Google Patents

Ttk 억제제 화학요법을 위한 예후 바이오마커 Download PDF

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KR102720422B1
KR102720422B1 KR1020177032671A KR20177032671A KR102720422B1 KR 102720422 B1 KR102720422 B1 KR 102720422B1 KR 1020177032671 A KR1020177032671 A KR 1020177032671A KR 20177032671 A KR20177032671 A KR 20177032671A KR 102720422 B1 KR102720422 B1 KR 102720422B1
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루스 예로엔 데
주스트 코르넬리스 마리누스 우이트데하아그
만 아드리아누스 페트루스 안토니우스 데
로지에르 크리스티아안 부이스만
귀도 예니 루돌프 자만
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크로스파이어 온콜로지 홀딩 비.브이.
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Abstract

본 발명은 a) 종양 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 종양 샘플 내의 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재를 확인하는 단계로서, 상기 돌연변이가 CTNNB1의 엑손 3에 위치하고, 상기 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재는 상기 종양이 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 인간 개체 또는 동물에서 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있는 종양을 확인하는 방법을 제공한다. 대안적인 양태에서, 상기 정의된 방법의 단계 b)는 상기 종양 샘플 내의 돌연변이된 CTNNB1 단백질의 존재를 확인하는 단계로서, 상기 돌연변이가 CTNNB1의 엑손 3에 위치하고, 상기 돌연변이된 CTNNB1 단백질의 존재는, 상기 종양이 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 나타내는 것인 단계로 대체된다. 추가의 대안으로, 단계 b)는 CTNNB1 조절 유전자의 변경된 발현을 확인하는 단계로서, CTNNB1 조절 유전자의 변경된 발현은, 상기 종양이 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 의미하는 것인 단계를 포함한다.

Description

TTK 억제제 화학요법을 위한 예후 바이오마커
본 발명은 TTK 억제제를 사용하는 항암 요법에 감수성이 있는 종양을 확인하기 위해 CTNNB1 유전자 또는 CTNNB1 단백질의 돌연변이 상태, 또는 CTNNB1 조절 유전자의 변경된 발현을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CTNNB1 유전자 또는 CTNNB1 단백질의 돌연변이 상태, 또는 CTNNB1 조절 유전자의 변경된 발현의 검출에 의해, TTK 억제제를 사용하여 치료되는 암의 결과, 또는 질병의 진행을 예측하는 방법에 관한 것이다.
표적 치료는 선택성이 덜한 전통적인 세포독성제보다 부작용이 적어 생존율을 향상시킬 수 있기 때문에 암 환자들에게 크나큰 이익을 가져다 준다. 단백질 키나아제의 소분자 억제제는 표적 치료 성공의 아주 좋은 예이다: 이러한 억제제의 대부분은 건강한 세포에 대해 제한된 효과를 가지면서도 암 특이성을 허용하는 종양 세포의 독특한 특성을 이용한다. 표적 치료의 전형적인 예는 HER2 유전자가 증폭되거나 과발현된 유방암 환자에서 티로신 키나아제 억제제 및 항체를 사용하는 것이다(Higgins, M.J., and Baselga, J., J. Clin. Invest. 121: 3797; 2011).
환자가 특정 표적 치료에 반응할 것인지의 여부를 확인하기 위해서는, 치료를 개시하기 전에 환자 종양의 시료에서 약물 민감성과 관련이 있는 바이오마커의 상태 및 존재를 확인하는 것이 중요하다.
흔히 Mps1로 지칭되는 단백질 키나아제 TTK(EC 2.7.12.1)는 염색체 분리의 정확도를 보장하는 감시 기전인 방추체형성요주의점(spindle assembly checkpoint, SAC)의 성분이다(Liu, X., and Winey, M., Annu. Rev. Biochem. 81: 561; 2012). SAC 기능의 결함은 중립적인 동원체의 존재 하에 유사분열의 종결을 허용함으로써 염색체 분리의 오류를 초래할 수 있다. SAC 기능의 완전한 손실은 마우스에 있어서는 치명적이며(Baker, D.J., et al., Curr. Opin. Cell Biol. 17, 583; 2005), 인간 세포주의 생존 능력과도 양립할 수 없다(Michel, L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4459; 2004; Kops G.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8699; 2004). TTK mRNA 수준은 유방, 갑상선 유두상 암종, 간세포 암종, 췌장 선암종, 신경교종, 위암, 기관지암, 및 폐암을 비롯한 다양한 인간의 암에서 상승된다(Daniel, J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 5384; 2011; Maire, V., et al., PLoS ONE 8(5) e63712; 2013; Kilpinen, S., et al., PLoS ONE 5(12), e15068; 2010; Landi, M.T., et al., PLoS ONE 3(2) e1651; 2008; Liang, X.D., et al. PLoS ONE 9(6), e97739; 2014; Mills, G.B., et al. J. Biol. Chem. 267: 16000; 1992; Mir, S.E., et al., Cancer Cell 18: 244; 2010; Salvatore, G., et al., Cancer Res. 67: 10148; 2007: Slee, R.B., et al., Mol. Cancer Ther. 13: 307; 2014; Tannous, B.A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 105: 1322; 2013; Yuan, B., et al., Clin. Cancer Res. 12: 405; 2006). 따라서, TTK의 활성을 억제하는 화합물은 다양한 암의 치료에 유용하다. 이들 화합물은 단일 제제로, 또는 다른 항암제와 병용하여 사용될 수 있다.
TTK에 대한 억제 효과를 나타내는 다양한 화합물들이 개시된 바 있다. 아스트라제네카(AstraZeneca UK Ltd.)는 WO2009/024824 A1에서 TTK의 억제제로서 2-아닐리노퓨린-8-온을 개시하였다. 온코세라피 사이언스(Oncotherapy Science Inc.)는 WO2011/013729 A1에서 융합형 이미다졸을, WO2011/016472 A1에서는 피리딘 및 피리미딘 유도체를 개시하였다. TTK의 억제를 위한 인다졸은 WO2011/123937 A1, WO2013/053051 A1 및 WO2014/056083 A1에서 대학 보건 네트워크(University Health Network)에 의해 개시되었다. 다나 파버 암 연구소(Dana Farber Cancer Institute)는 WO2010/080712 A1에서 TTK의 억제제로서 피리미도-디아제피논을 개시하였다. 너비아노 메디칼 사이언스(Nerviano Medical Sciences S.R.L.)는 TTK의 억제제로서 WO2009/156315 A1에서는 피라졸로-퀴나졸린을, WO2012/101029 A1에서는 트리사이클릭 유도체를, WO2010/108921 A1에서는 N-아릴-2-(2-아릴아미노피리미딘-4-일)피롤-4-카복사미드를, WO2012/013557 A1에서는 이속사졸로-퀴나졸린을, WO2012/101032 A1에서는 트리사이클릭 피롤로 유도체 및 WO2012/139930 A1에서는 피라졸릴-피리미딘을 개시하였다.
미리어드 파마슈티컬스(Myriad Pharmaceuticals Inc.)는 WO2010/111406 A2에서 TTK의 억제제로서 퓨린을 개시하였다. 또한, 캔서 리서치 테크놀로지(Cancer Research Technology Ltd.)는 TTK의 억제제로서 WO2012/123745 A1에서 피롤로피리딘아미노 유도체를, WO2014/037750 A1 및 WO2014/037751 A1에서 바이사이클을 개시하였다.
바이엘 쉐링 파마(Bayer Schering Pharma A.G)는 TTK의 억제제로서 WO2010/124826 A1에서 이미다조퀴녹살린을, WO2011/026579 A1에서 아미노퀴녹살린을, WO2011/063907 A1, WO2011/063908 A1, WO2011/064328 A1, WO52011/17688 A1, WO2012/143329 A1, WO2014/009219 A1, WO2014/195274 A1, WO2014/195276 A1 및 WO2014/198647 A1에서 트리아졸로피리딘을, WO2012/136531 A1에서 이미다조피리딘을, WO2012/130905 A1에서 치환된 벤즈이미다졸을, WO2012/032031 A1, WO2013/135612 A1 및 WO2014/131739 A1에서 이미다조피리다진을, WO2011/113862 A1, WO2011/151259 A1, WO2012/080228 A1, WO2012/080229 A1, WO2012/080230 A1, WO2012/080232 A1, WO2012/080234 A1 및 WO 2012/080236 A1에서 이미다조피라진을 각각 개시하였다.
서로 다른 인간 암 세포주를 사용하는 세포 증식 분석에서 서로 다른 화합물 부류의 대표적인 화합물들을 조사한 바 있다. 이미다조-피라진의 대표적인 TTK 억제제인 Mps-BAY2b는 160 nM 내지 4.3 μM의 IC50으로 서로 다른 종양 기원의 27개의 인간 암 세포주의 증식을 억제하는 것으로 나타났으며(Jemaa, M., et al., Cell Death Different. 20: 1532; 2013); 반응과 유전자 불안정성의 패턴, 종양 형성에 관련된 수개의 단백질의 활성, 또는 SAC의 기능성 간에는 아무런 상관관계가 없는 것으로 밝혀졌다.
피라졸로-퀴나졸린 부류의 대표적인 것인 NMS-P715는 127개의 암 세포주의 패널에서 광범위한 세포주의 증식을 억제하였고(Colombo, R., et al., Cancer Res. 70: 10255; 2010); IC50은 1 μM에 근접하거나 또는 그 이상이었으며, 항증식 효과와 세포의 배가 시간 간에는 상관관계가 관찰되지 않았다.
미리어드에 의해 개시된 TTK 억제제인 MPI-04079605는 서로 다른 종양 기원인 14개의 인간 암 세포주의 성장을 억제하는 것으로 나타났으나, 장시간의 항온배양 시간 후에만 그러하였다(Tardif, K.D., et al., Mol. Cancer Res. 10: 2267; 2011).
1H-피롤로[2,3-c]피리딘 부류의 대표적인 것인 CCT251455는 160 nM의 GI50으로 HCT116 세포의 증식을 억제하였다(Naud, S., et al., J. Med. Chem. 56: 10045; 2013).
시오노키(Shionogi)에 의해 개시된 이미다조[1,2-b]피리다진계 TTK 억제제는 3.3 nM 내지 320 nM의 IC50으로 서로 다른 종양 기원인 14개의 인간 암 세포주의 증식을 억제하는 것으로 나타났다(Kusakabe, K., et al., J. Med. Chem. 58: 1716; 2015).
대표적인 인다졸인 CFI-401870은 8 nM 내지 70 nM의 GI50으로 22개의 암 세포주의 패널에 있어서 광범위한 세포주의 증식을 억제하였다(Liu, Y., et al., J. Med. Chem. 58: ASAP; 2015).
상기 언급한 프로파일링 실험에서 서로 다른 암 세포주들이 TTK 억제제에 대하여 상이한 상대적 민감도를 나타내었던 반면, TTK 억제제에 대한 민감도와 관계가 있는 어떠한 유전자 또는 다른 마커들도 확인되지는 않았다.
상기 언급한 화합물 부류 중 수개의 TTK 억제제가 흑색종(Colombo, R., et al.), 결직장암(Jemaa, M., et al.; Tardif, et al.; Laufer, R., et al., Bioorg. Med. Chem. 22: 4968; 2014), 자궁경부암(Jemaa, M., et al.) 및 신경교종 세포(Tannous, B.A. et al.)의 마우스 모델에서 이종이식의 성장을 감소시키는 것으로 나타났던 바 있는데, 이는 다양한 암의 치료에 있어서 TTK 억제제의 잠재적인 용도를 입증하는 것이다.
서로 다른 여러가지 세포주 및 종양 유형에서 TTK 억제제의 광범위한 활성을 고려하면, 어떠한 암이 TTK 억제제를 사용하는 화학요법 치료에 가장 잘 반응하는지를 예측하는데 사용될 수 있는 바이오마커는 분명 필요하다. 이러한 예후 약물 민감성 바이오마커는 TTK 억제제를 사용하는 약물 요법에 대해 가장 최적의 환자 모집단을 확인하는데 사용될 수 있거나, 또는 TTK 억제제를 사용하여 치료된 질병의 진행 또는 결과를 예측하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 본원에 첨부된 청구항 제1항에 정의된 방법이 제공된다.
본 발명자들은 놀랍게도 CTNNB1 유전자(HUGO 명칭: CTNNB1) 내에 돌연변이를 품고 있는 암세포가 정상 세포 또는 돌연변이 CTNNB1을 발현하지 않는 암세포(CTNNB1 적격인(proficient) 세포)보다 TTK 억제제에 더 민감하다는 것을 관찰하였다.
CTNNB1 유전자는 세포 부착의 정합을 조절하고 Wnt 신호전달 경로에서의 유전자 전사를 조절하는 이중 기능 단백질인 β-카테닌을 암호화한다(Logan, C.Y., and Nusse, R., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 896: 1998; 2004). CTNNB1 유전자 내의 돌연변이는 여러가지 암, 예컨대 결장암(Morin, P.J. et al., Science 275: 1787; 1997; Iwao, K., et al., Cancer Res. 58: 1021; 1998; Sparks, A.B., et al. Cancer Res. 58: 1130; 1998) 및 간세포 암종(Miyoshi, Y., et al., Cancer Res. 58: 2524; 1998; Chen, Y.W., et al., Hepatology 36: 927; 2002), 흑색종(Rubinfeld, B., et al., Science 275: 1790; 1997), 수아세포종(Zurrawel, R.H., et al. Cancer Res. 58: 896; 1998), 폐암(Shigemitsu, K., et al., Oncogene 20: 4249; 2001), 자궁내막암(Fukuchi, T., et al., Cancer Res. 58: 3526; 1998; Liu, Y., et al., J. Natl. Canc. Inst. 106(9); 2014), 난소암(Palacios, J., and Gamallo, C., Cancer Res. 58: 1344; 1998) 및 전립선암(Voeller, H.J., and Gelmann, E.P., Cancer Res. 58, 2520; 1998)에서 발견된 바 있다.
β-카테닌의 활성은 단백질 키나아제인 글리코겐 신타아제 키나아제 3β(GSK3β) 및 카제인 키나아제 I(CKI)에 의한 세린과 트레오닌에서의 인산화, 이후 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 및 분해에 의해 조절된다(Liu, C., et al. Cell 108, 837; 2002). 하나 이상의 이들 세린 또는 트레오닌 잔기의 결실 또는 치환을 유발하는 CTNNB1 유전자 내의 돌연변이는 과활성 β-카테닌 및 제어되지 않은 세포 성장을 초래한다(Morin, P.J. et al., Science 275: 1787; 1997; Liu, C., et al.).
본 발명은 TTK 억제제를 사용하는 항암 요법에 대한 종양의 감수성을 확인하기 위해, 상기 종양 유래 물질에서 CTNNB1의 돌연변이 상태를 확인하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 TTK 억제제를 사용하는 증식성 질환에 대한 요법의 효용성을 모니터링하거나, 또는 TTK 억제제를 사용하여 치료된 암의 결과를 예측하기 위해 CTNNB1의 돌연변이 상태를 확인하는 방법을 제공한다.
CTNNB1의 돌연변이 상태에 대한 분석은 다른 유전자 및/또는 단백질의 돌연변이 상태 또는 발현에 대한 분석과 함께 수행될 수 있거나, 또는 CTNNB1 유전자 상태에 대한 분석만으로 한정될 수도 있다.
본 발명은 진단 방법을 구성한다. 그러나, 상기 방법은 인체 또는 동물체 상에서 직접적으로 수행되지는 않는다. 상기 진단 방법은 실험실 내에서 수행될 수 있지만, 특히 단일 제제로서, 또는 다른 치료제 또는 방사선요법과 함께 사용된 TTK 억제제를 이용한 화학요법에 환자가 반응하는지의 여부와 관련하여 의사가 암 환자의 질병 진행에 대한 정확한 진단을 내릴 수 있도록 하는 결과를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 본원에 상술된 화학식 I - VIII에 정의된 바와 같은 TTK 억제제를 사용하는 항암 요법에 있어서 종양 유래 물질의 감수성을 확인하기 위해, 상기 종양 유래 물질에서 발암성 CTNNB1의 돌연변이 상태를 확인하는 방법을 제공한다.
β-카테닌에서 여러가지 서로 다른 돌연변이들이 암 환자에게서 관찰되었으며, 이들은 COSMIC과 같은 데이터베이스에 분류되어 있다(http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). 인간의 암에서 CTNNB1 돌연변이는 암유전체지도(The Cancer Genome Atlas)에 보고되어 있으며, 이는 http://www.cancergenome.nih.gov에서 찾아볼 수 있다.
CTNNB1 핵산 및 단백질 서열에 대한 링크는 http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report?hgnc_id=2514에서 찾아볼 수 있으며, 이 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. CTNNB1의 단백질 서열과 아미노산 넘버링도 본원에 첨부된 도 1에 제공되어 있다.
CTNNB1의 엑손 3은 β-카테닌을 인산화시키는 키나아제의 역량에 영향을 미치는 돌연변이의 핫스팟을 포함한다(Morin, P.J. et al., 1997). 이 인산화의 결핍은 핵 내의 β-카테닌의 축적을 초래한다(Liu, C. et al., 2002). 보다 구체적으로, 33번, 37번 또는 45번 위치에서 세린 잔기의 돌연변이 또는 결실, 또는 41번 위치에서 트레오닌 잔기의 돌연변이 또는 결실은 β-카테닌의 분해에 참여하는 GSK3β 인산화 모티프를 변경시킨다(Rubinfeld, B., et al.; Morin, P.J., et al.). 결과적으로, 이들 돌연변이는 발암성 신호전달을 증가시킨다(Rubinfeld, B., et al.; Morin, P.J., et al.).
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본원에 첨부된 청구항 15항 내지 18항에 따른 방법이 제공된다. 구체적으로, 화합물이 TTK 억제제인지를 확인하는 방법으로서, 상기 방법이 a) 제1 및 제2 포유동물 세포주를 제공하는 단계로서, 상기 제1 세포주는 CTNNB1이 돌연변이된 것이고 상기 제2 세포주는 CTNNB1 적격인 것인 단계; b) 상기 제1 및 제2 세포주를 제1 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 제1 및 제2 세포주의 세포 증식의 억제를 분석으로 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법이 기술된다. 이 방법의 중요한 변형에서는, 제2 후보 화합물을 사용하여 상기 언급한 단계 b) 및 c)를 반복하며, 후보 화합물의 선택은 상기 제1 세포주를 사용한 분석에서의 각 후보 화합물들의 활성에 기초하여 이루어진다.
한 실시양태에서, 이 방법에서 사용된 제1 및 제2 세포주는 암세포주일 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 제1 및 제2 세포주는 동질유전자 세포주일 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 상기 기술된 3개의 돌연변이의 발현이 TTK의 화학 억제제에 대한 암세포의 감수성이 증가된 것과 관련이 있음을 관찰하였다. 따라서, 세린 33번, 트레오닌 41번 또는 세린 45번에서의 CTNNB1 유전자의 돌연변이 상태에 대한 검출은 TTK 억제제를 이용한 치료에 있어서 종양의 감수성을 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 기술한다:
도 1은 CTNNB1(β-카테닌)의 단백질 서열과 아미노산 넘버링이다(UniProt code P35222). 33번, 37번, 41번 및 45번 위치에서 밑줄친 세린(S) 또는 트레오닌(T) 잔기의 돌연변이 또는 결실은 β-카테닌의 인산화 및 분해를 변경시킨다(Rubinfeld, B., et al.; Morin, P.J., et al.).
도 2a 내지 도 2g는 실시예 5, 8, 9, 12, 13, 17 및 20에 있어서 66개의 암세포주의 세포 프로파일링의 볼케이노 플롯(volcano plot)을 나타낸다.
완성도를 위해, 볼케이노 플롯은 세포주에 존재하는 암 유전자 돌연변이와 화합물을 이용한 증식 분석에서 이들 세포주의 반응과의 연관성에 대한 분산 분석(Anova)을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 볼케이노 플롯은 돌연변이 및 비돌연변이 세포주 간의 평균 IC50 이동(x-축)과 Anova 시험의 유의성(y-축)을 나타낸다. 유의성은 여러 시험에 대해 보정되었고 임계 수준(점선) 위의 모든 결합들은 검정색 으로 채웠다. 원의 면적은 돌연변이를 수반하는 세포주의 수에 비례한다. 약물 민감성 분석에 사용된 암세포주를 하기 표 1에 열거한다.
분석용 종양 샘플을 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있어 여기에서 특별한 설명은 필요치 않다. 암에 걸린 개체에 있어서 종양의 CTNNB1 유전자의 돌연변이 상태는 해당 종양 샘플의 DNA 서열을 분석하고, 상기 종양 DNA 서열을 건강한 조직에서의 DNA 서열 또는 UniProt 데이터베이스에서 P35222로 언급되고 도 1에 나타낸 '야생형' CTNNB1 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. DNA 샘플은 종양 생검으로부터 직접 채취하거나, 또는 혈중 종양 DNA로부터 유래할 수 있다(Diaz, L.A., et al., Nature 486: 537; 2012). CTNNB1 유전자의 돌연변이 상태는 종양 샘플의 mRNA의 시퀀싱에 의해 확인될 수도 있거나, 또는 β-카테닌의 아미노산 서열에 대한 분석에 의해 직접적으로 확인될 수도 있거나, 또는 특정 항체를 사용하는 β-카테닌의 인산화 상태의 확인에 의해 알아볼 수 있다.
돌연변이가 β-카테닌의 분해에 영향을 주기 때문에, 이들은 β-카테닌의 총 세포 농도 및 핵 내의 β-카테닌의 양에 영향을 미친다. 따라서, CTNNB1 유전자의 돌연변이 상태는 종양 세포 내의 총 또는 핵성 β-카테닌 농도를 측정함으로써 간접적으로 알아볼 수도 있다.
다르게는, CTNNB1의 돌연변이 상태는 β-카테닌에 의해 조절되는 유전자의 발현을 분석함으로써 확인될 수 있다. β-카테닌에 의해 조절되는 유전자의 검출은 종양 샘플로부터 RNA를 추출하고 역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하거나 마이크로어레이 분석을 이용하여 유전자 발현을 확인함으로써 행해질 수 있다. β-카테닌에 의해 조절된 여러가지 유전자들이 기술된 바 있는데, 여기에는 Axin2(Yan, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 14973; 2001), c- myc(He, T.C. et al., Science 281: 1509; 1998) 및 LGR5(Barker, N. et al., Nature 499: 1003; 2007)를 포함한다. β-카테닌에 의해 조절되는 유전자들을 종합한 목록은 Wnt 홈페이지(http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/target_genes) 및 과학 학술논문(Willert, J. et al., BMC Dev. Biol. 2:8; van de Wetering, M et al., Cell 111: 241; 2002)에서 찾아볼 수 있다.
β-카테닌에 의해 조절되는 유전자의 발현은 특정 항체 또는 질량분광법 기초의 방법을 사용하여 단백질 수준에서 확인될 수도 있다. β-카테닌에 의해 조절되는 수개의 유전자들이 발암유전자이기 때문에, CTNNB1의 돌연변이 상태는 발암유전자의 신호전달을 확인함으로써 확인될 수도 있다.
TTK 억제제의 예로는 화학식 I에 따른 (5,6-디하이드로)피리미도[4,5-e]인돌리진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 I
상기 식 중에서,
R1은 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
R11은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (2-3C)알케닐, (2-3C)알키닐, (1-2C)알콕시 또는 OC2H3이고, 모든 알킬 및 알콕시기는 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되며;
R12는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
R13은 R131CH2, R132O, R133R134N, R135C(O), R136S, R136S(O), R136S(O)(NH), R137SO2, (2-7C)헤테로사이클로알킬, 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 각각의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 옥소, (1-2C)알콕시, (1-6C)알킬카보닐, (1-6C)알킬설포닐, (1-5C)알콕시카보닐, (1-6C)알킬아미노카보닐, (3-6C)사이클로알킬카보닐, (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐 또는 디[(1-2C)알킬]아미노로 임의로 치환되며, 각각의 알킬카보닐, 알킬설포닐, 알콕시카보닐, 알킬아미노카보닐, 사이클로알킬카보닐 또는 헤테로사이클로알킬카보닐은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 시아노, 옥소 또는 (1-2C)알콕시로 임의로 치환되고;
R131은 (1-6C)알킬카보닐아미노, (3-6C)사이클로알킬카보닐아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R132는 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 할로겐, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R133은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬카보닐, (1-5C)알콕시카보닐, (3-6C)사이클로알킬카보닐 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R134는 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
R135는 (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬아미노, 디[(1-6C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬아미노 또는 (3-6C)사이클로알킬아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬, 옥소, 시아노 또는 아미노로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R136은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R137은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬아미노, 디[(1-6C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬아미노 또는 (3-6C)사이클로알킬아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
R14는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
R15는 H 또는 할로겐이다.
상기 화학식 I에서, R2는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
R21은 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
R22는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
R23은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 시아노 또는 하이드록시이고;
R24는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
R25는 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
R26은 H, (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-5C)헤테로사이클로알킬, (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬이고, 여기서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수를 나타내며, 모든 알킬, 헤테로사이클로알킬 및 (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬기는 (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시, 옥소, 아미노, (3-6C)사이클로알킬, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-5C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환된다.
상기 화학식 I에서, R2에 있어서 R21과 R25 중 단 하나만이 H일 수 있다.
공지된 TTK 억제제의 다른 예로는 WO2009/156315 A1에 기술된 화학식 II에 따른 피라졸로-퀴나졸린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 II
상기 식 중에서,
R1 및 R3은 (6-10C)아릴 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 양 기는 모두 임의로 치환될 수 있으며;
R2는 (1-6C)알킬 및 (2-6C)알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 모두 임의로 치환될 수 있으며;
R4는 수소 및 (1-6C)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 모두 임의로 치환될 수 있으며;
R5 및 R6은 독립적으로 수소 또는 메틸이다.
공지된 TTK 억제제의 다른 예로는 WO2011/013729 A1, WO2011/113862 A1, WO2011/151259 A1, WO2012/080228 A1, WO2012/080229 A1, WO2012/080230 A1, WO2012/080232 A1, WO2012/080234 A1 및 WO 2012/080236 A1에 기술된 것과 같은 화학식 III에 따른 이미다조-피라진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 III
상기 식 중에서,
R1은 (1-6C)알킬, 할로(1-6C)알킬, HO-(1-6C)알킬, H2N-(1-6C)알킬, 시아노(1-6C)알킬, (1-6C)알콕시(1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, (3-6C)사이클로알킬, (3-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R2는 (6-10C)아릴 및 (1-9C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 모두 임의로 치환될 수 있으며;
R3은 (1-6C)알킬, -(CH2)n-(3-7C)헤테로사이클로알킬), -(CH2)n-(4-8C)헤테로사이클로알케닐), (3-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴, (1-9C)헤테로아릴, -(CH2)n-(6-10C)아릴, -O-(6-10C)아릴, -C(=O)N 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 치환될 수 있으며, n은 0, 1 또는 2의 정수이다.
공지된 TTK 억제제의 또 다른 예로는 WO2010/111406 A1에 기술된 것과 같은 화학식 IV에 따른 퓨린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 IV
상기 식 중에서,
R1은 (3-6C)사이클로알킬 및 (3-7C)헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R2는
a) (6-10C)아릴, 및
b) (1-5C)헤테로아릴
으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
양 기는 모두 임의로 치환될 수 있다.
또한, 공지된 TTK 억제제의 다른 예로는 WO2011/013729 A1, WO2012/032031 A1, WO2013/135612 A1 및 WO2014/131739 A1에 기술된 것과 같은 화학식 V에 따른 이미다조-피리다진 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 V
상기 식 중에서,
R1은 수소, (1-6C)알킬, 할로(1-6C)알킬, HO(1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (3-7C)헤테로사이클로알킬 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R2는 (6-10C)아릴 또는 (1-9C)헤테로아릴이고, 이들 중 각각은 임의로 치환될 수 있고;
R3은 X-(6-10C)아릴 및 X-(1-9C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 모두 임의로 치환될 수 있으며, 여기서 X는 S(=O)p, O, NR4, CR4aR4b 또는 C=CR4aR4b 이고, p는 0, 1 또는 2의 정수이며;
R4, R4a, R4b는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 (1-6C)알킬을 나타낸다.
공지된 TTK 억제제의 다른 예로는 WO2011/063907 A1, WO2011/063908 A1, WO2011/064328 A1, WO2011/157688 A1, WO2012/143329 A1, WO2014/009219 A1, WO2014/195274 A1, WO2014/195276 및 WO2014/198647 A1에 기술된 것과 같은 화학식 VI에 따른 트리아졸로피리딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 VI
상기 식 중에서,
R1은 페닐기, 피리딜기 또는 인돌릴기를 나타내고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R2는 페닐기, 피리딜기 또는 피리미딜기를 나타내고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R3은 수소 원자 또는 -C(=O)-O-(CR7R8)-O-C(=O)-R4로부터 선택된 기를 나타내고, 여기서 R4는 -NH2, -N(H)R5, -N(R5)R6으로부터 선택된 기로 동일하거나 다르게 1회 이상 치환된 (1-6C)알킬, -NH2, -N(H)R5, -N(R5)R6으로부터 선택된 기로 동일하거나 다르게 1회 이상 임의로 치환된 (4-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 기를 나타내며;
R5 및 R6은 서로 독립적으로 수소 원자 및 (1-3C)알킬로부터 선택된 기를 나타내고;
R7은 수소 원자 및 (1-3C)알킬로부터 선택된 기를 나타내며;
R8은 수소 원자를 나타낸다.
공지된 TTK 억제제의 또 다른 예로는 WO2009/032694 A1, WO2009/032703 A1 및 문헌[Nature Chemical Biology 6 (2010), 359]에 기술된 것과 같은 화학식 VII에 따른 피롤로피리딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 VII
상기 식 중에서,
R1은 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있고;
R2는 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있다.
또한, 공지된 TTK 억제제의 또 다른 예로는 WO2011/016472 A1, 문헌[ACS Med. Chem. Letters 3 (2012), 560] 및 [Bioorg. Med. Chem. Letters 23 (2015), 2247]에 기술된 것과 같은 화학식 VIII에 따른 아미노피리딘 및 아미노피리미딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 부류에 속하는 화합물을 들 수 있다.
화학식 VIII
상기 식 중에서,
R1은 수소 원자 및 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 (6-10C)아릴, (1-5C)헤테로아릴, (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬 및 (3-7C)헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
R3은 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
X는 C 또는 N이다.
본원에 사용된 용어를 하기에 언급한다:
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
(1-2C)알킬은 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미하고, 메틸 또는 에틸이다. 메틸기는 Me 또는 CH3로 나타낼 수 있다.
(1-3C)알킬은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하고, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필이다.
(1-4C)알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하고, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸 또는 3급-부틸이고, (1-3C)알킬기가 바람직하다.
(1-5C)알킬은 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸 및 이소펜틸이고, (1-4C)알킬기가 바람직하다.
(1-6C)알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 3급-부틸, n-펜틸 및 n-헥실이다. (1-5C)알킬기가 바람직하고, (1-4C)알킬이 보다 바람직하다.
(1-2C)알콕시는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 의미하고, 상기 알킬 모이어티는 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다.
(2-4C)알콕시는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 의미하고, 예를 들어, 에톡시, 프로필옥시, 부틸옥시, 이소프로필옥시, 이소부틸옥시 및 4급-부틸옥시이다. 에틸옥시 및 프로필옥시가 바람직하다. 에틸옥시기가 보다 바람직하다.
(1-3C)알콕시는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 의미하고, 상기 알킬 모이어티는 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다. (1-2C)알콕시기가 바람직하다.
(1-4C)알콕시는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 의미하고, 상기 알킬 모이어티는 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다. (1-3C)알콕시기가 바람직하고, (1-2C)알콕시기가 가장 바람직하다.
(1-5C)알콕시는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알콕시기를 의미하고, 상기 알킬 모이어티는 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다. (1-4C)알콕시기가 바람직하고, (1-3C)알콕시기가 보다 바람직하다.
(2-3C)알케닐은 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알케닐기를 의미하고, 예를 들어, 에테닐 또는 2-프로페닐이다.
(2-3C)알키닐은 에티닐 또는 2-프로피닐을 의미한다.
(3-4C)사이클로알킬은 3 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬기를 의미하고, 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이다.
(3-6C)사이클로알킬은 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬기를 의미한다. "사이클로알킬"의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 포함한다.
(2-5C)헤테로사이클로알킬은 2 내지 5개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 5개의 탄소 원자; 및 N, O 및/또는 S로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 헤테로사이클로알킬기를 의미하고, 이는 가능한 경우에 헤테로원자, 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 바람직한 헤테로원자는 N 또는 O이다. 옥세타닐, 아제티디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 피롤리디닐 및 피페라지닐이 바람직하다. 가장 바람직한 (2-5C)헤테로사이클로알킬은 옥세타닐 및 아제티디닐이다.
(2-7C)헤테로사이클로알킬은 2 내지 7개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 5개의 탄소 원자, 및 N, O 및/또는 S로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 헤테로사이클로알킬기를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 N 또는 O이다. 바람직한 (2-7C)헤테로사이클로알킬기는 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 호모피페리디닐, 모르폴리닐 또는 티오모르폴리닐이다. 헤테로사이클로알킬기는 가능한 경우에 헤테로원자를 통해 부착될 수 있다.
(6-10C)아릴은 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 방향족 탄화수소기를 의미한다. "(6-10C)아릴"의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸 또는 인데닐을 포함한다.
(1-5C)헤테로아릴은 1 내지 5개의 탄소 원자 및 N, O 및/또는 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 치환되거나 치환되지 않은 방향족기를 의미한다. (1-5C)헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있다. "(1-5C)헤테로아릴"의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피리딜, 피리미딜, 트리아지닐, 티에닐, 퓨릴, 피롤릴 또는 피라졸릴을 포함한다.
(3-6C)사이클로알킬아미노는 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 사이클로알킬기로 일치환된 아미노기를 의미한다.
(1-6C)알킬아미노는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기로 일치환된 아미노기를 의미한다. 바람직한 (1-6C)알킬아미노기는 메틸아미노이다.
디[(1-2C)알킬]아미노는 각각 독립적으로 1 내지 2개의 탄소 원자를 포함하고, 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기(들)로 이치환된 아미노기를 의미한다. 바람직한 디[(1-2C)알킬]아미노기는 디메틸아미노이다.
디[(1-6C)알킬]아미노는 각각 독립적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고, 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기(들)로 이치환된 아미노기를 의미한다. 바람직한 디[(1-6C)알킬]아미노기는 N-메틸프로판-1-아미노이다.
(2-7C)헤테로사이클로알킬아미노는 2 내지 7개의 탄소 원자를 포함하고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (2-7)헤테로사이클로알킬기로 일치환된 아미노기를 의미한다.
(1-6C)알킬아미노카보닐은 아미노기로 치환된 카보닐기를 의미한다. 상기 아미노기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기로 일치환된다.
(2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐은 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (2-7C)헤테로사이클로알킬기로 치환된 카보닐기를 의미한다.
(1-5C)알콕시카보닐은 알콕시기로 치환된 카보닐기를 의미하고, 상기 알콕시기의 알킬 모이어티는 상기 정의된 바와 같이 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다.
(1-6C)알킬설포닐은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (1-6C)알킬기로 치환된 설포닐기를 의미한다.
(1-6C)알킬카보닐은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (1-6C)알킬기로 치환된 카보닐기를 의미한다.
(3-6C)사이클로알킬카보닐은 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (3-6C)사이클로알킬기로 치환된 카보닐기를 의미한다.
(1-6C)알킬아미노카보닐은 아미노기로 치환된 카보닐기를 의미한다. 상기 아미노기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기로 일치환된다.
(1-6C)알킬카보닐아미노는 카보닐기로 치환된 아미노기를 의미한다. 상기 카보닐기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 알킬기로 일치환된다.
(3-6C)사이클로알킬카보닐아미노는 카보닐기로 치환된 아미노기를 의미한다. 상기 카보닐기는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 사이클로알킬기로 일치환된다.
(2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐아미노는 카보닐기로 치환된 아미노기를 의미한다. 상기 카보닐기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (2-7C)헤테로사이클로알킬기로 일치환된다.
하이드록시(1-2C)알킬은 하이드록시기로 치환된, 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (1-2C)알킬기를 의미한다.
(1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬은 하나 이상의 (2-4C)알킬옥시기로 치환된, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 상기 정의된 것과 동일한 의미를 갖는 (1-6C)알킬기를 의미하고, 여기서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수를 나타내고, 알콕시기는 하나를 다른 하나에 선형으로 연결된다. 마지막 (2-4C)알킬옥시기는 (1-2C)알킬옥시기로 치환된다. (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬 그룹에서, 바람직한 (1-2C)알콕시기는 메톡시이고, 바람직한 (2-4C)알콕시는 에톡시이고, 바람직한 (1-6C)알킬은 에틸이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 4이고, n이 1 또는 2인 것이 가장 바람직하다.
(1-9C)헤테로아릴은 1-9개의 탄소 원자, 및 N, O 및/또는 S으로부터 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 치환되거나 치환되지 않은 방향족기를 의미한다. 상기 (1-9C)헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있다. "(1-9C)헤테로아릴"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 퀴놀론, 이소퀴놀린, 인다졸, 벤즈이속사졸 및 인돌을 포함한다.
(2-6C)알케닐은 2-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알케닐기를 의미한다. "(2-6C)알케닐"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 에테닐, 2-부테닐 및 n-펜테닐을 포함한다.
(2-6C)알키닐은 2-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알키닐기를 의미한다. "(2-6C)알키닐"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 에티닐, 프로피닐, n-부티닐, n-펜티닐, 이소펜티닐, 이소헥시닐 또는 n-헥시닐을 포함한다.
(3-7C)헤테로사이클로알킬은 3-7개의 탄소 원자, 바람직하게는 3-5개의 탄소 원자, 및 N, O 및/또는 S으로부터 선택된 1개 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 헤테로사이클로알킬기를 의미한다. "헤테로사이클로알킬"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 호모피페리디닐 또는 모르폴리닐을 포함한다.
(4-8C)헤테로사이클로알케닐은 4-8개의 탄소 원자, 바람직하게는 이중 결합을 갖는 3-5개의 탄소 원자; 및 N, O 및/또는 S로부터 선택된 1개의 헤테로원자를 갖는 헤테로사이클로알케닐기를 의미한다. "헤테로알케닐"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 옥시사이클로헥세닐 및 아자사이클로헥세닐을 포함한다.
할로(1-6C)알킬은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하는데, 여기서 1개 내지 모든 수소 원자들은 본원에 정의된 할로겐으로 대체된다. 본 발명에 유용한 이러한 분지쇄형 또는 직쇄형 할로알킬기의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 할로겐 원자, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도로 독립적으로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸 및 n-부틸을 포함한다. "할로알킬"의 구체적인 예로는 이에 제한되지는 않지만, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 1-플루오로에틸, 2-플루오로에틸, 2,2-디플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 및 퍼플루오로-n-프로필을 포함한다.
HO(1-6C)알킬은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하는데, 여기서 1개, 2개 또는 3개의 수소 원자는 히드록시기로 대체된다. "HO(1-6C)알킬"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸, 2-하이드록시에틸, 및 1,2-디하이드록시에틸을 포함한다.
H2N(1-6C)알킬은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하는데, 여기서 1개, 2개 또는 3개의 수소 원자는 아미노기로 대체된다. "H2N(1-6C)알킬"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 아미노메틸, 1-아미노에틸, 2-아미노에틸, 및 1,2-디-아미노에틸을 포함한다.
시아노(1-6C)알킬은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하는데, 여기서 1개, 2개 또는 3개의 수소 원자는 시아노기로 대체된다. "시아노(1-6C)알킬"의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 시아노메틸, 1-시아노에틸, 2-시아노에틸, 및 1,2-디시아노에틸을 포함한다.
다작용성기를 갖는 상기 정의에서, 부착점은 마지막 기에 존재한다.
치환체의 정의에서, 상기 치환체의 "모든 알킬기"가 임의로 치환되는 것으로 나타나는 경우, 이는 알콕시기의 알킬 모이어티도 포함한다.
"치환된" 이라는 용어는 지정된 원자(들) 상의 하나 이상의 수소가 여기에 나타낸 기로부터 선택된 것으로 대체되는 것을 의미하지만, 단, 기존 환경 하에서 지정된 원자의 정상 원자가는 초과되지 않으며, 해당 치환은 안정한 화합물을 유도한다. 치환체 및/또는 변수의 조합은 해당 조합이 안정한 화합물을 유도하는 경우에만 허용가능하다.
"안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로의 단리, 및 효과적인 치료제로의 제제화를 견뎌낼 정도로 충분히 강한 화합물 또는 구조로 정의된다.
"임의로 치환된" 이라는 용어는 특정한 그룹, 라디칼 또는 모이어티를 사용한 임의의 치환을 의미한다.
이제 본 발명을 하기의 실시예에서 기술한다. 이들 실시예들은 본 발명을 예시하려는 것일 뿐이지, 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.
실시예
방법
암 세포주
TTK 억제제에 대한 암 유래 세포의 민감성이 특정 유전자 마커의 존재와 상관관계가 있는지를 알아보기 위해, 다양한 TTK 억제제들을 서로 다른 종양 기원으로부터 유래한 것으로서 다양한 발암유전자 및 종양 억제유전자의 발현과 돌연변이 상태와 관련하여 특성을 분석한 66개의 암세포주의 패널 상에서 동시에 프로파일링하였다(Uitdehaag, J.C.M., et al., PLoS ONE 9(3), e92146; 2014). 사용된 암 세포주들을 하기 표 1에 열거하였다. 모든 세포주들은 미국 미생물보존센터(ATCC)(미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 구매하였다.
[표 1]
약물 민감성 분석에 사용된 암세포주
세포주 패널에서 31개의 가장 변화 빈도가 높은 암 유전자의 유전자 상태를 공공 시퀀싱 데이터의 '돌연변이' 또는 '야생형'으로 확립하였다(Garnett, M.J., et al., Nature 483: 570; 2012). 하기 표 2에 CTNNB1 유전자 돌연변이를 갖는 세포주를 나열하였다. A427, LS 174T, HCT116 및 SW48은 특정 세린 및 트레오닌 잔기에서의 인산화를 통해 β-카테닌의 안정성을 조절하는 세린 또는 트레오닌 잔기 내에 돌연변이를 가진다(Polakis, P., Curr. Opin. Gen. Dev. 9: 15; 1999). 상기 표에 열거된 다른 세포주 및 언급되지 않은 66개의 암 세포주 패널의 세포주는 단백질 안정성의 조절에 관련되지 않은 CTNNB1 돌연변이를 가지거나, 또는 어떠한 CTNNB1 유전자 돌연변이도 가지지 않는다.
[표 2]
약물 민감성 분석에 포함된 암세포주 내의 CTNNB1 유전자 돌연변이
참고문헌
1. Cosmic Cell Lines project, status February, 2nd, 2015
2. Garnett, M.J., et al.
3. Wang, Z., et al., Cancer Res. 63: 5234; 2003
4. Cancer Cell Line Encyclopedia, status February, 2nd, 2015
5. Morin, et al., 1997; Ilyas, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10330; 1997
세포 증식 분석
모든 세포주들을 ATCC에서 권고한 배지 내에서 배양하였다. 상기 배양 배지는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, 네덜란드 블레이베이크 소재)에서 구매하였다. 증식 분석은 120시간 동안 화합물과의 항온배양과 함께 384-웰 플레이트 내에서 기술된 바와 같이 수행하였다(Uitdehaag J.C.M., et al.). TTK 억제제의 효과를 9-포인트 희석액 계열 중에서 중복하여 확인하였다. 항온배양 동안의 최종 DMSO 농도는 모든 웰에서 0.4 %(v/v)였다. 정보의 판독으로서, ATPlite™ 1 스텝 용액(네덜란드 흐로닝엔 소재의 퍼킨 엘머)을 사용하여 세포내 ATP 함량을 세포수의 간접적 측정치로 사용하였다. 세포 성장에 대한 화합물의 효과를 단 0.4%(v/v)의 DMSO를 함유하는 대조군 웰에 대하여 계산하였다. 반수 최대 억제 효능(IC50)을 XLfit™5(영국 써레이 소재의 ID 비즈니스 솔루션(Business Solutions, Ltd.))을 이용하여 비선형 회귀에 의해 피팅하였다.
세포 패널 반응 데이터의 분석
분산 분석(Anova)을 사용하여 세포주의 패널에 있어서 특정 유전자 변화와 약물 민감성 간에 통계적 상관관계가 존재하는지를 확인하였다. 세포 증식 분석의 돌연변이 및 10logIC50을 통계 프로그램 R(오스트리아 빈 소재의 통계 계산을 위한 R 재단(R Foundation for statistical computing) 제조)을 사용하는 II형 Anova 분석을 이용하여 분석하고 도 2a 내지 도 2g에 나타난 것과 같은 볼케이노 플롯으로 나타내었다. p-값(볼케이노 플롯에서 y-축)은 IC50 이동을 갖는 특정 유전자 내의 돌연변이의 유전자 관련성에 대한 신뢰 수준을 나타낸다. IC50이 이동하게 되는 일반적인 요인은 x-축 상에 나타나 있다. 원의 면적은 세포 패널 내의 돌연변이의 수에 비례한다(각 돌연변이는 2회 이상 존재함). 유의성을 계산하기 위해, p-값들은 벤자미니-호흐버그(Benjamini-Hochberg) 다중 시험 보정을 거쳤다(Benjamini, Y., and Hochberg, Y., J. Royal. Statistic. Soc. B 57:289; 1995). < 20%의 오류 발견율을 갖는 유전자 관련성을 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
민감성의 차이에 대한 통계 분석
CTNNB1이 돌연변이된 세포와 CTNNB1 적격인 세포 간 민감성의 차이를 정량하기 위해, TTK 억제제의 억제 효능을 pIC50(-10logIC50)로 나타내었다. 양측 스튜던트 t-검정을 수행하여 CTNNB1이 돌연변이된 세포와 CTNNB1 적격인 세포 간 민감성의 차이(ΔpIC50)가 통계학적으로 유의성이 있는지(즉, p < 0.05)의 여부를 알아보았다.
동질유전자 세포주에서 민감성의 비교
돌연변이된 CTNNB1이 TTK 억제제에 대한 민감성을 증가시키는데 충분하였는지의 여부를 알아보기 위해, 한쌍의 동질유전자 세포주를 사용하여 증식 분석을 수행하였다. 부모 HCT116 세포는 한 카피의 CTNNB1 유전자의 복제물 내에 3개의 염기쌍의 결실을 보유하고 있어, β-카테닌의 45번 위치(S45del)에서 조절성 세린 잔기의 결실을 초래하게 된다(표 2). 나아가, 부모 HCT116 세포는 CTNNB1 유전자 내의 돌연변이에 대하여 이형접합성인데, 즉 CTNNB1 에 대한 부모 HCT116의 유전자형이 S45del/+이다. 돌연변이된 CTNNB1 유전자 카피(+/-)를 결여한 HCT116 유래의 동질유전자 세포주는 호라이즌 디스커버리(Horizon Discovery, 영국 케임브리지 소재)에서 구매하였다(Chan, T.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8265; 2002). HCT116 부모 및 동질유전자 유도체는 공급자에 의해 권고된 바와 동일한 배지 중에서 배양하였다. 증식 분석은 암세포주에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다(Uitdehaag J.C.M., et al.). 용량 반응 곡선을 플롯팅하고, XLfit™5을 사용하여 IC50, pIC50 및 최대 백분율 효과(효능)를 계산하였다. 부모 및 동질유전자 유도체의 민감성에서의 차이는 pIC50에서의 차이(ΔpIC50)와 효능에서의 차이(Δ효능)로 나타내었다.
TTK 억제제( 실시예 1 내지 31)
하기의 실시예는 본 발명의 예시적인 실시양태이고, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다. 시약은 시판되거나 문헌의 절차에 따라서 제조된다.
방법 LCMS(A)
방법 LCMS(B)
방법 LCMS(C)
Figure 112017111748925-pct00015
Figure 112017111748925-pct00016
분취용 HPLC 방법
Figure 112017111748925-pct00017
하기의 약어는 화학 용어와 관련하여 본 출원 전반에 걸쳐 사용된다:
TFA 트리플루오르아세트산
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트
DMF N,N-디메틸포름아미드
THF 테트라하이드로푸란
MeOH 메탄올
EtOAc 에틸 아세테이트
DCM 디클로로메탄
Na2SO4 황산나트륨
TMS-Cl 클로로트리메틸실란
DiPEA N,N-디이소프로필에틸아민
EtOH 에탄올
10% Pd/C 목탄 상 10% 팔라듐
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
LCMS 질량 분광 검출법을 이용한 액체 크로마토그래피
NaOH 수산화나트륨
KOH 수산화칼륨
HCl 염화수소
NaHCO3 중탄산나트륨
4-DMAP 4-디메틸아미노 피리딘
Boc 부틸옥시카보닐
Cbz 벤질옥시카보닐
HNO3 질산
LiHMDS 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드
DDQ 2,3-디클로로-5,6-디시아노-p-벤조퀴논
DEAD 디에틸 아조디카복실레이트
o/n 오버나이트
실시예에서 최종 생성물의 명칭은 Accelrys Draw(4.1 버전)를 사용하여 생성한다.
실시예 1(WITJ0018D)
N 6-사이클로헥실- N 2-(2-메틸-4-모르폴리노-페닐)-9 H -퓨린-2,6-디아민
상기 화합물은 WO2010/111406 A2 및 문헌[Bioorg. Med. Chem. Letters 22 (2012) 4377]에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(338 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (C) Rt : 10.995 분; m/z 408.3 (M+H)+ .
실시예 2(JGS0282C)
N -사이클로프로필-4-[8-(이소부틸아미노)이미다조[1,2- a ]피라진-3-일]벤즈아미드
상기 화합물은 WO2012/080229 A1 및 문헌[Cell Death and Differentiation 20 (2013), 1532]에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(47 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (B) Rt : 8.088 분; m/z 350.2 (M+H)+.
실시예 3(BTHO238B)
N -(2,6-디에틸페닐)-1-메틸-8-[4-[(1-메틸-4-피페리딜)카바모일]-2-(트리플루오로메톡시)아닐리노]-4,5-디하이드로피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드
상기 화합물은 WO2009/156315 A1 및 문헌[Cancer Res. 70 (2010), 10255]에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(191 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (A) Rt : 5.810 분; m/z 677.6 (M+H)+.
실시예 4(WITJ113B)
N -(2,6-디에틸페닐)-8-(2-메톡시-4-피페라진-1-일-아닐리노)-1-메틸-4,5-디하이드로피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드
상기 화합물은 WO2009/156315 A1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(7.3 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (C) Rt : 12.954 분; m/z 567.3 (M+H)+.
실시예 5(JGS0716D)
N -사이클로프로필-4-[6-(2,3-디플루오로-4-메톡시-페녹시)-8-(테트라하이드로피란-4-일메틸아미노)이미다조[1,2- b ]피리다진-3-일]-2-메틸-벤즈아미드
상기 화합물은 WO 2014/131739 A1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(90 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (B) Rt : 13.496 분; m/z 564.5 (M+H)+.
실시예 6(JGS0728A)
N -사이클로프로필-4-[6-(3-플루오로-4-메톡시-페녹시)-8-(옥세탄-3-일메틸아미노)이미다조[1,2- b ]피리다진-3-일]-2-메틸-벤즈아미드
상기 화합물은 WO 2014/131739 A1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물(45 mg)을 수득하였다. 데이터: LCMS (B) Rt : 11.640 분; m/z 518.4 (M+H)+.
중간체 1
에틸 2-클로로-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트
(a) 5- 브로모 -2- 클로로 -피리미딘-4-아민(WITJ0221)
THF(445mL) 중 5-브로모-2,4-디클로로-피리미딘(150g; 658mmol)의 용액에 수산화암모늄(물 중 25%, 250mL)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 이후 혼합물을 진공에서 농축시켜 소부피로 만들고, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 물과 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 137.3g(정량적 수율)의 5-브로모-2-클로로-피리미딘-4-아민을 수득하였다.
(b) 5- 브로모 -2- 메톡시 -피리미딘-4-아민(WITJ0223)
메탄올(1 L) 중 5-브로모-2-클로로-피리미딘-4-아민(137.3g, 658mmol)의 현탁액에 분획으로 나트륨 메톡사이드(83.5g; 1.54mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 환류에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 소부피(~400mL)로 농축하고, 물 중의 염화암모늄의 포화 용액(1.2 L)에 부었다. 이 혼합물을 15분 동안 교반시킨 후, 물 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합된 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 5-브로모-2-메톡시피리미딘-4-아민(133.7g, 99.4%)을 수득하였다.
(c) 에틸(E)-3-(4-아미노-2- 메톡시 -피리미딘-5-일) 프로프 -2-에노에이트(WITJ0256)
팔라듐(II) 아세테이트(1.21g, 5.5mmol) 및 트리페닐포스핀(3.40g, 13.0mmol)을 무수 및 산소-비함유 DMF(53mL)에 용해시키고, 5분 동안 30℃에서 교반하여 오렌지색 현탁액을 수득하였다. 이러한 현탁액에 DMF(270mL) 중 5-브로모-2-메톡시피리미딘-4-아민(44.1g, 216mmol)의 용액 및 트리에틸아민(60.2mL, 432mmol) 및 DMF(50mL) 중 에틸 아크릴레이트(23.5mL, 216mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기하의 100℃에서 o/n 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 증발시켜 소부피로 만들었다. 물(300mL) 및 염수(300mL)를 상기 혼합물에 첨가한 후, 에틸 아세테이트(300mL, 2회)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헵탄 = 2:1 v/v%)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(38.2g, 77%).
(d) 2- 메톡시 -6,8- 디하이드로 -5H- 피리도[2,3-d]피리미딘 -7-온(WITJ0262)
메탄올(250mL) 중 에틸(E)-3-(4-아미노-2-메톡시-피리미딘-5-일)프로프-2-에노에이트(12.52g, 56.1mmol)의 교반된 용액에 메탄올/에탄올=3/1 v/v%(30mL) 중의 목탄 상 10% Pd(1.19 g)의 현탁액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 질소 분위기하에 교반하였다. 이어서, 포름산암모늄(35.3g, 561mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 o/n 환류시켰다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 새로운 분획의 포름산암모늄(20g, 317mmol)를 첨가하고, 교반을 하루 저녁 더 환류에서 계속하였다. 상기 반응 혼합물을 Decalite®로 여과하고, Pd-C/ Decalite® 잔류물을 디클로로메탄/메탄올 = 8/2 v/v%로 세척하고, 여과물을 진공하에 농축시켰다. 상기 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축하여 9.4g(94%)의 2-메톡시-6,8-디하이드로-5H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온을 수득하였다.
(e) 에틸 2- 메톡시 -5,6,8,9- 테트라하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진 -7-카복실레이트(JGS0241)
2-메톡시-6,8-디하이드로-5H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온(4.79g, 26.8mmol)을 기계적 교반기, 온도계 및 환류 응축기가 장착된 3구 플라스크(500mL)에서 THF(200mL) 중에 현탁시켰다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 수산화나트륨(오일 중 60% 분산액, 1.18g, 29.4mmol)를 2개의 배치(batch)로 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. (1-에톡시카보닐사이클로프로필)트리페닐포스포늄 테트라플루오로보레이트(13.6g, 29.4mmol)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 환류까지 가열하고, 환류 온도에서 3일 동안 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 염수/물/EtOAc(450mL)의 1/1/1 혼합물에 부었다. 물 층을 에틸 아세테이트(2x)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물과 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축하여 18.05g의 오렌지색 오일을 수득하였다. 미정제 생성물을 다음 단계에서 정제 없이 직접 사용하였다.
(f) 에틸 2- 메톡시 -5,6- 디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진 -7-카복실레이트(JGS244)
디클로로메탄(100mL) 중 에틸 2-메톡시-5,6,8,9-테트라하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(18.05g, 26.2mmol)의 교반된 용액에 아세트산(3.15g, 3mL) 및 납(IV)아세테이트(13.9g, 31.4mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, PE 필터에서 여과하여 Pb-염을 제거하고, Pb-잔류물을 2 x 30mL DCM으로 세척하였다. 여과물을 진공하에 농축시키고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트(300mL)에 용해시켰다. 중탄산나트륨(5%)의 용액을 pH 약 8.5까지 첨가하였다. 유기층과 물 층을 모두 Decalite®로 여과하여 임의의 잔류 염을 제거하였다. 이어서, 물 층을 EtOAc(2 x 50mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 5% 중탄산나트륨-용액(100mL), 물(100mL), 염수(50mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공하에 농축하였다. 미정제 생성물을 실리카 상의 컬럼 크로마토그래피(헵탄:에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/1 v/v%)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(4.74g, 2단계에 걸쳐서 66%).
(g) 에틸 2- 하이드록시 -5,6- 디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진 -7-카복실레이트(JGS0245)
요오드화나트륨(7.83g, 52.2mmol)를 아세토니트릴(150mL) 중 에틸 2-메톡시-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(4.74g, 17.3mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 아세토니트릴(30mL)에 용해시킨 염화트리메틸실릴(5.64g, 6.59mL)을 상기 반응 혼합물에 적가하고, 상기 혼합물을 실온에서 o/n 교반하였다. NaI(1 당량)를 첨가하고, 아세토니트릴(6mL) 중 추가의 TMS-Cl(0.94g, 1.1mmol)을 적가하고, 상기 반응물을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 200mL DCM/MeOH(4/1)에 현탁시키고, 티오황산나트륨(200mL)의 포화된 용액 및 물(200mL)의 혼합물로 추출하였다. 물 층을 3x150mL DCM/MeOH(4/1)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압하에 제거하여 황색 고체를 수득하였다. 잔류물을 40℃에서 진공하에 18시간 동안 건조시켜 3.89g의 에틸 2-하이드록시-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(86%)를 수득하였다.
(h) 에틸 2-클로로-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(중간체 1)(JGS0248)
N,N-디메틸아닐린(182mg, 191 μL, 1.50mmol)을 아세토니트릴(100mL) 중 에틸 2-하이드록시-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(3.89g, 15.0mmol)의 용액에 첨가하였다. 아세토니트릴(15mL) 중 옥시염화인(V)(11.5g, 7.00mL, 75.0mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 적가하였다. 황색 현탁액을 4시간 동안 65℃로 가열하였는데, 그 동안 현탁액이 맑은 용액으로 변하였다. 냉각 후, 상기 혼합물을 25% 수성 암모니아(200mL, 86.7 당량) 및 빙수(250mL)의 교반된 혼합물 중에 서서히 부어 온도를 10℃ 아래로 15분 내지 20분 내에 유지하였다. 추가로 15분 동안 더 교반한 후, 고체를 여과하였다. 상기 고체를 200mL EtOAc에 용해시키고, 염수(20mL)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 진공하에 농축하여 미백색 고체를 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카 상의 컬럼 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/1 v/v%)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(3.05g, 73%).
중간체 A
벤질 4-(4-아미노-3-메틸-페닐)피페라진-1-카복실레이트
(a) 벤질 4-(3- 메틸 -4-니트로- 페닐 )피페라진-1-카복실레이트( WITJ404 )
벤질 피페라진-1-카복실레이트(1.05 mL, 5.25 mmol) 및 탄산칼륨(1.38 g, 10 mmol)을 DMF(10 mL) 중 4-플루오로-2-메틸-1-니트로-벤젠(776 mg, 5 mmol)의 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 교반하였다. 물을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출을 수행하였다. 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 칼럼 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 6/4 v/v%)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(1.75 g, 98%).
(b) 벤질 4-(4-아미노-3- 메틸 - 페닐 )피페라진-1-카복실레이트(중간체 A)(WITJ406)
벤질 4-(3-메틸-4-니트로-페닐)피페라진-1-카복실레이트(355 mg, 1 mmol)를 THF(5 mL) 중에 용해시키고 아세트산(1.1 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각시키고 아연(1.31 g, 20 mmol)을 소분획으로 첨가하여 20℃ 아래로 온도를 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 o/n 교반하였다. TLC 분석이 출발 물질의 완전한 전환을 나타낸 후, 상기 혼합물을 Decalite®로 여과시킨 후, Zn-Decalite® 잔류물을 EtOAc(20 mL)로 세척하였다. 혼합된 여과물을 1N NaOH-용액(25 mL)으로 세척한 다음, 물(25 mL) 및 염수(25 mL)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고 진공에서 농축시켜 벤질 4-(4-아미노-3-메틸-페닐)피페라진-1-카복실레이트(327 mg, 정량)를 수득하였다.
중간체 2
벤질 4-[4-[(7-클로로카보닐-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-2-일)아미노]-3-메틸-페닐]피페라진-1-카복실레이트
(a) 에틸 2-[4-(4- 벤질옥시카보닐피페라진 -1-일)-2- 메틸 - 아닐리노 ]-5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복실레이트(WITJ407)
n-부탄올(8 mL) 중 에틸 2-클로로-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(중간체 1, 292 mg, 1.05 mmol)의 현탁액에 벤질 4-(4-아미노-3-메틸-페닐)피페라진-1-카복실레이트(중간체 A, 327 mg, 1.0 mmol)와 트리플루오로아세트산(153 μL 2.0 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 120℃에서 전자파 하에 12시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 유기층을 중탄산나트륨의 포화 용액으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고 진공에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카 칼럼 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 = 4/6 내지 0/1 v/v%)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 수거하고 증발시켜 에틸 2-[4-(4-벤질옥시카보닐피페라진-1-일)-2-메틸-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(423 mg, 75% 수율)를 수득하였다.
(b) 벤질 4-[4-[(7- 클로로카보닐 -5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -2-일)아미노]-3- 메틸 - 페닐 ]피페라진-1- 카복실레이트(중간체 2)(WITJ408/WITJ414)
15 mL 무수 에탄올 중 에틸 2-[4-(4-벤질옥시카보닐피페라진-1-일)-2-메틸-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(423 mg, 0.75 mmol)의 용액에 2M NaOH-용액(935 μL(2.5 당량), 1.87 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 65℃에서 o/n 가열하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조하게 하고 고진공 상태 하에 건조시켰다. 생성된 잔류물을 물에 용해시키고, 실온에서 o/n 교반하고 동결건조시켜 미정제 나트륨 2-[4-(4-벤질옥시카보닐피페라진-1-일)-2-메틸-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트를 수득하였다.
염화티오닐(561 μL, 7. mmol)을 디클로로메탄(8 mL) 중의 미정제 나트륨 2-[4-(4-벤질옥시카보닐피페라진-1-일)-2-메틸-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(217 mg, 0.39 mmol 이론치)의 차가운(0℃) 현탁액에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 o/n 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 잔류물을 톨루엔(2 x 10 mL)으로 동시증발시켜 황색/갈색 분말로서 벤질 4-[4-[(7-클로로카보닐-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-2-일)아미노]-3-메틸-페닐]피페라진-1-카복실레이트(261 mg, 정량. 미정제 수율)를 수득하였다.
실시예 7(WITJ0416/WITJ429A)
N -(2,6-디메틸페닐)-2-(2-메틸-4-피페라진-1-일-아닐리노)-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
아세토니트릴(3 mL) 중의 벤질 4-[4-[(7-클로로카보닐-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-2-일)아미노]-3-메틸-페닐]피페라진-1-카복실레이트(중간체 2, 45 mg, 0.081 mmol 이론치)의 현탁액에 2,6-디메틸아닐린(15 μL, 0.12 mmol) 및 촉매량의 4-DMAP를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용매의 증발 후, Cbz 기를 TFA/티오아니솔을 사용하여 탈보호시키고 미정제 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 수거하고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄과 5% NaHCO3-용액 사이에 분배시켰다. 유기상을 PE-필터로 분리하고 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다(20 mg, 64%). 데이터: LCMS (B) Rt : 9.706 분; m/z 508.3 (M+H)+.
실시예 8(JGS439C)
N -(2,6-디메틸페닐)-2-[2-메톡시-4-(테트라하이드로피란-4-일카바모일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
(a) 2-(4- 브로모 -2- 메톡시 - 아닐리노 )- N -(2,6- 디메틸페닐 )-5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복사미드(JGS453)
상기 화합물은 출발 물질로서 시판되는 4-브로모-2-메톡시아닐린을 사용하고, 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 상기 산염화물을 실시예 7에 기술된 절차에 따라 2,6-디메틸아닐린과 반응시켜 표제 화합물을 수득하였다(1.35 g, 84%).
(b) 2-(4- 시아노 -2- 메톡시 - 아닐리노 )- N -(2,6- 디메틸페닐 )-5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복사미드(JGS455)
DMF(4 mL) 중의 2-(4-브로모-2-메톡시-아닐리노)-N-(2,6-디메틸페닐)-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드(1.35 g, 2.6 mmol) 및 시안화아연(321 mg, 2.73 mmol)의 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(300 mg, 0.26 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 170℃에서 30분 동안 전자파 하에 가열하였다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 혼합물을 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물과 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켜 미정제 표제 화합물을 수득하였다(1.05 g, 87%).
(c) 4-[[7-[(2,6- 디메틸페닐 ) 카바모일 ]-5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -2-일]아미노]-3- 메톡시 -벤조산(JGS0457)
MeOH(25 mL) 중 2-(4-시아노-2-메톡시-아닐리노)-N-(2,6-디메틸페닐)-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드(750 mg, 1.61 mmol)의 교반된 현탁액에 물(12.5 mL) 중의 수산화칼륨(453 mg, 8.07 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 120℃에서 2시간 동안 전자파 하에 가열하였다. 메탄올 분획의 증발 후, 생성된 물 층을 pH가 2가 될 때까지 2N HCl 용액을 첨가하여 산성화시켰다. 디클로로메탄으로 추출 후, 혼합된 유기층을 PE-필터로 여과하여 330 mg의 표제 화합물을 수득하였다(수율: 42%).
(d) N -(2,6- 디메틸페닐 )-2-[2- 메톡시 -4-( 테트라하이드로피란 -4- 일카바모일 )아닐리노]-5,6- 디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복사미드(JGS439C)
4-[[7-[(2,6-디메틸페닐)카바모일]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-2-일]아미노]-3-메톡시-벤조산(30 mg, 0.062 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(3 ml) 중에 용해시켰다. 이후, HATU(25.9 mg, 0.068 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(43.1 μL, 0.25 mmol)을 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 4-아미노테트라하이드로피란 하이드로클로라이드(12.8 mg, 0.093 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 o/n 교반하였다. 상기 혼합물을 혼합물인 에틸 아세테이트/물/염수(1/1/1)에 붓고 15분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 진공에서 농축시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(5 mg, 18%). 데이터: LCMS (B) Rt : 14.407 분; m/z 567.3 (M+H)+.
중간체 B(NV0068/NV0076)
2-메톡시-4-(1,3,5-트리메틸피라졸-4-일)아닐린
(a) tert -부틸 N -[2- 메톡시 -4-(1,3,5- 트리메틸피라졸 -4-일) 페닐 ] 카바메이 트(NV0068)
디옥산(4 mL) 중의 tert-부틸 N-(4-브로모-2-메톡시-페닐)카바메이트(150 mg, 0.5 mmol), 1,3,5-트리메틸-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)피라졸(118 mg, 0.5 mmol), 테트라키스(트리-페닐포스핀)팔라듐(0)(58 mg, 0.05 mmol) 및 탄산칼륨(207 mg, 1.5 mmol)의 혼합물을 밀봉된 튜브 중에서 100℃에서 20분 동안 전자파 하에 가열하였다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 혼합물을 농축시키고 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물과 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 = 100/0 내지 25/75 v/v%)로 정제하여 tert-부틸 N-[2-메톡시-4-(1,3,5-트리메틸피라졸-4-일)페닐]카바메이트(126.8 mg, 77 %)를 수득하였다.
(b) 2- 메톡시 -4-(1,3,5- 트리메틸피라졸 -4-일)아닐린(중간체 B)(NV0076)
tert-부틸 N-[2-메톡시-4-(1,3,5-트리메틸피라졸-4-일)페닐]카바메이트(127 mg, 0.38 mmol)를 DCM(2 mL) 중에 용해시켰다. TFA(3 mL)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 진공에서 농축시켜 갈색 오일(313 mg)을 수득하고 이를 추가의 정제없이 사용하였다.
중간체 C(JDM0438/JDM0435)
1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-피라졸-4-아민
(a) 1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸
THF(10 mL) 중의 3,5-디메틸-4-니트로-1H-피라졸(250 mg, 1.77 mmol), 트리에틸렌 글리콜 모노메틸에테르(482 μL, 3.01 mmol) 및 트리페닐포스핀(789 mg, 3.01 mmol)의 차가운(0℃) 용액에 톨루엔 중의 40% DEAD(1.31 mL, 3.01 mmol)의 용액을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 3시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하고 10% NaCl 용액으로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하여 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH = 99/1 내지 95/5 v/v%)로 정제하여 1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸(1.7 g, 미정제)를 수득하고, 이를 다음 단계에서 정제없이 사용하였다.
(b) 1-[2-[2-(2- 메톡시에톡시 ) 에톡시 ]에틸]-3,5-디메틸- 피라졸 -4-아민(중간체 C)
1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸(1.5 g, 1.77 mmol 이론치)을 THF(15 mL) 중에 용해시키고 아세트산(1.6 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각시키고 아연(2.3 g, 35.4 mmol)을 소분획으로 첨가하여 온도를 20℃ 아래로 유지하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 o/n 교반하였다. TLC 분석이 출발 물질의 완전한 전환을 나타낸 후, 상기 혼합물을 Decalite®로 여과시킨 후, Zn-Decalite® 잔류물을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 혼합된 여과물을 1N NaOH-용액으로 세척한 다음, 물과 염수로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4), 여과하고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 메탄올 중에 용해시킨 후, SCX-2 컬럼으로 여과하였다. 컬럼을 메탄올로 헹궈낸 후, 목적하는 생성물을 0.7 N 암모니아/메탄올 용액으로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다(340.1 mg, 74.7%).
실시예 9(JDM0641A)
N -[1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-(1,3,5-트리메틸피라졸-4-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 B를 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8b에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 C와 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(19.5 mg, 42.6%). 데이터: LCMS (B) Rt : 10.946 분; m/z 684.7 (M+H)+.
중간체 D(JGS88/92)
2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린
상기 화합물은 N-메틸피페라진 및 2-메톡시-4-플루오로니트로벤젠으로부터 출발하여 중간체 A에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 표제 화합물을 수득하였다(1.38 g, 94%).
실시예 10(JDM0443A)
N -[1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 D를 사용하고 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 상기 산염화물을 실시예 8d에 기술된 절차에 따라 중간체 C와 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(11.6 mg, 28.6%). 데이터: LCMS (B) Rt : 6.985 분; m/z 674.3 (M+H)+.
실시예 11(JGS79C)
N -(2,6-디에틸페닐)-2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 D를 사용하고 중간체 2a에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 에스테르로부터 제조하였다. LiHDMS(THF/에틸벤젠 중 1M, 412 μL, 0.412 mmol)를 THF(1 mL) 중의 2,6-디에틸아닐린(50.8 μL, 0.31 mmol)의 차가운(0℃) 용액에 첨가하였다. 0℃에서 15분간의 교반 후, THF(2 mL) 중의 에틸 2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(48 mg, 0.103 mmol)를 상기 반응 혼합물에 적가하고 교반을 0℃에서 90분간 지속하였다. 추가의 LiHMDS(100 μL)를 실온에서 적가하고 교반을 실온에서 2시간 동안 지속하였다. 상기 반응 혼합물을 20 mL의 염화암모늄의 포화 용액으로 냉각시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합된 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(13.5 mg, 23.2%). 데이터: LCMS (C) Rt : 12.686 분; m/z 566.4 (M+H)+.
중간체 E(WITJ437/WITJ438/WITJ440)
2-(디플루오로메톡시)-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린
DMF(6 ml) 중의 5-플루오로-2-니트로-페놀(500 mg, 3.18 mmol)의 용액에 2-클로로-2,2-디플루오로-아세트산 나트륨(970 mg, 6.36 mmol) 및 탄산이나트륨(405 mg, 3.82 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 100℃에서 3.5시간 동안, 이후 실온에서 3일 동안 교반하였다. 투명한 용액이 수득될 때까지 4M HCl 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 혼합된 유기층을 1M NaOH-용액, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 = 10/0 내지 8/2 v/v%)로 정제하여 2-(디플루오로메톡시)-4-플루오로-1-니트로-벤젠(493 mg, 75%)을 수득하였다.
N-메틸피페라진 및 2-(디플루오로메톡시)-4-플루오로-1-니트로-벤젠으로부터 출발하여 중간체 A에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하여 180 mg(80%)을 수득하였다.
중간체 F(JDM300/WITJ410/WITJ411/WITJ413)
3,5-디에틸-1 H -피라졸-4-아민
(a) 3,5-디에틸-1 H -피라졸
물(10 mL) 중의 3,5-헵탄디온(2 g, 15.6 mmol) 및 히드라진 수화물(0.77 g, 15.8 mmol)의 용액에 아세트산(1 방울)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 환류로 1시간 동안 가열하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 냉각시키고 감압 하에 농축시켜 1.8 g의 표제 화합물을 제공하였다. 상기 화합물은 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
(b) 3,5-디에틸-4-니트로-1 H -피라졸
격한 교반 하에서, 3,5-디에틸-1H-피라졸(1.8 g, 14.5 mmol) 및 농축 황산(1.5 ml)의 차가운(0℃) 혼합물에 발연성 HNO3(4.35 ml)을 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 이후, 상기 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 중탄산나트륨의 얼음처럼 차가운 포화 용액을 조심스럽게 첨가하고 15분간 교반하였다. 이후, 상기 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하고 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공에서 증발시켜 2.52 g의 3,5-디에틸-4-니트로-1H-피라졸을 수득하였다.
(c) 3,5- 디에틸 -1 H - 피라졸 -4-아민(중간체 F)
표제 화합물은 3,5-디에틸-4-니트로-1H-피라졸로부터 출발하여 중간체 C에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 3,5-디에틸-1H-피라졸-4-아민(174 mg, 71%)을 수득하였다.
실시예 12(WITJ453B)
N -(3,5-디에틸-1H-피라졸-4-일)-2-[2-(디플루오로메톡시)-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 E를 사용하고 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 카복실산으로부터 제조하였다. 이후, 실시예 8d에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 카복실산을 중간체 F와 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(9.6 mg, 23%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.864 분; m/z 592.3 (M+H)+.
중간체 G(JDM617/JDM622/JDM630)
3,5-디에틸-1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]피라졸-4-아민
표제 화합물은 3,5-디에틸-4-니트로-1H-피라졸(중간체 Fb) 및 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르로부터 출발하여 중간체 C에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 660 mg의 3,5-디에틸-1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]피라졸-4-아민(41.7%)을 수득하였다.
중간체 M(WITJ461/WITJ458)
벤질 4-(4-아미노-3-메톡시-페닐)피페라진-1-카복실레이트
상기 화합물은 벤질 피페라진-1-카복실레이트 및 2-메톡시-4-플루오로니트로벤젠으로부터 출발하여 중간체 A에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 표제 화합물을 수득하였다(1.2 g, 95%).
실시예 13(JDM0684A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-[4-(2-메톡시아세틸)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 실시예 8d에 기술된 바와 같은 표준 HATU-커플링 절차를 이용하여 그의 상응하는 아민(중간체 1과 중간체 M으로부터 출발하여 실시예 7에 대해 기술된 바와 같이 제조됨) 및 메톡시아세트산으로부터 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(17.8 mg, 57.1%). 데이터: LCMS (B) Rt : 9.908 분; m/z 760.8 (M+H)+.
중간체 H(JDM221/JDM0222/JDM393)
1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-피라졸-4-아민
(a) 1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸
DMF(50 mL) 중의 3,5-디메틸-4-니트로-1H-피라졸(2.5 g, 17.7 mmol) 및 탄산세슘(6.06 g, 18.6 mmol)의 용액에 2-브로모에틸 메틸 에테르(2.59 g, 1.75 mL, 18.6 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃에서 3.5시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 물에 부어 에틸 아세테이트(3x50 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 염수로 세척하고(50 mL), 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헵탄 = 1/4 v/v%)로 정제하여 백색의 결정 고체로서 1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸(2.66 g, 75.4%)을 수득하였다.
(b) 1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-피라졸-4-아민
1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸(245 mg, 1.22 mmol)을 메탄올(25 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 용액을 H-큐브(Cube) 연속 유동 수소화 반응기(10% Pd/C, 30℃, 8-10 bar, 1 mL/분, 완전 H2 양식)를 사용하여 수소화하였다. 생성된 용액을 진공에서 농축시켜 담갈색 오일로서 208 mg(정량 수율)의 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 I(JDM464/JDM450)
3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-아민
표제 화합물은 3,5-디에틸-4-니트로-1H-피라졸(중간체 Fb) 및 1-브로모-2-(2-메톡시에톡시)-에탄으로부터 출발하여 중간체 H에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 290 mg의 3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-아민(72.2%)을 수득하였다.
실시예 14(JDM0466A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 D를 사용하고 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 상기 산염화물을 실시예 7에 기술된 절차에 따라 중간체 I과 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(22 mg, 54.4%). 데이터: LCMS (B) Rt : 7.845 분; m/z 658.3 (M+H)+.
중간체 J(WITJ277/WITJ84)
tert -부틸 4-(4-아미노-3-메톡시-페닐)피페라진-1-카복실레이트
상기 화합물은 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 및 2-메톡시-4-플루오로니트로벤젠으로부터 출발하여 중간체 A에 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 표제 화합물을 수득하였다(245 mg, 91%).
실시예 15(WITJ349B)
N -[1-(2-메톡시에틸)-3,5-디메틸-피라졸-4-일]-2-(2-메톡시-4-피페라진-1-일-아닐리노)-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
에틸 2-클로로-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(중간체 1, 296 mg, 1.07 mmol), tert-부틸 4-(4-아미노-3-메톡시-페닐)피페라진-1-카복실레이트(중간체 J, 328 mg, 1.07 mmol) 및 탄산세슘(1.39 g, 4.27 mmol)을 디옥산(25 mL) 중에 현탁시켰다. 상기 혼합물을 통해 30℃에서 5분 동안 질소로 거품을 일게한 후 9,9-비스-디메틸-4,5-비스(디페닐포스피노)크산텐(62 mg, 0.11 mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(49 mg, 53 μMol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 기체의 흐름 하에 80℃에서 20시간 동안 교반하였다.
에틸 아세테이트/물/염수(1/1/1 v/v%, 50 mL)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 15분 동안 지속하였다. Decalite®로 여과한 후, 물 층을 분리하고 에틸 아세테이트(2x20 mL)로 추출하였다. 이후, 혼합된 유기층을 물(40 mL), 염수(20 mL)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카(헵탄/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1 v/v%) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 에틸 2-[4-(4-tert-부톡시카보닐피페라진-1-일)-2-메톡시-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(115 mg, 20%)를 수득하였다.
다음으로, 이렇게 수득된 에틸 에스테르를 중간체 2b에 대해 기술된 조건을 사용하여 가수분해하였다. 이후, 상응하는 카복실산의 나트륨염을 실시예 8d에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 H와 반응시켰다. Boc 기를 탈보호시킨 후, 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(5.2 mg, 28%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.140 분; m/z 572.3 (M+H)+.
중간체 K(JDM251/JDM302)
2-메톡시-4-[(1-메틸-4-피페리딜)옥시]아닐린
(a) 4-(3-메톡시-4-니트로-페녹시)-1-메틸-피페리딘
톨루엔(10 mL) 중의 4-플루오로-2-메톡시-1-니트로-벤젠(750 mg, 4.38 mmol)의 용액에 10 mL의 25% KOH-용액, 4-하이드록시-N-메틸피페리딘(1009 mg, 8.76 mmol) 및 테트라-n-부틸 암모늄브롬화물(282 mg, 0.876 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 o/n 가열하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 물 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔(디클로로메탄/메탄올 = 99/1 내지 9/1 v/v%) 상에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(650 mg, 55.7%).
(b) 2- 메톡시 -4-[(1- 메틸 -4- 피페리딜 ) 옥시 ]아닐린(중간체 K)
10% Pd/C(20 mg)를 에탄올 중의 현탁액으로서 에탄올(5 mL) 중의 4-(3-메톡시-4-니트로-페녹시)-1-메틸-피페리딘(200 mg, 0.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. 포름산암모늄(473 mg, 7.5 mmol)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하의 환류에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 Decalite®로 여과하였다. 여과물을 진공에서 농축시키고, 이후 디클로로메탄을 첨가하고 유기상을 NaHCO3의 5% 용액으로 세척하였다. 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켜 2-메톡시-4-[(1-메틸-4-피페리딜)옥시]아닐린(169.5 mg, 95.6%)을 수득하였다.
중간체 L(JDM221/JDM0222)
3,5-디메틸-1 H -피라졸-4-아민
표제 화합물은 3,5-디메틸-4-니트로-1H-피라졸로부터 출발하여 중간체 Hb에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 110 mg의 3,5-디메틸-1H-피라졸-4-아민(정량)을 수득하였다.
실시예 16(JDM323A)
N -(3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)-2-[2-메톡시-4-[(1-메틸-4-피페리딜)옥시]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 K를 사용하고 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 실시예 7에 기술된 절차에 따라 중간체 L과 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(14.1 mg, 37%). 데이터: LCMS (B) Rt : 7.902 분; m/z 543.2 (M+H)+.
실시예 17(WITJ0529B)
N -(2,6-디메틸페닐)-2-[2-메톡시-4-[4-(2-메톡시아세틸)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 실시예 8d에 기술된 바와 같은 표준 HATU-커플링 절차를 이용하여 그의 상응하는 아민(중간체 1과 중간체 M으로부터 출발하여 실시예 7에 대해 기술된 바와 같이 제조됨) 및 메톡시아세트산으로부터 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(10 mg, 49%). 데이터: LCMS (B) Rt : 12.973 분; m/z 596.3 (M+H)+.
중간체 3
에틸 2-클로로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복실레이트
(a) 에틸 2- 메톡시피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복실레이트(JGS362)
DDQ(1.53 g, 6.76 mmol)를 DCM(50 mL) 중의 에틸 2-메톡시-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(1.54 g, 5.63 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 3일간 교반하였다. 추가량의 200 mg의 DDQ를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 7일간 더 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 진공에서 농축시켜 소부피로 만들었다. 미정제 생성물을 실리카(헵탄/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 1/1 v/v%) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(750 mg, 50%).
(b) 에틸 2- 하이드록시피리미도[4,5-e]인돌리진 -7-카복실레이트(JGS377)
요오드화나트륨(1.24 g, 8.29 mmol)을 아세토니트릴(19 mL) 중의 에틸 2-메톡시-피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(750 mg, 2.76 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 아세토니트릴(3 mL) 중의 염화트리메틸실릴(896 mg, 1.05 mL)의 용액을 상기 반응 혼합물에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 o/n 교반하였다. 추가의 요오드화나트륨(3.33 g) 및 아세토니트릴(6 mL) 중의 TMS-Cl(2.4 g, 2.8 mL)를 적가하고 상기 반응물을 실온에서 3일간 교반하였다. 상기 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 200 mL DCM/MeOH(4/1) 중에 현탁시키고 티오황산나트륨(50 mL)의 포화 용액과 물(100 mL)의 혼합물로 추출하였다. 물 층을 DCM/MeOH(4/1, 2 x 150 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 용매를 감압 하에 제거하여 고체를 수득하였다. 상기 고체를 끓는 에틸 아세테이트(50 mL) 중에서 잘게 연마하였다. 상기 고체를 냉각시킨 후, 실온에서 1시간 동안 교반하고 여과하였다. 잔류물을 진공 하의 40℃에서 건조시켜 1.0 g의 미정제 에틸 2-하이드록시-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(정량 수율)를 수득하였다.
(c) 에틸 2- 클로로피리미도[4,5- e ]인돌리진 -7-카복실레이트(중간체 3)(JGS380)
N,N-디메틸아닐린(47 mg, 50 μL, 1.50 mmol)을 아세토니트릴(30 mL) 중의 에틸 2-하이드록시피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복실레이트(1.0 g, 3.89 mmol)의 용액에 첨가하였다. 아세토니트릴(4 mL) 중의 옥시염화인(V)(2.99 g, 1.81 mL, 19.5 mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 적가하였다. 갈색/적색 현탁액을 65℃로 4시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 상기 혼합물을 25% 암모니아 수용액(50 mL)과 얼음물(100 mL)의 교반된 혼합물 중에 천천히 부어 온도를 10℃ 아래로 유지하였다. 15분간 더 교반한 후, 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 이후, 혼합된 유기층을 물(50 mL), 0.2 N HCl(50 mL), 염수(25 mL)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하여 진공에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 실리카(헵탄/에틸 아세테이트 =1/0 내지 1/1 v/v%) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 200 mg의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 18(WITJ490B)
N -(2,6-디메틸페닐)-2-[2-메톡시-4-[(1-메틸-4-피페리딜)옥시]아닐리노]피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 3 및 중간체 K로부터 출발하고, 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 상기 산염화물을 실시예 7에 기술된 절차에 따라 2,6-디메틸아닐린과 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(30 mg, 45%). 데이터: LCMS (B) Rt : 12.491 분; m/z 551.3 (M+H)+.
중간체 N(JDM618/JDM626/JDM634)
1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디에틸-피라졸-4-아민
(a) 2-(2-에톡시에톡시)에틸 4-메틸벤젠설포네이트
0℃에서 냉각된 15 mL의 THF 중의 디(에틸렌 글리콜)에틸 에테르(4.92 ml, 36.2 mmol)의 용액에 15 mL의 물 중에 용해된 NaOH(2.46 g, 61.5 mmol)를 첨가하면서 격하게 교반시켰다. 상기 혼합물에 15 mL의 THF 중의 염화토실(8.28 g, 43.4 mmol)의 용액을 0℃에서 10분간에 걸쳐 적가하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 질소 하에 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 혼합물을 50 mL의 디에틸 에테르로 2회 추출하고, 유기층을 1M NaOH 수용액과 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 무색 액체로서 2-(2-에톡시에톡시)에틸 4-메틸벤젠설포네이트(10 g, 95.8%)를 수득하였다.
(b) 1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸
DMF(10 mL) 중의 3,5-디메틸-4-니트로-1H-피라졸(1 g, 7.08 mmol) 및 탄산세슘(2.31 g, 7.08 mmol)의 용액에 2-(2-에톡시에톡시)에틸 4-메틸벤젠설포네이트(2.04 g, 7.08 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 물/염수에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다(100 mL). 혼합된 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 감압 하에 농축시켜 1.69 g의 표제 화합물을 수득하였다(92.8%).
(c) 1-[2-(2- 에톡시에톡시 )에틸]-3,5-디메틸- 피라졸 -4-아민(중간체 N)
메탄올(25 mL) 중의 1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디메틸-4-니트로-피라졸(1.69 g, 6.57 mmol)의 용액에 에탄올(1 mL) 중의 목탄 상 10% Pd(200 mg)의 현탁액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이후, 포름산암모늄(4.14 g, 65.7 mmol)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 환류로 15분간 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시키고, Decalite®로 여과하고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 메탄올 중에 용해시킨 후, SCX-2 컬럼으로 여과하였다. 컬럼을 메탄올로 헹궈낸 후, 목적하는 생성물을 0.7 N 암모니아/메탄올 용액으로 용리시켰다. 생성된 용리액을 진공에서 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다(520 mg, 34.8%).
실시예 19(JDM640A)
N -[1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디메틸-피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5- e ]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 D를 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 N과 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(32.3 mg, 53.9%). 데이터: LCMS (B) Rt : 7.432 분; m/z 644.6 (M+H)+.
실시예 20(JDM677A)
N -[1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]-3,5-디메틸-피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-[4-(2-메톡시아세틸)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 C와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 메톡시아세트산을 도입하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(19.0 mg, 63.4%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.815 분; m/z 732.7 (M+H)+.
실시예 21(JDM711A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-[4-(3-메틸아제티딘-3-카보닐)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 I와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 1-(tert-부톡시카보닐)-3-메틸아제티딘-3-카복실산을 도입하였다. Boc 기의 탈보호 후 정제를 수행하고, 분취용 HPLC를 사용하여 표제 화합물을 수득하였다(16.3 mg, 55%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.107 분; m/z 741.8 (M+H)+.
중간체 O(JDM618/JDM625/JDM633)
1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디에틸-피라졸-4-아민
표제 화합물은 3,5-디에틸-4-니트로-1H-피라졸(중간체 Fb) 및 디(에틸렌 글리콜)에틸 에테르로부터 출발하여 중간체 N에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제조하여 550 mg의 1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디에틸-피라졸-4-아민(79.8%)을 수득하였다.
실시예 22(JDM713A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-[4-(3-메틸아제티딘-3-카보닐)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 O와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 Boc-N-에틸-글리신을 도입하였다. Boc 기의 탈보호 후 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(15 mg, 53.1%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.619 분; m/z 743.8 (M+H)+.
실시예 23(JDM697A)
N -[1-[2-(2-에톡시에톡시)에틸]-3,5-디에틸-피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-[4-(2-메톡시아세틸)피페라진-1-일]아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 O와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 메톡시아세트산을 도입하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(17.0 mg, 61.4%). 데이터: LCMS (B) Rt :10.554 분; m/z 730.7 (M+H)+.
실시예 24(JDM636A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]피라졸-4-일]-2-[2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 D를 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 G와 반응시켰다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(22.5 mg, 34.5%). 데이터: LCMS (B) Rt : 7.879 분; m/z 702.7 (M+H)+.
실시예 25(JDM703A)
N -[3,5-디에틸-1-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에틸]피라졸-4-일]-2-[4-[4-[2-(에틸아미노)아세틸]피페라진-1-일]-2-메톡시-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 G와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 Boc-N-에틸-글리신을 도입하였다. Boc 기의 탈보호 후 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(18.4 mg, 59.4%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.194 분; m/z 773.8 (M+H)+.
실시예 26(JDM709A)
2-[4-[4-[(2 R )-아제티딘-2-카보닐]피페라진-1-일]-2-메톡시-아닐리노]-N-[3,5-디에틸-1-[2-(2-메톡시에톡시)에틸]피라졸-4-일]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2b에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산으로부터 제조하였다. 이후, 카복실산을 실시예 8d에 기술된 것과 유사한 방식으로 중간체 I와 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 (R)-N-Boc-아제티딘-2-카복실산을 도입하였다. Boc 기의 탈보호 후 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(16.8 mg, 57.7%). 데이터: LCMS (B) Rt : 8.017 분; m/z 727.9 (M+H)+.
실시예 27(JDM666A)
N -(2,6-디메틸페닐)-2-[4-[4-[2-(에틸아미노)아세틸]피페라진-1-일]-2-메톡시-아닐리노]-5,6-디하이드로피리미도[4,5-e]인돌리진-7-카복사미드
상기 화합물은 출발 물질로서 중간체 M을 사용하고, 중간체 2에 대해 기술된 것과 동일한 반응 순서를 이용하여 그의 상응하는 산염화물로부터 제조하였다. 이후, 산염화물을 실시예 7에 기술된 것과 유사한 방식으로 2,6-디메틸아닐린과 반응시켰다. Cbz 기의 탈보호 후 상응하는 아민을 수득하고, 실시예 8d에 기술된 표준 HATU-커플링 절차를 사용하여 (R)-N-Boc-아제티딘-2-카복실산을 도입하였다. Boc 기의 탈보호 후 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(1 mg, 13.2%). 데이터: LCMS (B) Rt : 9.388 분; m/z 609.6 (M+H)+.
실시예 28(JGS0715B)
N -사이클로프로필-4-[6-(2,3-디플루오로-4-메톡시-페녹시)-8-(3,3,3-트리플루오로프로필아미노)이미다조[1,2-b]피리다진-3-일]-2-메틸-벤즈아미드
상기 화합물은 WO 2014/131739 A1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(30 mg). 데이터: LCMS (B) Rt : 14.958 분; m/z 562.5 (M+H)+.
실시예 29(JDM943D)
(2 R )-2-(4-플루오로페닐)-N-[4-[2-(2-메톡시-4-메틸설포닐-아닐리노)-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-6-일]페닐]프로판아미드
상기 화합물은 WO 2014/009219 A1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 분취용 HPLC를 사용해 정제를 수행하여 표제 화합물을 수득하였다(107.1 mg). 데이터: LCMS (B) Rt : 13.703 분; m/z 558.0 (M-H)-.
실시예 30(JDM969A)
1-[4-[[4-(2- 이소프로필설포닐아닐리노 )-1H- 피롤로[2,3-b]피리딘 -6-일]아미노]-3- 메톡시 - 페닐 ]피페리딘-4-올( Mps1 -IN-1)
상기 화합물은 토크리스(Tocris) 사로부터 구입하였다.
실시예 31(JDM969B)
4-[[4-아미노-6-( tert - 부틸아미노 )-5- 시아노 -2- 피리딜 ]아미노] 벤즈아미드(TC Mps1 12)
상기 화합물은 토크리스 사로부터 구입하였다.
TTK 효소 분석
생화학적으로 정제된 전장 TTK(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 제조)에 대한 화합물의 억제 활성은 IMAP® 검정(미국 캘리포니아주 써니베일 소재의 몰레큘라 디바이스(Molecular Devices))으로 측정하였다. 화합물을 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 중에 용해시켰다. 실험 당일에, 화합물 스톡을 100% DMSO 중에서 3.16배 단계로 희석시켜 10-포인트 희석액 계열을 수득한 후, 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 0.01% Tween-20, 0.1% NaN3 및 1mM 갓 제조된 디티오트레이톨로 이루어진 IMAP 반응 버퍼 중에서 추가로 희석하였다. 화합물 용액을 IMAP 반응 버퍼 중에서 동일한 부피의 전장 TTK 효소와 혼합하였다. 실온의 암실에서 1시간의 사전 항온배양 후, 플루오레세인 표지된 MBP 유래의 기질 펩타이드(몰레큘라 디바이스)를 첨가한 후, ATP를 첨가하여 반응을 개시하였다. 최종 효소 농도는 3.9 nM였고, 최종 기질 농도 50 nM였으며, 최종 ATP 농도는 5 μM였다. 반응을 실온의 암실에서 2시간 동안 진행되도록 하였다. 반응을 제조업자(몰레큘라 디바이스)의 프로토콜에 따라 IMAP 진행성(progressive) 결합 용액으로 냉각시켜 중지시켰다. 플루오레세인 편광을 엔비전(Envision) 멀티모드 판독기(미국 메사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨 엘머 제조) 상에서 확인하였다. 용량 반응 곡선을 XLfit™5(영국 길드포드 소재의 ID 비즈니스 솔루션)에서 4 매개변수 로그방정식에 피팅하였다. 표 3은 TTK에 대한 효소 분석에서 서로 다른 화합물 부류인 다수의 TTK 억제제의 반수 최대 억제 효능을 나타낸다.
[표 3]
TTK 효소 분석에서 소분자 TTK 억제제의 활성
TTK 억제제에 대한 암세포의 민감성과 관련있는 유전체 바이오마커를 확인하기 위해, 66개의 서로 다른 유전적으로 잘 특성화된 암세포주들을 사용하여 증식 분석에서 화합물들을 시험하였다.
세포주 내에 특정 암 유전자 돌연변이를 가지고 있는 억제제의 항증식 활성에 대한 통계적 분석을 통해, TTK 억제제가 CTNNB1-코딩된 단백질 β-카테닌의 안정성의 조절에 관련된 것으로 알려진 CTNNB1 유전자 내에 돌연변이를 갖는 세포를 우선적으로 사멸시킨다는 사실을 밝혀냈다.
도 2a 내지 도 2g는 실시예 5, 8, 9, 12, 13 및 17의 Anova 분석의 볼케이노 플롯을 나타내고 있다. TTK 억제제가 CTNNB1 내에 돌연변이를 갖는 않는 세포주에 비해 돌연변이 CTNNB1를 발현하는 세포주에서 현저히 더 효능이 있는지를 검증해보기 위해, 단측 스튜던트 t-검정을 수행하였다. 표 4는 서로 다른 화합물 부류의 대표적인 TTK 억제제 다수의 민감성의 차이(ΔpIC50)를 나타내고 있다. 마이너스 ΔpIC50값은 CTNNB1 돌연변이 세포주가 CTNNB1 유전자의 조절성 도메인 내에 돌연변이를 갖지 않는 세포주에 비해 억제제에 더 민감함을 의미한다(표 2). p값이 < 0.05라는 것은 차이가 유의성이 있다는 것을 의미한다.
{표 4]
TTK 억제제에 대한 CTNNB1 돌연변이 및 비돌연변이 세포주의 민감성의 차이
1 -10log IC50(M)로 정의됨
2 단측 스튜던트 T-검정, 이분산성
3 CTNNB1 유전자를 지칭함
돌연변이된 CTNNB1 유전자 카피의 존재가 TTK 억제제에 대해 증가된 민감성을 부여하기에 충분한지를 확인하기 위해, 부모 HCT116 세포(S45del/+) 및 돌연변이된 CTNNB1(-/+)가 결여된 동질유전자 유도체를 사용하여 증식 분석을 수행하였다. 표 5는 부모 HCT116 세포와 비교하여 동질유전자 세포주 내의 서로 다른 화합물 부류의 대표적인 다수의 TTK 억제제에 있어서 민감성의 차이를 개괄하고 있다. 마이너스 ΔpIC50 또는 마이너스 Δ효능은 돌연변이 CTNNB1(S45del/+)를 발현하는 HCT116 부모 세포가 돌연변이된 CTNNB1 유전자가 제거된 (-/+) 동질유전자 유도체보다 억제제에 더 민감하다는 것을 의미한다. 따라서, 마이너스 ΔpIC50 또는 마이너스 Δ효능을 갖는 억제제는 돌연변이 CTNNB1 신호전달이 존재하는 세포주를 보다 잘 억제한다.
[표 5]
CTNNB1 유전자의 돌연변이된 카피를 발현하거나 발현하지 않는 HCT116 세포에서 TTK 억제제에 대한 민감성의 차이

Claims (29)

  1. 인간 개체 또는 동물에서 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있는 종양을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    인간 개체 또는 동물로부터 얻은 종양 샘플 내의 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재를 확인하는 단계로서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 엑손 3에 위치하고,
    상기 돌연변이는 상응하는 CTNNB1-코딩된 단백질의 S33, S37, S45 및 T41로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 치환이거나,
    상기 돌연변이는 상응하는 CTNNB1-코딩된 단백질의 S33, S37, S45 및 T41로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 결실이고,
    상기 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재는, 상기 종양이 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 나타내는 것인 단계
    를 포함하고,
    상기 TTK 억제제는 하기 화학식 I에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 I
    상기 식 중에서,
    R1은 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    ;
    R11은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (2-3C)알케닐, (2-3C)알키닐, (1-2C)알콕시 또는 OC2H3이고, 모든 알킬기 및 알콕시기는 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되며;
    R12는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
    R13은 R131CH2, R132O, R133R134N, R135C(O), R136S, R136S(O), R136S(O)(NH), R137SO2, (2-7C)헤테로사이클로알킬 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 각각의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 옥소, (1-2C)알콕시, (1-6C)알킬카보닐, (1-6C)알킬설포닐, (1-5C)알콕시카보닐, (1-6C)알킬아미노카보닐, (3-6C)사이클로알킬카보닐, (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐 또는 디[(1-2C)알킬]아미노로 임의로 치환되며, 각각의 알킬카보닐, 알킬설포닐, 알콕시카보닐, 알킬아미노카보닐, 사이클로알킬카보닐 또는 헤테로사이클로알킬카보닐은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 시아노, 옥소 또는 (1-2C)알콕시로 임의로 치환되고;
    R131은 (1-6C)알킬카보닐아미노, (3-6C)사이클로알킬카보닐아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R132는 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 할로겐, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R133은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬카보닐, (1-5C)알콕시카보닐, (3-6C)사이클로알킬카보닐 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R134는 수소 또는 (1-2C)알킬이고;
    R135는 (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬아미노, 디[(1-6C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬아미노 또는 (3-6C)사이클로알킬아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬, 옥소, 시아노 또는 아미노로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R136은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R137은 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬아미노, 디[(1-6C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬아미노 또는 (3-6C)사이클로알킬아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시 또는 (1-2C)알콕시로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R14는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
    R15는 H 또는 할로겐이며,
    상기 화학식 I에서, R2는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    ;
    R21은 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
    R22는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
    R23은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 시아노 또는 하이드록시이고;
    R24는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
    R25는 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
    R26은 H, (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-5C)헤테로사이클로알킬, 또는 (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬이고, 여기서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수를 나타내며, 모든 알킬, 헤테로사이클로알킬 또는 (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬기는 (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시, 옥소, 아미노, (3-6C)사이클로알킬, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-5C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고;
    상기 화학식 I에서, R2에서 R21 및 R25 중 단 하나만이 H일 수 있다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 II에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 II
    상기 식 중에서,
    R1 및 R3은 (6-10C)아릴 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 양 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 (1-6C)알킬 및 (2-6C)알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R4는 수소 및 (1-6C)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R5 및 R6은 독립적으로 수소 또는 메틸이다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 III에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 III
    상기 식 중에서,
    R1은 (1-6C)알킬, 할로(1-6C)알킬, HO-(1-6C)알킬, H2N-(1-6C)알킬, 시아노(1-6C)알킬, (1-6C)알콕시(1-6C)알킬, (2-6C)알케닐, (2-6C)알키닐, (3-6C)사이클로알킬, (3-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 (6-10C)아릴 및 (1-9C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R3은 (1-6C)알킬, -(CH2)n-(3-7C)헤테로사이클로알킬), -(CH2)n-(4-8C)헤테로사이클로알케닐), (3-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴, (1-9C)헤테로아릴, -(CH2)n-(6-10C)아릴, -O-(6-10C)아릴, -C(=O)N 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 치환될 수 있으며, n은 0, 1 또는 2의 정수이다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 IV에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 IV
    상기 식 중에서,
    R1은 (3-6C)사이클로알킬 및 (3-7C)헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 (6-10C)아릴 및 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 임의로 치환될 수 있다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 V에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 V
    상기 식 중에서,
    R1은 수소, (1-6C)알킬, 할로(1-6C)알킬, HO(1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (3-7C)헤테로사이클로알킬 또는 (1-5C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 (6-10C)아릴 또는 (1-9C)헤테로아릴이고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R3은 X-(6-10C)아릴 및 X-(1-9C)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 양 기는 임의로 치환될 수 있으며, 여기서 X는 S(=O)p, O, NR4, CR4aR4b 또는 C=CR4aR4b를 나타내고, p는 0, 1 또는 2의 정수이며; 추가로 R4, R4a, R4b는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 (1-6C)알킬을 나타낸다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 VI에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 VI
    상기 식 중에서,
    R1은 페닐기, 피리딜기 또는 인돌릴기를 나타내고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 페닐기, 피리딜기 또는 피리미딜기를 나타내고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R3은 수소 원자 또는 -C(=O)-O-(CR7R8)-O-C(=O)-R4로부터 선택된 기를 나타내고, 여기서 R4는 -NH2, -N(H)R5, -N(R5)R6으로부터 선택된 기로 동일하거나 다르게 1회 이상 치환된 (1-6C)알킬, -NH2, -N(H)R5, -N(R5)R6으로부터 선택된 기로 동일하거나 다르게 1회 이상 임의로 치환된 (4-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 기를 나타내며;
    R5 및 R6은 서로 독립적으로 수소 원자 및 (1-3C)알킬로부터 선택된 기를 나타내고;
    R7은 수소 원자 및 (1-3C)알킬로부터 선택된 기를 나타내며;
    R8은 수소 원자를 나타낸다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 VII에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물이거나:

    화학식 VII
    상기 식 중에서,
    R1은 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R2는 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있다;
    또는, 상기 TTK 억제제는 하기 화학식 VIII에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물인 방법:

    화학식 VIII
    상기 식 중에서,
    R1은 수소 원자 및 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 (6-10C)아릴, (1-5C)헤테로아릴, (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬 및 (3-7C)헤테로사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    R3은 (6-10C)아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 기는 임의로 치환될 수 있으며;
    X는 C 또는 N이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 33에 상응하는 세린 잔기의 미스센스 돌연변이 또는 결실인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 41에 상응하는 트레오닌 잔기의 미스센스 돌연변이 또는 결실인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 45에 상응하는 세린 잔기의 미스센스 돌연변이 또는 결실인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재를 종양 샘플 내의 종양 DNA에서 검출하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 돌연변이된 CTNNB1 유전자의 존재를 종양 샘플 내의 종양 mRNA에서 검출하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 종양 샘플을 종양 생검으로부터 채취하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 샘플은 DNA 샘플이고 순환하는 종양 DNA로부터 유래하는 것인 방법.
  9. 인간 개체 또는 동물에서 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있는 종양을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    인간 개체 또는 동물로부터 얻은 종양 샘플 내의 돌연변이된 CTNNB1-코딩된 단백질의 존재를 확인하는 단계로서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 엑손 3에 위치하고,
    상기 돌연변이는 상응하는 CTNNB1-코딩된 단백질의 S33, S37, S45 및 T41로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 치환이거나,
    상기 돌연변이는 상응하는 CTNNB1-코딩된 단백질의 S33, S37, S45 및 T41로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 결실이고,
    돌연변이된 CTNNB1-코딩된 단백질의 존재는, 상기 종양이 TTK 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 나타내는 것인 단계
    를 포함하고,
    상기 TTK 억제제는 제1항에 정의한 바와 같은 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 33에 상응하는 세린 잔기의 치환 또는 결실인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 41에 상응하는 트레오닌 잔기의 치환 또는 결실인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 돌연변이는 CTNNB1의 코돈 45에 상응하는 세린 잔기의 치환 또는 결실인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 종양 샘플 내의 β카테닌의 아미노산 서열 또는 인산화 상태를 분석하여 돌연변이된 CTNNB1-코딩된 단백질의 존재를 확인하는 것인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 종양 샘플을 종양 생검으로부터 채취하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TTK 억제제는 제1항에 정의된 바와 같은 화학식 I에 따른 화합물 부류에 속하는 화합물인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 화학식 I에서,
    R1은 이고;
    R11은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (2-3C)알케닐, (2-3C)알키닐, (1-2C)알콕시 또는 OC2H3이고, 모든 알킬 및 알콕시기는 하나 이상의 할로겐으로 임의로 치환되며;
    R12는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
    R13은 R132O, R135C(O), (2-7C)헤테로사이클로알킬, 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 각각의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 옥소, (1-2C)알콕시, (1-6C)알킬카보닐, (1-6C)알킬설포닐, (1-5C)알콕시카보닐, (1-6C)알킬아미노카보닐, (3-6C)사이클로알킬카보닐, (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐 또는 디[(1-2C)알킬]아미노로 임의로 치환되며, 각각의 알킬카보닐, 알킬설포닐, 알콕시카보닐, 알킬아미노카보닐, 사이클로알킬카보닐 또는 헤테로사이클로알킬카보닐은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, 시아노, 옥소 또는 (1-2C)알콕시로 임의로 치환되고;
    R132는 (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-7C)헤테로사이클로알킬, (6-10C)아릴 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 할로겐, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R135는 (2-7C)헤테로사이클로알킬, (1-6C)알킬아미노, 디[(1-6C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬아미노 또는 (3-6C)사이클로알킬아미노이고, 이들 각각은 (1-2C)알킬, 플루오로, 하이드록시, (1-2C)알콕시, 디[(1-2C)알킬]아미노, (2-7C)헤테로사이클로알킬, 옥소, 시아노 또는 아미노로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R14는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이고;
    R15는 H 또는 할로겐이며;
    R2는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    ;
    R21은 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
    R22는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
    R23은 H, 할로겐, (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 시아노 또는 하이드록시이고;
    R24는 H, 할로겐, (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시이며;
    R25는 H, 할로겐, (1-3C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시(1-2C)알킬, (3-4C)사이클로알킬, (2-3C)알케닐 또는 시아노이고;
    R26은 H, (1-6C)알킬, (3-6C)사이클로알킬, (2-5C)헤테로사이클로알킬, (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬이고, 여기서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수를 나타내며, 모든 알킬, 헤테로사이클로알킬 및 (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬기는 (1-2C)알킬, (1-2C)알콕시, 하이드록시, 옥소, 아미노, (3-6C)사이클로알킬, 디[(1-2C)알킬]아미노 또는 (2-5C)헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되고;
    상기 화학식 I에서, R2에서 R21 및 R25 중 단 하나만이 H일 수 있는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 화학식 I에서,
    R1은 이고;
    R11은 (1-2C)알콕시이고;
    R12는 H이고;
    R13은 R132O, R135C(O), (2-7C)헤테로사이클로알킬, 또는 (1-5C)헤테로아릴이고, 각각의 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴은 (1-2C)알킬, (1-6C)알킬카보닐, 또는 (2-7C)헤테로사이클로알킬카보닐로 임의로 치환되며, 각각의 알킬카보닐 또는 헤테로사이클로알킬카보닐은 (1-2C)알킬 또는 (1-2C)알콕시로 임의로 치환되고;
    R132는 (2-7C)헤테로사이클로알킬이고, (1-2C)알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R135는 (2-7C)헤테로사이클로알킬이고, 각각 (1-2C)알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 임의로 치환되며;
    R14는 H이고;
    R15는 H이며;
    R2는 하기 화학식으로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    ;
    R21은 (1-3C)알킬이고;
    R22는 H이고;
    R23은 H이고;
    R24는 H이고;
    R25는 (1-3C)알킬이고;
    R26은 H, (1-6C)알킬, (1-2C)알콕시[(2-4C)알콕시]n(1-6C)알킬이고, 여기서, n은 1, 2, 3 또는 4의 정수를 나타내는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TTK 억제제는 하기 실시예 1 내지 31로부터 선택된 화합물인 것인 방법:




  19. 화합물이 TTK 억제제인지를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 제1 포유동물 세포주 및 제2 포유동물 세포주를 제공하는 단계로서, 상기 제1 세포주는 CTNNB1이 돌연변이된 것이고 상기 제2 세포주는 CTNNB1 적격인(proficient) 것인 단계;
    b) 상기 제1 세포주 및 제2 세포주를 제1 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 제1 세포주 및 제2 세포주의 세포 증식의 억제를 분석으로 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제2 후보 화합물을 사용하여 상기 단계 b) 및 c)를 반복하며, 후보 화합물의 선택은 상기 제1 세포주를 사용한 분석에서의 각 후보 화합물들의 활성에 기초하여 이루어지는 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 제1 세포주 및 제2 세포주는 암세포주인 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 제1 세포주 및 제2 세포주는 동질유전자 세포주인 방법.
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